JP2022549172A - Gipr抗体及びglp-1とのその融合タンパク質、並びにその医薬組成物及び用途 - Google Patents
Gipr抗体及びglp-1とのその融合タンパク質、並びにその医薬組成物及び用途 Download PDFInfo
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Abstract
GIPR抗体及びそれとGLP-1との間の融合タンパク質、並びにその医薬組成物が提供される。さらに、GIPR抗体及びそれとGLP-1との間の融合タンパク質を使用して、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、2型糖尿病、又は肥満症の中の1つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための方法が提供される。【選択図】なし
Description
本明細書には、GIPRに特異的に結合する抗体及びGLP-1とのその融合タンパク質、並びにその医薬組成物が提供される。非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、2型糖尿病又は肥満の1つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するために、GIPR抗体及びGLP-1とのその融合タンパク質を使用するための方法も、本明細書において提供される。
消化管抑制ポリペプチド(GIP)は、摂食後に腸管K細胞によって分泌されるポリペプチドホルモンであり、42-及び30-アミノ酸ペプチドの2つのアイソフォームを含む。GIPは、膵β細胞の表面における胃抑制ポリペプチド受容体(GIPR)を活性化することによってインスリン分泌の生理学的過程に関与する(Tseng et al.,1996,J.Clin.Invest.98:2440-2445;Ravn et al.,2013,J.Biol.Chem.288:19760-72)。GIPの古典的な生物学的機能は、GLP-1に類似しているため、これらのぺプチドホルモンは、インクレチンと総称される。GIPRは、膵臓、骨、心臓、胃、腸及び脂肪組織を含む多くの組織に広く分布しており(Peter et al.,2013,J.Biol.Chem.288:19760-72)、この多様な分布は、GIP/GIPR経路が、血糖調節を超える生物学的機能を有することを示唆している。実験的証拠は、GIP/GIPRシグナル伝達経路が、これらの組織における脂質代謝に少なくとも密接に関係していることを示す(Yip and Wolfe,2000,Life Sci.66:91-103)。実験データはまた、肥満又は糖尿病患者において血液循環GIP濃度の増加があることも示す(Creutzfeldt et al.,1978,Diabetologia 14:15-24;Flatt et al.,1984,J.Endocrinol.101:249-256;Salera et al.,1982,J.Clin.Endocrinol.Metab.55:329-336;Vilsboell et al.,2003,J.Clin.Endocrinol.Metab.88:2706-2713)。GIPRシグナルをGIPR阻害剤でブロックした後、有意な体重減少、インスリン抵抗性の低下及びさらに2型糖尿病の改善が、高脂肪食によって誘導された肥満マウスにおいて観察された(Ravn et al.,2013,J.Biol.Chem.288:19760-72)。
長時間作用型グルカゴン様ペプチド-1類似体(GLP-1類似体)は、新世代の、且つ最も有効な2型糖尿病薬である(Tomlinson et al.,2015,Expert Opin.Investig.Drugs 25:1744-7658;Gallwitz,2015,Eur.Endocr.11:21-25)。長時間作用型GLP-1薬はまた、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の治療のための臨床試験において試験されている。研究は、長時間作用型GLP-1薬が、NAFLDの患者において、肝組織モルホロジーの改善、アラニンアミノトランスフェラーゼ/グルタチオンアミノトランスフェラーゼ比及び肝臓脂肪含量の低下に有意な効果を与えることを示す(Samson et al.,2013,J.Diabetes Complications 27:401-6;Portillo-Sanchez and Cusi,2016,Clin.Diabetes Endocrinol.2:9)。
GLP-1薬とGIPR阻害剤とを一緒に使用することができれば、これら2つが一緒になった組合せ又は融合体を含め、それによってインスリン抵抗性を改善すると同時に過剰な脂肪蓄積(肥満)を減少させる効果が実現し得る。これに関して、血中グルコースが減少し、脂質代謝が増加するが、ここではGLP-1部分がグルコース代謝を改善し、食欲及び体重を減少させ、及びGIPR抗体部分が脂肪のさらなる蓄積を減少させて、肝機能を改善する。GIPR抗体の脂肪減少効果及びGLP-1の体重減少効果を用いて、非アルコール性脂肪肝疾患/非アルコール性脂肪性肝炎を相乗的に処置し得る。本開示は、非アルコール性脂肪肝疾患/非アルコール性脂肪性肝炎、2型糖尿病及び肥満のうちの1つ又は複数の疾患に罹患した患者に利益を与える融合タンパク質薬剤を提供する。
GIPRに特異的に結合する抗体であって、GIPRのアンタゴニストである抗体が、本明細書において提供される。
1、2、3、4、5又は6つのアミノ酸配列を含む、GIPRに特異的に結合する抗体であって、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;
d.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
e.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29;
f.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される、抗体も、本明細書において提供される。
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;
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d.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
e.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29;
f.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される、抗体も、本明細書において提供される。
GIPRに特異的に結合する抗体、及び1、2、3、4、5、6、7又は8つのGLP-1フラグメントを含むGLP-1融合タンパク質であって;融合タンパク質が、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合するか、又はGLP-1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端と結合する、GLP-1融合タンパク質が、本明細書においてさらに提供される。
GIPR抗体及び2つのGLP-1フラグメントを含むGLP-1融合タンパク質であって;融合タンパク質が、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体の軽鎖のアミノ末端と結合し:N’-GLP-1-リンカー-R-C’;又はGLP-1フラグメントのカルボキシ末端が、GIPR抗体の重鎖のアミノ末端に結合し:N’-GLP-1-リンカー-R-C’;ここで:N’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、C’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のカルボキシ末端を表し、GLP-1が、GLP-1フラグメントを表し、Rが、GIPR抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列であり、リンカーが、ペプチドリンカーを表す、GLP-1融合タンパク質が、本明細書において提供される。
本明細書に記載されるGIPR抗体をコードするポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。
本明細書に記載されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。
本明細書に記載されるGIPR抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、本明細書において提供される。
本明細書に記載されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、本明細書において提供される。
本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞が、本明細書において提供される。
本明細書に記載されるGIPR抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
本明細書に記載されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物が、本明細書において提供される。非アルコール性脂肪性肝炎疾患の処置、予防又は改善のための薬剤の調製における、本明細書に記載されるGIPR抗体の使用が、本明細書においてさらに提供される。
非アルコール性脂肪性肝炎疾患を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
2型糖尿病を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるGIPR抗体の使用が、本明細書において提供される。
2型糖尿病を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
体重を減少させるか、又は肥満及び肥満関連疾患を処置、予防若しくは改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるGIPR抗体の使用が、本明細書において提供される。
体重を減少させるか、又は肥満及び肥満関連疾患を処置、予防若しくは改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
非アルコール性脂肪性肝炎疾患、肥満、又は2型糖尿病のうちの2つ以上の疾患を同時に処置、予防若しくは改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるGIPR抗体の使用が、本明細書において提供される。
非アルコール性脂肪性肝炎疾患、肥満、又は2型糖尿病のうちの2つ以上の疾患を同時に処置、予防若しくは改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
非アルコール性脂肪性肝炎の1つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるGIPR抗体を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
非アルコール性脂肪性肝炎の1つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
2型糖尿病の1つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるGIPR抗体を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
2型糖尿病の1つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
肥満の1つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるGIPR抗体を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
肥満の1つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
定義
本明細書において特に定義されない限り、科学用語及び技術用語は、当業者によって理解される意味を有するものとする。一般に、薬理学、生物学、生化学、細胞及び組織培養、生物学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連する命名法及び技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。
本明細書において特に定義されない限り、科学用語及び技術用語は、当業者によって理解される意味を有するものとする。一般に、薬理学、生物学、生化学、細胞及び組織培養、生物学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連する命名法及び技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。
本発明は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示すために標準的な一文字又は三文字略語を使用した。ポリペプチド配列が記載される場合、アミノ基を有する第1のアミノ酸残基(N’)は、左端にあり、カルボキシル基を有する最後のアミノ酸残基(C’)は、右端にある、例えば、本発明に係るGLP-1フラグメント配列:配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、及び配列番号109である。逆ポリペプチド配列は、アミノ酸がオリジナルに対して逆の順序で配置されたポリペプチド配列、例えば、上記のGLP-1フラグメント配列から変換された逆GLP-1フラグメント配列:配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、及び配列番号123を指す。一本鎖及び二本鎖核酸配列の上鎖(upstream chain)の5’末端が左側にあり、それらの3’末端が右側にある。ポリペプチドの特定の部分は、アミノ酸80~130などのアミノ酸残基数によって表されるか、又はLys80~Lys130などの、その部位の実際の残基によって表され得る。特定のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、参照配列とのその相違を示すことによって表すこともできる。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合された2つ以上のアミノ酸を含む分子を指す。これらの用語は、例えば、天然及び人工タンパク質及びタンパク質配列のペプチド類似体(突然変異タンパク質、変異体及び融合タンパク質など)並びに翻訳後、或いは共有結合的に又は非共有結合的に修飾されたタンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、モノマー又はポリマーであり得る。
「ポリペプチドフラグメント」という用語は、対応する完全長タンパク質からのアミノ末端及び/又はカルボキシル末端欠失を有するポリペプチドを指す。例えば、フラグメント長さは、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150、又は200アミノ酸であり得る。フラグメント長さは、例えば、最大で1000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11、又は10アミノ酸であり得る。フラグメントは、一方の末端又は両方において1つ又は複数のさらなるアミノ酸、例えば、異なる天然タンパク質からのアミノ酸配列(例えば、Fc又はロイシンジッパードメイン)又は人工アミノ酸配列(例えば、人工結合配列)をさらに含み得る。
本発明のペプチドは、任意の理由で及び任意の手段によって、例えば、(1)タンパク質分解に対する感受性を低下させ、(2)酸化に対する感受性を低下させ、(3)タンパク質複合体を形成するように親和性を改変し、(4)結合親和性を改変し、(5)他の物理化学的又は機能的特性を与えるか又は調節することによって修飾されたペプチドを含む。類似体は、ポリペプチドの突然変異タンパク質を含む。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)は、天然配列中で行われ得る(例えば、分子内接触を形成するポリペプチドのドメインの外部)。「保存的アミノ酸置換」は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させないものである(例えば、アミノ酸の置換は、親配列に存在するヘリックスを破壊すべきでなく、又は親配列にその特性又は機能を与えるために必要とされる他の二次的な構造タイプに干渉すべきでない)。
ポリペプチドの「突然変異体」は、アミノ酸配列が、別のポリペプチド配列と比べてアミノ酸配列中の1つ又は複数の残基の挿入、欠失、及び/又は置換を含む。本発明の変異体は、融合タンパク質を含んでいた。
ポリペプチドの「誘導体」は、ポリエチレングリコール、アルブミン(ヒト血清アルブミンなど)、リン酸化、及びグリコシル化などの、例えば他の化学部分への結合によって化学修飾されたポリペプチドである。
特に記載しない限り、「抗体」という用語は、2つの完全長重鎖及び2つの完全長軽鎖を含む抗体、並びにそれらの誘導体、変異体、フラグメント、及び突然変異タンパク質を含み、その例は後述される。
「抗体」という用語は、抗原結合部分、及び任意選択的に、抗原への抗体の結合を促進する立体配座を抗原結合部分が取るのを可能にする足場又はフレームワーク部分を含むタンパク質である。抗体の例としては、完全抗体、抗体フラグメント(抗体の抗原結合部分など)、抗体誘導体、及び抗体類似体が挙げられる。抗体は、グラフトされたCDR又はCDRの誘導体を含む、代替的なタンパク質足場又は人工足場を含み得る。足場には、限定はされないが、抗体の三次元構造を安定化させるために導入される抗体由来の足場、及び生体適合性ポリマーなどを含む完全合成足場が含まれる。例えば、Korndorfer et al.,2003,Proteins 53:121-129;Roque et al.,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654を参照のこと。加えて、抗体は、モックペプチド抗体(「PAM」)又は足場と同様のフィブリンコネキシンを用いるモック抗体を含有する足場のいずれかであってもよい。
抗体は、天然免疫グロブリンなどの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然免疫グロブリンにおいて、各四量体は、2つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、「軽」鎖(約25kDa)及び「重」鎖(約50~70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端は、主に抗原認識に関連している約100~110のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシル末端は、主にエフェクターの効果に関連している定常領域を画定する。ヒト抗体軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、α、又はεに分類され、IgM、IgD、IgG、IgA、及びIgEなどの同じタイプの抗原を画定した。軽鎖及び重鎖内で、可変及び定常領域は、約12以上のアミノ酸の「J」領域によって結合され、重鎖は、約10超のアミノ酸の「D」領域も含む。Fundamental Immunology ch.7(edited by Paul,2nd edition,Raven Press,1989)を参照されたい。各軽鎖/重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成し、このようにして完全な免疫グロブリンが、2つの結合部位を有する。
天然免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域又はCDRとしても知られている、3つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域(FR)の同じ基本構造を示す。N末端からC末端へと、軽鎖及び重鎖は、構造ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4を含む。全ての構造ドメイン中のアミノ酸の分布は、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edition,U.S.Dept.Of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication No.91-3242,1991と一致していた。
特に規定されない限り、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン、又は結合についてインタクトな抗体と特異的に競合し得る、その抗原結合部分のいずれかを意味する。抗原結合部分は、組み換えDNA技術、インタクトな抗体の酵素的若しくは化学的切断によって産生され得る。抗原結合部分としては、特に、Fab、Fab’、F(ab)2、Fv、構造ドメイン抗体(dAb)が挙げられ、相補性決定領域(CDR)を含むフラグメント、一本鎖抗体(scFv)、キメラ抗体、二重鎖抗体(二重特異性抗体)、三重鎖抗体(三重特異性抗体)、四重鎖抗体(四重特異性抗体)及びポリペプチド特異的抗原に結合する免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。
Fabフラグメントは、VL、VH、CL、及びCH1ドメインを有する一価フラグメントであり;F(ab’)2フラグメントは、ヒンジ領域においてジスルフィド結合によって連結された2つのFabフラグメントを有する二価フラグメントであり;Fvフラグメントは、VH及びVLドメインを有し;dAbフラグメントは、VHドメイン、VLドメイン、又はVH若しくはVLドメインの抗原結合フラグメントを有する(米国特許第6,846,634号明細書及び米国特許第6,696,245号明細書;米国特許出願公開第2005/0202512号明細書、米国特許出願公開第2004/0202995号明細書、米国特許出願公開第2004/0038291号明細書、米国特許出願公開第2004/0009507号明細書、及び米国特許出願公開第2003/0039958号明細書;Ward et al.,1989,Nature 341:544-546)。
一本鎖抗体(scFv)は、VL及びVH領域がリンカー(例えば、アミノ酸残基の合成配列)を介して結合されて、連続タンパク質抗体を形成する融合タンパク質であり、ここで、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体で折り畳まれて、一価抗原結合部位を形成するのを可能にするのに十分に長い(例えば、Bird et al.,1988,Science 242:423-26;及びHuston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-83を参照)。
二重鎖抗体は、2つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、ポリペプチド鎖はそれぞれ、同じ鎖上の2つのドメインの対形成を可能にしないほど短いリンカーによって結合されたVH及びVL領域を含む。したがって、各ドメインが、別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対形成するのを可能にする(例えば、Holliger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-48;Poljak et al.,1994,Structure 2:11 21-23を参照)。二重鎖抗体の2つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成から生じる二重鎖抗体は、同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いて、異なる抗原結合部位を有する二重鎖抗体を作製することができる。同様に、三重鎖及び四重鎖抗体は、3つ及び4つのポリペプチド鎖を含み、同じか又は異なり得る3つ及び4つの抗原結合部位を形成する抗体である。
本明細書では、Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edition,U.S.Dept.Of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication No.91-3242,1991においてKabatらが説明している方法を用いて、所与の抗体の相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)を同定する。1つ又は複数のCDRを、共有結合的又は非共有結合的に分子中に組み込んで、それを抗体にし得る。抗体は、より大きいポリペプチド鎖をCDRに組み込むことができる。CDRは、別のポリペプチド鎖に共有結合することができ、又はCDRに非共有結合的に組み込むことができる。CDRは、抗体が、該当する特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
抗体は、1つ又は複数の結合部位を有し得る。2つ以上の結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であっても又は異なっていてもよい。例えば、天然ヒト免疫グロブリンは、通常、2つの同一の結合部位を有する一方、「二重特異性」又は「二機能性」抗体は、2つの異なる結合部位を有する。
「マウス抗体」という用語は、マウス免疫グロブリン配列に由来する1つ又は複数の可変及び定常領域を有する抗体を含む。
「ヒト化抗体」という用語は、マウス抗体分子の相補性決定領域の配列を、ヒト抗体可変領域のフレームワークにグラフトすることによって作製される抗体である。
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、又は「抗原結合部位」という用語は、抗原と相互作用し、抗原に対する抗体の特異性及び親和性に寄与するアミノ酸残基を含む抗体の部分である。それらの抗原に特異的に結合する抗体については、これは、そのCDRドメインの少なくとも1つの少なくとも一部を含む。
「エピトープ」という用語は、抗体に(例えば、抗体によって)結合する分子の部分である。エピトープは、分子の非隣接部分(例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列において隣接していないが、ポリペプチドの三次及び四次構造において、抗体によって互いに結合されるのに十分に近いアミノ酸残基)を含み得る。
2つのポリヌクレオチド又は2つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、GAPコンピュータプログラム(GCG Wisconsin Package;version 10.3(Accelrys,San Diego,CA)の一部)のデフォルトパラメータ比較配列を用いて決定される。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、全文を通して同義的に使用され、DNA分子(例えば、cDNA又はゲノムDNA)、RNA分子(例えば、mRNA)、ヌクレオチド類似体(例えば、ペプチド核酸及び非天然ヌクレオチド類似体)を用いて生成されるDNA又はRNA類似体並びにそれらのハイブリッドを含み得る。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得る。一実施形態において、本発明に含まれる核酸分子は、抗体又はそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、若しくは変異体隣接オープンリーディングフレームをコードする。
2つの一本鎖ヌクレオチドは、それらの配列が逆平行であり得る場合、互いに「相補的」であり、一方のポリヌクレオチド中の各ヌクレオチドが、他方のポリヌクレオチド中の相補的ヌクレオチドと反対であり、ギャップが導入されず、各配列の5’又は3’末端に対形成しないヌクレオチドが見られないようになっている。2つのポリヌクレオチドが、中程度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズし得る場合、一方のポリヌクレオチドは、他方のポリヌクレオチドと「相補的」である。したがって、一方のポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドに相補的であり得るが、その相補配列でない。
「担体(carrier)」という用語は、それに連結された別の核酸を細胞内に導入するのに使用され得る核酸である。担体の1つのタイプは、「プラスミド」であり、さらなる核酸セグメントに結合可能な直鎖状又は環状二本鎖DNA分子を指す。担体の別のタイプは、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)であり、ここで、さらなるDNAセグメントが、ウイルスゲノム内に導入され得る。一部の担体は、それらが導入された宿主細胞において自己複製可能である(例えば、細菌複製起点を含む細菌担体及び遊離型(free-type)哺乳動物担体)。他の担体(例えば、非遊離型哺乳動物担体)は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。「発現担体」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を指令し得る担体のタイプである。
制御配列がヌクレオチド配列の発現(例えば、発現のレベル、時間、又は部位)に影響を及ぼす場合、ヌクレオチド配列は、制御配列に「操作可能に連結される」。「制御配列」は、それが操作可能に連結される核酸の発現(例えば、発現のレベル、時間、又は部位)に影響を及ぼす核酸である。制御遺伝子は、例えば、制御される核酸に対して直接、又は1つ又は複数の他の分子(例えば、制御配列及び/又は核酸に結合するポリヌクレオチド)を介して作用する。制御配列の例としては、プロモータ、エンハンサー、及び他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)が挙げられる。制御配列のさらなる例が、Goeddel,1990,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Volume 185,Academic Press,San Diego,CA;及びBaron et al.,1995,Nucleic Acids Res.23:3605-06などに記載され得る。
「宿主細胞」という用語は、本明細書において提供されるものなどの核酸を発現するのに使用される細胞を指す。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)であり得るか、又はそれは、真核生物、例えば、単細胞真核生物(例えば、酵母又は他の真菌)、植物細胞(例えば、タバコ又はトマト植物細胞)、動物細胞(例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞又は昆虫細胞)又はハイブリドーマであり得る。通常、宿主細胞は、宿主細胞において後に発現され得るペプチドコード核酸で形質転換又はトランスフェクトされ得る培養細胞である。「組み換え宿主細胞」という語句は、予測される発現の核酸で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を示すのに使用され得る。宿主細胞はまた、核酸を含むが、制御配列が、核酸と操作可能に連結されるように宿主細胞中に導入されない限り、所望のレベルでその核酸を発現しない細胞であり得る。「宿主細胞」という用語が、特定の被験体の細胞だけでなく、その細胞の子孫又は潜在的な子孫も指すことが理解されるべきである。続く世代で起こる特定の修飾、例えば、突然変異又は環境的影響のため、このような子孫は、実際に、親細胞と異なり得るが、なお、本発明において使用されるこの用語の範囲内に含まれる。
消化管抑制ペプチド受容体
消化管抑制ペプチド受容体は、7-膜貫通Gタンパク質で結合される受容体のファミリーのタイプBに属する。受容体は、ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)によって1つ又は複数の細胞内シグナル伝達経路に結合される(Drucker et al.,2006,Cell Metab.3:153-65)。これまで、研究は、GIPRが、主に、膵β細胞及び脂肪細胞の表面で発現され(Ravn et al.,2013,J.Biol.Chem.288:19760-72)、ヒトにおいてグルコース及び脂質代謝の両方に関与し、したがって糖尿病、肥満及び関連疾患に密接に関連している(Skaw et al.,2016,Diabetes Obes.Metab.18:847-854)ことを示す。本明細書において使用される「ヒトGIPR」及び「hGIPR」は両方とも、ヒト腸抑制ペプチド受容体を指し、同義的に使用され得る。本明細書において使用される「マウスGIPR」及び「mGIPR」は両方とも、マウス胃抑制ペプチド受容体を指し、これらも同義的に使用され得る。
消化管抑制ペプチド受容体は、7-膜貫通Gタンパク質で結合される受容体のファミリーのタイプBに属する。受容体は、ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)によって1つ又は複数の細胞内シグナル伝達経路に結合される(Drucker et al.,2006,Cell Metab.3:153-65)。これまで、研究は、GIPRが、主に、膵β細胞及び脂肪細胞の表面で発現され(Ravn et al.,2013,J.Biol.Chem.288:19760-72)、ヒトにおいてグルコース及び脂質代謝の両方に関与し、したがって糖尿病、肥満及び関連疾患に密接に関連している(Skaw et al.,2016,Diabetes Obes.Metab.18:847-854)ことを示す。本明細書において使用される「ヒトGIPR」及び「hGIPR」は両方とも、ヒト腸抑制ペプチド受容体を指し、同義的に使用され得る。本明細書において使用される「マウスGIPR」及び「mGIPR」は両方とも、マウス胃抑制ペプチド受容体を指し、これらも同義的に使用され得る。
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒトGIPRに特異的に結合する抗体である。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、細胞膜においてGIPRに特異的に結合する抗体であり、この抗体は、これらの細胞においてGIPシグナルの伝達を阻害又は阻止し得る。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒトGIPRに特異的に結合する抗体であり、抗体は他の種(例えば、サル又はマウス)のGIPRに結合し、これらの種においてGIPシグナル伝達を阻止し得る。さらなる実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒトGIPRに結合し、他の種(例えば、サル)のGIPRに結合し得るマウス抗体である。
一実施形態において、GIPRのアミノ酸及びポリヌクレオチド配列が、以下に列挙され、配列データは、アメリカ国立生物工学情報センター(US national center for biotechnology information)のGene-Bankデータベース及び欧州バイオインフォマティクス研究所(European institute for biological information)のUniprotデータベースから入手される:
ヒト(ホモ・サピエンス(Homo sapiens))ポリヌクレオチド(配列番号114);受託番号:S79852;
ヒト(ホモ・サピエンス(Homo sapiens))アミノ酸(配列番号113);受託番号:AAB35419.2;
サル(アカゲザル(Rhesus macaque))ポリヌクレオチド(配列番号116);受託番号:XM_015124289.1;
サル(アカゲザル(Rhesus macaque))アミノ酸(配列番号115);受託番号:XP_014979775;
マウス(ハツカネズミ(Mus musculus))ポリヌクレオチド(配列番号118);受託番号:CCDS39795;及びマウス(ハツカネズミ(Mus musculus))アミノ酸(配列番号117);受託番号:Q0P543。
ヒト(ホモ・サピエンス(Homo sapiens))ポリヌクレオチド(配列番号114);受託番号:S79852;
ヒト(ホモ・サピエンス(Homo sapiens))アミノ酸(配列番号113);受託番号:AAB35419.2;
サル(アカゲザル(Rhesus macaque))ポリヌクレオチド(配列番号116);受託番号:XM_015124289.1;
サル(アカゲザル(Rhesus macaque))アミノ酸(配列番号115);受託番号:XP_014979775;
マウス(ハツカネズミ(Mus musculus))ポリヌクレオチド(配列番号118);受託番号:CCDS39795;及びマウス(ハツカネズミ(Mus musculus))アミノ酸(配列番号117);受託番号:Q0P543。
消化管抑制ペプチド受容体(GIPR)抗体
一実施形態において、GIPR抗体が、本明細書において提供される。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、完全GIPR抗体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体フラグメントである。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体の誘導体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体突然変異タンパク質である。さらなる実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体の変異体である。
一実施形態において、GIPR抗体が、本明細書において提供される。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、完全GIPR抗体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体フラグメントである。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体の誘導体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体突然変異タンパク質である。さらなる実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPR抗体の変異体である。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1、2、3、4、5、又は6つのアミノ酸配列を含み、これらはそれぞれ、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;
d.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
e.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29;及び
f.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;
d.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
e.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29;及び
f.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
表1は、本明細書において提供されるGIPR抗体の軽鎖CDRのアミノ酸配列、並びに対応するポリヌクレオチドコード配列を列挙している。表2は、本明細書において提供されるGIPR抗体の重鎖CDRのアミノ酸配列、並びに対応するポリヌクレオチドコード配列を列挙している。
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、5、4、3、2又は1つのアミノ酸付加、置換、及び/又は欠失が、表1及び2に列挙されるCDRアミノ酸配列の1つと異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、4、3、2又は1つのアミノ酸付加、置換、及び/又は欠失が、表1及び2に列挙されるCDRアミノ酸配列の1つと異なる配列を含む。
別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、3、2又は1つのアミノ酸付加、置換、及び/又は欠失が、表1及び2に列挙されるCDRアミノ酸配列の1つと異なる配列を含む。
別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、2又は1つのアミノ酸付加、置換、及び/又は欠失が、表1及び2に列挙されるCDRアミノ酸配列の1つと異なる配列を含む。
さらなる実施形態において、本明細書において提供される抗体は、1つのアミノ酸付加、置換、及び/又は欠失が、表1及び2に列挙されるCDRアミノ酸配列の1つと異なる配列を含む。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;及び
b.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26
から選択される。
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;及び
b.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26
から選択される。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;及び
b.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29
から選択される。
a.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;及び
b.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29
から選択される。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1、2、3、又は4つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;及び
b.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
a.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;及び
b.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1、2、3、又は4つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
c.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;及び
d.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29
から選択される。
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
c.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;及び
d.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29
から選択される。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1、2、3、又は4つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;及び
d.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;及び
d.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
さらなる実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1、2、3、又は4つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;
b.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;及び
d.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
a.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;
b.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;及び
d.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1、2、又は3つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17から選択される。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1、2、又は3つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、及び配列番号30から選択される。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せを含む。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せを含む。
さらなる実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せを含む。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、
a.以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せ;及び
b.以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せ
を含む。
a.以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せ;及び
b.以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せ
を含む。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、
a.以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せ;及び
b.以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せ
を含む。
a.以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せ;及び
b.以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せ
を含む。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、
a.以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せ;及び
b.以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せ
を含む。
a.以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せ;及び
b.以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せ
を含む。
さらなる実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、
a.以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せ;
b.以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せ;及び
c.以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せ
を含む。
a.以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せ;
b.以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せ;及び
c.以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せ
を含む。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、
a.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号18、配列番号19、及び配列番号20の組合せ;
b.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号18、配列番号21、及び配列番号22の組合せ;
c.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25の組合せ;
d.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号26、配列番号27、及び配列番号28の組合せ;
e.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号13、配列番号11、配列番号14、配列番号26、配列番号27、及び配列番号28の組合せ;又は
f.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号26、配列番号29、及び配列番号30の組合せ
を含む。
a.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号18、配列番号19、及び配列番号20の組合せ;
b.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号18、配列番号21、及び配列番号22の組合せ;
c.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25の組合せ;
d.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号26、配列番号27、及び配列番号28の組合せ;
e.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号13、配列番号11、配列番号14、配列番号26、配列番号27、及び配列番号28の組合せ;又は
f.軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列:配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号26、配列番号29、及び配列番号30の組合せ
を含む。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖可変ドメインアミノ酸配列:配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、及び配列番号71;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるアミノ酸配列;及び
b.重鎖可変ドメインアミノ酸配列:配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるアミノ酸配列
から選択される。
a.軽鎖可変ドメインアミノ酸配列:配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、及び配列番号71;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるアミノ酸配列;及び
b.重鎖可変ドメインアミノ酸配列:配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるアミノ酸配列
から選択される。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体のポリヌクレオチドコード配列は、1又は2つのポリヌクレオチドコード配列を含み、ここで、各ポリヌクレオチドコード配列が、独立して、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列:
a.軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列:配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、及び配列番号91;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるポリヌクレオチド配列;及び
b.重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列:配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、及び配列番号100;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるポリヌクレオチド配列
から選択される。
a.軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列:配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、及び配列番号91;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるポリヌクレオチド配列;及び
b.重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列:配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、及び配列番号100;及びいずれかの上記の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるポリヌクレオチド配列
から選択される。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、以下のリスト:配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、及び配列番号71から独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、以下のリスト:配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80から独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、以下に列挙される軽鎖及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列:配列番号61及び配列番号72、配列番号62及び配列番号73、配列番号63及び配列番号74、配列番号64及び配列番号74、配列番号65及び配列番号75、配列番号66及び配列番号76、配列番号67及び配列番号77、配列番号68及び配列番号77、配列番号69及び配列番号78、配列番号70及び配列番号79、及び配列番号71及び配列番号80から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含む。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、以下のリスト:配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号73、配列番号74、配列番号76、及び配列番号77から独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、以下に列挙される軽鎖及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列:配列番号61及び配列番号72(L1H1)、配列番号62及び配列番号73(L2H2)、配列番号63及び配列番号74(L3H3)、配列番号64及び配列番号74(L4H3)、配列番号65及び配列番号75(L5H4)、配列番号66及び配列番号76(L6H5)、配列番号67及び配列番号77(L7H6)、配列番号68及び配列番号77(L8H6)、配列番号69及び配列番号78(L9H7)、配列番号70及び配列番号79(L10H8)、及び配列番号71及び配列番号80(L11H9)から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含む。
「LxHy」という記号を用いて、本明細書において提供されるGIPR抗体を示すこともでき、ここで、「x」が、軽鎖可変領域配列コードに対応し、「y」が、重鎖可変領域配列コードに対応する。例えば、L2H2は、配列番号62(L2)アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号73(H2)アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する完全抗体である。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖定常領域アミノ酸配列:配列番号101及び配列番号102;及び
b.重鎖定常領域アミノ酸配列:配列番号103及び配列番号104、及び配列番号124
から選択される。
a.軽鎖定常領域アミノ酸配列:配列番号101及び配列番号102;及び
b.重鎖定常領域アミノ酸配列:配列番号103及び配列番号104、及び配列番号124
から選択される。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙される軽鎖及び重鎖定常領域アミノ酸配列の組合せ:配列番号101及び配列番号103、配列番号101及び配列番号104、配列番号102及び配列番号103、及び配列番号102及び配列番号104から選択される。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙される軽鎖及び重鎖定常領域アミノ酸配列の組合せ:配列番号101及び配列番号124、及び配列番号102及び配列番号124から選択される。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、本明細書に列挙される軽鎖及び重鎖CDR、及びFR(フレームワーク)のアミノ酸配列を含む。FRのアミノ酸配列は、軽鎖又は重鎖可変ドメイン配列に含まれ、別個に示されていない。一実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖CDR1配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖CDR2配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖CDR3配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖CDR1配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖CDR2配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖CDR3配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖FR1配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖FR2配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖FR3配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖FR4配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖FR1配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖FR2配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖FR3配列を含む。さらなる実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖FR4配列を含む。
一実施形態において、抗体の軽鎖CDR3配列は、6、5、4、3、2又は1つ以下のアミノ酸付加、置換、及び/又は欠失が、上に示される軽鎖CDR3配列の配列番号6、配列番号12、及び配列番号14と異なる。別の実施形態において、抗体の重鎖CDR3配列は、6、5、4、3、2又は1つ以下のアミノ酸付加、置換、及び/又は欠失が、上に示される重鎖CDR3配列の配列番号22及び配列番号28と異なる。さらなる実施形態において、抗体の軽鎖CDR3配列は、6、5、4、3、2又は1つ以下のアミノ酸付加、置換、及び/又は欠失が、上に示される軽鎖CDR3配列の配列番号6、配列番号12、及び配列番号14と異なり、抗体の重鎖CDR3配列は、6、5、4、3、2又は1つ以下のアミノ酸付加、置換、及び/又は欠失が、上に示される重鎖CDR3配列の配列番号22及び配列番号28と異なる。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖及び重鎖CDR配列の1、2、3、4、5又は6つの組合せをさらに含む。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、本明細書に列挙されるL2(配列番号62)、L3(配列番号63)、L4(配列番号64)、L6(配列番号66)、L7(配列番号67)、及びL8(配列番号68)軽鎖可変ドメイン配列から選択される軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。一実施形態において、GIPR抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸の相違が、L2(配列番号62)、L3(配列番号63)、L4(配列番号64)、L6(配列番号66)、L7(配列番号67)、及びL8(配列番号68)の1つの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と異なり、ここで、各配列の相違は、独立して、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、GIPR抗体の軽鎖可変ドメインは、L2(配列番号62)、L3(配列番号63)、L4(配列番号64)、L6(配列番号66)、L7(配列番号67)、及びL8(配列番号68)の1つの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、GIPR抗体の軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、L2(配列番号62)、L3(配列番号63)、L4(配列番号64)、L6(配列番号66)、L7(配列番号67)、及びL8(配列番号68)の1つのポリヌクレオチドコード配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一であるヌクレオチドコード配列を含む。別の実施形態において、GIPR抗体の軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、L2(配列番号62)、L3(配列番号63)、L4(配列番号64)、L6(配列番号66)、L7(配列番号67)、及びL8(配列番号68)の1つの相補的ポリヌクレオチドコード配列と中程度の条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態において、GIPR抗体の軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、L2(配列番号62)、L3(配列番号63)、L4(配列番号64)、L6(配列番号66)、L7(配列番号67)、及びL8(配列番号68)の1つの軽鎖可変ドメインの相補的ポリヌクレオチドコード配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、本明細書に列挙されるH2(配列番号73)、H3(配列番号74)、H5(配列番号76)、及びH6(配列番号77)重鎖可変ドメイン配列から選択される重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、GIPR抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸が、H2(配列番号73)、H3(配列番号74)、H5(配列番号76)、及びH6(配列番号77)の1つの重鎖可変ドメイン配列と異なり、ここで、各配列の相違は、独立して、1つのアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、GIPR抗体の重鎖可変ドメインは、H2(配列番号73)、H3(配列番号74)、H5(配列番号76)、及びH6(配列番号77)の1つの重鎖可変ドメイン配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、GIPR抗体の重鎖可変ドメインは、H2(配列番号73)、H3(配列番号74)、H5(配列番号76)、及びH6(配列番号77)の1つの重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一であるポリヌクレオチドコード配列を含む。別の実施形態において、GIPR抗体重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、H2(配列番号73)、H3(配列番号74)、H5(配列番号76)、及びH6(配列番号77)の1つの重鎖可変ドメインの相補的ポリヌクレオチドコード配列と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、GIPR抗体重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、H2(配列番号73)、H3(配列番号74)、H5(配列番号76)、及びH6(配列番号77)の1つの重鎖可変ドメインの相補的ポリヌクレオチドコード配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、L1H1(配列番号61及び配列番号72)、L2H2(配列番号62及び配列番号73)、L3H3(配列番号63及び配列番号74)、L4H3(配列番号64及び配列番号74)、L5H4(配列番号65及び配列番号75)、L6H5(配列番号66及び配列番号76)、L7H6(配列番号67及び配列番号77)、L8H6(配列番号68及び配列番号77)、L9H7(配列番号69及び配列番号78)、L10H8(配列番号70及び配列番号79)、又はL11H9(配列番号71及び配列番号80)、又はその所望の表現型(例えば、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE、若しくはIgD)、又はそのFab若しくはF(ab’)2フラグメントの組合せを含む抗体である。
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、L2H2(配列番号62及び配列番号73)、L3H3(配列番号63及び配列番号74)、L4H3(配列番号64及び配列番号74)、L6H5(配列番号66及び配列番号76)、L7H6(配列番号67及び配列番号77)、又はL8H6(配列番号68及び配列番号77)、又はその所望の表現型(例えば、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE、若しくはIgD)、又はそのFab若しくはF(ab’)2フラグメントの組合せを含む抗体である。
本明細書において提供される抗体は、当該技術分野において公知の定常領域のいずれかを含み得る。軽鎖定常領域は、例えば、κ又はλ軽鎖定常領域、例えば、マウスκ又はλ軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、α、δ、ε、γ、又はμ重鎖定常領域、例えば、マウスα、δ、ε、γ、又はμ重鎖定常領域であり得る。一実施形態において、軽鎖又は重鎖定常領域は、天然定常領域のフラグメント、誘導体、変異体、又は突然変異体である。
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒト軽鎖κ又はλ定常ドメイン又はそのフラグメントをさらに含む。軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである:
ヒト軽鎖κ定常ドメインアミノ酸配列:(配列番号101);及び
ヒト軽鎖λ定常ドメインアミノ酸配列:(配列番号102)。
ヒト軽鎖κ定常ドメインアミノ酸配列:(配列番号101);及び
ヒト軽鎖λ定常ドメインアミノ酸配列:(配列番号102)。
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒト重鎖定常ドメイン又はそのフラグメントをさらに含む。
重鎖定常領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである:
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列(hIgG2):(配列番号103);
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列(hIgG4):(配列番号104);及び
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列(hIgG4):(配列番号124)。
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列(hIgG2):(配列番号103);
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列(hIgG4):(配列番号104);及び
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列(hIgG4):(配列番号124)。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は1つの軽鎖ドメインアミノ酸配列を含み、ここでこの配列は、本明細書において提供されるV1(配列番号125)及びV2(配列番号126)から選択される。一実施形態において、GIPR抗体の軽鎖ドメインアミノ酸配列は、V1及びV2の一方の軽鎖ドメインアミノ酸配列と15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸だけ異なり、ここで各配列の相違は、独立して、1つのアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、GIPR抗体の軽鎖ドメインアミノ酸配列は、V1及びV2の一方の軽鎖ドメインアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%及び少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、GIPR抗体の軽鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列は、V1及びV2の一方の軽鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%及び少なくとも99%同一であるポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、GIPR抗体の軽鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列は、V1及びV2の一方の軽鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列の相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、GIPR抗体の軽鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列は、V1及びV2の一方の軽鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は1つの重鎖ドメインアミノ酸配列を含み、この配列は、本明細書において提供されるW1(配列番号127)、W2(配列番号128)、W3(配列番号129)、W4(配列番号130)、W5(配列番号131)、W6(配列番号132)、W7(配列番号133)、W8(配列番号134)、及びW9(配列番号135)から選択される。一実施形態において、GIPR抗体の重鎖ドメインアミノ酸配列は、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8及びW9のうちの1つの重鎖ドメインアミノ酸配列と15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1つのアミノ酸だけ異なり、ここで各配列の相違は、独立して、1つのアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、GIPR抗体の重鎖ドメインアミノ酸配列は、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8及びW9のうちの1つの重鎖ドメインアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%及び少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、GIPR抗体の重鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列は、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8及びW9のうちの1つの重鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%及び少なくとも99%同一であるポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、GIPR抗体の重鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列は、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8及びW9のうちの1つの重鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列の相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、GIPR抗体の重鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列は、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8及びW9のうちの1つの重鎖ドメインポリヌクレオチドコード配列の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V1W1(配列番号125及び配列番号127)、V1W2(配列番号125及び配列番号128)、V1W3(配列番号125及び配列番号129)、V1W4(配列番号125及び配列番号130)、V1W5(配列番号125及び配列番号131)、V1W6(配列番号125及び配列番号132)、V1W7(配列番号125及び配列番号133)、V1W8(配列番号125及び配列番号134)、V1W9(配列番号125及び配列番号135)、V2W1(配列番号126及び配列番号127)、V2W2(配列番号126及び配列番号128)、V2W3(配列番号126及び配列番号129)、V2W4(配列番号126及び配列番号130)、V2W5(配列番号126及び配列番号131)、V2W6(配列番号126及び配列番号132)、V2W7(配列番号126及び配列番号133)、V2W8(配列番号126及び配列番号134)、又はV2W9(配列番号126及び配列番号135)の組合せを含む抗体である。
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V1W1(配列番号125及び配列番号127)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V1W2(配列番号125及び配列番号128)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V1W3(配列番号125及び配列番号129)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V1W4(配列番号125及び配列番号130)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V1W5(配列番号125及び配列番号131)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V1W6(配列番号125及び配列番号132)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V1W7(配列番号125及び配列番号133)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V1W8(配列番号125及び配列番号134)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V1W9(配列番号125及び配列番号135)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V2W1(配列番号126及び配列番号127)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V2W2(配列番号126及び配列番号128)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V2W3(配列番号126及び配列番号129)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V2W4(配列番号126及び配列番号130)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V2W5(配列番号126及び配列番号131)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V2W6(配列番号126及び配列番号132)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V2W7(配列番号126及び配列番号133)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V2W8(配列番号126及び配列番号134)の組合せを含む抗体である。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、V2W9(配列番号126及び配列番号135)の組合せを含む抗体である。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、マウス由来抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)xフラグメント、構造ドメイン抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、又はIgG4抗体から選択される。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、GIPRモノクローナル抗体である。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、以下のリスト:配列番号61及び配列番号72、配列番号62及び配列番号73、配列番号63及び配列番号74、配列番号64及び配列番号74、配列番号65及び配列番号75、配列番号66及び配列番号76、配列番号67及び配列番号77、配列番号68及び配列番号77、配列番号69及び配列番号78、配列番号70及び配列番号79、及び配列番号71及び配列番号80から選択されるアミノ酸配列の組合せを含むモノクローナル抗体である。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、マウスGIPR抗体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、ヒト化GIPR抗体である。
一実施形態において、本明細書において提供されるGIPR抗体は、約1nM~200nM又は約1nM~100nMのIC50値を有し、ヒトGIPシグナル伝達を低減する。
抗体及び抗体フラグメント
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、完全長抗体(完全長重鎖及び/又は軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む)である。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、抗体フラグメント、例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv、Fc、又はFdフラグメント、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディ(maxibodies)、ミニボディ(minibodies)、イントラボディ(intrabodies)、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、v-NAR又はビス-scFvである(例えば、Hollinger and Hudson,2005,Nature Biotechnology,23:1126-1136を参照)。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、フィブロネクチンポリペプチド単一特異性抗体(monobodies)を含む、米国特許第6703199号明細書に開示されるものなどの抗体ポリペプチドも含む。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、一本鎖ポリペプチドである、米国特許出願公開第2005/0238646号明細書に開示される他の抗体ポリペプチドも含む。
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、完全長抗体(完全長重鎖及び/又は軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む)である。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、抗体フラグメント、例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv、Fc、又はFdフラグメント、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディ(maxibodies)、ミニボディ(minibodies)、イントラボディ(intrabodies)、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、v-NAR又はビス-scFvである(例えば、Hollinger and Hudson,2005,Nature Biotechnology,23:1126-1136を参照)。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、フィブロネクチンポリペプチド単一特異性抗体(monobodies)を含む、米国特許第6703199号明細書に開示されるものなどの抗体ポリペプチドも含む。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、一本鎖ポリペプチドである、米国特許出願公開第2005/0238646号明細書に開示される他の抗体ポリペプチドも含む。
一実施形態において、ハイブリドーマ中の該当するモノクローナル抗体を発現するIgG遺伝子の可変領域は、ヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。これらのプライマーは、当業者が合成してもよく、又は市販品を購入してもよい。VHa、VHb、VHc、VHd、CH1、VL及びCL領域を含めたマウス及びヒト可変領域用のプライマーは、市販品を購入してもよい。これらのプライマーは、それぞれIMMUNOZAP(商標)H又はIMMUNOZAP(商標)L(Stratagene)などのベクターに後に挿入され得る重鎖又は軽鎖可変領域を増幅するのに使用され得る。次に、これらのベクターは、発現のために大腸菌(E.coli)、酵母、又は哺乳動物に基づく系に導入され得る。VH及びVL領域の融合を含む大量の一本鎖タンパク質が、これらの方法を用いて産生され得る(Bird et al.,1988,Science 242:423-426を参照)。
抗体などの特定のタンパク質が、様々な翻訳後修飾を受けることができることが、当業者によって理解されるべきである。これらの修飾のタイプ及び程度は、タンパク質を発現するのに使用される宿主細胞系並びに培養条件に左右されることが多い。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペリジン(diketopiperizine)形成、アスパラギン酸塩異性化及びアスパラギン脱アミド化の変化を含み得る。高頻度の修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシル末端塩基性残基(リジン又はアルギニンなど)の損失である(Harris,1995,Journal of Chromatography 705:129-134に記載されるように)。
マウスモノクローナル抗体の産生のための一般的な方法は、ハイブリドーマ細胞による。モノクローナル抗体は、様々な確立した技術によって単離及び精製され得る。このような単離技術としては、プロテイン-Aセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる(例えば、Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3;Baines et al.,“Purification of Immunoglobulin G(IgG),”in Methods in Molecular Biology,Vol.10,pages 79-104(The Humana Press,Inc.1992)を参照)。モノクローナル抗体は、抗体の特定の特性(例えば、重鎖又は軽鎖アイソタイプ、結合特異性など)に基づいて選択される適切なリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。固体担体上に固定される好適なリガンドの例としては、プロテインA、プロテインG、抗定常領域(軽鎖又は重鎖)抗体、抗イディオタイプ抗体、及びTGF-β結合タンパク質、又はそのフラグメント若しくは変異体が挙げられる。
Schier et al.,1996,J.Mol.Biol.263:551-567によって記載されるように、抗体結合部位の中心における相補性決定領域(CDR)の分子進化も、増加した親和性を有する抗体、例えば、c-erbB-2に対する増加した親和性を有する抗体を再成形するのに使用されている。したがって、このような技術は、GIPRに対する抗体を調製するのに使用され得る。
ヒトGIPRに対する抗体が、例えば、インビトロ又はインビボのいずれかで、GIPRの存在を検出するアッセイにおいて使用され得る。
抗体はまた、従来の技術のいずれかによって調製され得る。例えば、抗体は、それらを天然で発現する細胞から精製され得るか(例えば、抗体は、それを産生するハイブリドーマから精製され得る)又は当該技術分野において公知の任意の技術を用いて組み換え発現系において産生され得る。例えば、Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses,Kennet et al.(eds.),Plenum Press,New York(1980);及びAntibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Land(eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)。これは、以下の核酸の節において説明されている。
抗体は、任意の公知の技術によって、調製され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。いくつかの技術は、関連する抗体(例えば、抗GIPR抗体)のポリペプチド鎖(又はその部分)をコードする核酸の単離及び組み換えDNA技術による核酸の操作に関連する。核酸は、別の関連する核酸と融合されるか、又は1つ又は複数のアミノ酸残基を付加、削除又は置換するために修飾(例えば、誘発突然変異又は他の従来の技術)され得る。
上述されるCDRの1つ又は複数を含有する本発明に係る抗体の親和性を向上させることが必要とされる場合、このような抗体は、CDRの維持(Yang et al.,1995,J.Mol.Biol.,254:392-403)、鎖シャッフリング(Marks et al.,1992,Bio/Technology,10:779-783)、大腸菌(E.coli)の突然変異株の使用(Low et al.,1996,J.Mol.Biol.,250:350-368)、DNAシャッフリング(Patten et al.,1997,Curr.Opin.Biotechnol.,8:724-733)、ファージディスプレイ(Thompson et al.,1996,J.Mol.Biol.,256:7-88)及びさらなるPCR技術(Crameri et al.,1998,Nature,391:288-291)を含む、いくつかの親和性成熟プロトコルによって得られる。これらの方法又は親和性成熟の全ては、Vaughan et al.,1998,Nature Biotechnology,16:535-539に記載されている。
一実施形態において、GIPR抗体のフラグメントが、本明細書において提供される。このようなフラグメントは、全体的に、抗体に由来する配列又はさらなる配列を含み得る。抗原結合フラグメントの例としては、Fab、F(ab’)2、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、及びドメイン抗体が挙げられる。他の例が、Lunde et al.,2002,Biochem.Soc.Trans.30:500-06において提供されている。
一本鎖抗体は、単一ポリペプチド鎖を生じるように、アミノ酸架橋(短ペプチドリンカー)によって重鎖及び軽鎖可変ドメイン(Fv領域)フラグメントを連結することによって形成され得る。このような一本鎖Fv(scFv)は、2つの可変ドメインポリペプチド(VL及びVH)をコードするDNA間のペプチドリンカーをコードする融合DNAによって調製されている。得られるポリペプチドは、それ自体で折り畳まれて、抗原結合モノマーを形成し得るか、又はそれらは、2つの可変ドメイン間のフレキシブルリンカーの長さに応じて、多量体(例えば、二量体、三量体、又は四量体)を形成し得る(Kortt et al.,1997,Prot.Eng.10:423;Kortt et al.,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。様々なVL及びVH含有ポリペプチドを組み合わせることによって、様々なエピトープに結合する多量体scFvが形成され得る(Kriangkum et al.,2001,Biomol.Eng.18:31-40)。一本鎖抗体の産生のために開発された技術としては、米国特許第4946778号明細書;Bird,1988,Science 242:423;Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879;Ward et al.,1989,Nature 334:544;de Graaf et al.,2002,Methods Mol.Biol.178:379-87に記載されるものが挙げられる。限定はされないが、可変ドメイン組合せL1H1を含むscFvを含む、本明細書において提供される抗体に由来する一本鎖抗体が、本発明によって包含される。
1つの抗体に由来する複数の抗原結合フラグメントはまた、従来の方法にしたがって、例えば、抗体のタンパク質分解的加水分解、例えば、全抗体のペプシン又はパパイン消化によって得られる。例として、抗体フラグメントは、F(ab’)2と呼ばれるSSフラグメントを生じる、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって、生成され得る。このフラグメントは、チオール還元剤を用いてさらに切断されて、3.5S Fab’一価フラグメントを生じ得る。任意選択的に、切断反応は、ジスルフィド結合の切断から得られるスルフヒドリル基のブロッキング基を用いて行われ得る。代替例として、パパインを用いた酵素的切断により、2つの一価Fabフラグメント及びFcフラグメントを直接生成する。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第4331647号明細書、Nisonoffet et al.,1960,Arch.Biochem.Biophys.89:230;Porter,1959,Biochem.J.73:119;Edelman et al.,Methods in Enzymology 1:422(Academic Press 1967);及びAndrews,S.M.and Titus,J.A.in Current Protocols in Immunology(Coligan J.E.,et al.,eds),John Wiley & Sons,New York(2003),pages 2.8.1-2.8.10 and 2.10A.1-2.10A.5によって記載されている。重鎖を分離して一価軽鎖-重鎖フラグメント(Fd)を形成するなどの、抗体を切断するための他の方法、フラグメントの他の切断、又は他の酵素的、化学的、又は遺伝子学的技術も、フラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
抗体フラグメントの別の形態は、抗体の1つ又は複数の相補性決定領域(CDR)を含むペプチドである。CDRは、CDRをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得られる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、鋳型としてmRNA又は抗体産生細胞を用いて可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を用いることによって調製される(例えば、Larrick et al.,1991,Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106;Courtenay-Luck,“(Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,”in Monoclonal Antibodies:Production,Engineering and Clinical Application,Ritter et al.(eds.),page 166(Cambridge University Press 1995);及びWard et al.,“Genetic Manipulation and Expression or Antibodies,”in Monoclonal Antibodies:Principles and Applications,Birch et al.,(eds.),page 137(Wiley-Liss,Inc.1995を参照)。抗体フラグメントは、本明細書に記載される抗体の少なくとも1つの可変領域ドメインをさらに含み得る。したがって、例えば、V領域ドメインは、モノマー及びVH又はVLドメインであり得、これは、後述されるように1x10-7M以下の親和性でGIPRに結合し得る。
可変領域ドメインは、任意の天然可変ドメイン又はその操作された形態であり得る。操作された形態とは、組み換えDNA操作技術を用いて生成された可変領域ドメインを意味する。このような操作された形態は、例えば、特定の抗体のアミノ酸配列における又はそれに対する挿入、欠失、又は変化によって、特定の抗体可変領域から生成されるものを含む。具体的な例は、第1の抗体からの1つのCDR及び任意選択的に1つ又は複数のフレームワークアミノ酸を含有する操作された可変領域ドメイン、及び第2の抗体からの可変領域ドメインの残りの部分を含む。
可変領域ドメインは、C末端アミノ酸において、少なくとも1つの他の抗体ドメイン又はそのフラグメントに共有結合され得る。したがって、例えば、可変領域ドメイン中に存在するVHドメインは、免疫グロブリンCH1ドメイン又はそのフラグメントに連結され得る。同様に、VLドメインは、CKドメイン又はそのフラグメントに連結され得る。このように、例えば、抗体は、Fabフラグメントであり得、ここで、抗原結合ドメインは、それらのC末端において、それぞれCH1及びCκドメインに共有結合的に連結される関連するVH及びVLドメインを含有する。CH1ドメインは、さらなるアミノ酸で拡張されて、例えば、Fab’フラグメントに見られるようなヒンジ領域又はヒンジ領域ドメインの部分を生じるか、又は抗体CH2及びCH3ドメインなどのさらなるドメインを生じ得る。
抗体の誘導体及び変異体
L1及びH1のヌクレオチド配列が、例えば、ランダム突然変異誘発によって又は部位特異的突然変異誘発(例えば、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的突然変異誘発)によって改変されて、非突然変異ポリヌクレオチドと比較して、1つ又は複数の特定のヌクレオチド置換、欠失、又は挿入を含む改変ポリヌクレオチドを生成し得る。このような改変を行うための技術の例が、Walder et al.,1986,Gene 42:133;Bauer et al.,1985,Gene 37:73;Craik,1985,BioTechniques,3:12-19;Smith et al.,1981,Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press;並びに米国特許第4518584号明細書及び米国特許第4737462号明細書に記載されている。これらの及び他の方法が、非誘導体化抗体と比較して、所望の特性、例えば、GIPRに対する親和性、アビディティ(avidity)、若しくは特異性又はインビボ若しくはインビトロ安定性の向上、又はインビボ副作用の減少を有する、例えば、GIPR抗体の誘導体を作製するのに使用され得る。
L1及びH1のヌクレオチド配列が、例えば、ランダム突然変異誘発によって又は部位特異的突然変異誘発(例えば、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的突然変異誘発)によって改変されて、非突然変異ポリヌクレオチドと比較して、1つ又は複数の特定のヌクレオチド置換、欠失、又は挿入を含む改変ポリヌクレオチドを生成し得る。このような改変を行うための技術の例が、Walder et al.,1986,Gene 42:133;Bauer et al.,1985,Gene 37:73;Craik,1985,BioTechniques,3:12-19;Smith et al.,1981,Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press;並びに米国特許第4518584号明細書及び米国特許第4737462号明細書に記載されている。これらの及び他の方法が、非誘導体化抗体と比較して、所望の特性、例えば、GIPRに対する親和性、アビディティ(avidity)、若しくは特異性又はインビボ若しくはインビトロ安定性の向上、又はインビボ副作用の減少を有する、例えば、GIPR抗体の誘導体を作製するのに使用され得る。
本発明の範囲内のGIPR抗体の他の誘導体は、抗GIPR抗体ポリペプチドのN末端若しくはC末端に融合された異種ポリペプチドを含む発現又は組み換え融合タンパク質などによって、他のタンパク質又はポリペプチドとともに、抗GIPR抗体の共有結合的又は凝集性コンジユゲート、又はそのフラグメントを含む。例えば、共役ペプチドは、異種シグナル(又はリーダー)ポリペプチド、例えば、酵母α-因子リーダー又はエピトープタグなどのペプチドであり得る。融合タンパク質を含有する抗体は、抗原結合タンパク質(例えば、ポリ-His)の精製又は同定を促進するために加えられるペプチドを含み得る。抗体はまた、Hopp et al.,1988,Bio/Technology 6:1204、及び米国特許第5011912号明細書に記載されるように、FLAGペプチドに連結され得る。FLAGペプチドは、高度に抗原性であり、特異的モノクローナル抗体(mAb)によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組み換えタンパク質の迅速なアッセイ及び容易な精製を可能にする。FLAGペプチドが所与のポリペプチドに融合された融合タンパク質を調製するのに有用な試薬は市販されている(Sigma,St.Louis,Mo.)。別の実施形態において、1つ又は複数の抗体を含有するオリゴマーが、GIPRアンタゴニストとして用いられ得る。オリゴマーは、共有結合的に連結された又は非共有結合的に連結された二量体、三量体、又はより高次のオリゴマーの形態であり得る。2つ以上の抗体を含むオリゴマーの使用が想定され、一例はホモ二量体である。他のオリゴマーとしては、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが挙げられる。
一実施形態は、抗体に融合されたペプチド部分間の共有結合的又は非共有結合的相互作用を介して結合された複数の抗体を含むオリゴマーに関する。このようなペプチドは、ペプチドリンカー(スペーサ)、又はオリゴマー形成を促進する特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパー及び抗体に由来する特定のポリペプチドは、以下により詳細に記載されるように、それに結合された抗体のオリゴマー形成を促進し得るペプチドである。
特定の実施形態において、オリゴマーは、2~4つの抗体を含む。オリゴマーの抗体は、上述される形態のいずれか、例えば、変異体又はフラグメントなどの任意の形態であり得る。好ましくは、オリゴマーは、GIPR結合活性を示す抗体を含む。
一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて調製される。抗体由来ポリペプチドの様々な部分(Fcドメインを含む)に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製が、例えば、Ashkenazi et al.,1991,PNAS USA 88:10535;Byrn et al.,1990,Nature 344:677;及びHollenbaugh et al.,1992“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”,in Current Protocols in Immunology,Suppl.4,pages 10.19.1-10.19.11によって記載されている。本明細書において提供される一実施形態は、抗GIPR抗体のGIPR結合フラグメントを、抗体のFc領域に融合することによって生成された2つの融合タンパク質を含む二量体に関する。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合を、適切な発現ベクターに挿入し、組み換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞において遺伝子融合を発現させ、発現された融合タンパク質によく似た抗体分子を組み立てさせることによって作製され得、その直後に、鎖間ジスルフィド結合が、Fc部分間に形成されて、二量体が得られる。
本明細書において使用される際の「Fcポリペプチド」という用語は、抗体のFc領域に由来するポリペプチドの天然及び突然変異タンパク質形態を含む。二量化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの切断形態も含まれる。Fc部分(及びそれから形成されたオリゴマー)を含む融合タンパク質は、プロテインA又はプロテインG力ラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提供する。
PCT出願国際公開第93/10151号パンフレット(参照により本明細書に援用される)に記載される1つの好適なFcポリペプチドは、ヒトIgG1抗体のN末端ヒンジ領域からFc領域の天然C末端まで伸びる一本鎖ポリペプチドである。別の有用なFcポリペプチドは、米国特許第5457035号明細書及びBaum et al.,1994,EMBO J.13:3992-4001に記載されるFc突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸19がLeuからAlaに変化されており、アミノ酸20がLeuからGluに変化されており、アミノ酸22がGlyからAlaに変化されていることを除いて、国際公開第93/10151号パンフレットに示される天然Fc配列のものと同一である。突然変異タンパク質は、Fc受容体に対する低下した親和性を示す。他の実施形態において、抗GIPR抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変部分が、抗体重鎖及び/又は軽鎖の可変部分と置換され得る。
或いは、オリゴマーは、ペプチドリンカー(スペーサペプチド)を伴うか又は伴わずに複数の抗体を含む融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーの中には、米国特許第4751180号明細書及び米国特許第4935233号明細書に記載されるものがある。
オリゴマー抗体を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見られるタンパク質のオリゴマー形成を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのDNA結合タンパク質において同定され(Landschulz et al.,1988,Science 240:1759)、それ以来、様々な異なるタンパク質において見出されている。公知のロイシンジッパーの中には、二量化又は三量化する天然ペプチド及びその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに好適なロイシンジッパードメインの例が、PCT出願国際公開第94/10308号パンフレットに記載され、肺表面活性剤タンパク質D(SPD)に由来するロイシンジッパーは、Hoppe et al.,1994,FEBS Letters 344:191(参照により本明細書に援用される)に記載される。それに融合された異種タンパク質の安定した三量化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用が、Fanslow et al.,1994,Semin.Immunol.6:267-78に記載される。一方法において、ロイシンジッパーペプチドに融合された抗GIPR抗体フラグメント又は誘導体を含む組み換え融合タンパク質が、好適な宿主細胞において発現され、形成された可溶性オリゴマー抗GIPR抗体フラグメント又は誘導体が、培養上清から回収される。
別の実施形態において、抗体誘導体は、本明細書に開示されるCDRの少なくとも1つを含み得る。例えば、1つ又は複数のCDRは、公知の抗体フレームワーク領域(IgG1、IgG2など)に組み込まれるか、又はその半減期を増加させるために好適なビヒクルに共役され得る。好適なビヒクルとしては、限定はされないが、Fc、アルブミン、トランスフェリンなどが挙げられる。これらの及び他の好適なビヒクルは、当該技術分野において公知である。このような共役CDRペプチドは、モノマー、二量体、四量体、又は他の形態であり得る。一実施形態において、1つ又は複数の水溶性ポリマーが、1つ又は複数の特定の位置で、例えば、結合剤のアミノ末端で結合される。一例において、抗体誘導体は、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、又はポリプロピレングリコールを含む、1つ又は複数の水溶性ポリマー結合を含む。例えば、米国特許第4640835号明細書、米国特許第4496689号明細書、米国特許第4301144号明細書、米国特許第4670417号明細書、米国特許第4791192号明細書及び米国特許第4179337号明細書を参照されたい。特定の実施形態において、誘導体は、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、又は他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ-(N-ビニルピロリドン)-ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)及びポリビニルアルコール、並びにこのようなポリマーの混合物のうちの1つ又は複数を含む。特定の実施形態において、1つ又は複数の水溶性ポリマーは、1つ又は複数の側鎖にランダムに結合される。特定の実施形態において、PEGは、抗体などの結合剤の治療的能力を向上させるように働き得る。いくつかのこのような方法が、例えば、任意の目的のために参照により本明細書に援用される米国特許第6133426号明細書において説明されている。
抗体が結合特異性を保持する限り、本明細書において提供される抗体が、少なくとも1つのアミノ酸置換を有し得ることが理解されよう。したがって、抗体構造への修飾が、本発明の範囲内に包含される。これらは、抗体のヒトGIPR結合能を破壊しない、保存的又は非保存的であり得るアミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、生物系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって典型的に組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これは、ペプチド模倣体及びアミノ酸部分の他の逆又は反転形態を含む。保存的アミノ酸置換はまた、その位置においてアミノ酸残基の極性又は電荷に対する影響がほとんど又は全くないように、標準的残基による天然アミノ酸残基の置換を含み得る。非保存的置換は、アミノ酸又はアミノ酸模倣体のあるクラスのメンバーを、異なる物理的特性(例えば、サイズ、極性、疎水性、電荷)を有する別のクラスからのメンバーと交換することを含み得る。
さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において単一のアミノ酸置換を含む、試験される変異体を生成し得る。次に、変異体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得る。このような変異体は、好適な変異体についての情報を収集するのに使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が、破壊された、望ましくないほど低下した、又は不適切な活性をもたらしたことが発見された場合、このような変化を有する変異体は、回避され得る。言い換えると、このような日常的な実験から収集される情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独で又は他の突然変異と組み合わせて回避されるべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に記載されるポリペプチドの好適な変異体を決定することができる。特定の実施形態において、当業者は、活性にとって重要でない領域を標的にすることによって、活性を破壊せずに変化され得る分子の好適な領域を特定し得る。特定の実施形態において、類似のポリペプチドの中で、残基及び保存される分子の部分を特定することができる。特定の実施形態において、生物学的活性又は構造にとって重要であり得る領域でも、生物学的活性を破壊せずに、又はポリペプチド構造に悪影響を与えずに保存的アミノ酸置換に供され得る。さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要である、類似のポリペプチドにおける残基を特定する構造-機能試験を検討することができる。このような比較を考慮して、類似のタンパク質における活性又は構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測される重要なアミノ酸残基の代わりに化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
当業者は、類似のポリペプチドにおける該当する構造に関連する三次元構造及びアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアライメントを予測し得る。特定の実施形態において、当業者は、タンパク質の表面にあることが予測されるアミノ酸残基に根本的な変更を行わないことを選択してもよく、これは、このような残基が、他の分子との重要な相互作用に関与し得るためである。いくつかの科学出版物が、二次構造の予測をテーマにしている。Moult,1996,Curr.Op.Biotech.7:422-427;Chou et al.,1974,Biochemistry 13:222-245;Chou et al.,1974,Biochemistry 113:211-222;Chou et al.,1978,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47:45-148;Chou et al.,1979,Ann.Rev.Biochem.47:251-276及びChou et al.,Biophys.J.26:367-384を参照されたい。さらに、二次構造を予測するのを支援するコンピュータプログラムが、現在入手可能である。例えば、30%超の配列同一性、又は40%超の類似性を有する2つのポリペプチド又はタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース(PDB)の最近の成長は、ポリペプチド又はタンパク質の構造内の折り畳みの潜在的な数を含む、二次構造の向上した予測可能性を提供した。Holm et al.,1999,Nucl.Acid.Res.27:244-247を参照されたい。所与のポリペプチド又はタンパク質中に限られた数の折り畳みがあること、及び臨界数の構造が決定された後、構造予測が著しく正確になることが示唆されている(Brenner et al.,1997,Curr.Op.Struct.Biol.7:369-376)。
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング(threading)」(Jones,1997,Curr.Opin.Struct.Biol.7:377-87;Sippl et al.,1996,Structure 4:15-19)、「プロファイル分析」(Bowie et al.,1991,Science 253:164-170;Gribskov et al.,1990,Meth.Enzym.183:146-159;Gribskov et al.,1987,Proc.Nat.Acad.Sci.USA84:4355-4358)、及び「進化学的関連性(evolutionary linkage)」(Holm,前掲(1999)、及びBrenner,前掲(1997)を参照)が挙げられる。特定の実施形態において、抗体の変異体は、グリコシル化変異体を含み、ここで、グリコシル化部位の数及び/又はタイプが、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して改変されている。特定の実施形態において、変異体は、天然タンパク質より多い又は少ない数のN-結合グリコシル化部位を含む。或いは、置換によるこのような配列の除去は、存在するN-結合炭水化物鎖を除去する。N-結合炭水化物鎖の再配列も提供され、ここで、1つ又は複数のN-結合グリコシル化部位(典型的に、天然に存在するもの)が削除され、1つ又は複数の新しいN-結合部位が生成される。さらなる好ましい抗体変異体は、システイン変異体を含み、ここで、1つ又は複数のシスティン残基は、親アミノ酸配列と比較して、欠失されるか、又は別のアミノ酸(例えば、セリン)と置換される。システイン変異体は、抗体が、例えば不溶性封入体の単離の後、生物学的に活性な立体配座に再度折り畳まれなければならない場合に有用であり得る。システイン変異体は、一般に、天然タンパク質より少ないシステイン残基を有し、典型的に、不対システインから生じる相互作用を最小限に抑えるために偶数を有する。
(保存的か又は非保存的かにかかわらず)所望のアミノ酸置換が、このような置換が所望されるときに当業者によって決定され得る。特定の実施形態において、アミノ酸置換が、ヒトGIPRに対する抗体の重要な残基を同定するため、又は本明細書に記載されるヒトGIPRに対する抗体の親和性を増大若しくは低下させるために使用され得る。
特定の実施形態によれば、好ましいアミノ酸置換は、(1)タンパク質分解に対する感受性を低下させ、(2)酸化に対する感受性を低下させ、(3)タンパク質複合体を形成するように結合親和性を改変し、(4)結合親和性を改変し、及び/又は(4)このようなポリペプチドにおける他の物理化学的又は機能的特性を与えるか又は調節するものである。特定の実施形態によれば、単一又は複数のアミノ酸置換(特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換)は、天然配列中で行われ得る(特定の実施形態において、分子間接触を形成するドメインの外部のポリペプチドの部分において)。特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、典型的に、親配列の構造的特徴を実質的に変更することができない(例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊すべきでなく、又は親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊すべきでない)。当該技術分野において認識されているポリペプチドの二次及び三次構造の例が、Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1984));Introduction to Protein Structure(Branden and Tooze,Eds.,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991));及びThornton et al.,1991,Nature 354:105に記載され、これらのそれぞれが、参照により本明細書に援用される。
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ポリマー、脂質、又は他の部分と化学結合され得る。
抗原結合剤は、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれる本明細書に記載されるCDRの少なくとも1つを含み得る。一実施形態において、生体適合性フレームワーク構造は、局在化した表面領域における抗原(例えば、CDR、可変領域など)に結合するアミノ酸の1つ又は複数の配列を提示することができる、立体配座的に安定した構造的支持体、又はフレームワーク、又は足場を形成するのに十分なポリペプチド又はその部分を含む。このような構造は、天然ポリペプチド又はポリペプチド「折り畳み」(構造モチーフ)であり得るか、又は天然ポリペプチド又は折り畳みと比べて、アミノ酸の付加、欠失又は置換などの1つ又は複数の修飾を有し得る。これらの足場は、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌又はウイルスなどの任意の種の(又は2つ以上の種の)ポリペプチドに由来し得る。
典型的に、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質足場又は骨格に基づいている。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタチン、シトクロムb、CP1ジンクフィンガー、PST1、コイルドコイル、LACI-D1、Zドメイン及びテンダミスタットドメインに基づくものが使用され得る(例えば、Nygren and Uhlen,1997,Current Opinion in Structural Biology 7:463-469を参照)。
さらに、当業者は、好適な結合剤が、本明細書に具体的に開示される重鎖CDR1、CDR2、CDR3、軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3のうちの1つ又は複数などの、これらの抗体の部分を含むことを認識するであろう。重鎖CDR1、CDR2、CDR3、軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3の領域の少なくとも1つは、抗体が非置換CDRの結合特異性を保持する限り、少なくとも1つのアミノ酸置換を有し得る。抗体の非CDR部分は、非タンパク分子であり得、ここで、結合剤は、ヒトGIPRに対する本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックし、及び/又は受容体を介したGIPシグナル伝達の活性を阻害する。抗体の非CDR部分は、非タンパク分子であり得、ここで、抗体は、競合結合アッセイにおいてヒトGIPRペプチドへの、抗体L2H2/L6H5の少なくとも1つによって示されるものと類似の結合パターンを示し、及び/又はGIPの活性を中和する。抗体の非CDR部分は、アミノ酸から構成され得、ここで、抗体は、組み換え結合タンパク質又は合成ペプチドであり、組み換え結合タンパク質は、ヒトGIPRへの本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックし、及び/又はインビトロ若しくはインビボでGIPの活性を中和する。抗体の非CDR部分は、アミノ酸から構成され得、ここで、抗体は、組み換え抗体であり、組み換え抗体は、競合結合アッセイにおいてヒトGIPRペプチドへの、抗体L2H2/L6H5の少なくとも1つによって示されるものと類似の結合パターンを示し、及び/又はGIPの活性を中和する。
GIPR抗体及びGLP-1又は逆GLP-1の融合タンパク質
一実施形態において、GIPRに特異的に結合する抗体、及び1、2、3、4、5、6、7、又は8つのGLP-1フラグメント又は逆GLP-1フラグメントを含む、GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質であって、融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端に結合するか、又は逆GLP-1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
一実施形態において、GIPRに特異的に結合する抗体、及び1、2、3、4、5、6、7、又は8つのGLP-1フラグメント又は逆GLP-1フラグメントを含む、GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質であって、融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端に結合するか、又は逆GLP-1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、GIPRに特異的に結合する抗体、及び1、2、3、4、5、6、7、又は8つのGLP-1フラグメントを含む、GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質であって;融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、GIPRに特異的に結合する抗体、及び1、2、3、4、5、6、7、又は8つの逆GLP-1フラグメントを含む、GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質であって;融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、逆GLP-1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、GIPRに特異的に結合する抗体、及び1、2、3、又は4つのGLP-1フラグメントを含む、GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質であって;融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、GIPRに特異的に結合する抗体、及び1、2、3、又は4つの逆GLP-1フラグメントを含む、GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質であって;融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、逆GLP-1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、GIPRに特異的に結合する抗体、及び2つのGLP-1フラグメントを含む、GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質であって;融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、GIPRに特異的に結合する抗体、及び2つの逆GLP-1フラグメントを含む、GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質であって;融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、逆GLP-1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、GIPR抗体及び2つのGLP-1フラグメントを含むGLP-1融合タンパク質であって;融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体軽鎖のアミノ末端と結合し:N’-GLP-1-リンカー-R-C’;又はGLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体重鎖のアミノ末端に結合し:N’-GLP-1-リンカー-R-C’;ここで:N’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、C’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のカルボキシ末端を表し、GLP-1が、GLP-1フラグメントを表し、Rが、GIPR抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列を表し、リンカーが、ペプチドリンカー配列を表す、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、GIPR抗体及び2つの逆GLP-1フラグメントを含むGLP-1融合タンパク質であって;融合タンパク質が、逆GLP-1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体軽鎖のカルボキシ末端に結合し:N’-R-リンカー-逆GLP-1-C’;又はペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、逆GLP-1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体重鎖のカルボキシ末端に結合し:N’-R-リンカー-逆GLP-1-C’;ここで:N’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、C’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のカルボキシ末端を表し、逆GLP-1が、逆GLP-1フラグメントを表し、Rが、GIPR抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列を表し、リンカーが、ペプチドリンカー配列を表す、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
さらなる実施形態において、GIPR抗体及び2つのGLP-1フラグメントを含むGLP-1融合タンパク質であって;融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列(リンカー)を介して、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体軽鎖のアミノ末端に結合し:N’-GLP-1-リンカー-R-C’;ここで:N’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、C’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のカルボキシ末端を表し、GLP-1が、GLP-1フラグメントを表し、Rが、GIPR抗体軽鎖のアミノ酸配列を表し、リンカーが、ペプチドリンカー配列を表す、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
一実施形態において、本明細書において提供されるGLP-1融合タンパク質において、GLP-1フラグメントが、独立して、以下のアミノ酸配列:配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、及び配列番号109のうちの1つから選択される。一実施形態において、本明細書において提供されるGLP-1融合タンパク質において、逆GLP-1フラグメントが、独立して、以下のアミノ酸配列:配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、及び配列番号123のうちの1つから選択される。
一実施形態において、本明細書において提供されるGLP-1融合タンパク質において、ペプチドリンカー(リンカー)配列が、独立して、1~200のアミノ酸残基、2~100のアミノ酸残基、5~50のアミノ酸残基、6~25のアミノ酸残基、又は10~20のアミノ酸残基を含む。
別の実施形態において、本明細書において提供されるGLP-1融合タンパク質において、ペプチドリンカー(リンカー)配列が、独立して、以下のアミノ酸配列:配列番号110、配列番号111、及び配列番号112から選択される。
核酸
一態様において、本発明は、本明細書において提供される抗体をコードする単離核酸分子を提供する。核酸は、例えば、抗体又はGLP-1融合タンパク質の全て又は部分、例えば、本発明の抗体、又はそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、若しくは変異体の一方又は両方の鎖をコードするポリヌクレオチド;ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド;ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異させ、又は増幅するためのPCRプライマー又はシーケンシングプライマー;ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、及び上記のものの相補的配列を含む。核酸は、任意の長さであり得る。核酸は、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000又はそれ以上のヌクレオチド長であり得、及び/又は1つ又は複数のさらなる配列、例えば、制御配列を含み得、及び/又はより大きい核酸、例えば、ベクターの一部であり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、RNA及び/又はDNAヌクレオチド、及びその人工変異体(例えば、ペプチド核酸)を含み得る。
一態様において、本発明は、本明細書において提供される抗体をコードする単離核酸分子を提供する。核酸は、例えば、抗体又はGLP-1融合タンパク質の全て又は部分、例えば、本発明の抗体、又はそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、若しくは変異体の一方又は両方の鎖をコードするポリヌクレオチド;ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド;ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異させ、又は増幅するためのPCRプライマー又はシーケンシングプライマー;ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、及び上記のものの相補的配列を含む。核酸は、任意の長さであり得る。核酸は、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000又はそれ以上のヌクレオチド長であり得、及び/又は1つ又は複数のさらなる配列、例えば、制御配列を含み得、及び/又はより大きい核酸、例えば、ベクターの一部であり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、RNA及び/又はDNAヌクレオチド、及びその人工変異体(例えば、ペプチド核酸)を含み得る。
抗体ポリペプチド(例えば、重鎖又は軽鎖、可変ドメインのみ、又は完全長)をコードする核酸は、GIPR抗原で免疫付与されたマウスのB細胞から単離され得る。抗体又はGLP-1融合タンパク質の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの従来の手順によって単離され得る。
重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする核酸配列が上に示される。当業者は、遺伝暗号の縮重により、本明細書に開示されるポリペプチド配列のそれぞれが、多数の他の核酸配列によってコードされることを理解するであろう。本発明は、本明細書において提供される各抗体又はGLP-1融合タンパク質をコードする各縮重ヌクレオチド配列を提供する。
本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸(例えば、L2H2/L6H5のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸)にハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせるための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6を参照されたい。本明細書において定義されるように、例えば、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、5x塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)、0.5%のSDS、1.0mMのEDTA(pH8.0)、約50%のホルムアミドのハイブリダイゼーション緩衝液、6xSSCを含有する予洗(prewashing)溶液、及び55℃のハイブリダイゼーション温度(又は42℃のハイブリダイゼーション温度で、約50%のホルムアミドを含有するものなどの他の類似のハイブリダイゼーション溶液)、及び0.5xSSC、0.1%のSDS中で、60℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、45℃で6xSSC中でハイブリダイズし、続いて、68℃で0.1xSSC、0.2%のSDSで1回以上洗浄する。さらに、当業者は、互いに少なくとも65、70、75、80、85、90、95、98又は99%同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的に、互いにハイブリダイズされたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大又は低下させるように、ハイブリダイゼーション及び/又は洗浄条件を操作することができる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的パラメータ及び好適な条件を考案するための指針は、例えば、Sambrook,Fritsch,and Maniatis(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,chapters 9 and 11;及びCurrent Protocols in Molecular Biology,1995,Ausubel et al.,Eds.,John Wiley & Sons,Inc.,sections 2.10 and 6.3-6.4)によって記載されており、例えば、DNAの長さ及び/又は塩基組成に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。変化が、突然変異によって、核酸に導入され得、それによって、それがコードするポリペプチド(例えば、抗体)のアミノ酸配列の変化をもたらす。突然変異が、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて導入され得る。一実施形態において、1つ又は複数の特定のアミノ酸残基が、例えば、部位特異的突然変異誘発プロトコルを用いて変化される。別の実施形態において、1つ又は複数のランダムに選択された残基が、例えば、ランダム突然変異誘発プロトコルを用いて変化される。それがいかに作製されても、突然変異ポリペプチドは、発現され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。
突然変異が、それがコードするポリペプチドの生物学的活性をそれほど変更せずに、核酸に導入され得る。例えば、ヌクレオチド置換を行って、非必須アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすことができる。一実施形態において、L1~L11及びH1~H9、又はGLP-1融合タンパク質について本明細書において提供されるヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、変異体、若しくは誘導体は、それらが、2つ以上の異なるアミノ酸残基を有する配列を生じるように、アミノ酸残基の1つ又は複数の欠失又は置換を含む、L1~L11及びH1~H9について本明細書において提供されるアミノ酸配列をコードするように突然変異される。別の実施形態において、突然変異誘発は、2つ以上の異なるアミノ酸残基を有する配列を生じるように、L1~L11及びH1~H9又はGLP-1融合タンパク質について本明細書に示される1つ又は複数のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸を挿入する。或いは、1つ又は複数の突然変異が、核酸に導入され得、この核酸が、それがコードするポリペプチドの生物学的活性(例えば、GIPRへの結合)を選択的に変化させる。例えば、突然変異が、生物学的活性を定量的に又は定性的に変化させ得る。定量的変化の例は、活性を増大させ、低下させ、又はなくすことを含む。定性的変化の例は、抗体又はGLP-1融合タンパク質の抗原特異性を変化させることを含む。
別の態様において、本発明は、本発明の核酸配列の検出のためのプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに好適な核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみ、例えば、プローブ若しくはプライマーとして使用され得るフラグメント又は本発明のポリペプチドの活性部分(例えば、GIPR結合部分)をコードするフラグメントを含み得る。
本発明の核酸の配列に基づくプローブを用いて、核酸又は類似の核酸、例えば、本発明のポリペプチドをコードする転写産物を検出することができる。プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子を含み得る。このようなプローブを用いて、ポリペプチドを発現する細胞を同定することができる。
別の態様において、本明細書において提供されるベクターは、本発明のポリペプチド又はその一部をコードする核酸を含む。ベクターの例としては、限定はされないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターが挙げられる。
本明細書において提供される組み換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み得る。組み換え発現ベクターは、発現される核酸配列に操作可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される1つ又は複数の制御配列を含む。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの(例えば、SV40初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモータ及びサイトメガロウイルスプロモータ)、特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指令するもの(例えば、組織特異的制御配列、Voss et al.,1986,Trends Biochem.Sci.11:287、Maniatis et al.,1987,Science 236:1237を参照、これらのそれぞれの開示内容は、全体が参照により本明細書に援用される)、及び特定の処理又は条件に応答して、ヌクレオチド配列の誘導性発現を指令するもの(例えば、哺乳類細胞におけるメタロチオネインプロモータ、及び原核生物細胞系及び真核生物細胞系の両方におけるtet-応答性及び/又はストレプトマイシン応答性プロモータ(同文献参照)を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要因に左右され得ることが、当業者によって理解されよう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それによって、本明細書に記載される核酸によってコードされる融合タンパク質又はペプチドを含む、タンパク質又はペプチドを産生し得る。
別の態様において、本発明は、本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞又は真核生物細胞であり得る。原核生物宿主細胞は、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、大腸菌(E.co1i)又はバシラス属(baci11i)を含む。より高等な真核細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、及び哺乳動物由来の樹立細胞系を含む。好適な哺乳動物宿主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はVeggie CHOなどのそれらの誘導体及び無血清培地中で増殖する関連する細胞系(Rasmussen et al.,1998,Cytotechnology 28:31を参照)又はDHFRが欠乏したCHO株DXB-11(Urlaub et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-20を参照)を含む。さらなるCHO細胞系は、CHO-K1(ATCC#CCL-61)、EM9(ATCC# CRL-1861)、及びW20(ATCC# CRL-1862)を含む。さらなる宿主細胞は、サル腎臓細胞のCOS-7系(ATCC# CRL-1651)(Gluzman et al.,1981,Cell 23:175を参照)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL-163)、AM-1/D細胞(米国特許第6210924号明細書に記載される)、HeLa細胞、BHK(ATCC CRL-10)細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系CV1に由来するCV1/EBNA細胞系(ATCC CCL-70)(McMahan et al.,1991,EMBO J.10:2821を参照)、293、293 EBNA又はMSR 293などのヒト胚腎臓細胞、ヒト表皮A431細胞、ヒトColo205細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常な2倍体細胞、初代組織、初代移植のインビトロ培養物に由来する細胞株、HL-60、U937、HaK又はJurkat細胞を含む。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主とともに使用するための適切なクローニング及び発現ベクターが、Pouwels et al.(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)によって記載されている。
ベクターDNAが、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって、原核生物又は真核生物細胞に導入され得る。哺乳類細胞の安定したトランスフェクションについて、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術に応じて、細胞のごく一部のみが、外来性DNAをそれらのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの成分を同定し、選択するために、(例えば、抗生物質に対する耐性のために)選択可能なマーカーをコードする遺伝子が、一般に、該当する遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーは、G418、ハイグロマイシン及びメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与えるものを含む。導入された核酸が安定的にトランスフェクトされた細胞が、他の方法の中でも特に、薬剤選択によって同定され得る(例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は、生存するであろうが、他の細胞は死亡する)。
形質転換された細胞は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養され得、ポリペプチドは、従来のタンパク質精製手順によって回収される。1つのこのような精製手順が、以下の実施例に記載されている。本明細書において使用することが想定されたポリペプチドは、汚染性内因性物質を実質的に含まない実質的に均一な組み換え哺乳動物GIPR抗体又はGLP-1融合タンパク質ポリペプチドを含む。
GIPR抗体の活性
GIPR抗体の活性は、GIPRに特異的に結合し、GIPシグナル伝達を阻害又は阻止し、その後、治療的生物学的効果を示し、例えば、肥満、T2DM及び/又は非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を処置する際の、本明細書において提供される抗体の効果を指す。「GIPシグナル伝達の生物学的活性を低下させる」又は「GIPシグナル伝達の生物学的活性を阻害又は阻止する」という用語は、インビボでGIPRに結合することによって、GIPに対する下流の細胞応答を阻害又は阻止する際の、GIPR抗体又はそのGLP-1融合タンパク質の効果を指す。それらの応答としては、限定はされないが、インスリン分泌促進作用、脂肪蓄積の促進、及び脂肪分解の阻害が挙げられる。一実施形態において、本明細書において提供されるマウス抗体又はヒト化抗体は、ヒトGIPRに特異的に結合する。このような抗体は、GIPシグナル伝達を低減又は中和する拮抗又は中和抗体を含む。
GIPR抗体の活性は、GIPRに特異的に結合し、GIPシグナル伝達を阻害又は阻止し、その後、治療的生物学的効果を示し、例えば、肥満、T2DM及び/又は非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を処置する際の、本明細書において提供される抗体の効果を指す。「GIPシグナル伝達の生物学的活性を低下させる」又は「GIPシグナル伝達の生物学的活性を阻害又は阻止する」という用語は、インビボでGIPRに結合することによって、GIPに対する下流の細胞応答を阻害又は阻止する際の、GIPR抗体又はそのGLP-1融合タンパク質の効果を指す。それらの応答としては、限定はされないが、インスリン分泌促進作用、脂肪蓄積の促進、及び脂肪分解の阻害が挙げられる。一実施形態において、本明細書において提供されるマウス抗体又はヒト化抗体は、ヒトGIPRに特異的に結合する。このような抗体は、GIPシグナル伝達を低減又は中和する拮抗又は中和抗体を含む。
一実施形態において、ヒトGIPRに結合する本明細書において提供される抗体のKdは、約0.01nM~1000nM、0.1nM~500nM、0.5nM~200nM、1nM~200nM、又は10nM~100nMの範囲である。別の実施形態において、GIPRに結合する本明細書において提供される抗体のKdは、約1nM~200nMである。さらに別の実施形態において、GIPRに結合する本明細書において提供される抗体のKdは、約1nM~100nMである。さらに別の実施形態において、GIPRに結合する本明細書において提供される抗体のKdは、約1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、又は100nMである。
一実施形態において、GIPシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のIC50は、約0.01nM~500nM、0.1nM~200nM、0.5nM~200nM、1nM~200nM、又は10nM~100nMである。別の実施形態において、GIPシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のIC50は、約1nM~200nMである。さらに別の実施形態において、GIPシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のIC50は、約10nM~100nMである。さらに別の実施形態において、GIPシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のIC50は、約1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、又は100nMである。
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、GIPRに特異的に結合し、1つ又は複数の以下の特性を有する:
a.GIPRに結合する際に、参照抗体と実質的に同様のKdを提供すること;
b.GIPによって活性化されるGIPRに拮抗する際に、参照抗体と実質的に同様のIC50を提供すること;及び
c.ヒトGIPRに対して参照抗体と結合に関して交差競合すること。
a.GIPRに結合する際に、参照抗体と実質的に同様のKdを提供すること;
b.GIPによって活性化されるGIPRに拮抗する際に、参照抗体と実質的に同様のIC50を提供すること;及び
c.ヒトGIPRに対して参照抗体と結合に関して交差競合すること。
別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、1つ又は複数の以下の特性を有する抗体である:
a.GIPRに結合する際に、参照抗体と同じか又はそれより良好なKdを提供すること;
b.GIPによって活性化されるGIPRに拮抗する際に、参照抗体と同じか又はそれより良好なIC50を提供すること;及び
c.ヒトGIPRに対して参照抗体と結合に関して交差競合すること。
a.GIPRに結合する際に、参照抗体と同じか又はそれより良好なKdを提供すること;
b.GIPによって活性化されるGIPRに拮抗する際に、参照抗体と同じか又はそれより良好なIC50を提供すること;及び
c.ヒトGIPRに対して参照抗体と結合に関して交差競合すること。
一実施形態において、参照抗体は、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号66及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号76の組合せを含む。
一実施形態において、参照抗体は、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号68及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号77の組合せを含む。
別の実施形態において、参照抗体は、モノクローナル抗体L2H2、L6H5、又はL10H8である。
本明細書において使用される際、「実質的に同様」という用語は、参照抗体のIC50若しくはKdと同等であるか、又はその約200%、180%、160%、150%、140%、120%、110%、100%、99%、98%、97%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、若しくは50%であることを意味する。一実施形態において、参照抗体は、例えば、重鎖配列番号76及び軽鎖配列番号66の組合せを含む抗体である。別の実施形態において、参照抗体は、GIPR抗体L2H2、L6H5、又はL10H8を含む。
GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質の生物学的活性
GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質の生物学的活性は、GLP-1の生物学的活性及びGIPR抗体の活性を含む。GIPR抗体の活性は、上述されるとおりである。「GLP-1の生物学的活性」は、GLP-1受容体にインビボで結合し、それを活性化し、細胞内シグナル伝達応答を引き起こし、肥満、2型糖尿病、又は非アルコール性脂肪性肝炎などの治療効果を示す、GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質の生物学的活性を指す。シグナル伝達応答は、限定はされないが、インスリン分泌の増加、グルカゴン分泌の抑制、食欲の抑制、体重減少、満腹感の誘発、アポトーシスの阻害、膵β細胞増殖の誘発、及び膵β細胞分化を含む。GLP-1及びGIPR抗体の生物学的活性を組み合わせて、本明細書において提供されるGLP-1融合タンパク質を用いて、GLP-1R及びGIPRに関連する様々な疾患及び障害を処置することができる。融合タンパク質は、GLP-1R及び/又はGIPRに作用することによってその生物学的効果を発揮するため、本明細書において提供されるGLP-1融合タンパク質処置を用いて、疾患又は症状が「GLP-1Rシグナル伝達の増加」又は「GIPRシグナル伝達の低減」から利益を得る被験体を処置することができる。これらの被験体は、「GLP-1R刺激療法を必要とする」又は「GIPR刺激を低減する必要がある」被験体と呼ばれ、このような対照は、非インスリン依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、脳卒中(GLP-1R、国際公開第00/16797号パンフレットを参照)、心筋梗塞(GLP-1R、国際公開第98/08531号パンフレットを参照)、肥満(GLP-1R、国際公開第98/19698号パンフレットを参照;GIPR、Furija et al.,2008,PLoS ONE 3:e3163;米国特許出願公開第2017/0275370 A1号明細書を参照)、外科手術後の異化変化(GLP-1R、米国特許第6,006,753号明細書を参照)、機能性ディスペプシア及び過敏性腸症候群(GLP-1R、国際公開第99/64060号パンフレットを参照)、脂肪肝(GIPR、米国特許出願公開第2017/0275370 A1号明細書を参照)、非アルコール性脂肪肝疾患(GLP-1R、Debra et al.,2016,Hepatobiliary Surg Nutr 5:515-518を参照;GIPR、米国特許出願公開第2017/0275370 A1号明細書を参照)、非アルコール性脂肪性肝炎(GLP-1、Armstrong et al.,2013,BMJ Open 3:e003995を参照;GIPR、米国特許出願公開第2017/0275370 A1号明細書を参照)を含み、また、非インスリン依存性糖尿病を発症するリスクのある被験体(国際公開第00/07617号パンフレットを参照)、耐糖能異常又は空腹時血糖異常の被験体、体重が標準身長及び体重より約25%多い被験体、及び膵部分切除を有する被験体も含む。
GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質の生物学的活性は、GLP-1の生物学的活性及びGIPR抗体の活性を含む。GIPR抗体の活性は、上述されるとおりである。「GLP-1の生物学的活性」は、GLP-1受容体にインビボで結合し、それを活性化し、細胞内シグナル伝達応答を引き起こし、肥満、2型糖尿病、又は非アルコール性脂肪性肝炎などの治療効果を示す、GIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質の生物学的活性を指す。シグナル伝達応答は、限定はされないが、インスリン分泌の増加、グルカゴン分泌の抑制、食欲の抑制、体重減少、満腹感の誘発、アポトーシスの阻害、膵β細胞増殖の誘発、及び膵β細胞分化を含む。GLP-1及びGIPR抗体の生物学的活性を組み合わせて、本明細書において提供されるGLP-1融合タンパク質を用いて、GLP-1R及びGIPRに関連する様々な疾患及び障害を処置することができる。融合タンパク質は、GLP-1R及び/又はGIPRに作用することによってその生物学的効果を発揮するため、本明細書において提供されるGLP-1融合タンパク質処置を用いて、疾患又は症状が「GLP-1Rシグナル伝達の増加」又は「GIPRシグナル伝達の低減」から利益を得る被験体を処置することができる。これらの被験体は、「GLP-1R刺激療法を必要とする」又は「GIPR刺激を低減する必要がある」被験体と呼ばれ、このような対照は、非インスリン依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、脳卒中(GLP-1R、国際公開第00/16797号パンフレットを参照)、心筋梗塞(GLP-1R、国際公開第98/08531号パンフレットを参照)、肥満(GLP-1R、国際公開第98/19698号パンフレットを参照;GIPR、Furija et al.,2008,PLoS ONE 3:e3163;米国特許出願公開第2017/0275370 A1号明細書を参照)、外科手術後の異化変化(GLP-1R、米国特許第6,006,753号明細書を参照)、機能性ディスペプシア及び過敏性腸症候群(GLP-1R、国際公開第99/64060号パンフレットを参照)、脂肪肝(GIPR、米国特許出願公開第2017/0275370 A1号明細書を参照)、非アルコール性脂肪肝疾患(GLP-1R、Debra et al.,2016,Hepatobiliary Surg Nutr 5:515-518を参照;GIPR、米国特許出願公開第2017/0275370 A1号明細書を参照)、非アルコール性脂肪性肝炎(GLP-1、Armstrong et al.,2013,BMJ Open 3:e003995を参照;GIPR、米国特許出願公開第2017/0275370 A1号明細書を参照)を含み、また、非インスリン依存性糖尿病を発症するリスクのある被験体(国際公開第00/07617号パンフレットを参照)、耐糖能異常又は空腹時血糖異常の被験体、体重が標準身長及び体重より約25%多い被験体、及び膵部分切除を有する被験体も含む。
一実施形態において、GIPR抗体又はGLP-1とのその融合タンパク質の生物学的活性の変化が、インビトロでGIPRを阻害する際の、GIPR抗体又はGLP-1融合タンパク質の機能を定量する、直接のcAMPアッセイを用いて検出される。
医薬組成物
一実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書において提供されるGIPR抗体と、1つ又は複数の薬学的に許容できる担体とを含む。
一実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書において提供されるGIPR抗体と、1つ又は複数の薬学的に許容できる担体とを含む。
別の実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書において提供されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質と、1つ又は複数の薬学的に許容できる担体とを含む。
本明細書において使用される際の「担体」という用語は、細胞又は哺乳動物を、使用される投与量及び濃度でそれに曝すことによって無害である、担体、医薬品賦形剤、又は安定剤を含む。
処置の方法
一実施形態において、2型糖尿病を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるGIPR抗体又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
一実施形態において、2型糖尿病を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるGIPR抗体又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、非アルコール性脂肪肝疾患を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるGIPR抗体、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、非アルコール性脂肪肝疾患を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、非アルコール性脂肪性肝炎を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるGIPR抗体、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、非アルコール性脂肪性肝炎を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、2型糖尿病を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるGIPR抗体、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、2型糖尿病を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質、又はその薬剤組合せを被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、肥満を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるGIPR抗体、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
さらなる実施形態において、肥満を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
本明細書において提供される使用のいずれかにおいて、本明細書において提供される医薬組成物は、静脈内又は皮下注入用である。
本明細書において使用される際、「被験体」という用語は、ヒトを含む哺乳動物を指し、「患者」という用語と同義的に使用される。
「処置」という用語は、疾患の少なくとも1つの症状又は他の側面の軽減若しくは予防、又は疾患重症度の低下を含む。本明細書において提供されるGIPR抗体又はGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質は、有効な治療剤であるために、完治を提供し、又は疾患の全ての症状又は兆候を根絶する必要はない。関連分野において認識されるように、治療剤は、所与の病態の重症度を低下させ得るが、有効であるために、疾患の全ての兆候をなくす必要はない。同様に、予防薬は、有効であるために、病態の発生を完全に予防する必要はない。疾患の影響を単に低減すること(例えば、その症状の数若しくは重症度を低減することによって、又は別の処置の有効性を増加させることによって、又は別の有益な効果を生じることによって)、又は疾患が被験体において発生又は悪化する可能性を低下させることで十分である。本発明の一実施形態は、特定の疾患の重症度を反映する指標のベースラインに対する持続的改善を誘発するのに十分な量及び時間で抗体を患者に投与することを含む方法に関する。
GIPR抗体又はGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質の医薬組成物は、限定はされないが、非経口で、局所的に、又は吸入によるなどの任意の好適な技術によって投与され得る。注入される場合、医薬組成物は、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内又は皮下経路を介して、ボーラス注入又は持続注入によって投与され得る。例えば、経皮投与及び埋め込み型製剤(implant)の持続放出などの疾患又は損傷部位における局部的な投与が考えられる。吸入による送達としては、例えば、経鼻又は経口吸入、噴霧器の使用、エアロゾル形態の抗体の吸入などが挙げられる。他の代替例としては、丸薬、シロップ、又はトローチ剤を含む経口製剤が挙げられる。
有利には、本明細書において提供されるGIPR抗体又はGLP-1の融合タンパク質は、生理学的に許容できる担体、賦形剤又は希釈剤などの1つ又は複数のさらなる成分を含む組成物中で投与される。組成物は、後述される1つ又は複数の生理学的に活性な薬剤をさらに含む。多くの特定の実施形態において、組成物は、本明細書において提供される1つ又は複数の抗体(例えば、マウス抗体又はヒト化抗体)又はGLP-1融合タンパク質に加えて、1、2、3、4、5、又は6つの生理学的に活性な薬剤を含む。
一実施形態において、医薬組成物は、好適なpHで抗体に好適な緩衝液、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量ポリペプチド(10個未満のアミノ酸を有するものなど)、タンパク質、アミノ酸、デキストリンなどの炭水化物、EDTAなどのキレート剤、グルタチオン、安定剤、及び賦形剤からなる群から選択される1つ又は複数の物質と一緒に、本明細書において提供されるマウス抗体又はヒト化抗体又はGLP-1融合タンパク質を含む。適切な業界標準にしたがって、防腐剤も加えられ得る。組成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液を用いて、凍結乾燥物として製剤化され得る。好適な成分は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無害である。医薬製剤に用いられ得る成分のさらなる例が、Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th Ed.(1980)and 20th Ed.(2000)に示されている。本発明の1つ又は複数の抗体又はGLP-1融合タンパク質及びラベル又は本明細書に記載される病態のいずれかを処置する際の他の使用説明書を含む、医師による使用のためのMack Publishing Companyキットが提供される。一実施形態において、キットは、1つ又は複数のヒト抗体又はGLP-1融合タンパク質の滅菌製剤を含み、これは、上に開示される組成物の形態であり得、1つ又は複数のバイアル中にあり得る。
投与量及び投与の頻度は、投与経路、用いられる具体的な抗体又はGLP-1融合タンパク質、処置される疾患の性質及び重症度、病態が急性か又は慢性か、及び被験体の大きさ及び全身状態などの要因に応じて変化し得る。適切な投与量は、関連技術において公知の手順によって、例えば用量漸増試験を含み得る臨床試験において決定され得る。
本明細書において提供される抗体又はGLP-1融合タンパク質は、例えば、所定の期間にわたって一定の間隔で、例えば、1回又は2回以上投与され得る。特定の実施形態において、マウス抗体又はヒト化抗体又はGLP-1融合タンパク質は、少なくとも1ヶ月又はそれ以上の期間で1回、例えば、1、2、又は3ヶ月間にわたって、或いは無期限に投与される。慢性疾患を処置するために、長期処置が、一般に最も有効である。しかしながら、急性疾患を処置するために、例えば、1~6週間のより短い期間にわたる投与で、十分であり得る。一般に、ヒト化抗体は、1つ又は複数の選択された指標についてベースラインに対する医学的に関連する改善の程度が患者に見られるまで投与される。
本明細書において提供される処置計画の一例は、2型糖尿病、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝炎によって引き起こされる症状を処置するために、適切な投与量で、1週間又はそれ以上につき1回の、抗体又はGLP-1融合タンパク質の皮下注入を含む。抗体又はGLP-1融合タンパク質は、所望の結果が得られるまで、例えば、患者の症状が治まるまで、週に1回又は月に1回投与され得る。処置は、必要に応じて再開してもよく、或いは、維持量が投与され得る。
患者の血糖濃度及び体重は、患者の圧力の変化を検出するために、ヒト抗体又はGLP-1融合タンパク質などの抗体又はGLP-1融合タンパク質による処置の前、その間、及び/又はその後にモニターされ得る。いくつかの疾患については、血糖の変化は、疾患の進行などの要因により変化し得る。血糖濃度は、公知の技術を用いて決定され得る。
本明細書における方法及び組成物の特定の実施形態は、例えば、抗体又はGLP-1融合タンパク質及び1つ又は複数のGIPアンタゴニスト、本明細書において提供される2つ以上の抗体又はGLP-1融合タンパク質、又は本明細書において提供される抗体又はGLP-1融合タンパク質及び1つ又は複数の他のGIPアンタゴニストの使用を含む。さらなる実施形態において、抗体又はGLP-1融合タンパク質は、単独で、又は患者が罹患している症状を処置するのに使用される他の薬剤と組み合わせて投与される。これらの薬剤の例は、タンパク性及び非タンパク性薬剤を含む。複数の薬剤が組み合わせて投与される場合、投与量は、当該技術分野において周知であるように、それ相応に調整されるべきである。「併用投与」併用療法は、同時投与に限定されず、少なくとも1つの他の治療剤を患者に投与することを含む投与過程の間に抗原及びタンパク質が少なくとも1回投与される処置計画も含む。
一方、2型糖尿病、肥満及び非アルコール性脂肪性肝炎及び関連疾患を処置するための薬剤を調製するための方法であって、薬剤が、上記の疾患の関連疾患の処置のために、本明細書において提供される抗体又はGLP-1融合タンパク質及び薬学的に許容できる賦形剤の混合物を含む方法が、本明細書において提供される。薬剤の調製方法は、上述されるとおりである。
ヒトGIPRに特異的に結合し得る抗体又はGLP-1融合タンパク質に関連する組成物、キット、及び方法が、本明細書においてさらに提供される。GIPRに結合するポリペプチドの全て又は一部をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子並びにその誘導体及びフラグメント、例えば、GIPR抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、又はGLP-1融合タンパク質の全て又は一部をコードする核酸も提供される。このような核酸を含むベクター及びプラスミド、並びにこのような核酸及び/又はベクター及びプラスミドを含む細胞及び細胞系が、本明細書においてさらに提供される。本明細書において提供される方法は、例えば、ヒトGIPRに結合する抗体又はGLP-1融合タンパク質を調製、同定又は単離するための方法、抗体又はGLP-1融合タンパク質がGIPRに結合するかどうかを決定するための方法、及びGIPRに結合する抗体又はGLP-1融合タンパク質を動物モデルに投与する方法を含む。
本明細書に記載される技術的解決法は、以下の実施例によってさらに理解されよう。
規定されない場合、本明細書に記載される出発材料及び機器は、市販されているか、又は当該技術分野において一般的に使用されるものである。以下の実施例における方法は全て、特に規定されない限り、当該技術分野における従来の方法である。
1:免疫付与のための抗原の調製
CHO-DHFR-細胞を、6ウェルプレート中に播種した。24時間後、細胞に、hGIPR(ヒトGIPR)遺伝子(ヌクレオチド配列については配列番号114、及びアミノ酸配列については配列番号113を参照)を含むpTM15プラスミドをトランスフェクトした。製造業者の推奨するプロトコルにしたがって、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの48時間後、培地を、300μg/mLのハイグロマイシンを含有する完全培地と交換し、安定したクローンが現れるまで、約2週間の培養の間、3日ごとに培地を交換した。分散された細胞群体を、プレートから取り出し、細胞が100%コンフルエンスに達するまで連続的に継代培養した。構築された安定した細胞系を、圧力選択後に陽性クローンを確認するために、V5タグに対するモノクローナル抗体(Life Technologies)を用いて、FACSによって分析した。大量の細胞表面hGIPR発現が、選択されたCHO-DHFR-hGIPR細胞において検出された。最後に、3つの高hGIPR発現の安定した細胞系が、サブクローニング及びさらなる確認によって同定された。これらの細胞系を、抗体調製のための免疫原を産生するのに使用した(実施例2を参照)。さらに、ある実施形態において、hGIPR及びhIgG Fcの細胞外ドメインの融合タンパク質も、抗体調製のための免疫原として使用され得る。調製方法は、以下のとおりである:hGIPR細胞外ドメイン、hIgG Fc及びペプチドリンカー(リンカー)の融合タンパク質遺伝子を、pTM5プラスミド中にサブクローニングする。細胞上清を、懸濁されたHEK293細胞を用いて大量一過性発現(mass transient expression)によって生成し、次に、hGIPR細胞外ドメイン融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィー精製によって得た。
CHO-DHFR-細胞を、6ウェルプレート中に播種した。24時間後、細胞に、hGIPR(ヒトGIPR)遺伝子(ヌクレオチド配列については配列番号114、及びアミノ酸配列については配列番号113を参照)を含むpTM15プラスミドをトランスフェクトした。製造業者の推奨するプロトコルにしたがって、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの48時間後、培地を、300μg/mLのハイグロマイシンを含有する完全培地と交換し、安定したクローンが現れるまで、約2週間の培養の間、3日ごとに培地を交換した。分散された細胞群体を、プレートから取り出し、細胞が100%コンフルエンスに達するまで連続的に継代培養した。構築された安定した細胞系を、圧力選択後に陽性クローンを確認するために、V5タグに対するモノクローナル抗体(Life Technologies)を用いて、FACSによって分析した。大量の細胞表面hGIPR発現が、選択されたCHO-DHFR-hGIPR細胞において検出された。最後に、3つの高hGIPR発現の安定した細胞系が、サブクローニング及びさらなる確認によって同定された。これらの細胞系を、抗体調製のための免疫原を産生するのに使用した(実施例2を参照)。さらに、ある実施形態において、hGIPR及びhIgG Fcの細胞外ドメインの融合タンパク質も、抗体調製のための免疫原として使用され得る。調製方法は、以下のとおりである:hGIPR細胞外ドメイン、hIgG Fc及びペプチドリンカー(リンカー)の融合タンパク質遺伝子を、pTM5プラスミド中にサブクローニングする。細胞上清を、懸濁されたHEK293細胞を用いて大量一過性発現(mass transient expression)によって生成し、次に、hGIPR細胞外ドメイン融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィー精製によって得た。
2:抗体の調製
hGIPRに対する抗体が、以下のいずれかを含む免疫原を用いて産生され得る。例えば、特定の実施形態において、hGIPRを発現する全細胞が、hGIPRに対する抗体を産生するための免疫原として使用される。さらに、特定の実施形態において、hGIPR及びhFcのN末端細胞外ドメインを含む融合タンパク質が、hGIPRに対する抗体を産生するための免疫原として使用される。免疫原及び水酸化アルミニウムアジュバントを混合し、BALB/cマウス(6~8週)の皮下に注入し、週に1回追加免疫した。合計6回の免疫付与後、血液試料を、尾静脈から採取し、血清を遠心分離によって分離し、次に、血清力価をFACSによって分析した。最も高い力価が得られた後、マウスを殺処分し、その脾臓細胞を、無菌状態で採取した。対数増殖期のSP2/0細胞を収集し、遠心分離し、細胞ペレットを、無血清培地で再度懸濁させ、次に、遠心分離し、再度二度目の懸濁を行い、計数した。脾臓細胞及びSP2/0細胞を、SP2/0細胞:脾臓細胞≧1:1の比率で混合した後、3回の洗浄-遠心分離を行った。最後の遠心分離からペレットを取り出した後、1mLの予め温めたPEG-1500を滴下して加え、1分間にわたってピペット混合し、30mLの予め温めた無血清培地をゆっくりと加えて、PEG融合を停止させた。細胞ペレットを、融合培地中で再度懸濁させた。100μL中の脾臓細胞及び支持細胞層細胞を、96ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。融合されたハイブリドーマ細胞及び支持細胞層細胞を、HAT(サルシン、アメトプテリン及びチミジン)選択を用いて、96ウェルプレート中で共培養して、非融合細胞を除去した。10日後、培養プレート中のハイブリドーマ細胞の上清を、ELISA分析のために収集した。
hGIPRに対する抗体が、以下のいずれかを含む免疫原を用いて産生され得る。例えば、特定の実施形態において、hGIPRを発現する全細胞が、hGIPRに対する抗体を産生するための免疫原として使用される。さらに、特定の実施形態において、hGIPR及びhFcのN末端細胞外ドメインを含む融合タンパク質が、hGIPRに対する抗体を産生するための免疫原として使用される。免疫原及び水酸化アルミニウムアジュバントを混合し、BALB/cマウス(6~8週)の皮下に注入し、週に1回追加免疫した。合計6回の免疫付与後、血液試料を、尾静脈から採取し、血清を遠心分離によって分離し、次に、血清力価をFACSによって分析した。最も高い力価が得られた後、マウスを殺処分し、その脾臓細胞を、無菌状態で採取した。対数増殖期のSP2/0細胞を収集し、遠心分離し、細胞ペレットを、無血清培地で再度懸濁させ、次に、遠心分離し、再度二度目の懸濁を行い、計数した。脾臓細胞及びSP2/0細胞を、SP2/0細胞:脾臓細胞≧1:1の比率で混合した後、3回の洗浄-遠心分離を行った。最後の遠心分離からペレットを取り出した後、1mLの予め温めたPEG-1500を滴下して加え、1分間にわたってピペット混合し、30mLの予め温めた無血清培地をゆっくりと加えて、PEG融合を停止させた。細胞ペレットを、融合培地中で再度懸濁させた。100μL中の脾臓細胞及び支持細胞層細胞を、96ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。融合されたハイブリドーマ細胞及び支持細胞層細胞を、HAT(サルシン、アメトプテリン及びチミジン)選択を用いて、96ウェルプレート中で共培養して、非融合細胞を除去した。10日後、培養プレート中のハイブリドーマ細胞の上清を、ELISA分析のために収集した。
3:抗体のELISAスクリーニング
hGIPRを過剰発現するCHO-DHFR-hGIPR細胞及びCHO-DHFR-ブランク細胞を、96ウェルプレート中に別々に移し、90%コンフルエンスに到達させた。培地の上清を除去し、付着した細胞を、PBSで2回洗浄し、100%のメタノールを加えて、4℃で細胞を固定した。次に、100μLの、作製したばかりの0.6%のH2O2-PBSを加え、室温で20分間にわたるインキュベーションの後、細胞をPBSで2回洗浄した。1%のBSA溶液(PBSに溶解された)でブロックした後、ハイブリドーマ上清を加え、4℃で90分間インキュベートした。数回の洗浄後、100μLの希釈されたヤギ抗マウスFc-HRP二次抗体(Sigma-Aldrich)を、各ウェルに加え、37℃で30分間インキュベートした。5回洗浄した後、100μLのTMB発色性基質を加え、37℃で15分間インキュベートし、次に、50μLの2MのH2SO4を加えて反応を停止させてから、450nmで読み取った。さらに、特定の実施形態において、hGIPR及びhFcのN末端細胞外ドメインの融合タンパク質が、コーティング抗原として使用される。1%のBSA(PBSに溶解された)でブロックした後、ハイブリドーマ細胞の上清を加え、4℃で90分間インキュベートした。後続の工程は、抗hGIPRモノクローナル抗体をスクリーニングする上記のELISA方法と同じである。陽性対照は、免疫付与されたマウスの血清であり;陰性対照は、細胞培地である。ELISAによる予備スクリーニングの後、hGIPR抗体を分泌するいくつかの陽性ハイブリドーマ細胞系が得られた。hGIPR抗体を分泌するこれらのハイブリドーマ細胞系を選択し、限界希釈法によってサブクローニングした。最後に、陽性ハイブリドーマ細胞の上清を、FACS分析によって確認した(実施例10を参照)。
hGIPRを過剰発現するCHO-DHFR-hGIPR細胞及びCHO-DHFR-ブランク細胞を、96ウェルプレート中に別々に移し、90%コンフルエンスに到達させた。培地の上清を除去し、付着した細胞を、PBSで2回洗浄し、100%のメタノールを加えて、4℃で細胞を固定した。次に、100μLの、作製したばかりの0.6%のH2O2-PBSを加え、室温で20分間にわたるインキュベーションの後、細胞をPBSで2回洗浄した。1%のBSA溶液(PBSに溶解された)でブロックした後、ハイブリドーマ上清を加え、4℃で90分間インキュベートした。数回の洗浄後、100μLの希釈されたヤギ抗マウスFc-HRP二次抗体(Sigma-Aldrich)を、各ウェルに加え、37℃で30分間インキュベートした。5回洗浄した後、100μLのTMB発色性基質を加え、37℃で15分間インキュベートし、次に、50μLの2MのH2SO4を加えて反応を停止させてから、450nmで読み取った。さらに、特定の実施形態において、hGIPR及びhFcのN末端細胞外ドメインの融合タンパク質が、コーティング抗原として使用される。1%のBSA(PBSに溶解された)でブロックした後、ハイブリドーマ細胞の上清を加え、4℃で90分間インキュベートした。後続の工程は、抗hGIPRモノクローナル抗体をスクリーニングする上記のELISA方法と同じである。陽性対照は、免疫付与されたマウスの血清であり;陰性対照は、細胞培地である。ELISAによる予備スクリーニングの後、hGIPR抗体を分泌するいくつかの陽性ハイブリドーマ細胞系が得られた。hGIPR抗体を分泌するこれらのハイブリドーマ細胞系を選択し、限界希釈法によってサブクローニングした。最後に、陽性ハイブリドーマ細胞の上清を、FACS分析によって確認した(実施例10を参照)。
4:抗体遺伝子のクローニング及びサブクローニング
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を収集した。ハイブリドーマmRNAを、QIAGEN mRNA抽出キットの製造業者のプロトコルにしたがって抽出した。次に、抽出されたmRNAを、cDNAに逆転写した。逆転写プライマーは、マウスの軽鎖及び重鎖定常領域に対して特異的なプライマーであり、特に、重鎖逆転写プライマーは、(5’-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3’)であり、軽鎖逆転写プライマーは、(5’-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’)及び(5’-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’)であった。RT-PCR反応条件は、以下のとおりに指定されていた:25℃で5分、50℃で60分、及び70℃で15分。逆転写されたcDNAを、500μLになるまで0.1mMのTEで希釈し、限外ろ過遠心分離管(Amicon Ultra-0.5)に加え、10分間にわたって2,000gで遠心分離した。ろ液を除去し、500μLの0.1mMのTEを加え、10分間にわたって2,000gで遠心分離した。ろ液を除去し、調製管を、新しい遠心分離管に逆さに入れ、10分間にわたって2,000gで遠心分離して、精製されたcDNAを得た。精製されたcDNA(10μL)を鋳型として取った後、4μLの5倍のテーリングバッファー(Promega)、4μLのdATP(1mM)及び10U末端トランスフェラーゼ(Promega)を加え、均一に混合し、37℃で5分間、次に、65℃で5分間インキュベートした。ポリAテールcDNAを、鋳型として使用し、抗体の軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子を増幅するために、PCRを行った。上流プライマーは全て、オリゴdTであり、重鎖下流プライマーは、(5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’)及び(5’-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’)であり、軽鎖下流プライマーは、(5’-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3’)であった。PCR反応条件は、以下のとおりであった:95℃で5分;95℃で30秒、56℃で30秒、72℃で1分、40サイクル;及び72℃で7分。PCR産物を、配列決定のためにPMD 18-Tベクター(Takara Bio)に連結した。PCRプライマーを、抗体のDNA配列に基づいて設計し、したがって、完全な軽鎖、重鎖シグナルペプチド及び可変ドメイン及びマウスIgG1定常領域を、発現ベクターpTM5に連結した。
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を収集した。ハイブリドーマmRNAを、QIAGEN mRNA抽出キットの製造業者のプロトコルにしたがって抽出した。次に、抽出されたmRNAを、cDNAに逆転写した。逆転写プライマーは、マウスの軽鎖及び重鎖定常領域に対して特異的なプライマーであり、特に、重鎖逆転写プライマーは、(5’-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3’)であり、軽鎖逆転写プライマーは、(5’-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’)及び(5’-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’)であった。RT-PCR反応条件は、以下のとおりに指定されていた:25℃で5分、50℃で60分、及び70℃で15分。逆転写されたcDNAを、500μLになるまで0.1mMのTEで希釈し、限外ろ過遠心分離管(Amicon Ultra-0.5)に加え、10分間にわたって2,000gで遠心分離した。ろ液を除去し、500μLの0.1mMのTEを加え、10分間にわたって2,000gで遠心分離した。ろ液を除去し、調製管を、新しい遠心分離管に逆さに入れ、10分間にわたって2,000gで遠心分離して、精製されたcDNAを得た。精製されたcDNA(10μL)を鋳型として取った後、4μLの5倍のテーリングバッファー(Promega)、4μLのdATP(1mM)及び10U末端トランスフェラーゼ(Promega)を加え、均一に混合し、37℃で5分間、次に、65℃で5分間インキュベートした。ポリAテールcDNAを、鋳型として使用し、抗体の軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子を増幅するために、PCRを行った。上流プライマーは全て、オリゴdTであり、重鎖下流プライマーは、(5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’)及び(5’-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’)であり、軽鎖下流プライマーは、(5’-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3’)であった。PCR反応条件は、以下のとおりであった:95℃で5分;95℃で30秒、56℃で30秒、72℃で1分、40サイクル;及び72℃で7分。PCR産物を、配列決定のためにPMD 18-Tベクター(Takara Bio)に連結した。PCRプライマーを、抗体のDNA配列に基づいて設計し、したがって、完全な軽鎖、重鎖シグナルペプチド及び可変ドメイン及びマウスIgG1定常領域を、発現ベクターpTM5に連結した。
5:抗体のヒト化及び最適化
最初に、マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の配列を、NCBIオンライン抗体可変領域配列アライメントツール(Ig Blast)を用いた検索において入力として使用して、ヒト化のためのマウス抗体可変領域配列と相同のヒト抗体の生殖系列遺伝子配列(Ig Germline Gene配列)を検索し、CDR配列を除いて最も高い相同性を有するヒト遺伝子配列を、CDRグラフト化のための鋳型として使用して、ヒト化抗体可変領域配列を得た。ヒト化抗体軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子を合成し、ヒトIgG2又はIgG4定常領域配列と組み合わせて、完全長組み換えヒト化抗体配列を得た。組み換え抗体を、実施例8にしたがって発現させ、GIPRに対するそれらの親和性を、実施例10に記載されるようにFACSによって分析して、最良の親和性を有する抗体を選択した。ヒト化抗体の可変領域配列を、部位特異的突然変異誘発によって操作して、GIPRに対するその親和性をさらに改善した。
最初に、マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の配列を、NCBIオンライン抗体可変領域配列アライメントツール(Ig Blast)を用いた検索において入力として使用して、ヒト化のためのマウス抗体可変領域配列と相同のヒト抗体の生殖系列遺伝子配列(Ig Germline Gene配列)を検索し、CDR配列を除いて最も高い相同性を有するヒト遺伝子配列を、CDRグラフト化のための鋳型として使用して、ヒト化抗体可変領域配列を得た。ヒト化抗体軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子を合成し、ヒトIgG2又はIgG4定常領域配列と組み合わせて、完全長組み換えヒト化抗体配列を得た。組み換え抗体を、実施例8にしたがって発現させ、GIPRに対するそれらの親和性を、実施例10に記載されるようにFACSによって分析して、最良の親和性を有する抗体を選択した。ヒト化抗体の可変領域配列を、部位特異的突然変異誘発によって操作して、GIPRに対するその親和性をさらに改善した。
6:ヒト化hGIPR抗体の遺伝子のサブクローニング
最適化ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子配列を、アウトソーシングによって合成した。このプロセス中、2つの制限部位、5’末端におけるNheI及び3’末端におけるSalIを、重鎖可変領域配列に導入した。完全な重鎖可変領域を、pTM5の発現ベクターにおける重鎖定常領域と連結した。同様に、NheIを5’末端に及びBsiwIを3’末端に導入することによって、軽鎖可変領域を、pTM5の発現ベクターにおける軽鎖定常領域と連結した。
最適化ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子配列を、アウトソーシングによって合成した。このプロセス中、2つの制限部位、5’末端におけるNheI及び3’末端におけるSalIを、重鎖可変領域配列に導入した。完全な重鎖可変領域を、pTM5の発現ベクターにおける重鎖定常領域と連結した。同様に、NheIを5’末端に及びBsiwIを3’末端に導入することによって、軽鎖可変領域を、pTM5の発現ベクターにおける軽鎖定常領域と連結した。
7:ヒト化hGIPR抗体及びGLP-1の融合タンパク質の構築物
最適化ヒト化抗体を、軽鎖のN末端又はC末端を介して、GLP-1又はその誘導体配列と融合して、GLP-1融合タンパク質を形成し、2つの配列を架橋としてのペプチドリンカー配列(リンカー)によって連結した。シグナルペプチド-GLP-1-リンカーのヌクレオチド配列が、Genscript Biotechnology Co.,Ltdによって合成される。合成遺伝子を鋳型として用いて、「シグナルペプチド-GLP1-リンカー」部分の配列を、PCRを用いて増幅した。さらに、ヒト化抗体のヌクレオチド配列を鋳型として用いて、融合タンパク質配列の抗体の配列を増幅する。次に、オーバーラップPCRによって、融合タンパク質の核酸配列の「シグナルペプチド-GLP-1-ペプチドリンカー」部分を、抗体部分と連結して、2つの制限酵素部位Nhe1及びNot1を、プライマーの両端に導入し、それによって、完全融合タンパク質配列及び発現ベクターpTM5が一緒に連結される。
最適化ヒト化抗体を、軽鎖のN末端又はC末端を介して、GLP-1又はその誘導体配列と融合して、GLP-1融合タンパク質を形成し、2つの配列を架橋としてのペプチドリンカー配列(リンカー)によって連結した。シグナルペプチド-GLP-1-リンカーのヌクレオチド配列が、Genscript Biotechnology Co.,Ltdによって合成される。合成遺伝子を鋳型として用いて、「シグナルペプチド-GLP1-リンカー」部分の配列を、PCRを用いて増幅した。さらに、ヒト化抗体のヌクレオチド配列を鋳型として用いて、融合タンパク質配列の抗体の配列を増幅する。次に、オーバーラップPCRによって、融合タンパク質の核酸配列の「シグナルペプチド-GLP-1-ペプチドリンカー」部分を、抗体部分と連結して、2つの制限酵素部位Nhe1及びNot1を、プライマーの両端に導入し、それによって、完全融合タンパク質配列及び発現ベクターpTM5が一緒に連結される。
8:hGIPR抗体及びGLP-1融合タンパク質の一過性発現
HEK293又はCHO浮遊細胞(5x105/mL)を、振とうフラスコに接種した。37℃で24時間回転させた後、細胞密度は、1x106/mLに達し、これをトランスフェクションに使用した。ポリエチレンイミン(PEI)を、トランスフェクション試薬として使用し、それをDNAと混合する。PEI/DNAの混合物を、15分間のインキュベーションの後、細胞培養物に加えた。PEI/DNAの混合物を与えた後、細胞を、37℃、5%のCO2で24時間にわたって連続的に培養した。次に、トリプトンを、発現のための補助として細胞培養物に加えた。最後に、タンパク質の発現が完了した(96時間超)後、細胞上清を、抗体精製のために収集した。
HEK293又はCHO浮遊細胞(5x105/mL)を、振とうフラスコに接種した。37℃で24時間回転させた後、細胞密度は、1x106/mLに達し、これをトランスフェクションに使用した。ポリエチレンイミン(PEI)を、トランスフェクション試薬として使用し、それをDNAと混合する。PEI/DNAの混合物を、15分間のインキュベーションの後、細胞培養物に加えた。PEI/DNAの混合物を与えた後、細胞を、37℃、5%のCO2で24時間にわたって連続的に培養した。次に、トリプトンを、発現のための補助として細胞培養物に加えた。最後に、タンパク質の発現が完了した(96時間超)後、細胞上清を、抗体精製のために収集した。
9:hGIPR抗体及びGLP-1融合タンパク質の精製及び分離
細胞及び細胞残屑を、遠心分離(8000rpm)後に培養物から除去し、上清を、0.22μmフィルタに通してろ過した。清澄化された上清が、精製に使用される。精製プロセスを、クロマトグラフによって完了させた。上清が、まず、プロテインA/Gアフィニティーカラムを通って流れ、その間、抗体が、プロテインA/Gに結合され、カラムに残っていた。次に、抗体を、低pH(3.0以下)を有する溶出緩衝液を用いてクロマトグラフィーカラムから溶離した。低pH溶離剤を、1Mのトリス-HClで直ぐに中和した。次に、精製された抗体を、PBS又は他の緩衝系に対して透析した。
細胞及び細胞残屑を、遠心分離(8000rpm)後に培養物から除去し、上清を、0.22μmフィルタに通してろ過した。清澄化された上清が、精製に使用される。精製プロセスを、クロマトグラフによって完了させた。上清が、まず、プロテインA/Gアフィニティーカラムを通って流れ、その間、抗体が、プロテインA/Gに結合され、カラムに残っていた。次に、抗体を、低pH(3.0以下)を有する溶出緩衝液を用いてクロマトグラフィーカラムから溶離した。低pH溶離剤を、1Mのトリス-HClで直ぐに中和した。次に、精製された抗体を、PBS又は他の緩衝系に対して透析した。
10:機能性hGIPR抗体の結合活性を確認するためのFACS
10mMのEDTAを含有するPBSを用いて、CHO-DHFR-hGIPR細胞を取り出し、管当たり105個の細胞を、1.5mLのEP管中に分配し、上清を、遠心分離後に除去した。陰性対照試料を、ローディングバッファー(PBS、2%のFBS)で再度懸濁させた。陽性対照については、特定の濃度の200μLのGIPR抗体溶液を、細胞に加え、室温でインキュベートし;インキュベーションの後、次に、細胞を、1500rpmで遠心分離して、上清を除去し、FACSローディングバッファーで洗浄し、再度遠心分離した。細胞を、1:50の希釈率でのFITC標識ヤギ抗マウス蛍光抗体又はPE標識ヤギ抗ヒト蛍光抗体の添加(200μL/ウェル)により再度懸濁させ、暗所で30分間にわたって室温でインキュベートした。上清を、遠心分離後に除去し、細胞を、FACSローディングバッファーで洗浄し、再度遠心分離し、FACS分析のためにローディングバッファーで再度懸濁させた。組み換え抗hGIPR機能性抗体は、GIPR発現CHO-DHFR-GIPR細胞に特異的に結合する。図1に示される実験結果において、灰色のピーク及び点線のピークは、陰性対照であり;1μMの抗体L10H8に対応する実線のピークは、著しい右への移動を示して、L10H8及びCHO-DHFR-GIPRの特異的結合を証明する。
10mMのEDTAを含有するPBSを用いて、CHO-DHFR-hGIPR細胞を取り出し、管当たり105個の細胞を、1.5mLのEP管中に分配し、上清を、遠心分離後に除去した。陰性対照試料を、ローディングバッファー(PBS、2%のFBS)で再度懸濁させた。陽性対照については、特定の濃度の200μLのGIPR抗体溶液を、細胞に加え、室温でインキュベートし;インキュベーションの後、次に、細胞を、1500rpmで遠心分離して、上清を除去し、FACSローディングバッファーで洗浄し、再度遠心分離した。細胞を、1:50の希釈率でのFITC標識ヤギ抗マウス蛍光抗体又はPE標識ヤギ抗ヒト蛍光抗体の添加(200μL/ウェル)により再度懸濁させ、暗所で30分間にわたって室温でインキュベートした。上清を、遠心分離後に除去し、細胞を、FACSローディングバッファーで洗浄し、再度遠心分離し、FACS分析のためにローディングバッファーで再度懸濁させた。組み換え抗hGIPR機能性抗体は、GIPR発現CHO-DHFR-GIPR細胞に特異的に結合する。図1に示される実験結果において、灰色のピーク及び点線のピークは、陰性対照であり;1μMの抗体L10H8に対応する実線のピークは、著しい右への移動を示して、L10H8及びCHO-DHFR-GIPRの特異的結合を証明する。
11:GIPRのそのインビトロ拮抗作用についてのhGIPR抗体又はhGIPR抗体/GLP-1融合タンパク質のcAMPアッセイ試験
ヒトGIPRを安定的に発現するCHO-DHFR細胞を、ウェル当たり30,000個の細胞で96ウェル細胞培養プレートに播種し、37℃、5%のCO2の培養器に一晩入れた。翌日、上清を除去し、45μL/ウェルのハイブリドーマ上清又は段階希釈された抗体を加えた。細胞を30分間にわたって室温にしておき、次に、GIPペプチドを、45μL/ウェルで加えた(Phoenix Pharmaceuticals、50pM)。次に、96ウェルプレートを、37℃、5%のCO2の培養器に30分間入れ、10μL/ウェルの10%のTriton X-100を加えて、細胞を室温で溶解させ、溶解物をピペットで均一に混合した。cAMPキット(CisBio)を用いて、実験において産生されたcAMPを検出した。10μL/ウェルを上回る細胞溶解物を、白色の384ウェルプレートに移し、5μL/ウェルの1:20希釈cAMP-d2を加え、最後に、5μL/ウェルの1:20希釈抗cAMP-Eu3±クリプテートを加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。時間分解蛍光665nm/620nmシグナル比を、Envision 2103マイクロプレートリーダーで読み取り、次に、Prism5.0を用いて、IC50値を計算した。図2は、L7H6が、IC50=7.6nMで、GIPRに拮抗することを示す。図3は、GLP-1-リンカー-L7H6が、IC50=14.9nMで、GIPRに拮抗することを示す。
ヒトGIPRを安定的に発現するCHO-DHFR細胞を、ウェル当たり30,000個の細胞で96ウェル細胞培養プレートに播種し、37℃、5%のCO2の培養器に一晩入れた。翌日、上清を除去し、45μL/ウェルのハイブリドーマ上清又は段階希釈された抗体を加えた。細胞を30分間にわたって室温にしておき、次に、GIPペプチドを、45μL/ウェルで加えた(Phoenix Pharmaceuticals、50pM)。次に、96ウェルプレートを、37℃、5%のCO2の培養器に30分間入れ、10μL/ウェルの10%のTriton X-100を加えて、細胞を室温で溶解させ、溶解物をピペットで均一に混合した。cAMPキット(CisBio)を用いて、実験において産生されたcAMPを検出した。10μL/ウェルを上回る細胞溶解物を、白色の384ウェルプレートに移し、5μL/ウェルの1:20希釈cAMP-d2を加え、最後に、5μL/ウェルの1:20希釈抗cAMP-Eu3±クリプテートを加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。時間分解蛍光665nm/620nmシグナル比を、Envision 2103マイクロプレートリーダーで読み取り、次に、Prism5.0を用いて、IC50値を計算した。図2は、L7H6が、IC50=7.6nMで、GIPRに拮抗することを示す。図3は、GLP-1-リンカー-L7H6が、IC50=14.9nMで、GIPRに拮抗することを示す。
12:GLP-1Rのそのインビトロ活性化についてのhGIPR抗体/GLP-1融合タンパク質のレポーター遺伝子アッセイ試験
hGLP1R及びCRE-ルシフェラーゼを共発現するCHO-DHFR-細胞を、ウェル当たり20000個の細胞で96ウェル細胞培養プレートに播種し、37℃で一晩培養した。翌日、培養上清を除去した。細胞を無血清培地で2回洗浄し、残液を同様に除去した。次に、連続希釈された抗体又はGLP-1を含有する100μLの無血清培地を加え、37℃で4時間インキュベートした。刺激の後、100μLのBright Glo化学発光基質(Promega)を加えた。最後に、細胞溶解物を、白色の96ウェルプレートに移し、相対光度を、SpectraMax Lマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)において記録した。図4は、GLP-1-リンカー-L7H6が、EC50=0.04nMで、hGLP-1Rを活性化することを示す。
hGLP1R及びCRE-ルシフェラーゼを共発現するCHO-DHFR-細胞を、ウェル当たり20000個の細胞で96ウェル細胞培養プレートに播種し、37℃で一晩培養した。翌日、培養上清を除去した。細胞を無血清培地で2回洗浄し、残液を同様に除去した。次に、連続希釈された抗体又はGLP-1を含有する100μLの無血清培地を加え、37℃で4時間インキュベートした。刺激の後、100μLのBright Glo化学発光基質(Promega)を加えた。最後に、細胞溶解物を、白色の96ウェルプレートに移し、相対光度を、SpectraMax Lマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)において記録した。図4は、GLP-1-リンカー-L7H6が、EC50=0.04nMで、hGLP-1Rを活性化することを示す。
13:高脂肪食誘導性C57BL/6肥満マウスにおけるhGIPR抗体のインビボ有効性試験
60%の高脂肪食誘導性C57BL/6マウス肥満モデル(DIOマウス)を確立した。マウスを購入し、1週間にわたって正常食を与えた後、通常のマウスの餌を与える正常対照群として一定数のマウスをランダムに選択し、残りの動物に高脂肪食を与えた。全ての動物に、8週間にわたって連続的に給餌し、体重及び食物摂取量を週に1回評価した。その後、高脂肪食を与えられたマウスを、その体重に応じて、L10H8群(10mg/kg)及びモデル群にランダムに分けた。薬剤を、6週間にわたって2日ごとに皮下注入した。正常対照群は投与されず、モデル群は、同じ量のブランク製剤を与えられる。体重、食物摂取量及び行動観察のデータを、実験期間中に収集した。実験の最終日に、12時間の絶食(水の摂取は自由)の後、血清を分離するために、動物の眼窩血液を採取し、次に、安楽死させ、肝臓を切開し、秤量し、肝臓の形態を観察した。血清中のALT、AST、GLU、TC及びTG、並びに肝臓中のTGを調べた(図5及び表3中の結果を参照)。
60%の高脂肪食誘導性C57BL/6マウス肥満モデル(DIOマウス)を確立した。マウスを購入し、1週間にわたって正常食を与えた後、通常のマウスの餌を与える正常対照群として一定数のマウスをランダムに選択し、残りの動物に高脂肪食を与えた。全ての動物に、8週間にわたって連続的に給餌し、体重及び食物摂取量を週に1回評価した。その後、高脂肪食を与えられたマウスを、その体重に応じて、L10H8群(10mg/kg)及びモデル群にランダムに分けた。薬剤を、6週間にわたって2日ごとに皮下注入した。正常対照群は投与されず、モデル群は、同じ量のブランク製剤を与えられる。体重、食物摂取量及び行動観察のデータを、実験期間中に収集した。実験の最終日に、12時間の絶食(水の摂取は自由)の後、血清を分離するために、動物の眼窩血液を採取し、次に、安楽死させ、肝臓を切開し、秤量し、肝臓の形態を観察した。血清中のALT、AST、GLU、TC及びTG、並びに肝臓中のTGを調べた(図5及び表3中の結果を参照)。
L10H8の6週間の投与の後、L10H8群の重量増加は、モデル群の重量増加よりわずかに低いに過ぎなかったが、肝重量は、モデル群の肝重量より有意に低く、正常対照群の肝重量に近かった。L10H8群の肝臓TGは、モデル群の肝臓TGより有意に低く、血清TGは、モデル群の血清TGより優位に高かった。これらの結果は、L10H8が、肝臓脂肪の吸収及び蓄積を著しく遅くすることを示す。図5は、各群の体重変化のパーセンテージを示す。表3は、6週間にわたってL10H8抗体を与えた後の各群における肝臓分析データを要約している。
14.hGIPR抗体/GLP-1融合タンパク質GLP-1-リンカー-V1W5のそのインビトロGLP-1R活性化に関するレポーター遺伝子アッセイ試験
hGLP-1R-CRE-ルシフェラーゼを共発現するCHO-DHFR-細胞を96ウェル細胞培養プレートにウェル当たり20000個の細胞で播種し、37℃で一晩培養した。翌日、培養上清を除去した。細胞を無血清培地で2回洗浄し、残液を同様に除去した。次に、段階希釈した抗体又はGLP-1を含有する100μLの無血清培地を加え、37℃で4時間インキュベートした。刺激後、100μLのBright Glo化学発光基質(Promega)を加えた。最後に、細胞溶解物を白色の96ウェルプレートに移し、SpectraMax Lマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で相対光度を記録した。図6は、GLP-1-リンカー-V1W5がEC50=17.40pMでhGLP-1Rを活性化させることを示す。
hGLP-1R-CRE-ルシフェラーゼを共発現するCHO-DHFR-細胞を96ウェル細胞培養プレートにウェル当たり20000個の細胞で播種し、37℃で一晩培養した。翌日、培養上清を除去した。細胞を無血清培地で2回洗浄し、残液を同様に除去した。次に、段階希釈した抗体又はGLP-1を含有する100μLの無血清培地を加え、37℃で4時間インキュベートした。刺激後、100μLのBright Glo化学発光基質(Promega)を加えた。最後に、細胞溶解物を白色の96ウェルプレートに移し、SpectraMax Lマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で相対光度を記録した。図6は、GLP-1-リンカー-V1W5がEC50=17.40pMでhGLP-1Rを活性化させることを示す。
15.hGIPR抗体又はhGIPR抗体/GLP-1融合タンパク質GLP-1-リンカー-V1W5のそのインビトロGIPR拮抗活性に関するcAMPアッセイ試験
ヒトGIPRを安定に発現するCHO-DHFR細胞を96ウェル細胞培養プレートにウェル当たり30,000個の細胞で播種し、37℃、5%のCO2の培養器に一晩入れた。翌日、上清を除去し、45μL/ウェルのハイブリドーマ上清又は段階希釈した抗体を加えた。細胞を室温に30分間放置し、次に45μL/ウェルのGIPペプチドを加えた(Phoenix Pharmaceuticals、50pM)。次に96ウェルプレートを37℃、5%のCO2の培養器に30分間入れ、10μL/ウェルの10%のTriton X-100を加えて細胞を室温で溶解させ、溶解物をピペットで均一に混合した。cAMPキット(CisBio)を用いて、実験中に産生されたcAMPを検出した。10μL/ウェルを上回る細胞溶解物を白色の384ウェルプレートに移し、5μL/ウェルの1:20希釈cAMP-d2を加え、最後に5μL/ウェルの1:20希釈抗cAMP-Eu3±クリプテートを加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。Envision 2103マイクロプレートリーダーで時間分解蛍光665nm/620nmシグナル比を読み取り、次にPrism5.0を用いてIC50値を計算した。図7は、GLP-1-リンカー-V1W5がIC50=7.03nMでヒトGIP受容体(hGIPR)に拮抗することを示す。図8は、GLP-1-リンカー-V1W5がIC50=4.30nMでサルGIP受容体(maGIPR)に拮抗することを示す。
ヒトGIPRを安定に発現するCHO-DHFR細胞を96ウェル細胞培養プレートにウェル当たり30,000個の細胞で播種し、37℃、5%のCO2の培養器に一晩入れた。翌日、上清を除去し、45μL/ウェルのハイブリドーマ上清又は段階希釈した抗体を加えた。細胞を室温に30分間放置し、次に45μL/ウェルのGIPペプチドを加えた(Phoenix Pharmaceuticals、50pM)。次に96ウェルプレートを37℃、5%のCO2の培養器に30分間入れ、10μL/ウェルの10%のTriton X-100を加えて細胞を室温で溶解させ、溶解物をピペットで均一に混合した。cAMPキット(CisBio)を用いて、実験中に産生されたcAMPを検出した。10μL/ウェルを上回る細胞溶解物を白色の384ウェルプレートに移し、5μL/ウェルの1:20希釈cAMP-d2を加え、最後に5μL/ウェルの1:20希釈抗cAMP-Eu3±クリプテートを加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。Envision 2103マイクロプレートリーダーで時間分解蛍光665nm/620nmシグナル比を読み取り、次にPrism5.0を用いてIC50値を計算した。図7は、GLP-1-リンカー-V1W5がIC50=7.03nMでヒトGIP受容体(hGIPR)に拮抗することを示す。図8は、GLP-1-リンカー-V1W5がIC50=4.30nMでサルGIP受容体(maGIPR)に拮抗することを示す。
16:カニクイザルにおけるGIPR抗体/GLP-1融合タンパク質の薬物動態試験
合計6匹のカニクイザル(3匹の雄及び3匹の雌)に、2mg/kgの用量でGLP-1/hGIPR抗体融合タンパク質の単回皮下注入を与え、0.6mLの全血試料を、投与部位と同じ体側の前肢の静脈を介して、投与前(0分)、投与後2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、2日、4日、6日、8日、10日、12日、18日、28日の時点でそれぞれ採取し、氷上の遠心分離管に入れ、自然な凝固の後、次に、血液試料を遠心分離して、血清を分離し、使用するまで低温(-80℃)で貯蔵した。血清試料中のGLP-1/hGIPR抗体融合タンパク質のGLP-1部分及びhGIPR抗体部分を、ELISAによって別々に定量し、カニクイザルにおける両方の半減期を、ソフトウェア解析によって決定した。
合計6匹のカニクイザル(3匹の雄及び3匹の雌)に、2mg/kgの用量でGLP-1/hGIPR抗体融合タンパク質の単回皮下注入を与え、0.6mLの全血試料を、投与部位と同じ体側の前肢の静脈を介して、投与前(0分)、投与後2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、2日、4日、6日、8日、10日、12日、18日、28日の時点でそれぞれ採取し、氷上の遠心分離管に入れ、自然な凝固の後、次に、血液試料を遠心分離して、血清を分離し、使用するまで低温(-80℃)で貯蔵した。血清試料中のGLP-1/hGIPR抗体融合タンパク質のGLP-1部分及びhGIPR抗体部分を、ELISAによって別々に定量し、カニクイザルにおける両方の半減期を、ソフトウェア解析によって決定した。
17:アカゲザルにおけるGIPR抗体/GLP-1融合タンパク質の薬物動態試験
合計9匹の雄の健常アカゲザルが、hGIPR抗体/GLP-1融合タンパク質(GLP-1-リンカー-V1W4、GLP-1-リンカー-V1W5、又はGLP-1-リンカー-V1W6)の4mg/kgの単回皮下注射を各群3匹の動物について受け、投与前(0分)及び投与後2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、2日、4日、6日、8日、10日、12日、16日、20日、24日、30日、36日、42日、50日、60日の時点で前肢の静脈から0.6mL全血試料を採取し、8μlのDDP-IV阻害剤が入った氷上の遠心分離機に入れ、自然な凝固の後、次に血液試料を遠心分離して血清を分離し、使用時まで低温(-80℃)で貯蔵した。血清試料中のGLP-1/hGIPR抗体融合タンパク質のhGIPR抗体部分及びGLP-1部分をELISAによって別々に定量し、アカゲザルにおける両方の半減期をソフトウェア解析によって決定した。
合計9匹の雄の健常アカゲザルが、hGIPR抗体/GLP-1融合タンパク質(GLP-1-リンカー-V1W4、GLP-1-リンカー-V1W5、又はGLP-1-リンカー-V1W6)の4mg/kgの単回皮下注射を各群3匹の動物について受け、投与前(0分)及び投与後2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、2日、4日、6日、8日、10日、12日、16日、20日、24日、30日、36日、42日、50日、60日の時点で前肢の静脈から0.6mL全血試料を採取し、8μlのDDP-IV阻害剤が入った氷上の遠心分離機に入れ、自然な凝固の後、次に血液試料を遠心分離して血清を分離し、使用時まで低温(-80℃)で貯蔵した。血清試料中のGLP-1/hGIPR抗体融合タンパク質のhGIPR抗体部分及びGLP-1部分をELISAによって別々に定量し、アカゲザルにおける両方の半減期をソフトウェア解析によって決定した。
PK結果から、上記に記載される3つのGLP-1/hGIPR抗体融合タンパク質の抗体部分のT1/2が、それぞれ、約360、679及び614時間であり、GLP-1部分のT1/2が、それぞれ、約87、82及び97時間であったことが示された。種々の群におけるサルのPK曲線及びパラメータを図9、図10及び表4に示す。
18:霊長類におけるhGIPR抗体/GLP-1融合タンパク質の有効性を評価するための高脂肪食誘導性肥満カニクイザルにおけるhGIPR抗体/GLP-1融合タンパク質のインビボ有効性試験
肥満カニクイザルモデル(DIOカニクイザル)を60%高脂肪食誘導によって確立し、次にそれを使用して皮下投与によるGLP-1-リンカー-L7H6のインビボ有効性を評価した。高脂肪食誘導性サルを、その体重に応じて、GLP-1-リンカー-L7H6(10mg/kg)群及びモデル群にランダムに分けた。薬剤を、合計8週間にわたって2日ごとに皮下注入し、モデル群に、等容積のブランク製剤を与えた。体重、食物摂取量及び行動観察のデータを、実験期間中に収集した。実験が完了した後、動物を安楽死させ、肝臓を切開し、秤量し、肝臓の形態を観察した。血清中のALT、AST、GLU、TC及びTG、並びに肝臓中のTC及びTGを調べた。
肥満カニクイザルモデル(DIOカニクイザル)を60%高脂肪食誘導によって確立し、次にそれを使用して皮下投与によるGLP-1-リンカー-L7H6のインビボ有効性を評価した。高脂肪食誘導性サルを、その体重に応じて、GLP-1-リンカー-L7H6(10mg/kg)群及びモデル群にランダムに分けた。薬剤を、合計8週間にわたって2日ごとに皮下注入し、モデル群に、等容積のブランク製剤を与えた。体重、食物摂取量及び行動観察のデータを、実験期間中に収集した。実験が完了した後、動物を安楽死させ、肝臓を切開し、秤量し、肝臓の形態を観察した。血清中のALT、AST、GLU、TC及びTG、並びに肝臓中のTC及びTGを調べた。
上記に記載される方法を用いてGLP-1-リンカー-V1W5を決定した。9匹の肥満カニクイザルを、製剤対照群、GLP-1-リンカー-V1W5群及び陽性対照(GLP-1R抗体とGLP-1との融合タンパク質の使用)群に、各群3匹のサルとしてランダムに分けた。薬剤を週2回、合計8週間にわたり、第1週目は1mg/kg及び第2週目は2mg/kgで皮下注射し、製剤対照群には等容積のブランク製剤を与えた。この試験中、サルの食物摂取量(図11)、体重及び体重変化計算値(図12及び図13)、行動観察、ルーチンの血液検査/血液生化学試験及びDEXA試験のデータを、体幹脂肪量変化及び総脂肪量変化の時間曲線(図14及び図15)、及び総脂肪量変化率の時間曲線(図16)を含めて収集した;図17が、サルの体重1キログラム当たりの総体脂肪量の変化の時間曲線を示した一方、図18が、サルの体重1キログラム当たりの総除脂肪組織量の変化の時間曲線を示した。
有効性試験から、製剤対照及びGLP-1R抗体とGLP-1との融合タンパク質と比較したとき、GLP-1-リンカー-V1W5によって動物の食物摂取量が減少し、さらには肥満カニクイザルの体重が有意に減少し、さらに重要なことには、GLP-1-リンカー-V1W5によって肥満カニクイザルの総脂肪量及び体幹脂肪量が減少した一方、サルの除脂肪組織量が増加したことが示された。一方で、行動観察、ルーチンの血液検査及び血液生化学試験の点で異常な観察なし。
試験終了時、動物の肝臓を生検し、肝臓TP、TG及びTCを検出した(結果は表5に示す)。種々の群の肝臓生化学試験結果から、GLP-1-リンカー-V1W5によって肝臓TC含有量が減少したことが示された。
上記の実施形態は、権利請求される実施形態を作製及び使用する方法を、当業者に十分に開示及び説明することが意図され、本開示の範囲を限定することは意図されていない。当業者に明らかな変更は、本明細書における特許請求の範囲内である。本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それらのそれぞれが具体的に且つ独立して参照により本明細書に援用されているかのように、参照により本明細書に援用される。
Claims (51)
- 1、2、3、4、5又は6つのアミノ酸配列を含む、ヒトGIPRに特異的に結合する抗体であって、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;
b.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;
c.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;
d.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26;
e.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29;及び
f.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される、抗体。 - 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、及び配列番号15;及び
b.重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18、配列番号23、及び配列番号26から選択される、請求項1に記載の抗体。 - 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含み又はさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号11、及び配列番号16;及び
b.重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19、配列番号21、配列番号24、配列番号27、及び配列番号29
から選択される、請求項1又は2に記載の抗体。 - 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含むか又はさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号14、及び配列番号17;及び
b.重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20、配列番号22、配列番号25、配列番号28、及び配列番号30
から選択される、請求項1~請求項3のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含むか又はさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17から選択される、請求項1~請求項4のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含むか又はさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、及び配列番号30から選択される、請求項1~請求項5のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号1及び配列番号18、配列番号4及び配列番号18、配列番号7及び配列番号23、配列番号10及び配列番号26、配列番号13及び配列番号26、及び配列番号15及び配列番号26から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR1アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項1~請求項6のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号2及び配列番号19、配列番号5及び配列番号21、配列番号8及び配列番号24、配列番号11及び配列番号27、及び配列番号16及び配列番号29から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR2アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項1~請求項7のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号3及び配列番号20、配列番号6及び配列番号22、配列番号9及び配列番号25、配列番号12及び配列番号28、配列番号14及び配列番号28、及び配列番号17及び配列番号30から独立して選択される軽鎖及び重鎖CDR3アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項1~請求項8のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、
(a)軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号1;
軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号2;
軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号3;
重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18;
重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号19;及び
重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号20;
(b)軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号4;
軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号5;
軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号6;
重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号18;
重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号21;及び
重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号22;
(c)軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号7;
軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号8;
軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号9;
重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号23;
重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号24;及び
重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号25;
(d)軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号10;
軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号11;
軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号12;
重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号26;
重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号27;及び
重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号28;
(e)軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号13;
軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号11;
軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号14;
重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号26;
重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号27;及び
重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号28;
(f)軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号15;
軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号16;
軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号17;
重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号26;
重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号29;及び
重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号30
を含む、請求項1~請求項9のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、
軽鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号15;
軽鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号16;
軽鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号17;
重鎖CDR1アミノ酸配列:配列番号26;
重鎖CDR2アミノ酸配列:配列番号29;及び
重鎖CDR3アミノ酸配列:配列番号30
を含む、請求項10に記載の抗体。 - 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖可変アミノ酸ドメイン配列:配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、及び配列番号71;及びいずれかの上記の配列の1つと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるアミノ酸配列;及び
b.重鎖可変アミノ酸ドメイン配列:配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80;及びいずれかの上記の配列の1つと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるアミノ酸配列
から選択される、請求項1~請求項11のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体コードポリヌクレオチド配列が、1又は2つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで、各ポリヌクレオチド配列が、独立して、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列:
a.軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列:配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、及び配列番号91;及びいずれかの上記の配列の1つと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるポリヌクレオチド配列;及び
b.重鎖可変ドメインコードポリヌクレオチド配列:配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、及び配列番号100;及びいずれかの上記の配列の1つと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるポリヌクレオチド配列から選択される、請求項1~請求項12のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、以下のリスト:配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、及び配列番号71から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか又はさらに含む、請求項1~請求項13のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか又はさらに含む、請求項1~請求項14のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号61及び配列番号72、配列番号62及び配列番号73、配列番号63及び配列番号74、配列番号64及び配列番号74、配列番号65及び配列番号75、配列番号66及び配列番号76、配列番号67及び配列番号77、配列番号68及び配列番号77、配列番号69及び配列番号78、配列番号70及び配列番号79、及び配列番号71及び配列番号80から独立して選択される軽鎖及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列の組合せを含む、請求項1~請求項15のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号73、配列番号74、配列番号76、及び配列番号77から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか又はさらに含む、請求項16に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号62及び配列番号73、配列番号63及び配列番号74、配列番号64及び配列番号74、配列番号66及び配列番号76、配列番号67及び配列番号77、及び配列番号68及び配列番号77から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含む、請求項16に記載の抗体。
- 前記抗体が、アミノ酸配列配列番号67又は配列番号77を含む、請求項16に記載の抗体。
- 前記抗体が、アミノ酸配列配列番号67及び配列番号77の組合せを含む、請求項16に記載の抗体。
- 前記抗体が、1又は2つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列:
a.軽鎖定常ドメインアミノ酸配列:配列番号101及び配列番号102;及び
b.重鎖定常ドメインアミノ酸配列:配列番号103、配列番号104及び配列番号124
から選択される、請求項1~請求項20のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、マウスGIPR抗体又はヒト化GIPR抗体である、請求項1~請求項21のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、GIPRモノクローナル抗体である、請求項1~請求項22のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号61及び配列番号72、配列番号62及び配列番号73、配列番号63及び配列番号74、配列番号64及び配列番号74、配列番号65及び配列番号75、配列番号66及び配列番号76、配列番号67及び配列番号77、配列番号68及び配列番号77、配列番号69及び配列番号78、配列番号70及び配列番号79、及び配列番号71及び配列番号80から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含むモノクローナル抗体である、請求項1~請求項23のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下のリスト:配列番号61及び配列番号72、配列番号62及び配列番号73、配列番号63及び配列番号74、配列番号64及び配列番号74、配列番号65及び配列番号75、配列番号66及び配列番号76、配列番号67及び配列番号77、配列番号68及び配列番号77、配列番号69及び配列番号78、配列番号70及び配列番号79、及び配列番号71及び配列番号80から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含むモノクローナル抗体である、請求項1~請求項23のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、組合せV1W1(配列番号125及び配列番号127)、V1W2(配列番号125及び配列番号128)、V1W3(配列番号125及び配列番号129)、V1W4(配列番号125及び配列番号130)、V1W5(配列番号125及び配列番号131)、V1W6(配列番号125及び配列番号132)、V1W7(配列番号125及び配列番号133)、V1W8(配列番号125及び配列番号134)、V1W9(配列番号125及び配列番号135)、V2W1(配列番号126及び配列番号127)、V2W2(配列番号126及び配列番号128)、V2W3(配列番号126及び配列番号129)、V2W4(配列番号126及び配列番号130)、V2W5(配列番号126及び配列番号131)、V2W6(配列番号126及び配列番号132)、V2W7(配列番号126及び配列番号133)、V2W8(配列番号126及び配列番号134)、又はV2W9(配列番号126及び配列番号135)の抗体を含む、請求項1~請求項25のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、組合せV1W4(配列番号125及び配列番号130)、V1W5(配列番号125及び配列番号131)、又はV1W6(配列番号125及び配列番号132)の抗体を含む、請求項1~請求項25のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、組合せV1W5(配列番号125及び配列番号131)の抗体を含む、請求項1~請求項25のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、1つ又は複数の以下の特性:
a.ヒトGIPRに結合する際に、参照GIPR抗体と同じか又はそれより良好なKdを提供すること;
b.GIPによって活性化されるヒトGIPRに拮抗する際に、参照GIPR抗体と同じか又はそれより良好なIC50を提供すること;及び
c.ヒトGIPRに対して参照GIPR抗体と結合に関して交差競合すること
を含む、請求項1~請求項28のいずれか一項に記載の抗体。 - ヒトGIPRに対して前記参照GIPR抗体と結合に関して交差競合する前記抗体、請求項29に記載の抗体。
- 前記参照GIPR抗体が、請求項1~請求項28のいずれか一項に記載の抗体を含む、請求項29又は請求項30に記載の抗体。
- 前記参照GIPR抗体が、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号67及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号77の組合せを含む、請求項31に記載の抗体。
- その特徴は、前記抗体が、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)スフラグメント、ドメイン抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、又はIgG4抗体から選択される、ことである請求項1~請求項32のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒトGIPのシグナル伝達を低減する際に、約1nM~200nM又は1nM~100nMのIC50を有する、請求項1~請求項33のいずれか一項に記載の抗体。
- GLP-1融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、請求項1~34のいずれか一項に記載のGIPR抗体、及び1、2、3、4、5、6、7又は8つのGLP-1フラグメント又は逆GLP-1フラグメントを含み;前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合するか、又は逆GLP-1フラグメントのアミノ末端を、前記GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端と結合するという構造的特徴を有するGLP-1融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、GIPR抗体及び1、2、3又は4つのGLP-1フラグメントを含み;前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合する、請求項35に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、GIPR抗体及び1つ、2つ、3つ又は4つの逆GLP-1フラグメントを含み;前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、逆GLP-1フラグメントのアミノ末端を、GIPR抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端と結合する、請求項35に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質がGIPR抗体及び2つのGLP-1フラグメントを含み;前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介してGLP-1フラグメントのカルボキシ末端をGIPR抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端に結合する、請求項35に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質がGIPR抗体及び2つの逆GLP-1フラグメントを含み;前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して逆GLP-1フラグメントのアミノ末端をGIPR抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシ末端に結合する、請求項35に記載の融合タンパク質。
- 前記GIPR抗体、GLP-1フラグメント及びペプチドリンカーが、以下の方法のうちの1つにおいて融合されて前記融合タンパク質を形成し:
ペプチドリンカーを介して、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端が、GIPR抗体の軽鎖のアミノ末端に融合され:N’-GLP-1-リンカー-R-C’;
ペプチドリンカーを介して、GLP-1フラグメントのカルボキシ末端が、GIPR抗体の重鎖のアミノ末端に融合され:N’-GLP-1-リンカー-R-C’;
ここで:N’が、前記融合タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、C’が、前記融合タンパク質のポリペプチド鎖のカルボキシ末端を表し、GLP-1が、GLP-1フラグメントを表し、Rが、請求項1~34のいずれか一項に記載のGIPR抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列を表し、リンカーが、ポリペプチドリンカーを表す、請求項35に記載の融合タンパク質。 - 前記ペプチドリンカーが、配列番号110、配列番号111、及び配列番号112から独立して選択される、完全長、部分的、又は反復アミノ酸配列を含む、請求項35~40のいずれか一項に記載のGLP-1融合タンパク質。
- 前記GLP-1フラグメントが、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、及び配列番号109から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか;又は前記逆GLP-1フラグメントが、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、及び配列番号123から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、請求項35~40のいずれか一項に記載のGLP-1融合タンパク質。
- 請求項1~34のいずれか一項に記載のGIPR抗体、又は請求項35~42のいずれか一項に記載のGLP-1融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項43に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項44に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 薬学的に許容できる担体と混合された、請求項1~34のいずれか一項に記載のGIPR抗体又は請求項35~42のいずれか一項に記載のGLP-1融合タンパク質を含む医薬組成物。
- 非アルコール性脂肪肝疾患を予防又は処置するための薬剤の調製における、請求項1~34のいずれか一項に記載のGIPR抗体又は請求項35~42のいずれか一項に記載のGLP-1融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
- 2型糖尿病を予防又は処置するための薬剤の調製における、請求項1~34のいずれか一項に記載のGIPR抗体又は請求項35~42のいずれか一項に記載のGLP-1融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
- 肥満及び肥満関連疾患を体重減少又は処置するための薬剤の調製における、請求項1~34のいずれか一項に記載のGIPR抗体又は請求項35~42のいずれか一項に記載のGLP-1融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
- 非アルコール性脂肪肝疾患、肥満、又は2型糖尿病のうちの2つ以上の疾患を同時に処置するための薬剤の調製における、請求項1~34のいずれか一項に記載のGIPR抗体又は請求項35~42のいずれか一項に記載のGLP-1融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
- 前記医薬組成物が、静脈内に又は皮下に投与されるものである、請求項47~50のいずれか一項に記載の使用。
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