JP2022548905A - Ｄｍａｒｄに対する患者の応答を予測する方法 - Google Patents

Ｄｍａｒｄに対する患者の応答を予測する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、炎症状態を有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)を用いた処置に応答するかどうかを予測する方法であって、DMARDナイーブ患者試料中の少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップ、及び患者を予測されるDMARD応答者又は予測されるDMARD非応答者として分類するステップを含む、方法を提供する。本発明は、患者における炎症状態の処置における使用のための疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)の有効性を評価する方法も提供する。本発明は、関節リウマチを有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、どの関節リウマチ病型を発症するかを予測する方法も提供する。【選択図】図１－１

Description

本出願は、炎症状態の処置における使用のための疾患修飾性抗リウマチ薬(disease-modifying antirheumatic drug)(DMARD)の有効性を評価する方法に関する。本出願は、関節リウマチを有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、どの関節リウマチ病型を発症するかを予測する方法にも関する。本出願は、炎症状態を有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、DMARDを用いた処置に応答するかどうかを予測する方法にも関する。
正確な医薬的アプローチは、関節リウマチ(RA)を有する患者を含む、慢性炎症障害を有する患者の処置に、患者が画一的なアプローチを使用した規範的手段で処置される現在の方法より有効な可能性があると広く考えられている。残念ながら、関節リウマチを含む多くの慢性炎症状態において処置応答性を判定するロバストなバイオマーカーが欠けていることが、臨床状況におけるこのアプローチの開発の妨げになっている。
本明細書に記載されている結果から、処置を開始する前の血漿脂質メディエーターの濃度は、DMARDに応答する患者において、応答しない患者と比較した場合、異なることが実証される。機械学習方法論を使用すると、処置への応答に対する予測精度が最大約95%で、2つのRAコホートにおいて、特異的炎症収束性メディエーター(specialized pro-resolving mediator)(SPM)として公知のメディエーター群の濃度が、処置応答性を予測することを本発明者らは見出した。さらに、DMARDで処置を開始する前の血漿SPM濃度も、独特な関節疾患の病型を反映すると見出した。この研究に登録された患者は、DMARDナイーブであったが、両方のコホートにおいて患者の大半が、幾つかの併存症のために幅広い他の薬物治療を継続中であったことは注目すべきである。したがって、DMARD応答性を予測する特定の脂質メディエーターのシグネチャーの特定により、これらの脂質メディエーターにおける変化がこの治療薬群に特異的であることが示唆される。SPMは、宿主の先天性及び適応免疫応答を制御すること、並びにSPM生成は、白血球活性化状態を反映することを踏まえ(Dalli, J. & Serhan, C.N.「Specific lipid mediator signatures of human phagocytes: microparticles stimulate macrophage efferocytosis and pro-resolving mediators.」Blood 120、e60～72(2012)、Gao, Y.ら「Female-Specific Downregulation of Tissue Polymorphonuclear Neutrophils Drives Impaired Regulatory T Cell and Amplified Effector T Cell Responses in Autoimmune Dry Eye Disease.」J Immunol 195、3086～3099(2015)、及びSerhan, C.N. & Levy, B.D.「Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators.」J Clin Invest 128、2657～2669(2018)、そのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる)、この所見は、末梢血液SPM濃度が、患者を層別し、DMARDに対する処置応答性を予測するために機能的なバイオマーカーとして使用され得ることを指し示す。
SPMの生合成は、酵素の発現及び活性に依拠する生物活性生成物の正しい形成、並びにそれらの適切な細胞内局在化により、個別の酵素による必須脂肪酸の立体選択的変換に関与する。処置後6ヶ月の血漿のキラルクロマトグラフィー分析により、モノヒドロキシル化脂肪酸のS-異性体の優位が実証された。この観察は、測定されたモノヒドロキシル化脂肪酸の形成における、酵素、例えばシトクロムP450酵素の寄与を排除しないが、これにより、末梢血液SPM濃度がこの患者群において全体的に低下したにもかかわらず、DMARD非応答者においてALOX活性が持続することが示唆される。したがって、SPMの生合成経路は、DMARD処置の開始後に脱共役になることを示唆する。
第1の態様によると、本発明は、患者における炎症状態の処置における使用のための疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)の有効性を評価する方法であって、DMARDの投与前後に患者から得られた試料中の少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップを含み、DMARDの投与後の少なくとも1つのSPMのレベルの増大が、DMARDの有効性を示す、方法を提供する。
第2の態様によると、本発明は、関節リウマチを有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、どの関節リウマチ病型を発症するかを予測する方法であって、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)ナイーブ患者試料中の少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップ、並びに患者が発症する関節リウマチ病型を、リンパ骨髄性(Lympho-myeloid)、びまん性骨髄性(Diffuse-myeloid)及び微量免疫線維性(Pauci-immune-fibroid)として分類するステップを含む、方法を提供する。
第3の態様によると、本発明は、炎症状態を有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)を用いた処置に応答するかどうかを予測する方法であって、DMARDナイーブ患者試料中の少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップ、及び患者を予測されるDMARD応答者又は予測されるDMARD非応答者として分類するステップを含む、方法を提供する。
以下のように、幾つかの図面に対して参照が行われる。
DMARDナイーブRA患者における処置応答性を予測するベースラインの血漿脂質メディエータープロファイルの図である。 血漿は、DMARDを用いて処置を開始する前にRA患者から収集し、脂質メディエーター濃度は、LC-MS/MSに基づく脂質メディエータープロファイリングを使用して確定した(詳細については方法を参照されたい)。(A、B)DMARD応答者(Resp)及びDMARD非応答者(非Resp)での末梢血液脂質メディエーター濃度のOPLS-DA分析。(A)95%信頼域を表す灰色丸印を伴う2次元スコアプロット。(B)2次元ローディングプロット。1超のVIPスコアを有する脂質メディエーターは、青色で強調され、非Respで上方制御される。結果は、n=30 Resp及びn=22 非Respを表す。(C)指し示されている特定及び定量化したすべての脂質メディエーター(AL LM)又は個々の脂肪酸メタボロームの組合せに基づく予測モデルの%精度スコア。Clin.スコア=臨床スコア(含まれるパラメーターについては方法を参照されたい)。(D)予測モデルでのROC曲線及びAUC値。(E)n-3 DPAモデルの各クラス(感度及び特異度)に対する分類予測。緑色は、Respと予測された試料を指し示す一方、青色は、非Respと予測される患者を指し示す。パーセンテージは、真陽性(Respクラス)及び真陰性(非Respクラス)を指し示す。(F)精度の低下に基づく「ALL LM」モデルの予測性能における脂質メディエーターの関連性。(G)指し示されたSPMを使用するモデルの%精度スコア。(H)指し示されたSPMに基づく予測モデルに対するROC曲線及びAUC値。すべてのモデルは、ランダムフォレスト方法論(Rの「randomForest」パッケージ)を使用して作出した。 図１－１の続き。 図１－２の続き。 図１－３の続き。 DMARD非応答者における、DMARD応答者と比較した場合のベースラインの末梢血液脂質メディエーター濃度の上方制御の図である。 末梢血液は、DMARDの処置を開始する前に、患者であるDMARD応答者(Resp)及びDMARD非応答者(非Resp)において収集した。末梢血液脂質メディエータープロファイルは、保持時間及びMS/MS断片化スペクトルのマッチングを含めて、公表された基準に従って確定した。非Respにおける、Respと比較した場合の(上パネル)DHA及びn-3 DPA、並びに(下パネル)EPA及びAA生物活性メタボロームからのメディエーターの示差的発現に関する経路分析。非Resp及びResp群からの脂質メディエーターの標準化された濃度(倍数変化として表される)間の統計的な差は、student T-検定、続いてBenjamini-Hochberg手順を使用する多重比較補正を使用して判定した。結果は、Respでn=67及びn=30 非Respを表す。 図２－１の続き。 DMARD応答者とDMARD非応答者との間で本質的に同一であるALOX酵素のベースライン発現の図である。 末梢血液を、DMARDの処置を開始する前に、患者であるDMARD応答者(Resp)及びDMARD非応答者(Non Resp)において収集し、ALOX酵素の発現を評価した。RNAカウントの標準化及び示差的遺伝子発現分析は、Bioconductor Rパッケージ「edgeR」の擬似尤度法を使用して行った。データは、100万当たりのカウントの対数(Log(CPM))として表され、これは、100万とした、配列決定したリードの数によりスケーリングされる、遺伝子へのリードマッピングの数を指し示す。結果は、Respでn=43及び非Respでn=15を表す。 DMARDの処置を開始する前に、非応答者からの血漿における、応答者と比較した場合の全4つの必須脂肪酸メタボロームからのALOX5、ALOX12及びALOX15生成物の上方制御の図である。 血漿は、DMARDの処置を開始する前に、RA患者から収集し、LC-MS/MSに基づく脂質メディエータープロファイリングを使用して、ALOX5(7-HDHA、7-HDPA、5-HEPE及び5-HETE)、ALOX12(14-HDHA及び14-HDPA)及びALOX15(17-HDHA、17-HDPA、15-HEPE及び15-HETE)の活性を調査した。結果は、95%CIを有する平均として表される。Mann-Whitney検定を使用して*p<0.05。DMARD応答者(Resp)でN=30及びDMARD非応答者(非Resp)で24。 機械学習モデルの予測性を向上させる、SPM選択濃度と、疾患病型との組合せの図である。血漿は、DMARDを用いて処置を開始する前に、RA患者から収集し、脂質メディエーター濃度は、LC-MS/MSに基づく脂質メディエータープロファイリングを使用して確定した。(A、B)リンパ性骨髄性(リンパ性)、びまん性骨髄性(骨髄性)及び微量免疫線維性(線維性)病型での末梢血液脂質メディエーター濃度のPLS-DA分析。(A)3次元スコアプロット。(B)3つの群の間の濃度における最大の差を示す15種の脂質メディエーターの投影における変数の重要度(VIP)スコア。結果は、線維性ではn=18、骨髄性ではn=17及びリンパ性ではn=19を表す。(C)各病型についてDMARD応答者(Resp)と比較した場合、DMARD非応答者(非Resp)におけるDHA及びn-3 DPA生物活性メタボロームから示差的に発現したメディエーターでの経路分析。非Resp及びResp群からの脂質メディエーターの標準化された濃度(倍数変化として表される)の間の統計的な差は、student t-検定、続いてBenjamini-Hochberg手順を使用する多重比較補正を使用して判定した。結果は、線維性Respではn=19、線維性非Respではn=9、リンパ性Respではn=19、リンパ性非Respではn=8、骨髄性Respではn=22、骨髄性非Respではn=9を表す。(D)異なる病型(線維性、リンパ性及び骨髄性)に対する特定のデータセットを使用して作出されたRvD4、10S,17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPAモデルの各クラス(感度及び特異度)に対する分類精度。緑色は、Respとして予測される試料を指し示す一方、青色は、予測される非Respを指し示す。パーセンテージは、真陽性(Respクラス)及び真陰性(非Respクラス)を指し示す。すべてのモデルは、ランダムフォレスト方法論(Rの「randomForest」パッケージ)を使用して作出した。 図５－１の続き。 図５－２の続き。 図５－３の続き。 個別の病型を有する患者からのDMARD応答者及びDMARD非応答者の末梢血液におけるAA及びEPAメタボロームの示差的制御の図である。 血漿は、DMARDの処置を開始する前にRA患者から収集した。脂質メディエーターを特定し、LC-MS/MSに基づく脂質メディエータープロファイリングを使用して定量化し、AA及びEPAメタボロームからのメディエーターの示差的発現を、DMARD非応答者(非Resp)において、DMARD応答者(Resp)と比較した場合の各RA病型について分析した。結果は、線維性Respではn=19、線維性非Respではn=9、リンパ性Respではn=19、リンパ性非Respではn=8、骨髄性Respではn=22、骨髄性非Respではn=9を表す。 図６－１の続き。 図６－２の続き。 処置開始から6ヶ月後に、DMARD非応答者における、DMARD応答者と比較した場合の、末梢血液SPM濃度の低下の図である。末梢血液を、処置開始から6ヶ月後に関節疾患の減少を呈示した患者(DMARD応答者、Resp)及び呈示しなかった患者(DMARD非応答者、非Resp)において収集した。末梢血液脂質メディエータープロファイルは、LC-MS/MSに基づく脂質メディエータープロファイリングを使用して確定した。(A、B)Resp及び非Respからの脂質メディエータープロファイルのOPLS-DA。(A)スコアプロット、(B)暗灰色又は黒色で強調され、Resp又は非Respのそれぞれと対応する、1超のVIPスコアを呈示するメディエーターでのローディングプロットを表す。(C～D)非Respにおける、Respと比較した場合の(C)DHA及びn-3 DPA、並びに(D)EPA及びAA生物活性メタボロームからのメディエーターの示差的発現に対する経路分析。非Resp及びResp群からの脂質メディエーターの標準化された濃度(倍数変化として表される)の間の統計的な差は、student t-検定、続いてBenjamini-Hochberg手順を使用する多重比較補正を使用して判定した。結果は、Respではn=27及び非Respではn=17を表す。 図７－１の続き。 図７－２の続き。 DMARDの処置開始から6ヶ月後に、DMARD非応答者からの血漿における、DMARD応答者と比較した場合のDHA及びn-3 DPAメタボロームからのALOX5、ALOX12及びALOX15生成物の上方制御の図である。 血漿を、DMARDの処置開始から6ヶ月後にRA患者から収集し、ALOX5(7-HDHA及び7-HDPA)、ALOX12(14-HDHA及び14-HDPA)並びにALOX15(17-HDHA及び17-HDPA)の活性を、LC-MS/MSに基づく脂質メディエータープロファイリングを使用して調査した。結果は、95%CIを有する平均として表される。Mann-Whitney検定を使用して*p<0.05。DMARD応答者(Resp)ではN=30及びDMARD非応答者(非Resp)では24。 MTXが、ヒト末梢血液におけるSPM形成を上方制御する図である。ヒト健常志願者の末梢血液を、100nMのMTXの有無を問わずインキュベーションした(37℃、45min(分))。血漿を遠心分離により得、末梢血液SPM濃度を、LC-MS/MSに基づく脂質メディエータープロファイリングを使用して判定した。(A)血漿SPM濃度のOPLS-DA分析。着色球面領域は、それぞれのインキュベーションの95%信頼域を呈示する。(B)2つの群の間の濃度における最大の差を示す15種の脂質メディエーターの投影における変数の重要度(VIP)スコア。(C)MTXにより上方制御された脂質メディエーターファミリーの累積濃度。A、Bに対する結果は、3件の個別の実験からのドナーn=6を表す。Cに対する結果は、平均±SEM、ドナーn=6、Mann-Whitney検定を使用して*p<0.05vsビヒクル群である。(D～E)マウスにMTX(1μg/マウス又は22μg/マウス)又はビヒクルを、静脈内注射により投与した。血液を次いで1時間後に収集し、SPM濃度を、LC-MS/MSに基づく脂質メディエータープロファイリングを使用して判定した。(D)血漿SPM濃度のoPLS-DA分析。着色領域は、それぞれのインキュベーションの95%信頼域を呈示する。(E)3つの群の間の濃度における最大の差を示す15種の脂質メディエーターの投影における変数の重要度(VIP)スコア。結果は、群当たりのマウスn=4を表し、2つの個別の状況で実験を実施した。 図９－１の続き。 図９－２の続き。 炎症性関節炎において、ALOX15活性の欠失がMTXの保護作用を無効化する図である。炎症性関節炎は、野生型(WT)及びAlox15-/-欠乏マウスで、0及び2日目の関節炎誘発性血清の投与により開始した。マウスを次いで、3、5及び7日目にMTX(25mg/Kg)又はビヒクル(PBS)で、腹腔内注射により処置した。疾患重症度は、(A)26ポイントの臨床スコアを使用して、疾患活動性、(B)体重及び(C)前足の浮腫を測定することにより評価された。(D)疾患の開始後8日に、関節を収集し、白血球を遊離し、浸潤された白血球の数を、フローサイトメトリー及び蛍光標識抗体を使用して判定した。A～Cでの結果は、平均±SEMであり、Dでは群当たりのマウスn=7のビヒクルのパーセンテージである。Dでの結果は、群当たりのマウスn=8を表す。実験は、2つの個別の状況で実施した。A～Cでは二元配置ANOVAを使用し、Dでは1サンプルt検定を使用して*p<0.05vsビヒクル群。 図１０－１の続き。 MTXが、ALOX15ヌルマウスにおいて欠失している作用である、炎症性関節炎中の末梢血液及び関節における炎症性エイコサノイドのレベルを制御する図である。 炎症性関節炎を、野生型(WT)及びAlox15-/-マウスでK/BxN血清を、腹腔内注射により0及び2日目に注入することにより開始した。MTX(25μg/マウス)を3、5及び7日目に投与した。血液及び関節を8日目に収集し、(A)血漿及び(B)関節における炎症性エイコサノイドの濃度を、LC-MS/MSプロファイリングを使用して判定した。結果は、ビヒクル対照の%として提示される。2つの個別の実験からの群当たりマウスn=7。1サンプルt-検定を使用して*p<0.05。 p300及びMAPKの阻害が、SPM生合成を低下させ、炎症性関節炎におけるMTXの関節の保護作用を無効化する図である。(A～B)ヒト末梢血液をビヒクル、L002(p300阻害剤、2μM)又はSB202190(MAPK阻害剤5μM)と37℃にて15分、次いでMTX(100nM)又はビヒクルと(37℃、45min)インキュベーションした。血漿を遠心分離により収集し、SPMを特定し、LC-MS/MSに基づく脂質メディエータープロファイリングを使用して定量化した(詳細については方法を参照されたい)。(A)特定された脂質メディエーター濃度のsPLS-DAスコアプロット(B)主成分1におけるトップ10の示差的に制御されたメディエーターの寄与。結果は、2つの個別の状況で実施した実験での、群当たりの志願者n=6を表す。(C～G)炎症性関節炎は、マウスで、関節炎誘発性血清を0及び2日目に投与することにより開始した。マウスを次いでビヒクル(PBS)、MTX(25mg/Kg)、MTXとL002(20mg/Kg)又はMTXとSB202190(20mg/Kg)で腹腔内注射により、3、5及び7日目に処置した。疾患重症度を、(C)26ポイントの臨床スコアを使用した疾患活動性、(D)疾患開始後8日で収集した膝部のヘマトキシリン及びエオシン染色を使用した関節組織学的検査、元の倍率=×4及び(E)体重を測定することにより評価した。(F、G)疾患の開始後8日で関節を収集し、(F)白血球を前足から遊離させ、前足中に浸潤した好中球の数を、フローサイトメトリー及び蛍光標識抗体を使用して判定した。(G)脂質メディエーターを抽出し、LTB4の濃度を、液体クロマトグラフィータンデム質量分析を使用して判定した。C、E、Fは、平均±SEMであり、Gは、群当たりのマウスn=4のビヒクルのパーセンテージであり、実験は、2つの個別の状況で実施した。Dでの結果は、群当たりのマウスn=8を表す。C及びEで二元配置ANOVA、Fで一元配置ANOVAを使用して、Gで1サンプルt検定を使用した*p<0.05vsビヒクル群。F=大腿骨;m=半月板;PF=パンヌス形成;T=脛骨。 図１２－１の続き。 図１２－２の続き。 ランダムフォレスト及びSVMモデルの最適なパラメーターを確定する図である。(A)ランダムフォレストモデル及び(B)SVMモデルで、(A)決定木、(B)アンサンブル相互作用の数を増加させることによる平均パーセント精度で得られた代表的な結果。 DMARD応答者及び非応答者からのベースラインの血漿のキラルクロマトグラフィーが、より高い濃度のS-モノヒドロキシル化異性体を実証する図である。血漿を抽出し、(A)DHA、(B)n-3 DPA、(C)EPA及び(D)AAから指し示されるモノヒドロキシ脂肪酸に対するキラル異性体のそれぞれでの相対存在量を、キラルLC-MS/MS MRMアプローチを使用して、曖昧さなしで判定した。結果は、n=29 DMARD応答者及び22 DMARD非応答者を表す。 DMARD応答者及び非応答者からの6ヶ月血漿のキラルクロマトグラフィーが、より高い濃度のS-モノヒドロキシル化異性体を実証する図である。血漿を抽出し、(A)DHA、(B)n-3 DPA、(C)EPA及び(D)AAから指し示されるモノヒドロキシ脂肪酸に対するキラル異性体のそれぞれでの相対存在量を、キラルLC-MS/MS MRMアプローチを使用して、曖昧さなしで判定した。結果は、n=29 DMARD応答者及び22 DMARD非応答者を表す。
第1の態様によると、本発明は、患者における炎症状態の処置における使用のための疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)の有効性を評価する方法であって、DMARDの投与前後に患者から得られた試料中の少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップを含み、DMARDの投与後の少なくとも1つのSPMのレベルの増大が、DMARDの有効性を示す、方法を提供する。
患者及び疾患
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、ヒト又は非ヒト哺乳動物を指すために、互換的に使用される。対象は、コンパニオン非ヒト哺乳動物(すなわち、ペット、例えばイヌ、ネコ、モルモット、又は非ヒト霊長類、例えばサル若しくはチンパンジー)、農業用農場哺乳動物、例えば有蹄哺乳動物(例えばウマ、ウシ、ブタ又はヤギ)又は実験用非ヒト哺乳動物(例えばマウス及びラット)であり得る。本発明は、ヒト対象の処置に関して最大の適用を見出し得る。
炎症状態は、関節リウマチ、強直性脊椎炎に関連する関節炎、心血管疾患(CVD)、歯周病、喘息、糖尿病及び炎症性腸疾患(IBD)、潰瘍性大腸炎、クローン病又は神経学的障害、例えばアルツハイマー病であり得る。炎症状態は、心血管疾患(CVD)又は関節リウマチであり得る。好ましくは、炎症状態は関節リウマチである。
本明細書における実施形態のうちのいずれかでは、対象はヒトであり得る。対象は、炎症状態、例えば関節リウマチと診断された対象であり得る。対象は、炎症状態、例えば関節リウマチのための処置を受けている対象であり得る。
本方法は、有利には、医薬の個別化を可能とする。各患者は、任意の他の患者と比較した場合、遺伝学及びその環境における差を有するため、DMARDを含む薬物に異なって応答するであろう。患者がDMARDに応答していない場合には、代替の治療が必要となることがある。本発明の方法は、したがって、個別の患者についてのより良好な臨床的判断の決定を可能とする。患者は、したがって、「個別の患者」として記載され得る。
疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)
疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)は、薬物の一分類である。この薬物の分類のメンバーは、当業者に公知である。当業者には、どの薬物がDMARDでないかということ、例えばスタチンはDMARDでないことも公知である。スタチンとしては、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチンが挙げられ、それらはいずれもDMARDではない。DMARDとしては、生物学的(又は「生物的」)及び非生物学的(又は「非生物的」)薬物の両方が挙げられる。
生物学的DMARDとしては、すべて腫瘍壊死因子(TNF)阻害剤と呼ばれる薬物のクラスの一部であるエタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル及びゴリムマブ、並びにアナキンラ、アバタセプト、リツキシマブ及びトシリズマブを含む、異なる標的を有する様々な他の薬剤が挙げられる。
非生物学的DMARDとしては、メトトレキサート、アスピリン、ヒドロキシクロロキン及びレフルノミドが挙げられる。別の一般的な非生物学的DMARDは、スルファサラジンである。使用頻度の低い非生物学的DMARDとしては、金塩、アザチオプリン及びシクロスポリンが挙げられる。DMARDは、したがって、メトトレキサート、アスピリン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン、金塩、アザチオプリン及びシクロスポリンからなる群から選択することができる。DMARDは、メトトレキサート、アスピリン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド及びスルファサラジンからなる群から選択することができる。DMARDは、メトトレキサート、アスピリン、ヒドロキシクロロキン及びレフルノミドからなる群から選択することができる。DMARDは、メトトレキサートであってもよい。
一部の高頻度に使用される非生物学的DMARDに関する公知の詳細を、以下に提供する。各事例では、非生物学的DMARD処置に伴う問題は、患者のモニタリングについての必要性、毒性及び副作用であり得る。
メトトレキサート
メトトレキサートは、従来、がんのための化学療法処置として使用された。関節リウマチ及び他のリウマチ性疾患のためにはるかにより低い用量で使用される場合、メトトレキサートは、炎症を低減し関節損傷を低減するように作用する。これは、毎週(各週の同じ日)に、丸剤、液剤又は注射剤として服用される。メトトレキサートは、メトトレキサートが単独では十分に疾患を管理しない場合、他のDMARD又は生物剤と組み合わせることができる。
一般的な副作用としては、胃もたれ及び口内炎が挙げられる。メトトレキサートは、まれに骨髄の血液細胞の産生を妨害することがある。低い血液細胞計数は、発熱、感染、リンパ節腫脹、並びに痣のできやすさ及び出血を引き起こすことがある。低用量でさえも肝臓機能の問題が起こることがあり、したがって、メトトレキサートを服用する者は誰でも定期的な血液検査が必要である。メトトレキサートを使用する人々はまた、アルコールの使用との組合せにより肝臓傷害のリスクが増大するため、アルコールの使用を制限するべきである。肺への傷害がまれに起こることがあり、人が新たに咳嗽及び息切れを発症する場合、メトトレキサートを中止するべきである。女性は、メトトレキサートを服用している間は妊娠すべきではない。
メトトレキサートを服用する人々における薬物毒性を特定するために、適切なモニタリングが不可欠である。ベースラインの血球数を査定し、腎臓及び肝臓機能を確認するために、処置の開始前に検査を実施する。これらの検査は、最初の数ヶ月については4～6週毎に、次いでその後は8～12週毎に繰り返される。メトトレキサートの用量は、問題が認められた場合、修正することができる。メトトレキサートを服用する者は誰でも、ある特定の副作用、例えば胃もたれ、口内炎、低い血液細胞計数及び異常な肝臓機能のリスクを低減するために、葉酸(1日1mg)又はフォリン酸(週に5mg)を服用するべきである。
スルファサラジン
スルファサラジンは、関節リウマチ及び強直性脊椎炎に関連する関節炎及び炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎及びクローン病)の処置に使用される。スルファサラジンがどのように作用するかは不明である。これは、人が1種の薬物治療に十分に応答しない場合、他のDMARDと組み合わせることができる。これは、丸剤として1日あたり2回服用され、通常、副作用を最小化するために、低用量で開始され、ゆっくりと増大される。
スルファサラジンの副作用としては、血球数の変化、悪心又は嘔吐、日光過敏症、皮膚発疹及び頭痛が挙げられる。スルホンアミド薬物治療、例えばスルファメトキサゾール-トリメトプリム(試料商標名:Bactrim、Septra)にアレルギーを有する人々は、スルファサラジンに対する交差応答を有することがあり、したがって、これを服用するべきではない。血球数を定期的にモニタリングするために、周期的な血液検査が推奨される。
スルファサラジンは黄色～橙色であり、これを服用する人々は、彼らの尿、涙及び汗が橙色味を帯び、衣服及びコンタクトレンズを染色することがあることに気付くことがある。スルファサラジンを服用している間は十分な水分をとり、空腹で又は制酸剤とともに服用することを避けることが重要である。
ヒドロキシクロロキン
ヒドロキシクロロキンは、従来マラリアの処置として開発され、後に関節炎の症状を改善することが発見された。これは関節リウマチの過程の初期において使用することができ、多くの場合には、他のDMARDと組み合わせて使用される。これは、全身性エリテマトーデスの処置のためにも、非常に高頻度に使用される。これは、必要とされるステロイドの量を低減するために、ステロイド薬物治療と組み合わせることができる。通常、これは丸剤形態で、1日あたり1回又は2回服用される。
高用量のヒドロキシクロロキンを長期間にわたり服用すると、目の網膜への損傷のリスクが増大することがあるが、リウマチ状態の処置のために高用量は通常必要とされない。処置の開始前及びその後周期的に、眼科医による検眼が推奨される。眼科検診を各年1回受けることが一般的である。
レフルノミド
レフルノミドは、炎症細胞の産生を阻害して炎症を低減する。これは多くの場合単独で使用されるが、単独での又は生物剤を伴うメトトレキサートに十分に応答しなかった人々については、メトトレキサートと組み合わせて使用されることがある。これは、経口で1日1回服用される。
副作用としては、発疹、一時的な脱毛、肝臓機能検査異常、悪心、下痢、体重減少、上腹部痛及びニューロパチー(神経損傷)が挙げられる。高血圧が、人々の最大10パーセントに起こることがある。肝損傷及び他の毒性についてモニタリングするために、肝炎への事前曝露についての検査、及び治療中の定期的な血液検査が必要とされる。女性は、レフルノミドを服用している間、又はそれが身体内で依然として検出可能である間は、妊娠すべきではない。
アザチオプリン
アザチオプリンは、1950年代から、がん、関節リウマチ、ループス及び様々な他の炎症性疾患の処置において使用されてきた。これは、移植された臓器の拒絶反応を防止するために、臓器移植においても使用されてきた。
アザチオプリンの最も一般的な副作用としては、悪心、嘔吐、食欲低下、肝臓機能異常、低い白血球計数及び感染が挙げられる。これは通常、経口で1日1回服用される。アザチオプリンを用いた処置の間、定期的な血液検査が推奨される。
典型的に、本発明は、非生物学的DMARDに関し、例えば、本発明は非生物学的DMARDの有効性を評価する方法として定義され得る。本発明の利点は、臨床的判断の決定を通知し改善することができるということであり、特にこれは、非生物学的DMARDが有効でないというより速やかな決定をもたらし、したがって異なる非生物学的DMARD又は生物学的DMARDへの早期の、効率的な処置の変更を可能とすることができる。
特異的炎症収束性メディエーター(SPM)
SPMは、必須脂肪酸アラキドン酸(AA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、n-3ドコサペンタエン酸(n-3 DPA)及びドコサヘキサエン酸(DHA)のための、主に白血球中に保持される、酵素により産生される分子である。これらの分子は、炎症の間の自然免疫応答及び適応免疫応答の制御において、その終了を促進するために主要なものである。SPMは、「脂質メディエーター」とも称されることがある。
理論により拘束されるものではないが、SPMは保護的メディエーターであるため、少なくとも1つのSPMのレベルの増大は有効性を示すと考えられる。
本明細書で使用される場合、「レベル(複数可)」という用語は、「濃度(複数可)」という用語と互換的に使用される。
SPMは、DHA代謝産物、n-3 DPA代謝産物、AA代謝産物及び/又はEPA代謝産物であり得る。本方法は、少なくとも1つのDHA代謝産物、少なくとも1つのn-3 DPA代謝産物、少なくとも1つのAA代謝産物及び/又は少なくとも1つのEPA代謝産物のレベルを測定するステップを含んでもよい。
SPMは、DHA代謝産物及び/又はEPA代謝産物であり得る。本方法は、少なくとも1つのDHA代謝産物及び/又は少なくとも1つのEPA代謝産物のレベルを測定するステップを含んでもよい。
本発明は、代替的に、血漿特異的炎症収束性メディエーター(SPM)という用語と無関係に、少なくとも1つのDHA代謝産物、少なくとも1つのn-3 DPA代謝産物、少なくとも1つのAA代謝産物及び/又は少なくとも1つのEPA代謝産物のレベルを測定するステップを含むものとして特徴付けることができる。同様に、本発明は、血漿特異的炎症収束性メディエーター(SPM)という用語と無関係に、少なくとも1つのDHA代謝産物及び/又は少なくとも1つのEPA代謝産物のレベルを測定するステップを含むものとして特徴付けることができる。同様に、本発明は、以下に定義される特定のEPA、n-3 DPA、AA及び/又はDHA代謝産物のうちのいずれか1つ以上に対する参照により特徴付けることができる。
EPA代謝産物
EPA代謝産物としては、「Eシリーズレゾルビン」及びEPA由来のモノヒドロキシル化脂肪酸が挙げられる。
EPA代謝産物を、以下の表1に列挙する。
Figure 2022548905000002
n-3 DPA代謝産物
これらには、それぞれのモノヒドロキシル化脂肪酸を伴う、13シリーズレゾルビン - RvT1、RvT2、RvT3及びRvT4、Dシリーズレゾルビン - RvD1n-3 DPA、RvD2n-3 DPA及びRvD5n-3 DPA、プロテクチン PD1n-3 DPA PD2n-3 DPA及び10S, 17S-ジHDPA及びマレシン - MaR1n-3 DPA MaR2n-3 DPA及び7S, 14S-ジHDPAが挙げられる。
n-3 DPA代謝産物を、以下の表2に列挙する。
Figure 2022548905000003
AA代謝産物
AA代謝産物としては、リポキシン - LXA4、LXB4、5S, 15S-ジHETE、15R-LXA4及び15R-LXB4 ロイコトリエン:LTB4、5S, 12S-ジHETE、12-エピ-LTB4、6-トランス, 12-エピ-LTB4及び20-OH-LTB4、LTC4、LTD4及びLTE4、並びにプロスタノイド:PGD2、PGE2及びPGF2□ TxB2が挙げられる。
AA代謝産物を、以下の表3に列挙する。
Figure 2022548905000004
Figure 2022548905000005
DHA代謝産物
DHA代謝産物としては、「Dシリーズレゾルビン - RvD1、RvD2、RvD3、RvD4、RvD5、RvD6、17R-RvD1及び17R-RvD3、プロテクチン - PD1、10S, 17S-ジHDHA、17R-PD1及び22-OH-PD1、PCTR1、PCTR2及びPCTR3、並びにマレシン - MaR1、7S, 14S-ジHDHA、MaR2、4S, 14S-ジHDHA及び22-OH-MaR1、MCTR1、MCTR2及びMCTR3」が挙げられる。
DHA代謝産物を、以下の表4に列挙する。
Figure 2022548905000006
Figure 2022548905000007
SPM測定
本方法は、Dシリーズレゾルビン及び/又はEシリーズレゾルビンを測定するステップを含んでもよい。Dシリーズレゾルビンは、RvD1、RvD2、RvD3、RvD4、RvD5、RvD6、17R-RvD1及び17R-RvD3からなる群から選択することができる。Dシリーズレゾルビンの任意の組合せを測定することができる。Eシリーズレゾルビンは、RvE1、RvE2及びRvE3からなる群から選択することができる。Eシリーズレゾルビンの任意の組合せを測定することができる。
本方法は、RvT3;RvT4;RvD1;MaR1n-3 DPA;RvT4;RvE2;14-オキソ-MaR1;17R-RvD3;15R-LXB4;RvD3;RvD4;TxB2;LTB4;20-COOH-LTB4;LTE4;10S, 17S, ジHDHA(PDX);17R-PD1;15R-LXA4;PGE2;PGD2;MaR1n-3 DPA;10S, 17S-ジHDPA;4S, 14S-ジHDHA;5S, 12S-ジHETE;及び/又は5S, 15S-ジHETEのレベルを測定するステップを含んでもよい。
本方法は、RvD4、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及び/又はMaR1n-3 DPAのレベルを測定するステップを含んでもよい。本方法は、RvD4、5S, 12S-ジHETE、4S, 14S-ジHDHA、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及び/又はMaR1n-3 DPAのレベルを測定するステップを含んでもよい。本方法は、RvD4、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPAのレベルを測定するステップを含んでもよい。本方法は、RvD4、5S, 12S-ジHETE、4S, 14S-ジHDHA、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPAのレベルを測定するステップを含んでもよい。
本方法は、RvD4、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及び/又は5S, 12S-ジHETEのレベルを測定するステップを含んでもよい。本方法は、RvD4、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及び5S, 12S-ジHETEのレベルを測定するステップを含んでもよい。
本方法は、少なくとも1つのSPMのレベルを測定するステップを含んでもよい。本方法は、少なくとも2つ、少なくとも3つ又は少なくとも4つのSPMのレベルを測定するステップを含んでもよい。したがって、少なくとも1つのSPMは、少なくとも4つのSPMであり得る。少なくとも4つのSPMは、RvD4、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPAを含むことができる。少なくとも2つ又は少なくとも3つのSPMは、RvD4、5S, 12S-ジHETE、4S, 14S-ジHDHA、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPAから選択される任意の2つ又は3つのSPMを含むことができる。本方法は、少なくとも6つのSPMのレベルを測定するステップを含んでもよい。したがって、少なくとも1つのSPMは、少なくとも6つのSPMであり得る。少なくとも6つのSPMは、RvD4、5S, 12S-ジHETE、4S, 14S-ジHDHA、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPAを含むことができる。本方法は、少なくとも5つのSPMのレベルを測定するステップを含んでもよい。少なくとも5つのSPMは、RvD4、5S, 12S-ジHETE、4S, 14S-ジHDHA、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPAから選択される任意の5つを含むことができる。
本方法は、RvT3;RvT4;RvD1;MaR1n-3 DPA;RvT4;14-オキソ-MaR1;17R-RvD3;15-エピ-LXB4;RvD3;RvD4;TxB2;LTB4;20-COOH-LTB4;LTE4;10S, 17S, ジHDHA(PDX);17R-PD1;15-エピLXA4;PGE2;PGD2;10S, 17S-ジHDPA;及び/又は5S, 15S-ジHETEのレベルを測定するステップを含んでもよい。
本方法は、RvT3;RvT4;RvD1;MaR1n-3 DPA;RvT4;RvE2;14-オキソ-MaR1;17R-RvD3;15-エピ-LXB4;RvD3;RvD4;TxB2;LTB4;20-COOH-LTB4;LTE4;10S, 17S, ジHDHA(PDX);17R-PD1;15-エピLXA4;PGE2;PGD2;10S, 17S-ジHDPA;及び/又は5S, 15S-ジHETEのレベルを測定するステップを含んでもよい。
本方法は、14-オキソ-MaR1、RvD4、RvT3及び/又はRvE2のレベルを測定するステップを含んでもよい。本方法は、14-オキソ-MaR1及びRvD4のレベルを測定するステップを含んでもよい。本方法は、14-オキソ-MaR1、RvD4、RvT3及びRvE2のレベルを測定するステップを含んでもよい。
本方法は、少なくとも1つのSPMのレベルを測定するステップを含んでもよい。本方法は、少なくとも4つのSPMのレベルを測定するステップを含んでもよい。したがって、少なくとも1つのSPMは、少なくとも4つのSPMであり得る。少なくとも4つのSPMは、14-オキソ-MaR1、RvD4、RvT3及びRvE2を含むことができる。
本方法は、図1Fに示される上位の7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個又は54個のSPMから選択される少なくとも1つのSPM、例えば少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ又は少なくとも6つのSPMのレベルを測定するステップを含んでもよい。
本方法は、進行している炎症中の宿主応答の調整に関与するSPMのレベルを測定するステップを含んでもよい。本方法は、したがって、PCTR2、RvD2及び/又はRvD3のレベルを測定するステップを含んでもよい。
本方法は、疼痛調節と関連するメディエーターであるSPMのレベルを測定するステップを含んでもよい。本方法は、したがって、RvE1及び/又はRvE2のレベルを測定するステップを含んでもよい。
本方法は、疼痛調節と関連するメディエーターであるSPM、及び進行している炎症中の宿主応答の調整に関与するSPMのレベルを測定するステップを含んでもよい。本方法は、したがって、PCTR2、RvD2、RvD3、RvE1及び/又はRvE2のレベルを測定するステップを含んでもよい。これらのSPMメディエーターの任意の組合せを測定することができる。これらのSPMメディエーターの任意の2つ又は任意の3つ又は任意の4つを測定することができる。これらのSPMメディエーターの5つすべてを測定することができる。
DMARD応答者及び非応答者
本方法は、DMARDの有効性に基づいて、患者をDMARD応答者又はDMARD非応答者として分類するステップを更に含んでもよい。DMARDの投与後の少なくとも1つのSPMのレベルの増大が、DMARDが有効であることを示す場合、患者はDMARD応答者として分類される。逆に、DMARDの投与後の少なくとも1つのSPMのレベルの増大が検出されない場合、患者はDMARD応答者として分類される。
本明細書で使用される場合、「DMARD応答者」という用語は、典型的に非生物学的DMARD応答者を指し、これは非生物学的DMARDを用いた処置に応答しているか又は応答する患者である。同様に、「DMARD非応答者」という用語は、典型的に非生物学的DMARD非応答者を指し、これは非生物学的DMARDを用いた処置に応答していないか又は応答しない患者である。DMARD応答者及びDMARD非応答者は両者とも、生物学的DMARDに応答し得る。
応答者は、処置後に低い疾患活動性スコア-28(DAS28)<3.2を有する患者として臨床的に定義される。
本方法は、n-3 DPA及びDHAメタボロームの両方からのALOX5及び/又はALOX15由来のメディエーターのレベルを測定するステップを含んでもよい。n-3 DPA及びDHAメタボロームの両方からのALOX5及びALOX15由来のメディエーターとしては、RvD1、RvD4、RvD1n-3 DPA及びRvD2n-3 DPAが挙げられる。n-3 DPA及びDHAメタボロームの両方からのALOX5及びALOX15由来のメディエーターは、非応答者において減少し得る。
本方法は、EPAのALOX5由来の生成物のレベルを測定するステップを含んでもよい。EPAメタボロームからのALOX5由来のメディエーターとしては、RvE1及びRvE2が挙げられる。EPAメタボロームからのALOX5由来のメディエーターは、非応答者において減少し得る。
本方法は、AAのALOX5由来の生成物のレベルを測定するステップを含んでもよい。AAのALOX5由来の生成物としては、白血球化学誘引物質LTB4及びイオンチャネル型システイニルロイコトリエンが挙げられる。AA由来のALOX5生成物は、応答者と比較した場合、非応答者からの血漿中で増大し得る。
試料
各試料は、「患者試料」又は「生体試料」として定義され得る。
試料は、典型的に、本発明の方法が実施される前に得られる。本発明の方法は、したがって、in vitroの方法である。一部の代替の実施形態では、本方法は、試料収集のステップ(複数可)を更に含んでもよい。
試料は、血漿又は全血試料であってもよい。好ましくは、試料は血漿試料である。試料が血漿試料である場合、SPMは、血漿特異的炎症収束性メディエーター(SPM)として記載され得る。
DMARDを用いた処置前に得られた試料は、処置の開始の前の24時間以内のいずれかで得られていてもよい。
DMARDを用いた処置後に得られた試料は、DMARDを用いた処置の開始後6ヶ月前後で得られていてもよい。しかし、処置後1ヶ月でさえ、変化が観察され得る。DMARDを用いた処置後の試料は、DMARDを用いた処置の開始後1ヶ月前後、2ヶ月前後、3ヶ月前後、4ヶ月前後、又は5ヶ月前後で得られていてもよい。
試料は、凝固を防止するために、収集直後に、抗凝固剤、例えばヘパリンを用いて処理されてもよい。
試料-例えばヒト血漿試料を分析の前に保管する必要がある場合、これらは有機溶媒中に入れられ、-75℃以下の温度、例えば-80℃で保管されてもよい。好適には、有機溶媒は、メタノールを含むか又はそれからなるものであってもよい。脂質メディエーターは、長期保管の間は凍結試料中で不安定であり、3ヶ月の保管の後に一部のメディエーターのレベルが大幅に(>50%)低減することが見出されているが、これらが-75℃以下の温度で長期間保管される場合、メタノール及び場合により他の有機溶媒を使用することによりこれらの分子の安定性が改善され得ることが、驚くべきことに見出された。好適には、試料は、約-80℃以下の温度で保管され得る。試料は、少なくとも約1ヶ月、及び一部の実施形態では少なくとも約3ヶ月、最大約9ヶ月又はそれより長く保管することができる。
以下に記載される種類の重水素標識された標準物質を、凍結の前に試料に添加してもよい。
SPMレベル測定
生体試料、例えば血液及び組織中のSPMのレベルを測定する本方法は、当業者に利用可能であり、本明細書において詳細に記載する必要はない。
好適な本方法は、例えばYang R、Chiang N、Oh SF及びSerhan CN、2011年、「Metabolomics-Lipidomics of Eicosanoids and Docosanoids Generated by Phagocytes」、Curr Protoc Immunol. 95巻:14.26:14.26.1-14.26.26頁、並びにDalli J及びSerhan CN、2012年、「Specific lipid mediator signatures of human phagocytes:microparticles stimulate macrophage efferocytosis and pro-resolving mediators」、Blood.2012年;120巻:e60～e72頁において記載されており、その両方の内容が本明細書において参照により組み込まれる。
簡潔には、一部の実施形態では、試料中の少なくとも1つのSPMのレベルは、試料からSPMを抽出した後に、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用して測定されてもよい。
SPMは、固相抽出を使用して、例えばC18カラムを使用して、試料から抽出されてもよい。好適な本方法は、Colas RA、Shinohara M、Dalli J、Chiang N及びSerhan CN.「Identification and signature profiles for pro-resolving and inflammatory lipid mediators in human tissue」、Am J Physiol Cell Physiol. 2014年;307巻:C39～54頁により開示されており、その内容は本明細書において参照により組み込まれる。
試料中のSPMの定量化を促進するために、1つ以上の標識された内部標準物質を、SPMの抽出の前に試料に添加してもよい。好適な標識された標準物質は、重水素標識5S-HETE(5S-HETE-d8)、重水素標識ロイコトリエンB4(LTB4-d4)、重水素標識リポキシンA4(LXA4-d5)、重水素標識レゾルビンD2(RvD2-d5)及び重水素標識プロスタグランジンE2(PGE2-d4)である。
試料中のSPMの同定は、そのMS-MSスペクトルからのその保持時間(RT)及び少なくとも6つの診断用イオンを、SPMについての合成又は真正標準物質(authentic standard)のものと合致させることにより、確認することができる。液体クロマトグラフィーを使用して測定された分子についての保持時間は、多くの場合機器特異的であるが、一部の実施形態では、例えば、上述の13シリーズレゾルビンの保持時間は以下の表5に示す通りであり得る。
Figure 2022548905000008
定量化は、メディエーターについての合成又は真正標準物質を使用して作成された線形回帰曲線を使用して、達成されてもよい。
LC-MS/MSは、必要とされる設備を利用できる状況、例えば病院検査室における使用に好適であり得る。しかしより簡便には、試料中の少なくとも1つのSPMのレベルは、イムノアッセイを使用して測定することができる。イムノアッセイは、マイクロ流体デバイス又は試験紙で実行するために、より小規模に設計される潜在性を有し、臨床的なポイントオブケア用途により適し得る。イムノアッセイを組み入れる本発明の実施形態は、したがって、個別の患者のためのスタチンの処方を支援するために、プライマリーヘルスケア提供者によりその場で使用されてもよい。
少なくとも1つのSPMのレベルは、同種又は異種イムノアッセイを使用して測定されてもよい。
よって、一部の実施形態では、各SPMのレベルは、過剰に存在する標識された抗体への結合により溶液中で測定されてもよく、それにより結合は標識の検出可能な特性を変化させる。存在する特定のSPMの量は、したがって、特定の検出可能な性質を有する標識の量に影響を与える。当該技術分野において周知のように、標識としては、放射性標識、蛍光標識、又は酵素により作用する場合に発色するか、蛍光を引き起こすか若しくはそれを可能とする発色性若しくは化学発光性の基質を有する酵素を挙げることができる。
抗体は、SPMについての特異性を有するポリクローナル又はモノクローナルであってもよい。一部の実施形態では、モノクローナル抗体が使用されてもよい。
或いは、異種性フォーマットが使用されてもよく、ここで少なくとも1つのSPMは、分離及び定量化のために、表面結合性抗体により捕捉される。一部の実施形態では、サンドイッチアッセイが使用されてもよく、ここで表面結合性SPMは、標識された二次抗体への結合により定量化される。
好適には、イムノアッセイは酵素イムノアッセイ(EIA)を含んでもよく、ここで標識は酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である。HRPについての好適な基質は当該技術分野において周知であり、例えば、ABTS、OPD、AmplexRed、DAB、AEC、TMB、ホモバニリン酸及びルミノールが挙げられる。一部の実施形態では、ELISAイムノアッセイが使用されてもよく、サンドイッチELISAアッセイが特に好ましくあり得る。
イムノアッセイは、競合的又は非競合的であり得る。したがって、一部の実施形態では、少なくとも1つのSPMの量は、上記のように、同種又は異種の方法により直接測定されてもよい。或いは、試料中のSPMは、過剰に存在する公知の量の抗体を有する溶液中に捕捉され、残存する抗体の量は次いで表面結合性SPMへの結合により決定されて、元の試料中のSPMの量の間接的な読み出しをもたらし得る。別のバリアントでは、少なくとも1つのSPMは、公知の量の標識されたSPMを有する表面結合性抗体への結合についての競合を引き起こし得る。
表面結合性抗体又はSPMは、当該技術分野において公知の種類の任意の好適な表面上に固定されてもよい。例えば、抗体又はSPMは、ウェル若しくはプレートの表面、又は複数の磁気若しくは非磁気ビーズの表面上に固定されてもよい。
一部の実施形態では、イムノアッセイは、試料中で定量化されるものと同じであるが検出可能な標識でタグ付けされている公知の量のSPMを更に含む、競合アッセイであってもよい。標識されたSPMは、SPMに対する抗体により、好適な表面に親和性結合し得る。試料を添加すると、ある割合の標識されたSPMは表面結合性抗体から置き換えられ、それにより試料中のSPMのレベルの尺度をもたらし得る。
一部の実施形態では、イムノアッセイは、試料中で定量化されるSPMと同じである表面結合性SPM、及び溶液中の過剰な公知の量のSPMに対する抗体を含んでもよい。試料は最初に、ある割合の抗体が試料中のSPMと結合するように、溶液中で抗体と共に混合される。残存する非結合抗体の量は、次いで、表面結合性SPMへの結合により測定することができる。
一部の実施形態では、イムノアッセイは、表面結合性抗体に結合するSPMの量又は表面上に固定されたSPMに結合する一次抗体の量を定量化するための、SPMに対するか又はSPMに対する一次抗体に対する、標識された二次抗体を含んでもよい。
SPMレベルの測定は、試料収集デバイス及びイムノアッセイを含む、試料中の特定のSPMのレベルを測定するための器具によるものであってもよい。器具は、イムノアッセイ中、標識されたSPM又はSPMに対する標識された抗体を検出するための検出器を更に含んでもよい。好適な標識は上述されているが、好ましい実施形態では、標識は、酵素により作用する場合に発色するか、蛍光を引き起こすか又はそれを可能とする発色性又は化学発光性の基質を有する酵素であってもよい。
イムノアッセイ又は器具は、生体試料中の少なくとも1つのSPMのレベルを測定するためのより小規模に設計されるデバイス中に組み込まれてもよい。好適には、デバイスはラボオンチップを含んでもよい。
SPMレベルの測定は、患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベルを測定するためのデバイスであって、試料中のSPMの量を直接的に又は間接的に定量化するために、試料中のSPMがSPMを捕捉するためのSPMについての固定された一次抗体と応答し得るか、又は応答ゾーンの上流の試料との混合後の溶液中の過剰のSPMについての一次抗体が、試料中で測定されるものと同じであるが応答ゾーン内で表面上に固定されるSPMと応答し得る、入口ポート及び応答ゾーンを有する内部チャネルを定める1つ以上の部分を含む、デバイスによるものであってもよい。
捕捉されたSPM又は一次抗体は、次いで、酵素でタグ付けされた、SPM又は一次抗体に対する二次抗体を使用して検出されてもよい。
上記のように、酵素は、酵素により作用する場合に発色するか、蛍光を引き起こすか又はそれを可能とする発色性又は化学発光性の基質を有してもよい。好適には、少なくとも応答ゾーンに隣接するチャネルを定めるデバイスの1つ以上の部分は、チャネル又はさらなるチャネルの外側に配置された好適な検出器、例えばフォトダイオードなどを使用してSPM又は一次抗体と二次抗体との間の応答の検出を可能にするように、少なくとも基質の色又は蛍光を包含する波長範囲において、光に対して透明であってもよい。
一部の実施形態では、デバイスは、試料中の複数の異なるSPMのレベルを並行して測定するための、各々がそれ自体の入口ポートを有する複数のチャネルを含んでもよい。したがって、各チャネルは、異なるそれぞれの固定された一次抗体又はSPMを含んでもよい。
好適には、デバイスは、一連の異なる試薬、例えば試料、洗浄溶液、一次抗体、二次抗体及び酵素基質などのチャネル中への進入を制御するための、1つ以上の入口ポートと関連付けられた1つ以上の選択的に動作可能なバルブを含んでもよい。
デバイスは、したがって、マイクロ流体デバイスを含んでもよい。チャネルは、応答ゾーンを含んでもよい。マイクロ流体デバイスは当業者に公知である。マイクロ流体イムノアッセイ又はタンパク質診断チップマイクロアレイの総説は、Chinら、2012年、Lab on a Chip. 2012年;12巻:2118～2134頁により提供される。ポイントオブケアでのELISAイムノアッセイを実行するために好適なマイクロ流体デバイスは、Chan CD、Laksanasopin T、Cheung YK、Steinmiller Dら、「Microfluidics-based diagnostics of infectious diseases in the developing world」、Nature Medicine. 2011年;17巻(8号):1015～1019頁により開示され、その内容は本明細書において参照により組み込まれる。
有効性評価
DMARDの有効性の評価は、DMARDの投与前後に患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベルを比較するステップを含んでもよい。少なくとも1つのSPMのレベルがDMARDの投与前に患者から得られた試料中よりもDMARDの投与後に患者から得られた試料中で高いことを比較が示す場合には、比較は、DMARDの投与後の少なくとも1つのSPMのレベルの増大がDMARDの有効性を示すことを示す。逆の比較も同等であり、DMARDの投与前の少なくとも1つのSPMのレベルの低減がDMARDの有効性を示すことが諒解される。同様に、DMARDの投与後の少なくとも1つのSPMのレベルの低減は、DMARDの無効性を示す。DMARDの無効性は、DMARD治療に抵抗性の患者において観察され得る。
増大は、処置前の値と比較した差である。増大は、例えば少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%又は少なくとも約100%の増大であり得る。増大は、少なくとも約20%の増大であり得る。
或いは、増大は倍数変化として表され得る。当業者は、任意のパーセンテージの増大が倍数変化に変換され得、逆もまた同様であることを諒解するであろう。
「示す(indicates)」及び「示す(indicative)」という用語は、理論に拘束されるものではないが、方法が、DMARDが特定の状況下で無効であることを決定し得るが、これは絶対的な決定ではなく、例えば異なる処置レジメン又は用量の増大が一部の場合ではなお有効であり得るため、使用される。しかし、「示す(indicates)」及び「示す(indicative)」という用語は、適切な場合には「決定する(determine)」及び「決定する(determines)」と置き換えることができ、例えばDMARDの最大推奨用量が使用される場合、本方法はDMARDが無効であることを決定することができる。上記の用語のいずれかは、「予測する(predict)」又は「予測する(predictive)」という用語と置き換えることができる。別の群が関与する場合、「DMARDの投与後の少なくとも1つのSPMのレベルの増大は、DMARDを有効として分類する」のように、「分類する」という単語及びその変形形態を使用することができる。
複数のSPMが測定される場合、DMARDの有効性を示す増大は、各SPMについて同じであっても異なっていてもよい。
DMARDの有効性の評価は、対照、例えば対照データベースとの比較を含んでもよい。対照データベースは、複数のSPMのレベルが評価される場合、特に有益であり得る。
本方法は、したがって、DMARDの投与前に患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベルをDMARDの投与後に患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベルと比較する、さらなるステップを含んでもよい。そのような比較は、統計学的方法によるものを含む、当該技術分野において公知の任意の方法により実施されてもよい。
本方法は、DMARDの投与前に患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベルとDMARDの投与後に患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベルとの間の差を発見する、さらなるステップを含んでもよい。このステップは、統計学的方法によるものを含む、当該技術分野において公知の任意の方法により実施されてもよい。
本方法は、したがって、DMARDの投与前に患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベル及びDMARDの投与後に患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベルに基づいて、DMARDが有効か又は無効かを決定するさらなるステップを含んでもよい。例えば、本方法は、DMARDの投与前に患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベルとDMARDの投与後に患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベルとの比較及び/又はそれらの間の差の発見に基づいて、DMARDが有効か又は無効かを決定するステップを含んでもよい。
本方法は、DMARDが無効であると決定し、場合により患者の処置を変更する、さらなるステップを含んでもよい。
本方法は、多変量分析を使用してDMARDの有効性を評価するステップを含んでもよい。多変量分析は、直交部分的最小二乗判別分析(oPLS-DA)であってもよい。
oPLS-DAは、2群間で異なって表される脂質メディエーターの濃度に基づいて回帰モデルを生成する(Chong, J., Yamamoto, M.及びXia, J. MetaboAnalystR 2.0:「From Raw Spectra to Biological Insights」、Metabolites 9巻(2019年)。oPLS-DAは、MetaboAnalyst webベースのアプリケーション(https://www.metaboanalyst.ca/faces/ModuleView.xhtml)を使用して実施することができる。
本方法は、訓練された機械学習モデルを使用してDMARDの有効性を評価するステップを含んでもよい。そのような機械学習モデルは、データ、例えばSPMプロファイル(各患者についての各SPMの個別の濃度を含む)、臨床スコア及び特定のSPMファミリーのうちの1つ以上に基づいて、DMARD処置に対する応答を予測するために使用され得る。データは、患者の特定の病型に基づいて分けられ得る。
機械学習モデルは、例えばサポートベクターマシン(SVM)モデル及び/又はランダムフォレスト予測モデルを作出するために、様々なスクリプト、例えばRスクリプトを使用して、作出され得る。機械学習モデルは、したがって、SVMモデル及びランダムフォレスト予測モデルのうちの少なくとも1つを含み得る。当業者はSVMモデル及びランダムフォレスト予測モデルに精通しており、したがって、SVMモデル及びランダムフォレスト予測モデルの具体的な実施をここで簡潔に記載する。
SVMモデルは、Wishart Research Group(http://classyfire.wishartlab.com/)により開発され、刊行物:Djoumbou Feunang Y、Eisner R、Knox C、Chepelev L、Hastings J、Owen G、Fahy E、Steinbeck C、Subramanian S、Bolton E、Greiner R及びWishart DS. ClassyFire:Automated Chemical Classification With A Comprehensive, Computable Taxonomy. Journal of Cheminformatics、2016年8巻:61頁において記載されている、公知の、自由に利用可能なパッケージClassyFireを使用して、作出され得る。当業者に理解されるであろうように、ClassyFireは、化学物質の自動的な構造的分類のためのウェブベースのアプリケーションである。ClassyFireは、機械学習モデルを作出するためにSVMを使用する。理解されるように、SVMは、モデルの作出のために、分類を行い、回帰を作成し、新規性検出を作出する。幾つかのそのようなモデルは、最も正確なモデルが発見されるまで作出され得る。当然のことながら、モデルの検証は、マシューズ相関係数(MCC)値を推定し、予測の正確さを評価するために、検証コホートを使用して達成される。これらのSVMモデルは、検証後、精度のパーセンテージ及びMCC値を出力する。
SVMモデルは、訓練データに基づいて訓練される。そのようなデータは、処置の転帰が既に知られている患者についての「探索的」データ及び「応答」データを含む。探索的データは、患者が応答者であるか又はそうでないかの理由を決定するために使用されるすべてのデータを含む。例えば、探索的データは、血漿から得られるような脂質メディエーターの個別の濃度を含む、特定の患者についての脂質メディエータープロファイルであり得る。応答データは、特定の患者が実際に応答者であるか又はそうでないかどうかを示すデータを含む。訓練データは、したがって、患者の訓練データセットを行として、脂質メディエーターを列として有するタブ区切りの表、及び患者の検証データセットを行として、脂質メディエーターを列として有するタブ区切りの表を含み得る。
ランダムフォレストモデルは、刊行物:A. Liaw and M. Wiener(2002). Classification and Regression by randomForest. R News 2巻(3号)、18～22頁において記載されるような公知のパッケージrandomForestを使用して作出され得る。当業者に理解されるであろうように、このパッケージは、ランダムフォレストの分類及び回帰に基づいてランダムフォレストモデルを作出する。ランダムフォレストモデルは、訓練データからの異なるブートストラップ試料上で生成された複数の木の相関を失わせ、次いで平均化により木中の分散を減少させるために、ランダムフォレスト及びブートストラップを使用して作出され得る。平均化の使用は、決定木の性能を改善し、過剰適合を回避する。randomForestパッケージは、各々が最も良好なバージョンを作出するために異なる変数を使用する、幾つかの木を作出する。
mtryパラメーターは、各木ノードを分けるために利用可能な変数の数であり、異なる木を作出するためにデータが幾つの変数に分割されるかを定義するために使用することができる。この使用では具体的に、モデルの精度の改善における各脂質メディエーターの重要性は、ループを作出するために脂質メディエーターを定義すること、モデルの精度の変化についてモニタリングすること、及びモデルの精度に対する脂質メディエーターの効果に基づいて最も良好なmtryを定義することにより、推定される。モデルは次いで、定義された最も良好なmtry値に基づいて再実行され得る。SVMモデルに関しては、MCC値を推定するために検証コホートが使用される。これらのランダムフォレストモデルは、検証後に精度パーセンテージ及びMCC値を出力し、モデルの性能及びモデル構築における各脂質メディエーターの重要性に関連する1つ以上のプロットも出力し得る。
ランダムフォレストモデルは、SVMモデルのように、訓練データを使用して訓練される。ランダムフォレストモデルを訓練するために使用される訓練データは、SVMモデルを訓練するために使用されるものと同じであってもよい。
本方法は、したがって、少なくとも2つのSPMのレベルを測定するステップ、及びDMARDが有効であるかどうかを決定するステップを含んでもよく、該方法は、少なくとも2つのSPMのレベルを訓練された機械学習アルゴリズムに入力するステップを含み、訓練された機械学習アルゴリズムが、
i.DMARDの投与前に患者から得られた試料からの少なくとも2つのSPMのレベルを、DMARDの投与後に患者から得られた試料中の同じ少なくとも2つのSPMのレベルと比較し、
ii.DMARDが有効か又は無効かを出力する
ように構成され、場合により、訓練された機械学習モデルがサポートベクターマシン(SVM)モデル及び/又はランダムフォレストモデルである。
訓練された機械学習アルゴリズムは、訓練データに基づいて訓練されてもよく、訓練データは、
DMARDの投与前後の複数の患者についての脂質メディエータープロファイルを含み、場合により脂質メディエーターの濃度を含む第1のデータ、及び
複数の患者の各々についてDMARDが有効であったか又は無効であったかを特定する第2のデータ
を含む。
関節リウマチを含む炎症状態の処置
DMARD(生物製剤を含む)は、主要な種類の関節リウマチの処置である。患者はNSAIDも処方され、通常、患者はNSAIDを、症状を管理するために早期の段階で、及び通常診断の前に、与えられる。診断の際、第1週以内に改善がない場合、患者は通常メトトレキサートを処方され(約80～90%)、これは別の非生物学的DMARD、例えばヒドロクロロキノンと組み合わせられてもよく、6ヶ月後に改善がない場合、他の薬物、通常生物製剤が投与される。
生物学的DMARDの処方は、現在のガイドラインの下では、非生物学的処置が試みられた後まで制限されている。これについての1つの理由は、非生物学的DMARDが生物製剤よりもはるかに安価であることである。
患者の処置は、本発明に基づいて修正することができる。本発明の方法は、以下を可能とし得る:
・無効なDMARDを用いた処置を終了すること、及び代替のDMARDを用いた処置を代わりに開始すること。
・無効なDMARDを用いた処置を終了すること、及び生物製剤を用いた処置を代わりに開始すること。
・無効なDMARDの用量を変更すること。
・無効なDMARDと異なるDMARDとを組み合わせること。
有利な転帰は、患者が、彼らが有効な薬物を得られているか又はそうでないかを決定するのに6ヶ月待つ必要がなく、そのため臨床医が薬物の異なる組合せ若しくは用量を探索するか又は異なる薬物へと切り替えることができるということである。
本方法はしたがって、患者の処置を修正するステップを更に含んでもよい。例えば、本方法は、
a)無効なDMARDを用いた処置を終了すること、及び代替のDMARDを用いた処置を開始すること、
b)無効なDMARDを用いた処置を終了すること、及び生物学的DMARDを用いた処置を代わりに開始すること、
c)無効なDMARDの用量を変更し、典型的には無効なDMARDの用量を増大すること、並びに/又は
d)無効なDMARDと異なるDMARDとを組み合わせること
からなる群から選択される、その後のステップを更に含んでもよい。
本方法は、患者のための処置を選択するステップであって、
(a)DMARDが有効である場合には、同じDMARDが選択され、
(b)DMARDが無効である場合には、異なるDMARD、場合により生物学的DMARDが選択される、ステップを更に含んでもよく、
場合により、患者に選択された処置を投与するステップを更に含む。
第2の態様によると、本発明は、関節リウマチを有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、どの関節リウマチ病型を発症するかを予測する方法であって、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)ナイーブ患者試料中の少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップ、並びに患者が発症する関節リウマチ病型を、リンパ骨髄性、びまん性骨髄性及び微量免疫線維性として分類するステップを含む、方法を提供する。
「DMARDナイーブ」という用語は、DMARDを服用したことのない患者、又はDMARDを処方されたことのない患者を指す。患者は、関節リウマチの処置のためにDMARDを服用したことがなくてもよく、及び/又はDMARDを処方されたことがなくてもよい。
RAを有する患者は、3つの分類又は病型:リンパ骨髄性、びまん性骨髄性及び微量免疫線維性として分類することができる。これらの分類は、典型的に、滑液の分子及び組織学的特性に基づいて実施される。RAの各分類は、別個の疾患の進展及びDMARD処置に対する応答に関連する。
一実施形態では、収束性メディエーターの上方制御は、患者が微量免疫線維性病型を有することを特定する。15R-LXA4及び/又はMCTR2の上方制御は、患者が微量免疫線維性病型を有することを特定し得る。
一実施形態では、炎症誘発性及び免疫抑制性メディエーターの上方制御は、患者が微量免疫線維性病型を有することを特定する。PGD2、TxA2及び/又はTxB2の上方制御は、患者が微量免疫線維性病型を有することを特定し得る。TxA2のレベルは、その安定なさらなる代謝産物TxB2を介して間接的に測定することができる。
「分類すること」という用語は、「診断すること」及び「予測すること」という用語と互換的に使用される。本方法は、したがって、関節リウマチを有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、どの関節リウマチ病型を発症するかを診断する方法と考えられ得る。
分類することは、患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベルを対照と比較することを含み得る。少なくとも1つのSPMのレベルが対照よりも患者から得られた試料中で高いことを比較が示す場合には、比較は、患者試料中、少なくとも1つのSPMのレベルの増大が存在することを示す。
増大は、対照値と比較した差である。増大は、例えば少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%又は少なくとも約100%の増大であり得る。増大は、少なくとも約20%の増大であり得る。
或いは、増大は倍数変化として表され得る。当業者は、任意のパーセンテージの増大が倍数変化に変換され得、逆もまた同様であることを諒解するであろう。
複数のSPMが測定される場合、DMARDの有効性を示す増大は、各SPMについて同じであっても異なっていてもよい。
患者が発症する関節リウマチ病型を分類することは、対照、例えば対照データベースとの比較を含み得る。対照データベースは、複数のSPMのレベルが評価される場合、特に有益であり得る。
本方法は、多変量分析を使用して、患者が発症する関節リウマチ病型を分類するステップを含んでもよい。多変量分析は、直交部分的最小二乗判別分析(oPLS-DA)であってもよい。
本方法は、訓練された機械学習モデルを使用して、患者が発症する関節リウマチ病型を分類するステップを含み得る。訓練された機械学習モデルは、SVMモデル及び/又はランダムフォレストモデルであってもよい。
本方法は、少なくとも2つのSPMのレベルを測定するステップ、及び患者がどの関節リウマチ病型を発症するかを予測するステップを含んでもよく、該方法は、少なくとも2つのSPMのレベルを訓練された機械学習アルゴリズムに入力するステップを含み、訓練された機械学習アルゴリズムが、
i.試料からの少なくとも2つのSPMのレベルをデータベース中の同じ少なくとも2つのSPMのレベルと比較し、
iii.患者がリンパ骨髄性、びまん性骨髄性又は微量免疫線維性病型を発症するかどうかを出力する
ように構成され、場合により、訓練された機械学習モデルがサポートベクターマシン(SVM)モデル及び/又はランダムフォレストモデルである。
訓練された機械学習アルゴリズムは、訓練データに基づいて訓練されてもよく、訓練データは、
複数の患者についての脂質メディエータープロファイルを含み、場合により脂質メディエーターの濃度を含む第1のデータ、及び
複数の患者の各々が、リンパ骨髄性、びまん性骨髄性又は微量免疫線維性病型を発症したかどうかを特定する第2のデータ
を含む。
一実施形態では、本方法は、患者試料中の少なくとも1つのSPMのレベルを1つ以上の対照と比較するステップを含む。「増大」又は「上方制御」は、1つ以上の対照との比較により決定されてもよい。
1つ以上の対照は、1つ以上の対照試料であってもよい。1つ以上の対照試料は、患者試料と並行して分析されてもよい。1つ以上のSPMのレベルは、対照試料中の対応する1つ以上のSPMのレベルと比較されてもよい。「増大」又は「上方制御」は、対照試料との比較により決定されてもよい。比較は、複数の対照試料の間の平均SPMレベルに対するものであってもよい。
1つ以上の対照は、1つ以上の対照試料から以前に得られたレベルを含むデータベースであってもよい。1つ以上のSPMのレベルは、データベース中の対応する1つ以上のSPMのレベルと比較されてもよい。「増大」又は「上方制御」は、データベースとの比較により決定されてもよい。
対照は、関節リウマチ患者試料中の1つ以上のSPMの平均レベルであってもよい。
臨床医がある病型を別の病型とは異なって処置することができる場合、患者が発症する関節リウマチ病型を分類することは、患者により適した特定の又は代替の処置レジメンを採用することを可能とし得る。
例えば、理論により拘束されるものではないが、エビデンスは、現在のところ、微量免疫線維性病型を有する患者がDMARDにより抵抗性であることを示唆する。これらの患者は、したがって、非生物学的DMARD、例えばメトトレキサートではなく、生物製剤である彼らの処置からより利益を得ることができる。
本方法は、患者のための処置を選択するステップを更に含んでもよい。患者のための処置は、患者が発症する関節リウマチ病型の分類に基づいて選択されてもよい。
本方法は、患者のために選択された処置を投与するステップを更に含んでもよい。
一実施形態では、本方法は関節リウマチ病型を微量免疫線維性病型として分類し、生物学的DMARDを用いた処置が選択され、場合により患者に投与される。
第3の態様によると、本発明は、炎症状態を有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)を用いた処置に応答するかどうかを予測する方法であって、DMARDナイーブ患者試料中の少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップ、及び患者を予測されるDMARD応答者又は予測されるDMARD非応答者として分類するステップを含む、方法を提供する。
この態様の利点は、疾患が進行するのを待つ代わりに、患者が、彼らが応答する可能性が高いか又はそうでないかを決定するためにSPMのレベルを測定することができる試料を与えることである。そうでない場合、彼らは代替の処置、例えば生物製剤をすぐに処方され得る。
本方法は、RvD4、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及び/又はMaR1n-3 DPAを測定するステップを含んでもよい。本方法は、RvD4、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPAを測定するステップを含んでもよい。本方法は、RvD4、5S, 12S-ジHETE、4S, 14S-ジHDHA、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及び/又はMaR1n-3 DPAを測定するステップを含んでもよい。本方法は、RvD4、5S, 12S-ジHETE、4S, 14S-ジHDHA、10S, 17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPAを測定するステップを含んでもよい。
本方法は、14-オキソ-MaR1、RvD4、RvT3及び/又はRvE2を測定するステップを含んでもよい。本方法は、14-オキソ-MaR1及びRvD4を測定するステップを含んでもよい。本方法は、14-オキソ-MaR1、RvD4、RvT3及びRvE2を測定するステップを含んでもよい。
本方法は、RvD5及び/又はRvT3を測定するステップを含んでもよい。
本方法は、少なくとも1つの炎症誘発性エイコサノイドのレベルを測定するステップを更に含んでもよい。炎症誘発性エイコサノイドは、PGD2及び/又はPGE2であり得る。PGD2及び/又はPGE2は、AA由来のメディエーターであるが、SPMではない。少なくとも1つの炎症誘発性エイコサノイドのレベルの増大は、患者がDMARD非応答者であることを予測することができる。
本方法は、ALOX5活性のマーカー、ALOX12活性のマーカー及び/又はALOX15活性のマーカーを測定するステップを更に含んでもよい。ALOX5活性のマーカー、ALOX12活性のマーカー及び/又はALOX15活性のマーカーは、モノヒドロキシル化脂肪酸のS異性体であり得る。
本方法は、ALOX5活性のマーカー、ALOX12活性のマーカー及び/又はALOX15活性のマーカーのキラル分析を含んでもよい。
ALOX5活性のマーカーは、5-HETE、5HEPE、7-HDPA及び7-HDHAからなる群から選択され得る。ALOX5マーカーの任意の組合せを測定することができる。任意の2つ又は任意の3つのALOX5マーカーを測定することができる。4つすべてのALOX5マーカーを測定することができる。本方法は、したがって、5-HETE、5HEPE、7-HDPA及び/又は7-HDHAを測定するステップを含んでもよい。好ましくは、本方法は、7-HDHA、5-HEPE及び5-HETEを測定するステップを含む。
ALOX12活性のマーカーは、14-HDPA及び14-HDHAからなる群から選択することができる。ALOX12マーカーの任意の組合せを測定することができる。本方法は、したがって、14-HDPA及び/又は14-HDHAを測定するステップを含んでもよい。
ALOX15活性のマーカーは、17-HDPA、17-HDHA、15-HEPE及び15-HETEからなる群から選択することができる。ALOX15マーカーの任意の組合せを測定することができる。任意の2つ又は任意の3つのALOX15マーカーを測定することができる。4つすべてのALOX5マーカーを測定することができる。本方法は、したがって、17-HDPA、17-HDHA、15-HEPE及び/又は15-HETEを測定するステップを含んでもよい。
代替の態様では、本発明は、関節リウマチを有する患者がDMARDを用いた処置に対して応答するかどうかを予測する方法であって、DMARDナイーブ患者試料中のALOX5活性のマーカー、ALOX12活性のマーカー及び/又はALOX15活性のマーカーを測定するステップ、並びに患者を予測されるDMARD応答者又は予測されるDMARD非応答者として分類するステップを含む、方法を提供する。
「分類すること」という用語は、「診断すること」及び「予測すること」という用語と互換的に使用される。本方法は、したがって、炎症状態を有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、DMARDを用いた処置に対して応答するかどうかを診断する方法と考えられ得る。
本方法は、少なくとも1つのSPMのレベルが増大する場合、患者を予測されるDMARD非応答者として分類するステップを含んでもよい。
分類することは、患者から得られた試料中の少なくとも1つのSPMのレベルを対照と比較することを含み得る。少なくとも1つのSPMのレベルが対照よりも患者から得られた試料中で高いことを比較が示す場合には、比較は、患者試料中、少なくとも1つのSPMのレベルの増大が存在することを示す。
増大は、対照値と比較した差である。増大は、例えば少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%又は少なくとも約100%の増大であり得る。増大は、少なくとも約20%の増大であり得る。
或いは、増大は倍数変化として表され得る。当業者は、任意のパーセンテージの増大が倍数変化に変換され得、逆もまた同様であることを諒解するであろう。
複数のSPMが測定される場合、DMARDの有効性を示す増大は、各SPMについて同じであっても異なっていてもよい。
患者を予測されるDMARD非応答者として又は予測されるDMARD応答者として分類するステップは、対照、例えば対照データベースとの比較を含んでもよい。対照データベースは、複数のSPMのレベルが評価される場合、特に有益であり得る。
本方法は、多変量分析を使用して、患者を予測されるDMARD非応答者として分類するステップを含んでもよい。多変量分析は、直交部分的最小二乗判別分析(oPLS-DA)であってもよい。
本方法は、訓練された機械学習モデルを使用して、患者を予測されるDMARD非応答者として分類するステップを含んでもよい。訓練された機械学習モデルは、SVMモデル及び/又はランダムフォレストモデルであってもよい。
本方法は、少なくとも2つのSPMのレベルを測定するステップ、及び患者がDMARD応答者であるか又はDMARD非応答者であるかを決定するステップを含んでもよく、該方法は、少なくとも2つのSPMのレベルを訓練された機械学習アルゴリズムに入力するステップを含み、訓練された機械学習アルゴリズムが、
i.試料からの少なくとも2つのSPMのレベルをデータベース中の同じ少なくとも2つのSPMのレベルと比較し、
ii.患者がDMARD応答者であるか又はDMARD非応答者であるかを出力する
ように構成され、
場合により、訓練された機械学習モデルがサポートベクターマシン(SVM)モデル及び/又はランダムフォレストモデルである。
訓練された機械学習アルゴリズムは、訓練データに基づいて訓練されてもよく、訓練データは、
複数の患者についての脂質メディエータープロファイルを含み、場合により脂質メディエーターの濃度を含む第1のデータ、及び
複数の患者の各々がDMARD応答者であるか又はDMARD非応答者であるかを特定する第2のデータを含む。
機械学習モデルに加えて、ALOX12、ALOX5、ALOX15及びALOX15B酵素の識別的遺伝子発現分析を実施するために、別のスクリプトを使用してもよい。このスクリプトは、刊行物:Robinson MD、McCarthy DJ、Smyth GK(2010年).「edgeR:a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data」、Bioinformatics、26巻(1号)、139～140頁及びMcCarthy DJ、Chen Y、Smyth GK(2012年).「Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation”」、Nucleic Acids Research、40巻(10号)、4288～4297頁において記載されている、公知の、自由に利用可能なパッケージedgeRを使用して作出され得る。このスクリプトは、DMARD応答者とDMARD非応答者との間の特定の遺伝子の発現レベルの差を特定するために、疑似尤度法を使用する。これは、異なる遺伝子発現レベルを可視化するためのバイオリンプロットも提供する。
一実施形態では、本方法は、患者試料中の少なくとも1つのSPMのレベルを1つ以上の対照と比較するステップを含む。「増大」又は「上方制御」は、1つ以上の対照との比較により決定されてもよい。
1つ以上の対照は、1つ以上の対照試料であってもよい。1つ以上の対照試料は、患者試料と並行して分析されてもよい。1つ以上のSPMのレベルは、対照試料中の対応する1つ以上のSPMのレベルと比較されてもよい。「増大」又は「上方制御」は、対照試料との比較により決定されてもよい。比較は、複数の対照試料の間の平均SPMレベルに対するものであってもよい。
1つ以上の対照は、1つ以上の対照試料から以前に得られたレベルを含むデータベースであってもよい。1つ以上のSPMのレベルは、データベース中の対応する1つ以上のSPMのレベルと比較されてもよい。「増大」又は「上方制御」は、データベースとの比較により決定されてもよい。
対照は、複数のDMARDナイーブ患者試料中の1つ以上のSPMの平均レベルであってもよい。
患者が処置より前に予測されるDMARD非応答者として分類された場合には、臨床医はその患者を予測されるDMARD応答者として分類された患者とは異なって処置することができる。患者を予測されるDMARD非応答者として又は予測されるDMARD応答者として分類するステップは、患者により適した特定の又は代替の処置レジメンを採用することを可能とし得る。
例えば、予測されるDMARD非応答者はDMARDに対してより抵抗性であり得る。これらの患者は、したがって、非生物学的DMARD、例えばメトトレキサートではなく、生物製剤である彼らの処置からより利益を得ることができる。
本方法は、患者のための処置を選択するステップを更に含んでもよい。患者のための処置は、予測されるDMARD非応答者として又は予測されるDMARD応答者としての患者の分類に基づいて選択されてもよい。
本方法は、患者のための処置を選択するステップをであって、
(a)患者が予測されるDMARD応答者である場合には、非生物学的DMARDが選択され、
(b)患者が予測されるDMARD非応答者である場合には、生物学的DMARDが選択される
ステップ、を更に含んでもよく、
場合により、患者に選択された処置を投与するステップを更に含む。
本方法は、患者のために選択された処置を投与するステップを更に含んでもよい。
一実施形態では、方法が患者を予測されるDMARD非応答者として分類する場合、生物学的DMARDを用いた処置が選択され、場合により患者に投与される。
別の実施形態では、方法が患者を予測されるDMARD応答者として分類する場合、非生物学的DMARDを用いた処置が選択され、場合により患者に投与される。
一実施形態では、本方法は、患者試料中の少なくとも1つのSPMのレベルを1つ以上の対照と比較するステップを含む。「増大」又は「上方制御」は、1つ以上の対照との比較により決定されてもよい。
1つ以上の対照は、1つ以上の対照試料であってもよい。1つ以上の対照試料は、患者試料と並行して分析されてもよい。1つ以上のSPMのレベルは、対照試料中の対応する1つ以上のSPMのレベルと比較されてもよい。「増大」又は「上方制御」は、対照試料との比較により決定されてもよい。比較は、複数の対照試料の間の平均SPMレベルに対するものであってもよい。
1つ以上の対照は、1つ以上の対照試料から以前に得られたレベルを含むデータベースであってもよい。1つ以上のSPMのレベルは、データベース中の対応する1つ以上のSPMのレベルと比較されてもよい。「増大」又は「上方制御」は、データベースとの比較により決定されてもよい。
対照は、同じ炎症状態を有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者からの試料中の1つ以上のSPMの平均レベルであってもよい。
第2の態様の本方法は、第3の態様の方法と組み合わせてもよい。理論により拘束されるものではないが、関節リウマチを有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、どの関節リウマチ病型を発症するかの予測を、患者がDMARD応答者であるか又はDMARD非応答者であるかの予測と統合することは、
a)患者がDMARD応答者であるか若しくはDMARD非応答者であるかの改善された予測を提供する、及び/又は
b)患者のための処置の改善された選択を提供することができる。
したがって、本発明は、関節リウマチを有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)を用いた処置に対して応答するかどうかを予測する方法であって、第2の態様の方法に従って、患者が発症する関節リウマチ病型を、リンパ骨髄性、びまん性骨髄性及び微量免疫線維性として分類するステップ、DMARDナイーブ患者試料中の少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップ、並びに患者を予測されるDMARD応答者又は予測されるDMARD非応答者として分類するステップを含む、方法も提供する。
第3の態様の本方法は、したがって、第2の態様の方法に従って、患者が発症する関節リウマチ病型を、リンパ骨髄性、びまん性骨髄性及び微量免疫線維性として分類するステップを更に含んでもよい。
一部の実施形態では、患者が微量免疫線維性病型を発症する患者として、及び予測されるDMARD非応答者として分類される場合、生物学的DMARDを用いた処置が選択され、場合により患者に投与される。
コンピュータ実施
本発明の方法は、コンピュータ及びコンピュータにより制御される設備で行われ得る。少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップは、コンピュータにより制御される設備で行われ得る。
本発明は、患者における炎症状態の処置における使用のためのDMARDの有効性を評価するコンピュータ実施方法も提供し、これは、DMARD投与前後に患者から得られた試料における少なくとも1つのSPMのレベルを表す試料データをコンピュータで受信するステップ、並びに、コンピュータでソフトウェアを実行して、試料における少なくとも1つのSPMのレベルを比較し、DMARDの投与後の少なくとも1つのSPMのレベルの上昇が、DMARDの有効性を示し、比較に基づいてDMARDの有効性を表す有効性データを出力するステップを含む。
本発明は、使用説明書を含むコンピュータプログラムであって、コンピュータにより実行される場合、コンピュータに本発明のコンピュータ実施方法を実行させる、コンピュータプログラムも提供する。
試料における少なくとも1つのSPMのレベルを比較するステップは、試料におけるSPMのレベルを表すデータを最初に受信するコンピュータと異なるコンピュータで実行され得ると認識される。
本発明は、患者における炎症状態の処置における使用のためのDMARDの有効性を評価するコンピュータ装置であって、コンピュータを組み込む第1のデバイス、第2のコンピュータ、及び第1のデバイスと第2のコンピュータとの間における、それらの間のデータを送信するための通信チャネルを含み、第1のデバイスは、DMARD投与前後に患者から得られた試料における少なくとも1つのSPMのレベルを表すサンプルデータを受信するように、また、サンプルデータを、通信チャネルを経由して第2のコンピュータに送信するように配置され、第2のコンピュータは、ソフトウェアを実行して、試料における少なくとも1つのSPMのレベルを比較して、患者に対するDMARDの有効性を判定し、DMARDの投与後の少なくとも1つのSPMのレベルの上昇が、有効性を示すように配置され、DMARDの有効性を表す有効性データを出力する、コンピュータ装置も提供する。
第2のコンピュータは、有効性データを、通信チャネルを経由して第1のデバイスに、又は第3のコンピュータに送信するように配置され得る。
幾つかの実施形態では、第1のデバイスは、試料における少なくとも1つのSPMのレベルを測定するためのイムノアッセイ、設備又はデバイスを組み込み得る。
本発明は、本発明の第2の態様による、関節リウマチを有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、どの関節リウマチ病型を発症するかを予測するコンピュータ実施方法及びコンピュータ装置も提供し、その特徴は、変更すべきところは変更した本発明の第1の態様による、コンピュータ実施方法及びコンピュータ装置について上で示されているものに一致する。
本発明は、本発明の第3の態様による、炎症状態を有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)を用いた処置に応答するかどうかを予測するコンピュータ実施方法及びコンピュータ装置も提供し、その特徴は、変更すべきところは変更した本発明の第1の態様による、コンピュータ実施方法及びコンピュータ装置について上で示されているものに一致する。
さらなる利点
関節リウマチと診断され、まだ状態の処置を受けていない、深く表現型を決定された患者からの試料を使用して、本発明者らは、血漿における生物活性メディエーターのレベルを評価し、これらの脂質メディエーターと、DMARDを用いた処置の転帰の相関を評価した。特定済みの4種の特定の分子を実証したこれらの研究からの結果は、処置の転帰の予後を予測した。さらに、これらの研究により、末梢メディエーター濃度は、続いて疾患重症度及び処置応答性と関連する疾患サブセットに関連し得ることも実証された。
したがって、これらの結果により、診断時の患者からの血漿における生物活性脂質メディエーターのレベルを比較すると、患者が最も応答し得る治療薬に対する指標が得られることが指し示される。さらに、処置の開始後、これらの分子の血漿レベルを測定すると、患者が所定の処置に応答するか否かの指標も得られる。
この方法論は、関節リウマチを有する患者が、DMARDを用いた処置に応答するかどうかを予測できる。
本発明により得られる利点は、DMARD処置が有効かどうかを医師が最初に見分けられることである。現在、特定の処置レジメンが作用するか否かはすぐに明らかになり得るが、鎮痛剤などとの組合せの6ヶ月の用量増大サイクルは優にかかることがあり、その後、医師は、まず異なるDMARD、次いで最終的に異なるクラスの薬物を試してよい。この第2のサイクルは、さらに6ヶ月かかり得、疾患進行及び潜在的不可逆性損傷は1年に上り、その後有効な処置(おそらく生物製剤)が使用される。これは、患者を消耗させ、二次的疾患合併症、例えば心血管性疾患及びMTX副作用の形態の健康的影響だけではなく、経済的影響も引き起こす。まったく望ましくない可能性があるDMARDの副作用が、これらに付加されるおそれがある。
疾患病型の判定に関連して本発明により得られる利点は、患者の潜在的な応答性に関連を有することと同様に、異なる病型は、異なるレベルの処置の攻撃性を必要とすることである。したがって患者の疾患病型の判定により、処置の個別化が可能となる。
本発明は、患者の層別を補助する臨床研究室における使用、並びに薬物開発の補助としての医薬品における使用の両方を見出す。
本発明の第2及び後続の態様で好ましい特徴は、変更すべきところは変更した本発明の第1の態様と同様である。
本発明はここに、以下の実施例及び添付の図面に言及する目的で記載されており、これらは、単に例証する目的のために提示されており、本発明の限定とは解釈されるべきではない。
[実施例1]血漿SPM濃度により、RA患者におけるDMARD処置への応答性が予測される
RAを有する患者において、末梢血液SPM濃度によりDMARD応答性が予測されるか否かを判定するために、我々は、処置を開始する前に、深く表現型を決定された初期RA患者における血漿脂質メディエータープロファイルを調査した(患者の情報については表6を参照されたい)。血漿脂質メディエーターを公表された基準(Dalli, J.、Colas, R.A.、Walker, M.E. & Serhan, C.N.「Lipid Mediator Metabolomics Via LC-MS/MS Profiling and Analysis.」Methods Mol Biol 1730、59～72(2018)、その内容は、参照により組み込まれる)に従って特定した。RA患者の血漿において、我々は、全4つの主な必須脂肪酸メタボローム、すなわちアラキドン酸(AA)、EPA、n-3 DPA及びDHAからのメディエーターを特定した(表7)。これらは、EPA、n-3 DPA及びDHAに由来するレゾルビン、並びにn-3 DPA及びDHAに由来するプロテクチン及びマレシンを含んでいた。我々は次に、2つの群の間で異なって発現する脂質メディエーターの濃度に基づく回帰モデルを生成する潜在構造に対する直交射影判別分析(OPLS-DA)を使用して(Chong, J.、Yamamoto, M. & Xia, J. MetaboAnalystR 2.0:「From Raw Spectra to Biological Insights.」Metabolites 9(2019)、その内容は参照により組み込まれる)、DMARD応答者とDMARD非応答者との間で特定されたメディエーターの濃度を評価した。ここで、我々は、DMARD応答者及びDMARD非応答者を表す2つの個別のクラスター(図1A、B)を観察した。我々は次に、機械学習方法ランダムフォレストを使用して、血漿脂質メディエーター濃度に基づくモデルを構築して、これらのメディエーターの処置前のレベルが、DMARD応答性と関連するかどうかをさらに査定した。このアプローチを使用して、我々は、DHA(D-シリーズレゾルビン、プロテクチン及びマレシンを含む)及びEPA(E-シリーズレゾルビンを含む)メタボロームの累積濃度が、患者が処置に応答するか否かの予測の際に最も正確であったことを見出した。転帰の予測の際のDHAメタボロームについての精度は、約81%であり、n-3 DPAメタボロームの精度は約69%であった(図1C及び表8)。これらの値は、DAS28-ESR及びリウマチ因子濃度を含む臨床パラメーターの組合せを使用して得られたものよりやはり高かったことは注目すべきである(図1C)。
我々のモデルのロバスト性を検証するために、我々は、応答者36名及び非応答者22名で構成されるDMARDナイーブ患者の第2のコホートから末梢血液脂質メディエータープロファイルを得、異なるメディエーターメタボロームを使用して生成したモデルが、このコホートにおける患者で転帰を予測するかどうかを試験した(患者の臨床パラメーター及び脂質メディエーター濃度については表9及び10を参照されたい)。この目的のために、我々は、判別閾値を変動することにより分類器の診断可能性を査定する受診者動作特性(ROC)曲線を評価した。生成されたプロットに対する曲線下面積の評価から、DHAメタボロームは、0.44のAUCを生じる一方、n-3 DPAメタボロームは、0.58のAUCを生じることが実証された(図1D、図13及び表8)。異なる機械学習方略サポートベクターマシンを使用して同様の所見がなされた。ここで、DHAメタボロームは、約62%の最高精度スコア、0.54のAUCを生じる一方、n-3 DPAメタボロームは、61%の精度スコア、0.66のAUCを生じた(表1)。我々は、n-3 DPAメタボロームに基づくモデルが、生じたモデルのコンフュージョンマトリックスを使用して患者を正確にカテゴライズする能力をさらに査定した。ここで、我々は、n-3 DPAに由来するメディエーターの濃度に基づくモデルは、応答者の約83%を適切なカテゴリーに正しく分類できたことを見出した(図1E)。したがって、これらの結果は、ベースラインの末梢血液脂質メディエータープロファイルは、DMARD処置転帰と関連することを指し示す。
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患者のDMARD処置への応答性を判定する機構への洞察を得るために、我々は、脂質メディエーター経路分析を実施して、2つの患者群の間でどの経路が示差的に制御されるか特定した。これにより、DMARD非応答者において、応答者と比較した場合、DHAに由来するRvD5及びn-3 DPAに由来するRvT3、並びに侵害受容性メディエーターPGD2及びPGE2を含む炎症促進性エイコサノイドを含むSPM生合成経路の上方制御が存在することが実証された(図2)。SPM発現における差が、SPM生合成に関与する酵素の個別の転写制御と関連するかどうかを判定するために、我々は、これらの2つの患者群からの末梢血液におけるALOX酵素の転写物発現を評価した。ALOX5、ALOX12、ALOX15及びALOX15B転写物レベルは、DMARD応答者及びDMARD非応答者の間で同様であった(図3)。これらの結果から、SPM生合成経路の制御は、タンパク質翻訳の制御又は酵素の翻訳後修飾を経由して、活性を制御できることが示唆される(Dalli, J.、Chiang, N. & Serhan, C.N.「Elucidation of novel 13-series resolvins that increase with atorvastatin and clear infections.」Nat Med 21、1071～1075(2015)及びFredman, G.ら、Resolvin「D1 limits 5-lipoxygenase nuclear localization and leukotriene B4 synthesis by inhibiting a calcium-activated kinase pathway.」Proc Natl Acad Sci U S A 111、14530～14535(2014)。そのいずれの内容も参照により本明細書に組み込まれる)。したがって、我々は次に、これらの酵素の活性が変化するかどうかを試験した。この目的のために、我々は、全4つの脂肪酸メタボロームからのモノヒドロキシル化脂肪酸の血漿レベルを測定して、2つの患者群における活性への洞察を得た。ALOX5活性のマーカーである5-HETE、5HEPE、7-HDPA及び7-HDHAの血漿濃度の評価により、DMARD非応答者において、応答者と比較した場合、7-HDHA、5-HEPE及び5-HETEの著しい上方制御が明らかになった。ALOX12に対するマーカー(14-HDPA及び14-HDHA)及びALOX15に対するマーカー(17-HDPA、17-HDHA、15-HEPE及び15-HETE)の濃度からも、非応答者におけるこれらの酵素に対する活性の上昇が実証された(図4)。したがって、これらの所見から、非応答者において、血漿SPMで観察された上昇は、ALOX活性の上昇によることが指し示される。これらの提案される経路のマーカーの起源をさらに査定するために、我々は、所定のヒドロキシル化脂肪酸のR及びS異性体の分離を可能にするキラル液体クロマトグラフィータンデム質量分析を実施した。ここで、我々は、DMARD応答者及びDMARD非応答者両方の血漿において、試験したモノヒドロキシル化脂肪酸のすべてで最も多量の異性体は、S立体配座でアルコールを保有するものであることを見出した(図14)。SPM生合成に関与する全4つのALOX酵素が優先的にS立体配座の脂肪酸を酸化することを踏まえると、これらの結果から、非応答者におけるALOX活性の上昇が指し示される。
[実施例2]ベースラインのRvD4、10S,17S-ジHDPA、15R-LXA4、MaR1n-3 DPA濃度は、RA患者におけるDMARD処置転帰を予測する
脂質メディエータープロファイルにより、RA患者におけるDMARD処置への応答性を予測することを見出し、我々は次に、処置応答性に対するバイオマーカーとして有用であり得る特定の脂質メディエーターを特定できるかどうかを調査した。この目的のために、我々は、予測精度に基づくモデルの性能に関して、すべてのメディエーターの関連性を特定するランダムフォレスト「重要性」分析を実施した。ここで、我々は、DHAに由来するRvD4(4S,5R,17S-トリヒドロキシ-6E,8E,10Z,13Z,15E,19Z-ドコサヘキサエン酸)及び10S,17S-ジHDPA(10S,17S-ジヒドロキシ-7Z,11E,13Z,15E,19Z-ドコサペンタエン酸)は、処置応答性の予測において最も重要なメディエーターであることを見出し、15R-LXA4(5S,6R,15R-トリヒドロキシ-7E,9E,11Z,13E-エイコサテトラエン酸)、5S,12S-ジHETE(5S,12S-ジヒドロキシ-6E,8Z,10E,14Z-エイコサテトラエン酸)、4S,14S-ジHDHA(4S,14S-ジヒドロキシ-5E,7Z,10Z,12E,16Z,19Z-ドコサヘキサエン酸)及びn-3 DPAに由来するマレシン1(MaR1n-3 DPA)(7R,14S-ジヒドロキシ-8E,10E,12Z,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)も、RvD4及び10S,17S-ジHDPAより程度は低いが顕著な寄与を呈示した(図1F)。潜在的な候補バイオマーカーを特定し、我々は次に、ランダムフォレスト方法論、並びに、DMARDナイーブ患者の第2の群を使用したRvD4、10S,17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPA又はRvD4、10S,17S-ジHDPA、15R-LXA4、5S,12S-ジHETE、4S,14S-ジHDHA、MaR1n-3 DPAの濃度を使用して機械学習モデルを構築し(患者の臨床パラメーター及び脂質メディエーター濃度については表9及び10を参照されたい)、このモデルが患者を正しい転帰群に割り当てる能力を試験した。ここで、我々は、2つのメディエーターのみの組合せは、症例の約86%において処置転帰を予測するが、4つのメディエーターを使用したモデル構築は、約83%のより優れた予測スコアを生じることを見出した(図1G)。我々は次に、異なる群のDMARDナイーブ患者からのメディエーター濃度を使用して、これらの2つのモデルの精度を検証した。これらの実験からの結果により、4つのメディエーターを使用したモデル構築は、0.80のAUCを生じた一方、6つのメディエーターで構築したモデルは、0.79のAUCスコアを生じることが実証された(図1H)。これらのメディエーターでのAUCは、n-3 DPAメタボロームからのメディエーター濃度及び疾患スコアを使用して得られたものより著しく優れていたことは注目すべきである(図1D)。
[実施例3]処置前の脂質メディエータープロファイルにより、個別の疾患病型が特定される
最近の研究から、RAを有する患者は、滑膜の分子の及び組織学的特徴に基づいて、3つのカテゴリー、リンパ性骨髄性、びまん性骨髄性及び微量免疫線維性に分類され得、これらは、個別の疾患進行及びDMARD処置に対する応答に関連することが実証されている(Humby, F.ら、「Synovial cellular and molecular signatures stratify clinical response to csDMARD therapy and predict radiographic progression in early rheumatoid arthritis patients.」Ann Rheum Dis(2019)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。したがって、我々は次に、これらの群のそれぞれにおける免疫に関連した特徴が、滑膜を超えて全身循環へと拡大するかどうかを疑った。この疑いに対処するために、我々は、DMARD治療を開始する前に、これらの3つの群のそれぞれからのRA患者における末梢血液脂質メディエーター濃度が個別かどうかを評価する、脂質メディエータープロファイリングを実施した。PLS-DAを使用して、我々は、血漿脂質メディエーターは、異なる疾患病型について実際に特徴的であり、すなわち各カテゴリーについてクラスター化される個別の脂質メディエータープロファイルであることを見出した(図5A)。群間で観察された隔たりにおける各メディエーターの寄与を特定する、投影における変数の重要度(VIP)スコアの評価により、微量免疫線維性病型を有する患者からの末梢血液における15R-LXA4及びMCTR2を含む炎症収束性メディエーターの上方制御が実証された。これらの患者からの血漿において、我々は、PGD2、及び安定なさらなる代謝産物TxB2として測定されるTxA2を含む炎症促進性及び免疫抑制性メディエーターの上方制御も見出した(図5B)。
我々は次に、これら3つの病型のそれぞれに対する、DMARD応答者と非応答者との間における脂質メディエータープロファイルの示差的制御を調査した。ここで、我々は、リンパ性骨髄性病型を有する非応答者及び微量免疫線維性病型を有する非応答者において、それぞれの病型を有する応答者と比較した場合、n-3 DPA及びDHAメタボロームの両方から、ALOX5生成物の増加を見出した。これらは、DHAに由来するRvD4及びPDXにおける著しい増加を含んでいた。AA及びEPAメタボロームからのメディエーターの評価により、リンパ性骨髄性病型及び微量免疫線維性病型を有する非応答者におけるALOX5生成物の増加が実証され、この増加は、ロイコトリエン(LT)B4経路に関して、さらなる代謝産物20-COOH-LTB4を含めて、微量免疫線維性病型を有する患者において統計的有意性に達した。これらの患者では、我々は、炎症促進性及び侵害受容性メディエーターPGE2の統計的に有意な増加も見出した(図6)。これらの結果から、DMARD応答者と非応答者との間における末梢血液脂質メディエータープロファイルにおける差は、異なるRA病型に共通であることが実証される。
これらの患者群の間で脂質メディエーター濃度が異なることを見出し、我々は次に、疾患病型と上で特定されたバイオマーカーを組み合わせることにより、我々の機械学習モデルの予測性がさらに向上するかどうかを評価した。この分析からの結果により、RA病型のそれぞれに対して別の機械学習モデルが構築される場合、応答者の特定においてRvD4、10S,17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPAの予測性の顕著な上昇が実証され、モデルが応答者を正しく分類する能力は約89%まで上昇した(図5D)。
[実施例4]DMARD応答者における、処置後6ヶ月の非応答者と比較した場合のSPMの増加
処置を開始する前に、DMARD応答者とDMARD非応答者との間で、末梢血液SPM濃度における示差的制御を観察し、我々は次に、末梢血液脂質メディエーター濃度における差は、処置開始から6ヶ月後の患者にも存在するかどうかを調査した。OPLS-DA分析から、処置の開始から6ヶ月後に、DMARD応答者からの血漿脂質メディエータープロファイルは、2つの患者クラスター間の隔たりにより実証されるように、DMARD非応答者のものとは異なっていることが実証された(図7A、表11)。VIPスコアの評価により、2つの患者群の間で示差的に発現した21のメディエーター及びSPM経路マーカーが特定された(図7B)。これらのメディエーターのうち、我々は、進行している炎症中の宿主応答の調整に関与するSPM、例えばPCTR2、RvD2及びRvD3(Arnardottir, H.H.ら、Resolvin「D3 Is Dysregulated in Arthritis and Reduces Arthritic Inflammation.」J Immunol 197、2362～2368(2016)、Chiang, N.、Dalli, J.、Colas, R.A. & Serhan, C.N.「Identification of resolvin D2 receptor mediating resolution of infections and organ protection」. J Exp Med 212、1203～1217(2015)及びDalli, J.、Ramon, S.、Norris, P.C.、Colas, R.A. & Serhan, C.N. Novel proresolving and tissue-regenerative resolvin and protectin sulfido-conjugated pathways. FASEB J 29、2120～2136(2015)、そのすべての内容は、参照により組み込まれる)、並びに疼痛調節に関連するメディエーター、例えばRvE1及びRvE2(Barden, A.E.ら「Specialised pro-resolving mediators of inflammation in inflammatory arthritis」. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 107、24～29(2016)及びXu, Z.Z.ら「Resolvins RvE1 and RvD1 attenuate inflammatory pain via central and peripheral actions.」Nat Med 16、592～597、591～597頁(2010)、その両方の内容は、参照により組み込まれる)を見出した(図7B)。
Figure 2022548905000022
これらの患者群の間における示差的に制御されたメディエーター経路へのさらなる洞察を得るために、我々は、必須脂肪酸メタボロームのそれぞれでの生合成経路を調べた。この分析から、n-3 DPA及びDHAメタボロームの両方からのALOX5及びALOX15に由来するメディエーターの濃度は、非応答者の血漿において、応答者と比較した場合、低下したことが実証された(図7C)。EPA及びAAに由来する脂質メディエーター濃度の経路分析により、EPAのALOX5に由来する生成物も減少した一方、AAに由来するALOX5生成物は、強力な白血球化学誘引物質LTB4及びイオンチャネル型システイニルロイコトリエンのものを含めて(Radmark, O.、Werz, O.、Steinhilber, D. & Samuelsson, B.「5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease」. Biochim Biophys Acta 1851、331～339(2015)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)、非応答者からの血漿において、応答者と比較した場合、著しく増加したことが実証された(図7D)。
SPM濃度の著しい低下を観察して、我々は次に、ALOX酵素の活性、並びにDHA及びn-3 DPAの変換率が、2つの患者群からの末梢血液細胞において変化するかどうかを調査した。この目的のために、我々は、DHA及びn-3 DPAメタボロームからのモノヒドロキシル化脂肪酸の血漿レベルを測定して、酵素活性及び基質変換率の両方への洞察を得た。ALOX5生成物7-HDPA及び7-HDHAの血漿濃度は、2つの患者群の間で同様であった(7-HDPA)、又はDMARD非応答者において上方制御された(7-HDHA)。ALOX12(14-HDPA及び14-HDHA)及びALOX15(17-HDHA及び17-HDPA)生成物の濃度は、非応答者において上昇した(図8)。ベースラインの血漿で観察されるように、モノヒドロキシル化脂肪酸のキラル分析により、これらの生成物のそれぞれで主要な異性体は、S-異性体であると実証されたことは注目すべきである(図15)。これらの所見から、DMARD非応答者における血漿DHA及びn-3 DPA由来SPMにおいて観察された減少は、これらの患者からの末梢血液細胞におけるALOX活性及び/又は基質の可用性/変換率の低下によらなかったことが指し示される。まとめると、これらの観察により、処置開始から6ヶ月後、DMARD応答者における血漿SPM濃度は、DMARD非応答者において測定したものより高かったことが実証される。酵素活性が、非応答者において、応答者と比較した場合、上昇したことを踏まえ、これにより、SPM生合成経路の脱共役は、血漿SPM濃度の低下の原因であり得ることが示唆される。
[実施例5]SPMは、実験炎症性関節炎におけるMTXの保護作用を媒介する
SPMは、処置開始後に応答者において、非応答者と比較した場合、上昇したので、また、MTXは、これらの患者の処置におけるアンカードラッグであることを踏まえ、我々は次に、MTXがSPM生成を制御するかどうかを疑った。ヒト全血を、臨床的に関連性があり、比較可能な濃度のMTXとインキュベーションすることにより(Edno, L.ら「Total and free methotrexate pharmacokinetics in rheumatoid arthritis patients」. Ther Drug Monit 18、128～134(1996)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)、OPLS-DA分析におけるSPMクラスターの右側シフトにより実証されているように、血漿SPM濃度を上昇させた。このシフトは、DHAに由来するPDX及びRvD1、並びにEPAに由来するRvE3を含む、DHA、n-3 DPA及びEPA生物活性のメタボロームからのメディエーターの上方制御に関連していた(図9A～C及び表12)。
in vitroのヒト細胞で得られた所見が、in vivoシナリオにも移行可能かどうかを試験するために、我々は次に、MTXが、マウスにおけるSPMレベルも上方制御するかどうかを評価した。MTXのマウスへの投与により、末梢血液SPMプロファイルの用量依存的シフトがもたらされた。このシフトが、RvT1、RvT4及びRvD5n-3 DPAを含む幾つかのALOX15に由来するSPMの上方制御に関連していたことは注目すべきである(図9D～E及び表13)。我々は次に、SPMの制御が、実験炎症性関節炎において、MTXの関節保護作用の中心であるかどうかを試験した。この目的のために、我々は、MTXを野生型(WT)マウス及びALOX15(Alox15-/-)を欠くマウスに投与し、関節疾患活動性を評価した。予想通り、MTXのWTマウスへの投与により、臨床スコアの著しい低下、体重減少の改善及び前足の浮腫の抑制が導かれた(図10A～C)。これらの研究で、我々は、関節に動員された好酸球、好中球、単球及びマクロファージ数の減少、並びに炎症性エイコサノイド濃度の低下も見出した(図10D及び11)。MTXの保護作用が、ALOX15酵素を欠くマウスで失われたことは注目すべきである。これらのマウスで、MTXは、疾患活動性、体重減少(図10A～C)、白血球輸送(図10D)、並びに末梢血液及び循環エイコサノイド濃度(図11)をもはや制御しなかった。したがって、これらの所見から、MTXが、SPM生成を上方制御し、これらの内因性経路を欠くことで、このDMARDの関節保護作用が無効化することが指し示される。
Figure 2022548905000023
ヒト全血を、MTX(100nM、37℃、45min)とインキュベーションした。インキュベーションをクエンチし、SPMを特定し、LC-MS/MSに基づく脂質メディエータープロファイリングを使用して定量化した。結果は平均±SEMである。群当たりの志願者n=6。
Figure 2022548905000024
マウスに指示された用量のMTX又はビヒクル(生理食塩水)を、静脈内注射により投与した。1時間後血液を収集し、LC-MS/MSに基づく脂質メディエータープロファイリングを使用して、SPM濃度を判定した。0.1のFDRを用いたBenjamin Hochberg調整を使用して補正したt-検定を使用して* p<0.05。
[実施例6]MTXによるp-300及びMAPKの活性化は、SPM生成を増加させ、実験炎症性関節炎中に保護する
個別のシグナル伝達経路は、CREB-結合タンパク質及びそのホモログp300(CBP/p300)の下流のもの、並びにp38マイトジェン-活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)を含めて、白血球を含む標的細胞におけるMTXの細胞作用の媒介に関与する(Thornton, C.C.ら「Methotrexate-mediated activation of an AMPK-CREB-dependent pathway: a novel mechanism for vascular protection in chronic systemic inflammation」. Ann Rheum Dis 75、439～448(2016)及びWu, C.W.ら「Combined treatment with vitamin C and methotrexate inhibits triple-negative breast cancer cell growth by increasing H2O2 accumulation and activating caspase-3 and p38 pathways」. Oncol Rep 37、 2177～2184(2017)、その両方の内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。これらの2つの経路は、ALOX15発現の制御にも関与することを踏まえ(Shankaranarayanan, P.、Chaitidis, P.、Kuhn, H. & Nigam, S.「Acetylation by histone acetyltransferase CREB-binding protein/p300 of STAT6 is required for transcriptional activation of the 15-lipoxygenase-1 gene」. J Biol Chem 276、42753～42760(2001)、Xu, B.ら「Interleukin-13 induction of 15-lipoxygenase gene expression requires p38 mitogen-activated protein kinase-mediated serine 727 phosphorylation of Stat1 and
Stat3.」Mol Cell Biol 23、3918～3928(2003)及びFredman, G.ら「An imbalance between specialized pro-resolving lipid mediators and pro-inflammatory leukotrienes promotes instability of atherosclerotic plaques」. Nat Commun 7、12859(2016)、そのすべての内容は、参照により組み込まれる)、我々は次に、これらが、MTXによるSPM生成で観察される増加に関与しているかどうかを疑った。この目的のために、我々は、これらの経路への阻害剤が、ヒト末梢血液においてMTXに誘導されるSPMの上方制御をブロックするかどうかを評価する薬理学的アプローチを用いた。ここで、我々は、全血の、CBP/p300(L002)及びMAPK(SB202190)の両方に対する阻害剤とのインキュベーションは、血漿脂質メディエータープロファイルを、MTXが誘導するSPMの上方制御のブロックへと著しくシフトさせ、PD1、MaR2n-3 DPA及び抗関節炎ではRvD1を含む幾つかのメディエーターの濃度を低下させた(Norling, L.V.ら「Proresolving and cartilage-protective actions of resolvin D1 in inflammatory arthritis」. JCI Insight 1、e85922(2016)、その内容は参照により組み込まれる)(図12A、B)ことを見出した。我々は次に、これらの経路の阻害は、実験炎症性関節炎において、MTXの抗関節炎作用も無効化するかどうかを試験した。ここで、我々は、L002又はSB202190の投与により、疾患活動性のマーカーである関節炎症の増加、関節損傷の増加、及び体重減少の増加により測定されるように、MTXの抗関節炎作用が無効化したことを見出した(図12C～E)。これらの阻害剤の投与は、MTXが炎症関節への好中球輸送を制御する能力も無効化し、強力な白血球化学誘引物質LTB4の関節濃度の上昇と関連していた観察(図12F、G)。したがって、CBP/p300又はMAPKの薬理学的阻害は、MTXのALOX15活性に対する有益な効果、及び下流の関節疾患に対する有益な効果を取り消す。これらの所見から、CBP/p300及びMAPKの活性化により、MTXは、SPM生成を上方制御し、炎症性関節炎中の関節炎症及び関節損傷を抑えるALOX15の活性を制御することが示唆される。
[実施例7]好適な試料処理法の要約
血漿試料を収集し、重水素標識内部標準物質(d4-LTB4、d8-5S-HETE、d4-PGE2、d5-LXA4及びd5-RvD2、それぞれ500pg)を含有するメタノールに入れる。これらを次いで-20℃にて45分保持して、タンパク質を沈殿させ、先の刊行物(Dalliら、2018)のように固相抽出を施した。メチルホルメート分画を次いで、TurboVap LP(Biotage)を使用して乾燥させ、生成物を、LC-MS-MSのために水-メタノール(50:50 vol:vol)に懸濁した。QTrap 5500(ABSciex、ウォリントン、UK)と対にしたShimadzu LC-20AD HPLC及びShimadzu SIL-20ACオートインジェクター(島津製作所、京都、日本)を利用し、記載されているように作動させた(Dalliら、2018)。各脂質メディエーター及びそれぞれの経路をモニターするために、各脂質メディエーターについて合成及び真正材料、並びに少なくとも6種の診断用イオンに保持時間(RT)をマッチングさせることを含めて、診断用イオン断片及び最近公表された基準(Dalliら、2018)を使用した特定を用いた多重反応モニタリング(MRM)法を開発した。0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100及び200pgで真正化合物混合物及び重水素標識脂質メディエーターを使用して、それぞれに対して較正曲線を得た。各脂質メディエーターに対して線形較正曲線を得、これにより、0.98～0.99のr2値が得られた。すべての分析を盲検で実施した。
以下の脂質メディエーターファミリーに対するメディエーターレベルのレベル
アラキドン酸からのリポキシン、ロイコトリエン、プロスタグランジン及びトロンボキサン;エイコサペンタエン酸からのE-シリーズレゾルビン;n-3ドコサペンタエン酸からのレゾルビン、プロテクチン及びマレシン、並びにドコサヘキサエン酸からのレゾルビン、プロテクチン及びマレシン、並びにそれらの経路のマーカーと、さらなる代謝産物は、これらの患者からの血漿で測定され、目的の処置に応答及び非応答の患者からの深く表現型を決定された患者の試料を使用して集められた、確立されたデータベースと比較される。
材料&方法
以下の材料及び本方法は、上の実施例のすべてに関する。
液体クロマトグラフィー(LC)-グレードの溶媒は、Fisher Scientific(ピッツバーグ、PA、USA)から購入し、Poroshell 120 EC-C18カラム(100mm×4.6mm×2.7μm)は、Agilent(チェシャー、UK)から得、C18 SPEカラムは、Biotage(ウプサラ、SE)からであり、LC-タンデム質量分析(MS-MS)定量のための合成標準物質及び重水素化(d)内部標準物質(d8-5S-HETE、d5-RvD2、d5-LXA4、d4-PGE2及びd4-LTB4)は、Cambridge Bioscience(ケンブリッジ、UK)から購入し、又はCharles N. Serhan(Harvard Medical School、ボストン、マサチューセッツ、USA、NIH提供のP01GM095467により裏付けられる)により提供された。メトトレキサート(MTX、Sigma)、ダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS、カルシウム及びマグネシウムなし、Sigma)、全血溶解試薬キット(Beckman Coulter, Inc.)。L002及びSC202190(Cayman Chemicals)。
初期関節炎コホートの病理生物学
ベースライン及び処置後6ヶ月の血漿試料は、初期関節炎コホートの病理生物学(PEAC)から得た。PEACコホート研究は、King's College Hospital研究倫理委員会(REC 05/Q0703/198)の承認を受けた。書面によるインフォームドコンセントに従って、Barts Health NHS Trustで、初期関節炎コホートの病理生物学(PEAC、http://www.peac-mrc.mds.qmul.ac.uk)に募集され、大半の炎症関節(膝、手首又は手若しくは足の小関節)5の超音波(US)ガイド滑膜生検を受けた患者から末梢血液試料及び滑膜組織を得た。すべての患者は、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)及びステロイドナイーブであり、12ヶ月未満の症状の持続時間を有し、RAでのACR/EULAR 2010分類基準を満たしていた。RAの個人は、滑膜組織の組織学的分類に基づいて3種の病型:リンパ性骨髄性、びまん性骨髄性及び微量免疫線維性(さらなる詳細についてはHumby, F.ら「Synovial cellular and molecular signatures stratify clinical response to csDMARD therapy and predict radiographic progression in early rheumatoid arthritis patients.」Ann Rheum Dis(2019)を参照されたい、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)にカテゴライズした。患者をメトトレキサートで処置した。6ヶ月後に混合DMARD治療の応答状態を、DAS28-ESRに基づくEULAR応答基準により判定した。
キラルLC-MS/MS分析
キラルリピドーム分析では、定組成メタノール/水/酢酸95:5:0.01(v/v/v)を用いるChiralpak AD-RHカラム(150mm×2.1mm×5μm)を0.15ml/minで使用した。同重体モノヒドロキシドコサペンタエン酸レベルをモニターするために、Dalli J、Chiang N、Serhan CN. Elucidation of novel 13-series resolvins that increase with atorvastatin and clear infections. Nat Med 21、1071～1075(2015)のように各分子のシグネチャーイオン断片を使用する多重反応モニタリング(MRM)法を開発した。
データ
機械学習モデル及びネットワーク分析に使用されるデータは、第1のPEACに由来する患者コホートで、DMARDを用いた処置に応答する(n=30)、又は応答しない(n=24)、RAを有する患者の脂質メディエータープロファイルからなっていた。脂質メディエータープロファイルは、DHAに由来するレゾルビン(RvD1、RvD2、RvD3、RvD4、RvD5、RvD6、17-RvD1及び17-RvD3)、プロテクチン(PD1、17-PD1、10S,17S-ジHDAH及び22-OH-PD1)、PCTR(PCTR1、PCTR2及びPCTR3)、マレシン(MaR1、MaR2、7S,14S-ジHDHA、4,14-ジHDHA、14-オキソ-MaR1及び22-OH-MaR1)、MCTR(MCTR1、MCTR2及びMCTR3)、13-シリーズレゾルビン(RvT1、RvT2、RvT3及びRvT4)、n-3 DPAに由来するレゾルビン(RvD1n-3 DPA、RvD2n-3 DPA及びRvD5n-3 DPA)、n-3-DPAに由来するプロテクチン(PD1n-3 DPA及び10S,17S-ジHDPA)、n-3 DPAに由来するマレシン(MaR1n-3 DPA)、E-シリーズレゾルビン(RvE1、RvE2及びRvE3)、ロイコトリエン(LXA4、LXB4、5S,15S-ジHETE、20-OH-LTB4、20-COOH-LTB4、6-トランス-LTB4及び12-エピ-6-トランス-LTB4)、システイニルロイコトリエン(LTC4、LTD4及びLTE4)、プロスタグランジン(PGD2、PGE2、PGF2a)及びトロンボキサン(TXB2)を含んでいた。臨床スコアモデルは、以下の臨床パラメーターを使用して得た。疾患持続時間、赤血球沈降速度(ESR)、リウマチ因子(RF力価)、疲労のビジュアルアナログスケール(VAS)、疼痛のVAS、患者の全体的健康のVAS、医師の全体的評価のVAS、関節腫脹数、疾患活動性スコア-28(DAS28)、並びにUS滑膜肥厚及びUSパワードップラーのスコア最大12。患者45名(応答者37名及び非応答者8名)の第2の患者コホートは、PEAC研究から得、脂質メディエータープロファイリング及び臨床スコアモデルのための検証データセットとして、また、特定のバイオマーカーに基づく改善したモデルのための訓練データセットとして使用した。先に言及されていない年齢、性別及び臨床パラメーターは、RA患者のDMARD処置に対する応答を分類できるモデル作出の、この第1近似値とは考えられなかった。
モデル構築
データを前処理し、Rソフトウェア(バージョン3.5.1; https://www.r-project.org/)及びRStudio環境(バージョン1.1.456; https://www.rstudio.com/)を使用して分析した。
予備的分析から、試料収集中の凝固を反映する可能性があるTXB2の外れ値濃度を示すために2つの試料を除去し、臨床記録がないためにさらなる試料を除去した。脂質メディエーター濃度はすべて、同一量の標準物質に基づいて計算されるので、標準化は必要とされないが、濃度は、平均を引き、各特徴の標準偏差で割ることによりスケールされた。
2つの教師あり機械学習方法論を使用して、分類器モデル:クラシファイア(Chatzimichali, E.A. & Bessant, C.「Novel application of heuristic optimisation enables the creation and thorough evaluation of robust support vector machine ensembles for machine learning applications」. Metabolomics 12、16(2016)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)及びランダムフォレスト(Breiman, L. Classification and Regression Trees, (Routledge、2017)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)を作出した。クラシファイアは、サポートベクターマシン(SVM)を使用して、超平面により分けられた2つの空間で試料を組織することにより群を分離し、同一群における試料間の距離が、広くなりすぎず、群間の距離ができるだけ大きくなるようにする(Bennett, K.P. & Campbell, C.「Support vector machines.」ACM SIGKDD Explorations Newsletter 2, 1～13(2000)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。それ以外に、モデルを改善及び検証するために、ブートストラップ(元のデータを反復して復元リサンプリングすることにより作出される新たなデータセット)を使用する。この研究では、クラシファイアは、Rパッケージ「classyfire」(https://cran.r-project.org/src/contrib/Archive/classyfire/)を使用して実施され、各アンサンブルにおいて、70回のブートストラップ反復及び70の個々の分類器を用いた。我々は、モデルを改善及び検証するために、Rパッケージ「classyfire」におけるブートストラップの誤差36の最小化を含む内蔵自動最適化ステップも使用した(代表的な転帰については図13を参照されたい)。
ランダムフォレストは、弱い決定木分類器のコンセンサスを得ることにより動作する(Han, T.、Jiang, D.、Zhao, Q.、Wang, L. & Yin, K.「Comparison of random forest, artificial neural networks and support vector machine for intelligent diagnosis of rotating machinery.」Transactions of the Institute of Measurement and Control 40、2681～2693(2018)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。決定木は、頂点として特徴、及び葉として分類を使用して作出され、各木は、無作為に選択された特徴の異なるセットを使用して設計される(Lotsch, J.ら「Machine-learning based lipid mediator serum concentration patterns allow identification of multiple sclerosis patients with high accuracy.」Sci. Rep. 8、14884(2018)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。このケースでは、実行当たり木10,000本のパラメーター設定でRパッケージ「randomForest」(https://cran.r-project.org/package=randomForest)(検証方法としてブートストラップも使用する)、及び各分岐で候補として無作為にサンプリングした最良の数の変数を定義する小ループの設計を使用した。この値を超えるn本の木の数を増加させても、転帰を著しく改善しなかった(代表的な転帰については図13を参照されたい)。
モデル試験
受診者動作特性曲線(ROC曲線)を構築して、試験データセットにおいて、DMARD応答者とDMARD非応答者との間で予測する場合の、モデルの予測精度を査定した。ROC曲線は、偽陽性率に対する真陽性率をプロットすることにより作製され、これは、判別閾値が変化する場合、モデルの感度及び特異度を示す。曲線下面積(AUC)は、モデルの予測性能として計算される。ROC曲線は、Rパッケージ「pROC」(https://cran.r-project.org/web/packages/pROC/index.html)を使用して作出した。ほぼ1(AUC>0.8)のAUC値は、良好な分類器モデルを指す。
受診者動作特性曲線(ROC曲線)を構築して、試験データセットにおいて、DMARD応答者とDMARD非応答者との間で予測する場合の、モデルの予測精度を査定した。ROC曲線は、偽陽性率に対する真陽性率をプロットすることにより作出され、これは、判別閾値が変化する場合、モデルの感度及び特異度を示す。曲線下面積(AUC)は、モデルの予測性能として計算される。ROC曲線は、Rパッケージ「pROC」(https://cran.r-project.org/web/packages/pROC/index.html)を使用して作出した。ほぼ1(AUC>0.8)のAUC値は、良好な分類器モデルを指す。ROC曲線と共に、他の統計値、例えば正しく分類された試料のパーセンテージ(%精度スコア)、特異度及び感度も計算された。
特徴選択及びモデル改善
ランダムフォレストは、試験ステップ中の最良の検証スコアを示すので、モデル改善は、ランダムフォレスト方法論に基づいていた。脂質メディエーターを前駆体(DHA、n-3 DPA、EPA及びAA)に基づいて群、又はメディエーターの個別のクラスターに分離した。それ以外に、また、具体的な特徴が存在しない場合、モデルの平均精度の低下に基づく関連性によりモデルの特徴を組織するランダムフォレストの「重要性」機能を使用して、異なるモデルは、最も関連性がある脂質メディエーターのみを使用して作出した。%精度スコア及びMCCは、すべてのモデルについて、また結果に従って計算し、最良モデル、並びにDMARD応答者及びDMARD非応答者患者の分類について最も関連性があるバイオマーカーを選択した。
病型分析
すべてのデータ(訓練及び検証コホート)を、患者について示されている特定の病型:微量免疫/線維性(n=28)、リンパ性骨髄性(n=27)及びびまん性骨髄性(n=31)に基づいて分離した。これは、より良好な分類モデルを探す目的、及び、特定の脂質メディエーターが異なる疾患の発現の原因であったかどうかを見る目的で行われた。モデルは、ランダムフォレストを使用して構築し、各モデルを検証するために、異なる統計的スコアを計算した。
ネットワーク分析
DMARD非応答者及びDMARD応答者群からの脂質メディエーターの標準化された濃度の間における統計的な差(倍数変化として表される)は、student t-検定、続いてBenjamini-Hochberg手順を使用する多重比較補正を使用して判定した。これらの差に基づいて、Cytoscape 3.7.1を使用して、脂質メディエーター生合成ネットワークを作成した。異なる経路は、異なる色及び線形を使用して例証したが、上方又は下方制御されたメディエーターは、それぞれ菱形又は三角形、また、結節点の大きさの変化で表される。ボールド体のメディエーターは、2つの群の間における統計的な差を表す。DMARD非応答者とDMARD応答者との間の比較は、前及び後処置データで行われた。
標的化脂質メディエータープロファイリング
血漿は、健常志願者、患者及びマウスの末梢血液から得られ、これに、1500×g、室温にて10minの遠心分離が続いた。前足を収集し、1ml氷冷MeOH中で均質化する前に、液体窒素にすぐに移し、ガラスダウンスを使用して均質化した。固相抽出カラムを、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Walker, M. E.、Souza, P. R.、Colas, R. A. & Dalli, J.「13-Series resolvins mediate the leukocyte-platelet actions of atorvastatin and pravastatin in inflammatory arthritis.」FASEB J 31、3636～3648(2017)のように使用して、LC-MS/MS-に基づくプロファイリングのためにすべての試料を抽出した。試料抽出前に、定量化を促進するために、クロマトグラフィー分析で各領域を表す重水素化内部標準物質(それぞれ500pg)を添加した。試料を-20℃にて最短45min保持して、タンパク質を沈殿させた。上澄みを固相抽出に施し、メチルホルメート分画を収集し、乾燥させ、QTrap 5500又はQTrap 6500 plus(Sciex)と対にしたShimadzu LC-20AD HPLC及びShimadzu SIL-20ACオートインジェクターでの注入のために、相(メタノール/水、1:1、vol/vol)中で懸濁した。Agilent Poroshell 120 EC-C18カラム(100mm×4.6mm×2.7μm)を50℃にて保持し、20:80:0.01(vol/vol/vol)の、0.5minかけて50:50:0.01(vol/vol/vol)、次いで2minから11minで80:20:0.01(vol/vol/vol)に勾配し、14.5minまで維持し、次いで、次の0.1minで98:2:0.01(vol/vol/vol)に急速に勾配するメタノール/水/酢酸からなる移動相を使用してメディエーターを溶出した。これを続いて98:2:0.01(vol/vol/vol)で5.4min維持し、流速を0.5ml/minで維持した。QTrap 5500又はQTrap 6500 plusは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Walker, M. E.、Souza, P. R.、Colas, R. A. & Dalli, J.「13-Series resolvins mediate the leukocyte-platelet actions of atorvastatin and pravastatin in inflammatory arthritis.」FASEB J 31、3636～3648(2017)のように、多重反応モニタリング法を使用して作動させた。各脂質メディエーターは、合成又は真正標準物質及び少なくとも6種の診断用イオンに保持時間をマッチングさせることを含む、確立された基準を使用して特定した(Walker, M. E.、Souza, P. R.、Colas, R. A. & Dalli, J.「13-Series resolvins mediate the leukocyte-platelet actions of atorvastatin and pravastatin in inflammatory arthritis.」FASEB J 31、3636～3648(2017)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。脂質メディエーター混合物を、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100及び200pgで使用して、各メディエーターに対して較正曲線を得、これにより、r2値が0.98～0.99の線形較正曲線が得られた。
健常志願者の採血
NSAIDSを少なくとも14日間、カフェイン及びアルコールを少なくとも24h(時間)、及び脂の多い魚を48h摂取していないことを申告した絶食志願者からの静脈末梢血液を指示された間隔でクエン酸ナトリウム(3.2%)中に収集した。志願者から、Queen Mary研究倫理委員会(QMREC 2014:61)及びHelsinki宣言に従って書面による同意を得た。
ヒト全血インキュベーション
選択実験では、全血をL002(2μM)又はSB202190(5μM)又はビヒクル(0.1% DMSO)と45min(37℃)インキュベーションした。血液を次いでMTX(100nM)と45min(37℃)インキュベーションした。血漿を次いで、脂質メディエータープロファイリングのために、遠心分離により1,500×gで10min分離した。
動物
雄C57BL/6マウス及びAlox15-/-(11週齢)を、Charles River Laboratories (ケント、英国)から調達した。実験は、United Kingdom Home Office regulations (Guidance on the Operation of Animals、Scientific Procedures Act)及びLaboratory Animal Science Association Guidelines (Guiding Principles on Good Practice for Animal Welfare and Ethical Review Bodies)を厳守した。すべての動物に、標準的な実験動物用飼料及び水を自由に与え、12-h明暗サイクルで保持した。
炎症性関節炎
雄C57BL/6マウス及びAlox15-/-(11週齢)に、K/BxN血清(100μl、i.p.)を0日目及び2日目に投与して、炎症性関節炎を開始した。マウスに次いで、MTX(それぞれ25mg/kg)、又はビヒクル(1%DMSOを含有するDPBS-/-)を、3、5及び7日目に腹腔内注射により与えた。臨床スコアは、26ポイント関節炎スコアリングシステムを使用することにより毎日モニターした。マウスの後足首/前足首、肉球及び指の腫脹及び赤みを毎日査察した。血液及び前足を8日目に収集した。
選択実験では、雄C57BL/6マウス(11週齢)に、MTX注射の前にL002(それぞれ20mg/kg)又はSB202190(それぞれ20mg/kg)を与えた。臨床スコアは、26ポイント関節炎スコアリングシステムを使用することにより毎日モニターした。マウスの後足首/前足首、肉球及び指の腫脹及び赤みを毎日査察した。血液及び前足を関節炎開始から8日目に収集した。
酵素転写物発現
RNAは、Ambion Ribo-Pure Blood kit (ThermoFisher Scientific)を使用して、RNALater溶液中の全血試料から抽出した。全体のRNA配列決定(RNA-seq)は、Illumina HiSeq2500プラットフォームで行った。生データは、FastQCを使用して品質管理し、Cutadaptでトリミング又は除去した。転写物存在量は、Kallisto v0.43.0を使用して、GENCODE v24/GRCh38転写物での、対のサンプルFASTQファイルから導出した。DMARD応答者とDMARD非応答者との間における生データの標準化及び示差的遺伝子発現分析は、Bioconductor Rパッケージ「edgeR」(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)の擬似尤度法を使用して行った。結果は、各遺伝子の100万当たりのlogカウントとして表される。RNA-Seqデータは、ArrayExpressにアップロードされており、受入番号E-MTAB-6141を経由して入手可能である。
フローサイトメトリー
前足を採取し、白血球を以前に記載されているように(Norling, L.V.ら「Proresolving and cartilage-protective actions of resolvin D1 in inflammatory arthritis.」JCI Insight 1、e85922(2016)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)単離した。簡潔には、前足を、0.5μg/mlコラゲナーゼD及び40μg/ml DNaseIを含有するRPMI-1640において37℃にて30min激しくかき混ぜながらインキュベーションした。単離した細胞に70μM漉し器を通過させ、2U/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン、及び10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI-1640において懸濁し、次いで400gで10min遠心分離にかけた。単離した細胞を、0.02%ウシ血清アルブミン及び1%Fc-ブロッキングIgG(v/v)を含有するDPBS-/-中で懸濁し、0.1%生株/死滅株と氷上で20minインキュベーションした。細胞は、DPBS-/-を使用して洗浄し、以下の抗体:PE CD64(FcγRI、クローンX54-5/7.1、宿主マウス、Biolegend)、Alexa Fluor 700 Ly-6G(クローン1A、宿主ラット、Biolegend)、Brilliant Violet 785 Ly-6C(クローンHK1.4、宿主ラット、Biolegend)、APC/Cyanine 7 CD45(クローン30-F11、宿主ラット、Biolegend)、Alexa Fluor 488 CD11b(クローンM1/70、宿主ラット、Biolegend)、APC Siglec F(クローンES22-10D8、宿主ラット、Miltenyi Biotec)、Brilliant Violet 711 CD115(CSF-1R)(クローンAFS98、宿主ラット、Biolegend)及びBrilliant Violet 510 CD43(クローン1G10、宿主マウス、BD Biosciences)と氷上で45minインキュベーションした。これらを次いで洗浄し、1%パラホルムアルデヒドを使用して固定した。CountBright Absolute Counting Beadsを、白血球を数え上げるのに使用した。染色は、LSRFortessa細胞分析器を使用して査定し、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
組織学的検査
前足を10%ホルムアルデヒド(v/v、0.65%Na2HPO4及び0.4%NaH2PO4を含有する水中)に48h入れた。これらを次いでDPBS中の10%EDTAに2wk入れた。脱灰されている場合、前足を以前に記載されているようにワックスに包埋した(Walker, M. E.、Souza, P. R.、Colas, R. A. & Dalli, J.「13-Series resolvins mediate the leukocyte-platelet actions of atorvastatin and pravastatin in inflammatory arthritis.」FASEB J 31、3636～3648(2017)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。4ミクロンの切片を得、ヘマトキシリン及びエオシン染色を、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Walker, M. E.、Souza, P. R.、Colas, R. A. & Dalli, J.「13-Series resolvins mediate the leukocyte-platelet actions of atorvastatin and pravastatin in inflammatory arthritis.」FASEB J 31、3636～3648(2017)に記載されているように、Barts Cancer Institute Pathology Coreにより実行した。
統計的分析
我々は、すべての統計的分析及びデータ導出は、R(R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing.(2016)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)、MetaboAnalyst 4.0(Chong, J.、Yamamoto, M. & Xia, J. MetaboAnalystR 2.0:「From Raw Spectra to Biological Insights.」Metabolites 9(2019)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)、Prism 8及びMicrosoft Excelを使用して行った。図で提示されている結果は、平均として表され、表で呈示されているものは、平均±semとして呈示される。群の間における差は、1サンプルT検定(標準化されたデータ)又はMann Whitney検定(2群)又は一元配置ANOVA(2群超)を使用して判定した。各実験での試料の大きさは、以前の実験で観察されたばらつきで判定した。部分的最小二乗判別分析(PLS-DA)及び直交部分的最小二乗判別分析(OPLS-DA)は、MetaboAnalyst 4.0 Chong, J.、Yamamoto, M. & Xia, J. MetaboAnalystR 2.0:「From Raw Spectra to Biological Insights.」Metabolites 9(2019)、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)又はSIMCA 14.1ソフトウェア(Umetrics、Umea、スウェーデン)を、脂質メディエーター濃度の中央平均化及び単位分散スケーリング後に使用して行った。PLS-DAは、変数に基づいて観察(例えば処置応答)のクラス分離に寄与する可変物(脂質メディエーター濃度)を特定する線形多変量モデルに基づく。分類中、観察をそれぞれのクラスモデルに投影した。スコアプロットは、観察の間の系統的クラスター(より近いプロットは、データマトリックスにおいてより高い類似性を提示する)を例証する。
参考文献
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Claims (31)

  1. 炎症状態を有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)を用いる処置に応答するかどうかを予測する方法であって、DMARDナイーブ患者試料中の少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップ、及び患者を予測されるDMARD応答者又は予測されるDMARD非応答者として分類するステップを含む、方法。
  2. 患者のための処置を選択するステップであって、
    (a)患者が予測されるDMARD応答者である場合には、非生物学的DMARDが選択され、
    (b)患者が予測されるDMARD非応答者である場合には、生物学的DMARDが選択される、
    ステップを更に含み、場合により、患者に選択された処置を投与するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
  3. 少なくとも2つのSPMのレベルを測定するステップ、及び患者がDMARD応答者であるか又はDMARD非応答者であるかを決定するステップを含む、請求項1又は2に記載の方法であって、少なくとも2つのSPMのレベルを訓練された機械学習アルゴリズムに入力するステップを含み、訓練された機械学習アルゴリズムが、
    i.試料からの少なくとも2つのSPMのレベルをデータベース中の同じ少なくとも2つのSPMのレベルと比較し、
    ii.患者がDMARD応答者であるか又はDMARD非応答者であるかを出力する
    ように構成され、場合により、訓練された機械学習モデルがサポートベクターマシン(SVM)モデル及び/又はランダムフォレストモデルである、方法。
  4. 訓練された機械学習アルゴリズムが、訓練データに基づいて訓練され、訓練データが、
    複数の患者についての脂質メディエータープロファイルを含み、場合により脂質メディエーターの濃度を含む第1のデータ、及び
    複数の患者の各々がDMARD応答者であるか又はDMARD非応答者であるかを特定する第2のデータ
    を含む、請求項3に記載の方法。
  5. 患者における炎症状態の処置における使用のための疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)の有効性を評価する方法であって、DMARDの投与前後に患者から得られた試料中の少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップを含み、DMARDの投与後の少なくとも1つのSPMのレベルの増大が、DMARDの有効性を示す、方法。
  6. 患者のための処置を選択するステップであって、
    (a)DMARDが有効である場合には、同じDMARDが選択され、
    (b)DMARDが無効である場合には、異なるDMARD、場合により生物学的DMARDが選択される、
    ステップを更に含み、場合により、患者に選択された処置を投与するステップを更に含む、請求項5に記載の方法。
  7. 少なくとも2つのSPMのレベルを測定するステップ、及びDMARDが有効であるかどうかを決定するステップを含む、請求項5又は6に記載の方法であって、少なくとも2つのSPMのレベルを訓練された機械学習アルゴリズムに入力するステップを含み、訓練された機械学習アルゴリズムが、
    iv.DMARDの投与前に患者から得られた試料からの少なくとも2つのSPMのレベルを、DMARDの投与後に患者から得られた試料中の同じ少なくとも2つのSPMのレベルと比較し、
    v.DMARDが有効か又は無効かを出力する
    ように構成され、場合により、訓練された機械学習モデルがサポートベクターマシン(SVM)モデル及び/又はランダムフォレストモデルである、方法。
  8. 訓練された機械学習アルゴリズムが、訓練データに基づいて訓練され、訓練データが、
    DMARDの投与前後の複数の患者についての脂質メディエータープロファイルを含み、場合により脂質メディエーターの濃度を含む第1のデータ、及び
    複数の患者の各々についてDMARDが有効であったか又は無効であったかを特定する第2のデータ
    を含む、請求項7に記載の方法。
  9. 関節リウマチを有するか、それを有すると疑われるか、又はそれを発症するリスクのある患者が、どの関節リウマチ病型を発症するかを予測する方法であって、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)ナイーブ患者試料中の少なくとも1つの特異的炎症収束性メディエーター(SPM)のレベルを測定するステップ、並びに患者が発症する関節リウマチ病型を、リンパ骨髄性、びまん性骨髄性及び微量免疫線維性として分類するステップを含む、方法。
  10. 少なくとも1つのSPMの上方制御が、患者が微量免疫線維性病型を発症することを特定し、場合により、SPMが15R-LXA4及び/又はMCTR2である、請求項9に記載の方法。
  11. 少なくとも2つのSPMのレベルを測定するステップ、及び患者がどの関節リウマチ病型を発症するかを予測するステップを含む、請求項9又は10に記載の方法であって、少なくとも2つのSPMのレベルを訓練された機械学習アルゴリズムに入力するステップを含み、訓練された機械学習アルゴリズムが、
    ii.試料からの少なくとも2つのSPMのレベルをデータベース中の同じ少なくとも2つのSPMのレベルと比較し、
    vi.患者がリンパ骨髄性、びまん性骨髄性又は微量免疫線維性病型を発症するかどうかを出力する
    ように構成され、場合により、訓練された機械学習モデルがサポートベクターマシン(SVM)モデル及び/又はランダムフォレストモデルである、方法。
  12. 訓練された機械学習アルゴリズムが、訓練データに基づいて訓練され、訓練データが、
    複数の患者についての脂質メディエータープロファイルを含み、場合により脂質メディエーターの濃度を含む第1のデータ、及び
    複数の患者の各々が、リンパ骨髄性、びまん性骨髄性又は微量免疫線維性病型を発症したかどうかを特定する第2のデータ
    を含む、請求項11に記載の方法。
  13. PGD2、TxA2及び/又はTxB2のうちの1つ以上のレベルを測定するステップ、PGD2、TxA2及び/又はTxB2のうちの1つ以上のレベルの増大を検出するステップを含み、PGD2、TxA2及び/又はTxB2のうちの1つ以上のレベルの増大が、患者が微量免疫線維性病型を発症することを特定する、請求項9から12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 炎症状態が関節リウマチである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  15. 請求項9から13のいずれか一項に記載の方法により、患者がどの関節リウマチ病型を発症するかを予測するステップを更に含む、請求項14に記載の方法。
  16. 少なくとも1つのSPMのレベルが増大する場合、患者が予測されるDMARD非応答者として分類される、請求項1から4及び14、15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 少なくとも1つの炎症誘発性エイコサノイドのレベルを測定するステップを更に含み、少なくとも1つの炎症誘発性エイコサノイドのレベルの増大が、患者がDMARD非応答者であることを予測し、炎症誘発性エイコサノイドが場合によりPGD2及び/又はPGE2である、請求項1から4及び14から16のいずれか一項に記載の方法。
  18. DMARDが、場合によりメトトレキサート、アスピリン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン、金塩、アザチオプリン及びシクロスポリンからなる群から選択され、好ましくはメトトレキサート、アスピリン、ヒドロキシクロロキン及びレフルノミドからなる群から選択される非生物学的DMARDである、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 少なくとも1つのSPMが、DHA代謝産物、n-3 DPA代謝産物、AA代謝産物及び/又はEPA代謝産物である、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 少なくとも1つのSPMが、RvT3;RvT4;RvE2;RvD1;MaR1n-3 DPA;RvT4;14-オキソ-MaR1;17R-RvD3;15R-LXB4;RvD3;RvD4;TxB2;LTB4;20-COOH-LTB4;LTE4;10S, 17S,ジHDHA (PDX);17R-PD1;15R-LXA4;PGE2;PGD2;10S, 17S-ジHDPA;5S, 12S-ジHETE;4S, 14S-ジHDHA;及び/又は5S, 15S-ジHETEである、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
  21. 少なくとも1つのSPMが、RvD4、MaR1n-3 DPA、10S, 17S-ジHDPA及び/又は15R-LXA4である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 少なくとも1つのSPMが、
    (a)進行している炎症中の宿主応答の調整に関与し、場合によりPCTR2、RvD2及び/若しくはRvD3であり、並びに/又は
    (b)疼痛調節と関連するメディエーターであり、場合によりRvE1及び/若しくはRvE2である、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
  23. ALOX5活性の1つ以上のマーカー、ALOX12活性の1つ以上のマーカー、及び/又はALOX15活性の1つ以上のマーカーを測定するステップを更に含み、場合により、
    (a)ALOX5活性の1つ以上のマーカーが、5-HETE、5HEPE、7-HDPA及び/若しくは7-HDHAからなる群から選択され、
    (b)ALOX12活性の1つ以上のマーカーが、14-HDPA及び/若しくは14-HDHAからなる群から選択され、並びに/又は
    (c)ALOX15活性の1つ以上のマーカーが、17-HDPA、17-HDHA、15-HEPE及び/若しくは15-HETEからなる群から選択される、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 少なくとも2つのSPMのレベルを測定するステップを含み、多変量分析を使用して少なくとも2つのSPMのレベルの増大を検出し、場合により多変量分析が直交部分的最小二乗判別分析(oPLS-DA)である、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 少なくとも2つのSPMのレベルを測定するステップを含み、訓練された機械学習モデルを使用して少なくとも2つのSPMのレベルの増大を検出し、場合により訓練された機械学習モデルがSVMモデル及び/又はランダムフォレストモデルである、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 試料が血漿試料又は全血試料である、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 少なくとも1つのSPMのレベルが、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用して測定され、場合により、1つ以上の標識された内部標準物質が試料に添加され、定量化が、前記1つ以上の標識された標準物質を使用して作成された線形回帰曲線を使用して実行される、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
  28. 少なくとも1つのSPMのレベルが、イムノアッセイを使用して測定され、場合により、イムノアッセイが酵素イムノアッセイ(EIA)である、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
  29. 少なくとも1つのSPMが、少なくとも4つのSPMであり、少なくとも4つのSPMが、RvD4、10S,17S-ジHDPA、15R-LXA4及びMaR1n-3 DPAを含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
  30. 少なくとも1つのSPMが、RvD4、5S, 12S-ジHETE、4S, 14S-ジHDHA、MaR1n-3 DPA、10S, 17S-ジHDPA及び/又は15R-LXA4である、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
  31. 少なくとも1つのSPMが、少なくとも6つのSPMであり、少なくとも6つのSPMが、RvD4、5S, 12S-ジHETE、4S, 14S-ジHDHA、MaR1n-3 DPA、10S, 17S-ジHDPA及び15R-LXA4を含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
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