JP2022552408A - 神経障害の治療のための細胞外小胞系薬剤及び方法 - Google Patents

Abstract

神経障害の予防及び治療のためのグリア細胞由来細胞外小胞を含む組成物及び方法が、とりわけ本明細書で提供される。態様では、グリア細胞由来細胞外小胞は、以下のもの、ｍｉＲＮＡ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ｓｉＲＮＡ、ｖＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、ＤＮＡ、テトラスパニン、アミノ酸、代謝産物、シグナル伝達タンパク質、シャペロン、細胞骨格タンパク質、酵素、又はそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含み得る。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
本出願は、２０１９年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９１６，２０８号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の下の優先権の利益を主張し、その全内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、国立神経疾患・脳卒中研究所によって授与された助成金番号：Ｒ０１ ＮＳ０９４３８８の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

神経障害を治療するための新規な組成物及び方法が提供される。

神経障害、例えば、末梢神経系（ＰＮＳ）神経障害及び中枢神経系神経障害（ＣＮＳ）の予防及び治療のためのグリア細胞由来細胞外小胞を含む組成物及び方法が、とりわけ本明細書で提供される。態様では、グリア細胞由来細胞外小胞は、以下のもの、ｍｉＲＮＡ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ｓｉＲＮＡ、ｖＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、ＤＮＡ、テトラスパニン、アミノ酸、代謝産物、シグナル伝達タンパク質、シャペロン、細胞骨格タンパク質、酵素、又はそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含み得る。

実施形態では、グリア細胞由来細胞外小胞は、ｍｉＲＮＡ－２１、ｍｉＲＮＡ－１３２、ｍｉＲＮＡ－９、ｍｉＲＮＡ－２７ａ、ｍｉＲＮＡ－２２１、ｍｉＲＮＡ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－３６１、ｍｉＲＮＡ－２７４、ｍｉＲ－８７３ａ－５ｐ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９ ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶｒｈ１０、グリア細胞由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、グリア線維性酸性タンパク質、又はそれらの組み合わせを含む。例示的な配列には、以下のものが含まれる。
ｍｉＲＮＡ－２１：ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ（配列番号１）
ｍｉＲＮＡ－１３２：ＵＡＡＣＡＧＵＣＵＡＣＡＧＣＣＡＵＧＧＵＣＧ（配列番号２）
ｍｉＲＮＡ－９：ＵＡＡＡＧＣＵＡＧＡＵＡＡＣＣＧＡＡＡＧＵ（配列番号３）
ｍｉＲＮＡ－２７ａ：ＵＵＣＡＣＡＧＵＧＧＣＵＡＡＧＵＵＣＣＧＣ（配列番号４）
ｍｉＲＮＡ－２２１：ＡＧＣＵＡＣＡＵＵＧＵＣＵＧＣＵＧＧＧＵＵＵＣ（配列番号５）
ｍｉＲＮＡ－２００ａ－３ｐ：ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＣＧＡＵＧＵ（配列番号６）
ｍｉＲＮＡ－３６１：ＵＵＡＵＣＡＧＡＡＵＣＵＣＣＡＧＧＧＧＵＡＣ（配列番号７）
ｍｉＲＮＡ－２７４：ＧＡＡＧＵＵＧＵＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＵＵＣＧ（配列番号８）
ｍｉＲ－８７３ａ－５ｐ：ＧＣＡＧＧＡＡＣＵＵＧＵＧＡＧＵＣＵＣＣＵ（配列番号９）

例えば、グリア細胞由来細胞外小胞には、ｍｉＲＮＡ－２１、ｍｉＲＮＡ－１３２、ｍｉＲＮＡ－９、ｍｉＲＮＡ－２７ａ、ｍｉＲＮＡ－２２１、ｍｉＲＮＡ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－３６１、ｍｉＲＮＡ－２７４、又はｍｉＲ－８７３ａ－５ｐが含まれる。他の例では、グリア細胞由来細胞外小胞には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９ ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶｒｈ１０、又はそれらの組み合わせが含まれる。更なる例示的なカーゴは、Ｇｏｅｔｚｌ ＥＪ，Ｍｕｓｔａｐｉｃ Ｍ，Ｋａｐｏｇｉａｎｎｉｓ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｇｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１６；３０（１１）：３８５３－３８５９に見出すことができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

実施形態では、グリア細胞由来細胞外小胞は、２Ｄ又は３Ｄ培養物中のアストロサイト、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、ミクログリア又は衛星細胞に由来する。例えば、アストロサイト及び／又はシュワン細胞及び／又はオリゴデンドロサイトから作製される、スフェロイド、幹細胞由来オルガノイド、又は組織操作された３Ｄ構築物である。この３Ｄ培養物（アストロサイト及び／又はシュワン細胞及び／又はオリゴデンドロサイトから作製される、スフェロイド、幹細胞由来オルガノイド、又は組織操作された３Ｄ構築物を含む）は、細胞外小胞（エクソソーム）産生のスループット及び／又は収率の増加を促進すると考えられる。

ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ４００ ６ウェルマイクロウェル培養プレート（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を使用することによって、グリア細胞（例えばアストロサイト又はシュワン細胞）からなる３Ｄ組織スフェロイドを作製した。マイクロウェル培養プレートに細胞を播種する前に、０．５ｍＬの付着防止リンス溶液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、２分間の２０００ｇ遠心分離とそれに続く室温における３０分間のインキュベーションを行って、マイクロウェルへの細胞付着を防止した。次に、２ｍＬの２５０万個の単一細胞懸濁液を各ウェルに播種し、５分間の２００ｇ遠心分離を行ってマイクロウェル内で細胞をクラスター化させ、３７℃のＣＯ_２インキュベータ内で一晩細胞をインキュベートして凝集させ、スフェロイドを形成した。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇ．Ｒａｚｉａｎ，Ｙ．Ｙｕ，Ｍ．Ｕｎｇｒｉｎ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｓｉｚｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ（８１）（２０１３）ｅ５０６６５を参照されたい。

例では、細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト）初代単離細胞又は哺乳動物（例えば、ヒト）幹細胞である。哺乳動物幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられる。

実施形態では、グリア細胞由来細胞外小胞は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。例えば、ＡＡＶは、ＡＡＶ９、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ６、ＡＡＶ５、ＡＡＶ１、又はＡＡＶ２を含む。配列情報は、例えばＣｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．で公的に入手可能である。ＡＡＤＪ８の例示的な配列を以下に示す（配列番号１２）。
６－１８７１：ＡＡＶ－２ Ｒｅｐ遺伝子
１８８８－４１０１：ＡＡＶ－ＤＪ／８ Ｃａｐ遺伝子
５６０６－６４６６：アンピシリン耐性（ｂｌａ）遺伝子（相補体）

実施形態では、グリア細胞由来細胞外小胞は、細胞外小胞の表面上にタンパク質又はその断片を発現するための遺伝子組換えタンパク質又はその断片を含む。例えば、遺伝子組換えタンパク質は、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、テトラスパニン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン－３、ＩＣＡＭ－１、インテグリンα４、ＬｉＣＡＭ、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ－１、Ｖｔｉ－１Ａ及びＢ、ＣＸＣＲ４、ＦｃＲ、ＧｌｕＲ２／３、ＨＬＡ－ＤＭ、免疫グロブリン、ＭＨＣ－１、ＭＨＣ－２、又はＴＣＲβを含む。例示的な配列は以下を含む。Ｌａｍｐ－２：
ｍｖｃｆｒｌｆｐｖｐｇｓｇｌｖｌｖｃｌｖｌｇａｖｒｓｙａｌｅｌｎｌｔｄｓｅｎａｔｃｌｙａｋｗｑｍｎｆｔｖｒｙｅｔｔｎｋｔｙｋｔｖｔｉｓｄｈｇｔｖｔｙｎｇｓｉｃｇｄｄｑｎｇｐｋｉａｖｑｆｇｐｇｆｓｗｉａｎｆｔｋａａｓｔｙｓｉｄｓｖｓｆｓｙｎｔｇｄｎｔｔｆｐｄａｅｄｋｇｉｌｔｖｄｅｌｌａｉｒｉｐｌｎｄｌｆｒｃｎｓｌｓｔｌｅｋｎｄｖｖｑｈｙｗｄｖｌｖｑａｆｖｑｎｇｔｖｓｔｎｅｆｌｃｄｋｄｋｔｓｔｖａｐｔｉｈｔｔｖｐｓｐｔｔｔｐｔｐｋｅｋｐｅａｇｔｙｓｖｎｎｇｎｄｔｃｌｌａｔｍｇｌｑｌｎｉｔｑｄｋｖａｓｖｉｎｉｎｐｎｔｔｈｓｔｇｓｃｒｓｈｔａｌｌｒｌｎｓｓｔｉｋｙｌｄｆｖｆａｖｋｎｅｎｒｆｙｌｋｅｖｎｉｓｍｙｌｖｎｇｓｖｆｓｉａｎｎｎｌｓｙｗｄａｐｌｇｓｓｙｍｃｎｋｅｑｔｖｓｖｓｇａｆｑｉｎｔｆｄｌｒｖｑｐｆｎｖｔｑｇｋｙｓｔａｑ
（配列番号１０）。

他の例では、遺伝子組換えタンパク質は、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）、破傷風毒素断片Ｃ、又はＲＧＤペプチドのうちの少なくとも１つを含む。ＲＶＧ：ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ（配列番号１１）。

実施形態では、グリア細胞由来細胞外小胞は、直径が約１０ｎｍ～約１０００ｎｍである。あるいは、グリア細胞由来細胞外小胞は、直径が約５０ｎｍ～約２００ｎｍである。他の例では、グリア細胞由来エクソソーム（例えば、グリア細胞由来エクソソーム）は、約１０ｎｍ～約５０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１０００ｎｍの直径、例えば、約１０ｎｍ～約３００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、又は約３０ｎｍ～約１００ｎｍの直径を有するとして特性決定される。

態様では、培地中で細胞を培養することであって、ここで細胞は細胞外小胞を培地中へ分泌することによって放出すること、培地の上清を回収すること、細胞外小胞を含む上清を分画すること、及び、細胞外小胞を単離すること、を含む、グリア細胞由来細胞外小胞を調製する方法も本明細書で提供される。

実施形態では、方法は、超遠心分離、限外濾過、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）、又はそれらの組み合わせによる分画を更に含む。

例えば、方法を使用して、エクソソーム産生及びエクソソーム収率を増加させることができる。例えば、音響刺激又は電気刺激（例えば、ＥＶ新生中）を使用して、産生効率を最大化する方法が企図される。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｍｍｕｎ Ｂｉｏｌ．２０２０ Ｏｃｔ ５；３（１）：５５３、及びＮａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ．２０２０ Ｊａｎ；４（１）：６９－８３を参照されたい。

実施形態では、方法は、細胞が、ヒト神経外胚葉、末梢神経系における神経支持細胞、又は中枢神経系における神経支持細胞に由来することを規定する。例えば、細胞には、２Ｄ又は３Ｄ培養物中のアストロサイト、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、ミクログリア、又は衛星細胞が含まれる。

実施形態では、方法は、１つ又は複数の真空媒介遠心分離工程を更に含み得、真空媒介遠心分離は、生細胞、死細胞片、より大きな細胞片、又はそれらの組み合わせを除去する。

態様では、本明細書に記載のグリア細胞由来細胞外小胞を含む組成物を患者に投与することを含む、患者の神経障害を治療する方法が本明細書で提供される。

例えば、神経障害は、外傷性末梢神経損傷、化学療法誘発性末梢神経障害、外傷性脳損傷、脳卒中、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、前頭側頭葉型認知症、ハンチントン病、多発性硬化症、先天性筋無力症、失行、筋緊張亢進、重症筋無力症、又は脊髄性筋萎縮症を含む。

実施形態では、神経障害を治療する方法は、組成物が局所的又は全身的に投与されることを含む。他の例では、組成物は、静脈内、超音波、髄腔内、又は皮下投与を介して投与される。

実施形態では、患者は、哺乳動物、例えばヒトである。

態様では、グリア細胞由来細胞外小胞を含む組成物を投与することを含む、ニューロンアポトーシス、ニューロン老化、神経突起伸長、シナプス機能又は電気生理学的機能を予防又は治療する方法が本明細書に提供される。

実施形態では、ニューロンアポトーシス、ニューロン老化、又は電気生理学的機能は、細胞死、神経突起変性、異常な静止膜電位、異常な反復発火挙動、再分極速度、及び活動電位発火頻度を含む。

他の例では、ニューロンアポトーシスは、組成物を投与されていない患者と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は１００％減少する。更に、電気生理学的機能は、組成物を投与されていない患者と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、１５０％、又は２００％増加する。

他の実施形態では、神経突起伸長は、組成物を投与されていない患者と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、１５０％、又は２００％増加する。実施形態では、シナプス形成／機能は、組成物を投与されていない患者と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、１５０％、又は２００％増加する。

実施形態では、グリア細胞由来エクソソームは、所望の細胞型又は組織を標的とすることができる。この標的化は、標的化される細胞の表面上に発現される細胞表面部分に結合する標的化部分をエクソソームの表面上に発現させることによって達成することができる。典型的には、標的化部分は、開示されるエクソソーム標的化融合タンパク質内のペプチドである。しかし、それはまた、エクソソーム膜貫通部分との融合タンパク質として独立して発現され得る。

他の態様では、グリア細胞由来細胞外小胞（又はグリア細胞由来エクソソーム）を含み、細胞外小胞が１つ又は複数の遺伝子編集ツールを有する、組成物が本明細書で提供される。例えば、遺伝子編集ツールには、遺伝子編集タンパク質、ＲＮＡ分子及び／又はリボ核タンパク質が含まれる。

実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＴＡＬＥＮ）、ＭｅｇａＴＡＬ、Ｃａｓタンパク質、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、又はＦｌｐリコンビナーゼである。他の例では、ＲＮＰはＣａｓタンパク質を含む。

キットは、グリア細胞由来細胞外小胞（又はエクソソーム）を調製するための１つ又は複数の試薬を含み、エクソソームも本発明の範囲内である。

更なる態様では、本発明の細胞外小胞は、インビトロ系及びエクスビボ系で使用され得る。例えば、幹細胞又は前駆細胞を、機能性及び／又は成熟を促進又は誘導するために、本発明の細胞外小胞で処置又はインキュベートしてもよい。そのような方法では、例えば、細胞、例えば幹細胞又は前駆細胞の集団を得ることができ、本発明の細胞外小胞をインビトロで細胞の集団に投与して、好適には、処置された細胞の機能性又は成熟を生成させる。いくつかの実施形態では、本発明の細胞外小胞は、インビトロで細胞集団に、少なくとも１、２、３、６、１２、１８又は２４時間投与（例えばインキュベート）され得る。更なる態様では、本明細書に開示される本発明の細胞外小胞によりインビトロで処置された細胞の集団が提供される。

本発明の他の態様を以下に開示する。

特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を伴うこの特許又は特許出願公開の写しは、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供される。

図１Ａ～図１Ｃは、ＮＧＮ２導入遺伝子形質導入ヒトｉＰＳＣからの皮質ニューロンの分化を示すデータである。図１Ａは、ＮＧＮ２転写を開始させるためのドキシサイクリンの使用を強調する分化プロトコルを示す概略図である。図１Ｂは、分化の初期段階と培養の後期段階との間で観察された形態学的変化を示す画像である。図１Ｃは、ＣＵＸ－１（大脳皮質層２及び３におけるニューロンマーカ）及びＭＡＰ２（全体のニューロンマーカ）に対する抗体をＤＡＰＩ染色核と共に使用して免疫染色されたヒトｉＰＳＣ由来皮質ニューロンを示す画像である。挿入図は、細胞の細胞質におけるＣＵＸ－１の明確な発現を示す。挿入画像のスケールバー：２０μｍ。 図２Ａ～図２Ｊは、ＥＶ特性決定及び培養皮質ニューロンへの内在化を示すデータである。図２Ａは、ヒト初代アストロサイトの明視野像である。図２Ｂは、アストロサイトにおいて主に発現されるグリア細胞マーカである、ＧＦＡＰ及びＳ１００Ｂに対する抗体を使用して免疫染色したアストロサイト培養物を示す画像である。図２Ｃは、回収されたＥＶの粒度分布を示す棒グラフである。これらの実験から計算された平均粒径は１５４．６±４．３６ｎｍであった。図２Ｄは、ＥＶ回収前の様々な細胞インキュベーション時間で回収されたＥＶの粒度分布を示すグラフである。図２Ｅは、異なる培養時間後に回収されたＥＶの数を示す棒グラフである。ｘ軸上のインキュベーション時間は、４日目の無ＥＶ培地交換後に経過した時間を示す。エラーバーは、標準誤差（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｅｒｒｏｒ Ｍｅａｎ：ＳＥＭ）である。図２Ｆは、外因性ＥＶ非含有条件におけるアストロサイトのインキュベーションの８４時間後に馴化培地から回収されたＥＶの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す画像である。図２Ｇは、様々な細胞インキュベーション時間で培養物から回収されたＥＶのモード径を示す棒グラフである。平均値は１２４ｎｍである。図２Ｈは、ＥＶの内在化を示すために、ＣＤ８１及びＦ－アクチンに対する抗体で二重免疫染色した代表的な皮質ニューロンを示す画像である。処置例の細胞に対するＥＶの比を説明書きに示す。図２Ｉは、蛍光標識ＥＶで細胞数を定量することによって計算された、ＥＶに対するニューロンの異なる比におけるＥＶの取込み効率を示す棒グラフである。図２Ｊは、ＥＶ処置細胞におけるＣＤ８１蛍光強度と培養物を処置するために使用した細胞に対するＥＶの比との関係を示すグラフである。蛍光強度は、未処置の試料に対して正規化された相対値として表される。提示した全データにおいて、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓは、有意ではない（ｎ＝３）。 図３Ａ及び図３Ｂは、様々な濃度のアストロサイト由来ＥＶによる処置に応答したアポトーシスニューロンの分析を示すデータである。図３Ａは、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用した６日目のニューロンのフローサイトメトリ分析の画像である。挿入数字は、各象限を占める細胞の百分率を示す。Ｑ１＝初期アポトーシス細胞（ＰＩ陽性）、Ｑ２＝後期アポトーシス細胞（ＰＩ及びアネキシンＶの両方の陽性）、Ｑ３＝初期アポトーシス細胞（アネキシンＶ陽性）、Ｑ４＝生細胞（ＰＩ及びアネキシンＶ陰性）。条件当たり１０，０００個の細胞をこのアッセイに使用した。図３Ｂは、各条件における分析細胞数の定量及び比較を示す棒グラフである。 図４Ａ～図４Ｃは、誘導後３日目の未処置ニューロン及びＥＶ処置ニューロンを比較したニューロン老化アッセイを示すデータである。図４Ａは、ＥＶ処置有り及びＥＶ処置なしで培養した異なる時点から撮影した代表的な明視野画像である。図４Ｂは、過活性リソソームを支持する老化細胞の細胞質に沈殿物を産生するβ－ガラクトシダーゼ溶液で細胞を染色した後に撮影した代表的な明視野画像である。挿入画像のスケールバー：２０μｍ。図４Ｃは、各培養４日目の処置細胞及び未処置細胞におけるβ－ガラクトシダーゼ染色細胞数の定量化を示す棒グラフである。エラーバーはＳＥＭである。＊＊ｐ＜０．００５（ｎ＝３）。 図５Ａ～図５Ｃは、ＥＶ未処置ニューロンとＥＶ処置ニューロンとの間の神経突起伸長速度及び軸索分岐の比較を示すデータである。図５Ａは、３つの異なる時点におけるＥＶ処置有り及びＥＶ処置なしの低密度でプレーティングされたニューロンの形態学的比較を示す画像である。図５Ｂは、異なる時点で軸索を標識するためにニューロフィラメント発現について染色されたニューロンの代表的な免疫染色画像である。図５Ｃは、各培養条件において異なる数の軸索分岐を示すニューロンの集団を示す棒グラフである（ｎ＝１９）。 図６Ａ～図６Ｇは、アストロサイト由来のＥＶ処置ニューロン及び未処置ニューロンの単一細胞の電気生理（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）を示すデータである。図６Ａは、ＥＶ処置及び未処置ニューロンから記録された代表的な活動電位トレースを示すグラフである。図６Ｂは、５００ｍｓの脱分極電流注入に応答して測定されたニューロンの各群における最大活動電位発火率を示すグラフである。図６Ｃは、以前に報告されたように、「反復型」、「適応型」、「単一」、及び「なし」として分類された、異なる活動電位発火パターンを示すパッチされたニューロンの数を示す棒グラフである。^４９図６Ｄは、９０％の再分極における活動電位持続時間を示す棒グラフである。記録された活動電位の頂点に対するニューロンの、再分極速度（図６Ｅ）及び脱分極速度（図６Ｆ）。図６Ｇは、０ｐＡ電流注入で非刺激ニューロンから測定された静止膜電位を示す棒グラフである。提示した全てのデータにおいて、エラーバーはＳＥＭであり、＊＊＊ｐ＜０．０００３、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓは有意ではない。各データセットについて、ｎ＝２０（未処置）、ｎ＝１６（ＥＶ処置）である。 図７は、ＥＶ回収プロセスの図を示す概略図である。各工程は、培養物内の非ＥＶ構成要素を連続的に適切に除去するために必要な遠心分離速度を示す。 図８Ａ及び図８Ｂは、異なるバッチで回収されたアストロサイト由来ＥＶの特性決定を示す棒グラフである。図８Ａは、３つの異なるバッチにおけるＥＶの密度を示す棒グラフである。図８Ｂは、同じバッチにおけるＥＶの平均径を示す棒グラフである。エラーバーはＳＥＭである。 図９は、６日目のＥＶ処置ニューロンの生細胞画像を示す画像である。ＥＶをＥｘｏＧｌｏｗ色素で蛍光タグ付けして、生培養物における大部分の細胞へのＥＶの取込みを可視化した。 図１０は、培養の初期段階中の皮質ニューロンの神経突起伸長速度を示す棒グラフである。異なる濃度のＥＶ処置に応答した各時点で分析した各細胞における最長神経突起（μｍ）の比較。エラーバーはＳＥＭである。 図１１Ａ及び図１１Ｂは、シュワン細胞由来エクソソームからのデータである。図１１Ａは、エクソソーム産生中のヒトシュワン細胞の顕微鏡画像である（スケールバー＝１００ｍｍ）。図１１Ｂは、産生したヒトシュワン細胞由来エクソソームの粒度分布を示すグラフ及びその顕微鏡画像（インボックス、スケールバー＝１ｍｍ）である。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ装置を使用してエクソソームの平均直径が１０２．５±１０５．８ｎｍであることを確認した。 図１２は、標的とされる細胞の表面上に発現される細胞表面部分、例えば受容体に結合する、表面上に発現される標的化ペプチドを含む細胞外小胞（又はエクソソーム）を示す概略図である。

本明細書では、とりわけ、末梢神経系（ＰＮＳ）及び中枢神経系障害を含む神経障害を治療及び予防するための組成物、方法、及びキットが提供される。

ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来するニューロンは、新規治療化合物の神経病態生理及び前臨床有効性／毒性スクリーニングをモデル化するための強力なツールである。しかし、インビトロで培養されたヒトニューロンは、典型的には、特に成体ヒトニューロンに匹敵する形態学的成熟、寿命、及び電気化学的シグナル伝達能力を示すことに関して、ヒト神経系の生理を完全には再現しない。

本明細書に記載されるように、グリア細胞由来細胞外小胞（ＥＶ）を調査して、インビトロでニューロンの生存及び電気生理学的機能を調節した。具体的には、ヒトアストロサイトから得られたＥＶは、ｈｉＰＳＣ由来ヒト皮質ニューロンにおいて電気生理学的機能及び抗アポトーシス挙動の増強を促進した。更に、ヒトシュワン細胞から単離されたＥＶは、同様の方法で採取することができ（例えば、アストロサイトの抽出と同様の様式で）、ニューロン機能を増強することが以前に示されている。

神経突起伸長はＥＶ処置によって影響されなかったが、処置細胞におけるニューロン機能の改善及びアポトーシスシグナル伝達の阻害は、そのような細胞を利用する前臨床スクリーニングを改善するための有意な可能性を保持し得る。したがって、培養中のアストロサイトＥＶ媒介ニューロン増強は、特に生体模倣ヒト神経組織モデルの開発において、ｈｉＰＳＣ由来ニューロンの有用性を拡大する可能性を保持する。更に、データは、難治性の中枢及び末梢神経障害に対処するための将来の臨床治療の潜在的なクラスとしてのＥＶ系治療法の可能性を強調している。

哺乳動物の脳の大脳皮質は、異なるニューロン集団を支持する特定の層で良好に組織化されている。^１－３皮質内で、ニューロンは、互いにシナプスを形成するだけでなく、グリア細胞ともシナプスを形成する。これらのニューロン－グリアシナプスは、ニューロンの生存、再生、分化、並びに脳内の運動及び感覚情報の適切な調整を確実にするために必要である。^３－９アストロサイトは、中枢神経系（ＣＮＳ）においてニューロンと共存するグリア細胞の最も豊富なサブタイプである。^１０それらは、ニューロンに構造的及び栄養的支持を提供し、新生児の脳発達の初期段階でシナプス形成を媒介し、ニューロンシナプスを維持及び排除し、並びに関連するニューロンの興奮性を調節することが知られている。^１０動物研究により、ニューロン新生の後期段階（げっ歯類ではＥ１８前後）で始まるアストロサイト発生、アストロサイト分裂及び拡大は、軸索及び樹状突起伸長並びにニューロンにおけるシナプス開始と同時に発生することが明らかになった。^{１０、１１}多数の研究がニューロンに対する様々な範囲のアストロサイト機能性を明らかにしているが、これらの神経細胞が発達中及びそれ以降にどのようにして互いに特異的に相互作用するか、及びそれらの相互作用が疾患組織においてどのように変化するかの詳細な機構は十分に理解されていない。この研究では、アストロサイト由来ＥＶを介したニューロンアストロサイト傍分泌シグナル伝達に重点が置かれた。

具体的には、アストロサイト由来ＥＶ内部の分子カーゴを評価して、グリア細胞由来ＥＶが、培養ヒト皮質ニューロンにおける電気生理学的機能の生存及び発達を制御するかどうかを決定した。エクソソーム等のＥＶは、多胞体の内出芽を通して管腔内小胞として生成され、後期エンドソームのサブタイプである。^７－１４多胞体の内因的にプログラムされた細胞内輸送は、それらを分解のためにリソソームと融合するか、又はＥＶの形態で細胞外空間へのそれらの内容物の放出を促進するために細胞膜と融合することができる。^１５ＥＶの細胞「廃棄物処理」の役割に加えて、それらは現在、ＣＮＳ内の様々な種類の細胞間の傍分泌通信を媒介する可溶性因子の主要なキャリアと見なされている。^１６－１８ＥＶは、タンパク質翻訳、転写後遺伝子調節、及び転写されたｍＲＮＡの直接発現を含む、レシピエント細胞の挙動を調節するために、転写可能なｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ並びに多数のタンパク質及び脂質を封入する。^{１５、１９}

ＥＶに封入された最も一般的なタンパク質は、小胞輸送及び融合（Ｒａｂ ＧＴＰａｓａｓ、ＳＮＡＲＥ、アネキシン、及びフロチリン）、異なるインテグリン及びテトラスパニン（ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１及びＣＤ８２）、熱ショックタンパク質（Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０及び９０）、並びに多胞体の新生に関与するタンパク質に関連する。^８異なるニューロンサブタイプにおけるアストロサイト由来ＥＶの役割が、いくつかのインビトロ及びマウスモデル研究において研究されている。これらの研究では、神経芽腫細胞株又はマウス由来ニューロンを使用して、どの特定のカーゴタンパク質又はＲＮＡが存在するか、並びに細胞の完全性、生存、機能的成熟、及び病原性発生に対するそれらの影響を調査した。^{１０、２０－２２}以前の研究は、ニューロンに対するグリア細胞由来ＥＶの複雑な役割の理解を著しく拡大したが、使用されるマウス由来グリア細胞及び神経芽腫細胞株は、ヒト神経組織におけるグリア及びニューロンの相互作用を十分に反映していない可能性があり、したがって、ヒトＣＮＳの複雑な生理学的環境を再現しようとする場合に重大な制限を提示する。更に、グリア細胞由来ＥＶに焦点を当てた以前の研究は、ニューロンの主要な機能を決定するための最も重要な基準の１つであるニューロン電気生理の変化に対するそれらの機能的影響を示していない。

本研究では、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来皮質ニューロン及びヒトアストロサイト由来ＥＶを使用して、ヒトニューロンにおける生理学的挙動に対するアストロサイト由来ＥＶの影響を、ニューロンの電気生理の正の調節に特に焦点を当てて調査した。アストロサイトの細胞質からの封入された小胞のカーゴは、レシピエントニューロンの生存を増強し、更に膜貫通イオンチャネルのタンパク質活性を支持して、培養物のニューロンの電気化学的成熟を促進した。本明細書に提示されるデータは、培養の初期段階における老化及びアポトーシスマーカの発現が有意に低いことによって証明されるように、アストロサイト由来ＥＶが分化中の皮質ニューロンの生存を増強することを実証している。より重要なことに、ニューロンに対するＥＶ処置の最適な濃度は、培養物のそれらの電気生理学的機能を劇的に増強し、ニューロンに送達された小胞分子が、正しいイオンチャネル発現パターンの発達を支持する上で重要な影響を有し得ることを示唆している。

本明細書のデータは、ヒトの脳におけるアストロサイトと皮質ニューロンとの間の傍分泌相互作用の理解を改善することに寄与する。これらのデータは、ヒトｉＰＳＣ由来皮質ニューロンを使用してＣＮＳ疾患をモデル化するための将来の取り組みにとって重要であり、ヒト神経系におけるグリア細胞の様々な病原的役割の研究を促進するのに役立つであろう。

特定の好ましい態様では、開示されたシステムは、ヒトニューロンの機能的特性の調節に対するアストロサイト由来ＥＶの生理学的役割の理解における進歩を提供することができる。より具体的には、とりわけ、以下の通りである。
・ヒトアストロサイト由来ＥＶは、ｈｉＰＳＣ由来皮質ニューロンによって活発にエンドサイトーシスされ、ストレス性分化プロセスを経ることを強いられた初期の未成熟ニューロンに抗アポトーシス効果を与える。
・培養皮質ニューロンに対するＥＶ処置の最適濃度は、細胞生存率を延長し、培養物の初期段階の細胞老化を防ぐ能力に関して定義される。
・アストロサイト由来ＥＶを取り込んだ皮質ニューロンは、静止膜電位、活動電位持続時間、再分極速度、及び注入された脱分極電流に応答して反復活動電位連発を発火することができる細胞の割合の顕著な増加を含む、有意に増強された単一細胞電気生理を示す。

培養中に観察される神経生理と実際の神経系で測定される神経生理との間に現在存在する有意なギャップを減少させることがますます重要になってきている。これは、通常はニューロン自律的ではないヒト神経障害の信頼できるモデリングを可能にすることに関して特に当てはまる。

効率的な薬物開発のために神経組織モデリングを適用するには、支持細胞の助けを借りてニューロンがどのように生存し、機能するかを理解することが重要であり得る。その意味で、発達状態から神経変性状態へのニューロンとグリアとの間のクロストークに対する我々の理解を改善する最近の進歩がなされている。この分野では、本明細書の研究は、特にヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの生存及び電気生理学的機能に対するアストログリア細胞由来ＥＶの包括的な役割を理解することに関して、重要な進歩を表す。

結果は、ヒト神経系における細胞間通信の手段としてのＥＶの機能的側面に対する新たな洞察を提供し、神経変性疾患の発症及び進行に対抗するためのＥＶ由来療法の可能性に焦点を当てた重要なプロジェクトを推進する。

細胞外小胞及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
標準的なＡＡＶベクターは、広く使用されている２９３Ｔのような産生細胞株を用いて作製される。ベクター産生中、集合したＡＡＶベクター粒子は産生細胞内に蓄積し、精製プロトコルは多くの場合、細胞溶解から開始してＡＡＶ粒子を放出し、その後の精製工程を含むプロセスを記載する。

ＡＡＶ粒子は、多くの場合、細胞膜から培養培地中に分泌される細胞エクソソーム、小膜小胞又は微小胞（直径約４０～１５０ｎｍ）と共に見出される。ＡＡＶ粒子は、エクソソームの外側表面に結合しているか、又は小胞の内側に担持されるかのいずれかであり、タンパク質又は核酸等の他の細胞分子も含み得る。ベクター及びエクソソームのこの組み合わせには、ベキソソーム（ｖｅｘｏｓｏｍｅ）（ベクター－エクソソーム）、エクソソームＡＡＶ、又はｅｘｏ－ＡＡＶという名称が付けられた。これらの粒子は、従来の精製ＡＡＶベクターに優る利点、例えばより高い形質導入効率を有する（同じ数のＡＡＶ粒子がより多くの細胞に感染することができる）。更に、ｅｘｏ－ＡＡＶは、中和抗ＡＡＶ抗体に対してより耐性であった。これは、内因性抗ＡＡＶ抗体がしばしばＡＡＶベクターの治療有効性を中和するインビボでの治療適用に特に有用である。

ｍｉＲＮＡ及び細胞外小胞（エクソソーム）
研究は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）がエクソソーム内に含まれて体内を移動することを示す。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を調節する小さなノンコーディングＲＮＡである。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、それらが合成される細胞にその効果を発揮し、また細胞外空間に放出され、血液及び尿等の体液中で輸送される。

最近の研究は、ｍｉＲＮＡが、細胞間通信プロセスにおいて機能する小さな細胞由来小胞であるエクソソーム内で、体液中で輸送されるという証拠を明らかにした。細胞外液に放出されると、エクソソームは他の細胞と融合し、それらのカーゴをアクセプター細胞に移す。エクソソームｍｉＲＮＡは、細胞－細胞通信において重要な機能を有し得、疾患を検出及びモニタリングするためのバイオマーカとしての可能性を有し得る。本発明者等は、このエキサイティングな研究分野における最近の進歩を概説する。

ｍｉＲＮＡは活発に小胞に選別される
エクソソームｍｉＲＮＡシグネチャもまた、特定の条件及び疾患下で変化する。例えば、エクソソームのｌｅｔ－７ｆ、ｍｉＲ－２０ｂ及びｍｉＲ－３０ｅ－３ｐのレベルが、小細胞肺癌を有する患者の血漿において変化した。同様に、ｍｉＲ－２１及びｍｉＲ－１４１は、良性腫瘍及び卵巣癌の存在下で変化することが見出されている。

エクソソームｍｉＲＮＡは標的細胞における遺伝子発現を制御する
エクソソームは、細胞間の情報交換において重要な役割を果たす。エクソソームは、放出されると、身体全体を移動した後、それらの内容物をレシピエント細胞に放出する。ｍｉＲＮＡが遺伝子発現を調節するため、ｍｉＲＮＡが標的細胞における遺伝子発現を制御することができる可能性を高める。

エクソソームｍｉＲＮＡがレシピエント細胞において遺伝子発現を有し得る制御の顕著な例が、近年、乳癌エクソソームにおいて明らかにされている。癌エクソソームは、レシピエント細胞において特定のｍＲＮＡを迅速にサイレンシングすることができることが示され、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｉｌｓｉｚ Ｎ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｆｕｔｕｒｅ Ｓｃｉ ＯＡ．２０２０ Ｆｅｂ ２６；６（４）：ＦＳＯ４６５を参照されたい。

治療方法
患者の神経障害を予防又は治療する方法が本明細書で提供される。例えば、神経障害は、外傷性末梢神経損傷、化学療法誘発性末梢神経障害、外傷性脳損傷、脳卒中、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、前頭側頭葉型認知症、ハンチントン病、多発性硬化症、先天性筋無力症、失行、又は筋緊張亢進、重症筋無力症、又は脊髄性筋萎縮症である。

方法は、グリア細胞由来細胞外小胞（例えば、小胞は、ｍｉＲＮＡ－２１、ｍｉＲＮＡ－１３２、ｍｉＲＮＡ－９、ｍｉＲＮＡ－２７ａ、ｍｉＲＮＡ－２２１、ｍｉＲＮＡ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－３６１、ｍｉＲＮＡ－２７４、ｍｉＲ－８７３ａ－５ｐ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９ ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶｒｈ１０、グリア細胞由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、ＧＦＡＰを含む）を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。更なる例示的なカーゴは、Ｇｏｅｔｚｌ ＥＪ，Ｍｕｓｔａｐｉｃ Ｍ，Ｋａｐｏｇｉａｎｎｉｓ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｇｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１６；３０（１１）：３８５３－３８５９に見出すことができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

実施形態では、患者は、組成物を静脈内投与される。実施形態では、グリア細胞由来細胞外小胞は、静脈内、超音波、又は皮下投与によって投与され得る。あるいは、投与は、腹腔内、筋肉内、関節内、動脈内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術であり得る。実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は髄腔内投与によって投与され得る。

組成物は、約１×１０^９～約２×１０^９ゲノムコピー／マウスの範囲で投与され得る。あるいは、組成物は、タンパク質標準と等価な量で投与され得る。体表面積に基づく動物用量のヒト等価用量への変換を以下の表に示す（ＦＤＡ Ｇｕｉｄａｎｃｅ，“Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）Ｊｕｌｙ ２００５ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙに基づき、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
表１．動物用量のヒト等価用量への変換

本明細書に記載の方法によれば、「必要とする対象」は、神経障害（神経性疾患又は障害）を有する対象、又は一般集団と比較して神経障害を発症するリスクが高い対象である。

神経障害の予防又は治療のための有効量は、約０．０１ｎｇ～約１０，０００ｎＭの組成物である。組成物は、約、少なくとも約、又は多くとも約０．０１、１．０、１０．０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００若しくは１００００ｎＭ、又はその中から導き出せる任意の範囲のグリア細胞由来細胞外小胞を含有する濃度からなる。

上記の数値はまた、ｎｇ／ｋｇ、ｍｇ／ｋｇ、又はｇ／ｋｇ、及びそれらの値から導き出せる任意の範囲として表される、患者の体重に基づいて患者に投与される投与量であり得る。組成物は、０．０１、１．０、１０．０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００ｎｇ／ｍｌ、又はその中から導き出せる任意の範囲のエクソソーム濃度を有し得る。有効量は、組成物の約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０，０００ｎｇ／ｍＬである。

実施形態では、組成物（グリア細胞由来細胞外小胞を含む）は、患者に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回若しくはそれを超える回数、又はその中の導き出せる任意の範囲で投与（又は摂取）され得、それらは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７日間、又は１、２、３、４、５週間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月毎、あるいはその中の導き出せる任意の範囲で投与され得る。

実施形態では、組成物は、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、若しくは１日６回（又はその中の導き出せる任意の範囲）並びに／あるいは必要に応じて、患者に投与され得る。

実施形態では、組成物は、患者に、又は患者によって、２、４、６、８、１２又は２４時間（あるいはその中の導き出せる任意の範囲）毎に投与され得る。いくつかの実施形態では、患者は、一定期間又は一定の用量数で組成物を投与される。

実施形態では、組成物（グリア細胞由来細胞外小胞を含む）は、０．００１～１０００ｍｇ／日の量で投与される。実施形態では、組成物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約２５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ、又は範囲の下端が０．００１ｍｇ／ｋｇ～９００ｍｇ／ｋｇの任意の量であり、範囲の上端が０．１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇの任意の量（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ）である任意の範囲で投与される。有効用量はまた、当業者によって認識されるように、治療される疾患、投与経路、賦形剤の使用、及び他の薬剤の使用等の他の治療処置との併用の可能性に応じて変化するであろう。

実施形態では、併用療法を含む方法が提供される。本明細書で使用される場合、「併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ又はｃｏ－ｔｈｅｒａｐｙ）」は、レジメン中の活性薬剤の共作用から有益な効果を提供することを意図した特定の治療レジメン、例えば追加の神経障害治療の一部として、少なくとも１つの追加の活性薬剤と共に、グリア細胞由来細胞外小胞を含む医薬組成物の治療有効量の投与を含む。例示的な更なる治療は、小分子、遺伝子療法（例えば、ＡＬＳのための遺伝子治療には、発現生来型ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ、Ｃ９ＯＲＦ７２が含まれる）又は細胞療法を含み得る。他の例では、ＣＭＴ（シャルコー・マリー・トゥース病１型及び／又は２型）の遺伝子治療、例えば、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）、ＨＧＦ７２８及びＨＧＦ７２３の２つのアイソフォームを同時に発現するように設計されたプラスミドＤＮＡであるＥｎｇｅｎｓｉｓ（ＶＭ２０２）を、特許請求される本発明と組み合わせて使用することができる。

以下の表２は、併用療法として使用することができる神経障害のためのＦＤＡ承認薬物を概説している（Ｖｉｎｉｋ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ．［Ｕｐｄａｔｅｄ ２０１８ Ｆｅｂ ５］．ＭＤＴｅｘｔ．ｃｏｍ，Ｉｎｃ．；２０００－．Ｔａｂｌｅ ７，Ｄｒｕｇｓ Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＦＤＡ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ Ｐａｉｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ：

シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）の治療
他の例では、ＣＭＴのための併用療法は、グリア細胞由来細胞外小胞を含む治療有効量の医薬組成物を、レジメン中の活性薬剤の共作用から有益な効果を提供することを意図した少なくとも１つの更なる治療レジメンと共に投与することを含み得る。追加の治療は、理学療法及び作業療法、装具及び他の整形外科装置を含むことができ、整形外科手術は、人々が疾患の障害の症状に対処するのを助けることができる。更に、疼痛緩和薬は、重度の神経痛を有する個人に処方することができる。他の細胞系治療は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又は造血幹細胞移植を含み得る。更なる例示的な治療法は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｅｎａ Ｊ，Ｇｕｐｔａ Ａ，Ｈｏｙｌｅ ＪＣ．Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ：Ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１９；２０（１４）：３４１９．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１９ Ｊｕｌ １２に記載される。

標的送達のための遺伝子治療
遺伝的神経障害（ＡＬＳ及びシャルコー・マリー・トゥース病等）を標的とするＣＲＩＳＰＲ系遺伝子編集戦略は、これらの重度の神経変性状態を引き起こす遺伝的変異を修正する手段として現在開発中である。例えば、脊髄性筋萎縮症の患者におけるＳＭＮ２発現を回復させるための遺伝子治療の使用のための試験が現在進行中であり、例えば、臨床試験番号：ＮＣＴ０３８３７１８４を参照されたい。同様に、多くの遺伝子修正戦略が、ＡＬＳ及びＣＭＴ患者における遺伝子変異を修正するための手段として学術的環境において有望であることが示されている。例えば、それぞれが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１９ Ｊｕｎ ７；１６：２６－３７．Ｅｐｕｂ ２０１９ Ｆｅｂ １１及びＢｒａｉｎ．２０１９ Ｍａｙ １；１４２（５）：１２２７－１２４１を参照されたい。

そのようなＥＶ媒介治療との治療戦略に関与する併用療法は、回復を更に促進するために、遺伝子治療ベクター及び追加の栄養補助因子を含有するＥＶによる、患者の同時又は逐次治療に関与し得る。あるいは、ＥＶは、ニューロンへのＣＲＩＳＰＲ系又は代替の遺伝子編集機構の標的化送達を促進する手段として使用することができる。ＥＶ表面上の細胞型特異的標的化部分の使用は、目的の細胞型のみへの遺伝子編集機構の送達を確実にするために使用することができ、それによって標的外編集及び／又は非標的組織における予測不可能な結果のリスクを制限する。

例えば、グリア細胞由来エクソソーム（又はグリア細胞由来細胞外小胞）は、目的の標的細胞に遺伝子編集ツールを送達するために、例えば、目的の特定のタンパク質の発現を回復又は減少させるために使用され得る。

例えば、遺伝子編集ツールは、遺伝子編集タンパク質（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＭｅｇａＴＡＬ、Ｃａｓタンパク質、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、又はＦｌｐリコンビナーゼ）、ＲＮＡ分子及び／又はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含み得る。例えば、ＲＮＰは、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質又はその変異体である。例示的なＣａｓタンパク質（Ｃａｓ９及びＣａｓ９変異体の非限定的な例を含む）を以下に記載する。

他の例では、遺伝子編集組成物は、細胞内のＤＮＡの一本鎖又は二本鎖の切断を誘導する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集組成物は、修復テンプレートポリヌクレオチドを更に含む。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用した遺伝子編集（修復テンプレートを含む）に関する非限定的な説明は、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１－２３０８で論じられ、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。修復テンプレートに関与する実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含むものに限定されない。

Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓｌ、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓｉｏ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎｌ及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、又はそれらの改変型が挙げられる。これらの酵素は公知であり、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース及びアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２．１としてＮＣＢＩデータベースに見出すことができる。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースアクセッション番号Ａ０Ａ０Ｇ４ＤＥＵ５及びＣＤＪ５５０３２は、Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列の別の例を提供する。別の非限定的な例は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質であり、そのアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｑ０３ＪＩ６．１の下でＵｎｉＰｒｏｔデータベースに見出すことができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９等の非改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ切断活性を有する。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又はＳ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のＣａｓ９であり得る。様々な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内等の標的配列の位置で、一方又は両方の鎖の切断を指示する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００又はそれを超える塩基対内で一方又は両方の鎖の切断を指示する。いくつかの実施形態では、ベクターは、変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に対して変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９のＲｕｖＣＩ触媒ドメインにおけるアスパルタートからアラニンへの置換は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼに変換する（一本鎖を切断する）。Ｃａｓ９をニッカーゼにする変異の他の例としては、限定されないが、ＩＩ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ及びＮ８６３Ａが挙げられる。本発明の態様では、相同組換えによるゲノム編集のためにニッカーゼを使用することができる。

したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば「コドン使用頻度データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は多数の方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００” Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）等、特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である。いくつかの実施形態では、配列中の１つ又は複数のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、又はそれを超えるか、あるいは全てのコドン）は、特定のアミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンに対応するＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。

他の例では、ＥＶは、ＣＭＴのための、ニューロンへのＣＲＩＳＰＲベース又は代替の遺伝子編集機構の標的化送達を促進する手段として使用することができる。ＣＭＴは異質性の疾患であり、それに関連する変異はいくつかの異なる遺伝子で起こり得る。影響を受ける遺伝子に応じて、ＣＭＴはいくつかのタイプ及びサブタイプに分けられる。ＣＭＴの最も一般的な原因は、ＰＭＰ２２遺伝子の重複である。他の変異は、ミトコンドリアタンパク質をコードするＭＦＮ２遺伝子に影響を及ぼし、それ自体の融合又は凝集を妨げる。これにより、ミトコンドリアは軸索に沿ってシナプスに向かって移動することができない。本明細書に記載の遺伝子編集ツールを使用して対処することができる例示的なＣＭＴ変異（グリア細胞由来細胞外小胞又はグリア細胞由来エクソソームを使用）としては、ＣＭＴ１型変異－ＣＭＴ１Ａ（ＰＭＰ２２変異）、ＣＭＴ１Ｂ（ＭＰＺ変異）、ＣＭＴ１Ｃ（ＬＩＴＡＦ変異）、ＣＭＴ１Ｄ（ＥＧＲ２変異）、ＣＭＴ１Ｅ（ＰＭＰ２２変異）、又はＣＭＴ２型変異－ＣＭＴ２Ａ（ＭＦＮ２変異）、ＣＭＴ２Ｂ（ＲＡＢ７Ａ変異）、ＣＭＴ２Ｃ（ＴＲＰＶ４変異）、ＣＭＴ２Ｄ（ＧＡＲＳ変異）、ＣＭＴ２Ｅ（ＮＥＦＬ変異）、ＣＭＴ２Ｆ（ＨＳＰＢ１変異）、ＣＭＴ２Ｇ（１２ｑ１２－ｑ１３変異）、ＣＭＴ２Ｈ（ＧＤＡＰ１変異）、ＣＭＴ２Ｌ（ＨＳＰＢ８変異）、ＣＭＴ２Ｎ（ＡＡＲＳ変異）、ＣＭＴ２Ｍ（ＤＭＮ変異）が挙げられる。

機能的成熟
本明細書に示されるように、本技術は、ニューロン培養の生存力及び機能性のためのグリア細胞由来ＥＶの特有の組み合わせ及び処置条件に由来する。他の例では、この技術は、心筋細胞、肝細胞、ニューロン、及び他の細胞型のための、人工多能性幹細胞、細胞リプログラミング、及びｉＰＳＣ市場に関連する。

治療剤に関して、組み合わせの有益な効果には、治療活性化合物の組み合わせから生じる薬物動態学的又は薬力学的共作用が含まれるが、これらに限定されない。非治療薬に関して、組み合わせの有益な効果は、組み合わせ中の治療剤に関連する毒性、副作用、又は有害事象の緩和に関連し得る。

本発明の他の特徴及び利点は、様々な例から明らかである。提供される例は、本発明を実施するのに有用な様々な構成要素及び方法論を示す。例は、特許請求される発明を限定しない。本開示に基づいて、当業者は、本発明を実施するのに有用な他の構成要素及び方法論を特定し、使用することができる。

キット
態様では、グリア細胞由来細胞外小胞及び試薬を含むキットが提供される。

実施形態では、キット中のグリア細胞由来細胞外小胞は、対象への送達（例えば、局所注射）に適している。

本発明はまた、本発明の方法で使用するための医薬組成物を含む包装及びキットを提供する。キットは、ボトル、バイアル、アンプル、ブリスターパック、及びシリンジからなる群から選択される１つ又は複数の容器を含むことができる。

キットは、本発明の疾患、状態又は障害（例えば、神経性疾患又は障害）を治療及び／又は予防するのに使用するための説明書、１つ又は複数のシリンジ、１つ又は複数のアプリケータ、あるいは本発明の医薬組成物を再構成するのに適した滅菌溶液のうちの１つ又は複数を更に含むことができる。

一般的な定義
以下の定義は、本主題を理解する目的及び添付の特許請求の範囲を構成する目的で含まれる。本明細書で使用される略語は、化学及び生物学の分野における従来の意味を有する。

本発明の様々な実施形態及び態様が本明細書に示され説明されているが、そのような実施形態及び態様が単なる例として提供されていることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更、及び置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されるべきである。

本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためだけであり、記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。限定するものではないが、特許、特許出願、論文、書籍、マニュアル、及び論説を含む、本出願で引用された全ての文書又は文書の一部は、任意の目的のためにその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、通常の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）を参照されたい。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法、装置及び材料を、本発明の実施において使用することができる。以下の定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供され、本開示の範囲を限定することを意味しない。

「疾患」という用語は、哺乳動物の正常な健康状態からのいずれかの逸脱を指し、疾患症状が存在する時の状態、及び逸脱（例えば、神経障害、特にＰＮＳ神経障害）が生じているが症状はまだ現れていない状態を含む。

「ニューロン損傷」及び「損傷」という用語は、本明細書では互換的に使用されることが多い。「神経外傷」は「ニューロン損傷」の一形態であり、一般に同義語と見なすことができる。「ニューロン損傷」は、神経組織の一部の破壊又は死を引き起こす損傷である。ニューロン損傷は、一般に、続発症としていくらかの喪失、例えば精神機能、感覚機能又は筋肉機能の低下を有する。したがって、本明細書に記載の組成物は、ニューロン損傷を治療又は予防するために使用され得る。例えば、外傷性損傷は、ニューロンにおいて重度のストレス及びアポトーシス応答を引き起こし得る。本明細書のデータは、ＥＶがアポトーシスを阻害し、したがってＣＮＳに対する物理的外傷の治療に有益であり得ることを示した。

「患者」又は「それを必要とする対象」は、示された障害に罹患している又は罹患し得る動物界の生存しているメンバを指す。実施形態では、対象は、疾患に自然に罹患し得る個体を含む種のメンバである。実施形態では、対象は、哺乳動物である。哺乳動物の非限定的な例としては、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）、霊長類（例えば、キツネザル、ブッシュベビー、サル、類人猿、及びヒト）、ウサギ、イヌ（例えば、コンパニオン犬、サービス犬、又は警察犬、軍用犬、レース犬、若しくはショードック等の作業犬）、ウマ（例えば、レース用ウマ及び作業用ウマ）、ネコ（例えば、飼い慣らされたネコ）、家畜（例えば、ブタ、ウシ、ロバ、ラバ、バイソン、ヤギ、ラクダ及びヒツジ）及びシカが挙げられる。実施形態では、対象は、ヒトである。

「対象」、「患者」、「個体」等の用語は、限定することを意図するものではなく、一般に交換することができる。すなわち、「患者」として記載された個体は、必ずしも所与の疾患を有するとは限らず、単に医学的な助言を求めるだけであってもよい。

移行句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素又は方法工程を排除しない。対照的に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という移行句は、特許請求の範囲で指定されていないあらゆる要素、工程、又は成分を除外する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句は、特許請求の範囲を、特定の材料又は工程、及び「特許請求される発明の基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないもの」に限定する。

本明細書の説明及び特許請求の範囲において、「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｏｆ）」又は「１つ又は複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｏｆ）」等の語句が出現し、その後に要素又は特徴の連言的なリストが続き得る。「及び／又は」という用語はまた、２つ以上の要素又は特徴のリストに出現し得る。そのような語句は、それが使用される文脈によって暗黙的又は明示的に矛盾しない限り、列挙された要素又は特徴のいずれかを個別に、又は列挙された要素又は特徴のいずれかを他の列挙された要素又は特徴のいずれかと組み合わせて意味することを意図している。例えば、句「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」、「Ａ及びＢのうちの１つ又は複数」及び「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれ「Ａ単独、Ｂ単独、又はＡとＢとを一緒に」を意味することを意図している。３つ以上の項目を含むリストについても同様の解釈が意図される。例えば、句「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの１つ又は複数」、及び「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」は、それぞれ「Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢを一緒に、ＡとＣ一緒に、ＢとＣ一緒に、又はＡとＢとＣを一緒に」を意味することが意図されている。更に、上記及び特許請求の範囲における「に基づいて」という用語の使用は、列挙されていない特徴又は要素も許容されるように、「少なくとも部分的に基づいて」を意味することを意図している。

「外因性」という用語は、細胞又はエクソソームが、その天然若しくは野生型状態で通常関連していないか、又は発現していないタンパク質を指す。

本明細書で使用される場合、融合タンパク質は、キメラタンパク質としても知られており、別個のタンパク質を元々コードしていた２つ以上の遺伝子の結合によって作製されたタンパク質である。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。組換え融合タンパク質は、生物学的研究又は治療に使用するための組換えＤＮＡ技術によって人工的に作製することができる。キメラ変異タンパク質は、大規模変異、典型的には染色体転座が、２つの異なる遺伝子由来のコード配列の一部を含む新規コード配列を作成する場合に天然に生じる。融合タンパク質の機能性は、多くのタンパク質機能性ドメインがモジュールであるという事実によって可能になる。言い換えれば、所与のドメイン（例えば、チロシンキナーゼドメイン等）に対応するポリペプチドの直鎖部分は、その固有の酵素能力を破壊することなく、タンパク質の残りの部分から除去され得る。

組換え融合タンパク質は、融合遺伝子の遺伝子工学によって作製されたタンパク質である。これは、典型的には、第１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、次いで、ライゲーション又はオーバーラップ伸長ＰＣＲによって第２のタンパク質のｃＤＮＡ配列をインフレームで付加することを含む。次いで、そのＤＮＡ配列は、単一のタンパク質として細胞によって発現される。タンパク質は、両方の元のタンパク質の完全な配列、又はいずれかの一部のみを含むように操作することができる。

パラメータ範囲が提供される場合、その範囲内の全ての整数、及びその１０分の１も本発明によって提供されることが理解される。例えば、「０．２～５ｍｇ」は、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ等、５．０ｍｇを含む最大５．０ｍｇの開示である。

本明細書の説明及び以下の特許請求の範囲を通して使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。

本明細書で使用される場合、状態、疾患若しくは障害、又は状態、疾患若しくは障害に関連する症状の「治療すること」又は「治療」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るための手法を指す。有益な又は所望の臨床結果としては、限定されないが、１つ又は複数の症状又は状態の緩和又は改善、状態、障害又は疾患の程度の縮小、状態、障害又は疾患の状態の安定化、状態、障害又は疾患の発症の予防、状態、障害又は疾患の伝播の予防、状態、障害又は疾患の進行の遅滞又は遅延、状態、障害又は疾患の発症の遅延又は遅延、状態、障害又は疾患の状態の改善又は緩和、並びに部分的若しくは全体的にかかわらず寛解を挙げることができる。「治療すること」はまた、状態、障害又は疾患の進行を阻害すること、状態、障害又は疾患の進行を一時的に遅らせることを意味し得るが、場合によっては、状態、障害又は疾患の進行を永続的に停止させることを含む。

本明細書で使用される場合、用語「治療する」及び「予防する」は、絶対的な用語であることを意図しない。様々な実施形態では、治療は、確立された疾患、状態、又は疾患若しくは状態の症状の重症度の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の減少を指し得る。実施形態では、疾患を治療するための方法は、対照と比較して、対象において疾患の１つ又は複数の症状が１０％低下する場合、治療であると見なされる。したがって、低下は、天然又は対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１０％～１００％の任意の百分率の低下であり得る。治療は、必ずしも疾患、状態、又は疾患若しくは状態の症状の治癒又は完全な消失を意味しないことが理解される。実施形態では、減少、低下又は阻害への言及は、対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超える変化を含み、そのような用語は完全な排除を含むことができるが、必ずしも含むわけではない。実施形態では、疾患の重症度は、例えば、投与前の個体又は治療を受けていない対照個体と比較して、少なくとも１０％低下する。いくつかの態様では、疾患の重症度は、少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、又は９０％低下し、又は場合によっては、標準的な診断技術を使用してもはや検出できない。

「有効量」、「有効用量」等の用語は、本明細書に記載されるように、所望の効果を達成するのに十分な薬剤の量を指す。実施形態では、細胞又は治療化合物の量に言及する場合の「有効な」という用語は、本開示の様式で使用した場合の合理的な利益／リスク比に見合った、過度の有害な副作用（毒性、刺激、又はアレルギー反応等）なしに改善又は所望の治療応答を得るのに十分な細胞又は化合物の量を指し得る。実施形態では、所望の細胞集団の生成に言及する場合の「有効な」という用語は、特に１つ又は複数の化合物を欠く培養条件と比較して、所望の細胞集団のメンバの製造が生じるか又は促進するのに十分な１つ又は複数の化合物の量を指し得る。

本明細書で使用される場合、「単離された」又は「精製された」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はタンパク質は、組換え技術によって産生される場合、他の細胞材料又は培養培地を実質的に含まないか、又は化学合成される場合、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。精製化合物は、目的の化合物の少なくとも６０重量％（乾燥重量）である。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％の目的の化合物である。例えば、精製化合物は、所望の化合物の少なくとも９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％、又は１００重量％（ｗ／ｗ）である化合物である。純度は、任意の適切な標準的方法によって、例えばカラムクロマトグラフィ、薄層クロマトグラフィ又は高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析によって測定される。精製又は単離されたポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）は、その天然に存在する状態でそれに隣接する遺伝子又は配列を含まない。精製はまた、ヒト対象への投与に安全な程度の無菌性、例えば感染性又は毒性因子を欠くことを定義する。

特定の例では、使用されるＥＶ回収方法は、他の粒子（細胞片、アポトーシス小体等）を除去するための遠心力に基づいており、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％純粋である。細胞外小胞を実質的に精製することもできる。本明細書で使用される「実質的に精製された」という用語は、試料における実質的に濃縮された細胞外小胞又はエクソソームを指し得る。試料は、試料が少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はそれを超える所望の細胞外小胞又はエクソソーム、あるいは約４０％、３０％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満の望ましくない又は他の細胞外小胞又はエクソソームが存在するように、目的の細胞外小胞又はエクソソームのために実質的に精製又は濃縮することができる。例示的な実施形態では、組成物は、実質的に精製された細胞外小胞を含む。他の実施形態では、組成物は、実質的に精製されたエクソソームを含む。他の例では、組成物は、実質的に精製されたグリア細胞由来細胞外小胞及び少なくとも１つの実質的に精製されたグリア細胞由来エクソソームを含む。別の実施形態は、治療有効量の実質的に精製されたグリア細胞由来細胞外小胞又はグリア細胞由来エクソソームを含む、対象における神経障害を治療又は予防するための医薬組成物に関する。

同様に、「実質的に純粋」は、天然に付随する構成要素から分離されたヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。典型的には、ヌクレオチド及びポリペプチドは、それらが少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、又は更には９９重量％、それらが天然に会合するタンパク質及び天然に存在する有機分子を含まない場合、実質的に純粋である。

「対照」の試料又は値は、試験試料と比較するための参照、通常は既知の参照として機能する試料を指す。例えば、試験試料は、試験対象、例えば、神経障害を有する対象から採取され得、公知の状態、例えば、神経障害を有さない対象（複数可）（陰性対照又は正常対照）又は神経障害を有する対象（複数可）（陽性対照）からの試料と比較され得る。対照はまた、多数の試験又は結果から回収された平均値を表すことができる。当業者は、任意の数のパラメータの評価のために対照を設計することができることを認識するであろう。当業者は、どの対照が所与の状況で価値があるかを理解し、対照値との比較に基づいてデータを分析することができる。対照は、データの有意性を決定するためにも有益である。例えば、所与のパラメータの値が対照において可変である場合、試験試料の変動は有意であると見なされない。

化合物（例えば、タンパク質又はｍＲＮＡ）に関する「正常量」という用語は、健康又は一般集団において神経障害を有さない個体における化合物の正常量を指す。化合物の量は、試験試料中で測定し、基準限界、識別限界、又はリスクを定義する閾値等の技術を利用して「正常対照」レベルと比較して、カットオフポイント及び異常値（例えば、神経障害又はその症状に関する）を定義することができる。正常対照レベルは、神経障害に罹患していないことが知られている対象に典型的に見られる１つ又は複数の化合物又は組み合わせた化合物のレベルを意味する。そのような正常対照レベル及びカットオフポイントは、化合物が単独で使用されるか、又は他の化合物と指数に組み合わせる式で使用されるかに基づいて変化し得る。あるいは、正常対照レベルは、臨床的に関連する計画対象期間にわたって神経障害又はその特定の症状（例えば、神経障害が発症した場合、又は既に神経障害を有する対象が試験された場合）を発症しなかった、以前に試験された対象からの化合物パターンのデータベースであり得る。

決定されるレベルは、制御レベル又はカットオフレベル又は閾値レベルと同じであり得るか、あるいは制御レベル又はカットオフレベル又は閾値レベルに対して増減され得る。いくつかの態様では、対照対象は、同じ種、性別、民族、年齢群、喫煙状態、肥満度指数（ＢＭＩ）、現在の治療レジメン状態、病歴、又はそれらの組み合わせの一致対照であるが、対照が問題の疾患（又はその症状）に罹患していないか、又は疾患のリスクがないという点で、診断されている対象とは異なる。

対照レベルと比較して、決定されるレベルは増加したレベルであり得る。本明細書で使用される場合、レベル（例えば、タンパク質又はｍＲＮＡレベル）に関して「増加した」という用語は、対照レベルを超える任意の％の増加を指す。様々な実施形態では、増加したレベルは、対照レベルと比較して、少なくとも又は約５％の増加、少なくとも又は約１０％の増加、少なくとも又は約１５％の増加、少なくとも又は約２０％の増加、少なくとも又は約２５％の増加、少なくとも又は約３０％の増加、少なくとも又は約３５％の増加、少なくとも又は約４０％の増加、少なくとも又は約４５％の増加、少なくとも又は約５０％の増加、少なくとも又は約５５％の増加、少なくとも又は約６０％の増加、少なくとも又は約６５％の増加、少なくとも又は約７０％の増加、少なくとも又は約７５％の増加、少なくとも又は約８０％の増加、少なくとも又は約８５％の増加、少なくとも又は約９０％の増加、少なくとも又は約９５％の増加であり得る。

対照レベルと比較して、決定されるレベルは低下したレベルであり得る。本明細書で使用される場合、レベル（例えば、タンパク質又はｍＲＮＡレベル）に関して「減少した」という用語は、対照レベルを下回る任意の％の減少を指す。様々な実施形態では、減少したレベルは、対照レベルと比較して、少なくとも又は約５％の減少、少なくとも又は約１０％の減少、少なくとも又は約１５％の減少、少なくとも又は約２０％の減少、少なくとも又は約２５％の減少、少なくとも又は約３０％の減少、少なくとも又は約３５％の減少、少なくとも又は約４０％の減少、少なくとも又は約４５％の減少、少なくとも又は約５０％の減少、少なくとも又は約５５％の減少、少なくとも又は約６０％の減少、少なくとも又は約６５％の減少、少なくとも又は約７０％の減少、少なくとも又は約７５％の減少、少なくとも又は約８０％の減少、少なくとも又は約８５％の減少、少なくとも又は約９０％の減少、少なくとも又は約９５％の減少であり得る。

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用され、ポリマーは、実施形態では、アミノ酸から構成されない部分にコンジュゲートされ得る。この用語はまた、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーにも適用される。「融合タンパク質」は、単一部分として組換え発現又は化学合成される２つ以上の別個のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。

「ポリペプチド断片」は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指し、残りのアミノ酸配列は、通常、天然に存在する配列の対応する位置と同一である。断片は、典型的には、少なくとも５、６、８又は１０アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、又は少なくとも７０アミノ酸長である。

「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。実施形態では、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって、百分率を計算する。

２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」という用語又は「同一性」百分率は、配列比較アルゴリズムを使用して、又はマニュアルアライメント及び目視検査によって測定した場合に、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたって、最大の対応関係のために、比較又はアライメントした場合、同じであるか、又は指定された百分率の同じアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する、２つ以上の配列又は部分列（例えば、特定の領域、例えば、ポリペプチド配列全体又はその個々のドメインにわたって、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超える同一性）を指す。実施形態では、２つの配列は１００％同一である。実施形態では、２つの配列は、配列の１つ（例えば、配列が異なる長さを有する場合の２つの配列のうちの短い方）の全長にわたって１００％同一である。実施形態では、同一性は、試験配列の相補体を指し得る。実施形態では、同一性は、少なくとも約１０～約１００、約２０～約７５、約３０～約５０アミノ酸又はヌクレオチド長である領域にわたって存在する。実施形態では、同一性は、少なくとも約５０アミノ酸又はヌクレオチド長である領域にわたって、又はより好ましくは１００～５００、１００～２００、１５０～２００、１７５～２００、１７５～２２５、１７５～２５０、２００～２２５、２００～２５０又はそれを超えるアミノ酸又はヌクレオチド長である領域にわたって存在する。

配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列を比較する参照配列としての役割を果たす。実施形態では、配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトのプログラムパラメータを使用し得、又は代替パラメータを指定し得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性百分率を計算する。

「比較ウィンドウ」は、連続位置の数（例えば、少なくとも約１０～約１００、約２０～約７５、約３０～約５０、１００～５００、１００～２００、１５０～２００、１７５～２００、１７５～２２５、１７５～２５０、２００～２２５、２００～２５０）のいずれか１つのセグメントを指し、ここで、２つの配列が最適にアライメントされた後に、配列が同じ数の連続位置の参照配列と比較され得る。実施形態では、比較ウィンドウは、２つのアライメントされた配列の一方又は両方の全長である。実施形態では、比較されている２つの配列は異なる長さを含み、比較ウィンドウは、２つの配列のうちの長い方又は短い方の全長である。異なる長さの２つの配列に関する実施形態では、比較ウィンドウは、２つの配列のうちの短い方の全長を含む。異なる長さの２つの配列に関する実施形態では、比較ウィンドウは、２つの配列のうちの長い方の全長を含む。

比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似の方法の研究、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実施（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、又はマニュアルアライメント及び目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）によって実行され得る。

配列同一性百分率及び配列類似性百分率を決定するのに適したアルゴリズムの非限定的な例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）にそれぞれ記載される、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０を、本明細書に記載のパラメータと共に使用して、核酸及びタンパク質の配列同一性百分率を決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、当技術分野で知られているように、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から公的に入手可能である。例示的なＢＬＡＳＴアルゴリズムは、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって高スコア配列対（Ｈｉｇｈ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｐａｉｒ：ＨＳＰ）を最初に同定することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントした場合に、一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たす。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上記）と呼ばれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致残基対に対するリワードスコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアマトリックスを使用して累積スコアを計算する。ワードヒットの各方向における拡張は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下した時、累積スコアが１つ又は複数の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積のために０以下になった時、又はいずれかの配列の末端に達した時に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。実施形態では、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して配列をアライメントする。実施形態では、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰプログラムは、ＮＣＢＩによって使用されるデフォルトを使用する。実施形態では、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして以下を使用する。２８のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待閾値（Ｅ）、０に設定された問い合わせ範囲内の最大一致、１、－２の一致／不一致スコア、線形ギャップコスト、使用される低複雑度領域のためのフィルタ、及びルックアップテーブルのみに使用のマスク。実施形態では、ＢＬＡＳＴＰプログラム（アミノ酸配列用）は、デフォルトとして以下を使用する：３のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待閾値（Ｅ）、０に設定された問い合わせ範囲内の最大一致、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２））；存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）：１１及び伸長：１のギャップコスト；及び条件付き組成スコアマトリックス調整。

アミノ酸又はヌクレオチド塩基の「位置」は、Ｎ末端（又は５’末端）に対するその位置に基づいて、参照配列中の各アミノ酸（又はヌクレオチド塩基）を順次同定する番号によって示される。最適なアラインメントを決定する場合に考慮しなければならない欠失、挿入、切断、融合等のために、一般に、Ｎ末端から単純に数えることによって決定される試験配列中のアミノ酸残基の数は、参照配列中のその対応する位置の数と必ずしも同じではないであろう。例えば、アラインメントされた参照配列に対してバリアントが欠失を有する場合、欠失部位の参照配列中の位置に対応するバリアント中のアミノ酸は存在しない。アラインメントされた参照配列中に挿入が存在する場合、その挿入は、参照配列中の番号付けされたアミノ酸位置に対応しない。切断又は融合の場合、対応する配列中のいずれのアミノ酸にも対応しない参照又はアラインメントされた配列中のアミノ酸の伸長が存在し得る。

「～を参照して番号付けされた」又は「～に対応する」という用語は、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合の特定の参照配列の残基の番号付けを指す。

「核酸」は、一本鎖、二本鎖若しくは多鎖形態のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び２’－修飾ヌクレオチド）及びそのポリマー、又はそれらの相補体を指す。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」等の用語は、通常及び通例の意味で、ヌクレオチドの直鎖配列を指す。「ヌクレオチド」という用語は、通常及び通例の意味で、ポリヌクレオチドの単一単位、すなわちモノマーを指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はそれらの修飾バージョンであり得る。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例としては、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が挙げられる。核酸、例えば本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例としては、任意の種類のＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ、並びに任意の種類のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及びミニサークルＤＮＡ、並びにそれらの任意の断片が挙げられる。ポリヌクレオチドの文脈における「二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」という用語は、通常及び通例の意味で、二本鎖性を指す。

核酸、例えばホスホロチオアート骨格を有する核酸は、１つ又は複数の反応性部分を含むことができる。本明細書で使用される場合、反応性部分という用語は、共有結合、非共有結合又は他の相互作用を介して別の分子、例えば核酸又はポリペプチドと反応することができる任意の基を含む。例として、核酸は、共有結合、非共有結合、又は他の相互作用を介してタンパク質又はポリペプチド上のアミノ酸と反応するアミノ酸反応性部分を含むことができる。

これらの用語はまた、既知のヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基若しくは結合を含有する核酸を包含し、これらは合成、天然及び非天然であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。そのような類似体の例としては、限定されないが、例えば、ホスホルアミダート、ホスホロジアミダート、ホスホロチオアート（ホスファートに二重結合した酸素置換硫黄を有するホスホチオアートとしても知られる）、ホスホロジチオアート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシラート、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、メチルホスホナート、ホスホン酸ホウ素、又はＯ－メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）、並びに５－メチルシチジン又はプソイドウリジン等のヌクレオチド塩基への修飾、並びにペプチド核酸骨格及び結合が挙げられる。他の類似体核酸には、正の骨格、非イオン性骨格、修飾糖、及び非リボース骨格（例えば、当技術分野で公知のホスホロジアミダートモルホリノオリゴ又はロック核酸（ＬＮＡ））を有するものが含まれ、米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ６ ａｎｄ ７，ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｓａｎｇｈｕｉ＆Ｃｏｏｋ，ｅｄｓに記載されるものを含んでいる。１つ又は複数の炭素環式糖を含有する核酸も、核酸の一定義内に含まれる。リボース－ホスファート骨格の修飾は、様々な理由で、例えば、生理学的環境において、又はバイオチップ上のプローブとしてそのような分子の安定性及び半減期を増加させるために行われ得る。天然に存在する核酸及び類似体の混合物を作製することができるか、あるいは、異なる核酸類似体の混合物、並びに天然に存在する核酸及び類似体の混合物を作製することができる。実施形態では、ＤＮＡ中のヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、又は両方の組み合わせである。

「作動可能に連結された」は、そのように記載された構成要素が、それらの意図された方法で機能することを可能にする関係にある並列を指す。コード配列に対して「作動可能に連結される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方法で連結される。

本明細書で使用される「スペーサ」は、融合タンパク質を含むタンパク質を合わせるペプチドを指す。一般に、スペーサは、タンパク質を合わせること、又はそれらの間のいくらかの最小距離若しくは他の空間的関係を保存すること以外に、特異的な生物学的活性を有さない。しかし、スペーサの構成アミノ酸は、分子の折畳み、正味電荷、又は疎水性等の分子の何らかの特性に影響を及ぼすように選択されてもよい。

「ベクター」又は「構築物」という用語は、ベクター配列が連結された別の核酸を細胞に輸送することができる核酸配列を指す。「発現ベクター」という用語は、細胞（例えば、転写制御エレメントに連結される）による発現に適した形態の遺伝子構築物を含む任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミド又はファージ染色体）を含む。

本明細書で使用され得る場合、「核酸」、「核酸分子」、「核酸オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸断片」及び「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドのいずれか、並びに／あるいはそれらの類似体、誘導体又は修飾の様々な長さを有し得る、共に共有結合したヌクレオチドのポリマー形態を含むが、これらに限定されないことが意図される。異なるポリヌクレオチドは、異なる三次元構造を有し得、既知又は未知の様々な機能を果たし得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、ゲノムＤＮＡ、ゲノム、ミトコンドリアＤＮＡ、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（限定されないが、ヘテロクロマチンＤＮＡを含む）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離されたＤＮＡ配列、単離されたＲＮＡ配列、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。本開示の方法において有用なポリヌクレオチドは、天然核酸配列及びそのバリアント、人工核酸配列、又はそのような配列の組み合わせを含み得る。

本明細書で使用される「アミノ酸残基」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び非天然アミノ酸の両方を包含する。非天然アミノ酸の例としては、Ｄ－アミノ酸（すなわち、天然に存在する形態とは反対のキラリティのアミノ酸）、Ｎ－α－メチルアミノ酸、Ｃ－α－メチルアミノ酸、β－メチルアミノ酸及びＤ－又はＬ－β－アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の非天然アミノ酸としては、例えば、β－アラニン（β－Ａｌａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ホモアルギニン（Ｈａｒ）、４－アミノ酪酸（γ－Ａｂｕ）、２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、６－アミノヘキサン酸（ε－Ａｈｘ）、オルニチン（ｏｒｎ）、サルコシン、α－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸（２，３－ｄｉａＰ）、Ｄ－又はＬ－フェニルグリシン、Ｄ－（トリフルオロメチル）－フェニルアラニン、及びＤ－ｐ－フルオロフェニルアラニンが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ペプチド結合」は、天然に存在するペプチド結合又は非天然（すなわち、修飾された）ペプチド結合であり得る。適切な修飾ペプチド結合の例は当技術分野で周知であり、－ＣＨ_２ＮＨ－、－ＣＨ_２Ｓ－、－ＣＨ_２ＣＨ_２－、－ＣＨ＝ＣＨ－（シス又はトランス）、－ＣＯＣＨ_２－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＳＯ－、－ＣＳ－ＮＨ－及び－ＮＨ－ＣＯ－（すなわち、逆ペプチド結合）（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．ｐｐ．４６３－４６８（１９８０）；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７－１８５（１９７９）；Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８：１２４３－１２４９（１９８６）；Ｈａｎｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ ３０７－３１４（１９８２）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２－１３９８（１９８０）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ－Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３：２５３３（１９８２）；Ｓｚｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ ４５６６５（１９８２）；Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４：４４０１－４４０４（１９８３）；及びＨｒｕｂｙ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３１：１８９－１９９（１９８２）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。

ポリヌクレオチドは、典型的には、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；及びチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミン（Ｔ）についてはウラシル（Ｕ））の特定の配列から構成される。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示であるか、あるいは、この用語は、ポリヌクレオチド分子自体に適用され得る。このアルファベット表示は、中央処理ユニットを有するコンピュータ内のデータベースに入力することができ、機能ゲノミクス及び相同性検索等のバイオインフォマティクス用途に使用することができる。ポリヌクレオチドは、場合により、１つ又は複数の非標準ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及び／又は修飾ヌクレオチドを含み得る。

医薬組成物及び製剤
本発明は、有効量の組成物（例えば、グリア細胞由来細胞外小胞を含む組成物）及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物を提供し、有効量は、本発明の方法に関連して上述した通りである。

一実施形態では、組成物（例えば、グリア細胞由来細胞外小胞を含む組成物）は、単一用量形態で少なくとも１つの更なる治療剤と更に組み合わされる。一実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、ガバペンチン、プレガバリン、ラモトリギン、カルバマゼピン、デュロキセチン、リドカイン、オピオプド（ｏｐｉｏｐｄ）鎮痛薬、トラマドール塩酸塩、三環系抗うつ薬（ノルチピリン塩酸塩又はデシプラミン塩酸塩）、デュロキセチン（セロトニン／ノルエピネフリン再取込み阻害剤）、フルオキセチン、又はタペンタドールを含む。

「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしにヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適した、化合物、物質、組成物、担体、及び／又は剤形を指す。

「薬学的に許容される賦形剤」は、一般に安全で、非毒性であり、生物学的にも他の点でも望ましくないものでもない医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を意味し、獣医学的使用及びヒト医薬使用に許容される賦形剤を含む。薬学的に許容される賦形剤の例には、滅菌液体、水、緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、油、洗剤、懸濁化剤、炭水化物（例えば、グルコース、ラクトース、スクロース又はデキストラン）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸又はグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、又はそれらの適切な混合物が含まれるが、これらに限定されない。

医薬組成物は、バルク又は用量単位形態で提供され得る。投与の容易さ及び用量の均一性のために、医薬組成物を用量単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される「用量単位形態」という用語は、治療される対象のための単位用量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要とされる医薬担体と会合して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の用量単位形態の仕様は、活性化合物の固有の特徴及び達成されるべき特定の治療効果によって決定され、それらに直接依存する。用量単位形態は、アンプル、バイアル、坐剤、糖衣錠、錠剤、カプセル、ＩＶバッグ、又はエアロゾル吸入器上の単一ポンプであり得る。

治療用途では、用量は、選択された用量に影響を及ぼす他の要因の中でも、薬剤、レシピエント患者の年齢、体重及び臨床状態、並びに治療を投与する臨床医又は開業医の経験及び判断に応じて変化する。一般に、用量は治療有効量であるべきである。用量は、ｍｇ／ｋｇ／日の測定単位（用量は、患者の体重（ｋｇ）、体表面積（ｍ^２）、及び年齢（年）に合わせて調整され得る）で提供することができる。筋疾患又は筋障害を治療する方法における組成物の例示的な用量及び投与レジメンが本明細書に記載されている。

医薬組成物は、任意の所望の経路（例えば、肺、吸入、鼻腔内、経口、頬側、舌下、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸膜内、髄腔内、経皮、経粘膜、直腸等）による投与のための任意の適切な形態（例えば、液体、エアロゾル、溶液、吸入剤、ミスト、スプレー、又は固体、粉末、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、パッチ等）をとることができる。例えば、本発明の医薬組成物は、吸入又は吹送（口又は鼻のいずれか）によるエアロゾル投与のための水溶液又は粉末の形態、経口投与のための錠剤又はカプセルの形態、直接注射又は静脈内注入のための滅菌注入液への添加による投与に適した滅菌水溶液又は分散液の形態、あるいは経皮又は経粘膜投与用のローション、クリーム、フォーム、パッチ、懸濁液、溶液又は坐剤の形態であり得る。

実施形態では、医薬組成物は、注射可能な形態を含む。

医薬組成物は、限定するものではないが、カプセル、錠剤、頬側形態、トローチ、薬用ドロップ、及びエマルジョン、水性懸濁液、分散液又は溶液の形態の経口液体を含む経口的に許容される剤形の形態とすることができる。カプセルは、本発明の化合物と、不活性充填剤及び／又は希釈剤、例えば薬学的に許容されるデンプン（例えば、トウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）、糖、人工甘味料、粉末セルロース、例えば結晶性及び微結晶性セルロース、小麦粉、ゼラチン、ガム等と、との混合物を含有し得る。

医薬組成物は、非経口投与に適した滅菌水溶液又は分散液の形態とすることができる。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術を含む。

医薬組成物は、直接注射又は静脈内注入のための滅菌注入液への添加のどちらかによる投与に適した滅菌水溶液又は分散液の形態であり得、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物、あるいは１つ又は複数の植物油を含有する溶媒又は分散媒を含む。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての本発明の化合物の溶液又は懸濁液は、界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。適切な界面活性剤の例を以下に示す。分散液は、例えば、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及び油中のそれらの混合物中で調製することもできる。

本発明の方法で使用するための医薬組成物は、製剤中に存在する任意の担体又は希釈剤（ラクトース又はマンニトール等）に加えて、１つ又は複数の添加剤を更に含むことができる。１つ又は複数の添加剤は、１つ又は複数の界面活性剤を含むか、又は１つ又は複数の界面活性剤からなることができる。界面活性剤は、典型的には、細胞の脂質構造に直接挿入して薬物透過及び吸収を増強することを可能にする脂肪酸等の１つ又は複数の長脂肪族鎖を有する。界面活性剤の相対的な親水性及び疎水性を特性決定するために一般的に使用される経験的パラメータは、親水性－親油性バランス（「ＨＬＢ」値）である。界面活性剤のＨＬＢ値が低いほどより疎水性であり、油中の溶解度がより大きく、一方界面活性剤のＨＬＢ値が高いほどより親水性であり、水溶液中の溶解度はより大きい。したがって、親水性界面活性剤は、一般に、ＨＬＢ値が約１０を超える化合物であり、疎水性界面活性剤は、一般に、ＨＬＢ値が約１０未満の化合物であると考えられる。しかし、多くの界面活性剤では、ＨＬＢ値を決定するために選択された経験的方法に応じて、ＨＬＢ値は約８ＨＬＢ単位も異なり得るので、これらのＨＬＢ値は単なる指針である。本明細書で使用される全ての百分率及び比は、特に明記しない限り、重量基準である。

以下の実施例は、本発明のある種の特定の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

本明細書の実施形態は、以下の実施例及び詳細なプロトコルによって更に説明される。しかし、実施例は、単に実施形態を例示することを意図しており、本明細書の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本出願を通して引用された全ての参考文献並びに公開された特許及び特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１：ニューロゲニン２導入遺伝子形質導入ｈｉＰＳＣからのヒト皮質ニューロンの分化
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンのインビトロ適用は、高い生産コスト及び遅い分化速度と相まって、それらが不均一であり電気生理学的に未熟であったため、制限されてきた。この問題に対処するため、ヒトｉＰＳＣから急速に分化した未成熟ニューロンに適用した場合の、グリア細胞由来ＥＶの効果を調査した。Ｗａｎｇらは、幹細胞の皮質ニューロンへの迅速な変換を促進する転写因子である、ドキシサイクリン誘導性ニューロゲニン２導入遺伝子を有するｉＰＳＣ株を以前に開発した。^{２３、２４}これらの細胞では、ｉＰＳＣの単一細胞解離後２４時間ドキシサイクリンを適用することによってニューロン分化を誘導し、初期段階のニューロンを特異的誘導培地に更に４８時間曝露することによって完了する。次いで、これに続いて、３日目以降の維持のために、ＢＤＮＦ、Ｂ２７、ラミニンを補充した培地に交換する（図１Ａ）。

誘導後の最初の２４時間の期間において、幹細胞は急速に分極し、初期の神経突起伸長を示す成長円錐を示し始めた。３日目までに、神経突起成長がより明らかになり、各細胞における明確な軸索伸長が観察された。７日目の細胞は、非常に長い軸索及び樹状突起を特徴とする典型的なニューロン形態を獲得し、それらの隣接する細胞及び小さな明確な体細胞に接近している（図１Ｂ）。分化したニューロンを、免疫細胞化学による分析のために３日目にラミニン被覆アッセイプレートに移すか、又は更なる成熟のために維持した。全体的な分化期間は、４～６週間かかり得る従来のヒトｉＰＳＣ由来ニューロン分化で必要とされるものよりも劇的に短かった。^{２５－２７}これらの細胞から回収された免疫細胞化学データは、各実験バッチから生成された皮質ニューロンにおける高度の均一性を実証し（ｎ＝５）、ヒトニューロン分化の再現性の有意な向上を示している。特に、試験した細胞の大部分で観察されたＣＵＸ－１の均一な発現は、大脳皮質の層２及び３に特異的な錐体皮質ニューロンの生成の成功を実証した。免疫細胞化学の結果は、内在化ＥＶの効果を試験するための、分化したニューロンを生成するための記載された方法の信頼性を強調している（図１Ｃ）。

実施例２：ヒトアストロサイト由来ＥＶの回収及び特性決定
哺乳動物ＣＮＳ内では、ＥＶは、ニューロン、神経幹細胞、並びにミクログリア、オリゴデンドロサイト、及びアストロサイト等の主要なグリア細胞型を含む、ほぼ全ての種類の細胞によって放出されることが知られている。^{２０、２８－３０}アストロサイト由来のＥＶがニューロンにおいて内在化され得ることが実証されているが、ニューロンの生存及び機能に対するそれらの具体的な生理学的影響はまだ完全には理解されていない。この問題に対処するために、ニューロン生存、神経突起伸長、及び電気生理学的挙動に対するアストロサイト由来ＥＶの生理学的効果を調査した。アストロサイト細胞質に主に発現することが知られている、２つのグリア細胞特異的タンパク質マーカである、ＧＦＡＰ及びＳ１００Ｂの免疫染色を使用して、培養アストロサイト集団の均一性を確認した（図２Ａ及び図２Ｂ）。^{３１、３２}アストロサイトをＥＶ回収前に８４時間培養し、様々な遠心力を伴う一連の超遠心分離工程を使用して精製して、非ＥＶ要素を培養培地から取り除いた（図７）。複数のバッチから回収したＥＶを、分析した全ての粒子の粒度分布及び密度情報を提供したナノ粒子追跡分析を使用して特性決定した。アッセイ溶液中の回収されたＥＶのブラウン運動をレーザーによって追跡して、それらのブラウン運動の速度を粒径と相関させた。ＥＶ溶液中の粒径は１５４．６±４．３６ｎｍであり、密度は１．５×１０９粒子／ｍＬであった（図２Ｃ並びに図８Ａ及び８Ｂ）。

死細胞片、アポトーシス小体及び微小胞等の非ＥＶ構成要素の大部分は、全てＥＶよりも大きいサイズを有することが知られている。したがって、回収されたデータは、ＥＶ回収プロセス中にこれらの要素の除去が成功したことを示した。

異なるインキュベーション時間後の培養培地中の分泌ＥＶの数を調査した。回収されたＥＶの数は、アストロサイトが培養において連続的に増殖するが、おそらく比較的一貫したＥＶ分泌速度を維持するため、アストロサイトのインキュベーション時間に線形に比例した。アストロサイト培養の４８時間と８４時間で回収されたＥＶの数に有意差はなかったが、全ての培養物を８４時間まで維持して、細胞がコンフルエントを超えて悪化し始める前に、ＥＶの最大数を得た（図２Ｅ）。

実施例３：分化した皮質ニューロンはアストロサイト由来ＥＶを容易に取り込む
グリア細胞由来のＥＶは、レシピエントニューロンの表現型に有意な影響を及ぼし得る様々なタンパク質及びＲＮＡを封入し得る。^{１５、１９、２１、３３}それらのカーゴ分子をレシピエント細胞に送達するために、ＥＶ及びニューロンの両方の膜上の膜貫通タンパク質は、それらの相互作用を開始して小胞を細胞に内在化するか、又は直接的エンドサイトーシス取込み後にエンドソーム膜と相互作用する。^１４哺乳動物細胞によるＥＶ取込みの基礎となる分子機構は完全には理解されておらず、グリア細胞由来ＥＶのニューロンへの進入の基礎となる規則を明らかにするために更なる研究が必要であるが、ＥＶが隣接細胞によって十分に内在化されることを支持する堅固な証拠が存在する。^{１４、３３}

ＥＶ取込みは、ほとんどのＥＶにおいて豊富な膜タンパク質を標的とするＥＶ特異的抗体を使用するか、又は取込み前にＥＶ膜を直接染色するために蛍光脂質膜色素を使用して、可視化することができる。あるいは、膜透過性化学化合物はまた、エステル化の結果として蛍光を発する細胞質内腔に限定され得るＥＶを染色するために日常的に使用されている。^{３４、３５}細胞外小胞は、レシピエント細胞の膜上に発現されるタンパク質に結合する蛍光タグ付き小胞タンパク質を介して、より排他的な方法で可視化することができる。例えば、ＣＤ８１、ＣＤ９及びＣＤ６３は、フルオロフォアでタグ付けされた場合、レシピエント細胞への小胞の取込みを可視化するために使用することができる、小胞膜に見出されるテトラスパニンタンパク質である。^３６

これらのタンパク質マーカは、様々な種類の細胞外小胞を互いに区別するために使用されるが、観察された小胞の種類を区別するための決定的なデータを提供しない。しかし、ＣＤ８１は、現在のところ、ＥＶ上のその高い発現に基づいて、比較的正確なＥＶ特異的マーカであると考えられているが、他の種類の小胞ではそうではない。逆に、ＣＤ９及びＣＤ６３は、より一般的には大部分の細胞外小胞集団にわたって発現される。^３７したがって、ニューロン細胞質におけるＥＶ特異的タンパク質発現をクロスチェックするために、ＥｘｏＧｌｏｗタンパク質ＥＶ標識キット及びＣＤ８１に対する抗体を一緒に使用して、アストロサイト由来ＥＶがヒト皮質ニューロンによって容易に内在化され得るかどうかを調査した。ＥｘｏＧｌｏｗからの蛍光シグナルを最適化して、培養ニューロンによるＥＶの取込みをモニタリングしたが、２時間後に急速に減衰した。したがって、Ｅｘｏｇｌｏｗは、生細胞画像化顕微鏡を使用してＥＶエンドサイトーシスの初期段階でリアルタイムＥＶ取込みをモニタリングするためにのみ使用した。次いで、ＣＤ８１に対する抗体を使用して、ニューロン固定後及び細胞対ＥＶの異なる比による処置後に内在化ＥＶを蛍光定量した。培養７日目のニューロンをＥｘｏＧｌｏｗ試薬で標識したＥＶで処置し、次いでＥＶの内在化速度を記録した。１時間のＥＶ処置及びその後の培地洗浄後、試験したニューロンの８３．３％が平均してそれらの細胞体において赤色蛍光を示し、非常に短期間での皮質ニューロンの細胞質へのアストロサイト由来ＥＶの取込みの成功を示した（図９）。

誘導後７日目及びＥＶ処置の２４時間後に固定したニューロンのＣＤ８１発現分析は、ＥＶ処置ニューロンが用量依存的に蛍光強度の有意な増加を示したことを明らかにし、標識ＥＶの培養ニューロンへの内在化の成功の更なる証拠を提供した（図２Ｈ）。蛍光強度は、細胞レベル当たり２５のＥＶまで劇的に増加し、次いで定常に達し始め、その結果、より高いＥＶ濃度は蛍光強度の更なる有意な変化を促進せず、ＥＶ取込みが１：２５の比付近で飽和したことを示唆した（図２Ｊ）。ニューロンの未処置バッチは有意なＣＤ８１陽性を示さず、細胞内にＥＶが存在しないことを示しただけでなく、培養ニューロンにおける無視できるレベルの内因性ＣＤ８１発現のレベルも示した。

実施例４：アストロサイト由来ＥＶ処置は、培養ニューロンにおけるニューロンアポトーシス及び老化を阻害する
培養ニューロンのアポトーシス及び老化に対するアストロサイト由来ＥＶの効果を試験した。分化は既に培養中の細胞に対する非常にストレスの多いプロセスであるため、ニューロゲニン－２過剰発現によって引き起こされる急速な分化は、細胞にとって更にストレスが多い可能性があり、高い割合のアポトーシスニューロンを産生している。ＥＶ処置していないニューロンの９２％が、使用したアポトーシスマーカの少なくとも１つを発現したが、ＥＶ処置ニューロンは、アポトーシス細胞の集団の減少を示した。ＥＶ処置の濃度の増加は、各群における健康な生細胞の百分率と密接に相関することが見出され、ニューロンがアポトーシス経路に入るのを阻害することにおけるアストロサイト由来ＥＶの役割を強く示唆している。

ＥＶは既にアポトーシスの後期段階にある細胞を効果的に救済しなかったが、全てのＥＶ処置群において初期段階のアポトーシスに入る細胞の数が徐々に減少するという明らかな傾向は、ＥＶに封入された生物活性分子がレシピエントニューロンにおいて発現され、これらのシグナルが、これらの細胞が分化培養においてプロアポトティックシグナルに応答するのを妨げたことを示唆している（図３Ａ及び図３Ｂ）。

一般に、ニューロンアポトーシスは、特定の状況で必要とされるように細胞が自身の破壊を開始する固有の自殺プログラムを表す。^３８胚性及び新生児神経系の発達中、アポトーシス媒介性のニューロン喪失はニューロン集団の調節に寄与し、初期ニューロン新生中に生まれた全ニューロンの約半分を除去する役割を果たす。しかし、成熟神経系では、アポトーシス性ニューロン喪失は通常、生理学的に不適切であり、アルツハイマー病及びパーキンソン病等の神経変性障害の一因となり得る。^{３９、４０}成体神経組織におけるニューロンアポトーシスを制御するシグナル伝達機構は完全には理解されていないが、以前の研究は、ニューロトロフィン及びＩＧＦ－１等の傍分泌栄養因子の欠如がアポトーシス細胞死を導く可能性を示唆している。^３９他の以前の観察は、細胞周期の調節解除がアポトーシスを直接誘発し得るか、又は酸化ストレスが細胞周期機構に影響を及ぼしてアポトーシスを促進し得るという仮説を導いた。^４１

成長因子の不十分な提供及び／又は酸化ストレスの耐性は、神経変性疾患の発症を推進する強力な因子である。したがって、通常の培養ニューロンにおけるグリア細胞からの直接的及び遠隔的な支持の欠如は、特に神経変性疾患モデリング研究において、アッセイ結果の誤った解釈を導き得る。アストロサイト由来ＥＶのどの構成要素が、ニューロンにおけるアポトーシスシグナル伝達タンパク質と相互作用するかは、未だ明らかにされていない。それにもかかわらず、アストロサイト由来ＥＶは、傍分泌様式でレシピエントニューロンと相互作用して、ニューロンの生存を改善し、ストレスの多い分化プロセスを経たニューロンのアポトーシス集団を減少させることが明らかである。これは、そのような細胞型に関与する将来のインビトロ研究に強い意味を有し得る。

神経老化
年齢依存性神経変性疾患で観察されるニューロン喪失をモデル化するための低密度培養物におけるニューロン老化に対するアストロサイト由来ＥＶの効果を試験した。培養中の皮質ニューロンは、低血清条件下で高密度の細胞外タンパク質被覆ガラス上でそれらの生理を首尾よく維持することができることが多いが、インビトロでグリア細胞を含まない低密度培養物は、典型的には十分に生存せず、生存及び機能に不可欠なシナプス形成活性を欠く。初期の分化したニューロン（３日目）を１０，０００細胞／ｃｍ^２でプレーティングし、これは、長期培養のための典型的なニューロンプレーティング密度の１０％を構成する。ＥＶをニューロンプレーティングの１時間後に適用し、その後アッセイ日まで３日毎に新鮮なＥＶ補充培地で培地を補充した。未処置群は急速に有意な神経突起変質を示し始め、細胞は培養８日目を超えて生存しなかった。逆に、ＥＶ処置培養物は、４日目に正常な軸索突起を示し、８日目までそれらの堅固な形態を保持した（図４Ａ）。更に、低密度皮質ニューロンが異常な細胞老化に感受性であるかどうか、及びアストロサイト由来ＥＶがそれらの変性を阻害するかどうかを試験した。β－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）は、通常、高活性リソソームを含む老化細胞において、βガラクトシドの単糖への加水分解を触媒する加水分解酵素である。^４２

上方制御されたガラクトシダーゼ活性による発色基質Ｘ－ｇａｌ溶液の切断は、老化細胞の細胞質における紫色色素の沈殿をもたらす。胎児又は若年成人ニューロンにおけるβ－ｇａｌ発現ニューロンの存在は、そのような組織でニューロン老化が優勢であるか、又はβ－ｇａｌがニューロン老化の信頼できるマーカではないという証拠として代替的に解釈されているので、ニューロンアポトーシスのマーカとしてβ－ｇａｌを使用することには議論の余地がある。^{４３、４４}それにもかかわらず、ニューロンのβ－ｇａｌ発現は、ストレスを受けた神経組織で一般的に観察される。^{４５ Ａ}β－ｇａｌ溶液キットをニューロンの各群で使用し、それらの細胞質におけるＸ－ｇａｌ切断媒介色素沈殿発現を分析した。ＥＶ処置なしの４日目の低密度ニューロンは、それらの細胞体に紫色凝集体を明確に発現し、細胞が老化状態をとったことを強く示している（図４Ｂ及び図４Ｃ）。

これらの細胞におけるニューロゲニン－２導入遺伝子形質導入は、ニューロゲニン－２タンパク質の調節不全を引き起こして、それらを急速な老化及び変性に対して感受性にした可能性がある。以前の研究では、ニューロゲニン－２タンパク質の調節不全とアミロイド－β前駆体タンパク質の過剰発現との間の相関関係が強調されており、これを理にかなったものにしている。^４６

アストロサイト由来のＥＶがニューロン老化の開始を抑制したかどうかの処置を評価した。ＥＶ処置群（１：１００）のβ－ｇａｌ陽性ニューロン数は、培養４日目の未処置対照の数よりも有意に少なく、アストロサイトに由来する小胞カーゴも同様にニューロン老化を抑制することができることを示している。

実施例５：ＥＶは、神経突起伸長及び軸索分岐の促進に対する効果が限定的である
培養の初期段階における神経突起伸長及び後期段階における軸索の分岐の動態に対するＥＶ処置の効果を評価した。プレーティングの日にニューロンをＥＶで処置し、各培養物を異なる時点で画像化した。神経突起伸長速度の分析は、全ての条件について、プレーティング後６時間と１２時間との間に最長神経突起長の顕著な増加を示した（図１０）。調査したＥＶ濃度にかかわらず、ＥＶ未処置群とＥＶ処置群との間で神経突起の初期段階伸長速度に有意差は観察されなかった（図５Ａ～図５Ｃ）。結果は、回収されたＥＶが、アクチン重合の制御を介して初期神経突起成長を促進することが知られている、小型ＧＴＰａｓｅ Ｒｈｏファミリ（例えば、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２）のタンパク質又はＭｉＲ－１２４等のｍｉＲＮＡのような神経突起伸長の制御に関与する生体分子を含有しないことを示した。

神経突起伸長の初期段階において、これらの分子は、アクチンと微小管細胞骨格との間の協調作用を調節して、ニューロン成長円錐の形成を可能にする。ここに示される結果は、アストロサイト由来ＥＶにおけるそれらの分子の無視できる封入、又は、レシピエントニューロンへの封入された分子の不十分な送達を示し得る。

軸索分岐分析
主軸索シャフトに対して直交する角度で神経突起を伸長させるプロセスとして定義される軸索分岐に対するＥＶの効果も評価した。軸索発生中、側枝分岐は、主軸索シャフトから延びて、隣接する標的細胞のシナプス後領域との多様な接続を確立する。分子キューの勾配、アクチン及び微小管細胞骨格の動的及びプログラムされた再編成、カルシウム移行及び細胞内シグナル伝達経路は全て軸索分岐を媒介する。^４１これらの機構は完全には理解されていないが、軸索成長及び標的ニューロンへの分岐挙動は独立して調節される可能性が高いと思われる。

データは、アストロサイト由来ＥＶがヒト皮質ニューロンの軸索分岐を有意に促進しないことを示唆し、このことは、回収されたＥＶの分子カーゴが軸索発達の調節において役割を果たさないことを示唆している（図５Ｃ）。

実施例６：アストロサイト由来ＥＶ処置は、ニューロンの単一細胞の電気生理を増強する
アストロサイトに起因する最も重要な機能の１つは、細胞外空間への異常な蓄積を防止するために細胞外空間から細胞外カリウムイオンを活発に取り込むことによる細胞外カリウムイオンの緩衝である。細胞外カリウムレベルの適切な調節は、ニューロンが正常な再分極特性を維持することを可能にし、適切なレベルのニューロン興奮性を保証する。^４７アストロサイトは、隣接するニューロンとの間で三者間シナプスを形成し、この場合、シナプスは、ニューロン間にシナプス前及びシナプス後終末を含み、アストロサイトプロセスは、これらのニューロン接触の周りに巻き付けられる。^１０アストロサイトはＣＮＳにおけるニューロンの電気化学的挙動に積極的に関与しており、したがって、アストロサイトによる被覆が隣接するニューロンに限定される一方で、ＣＮＳ全体にわたるニューロンには一貫した電気化学的調節が必要であるという事実に基づいて、分泌された細胞外小胞によってニューロンの電気生理を調節することもできる。

ホールセルパッチクランプ記録は、静止膜電位、入力抵抗及びキャパシタンスを含む単一ニューロンの電気生理学的評価、並びに誘発又は自発活動電位の波形解析を可能にする。^１１脱分極及び再分極速度、活動電位の振幅及び頻度、活動電位の持続時間、並びにナトリウム電流及びカリウム電流の振幅等の活動電位の特性は全て、ニューロンの機能的成熟の検証のための重要な基準である。アストロサイト由来ＥＶによる処置を伴うか、又は伴わない４週齢の皮質ニューロン培養物におけるこれらの基準を調査するために、パッチクランプ技術を使用した。ＥＶで処置したニューロンにおける誘発活動電位発火は、未処置ニューロンのものよりも、反復発火及び活動電位振幅に関してより一貫していた（図６Ａ）。具体的には、反復発火を示すニューロンの集団は、未処置対照（３０％）と比較してＥＶ処置群ではるかに高く（５０％）、ＥＶ処置ニューロンが、アストロサイト由来ＥＶの助けを借りずに培養されたニューロンよりも入力刺激に対して応答性がより高かったことを示している（図６Ｂ）。

活動電位発火の最大頻度は、ニューロンが持続的な脱分極刺激に応答して活動電位発火サイクルをどのように良好に繰り返すことができるかを示し、ニューロンに加えられる刺激の強度に依存する。体内の神経系は、振幅変調ではなく頻度変調されており、これは、刺激の強度が活動電位の振幅に影響を及ぼさないが、活動電位の発火の頻度に影響を及ぼすことを意味している。最大頻度は最終的には絶対不応期によって制限され、これは通常、インビボでニューロンにおいて１ｍｓである。培養中の単離されたニューロンは通常、おそらくグリア細胞及び他の支持因子が存在しないために、活動電位発火のこの最大頻度に達しない。

この研究では、アストロサイト由来ＥＶは、皮質ニューロンにおける活動電位発火頻度の有意な増加を明らかに誘導し（図６Ｃ）、このことは、ニューロン機能に対するアストロサイト媒介の電気化学的調節の影響を示している。一貫した電流注入強度に応答して、活動電位発火におけるこの差次的応答は、ＥＶ支援ニューロンにおいて電気化学刺激を処理する細胞内タンパク質カスケードが、未処置対照細胞のものよりもより迅速に機能していることを示し得る。

活動電位持続時間はまた、脱分極期間中の細胞外Ｎａ^２＋の流入及び再分極期間中の細胞内Ｋ^＋の流出をニューロンがどの程度迅速に繰り返すことができるかの強力な指標である。再分極の９０％における活動電位持続時間（ＡＰＤ９０）がより短いことは、通常、ニューロン膜上の電位依存性イオンチャネルのより迅速な応答を示し、培養中の細胞成熟を評価するための重要な基準として役立つ。これらの実験では、アストロサイト由来ＥＶ処置皮質ニューロンは、非処置群のＡＰＤ９０値（６．８９±０．３３ｍｓ）と比較して、有意に短いＡＰＤ９０値（５．６１±０．０８ｍｓ）を示し（図６Ｄ）、これは、小胞のカーゴ分子が、より速いイオンサイクルを促進するために、電位依存性イオンチャネルの活性を促進したことを示し得る。特に、データは、活動電位再分極の有意な改善が処置細胞で観察されたが、脱分極速度は一貫していたため、電位依存性カリウムチャネルの活性がＥＶ処置によって最も影響されることを示唆した（図６Ｅ及び図６Ｆ）。以前の研究は、ｆａｓｔ－ｓｐｉｋｉｎｇ表現型が電位依存性カリウムチャネルのＫｖ３サブファミリの発現に関連し、狭い活動電位曲線及び短い不応期を生成するための急速な電圧依存性分極及び脱分極速度論がこのチャネル挙動に高度に依存することを示した。^４８これらの変化を誘導するように作用する分子はまだ定義されていないが、将来の研究のための有益な手段は、小胞カーゴとＫｖ３チャネルとの間の特異的相互作用発達を調査して、この改善を媒介することに関与する根本的な機構を特定することであろう。

静止膜電位（Ｒｅｓｔｉｎｇ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ＲＭＰ）分析
処置ニューロン集団と未処置ニューロン集団との間の静止膜電位（ＲＭＰ）を試験した。ＲＭＰは、活動電位発火前のニューロンの静止状態における膜電位であり、細胞内領域で最も優勢なイオンであるＫ＋の平衡膜電位（－８５ｍＶ）に近い。哺乳動物錐体ニューロンにおけるＲＭＰの生理学的値は、およそ－７０ｍＶである。非常に負のＲＭＰ値は、ニューロンの成熟度の強力な指標であり、培養ニューロン膜がイオンの有効なキャパシタとして機能していることを示す。ＲＭＰが低い細胞は、細胞内領域と細胞外領域との間でイオン濃度の実質的な差を維持し、それによって活動電位が引き起こされた時に有意なイオン電流の発生を促進する。これらの実験では、培養２８日目のアストロサイト由来ＥＶ処置ニューロンの平均ＲＭＰは－６１．６±２．０ｍＶであったが、未処置ニューロンは－５０±１．７６ｍＶの平均ＲＭＰを示した（図６Ｇ）。ＲＭＰのこの有意な減少は、ＥＶ処置細胞における膜貫通タンパク質が受動的Ｋ^＋膜透過性を媒介する能力がより大きいことを示し得る。別の可能な推測は、ＥＶ処置が培養ニューロンの細胞内領域におけるより生理学的なＫ＋勾配の発生を促進したということである。したがって、このような結果は、ＥＶ処置ニューロンがより機能的なイオンポンプ及び／又は輸送体の発現を促進することを示唆するであろう。

処置群及び未処置群の電気生理の重要な側面で観察された有意差は、ＥＶを介して送達されるグリア細胞由来生体分子に対するニューロンの機能的応答性、及びこれらの分子が比較的短い培養期間で実質的な表現型増強を促進する能力を強く示す。

実施例７：シュワン細胞由来エクソソーム
ヒトシュワン細胞由来エクソソームを単離し、評価した。ヒトシュワン細胞は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＣａｔａｌｏｇ（＃１７００）から購入した。培養培地は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（＃１７０１）から購入した。エクソソーム粒度分布及び顕微鏡画像化を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって行った。図１１Ａ～１１Ｂ。細胞外小胞の産生中、培養シュワン細胞はそれらの正常な形態を維持した。更に、シュワン細胞から生成した細胞外小胞は、約１００ｎｍの平均的な均一な大きさを有することが確認された。

実施例８：幹細胞の成熟及びスケーリング
幹細胞を、修正を加えた以前に報告された方法^{２３、２４}を使用して維持した。具体的には、ｍＴｅＳＲ１培地を更に４８時間毎日補充して培養物を維持した後、継代し、最終アッセイプレートに移した。８０％コンフルエントな幹細胞コロニーが得られると、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して単一細胞に解離させ、新鮮なマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）被覆プレートに移した。ＥＶ処置の前に、幹細胞を成長因子補充ニューロン維持培地中で２４時間培養した。次いで、ＥＶ懸濁培地を、１００ＥＶ／細胞比で幹細胞培養物に添加した。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．［ｉ３Ｎ ｏｒｉｇｉｎａｌ］Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｔａｕ－Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９，１２２１－１２３３（２０１７）及びＦｅｒｎａｎｄｏｐｕｌｌｅ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．［ｉ３Ｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ］Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣｓ ｉｎｔｏ Ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７９，ｅ５１（２０１８）を参照されたい。

考察
ヒトｉＰＳＣ由来皮質ニューロンに対するヒトアストロサイトから分泌されるＥＶの広範な効果を評価した。最適化されたＥＶ濃度による処置は、ニューロンアポトーシス及び老化の阻害、並びに培養における長期生存の改善に有意な効果を及ぼすことが分かった。ＥＶはまた、単一ニューロンの電気生理を著しく変化させた。未処置対照と比較して、反復活動電位発火挙動を示すニューロン数の４０％の増加、活動電位発火における最大頻度の３倍の増加、及びＥＶ処置ニューロンのＡＰＤ９０の１８．５％の低下が観察された。

ＥＶ処置ニューロンはまた、静止膜電位の低下及びより速い再分極速度を示し、これらは全て、おそらく膜貫通タンパク質の発現及び／又は機能性の変化を介した、ニューロンの機能的成熟に対するアストロサイト由来ＥＶのプラスの効果を示している。

本明細書に提示される観察は、ヒトＣＮＳにおけるニューロン－グリア通信の多様な様式に関する重要な洞察を提供する。これらのデータは、前臨床スクリーニング用途のためのより生理学的に関連する神経オンチップアッセイ（ｎｅｒｖｅ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ ａｓｓａｙ）を開発するためのＥＶの使用、様々な種類の神経障害をモデル化する能力の向上、及び更には将来、神経変性疾患と闘うために重要な新規の治療法又はバイオマーカの開発について情報を提供し得る。

材料及び方法
以下の材料及び方法を使用した。

アストロサイト細胞培養
市販のヒト初代アストロサイトを、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入し、製造業者のプロトコルに基づいて貯蔵し、解凍し、継代培養した。培養物を３７℃／５％ＣＯ_２インキュベータ中で培養期間を通して維持し、アストロサイトを５継代まで使用して、一貫した細胞品質を維持した。最初に、アストロサイトを、全て同じ製造業者によって提供されるアストロサイト増殖サプリメント及びウシ胎児血清を含む基礎培地中で７２時間培養した。７２時間の培養後、培地を、基礎培地＋ＥＶ除去血清及びサプリメントからなるＥＶ非含有培地と交換した。次いで、細胞を更に８４時間培養し、最大数のＥＶを分泌させながら、９０％未満のコンフルエンシーを維持した後、馴化培地のＥＶを回収した。

ヒトｉＰＳＣ維持及び皮質ニューロン分化
導入遺伝子を過剰発現するドキシサイクリン媒介ニューロゲニン－２転写因子で安定に形質導入されたＷＴＣ１１ヒト人工多能性幹細胞は、Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）によって提供された。これらの細胞を、先に公開されたＧｌａｄｓｔｏｎｅプロトコルに従って維持及び分化させた。^{２３、２４}限定された改変を伴う以前に報告された方法を使用して、ｈｉＰＳＣをヒト皮質ニューロンに分化させた。具体的には、マトリゲルプレート上の８０％コンフルエントｈｉＰＳＣコロニーを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して単一細胞に解離させ、新鮮なマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）被覆プレートに移した。次いで、細胞を、Ｎ_２サプリメント（１００ｘ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、非必須アミノ酸（１００ｘ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００ｘ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）及びドキシサイクリン（１０００ｘ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む誘導培地で処置して、分化を開始させた。培養物を同じ誘導培地で更に４８時間毎日補充して維持した後、継代し、最終アッセイプレートに移した。３日目までに完全に分化したニューロンを、その後のアッセイのために０．０１％ポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５μｇ／ｍＬのラミニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）被覆ガラスカバースリップに移した。Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ラミニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び１０ｎｇ／ｍＬ脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を補充したＢｒａｉｎＰｈｙｓ基礎培地からなる維持培地を、エンドポイント分析まで３日毎に供給した。

ＥＶの単離及び特性決定

アストロサイトを、ＥＶ除去血清で補充された供給業者提供の基礎培地と共に培養した。培養８４時間後に細胞由来ＥＶを懸濁した培養培地を回収した。次いで、多段階超遠心分離プロトコルを適用してＥＶを濃縮及び精製した。最初に、３００ｒｃｆで１０分間の回転を使用して、偶発的に分離した細胞を除去した。次いで、２，０００ｒｃｆで１０分間を使用して死細胞を除去した後、１０，０００ｒｃｆで３０分間の回転を適用して細胞片及びアポトーシス小体を除去した。次いで、３０，０００ｒｃｆで７０分間の２回の超遠心分離工程を繰り返した後、ＥＶを回収した。最終溶液中のＥＶを５０μＬのＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）で再懸濁し、使用するまで－８０℃で最大１ヶ月間保存した。回収したＥＶの粒度分布及び密度を、Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ｏｆ Ｍａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して分析した。

免疫細胞化学
皮質ニューロンの成功裡の分化及び培養アストロサイトの均質性を検証するために、細胞を皮質ニューロン（層２及び層３）及びグリア特異的マーカの発現について免疫染色した。簡潔には、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、室温で１時間、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡでブロッキングした。次いで、細胞を、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ溶液に希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、それらを、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ溶液に希釈した二次抗体を含有する二次抗体溶液中で２時間インキュベートした。カバーガラスを、ＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して顕微鏡スライド上にマウントして、核の試料を対比染色した。Ｔｉ－Ｅ倒立顕微鏡プラットフォーム上でＮｉｋｏｎ Ａ１共焦点システムを使用して、ワシントン大学の幹細胞及び再生医療研究所（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＧａｒｖｅｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅで画像を撮影した。これらの試験で使用した抗体は以下の通りであった。ウサギ抗ＭＡＰ－２（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＣＵＸ－１（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ニワトリ抗ＧＦＡＰ（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マウス抗Ｓ１００Ｂ（１：５００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－５９４コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－５９４コンジュゲートヤギ抗ニワトリ二次抗体（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－４８８コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ－６４７コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

ＥＶ標識及び取込み研究
ＥｘｏＧｌｏｗタンパク質ＥＶ標識キット（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を生細胞ＥＶ画像化に使用した。回収したＥＶを標識色素（１：５００）と共に３７℃で２０分間インキュベートして、色素分子との小胞タンパク質コンジュゲーションを誘導した。次いで、溶液をＥｘｏＱｕｉｃｋ－ＴＣ溶液で処置し、４℃で２時間インキュベートした後、１０，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離して、非標識試薬分子を除去し、標識ＥＶのみを回収した。標識ＥＶをニューロン維持培地に再懸濁し、様々な濃度で分化後７２時間のニューロンに添加した。生細胞画像化顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔ１，Ｎｉｋｏｎ）を使用して、５分毎に複数の位置で２時間画像を取得することによって、培養ニューロンによる蛍光標識ＥＶ取込みを画像化した。更に、ＥＶで処置したニューロンを処置の２時間後に固定し、マウス抗ＣＤ８１抗体（１：１００、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、続いてＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ－５９４コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、蛍光標識ファロイジン（Ｆ－アクチン可視化用；１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で免疫染色して、蛍光強度に基づいて内在化ＥＶの相対量を定量化した。

細胞老化及びアポトーシスアッセイ
各培養条件における老化ニューロンの集団を定量するために、β－ガラクトシダーゼ染色キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。細胞を４日目に４％ＰＦＡで１５分間固定した。染色溶液は、２５μＬのＸ－ｇａｌ溶液を４７５μＬの鉄緩衝液と混合することによって調製して、各ウェルにつき合計５００μＬとした。染色溶液を培養物に添加し、３７℃で３時間保持した後、評価した。次いで、明視野顕微鏡下で細胞質に青色色素蓄積を示す細胞の数を各群について比較した。これらの培養物中のアポトーシス細胞を定量するために、ヨウ化プロピジウム（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）と共にアネキシン５（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、フローサイトメトリ分析（ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）のために細胞を標識した。具体的には、各条件につき２００，０００個の細胞を、室温で１５分間、蛍光標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで処置した。次いで、これらの細胞をＦＡＣＳ分析の前に速やかに洗浄して、アッセイプロセス中の細胞死を最小限に抑えた。次いで、各群においてアネキシンＶ及び／又はヨウ化プロピジウムを発現する細胞の数を、ＦｌｏＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析及び定量した。

ニューロンの形態学的評価
軸索伸長に対するアストロサイト由来ＥＶ処置の効果を調べるために、培養ニューロンをプレーティングの２時間後、６時間後及び１２時間後に画像化した。各ニューロンについての最長神経突起セグメントの長さを、各時点で撮影された画像ごとに測定した。更に、各群からのニューロンを各時点で固定し、抗ニューロフィラメントで染色して、軸索長の比較評価を可能にした。ＩｍａｇｅＪのＳｉｍｐｌｅ Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｔｒａｃｅｒプラグインを使用して軸索の形態を分析した。軸索分岐を測定するために、ニューロフィラメント発現について免疫染色したニューロンを、軸索終末の分岐に関して目で個々に分析した。

ニューロンの電気生理学的評価
各群のニューロンの電気生理学的機能を、ホールセルパッチクランプ技術を使用して記録した。記録は、ＥＰＣ１０パッチクランプ増幅器に接続された倒立ＤＩＣ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）及びＰａｔｃｈｍａｓｔｅｒソフトウェア（ＨＥＫＡ）を実行するコンピュータで行った。培養ニューロンを支持するカバーガラスを顕微鏡の載物台に装填し、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭグルコース、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むタイロード溶液に浸漬した。細胞内記録溶液（１２０ｍＭのＬ－アスパラギン酸、２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、３ｍＭのＭｇ^２＋－ＡＴＰ、５ｍＭのＥＧＴＡ及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ）を２～６ＭΩの範囲の抵抗でホウケイ酸ガラスパッチピペット（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に充填した。ギガΩシールを形成する前は、オフセット電圧は０であった。次いで、吸引を適用して、ピペット端部と接触している細胞膜を破壊した。このプロセスは、細胞内空間への電気的及び分子的アクセスを可能にし、次いで、膜電位を、Ｐａｔｃｈｍａｓｔｅｒによって計算された液体間電位の減算によって補正した。電流クランプモードは、ニューロンの活動電位挙動を記録するために使用した。具体的には、２ｎＡの脱分極単一パルスを５ｍｓ印加して単一の活動電位を誘導し、５００ｍｓの間に－３０～＋７０ｐＡまでの１０ｐＡの段階的な電流注入を印加して反復的な活動電位発火を誘発した。９０％再分極（ＡＰＤ９０）における活動電位持続時間、脱分極速度及び再分極速度を、Ｐａｔｃｈｍａｓｔｅｒソフトウェアによってニューロンの各群について記録した。

ボルテージクランプモードで、－１２０ｍＶ～＋３０ｍＶの５００ｍｓの脱分極工程を１０ｍＶ刻みで提供することによって、内向き電流及び外向き電流を誘起した。各群のニューロンの静止膜電位を測定するために、パッチされたニューロンにおける自発的活性のギャップフリー記録を、０ｐＡ電流注入を用いて電流クランプモードで行った。活動電位波形及び電流の分析は、Ｐａｔｃｈｍａｓｔｅｒソフトウェアスイートを使用して行った。このプロトコルで使用される全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。

参考文献
１．Ｆａｒｈｙ－Ｔｓｅｌｎｉｃｋｅｒ，Ｉ．＆Ａｌｌｅｎ，Ｎ．Ｊ．Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｕｒｏｎｓ，ｓｙｎａｐｓｅｓ：Ａ ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｖｉｅｗ ｏｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｉｒｃｕｉｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎｅｕｒａｌ Ｄｅｖ．１３，１－１２（２０１８）．
２．Ｍｏｌｎａｒ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ．Ｊ．Ａｎａｔ．４３２－４５１（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊｏａ．１３０５５
３．Ｒａｋｉｃ，Ｐ．＆Ｌｏｍｂｒｏｓｏ，Ｐ．Ｊ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ：Ｉ．Ｆｏｒｍｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｃｈｉｌｄ Ａｄｏｌｅｓｃ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３７，１１６－１１７（１９９８）．
４．Ｈａｒｒｉｓ，Ｋ．Ｄ．＆Ｍｒｓｉｃ－Ｆｌｏｇｅｌ，Ｔ．Ｄ．Ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ ｃｏｄｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ５０３，５１－５８（２０１３）．
５．Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｒ．Ｊ．＆Ｍａｒｔｉｎ，Ｋ．Ａ．Ｃ．Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７，４１９－４５１（２００４）．
６．Ｄｚｙｕｂｅｎｋｏ，Ｅ．，Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ，Ｃ．＆Ｆａｉｓｓｎｅｒ，Ａ．Ｎｅｕｒｏｎ－Ｇｌｉａ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ：Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ Ｐｅｒｉｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｅｔｓ．Ｎｅｕｒａｌ Ｐｌａｓｔ．２０１６，（２０１６）．
７．Ｈａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃ Ａｃｃｅｓｓ．１２，３４２－３５３（２０１４）．
８．Ｌｕａｒｔｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ａｔ ｔｈｅ Ｈｕｂ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｓｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉＲＮＡｓ ｉｎ Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ．２０１７，（２０１７）．
９．Ｓｈｉ，Ｙ．，Ｋｉｒｗａｎ，Ｐ．＆Ｌｉｖｅｓｅｙ，Ｆ．Ｊ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．７，１８３６－１８４６（２０１２）．
１０．Ｂｅｌｌｏｔ－Ｓａｅｚ，Ａ．，Ｋｅｋｅｓｉ，Ｏ．，Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｗ．＆Ｂｕｓｋｉｌａ，Ｙ．Ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｋ＋ｓｐａｔｉａｌ ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．７７，８７－９７（２０１７）．
１１．Ｈａｎｓｅｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｔｏｒｎｅｒｏ，Ｄ．，Ｃａｎａｌｓ，Ｉ．，Ａｈｌｅｎｉｕｓ，Ｈ．＆Ｋｏｋａｉａ，Ｚ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９１９，７３－８８（２０１９）．
１２．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｒ．Ｍ．，Ａｄａｍ，Ｍ．，Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ｒ．，Ｏｒｒ，Ｌ．＆Ｔｕｒｂｉｄｅ，Ｃ．Ｖｅｓｉｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，９４１２－９４２０（１９８７）．
１３．Ｌｅｅ，Ｙ．，Ｅｌ Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，Ｓ．＆Ｗｏｏｄ，Ｍ．Ｊ．Ａ．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２１，１２５－１３４（２０１２）．
１４．Ｍｕｌｃａｈｙ，Ｌ．Ａ．，Ｐｉｎｋ，Ｒ．Ｃ．，Ｒａｕｌ，Ｄ．＆Ｃａｒｔｅｒ，Ｆ．Ｒｏｕｔｅｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｕｐｔａｋｅ．１，１－１４（２０１４）．
１５．Ｓａｅｅｄｉ，Ｓ．，Ｉｓｒａｅｌ，Ｓ．，Ｎａｇｙ，Ｃ．＆Ｔｕｒｅｃｋｉ，Ｇ．Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｍｅｎｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ９，（２０１９）．
１６．Ｇａｎｇｏｄａ，Ｌ．，Ｂｏｕｋｏｕｒｉｓ，Ｓ．，Ｌｉｅｍ，Ｍ．，Ｋａｌｒａ，Ｈ．＆Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ，Ｓ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｒｅ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：Ａｒｅ ｔｈｅｙ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ？Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １５，２６０－２７１（２０１５）．
１７．Ｚａｇｒｅａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｏｐｒｉｓ，Ｉ．，Ｚａｇｒｅａｎ，Ｌ．＆Ｐｏｐａ－Ｗａｇｎｅｒ，Ａ．Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｒｏｓｓｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｕｎｉｔ ａｆｔｅｒ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２，１－９（２０１８）．
１８．Ｐａｏｌｉｃｅｌｌｉ，Ｒ．Ｃ．，Ｂｅｒｇａｍｉｎｉ，Ｇ．＆Ｒａｊｅｎｄｒａｎ，Ｌ．Ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ４０５，１４８－１５７（２０１９）．
１９．Ｂａｓｓｏ，Ｍ．＆Ｂｏｎｅｔｔｏ，Ｖ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｆｏｒｍ ｏｆ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ．Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０，１－１３（２０１６）．
２０．Ｇｏｅｔｚｌ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．８３，５４４－５５２（２０１９）．
２１．Ｐａｓｃｕａ－Ｍａｅｓｔｒｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ ｔｏ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｕｐｏｎ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２，１－１３（２０１９）．
２２．Ｍｉｚｕｎｏ，Ｇ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ａ Ｈｕｍａｎ Ｄｏｗｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｅｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２４，３５５－３６５（２０１８）．
２３．Ｗａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．［ｉ３Ｎ ｏｒｉｇｉｎａｌ］Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｔａｕ－Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９，１２２１－１２３３（２０１７）．
２４．Ｆｅｒｎａｎｄｏｐｕｌｌｅ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．［ｉ３Ｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ］Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣｓ ｉｎｔｏ Ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７９，ｅ５１（２０１８）．
２５．Ｓｈｉ，Ｙ．，Ｋｉｒｗａｎ，Ｐ．＆Ｌｉｖｅｓｅｙ，Ｆ．Ｊ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．７，１８３６－１８４６（２０１２）．
２６．Ｐａｔａｎｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｔｉｎｏｉｄ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｍｅｄｉａｌ ｃｏｌｕｍｎａｒ ｇｒｏｕｎｄ ｓｔａｔｅ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２，（２０１１）．
２７．Ｄｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３．基因的改変ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃ Ａｃｃｅｓｓ．Ｂｏｎｅ ２３，１－７（２００８）．
２８．Ｐｏｌａｎｃｏ，Ｊ．Ｃ．，Ｌｉ，Ｃ．，Ｄｕｒｉｓｉｃ，Ｎ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｒ．＆Ｇｏｔｚ，Ｊ．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｔａｋｅｎ ｕｐ ｂｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ｈｉｊａｃｋ ｔｈｅ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｓｐｒｅａｄ ｔｏ ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｃｏｍｍｕｎ．６，１０（２０１８）．
２９．Ｊａｎａｓ，Ａ．Ｍ．，Ｓａｐｏｎ，Ｋ．，Ｊａｎａｓ，Ｔ．，Ｓｔｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｈ．Ｂ．＆Ｊａｎａｓ，Ｔ．［２０１６ Ｒｅｖｉｅｗ］Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ－Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．１８５８，１１３９－１１５１（２０１６）．
３０．Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．，Ｍｅｓｃｉ，Ｐ．，Ｃａｒｒｏｍｅｕ，Ｃ．，Ｍｃｃｌａｔｃｈｙ，Ｄ．Ｒ．＆Ｓｃｈｉａｐｐａｒｅｌｌｉ，Ｌ．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｉｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ．１－９（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１９０２５１３１１６
３１．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｔｃｈ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ．Ｇｌｉａ ５５，１４１６－１４２５（２００７）．
３２．Ｙａｓｕｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓ１００β ａｎｄ ＧＦＡＰ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｌｉａｌ ｓｃａｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｍｉｌｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１０２１，２０－３１（２００４）．
３３．Ｆｒｕｈｂｅｉｓ，Ｃ．，Ｆｒｏｈｌｉｃｈ，Ｄ．＆Ｋｒａｍｅｒ－Ａｌｂｅｒｓ，Ｅ．Ｍ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｇｌｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３ ＡＰＲ，１－７（２０１２）．
３４．Ｈｅｓｓｖｉｋ，Ｎ．Ｐ．＆Ｌｌｏｒｅｎｔｅ，Ａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｏｎ ｅｘｏｓｏｍｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７５，１９３－２０８（２０１８）．
３５．Ｓｋｏｔｌａｎｄ，Ｔ．，Ｈｅｓｓｖｉｋ，Ｎ．Ｐ．，Ｓａｎｄｖｉｇ，Ｋ．＆Ｌｌｏｒｅｎｔｅ，Ａ．Ｅｘｏｓｏｍａｌ ｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｔｈｅｒ ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅｓ ｉｎ ｅｘｏｓｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．６０，９－１８（２０１９）．
３６．Ａｎｄｒｅｕ，Ｚ．＆Ｙａｎｅｚ－Ｍｏ，Ｍ．Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，１－１２（２０１４）．
３７．Ｋｏｗａｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１３，Ｅ９６８－Ｅ９７７（２０１６）．
３８．Ｃａｖａｌｌａｒｏ，Ｓ．Ｃｒａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｄｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．６，ｅ１９６３－３（２０１５）．
３９．Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｒ．，Ｚｕｂａｉｒ，Ｈ．，Ｐｕｒｓｅｌｌ，Ｓ．＆Ｓｈａｈａｂ，Ｍ．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｂｒａｉｎ Ｓｃｉ．８，（２０１８）．
４０．Ｓｐａｌｄｉｎｇ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＸＤｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎｓ．Ｃｅｌｌ １５３，１２１９（２０１３）．
４１．Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．Ａ．＆Ａｃｋｅｒｍａｎ，Ｓ．Ｌ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ，ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ，ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１，７８５－７９３（２００３）．
４２．Ｌｅｅ，Ｂ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｉｓ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ ５，１８７－１９５（２００６）．
４３．Ｐｉｅｃｈｏｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｓ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ？Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７，８１０９９－８１１０９（２０１６）．
４４．ｄｅ Ｍｅｒａ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｖｉａｎ ｒｅｔｉｎａ．Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２４８，８５０－８６５（２０１９）．
４５．Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｔ．，Ｓｈｉｍａｄａ，Ｒ．，Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｋａｗａｍａｔａ，Ｔ．＆Ｋｉｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｃｅｒｅｂｒｕｍ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １４，１－１７（２０１９）．
４６．Ｂｏｌｏｓ，Ｍ．，Ｈｕ，Ｙ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．Ｍ．，Ｆｏａ，Ｌ．＆Ｓｍａｌｌ，Ｄ．Ｈ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｍｙｌｏｉｄ－β ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９，３１２５３－３１２６１（２０１４）．
４７．Ｂｏｒｄｅｙ，Ａ．，Ｌｙｏｎｓ，Ｓ．Ａ．，Ｈａｂｌｉｔｚ，Ｊ．Ｊ．＆Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｈ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．
８５，１７１９－１７３１（２００１）．４８．Ｌａｂｒｏ，Ａ．Ｊ．，Ｐｒｉｅｓｔ，Ｍ．Ｆ．，Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｎｙｄｅｒｓ，Ｄ．Ｊ．＆Ｂｅｚａｎｉｌｌａ，Ｆ．Ｋｖ ３．１ ｕｓｅｓ ａ ｔｉｍｅｌｙ ｒｅｓｕｒｇｅｎｔ Ｋ＋ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏ ｓｅｃｕｒｅ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６，１－１２（２０１５）．
４９．Ｄｅｖｌｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ｈａｒｂｏｕｒｉｎｇ ＴＡＲＤＢＰ ｏｒ Ｃ９ＯＲＦ７２
ＡＬＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｐｉｔｅ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６，１－１２

他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は例示を意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲内である。

本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される、全ての参考文献、例えば、米国特許、米国特許出願公開、米国で公開された外国特許及び特許出願を指定するＰＣＴ特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用されるアクセッション番号によって示されるＧＥＮＢＡＮＫ及びＮＣＢＩの提出物は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用される他の全ての公開された参考文献、文書、原稿及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。更に、材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

本発明は、その好ましい実施形態を参照して特に示され説明されてきたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更がなされ得ることが当業者によって理解されるであろう。

Claims (40)

1. グリア細胞由来細胞外小胞を含み、前記細胞外小胞が、以下のもの、ｍｉＲＮＡ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ｓｉＲＮＡ、ｖＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＤＮＡ、テトラスパニン、アミノ酸、代謝産物、シグナル伝達タンパク質、シャペロン、細胞骨格タンパク質、酵素、又はそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含む、組成物。
2. 前記グリア細胞由来細胞外小胞が、ｍｉＲＮＡ－２１、ｍｉＲＮＡ－１３２、ｍｉＲＮＡ－９、ｍｉＲＮＡ－２７ａ、ｍｉＲＮＡ－２２１、ｍｉＲＮＡ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－３６１、ｍｉＲＮＡ－２７４、ｍｉＲ－８７３ａ－５ｐ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９ ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶｒｈ１０、グリア細胞由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、ＧＦＡＰ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記グリア細胞由来細胞外小胞が、２Ｄ又は３Ｄ培養物中のアストロサイト、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、ミクログリア、又は衛星細胞に由来する、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記細胞が哺乳動物初代単離細胞又は哺乳動物幹細胞である、請求項３に記載の組成物。
5. 前記幹細胞が人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、又は間葉系幹細胞を含む、請求項４に記載の組成物。
6. 前記細胞外小胞が、ＡＡＶ９、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ６、ＡＡＶ５、ＡＡＶ１、又はＡＡＶ２を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記グリア細胞由来細胞外小胞が、遺伝子組換えタンパク質又はその断片を前記細胞外小胞の表面上で発現するために、前記タンパク質又はその断片を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記遺伝子組換えタンパク質が、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、テトラスパニン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン－３、ＩＣＡＭ－１、インテグリンα４、ＬｉＣＡＭ、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ－１、Ｖｔｉ－１Ａ及びＢ、ＣＸＣＲ４、ＦｃＲ、ＧｌｕＲ２／３、ＨＬＡ－ＤＭ、免疫グロブリン、ＭＨＣ－１、ＭＨＣ－２、又はＴＣＲβを含む、請求項７に記載の組成物。
9. 前記遺伝子組換えタンパク質が、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）、破傷風毒素断片Ｃ、又はＲＧＤペプチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項７に記載の組成物。
10. 前記細胞外小胞が約１０ｎｍ～約１０００ｎｍの直径を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記細胞外小胞が約５０ｎｍ～約２００ｎｍの直径を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
12. 以下の工程を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞外小胞を調製する方法：
    培地中で細胞を培養することであって、前記細胞は前記細胞外小胞を前記培地中へ分泌することによって放出すること、
    前記培地の上清を回収すること、前記細胞外小胞を含む前記上清を分画すること、及び、前記細胞外小胞を単離すること。
13. 超遠心分離、限外濾過、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）、又はそれらの組み合わせによる分画を更に含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記細胞が、ヒト神経外胚葉、末梢神経系における神経支持細胞、又は中枢神経系における神経支持細胞に由来する、請求項１１又は１２に記載の方法。
15. 前記細胞が、２Ｄ又は３Ｄ培養物中のアストロサイト、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、ミクログリア、又は衛星細胞を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. １つ又は複数の真空媒介遠心分離工程を更に含み、前記真空媒介遠心分離が生細胞、死細胞片、より大きな細胞片、又はそれらの組み合わせを除去する、請求項１２～１５の一項に記載の方法。
17. 有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象の神経障害を治療する方法。
18. 前記神経障害が、外傷性末梢神経損傷、化学療法誘発性末梢神経障害、外傷性脳損傷、脳卒中、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、前頭側頭葉型認知症、ハンチントン病、多発性硬化症、先天性筋無力症、失行、筋緊張亢進、重症筋無力症、又は脊髄性筋萎縮症を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記組成物が局所的又は全身的に投与される、請求項１７又は１８に記載の方法。
20. 前記組成物が、静脈内、髄腔内、超音波、又は皮下投与を介して投与される、請求項１７又は１８に記載の方法。
21. 前記対象が神経障害に罹患していると特定され、前記組成物が前記特定された対象に投与される、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記対象が神経障害に感受性であると特定され、前記組成物が前記特定された対象に投与される、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記対象が哺乳動物である、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記対象がヒトである、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
25. 有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、前記対象におけるニューロンアポトーシス、ニューロン老化、神経突起伸長、シナプス機能又は電気生理学的機能を予防又は治療する方法。
26. 前記ニューロンアポトーシス、ニューロン老化、神経突起伸長、シナプス機能又は電気生理学的機能が、細胞死、神経突起変性、異常な静止膜電位、異常な反復発火挙動、再分極速度、及び活動電位発火頻度を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ニューロンアポトーシスが、前記組成物を投与されていない患者と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は１００％減少する、請求項２５又は２６に記載の方法。
28. 前記電気生理学的機能が、前記組成物を投与されていない患者と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、１５０％、又は２００％増加する、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 神経突起伸長が、前記組成物を投与されていない患者と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、１５０％、又は２００％増加する、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. シナプス形成／機能が、前記組成物を投与されていない患者と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、１５０％、又は２００％増加する、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 以下の工程を更に含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法：
    ニューロンアポトーシス、ニューロン老化、神経突起伸長、シナプス機能又は電気生理学的機能に損傷があるとして対象を特定すること；及び
    前記特定された対象に前記組成物を投与すること。
32. 以下の工程を更に含む、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法：
    ニューロンアポトーシス、ニューロン老化、神経突起伸長、シナプス機能又は電気生理学的機能に感受性であるとして対象を特定すること；及び
    前記特定された対象に前記組成物を投与すること。
33. 前記対象がヒトである、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. グリア細胞由来細胞外小胞を含み、前記細胞外小胞が１つ又は複数の遺伝子編集ツールを含み、前記遺伝子編集ツールが、遺伝子編集タンパク質、ＲＮＡ分子及び／又はリボ核タンパク質を含む、組成物。
35. 前記遺伝子編集タンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＭｅｇａＴＡＬ、Ｃａｓタンパク質、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、又はＦｌｐリコンビナーゼである、請求項３４に記載の組成物。
36. 前記ＲＮＰがＣａｓタンパク質を含む、請求項３４に記載の組成物。
37. 前記組成物が請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞外小胞の組成物を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の組成物。
38. 請求項１～１１又は請求項３４～３７のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞にインビトロで投与することを含む、細胞の集団をインビトロで処置する方法。
39. 前記細胞が幹細胞又は前駆細胞である、請求項３４に記載の方法。
40. 請求項３８又は３９に記載の方法によって産生される幹細胞又は前駆細胞の集団。

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