JP2022550589A

JP2022550589A - Ｉｄタンパク質の小分子阻害剤

Info

Publication number: JP2022550589A
Application number: JP2022520582A
Authority: JP
Inventors: ロバートベネズラ; オウアセクオウエルフェリ; グアンリヤン
Original assignee: メモリアルスローンケタリングキャンサーセンター
Priority date: 2019-10-01
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-12-02
Also published as: EP4037668A4; MX2022003986A; AU2020357941A1; CA3153482A1; US20220356163A1; EP4037668A1; WO2021067393A1

Abstract

本技術は、一般に、対象における病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患を処置、予防、および／または改善するのに有用な化合物、組成物、および方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１日出願の米国仮特許出願第６２／９０９，０３６号の利益および優先権を主張するものであり、その内容はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
米国政府の支持
本発明は、国立衛生研究所により与えられたＣＡ００８７４８に基づく政府の支援によってなされたものである。政府は、本発明に特定の権利を有する。
本技術は、一般に、対象における病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患を処置、予防、および／または改善するのに有用なＩｄ（分化の阻害剤）タンパク質を阻害する化合物、その組成物、およびその方法に関する。

一態様では、本開示は、式Ｉ

(I)
による化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物を提供する。
（式中、
Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリアルキルアンモニウム、ペンタフルオロスルファニル、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹⁰）（Ｒ¹¹）であり；
Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリアルキルアンモニウム、ペンタフルオロスルファニル、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹²）（Ｒ¹³）であり；
Ｒ⁸は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ⁹はＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、またはフルオロであり；
Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、およびＲ¹³は、それぞれ独立してＣ₁－Ｃ₃アルキルである）

関連する態様では、対象における病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患を処置するための有効量の式Ｉの化合物、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

一態様では、対象の状態を処置するための方法であって、状態を処置するのに有効な量の式Ｉの化合物を対象に投与することを含み、状態が、病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患のうちの１つまたは複数を含む、方法を提供する。
本技術のさらなる態様および実施形態が本明細書に記載されている。

Ｉｄ１またはＩｄ３の遺伝子欠失により、片方の眼の３か所でブルッフ膜のレーザー誘発性破裂を有する、滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）のマウスモデルＩｄ１^-/-（図１Ａ）またはＩｄ３^-/-（図１Ｂ）マウスおよび同腹仔対照Ｉｄ１^+/+またはＩｄ３^+/+（各群中ｎ＝１２）おいて血管新生が抑制されることを実証する。１４日後、脈絡膜血管新生（ＮＶ）の平均面積は、対応する対照のものよりもＩｄ１^-/-またはＩｄ３^-/-において有意に小さかった（＊は対応のないｔ検定によるｐ＜０．０３を示し、エラーバーはＳＥＭを表す）。図１Ｃは、野生型、Ｉｄ１^-/-またはＩｄ３^-/-マウスにおける虚血誘発性網膜血管新生を示す。Ｉｄ１^-/-またはＩｄ３^-/-マウスおよび同腹仔対照Ｉｄ１^+/+またはＩｄ３^+/+マウスを、未熟児網膜症（ＲＯＰ）を誘発するために、生後７日目に７５％Ｏ₂チャンバー内に５日間入れた。生後１７日目に動物を安楽死させ、脈絡膜フラットマウントのグリフォニアシンプリシフォリアレクチン染色（血管細胞に対して選択的）によって網膜血管新生の領域を評価した（染色の代表的な画像を示している）（白いスケールバー＝５００μｍ）。群あたりのＮＶの平均総面積の定量化は、ｎ＝仔の数でプロットされ、＊は対応のないｔ検定によってｐ＜０．０００１を示し、エラーバーはＳＥＭを表す。ＡＧＸ５１の識別を示す。図２Ａは、水素結合が黒い破線で示され、塩橋が灰色の破線で示され、関与する残基が標識されているＩｄ１およびＥ４７の結晶構造を示している。図２Ｂは、Ｉｄ１の疎水性隙間分析を示している。黒い矢印および灰色の領域は、識別された裂け目を示す。図２Ｃは、化合物Ａ、ＢおよびＣのインビトロ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を示す。くさび形は、小分子の濃度が１から１００μＭまで増加することを示し：レーン３～５：２０、５０１００μＭの化合物Ａ；レーン６～８：２０、５０１００μＭの化合物Ｂ；レーン１０～１６：１、５、１０、２０、３０、５０、１００μＭの化合物Ｃを示す。図２Ｄは、図２Ｃからの化合物Ａ、ＢおよびＣの構造を示しており、ここでＣはＡＧＸ５１であり、赤色のアスタリスクは、キラル中心を示す。図２Ｅは、Ｉｄ１ＨＬＨドメイン（緑色で表示）におけるＡＧＸ５１（青色の棒形で表示）ドッキング部位（灰色で表示）の予測を示す。図２Ｆは、ＡＧＸ５１と相互作用するＩｄ１残基の予測を示している。図２Ｇは、ＤＭＳＯ（左のプロット）、またはＡＧＸ５１（０、１０、２０、および５０μＭ）（中央のプロット）、およびＡＧＸ５１とともにＥ４７（０、１０、２０、および５０μＭ）（右のプロット）を使用した、Ｉｄ１の円二色性（ＣＤ）を示す。図８Ａ～１０Ｃおよび１６～１８も参照されたい。ＩＤタンパク質レベル、Ｅタンパク質相互作用、およびＩＤ１ユビキチン化に対するＡＧＸ５１の効果を示す。図３Ａは、０～４０μＭのＡＧＸ５１で２４時間処理されたＨＵＶＥＣからの全細胞溶解物におけるＩＤ１およびＩＤ３のウエスタンブロットを示している。図３Ｂは、６０μＭＡＧＸ５１で０～２４時間処理したＨＣＴ１１６細胞（Ｆｌａｇタグ付きＩＤ１を発現）からの全細胞溶解物のＦｌａｇのウエスタンブロットを示す。図３Ｃは、ＭＧ１３２およびＡＧＸ５１で処理されたＵ８７ＭＧおよびＨＣＴ１１６細胞におけるユビキチン化アッセイを示している。図３Ｄは、６０μＭＡＧＸ１で１時間処理したＨＣＴ１１６細胞における内因性ＩＤ１およびＥ４７の免疫沈降（ＩＰ）を示しており、ＩＰブロットの右側に全細胞溶解物の対応する免疫ブロットがある。図１１Ａ～１１Ｃも参照されたい。ＨＵＶＥＣの増殖に対するＡＧＸ５１の効果を示す。図４Ａは、ＤＭＳＯまたは２０μＭＡＧＸ５１で５日間処理したＨＵＶＥＣの細胞増殖を示している。図４Ａは、ＤＭＳＯまたは２０μＭＡＧＸ５１で２４時間処理したＨＵＶＥＣの細胞周期分析を示している。図４Ｃは、０～４０μＭのＡＧＸ５１で２４時間処理したＨＵＶＥＣの全細胞溶解物に対するサイクリンＤ１のウエスタンブロットを示している。チューブリンは、タンパク質負荷対照として使用する。図１２も参照のこと。図４Ｄは、０～４０μＭのＡＧＸ５１の非存在下または存在下でマトリゲル上にて１８～２０時間培養した後にＨＵＶＥＣ分岐が観察されたことを示しており、画像は１０倍の倍率で撮影された。図４Ｅは、ノード、ジャンクション、メッシュ、および全分岐長さの定量化を示す（ｎ＝４は、試験された濃度ごとに複製される）。＊は、ウィルコクソン検定によるｐ＜０．０５を示す。図４Ｆは、ＨＵＶＥＣの遊走に対するＡＧＸ５１の効果を示す。ＨＵＶＥＣ単層をスクラッチしてから、培地を０～４０μＭのＡＧＸ５１を含有する培地と交換し、２４時間後に遊走を観察し、画像を２０倍の倍率で撮影した。ＡＧＸ５１処置によりＡＭＤおよびＲＯＰのマウスモデルにおいて眼の血管新生が抑制されることを示す。図５Ａは、レーザー誘発性脈絡膜血管新生に対するＡＧＸ５１の効果を示している。野生型マウスでは、各眼の３箇所でブルッフ膜が破裂し、直ちにおよび７日後に片方の眼に１０μｇのＡＧＸ５１またはビヒクルを硝子体内注射した（群あたりｎ＝１０）。レーザー誘発破裂の１４日後、ＣＮＶの平均面積はＡＧＸ５１を注入した眼の方が対照眼よりも有意に小さかった（＊は複数の比較のためのボンフェローニ補正を伴うＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５を示し、エラーバーはＳＥＭを示す）。図５Ｂは、対照注射された眼およびＡＧＸ５１注射された眼（バー＝１００μｍ）からの代表的なグリフォニアシンプリシフォリアレクチン（血管細胞をマーキングする）で染色された脈絡膜フラットマウントを示す。図５Ｃは、５００μｇＡＧＸ５１の１日２回のｉ．ｐ．注射によっても、ＣＮＶが有意に抑制されたことを示す（群あたりｎ＝１０マウス、＊は対応のないｔ検定によるｐ＜０．０５を示し、エラーバーはＳＥＭを示す）。図５Ｄは、１日２回ｉ．ｐ．注射によりＡＧＸ５１（１０μｇ）またはビヒクルで処置されたマウスからの眼の代表的なグリフォニアシンプリシフォリアレクチン染色された脈絡膜フラットマウントを示す（バー＝１００μｍ）。図５Ｅは、硝子体内注射（バー＝５０μｍ）によってＡＧＸ５１またはＤＭＳＯで処置されたマウスからのＣＮＶ領域のＩｄ１の免疫蛍光を示す画像を示す。図５Ｆは、虚血誘発性網膜血管新生に対するＡＧＸ５１の効果を示している。ＲＯＰを誘発するために、仔（ｎ＝１５）を、生後７日目に７５％Ｏ₂チャンバー内に５日間入れた。生後１２日目に、マウスを室内空気に戻し、片眼に１０μｇのＡＧＸ５１またはＦＥにＤＭＳＯの硝子体内注射を受けた。生後１７日目に、マウスを安楽死させ、網膜血管新生（ＲＮＶ）の領域を評価した（＊は対応のないｔ検定によるｐ＜０．０１を示し、エラーバーはＳＥＭを示す）。図１３および１７も参照のこと。ＡＧＸ５１エナンチオマー単独およびアフリベルセプトとの併用処置の効果を示す。図６Ａは、レーザー誘発ＣＮＶに対するＡＧＸ５１エナンチオマーの効果を示している。レーザー誘発性ＣＮＶをマウスにおいて誘発し、ＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１ラセミ体、またはエナンチオマー（ＡＧＸ５１Ｅ１またはＡＧＸ５１Ｅ２）で処置した（群あたりｎ＝１０マウス）。マウスを、腹腔内投与により処置した。５０μＬのビヒクルまたは１０ｍｇ／ｍＬの化合物で１日２回ｉ．ｐ．注射により処置した。１４日目に、動物を安楽死させ、記載されているようにＣＮＶの面積を測定した（ＡＮＯＶＡおよび複数の比較のためのボンフェローニ補正により、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＝０．００１４を示し、エラーバーはＳＥＭを示す）。図６Ｂは、（ａ）（バー＝１００μｍ）で処置されたマウスからの眼の、代表的なグリフォニアシンプリシフォリアレクチン（血管細胞マーカー）染色された脈絡膜フラットマウントを示す。図６Ｃ（上部パネル）は、レーザー誘発性ＣＮＶに供され、ＡＧＸ５１Ｅ２で処置されたマウスの眼の、グリフォニアシンプリシフォリアレクチン染色された脈絡膜フラットマウントを示す。１群あたり８匹のマウスを、レーザー誘発性ＣＮＶ後１日目および７日目に１、３、１０、または３０μｇのＡＧＸ５１Ｅ２を硝子体内注射して処置した。１４日目にマウスを安楽死させ、ＣＮＶの面積を測定した。代表的なグリフォニアシンプリシフォリアレクチン染色された眼の脈絡膜フラットマウントが示されている。図６Ｃ（下部パネル）は、データの定量化がプロットされていることを示しており、＊はＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５を示し、エラーバーはＳＥＭを示す）（バー＝１００μｍ）。図６Ｄは、レーザー誘発性ＣＮＶに対する、ＡＧＸ５１単独およびアフリベルセプトとの組み合わせの効果を示している。レーザー誘発性ＣＮＶをマウスにおいて誘発し、１日目および７日目に群あたりｎ＝１０マウスで、ＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１（１０μｇ）、アフリベルセプト（Ａ）（４０μｇ）、またはＡＧＸ５１＋アフリベルセプトにより処置した。１４日目に動物を安楽死させ、ＣＮＶの面積を記載のように測定した。図６Ｃ～６Ｄにおいて、ＦＥは「僚眼」を指し、両眼がレーザー治療を受けた動物の未処置の眼として定義される（ＡＮＯＶＡにより＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＝０．００１４を示し、＊＊＊はｐ＜０．０００１を示し、エラーバーはＳＥＭを示す）。図１４も参照のこと。ＡＧＸ５１などの既知のＩｄ阻害剤よりも驚くべきことにかつ予想外に著しく優れた効果を示す、本技術のＩｄ阻害化合物であるＡＧＸ－Ａの特性を示す。図７Ａは、ＡＧＸ－Ａの化学構造を示している。図７Ｂは、ＡＧＸ－Ａ（ＤＭＳＯ中０～１１０μＭ）とＩｄ１の相互作用を示す円二色性（ＣＤ）スペクトルを示している。図７Ｃは、０～１０μＭのＡＧＸ－Ａで２４時間処理されたＨＣＴ１１６細胞からの全細胞溶解物におけるＩＤ１のウエスタンブロットを示している。ＩＣ５０を示す。ＡＧＸ５１のＩＣ５０は２２．２８μＭであった。図７Ｄは、０～２０μＭのＡＧＸ－Ａで２４時間処理された４Ｔ１細胞からの全細胞溶解物におけるＩｄ１のウエスタンブロットを示している。ＩＣ５０を示す。ＡＧＸ５１のＩＣ５０は２６．６６μＭであった。図７Ｅは、レーザー誘発性脈絡膜血管新生に対するＡＧＸ－ＡまたはＡＧＸ５１の効果を示している。レーザー誘発性脈絡膜血管新生（ＮＶ）をマウスに誘発し、ＤＭＳＯ、１もしくは５μｇＡＧＸ－Ａ、または１もしくは５μｇＡＧＸ５１の硝子体内注射によってマウスを処置した。１４日目に動物を安楽死させ、ＣＮＶの面積を記載のように測定した。（＊＊はＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．０００１を示し、エラーバーはＳＥＭを示す）。ＡＧＸ５１－ＸＬ２とＩｄ１との間の物理的相互作用の調査を示す。図８Ａは、ヒト（ｈｓ）およびマウス（ｍｍ）におけるＩｄファミリーメンバー（Ｉｄ１－Ｉｄ４）にわたるＩｄＨＬＨドメインの保存を示している。キイロショウジョウバエ（ｄｍ）Ｉｄオルソログも示され（ｅｍｃ）も示されている。図８Ｂは、ＡＧＸ５１－ＸＬ２の構造を示している。図８Ｃは、Ｉｄ１ヘリックスおよびループ領域の概略図を示している。黒い点は、Ｉｄ１結合ポケットに近接していると予測されるアミノ酸を示し、オレンジ色の点は、質量分析によってＩｄ１に共有結合していると識別されたアミノ酸を示す。群ごとに１つの試料を分析した（＋／－ＵＶ；＋／－ＡＧＸ５１－ＸＬ２）。実験は３か月間隔で２回実行した。図１７～１８も参照ものこと。ＡＧＸ５１およびＩｄ３の円二色性を示す。０または１００μＭＡＧＸ５１を使用したＩｄ３の円二色性（ＣＤ）を示す。ＮａｎｏＬｕｃ－ＩＤ１およびＡＧＸトレーサーを使用したＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）アッセイを示す。図１０Ａは、ＡＧＸ５１トレーサーの構造を示している。図１０Ｂは、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）アッセイの結果を示す。ＮａｎｏＬｕｃ－ＩＤ１をトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、０～４μＭのＡＧＸ蛍光トレーサーで処理した。生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）比を、ＡＧＸ５１トレーサー濃度の関数としてプロットした。図１０Ｃは、ＡＧＸ５１トレーサーおよび示された薬物の存在下で実行されたＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）アッセイの結果を示す。ＮａｎｏＬｕｃ－ＩＤ１をトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、２μＭＡＧＸ蛍光トレーサーおよび０～６０μＭＡＧＸ５１またはＡＧＸ－Ａにより、５０μｇ／ｍＬジギトニンの存在下で処理した。完全な基質を細胞に加え、ＧｌｏＭａｘＤｉｓｃｏｖｅｒＳｙｓｔｅｍ照度計を使用して測定したドナーとアクセプターの発光波長およびＢＲＥＴ比を決定した。ＨＣＴ１１６細胞のＩＤタンパク質に対するＡＧＸ５１の効果を示す。図１１Ａは、４０μＭＡＧＸ５１で０～４８時間処理されたＨＣＴ１１６細胞からの全細胞溶解物におけるＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３およびＩＤ４のウエスタンブロットを示す。チューブリンを、タンパク質負荷対照として使用した。図１１Ｂは、４０μＭＡＧＸ５１で２４時間処理されたＨＣＴ１１６細胞におけるＩＤ１およびＩＤ３のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。平均倍率差は、技術的複製のＳＥＭを示すエラーバーを伴う。図１１Ｃは、４０μＭＡＧＸ５１で１時間または２４時間処理されたＨＣＴ１１６細胞からの全細胞溶解物のＥＭＳＡを示している。スペースは、試料が異なるゲルまたはゲルの異なる部分で実行されたことを示す。培養中のＨＣＴ１１６細胞に対するＡＧＸ５１の効果を示す。図１２Ａは、４０μＭＡＧＸ５１で２４時間処理されたＨＣＴ１１６細胞におけるＭＴＴ細胞生存率アッセイを示す。テクニカルトリプリケートの平均値をプロットし、エラーバーはＳＤを表す。図１２Ｂは、４０μＭＡＧＸ５１で４～２４時間処理されたＨＣＴ１１６細胞における細胞周期分析を示している。図１２Ｃは、４０μＭのＡＧＸ５１またはビヒクルで０～４８時間処理されたＨＣＴ１１６細胞からの溶解物におけるサイクリンＤ１のウエスタンブロットを示す。チューブリンを、タンパク質負荷対照として使用した。スペースは、試料が異なるゲルまたはゲルの異なる部分で実行されたことを示す。ＡＧＸ５１の用量滴定を示す。レーザー誘発性ＣＮＶをマウスにおいて誘発し、マウスを、１日目および７日目に、ＤＭＳＯ（対照）（ｎ＝７）、ＡＧＸ５１（１μｇ）（ｎ＝８）またはＡＧＸ５１（５μｇ）（ｎ＝７）を用いて硝子体内注射により処置した。１４日目に、動物を安楽死させ、記載されているようにＣＮＶの面積を測定した（＊は、ＡＮＯＶＡによる０．０５を示し、エラーバーはＳＥＭを示す）。ＡＧＸ５１エナンチオマーの円二色性を示す。０または１００μＭＡＧＸ５１（図１４Ａ）、ＡＧＸ５１－Ｅ２（図１４Ｂ）およびＡＧＸ５１－Ｅ１（図１４Ｃ）を使用したＩｄ１の円二色性（ＣＤ）を示す。実施例に記載された研究において使用された試薬および試薬の供給源を示す。実施例に記載された研究において使用された試薬および試薬の供給源を示す（続き）。実施例による、結晶学的回折データ収集および精密化統計の要約を示す。実施例に従う、質量分析によってＡＧＸ５１－ＸＬ２に共有結合していると同定されたＩｄ１アミノ酸を示す。実施例に従う、ＡＧＸ５１競合がある場合とない場合の質量分析によってＡＧＸ５１－ＸＬ２に共有結合していると同定されたＩｄ１アミノ酸を示す。実施例に従う、腹腔内注射により１日２回投与された６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１による２週間の処置後の毒性試験の結果を示す。実施例に従う、Ｒ－（＋）－３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－Ｎ－ベンジル－３－（２－メトキシフェニル）プロパン－１－アミンのＸ線構造を示す。実施例に従う、ＴＦＫ１細胞培養におけるＩｄ１のノックダウンに対するＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの対照比較効果を示す。実施例に従う、ＴＦＫ１細胞培養におけるＩｄ３のノックダウンに対するＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの対照比較効果を示す。実施例に従う、２４時間にわたるＴＦＫ１細胞生存率に対するＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの用量依存的効果を示す。実施例に従う、ＤＭＳＯ中のＡＧＸ－ＡならびにＤＭＳＯ中のゲムシタビンおよびＡＧＸ－Ａを利用する併用療法のインビボ有効性を示す胆管癌のマウスモデルの結果を提供する。実施例に従う、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（「ＨＰＢＣＤ」）を含む水溶液中のＡＧＸ－Ａで処理されたＳＮＵ１０７９細胞（図２５Ａ）およびＳＮＵ１１９６細胞（図２５Ｂ）の２４時間の細胞生存率研究の結果を提供する。実施例に従う、水溶液（１２．５質量％ＨＰＢＣＤを含む）中のＡＧＸ－ＡおよびにゲムシタビンとＡＧＸ－Ａの水溶液を利用する併用療法のインビボ有効性を示す胆管癌のマウスモデルの結果を提供する。実施例に従う、本技術の化合物との将来の比較を支援するために、ＡＧＸ５１で処理された４Ｔ１細胞のアラマーブルー生存率アッセイの結果を提供する。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。実施例に従う、本技術の化合物との将来の比較を支援するための、マウス膵臓オルガノイド細胞株Ｔ７およびＴ８に対するＡＧＸ５１の効果を示す。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。実施例に従う、本技術の化合物との将来の比較を支援するための、マウス膵臓癌株８０６（ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ－／－；Ｓｍａｄ４－／－）、ＮＢ４４（ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ－／－）および４２７９（ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ－／－）に対するＡＧＸ５１の効果を示す。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。実施例に従う、本技術の化合物との将来の比較を支援するための、ヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ１およびＡ２１に対するＡＧＸ５１の効果を示す。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。実施例に従う、本技術の化合物との将来の比較を支援するための、原発腫瘍に対するＡＧＸ５１（パクリタキセルを伴うおよび伴わない）の効果を示す。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。実施例に従う、本技術の化合物との将来の比較を支援するための、肺定着に対するＡＧＸ５１の効果を示す。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。実施例に従う、本技術の化合物との将来の比較を支援するための、肺転移の確立に対するＡＧＸ５１の効果を示す。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。実施例に従う、本技術の化合物との将来の比較を支援するための、ＡＧＸ５１での処理による、二次部位での血管外遊出および初期播種または血管外遊出癌細胞増殖の腫瘍への進行の阻害を評価する研究の結果を示す。二次部位での癌細胞の初期播種に対するＡＧＸ５１の効果を、全細胞に関して図３４Ａに、および全組織面積に関して図３４Ｂに示す。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。実施例に従う、本技術の化合物との将来の比較を支援するための、散発性腫瘍に対するＡＧＸ５１の効果を示す。図３５Ａは腫瘍の総数に関する結果を提供し；図３５Ｂは、≦１ｍｍで測定される腫瘍の結果として生じる数を示し；図３５Ｃは、１．５ｍｍ～２．５ｍｍで測定される腫瘍の結果として生じる数を示し；図３５Ｄは、≧３ｍｍで測定される腫瘍の数を示す。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。

本技術の実質的な理解を提供するために、本発明の方法のある特定の態様、様式、実施形態、変形例、および特徴を種々の詳細レベルで以下に説明することを理解されたい。

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、一般に、この技術が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの単数形の冠詞、ならびに要素の説明との関連における（特に以下の特許請求の範囲との関連における）同様の指示対象は、本明細書に別段の記載がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の記載がない限り、単にその範囲内に含まれるそれぞれの別個の値を個々に示すのを省略した方法としての役割を果たすに過ぎず、それぞれの別個の値は、あたかも本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に別段の記載がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本明細書で記載されているすべての方法は、任意の好適な順序で実施することができる。任意のおよびすべての例、または例示語（例えば、「など」）の使用は、単に本実施形態をよりよく説明するためのものであり、別段の記載がない限り、特許請求の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいずれの文言も、特許請求の範囲に記載されていない要素が、不可欠であることを示すものと解釈するべきではない。例えば、「細胞」への言及は、２つ以上の細胞の組み合わせなどを含む。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、有機化学、分析化学、および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。

本明細書で使用される場合、「約」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化するであろう。当業者には明確でない用語の使用がある場合、それが使用される文脈を考えると、「約」は、特定の用語の最大プラスまたはマイナス１０％を意味する－例えば、「約１０質量％」は、「９質量％～１１質量％」を意味すると理解されるであろう。「約」が用語の前にある場合、その用語は、「約」による用語ならびに「約」によって変更がないその用語を開示するものとして解釈されるべきであることを理解されたい－例えば、「約１０質量％」は「９質量％～１１質量％」を開示し、ならびに「１０質量％」を開示する。

本明細書で使用される場合、対象への薬剤または薬物の「投与」は、その意図された機能を実行するために化合物を対象に導入または送達する任意の経路を含む。投与は、経口、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、または局所を含む任意の好適な経路によって実施することができる。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。
本開示で使用される「および／または」という句は、列挙されたメンバーのいずれか１つを個別に、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせを意味すると理解される－例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は「Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、またはＢおよびＣ」を意味する。

本明細書で使用される場合、「癌」、「新生物」、および「腫瘍」という用語は交換可能に使用され、宿主生物に対して病的になる悪性形質転換を受けた細胞を指す。原発性癌細胞（すなわち、悪性形質転換部位の近くから得られた細胞）は、十分に確立された技術、特に組織学的検査によって、非癌性細胞と容易に区別することができる。本明細書で使用される癌細胞の定義は、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞の祖先に由来する任意の細胞を含む。これには、転移した癌細胞、および癌細胞に由来するインビトロ培養物および細胞株が含まれる。通常、固形腫瘍として現れるタイプの癌を指す場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波、または触診などの手順によって、腫瘍塊に基づいて検出可能である、および／または患者から入手可能な試料中の１種または複数種の癌特異的抗原の発現のために検出可能である腫瘍である。

本明細書で使用される場合、「対照」は、比較の目的で実験において使用される代替試料である。対照は、「陽性」または「陰性」であり得る。例えば、実験の目的が特定のタイプの疾患または状態の処置に対する治療剤の有効性の相関関係を決定することである場合、陽性対照（所望の治療効果を示すことが知られている化合物または組成物）および陰性対照（治療を受けていない、またはプラセボを受けている対象または試料）が、通常使用される。

本明細書で使用される場合、「転移」または「転移性」という用語は、癌細胞が周囲の組織に侵入し、循環系に入り、新しい部位で悪性増殖を確立する能力を指す。
「非転移性」は、それらの元の発生部位を超えて広がることはなく、特に循環系に入り、新しい部位で悪性増殖を確立することのない腫瘍を指す。
本明細書で使用される場合、疾患もしくは状態の「予防」、疾患もしくは状態を「予防する」、または疾患もしくは状態を「予防すること」は、統計的試料において、未処置の対象試料と比較して、処置された試料における疾患もしくは状態の発生を低減するか、または未処置の対照試料と比較して、疾患もしくは状態の１種もしくは複数種の症状の発症を遅らせる、１種もしくは複数種の化合物を指す。本明細書で使用される場合、予防には、疾患または状態の症状の開始を予防または遅延させることが含まれる。本明細書で使用される場合、予防には、疾患もしくは状態の１種もしくは複数種の徴候または症状の再発を予防することも含まれる。

本明細書中で使用される場合、「試料」という用語は、対象から得られた臨床試料を指す。生体試料には、対象から分離された組織、細胞、細胞のタンパク質または膜抽出物、粘液、喀痰、骨髄、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、気管支洗浄（ＢＷ）、および体液（例えば、腹水または脳脊髄液（ＣＳＦ））、ならびに対象内に存在する組織、細胞、および体液（血液、血漿、唾液、尿、血清など）を含めてもよい。
本明細書で使用される場合、「別個の」治療的使用という用語は、異なる経路により同時または実質的に同時である少なくとも２種の活性成分の投与を指す。
本明細書で使用される場合、「連続的」治療的使用という用語は、異なる時間での少なくとも２種の活性成分の投与を指し、投与経路は同一であるかまたは異なっている。より具体的には、連続的使用は、他の投与の前または他の投与が開始される前の、一方の活性成分の全投与を指す。したがって、他の活性成分または他の複数の活性成分を投与する前に、活性成分の一方を数分、数時間、または数日にわたって投与することが可能である。この場合、同時の処置はない。
本明細書で使用される場合、「同時の」治療的使用という用語は、同じ経路で同時にまたは実質的に同時である少なくとも２種の活性成分の投与を指す。
本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」、または「患者」という用語は交換可能に使用され、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトを指す。ある特定の実施形態では、個体、患者、または対象はヒトである。

本明細書で使用される「処置すること」、「処置する」、または「処置」は、ヒトなどの対象における本明細書に記載の疾患または障害の処置を包含し、（ｉ）疾患または障害を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること；（ｉｉ）疾患または障害を軽減すること、すなわち、障害の退行を引き起こすこと；（ｉｉｉ）障害の進行を遅らせること；および／または（ｉｖ）疾患または障害の１種または複数種の症状の進行を阻害、緩和、または遅らせること、を含む。いくつかの実施形態では、処置は、疾患に関連する症状が、例えば、軽減、低減、治癒、または寛解状態に置かれることを意味する。
記載されるような医学的疾患および状態の処置または予防の種々の様式は、「実質的」を意味することを意図し、これは、全処置または予防ならびに全処置または予防に満たない、一部の生物学的または医学的に関連する結果が得られるものを含むことも理解されたい。処置は、慢性疾患の継続的な長期処置、または急性状態の処置のための単回または数回の投与であり得る。

一般に、水素またはＨなどのある特定の元素への言及は、その元素のすべての同位体を含むことを意味する。例えば、Ｒ基が水素またはＨを含むように定義されている場合、重水素およびトリチウムも含まれる。したがって、トリチウム、¹⁴Ｃ、³²Ｐおよび³⁵Ｓなどの放射性同位元素を含む化合物は、本技術の範囲内にある。本技術の化合物にそのような標識を挿入するための手順は、本明細書の開示に基づいて当業者には容易に明らかであろう。

一般に、「置換された」とは、そこに含まれる水素原子への１つまたは複数の結合が非水素または非炭素原子への結合によって置き換えられている、以下に定義される有機基（例えば、アルキル基）を指す。置換基には、炭素原子または水素原子への１つまたは複数の結合が、ヘテロ原子への、二重結合または三重結合を含む１つまたは複数の結合で置き換えられている基も含まれる。したがって、置換基は、特に明記しない限り、１つまたは複数の置換基で置換される。いくつかの実施形態では、置換基は、１、２、３、４、５、または６個の置換基で置換されている。置換基の例としては、ハロゲン（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）；ヒドロキシル；アルコキシ基、アルケノキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、ヘテロシクリル基、ヘテロシクリルアルキル基、ヘテロシクリルオキシ基、およびヘテロシクリルアルコキシ基；カルボニル（オキソ）；カルボキシレート；エステル；ウレタン；オキシム；ヒドロキシルアミン；アルコキシアミン；アラルコキシアミン；チオール；スルフィド；スルホキシド；スルホン；スルホニル；ペンタフルオロスルファニル（すなわち、ＳＦ₅）、スルホンアミド；アミン；Ｎ－オキシド；ヒドラジン；ヒドラジド；ヒドラゾン；アジド；アミド；ウレア；アミジン；グアニジン；エナミン；イミド；イソシアネート；イソチオシアネート；シアネート；チオシアネート；イミン；ニトロ基；ニトリル（すなわち、ＣＮ）；など、が挙げられる。

置換シクロアルキル基、アリール基、ヘテロシクリルおよびヘテロアリール基などの置換環基には、水素原子への結合が炭素原子への結合で置き換えられている環および環系も含まれる。したがって、置換シクロアルキル基、アリール基、ヘテロシクリル基およびヘテロアリール基はまた、以下に定義されるように、置換または非置換アルキル、アルケニル、およびアルキニル基で置換され得る。

アルキル基には、１～１２個の炭素原子、および典型的には１～１０個の炭素、またはいくつかの実施形態では１～８個、１～６個、もしくは１～４個の炭素原子を有する直鎖および分岐鎖アルキル基が含まれる。アルキル基は、置換または非置換であり得る。直鎖アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、およびｎ－オクチル基などの基が挙げられる。分岐鎖アルキル基の例としては、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ネオペンチル、イソペンチル、および２，２－ジメチルプロピル基が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な置換アルキル基は、上記のような置換基で１回または複数回置換することができ、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルコキシアルキル、カルボキシアルキルなどを含むがこれらに限定されない。

シクロアルキル基には、環内に３～１２個の炭素原子、あるいはいくつかの実施形態では、３～１０、３～８、または３～４、５、もしくは６個の炭素原子を有する単環式、二環式もしくは三環式アルキル基が含まれる。シクロアルキル基は、置換または非置換であり得る。例示的な単環式シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、およびシクロオクチル基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、シクロアルキル基は３～８個の環員を有するが、他の実施形態では、環炭素原子の数は３～５、３～６、または３～７の範囲である。二環式および三環式環系としては、架橋シクロアルキル基および縮合環の両方、例として、ビシクロ［２．１．１］ヘキサン、アダマンチル、デカリニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。置換シクロアルキル基は、上記で定義されたように、非水素および非炭素基で１回または複数回置換され得る。しかし、置換シクロアルキル基には、上で定義された直鎖または分岐鎖アルキル基で置換された環も含まれる。代表的な置換シクロアルキル基は、一置換であっても複数置換されていてもよく、例として、これらに限定されないが、２，２－、２，３－、２，４－２，５－または２，６－二置換シクロヘキシル基であってもよく、これらは、上記のような置換基で置換されていてもよい。

シクロアルキルアルキル基は、アルキル基の水素または炭素結合が上で定義されたシクロアルキル基への結合で置き換えられている、上で定義されたアルキル基である。シクロアルキルアルキル基は、置換または非置換であり得る。いくつかの実施形態では、シクロアルキルアルキル基は、４～１６個の炭素原子、４～１２個の炭素原子、および典型的には４～１０個の炭素原子を有する。置換シクロアルキルアルキル基は、この基のアルキル、シクロアルキル、またはアルキル部分とシクロアルキル部分の両方で置換することができる。代表的な置換シクロアルキルアルキル基は、一置換であっても複数置換されていてもよく、例として、これらに限定されないが、上記のような置換基で一置換、二置換、または三置換されていてもよい。

アルケニル基には、２つの炭素原子の間に少なくとも１つの二重結合が存在することを除いて、上で定義された直鎖および分岐鎖のアルキル基が含まれる。アルケニル基は、置換または非置換であり得る。アルケニル基は、２～１２個の炭素原子、および典型的には２～１０個の炭素、またはいくつかの実施形態では２～８個、２～６個、もしくは２～４個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、１つ、２つ、または３つの炭素－炭素二重結合を有する。例としては、特に、ビニル、アリル、－ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ₃）、－ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ₃）₂、－Ｃ（ＣＨ₃）＝ＣＨ₂、－Ｃ（ＣＨ₃）＝ＣＨ（ＣＨ₃）、－Ｃ（ＣＨ₂ＣＨ₃）＝ＣＨ₂が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な置換アルケニル基は、一置換であっても複数置換されていてもよく、例として、これらに限定されないが、上記のような置換基で一置換、二置換、または三置換されていてもよい。

シクロアルケニル基には、２つの炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を有する、上で定義されたシクロアルキル基が含まれる。シクロアルケニル基は、置換または非置換であり得る。いくつかの実施形態では、シクロアルケニル基は、１つ、２つ、または３つの二重結合を有し得るが、芳香族化合物を含まない。シクロアルケニル基は、４～１４個の炭素原子、またはいくつかの実施形態では、５～１４個の炭素原子、５～１０個の炭素原子、または５、６、７、もしくは８個の炭素原子を有する。シクロアルケニル基の例には、シクロヘキセニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキサジエニル、シクロブタジエニル、およびシクロペンタジエニルが含まれる。
シクロアルケニルアルキル基は、アルキル基の水素または炭素結合が上で定義されたシクロアルケニルル基への結合で置き換えられている、上で定義されたアルキル基である。シクロアルケニルアルキル基は、置換または非置換であり得る。置換シクロアルケニルアルキル基は、この基のアルキル、シクロアルケニル、またはアルキル部分とシクロアルケニル部分の両方で置換することができる。代表的な置換シクロアルケニルアルキル基は、上記のような置換基で１回または複数回置換され得る。

アルキニル基には、２つの炭素原子の間に少なくとも１つの三重結合が存在することを除いて、上で定義された直鎖および分岐鎖のアルキル基が含まれる。アルキニル基は、置換または非置換であり得る。アルキニル基は、２～１２個の炭素原子、および典型的には２～１０個の炭素、またはいくつかの実施形態では２～８個、２～６個、もしくは２～４個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、１つ、２つ、または３つの炭素－炭素三重結合を有する。例としては、特に－Ｃ≡ＣＨ、－Ｃ≡ＣＣＨ₃、－ＣＨ₂Ｃ≡ＣＣＨ₃、－Ｃ≡ＣＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₂ＣＨ₃）₂が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な置換アルキニル基は、一置換であっても複数置換されていてもよく、例として、これらに限定されないが、上記のような置換基で一置換、二置換、または三置換されていてもよい。

アリール基は、ヘテロ原子を含有しない環状芳香族炭化水素である。本明細書のアリール基には、単環式、二環式および三環式環系が含まれる。アリール基は、置換または非置換であり得る。したがって、アリール基としては、フェニル基、アズレニル基、ヘプタレニル基、ビフェニル基、フルオレニル基、フェナントレニル基、アントラセニル基、インデニル基、インダニル基、ペンタレニル基、およびナフチル基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アリール基は、基の環部分に６～１４個の炭素を含有し、他の実施形態では、６～１２個、さらには６～１０個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、アリール基は、フェニルまたはナフチルである。「アリール基」という句は、縮合芳香族脂肪族環系（例えば、インダニル、テトラヒドロナフチルなど）などの縮合環を含有する基を含む。代表的な置換アリール基は、一置換（例えば、トリル）であっても複数置換されていてもよい。例えば、一置換アリール基には、これらに限定されないが、２－、３－、３－、４－、５－、または６－置換フェニルまたはナフチル基が含まれ、これらは、上記のような置換基で置換することができる。

アラルキル基は、アルキル基の水素または炭素結合が上で定義されたアリール基への結合で置き換えられている、上で定義されたアルキル基である。アラルキル基は、置換または非置換であり得る。いくつかの実施形態では、アラルキル基は、７～１６個の炭素原子、７～１４個の炭素原子、または７～１０個の炭素原子を含有する。置換アラルキル基は、この基のアルキル、アリール、またはアルキル部分とアリール部分の両方で置換することができる。代表的なアラルキル基としては、ベンジル基およびフェネチル基、ならびに４－インダニルエチルなどの縮合（シクロアルキルアリール）アルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な置換アラルキル基は、上記のような置換基で１回または複数回置換され得る。

ヘテロシクリル基には、３つ以上の環員を含有し、そのうちの１つまたは複数は、Ｎ、Ｏ、およびＳなどであるがこれらに限定されないヘテロ原子である、芳香族（ヘテロアリールとも呼ばれる）および非芳香族環化合物が含まれる。ヘテロシクリル基は、置換または非置換であり得る。一部の実施形態では、ヘテロシクリル基は、１、２、３または４個のヘテロ原子を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクリル基は、３～１６個の環員を有する単環式、二環式および三環式環を含み、一方、他のそのような基は、３～６、３～１０、３～１２、または３～１４の環員を有する。ヘテロシクリル基は、芳香族、部分的不飽和および飽和の環系、例としてイミダゾリル、イミダゾリニルおよびイミダゾリジニル基を包含する。「ヘテロシクリル基」という句は、例えば、ベンゾトリアゾリル、２，３－ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシニル、およびベンゾ［１，３］ジオキソリルなどの、縮合芳香族および非芳香族基を含むものを含む縮合環種を含む。この句はまた、キヌクリジルなどのヘテロ原子を含有するがこれに限定されない架橋多環式環系を含む。この句は、「置換ヘテロシクリル基」と呼ばれる、環員の１つに結合した、アルキル、オキソまたはハロ基などの他の基を有するヘテロシクリル基を含む。ヘテロシクリル基としては、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロフラニル、ジオキソリル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾール、チアゾリニル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、オキサチアン、ジオキシル、ジチアニル、ピラニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ジヒドロピリジル、ジヒドロジチイニル、ジヒドロジチオニル、ホモピペラジニル、キヌクリジル、インドリル、インドリニル、イソインドリル、アザインドリル（ピロロピリジル）、インダゾリル、インドリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンズチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾオキサジニル、ベンゾジチイニル、ベンゾオキサチイニル、ベンゾチアジニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［１，３］ジオキソリル、ピラゾロピリジル、イミダゾピリジル（アザベンズイミダゾリル）、トリアゾロピリジル、イソキサゾロピリジル、プリニル、キサンチニル、アデニニル、グアニニル、キノリニル、イソキノリニル、キノリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シノリニル、フタラジニル、ナフチリジニル、プテリジニル、チアナフチル、ジヒドロベンゾチアジアジニル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロインドリル、ジヒドロベンゾジオキシニル、テトラヒドロインドリル、テトラヒドロインダゾリル、テトラヒドロベンズイミダゾリル、テトラヒドロベンゾトリアゾリル、テトラヒドロピロロピリジル、テトラヒドロピラゾロピリジル、テトラヒドロイミダゾピリジル、テトラヒドロトリアゾロピリジル、およびテトラヒドロキノリニル基が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な置換ヘテロシクリル基は、一置換であっても複数置換されていてもよく、例として、これらに限定されないが、上記のような種々の置換基で２－、３－、４－、５－もしくは６置換されているかまたは二置換されていている、ピリジル基またはモルホリニル基であってもよい。

ヘテロアリール基は、５つ以上の環員を含有し、そのうちの１つまたは複数は、Ｎ、Ｏ、およびＳなどであるがこれらに限定されないヘテロ原子である芳香族環化合物である。ヘテロアリール基は、置換または非置換であり得る。ヘテロアリール基としては、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、フラニル、ベンゾフラニル、インドリル、アザインドリル（ピロロピリジニル）、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、イミダゾピリジニル（アザベンズイミダゾリル）、ピラゾロピリジニル、トリアゾロピリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、イミダゾピリジニル、イソキサゾロピリジニル、チアナフチル、プリニル、キサンチニル、アデニニル、グアニニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、キノキサリニル、およびキナゾリニル基が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリール基には、インドリル基のようにすべての環が芳香族である縮合環化合物が含まれ、２，３－ジヒドロインドリル基のように環の１つだけが芳香族である縮合環化合物が含まれる。代表的な置換ヘテロアリール基は、上記のような種々の置換基で１回または複数回置換され得る。

ヘテロシクリルアルキル基は、アルキル基の水素または炭素結合が上で定義されたヘテロシクリル基への結合で置き換えられている、上で定義されたアルキル基である。ヘテロシクリルアルキル基は、置換または非置換であり得る。置換ヘテロシクリルアルキル基は、この基のアルキル、ヘテロシクリル、またはアルキル部分とヘテロシクリル部分の両方で置換することができる。代表的なヘテロシクリルアルキル基としては、モルホリン－４－イル－エチル、フラン－２－イル－メチル、イミダゾール－４－イル－メチル、ピリジン－３－イル－メチル、テトラヒドロフラン－２－イル－エチル、およびインドール－２－イル－プロピルが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な置換ヘテロシクリルアルキル基は、上記のような置換基で１回または複数回置換され得る。

ヘテロアラルキル基は、アルキル基の水素または炭素結合が上で定義されたヘテロアリール基への結合で置き換えられている、上で定義されたアルキル基である。ヘテロアラルキル基は、置換または非置換であり得る。置換ヘテロアラルキル基は、この基のアルキル、ヘテロアリール、またはアルキル部分ヘテロアリール部分の両方で置換することができる。代表的な置換ヘテロアラルキル基は、上記のような置換基で１回または複数回置換され得る。

本技術の化合物内に２つ以上の結合点（すなわち、二価、三価、または多価）を有する本明細書に記載の基は、接尾辞「ｅｎｅ」の使用によって示される。例えば、二価のアルキル基はアルキレン基であり、二価のアリール基はアリーレン基であり、二価のヘテロアリール基は二価のヘテロアリーレン基である、など。本技術の化合物への単一の結合点を有する置換基は、「ｅｎｅ」指定を使用して言及されない。したがって、例えば、クロロエチルは、本明細書ではクロロエチレンとは呼ばれない。

アルコキシ基は、水素原子への結合が、上で定義された置換または非置換アルキル基の炭素原子への結合によって置き換えられているヒドロキシル基（－ＯＨ）である。アルコキシ基は、置換または非置換であり得る。直鎖アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。分岐鎖アルコキシ基の例としては、イソプロポキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、イソペントキシ、イソヘキソキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。シクロアルコキシ基の例としては、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な置換アルコキシ基は、上記のような置換基で１回または複数回置換され得る。
本明細書で使用される「アルカノイル」および「アルカノイルオキシ」という用語は、それぞれ、それぞれ２～５個の炭素原子を含有する－Ｃ（Ｏ）－アルキル基および－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アルキル基を指すことができる。同様に、「アリーロイル」および「アリーロイルオキシ」は、－Ｃ（Ｏ）－アリール基および－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール基を指す。

「アリールオキシ」および「アリールアルコキシ」という用語は、それぞれ、酸素原子に結合した置換または非置換アリール基、およびアルキルで酸素原子に結合した置換または非置換アラルキル基を指す。例としては、フェノキシ、ナフチルオキシ、およびベンジルオキシが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な置換アリールオキシおよびアリールアルコキシ基は、上記のような置換基で１回または複数回置換され得る。
本明細書で使用される「カルボキシレート」という用語は、－ＣＯＯＨ基を指す。
本明細書で使用される「エステル」という用語は、－ＣＯＯＲ⁷⁰および－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｇ基を指す。Ｒ⁷⁰は、本明細書で定義されるような置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリルアルキルまたはヘテロシクリル基である。Ｇは、カルボキシレート保護基である。カルボキシレート保護基は、当業者に周知である。カルボキシレート基官能基の保護基の広範なリストは、Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, T.W.; Wuts, P. G. M., John Wiley & Sons, New York, NY, (3rd Edition, 1999)中に見出され、これは、そこに記載されている手順を使用して追加または削除することができ、本明細書に完全に記載されているかのように、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

「アミド（ａｍｉｄｅ）」（または「アミド（ａｍｉｄｏ）」）という用語は、Ｃ－およびＮ－アミド基、すなわち、それぞれ－Ｃ（Ｏ）ＮＲ⁷¹Ｒ⁷²および－ＮＲ⁷¹Ｃ（Ｏ）Ｒ⁷²基を含む。Ｒ⁷¹およびＲ⁷²は、独立して、水素、または本明細書で定義されるような置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリルアルキルまたはヘテロシクリル基である。したがって、アミド基としては、カルバモイル基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂）およびホルムアミド基（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｈが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アミドは－ＮＲ⁷¹Ｃ（Ｏ）－（Ｃ_1-5アルキル）であり、この基は「カルボニルアミノ」と呼ばれ、他の実施形態では、アミドは－ＮＨＣ（Ｏ）－アルキルであり、この基は「アルカノイルアミノ」と呼ばれる。
本明細書で使用される「ニトリル」または「シアノ」という用語は、－ＣＮ基を指す。

ウレタン基としては、Ｎ－およびＯ－ウレタン基、すなわち、それぞれ－ＮＲ⁷³Ｃ（Ｏ）ＯＲ⁷⁴および－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ⁷³Ｒ⁷⁴基が挙げられる。Ｒ⁷³およびＲ⁷⁴は、独立して、本明細書で定義されるような置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリルアルキルまたはヘテロシクリル基である。Ｒ⁷³はまた、Ｈであり得る。
本明細書で使用される「アミン」（または「アミノ」）という用語は、－ＮＲ⁷⁵Ｒ⁷⁶基を指し、Ｒ⁷⁵およびＲ⁷⁶は、独立して、水素、または本明細書で定義されるような置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリルアルキルまたはヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態では、アミンは、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、またはアルキルアリールアミノである。他の実施形態では、アミンは、ＮＨ₂、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、フェニルアミノ、またはベンジルアミノである。

「スルホンアミド」という用語は、Ｓ－およびＮ－スルホンアミド基、すなわち、それぞれ－ＳＯ₂ＮＲ⁷⁸Ｒ⁷⁹および－ＮＲ⁷⁸ＳＯ₂Ｒ⁷⁹基を含む。Ｒ⁷⁸およびＲ⁷⁹は、独立して、水素、または本明細書で定義されるような置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはヘテロシクリル基である。したがって、スルホンアミド基としては、スルファモイル基（－ＳＯ₂ＮＨ₂）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書のいくつかの実施形態では、スルホンアミドは－ＮＨＳＯ₂－アルキルであり、「アルキルスルホニルアミノ」基と呼ばれる。
「チオール」という用語は、－ＳＨ基を指し、「スルフィド」は、－ＳＲ⁸⁰基を含み、「スルホキシド」は、－Ｓ（Ｏ）Ｒ⁸¹基を含み、「スルホン」は、－ＳＯ₂Ｒ⁸²基を含み、「スルホニル」は、－ＳＯ₂ＯＲ⁸³を含む。Ｒ⁸⁰、Ｒ⁸¹、Ｒ⁸²、およびＲ⁸³は、それぞれ独立して、本明細書で定義されるような置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアラルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキル基である。いくつかの実施形態では、スルフィドは、アルキルチオ基、－Ｓ－アルキルである。

「ウレア」という用語は、－ＮＲ⁸⁴－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ⁸⁵Ｒ⁸⁶基を指す。Ｒ⁸⁴、Ｒ⁸⁵、およびＲ⁸⁶は、独立して、水素、または本明細書で定義されるような置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロシクリルアルキル基である。
「アミジン」という用語は、－Ｃ（ＮＲ⁸⁷）ＮＲ⁸⁸Ｒ⁸⁹および－ＮＲ⁸⁷Ｃ（ＮＲ⁸⁸）Ｒ⁸⁹を指し、Ｒ⁸⁷、Ｒ⁸⁸、およびＲ⁸⁹は、それぞれ独立して、水素、または本明細書で定義されるような置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアラルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキル基である。
「グアニジン」という用語は、－ＮＲ⁹⁰Ｃ（ＮＲ⁹¹）ＮＲ⁹²Ｒ⁹³を指し、Ｒ⁹⁰、Ｒ⁹¹、Ｒ⁹²、およびＲ⁹³は、それぞれ独立して、水素、または本明細書で定義されるような置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアラルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキル基である。

「エナミン」という用語は、－Ｃ（Ｒ⁹⁴）＝Ｃ（Ｒ⁹⁵）ＮＲ⁹⁶Ｒ⁹⁷および－ＮＲ⁹⁴Ｃ（Ｒ⁹⁵）＝Ｃ（Ｒ⁹⁶）Ｒ⁹⁷を指し、Ｒ⁹⁴、Ｒ⁹⁵、Ｒ⁹⁶、およびＲ⁹⁷は、それぞれ独立して、水素、本明細書で定義されるような置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアラルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキル基である。
本明細書で使用される「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、臭素、塩素、フッ素、またはヨウ素を指す。いくつかの実施形態では、ハロゲンはフッ素である。他の実施形態では、ハロゲンは塩素または臭素である。

本明細書で使用される「ヒドロキシル」という用語は、－ＯＨまたはそのイオン化形態－Ｏ^-を指すことができる。「ヒドロキシアルキル」基は、ＨＯ－ＣＨ₂－などのヒドロキシル置換アルキル基である。
「イミド」という用語は、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ⁹⁸Ｃ（Ｏ）Ｒ⁹⁹を指し、Ｒ⁹⁸およびＲ⁹⁹は、それぞれ独立して、水素、または本明細書で定義されるような置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアラルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキル基である。
「イミン」という用語は、－ＣＲ¹⁰⁰（ＮＲ¹⁰¹）基および－Ｎ（ＣＲ¹⁰⁰Ｒ¹⁰¹）基を指し、Ｒ¹⁰⁰およびＲ¹⁰¹は、Ｒ¹⁰⁰およびＲ¹⁰¹の両方が同時に水素ではないという条件で、それぞれ独立して、水素、または本明細書で定義されるような置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアラルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキル基である。
本明細書で使用される「ニトロ」という用語は、－ＮＯ₂基を指す。
本明細書で使用される「トリフルオロメチル」という用語は、－ＣＦ₃を指す。

本明細書で使用される「トリフルオロメトキシ」という用語は、－ＯＣＦ₃を指す。
「アジド」という用語は、－Ｎ₃を指す。
「トリアルキルアンモニウム」という用語は、－Ｎ（アルキル）₃基を指す。トリアルキルアンモニウム基は正に帯電しているため、通常、ハロゲンアニオンなどの会合するアニオンを有する。
「イソシアノ」という用語は、－ＮＣを指す。
「イソチオシアノ」という用語は、－ＮＣＳを指す。
「ペンタフルオロスルファニル」という用語は、－ＳＦ₅を指す。

当業者によって理解されるように、あらゆる目的のために、特に書面による説明を提供するという観点から、本明細書に開示されるすべての範囲はまた、あらゆる可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせを包含する。列挙された範囲はどれも、同じ範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解できるように十分に記述していると簡単に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下３分の１、中３分の１、および上３分の１などに容易に分解することができる。当業者によってまた理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などのすべての言語は、列挙された数を含み、その後に上記のように部分範囲に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は、個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１～３個の原子を有する基は、１、２、または３個の原子を有する基を指す。同様に、１～５個の原子を有する群は、１、２、３、４、または５個の原子を有する群などを指す。

本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩は、本技術の範囲内にあり、所望の薬理学的活性を保持し、生物学的に望ましくないものではない（例えば、塩は過度に毒性、アレルギー性、または刺激性ではなく、生物学的に利用可能である）酸または塩基付加塩を含む。本技術の化合物が、例えば、アミノ基などの塩基性基を有する場合、薬学的に許容される塩を、無機酸（例として、塩酸、ヒドロホウ酸、硝酸、硫酸、およびリン酸）、有機酸（例えば、アルギン酸、ギ酸、酢酸、安息香酸、グルコン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、およびｐ－トルエンスルホン酸）または酸性アミノ酸（例として、アスパラギン酸およびグルタミン酸）とともに形成することができる。本技術の化合物が、例えば、カルボン酸基などの酸性基を有する場合、それは、金属、例としてアルカリ金属およびアルカリ土類金属（例えば、Ｎａ⁺、Ｌｉ⁺、Ｋ⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｚｎ²⁺）、アンモニアまたは有機アミン（例えば、ジシクロヘキシルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン）または塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、およびオルニチン）、とともに塩を形成することができる。そのような塩は、化合物を単離または精製する際にインサイチュで、または遊離塩基もしくは遊離酸の形態の精製化合物をそれぞれ好適な酸もしくは塩基と別々に反応させ、こうして形成された塩を単離することによって、調製することができる。

当業者は、本技術の化合物が互変異性、立体配座異性、幾何異性および／または立体異性の現象を示し得ることを理解するであろう。明細書および特許請求の範囲内の式の図面は、可能な互変異性体形態、立体配座異性体形態、立体化学異性体形態または幾何異性体形態のうちの１つしか提示することができないので、本技術は、本明細書に記載の１種または複数種の有用性を有する化合物の任意の互変異性体形態、立体配座異性体形態、立体化学異性体形態および／または幾何異性体形態、ならびにこれらの種々の異なる形態の混合物を包含することを理解されたい。
「互変異性体」は、互いに平衡状態にある化合物の異性体形態を指す。異性体の存在および濃度は、化合物が見出される環境に依存し、例えば、化合物が固体であるか、有機溶液もしくは水溶液中にあるかによって異なる場合がある。例えば、水溶液中で、キナゾリノンは以下の異性体形態を示す場合があり、これらは互いに互変異性体と呼ばれる。

別の例として、グアニジンは、プロトン性有機溶液中で以下の異性体形態を示す場合があり、互いに互変異性体とも呼ばれる。

構造式による化合物の提示には限界があるため、本明細書に記載の化合物のすべての化学式は、化合物のすべての互変異性体形態を表し、本技術の範囲内にあることを理解されたい。

化合物の立体異性体（光学異性体としても知られる）は、特定の立体化学が明示的に示されない限り、構造のすべてのキラル形態、ジアステレオマー形態、およびラセミ形態を含む。したがって、本技術で使用される化合物は、描写から明らかなように、いずれかまたはすべての不斉原子での濃縮されたまたは分割された光学異性体を含む。ラセミおよびジアステレオマー混合物の両方、ならびに個々の光学異性体は、それらのエナンチオマーまたはジアステレオマーパートナーを実質的に含まないように単離もしくは合成することができ、これらの立体異性体はすべて本技術の範囲内にある。
本技術の化合物は、溶媒和物、特に水和物として存在し得る。化合物または化合物を含む組成物の製造中に水和物が形成される場合があり、または化合物の吸湿性のために水和物が時間とともに形成される場合がある。本技術の化合物は、とりわけＤＭＦ、エーテル、およびアルコール溶媒和物を含む、有機溶媒和物としても存在し得る。特定の溶媒和物の同定および調製は、合成有機または医薬品化学の当業者の技能の範囲内にある。

本開示を通して、種々の刊行物、特許、および公開された特許明細書は、識別引用によって参照される。また、本開示の中には、参照された引用を指すアラビア数字があり、その完全な書誌詳細は、請求項の直前に提供されている。これらの刊行物、特許、および公開された特許明細書の開示は、本発明が関係する現況技術をより完全に説明するために、参照により本開示に組み込まれる。

本発明による技術
当技術分野において説明されているように（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００９／０２２６４２号および国際公開第ＷＯ２０１５／０８９４９５号において）、Ｉｄタンパク質は、大腸癌と悪性神経膠腫の両方で幹細胞アイデンティティーの調節因子として重要な役割を果たすことが示され、癌幹細胞の自己複製能と腫瘍開始能の両方に不可欠である。癌幹細胞の発達に関与する機構の複雑さおよび不明確な経路にもかかわらず、抗Ｉｄ化合物は、Ｉｄタンパク質を、重要な基礎において無効にして、幹細胞アイデンティティーを破壊し、幹細胞腫瘍の開始を損なう。抗転移性および抗血管新生効果のある抗Ｉｄ化合物は、腫瘍幹細胞の生存率、増殖能、腫瘍開始潜在能、および／または細胞運命決定を特異的に標的とすることができ、その結果、新しいまたは確立された腫瘍に存在する新しい腫瘍誘導能のある幹細胞の集団が大幅に減少する。

本技術の化合物は、Ｉｄ１およびＩｄ３陽性「休止」幹細胞を標的とする。これらの細胞は、化学療法に比較的耐性のある癌前駆細胞のプールを表す（休止状態の非増殖状態に基づいて、このような細胞は、増殖細胞を標的とする一次化学療法を回避する）。このように、これらの幹細胞は、頻繁に一次癌処置から逃れ、その後、それらはリバウンドして新しい癌細胞集団を生み出すことができる。ここに提示されたさらなる追加の証拠は、本技術の化合物が、単独で、または従来の化学療法癌治療と組み合わせてのいずれかで、それらの効果にも影響を与え、獲得耐性を排除することを示している。例えば、一次処置を変異により逃れる休止幹細胞または癌細胞（例えば、変異によって化学療法薬に対する耐性を獲得する細胞）は、本技術の化合物をさらに回避することも、それに対する耐性を発達させることもできない。理論に拘束されるものではないが、機能的に重要な、進化的に制約／保存されたＩｄ結合界面（本技術の化合物によって標的とされる）は、「獲得耐性」を生成するために変更することは実質的にできない。いかなる構造的変異も、このようなタンパク質が癌細胞においてその役に立つ本質的な目的に関して機能的に無効な、生物学的に機能しないＩｄタンパク質を生じるからである。

したがって、一態様では、本開示は、式Ｉ

本明細書の任意の実施形態では、Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹⁰）（Ｒ¹¹）であり得る。本明細書の任意の実施形態では、Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂であり得る。本明細書の任意の実施形態では、Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³は、それぞれ独立してＨ、メチル、メトキシ、イソプロピル、イソプロポキシ、フルオロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂であり得る。本明細書の任意の実施形態では、Ｒ³は、メトキシであり得る。

本明細書の任意の実施形態では、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹²）（Ｒ¹³）であり得る。本明細書の任意の実施形態では、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂であり得る。本明細書の任意の実施形態では、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷は、それぞれ独立してＨ、メチル、メトキシ、イソプロピル、イソプロポキシ、フルオロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂であり得る。本明細書の任意の実施形態では、Ｒ⁶は、イソプロポキシであり得る。

本明細書の任意の実施形態では、式Ｉの化合物は、式ＩＡ

(IA)
の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物であり得る。

本明細書の任意の実施形態では、式Ｉの化合物は、式ＩＢ

(IA)
の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物であり得る。
（式中、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリアルキルアンモニウム、ペンタフルオロスルファニル、ハロ、アリールオキシ、アリーロイル、ヒドロキシル、アミノ、またはアミドである）

本明細書の任意の実施形態では、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、アリールオキシ、アリーロイル、または－Ｎ（Ｃ₁－Ｃ₃アルキル）₂であり得る。本明細書の任意の実施形態では、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂であり得る。本明細書の任意の実施形態では、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶は、それぞれ独立してＨ、メチル、メトキシ、イソプロピル、イソプロポキシ、フルオロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂であり得る。本明細書の任意の実施形態では、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶は、それぞれ独立してＨであり得る。

本明細書の任意の実施形態では、式Ｉの化合物は、

またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物であり得る。

本明細書の任意の実施形態では、式Ｉの化合物は、式ＩＣ

(IC)
の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物であり得る。

本明細書の任意の実施形態では、式Ｉの化合物は、

一態様では、本明細書に開示される任意の実施形態の式Ｉの化合物（例えば、式Ｉによる化合物、上記に開示された化合物、上記に開示された任意の化合物の薬学的に許容される塩および／または溶媒和物）および薬学的に許容される担体または１種もしくは複数種の賦形剤、充填剤または薬剤（特に指定および／または明記しない限り、以下、総称して「薬学的に許容される担体」と呼ぶ）を含む組成物が提供される。関連する態様では、本明細書に開示される任意の実施形態の式Ｉの化合物を含む医薬が提供される。関連する態様では、（ｉ）本明細書に開示される任意の実施形態の式Ｉの有効量の化合物、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。参照を容易にするために、本技術の組成物、医薬、および医薬組成物を、本明細書では総称して「組成物」と呼んでもよい。さらに関連する態様では、本技術は、本明細書に開示される任意の実施形態の化合物および／または本明細書に開示される任意の実施形態の組成物を含む方法、ならびに本明細書に開示される任意の実施形態の化合物および／または本明細書に開示される任意の実施形態の組成物の使用を提供する。そのような方法および使用は、本明細書に開示される任意の実施形態の有効量の化合物を含み得る。本明細書に開示される任意の態様または実施形態（本明細書において「本明細書の任意の実施形態」、「本明細書に開示される任意の実施形態」などと総称される）では、有効量は、対象における病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患を処置する量であり得る。本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」は、典型的には、ネコ、イヌ、齧歯類または霊長類などの哺乳動物である。典型的には、対象はヒトであり、好ましくは、病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患に罹患している、または罹患している疑いのあるヒトである。対象および患者という用語は、交換可能に使用することができる。

したがって、本発明の技術は、本技術の本明細書に開示される化合物のいずれか（例えば、式Ｉの化合物の本明細書に開示される任意の実施形態）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物および医薬を提供する。組成物は、本明細書に記載の方法および処置に使用することができる。そのような組成物および医薬は、式Ｉの化合物を含むがこれに限定されない、本明細書に記載されるような治療有効量の任意の化合物を含む。医薬組成物は、単位剤形で包装することができる。単位剤形は、それを必要とする対象に投与された場合、病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患を処置するのに有効である。

本技術の医薬組成物および医薬は、本技術の１つまたは複数の化合物、その薬学的に許容される塩、その立体異性体、その互変異性体、またはその溶媒和物を、薬学的に許容される担体、賦形剤、結合剤、希釈剤等と混合することによって調製し得る。本明細書に記載の化合物および組成物は、病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患を予防または処置する製剤および医薬を調製するために使用することができる。そのような組成物は、例えば、顆粒、粉末、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、座薬、注射剤、乳濁液、エリキシル剤、懸濁液または溶液の形態であり得る。本組成物は、例えば、経口、非経口、局所、直腸、経鼻、膣内投与によって、または植込みリザーバーを介して、種々の投与経路のために製剤化することができる。非経口または全身投与としては、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、および筋肉内注射が挙げられるが、これらに限定されない。以下の剤形は例として与えられており、本技術を制限するものとして解釈されるべきではない。

経口、口腔、および舌下投与の場合、粉末、懸濁液、顆粒、錠剤、丸薬、カプセル錠、ゲルキャップ、およびカプレットが固形剤形として許容される。これらは、例えば、本発明の技術の１種または複数種の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは互変異性体を、デンプンもしくは他の添加剤などの少なくとも１種の添加剤と混合することによって調製することができる。好適な添加剤は、スクロース、ラクトース、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアガム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成ポリマーまたはグリセリドである。任意に、経口剤形は、例として、不活性希釈剤、またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、またはパラベンもしくはソルビン酸などの防腐剤、またはアスコルビン酸、トコフェロールもしくはシステインなどの抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味料、香味剤または芳香剤、など、投与を助ける他の成分を含有してもよい。錠剤および丸薬は、当技術分野で知られている好適なコーティング材料でさらに処理することができる。

経口投与用の液体剤形は、水などの不活性希釈剤を含有し得る、薬学的に許容されるエマルション、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁液、および溶液の形態であり得る。医薬製剤および医薬は、油、水、アルコール、およびこれらの組み合わせなどであるがこれらに限定されない滅菌液体を使用して、液体懸濁液または溶液として調製することができる。経口または非経口投与のために、薬学的に好適な界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤を加えることができる。

上記のように、懸濁液は油を含み得る。このような油としては、ピーナッツ油、ゴマ油、綿実油、コーン油、およびオリーブ油が挙げられるが、これらに限定されない。懸濁液調製物はまた、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリドおよびアセチル化脂肪酸グリセリドなどの脂肪酸のエステルを含み得る。懸濁液製剤としては、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロール、およびプロピレングリコールなどのアルコールを挙げることができるが、これらに限定されない。これらに限定されないが、ポリ（エチレングリコール）、鉱油およびワセリンなどの石油炭化水素などのエーテル；および水を懸濁液製剤に使用することもできる。

注射用剤形は、一般に、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して調製することができる水性懸濁液または油性懸濁液を含む。注射用形態は、溶液相または懸濁液の形態であり得、これは溶媒または希釈剤で調製される。許容される溶媒またはビヒクルとしては、滅菌水、リンゲル液、または等張食塩水が挙げられる。あるいは、滅菌油を溶媒または懸濁化剤として使用することができる。典型的には、油または脂肪酸は不揮発性であり、天然または合成油、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドが含まれる。
注射の場合、医薬製剤および／または医薬は、上記のような適切な溶液での復元に好適な粉末であり得る。これらの例としては、凍結乾燥、回転乾燥または噴霧乾燥粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物、または粒子が挙げられるが、これらに限定されない。注射の場合、製剤は、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、生物学的利用能調整剤、およびこれらの組み合わせを含んでもよい。

本技術の化合物は、鼻または口からの吸入によって肺に投与することができる。吸入に好適な医薬製剤としては、溶液、スプレー、乾燥粉末、またはエアロゾルが挙げられ、適切な溶媒を含有し、安定剤、抗菌剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、生物学的利用能調整剤、およびこれらの組み合わせなどの他の化合物を含有してもよい。担体および安定剤は、特定の化合物の要件によって異なるが、典型的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎｓ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、またはポリエチレングリコール）、血清アルブミン、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝液、塩、糖、または糖アルコールなどの無害なタンパク質が含まれる。水性および非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤中）のエアロゾルは、典型的には、吸入による本技術の化合物の送達に使用される。

本技術の化合物の局所（口腔内および舌下を含む）または経皮投与のための剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、およびパッチが挙げられる。活性成分は、無菌条件下で薬学的に許容される担体または賦形剤、および必要とされ得る任意の防腐剤または緩衝液と混合してもよい。粉末およびスプレーは、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を用いて調製することができる。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルはまた、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有してもよい。吸収促進剤を使用して、皮膚全体にわたる本技術の化合物の流束を増加させることもできる。そのような流束の速度は、速度制御膜を提供することによって（例えば、経皮パッチの一部として）、または化合物をポリマーマトリックスもしくはゲルに分散させることによって制御することができる。

上記の代表的な剤形に加えて、薬学的に許容される賦形剤および担体は、一般に当業者に知られており、したがって、本発明の技術に含まれる。そのような賦形剤および担体は、例えば、“Remingtons Pharmaceutical Sciences” Mack Pub. Co., New Jersey (1991)に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本技術の製剤は、下記に示すように短時間作用型、速放出性、長時間作用性、および持続放出性であるように設計され得る。したがって、医薬製剤はまた、制御放出または徐放のために製剤化され得る。
本発明の組成物はまた、例えば、ミセルもしくはリポソーム、またはいくつかの他のカプセル化された形態を含み得るか、または長期の保存および／または送達効果を提供するために徐放形態で投与され得る。したがって、医薬製剤および医薬は、ペレットもしくはシリンダーに圧縮され、筋肉内もしくは皮下にデポー注射として、またはステントなどのインプラントとして植込むことができる。このようなインプラントには、シリコーンおよび生分解性ポリマーなどの既知の不活性材料を使用してもよい。

特定の投与量は、疾患の状態、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および対象の食事、投与間隔、投与経路、排泄率、および薬物の組み合わせに応じて調整することができる。有効量を含有する上記の剤形のいずれも、十分に定型的実験の範囲内にあり、したがって、十分に本発明の技術の範囲内にある。
当業者は、所望の結果が達成されるまで、本技術の化合物を、量を増加して患者に単に投与することによって、有効量を容易に決定することができる。本技術の化合物は、１日あたり約０．１～約１，０００ｍｇの範囲の投与量レベルで患者に投与することができる。体重が約７０ｋｇの正常な成人の場合、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．０１～約１００ｍｇの範囲の投与量で十分である。しかし、使用される特定の投与量は、当業者によって適切であると考えられるように変更するか、または調整することができる。例えば、投与量は、患者の要件、状態の重症度、および使用されている特定の化合物の薬理学的活性を含む複数の要因に依存し得る。特定の患者に最適な投与量の決定は、当業者に周知である。

本技術による処置の治療効果を判定するために、種々のアッセイおよびモデルシステムを容易に使用することができる。本技術の組成物および方法の有効性は、症状の減少によっても示すことができる。
本明細書に記載の示された状態のそれぞれについて、プラセボ処置または他の好適な対照対象と比較して、試験対象は、対象の障害によって引き起こされた、またはそれに関連した、１種または複数種の症状について、１０％、２０％、３０％、５０％以上の減少、最大７５～９０％、または９５％以上の減少を示す。

例えば、癌および転移性疾患に対する本技術の化合物、組成物、および方法の有効性を、様々な方法のいずれかによって、例えば、Ｘ線またはＭＲＩを使用した腫瘍イメージング（例えば、処置を受けた患者の腫瘍のサイズまたは数が減少したかどうかを判定するため）によって、臨床的成功の観点から監視することができる。有効性は、腫瘍サイズの減少のＸ線写真またはＭＲＩ観察によって多くの場合判定することができる。癌を処置するための本技術の効果的な化合物、組成物、および方法によって、資格のある同等の対照対象と比較して、処置を受けた患者の腫瘍サイズ、または処置を受けた患者の群間の平均腫瘍サイズの少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％以上の減少が定型的に生じる。癌および転移性疾患に対する本技術の化合物、組成物、および方法の有効性は、好適な試験対象と対照対象との間の血液試料中の循環腫瘍細胞の数を測定することによってさらに判定することができる。これは、免疫磁気選択、フローサイトメトリー、免疫ビーズ捕捉、蛍光顕微鏡法、細胞形態学的分析、または細胞分離技術を含むがこれらに限定されない、適用可能な任意の手段によって達成することができる。癌を処置するための本技術の効果的な化合物、組成物、および方法によって、資格のある同等の対照対象と比較して、処置を受けた患者の、または処置を受けた患者の群間の血液試料中の循環腫瘍細胞の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％以上の減少が定型的に生じる。癌および転移性疾患に対する本技術の化合物、組成物、および方法の有効性は、骨、リンパ節および肺を含むがこれらに限定されない二次組織または器官における原発腫瘍細胞の発生または数を検出または測定することによって、さらに判定することができる。癌を処置するための本技術の効果的な化合物、組成物、および方法によって、資格のある同等の対照対象と比較して、処置を受けた患者間の二次組織または臓器に転移した原発腫瘍細胞の発生または数の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％以上の減少が定型的に生じる。

本明細書の任意の実施形態または態様において、本技術の抗血管新生化合物、組成物、および方法は、哺乳動物対象における病的な眼の血管新生を低減するのに有効であり得る。これらの方法は、単剤療法または併用療法を採用してもよい。本技術の化合物、組成物、および方法は、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を伴う対象の眼組織における血管病変の発生率、サイズ、または数を低減するために「抗血管新生効果的」である。「血管新生の減少」は、ＡＭＤ病変サイズの組織病理学的または眼血管造影指数の減少の観察、例えば、二次眼部位で観察される病変または病変の「病巣」の発生、サイズ、数または分布の減少に対応し得る。抗血管新生に対する有効性は、ＡＭＤの有効な予防および／または処置と相関する１つまたは複数の患者の治療指数の正の変化によって、例えば、本技術の化合物／組成物を受けていない好適な対照対象と比較した、本技術の化合物／組成物を受けている対象の無病状態または疾患安定状態の期間の増加によって、判定することができる。

抗ＡＭＤの病変有効性、例えば、本技術の化合物、組成物、および方法が新生血管病変複合体の増殖を減少または安定化させる有効性によって、その根底にある病状の一部として有害な血管新生を伴う眼の状態（または他の病原性の状態）の処置を受けた患者における実質的な治療上の利益および改善された処置結果がもたらされることがある。例えば、本技術の化合物、組成物、および方法により処置を受けた患者は、有害な副作用の増加なしにまたは減少の観察を伴い、改善された処置結果を示し得る。本技術のこれらの利点、化合物、組成物、および方法の例示によって、１つまたは複数の正の臨床治療指数の少なくとも２０％の増加、例えばＡＭＤ病変指数の有益な変化（例えば、二次眼部位で観察される病変または一次病変の「病巣」の発生、サイズ、数または分布の減少）が生じる場合がある。本技術の化合物、組成物、および方法の抗ＡＭＤの病変有効性は、好適な対照患者（本技術の化合物／組成物で処置されていない）において判定された生存率と比較した、本技術の化合物／組成物で処置された患者の無病状態または疾患安定状態の少なくとも２０％の増加によって間接的に実証され得る。本技術の化合物、組成物、および方法は、さらに大きな抗ＡＭＤ臨床的利益をもたらす場合があり、例えば、正の治療指数が２０～５０％増加し、５０～９０％増加し、最大７５％～１００％増加し、例えば、６か月～１年、１～２年、２～５年、５年以上持続する、１０年以上の寛解を含む、観察された原発性ＡＭＤ病変の完全寛解を含む。本技術の化合物／組成物で処置された対象対未処置またはプラセボ処置を受けた対象において、例えば、比較組織病理学、眼血管造影、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）、または別の眼イメージング技術によって示されるように、本技術の化合物、組成物、および方法は、病変サイズの少なくとも２０％の減少、２０％～５０％、５０％～７５％、最大９０％以上の減少をもたらすのに有効な抗ＡＭＤであり得る。抗ＡＭＤの有効性は、本技術の化合物／組成物で処置された患者と陽性対照処置対象との間でＡＭＤの観察された症状、例えば、視力の喪失の増加がないこと、またはその減少にも相関する場合がある。例えば、本技術の化合物／組成物を介して単剤療法で処置された対象、および本技術の化合物／組成物プラス抗ＶＥＧＦ療法などの組み合わせ法で処置された対象を含む対象は、従来の（例えば、抗ＶＥＧＦ）療法で処置された陽性対照対象と比較して、スネレン視標スコアの増加を示さないことがあり、スネレン視標スコアの少なくとも２０％の増加、２０～５０％の増加、最大５０～９０％以上の増加を示すことがある。

本技術の化合物はまた、病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患の処置に有用であり得る他の従来の治療剤と共に患者に投与してもよい。投与としては、経口投与、非経口投与、または経鼻投与を挙げてもよい。これらの実施形態のいずれにおいても、投与は、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、または筋肉内注射を含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、投与は経口投与を含み得る。本技術の方法はまた、病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患の処置に潜在的または相乗的に有効であり得る量の従来の治療剤を、本技術の１種または複数種の化合物と連続的にまたは組み合わせて投与することを含み得る。

一態様では、本技術の化合物は、治療的使用に好適な量または投与量で患者に投与される。一般に、本技術の化合物を含む単位投与量は、患者の考慮事項に応じて変化する。そのような考慮事項には、例えば、年齢、プロトコル、状態、性別、疾患の程度、禁忌、併用療法などが含まれる。これらの考慮事項に基づく例示的な単位投与量はまた、当技術分野の医師によって調整または改変することができる。例えば、本技術の化合物を含む患者への単位投与量は、１×１０^-4ｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇ、好ましくは、１×１０^-3／ｋｇ～１．０ｇ／ｋｇで変化し得る。本技術の化合物の投与量はまた、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋで、または好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇで変化し得る。

本技術の化合物はまた、例えば、薬物動態特性、毒性または生物学的利用能を改善するために（例えば、インビボ半減期の増加）、有機部分の共有結合またはコンジュゲートによって修飾することができる。コンジュゲートは、直鎖または分枝鎖の親水性ポリマー基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基であり得る。ポリマー基は、例えば、薬物動態特性、毒性または生物学的利用能を改善するために当業者によって調整され得る分子量を含むことができる。例示的なコンジュゲートは、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマーまたはポリビニルピロリドン、および脂肪酸または脂肪酸エステル基を含むことができ、これらのそれぞれは、約８～約７０の炭素原子を含むことができる。本技術の化合物と共に使用するためのコンジュゲートはまた、例えば、任意の好適な置換基または基、放射性標識（マーカーまたはタグ）、ハロゲン、タンパク質、酵素、ポリペプチド、他の治療剤（例えば、医薬品または薬物）、ヌクレオシド、染料、オリゴヌクレオチド、脂質、リン脂質および／またはリポソームへのリンカーとして機能することができる。一態様では、コンジュゲートは、ポリエチレンアミン（ＰＥＩ）、ポリグリシン、ＰＥＩとポリグリシンのハイブリッド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を含むことができる。コンジュゲートはまた、本技術の化合物を、例えば、標識（蛍光もしくは発光）またはマーカー（放射性核種、放射性同位体および／または同位体）に連結させて、本技術のプローブを構成することができる。本技術の化合物と共に使用するためのコンジュゲートは、一態様では、インビボ半減期を改善することができる。本技術の化合物と共に使用するための他の例示的なコンジュゲート、ならびにその用途および関連する技術には、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６７２，６６２号によって一般的に記載されるものが含まれる。

別の態様では、本技術は、目的の標的を、検出可能量またはイメージング有効量の本技術の標識化合物と接触させることを含む、目的の標的を同定する方法を提供する。検出可能量またはイメージング有効量は、選択された検出方法によって検出されるのに必要な本技術の標識化合物の量である。例えば、検出可能量は、限定されないが、病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患に関連する細胞または組織を含む、目的の標的への標識化合物の結合の検出が可能になるのに十分な投与量であり得る。好適な標識は当業者に知られており、例えば、放射性同位体、放射性核種、同位体、蛍光基、ビオチン（ストレプトアビジン複合体形成と組み合わせて）、および化学発光基を含み得る。標識化合物が目的の標的に結合すると、標的は、単離され、精製され、アミノ酸配列を決定することなどによってさらに特徴付けることができる。

「会合する」および／または「結合する」という用語は、例えば、本技術の化合物と目的の標的との間の化学的または物理的相互作用を意味し得る。会合または相互作用の例には、共有結合、イオン結合、親水性－親水性相互作用、疎水性－疎水性相互作用および複合体が含まれる。会合は、一般に「結合」または「親和性」を指すこともあり得、これは、それぞれを使用して種々の化学的または物理的相互作用を説明することができるからである。結合または親和性を測定することもまた、当業者にとって定型的である。例えば、本技術の化合物は、目的の標的またはその前駆体、部分、フラグメントおよびペプチド、ならびに／またはそれらの沈着物に結合または相互作用することができる。

併用療法
本開示において以前に示されたように、本明細書の任意の実施形態または態様では、本技術の任意の実施形態の化合物、組成物、または医薬組成物は、病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患の予防または処置のための１種もしくは複数種の追加の治療と組み合わせることができる。追加の治療剤には、化学療法剤、免疫療法剤、外科手術、放射線療法、抗血管新生剤、非ステロイド性抗炎症薬、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

追加的または代替的に、本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、追加の治療剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、小胞体ストレス誘発剤、代謝拮抗剤、免疫療法剤、有糸分裂阻害剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、アルキルスルホネート、プラチナ剤、タキサン、ビンカ剤、抗エストロゲン剤、アロマターゼ阻害剤、卵巣抑制剤、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、細胞静止性アルカロイド、細胞毒性抗生物質、内分泌／ホルモン剤、ビスホスホネート療法剤、フェンホルミン、抗血管新生剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、からなる群から選択され得る。

追加的または代替的に、本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、追加の治療剤は、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５－フルオロウラシルまたは５－ＦＵ）、メトトレキサート、エダトレキサート（１０－エチル－１０－デアザ－アミノプテリン）、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（アルブミン結合パクリタキセル）、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾルミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、リュープロリド、アバレリックス、ブセルリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、アントラサイクリン（例、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、クラドリビン、ミドスタウリン、ベバシズマブ、オキサリプラチン、メルファラン、エトポシド、メクロレタミン、ブレオマイシン、微小管毒、非酢酸アセトゲニン、クロラムブシル、イホスファミド、ストレプトゾシン、カルムスチン、ロムスチン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド、アルトレタミン、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、ペメトレキセド、エピルビシン、イダルビシン、ＳＮ－３８、ＡＲＣ、ＮＰＣ、カンプトテシン（ｃａｍｐｏｔｈｅｃｉｎ）、９－ニトロカンプトテシン、９－アミノカンプトテシン、ルビフェン、ギマテカン、ジフロモテカン、ＢＮ８０９２７、ＤＸ－８９５１ｆ、ＭＡＧ－ＣＰＴ、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、リン酸エトポシド、テニポシド、アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ）、デシタビン、バッカチンＩＩＩ、１０－デアセチルタキソール、７－キシロシル－１０－デアセチルタキソール、セファロマンニン、１０－デアセチル－７－エピタキソール、７－エピタキソール、１０－デアセチルバッカチンＩＩＩ、１０－デアセチルセファロマンニン、ストレプトゾトシン、ニムスチン、ラニムスチン、ベンダムスチン、ウラシルマスタード、エストラムスチン、マンノスルファン、カンプトテシン、エキサテカン、ルートテカン、ラメラリンＤ９－アミノカンプトテシン、アムサクリン、エリプチシン、オーリントリカルボン酸、ＨＵ－３３１、およびそれらの混合物、からなる群から選択される化学療法剤であり得る。

追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、ペメトレキセド、およびそれらの混合物、からなる群から選択される代謝拮抗剤であり得る。
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、バッカチンＩＩＩ、１０－デアセチルタキソール、７－キシロシル－１０－デアセチルタキソール、セファロマンニン、１０－デアセチル－７－エピタキソール、７－エピタキソール、１０－デアセチルバッカチンＩＩＩ、１０－デアセチルセファロマンニン、およびそれらの混合物、からなる群から選択されるタキサンであり得る。
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、ベンダムスチン、ウラシルマスタード、エストラムスチン、カルムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾトシン；ブスルファン、マンノスルファン、およびそれらの混合物、からなる群から選択されるＤＮＡアルキル化剤であり得る。

追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＳＮ－３８、ＡＲＣ、ＮＰＣ、カンプトテシン、トポテカン、９－ニトロカンプトテシン、エキサテカン、ルートテカン、ラメラリンＤ９－アミノカンプトテシン、ルビフェン、ギマテカン、ジフロモテカン、ＢＮ８０９２７、ＤＸ－８９５１ｆ、ＭＡＧ－ＣＰＴ、およびそれらの混合物、からなる群から選択されるトポイソメラーゼＩ阻害剤であり得る。
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、オーリントリカルボン酸、ドキソルビシン、およびＨＵ－３３１およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択されるトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であり得る。
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体）、イピリムマブ、９０Ｙ－クリバツズマブ・テトラキセタン、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、トラスツズマブ、シクスツムマブ、ガニツマブ、デムシズマブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、ダロツズマブ、シプロイセルＴ、ＣＲＳ－２０７、およびＧＶＡＸ、からなる群から選択される免疫療法剤であり得る。

追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ベバシズマブ、セディラニブ、アキシチニブ、アンギネックス、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、バタラニブ、カボザンチニブ、ポナチニブ、レンバチニブ、ＳＵ６６６８、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標））、レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ（登録商標））、レゴラフェニブ（Ｓｔｉｖａｒｇａ（登録商標））、サリドマイド（Ｓｙｎｏｖｉｒ、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））、バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（登録商標））、およびアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））、からなる群から選択される抗血管新生剤であり得る。

追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ツバシン、アピシジン、デプシペプチド、ＭＳ２７５、ＢＭＬ－２１０、ＲＧＦＰ９６６、ＭＧＣＤ０１０３、ＬＢＨ５８９、スプリトマイシン、ＦＫ２２８、フェニル酪酸、ＳＡＨＡ、ベリノスタット、パノビノスタット（Ｐａｎａｂｉｏｓｔａｔ）、ギビノスタット、レスミノスタット、アベキシノスタット、クイジノスタット（Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ）、ロシリノスタット（Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ）、プラシノスタット（Ｐｒａｃｔｉｎｏｓｔａｔ）、ＣＨＲ－３９９６、バルプロ酸、酪酸、エンチノスタット、タセジナリン、４ＳＣ２０２、モセチノスタット、ロミデプシン、ニコチンアミド、シルチノール、カンビノール、およびＥＸ－５２７、からなる群から選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり得る。

追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、インドメタシン、フェノプロフェン、イブプロフェン、フルフェナム酸、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、ケトロラク、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク、およびトルメチン、からなる群から選択されるＮＳＡＩＤであり得る。
代謝拮抗剤の例としては、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、ペメトレキセド、およびそれらの混合物が挙げられる。

タキサンの例としては、バッカチンＩＩＩ、１０－デアセチルタキソール、７－キシロシル－１０－デアセチルタキソール、セファロマンニン、１０－デアセチル－７－エピタキソール、７－エピタキソール、１０－デアセチルバッカチンＩＩＩ、１０－デアセチルセファロマンニン、およびそれらの混合物が挙げられる。
免疫療法剤の例としては、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体）、イピリムマブ、９０Ｙ－クリバツズマブ・テトラキセタン、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、トラスツズマブ、シクスツムマブ、ガニツマブ、デムシズマブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、ダロツズマブ、シプロイセルＴ、ＣＲＳ－２０７、およびＧＶＡＸが挙げられる。
抗血管新生剤の例としては、ベバシズマブ、セディラニブ、アキシチニブ、アンギネックス、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、バタラニブ、カボザンチニブ、ポナチニブ、レンバチニブ、ＳＵ６６６８、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標））、レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ（登録商標））、レゴラフェニブ（Ｓｔｉｖａｒｇａ（登録商標））、サリドマイド（Ｓｙｎｏｖｉｒ、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））、バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（登録商標））、およびアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））が挙げられる。

ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の例としては、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ツバシン、アピシジン、デプシペプチド、ＭＳ２７５、ＢＭＬ－２１０、ＲＧＦＰ９６６、ＭＧＣＤ０１０３、ＬＢＨ５８９、スプリトマイシン、ＦＫ２２８、フェニル酪酸、ＳＡＨＡ、ベリノスタット、パノビノスタット（Ｐａｎａｂｉｏｓｔａｔ）、ギビノスタット、レスミノスタット、アベキシノスタット、クイジノスタット（Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ）、ロシリノスタット（Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ）、プラシノスタット（Ｐｒａｃｔｉｎｏｓｔａｔ）、ＣＨＲ－３９９６、バルプロ酸、酪酸、エンチノスタット、タセジナリン、４ＳＣ２０２、モセチノスタット、ロミデプシン、ニコチンアミド、シルチノール、カンビノール、およびＥＸ－５２７が挙げられる。
ＮＳＡＩＤの例としては、インドメタシン、フェノプロフェン、イブプロフェン、フルフェナム酸、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、ケトロラク、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク、およびトルメチンが挙げられる。

いずれの場合も、本明細書の任意の実施形態では、複数の治療剤は、任意の順序で、または同時でも投与することができる。同時である場合、複数の治療剤は、単一の統一された形態、または複数の形態で提供され得る（例としてのみ、単一の注射、２種の別個の注射、または丸薬と組み合わせた注射のいずれかとして）。治療剤のうちの一方を複数回用量で投与することも、両方を複数回用量で投与することもできる。同時でない場合、複数回用量間のタイミングは、０週間以上から４週間未満まで変化する場合がある。加えて、組み合わせ方法、組成物および製剤は、２種の薬剤のみの使用に限定されるべきではない。

キット
本開示はまた、本技術の化合物および／または組成物を含むキット、ならびに病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患を予防および／または処置するためにそれを使用するための説明書を提供する。任意に、本技術のキットの上記の成分は、好適な容器に詰められ、病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患の予防および／または処置のために標識される。

上記の成分は、単位用量または複数回用量容器、例えば、密封されたアンプル、バイアル、ボトル、注射器、および試験管に、水性の、好ましくは滅菌の溶液として、または復元のために、凍結乾燥された、好ましくは滅菌の製剤として保存することができる。キットは、医薬組成物をより高い体積に希釈するのに好適な希釈剤を保持する第２の容器をさらに含んでもよい。好適な希釈剤としては、医薬組成物の薬学的に許容される担体および生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、キットは、医薬組成物を希釈するための説明書、および／または希釈されているかどうかにかかわらず、医薬組成物を投与するための説明書を含んでもよい。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができ、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針によって突き刺すことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含むより多くの容器をさらに含み得る。キットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、１種または複数種の好適な宿主のための培養培地を含む、市販および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。キットは、例えば、そのような治療または診断製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、製造、投与、禁忌および／または警告に関する情報を含む、治療または診断製品の市販パッケージに慣習的に含まれる説明書を含んでもよい。

キットはまた、例えば、緩衝剤、防腐剤または安定剤を含むことができる。キットには、対照試料または一連の対照試料を含めることもでき、これらの試料を、アッセイして試験試料と比較することができる。キットの各成分を、個別の容器に封入してもよく、種々の容器すべてを、キットを使用して実行されたアッセイの結果を解釈するための説明書とともに、単一のパッケージに内に入れることができる。本技術のキットは、キット容器上またはキット容器内に記載がある製品を含み得る。記載がある製品では、キットに含まれている試薬の使用方法が説明されている。ある特定の実施形態では、試薬の使用は、本技術の方法に従うことができる。本明細書の任意の実施形態では、記載がある製品は、本明細書に記載される任意の実施形態による方法の実行を指示することができる。

本技術は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは、決して限定的であると解釈されるべきではない。本明細書の実施例は、本技術の利点を説明し、当業者が本技術の組成物およびシステムを調製または使用することをさらに支援するために提供されている。例示は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本技術の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。実施例は、上記の本技術の変形、態様、または実施形態のいずれかを含むか、または組み込むことができる。上記の変形、態様、または実施形態はまた、それぞれ、本技術の他の任意またはすべての変形、態様、または実施形態の変形をさらに含むか、または組み込むことができる。以下の実施例は、Ｉｄタンパク質を阻害する本技術の例示的な組成物の調製、特徴付け、および使用を実証している。

（実施例１）
ＡＧＸ５１の合成。
２－メトキシシンナムアルデヒド１とカリウムアリールトリフルオロボレート２ａまたは通常のアリールボロン酸２ｂの反応により、目的の付加物３を、高収率で得た（スキーム１）。アルデヒド３をベンジルアミンおよび水素化ホウ素ナトリウムで還元的アミノ化して、アミン４を得た。アミン４を塩化プロピオニルでアシル化して、最終生成物５（ＡＧＸ５１）を、全体の７５％の収率で得た。

スキーム１．化合物ＡＧＸ５１（化合物５）の合成：

（実施例２）
ＡＧＸ－Ａの合成。
化合物７を、触媒量のパラジウムジベンジリデンアセトンとトリフェニルホスフィンの存在下で、アルデヒド１にトリフルオロボレート６を共役付加することにより１ステップで生成した。アルデヒド７の還元的アミノ化により、第二級アミン８（ＡＧＸ－Ａ）を、粘稠な油として高収率で得て、これを対応する塩酸塩９に変換し、白色の固体として単離した。

スキーム２．化合物８（ＡＧＸ－Ａ）および対応する塩酸塩の合成。

（実施例３）
カルボニル基を有するアミンを使用する還元的アミノ化。
ＮａＢＨ₄などの試薬によって還元することができるケトンなどの非相溶性基を有するアミンを用いたアルデヒド３（スキーム３）の２段階還元的アミノ化を、代わりに、木炭上パラジウム触媒下で水素を使用して水素化して行った。化合物１０を、１雰囲気水素下で木炭上の１０％Ｐｄを使用して中間体イミンを水素化することによって得た。

スキーム３．化合物１１の合成。

（実施例４）
ＡＧＸ５１のキラル分割
スキーム４に示されるように、ラセミＡＧＸ５１を、キラルＡＳ－Ｈ分取カラム（Ｃｈｉｒａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分割して、化合物Ｐ１（ピーク１、＞９９％ｅｅ、［α］^21.6Ｄ＋２２．５３（ｃ０．８、ＭｅＯＨ））および化合物Ｐ２（ピーク２、約９３％ｅｅ、［α］^21.6Ｄ－２５．７７（ｃ０．８、ＭｅＯＨ））を得た。

スキーム４．ＡＧＸ５１のキラル分割

（実施例５）
結晶化およびＸ線構造決定。
Ｐ１もＰ２もＸ線品質の結晶を提供しなかった。しかし、対応するアミン塩は結晶性であるため、アミドは条件下で加水分解される可能性があり、これはキラル中心を損なうことはない。したがって、スキーム５に示すように、（＋）－エナンチオマーを、ジオキサン－水中の４．０規定ＨＣｌに８５℃で２４時間曝露し、塩基後処理の後に対応するアミンを提供した。

スキーム５．キラル分割

次に、このようにして得られた（＋）－キラルアミンをいくつかの酸；エタノール中の（＋）－カンファースルホン酸、Ｄ－（－）－酒石酸、Ｌ－（＋）－酒石酸、Ｌ－（－）－リンゴ酸、およびフマル酸により結晶化させた（トルエン外部チャンバー）。結晶を採取し、Ｘ線結晶構造解析のために提出した。フマル酸塩からの結晶のみが回折し、Ｒ－（＋）－エナンチオマーとしてキラル中心の立体配座を明確に提供した。Ｐ１、Ｒ－（＋）エナンチオマー（すなわち、Ｒ－（＋）－３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－Ｎ－ベンジル－３－（２－メトキシフェニル）プロパン－１－アミン））のＸ線構造を、図２０に示す。

（実施例６）
ＡＧＸ５１の両方のエナンチオマーの脱アシル化。
スキーム６に示すように、光学的に純粋なアミドＰ１およびＰ２の両方の脱アシル化を、不活性第三級アミドのインサイチュ活性化およびそれに続くフェニルグリニャール試薬の添加によって更に達成した（Huang at al., Tetrahedron, 71(2015): 4248-4254）。両方の光学アミンのＮＭＲ分析は、スキーム１で合成されたアミン４の分析と同一である。

スキーム６．ＡＧＸ５１の両方のエナンチオマーの脱アシル化。

（実施例７）
クロスリンカー化合物１６の合成。
さらに、スキーム７に示されているように、直接キラル合成は、Ｒ－（Ｃ₇Ｆ₇）₂－ＢＩＮＯＬ（Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 54(34): 9931-9935 (2015)）などのキラル触媒を使用した有機触媒作用によって達成することができた。実際、９５℃でトルエン中の触媒量のＲ－（Ｃ₇Ｆ₇）₂－ＢＩＮＯＬの存在下でモレキュラーシーブを用いてアルデヒド１をトリフルオロボロネート２ａと反応させると、キラルアルデヒド３が生成され、これを対応するキラルアミン１２に進めた。トリフルオロアセトアミドを設定してＢｏｃ保護基を除去するための官能基操作に続いて、アルデヒド１５を使用して得られたアミンの還元的アミノ化により、［α］²²Ｄ－７０．３９（ｃ１．０、ＣＨ₂Ｃｌ₂）の比旋光度を示すジアジリン１６を得た。エナンチオマー過剰率は、決定されなかった。アルデヒド１５は、アルコール１４のデスマーチンペルヨージナン酸化の生成物であった。

スキーム７．クロスリンカー化合物１６の合成。

（実施例８）
ＡＧＸ－Ｅの合成。
スキーム８に例示されるように、追加のアナログを官能基操作により修飾した。化合物１７（ＡＧＸ－Ｃ）の塩化物を、マイクロ波照射下で酢酸ナトリウムを使用するアセテートで置換してＡＧＸ－Ｄ（１８）を生成し、これを加水分解してＡＧＸ－Ｅ（１９）を生成した（スキーム６）。

スキーム８．後期段階修飾。

（実施例９）
より多くのＡＧＸ５１アナログの合成。
スキーム９に示されるように、化合物２１（ＡＧＸ－Ｆ）および２４（ＡＧＸ－Ｈ）を、第二級アミン４と対応する酸２０、２２とのアミド形成によって良好な収率で提供した（スキーム７）。

スキーム９．より多くのＡＧＸ５１アナログの合成。

（実施例１０）
クロスリンカーＡＧＸ５１アナログの合成。
スキーム１０に示されるように、いくつかの架橋ならびに蛍光プローブも合成された。ＡＧＸ５１－ＢＯＤＩＰＹアナログは、アミン４およびＰＥＧスペーサー２８、３１をＢＯＤＩＰＹＮＨＳエステル２５とカップリングすることで作製することができる（スキーム７）。

スキーム１０．クロスリンカーＡＧＸ５１アナログの合成。

（実施例１１）
実験手順
有機トリフルオロホウ酸カリウム２ａの２－メトキシシンナムアルデヒドへの共役付加のための典型的な手順Ａ。フラスコに、アルゴン下で、有機トリフルオロホウ酸カリウム２ａ（６．１８３ｇ、２７ｍｍｏｌ、２．５当量）、２－メトキシシンナムアルデヒド１（１．７６ｇ、１０．８５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）₂（１２２ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ、５ｍｏｌ％）、ｂｐｙ（３３９ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ、２０ｍｏｌ％）、ＨＯＡｃ（１０ｍＬ）、ＴＨＦ（５．４ｍＬ）、およびＨ₂Ｏ（３．２ｍＬ）を加えた。混合物を撹拌し、６０℃で２～３日間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を飽和ＮａＨＣＯ₃で中和し、次に酢酸エチル（×３）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。残留物をＩＳＣＯコンビフラッシュＳｉＯ₂（１２ｇ）カラム（２０％酢酸エチル／シクロヘキサン）で精製して、生成物３（２．８３ｇ）を９２％の収率で黄色の油として得た。

２－メトキシシンナムアルデヒドへのアリールボロン酸の共役付加のための典型的な手順Ｂ。アルゴン下で、フラスコに、アリールボロン酸６ａ（２．８２ｇ、１５．６７ｍｍｏｌ、２．５当量）、２－メトキシシンナムアルデヒド１（１ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）₂（６９ｍｇ、０．３０８ｍｍｏｌ、５ｍｏｌ％）、ｂｐｙ（１９２ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ、２０ｍｏｌ％）、ＨＯＡｃ（６ｍＬ）、ＴＨＦ（３ｍＬ）、およびＨ₂Ｏ（１．８ｍＬ）を加えた。混合物を撹拌し、６０℃で２～３日間加熱した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ₃で中和し、次に酢酸エチル（×３）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。残留物をＩＳＣＯコンビフラッシュＳｉＯ₂（２４ｇ）カラム（２５％酢酸エチル／シクロヘキサン）で精製して、生成物７（１．４６ｇ）を８０％の収率で黄色の油として得た。

基本手順Ｃ還元的アミノ化：ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中のアルデヒド３（７．６６ｇ、２６．９６ｍｍｏｌ）とベンジルアミン（３．１７ｇ、２９．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、無水硫酸マグネシウム（４．８５ｇ、４０．４４ｍｍｏｌ）を加えた。還流下で１時間撹拌した後、反応混合物を濾過して乾燥剤を除去し、溶媒を減圧下で除去した。次に、粗イミンをメタノール（１００ｍＬ）中に溶解し、水素化ホウ素ナトリウム（２．０４ｇ、５３．９２ｍｍｏｌ）を０°Ｃで撹拌しながら加えた。還流下でさらに１時間撹拌した後、反応混合物を水でクエンチし、濃縮してメタノールを除去した。残留物をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。水層をジクロロメタン（×３）で抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。残留物をＩＳＣＯコンビフラッシュＳｉＯ₂（１２０ｇ）カラム（５％ＭｅＯＨ／酢酸エチル）で精製して、生成物５（９．３６ｇ）を９２％の収率で黄色の油として得た。

３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロパナール３。¹H NMR (CDCl, 600 MHz) δ 9.69 (t, J =2.2 Hz, 1H), 7.19 (dt, J = 7.5, 1.6 Hz, 1H), 7.07 (dd, J = 7.6, 1.5 Hz, 1H), 6.9 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.73 (m, 3H), 5.91 (s, 2H), 4.95 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.05 (dd, J = 7.9, 2.2 Hz, 2H); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ 201.75, 156.53, 147.71, 146.06, 136.75, 131.65, 127.88, 127.84, 120.88, 120.71, 110.78, 108.66, 108.14, 100.92, 55.40, 48.63, 37.96.

Ｎ－ベンジル－３－（４－イソプロポキシフェニル）－３－（２－メトキシフェニル）プロパン－１－アミン４ ¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.30-7.19 (m, 6H), 7.15 (dt, J = 8.1, 1.4 Hz, 1H), 6.89 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.73 (m, 2H), 6.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.86 (s, 2H), 4.41 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.72 (s, 2H), 2.60 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.17 (m, 2H); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ 156.99, 147.58, 145.72, 140.67, 138.46, 133.46, 128.51, 128.23, 127.66, 127.32, 127.00, 121.10, 120.82, 110.84, 108.80, 108.10, 100.89, 55.61, 54.03, 47.95, 40.74, 35.45.

Ｎ－（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロピル）－Ｎ－ベンジルプロピオンアミド５（ＡＧＸ５１）
基本手順Ｄ：無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のアミン８（６．１４ｇ、１６．３７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４５．６ｍＬ、３２．７５ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化プロピオニル（３．５７ｍＬ、４０．９２ｍｍｏｌ）を、０°Ｃで滴加した。反応混合物を室温で一晩放置した後、得られた溶液を水に注ぎ、分離した。水層をジクロロメタン（×３）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、次に、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。残留物をＩＳＣＯコンビフラッシュＳｉＯ₂（１２０ｇ）カラム（３０～４０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、生成物１０（６．３５ｇ）を９０％の収率で粘着性の黄色の油として得た。得られた透明な粘着性のシロップをエタノール（９ｍＬ）で処理し、よく混合した。冷凍庫に一晩置いた後、白色の沈殿物が形成され、白色の固体を濾過し、冷エタノールで洗浄して、乾燥した白色の粉末５．７７ｇ（ＡＧＸ５１）を得た。Ｍｐ：８７～８８℃。
¹H NMR (DMSO-d₆, 600 MHz) δ 7.30-7.18 (m, 4H), 7.15 (m, 1H), 7.08 (m, 2H), 6.92-6.88 (m, 2H), 6.84-6.74 (m, 2H), 6.68 (m, 1H), 5.93 (m, 2H), 4.54-4.40 (m, 2H), 4.18 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 3.73, 3.72 (s, s, 3H), 3.16-2.98 (m, 2H), 2.54-2.05 (m, 4 H), 0.95 (t, J = 7.3 Hz, 3H); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ 173.91, 173.83, 156.68, 147.66, 147.41, 145.91, 145.59, 138.34, 137.96, 137.47, 137.21, 132.79, 132.26, 128.80, 128.45, 128.24, 127.58, 127.44, 127.33, 127.19, 127.16, 126.34, 120.83, 120.81, 120.72, 120.68, 110.72, 110.66, 108.56, 108.48, 108.11, 107.95, 100.87, 100.70, 55.41, 55.37, 51.48, 48.05, 45.99, 45.36, 40.90, 40.50, 33.61, 32.54, 26.55, 26.02, 9.67, 9.48; ; 高分解能MS C₂₇H₃₀NO₂₄の計算値432.2175, 実測値432.2191 (M+H).

３－（４－イソプロポキシフェニル）－３－（２－メトキシフェニル）プロパナール７。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 9.69 (t, J = 2.3 Hz, 1H), 7.18 (dt, 1H, J = 8.1, 1.7 Hz), 7.14 (m, 2H), 7.05 (dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 6.88 (dt, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.2, 0.9 Hz, 1H), 6.80 (m, 2H),4.96 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.49 (m, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.05 (dd, J = 7.9, 2.3 Hz, 2H), 1.31(d, J = 6.0 Hz, 6H); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ 202.15, 156.57, 156.43, 134.55, 132.05, 129.03, 128.08, 127.68, 120.67, 115.72, 110.73, 69.79, 55.39, 48.63, 37.53, 22.10.

Ｎ－ベンジル－３－（４－イソプロポキシフェニル）－３－（２－メトキシフェニル）プロパン－１－アミン８（ＡＧＸ－Ａ）。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.29-7.18 (m, 6H), 7.16-7.12 (m, 3H), 6.88 (dt, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.75 (m, 2H), 4.48-4.41 (m, 2H), 3.75(s, 3H), 3.71 (s, 2H), 2.60 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.19 (m, 2H), 1.29 (d, J = 6.1 Hz, 6H); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ 156.90, 156.04, 140.54, 136.62, 133.71, 129.02, 128.09, 127.72, 127.00, 126.83, 120.64, 115.53, 110.68, 69.77, 55.47, 53.88, 47.91, 40.09, 35.29, 30.39, 22.18; 高分解能MS C₂₆H₃₂NO₂の計算値390.2433, 実測値390.2426 (M+H).

ＡＧＸ－Ａ塩化水素塩９の形成：ジクロロメタン（４０ｍＬ）中のベンジルアミンＡＧＸ－Ａ８（９．９２ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）を、氷浴中のＨＣｌ（エーテル中２Ｎ、１４ｍＬ、２８ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を２時間撹拌した。溶媒を除去した後、粘着性シロップをヘキサンで２回処理し、減圧下で濃縮した。シロップ（５ｇ）を酢酸エチル（１０ｍＬ）で滴定して、白色の沈殿物を形成した。白色の固体を濾過し、ヘキサンで洗浄して、白色粉末としてＡＧＸ－ＡＨＣｌ９塩（１０．６ｇ）を得た。Ｍｐ：１５８～１６０℃。
（４－（（（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロピル）アミノ）メチル）フェニル）（フェニル）メタノン１０。４－（アミノメチル）フェニル］（フェニル）メタノン塩酸塩（６６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１０ｍＬ）および水（２ｍＬ）中のＫ₂ＣＯ₃（５当量）で前処理した。室温で２時間撹拌した後、水層をジクロロメタン（×３）で抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、次に、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮して、次のステップに直接使用する無色の油を得た。

得られた遊離アミンを、基本手順Ｃを使用してアルデヒド３で処理してイミンを得、これをＭｅＯＨ（４ｍＬ）およびジクロロメタン（２ｍＬ）中の１０％Ｐｄ／Ｃ（４８ｍｇ）で、水素バルーンを用いて２時間処理した。反応混合物をセライトで濾過し、ＭｅＯＨとジクロロメタンの混合物で洗浄した。溶媒を除去した後、残留物をＩＳＣＯコンビフラッシュＳｉＯ₂（４ｇ）カラム（５％ＭｅＯＨ／ジクロロメタン）で精製して、生成物１０（６０ｍｇ）を５０％の収率で発泡性固体として得た。¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.75 (m, 4H), 7.59 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.46 (t, J = 7.6 Hz, 2H),7.13 (m, 2H), 6.86 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.70 (m, 2H), 6.63 (d, J =8.3 Hz, 1H), 5.83 (s, 2H), 4.36 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 3.97 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 2.71 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.41 (m, 2H); ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 195.06, 180.18, 170.20, 155.69, 146.56, 144.86, 136.57, 136.34, 136.29, 131.63, 130.96, 129.52, 129.04, 128.27, 127.37, 126.58, 126.48, 119.85, 119.81, 109.76, 107.51, 107.06, 99.82, 59.43, 54.49, 39.57, 20.08, 13.22.

Ｎ－（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロピル）－Ｎ－（４－ベンゾイルベンジル）プロピオンアミド１３。上記のアミン１０をプロピオニルクロリド（２９μＬ、０．３１３ｍｍｏｌ）で処理し、続いて基本手順Ｄで処理して、化合物１１（６６ｍｇ、９８％）を粘着性シロップとして得た。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.81-7.70 (m, 4H), 7.60 (m, 1H), 7.49 (m, 2H), 7.25-7.12 (m, 4H), 6.91 (m, 1H), 6.85-6.79 (m, 1H), 6.75-6.67 (m, 3H), 5.88-5.84 (m, 2H), 4.69-4.51 (m, 2H), 4.31-4.23(t, t, J = 7.9, 7.9 Hz, 1H), 3.78, 3.75 (s, s, 3H), 3.34, 3.17 (t, t, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 2.30-2.22 (m, 4H), 1.12 (t, J = 7.4 Hz, 3H); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ 196.35, 196.21, 174.07, 173.93, 156.68, 147.71, 147.48, 145.99, 145.67, 142.84, 142.05, 138.21, 137.64, 137.45, 137.35, 136.91, 136.54, 132.69, 132.56, 132.14,130.68, 130.38, 130.02, 130.00, 128.36, 128.29, 127.87, 127.69, 127.31, 127.13, 126.21, 120.80, 120.78, 120.72, 110.78, 110.72, 108.53, 108.44, 108.16, 108.00, 100.92, 100.75, 60.41, 55.45, 55.42, 51.36, 48.12, 46.14, 45.81, 40.90, 40.47, 33.71, 32.58, 26.60, 26.02, 21.07, 9.66, 9.47.

キラルカラムを使用するキラルＡＧＸ５１の調製。ラセミＡＧＸ５１５（１ｇ）を、１５％ＭｅＯＨ／液体ＣＯ₂ ３．５ｍｌ／分で溶出するｗａｔｅｒｓ社キラルＡＳ－Ｈ分取カラムを使用して分割し、ＡＧＸ５１Ｐ１（９９％ｅｅ、４６０ｍｇのシロップ、［α］＝２２．５３（ｃ＝０．８ＭｅＯＨ）、ＡＧＸ５１Ｐ２（９３％ｅｅ、４８０ｍｇのシロップ、［α］＝－２５．７７（ｃ＝０．８ＭｅＯＨ）を得た。

キラル第三級アミドをキラルアミンに直接変換するための基本手順。Ｔｆ₂Ｏ（１．２当量）を、ＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍＬ）中のアミドＡＧＸ５１（Ｐ１）および２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルピリジン（ＤＴＢＭＰ１．２当量）の冷却（－７８°Ｃ）溶液に滴加した。反応物を２時間かけて０℃に温めた。得られた混合物にグリニャール試薬ＰｈＭａＢｒ（１ＮＴＨＦ、１．０当量）の溶液を－７８℃で滴加し、同温で２時間撹拌した。次に、反応混合物をＮＨ₄Ｃｌの水溶液でクエンチした。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。残留物をＩＳＣＯコンビフラッシュＳｉＯ₂カラム（５０～７０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、キラル生成物４を得た。
アミン４Ｐ１を、ＡＧＸ５１（Ｐ１）、［α］²¹Ｄ３９．６６（ｃ１．７、ＭｅＯＨ）から得た。アミン４Ｐ２を、ＡＧＸ５１（Ｐ２）、［α］²¹Ｄ－３８．４９（ｃ１．３、ＭｅＯＨ）から得た。

３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロパナール（３）。撹拌棒を取り付けたフラスコに、粉末の４Åモレキュラーシーブ（０．７ｇ）を加え、フラスコを減圧下で火炎乾燥させた。フラスコをアルゴン下で室温に冷却した。アルデヒド１（１００ｍｇ、０．６１６ｍｍｏｌ）、リガンドＲ－（Ｃ₇Ｆ₇）₂ＢＩＮＯＬ（８８ｍｇ、０．１２ｍｏｌ、０．２当量）、トリフルオロホウ酸カリウムアリール塩２ａ（４２２ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ、３当量）を加え、続いて無水トルエン（１２ｍＬ）を加えた。反応物を９５℃で３日間加熱した。次に、反応混合物をセライトで濾過し、エーテルで洗浄した。濃縮後、残留物を５～１０％アセトン／ヘキサンで溶出する４ｇのシリカゲルカラムで精製して、生成物３（７０ｍｇ、４０％）を得て、出発物質のアルデヒド１を回収した。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 9.69 (t, J =2.2 Hz, 1H), 7.19 (dt, J = 7.5, 1.6 hz, 1H), 7.07 (dd, J = 7.6, 1.5 Hz, 1H), 6.9 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.73 (m, 3H), 5.91 (s, 2H), 4.95 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.05 (dd, J = 7.9, 2.2 Hz, 2H); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ 201.75, 156.53, 147.71, 146.06, 136.75, 131.65, 127.88, 127.84, 120.88, 120.71, 110.78, 108.66, 108.14, 100.92, 55.40, 48.63, 37.96. [α]²²D -70.39 (c 1.0, CH₂Cl₂).

ｔｅｒｔ－ブチル（４－（（（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロピル）アミノ）メチル）フェニル）カルバメート１２
基本手順。ＣｌＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ（１ｍｌ）中のアルデヒド３（２０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル（４－（アミノメチル）フェニル）カルバメート（１８ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）および酢酸（５μＬ、０．０８６ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で３０分間撹拌し、その後トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３７ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１８時間撹拌した。混合物を濃縮し、ＭｅＯＨに溶解し、４ｇのシリカゲルカラムで精製して、生成物１２（２５ｍｇ、６０％）を無色の油として得た。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.26 (m, 1H), 7.19-7.13 (m, 4H), 6.89 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.71-6.66 (m, 3H), 6.55 (brs, 1H), 6.23 (br, 2H), 5.87 (s, 2H), 4.34 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.73(s, 2H), 2.61 (m, 2H), 2.23 (m, 2H), 1.51(s, 9H); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ 156.73, 147.49, 145.70, 138.05, 137.87, 132.68, 129.46, 127.75, 120.89, 120.75, 118.56, 110.71, 108.57, 108.00, 100.76, 80.57, 55.45, 51.79, 46.38, 40.57, 33.44, 28.35; [α]²²D -30.45 (c 1.25, MeOH); 高分解能MS C₂₉H₃₅N₂O₅の計算値491.2546, 実測値491.2534 (M+H).

Ｎ－（４－アミノベンジル）－Ｎ－（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロピル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド１３。ＣＨ₂Ｃｌ₂（１ｍＬ）中のアミン１２（２５ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２１μｌ、０．１５３ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で無水トリフルオロ酢酸（１８μＬ、０．１２７ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を４時間撹拌した後、溶液を濃縮し、４ｇのシリカゲルカラムで精製して、生成物（１８ｍｇ、６０％）を得た。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.30 (m, 1H), 7.21-7.15 (m, 1H), 7.10 (t, J = 8.9 Hz, 1H), 6.92 (dd, J = 8.3, 16.7 Hz, 2H), 6.92-6.80 (m, 2H), 6.72-6.67 (m, 3H), 6.48 (d, J = 19.1Hz, 1H), 5.89 (m, 2H), 4.51 (s, 1H), 4.46(s, 1H), 4.22 (m, 1H), 3.78, 3.76 (s, s, 3H), 3.22 (m, 2H), 2.28-2.14 (m, 2H), 1.51 (s, 9H); ¹⁹FデカップリングH δ -67.96, -68.96; [α]²²D -24.02 (c 0.85, MeOH); ES MS C₃₁H₃₃FN₂O₆の計算値586.23, 実測値609.3 (M+Na).

上記で調製した中間体（１７ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）をジオキサン／ＨＣｌ溶液（４Ｎ、０．２ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、室温で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残留物を濃縮ＮａＨＣＯ₃水溶液で遊離塩基にした。この材料を、ＣＨ₂Ｃｌ₂中の５％ＭｅＯＨで溶出するシリカでのクロマトグラフィーによって精製して、生成物１３（１３ｍｇ、９２％）を得た。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.19-7.15 (m, 1H), 7.10 (m, 1H), 6.93-6.80 (m, 4 H), 6.72-6.66 (m, 3H), 6.61 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.89 (dd, J = 4.9, 12.9 Hz, 2H), 4.46 (s, 1H), 4.39 (s, 1H), 3.78, 3.76 (s, s, 3H), 3,20 (m, 2H), 2.29-2.10 (m, 2H); ); ¹⁹FデカップリングH δ -67.82, -68.94; [α]²²D -29.16 (c 0.55, MeOH); ES MS C₂₆H₂₅N₂O₄の計算値486.18, 実測値509.3 (M+Na).

Ｎ－（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロピル）－Ｎ－（４－（（２－（３－（ブト－３－イン－１－イル）－３Ｈ－ジアジリン－３－イル）エチル）アミノ）ベンジル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド１６。化合物１６は、アミン１３（１３ｍｇ、０．０２６７ｍｍｏｌ）およびアルデヒド１５（５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の処理による基本手順を使用して合成することができる。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.19-7.15 (m, 1H), 7.10 (m, 1H), 6.93-6.80 (m, 4 H), 6.72-6.66 (m, 3H), 6.51 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.89 (m, 2H), 4.46 (s, 1H), 4.22 (s, 1H), 3.78, 3.76 (s, s, 3H), 3.20 (m, 2H), 2.92 (m, 2H), 2.25-2.04 (m, 2H), 2.01 (m, 3H), 1.80 (m, 2H), 1.67 (m, 2H); ¹⁹FデカップリングH δ -67.79, -68.94; ES MS C₃₃H₃₃F₃N₂₄O₄の計算値606.25, 実測値607.3 (M+H).

２－（（３，４－ジメトキシベンジル）（３－（４－メトキシフェニル）－３－フェニルプロピル）アミノ）－２－オキソエチルアセテート（２２、ＡＧＸ－Ｄ）。マイクロ波チューブ内のベンゼン（１ｍＬ）中のＧＹ－ＡＧＸ－Ｃ１７（４７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の混合物に、ＮａＯＡｃ（５２ｍｇ、６ｍｍｏｌ）を加え、続いて臭化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢｒ、６ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加えた。反応物をマイクロ波下で１２０℃にて３０分間加熱した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮した。残留物を、５０％ＥＡ／ヘキサンで溶出するシリカ（４ｇカラム）で精製して、生成物１８（４６ｍｇ、９３％）を得た。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.28-7.25 (m, 2 H), 7.17-7.11 (m, 3H), 7.08 (m, 2H), 6.83-6.63 (m, 5H), 4.69, 4.51 (s, s, 2H), 4.45, 4.27 (s, s, 2H), 3.88-3.74 (m, 9H), 3.30, 3.05 (m, 2H), 2.29 (m, 2H), 2.17 (s, 3H); ES MS C₂₉H₃₃NO₆の計算値491.23, 実測値492.3 (M+H).

Ｎ－（３，４－ジメトキシベンジル）－２－ヒドロキシ－Ｎ－（３－（４－メトキシフェニル）－３－フェニルプロピル）アセトアミド（１９、ＡＧＸ－Ｅ）。ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中のアセテート１８（４２ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）の反応混合物に、Ｋ₂ＣＯ₃（３８ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で２時間加熱した。混合物を濾過し、ＤＣＭで洗浄し、溶媒を濃縮した。得られた残留物を、５０％ＥＡ／ヘキサンで溶出するシリカ（４ｇカラム）で精製して、生成物１９（３２ｍｇ、８６％）を得た。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.29-7.24 (m, 2H), 7.20-7.16 (m, 3H), 7.14-7.07 (m, 2H), 6.84-6.74 (m, 3H), 6.70-6.50 (m, 2H), 4.55(s, 1H), 4.15 (s, 1H), 3.92 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 3.86-3.71 (m, 9H), 3.65, 3.61 (m, 1H), 3.35 (m, 1H), 2.95 (m, 1H), 2.31-2.21 (m, 2H); ES MS C₂₇H₃₁NO₅の計算値449.22, 実測値450.3 (M+H).

古典的なアミド形成法。ＤＣＭ（２ｍＬ）中のアミン４（６８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびカルボン酸（１．２当量）を、ＥＤＣ（１．３当量、４５ｍｇ）およびＨＯＢｔ（１．３当量、３２ｍｇ）で処理し、その後ＤＩＥＰＡ（４当量、１２６μＬ）で処理した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、ＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄した。有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮した。残留物を５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭにより溶出するシリカ（４ｇカラム）で精製して、生成物２１（５３ｍｇ、６５％）、２３（７５％）を得た。

Ｎ－（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロピル）－Ｎ－ベンジル－２－（ジメチルアミノ）アセトアミド（２１、ＡＧＸ－Ｆ）。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.35-7.03 (m, 7H), 6.94-6.79 (m, 2H), 6.73-6.66 (m, 3H), 5.86 (m, 2H), 4.65-4.35 (m, 2H), 4.19 (m, 1H), 3.94-3.54 (m, 5H), 3.35, 3.05 (m, 2H), 2.91-2.86 (m, 6H), 2.16 (m, 2H); ES MS C₂₈H₃₂N₂O₄の計算値460.24, 実測値461.2 (M+H).

２－（（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロピル）（ベンジル）アミノ）－２－オキソエチルアセテート（２３、ＡＧＸ－Ｇ）。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.35-7.24 (m, 3H), 7.20-7.09 (m, 4H), 6.91-6.78 (m, 2H), 6.67 (m, 3H), 5.90 (2H), 4.66-4.55 (m, 2H), 4.51,.4.36 (s, s, 2H), 4.22 (m, 1H), 3.78, 3.75 (s, s, 3H), 3.33, 3.06 (m, m, 2H), 2,22 (m, 2H), 2.19, 2.12 (s, s, 3H); ES MS C₂₈H₂₉NO₆の計算値475.20, 実測値476.2 (M+H).
Ｎ－（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロピル）－Ｎ－ベンジル－２－ヒドロキシアセトアミド（２４、ＡＧＸ－Ｈ）。化合物２４は、化合物１９を製造するのと同じ方法を使用して得ることができる。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.31-7.25 (m, 3H), 7.18-7.03 (m, 4H), 6.90 (m, 1H), 6.84 (m, 1), 6.71-6.65 (m, 3H), 5.89-5.85 (m, 2H), 4.63 (s, 1H), 4.30-4.14 (m, 3H), 3.99 (s, 2H), 3.78, 3.75(s, s, 3H), 3.36, 2.96 (m, t, 2H), 2.24-2.14 (m, 2H); ES MS C₂₆H₂₇NO₅の計算値433.19, 実測値434.2 (M+H).

アミン４とＮＨＳエステル２５との一般的カップリング反応：アミン４（１当量）およびＮＨＳエステル２５（１当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＰＡ（３当量）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、精製に供した。
ＮＢｏｃ反応の加水分解：ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中のＡＧＸ－ＰＥＧアナログ２８、３１を、４ＮＨＣｌ（ドキサン中、１０当量）で処理した。反応物を室温で４時間撹拌し、次に濃縮し、減圧下で乾燥させた。各ＨＣｌ塩を、精製せずに次のステップに直接使用した。
ＡＧＸ－ＢＯＤＩＰＹアナログのＨＰＬＣ精製：ＭｅＯＨおよび水中の粗ＢＯＤＩＰＹ混合物の溶液を、ＨＰＬＣＸＢｒｉｄｇｅ（商標）分取Ｃ１８カラム（５μｍ、１９×１５０ｍｍ）に注入し、６０～９０％ＡＣＮ／水（各溶液に０．０５％ＴＦＡ）で１０分間溶出し、流速２０ｍｌ／分で生成物を塊で採取する。

ｔｅｒｔ－ブチル（２－（３－（（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロピル）（ベンジル）アミノ）－３－オキソプロポキシ）エチル）カルバメート２８。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.33-7.24 (m, 3H), 7.20-7.08 (m, 4H), 6.92-6.79 (m, 2H), 6.70 (m, 3H), 5.90-5.86 (m, 2H), 5.07, 4.98 (brs, 1H), 4.57, 4.45 (s,s, 2H), 4.26 (m, 1H), 3.81, 3.74 (s, s, 3H), 3.73 (m, 2H), 3.48 (m, 2H), 3.33-3.13 (m, 4H), 2.56, 2.43 (t, t, 2H), 2.20 (m, 2H), 1.43, 1.41 (s, s, 9H); ES MS C₃₄H₄₂N₂O₇の計算値590.30, 実測値591.3 (M+H).

ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（３－（（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－３－（２－メトキシフェニル）プロピル）（ベンジル）アミノ）－３－オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）カルバメート３１。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.32-7.22 (m, 3H), 7.21-7.07 (m, 4H), 6.92-6.79 (m, 2H), 6.69 (m, 3H), 5.90-5.86 (m, 2H), 5.05, 4.98 (brs, 1H), 4.56, 4.46 (s,s, 2H), 4.29-4.11 (m, 1H), 3.80 (m, 2H), 3.78, 3.75 (s, s, 3H), 3.58-3.50 (m, 6H), 3.33-3.14 (m, 4H), 2.60, 2.52 (t, t, 2H), 2.15 (m, 2H), 1.42 (s, 9H); ES MS C₃₆H₄₆N₂O₈の計算値634.33, 実測値635.3 (M+H).

ＡＧＸ－ＢＯＤＩＰＹ２６。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 10.35 (brs, 1H), 7.28 (m, 2H), 7.17-7.02 (m, 6 H), 6.97 (m, 2H), 6.91-6.58 (m, 7H), 6.36 (m, 1H), 6.21(m, 1H), 5.88(m, 2H), 4.59-4.42 (m, 1H), 4.29-4.15 (m, 1H), 3.75, 3.68 (s, s, 3H), 3.37-3.11 (m, 4H), 2.78-2.63 (m, 2H), 2.23-2.08 (m, 2H); ¹⁹F NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ -75.67 (TFA), -140.09 (m, B-F); ES MS C₄₀H₃₇BF₂N₄O₄の計算値686.29, 実測値687.3 (M+H).

ＡＧＸ－ＰＥＧ１－ＢＯＤＩＰＹ２９。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 10.38 (brs, 1H), 7.21-7.16 (m, 2H), 7.12-7.04 (m, 3H), 7.02-6.92 (m, 5H), 6.90-6.77 (m, 4H), 6.66 (m, 3H), 6.35 (m, 1H), 6.26 (m, 1H), 5.86 (m, 2H), 4.51, 4.37 (s, s, 2H), 4.20 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.66 (m, 2H), 3.47-3.40 (m, 4H), 3.32-3.10 (m, 4H), 2.70 (m, 2H), 2.49, 2.40 (t, t, 2H), 2.11 (m, 2H); ¹⁹F NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ -75.84 (TFA), -140.08 (m, B-F); ES MS C₄₅H₄₆BF₂N₅O₆の計算値801.35, 実測値802.3 (M+H).
ＡＧＸ－ＰＥＧ２－ＢＯＤＩＰＹ３２。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 10.38 (brs, 1H), 7.24-6.95 (m, 9H), 6.88-6.78 (m, 3H), 6.67 (m, 3H), 6.56 (m, 1H), 6.35-6.26 (m, 2H), 5.88 (m, 2H), 4.51, 4.37 (s, s, 2H), 4.25 (m, 1H), 3.73 (m, 4H), 3.51 (m, 5H), 3.41 (m, 2H), 3.33-3.08 (m, 4H), 2.66-2.43 (m, 4H), 2.16 (m, 2H); ¹⁹F NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ -75.76 (TFA), -140.06 (m, B-F); ES MS C₄₇H₅₀BF₂N₅O₇の計算値845.38, 実測値846.3 (M+H).

（実施例１２）
実験モデルおよび主題の詳細
インビボ動物研究。動物研究を、施設の規制（ＣＮＶ血管新生研究の場合はＭＯ１６Ｍ１３０、ＲＯＰ研究の場合はＭ０１６Ｍ１３８）に従って非盲検法で実施した。
薬物動態分析。ＡＧＸ５１の薬物動態パラメータを決定するために、８週齢の雄型Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃｆａｒｍｓ）に、７０％ＤＭＳＯで調製した３０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇＡＧＸ５１を用いて、ｉ．ｐ．注射により１回投与した（ｎ＝群あたり３匹のマウス）。３匹のマウスの別のセットに、１００％ＤＭＳＯで調製した１００ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１を投与した。ＡＧＸ５１投与の３０分後、１時間後、３時間後、６時間後、および２４時間後に血液を採取し、ＭＳＫＣＣＡｎｔｉｔｕｍｏｒＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙで以前に検証されたプロトコルに従ってＬＣ－ＭＳにより血漿を分析した。採血後、ＣＯ₂窒息によりマウスを犠死させ、３０ｍｇ／ｋｇの処置群の眼を採取し、分析のためにフラッシュ凍結した。ＬＣ－ＭＳから得られたデータを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（バージョン８．１）を介して薬物動態パラメータについて分析した。

毒性分析。毒性を評価するために、６～８週齢の雌型無胸腺ヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ）に、対照ビヒクル（水中７０％ＤＭＳＯ）またはＡＧＸ５１のいずれかを６０ｍｇ／ｋｇで、１日２回１４日間連続して、ｉ．ｐ．投与した。最後の試験投与の２４時間後にマウスを犠死させた。肉眼的および完全な剖検、ならびに臨床病理分析をすべてのマウスで実施した。測定された臨床化学パラメータは、ＢＵＮ、クレアチン、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ビリルビン、総タンパク質、アルブミン、グロブリン、リン、グルコース、コレステロール、リン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、塩化物であった。測定された血液学的パラメータは、白血球（リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、好中球）、赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、ＲＤＷ、血小板であった。分析された臓器／組織は、肺、心臓、胸腺、腎臓、肝臓、脾臓、胆嚢、膵臓、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、骨髄、大腿骨、脛骨、胸骨、脳、眼、耳、鼻腔および口腔、歯、腸間膜および気管のリンパ節、であった。

眼の血管新生のマウスモデル。ＣＮＶを前述のように誘発した。Tobe et al., Am. J. Pathol., 153, 1641-1646 (1998)。要約すると、４～６週齢の雌型Ｉｄ１^-/-またはＩｄ３^-/-マウスと同腹仔対照Ｉｄ１^+/+またはＩｄ３^+/+マウス（すべてＣ５７ＢＬ／６バックグラウンド）では、各眼の３箇所でレーザー誘発性ブルッフ膜破裂があり、１４日後、マウスを安楽死させ、眼を取り除き、脈絡膜フラットマウントを、血管細胞を選択的に染色するＦＩＴＣ標識グリフォニアシンプリシフォリアレクチン（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で染色した（群あたりｎ＝１２匹のマウス）。フラットマウントを蛍光顕微鏡で検査し、各ＣＮＶの面積を、実験群に関してマスクされた観察者によるＩｍａｇｅ－ＰｒｏＰｌｕｓソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、ＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を使用した画像分析によって測定した。他の実験では、野生型４～６週齢の雌型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、各眼の３箇所でブルッフ膜が破裂し、その後直ちにおよび７日後に片方の眼に１～３０μｇのＡＧＸ５１（ラセミ、Ｅ１またはＥ２）またはビヒクルを硝子体内注射するか、またはマウスに５００μｇのＡＧＸ５１またはビヒクルを、１４日間１日２回ｉ．ｐ．注射した（群あたりｎ＝７～１０匹のマウス）。ブルッフ膜が破裂してから１４日後にＣＮＶの面積を測定した。アフリベルセプトおよびＡＧＸ－Ａの処置実験では、ブルッフ膜の破裂が行われた後、マウスを、４０μｇのアフリベルセプト、１０μｇのＡＧＸ５１Ｅ２、１～５μｇのＡＧＸ５１、１～５μｇのＡＧＸ－Ａ、ＤＭＳＯ、またはそれらの組み合わせで処置した。マウスは、４～６週齢の雌型Ｃ５７ＢＬ／６であった。１４日後にマウスを安楽死させ、ＣＮＶを上記のように測定した。

ＲＯＰ実験では、２６匹のＣ５７ＢＬ／６仔、３６匹のＩｄ^-/-および２２匹のＩｄ３^-/-仔を、生後７日目で７５％Ｏ₂に入れた。生後１２日目で、マウスを室内空気に戻し、生後１７日目で、マウスを安楽死させ、網膜血管新生を上記のように測定した。ＡＧＸ５１ＲＯＰ実験では、Ｃ５７ＢＬ／６仔を、生後７日目で７５％Ｏ₂に入れた。生後１２日目で、マウスを室内空気に戻し、ＦＥでは１０μｇのＡＧＸ５１またはＤＭＳＯを眼に注射した（Ｎ＝１５匹マウス／群）。生後１７日目で、マウスを安楽死させ、網膜血管新生を上記のように測定した。

細胞株および細菌株
細胞株。ＨＣＴ１１６（雄型）、４Ｔ１（雌型）、および２９３Ｔ（雌型）細胞株を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１％ペニシリン－ストレプトマイシンおよび１％Ｌ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ（ＨＣＴ１１６）またはＤＭＥ（４Ｔ１および２９３Ｔ）培地中で増殖させた。ＨＵＶＥＣを、Ｃｏｒｎｉｎｇ（性別不特定）（Ｏｎｅｏｎｔａ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入し、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）中で増殖させた。細胞を、３７℃で培養した。
細菌株。Ｉｄ１およびＩｄ３を、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）コンピテントセル（ＳｉｇｍａＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）から精製した。

（実施例１３）
方法詳細
Ｉｄタンパク質精製。ｐＧＥＶ－ＰＳＰ－ｍＩｄ１およびｍＩｄ３発現コンストラクトを、タンパク質発現のためにＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）コンピテントセル（ＳｉｇｍａＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）に形質転換した。組換えＧＳＴタグ付きタンパク質を産生するために、５０ｍＬのＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍ）＋クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）培養物を、３７℃で一晩増殖させた。翌日の早朝、一晩培養物を、６ＬＬＢ／アンピシリン＋クロラムフェニコールで１：１００に希釈し、ＯＤ₆₀₀＝０．７になるまで３７℃で約４時間培養した。培養物を１ｍＭＩＰＴＧで誘導し、１６℃で１６～１８時間インキュベートした。４℃にて１５分間、４０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を採取し、ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０；４００ｍＭＮａＣｌ；０．５ｍＭＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁した（２５ｍＬ／Ｌの培養物）。細胞を溶解するために、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００およびリゾチームを、それぞれ０．１％および１０μｇ／ｍＬで加え、氷上で３０分間インキュベートし、超音波処理した。溶解物を、４℃にて３０分間、１７，０００ｒｐｍでスピンさせ、上清を０．４５μＭフィルターでろ過した後、グルタチオンセファロースと４℃で２時間インキュベートした。タンパク質が結合したセファロースをポリプロピレンカラムに通し、５０ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０；４００ｍＭＮａＣｌ）で２回洗浄した後、タンパク質を１０ｍＬの５０ｍＭグルタチオン溶出緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。タンパク質をＰＤ１０カラム（Ｓｉｇｍａ）で１２ｍＬの保存緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．０、４００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、１０％グリセロール）に緩衝液交換した。

ＧＳＴタグを、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼで切断し（０．１μＬの０．３μｇ／μＬＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼは４℃で４時間インキュベートすると１０μｇのＧＳＴ－ｍＩｄ１を切断する）、グルタチオンセファロースとインキュベートして切断されたＧＳＴタグを分離した。切断されたｍＩｄ１タンパク質を、クーマシーゲル分析の前に、ＧＳＴ抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ９０８５－２００μＬ抗ＧＳＴウサギポリクローナル；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃ＭＡ４－００４抗ＧＳＴマウスモノクローナル）とのインキュベーションによってさらに洗浄した。切断されたタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ３０００ＭＣＯＵｌｔｒａ－４遠心カラム（ＵＦＣ８００３０８）を使用して所望の強度に濃縮した。

結晶化。マウスＩｄ１（５１－１０４）の結晶を、４℃でハンギングドロップ蒸気拡散法によって成長させた。２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２５ＭＮａＣｌ、および５ｍＭＤＴＴ中の２．８ｍｇ／ｍＬ濃度のタンパク質のアリコート（１．５μＬ）を、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．２Ｍ酢酸マグネシウム、１０％ＰＥＧ８０００を含有する１．５μＬのリザーバー緩衝液と混合した。結晶を採取し、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．２Ｍ酢酸マグネシウム、１１％ＰＥＧ８０００、３０％エチレングリコールを含有する溶液に段階的に移して凍結保護し、液体窒素で急速凍結した。マウスＩｄ１（５８－１０４）の結晶を、４℃でシッティングドロップ蒸気拡散法によって成長させた。２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２５ＭＮａＣｌ、および９％エタノール中の２ｍｇ／ｍＬ（２μＬ）のタンパク質のアリコートを、０．１ＭＭＥＳ（ｐＨ６．５）、０．２Ｍ酢酸ナトリウムを含有する２μＬのリザーバー緩衝液と混合した。結晶を採取し、０．１ＭＭＥＳ（ｐＨ６．５）、０．２Ｍ酢酸ナトリウム、１０％ＰＥＧ８０００、および３０％エチレングリコールを含有する溶液に移して凍結保護し、次に液体窒素で急速凍結した。

マウスＩｄ１（５１－１０４）－ヒトＥ４７（３４８－３９９）複合体の結晶を、２２℃でハンギングドロップ蒸気拡散法によって成長させた。２０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、０．３ＭＮａＣｌ、および５ｍＭＤＴＴ中の９ｍｇ／ｍＬ濃度のタンパク質のアリコート（１μＬ）を、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、０．２５ＭＮａＣｌ、２２．５％ＰＥＧ８０００を含有する１μＬのリザーバー緩衝液と混合した。結晶を採取し、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、０．２５ＭＮａＣｌ、２３％ＰＥＧ８０００、１６％エチレングリコールを含有する溶液に移して凍結保護し、液体窒素で急速凍結した。

構造決定。回折データを、Ｉｄ１（５１－１０４）およびＩｄ１－Ｅ４７についてビームラインＢＮＬ－Ｘ９Ａそれぞれ１．８および１．９Åの分解能で単結晶から収集した。Ｉｄ１（５８－１０４）の場合、データはＣＨＥＳＳで１．５Åの分解能で収集した。回折データのインデックス作成およびマージは、ＨＫＬ２０００で実行した（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ、１９９７）。Ｉｄ１（５１－１０４）の構造を、検索モデルとしてＰＤＢエントリ１ＭＤＹを使用した分子置換によって解析した。検索モデルは、結晶化に使用されるコンストラクトの長さに一致するように短縮化した。Ｉｄ１（５８－１０４）およびＩｄ１－Ｅ４７複合体の構造を、検索モデルとしてＩｄ１（５１－１０４）の精密化構造を使用した分子置換によって解析した。分子置換、モデル構築、および精密化を、Ｐｈｅｎｉｘで達成した。回折データの収集および精密化の統計を、図１６に要約する。

インシリコスクリーニング。最初のドッキング研究は、Ｉｄ１－Ｅ４７Ｘ線構造（寄託ＩＤ：Ｄ＿１０００２２３９３１ＰＤＢＩＤ：（６ＭＧＮ））で実行した。標準設定を使用するＡｕｔｏｄｏｃｋ４．０（ＴｈｅＳｃｒｉｐｐｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒａｐｈｉｃｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ．ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９２０３７）のベータリリースを使用して、市販の化合物のコンパイル済みリスト（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ、ＣｈｅｍＤｉｖ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、およびＳａｌｏｒから入手可能なライブラリ）をスクリーニングした。ドッキングには、Ｉｄ１－Ｅ４７ヘテロ二量体に存在するＩｄ１のループ領域に隣接する裂け目を、標的とした。ドッキング研究は、Ｌｉｎｕｘ動作ＳｕｎＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＭｅｎｌｏＰａｒｋ、ＣＡ９４０２５）ワークステーションで実行した。Ｉｄ１－小分子複合体のモンテカルロシミュレーションを１ｘ１０⁶ステップで実行し、１００の立体配座を収集して分析した。最高スコアおよび最低総エネルギー有する複合体立体配座を、さらなる分析のために選択した。有望なドッキングスコア＞６．０を提供する３０００の化合物を、計算による物理的特性：ＣｌｏｇＰ＜５（１－オクタノール－水分配係数）、ｔＰＳＡ＞８０（トポロジー極性表面積）、ＭＷ＜６００、ならびに化学的および生化学的安定性、によってさらに計算によってフィルタリングした。計算により得られたヒットである３６４の化合物は、ベンダーから購入し、Ｉｄ１－Ｅ４７ホモ二量体化を妨害する能力についてスクリーニングした。

インシリコモデリング。すべてのリガンドの調製およびドッキングの計算では、特に明記されていない限り、デフォルト設定を使用してＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒＳｕｉｔｅバージョン２０１６－１を使用した。ＬｉｇＰｒｅｐを使用して、スケッチした２Ｄ構造からドッキングするために小分子を調製した。３Ｄ構造を、ＯＰＬＳ３力場を使用して生成し、イオン化状態を、ｐＨ７．０＋／－２．０でＥｐｉｋを使用して決定した。Ｉｄ１モノマー、残基５８－１０４を、タンパク質調製ウィザードを使用して結晶学的座標から調製した。タンパク質のプロトン化状態を、ＰＲＯＰＫＡを使用してｐＨ７．０に割り当てた。タンパク質は、ＯＰＬＳ３力場を使用して最小化した。インシリコスクリーニング段階とは無関係に、Ｉｄ１モノマー内の結合ポケットを、デフォルト設定でＳｉｔｅＭａｐを使用して同定し、これを使用して、Ｇｌｉｄｅにより、ヒドロキシル水素（Ｔｙｒ６６、Ｓｅｒ６７、Ｔｈｒ７５、およびＳｅｒ８３）を回転させ、ドッキングに使用する受容体グリッドを生成した。ドッキングは、超高精度、柔軟なリガンドサンプリング、および環立体配座および窒素反転サンプリングを使用してＧｌｉｄｅにより実行した。ひずみサンプリングは、非平面立体配座にペナルティを課すためにアミドに偏っていた。

ＡＧＸ５１（ＡＧＸ５１トレーサー）に由来するＢＲＥＴプローブを、市販のＮ－Ｂｏｃ－ａｍｉｎｏＰＥＧ２－ＮＨＳエステルとの反応、Ｂｏｃ保護基の除去、およびＢｏｄｉｐｙ－５５８／５６８－ＮＨＳエステルとの反応により、高度な中間アミン４から３ステップで調製した。

円二色性。遠紫外線円二色性（ＣＤ）測定は、ＡＧＸ５１、ＡＧＸ５１Ｅ１、ＡＧＸ５１Ｅ２、またはＡＧＸ－Ａの不存在下で、０．１ｃｍ細胞および０．１ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液を使用して、室温にてＪａｓｃｏＪ－１５００分光偏光計で行った。試料にはＤＭＳＯが含まれているため、スキャンする最低波長は制限されている。

ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）標的結合アッセイ。Ｎ末端ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼＩＤ１融合タンパク質を、Ｇｅｎｅｗｉｚ（ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）によってｐＵＣ５７骨格に合成し、ＥｃｏＲＩ－ＨＦおよびＸｂａＩ（両方ともＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ製の酵素）を使用してｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにクローン化した。アッセイは、基本的に、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）ＴＥＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＢＥＴＢＲＤアッセイキットマニュアル（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）に記載されているように実行した。要約すると、細胞にトランスフェクトし、２４時間後、平底の非結合表面の白色ポリスチレン９６ウェルプレート（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ、ＭＥ、ＵＳＡ）にプレーティングした。次に、ＡＧＸ５１トレーサーを加え（０～４μＭ）、続いてジギトニン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を加えて、細胞（５０μｇ／ｍＬ）を透過処理した。次に、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）加え、ＧｌｏＭａｘＤｉｓｃｏｖｅｒＳｙｓｔｅｍ機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して読み取りを行った。競合アッセイでは、細胞を２μＭのＡＧＸ５１トレーサーおよび０～６０μＭのＡＧＸ－ＡまたはＡＧＸ５１で処理した。

ＡＧＸ５１誘導体のＩｄ１への共有結合。ベンゾフェノン光反応性部分を含有するＡＧＸ５１のアナログ（ＡＧＸ５１－ＸＬ２）を使用した。１μｇの精製Ｉｄ１（ａ．ａ．５９－１０４）と１９．７ｎｇのＡＧＸ５１－ＸＬ２（ＤＭＳＯに溶解）とを暗所で合わせ、次に２０分間ＵＶ光に曝露し、ＵＶ曝露なしの陰性対照も含めた。次に、試料を暗所で１５％変性ゲル上で泳動させ、製造元のプロトコル（ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ染色Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）に従って銀染色し、以下に説明するように質量分析のためにバンドを切り出した。ＡＧＸ５１－ＸＬ２と競合するＡＧＸ５１の能力を評価するために、またＡＧＸ５１－ＸＬ２に対して、ＡＧＸ５１が１０倍過剰である別の試料を追加して、上記の実験を繰り返した。

質量分析のためのゲル内消化。ゲル内消化は、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏらによる方法（Nat Protoc 1(6):2856-60(2006)）を使用して実行した。要約すると、ゲルバンドを切り出し、１：１（アセトニトリル：１００ｍＭ重炭酸アンモニウム）で３０分間洗浄し、ゲル切片が収縮して過剰なアセトニトリルが除去されるまで１００％アセトニトリルで１０分間脱水し、切片を、加熱せずに１０分間ｓｐｅｅｄ－ｖａｃで乾燥させた。ゲル切片を、５ｍＭＤＴＴにより、５６℃で３０分間、サーモスタット付き（ｔｈｅｒｍｏｓｔｏｔａｔｅｄ）ミキサーで穏やかに混合しながら還元し、取り出し、室温まで冷却した後、１１ｍＭＩＡＡにより暗所で３０分間アルキル化した。ゲル切片を、１００ｍＭ重炭酸アンモニウムおよび１００％アセトニトリルでそれぞれ１０分間洗浄した。過剰のアセトニトリルを除去し、切片を、加熱せずに１０分間ｓｐｅｅｄ－ｖａｃで乾燥させた。次に、ゲル切片を、氷上で３０分間、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の２５ｎｇ／μＬトリプシンの溶液で再水和した。穏やかに混合しながら、サーモスタット付きヒーターで３７℃にて一晩、消化を行った。消化されたペプチドを収集し、高速混合で抽出緩衝液（１：２体積／体積）５％ギ酸／５０％アセトニトリル）でゲル切片からさらに抽出した。抽出物を合わせ、真空遠心分離機で乾燥させた。ペプチドをＣ１８樹脂充填ｓｔａｇｅ－ｔｉｐで脱塩し、凍結乾燥して乾燥させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析用に３％アセトニトリル／０．１％ギ酸で復元させた。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、ＴｈｅｒｍｏＱ－ＥｘａｃｔｉｖｅＰｌｕｓＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計に接続された１８０μｍ×２ｃｍのトラップカラムで構成されたＷａｔｅｒｓＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙＬＣシステム（内径１００μｍ×長さ１０ｃｍのＣ１８カラム（１．７μｍＢＥＨ１３０；Ｗａｔｅｒｓ）を用いる）を使用して実行した。トラッピングは、１５μＬ／分０．１％ギ酸（緩衝液Ａ）で１分間実行した。ＬＣ勾配は、３００ｎＬ／分で９０分間にわたって０．５％～５０％Ｂ（１００％アセトニトリル、０．１％ギ酸）であった。ＭＳデータを、ＨＣＤフラグメンテーションのトップ１０プリカーサーイオン選別を利用したデータ依存型取得（ＤＤＡ）モードで収集した。フルＭＳスキャンは、以下のパラメータを使用して実行した：分解能：７０，０００；ＡＧＣターゲット：１ｅ６；最大ＩＴ：５０ミリ秒；スキャン範囲：４００～１６００ｍ／ｚ。ＤＤＡパラメータは、以下の通りであった：分解能：１７，５００；ＡＧＣターゲット５ｅ４；最大ＩＴ：５０ミリ秒；アイソレーション・ウインドウ：１．５ｍ／ｚ；ＮＣＥ：２７；最小ＡＧＣターゲット：２ｅ３；強度閾値：４ｅ４；ダイナミックエクスクルージョン：１５秒；電荷排除：非割当、１、６～８、＞８。

架橋ペプチド同定分析。ＭＳｒａｗファイルを、Ｂｙｏｎｉｃバージョン２．５（ＰｒｏｔｅｉｎＭｅｔｒｉｃｓ、ＳａｎＣａｒｌｏｓ、ＵＳＡ）を使用して、マウスＩＤ１カスタムデータベースを検索することにより処理した。検索基準には、ＭＳスペクトルの１０ｐｐｍの質量許容誤差、ＭＳ／ＭＳスペクトルの４０ｐｐｍの質量許容誤差、最大２つの許容される切断の失敗、固定カルバミドメチルシステイン修飾、可変メチオニン酸化、グルタミンおよびアスパラギンの脱アミド化、Ｎ末端タンパク質アセチル化、およびＡＧＸ５１－ＸＬ２架橋生成物（４１９．１８８５Ｄａ）のモノアイソトピック質量が含まれる。０．００５以下のＰｅｐ２Ｄ有意性閾値は、有意であると見なされた。架橋ペプチドを、視覚的分析によってさらに検査した。

電気泳動移動度シフトアッセイ。インシリコスクリーニングで同定された化合物の活性を試験するために、全長Ｅ４７を細菌から精製し、精製された完全長Ｉｄ１の存在下または非存在下で、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）エンハンサー、ＢＳＡ、ＤＴＴ、ポリｄＩ－ｄＣ、サケ精子、およびＨｅＬａ核抽出物に由来するＰ³²標識Ｅ－ｂｏｘ配列と混合した。ＤＭＳＯに溶解した濃度を高めた種々の試験化合物またはＤＭＳＯのみを、反応混合物に３０分間加え、５％非変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーを行った。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を、ＡＧＸ５１処理細胞からの全細胞溶解物に対して実施し、ＥＭＳＡは以前に記載されたように実行した（Tournay and Benezra, Mol Cell Biol, 16: 2418-30 (1996)）。

イムノブロッティング。イムノブロッティングのために、細胞をトリプシン処理によって収集し、ＰＢＳで洗浄し、ホモジナイゼーション緩衝液（０．３Ｍスクロース、１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４００ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ塩化マグネシウム、０．５％ＮＰ４０／ＩＧＥＰＡＬ、１００μｇ／ｍＬアプロチニン＋プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ＃１１８３６１５３００１）中に溶解した。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、膜（ＬＩ－ＣＯＲ）に転写し、４℃で一晩一次抗体でプローブし、室温で１～２時間二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ）でプローブした。タンパク質を、ＬＩ－ＣＯＲＯｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージング検出システムを使用して視覚化した。以下の一次抗体Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３、Ｉｄ４（それぞれ、１９５－１４、９－２－８、１７－３、８２－１２、すべてＢｉｏｃｈｅｃｋ製）、サイクリンＤ１（２９７８、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、アクチン（Ａ２０６６、Ｓｉｇｍａ）、チューブリン（Ｔ４０２６、Ｓｉｇｍａ）を使用した。ウエスタンブロットの定量化は、Ｏｄｙｓｓｅｙアプリケーションソフトウェアバージョン３．０．３０（ＬＩ－ＣＯＲ）のチャネル７００およびチャネル８００の強度データを使用して、ブランク値を差し引き、チューブリンに正規化して実施した。

免疫沈降。細胞をＮＰ４０溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０、１．５ｍＭＮａ₃ＶＯ₄、５０ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭβ－グリセロールホスフェートおよびＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ））、またはＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１．５ｍＭＮａ₃ＶＯ₄、５０ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭβ－グリセロールホスフェートおよびＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ））中で溶解した。溶解物を、４℃にて１５分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離することにより清澄化した。免疫沈降のために、細胞溶解物を一次抗体（ＦＬＡＧＭ２アフィニティーゲル、Ｓｉｇｍａ、Ｆ２４２６；ＩＤ１（Ｃ－２０）、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ｓｃ－４８８；Ｅ２Ａ（Ｎ－６４９）、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ｓｃ－７６３）およびタンパク質Ｇ／Ａビーズ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ｓｃ－２００３）とともに、４℃で一晩インキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で４回洗浄し、２×ＳＤＳ試料緩衝液で溶出した。タンパク質試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。５％の脱脂乳および０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳで膜を遮断し、一次抗体でプローブした。抗体および使用濃度は以下のとおりである：ＩＤ１１：５００（Ｃ－２０、ｓｃ－４８８）およびＥ２Ａ１：１０００（Ｎ－６４９、ｓｃ－７６３）、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手；ＨＡ１：１０００（Ｃ２９Ｆ４、＃３７２４）、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手；Ｓｉｇｍａから入手したβ－アクチン１：８０００（Ａ５４４１）、ビンキュリン１：８０００（Ｖ９１３１）、およびＦＬＡＧＭ２１：５００（Ｆ１８０４）。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体はＰｉｅｒｃｅから購入し、ＥＣＬ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を検出に使用した。

ユビキチン化アッセイ。リポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＨＣＴ１１６細胞にｐｃＤＮＡ３－ＩＤ１－ＦｌａｇおよびｐｃＤＮＡ３－ＨＡ－ユビキチンをトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞を、６０μＭＡＧＸ５１で２時間処理した後、２０μＭＭＧ１３２（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）でさらに６時間処理した。氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を２％ＳＤＳを含有する１００μＬのＴＢＳ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ）中に溶解し、１００℃で１０分間煮沸した。溶解物を、１％ＮＰ４０およびＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する９００μＬのＴＢＳで希釈し、１５分間、４℃にて１５，０００ｒｐｍで遠心分離して清澄化した。免疫沈降は、ＦＬＡＧＭ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ、Ｆ２４２６）を含む１ｍｇの細胞溶解物を使用して実行した。ユビキチン化タンパク質を、示された抗体を使用したイムノブロットによって分析した。

ｑＲＴ－ＰＣＲ。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶＦｉｒｓｔ－ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して１μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。定量的ＰＣＲは、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｒｉｍｅｒＡｓｓａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、７９００ＨＴＦａｓｔリアルタイムＰＣＲ機器（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）の製造元の指示に従って実施した。個々の遺伝子のプライマーペアを、生物情報学的に検証されたＱｕａｎｔｉＴｅｃｔライブラリから取得し、これらを以下に示す：ＩＤ１（ＱＴ００２３０６５０）、ＩＤ３（ＱＴ０１６７３３３６）、およびＧＡＰＤＨ（ＱＴ０１１９２６４６）。遺伝子発現の倍数変化は、デルタ－デルタＣＴ法を使用して計算した。

細胞生存率アッセイ。細胞株を９６ウェルプレートに播種した（ウェルあたり５０００細胞）。一晩インキュベートした後、細胞をＡＧＸ５１で処理し、２４時間インキュベートした後、ウェルごとにＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍＬ）を加え、細胞を４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を吸引し、ウェルあたり２００μＬのＤＭＳＯを加えた。次に、プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ２、ＢｉｏＴｅｋ）を使用して５７０ｎｍで吸光度を測定した。細胞増殖プロファイルは、２４ウェルプレートに３８，０００個の細胞を各時点で３回播種し、播種後１、３、５日目に死細胞をトリパンブルー排除を使用して細胞を計数することにより決定した。

細胞周期分析。細胞をＡＧＸ５１またはＤＭＳＯで処理し、トリプシン処理によって収集し、１×ＰＢＳで洗浄し、５００μＬの１×ＰＢＳに再懸濁し、６ｍＬの７０％エタノールで希釈し、分析まで－２０℃で保存した。細胞周期分析では、細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１×ＰＢＳで洗浄した後、０．５ｍＬのＰＩ／ＲＮａｓｅ染色緩衝液（５５０８２５、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、室温で１５分間インキュベートし、フローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ）で分析した。

ＨＵＶＥＣ細胞分岐アッセイ。分岐アッセイでは、３５０μＬのマトリゲルを氷上で２４ウェルプレートの各ウェルに充填し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートして、マトリゲルを固化させた。示されたＡＧＸ濃度の０．５ｍＬのＥＧＭ－２培地中の８０，０００個のＨＵＶＥＣを、固化したマトリゲルにプレーティングした。１８～２０時間のインキュベーションで、チューブ形成がピークに達すると、ウェルから培地を注意深く除去し、１０％緩衝ホルマリンで１５分間固定した。各ウェルをＤＰＢＳで洗浄した。キャピラリー様構造の形態を、倒立顕微鏡を使用して視覚化し、１０倍の倍率でデジタルカメラで撮影した。チューブネットワークを定量化するために、ＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓＡｎａｌｙｚｅｒプラグイン（パブリックドメインのＪａｖａベースの画像処理プログラム、参考文献：Carpentier G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. 2012）を備えたＩｍａｇｅＪをインストールして、ノード、ジャンクション、メッシュの数、および分岐の合計の長さの分析を、説明書に従って実行した。統計データ分析は、ウィルコクソン検定を使用して実行した。

ＨＵＶＥＣスクラッチアッセイ。ＨＵＶＥＣを、０．１％フィブロネクチンでコーティングされた２４ウェルプレートに播種した。細胞がコンフルエンシーに成長した２４時間後、細胞を内皮基礎培地（ＥＢＭ、Ｌｏｎｚａ）で４時間血清飢餓状態にし、滅菌Ｐ２００ピペットチップでこすり取って無細胞ゾーンを生成した。細胞をＰＢＳで洗浄し、示されたＡＧＸ濃度のＥＧＭ－２培地で２４時間刺激した。０および２４時間での、スクラッチされた領域を、倒立顕微鏡を使用して視覚化し、２０倍の倍率でデジタルカメラにより撮影した。

定量化および統計分析。実験の統計的詳細を、本明細書に見出すことができる。インビトロ実験の各実験条件には、３つの複製を一般に使用し、各マウス実験では、典型的には、群あたり５匹のマウスを使用した。サンプルサイズを、予想される大きな効果量に基づいて決定した。条件ごとに３回複製して、２標本ｔ検定を使用して、両側有意水準０．０５にて８０％の検出力で３という小さな効果量を検出することができる。群ごとに５匹のマウスを用い、２標本ｔ検定を使用して、両側有意水準０．０５にて８０％の検出力で２という小さな効果量を検出することができる。データのより大きな変動が観察され、分析のためにデータがプールされた場合、追加の実験を実行することができる。一般に、ウェルチのｔ検定を使用して、２つの群間の差を調べた。ＡＮＯＶＡを使用して、複数の実験群間の差を調べた。データを変換して、基礎となる正規性の仮定が満たされていることを確認してもよい。不均一分散が観察された場合、加重線形回帰分析を使用し、各群のデータポイントを、通常、各群のデータの標準偏差の逆数によって重み付けした。複数の実験からプールされたデータの場合、モデルには、実験と、実験における潜在的な差を説明するための共変量としての処置群の相互作用による実験の両方が含まれていた。関心のある線形対比の有意性を、加重最小二乗法から得られた推定値に基づいて評価した。残差のＱ－Ｑプロットを調べて、基礎となるモデルの仮定が満たされていることを確認した。Ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると見なされた。

（実施例１４）
Ｉｄ１またはＩｄ３の遺伝的喪失は、眼の血管新生を減少させる
理論に拘束されるものではないが、Ｉｄタンパク質が、ＡＭＤで発生するＣＮＶに関与するという仮説を立てた。本明細書で使用されるレーザー誘発性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のマウスモデルによって、ＡＭＤ処置を調査する臨床試験のアウトカムを予測する結果が以前に提供されてきた。ブルッフ膜のレーザー誘発破裂を、Ｉｄ１^-/-またはＩｄ３^-/-マウスおよび同腹仔対照Ｉｄ１^+/+またはＩｄ３^+/+マウスで実施した。１４日後、マウスを安楽死させ、脈絡膜フラットマウントを、血管細胞を選択的に染色するＦＩＴＣ標識グリフォニアシンプリシフォリアレクチンで染色し、ＣＮＶの面積を測定した。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、Ｉｄ１またはＩｄ３の遺伝子欠失は、野生型と比較して、ＣＮＶを有意に抑制した（ｐ＜０．０３）。

網膜血管新生の病理は、未熟児網膜症（ＲＯＰ）のマウスモデルでも研究することができる。このモデルでは、出生後（Ｐ）７日目のマウスを７５％Ｏ₂チャンバーに入れ、これにより網膜毛細血管の欠失を引き起こす。生後１２日目で、マウスを室内空気に戻し、これにより、網膜血管系における網膜虚血および増殖性血管疾患の発症がもたらされる。このモデルをＩｄ１またはＩｄ３ノックアウトマウスに適用した場合、野生型マウスと比較して網膜血管新生の有意な減少が観察された（ｐ＜０．０００１）（図１Ｃ）。
これらの研究を総合すると、薬理学的にＩｄタンパク質に拮抗することが、眼の血管新生疾患を処置するための有用なアプローチであり得ることを実証している。したがって、本技術の化合物は、眼の血管新生疾患を処置するのに役立つ。

（実施例１５）
インシリコスクリーニングにより、Ｉｄ１アンタゴニストであるＡＧＸ５１を同定する。
Ｉｄタンパク質に拮抗し得る小分子の探索を容易にするために、ＨＬＨドメイン、残基（５１－１０４）および（５９－１０４）（マウスおよびヒトで同一）を含むＩｄ１の２つのフラグメントの結晶構造、およびＥ４７－Ｉｄ１複合体：Ｉｄ１（５９－１０４）－Ｅ４７（５５８－６０９）を解析した（図２Ａおよび１６）。図２Ａに示すように、ＨＬＨスーパーファミリーの他のメンバーと同様に、構造はＩｄ１の１０残基とＥ４７の７残基のループによって接続された２つのαヘリックスで構成されていた。結晶構造は、Ｉｄ１のＨＬＨドメインがホモ二量体であり、両方のモノマーからのαヘリックスが４ヘリックスバンドルを形成していることを示した。界面領域は１０４５Å²であり、疎水性相互作用および７つの水素結合のロイシンジッパー様領域によって形成される（図２Ａ）。Ｉｄ１－Ｅ４７界面は、ホモ二量体界面と同じＩｄ１の領域によって形成される。Ｉｄ１と相互作用するＥ４７の残基は、Ｉｄ１の界面領域と構造的に同等であり、これにより、１１３１Å²の埋まった領域を有するＩｄ１ホモ二量体の構造に類似した４ヘリックスバンドルがもたらされる（図２Ａ）。疎水性相互作用および６つの水素結合（Ｉｄ１－Ｌ５９：Ｅ４７－Ｑ５９０；Ｉｄ１－Ｑ８９：Ｅ４７－Ｒ５５８；Ｉｄ１－Ｑ８９：Ｅ４７－Ｖ５５９；Ｉｄ１－Ｙ９４：Ｅ４７－Ｅ６００；Ｉｄ１－Ｌ１０２：Ｅ４７－Ｒ６０６；Ｉｄ１－Ｓ１０４：Ｅ４７－Ｒ６０６）に加えて、２つの塩橋（Ｉｄ１－Ｒ９９：Ｅ４７－Ｅ５６８；Ｅ４７－Ｅ５６８：Ｅ４７－Ｒ５７１）が形成される（図２Ａ）。結晶構造はさらに、Ｉｄ１の２つのヘリックス間のループ領域が柔軟であり、これにより３つの構造で観察される異なる立体配座および高いＢ因子がもたらされることを示した。Ｅ４７のみのＨＬＨ領域の結晶構造（Ahmadpour et al., PLoS One, 7: e32136 (2012)）および他のタンパク質とＤＮＡとの複合体は以前に公開されている。El Omari et al., Cell Rep, 4, 135-47 (2013); Longo et al., Biochemistry, 47, 218-29 (2008)。本明細書で報告されているＥ４７構造に重なり合うすべての構造は、Ｃα原子間のＲＭＳＤが０．４～０．８Åである。Ｅ４７ホモ二量体とＴ細胞急性リンパ性白血病タンパク質１および神経性分化因子１とのヘテロ二量体の両方における二量体化界面は、Ｉｄ１－Ｅ４７複合体におけるものと同じであることがわかった。しかし、これらの研究では、ループの立体配座がＥ４７のすべての構造で類似しているため、Ｅ４７のループ領域はＩｄ１のループ領域よりも剛性が高いことが示された。

図２Ｂに示すように、疎水性の隙間分析により、Ｉｄ１－Ｅ４７ヘテロ二量体に存在するＩｄ１のループ領域に隣接する裂け目が明らかになり、Ｉｄ１の領域は、ファミリーのメンバー間および種間で高度に保存されており、Ｉｄ活性の維持に重要である。Pesce and Benezra, Mol. Cell. Biol., 13, 7874-7880 (1993)。隙間結合のための２，２３４，０００の化合物のインシリコスクリーニングが実行され、薬物様特性のために削減された３，０００のヒットが得られた。３６４の候補が出現し、前述のようにＥＭＳＡによってＤＮＡへのＥ４７の結合に拮抗するＩｄ１の能力を阻害する能力について試験した（Ｂｅｎｅｚｒａ、１９９４）。試験した化合物のうちの３つを示す代表的なＥＭＳＡを図２Ｃに示し、化合物ＢおよびＣはＥタンパク質結合の用量依存的な増加を示した（それぞれレーン６～８および９～１６）。化合物Ａはそのような回復を示さなかった。Ｅタンパク質単独と比較したＥタンパク質結合活性の強力な回復（レーン１～１６を比較）は、化合物ＣがＩｄ１活性に拮抗し、Ｅ４７－ＤＮＡ結合にほとんど影響を与えなかったことを示唆した。要約すると、ＥＭＳＡアッセイで強い活性を示したのは２つの化合物のみであったため、ヒット率は２／３６４または０．５５％であった。この抗Ｉｄ１活性は、Ｉｄ１－Ｅ４７相互作用の撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）が原因である可能性が最も高いが、化合物の存在下でのＤＮＡへのＩｄ１－Ｅ４７複合体の結合などの他の説明も可能である。以前は、ＥＭＳＡは網状赤血球溶解物の存在下で実行され（Benezra et al., Cell, 61: 49-59 (1990)）、ここでまた、観察された相互作用を促進するためにＨｅＬａ核抽出物が加えられた。Ｂよりも強力な化合物Ｃは、Ｉｄ１アンタゴニストとしてさらなる分析のために選択され、ＡＧＸ５１と呼ばれる。図２ＣからのＡ、ＢおよびＣの構造が、図２Ｄに示されている。

ＡＧＸ５１は単一の立体中心を有する（図２Ｄ）。図２Ｅに示すように、ＳｉｔｅＭａｐ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒリリース２０１６－１：ＬｉｇＰｒｅｐ、バージョン３．７、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ）を使用して、Ｉｄ１の結合ポケットを予測し、これは、図２Ｂで同定されたのと同じ裂け目であったが、Ｅ４７のＡＧＸ５１結合ポケットは見出されなかった。ＡＧＸ５１結合ポーズの分析（ＧｌｉｄｅＸＰを使用したその後の高分解能ドッキング計算によって予測）により、Ｌｙｓ７０がＡＧＸ５１と水素結合を形成してＩｄ１のループドメインの７残基およびヘリックス１の４残基にＡＧＸ５１が近接していることを示した（図２Ｆ）。重要なことに、図８に示されるように、これらの残基の大部分（７／１１）は４つのＩｄファミリーメンバー間で高度に保存されており、９／１１はキイロショウジョウバエＩｄオルソログに見られるコンセンサスアミノ酸配列を生成した。

Ｉｄ１とＡＧＸ５１の間の物理的相互作用を実証するために、円二色性（ＣＤ）測定を実行した。図２Ｇに示すように、ＣＤスペクトルの分析により、Ｉｄ１がＡＧＸ５１と相互作用し、Ｉｄ１の二次構造に有意な変化をもたらすことが示された。ＣＤの変化は２０μＭで飽和し、これは、解離定数がこの範囲にあることを意味していた。重要なことに、ＡＧＸ５１とＥ４７の間に相互作用の証拠はなく、ＤＭＳＯまたは使用した緩衝液に起因する変化も観察されなかった（図２Ｇ）。ＤＭＳＯは、これらのアッセイで使用される波長で強い吸光度を示し、スペクトルにスパイクが生じる。残念ながら、ＡＧＸ５１は水に不溶性であり、ＤＭＳＯおよびこれらのアッセイで使用される波長範囲を含める必要があったため、このようなノイズを回避することはできなかった。ポケット領域に変異を有する十分な量のＩｄ１を精製することができず、これはおそらくそれらが不活性であること（Pesce and Benezra, Mol. Cell. Biol., 13, 7874-7880 (1993)）、そしておそらくこれらのタンパク質が不安定であることを反映している。ＣＤアッセイはまた、精製されたＩｄ３を用いて実行され、図９に示されるように、Ｉｄ１で観察された傾向に従って、Ｉｄ３の二次構造に対するＡＧＸ５１の小さいが再現性のある効果があった。ＡＧＸ５１の凝集はタンパク質のＣＤスペクトルに影響を与える場合があるが、このような影響は、関連性の高いＥ４７ｂＨＬＨタンパク質よりもＩｄタンパク質に特異的であるとは予想されないため、ここではこの可能性はない。ＡＧＸ５１とＩｄ１の共結晶化も試みたが、一般的に使用されるすべてのスパースマトリックススクリーニングおよびＩｄ１結晶の浸漬など、１０００を超える条件を試したにもかかわらず、これらの取り組みは不成功であった。興味深いことに、Ｉｄ１結晶をＡＧＸ５１に曝露した場合、結晶は融解し、ＤＭＳＯのみに曝露した場合は融解しなかった。ＡＧＸ５１曝露後のＩｄ１結晶の溶解は、ＣＤデータと一致しており、格子形成に適合しない立体配座変化を示唆している。

細胞への標的結合を実証するために、ＩＤ１およびＡＧＸ５１用にＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）アッセイが開発された。このアッセイは、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）ＴａｒｇｅｔＥｎｇａｇｅｍｅｎｔ（ＴＥ）ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＢＥＴＢＲＤアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に基づいている。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼＩＤ１融合タンパク質およびＡＧＸ５１－蛍光トレーサーを発現するコンストラクトを生成した（図１０Ａ）。標的が結合すると、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼから融合タンパク質の標的タンパク質部分に結合している蛍光トレーサーに発光エネルギーが移動することにより、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）が発生する。融合タンパク質をトランスフェクトされた透過処理２９３Ｔ細胞をＡＧＸ５１トレーサー（０～４μＭ）で処理した場合（図１０Ｂ）、ＢＲＥＴ比の用量依存的な増加が観察され、これは、標的結合を示していた。さらに、図１０Ｃに示すように、ＡＧＸ５１トレーサーはＡＧＸ５１と競合する可能性があり、生物学的アッセイ（本明細書に記載の）において、より大きな活性を有するＡＧＸ－Ａとより効率的に競合する可能性がある。これらのアッセイで同定された有効な化合物濃度は、生化学的および細胞ベースのアッセイ（以下を参照）で見出されるものとは異なっており、これは、このアッセイでは、ＡＧＸ５１とは異なる実体であり、独自の特性を有するＡＧＸ５１トレーサー、および内因性ＩＤ１ではなくＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼＩＤ１融合タンパク質を使用しているためである。さらに、ＡＧＸ５１トレーサーのサイズにより、ジギトニン透過性細胞においてアッセイを実施し、これは、内因性細胞状態を変化させ、結合特性に影響を与える可能性がある。これらの結果は、ＩＤ１が細胞環境におけるＡＧＸ５１の直接の標的であることを裏付けている。

物理的相互作用データをさらに検証し、どのＩｄ１残基がＡＧＸ５１、ＡＧＸ５１アナログであり、ＵＶ照射時に近接した残基と共有結合を形成するベンゾフェノン部分を組み込んでいるＡＧＸ５１－ＸＬ２（図８Ｂ）と相互作用するかを調査する。ＡＧＸ５１－ＸＬ２は、Ｉｄ１におけるＡＧＸ５１と同じポケットに結合すると予測された（データは示されていない）。ＡＧＸ５１－ＸＬ２と精製Ｉｄ１（５９－１０４）とを混合し、ＵＶ光に曝露し、試料を質量分析で分析した。図８Ｃに示すように、６つの残基（Ｖ７３、Ｐ７４、Ｔ７５、Ｐ７７、Ｑ７８、およびＲ８０）でＩｄ１に共有結合するＡＧＸ５１－ＸＬ２の証拠が見出された。これらの残基は、ＡＧＸ５１に近接していると予測される４つのヘリックス１残基および７つのループ残基と重複していた（図８および１７）。ＵＶ光に曝露されていない試料では共有結合の証拠は観察されず、Ｅ４７へのＡＧＸ５１－ＸＬ２の結合の証拠も観察されなかった（データは示されていない）。ＡＧＸ５１がＡＧＸ５１－ＸＬ２と同じ領域に結合するという概念を裏付けるために、過剰量のＡＧＸ５１を加えてＩｄ１結合部位に対し競合させた。質量分析により、１０倍過剰のＡＧＸ５１を加えた後、Ｉｄ１へのＡＧＸ５１－ＸＬ２の結合が大幅に減少することがわかった（図１８）。ＡＧＸ５１の細胞透過性、ＵＶ反応性の形態を、生細胞でこの分析を実行するために開発することができなかった。
これらのデータは、上記のインシリコスクリーニングおよびモデリングと一致するＡＧＸ５１とＩｄ１間の直接相互作用を裏付ける。

（実施例１６）
細胞内のＩｄタンパク質に対するＡＧＸ５１の効果
ＡＧＸ５１の活性を、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞株、すなわちＩＤ１～４発現プロファイルが異なる２つの細胞タイプで試験した。非結合Ｉｄタンパク質は、半減期が１０～２０分のオーダーで短命であるが、Ｅタンパク質と複合体を形成すると大幅に安定化する。インビトロで見られるように、培養中の細胞においてＩｄ－Ｅ相互作用がＡＧＸ５１によって破壊される場合、これは非結合Ｉｄタンパク質の増加につながり、これはその後急速に分解されると予測される。ＨＵＶＥＣを、濃度が増加したＡＧＸ５１（０～４０μＭ）で２４時間処理し、１０μＭでＩＤ１タンパク質レベルの有意な減少が観察された（図３Ａ）。ＩＤ３に関して同様のタンパク質喪失パターンが観察された（図３Ａ）；ＩＤ２およびＩＤ４タンパク質は、この細胞株では検出できなかった（データは示されていない）。ＨＵＶＥＣのＩＤ３喪失に対するＡＧＸ５１の効果は、ＣＤスペクトルで観察されたより弱い撹乱と一致して、ＩＤ１と比較して２０～４０μＭの範囲で低下した。Ｉｄ３に対する同様の効果の低下は、４Ｔ１乳癌細胞でも観察された（データは示されていない）。ＨＣＴ１１６細胞では、ＡＧＸ５１処理によりＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、およびＩＤ４のレベルが低下し、このことはＡＧＸ５１がタンパク質ファミリーの４つのメンバーすべてに拮抗したことを示唆している（図１１Ａ）。逆説的に、ＩＤタンパク質レベルはＡＧＸ５１処理によって低下したが、おそらく遊離Ｅタンパク質によるＩＤ１プロモーターの活性化のために、ＩＤ１ｍＲＮＡレベルの増加が観察された（図１１Ｂ）。これらの結果は、ＡＧＸ５１によるＩＤ１定常状態タンパク質レベルの低下が、ＩＤ１ｍＲＮＡ産生の有意な増加を克服する程度に強力であることを示している。

Ｉｄタンパク質は、ユビキチン２６Ｓプロテアソームシステムによって分解される。Lasorella et al., Nat Rev Cancer, 14: 77-91 (2014)。次に、この分解経路がＩｄタンパク質レベルに対するＡＧＸ５１の効果を媒介するかどうかを決定するために調査した。ＨＵＶＥＣに発現コンストラクトをトランスフェクトするのは難しいため、ＨＣＴ１１６細胞をこのアッセイに使用した。ＨＣＴ１１６細胞にＦｌａｇ－ＩＤ１を発現するコンストラクトをトランスフェクトし、６０μＭＡＧＸ５１で２～２４時間処理した（図３Ｂ）。次に、ＨＣＴ１１６およびＵ８７神経膠腫細胞に、ＦＬＡＧ－ＩＤ１およびＨＡ－ユビキチンを同時トランスフェクトし、分解前のユビキチン化を視覚化するために、ビヒクルまたはＡＧＸ５１のいずれかで２時間処理した。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２をさらに６時間加えた後、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、抗ＨＡ抗体を使用して免疫ブロットしてユビキチン化ＩＤ１を可視化した。ＩＤ１ユビキチン化は、ＭＧ１３２で処理された細胞からの溶解物で観察された（図３Ｃ）。ＡＧＸ５１による処理によって、両方の細胞型においてＩＤ１ポリユビキチン化がさらに増加した。

理論に拘束されるものではないが、Ｅタンパク質自体に対する化合物の干渉がほとんどないと仮定すると、ＡＧＸ５１に応答したＩｄタンパク質の喪失により、Ｅタンパク質結合活性の増加がもたらされるはずであるという仮説を立てた。ＨＣＴ１１６細胞をＡＧＸ５１で２４時間処理した後、予想通り、対照と比較して、細胞溶解物中のＥタンパク質結合のわずかな増加が観察された（図１１Ｃ）。Ｉｄ活性の喪失がＩｄタンパク質の喪失に先行するかどうかを判定するために、ＡＧＸ５１で１時間処理したＨＣＴ１１６細胞からの細胞溶解物を使用してＥＭＳＡを実施した。ＩＤ１タンパク質レベルが検出可能に低下しない場合に、ＡＧＸ５１に応答してＥタンパク質結合の同様の増加が見られ（図１１Ｃ）、このことは、観察されたＥタンパク質結合の増加は、全体的なＩＤタンパク質レベルの低下ではなく、ＩＤ１－Ｅタンパク質ヘテロ二量体の破壊によるものであることを示唆している。同様の結果が、ＡＧＸ５１で処理された４Ｔ１乳癌細胞において観察された（データは示されていない）。

ＡＧＸ５１の存在下でのＤＮＡへのＥ４７結合の増加が、内因性Ｅ４７－ＩＤ１細胞複合体のＡＧＸ５１誘導性解離によって引き起こされたことを確認するために、ＩＤ１またはＥ４７抗体を使用した免疫沈降および内因性Ｅ４７またはＩＤ１のウエスタンブロットをそれぞれ実行した。両方のアッセイで、ＡＧＸ５１による処理は、ＩＤ１タンパク質の検出可能な喪失の前に、共沈したタンパク質のレベルを著しく低下させた。したがって、ＡＧＸ５１は、細胞内のＩＤ１－Ｅ４７ＰＰＩを遮断することができる（図３Ｄ）。
これらの結果を総合すると、ＡＧＸ５１処理によってＩＤ１－Ｅ４７複合体が破壊され、プロテアソームを介したＩＤ１の分解、および転写を促進するＥタンパク質の遊離がもたらされることが示唆される。もっとも、ユビキチン化イベントが先行し、潜在的に複合体の完全な解離とそれに続くＩｄ分解を促進する可能性も形式的にはある。

（実施例１７）
細胞成長に対するＡＧＸ５１の効果
ＡＧＸ５１処理によって、ＨＵＶＥＣ（図４Ａ～４Ｃ）およびＨＣＴ１１６細胞（図１２Ａ～１２Ｃ）の両方において、細胞生存率の低下、Ｇ０／Ｇ１増殖停止、およびサイクリンＤ１レベルの低下がもたらされた。他のタンパク質の変化も、ＡＧＸ５１処理後の全プロテオームＳＩＬＡＣ分析によって観察された（データは示されていない）。これらのデータは、Ｉｄタンパク質発現の閾値レベルが、培養において調べた本質的にすべての細胞型の増殖および／または生存に不可欠であるが、これらのタンパク質がサイレンシングされているほとんどの成人組織では不可欠ではないという遺伝子実験と一致している（以下の毒性研究を参照のこと）。

ＨＵＶＥＣ血管分岐に対するＡＧＸ５１の効果を特徴づけるために、ノード、ジャンクション、メッシュの数、および分岐の長さをＡＧＸ５１処理後に測定した。図４Ｄ～４Ｅに示されるように、ＨＵＶＥＣをＡＧＸ５１の存在下でマトリゲル上で１８～２０時間培養した場合、ビヒクル対照と比較して、試験したすべてのパラメータにわたって用量依存的様式で血管分岐が有意に損なわれた（ｐ＜０．０５）。単層がスクラッチされ、次いでＡＧＸ５１含有培地で２４時間培養された後、ＡＧＸ５１によってＨＵＶＥＣ遊走も著しく損われた（図４Ｆ）。
したがって、ＡＧＸ５１処理により、培養中のヒト内皮細胞の正常な増殖特性が損なわれた。

（実施例１８）
腹腔内注射後のＡＧＸ５１の薬物動態および毒性。
次に、眼の網膜症の処置のためにＡＧＸ５１を全身投与することが実現可能であるかを調査して判定した。血清中のＡＧＸ５１の半減期を決定するために、マウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により、７０％ＤＭＳＯ中の３０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇＡＧＸ５１の単回投与で処置し、２４時間にわたって採血した。ＡＧＸ５１血清レベルの時間依存的な低下が、約３時間の半減期で観察された。３０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇの投与後に達成されたＡＧＸ５１の平均最大血清濃度は、それぞれ１．１および１．６μｇ／ｍＬ（２．７および４μＭ）であり、マウスを１００ｍｇ／ｋｇ用量で処置した場合はそれ以上増加しなかった。注目すべきことに、１０μＭのＨＵＶＥＣで有意なＩｄ喪失が見られた。１００％ＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｋｇで約１２μＭ）でより高い平均血清濃度を達成することができたが、動物はＤＭＳＯのみで注射部位毒性を示した。したがって、７０％の製剤が将来のすべての研究で使用された。

マウスに、ビヒクルまたはＡＧＸ５１のいずれかを６０ｍｇ／ｋｇで、１日２回ｉ．ｐ．投与した１４日間の処置期間の後、死亡または罹患は観察されなかった；全体的に、すべてのマウスは健康に見え、全体を通して正常な行動を示した；いずれのグループでも有意な体重減少は見られず、臨床化学パラメータおよび血液学はすべて正常範囲内であった（図１９）。肉眼的剖検中にも、すべての主要臓器の完全な組織病理学的評価の後にも、異常な所見は検出されなかった。
したがって、ＡＧＸ５１処置は毒性がない。したがって、本技術の化合物は、眼の血管新生疾患および癌を含む増殖性疾患を処置するのに役立つ。

（実施例１９）
眼の血管新生に対するＡＧＸ５１治療の効果
ＡＧＸ５１処置により、上記のＩｄ１およびＩｄ３喪失の遺伝子モデルに見られる効果が表現型模写されるかどうかを判定するために、本明細書で論じられるＡＭＤマウスモデルを再び使用した。Tobe et al., Am. J. Pathol., 153, 1641-1646 (1998)。図５Ａ～５Ｂに示されるように、１週間間隔で１０μｇのＡＧＸ５１の２回の硝子体内注射（レーザー処置の２時間後および７日後：分析は１４日目に実施された）により、ビヒクル単独と比較してＣＮＶが有意に抑制された（ｐ＜０．０５）。同様の結果が、レーザー処置の２時間後のＡＧＸ５１の単回投与および１４日目の分析で見られた（データは示されていない）。５μｇのＡＧＸ５１もＣＮＶを有意に減少させるのに有効であったが、１μｇはそうではなかった（ｐ＜０．０５）（図１３Ａ）。ＡＧＸ５１（約３０ｍｇ／ｋｇ）の１日２回のｉ．ｐ．注射によってまた、ビヒクル処置マウスと比較してＣＮＶが有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図５Ｃ～５Ｄ）。図５Ｅに示すように（上段、矢印）、Ｉｄ１タンパク質は、ＣＮＶ領域における対照眼（矢印の頭）で容易に検出され、レクチン染色された内皮細胞と共局在していた。ＡＧＸ５１での処理により、ＣＮＶを欠く領域にＩｄ１陽性細胞は生じず（図５Ｅ、中段を参照のこと）、ＣＮＶが観察された希少なセクションでは、Ｉｄ１染色はなかった（図５Ｅ、下段）。

ｉ．ｐ．投与によって観察された有効性は、ＡＧＸ５１が全身注射後に眼に到達する可能性があることを示唆していた。したがって、ＡＧＸ５１の濃度は、３０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１をｉ．ｐ．投与されたマウスの眼において、２４時間にわたる質量分析により測定された。３０分後のＡＧＸ５１の最大濃度は約４ｎｇ／眼であり、半減期は３．７時間であった。眼に到達するＡＧＸ５１の量は、有効性を示すために眼内注射に必要な量をはるかに下回り、これは、切り出された眼の摘出からの回復が不完全であるか、有効な用量範囲が送達経路によって大幅に異なるためである可能性がある。
ＲＯＰマウスモデルにおけるＡＧＸ５１の効果も、評価した。高酸素状態、次に正常酸素状態に曝露されたマウスを、生後１２日目でＡＧＸ５１により処置し、生後１７日目で安楽死させて、血管新生の程度を測定した。図５Ｆに示すように、ＡＧＸ５１の眼内注射によって、Ｉｄ１およびＩｄ３ノックアウトデータと一致して、網膜血管新生が有意に減少した（ｐ＜０．０１）。これらの結果は、ＣＮＶの領域における分解のためにＩｄタンパク質を標的とするＡＧＸ５１と一致しており、発現研究の遺伝的喪失が表現型模写されている。

ＡＧＸ５１には１つのキラル中心があるため、２つのＡＧＸ５１エナンチオマー（ＡＧＸ５１Ｅ１およびＥ２と呼ばれる）の相対活性の測定を行った。２つのエナンチオマーの立体特異的合成を実行し、Ｘ線結晶化研究により、ＡＧＸ５１Ｅ１およびＡＧＸ５１Ｅ２がそれぞれ分子のＲ型およびＳ型であることが同定された。ラセミ混合物、ＡＧＸ５１Ｅ１、ＡＧＸ５１Ｅ２、およびビヒクル対照のｉ．ｐ．注射の効果を、ＣＮＶアッセイで比較した。図６Ａおよび６Ｂに示されるように、ラセミ混合物およびＡＧＸ５１Ｅ２のみが、ビヒクル対照と比較してＣＮＶ面積を有意に減少させた（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＝０．００１４）。硝子体内注射アッセイにおけるＡＧＸ５１Ｅ２の用量設定は、僚眼（ＦＥ）と比較して３０および１０μｇの用量（ｐ＝０．０３）で有意な有効性を示したが、３または１μｇの用量では示さなかった（図６Ｃ）。興味深いことに、ＡＧＸ５１Ｅ２はＣＤアッセイにおいてＡＧＸ５１Ｅ１よりも高い活性を示し（図１４）、それがより活性なエナンチオマーであるという考えをさらに裏付けている。

ＡＭＤの現在の臨床的に承認された処置には、新生血管の増殖を阻害するＶＥＧＦトラップであるアフリベルセプトが含まれる。ＡＧＸ５１Ｅ２およびアフリベルセプトの相対的有効性を決定するために、ＣＮＶアッセイにおいて直接および併用処置を実施した。ＡＧＸ５１Ｅ２は、ＦＥと比較してこのアッセイにおいてＣＮＶを有意に低下させた（ｐ＝０．００１４）が、アフリベルセプトは、阻害活性を示しながら、これらの条件下で統計的有意性に達することができなかった。さらに、ＡＧＸ５１＋アフリベルセプト併用処置は、アフリベルセプト単独よりも良好に作用した（ｐ＜０．０５）（図６Ｄ）。
全体として、これらの結果は、全身投与または硝子体内投与による病的血管新生におけるＩｄタンパク質のＡＧＸ５１ターゲティングが貴重な治療アプローチであり得ることを示唆している。
したがって、ＡＧＸ５１処理により、培養中のヒト内皮細胞の正常な増殖特性が損なわれた。

（実施例２０）
ＡＧＸ－Ａの特性評価
ＡＧＸ－Ａ（図７Ａ）は、ＣＤ（図７Ｂ）およびＮａｎｏＢＲＥＴアッセイ（図１０Ｃ）においてＡＧＸ５１よりも高い活性を示すものとして同定された。細胞ベースのアッセイでは、ＡＧＸ－ＡはＡＧＸ５１よりも低濃度で、ＩＣ５０値の約４分の１の減少およびＩｄタンパク質レベルの低下を示した（図７Ｃ－７Ｄ）。さらに、ＡＧＸ－Ａは、１μｇの用量でのＣＮＶアッセイにおいて、ＡＧＸ５１よりも良好に機能した（図７Ｅ）。

本開示において、Ｉｄタンパク質の遺伝的喪失により、眼血管疾患の２つのモデルにおいて血管新生が減少したことを示した。ＡＧＸ５１は、Ｉｄタンパク質ファミリーの小分子アンタゴニストである。この分子は、ＩｄＨＬＨ二量体化モチーフの高度に保存されたループ領域内の疎水性ポケットと相互作用し得る化合物のインシリコスクリーニングで同定された。ＣＤデータは、ＡＧＸ５１がＥ４７ではなくＩｄ１およびＩｄ３と相互作用し、Ｉｄ１２°構造を変更することを示した。Ｉｄ１との相互作用は２０μＭの範囲で発生し、これは、ＥＭＳＡデータおよびｃｏ－ＩＰデータと一致している。Ｉｄタンパク質に対する効果を確認するために必要なＡＧＸ５１の濃度は、Ｍｙｃ－Ｍａｘ阻害に必要な濃度（約２０～５０μＭ）と同様であり、２量体は、相互作用して４ヘリックスバンドルを形成する隣接するロイシンジッパーを有する２つのｂＨＬＨタンパク質で構成されている。重要なことに、インビトロおよび細胞ベースのアッセイで使用されるＡＧＸ５１の濃度はマイクロモル範囲であり、関連する毒性がなく、ｉ．ｐ．注射後のマウスの血清において達成され、したがって全身的抗Ｉｄ療法の実現可能性を示唆している。理論に拘束されるものではないが、骨髄機能への影響がなく、一般に明白な毒性が観察されないのは、Ｉｄタンパク質が主に、ストレスや怪我に応答して成体幹細胞がサイクルに入るように誘導されたときにこれらの細胞によって必要とされることが原因である可能性が高いと仮定されている。

本明細書に開示される分析は、ＡＧＸ５１が細胞内の内因性Ｉｄ１－Ｅ４７ＰＰＩを破壊することを示し、これは、ＡＧＸ５１が、Ｉｄファミリーの高度に保存された機能的ループドメインに結合することにより、Ｅタンパク質と会合する能力を破壊するという提案されたモデルと一致する。Ｉｄ１／Ｅ４７相互作用の撹乱を観察するには、インビトロで細胞溶解物が必要であり、ＰＰＩの不安定化を促進するために細胞因子（場合によりＡＧＸ５１結合時のＩｄ１のユビキチン化）が必要であることを示唆していることは注目に値する。重要なことに、このＰＰＩが細胞培養で破壊された直後に、ＩＤタンパク質レベルが着実に低下し、これは、少なくともＩＤ１の場合、ユビキチン媒介タンパク質分解の増加によるものである。このＩｄタンパク質の不安定化は、Ｅタンパク質の共発現によりＩｄ３の安定性が劇的に増加することが示された遺伝子分析と一致している。ＳＩＬＡＣ分析（データは示されていない）によって、ＡＧＸ５１に応答してダウンレギュレーションされた他の１３のタンパク質のいずれも、Ｉｄ１デユビキチナーゼ（ＵＳＰ１）の既知の基質ではなく、ＵＳＰ１が薬物の標的となる可能性は低いことは注目に値する。ＡＧＸ５１は細胞培養および組織においてＩｄタンパク質のアンタゴニストおよび分解物因子として作用するように見えるため、組織または循環するＩｄ発現細胞におけるＩｄタンパク質のレベルは、ＡＧＸ５１活性のバイオマーカーとして機能する可能性がある。

細胞と動物の両方において、ＡＧＸ５１処理に応答してＩｄタンパク質が失われることは、それらが薬物標的であることを明確に示しているが、理論に拘束されるものではないが、Ｉｄタンパク質がＡＧＸ５１誘発性表現型の重要な標的であると仮定される。そうである場合、化合物がＩｄの機能喪失変異の影響を再現すると予想され、この予測は複数のアッセイで裏付けられている：ＡＧＸ５１は細胞増殖を阻害し、Ｇ０／Ｇ１停止を誘発する；ＡＭＤおよびＲＯＰのマウスモデルにおいて眼の血管新生を阻害する；ＲＯＳ産生および転移抑制を含む様々な癌モデルにおけるＩｄ１およびＩｄ３喪失の影響を表現型模写する（データは示されていない）。さらに、ｓｈＲＮＡによるＩｄ１およびＩｄ３の部分的減少により、細胞内のＡＧＸ５１のＩＣ５０が減少し、Ｉｄタンパク質が検出されない静止細胞では細胞死滅が大幅に減衰する（データは示されていない）。他の意図しない標的も観察された表現型に寄与する可能性を厳密に排除することはまだできない。

本明細書で提示されたＣＤ、架橋およびＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）アッセイの結果、ならびに結晶格子撹乱は、インビトロおよび細胞内の両方においてＩＤ１とＡＧＸ５１の間の直接的標的結合を裏付ける。さらに、ＡＧＸ－ＡはＡＧＸ５１よりも低い濃度で作用し、ＣＤアッセイでＩｄ１に二次的な変化をもたらし、ＮａｎｏＢＲＥＴアッセイでトレーサー結合に対し競合した；これに対応して、ＡＧＸ５１よりも低濃度の細胞内のＡＧＸ－Ａ分解Ｉｄタンパク質は、ＣＮＶアッセイにおいてＩＣ５０が低く、活性が強い。逆に、ＥＭＳＡアッセイでＩｄ１を撹乱させ、細胞内のＩｄタンパク質を分解し、細胞生存率アッセイで高いＩＣ５０を示すには、より高濃度のＡＧＸ８（図２の化合物Ｂ）が必要であった（データは示されていない）。これらのデータを総合すると、ＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａが標的ＩＤタンパク質に直接結合することが裏付けられる。

ＡＧＸ５１の硝子体内および／または全身投与によって、新生血管眼疾患の２つのモデル：ＡＭＤおよびＲＯＰにおいて眼の血管新生が抑制された。重要なことに、ＲＯＰモデルの有効性により、糖尿病性網膜症の有効性も予測することができる場合がある。さらに、本明細書では、ＡＧＸ５１が、現在利用可能なＡＭＤ処置、アフリベルセプト、および併用療法と同様に機能し、アフリベルセプト単独よりも良好に作用したことが示されている。網膜における血管新生を阻害するＡＧＸ５１の全身送達の能力は、硝子体内送達と一致しており、Ｉｄ依存性の循環内皮前駆細胞が表現型に寄与している可能性がある。血管新生を促進する分子シグナルは必ずしもすべての臓器で同一ではないが、眼の血管新生および腫瘍血管新生におけるＩｄタンパク質の関与は、ＡＧＸ５１が血管新生を合併する他の疾患の治療可能性を有し得ることを示唆している。

結論として、本明細書で同定されるのは、病的状態におけるＩｄ遺伝子喪失を表現型模写する、ファーストインクラスのＩｄタンパク質アンタゴニストおよび分解物因子であるＡＧＸ５１であり、これは、Ｉｄタンパク質を研究するための有用な生物学的ツールであることに加えて、眼の血管新生疾患および癌などの増殖性疾患を含むさまざまなＩｄ関連のヒトの病状に臨床的利益をもたらすことができる治療剤へと開発することもできることを示唆している。

（実施例２１）
抗Ｉｄ化合物であるＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの、抗Ｉｄ有効性、抗癌有効性のための、および胆管癌における休止幹細胞を標的とし、標準治療化学療法に関連する獲得耐性を防止するための比較研究。
本実施例では、ＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの対照比較研究を提供する。これらの研究は、抗Ｉｄ、抗癌、および抗病原性血管新生を媒介し、臨床使用における他の治療効果を裏付けるための、本技術の化合物の広範かつ柔軟な範囲を示している。本明細書における研究は、ＡＧＸ－Ａなどの本技術の化合物が強力な抗Ｉｄ薬であり、ヒトにおける癌薬物有効性の受け入れられた動物モデルにおいて、有効かつ用量依存的な抗癌化合物として良好に機能することを示している。以下でさらに詳細に説明するように、ＡＧＸ－Ａは、いくつかの実験において、ＡＧＸ５１と比較して有意に優れた効力を示し、低用量で同等または有意に優れた有効性を示す。

本明細書に記載の方法（例えば、実施例１２～１３を参照のこと）に従って、ＡＧＸ－ＡおよびＡＧＸ５１を、細胞培養においてＩｄノックダウンを媒介するそれらの能力について比較した。図２１は、実施例に従う、ＴＦＫ１細胞培養におけるＩｄ１のノックダウンに対するＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの対照比較効果を示す。図２２は、実施例に従う、ＴＦＫ１細胞培養におけるＩｄ３のノックダウンに対するＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの対照比較効果を示す。特に、最も関連性の高い細胞株は培養してもＩｄ３を発現しないが（ＳＮＵ１０７９、ＳＮＵ１１９６など）、ＴＦＫ１は培養するとＩｄ３を発現する。これらの実験では、ＡＧＸ－Ａは、ＡＧＸ５１と比較して優れた抗Ｉｄ１および抗Ｉｄ３効力を示し、ＡＧＸ５１と比較して低濃度で同等または優れたＩｄノックダウン活性を示す。

胆管癌の臨床標的は、いくつかの理由でさらなる比較研究のために選択された。予備研究では、胆管癌細胞および腫瘍がＩｄ１を過剰発現し、Ｉｄ３についても陽性であることが示され、これは、これらの標的が抗Ｉｄ１および抗Ｉｄ３干渉の影響を受けやすいことを示している。重要なことに、胆管癌は、強力な化学療法薬ゲムシタビンを使用した一次標準治療（ＳＯＣ）処置後に、獲得耐性を伴う再発を示すことが多い難治性の癌タイプである。以下の拡張研究は、本技術による抗Ｉｄ療法がＩｄ１およびＩｄ３陽性の「休止」幹細胞を標的とすることを示している。これらの細胞は、化学療法に比較的耐性のある癌前駆細胞のプールを表す（休止中の非増殖状態に基づいて、このような細胞は、増殖細胞を標的とする一次化学療法を回避する）。このように、これらの幹細胞は、頻繁に一次癌処置から逃れ、その後、それらはリバウンドして新しい癌細胞集団を生み出すことができる。本明細書に提示されたさらなる追加の証拠は、本技術の化合物が、単独で、または従来の化学療法癌治療と組み合わせてのいずれかで、それらの効果にも影響を与え、獲得耐性を排除することを示している。例えば、一次処置を変異により逃れる休止幹細胞または癌細胞（例えば、変異によって化学療法薬に対する耐性を獲得する細胞）は、本技術の化合物をさらに回避することも、それに対する耐性を発達させることもできない。理論に拘束されるものではないが、機能的に重要な、進化的に制約／保存されたＩｄ結合界面（本技術の化合物によって標的とされる）は、「獲得耐性」を生成するために変更することは実質的にできない。いかなる構造的変異も、このようなタンパク質が癌細胞においてその役に立つ本質的な目的に関して機能的に無効な、生物学的に機能しないＩｄタンパク質を生じるからである。

本明細書のさらなる追加のデータにより、本技術の抗Ｉｄ化合物が、高度に増殖性の細胞集団を標的とする一次化学療法、放射線および他の癌処置を免れる休止幹細胞を強力に標的とすることをさらに証明する。組織化学的研究を実行し、そこでの結果は、２つの異なる腫瘍タイプである胆管癌およびトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）の休止中の非増殖性幹細胞が、癌細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７と相互に排他的にＩｄ１を発現することを示した。比較可能なデータは、非増殖性幹細胞が同様に相互に排他的にＩｄ３を発現し、Ｋｉ６７を発現しないことを示した。さらなる研究は、化学療法後の腫瘍において、Ｉｄ１＋／Ｋｉ６７＋細胞の比率が劇的に増加したことを示し、このことは、Ｉｄ１＋／Ｋｉ６７－である休止幹細胞の相対集団が化学療法によって大幅に濃縮されたことを意味する。これらのデータは、Ｉｄ１が多様な癌タイプにおける両方の休止幹細胞マーカーであること、休止Ｉｄ＋／Ｋｉ６７－幹細胞が従来の化学療法（および増殖を標的とする他の癌処置）に耐性があること、および本技術の抗Ｉｄ化合物は、化学療法／寛解後の癌再発に関係する休止Ｉｄ＋幹細胞を根絶することを示している。これらの休止幹細胞を標的とするために、本技術の抗Ｉｄ化合物は、化学療法剤または他の従来の処置による一次処置に続く二次治療として、化学療法または他の従来の癌処置との協調処置プロトコルにおいて、または、増殖性癌細胞と休止中のＩｄ＋幹細胞の両方を固有にかつ広範に標的とする有効な一次治療として単独で、効果的に使用することができる。

Ａ：細胞増殖に対するＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの比較効果
インビトロ研究では、以下の表１に列挙されている、多様な胆管癌細胞株に対するＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの抗Ｉｄ媒介性の影響を調べた。

胆管癌細胞の生存率に対するＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの効果を、６つの異なる胆管癌細胞株について評価した。これらの研究で測定されたＩＣ５０値（μＭ）を、比較に役立てるため、ＡＧＸ５１ＩＣ５０のＡＧＸ－ＡＩＣ５０に対する比とともに以下の表２に示す。

表２に示されるように、ＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの両方は、胆管癌細胞の生存率に対してＩｄノックダウンに関連する負の影響を及ぼし、ＡＧＸ－Ａの抗癌特性は、ＡＧＸ５１の抗癌特性より一貫して優れている。特に、ＳＮＵ－１０７９、ＥＧＩ－１、およびＷＩＴＴ細胞において、ＡＧＸ－Ａの抗癌特性はＡＧＸ５１の抗癌特性よりも大幅に優れている。ＴＦＫ１細胞生存率に対するＡＧＸ５１およびＡＧＸ－Ａの用量依存的効果を、２４時間にわたる関連研究で評価し、例示的なデータを図２３に示す。これらのデータは、ＡＧＸ５１と比較して、ＡＧＸ－Ａが優れた抗癌潜在能を有し、低濃度での細胞生存率の阻害が同等または大幅に優れていることを実証している。

Ｂ：胆管癌のマウスモデルにおけるゲムシタビンを用いる場合および用いない場合のＡＧＸ－Ａのインビボ有効性
ヒトにおける抗胆管癌の薬物有効性を予測する胆管癌の動物モデルでの追加の研究は、ＡＧＸ－Ａ単独およびＳＯＣ化学療法薬ゲムシタビンと組み合わせたＡＧＸ－Ａの用量依存的な抗癌効果を証明している。
研究の第１ラウンド（「ラウンド１」）を、投与のために生理食塩水中のゲムシタビンおよびＤＭＳＯ中のＡＧＸ－Ａを利用して、以下のラウンド１研究プロトコルに示されるように計画した。

ラウンド１研究プロトコル－動物モデルおよび実験計画（ＤＭＳＯ中のＡＧＸ－Ａ）：
・マウス：６～８週齢の雌型ＮＳＧ
・ＰＤＸ：ＲｏｍｅＰ＿ＰＨＣＨ＿Ｘ＿０００８ａ、マトリゲルを用いるｓｃ連続移植
・処置群（少なくとも６動物／群）：腫瘍が１００ｍｍ³に達したときに処置を開始した（各動物の「０日目」）
・群１．生理食塩水、ｉ．ｐ．週に１回（「ＱＷ」）３～４週間（「×３～４週間」）
・群２．ゲムシタビン２５ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．ＱＷ×３～４週間
・群３．ＡＧＸ－Ａ１０ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．１日１回、連続５日間（「ＱＤｘ５」）×３～４週間
・群４．ゲムシタビン２５ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．ＱＷ＋ＡＧＸ－Ａ１０ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．ＱＤｘ５×３～４週間
腫瘍の体積、体重、および臨床徴候を、研究全体を通して、各群の各動物について、最低週に２回監視した。

ラウンド１の研究において、群１および２の動物の体重は、研究の期間中、本質的に変化しなかったことが観察された。しかし、ＤＭＳＯ中のＡＧＸ－Ａを受けた動物（群３および４）では、体重減少が観察され、ＤＭＳＯがある程度の毒性を呈していたことを示している。このため、群３および４の処置は、９日目以降に中止し、腫瘍の体積、体重、および臨床徴候を、各群の各対象について、最低週に２回監視し続けた。その後、群３および４の動物は体重減少（ｌｏｏｓｉｎｇｗｅｉｇｈｔ）が停止し、代わりに体重が再増加し始めた。その間、群１および２の処置を、計画通り継続した。計画された研究の変更により、ラウンド１は２０日目に終了した。
ラウンド１研究からの腫瘍体積データを、図２４に提示する。注目すべきことに、群３の処置は９日で中止されたが、データは、ＡＧＸ－Ａ単独の方がＳＯＣ薬のゲムシタビンよりも良好に機能していることを示している。さらに、群４のデータは、ＡＧＸ－Ａをゲムシタビンと共に使用する併用療法（ここでも、わずか９日後に処置を中止した）により、さらに大きな抗癌効果がもたらされることを示している。

ＤＭＳＯが提起した問題を克服するために、ＡＧＸ－Ａと適合性があり、投与に好適な製剤を開発するための調査を実行した。ある調査では、本技術の抗Ｉｄ化合物とともにスルホブチルエーテル－β－シクロデキストリン（ＣＡＰＴＩＳＯＬ）を使用することを検討したが、スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリンを含む製剤は、ＡＧＸ－Ａにより誘発される胆管癌細胞の細胞死を中和した。
最終的に、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（「ＨＰＢＣＤ」）を使用する特に効果的な製剤が発見された。ＨＰＢＣＤは、胆管癌細胞に対するＡＧＸ－Ａ活性を維持しながら、水溶液中でＡＧＸ－Ａを効果的に可溶化することがわかった。代表的なデータを、それぞれＳＮＵ１０７９細胞およびＳＮＵ１１９６細胞の２４時間の細胞生存率研究の結果を提供する図２５Ａ－２５Ｂに示す。これらの研究およびデータは、ＨＰＢＣＤおよび同等の可溶化剤を、本技術の抗Ｉｄ化合物を含む医薬製剤に効果的に使用することができることを証明している。

この発見が得られたので、以下に示すように「ラウンド２」研究を実行し、ここでは、ＡＧＸ－Ａを、１２．５質量％のＨＰＢＣＤを含む生理食塩水製剤で投与し、ゲムシタビンを生理食塩水で投与した（ゲムシタビンは第１ラウンドの研究で投与されたため）。
ラウンド２研究プロトコル－動物モデルおよび実験計画（ＡＧＸ－Ａ＋ＨＰＢＣＤ）：
・マウス：６～８週齢の雌型ＮＳＧ
・ＰＤＸ：ＲｏｍｅＰ＿ＰＨＣＨ＿Ｘ＿０００８ａ、マトリゲルを用いるｓｃ連続移植
・処置群（少なくとも６動物／群）：腫瘍が１００ｍｍ³に達したときに処置を開始した（各動物の「０日目」）
・群１．１２．５重量％のＨＰＢＣＤ（「ビヒクル」）を含む生理食塩水、ｉ．ｐ．各週ＱＤ×５×１週間
・群２．ゲムシタビン１５ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．ＱＷ×１週間
・群３．ＡＧＸ－Ａ１０ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．ＱＤｘ５ｘ１週間
・群４．ＡＧＸ－Ａ１５ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．ＱＤｘ５ｘ１週間
・群５．ゲムシタビン１５ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．ＱＷ＋ＡＧＸ－Ａ１０ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．ＱＤｘ５×１週間
・群６．ゲムシタビン１５ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．ＱＷ＋ＡＧＸ－Ａ１５ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．ＱＤｘ５×１週間

研究中、腫瘍の体積、体重、および臨床徴候を、各群の各動物について、最低週に２回監視した。このラウンド２の研究期間中、いずれの群の動物でも体重減少は観察されず、このことは、ＨＰＢＣＤの忍容性が高いことを示している。
このラウンド２研究からの腫瘍体積データを、図２６に提示する。このラウンド２の研究からのデータによって、ラウンド１の研究で示された本技術の抗Ｉｄ化合物の有意な効力および有効性が、単独および併用療法の一部の両方で確認された。

（実施例２２）
種々の追加の癌細胞株に対するＡＧＸ５１および本技術の化合物の効果
主要な乳癌サブタイプ（ＥＲ＋、ＨＥＲ２＋、およびＴＮＢＣ）を表す４Ｔ１マウス乳癌細胞株および９つの乳癌細胞株、例えばＭＤＡ－ＭＢ－１５７、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、ＭＣＦ－７、およびＴ４７－Ｄを、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１％ペニシリン－ストレプトマイシンおよび１％Ｌ－グルタミンを補充したＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地中で増殖させる。患者由来の異種移植細胞株ＢＲ７、ＢＲ１１、およびＩＢＴは、インフォームドコンセントを得て患者から外科的に切除された乳癌の骨転移標本から直接確立される。ＢＲ７およびＢＲ１１標本を、ＥＲ陽性（ＨＥＲ２陰性およびＰＲ陰性）の転移性乳癌患者から取得し、ＩＢＴ標本を、転移性トリプルネガティブ乳癌患者から取得する。新鮮な腫瘍組織を氷冷ＰＢＳですばやく洗浄し、滅菌カミソリの刃を使用してＭＥＭ培地（ＦＢＳ非含有）中で約１～３ｍｍの小片に細かく切り刻む。細かく刻んだ元の腫瘍組織の一部を、ＦＢＳを含まないＭＥＭ培地（５ｍＬ／２５０ｍｇ組織）でコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ酵素混合物（１，０００単位、ＶｏｄｅｎＭｅｄｉｃａｌ、Ｌｏｍｂａｒｄｉａ、Ｉｔａｌｙ）と２～４時間インキュベートする。次に、解離した腫瘍組織を７０μｍナイロンフィルターに通して濾過し、細胞を室温での遠心分離によって濃縮し、播種して、３％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を含むＭＥＭ培地中でそれぞれの初代細胞培養物を誘導する。初代細胞培養物に、レンチウイルスベクターを発現する蛍光ｔｄｔｏｍａｔｏ－／ＥＧＦＰ－ルシフェラーゼ融合タンパク質を１８～２４時間形質導入し、次に、初代細胞を、３％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、および１％Ｌ－グルタミンを補充したＭＥＭ培地中で維持する。初代細胞培養のアリコートはまた、最小数（３～４）のインビトロ継代後に凍結保存する。細胞を、１００μＭのＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１、またはＡＧＸ－Ａなどの本技術の化合物のいずれかで処理する。細胞の形態および増殖を、形態の変化または細胞死について顕微鏡検査によって１週間毎日監視する。ＩＣ５０を決定するために、癌細胞株を９６ウェルプレートに播種する（ウェルあたり５０００細胞）。一晩のインキュベーション後、細胞を、ＡＧＸ５１（０、５、１０、２０、４０、６０μＭ）または本技術の化合物（０、５、１０、２０、４０、６０μＭ）で処理し、２４時間、４８時間、７２時間インキュベートし、各条件を３回繰り返した。各時点で、ウェルあたり４０μＬのＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍＬ）を加え、細胞を４時間インキュベートする。インキュベーション後、培地を吸引し、ウェルあたり２００μＬのＤＭＳＯを加える。次に、プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ２、ＢｉｏＴｅｋ）を使用して５７０ｎｍで吸光度を測定する。本技術の化合物との将来の比較を支援するために、最初に、ＡＧＸ５１について上記のように研究を実施し、以下の表３に示すデータを提供した。

ＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１、または本技術の化合物（ＡＧＸ－Ａなど）の４Ｔ１細胞に対する効果もまた、製造元の指示に従ってアラマーブルー生存率アッセイを使用して評価する。要約すると、５０００個の４Ｔ１細胞を９６ウェルプレートに播種し、翌日４０μＭＡＧＸ５１で２４時間処理し、その後、アラマーブルー細胞生存率試薬の１：１０希釈液を細胞に加え、プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ２、ＢｉｏＴｅｋ）を使用して試薬を加えてから２、３、４、５、６時間後に吸光度を測定した。本技術の化合物との将来の比較を支援するために、そのようなアッセイをＡＧＸ５１で実行し、結果を図２７に提供した。

膵臓癌細胞およびオルガノイド株に対するＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１、または本技術の化合物（ＡＧＸ－Ａなど）の効果も調べる。検査する株は、ヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ１およびＡ２１、マウス膵臓癌株８０６（ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ－／－；Ｓｍａｄ４－／－）、ＮＢ４４（ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ－／－）および４２７９（ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ－／－）、およびマウス膵臓オルガノイド細胞株Ｔ７およびＴ８である。膵臓スフェロイドは、Ｇｌｕｔａｍａｘ（２ｍＭ）およびヘパリン（５μｇ／ｍＬ）を補充したＤＭＥＭの超低接着培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｏｎｅｏｎｔａ、ＮＹ、ＵＳＡ）で増殖させる。膵臓オルガノイドは、参照により本明細書に組み込まれるBoj, S.F., et al., Cell 160: 324-338 (2015)に記載されているように、Ｂ－２７（１２５８７－０１０、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、５０％Ｗｎｔ／Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ／Ｎｏｇｇｉｎ馴化培地（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２７６）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（２ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｎ－アセチルシステイン（１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、上皮成長因子（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ、ＮＪ）、ガストリン（１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、線維芽細胞成長因子－１０（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ、ＮＪ）、Ａ８３－０１（０．５μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ／Ｆ１２（１２６３４－０２８、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてマトリゲルに埋め込む。すべての細胞株およびオルガノイドを、３７℃および５％ＣＯ₂で維持する。細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造元の指示に従って使用して測定する。本技術の化合物との将来の比較を支援するために、研究は最初にＡＧＸ５１を用いて実行し、結果を、図２８（マウスオルガノイド）、図２９（マウス細胞株８０６、ＮＢ４４、および４２７９）および図３０（ヒト細胞株Ｐａｎｃ１およびＡ２１）に示した。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示され、本技術の化合物が癌の処置に有用であるというまたさらなる証拠を提供することが期待される。

（実施例２３）
マウスの癌細胞株異種移植片に対するＡＧＸ５１および本技術の化合物の効果。
原発腫瘍に対するＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１、または本技術の化合物（ＡＧＸ－Ａなど）の効果を、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を使用する原発腫瘍異種移植モデルにおいてパクリタキセルを用いる場合および用いない場合で試験する。同所性乳腺脂肪体腫瘍を、５×１０⁶ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（１：１ＰＢＳ：マトリゲル）を８～１２週齢の雌型無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスの右尾側乳腺脂肪体に注入することによって生成する。マウスは、ＳｉｍｏｎｓｅｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｉｌｒｏｙ、ＣＡから入手する。腫瘍を、約１００ｍｍ³まで増殖させ、その時点で、ほぼ同じ腫瘍量の５匹のマウスからなる１２の群に分け、次いで処置を開始する。群１はビヒクル（ＤＭＳＯ、ｑ５ｄ投与）対照であり、群２は、１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを１日１回５日間受け、群３は、６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１を１日２回１９日間受け、群４は、１日１回の１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルと１日２回の６．７ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１の組み合わせを、１９日間受け、群５は、１日１回の１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルと１日２回の２０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１の組み合わせを、１９日間受け、群６は、１日１回の１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルと１日２回の６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１の組み合わせを、１９日間受け、群７は、１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを１日１回、１９日間受け、同時に６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１を１日２回、最初の７日間受け、群８は、６０ｍｇ／ｋｇの本技術の化合物（例えば、ＡＧＸ－Ａ）を１日２回１９日間受け、群９は、１日１回の１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルと１日２回の６．７ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ－Ａの組み合わせを、１９日間受け、群１０は、１日１回の１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルと１日２回の２０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ－Ａの組み合わせを、１９日間受け、群１１は、１日１回の１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルと１日２回の６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ－Ａの組み合わせを、１９日受け、群１２は、１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを１日１回、１９日間受け、同時に６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１を１日２回、最初の７日間受ける。処置剤は、ｉ．ｐ．投与される。腫瘍体積は、デジタルノギスおよび式：腫瘍体積＝１／２（長さ×幅２）を使用して研究全体を通して決定し、式中、最大の縦方向の直径が腫瘍の長さであり、最大の横方向の直径が幅である。研究の終了時に、マウスを、頸椎脱臼によって犠死させる。本技術の化合物との将来の比較を支援するために、研究を、最初にＡＧＸ５１で実行した（つまり、群２の１匹のマウスが研究中に死亡したことを除いて群１～７に提供された）。パクリタキセルを伴う場合および伴わない場合の、原発腫瘍に対するＡＧＸ５１の効果の例示的なデータを図３１に示す。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示され、本技術の化合物がトリプルネガティブ乳癌の処置に有用であるというまたさらなる証拠を提供することが期待される。

ＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１、または本技術の化合物（ＡＧＸ－Ａなど）の転移への効果も、肺定着モデルを使用して調べる。肺転移を、５０，０００個のルシフェラーゼ標識４Ｔ１細胞を、６～８週齢の雌型Ｂａｌｂ／ｃマウスの尾静脈に注入することによって生成する。尾静脈注射の２４時間後、マウスを、１日１回、ＤＭＳＯ、５０ｍｇ／ｋｇＡＧＸ５１で、または５０ｍｇ／ｋｇの、例えばＡＧＸ－Ａで１日２回（処置群あたり少なくとも５匹のマウス）ｉ．ｐ．注射により処置する。肺転移の発生は、ＩＶＩＳ－２００インビボイメージングシステムを使用して監視する。本技術の化合物との将来の比較を支援するために、研究を、ＭＳＯおよびＡＧＸ５１を用いて実行し、肺定着に対するＡＧＸ５１の効果の例示的なデータを図３２に提示する。ＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１、または本技術の化合物（ＡＧＸ－Ａなど）の、確立された肺転移への効果も調べる。肺転移の証拠がインビボイメージングによって観察可能になると、マウスを、処置群ごとにほぼ同じ腫瘍量を有する５匹のマウスの群に分ける。群は、群１ビヒクル（ＤＭＳＯ）を５日間、群２５０ｍｇ／ｋｇＡＧＸ５１を１日２回、５日間、群３１５ｍｇ／ｋｇパクリタキセルを１日１回、５日間、群４１日２回の５０ｍｇ／ｋｇＡＧＸ５１および１日１回の１５ｍｇ／ｋｇパクリタキセルの５日間の組み合わせ、群５５０ｍｇ／ｋｇの、例えばＡＧＸ－Ａを１日２回、５日間、群６１日２回の５０ｍｇ／ｋｇＡＧＸ５１と１日１回の１５ｍｇ／ｋｇパクリタキセルの５日間の組み合わせ、である。実験の終了時に、マウスを安楽死させ、さらなる分析のために組織を収集した。肺腫瘍量は、病理学者によって盲検的に定量化される。本技術の化合物との将来の比較を支援するために、研究を、ＤＭＳＯおよびＡＧＸ５１を用いて実行し、確立された肺転移に対するＡＧＸ５１の効果の例示的なデータを図３３に提示する。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。

二次部位での血管外遊出および初期播種の阻害、または腫瘍への血管外遊出癌細胞の増殖の進行を評価するために、尾静脈からマウスにＧＦＰ標識４Ｔ１細胞を注射し、ＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１（５ｍｇ／ｋｇ）、または本技術の化合物（例えば、ＡＧＸ－Ａ；５０ｍｇ／ｋｇ）で２４時間または４８時間マウスを処置し、次に肺をＧＦＰ（すなわち、腫瘍細胞）について染色し、腫瘍細胞数を定量化する。本技術の化合物との将来の比較を支援するために、研究を、最初にＤＭＳＯおよびＡＧＸ５１を用いて実行し、二次部位での癌細胞の初期播種に対するＡＧＸ５１の効果の例示的なデータを、全細胞に関して図３４Ａに、および全組織面積に関して図３４Ｂに示す。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。

ＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１、または本技術の化合物（ＡＧＸ－Ａなど）が散発性腫瘍に及ぼす影響を、化学的に誘発された自発性腺腫モデルであるアゾキシメタン（ＡＯＭ）結腸腫瘍モデルを使用して調べる。自発性結腸腫瘍を、３０匹の４週齢の雄型Ａ／Ｊマウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、ＡＯＭ（１０ｍｇ／ｋｇ；ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）で週に１回ｉ．ｐ．注射により６週間処置することによって誘発する。実験期間中、マウスを、ＡＩＮ－９３Ｇ精製食（ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ）で飼育する。３週間の処置中断の後、マウスに、ＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１（１５ｍｇ／ｋｇ）、または本技術の化合物（例えば、ＡＧＸ－Ａ；１５ｍｇ／ｋｇ）を用いて、３週間ｉ．ｐ．処置を行う。最後の注射に続いて、マウスを安楽死させ、結腸腫瘍をホルマリン固定して腫瘍量を評価する。腫瘍の数およびサイズを、メチレンブルー染色後の組織のマウント全体において決定する。本技術の化合物との将来の比較を支援するために、研究を、ＤＭＳＯおよびＡＧＸ５１を用いて実行し、散発性腫瘍に対するＡＧＸ５１の効果の例示的なデータを図３５Ａ～３５Ｄに示す。特に、ＡＧＸ５１処置により、図３５Ａに示すように結腸腫瘍の数の有意な減少（ｐ＝０．００８）がもたらされた。加えて、ＡＧＸ５１群の腫瘍はＤＭＳＯ群の腫瘍よりも小さく（図３５Ｂ～３５Ｄ）、この差は、図３５Ｄに示すように＞３ｍｍが測定される腫瘍を比較した場合に有意であった（ｐ＝０．００４）。本技術の化合物により、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。

（実施例２４）
前立腺癌細胞株に対するＡＧＸ５１および本技術の化合物の効果
前立腺癌細胞株ＤＵ１４５およびＰＣ３（１０％ＢＣＳ）を、１０％ＢＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）および適切な抗生物質（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ファンギゾン（ｆｕｎｇｉｚａｏｎｅ）、およびゲンタマイシン（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））を含有するＨａｍ’ｓＦ１２（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）培地中で培養する。すべての細胞を、５％ＣＯ₂を含有する完全加湿雰囲気下で３７℃にて培養する。
５０％コンフルエンスで、細胞を、１００μＭのＤＭＳＯ、ＡＧＸ５１、または本技術の化合物（ＡＧＸ－Ａなど）のいずれかで処理する。細胞の形態および増殖を、形態の変化または細胞死について顕微鏡検査によって１週間毎日監視する。アポトーシスは、Ｐｒｏｍｅｇａ（（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ３／７アッセイシステムを使用して、カスパーゼ３およびカスパーゼ７の活性を測定することによって決定する。

ＡＧＸ５１および本技術の化合物は、ＤＵ１４５細胞に対して顕著な効果を示すと予想される：３日後、細胞は非常に不健康に見え、対照と比較して増殖することができなくなる。さらに、６日後、ＤＵ１４５細胞をＡＧＸ５１、または本技術の化合物のいずれかで処理すると、細胞死が起こる。本技術の化合物により、ＡＧＸ５１と比較して、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。
前立腺癌細胞に対する本技術の化合物の効果の根底にある分子メカニズムを、アポトーシスの主要なメディエーターであるカスパーゼ３／７の活性を測定することによって評価する。低濃度の本技術の化合物によって、ＤＵ１４５細胞とＰＣ３細胞の両方でカスパーゼ３／７の有意な増加がもたらされ、これは、既知のアポトーシス誘導剤であるスタウロスポリン（１０μｍ）で処理された細胞のカスパーゼ活性よりも高くなると予想される。

（実施例２５）
マウスのマトリゲルアッセイにおける抗血管新生活性に対するＡＧＸ５１および本技術の化合物の効果
ＶＥＧＦ－１６５およびＦＧＦ－２で処理されたマトリゲルプラグを、０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスに移植する。マウスを、ビヒクル、ＡＧＸ５１、または本技術の化合物（ＡＧＸ－Ａなど）のいずれかで処置する。ＡＧＸ５１および本技術の化合物を、プラグ（２５μｇ／ｍｇ）または１０日間の毎日のｉｐ処置（３０または１００ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで提供する。プラグを、１０日目に採取し、固定し、パラフィン包埋する。各プラグの３つの切片（厚さ５μＭ）を抗ＣＤ３１抗体で染色し、ヘマトキシリンおよびエオジン染色で対比染色する。ＣＤ３１陽性微小血管を、プラグごとに１つの断面全体について計数し、平均微小血管密度±ＳＤ血管を決定する。スチューデントのｔ検定を、統計分析に使用する。

ビヒクル対照動物と比較して、ＡＧＸ５１または本技術の化合物による処置により、新しい血管形成からの有意な保護が提供されると予想される。マトリゲルプラグの切片の典型的な写真は、ビヒクルのみの対照における完全な血管の存在を示すと予想される。対照的に、内皮細胞の存在は、ＡＧＸ５１または本技術の化合物を用いた処置により有意に減少すると予想される。本技術の化合物により、ＡＧＸ５１と比較して、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。

（実施例２６）
ＬＬＣマウスモデルの転移活性に対するＡＧＸ５１および本技術の化合物の効果
３０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、７．５×１０⁵のＬＬＣ癌細胞／動物を移植する。移植の７日後、群あたり５Ｍ／５Ｆを、投与ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＡＧＸ５１、または本技術の化合物（ＡＧＸ－Ａなど）で２５日間毎日ｉｐ処置する。移植の１４日後、５Ｍ／５Ｆ動物の別の群を、５０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１で１８日間毎日ｉｐで処置し、５Ｍ／５Ｆ動物の別の群を、本技術の化合物（ＡＧＸ－Ａなど）で１８日間毎日ｉｐ処置する。腫瘍を、７日目から１４日目まで３回測定する。１４日目に腫瘍を切除する。動物を、切除後３２日目、１８日目に肺転移の存在について剖検する。ＡＧＸ５１および本技術の化合物による処置により、肺転移が大幅に減少すると予想される。さらに、本技術の化合物により、ＡＧＸ５１と比較して、同様のまたは著しく改善された効果が示されることが期待される。

均等物
ある特定の実施形態が図示および説明されているが、当業者は、前述の明細書を読んだ後、本明細書に記載の本技術の化合物、または、それらの塩、医薬組成物、誘導体、プロドラッグ、代謝産物、互変異性体またはラセミ混合物に対し、変更、均等物の置換、および他のタイプの変更を行うことができる。上記の各態様および実施形態はまた、他の態様および実施形態のいずれかまたはすべてに関して開示されるような変形または態様を含むか、またはそれをもって組み込むことができる。
本技術はまた、本技術の個々の態様の単一の例示として意図されており、本明細書に記載の特定の態様に関して限定されるべきではない。この本技術の多くの修正および変形は、当業者には明らかであるように、その精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に列挙されたものに加えて、本技術の範囲内の機能的に均等の方法は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正および変形は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。この本技術は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、標識化合物、または生物学的システムに限定されず、もちろん変化する可能性があることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。したがって、本明細書は、添付の特許請求の範囲、その中の定義、およびそれらの均等物によってのみ示される、本技術の幅、範囲、および精神に関し、例示としてのみ考慮されることが意図されている。

本明細書に例示的に記載されている実施形態は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または限定がない場合でも、好適に実施することができる。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、広範かつ限定なしに読まれるものとする。さらに、本明細書で使用されている用語および表現は、説明の用語として用いるものであり、限定ではなく、そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の均等物を排除することを意図するものではなく、特許請求の範囲に記載される技術の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。さらに、「本質的にからなる」という句は、具体的に列挙された要素と、特許請求の範囲に記載される技術の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさない追加の要素を含むと理解される。「からなる」という句は、明記されていない、いかなる要素をも除外する。

加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群の観点から記載されている場合、当業者は、本開示が、それによって、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位群の観点からも記載されていることを認識するであろう。一般的な開示の範囲内にあるより狭い種および亜族の集団の各々も、本発明の一部を形成する。これは、切除された材料が本明細書に特に列挙されるか、されないかにかかわらず、任意の主題を属から取り除く条件または否定的な制限を有する本発明の一般的記述を含む。

当業者によって理解されるように、あらゆる目的のために、特に書面による説明を提供するという観点から、本明細書に開示されるすべての範囲はまた、あらゆる可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせを包含する。列挙された範囲はどれも、同じ範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解できるように十分に記述していると簡単に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下３分の１、中３分の１、および上３分の１などに容易に分解することができる。当業者によってまた理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などのすべての言語は、列挙された数を含み、その後に上記のように部分範囲に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は、個々のメンバーを含む。

本明細書において参照される全ての刊行物、特許出願、交付済み特許、および他の文書（例えば、定期刊行物、記事、および／または教科書）は、各個々の刊行物、特許出願、交付済み特許、または他の文書が、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。参照によって組み込まれる記載内容に含まれる定義は、それらが本開示における定義に矛盾する限り除外される。
本技術は、以下の文字付き項に列挙されている特徴および特徴の組み合わせを含み得るが、これらに限定されるものではなく、以下の段落は、本書に添付されている特許請求の範囲を限定するものとして、またそのようなすべての機能が必然的にそのような特許請求の範囲に含まれなければならないことを義務付けるものとして、解釈されるべきではないことを理解すべきである。
Ａ．式Ｉ

(I)
による化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
（式中、
Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリアルキルアンモニウム、ペンタフルオロスルファニル、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹⁰）（Ｒ¹¹）であり；
Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリアルキルアンモニウム、ペンタフルオロスルファニル、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹²）（Ｒ¹³）であり；
Ｒ⁸は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ⁹はＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、またはフルオロであり；
Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、およびＲ¹³は、それぞれ独立してＣ₁－Ｃ₃アルキルである）
Ｂ．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹⁰）（Ｒ¹¹）である、Ａ項の化合物。
Ｃ．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、Ａ項またはＢ項の化合物。
Ｄ．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³が、それぞれ独立してＨ、メチル、メトキシ、イソプロピル、イソプロポキシ、フルオロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、Ａ～Ｃ項のいずれか１項の化合物。
Ｅ．Ｒ³が、メトキシである、Ａ～Ｄ項のいずれか１項の化合物。
Ｆ．Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹²）（Ｒ¹³）である、Ａ～Ｅ項のいずれか１項の化合物。
Ｇ．Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、Ａ～Ｆ項のいずれか１項の化合物。
Ｈ．Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷が、それぞれ独立してＨ、メチル、メトキシ、イソプロピル、イソプロポキシ、フルオロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、Ａ～Ｇ項のいずれか１項の化合物。
Ｉ．Ｒ⁶が、イソプロポキシである、Ａ～Ｈ項のいずれか１項の化合物。
Ｊ．式ＩＡ

(IA)
のものである、Ａ～Ｉ項のいずれか１項の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
Ｋ．式ＩＢ

(IA)
のものである、Ａ～Ｉ項のいずれか１項の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
（式中、
Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリアルキルアンモニウム、ペンタフルオロスルファニル、ハロ、アリールオキシ、アリーロイル、ヒドロキシル、アミノ、またはアミドである）
Ｌ．Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、アリールオキシ、アリーロイル、または－Ｎ（Ｃ₁－Ｃ₃アルキル）₂である、Ｋ項の化合物。
Ｍ．Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、Ｋ項またはＬ項の化合物。
Ｎ．Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶が、それぞれ独立してＨ、メチル、メトキシ、イソプロピル、イソプロポキシ、フルオロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、Ｋ～Ｍ項のいずれか１項の化合物。
Ｏ．Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶が、それぞれ独立してＨである、Ｋ～Ｎ項のいずれか１項の化合物。
Ｐ．

である、Ａ～Ｏ項のいずれか１項の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
Ｑ．式ＩＣ

(IC)
のものである、Ａ～Ｏ項のいずれか１項の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
Ｒ．

である、Ａ～Ｑ項のいずれか１項の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。

Ｓ．Ａ～Ｒ項のいずれか１項の化合物；および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
Ｔ．対象における病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患を処置するための有効量のＡ～Ｒ項のいずれか１項の化合物；および
薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
Ｕ．病原性血管増殖性疾患が、癌疾患または状態に関連する病原性血管新生を含む、Ｔ項の医薬組成物。
Ｖ．病原性血管増殖性疾患が、眼疾患を含む、Ｔ項またはＵ項の医薬組成物。

Ｗ．病原性血管増殖性疾患が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、鎌状細胞網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、血管新生黄斑変性症または眼癌、からなる群から選択される、Ｔ～Ｖ項のいずれか１項の医薬組成物。
Ｘ．病原性血管増殖性疾患が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む、Ｔ～Ｗ項のいずれか１項の医薬組成物。
Ｙ．病原性血管増殖性疾患が、ウェット型、滲出型加齢性黄斑変性症を含む、Ｔ～Ｘ項のいずれか１項の医薬組成物。

Ｚ．癌が、胆管癌、トリプルネガティブ乳癌、または結腸直腸癌を含む、Ｔ～Ｙ項のいずれか１項の医薬組成物。
ＡＡ．非経口投与、静脈内投与、皮下投与、および／または経口投与用に製剤化されている、Ｔ～Ｚ項のいずれか１項の医薬組成物。
ＡＢ．薬学的に許容される担体が２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含む、Ｔ～ＡＡ項のいずれか１項の医薬組成物。
ＡＣ．新生物に罹患している哺乳動物対象用に製剤化されている、Ｔ～ＡＢ項のいずれか１項の医薬組成物。
ＡＤ．新生物に罹患しているかまたは新生物の病歴を提示している哺乳動物対象用に製剤化されている、Ｔ～ＡＣ項のいずれか１項の医薬組成物。

ＡＥ．新生物に罹患しているかまたは以前に新生物の処置を受けて臨床的に寛解した哺乳動物対象用に製剤化されている、Ｔ～ＡＤ項のいずれか１項の医薬組成物。
ＡＦ．病原性血管新生によって媒介される、または病原性血管新生が寄与する状態に罹患している哺乳動物対象用に製剤化されている、Ｔ～ＡＥ項のいずれか１項の医薬組成物。
ＡＧ．対象の状態を処置するための方法であって、状態を処置するためのＡ～Ｒ項のいずれか１項の化合物を有効量で対象に投与することを含み、状態が、病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患のうちの１種または複数種を含む、方法。
ＡＨ．病原性血管増殖性疾患が、癌疾患または状態に関連する病原性血管新生を含む、ＡＧ項の方法。
ＡＩ．病原性血管増殖性疾患が、眼疾患を含む、ＡＧ項またはＡＨ項の方法。
ＡＪ．病原性血管増殖性疾患が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、鎌状細胞網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、血管新生黄斑変性症または眼癌、からなる群から選択される、ＡＧ～ＡＩ項のいずれか１項の方法。
ＡＫ．Ｘ．病原性血管増殖性疾患が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む、ＡＧ～ＡＪ項のいずれか１項の方法。
ＡＬ．病原性血管増殖性疾患が、ウェット型、滲出型加齢性黄斑変性症を含む、ＡＧ～ＡＫ項のいずれか１項の方法。
ＡＭ．癌が、胆管癌、トリプルネガティブ乳癌、または結腸直腸癌を含む、ＡＧ～ＡＬ項のいずれか１項の方法。
ＡＮ．医薬組成物が、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、および／または経口投与用に製剤化されている、ＡＧ～ＡＭ項のいずれか１項の方法。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲が与えられている均等物の全範囲とともに、そのような特許請求の範囲に記載される。

Claims

式Ｉ

(I)
による化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
（式中、
Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリアルキルアンモニウム、ペンタフルオロスルファニル、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹⁰）（Ｒ¹¹）であり；
Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリアルキルアンモニウム、ペンタフルオロスルファニル、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹²）（Ｒ¹³）であり；
Ｒ⁸は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ⁹はＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、またはフルオロであり；
Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、およびＲ¹³は、それぞれ独立してＣ₁－Ｃ₃アルキルである）
Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹⁰）（Ｒ¹¹）である、請求項１に記載の化合物。
Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、請求項１に記載の化合物。
Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³が、それぞれ独立してＨ、メチル、メトキシ、イソプロピル、イソプロポキシ、フルオロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、請求項１に記載の化合物。
Ｒ³がメトキシである、請求項１に記載の化合物。
Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｒ¹²）（Ｒ¹³）である、請求項１に記載の化合物。
Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、請求項１に記載の化合物。
Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷が、それぞれ独立してＨ、メチル、メトキシ、イソプロピル、イソプロポキシ、フルオロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、請求項１に記載の化合物。
Ｒ⁶がイソプロポキシである、請求項１に記載の化合物。
式ＩＡ

(IA)
のものである、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
式ＩＢ

(IA)
のものである、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
（式中、
Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶は、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリアルキルアンモニウム、ペンタフルオロスルファニル、ハロ、アリールオキシ、アリーロイル、ヒドロキシル、アミノ、またはアミドである）
Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、アリールオキシ、アリーロイル、または－Ｎ（Ｃ₁－Ｃ₃アルキル）₂である、請求項１１に記載の化合物。
Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶が、それぞれ独立してＨ、Ｃ₁－Ｃ₃アルキル、Ｃ₁－Ｃ₃アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、請求項１１に記載の化合物。
Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶が、それぞれ独立してＨ、メチル、メトキシ、イソプロピル、イソプロポキシ、フルオロ、または－Ｎ（Ｍｅ）₂である、請求項１１に記載の化合物。
Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、およびＲ¹⁶が、それぞれ独立してＨである、請求項１１に記載の化合物。
である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
式ＩＣ

(IC)
のものである、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
請求項１～１８のいずれか１項に記載の化合物；および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
対象における病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患を処置するための請求項１～１８のいずれか１項に記載の有効量の化合物；および
薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
前記病原性血管増殖性疾患が、癌疾患または状態に関連する病原性血管新生を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
前記病原性血管増殖性疾患が、眼疾患を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
前記眼疾患が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、鎌状細胞網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、血管新生黄斑変性症または眼癌、からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
前記病原性血管増殖性疾患が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
前記病原性血管増殖性疾患が、ウェット型、滲出型加齢性黄斑変性症を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
前記癌が、胆管癌、トリプルネガティブ乳癌、または結腸直腸癌を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
非経口投与、静脈内投与、皮下投与、および／または経口投与用に製剤化されている、請求項２０に記載の医薬組成物。
前記薬学的に許容される担体が、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
新生物に罹患している哺乳動物対象用に製剤化されている、請求項２０に記載の医薬組成物。
新生物に罹患しているかまたは新生物の病歴を提示している哺乳動物対象用に製剤化されている、請求項２０に記載の医薬組成物。
新生物に罹患しているかまたは以前に新生物の処置を受けて臨床的に寛解した哺乳動物対象用に製剤化されている、請求項２０に記載の医薬組成物。
病原性血管新生によって媒介される、または病原性血管新生が寄与する状態に罹患している哺乳動物対象用に製剤化されている、請求項２０に記載の医薬組成物。
対象の状態を処置するための方法であって、前記状態を処置するための請求項１～１８のいずれか１項に記載の化合物を前記対象に有効量で投与することを含み、前記状態が、病原性細胞増殖、血管新生、癌、転移性疾患、および／または病原性血管増殖性疾患のうちの１種または複数種を含む、方法。
前記病原性血管増殖性疾患が、癌疾患または状態に関連する病原性血管新生を含む、請求項３３に記載の方法。
前記病原性血管増殖性疾患が、眼疾患を含む、請求項３３に記載の方法。
前記病原性血管増殖性疾患が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、鎌状細胞網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、血管新生黄斑変性症または眼癌、からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
前記病原性血管増殖性疾患が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む、請求項３３に記載の方法。
前記病原性血管増殖性疾患が、ウェット型、滲出型加齢性黄斑変性症を含む、請求項３３に記載の方法。
前記癌が、胆管癌、トリプルネガティブ乳癌、または結腸直腸癌を含む、請求項３３に記載の方法。
非経口投与、静脈内投与、皮下投与、および／または経口投与による前記化合物の投与を含む、請求項３３に記載の方法。