JP2022551554A - 遺伝子構築物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、神経変性障害、例えば、パーキンソン病(PD)を治療するための遺伝子治療及び方法のための、遺伝子構築物、発現カセット並びにこのような構築物及びカセットを含む組換えベクターの使用に関する。構築物は、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)をコードする第1のコード配列、及びGTPシクロヒドロラーゼ1(GCH1)をコードする第2のコード配列に動作可能に結合されるプロモーターを含む。第2のコード配列は、第1のコード配列に対して3'であり、第1及び第2のコード配列は、単一オペロンの一部であり、ここで、遺伝子構築物は、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)をコードしない。構築物は、対象の脳脊髄液(CSF)に送達される。

Description

本発明は、神経変性障害、例えば、パーキンソン病(PD)を治療するための遺伝子治療及び方法のための、遺伝子構築物、発現カセット並びにこのような構築物及びカセットを含む組換えベクターの使用に関する。
パーキンソン病は、線条体におけるドーパミン産生細胞の減少と関連する神経変性疾患である。脳細胞によるドーパミンの産生に必要な3つの酵素:チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、GTPシクロヒドロラーゼ1(GCH1)及び芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)が存在する。TH及びGCH1により、チロシンからのL-DOPA(ドーパミンの前駆体)の産生が制御され、AADCにより、L-DOPAがドーパミンに変換される。パーキンソン病のための現在の治療選択肢は、L-DOPAの経口投与を含み、このL-DOPAは、ドーパミンとは対照的に、血液脳関門を越えて吸収される。AADCがパーキンソン病患者の脳になお存在するため、この治療は、効果的である。
しかし、経口L-DOPA治療に関する問題は、これにより副作用、例えば、異常運動が引き起こされ得ることである。このような副作用は、血液及び脳におけるL-DOPAのレベルの変動のためであると考えられ、この変動は、L-DOPAの短い半減期、並びに腸粘膜及び血液脳関門を越える変わりやすい吸収に起因し、この変わりやすい吸収は、能動輸送における他のアミノ酸との競合から生じる(Lees、April 2008、The Importance of Steady-State plasma DOPA levels in reducing motor fluctuations in Parkinson's disease、Expert Roundtable Supplement、CNS Spectr 13:4 (Suppl 7)4～7頁)。
L-DOPAの定常な血液及び脳レベルをもたらす徐放経口製剤にL-DOPAを製剤化する多くの試みが行われている。これらの試みは、成功していない。現在、定常な血漿L-DOPAレベルをもたらすための最も有効な方法では、患者の腹壁を通したチューブを介して患者の空腸へ直接的にL-DOPAゲル製剤を一定に緩徐に注入することを必要とする。L-DOPAの更に安定な血漿レベルにより、症候制御の著しい向上及びジスキネジアの減少が生じる(OlanowらContinuous intrajejunal infusion of levodopa-carbidopa intestinal gel for patients with advanced Parkinson's disease: a randomised, controlled, double-blind, double-dummy study. The Lancet Neurology 13巻 February 2014)。しかし、大型ポンプを運搬し、ゲルを毎日新たに供給するための、腹壁を通したチューブ(移動、よじれ、閉塞及び感染症を含む有害事象を有する)に対する生涯にわたる要件により、この治療の使用が制限され、これによって、特に、PDを有する高齢患者には、最適以下となっている。
したがって、最患部脳領域、すなわち、線条体へ直接的に遺伝子治療を標的化することによる、パーキンソン病患者におけるドーパミンレベルを回復させる多くの試みが、複数の著者により行われている。前臨床及び臨床試験では、種々の構築物(TH、GCH及びAADCを送達する3つのAAVベクターの混合物(Muramatsu 10 February、2002、Behavioral Recovery in a Primate Model of Parkinson's disease by Tripe Transduction of Striatal Cells with Adeno-Associated Viral (AAV) Vectors Expressing dopamine- Synthesizing Enzymes、Human Gene Therapy、12: 345～354)、3つ全ての遺伝子を有する単一トリシストロン性Lenteベクター又はTH及びGCHのみを有するバイシストロン性AAVベクター(国際公開第2013/061076号及び国際公開第2010/055209号)を含む)による一部の作用が示された。Rosenbladらは、線条体へ直接的に投与してL-DOPAを産生させる、チロシンヒドロキシラーゼ及びGCH1を発現するバイシストロン性AAVを評価した。しかし、遺伝子治療構築物の患者の線条体への直接的注射と関連する多数の問題及び複雑性が存在し、(a)ベクター標的化、(b)線条体全体への十分なベクター分布の達成、(c)患者の脳を両側的に治療する必要性、(d)脳組織への注射であるため、対流増強送達(convection enhanced delivery)と呼ばれるプロセスにより非常に緩徐に行うことによって損傷を回避し、また、ニードル外部に沿った逆流を回避する、すなわち、最も抵抗の少ない方法をとる必要があること、(e)複数の穿刺経路(needle tracts)が通常必要とされ、このプロセスによって約3～10時間の神経外科手術時間がかかることを含む。
本発明は、先行技術に内在する1つ又は複数の問題に対処しようと努力するものである。
国際公開第2013/061076号 国際公開第2010/055209号 国際公開第2018215787号 国際公開第2013/061076号 国際公開第2013119371号
Lees、April 2008、The Importance of Steady-State plasma DOPA levels in reducing motor fluctuations in Parkinson's disease、Expert Roundtable Supplement、CNS Spectr 13:4 (Suppl 7)4～7頁 OlanowらContinuous intrajejunal infusion of levodopa-carbidopa intestinal gel for patients with advanced Parkinson's disease: a randomised, controlled, double-blind, double-dummy study. The Lancet Neurology 13巻February 2014 Muramatsu 10 February、2002、Behavioral Recovery in a Primate Model of Parkinson's disease by Tripe Transduction of Striatal Cells with Adeno-Associated Viral (AAV) Vectors Expressing dopamine- Synthesizing Enzymes、Human Gene Therapy、12: 345～354 Daubner SC, Lohse DL, Fitzpatrick ' PF. Expression and characterization of catalytic and regulatory domains of rat tyrosine hydroxylase.hydroxylase. Protein Sci. 1993;2:1452～60 Furler S、Paterna J-C、Weibel M及びBueler H Recombinant AAV vectors containing the foot and mouth disease virus 2A sequence confer efficient bicistronic gene expression in cultured cells and rat substantia nigra neurons Gene Ther. 2001、8巻、864～873頁 Wang YらScientific Reports 2015、5 http://www.iresite.org/ New Messenger RNA Research Communications(ISBN:1-60021-488-6) Luら、2017、「A 5' Noncoding Exon Containing Engineered Intron Enhances Transgene Expression from Recombinant AAV Vectors in vivo」、Human Gene Therapy、28巻、125～134頁 Matsushitaら、Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy (1998) 5、938～945 Thompsonら、1994、Nucleic Acids Research、22、4673～4680 Thompsonら、1997、Nucleic Acids Research、24、4876～4882
本発明者は、GCH1及びTHの産生の向上を生じ、これにより、神経変性疾患、特に、カテコールアミン機能障害と関連する疾患、例えば、パーキンソン病のための治療の改良方法における使用に適するAAVに基づく新規の遺伝子構築物を、これまでに開発した(国際公開第2018215787号)。発明者は、遺伝子治療を使用して、ドーパミンのレベルの低下に関わるパーキンソン病及び他の脳障害を治療する新規の方法を開発した。本発明では、線条体を標的化して、脳において基質を増加させることを一般に必要としないが、AADCの本質的な選択的領域分布により、脳の標的領域における所望の神経伝達物質(ドーパミン)の増加の選択的標的化を達成する、遺伝子治療を使用する。
このようなこれまでの研究に基づいて、本発明者は、くも膜下腔内に(すなわち、脳脊髄液中に)AAVベクターを注射することにより、ベクターを線条体に直接的に送達する困難を回避するが、それでもなおドーパミンレベルの回復が、AADCの本来の発現を有する脳の関連領域を標的化すると仮定した。
したがって、本発明者は、本発明の構築物をCSF中に投与する2つの経路、すなわち第1は脳室内への注射を含み、第2は大槽内への注射について、ラットにおいて試験を実施した。驚いたことには、本発明者は、本発明の構築物を脳脊髄液(CSF)中に送達することにより、線条体ドーパミン受容体を介するフィードバック阻害と整合して、CSF中で驚くほど高レベルのL-DOPAの生成し、及びその後の線条体における線条体内ドーパミンの減少をもたらすことが可能であることを観察し、これにより、非標的化遺伝子治療を使用した脳における基質の増加によって、AADCの本来の選択的領域分布を原因とする、更に標的化した作用が達成可能であることが実証された。
本発明のより良い理解のため及びこの実施形態を実行に移し得る方法を示すために、例として添付する図面に、ここで言及する。
図1は、第1の実施形態の本発明の構築物のプラスミドマップであり、配列番号13の特徴を示す。 図2は、第2の実施形態の本発明の構築物のプラスミドマップであり、配列番号14の特徴を示す。 図3は、第3の実施形態の本発明の構築物のプラスミドマップであり、配列番号15の特徴を示す。 図4は、第4の実施形態の本発明の構築物のプラスミドマップであり、配列番号16の特徴を示す。 図5は、第5の実施形態の本発明の構築物のプラスミドマップであり、配列番号17の特徴を示す。 図6は、第6の実施形態の本発明の構築物のプラスミドマップであり、配列番号18の特徴を示す。 図7は、第7の実施形態の本発明の構築物のプラスミドマップであり、配列番号19の特徴を示す。 図8は、第8の実施形態の本発明の構築物のプラスミドマップであり、配列番号20の特徴を示す。 図9は、本発明の構築物の一実施形態のくも膜下腔内注射により処置したラットが、14日後にCSF中のL-DOPAレベルの上昇を呈することを示す。前AAVベースラインDOPAは、注射の初回時点のDOPA濃度を指す第1の対照であり(前AAV)、第2の対照は、構築物に曝露されていない14日目の対象におけるDOPAレベルである(無AAV)。 図10は、本発明の構築物の一実施形態のくも膜下腔内注射により処置したラットが、CSF中のドーパミンレベルの上昇を呈することを示す。対照は、注射の初回時点のドーパミン濃度を指す(前AAV)。 図11は、本発明の構築物の一実施形態のくも膜下腔内注射により処置したラットが、線条体における細胞内ドーパミンレベルの低下を呈することを示す。対照は、AAV投与から14日後のドーパミン濃度を指す(14日目の無AAV対照)。 図12は、側脳室又は大槽のいずれかへのくも膜下腔内注射により、線条体細胞内ドーパミンレベルにおいて類似する低下が生じたことを示す。
したがって、本発明の第1の態様によって、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)をコードする第1のコード配列、及びGTPシクロヒドロラーゼ1(GCH1)をコードする第2のコード配列に動作可能に結合されるプロモーターを含む、対象における神経変性障害の治療、予防、又は改善における使用のための遺伝子構築物であって、第2のコード配列が、第1のコード配列に対して3'であり、第1及び第2のコード配列が、単一オペロンの一部であり、遺伝子構築物が、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)をコードせず、対象の脳脊髄液(CSF)に送達される、遺伝子構築物を提供する。
有利なことには、本発明者は、神経変性疾患に罹患している対象に構築物を送達するための極めて新規の投与経路を同定した。これにより、パーキンソン病(PD)のような症状を治療するための驚くほど有効な手法がもたらされる。図9に示すように、本発明の構築物をCSFに送達すると、CSF中のL-DOPA濃度が驚くほど上昇する。その上、図10に示すように、CSF中のL-DOPAは、AADCによりCSF中でドーパミンに脱炭酸される。更に、図11では、線条体における細胞内ドーパミンレベルも有意に低下することが示される。これにより、線条体外で産生された、例えば、CSFに及び程度は少ないが脳全体のニューロンに隣接する形質導入された上衣及び組織により異所的に産生された、L-DOPA及びドーパミンが、血液供給及び/又は血管周囲腔における細胞外液の拍動流によって線条体に輸送され得るという証拠がもたらされる。細胞外線条体におけるドーパミン及びL-DOPAのレベルの上昇により、ドーパミン作動性の局所的刺激が回復する。この結果により、この回復が、生存するドーパミン作動性細胞における更なる局所的ドーパミン産生のフィードバック阻害を生じるのに十分であることが実証される。これは、生物学的に有効なレベルに達していることを意味する。
したがって、ベクターを使用してCSF及び脳の細胞外液中のL-DOPAのレベルを上昇させることにより、代替ソースであるL-DOPA基質が供給されて、ドーパミン産生は病理学的に少ないがAADC活性は十分である領域、例えば、パーキンソン病線条体において、ドーパミンの回復を部分的に再び完了させることが可能となり得る。CSF及び脳レベルは、更に安定し、経口L-DOPA治療により経験する急性の変動は有しない。本発明では、脳全体を上昇レベルのL-DOPAに曝露するが、L-DOPAの経口投与を用いた40年を超える臨床経験により、上昇レベルのDOPAへの他の脳領域の長期曝露は、良好に許容されることが示される。経口治療に固有の脳L-DOPAレベルのピーク及びトラフは回避される。これにより、線条体におけるドーパミンレベルの変動の低下が生じ、これが、パーキンソン病(又は脳ドーパミンの減少による他の症状)の症候制御の向上及びL-DOPA誘導性ジスキネジアのリスクの低下をもたらす。
したがって、線条体外で構築物を発現する細胞により産生されるL-DOPAは、CSFに侵入し、CSFから線条体の細胞外空間内に拡散し、局所的残留AADCによりドーパミンに変換されてPDの症候を軽減するのに有効となる。
有利なことには、遺伝子治療構築物のCSFへの送達により、能動輸送における他のアミノとの競合から生じる腸粘膜及び血液脳関門を越える変わりやすい吸収が回避され得るため、経口L-DOPA治療に関連する副作用、例えば、異常運動が確実に回避可能である。加えて、CSFへの送達が、先行技術において現在、記載されている、患者の線条体への遺伝子治療構築物の直接的注射よりも簡易、安全であり、時間がかからないことが容易に理解される。ベクターの注射は、数時間もかからず数分で達成することができる。
好ましくは、構築物は、注射によりCSFに送達される。構築物の1又は複数回の注射を実行して、構築物をCSFに送達し得る。しかし好ましくは、構築物は、単回注射によりCSFに送達される。
好ましくは、構築物は、くも膜下腔内注射によりCSFに送達される。より好ましくは、遺伝子構築物は、脳室系、大槽、及びL3/L4、L4/L5又はL5/S1の腰椎間から選択される群の1つ又は複数を介してCSFに送達される。より好ましくは、遺伝子構築物は、脳室系又は大槽を介して、好ましくは、単回注射により、CSFに送達される。
一実施形態では、構築物は、L3/L4、L4/L5又はL5/S1の腰椎間を介してCSFに送達される。有利なことには、注射する組成物への造影剤の追加により、脳への構築物の有効な送達が可能となり、ここで、L3/L4、L4/L5又はL5/S1の腰椎間への遺伝子構築物の注射後に頭部を低くする場合、造影剤による質量の増加によって、脳への構築物の輸送が可能となる。脳への造影剤とこれによる本発明の構築物との送達手段は、トレンデレンブルグ傾斜台の使用によるものであってもよく、このような方法は、当業者に周知である。したがって、使用は、造影剤及び構築物の注入中、患者を約10～40度、好ましくは、約15～30度、頭低位に、すなわち、足を頭上に上げて仰臥位に傾斜させることを含み得る。
したがって、使用は、本発明の遺伝子構築物と組み合わせた造影媒体の注射を更に含み得る。
造影媒体は、任意の適する非イオン水溶性造影媒体であってもよく、これは、当業者に公知である。好ましくは、造影媒体は、イオヘキソールであってもよく、当業者は、これをオムニパーク180(商標)と称されてよいことを理解する。
本発明者は、特に驚くべきことに、本発明の構築物を有する線条体細胞を標的化することを必要とせず、CSFへの構築物の送達により、線条体外部の細胞、例えば、CSF周囲の脳室上衣及び/又は軟髄膜細胞による構築物の取込みが生じることを観察した。また、大槽内AAV9により、線条体外部の脳及び脊髄の殆どの領域にわたるニューロン及びアストロサイトが形質導入されることが知られる。次いで、形質導入細胞はL-DOPAを産生し、CSF、血液、及び細胞外液中に放出し、これが、線条体に輸送され得る。これにより、AADCの内因的発現を有する線条体におけるドーパミン産生の選択的増加が生じる。
したがって、一実施形態では、構築物は、線条体外部の細胞により実質的に発現する。好ましくは、構築物は、線条体外部の細胞により発現する。したがって、一実施形態では、構築物は、上衣細胞、軟髄膜細胞、並びに/又は脳及び脊髄にわたるニューロン及びアストロサイトにより発現する。より好ましくは、構築物は、上衣細胞及び/又は軟髄膜細胞により発現する。別の実施形態では、構築物は、線条体の細胞により選択的に発現しない。好ましくは、構築物は、線条体の細胞により実質的に発現しない。より好ましくは、構築物は、線条体の細胞により発現しない。
好ましくは、CSF DOPAレベルは、線条体内の生存するドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生のフィードバック阻害を引き起こすのに十分に上昇する。当業者は、線条体内の生存するドーパミン作動性細胞によるドーパミンのフィードバック阻害により、生理学的又は薬理学的に適切なレベルのドーパミンが達成されていることを指示し得ることを理解する。一実施形態では、CSF DOPAレベルは、5pmol/ml～20pmol/mlに上昇し得る。好ましくは、CSF DOPAレベルは、7pmol/ml～15pmol/mlに上昇し得る。最も好ましくは、CSF DOPAレベルは、8pmol/ml～12pmol/mlに上昇し得る。当業者は、「pmol」は、10-12mol/mlを指すことを理解する。
一実施形態では、治療する神経変性障害は、カテコールアミン機能障害と関連する疾患である。好ましい実施形態では、カテコールアミン機能障害は、ドーパミンの欠乏により特徴づけられ得る。別の実施形態では、治療する障害は、パーキンソン病、DOPA応答性ジストニア、血管性パーキンソニズム、L-DOPA治療と関連する副作用、又はL-DOPA誘導性ジスキネジアからなる群から選択される。
より好ましい実施形態では、治療する神経変性障害は、パーキンソン病である。
一実施形態では、第1のコード配列は、ヒトTHをコードするヌクレオチド配列を含む。ヒトTHをコードするヌクレオチド配列は、以下に提示されるように、本明細書において配列番号1、又はその断片若しくはバリアントと呼ぶ。
Figure 2022551554000002
 [配列番号1]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号1に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましい一実施形態では、第1のコード配列は、ヒトTHをコードするヌクレオチド配列を含む。ヒトTHは、NCBI参照配列:NP_000351.2によるアミノ酸配列を有してもよく、これは、以下に提示されるように、本明細書において配列番号21、又はその断片若しくはバリアントと呼ぶ。
Figure 2022551554000003
 [配列番号21]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的配列番号21に提示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
別の実施形態では、第1のコード配列は、ヒト切断THをコードするヌクレオチド配列を含む。ヒト切断THは、触媒ドメインのみを有し、制御ドメインを除去したTHのバリアントである。THのドメイン及びこれらの役割は、Daubnerら(Daubner SC, Lohse DL, Fitzpatrick ' PF. Expression and characterization of catalytic and regulatory domains of rat tyrosine hydroxylase.hydroxylase. Protein Sci. 1993;2:1452～60)に記載されている。ヒト切断THは、以下に提示されるように、本明細書において配列番号2と呼ぶヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
Figure 2022551554000004
 [配列番号2]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号2に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましい一実施形態では、第1のコード配列は、ヒト切断THをコードするヌクレオチド配列を含む。ヒト切断THは、以下に提示されるように、本明細書において配列番号22と呼ぶアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
Figure 2022551554000005
 [配列番号22]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号22に提示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
或る実施形態では、第2のコード配列は、マウスGCH1をコードするヌクレオチド配列を含む。マウスGCH1をコードするヌクレオチド配列は、本明細書において、配列番号3、又はその断片若しくはバリアントと呼ぶ。
Figure 2022551554000006
 [配列番号3]
したがって、第2のコード配列は、実質的に配列番号3に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
好ましい実施形態では、第2のコード配列は、ヒトGCH1をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、ヒトGCHをコードする配列は、GenBank NM000161.2による配列であり得る。ヒトGCH1をコードするヌクレオチド配列は、以下に提示されるように、本明細書において配列番号4、又はその断片若しくはバリアントと呼ぶ。
Figure 2022551554000007
 [配列番号4]
したがって、好ましくは、第2のコード配列は、実質的に配列番号4に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましい一実施形態では、第2のコード配列は、ヒトGCH1をコードするヌクレオチド配列を含む。ヒトGCH1は、NCBI参照配列:NP_000152.1によるアミノ酸配列を有し得る。ヒトGCH1は、以下に提示されるように、本明細書において配列番号23と呼ぶアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
Figure 2022551554000008
 [配列番号23]
したがって、好ましくは、第2のコード配列は、実質的に配列番号23に提示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
6-ピルボイルテトラヒドロプテリン(PTPS)は、TH活性に必須の共同因子であるBH4の産生に必要なGCH1に次いで第2の律速酵素である。
したがって、一実施形態では、構築物は、6-ピルボイルテトラヒドロプテリン(PTPS)をコードする第3のコード配列を更に含んでもよく、ここで、第3のコード配列は、第2のコード配列に対して3'であり、単一オペロンの一部であり得る。
別の実施形態では、PTPS配列は、第2のコード配列に対して5'であり、単一オペロンの一部であり得る。例えば、第3のコード配列は、第1のコード配列の3'及び第2のコード配列の5'であり得るか、又は第3のコード配列は、第1のコード配列の5'及び第2のコード配列の5'であり得る。
好ましくは、構築物は、6-ピルボイルテトラヒドロプテリン(PTPS)をコードする第3のコード配列を含み、ここで、第3のコード配列は、第2のコード配列に対して3'であり、単一オペロンの一部である。
一実施形態では、第3のコード配列は、ヒトPTPSをコードするヌクレオチド配列を含む。
例えば、ヒトPTPSをコードする配列は、GenBank NM000317による配列であり得る。ヒトPTPSをコードするヌクレオチド配列は、以下に提示されるように、本明細書において配列番号32、又はその断片若しくはバリアントと呼ぶ。
Figure 2022551554000009
 [配列番号32]
したがって、好ましくは、第3のコード配列は、実質的に配列番号32に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
ヒトPTPSは、NCBI参照配列:NP000308.1によるアミノ酸配列を有し得る。ヒトPTPSは、以下に提示されるように、本明細書において配列番号33、又はその断片若しくはバリアントと呼ぶアミノ酸配列を含む。
Figure 2022551554000010
 [配列番号33]
したがって、好ましくは、第3のコード配列は、実質的に配列番号33に提示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
第1の態様による遺伝子構築物は、プロモーターを含む。プロモーターは、構成的プロモーター、活性化プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターを含む、任意の適するプロモーターであり得る。好ましい実施形態では、プロモーターは、治療に最も適する1つ又は複数の組織においてTH及びGCH1並びに任意選択でPTPSの生成が可能となるプロモーターである。実施形態では、プロモーターは、上衣及びニューロンにおける高発現が可能となるプロモーターである。プロモーターは、ニューロン特異的プロモーターであり得る。
或る実施形態では、プロモーターは、CMVプロモーターであり、この一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号25と呼ぶ。
Figure 2022551554000011
 [配列番号25]
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号25に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
或る実施形態では、プロモーターは、ヒトシナプシンプロモーターであり得る。実施形態では、プロモーターは、ヒトシナプシン1プロモーターである。ヒトシナプシンI(SYN I)プロモーターをコードする469ヌクレオチド配列の一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号5と呼ぶ。
Figure 2022551554000012
 [配列番号5]
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号5に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
一実施形態では、プロモーターは、チロシンヒドロキシラーゼプロモーターであってもよく、この一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号35と呼ぶ。
Figure 2022551554000013
 [配列番号35]
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号35に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
一実施形態では、プロモーターは、ヒト真核生物翻訳伸長因子1アルファ1プロモーターであってもよく、この一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号36と呼ぶ。
Figure 2022551554000014
 [配列番号36]
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号36に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
一実施形態では、プロモーターは、ヒト真核生物翻訳伸長因子1アルファ1短鎖型プロモーターであってもよく、この一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号37と呼ぶ。
Figure 2022551554000015
 [配列番号37]
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号37に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
一実施形態では、プロモーターは、サルウイルス40初期プロモーターであってもよく、この一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号38と呼ぶ。
Figure 2022551554000016
 [配列番号38]
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号38に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
一実施形態では、プロモーターは、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ(phosphoglycerated kinase)1プロモーターであってもよく、この一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号39と呼ぶ。
Figure 2022551554000017
 [配列番号39]
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号39に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
一実施形態では、プロモーターは、ヒトユビキチンCプロモーターであってもよく、この一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号40と呼ぶ。
Figure 2022551554000018
 [配列番号40]
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号40に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号5、25、35から40に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号5若しくは25に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
遺伝子構築物は、TH、GCH1及び任意選択でPTPSの発現を増加させるように構成した1つ又は複数のエンハンサーを更に含み得る。特に、構築物は、プロモーターと協働するように設計したエンハンサーを含み得る。例として、CMVプロモーターを含む構築物は、CMVエンハンサーも含み得る。
したがって、一実施形態では、CMVプロモーターは、CAG融合初期エンハンサーを含んでもよく、この一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号43と呼ぶ。
Figure 2022551554000019
 [配列番号43]
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号43に提示されるヌクレオチド配列、又はこのバリアント若しくは断片を含み得る。
一実施形態では、CMVプロモーターは、CBh融合初期エンハンサーを含んでもよく、この一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号44と呼ぶ。
Figure 2022551554000020
 [配列番号44]
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号44に提示されるヌクレオチド配列、又はこのバリアント若しくは断片を含み得る。
一実施形態では、エンハンサーは、CMVであってもよく、この一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号41と呼ぶ。
Figure 2022551554000021
 [配列番号41]
したがって、好ましくは、エンハンサーは、実質的に配列番号41に提示されるヌクレオチド配列、又はこのバリアント若しくは断片を含み得る。
一実施形態では、エンハンサーは、サルウイルス40エンハンサーであってもよく、この一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号42と呼ぶ。
Figure 2022551554000022
 [配列番号42]
したがって、好ましくは、エンハンサーは、実質的に配列番号42に提示されるヌクレオチド配列、又はこのバリアント若しくは断片を含み得る。
好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、第1及び第2のコード配列間に配置されるスペーサー配列を含む。このスペーサー配列は、単一プロモーターによる機能性THの産生及び機能性GCH1の産生が可能となるような配列である。ある実施形態では、スペーサー配列は、タンパク質合成の大きなプロセスの一部として、mRNA配列の中央に翻訳開始が可能となる配列を含む。
好ましい実施形態では、スペーサー配列は、分解されることによってTH及びGCH1を別々の分子として産生するように構成したペプチドスペーサーをコードするヌクレオチド配列を含み得る。特に好ましい実施形態では、スペーサー配列は、好ましくは、ウイルスペプチドスペーサー配列、より好ましくは、ウイルス2Aペプチドスペーサー配列を含み、これをコードする(Furler S、Paterna J-C、Weibel M及びBueler H Recombinant AAV vectors containing the foot and mouth disease virus 2A sequence confer efficient bicistronic gene expression in cultured cells and rat substantia nigra neurons Gene Ther. 2001、8巻、864～873頁)。好ましくは、2Aペプチド配列をコードするスペーサー配列は、第1のコード配列を第2のコード配列に結合させる。これにより、種々のベクターにおける発現により生じる、構築物のサイズ制限を克服することが可能となり、第1の態様の構築物によりコードされて単一プロモーターの制御下で生じるペプチドの全てを、単一タンパク質として発現させることが可能となる。したがって、TH、2Aペプチド及びGCH1の配列を含む単一タンパク質の翻訳後、ウイルス2Aペプチド配列の末端グリシン-プロリン結合において切断が生じ、これにより2つのタンパク質が遊離する。本明細書において提示するデータによって、ウイルス2Aペプチドスペーサー配列により分離された5'TH及び3'GCH1を含む構築物によって、驚くほど有効な遺伝子構築物が生じることが実証される(図1及び図2)。
好ましい実施形態では、スペーサーは、ウイルス2Aペプチドスペーサーを含み、フューリン切断部位を更に含む。上流のフューリン切断部位の挿入により、さもなければ上流のタンパク質に結合したままである2A残基の除去が可能となる。
或る実施形態では、ウイルス2A配列及びフューリン切断部位の両方をコードするペプチドスペーサーのヌクレオチド配列は、次のように、本明細書において配列番号8、又はその断片若しくはバリアントと呼び得る。
Figure 2022551554000023
 [配列番号8]
したがって、好ましくは、スペーサー配列は、実質的に配列番号8に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
2Aスペーサー配列は、任意の公知のバリアントであってもよく、Wang YらScientific Reports 2015、5に開示されているようにE2A、F2A、P2A及びT2Aと呼ぶ配列を含む。
一実施形態では、配列は、E2Aであり、次のように、本明細書において配列番号27と呼ぶ。
Figure 2022551554000024
 [配列番号27]
したがって、好ましくは、スペーサー配列は、実質的に配列番号27に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
一実施形態では、配列は、F2Aであり、次のように、本明細書において配列番号28と呼ぶ。
Figure 2022551554000025
 [配列番号28]
したがって、好ましくは、スペーサー配列は、実質的に配列番号28に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
一実施形態では、配列は、P2Aであり、次のように、本明細書において配列番号29と呼ぶ。
Figure 2022551554000026
 [配列番号29]
したがって、好ましくは、スペーサー配列は、実質的に配列番号29に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
一実施形態では、配列は、T2Aであり、次のように、本明細書において配列番号30と呼ぶ。
Figure 2022551554000027
 [配列番号30]
したがって、好ましくは、スペーサー配列は、実質的に配列番号30に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
或る実施形態では、2A配列は、2Aの効率を向上させる任意の配列が先行する、すなわち、この配列が2A配列に対して5'に位置し得る。実施形態では、2Aの効率を向上させる配列は、グリシン-セリン-グリシンスペーサー(GSG)であり、次のように、本明細書において配列番号31と呼ぶ。
Figure 2022551554000028
 [配列番号31]
好ましくは、2A配列では、配列番号31に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントが実質的に先行する。
或いは、スペーサー配列は、可動性リンカー(flexible linker)をコードする配列を含んでもよく、これにより、TH及びGCH1の両方の単一ポリペプチド鎖としての発現が可能となるが、ここで、TH及びGCH1は、独立性タンパク質として作用する。したがって、タンパク質は、これらがあたかも単独で発現したかのように、これらの作用を発揮する。本明細書において提示するデータによって、可動性リンカー配列を含むスペーサー配列により分離された5'TH及び3'GCH1を含む構築物によって、驚くほど有効な遺伝子構築物が生じることが実証される(図1)。
可動性リンカー配列は、国際公開第2013/061076(A1)号(Oxford Biomedica社)により開示されているものであってもよく、ここで、この公知のリンカーは、トリシストロン構築物に含まれた。可動性リンカー配列は、次のように、本明細書において配列番号9、又はその断片若しくはバリアントと呼び得る。
Figure 2022551554000029
 [配列番号9]
したがって、好ましくは、可動性リンカー配列は、実質的に配列番号9に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましい一実施形態では、可動性リンカー配列は、以下に提示されるように、本明細書において配列番号24と呼ぶアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
Figure 2022551554000030
 [配列番号24]
したがって、好ましくは、可動性リンカー配列は、実質的に配列番号24に提示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードする。
或いは、ウイルス2Aスペーサー又は可動性リンカー配列の代わりに、スペーサー配列は、内部リボソーム侵入部位(IRES)を含み得る。本明細書において提示するデータによって、IRESにより分離された5'TH及び3'GCH1を含む構築物によって、驚くほど有効な遺伝子構築物が生じることが明らかに実証される(図1及び図2)。実施形態では、IRESは、ピコルナウイルスIRESである。
他の実施形態では、IRESは、ライノウイルスIRES、A型肝炎ウイルスIRES、C型肝炎ウイルスIRES、ポリオウイルスIRES、エンテロウイルスIRES、カルジオウイルスIRES、アフトウイルスIRES、フラビウイルスIRES、ペスチウイルスIRES、クリパウイルス(cripavirus)IRES、ムギクビレアブラムシ(rhopalosiphum padi)ウイルスIRES又は任意の適するIRESから選択され得る。特に、IRESは、実験的に検証されたIRES構造のデータベースを提供する「IRESite」(http://www.iresite.org/)により記載されている任意のIRES、又は「New Messenger RNA Research Communications」(ISBN:1-60021-488-6)に開示されているものであり得る。
好ましい実施形態では、IRESは、口蹄疫ウイルス(FMDV)IRESであり、これは、次のように、配列番号6に提示されるIRES、又はその断片若しくはバリアントであり得る。
Figure 2022551554000031
 [配列番号6]
別の好ましい実施形態では、IRESは、脳心筋炎ウイルス(EMCV)IRESである。EMCV IRESは、次のように、配列番号7に提示されるIRES、又はその断片若しくはバリアントであり得る。
Figure 2022551554000032
 [配列番号7]
したがって、好ましくは、IRESは、実質的に配列番号6若しくは7に提示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
第3のコード配列が存在する実施形態では、遺伝子構築物は、第2及び第3のコード配列間に配置されるスペーサー配列を更に含み得る。このスペーサー配列により、単一プロモーターによる機能性THの産生、機能性GCH1の産生、及び機能性PTPSの産生が可能となる。好ましくは、第2及び第3のコード配列間のスペーサー配列は、第1及び第2のコード配列間のスペーサー配列として定義するものである。
或る実施形態では、遺伝子構築物は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント(WPRE)をコードするヌクレオチド配列を更に含んでもよく、これにより、2つの導入遺伝子の発現が増強される。好ましくは、WPREコード配列は、導入遺伝子コード配列の3'に配置される。特に、WPRE配列は、好ましくは、GCH1配列の3'である。好ましくは、第3のコード配列が存在する場合、WPRE配列は、好ましくは、PTPS配列の3'である。
WPREの一実施形態は、592bpの長さであり、ガンマ-アルファ-ベータエレメントを含み、次のように、本明細書において配列番号10と呼ぶ。
Figure 2022551554000033
 [配列番号10]
好ましくは、WPREは、実質的に配列番号10に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
しかし、好ましい実施形態では、切断WPREを使用し、これは、ベータエレメントの欠失のために247bpの長さであり、次のように、本明細書において配列番号11と呼ぶ。
Figure 2022551554000034
 [配列番号11]
好ましくは、WPREは、実質的に配列番号11に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、遺伝子構築物は、ポリA尾部をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ポリA尾部コード配列は、導入遺伝子コード配列の3'、好ましくは、WHPEコード配列の3'に配置される。
好ましくは、ポリA尾部は、224bpのサルウイルス40ポリA配列を含む。ポリA尾部の一実施形態は、次のように、本明細書において配列番号12と呼ぶ。
Figure 2022551554000035
 [配列番号12]
好ましくは、ポリA尾部は、実質的に配列番号12に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、遺伝子構築物は、左及び/又は右逆位末端反復配列(ITR)を含む。好ましくは、各ITRは、構築物の5'及び/又は3'末端に配置される。
好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、5'ITR、ヒトシナプシン1プロモーター又はCMVプロモーター、ヒト切断THをコードする配列、2Aフューリン配列、ヒトGCH1をコードする配列、WPREをコードする配列、ポリA尾部をコードする配列、及び3'ITRをこの特定の順序で含み得る。5'及び3'の使用は、この特徴が上流又は下流のいずれかであることを示し、この特徴が必然的な末端の特徴を示すことは意図していない。
特定の実施形態では、遺伝子構築物は、5'ITR、ヒトシナプシン1プロモーター又はCMVプロモーター、ヒト切断THをコードする配列、可動性リンカー、ヒトGCH1をコードする配列、WPREをコードする配列、ポリA尾部をコードする配列、及び3'ITRをこの特定の順序で含み得る。
特定の実施形態では、遺伝子構築物は、5'ヒトシナプシン1プロモーター又はCMVプロモーター、ヒト切断THをコードする配列、IRES、及びヒトGCH1をコードする3'配列をこの特定の順序で含む。
特定の実施形態では、遺伝子構築物は、5'ITR、ヒトシナプシン1プロモーター又はCMVプロモーター、ヒト切断THをコードする配列、IRES、ヒトGCH1をコードする配列、WPREをコードする配列、ポリA尾部をコードする配列、及び3'ITRをこの特定の順序で含み得る。
ヒトPTPSをコードする配列が存在する実施形態では、遺伝子構築物が、ヒトTH、GCH1及びPTPSをコードする配列を5'から3'の任意の順序で、このような配列間に存在するリンカー配列の任意の組合せにより含み得ることを、当業者は理解する。
好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、5'ITR、ヒトシナプシン1プロモーター又はCMVプロモーター、ヒト切断THをコードする配列、フューリン2A配列、ヒトGCH1をコードする配列、フューリン2A配列、ヒトPTPSをコードする配列、WPREをコードする配列、ポリA尾部をコードする配列、及び3'ITRをこの特定の順序で含み得る。
特定の実施形態では、遺伝子構築物は、5'ITR、ヒトシナプシン1プロモーター又はCMVプロモーター、ヒト切断THをコードする配列、可動性リンカー、ヒトGCH1をコードする配列、可動性リンカー、ヒトPTPSをコードする配列、WPREをコードする配列、ポリA尾部をコードする配列、及び3'ITRをこの特定の順序で含み得る。
特定の実施形態では、遺伝子構築物は、5'ヒトシナプシン1プロモーター又はCMVプロモーター、ヒト切断THをコードする配列、IRES、ヒトGCH1をコードする配列、IRES及びヒトPTPSをコードする3'配列をこの特定の順序で含む。5'及び3'の使用は、この特徴が上流又は下流のいずれかであることを示し、この特徴が必然的な末端の特徴を示すことは意図していない。
特定の実施形態では、遺伝子構築物は、5'ITR、ヒトシナプシン1プロモーター又はCMVプロモーター、ヒト切断THをコードする配列、IRES、ヒトGCH1をコードする配列、IRES、ヒトPTPSをコードする配列、WPREをコードする配列、ポリA尾部をコードする配列、及び3'ITRをこの特定の順序で含み得る。
特定の実施形態では、遺伝子構築物は、5'ITR、ヒトシナプシン1プロモーター又はCMVプロモーター、ヒト切断THをコードする配列、フューリン2A配列、ヒトPTPSをコードする配列、フューリン2A配列、ヒトGCH1をコードする配列、WPREをコードする配列、ポリA尾部をコードする配列、及び3'ITRをこの特定の順序で含み得る。
特定の実施形態では、遺伝子構築物は、5'ITR、ヒトシナプシン1プロモーター又はCMVプロモーター、ヒトPTPSをコードする配列、フューリン2A配列、ヒト切断THをコードする配列、フューリン2A配列、ヒトGCH1をコードする配列、WPREをコードする配列、ポリA尾部をコードする配列、及び3'ITRをこの特定の順序で含み得る。
特定の実施形態では、遺伝子構築物は、5'ITR、ヒトシナプシン1プロモーター又はCMVプロモーター、ヒトGCH1をコードする配列、フューリン2A配列、ヒト切断THをコードする配列、フューリン2A配列、ヒトPTPSをコードする配列、WPREをコードする配列、ポリA尾部をコードする配列、及び3'ITRをこの特定の順序で含み得る。
遺伝子構築物の一実施形態は、図10に示し、本明細書において配列番号18と呼ぶ。この特定の実施形態は、CMVプロモーター及びマウスGCH1を含み、このような特徴は、当業者により、本明細書に開示する他のバリアントに容易に置換可能である。
Figure 2022551554000036
Figure 2022551554000037
Figure 2022551554000038
Figure 2022551554000039
 [配列番号18]
好ましくは、遺伝子構築物は、実質的に配列番号18に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
遺伝子構築物の一実施形態は、図11に示し、本明細書において配列番号19と呼ぶ。この特定の実施形態は、CMVプロモーター及びマウスGCH1を含み、このような特徴は、当業者により、本明細書に開示する他のバリアントに容易に置換可能である。マウス型のGCH1は、構築物の前臨床試験を容易とするためのものである。マウス型のGCH1は、当業者により容易に置換することができ、例えば、マウス型は、ヒト型のGCH1により置換し得る。
Figure 2022551554000040
Figure 2022551554000041
Figure 2022551554000042
 [配列番号19]
好ましくは、遺伝子構築物は、実質的に配列番号19に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
遺伝子構築物の一実施形態は、図12に示し、本明細書において配列番号20と呼ぶ。この特定の実施形態は、CMVプロモーター及びマウスGCH1を含み、このような特徴は、当業者により、本明細書に開示する他のバリアントに容易に置換可能である。マウス型のGCH1は、構築物の前臨床試験を容易とするためのものである。マウス型のGCH1は、当業者により容易に置換することができ、例えば、マウス型は、ヒト型のGCH1により置換し得る。
Figure 2022551554000043
Figure 2022551554000044
Figure 2022551554000045
 [配列番号20]
好ましくは、遺伝子構築物は、実質的に配列番号20に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
本明細書において記載するように、第1の態様の遺伝子治療構築物を、くも膜下腔内、すなわち、脳脊髄液中に注射することにより、L-DOPA(及びドーパミン)のCSFレベルを上昇させ、パーキンソン病患者の線条体におけるL-DOPA及びドーパミンレベルに影響させる、新規かつ洗練された経路としてこれを使用することが、驚くべきことに可能である。くも膜下腔内注射の使用の更なる利点は、これにより、経口L-DOPA治療を使用する場合に経験する副作用が回避され、患者の脳の線条体領域への直接的注射の不利益も回避されることである。
この目的のために、本発明者らは、パーキンソン病の治療における使用のための、本発明の構築物を含む一連の組換え発現ベクターを作製した。
したがって、第2の態様によって、第1の態様による使用のための、遺伝子構築物を含む組換えベクターを提供する。
第1の態様により考察したように、本発明者らは、構築物を線条体細胞において発現させることを必要とせず、このため、ベクターに線条体細胞を標的化させることを必要としないことを、驚くべきことに見出した。したがって、好ましくは、ベクターは、修飾カプシドを含まない。
一実施形態では、ベクターは、CSF近傍の上衣細胞及び/又は隣接組織を標的化するように構成する。
組換えベクターは、組換えAAV(rAAV)ベクターであり得る。rAAVは、天然に存在するベクター又はハイブリッドAAV血清型を有するベクターであり得る。rAAVは、AAV-1、AAV-2、AAV-3A、AAV-3B、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10及びAAV-11であり得る。好ましくは、rAAVは、神経組織に対する指向性を有する。好ましい実施形態では、rAAVは、AAV1、AAV5、より好ましくは、AAV9であり得る。
「組換えAAV(rAAV)ベクター」の用語は、本明細書において使用する場合、少なくとも1つの末端反復配列を含む組換えAAV由来核酸を意味し得る。
本明細書において配列番号15と呼ぶ次の配列は、以下に示す配列番号13に類似するベクターを示すが、この好ましい実施形態は、EMCV IRESの代わりに、フューリン切断部位及びウイルス2Aペプチドスペーサーを含む。配列番号15を含むプラスミドの特徴を示すマップは、図3に示す。
Figure 2022551554000046
Figure 2022551554000047
Figure 2022551554000048
 [配列番号15]
好ましくは、ベクターは、実質的に配列番号15に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
本明細書において配列番号16と呼ぶ次の配列は、配列番号13に類似するベクターを示すが、この特定の実施形態は、EMCV IRESの代わりに可動性リンカーを含む。配列番号16を含むプラスミドの特徴を示すマップは、図4に示す。
Figure 2022551554000049
Figure 2022551554000050
Figure 2022551554000051
 [配列番号16]
好ましくは、ベクターは、実質的に配列番号16に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
或る実施形態では、ベクターは、AAV1ベクターであり、ヒトシナプシン1プロモーター、ヒト切断THをコードする配列、IRES、ヒトGCH1をコードする配列、WPREをコードする配列、ポリA尾部をコードする配列を含み得る。本明細書において配列番号13と呼ぶ次の配列は、このようなベクターを示す。この特定の実施形態は、CMVプロモーター、CMVエンハンサー、EMCV IRES及びSV40ポリA尾部を含む。個々の特徴は、当業者により、本明細書に開示する代替物に容易に置換可能である。
配列番号13を含むプラスミドの特徴を示すマップは、図1に示す。
Figure 2022551554000052
Figure 2022551554000053
Figure 2022551554000054
Figure 2022551554000055
 [配列番号13]
好ましくは、ベクターは、実質的に配列番号13に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
本明細書において配列番号14と呼ぶ次の配列は、配列番号13に類似するベクターを示すが、この特定の実施形態は、EMCV IRESの代わりにFMDV IRESを含む。配列番号14を含むプラスミドの特徴を示すマップは、図2に示す。
Figure 2022551554000056
Figure 2022551554000057
Figure 2022551554000058
 [配列番号14]
好ましくは、ベクターは、実質的に配列番号14に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
本明細書において配列番号17と呼ぶ次の配列は、AAV2右及び左ITRを保有するベクターをコードする。このベクターは、AAVベクターの生成に適するため、第1の態様の遺伝子構築物は、このベクター内にサブクローニングすることができる。配列番号17を含むプラスミドの特徴を示すマップは、図5に示す。このベクターは、単なる例示目的のためのものであり、当業者は、他の適するベクターを認識している。図5に示すpAV-FHベクター配列、及びAAVベクターの産生に適する他のベクターは、市販されている。
Figure 2022551554000059
Figure 2022551554000060
 [配列番号17]
好ましくは、本発明の組換えベクターは、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)及びGTPシクロヒドロラーゼ1(GCH1)の発現を増強する核酸配列を含み得る。より好ましくは、核酸配列は、Luら、2017、「A 5' Noncoding Exon Containing Engineered Intron Enhances Transgene Expression from Recombinant AAV Vectors in vivo」、Human Gene Therapy、28巻、125～134頁及び国際公開第2013119371号に記載されているように、pUC起点及びRNA-OUT(OIPR)配列を有する最適化イントロンを含むか、又はこれからなる。
OIPR配列は、次のように、本明細書において配列番号26と呼び得る。
Figure 2022551554000061
 [配列番号26]
好ましくは、OIPR配列は、実質的に配列番号26に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、OIPR配列は、メインカセット内に位置し、プロモーター配列の3'並びにチロシンヒドロキシラーゼ(TH)及びGTPシクロヒドロラーゼ1(GCH1)のコード配列の5'に配置される。
本明細書において配列番号34と呼ぶ次の配列は、本発明の第1の態様による使用に好ましいベクターを示し、このベクターは、5'から3'に、CMVエンハンサー、CMVプロモーター、切断ヒトチロシンヒドロキシラーゼ(TH)をコードする配列(すなわち、制御ドメインを除く)、F2Aリンカー、フューリン切断部位、ヒトGCH1をコードする配列、Xタンパク質及びSV40pAの発現を防ぐように修飾したウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント(WPRE)を、2つのAAV2逆位末端反復(ITR)間に順次含む。
Figure 2022551554000062
Figure 2022551554000063
Figure 2022551554000064
 [配列番号34]
好ましくは、ベクターは、実質的に配列番号34に提示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
遺伝子治療ベクターは、当技術分野において公知の任意の技術により生成し得る。例えば、rAAVベクターは、古典的三重トランスフェクション方法を使用して生成し得る。アデノ随伴ウイルスベクターの生成のための方法は、Matsushitaら(Matsushitaら、Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy (1998) 5、938～945)に開示されている。
一実施形態では、本明細書に記載するゲノム配列、すなわち、プロモーター-TH-リンカー-GCH1配列、又はプロモーター-TH-リンカー-GCH1-リンカー-PTPS配列は、ウイルスベクターを用いずに裸のDNAとして、直接的に注射により投与し得る。裸のDNAは、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド又はミニイントロンプラスミド(MIP)として投与し得る。裸のDNAは、プラスミドとして送達し、当業者に公知の任意の適する非ウイルス担体により投与し得る。
好ましくは、非ウイルス担体は、ポリ(2-エチル-2-オキサゾリン)-PLA-g-PEI両親媒性トリブロックミセル、ポリ(β-アミノエステル)に基づく生分解性ナノ粒子、プルロニック(登録商標)ブロック共重合体、例えば、プルロニックF27、プルロニックF68又はプルロニックF85、プルロニックの混合物、例えば、SP1017、及び担体、例えば、BrainFectIn(登録商標)(OZ Biosciences社、Marseille、仏国)からなる群から選択される。
必要とされる遺伝子構築物又は組換えベクターの量は、この生物学的活性及び生物学的利用率により決定されることが理解され、これは次いで、投与方法、遺伝子構築物又は組換えベクターの生理化学的特性、及びこれが単独療法として又は併用療法において使用されているかに依存する。投与される最適投薬量は、当業者により決定され、使用中の特定の遺伝子構築物又は組換えベクター、医薬組成物の強度、投与方法、及び神経変性障害の進行度により異なり得る。対象の年齢、体重、性別、食事、及び投与時間を含む、治療する特定の対象に応じた更なる因子により、投薬量を調整する必要性が生じる。
送達される用量は、300μl～20,000μl、300μl～10,000μl、300μl～5,000μl、300μl～4500μl、400μl～4000μl、500μl～3500μl、600μl～3000μl、700μl～2500μl、750μl～2000μl、800μl～1500μl、850μl～1000μl又はおよそ900μlであり得る。
用量の力価は、1mlあたり1E8～5E14、1E9～1E14、1E10～5E13、1E11～1E13、1E12～8E12、4E12～6E12又はおよそ5E12ゲノムコピー(GC/ml)であり得る。
遺伝子構築物又は組換えベクターは、障害発症の前、中、又は後に投与し得る。用量を単回投与として与え得るか、又は複数用量を治療にわたって与え得る。用量は、患者に投与してもよく、患者は、2回目又は更なる用量の必要性を評価するために監視し得る。同一ゲノムの反復使用による送達は、AAVカプシド血清型を切り換えて、それまでの治療により誘導される抗体による干渉又は細胞媒介免疫応答の確率を低下させることにより容易とし得る。
一部の実施形態では、治療方法は、遺伝子治療前に、L-DOPAの試験注入を含み得る。試験注入を使用して、対象がL-DOPAに対して応答性であることを実証してもよく、これにより、遺伝子治療から最も恩恵を被る可能性を有する対象の選択が可能となり得る。L-DOPA試験注入は、数時間又は数日にわたって定常な血中レベルをもたらすことが可能な任意の手段によるものであり得る。適する注入方法の例としては、経鼻胃チューブによる注入、i.v.注入、ポンプを介する注入、デュオドーパ(DuoDOPA)の使用による注入、又は他の任意の適する手段が挙げられる。
第1の態様による遺伝子構築物又は第2の態様による組換えベクターは、医薬において使用し得ることが理解され、これを単独療法として使用して(すなわち、本発明の第1の態様による遺伝子構築物又は第2の態様によるベクターの使用)、本明細書に開示する任意の障害を治療、改善、又は予防し得る。或いは、本発明による遺伝子構築物又は組換えベクターは、公知の治療の補助として、又はこれと組み合わせて使用して、本明細書に開示する任意の障害を治療、改善、又は予防し得る。一部の場合では、遺伝子構築物は、遺伝子治療を向上させるように設計した治療の補助として、これと組み合わせて、又はこれと並行して使用し得る。例えば、遺伝子構築物は、免疫抑制治療と組み合わせて使用して、遺伝子治療それ自体により誘導される免疫応答を低下、予防、又は制御し得る。例えば、免疫抑制治療により、遺伝子治療ベクターのカプシド、遺伝子治療ベクター内に含まれるゲノム、又は治療中に遺伝子治療ベクターにより産生される産物に対する免疫応答が予防、低下、又は制御され得る。免疫抑制レジメは、一般的免疫抑制剤、例えば、ステロイドを含み得る。免疫抑制レジメは、特定の免疫応答を低下させるように設計した免疫抑制の更なる標的化、例えば、遺伝子治療構築物内に見出されるか又はこれにより産生される特定の抗原に対する免疫治療を含み得る。
本発明による遺伝子構築物又は組換えベクターは、特に、組成物を使用すべき方法に応じた、多種多様な形態を有する組成物中で混合し得る。したがって、例えば、組成物は、粉末、液体、ミセル溶液、リポソーム懸濁液の形態、又は治療を必要とするヒト若しくは動物に投与し得る他の任意の適する形態であり得る。本発明による医薬のビヒクルは、これを与えられる対象により良好に許容されるものであるべきであることが理解される。好ましくは、組成物は、注射液の形態である。
製薬産業により従来の方法で利用されているもの(例えば、in vivoでの実験法、臨床試験等)のような公知の手順を使用して、本発明及び詳細な治療レジメによる遺伝子構築物又は組換えベクターの特定の製剤を形成し得る。
第3の態様によって、第1の態様による遺伝子構築物、又は第2の態様による組換えベクター、及び薬学的に許容されるビヒクルを含む、神経変性障害の治療、予防、又は改善における使用のための医薬組成物であって、対象の脳脊髄液(CSF)に送達される、医薬組成物を提供する。
好ましくは、送達及び神経変性障害は、第1の態様に定義するものである。しかし、好ましくは、組成物は、注射用組成物である。
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、又は飼育動物であり得る。したがって、本発明による組成物及び医薬を使用して、任意の哺乳動物、例えば、家畜(例えば、ウマ)、ペットを治療し得るか、又は他の獣医学的適用において使用し得る。しかし、最も好ましくは、対象は、ヒトである。
「治療有効量」の遺伝子構築物、組換えベクター又は医薬組成物は、任意の量であり、対象に投与する場合、障害を治療するのに必要とされる上述の量である。
例えば、使用する遺伝子構築物、組換えベクター又は医薬組成物の治療有効量は、約0.01mg～約800mg、好ましくは、約0.01mg～約500mgであり得る。遺伝子構築物、組換えベクター又は医薬組成物の量は、約0.1mg～約250mg、最も好ましくは、約0.1mg～約20mgの量であることが好ましい。
「薬学的に許容されるビヒクル」は、本明細書において言及する場合、医薬組成物の製剤化において有用であることが当業者に知られている、公知の任意の化合物又は公知の化合物の組合せである。
好ましい実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは、対象への組成物の直接的注射が可能となるようなビヒクルであり得る。例えば、ビヒクルは、CSF中への組成物の注射を可能とするのに適し得る。
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは、固体であってもよく、組成物は、粉末又は懸濁液の形態であり得る。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、色素、増量剤、流動促進剤、圧縮補助剤、不活性結合剤、保存剤、色素、コーティング剤、又は固体崩壊剤としても作用し得る1つ又は複数の物質を含み得る。また、ビヒクルは、封入材であり得る。粉末では、ビヒクルは、微粉化した固体であり、これは、微粉化した本発明による活性剤との混合物中に存在する。別の実施形態では、医薬ビヒクルは、ゲル等であり得る。
しかし、医薬ビヒクルは、懸濁液又は液体であってもよく、医薬組成物は、懸濁液又は溶液の形態である。滅菌溶液又は懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、くも膜下腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、特に、皮下注射により利用することができる。遺伝子構築物又は組換えベクターは、滅菌固体組成物として調製してもよく、これは、滅菌水、食塩水、MgCl2及びCaCl2を有するダルベッコリン酸緩衝食塩水(dPBS)、又は他の適する滅菌注射用培地を使用して、投与時に溶解又は懸濁し得る。
本発明は、任意の核酸若しくはペプチド、又はこのバリアント、誘導体若しくは類似体に及び、これは、そのバリアント又は断片を含む、本明細書において言及する配列のいずれかのアミノ酸又は核酸配列を実質的に含むことが理解される。「実質的アミノ酸/ヌクレオチド/ペプチド配列」、「バリアント」及び「断片」の用語は、本明細書において言及する配列のいずれか1つのアミノ酸/ヌクレオチド/ペプチド配列との少なくとも40%の配列同一性、例えば、配列番号1～44として同定される配列との40%の同一性等を有する配列であり得る。
また、言及する配列のいずれかに対する65%を越える配列同一性、より好ましくは、70%を越える、更により好ましくは、75%を越える、なおより好ましくは、80%を越える配列同一性を有するアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列が想定される。好ましくは、アミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列は、言及する配列のいずれかとの少なくとも85%の同一性、より好ましくは、本明細書において言及する配列のいずれかとの少なくとも90%の同一性、更により好ましくは、少なくとも92%の同一性、更により好ましくは、少なくとも95%の同一性、更により好ましくは、少なくとも97%の同一性、更により好ましくは、少なくとも98%の同一性、最も好ましくは、少なくとも99%の同一性を有する。
当業者は、2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性を計算する方法を理解している。2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性を計算するために、2つの配列のアラインメントを最初に作成した後、配列同一性の値を計算しなければならない。2つの配列のパーセンテージ同一性は、(i)配列をアラインメントするのに使用する方法、例えば、ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(種々のプログラムにおいて実行する)、又は3D比較による構造アラインメント、及び(ii)アラインメント方法により使用されるパラメータ、例えば、局所的対全体的アラインメント、使用するペアスコアマトリックス(例えば、BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)、並びにギャップペナルティ、例えば、関数形式及び定数に応じて種々の値をとり得る。
アラインメントを行うと、2つの配列間のパーセンテージ同一性を計算する多くの異なる方法が存在する。例えば、同一性の数を(i)最短の配列の長さ、(ii)アラインメントの長さ、(iii)配列の平均の長さ、(iv)非ギャップ位置の数、又は(v)オーバーハングを除く等価な位置の数で割る方法が存在し得る。その上、パーセンテージ同一性はまた、長さに大いに依存することが理解される。したがって、1対の配列が短ければ、偶然に生じることが予想され得る配列同一性も高くなる。
したがって、タンパク質又はDNA配列の正確なアラインメントが、複雑なプロセスであることが理解される。一般的な多重アラインメントプログラムであるClustalW(Thompsonら、1994、Nucleic Acids Research、22、4673～4680;Thompsonら、1997、Nucleic Acids Research、24、4876～4882)は、本発明によるタンパク質又はDNAの多重アラインメントを作成するための好ましい方法である。ClustalWに適するパラメータは、次のものであり得る:DNAアラインメントでは、ギャップ開始ペナルティ=15.0、ギャップ伸長ペナルティ=6.66及びマトリックス=同一性。タンパク質アラインメントでは、ギャップ開始ペナルティ=10.0、ギャップ伸長ペナルティ=0.2及びマトリックス=Gonnet。DNA及びタンパク質アラインメントでは、ENDGAP=-1及びGAPDIST=4。当業者は、これら及び他のパラメータを変えて配列アラインメントを最適化することが必要であり得ることを認識する。
好ましくは、2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性の計算は、次いで、(N/T)*100のアラインメントから計算してもよく、ここで、Nは、配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Tは、ギャップを含み、オーバーハングを含むか又は除外して比較した、位置の総数である。好ましくは、オーバーハングは、計算に含まれる。したがって、2つの配列間のパーセンテージ同一性を計算するのに最も好ましい方法は、(i)パラメータの適するセット、例えば、上に提示されるものを使用するClustalWプログラムを使用した配列アラインメントの作成、及び(ii)次の式:-配列同一性=(N/T)*100へのN及びTの値の代入を含む。
類似の配列を同定するための代替方法は、当業者に公知である。例えば、実質的に類似するヌクレオチド配列は、ストリンジェント条件下でDNA配列又はこれらの相補鎖にハイブリダイズする配列によりコードされる。ストリンジェント条件は、ヌクレオチドを、およそ45℃の3×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でフィルター結合DNA又はRNAにハイブリダイズした後、およそ20～65℃の0.2×SSC/0.1%SDSで少なくとも1回洗浄することを意味する。或いは、実質的に類似するポリペプチドは、少なくとも1つであるが、5、10、20、50又は100個未満のアミノ酸が、例えば、配列番号1～44に含まれるアミノ酸配列に示す配列と異なり得る。
遺伝子コードの縮重のため、本明細書に記載する任意の核酸配列は、これによりコードされるタンパク質の配列に実質的に影響せずに変化又は変異させて、この機能性バリアントが生じ得ることが明らかである。適するヌクレオチドバリアントは、配列内の同一のアミノ酸をコードする種々のコドンの置換により変更され、これによりサイレント変異が生じる配列を有するバリアントである。他の適するバリアントは、相同ヌクレオチド配列を有するが、それが置換するアミノ酸と類似する生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする種々のコドンの置換により変更されて、保存的変異が生じる配列の全て又は一部を含む、バリアントである。例えば、低分子の無極性疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンを含む。高分子の無極性疎水性アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを含む。極性中性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンを含む。正荷電(塩基性)アミノ酸は、リジン、アルギニン及びヒスチジンを含む。負荷電(酸性)アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。したがって、類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸と置換し得るアミノ酸が理解され、当業者は、このようなアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を理解している。
本明細書に記載する特徴(添付する任意の特許請求の範囲、要約及び図面を含む)の全て、並びに/又はこのように開示する任意の方法若しくはプロセスの工程の全ては、このような特徴及び/又は工程の少なくとも一部が相互排他的な組合せを除く、任意の組合せで、上記の態様のいずれかと組み合わせ得る。
背景
パーキンソン病の遺伝子治療についてのこれまでの試験は、成功した治療では、遺伝子治療のためのベクターを患者の線条体内に直接的に導入する必要があり、ここで、ベクターは、通常ドーパミンを産生しない脳細胞によるドーパミン又はL-DOPAの産生に必要な遺伝子を保有すると想定されていた。このような治療の目的は、パーキンソン患者の脳の患部領域におけるドーパミンの局所的産生である。遺伝子治療のいくつかの方法が開示されている。しかし、この技術はいくらか有望であり、これまでの方法はこの原理を証明するものであるが、これまでのベクターは、なお最適ではなく、脳外科手術のリスクを伴う。特に、パーキンソン患者の脳においてドーパミンの最適な産生(直接的又はL-DOPAを介して間接的に)が生じるベクター及び送達手段であって、実行可能な治療選択肢となるのに適するレベル及び適する費用効果で製造することができ、線条体、被殻、尾状核又は黒質への直接的注射に伴うリスク及び複雑性に煩わされない、ベクター及び送達手段の必要性が存在している。
発明者は、くも膜下腔内、すなわち、脳脊髄液中にAAVを注射することにより、L-DOPAのCSF及び脳細胞外液レベルを上昇させ、PD患者の線条体におけるドーパミンレベルに影響させる経路として、これを使用することが可能であると仮定した。これにより脳全体が上昇レベルのL-DOPAに曝露されるが、これは、患者を古典的経口L-DOPAにより治療する場合に生じる影響と類似するはずである。後者は、40年を超える期間、PDの治療の絶対的基準となっており、L-DOPAによる「全脳」の影響は、大多数の患者において通常、十分な忍容性を有する。
本発明者の仮定に基づいて、本発明の構築物をCSF内に投与する2つの経路である、脳室系内への単純な単回注射又は大槽内への単純な単回注射のいずれかを使用して、ラットにおける試験を実施した。
材料及び方法
構築物/ベクター
バイシストロン性AAV(血清型9)を、三重トランスフェクションにより使用調製した。ベクターゲノムは、CMVエンハンサー、CMVプロモーター、ヒトチロシンヒドロキシラーゼのcDNA(制御ドメインを除く)、F2Aリンカー、フューリン切断部位、ヒトGCH1のcDNA、Xタンパク質及びSV40pAの発現を防ぐように修飾したウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント(WPRE)を、2つのAAV2逆位末端反復(ITR)間に順次含んだ。
MFBのOHDA破壊
黒質線条体(nigrastriatal)経路の一側性の破壊を、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)の脳内投与により行った。6-OHDAは、0.9%の滅菌NaCl中の0.03%のアスコルビン酸により溶液5mg/mlに製剤化した。6-OHDA 3μLを内側前脳束内の十字縫合からの以下の定位固定的配置に注射した:頭蓋頂を基準に前後方向(A/P)-4.0mm、内外方向(M/L)-1.3mm、腹背方向(V/D)-8.0mm。
TAのICV注射及びCSF採取
6-OHDA破壊から2週間後、動物を治療群にランダム化した。群2の動物をイソフルランにより麻酔し、ノーズバーを+5mmに設定した定位固定フレームに配置した。2cmの矢状切開を行って十字縫合の位置を特定した。以下の配置を使用して穿孔した:AP:-0.4、L:+2.0。CSF(約50μl)を脳室から導出した(-4.5mm短くしたハミルトンシリンジを使用)。
CM採取では、ラットをイソフルランにより麻酔し、定位固定フレームに配置した。ラットの頭部をおよそ45度下方に曲げると、後頭隆起及び環椎(spine of the atlas)の間に菱形の外観を有する押圧可能な表面が見えた。23Gのニードルを大槽内に穿刺して、この領域にいかなる切開もせずにCSFを採取した。
同一の配置及び同一の孔を使用して、AAV9ベクターを脳室内に緩徐に注入した(10μl/分)。注射量:50μl(TBD)。ニードルを3分間留置し、次いで、取り除いた。切開を創傷クリップにより閉じた。CM CSF採取後、ニードルをそのまま留置し、次いで、TAを含むシリンジに連結した。TAは、CM内に緩徐に注入した(10μl/分)。注射量:約50μl(TBD)。ニードルを3分間留置し、次いで、取り除いた。対照動物には、ベクター注射を行わなかった。
終末CSF採取及び線条体解剖
6-OHDA破壊後28日目に、動物をイソフルランにより麻酔し、CSFをCMから採取し、清潔なチューブ内に移して、急速冷凍した。CSF採取後、動物を殺処分し、脳を抽出した。左線条体を解剖し、チューブ内で秤量して、急速冷凍した。CSF試料は、顧客指定の研究室へ発送するまで-80℃で保存した。
Table 1(表1)は、前脳基底部の破壊後のCSFレベルを測定した後、バイシストロン性ベクターを注射するのに実施した工程の概要を示す。
Figure 2022551554000065
結果及び考察
図1～図8は、本明細書に記載する発明に従って使用する遺伝子治療ベクターの実施形態を示す。特に、図3に示すベクターは、以下の実施例において使用した。
(実施例1)
DOPAレベルがCSF中で上昇する
本明細書に記載する遺伝子治療ベクターは、CSF近傍の上衣及び隣接組織の細胞にトランスフェクトするように設計する。ベクターにより、チロシンヒドロキシラーゼ及びGCH1の産生が形質導入される(後者は、TH活性に必須の共同因子であるBH4の産生において律速である)。図9は、CSF中のDOPA(L-DOPA)レベルが、前処置又は非処置(無ベクター)のいずれかの対照と比較して、ベクター処置動物において非常に高度に有意な上昇を呈することを示す。
(実施例2)
ドーパミンレベルがCSF中で上昇する
パーキンソン病の脳において残留AADC活性が存在すること、及び経口L-DOPAが、これに依存して活性であることがわかっている。このAADCが存在する場所に対する多数の見解が存在するが(例えば、生存するドーパミン作動性ニューロン、介在ニューロン、セロトニン作動性(serotonegic)ニューロン又はこれらの組合せ)、発明者は、CSF L-DOPAが上昇して、この脱炭酸化によりCSFドーパミン濃度の上昇が生じたことを観察した。実際、図10は、CSF中のドーパミンレベルが、前処置対照と比較して、ベクター処置動物において非常に高度に有意な上昇を呈することを示す。
(実施例3)
線条体細胞内ドーパミンレベルが低下する
このようにCSF、上衣及び隣接組織において産生されたDOPA及びドーパミンは、血液を介して脳内、又は血管周囲腔において脈動する細胞外液に、更に広範に分布し、これにより、DOPA及びドーパミンが線条体に達して、治療作用を付与することが可能となる。線条体は、2つの区画(細胞内区画及び細胞外液区画)として見ることができ、細胞外区画で生じることが、細胞内で生じることに影響することが理解される。本発明では、ドーパミン作動性細胞は、線条体における細胞外液中のドーパミンの量を検出可能である。ドーパミンの細胞外レベルが高い場合、線条体細胞は、ドーパミンの産生及び引き続く分泌を減少させることによって反応する。
したがって、線条体における細胞内ドーパミンレベルの定量により、CSFに隣接する上皮及び組織におけるL-DOPA産生の増加が、
(a)非隣接組織に分布しており、
(b)このような非隣接部位のドーパミン受容体を刺激するのに十分であり、このため治療可能性を有する
かどうかの指標がもたらされる。
図11は、細胞内線条体ドーパミンレベルが、無AAV対照と比較して、ベクター処置動物において非常に高度に有意な低下を呈することを示す。ドーパミンの細胞内レベルがベクター処置動物において低下する場合、これは、細胞外ドーパミンレベルの引き続く上昇と整合する。図Cが細胞内線条体ドーパミン濃度の濃縮を示すこと、及び本発明による治療目的が、基底核(線条体を含む)周囲の細胞外液中のL-DOPAレベルを上昇させることであるという理解を考慮すると、DOPA及びドーパミンの増加が主に線条体の細胞外液区画におけるものである点において、ベクターが所望の作用を達成しているという見解が、このようなデータによって明らかに支持される。細胞外区画におけるDOPA及びドーパミンの増加により、破壊された線条体内の生存するドーパミン作動性細胞におけるドーパミン産生のフィードバック阻害が生じる。
図12は、側脳室又は大槽のいずれかへのくも膜下腔内注射により、線条体細胞内ドーパミンレベルにおいて類似する低下が生じたことを示す。
概要
要するに、本明細書に記載する構築物の使用は、当技術分野における現行法に対する以下の利点を呈する。
i)本発明は、これまでに利用された方法の制限に対処する、パーキンソン病を治療する単純かつ実用的な方法である。本発明者により、非標的化方法によりCSF中に投与した遺伝子治療構築物によって、治療標的(線条体)における神経伝達物質L-DOPAの局所的変換が可能となるのに十分な基質(DOPA)の増加が生じることが実証され、結果として生じるドーパミンの細胞外レベルが、刺激するのに十分であり、局所性ドーパミン受容体に対する予想した結果であることが実証された。
ii)CNSへの一定レベルのL-DOPA基質の供給。これにより、経口L-DOPA治療の必要性が置き換わるか又は減少し得る。一定レベルのL-DOPA産生をもたらすことにより、経口治療と関連するピーク及びトラフが、回避されるか又は減少する。次いで、これにより、経口L-DOPA治療と関連する可変の血中レベルに関連するL-DOPA治療の長期合併症(ジスキネジア、オン/オフの変動、及び「すくみ」を含む)のリスクが予防若しくは低下するか、又はこの長期合併症を治療する。
iii) 遺伝子治療を線条体に直接的に注入するための複雑で長い外科手術の要件の必要性がないこと。中枢神経系におけるL-DOPA又はドーパミン産生の増加を求める現在の遺伝子治療の手法では、ベクターを線条体内に直接的に注入する。これには、標的組織にわたるベクターの十分な分布を確実とするために、両半球の脳組織を通した複数の穿刺経路の使用が必要とされ得る。脳組織内へのベクターの注入は、最大限の分布を達成し、傷害を回避するために緩徐でなければならない。結果として生じる手順は、神経外科一行による完全な神経外科チームによって実行しなければならず、最大10時間かかり得る(通常4～6時間)。この手順は、脳出血による死亡又は無能力のリスクを有する。対照的に、脳脊髄液中へのベクターの直接的注射は、更に迅速かつ単純で低リスクに達成することができる。
iv)L-DOPAの末梢による一定の産生(例えば、肝臓及び/又は筋肉による)を形質導入する遺伝子治療に対する製品原価の顕著な削減。CNSにおけるL-DOPAの局所的産生が可能となることにより、本発明では、CNSに達する前のL-DOPAの末梢分布、排泄及び代謝による非効率性を回避し、血液脳関門を越えるL-DOPAの移行の負荷を減少させる。したがって、本発明では、必要とするベクターが低用量であり、製品原価も低下する。本発明では、多くの筋肉内注射、又は肝臓若しくは筋肉に十分に形質導入するのに必要とされる複雑な注入レジメンの必要性を回避し、低免疫原性であり得る。
v)この使用により、L-DOPAの産生が生じるが、AADCの発現は形質導入されない。したがって、CNS全体における有効なドーパミン基質のレベルは上昇するが(L-DOPAの経口又は経腸投与を用いた現在の標準治療により生じる場合)、ドーパミンの産生は、著しい内因性AADC活性を有する脳領域において増加するのみである。これにより、標的外ドーパミンにより誘導される毒性のリスクが低下する。
vi)線条体細胞外液中に一定レベルのDOPA及びドーパミンをもたらすことにより、本発明では、空腸への持続的注入の必要のないL-DOPA/カルビドパゲルの持続的注入によって、現在達成されているものと同一の薬理学的目的を達成する。PEGチューブの生涯にわたる負担並びに閉塞、変位及び感染症の関連リスクを有せずに、L-DOPA/カルビドパゲル(デュオドーパ)の持続的注入により、優れた効果を達成することが本発明によって可能となる。

Claims (26)

  1. チロシンヒドロキシラーゼ(TH)をコードする第1のコード配列、及びGTPシクロヒドロラーゼ1(GCH1)をコードする第2のコード配列に動作可能に結合されるプロモーターを含む、対象における神経変性障害の治療、予防、又は改善における使用のための遺伝子構築物であって、前記第2のコード配列が、前記第1のコード配列に対して3'であり、前記第1及び第2のコード配列が、単一オペロンの一部であり、前記遺伝子構築物が、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)をコードせず、前記構築物が、前記対象の脳脊髄液(CSF)に送達される、遺伝子構築物。
  2. 前記構築物が、注射によりCSFに送達される、請求項1に記載の使用のための遺伝子構築物。
  3. 前記遺伝子構築物が、脳室系、大槽、及びL3/L4、L4/L5又はL5/S1の腰椎間から選択される群の1つ又は複数を介してCSFに送達される、請求項1又は2に記載の使用のための遺伝子構築物。
  4. 前記遺伝子構築物が、脳室系を介してCSFに送達される、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  5. 前記遺伝子構築物が、大槽を介してCSFに送達される、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  6. 前記遺伝子構築物が、L3/L4、L4/L5又はL5/S1の腰椎間を介してCSFに送達される、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  7. CSF DOPAレベルが、線条体内の生存するドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生のフィードバック阻害を引き起こすのに十分に上昇する、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  8. CSF DOPAレベルが、5pmol/ml～20pmol/ml、7pmol/ml～15pmol/ml又は8pmol/ml～12pmol/mlに上昇する、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  9. 前記遺伝子構築物が、L3/L4、L4/L5又はL5/S1腰椎間の注射によりCSFに送達され、前記使用が、本発明の遺伝子構築物と組み合わせた造影媒体を注射することを更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  10. 治療される前記神経変性障害が、カテコールアミン機能障害と関連する疾患である、請求項1から9のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  11. 治療される前記神経変性障害が、パーキンソン病、DOPA応答性ジストニア、血管性パーキンソニズム、L-DOPA治療と関連する副作用、又はL-DOPA誘導性ジスキネジアからなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  12. 治療される前記神経変性障害が、パーキンソン病である、請求項1から11のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  13. 前記第1のコード配列が、配列番号1若しくは配列番号2に実質的に提示されるヌクレオチド配列、若しくはその断片若しくはバリアントを含み、及び/又は配列番号21若しくは配列番号22に実質的に提示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、若しくはその断片若しくはバリアントを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  14. 前記第2のコード配列が、配列番号4に実質的に提示されるヌクレオチド配列、若しくはその断片若しくはバリアントを含み、及び/又は配列番号23に実質的に提示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、若しくはその断片若しくはバリアントを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  15. 前記構築物が、6-ピルボイルテトラヒドロプテリン(PTPS)をコードする第3のコード配列を更に含み、前記第3のコード配列が、前記第2のコード配列に対して3'であり、前記単一オペロンの一部である、請求項1から14のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  16. 前記第3のコード配列が、配列番号32に実質的に提示されるヌクレオチド配列、若しくはその断片若しくはバリアントを含み、及び/又は配列番号33に実質的に提示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、若しくはその断片若しくはバリアントを含む、請求項15に記載の使用のための遺伝子構築物。
  17. 前記構築物が、配列番号18、配列番号19若しくは配列番号20に実質的に提示される配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  18. 対象における神経変性障害の治療、予防、又は改善における使用のための、請求項1から17のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含む組換えベクターであって、前記ベクターが、前記対象の脳脊髄液(CSF)に送達される、組換えベクター。
  19. 前記組換えベクターが、組換えAAVベクターである、請求項18に記載の使用のための組換えベクター。
  20. 前記ベクターが、修飾カプシドを含まない、請求項18又は請求項19に記載の使用のための組換えベクター。
  21. 前記送達が、請求項2から9のいずれか一項に定義されるものである、請求項18から20のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
  22. 前記神経変性障害が、請求項10から12のいずれか一項に定義されるものである、請求項18から21のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
  23. 前記組換えベクターが、配列番号34、配列番号13、配列番号14、配列番号15若しくは配列番号16に実質的に提示される配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項18から22のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
  24. 請求項1から17のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物、又は請求項18から23のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター、及び薬学的に許容されるビヒクルを含む、神経変性障害の治療、予防、又は改善における使用のための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、対象の脳脊髄液(CSF)に送達される、医薬組成物。
  25. 前記送達が、請求項2から9のいずれか一項に定義されるものである、請求項24に記載の使用のための医薬組成物。
  26. 前記神経変性障害が、請求項10から12のいずれか一項に定義されるものである、請求項24又は請求項25に記載の使用のための医薬組成物。
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