JP2022548145A

JP2022548145A - 免疫療法の化合物および方法

Info

Publication number: JP2022548145A
Application number: JP2022517139A
Authority: JP
Inventors: エー．バレラダニエル; エス．ミラージェフリー; フェリシスマーティン; シュローダーマーティン
Original assignee: リージェンツオブザユニバーシティオブミネソタ; ジーティーバイオファーマ，インコーポレイティド
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2020-09-15
Publication date: 2022-11-16
Also published as: EP4031565A1; CA3154158A1; IL291343A; EP4031565A4; BR112022004712A2; KR20220087441A; WO2021055342A1; CN115023435A; AU2020350524A1; US20220324972A1

Abstract

免疫療法化合物は、ＮＫ細胞結合ドメイン、ＮＫ活性化ドメイン、および標的ドメインを含む。標的ドメインは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマー複合体に選択的に結合し、ＮＫ活性化ドメインおよびＮＫ細胞結合ドメインに作動可能に連結されている。化合物を対象に投与して、ＮＫ媒介性のがん細胞の死滅を誘導し、対象のＮＫ細胞の増殖を刺激し、および／またはがんを治療することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９０１，１９８号の利益を主張する。

政府の資金
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＣＡ１９７２９２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

配列表
本出願は、２０２０年９月１５日に作成された７０キロバイトのサイズの「Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ－０１１０－０００６３２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というタイトルのＡＳＣＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に電子的に提出された配列表を含む。配列表に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、一態様では、ＮＫ細胞結合ドメイン、ＮＫ活性化ドメイン、および標的ドメイン（ｔａｒｇｅｔｉｎｇｄｏｍａｉｎ）を含む多重特異性免疫療法化合物を記載している。標的ドメインは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマー複合体に選択的に結合し、ＮＫ活性化ドメインおよびＮＫ細胞結合ドメインに作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、ＮＫ細胞結合ドメインは、ＣＤ１６に特異的に結合する。これらの実施形態では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａまたはＣＤ１６ｂであってもよい。これらの実施形態の一部では、ＮＫ細胞結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、ＮＫ細胞結合ドメインの部分は、抗体またはその結合断片を含んでもよい。これらの実施形態の一部では、抗体またはその結合断片は、ヒト、ヒト化、またはラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）であってもよい。

一部の実施形態では、ＮＫ活性化ドメインは、ＩＬ－１５成分を含む。これらの実施形態の一部では、ＩＬ－１５成分は、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む。これらの実施形態の一部では、ＩＬ－１５の機能的バリアントは、配列番号４と比較して、Ｎ７２ＤまたはＮ７２Ａアミノ酸置換を含む。

一部の実施形態では、標的ドメインは、抗体またはその結合断片を含む。これらの実施形態の一部では、抗体結合断片は、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、または単一ドメイン抗体断片を含んでもよい。これらの実施形態の一部では、標的ドメインは、配列番号６、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、または配列番号２７のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、免疫治療化合物は、第二の標的ドメインを含んでもよい。

一部の実施形態では、免疫治療化合物は、第二のＮＫ活性化ドメインを含んでもよい。

別の態様では、本開示は、上記に要約された治療用化合物の任意の実施形態および薬学的に許容される担体を含む組成物を記載している。

一部の実施形態では、組成物は、追加の治療薬をさらに含んでもよい。これらの実施形態の一部では、追加の治療薬は、化学療法薬を含んでもよい。一部の実施形態では、追加の治療薬は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体複合体を標的とする治療薬を含んでもよい。

別の態様では、本開示は、がん細胞のＮＫ媒介性の死滅を誘導するのに有効な量で上記に要約された化合物または組成物の任意の実施形態を対象に投与する工程を含む方法を記載している。

別の態様では、本開示は、ｉｎｖｉｖｏでＮＫ細胞の増殖を刺激するための方法を記載している。一般に、方法は、対象におけるＮＫ細胞の増殖を刺激するのに有効な、上記に要約された化合物または組成物の任意の実施形態の量を対象に投与する工程を含む。

別の態様では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法を記載している。一般に、方法は、がんを治療するのに有効な上記に要約された化合物または組成物の任意の実施形態の量を対象に投与することを含む。

一部の実施形態では、化合物または組成物は、化学療法、腫瘍の外科的切除、または放射線療法の前、同時、または後に投与される。これらの実施形態の一部では、化学療法は、アルトレタミン、アムサクリン、Ｌ－アスパラギナーゼ、コラスパーゼ（ｃｏｌａｓｐａｓｅ）、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、サイトホスファン（ｃｙｔｏｐｈｏｓｐｈａｎｅ）、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、ホテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍａｉｄｅ）、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、ラルチトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、またはビノレルビンを含んでもよい。

上記の要約は、開示された各実施形態または本発明のすべての実施を記載することを意図するものではない。以下の記載は、より具体的に例示的な実施形態を例示している。本願全体のいくつかの箇所で、様々な組み合わせで使用できる例のリストを通じてガイダンスが提供されている。いずれの場合も、列挙されたリストは代表的な群としてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきではない。

特許または出願ファイルは、カラーで作成された図面を少なくとも１つ含む。このカラー図面を伴う特許または特許出願の公報のコピーは、リクエストおよび必要な料金の支払いに応じて、特許庁から提供される。

ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２の設計、作製、および精製。（Ａ）ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２の構成要素をコードするコード領域の配置を備えた例示的な発現ベクターの概略図（左から右へ）：ラクダ科の抗ＣＤ１６ＶＨＨ、ヒトＩＬ－１５、抗ＨＥＲ２ｓｃＦＶ。（Ｂ）制限酵素部位およびｐＥＴ２８ｃベクター上の標的遺伝子位置を含む、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２をコードする例示的な発現ベクターの遺伝子地図。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２の作製、および精製。（Ａ）２つの直交するカラムステップ（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｃｏｌｕｍｎｓｔｅｐ）後の最終産物の純度およびサイズを示す、クーマシーブルー色素で染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。ＭＷＳ：分子量標準；ＮＲ：非還元；Ｒ：還元。最終的な純度を導き出すために濃度測定を行った。（Ｂ）イオン交換（ＦＦＱ）カラムでのｃａｍ１６１５ＨＥＲ２の第一段階精製から得られたクロマトグラフィートレース。収集ピークは、両側の矢印で示される。（Ｃ）サイズ排除カラムでのｃａｍ１６１５ＨＥＲ２の第二段階精製から得られたクロマトグラフィートレース。収集ピークは、両側の矢印で示される。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２のＮＫ細胞増殖への影響、および増殖を起こし、フローサイトメトリーで測定されたＣ５６⁺ＣＤ３^-ＮＫ細胞の割合に対するＴｒｉＫＥ処理の影響を示す絶対数。６人の異なる正常なドナー由来のＰＢＭＣを別々にアッセイした。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２に加えて、ＩＬ－１５を対照として使用した。（Ａ）ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２処理は、対照と比較した場合、高度に増殖しているＮＫ細胞の割合が有意に異なっていたことを示す。（Ｂ）ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２処理は、対照と比較した場合、総ＮＫ細胞の割合が有意に異なっていたことを示す。（Ｃ）ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２処理は、ＮＴ対照と比較した場合、生のＮＫカウントの数が有意に異なっていたことを示す。（Ｄ）ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２処理は、高度に増殖しているＣＤ３⁺ＣＤ５６^-Ｔ細胞の割合を増加させなかった。（Ｅ）ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２処理は、総ＣＤ３⁺ＣＤ５６^-Ｔ細胞の割合を増加させなかった。（Ｆ）ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２処理は、生のＣＤ３⁺ＣＤ５６^-Ｔ細胞の数を増加させなかった。標的細胞株に結合するｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥ。（Ａ）ＳＫＯＶ－３細胞株に結合する、ＦＩＴＣで直接標識されたｃａｍ１６１５ＨＥＲ２。（Ｂ））ＳＫ－ＢＲ－３細胞株に結合する、ＦＩＴＣで直接標識されたｃａｍ１６１５ＨＥＲ２。（Ｃ））ＵＭＳＣＣ－１１Ｂ細胞株に結合する、ＦＩＴＣで直接標識されたｃａｍ１６１５ＨＥＲ２。ＢＡＣ３はＣＤ３結合分子であり、結合の陰性対照として機能する。機能活性は、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥの結合活性と相関している。（Ａ）ＣＤ１０７ａの機能活性は、ＩＬ－１５および無治療対照と比較して、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２で治療されたＰＢＭＣおよびＳＫＯＶ３細胞の培養物で上昇した。１０人の異なる正常なドナー由来のＰＢＭＣを別々にアッセイした。（Ｂ）同じＰＢＭＣ／ＳＫＯＶ３培養物でのＩＦＮ－γ活性の増強（Ｃ）ＣＤ１０７ａ機能活性は、ＰＢＭＣおよび乳がん細胞株ＳＫ－ＢＲ－３の培養物で上昇した（７人の異なるドナーをアッセイ）。（Ｄ）同じＰＢＭＣ／ＳＫ－ＢＲ－３培養物で強化されたＩＦＮ－γ活性。（Ｅ）ＵＭＳＣＣ－１１Ｂ頭頸部がん細胞株を同じアッセイで試験した場合（４人の異なるドナーをアッセイ）、ＣＤ１０７ａは上昇しなかった。薬剤（タモキシフェン）耐性ＭＣＦ－７Ｌ－ＴａｍＲ乳がん細胞の死滅を増強するＴｒｉＫＥの能力の試験。（Ａ）がん細胞を含まないＣＤ５６⁺ＣＤ３^- ＮＫ細胞のバックグラウンド細胞毒性活性を、ＣＤ１０７ａフローサイトメトリーを使用して試験した。（Ｂ）親ＭＣＦ－７Ｌ細胞株とインキュベートしたＰＢＭＣを使用したＣＤ１０７ａ活性。（Ｃ）タモキシフェン耐性ＭＣＦ－７Ｌ－ＴａｍＲ細胞とインキュベートしたＰＢＭＣを使用したＣＤ１０７ａ活性。（Ｄ）ＳＫＢＲ－３乳がん細胞とインキュベートしたＰＢＭＣを使用したＣＤ１０７ａ活性。（Ｅ）がん細胞を含まないＣＤ５６⁺ＣＤ３^- ＮＫ細胞のバックグラウンド細胞内ＩＦＮ－γ活性。（Ｆ）親ＭＣＦ－７Ｌ細胞株とインキュベートしたＰＢＭＣを使用した細胞内ＩＦＮ－γ活性。（Ｇ）タモキシフェン耐性ＭＣＦ－７Ｌ－ＴａｍＲ細胞とインキュベートしたＰＢＭＣを使用した細胞内ＩＦＮ－γ活性。（Ｈ）ＳＫＢＲ－３乳がん細胞とインキュベートしたＰＢＭＣを使用した細胞内ＩＦＮ－γ活性。細胞内ＩＦＮ－γ活性はＣＤ１０７ａ活性と相関していた。ＰＢＭＣの存在下でＳＫＯＶ３卵巣がん細胞の死滅をリアルタイムで測定し、ＣＤ１０７ａ細胞毒性データを確認するＩＮＣＵＣＹＴＥ（ＥＳＳＥＮＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ，ＩＮＣ．、ミシガン州アナーバー）データ。（Ａ）スフェロイドのサイズ；（Ｂ）スフェロイドの強度。Ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２は、無治療、抗ｃａｍ１６単独（ＣＡＭ１６）、およびＩＬ－１５単独（ＩＬ１５）対照での活性が低い場合と比較して、１２０時間にわたって測定された標的細胞における急激な低下を引き起こす。Ｎ＝７ドナー／群。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２が、７２時間にわたって測定された標的細胞における急激な時間依存性の低下を引き起こすという視覚的エビデンス（右の列）は、無治療（左の列）、抗ｃａｍ１６単独、およびＩＬ－１５単独対照での活性の低下と比較される。Ｎ＝７ドナー／群。エフェクター細胞の供給源としての卵巣がん患者由来の腹水の試験。（Ａ）患者の腹水由来の細胞をＭＡ－１４８卵巣がん細胞なしでインキュベートした場合のＣＤ１０７ａバックグラウンド活性。（Ｂ）腹水細胞（ａｓｃｉｔｅｓｃｅｌｌｓ）をＭＡ－１４８細胞、卵巣がん細胞とインキュベートした場合のＣＤ１０７ａ活性。（Ｃ）正常なドナー由来の細胞をＭＡ－１４８卵巣がん細胞なしでインキュベートした場合のＣＤ１０７ａバックグラウンド活性。（Ｄ）正常なドナー細胞をＭＡ－１４８細胞、卵巣がん細胞とインキュベートした場合のＣＤ１０７ａ活性。（Ｅ）患者の腹水由来の細胞をＭＡ－１４８卵巣がん細胞なしでインキュベートした場合のＩＦＮ－γバックグラウンド活性。（Ｆ）腹水細胞をＭＡ－１４８細胞、卵巣がん細胞とインキュベートした場合のＩＦＮ－γ活性。（Ｇ）正常なドナー由来の細胞をＭＡ－１４８卵巣がん細胞なしでインキュベートした場合のＩＦＮ－γバックグラウンド活性。（Ｈ）正常なドナー細胞をＭＡ－１４８細胞、卵巣がん細胞とインキュベートした場合のＩＦＮ－γ活性。対照はＩＬ－１５、および無治療であった。いずれの場合も、９～１３人の異なるドナーが独立して分析され、データが平均化された。異種移植モデルにおけるｃａｍ１６１５ＨＥＲ２のｉｎｖｉｖｏでの有効性。リアルタイムの生物発光イメージングの目的で、細胞にホタルルシフェラーゼを安定的にトランスフェクトした。（Ａ）ＳＫＯＶ３およびＮＫ細胞を腹腔内投与した６匹のＮＳＧマウスの群の生物発光イメージング。画像は、各動物の総フラックス（ｔｏｔａｌｆｌｕｘ）を示しており、無治療群の６匹の動物のうち５匹が進行した腫瘍を有していたことを示す。最小限の活性を示した無治療群の１匹の動物は、腫瘍を発症し続けた。（Ｂ）ＳＫＯＶ３およびＮＫ細胞も投与されたが、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥで治療された６匹のマウスの群の３８日目のイメージング。（Ａ）複数回のＴｒｉＫＥ注射にもかかわらず、動物の体重の変化は最小限であり、これは治療が無治療対照と比較して毒性がなかったことを示す。（Ｂ）腫瘍接種後４６日目の同じ実験からのデータの散布図。データは総フラックス放射輝度［ＴｏｔａｌｆｌｕｘＲａｄｉａｎｃｅ］（ｐ／ｓ）として表す。治療したマウスを、無治療のマウスと比較する。スチューデントのＴ検定（ｐ＝０．０２１６）によって決定されるように、差は有意である。（Ｃ）治療群が再発し始めたことを示す時間（日）の折れ線グラフ。（ｄ）延長された時間間隔にわたるデータの生存プロット。治療群と未治療群の違いは有意である。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥが他のＨＥＲ２発現卵巣がん細胞株の死滅を増強する能力の試験。（Ａ）ＰＢＭＣＮＫ細胞をＯＶＣＡＲ３卵巣がん細胞とインキュベートした場合のＣＤ１０７ａ活性。（Ｂ）ＰＢＭＣＮＫ細胞をＯＶＣＡＲ５卵巣がん細胞とインキュベートした場合のＣＤ１０７ａ活性。（Ｃ）ＰＢＭＣＮＫ細胞をＳＫＯＶ３卵巣がん細胞とインキュベートした場合のＣＤ１０７ａ活性。（Ｄ）ＰＢＭＣＮＫ細胞をＯＶＣＡＲ３卵巣がん細胞とインキュベートした場合のＩＦＮ－γ活性。（Ｅ）ＰＢＭＣＮＫ細胞をＯＶＣＡＲ５卵巣がん細胞とインキュベートした場合のＩＦＮ－γ活性。（Ｆ）ＰＢＭＣＮＫ細胞をＳＫＯＶ３卵巣がん細胞とインキュベートした場合のＩＦＮ－γ活性。ＳＫＯＶ３データは、以下の陰性対照を使用して実行した：無治療（ＮＴ）、抗ｃａｍ１６単独（ＣＡＭ１６）、ＩＬ－１５（ＩＬ１５）、および抗ＨＥＲ２抗体単独（ｅ２３）。

本開示は、一般に、膜貫通受容体チロシンキナーゼの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーであるヒト上皮成長因子受容体－２（ＨＥＲ２）および／またはヒト上皮成長因子受容体－３（ＨＥＲ３）を発現する腫瘍細胞を標的とする治療化合物を記載する。ＨＥＲ２は、その過剰発現が乳がんの予後不良と関連しており、細胞増殖、分化、および生存に関連する細胞内シグナル伝達経路を誘発するため、がんと直接関連している。Ｈｅｒ２とＨＥＲ３とはヘテロダイマー複合体を形成する可能性がある。

多くの実施形態では、免疫療法化合物は、三重特異性キラーエンゲージ化合物（ＴｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃＫｉｌｌｅｒＥｎｇａｇｅｒｃｏｍｐｏｕｎｄ；ＴｒｉＫＥ）であってもよい。ＴｒｉＫＥは、３つの別個の結合領域を有する：ＮＫ細胞に結合するＮＫ細胞結合ドメイン（ＣＤ１６等）、そのサイトカインの受容体に結合するサイトカインまたはその機能的断片を含むＮＫ活性化ドメイン、および標的細胞（がん細胞等）に存在するマーカーに結合する標的ドメイン。ＴｒｉＫＥの設計および作製は、たとえば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１８／０２８２３８６Ａ１号に広く記載されている。ＴｒｉＫＥは、抗体依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）促進部分（ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇｍｏｉｅｔｙ）と拡張関連部分［ｅｘｐａｎｓｉｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄｍｏｉｅｔｙ］（ＩＬ－１５）を同じ分子上で組み合わせるという利点を提供する。

免疫療法化合物の一つまたは複数の結合領域またはドメインは、抗体を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、一般に、免疫グロブリンまたはその断片を指し、したがって、モノクローナル抗体、その断片を包含する。例示的な抗体断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）、または他の改変形態（ヒト化等）、および／またはモノクローナル抗体および／またはその断片の組み合わせを含むが、これらに限定されない。たとえば、ラクダ科動物は軽鎖を欠く機能的な抗体を産生する。これらの単一ドメイン抗体断片（ＶＨＨまたはＮＡＮＯＢＯＤＩＥＳ（ＡｂｌｙｎｘＮ．Ｖ．，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ））は、生物工学用途でいくつかの利点を有する。それらは微生物でよく発現され、高い安定性および溶解性を有する。本明細書に記載のＴｒｉＫＥ化合物の特定の実施形態では、ＮＫ細胞結合ドメインは、ラクダ科の単一ドメイン抗体断片である。

免疫療法化合物が、配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２標的ｓｃＦｖを含む標的ドメインを有する例示的な実施形態の関連で本明細書に記載されているが、本明細書に記載の免疫療法化合物は、任意の他の適切なＨＥＲ２標的部分および／またはＨＥＲ３標的部分を含んでもよい。したがって、様々な実施形態では、標的ドメインは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、および／またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマーを認識することができる。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマーは、多くの乳がんおよび多くのＨＥＲ２⁺腫瘍で検出される。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ダイマーは、増殖、遠隔転移、および／または患者の転帰不良に関連している。

例示的な代替標的部分は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、および／またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマーに特異的に結合する抗体および抗体断片を含む。例示的な抗体断片は、ｅ２３またはその機能的断片（たとえば、配列番号１５）、トラスツズマブまたはその機能的断片（たとえば、配列番号１６および欧州特許番号第ＥＰ３４５７１３９Ａ１号）、配列番号１７、配列番号１８、ルムレツズマブ（ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）またはその機能的断片（ＲＧ７１１６；Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５；たとえば、配列番号１９、配列番号２０）、セリバンツマブ（ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）またはその機能的断片（ＭＭ－１２１；Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５；たとえば、配列番号２１、または配列番号２２）、ＫＴＮ３３７９／ＣＤＸ－３３７９またはその機能的断片（Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５；たとえば、配列番号２３）、パトリツマブまたはその機能的断片（Ｕ３－１２８７；Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５；たとえば、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、または配列番号２７）エルゲムツマブ（ｅｌｇｅｍｔｕｍａｂ）（ＬＪＭ７１６，Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５）またはその機能的断片、Ｕ３－１４０２（Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５）またはその機能的断片、ＡＶ－２０３（Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５）またはその機能的断片、ＧＳＫ２８４９３３０（Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５）またはその機能的断片、ＭＭ－１１１（Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５）またはその機能的断片、ＭＣＬＡ－１２８（Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５）またはその機能的断片、イスチラツマブ（ｉｓｔｉｒａｔｕｍａｂ）（ＭＭ－１４１；Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５）またはその機能的断片、デュリゴツズマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）（ＭＥＨＤ７９４５Ａ；Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５）またはその機能的断片、またはペルツズマブ、またはそれらの機能的バリアントを含むが、これらに限定されない。

ＮＫ細胞結合ドメインがＣＤ１６に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む例示的な実施形態の関連で本明細書に記載されているが、免疫療法化合物は、任意の他の適切なＮＫ結合部分を含んでもよい。例示的な代替のＮＫ結合部分は、ＮＫ細胞の表面に少なくとも部分的に位置する受容体に選択的に結合することができる任意のアミノ酸配列を含むが、これらに限定されない。したがって、ＮＫ細胞結合ドメインは、ＮＫ細胞を結合する機能を果たし、それにより、標的ドメインが選択的に結合する標的とＮＫを空間的に近接させることができる。特定の実施形態では、ＮＫ細胞結合ドメインは、ＮＫ細胞を活性化する受容体に選択的に結合することができ、したがって、活性化機能も有する。たとえば、ＣＤ１６受容体の活性化は、抗体依存性細胞毒性を誘発する可能性がある。したがって、例示的なｃａｍ１６１５ＨＥＲ２化合物のＮＫ細胞結合ドメインは、ＮＫ活性化活性を有する。他の実施形態では、ＮＫ細胞結合ドメインは、ＮＫ細胞を阻害するメカニズムを妨害し得る。そのような実施形態では、ＮＫ細胞結合ドメインは、たとえば、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、抗ＮＫＧ２Ａ、抗ＴＩＧＩＴ、抗キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、および／または任意の他の阻害ブロッキングドメインを含み得る。

ＮＫ細胞結合ドメインは、たとえば、細胞細胞毒性受容体２Ｂ４、低親和性Ｆｃ受容体ＣＤ１６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＲ－１、および／またはＤＮＡＭ－１等の任意のＮＫ細胞受容体に選択的に結合する抗体またはリガンドを含み得る。

ＮＫ細胞結合ドメインを、所望の程度のＮＫ選択性、したがって、所望の免疫結合特性を有するように設計することができる。たとえば、ＣＤ１６はＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）として同定されている。これらの受容体はＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合し、抗体依存性細胞毒性に対してＮＫ細胞を活性化する。抗ＣＤ１６抗体はＮＫ細胞に選択的に結合するが、好中球にも結合することができる。抗ＣＤ１６ａ抗体はＮＫ細胞に選択的に結合するが、好中球には結合しない。抗ＣＤ１６ａ抗体を有するＮＫ細胞結合ドメインを含む免疫療法化合物は、ＮＫ細胞に結合することができるが、好中球には結合しない。したがって、ＮＫ細胞を結合させたいが好中球を結合させたくない状況では、抗ＣＤ１６ａ抗体を含むように免疫療法化合物のＮＫ細胞結合ドメインを設計することができる。

ＮＫ活性化ドメインがヒトＩＬ－１５の断片を含む例示的な実施形態の関連で本明細書に記載されているが、ＮＫ活性化ドメインは、ＮＫ細胞を活性化する、ＮＫ細胞の持続を促進する、またはさもなければＮＫ細胞活性を促進する任意のアミノ酸配列を含むことができる。ＮＫ活性化ドメインは、ＮＫ細胞を活性化および／または維持することができる一つまたは複数のサイトカインであるか、またはそれに由来していてもよい。本明細書で使用される場合、「由来する」という用語は、参照されるサイトカインの機能的バリアントである、すなわち、言及されるサイトカインに対して十分な配列類似性または配列同一性を有し、ＮＫ細胞の活性化および／または持続活性を提供する、サイトカイン（たとえば、ＩＬ－１５）のアミノ酸断片を指す。ＮＫ活性化ドメインが基づくことができる例示的なサイトカインは、たとえば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－１２、およびＩＬ－２１を含む。したがって、例示的なｃａｍ１６１５ＨＥＲ２化合物は、ＩＬ－１５に由来するＮＫ活性化ドメインを含むが、ＨＥＲ２標的化合物は、任意の適切なサイトカインであるか、またはそれに由来するＮＫ活性化ドメインを有するように設計することができる。

この明細書の記載の簡潔さのために、それが基づくサイトカインを同定することによるＮＫ活性化ドメインへの言及は、サイトカインまたはサイトカインの機能的バリアントのいずれかの完全なアミノ酸配列を指すことができる。サイトカインの機能的バリアントは、サイトカインの任意の適切なアミノ酸断片および／または一つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換を含むサイトカインの改変バージョンを含んでもよい。したがって、「ＩＬ－１５」ＮＫ活性化ドメインへの言及は、ＩＬ－１５の完全なアミノ酸配列を含むＮＫ活性化ドメイン、ＩＬ－１５の断片を含むＮＫ活性化ドメイン、またはたとえばＩＬ－１５Ｎ７２ＤまたはＩＬ－１５Ｎ７２ＡのようなＮＫ活性化ドメインを含む。これらは、野生型ＩＬ－１５アミノ酸配列と比較したアミノ酸置換を含む。

免疫療法化合物が三重特異性キラーエンゲージ化合物（すなわち、ＴｒｉＫＥ）である例示的な実施形態の関連で上記に記載されているが、本明細書に記載の組成物および方法は、追加のドメインを含むように改変された免疫療法化合物の使用を含んでもよい。たとえば、免疫療法化合物は、より大きな分子であり、複数の標的ドメイン、複数のＮＫ細胞結合ドメイン、および／または複数のＮＫ活性化ドメインを有するように設計することができる。複数のＮＫ活性化ドメインを含む実施形態では、ＮＫ活性化ドメインは、直列に、または任意の他の組み合わせで提供されてもよい。サイトカインベースのＮＫ活性化ドメインは、免疫療法化合物に含まれる他のＮＫ活性化ドメインの性質とは無関係に、サイトカインの完全なアミノ酸配列を含むか、アミノ酸断片であるか、またはサイトカインの改変バージョンであってもよい。

例示的な追加の標的ドメインは、たとえば、腫瘍細胞、がん間質の標的、ＣＤ３３＋である骨髄由来サプレッサー細胞等の阻害細胞上の標的、またはウイルスに感染した細胞上の標的等の意図された標的に選択的に結合する任意の部分を含むが、これらに限定されない。したがって、標的ドメインは、たとえば、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、アフツズマブ（抗ＣＤ２０）、ペルツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ラベツズマブ（抗ＣＥＡ）、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、シタツズマブボガトックス（抗ＥｐＣＡＭ）、エドレコロマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、アルシツモマブ（抗ＣＥＡ）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ－Ａ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ザルツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（抗ＣＤ３３）、リンツズマブ（抗ＣＤ３３）、エタラシズマブ（抗インテグリンα_vβ₃）、インテツムマブ（抗ＣＤ５１）、イピリムマブ（抗ＣＤ１５２）、オレゴボマブ（抗ＣＡ－１２５）、ボツムマブ（抗腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、またはペムツムマブ（抗ＭＵＣ１）、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ１３３、抗メソテリン、抗ＲＯＲ１、抗ＣＳＰＧ４、抗ＳＳ１、または抗ＨＳＰＧ２、抗ＩＧＦ－１、抗ＲＯＲ－１、抗ｕＰＡＲ、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＬＩＶ－１、抗ＳＧＮ－ＣＤ７０Ａ、抗ＩＬ－３、抗ＩＬ－４Ｒ、抗上皮間葉移行（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥＭＴ）、抗ＴＲＡＩＬ、抗ＰＤ－Ｌ１、欧州特許番号第ＥＰ３４５７１３９Ａ１号の配列番号１～１１９のいずれか一つまたは複数、または前述のいずれかの機能的バリアントを含んでもよい。

「機能的バリアント」アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列と比較して特定の量の配列同一性または配列特異性を有する場合、アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の「機能的バリアント」である。「機能的断片」アミノ酸配列が参照アミノ酸配列の完全長アミノ酸配列より少ない場合、アミノ酸配列は参照アミノ酸配列の「機能的断片」である。「機能的断片」は、参照アミノ酸配列と比較して、特定の量の配列同一性または配列特異性をさらに有してもよい。

２つのアミノ酸配列の配列類似性および／または配列同一性は、それらの配列の長さに沿って同一のアミノ酸の数を最適化するためにアミノ酸配列の残基を整列させることによって決定することができる；同一のアミノ酸の数を最適化するために、いずれかまたは両方の配列のギャップがアラインメントの作成に許可されるが、それでも各配列のアミノ酸は適切な順序のままである必要がある。

アミノ酸配列のペアワイズ比較分析は、ＧＣＧパッケージ（バージョン１０．２、ウィスコンシン州マディソン）のＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズムを使用して実行することができる。あるいは、ポリペプチドは、Ｔａｔｉａｎａｅｔａｌ．（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，１７４，２４７－２５０（１９９９））によって記載され、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイトで入手可能である。マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップペナルティ＝１１、エクステンションギャップペナルティ＝１、ギャップｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、ｅｘｐｅｃｔ＝１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ＝３、およびフィルターオンを含む、すべてのＢＬＡＳＴ２検索パラメーターのデフォルト値を使用することができる。

２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は、パーセント「同一性」によって言及することができ、またはパーセント「類似性」によって言及することができる。「同一性」とは、同一のアミノ酸の存在を指す。「類似性」とは、同一のアミノ酸の存在だけでなく、保存的置換の存在を許容することを指す。アミノ酸配列内のアミノ酸残基の保存的置換は、アミノ酸残基が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。たとえば、無極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む。負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。したがって、保存的置換は、たとえば、正電荷を維持するための、Ａｒｇの場合のＬｙｓへの置換およびその逆；負電荷を維持するための、Ａｓｐの場合のＧｌｕへの置換およびその逆；フリー－ＯＨを維持するための、Ｔｈｒの場合のＳｅｒ；およびフリー－ＮＨ₂を維持するための、Ａｓｎの場合のＧｌｎ、を含む。

したがって、特定のサイズまたは特性（たとえば、電荷、疎水性、または親水性）を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸は、タンパク質の活性を変えることなく、特に生理活性に直接関連していないタンパク質の領域において、別のアミノ酸で置換することができる。生理活性に直接関連しないアミノ酸配列内の領域は、関連するアミノ酸配列を比較するときに変動性（たとえば、付加、欠失、または非保存的置換）が存在する領域を特定するアラインメント分析から推定することができる。本明細書で提供されるアミノ酸配列および／またはデータベースで容易に入手可能なアミノ酸配列を使用して、アラインメント分析を実行することができる。

ＮＫ結合ドメイン、ＮＫ活性化ドメイン、または標的ドメインは、参照アミノ酸配列（たとえば、参照抗体断片、サイトカイン、またはサイトカイン断片）に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

ＮＫ結合ドメイン、ＮＫ活性化ドメイン、または標的ドメインは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

本明細書に記載の免疫療法化合物はまた、たとえば、カラムへの捕捉または抗体の使用による精製を容易にすることができる、たとえば、付加されたＣ末端またはＮ末端アミノ酸の付加等の追加の配列を提供するように設計することができる。そのようなタグは、たとえば、ニッケルカラム上のポリペプチドの精製を可能にするヒスチジンリッチのタグを含む。そのような遺伝子改変技術および適切な追加の配列は、分子生物学の分野でよく知られている。

本開示はまた、本明細書に記載の免疫療法化合物のいずれかをコードするポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチド配列の補体を提供する。本明細書に記載の免疫療法化合物ポリペプチドのいずれか一つのアミノ酸配列（または免疫療法化合物の一つ以上の成分断片）を考えると、当業者は、従来の日常的な方法を使用してそのアミノ酸配列をコードするポリペプチドの全範囲を決定することができる。

図１Ａは、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）およびＮＫ細胞増殖の両方が可能である、本明細書でｃａｍ１６１５ＨＥＲ２（配列番号１）と呼ばれる第２世代ＴｒｉＫＥの例示的な実施形態の例示的な構築を示す。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥは、ＮＫ細胞結合ドメインとして抗ＣＤ１６ＶＨＨを含む。抗ＣＤ１６ＶＨＨは、ラクダ科の抗体の重鎖の可変領域である。図１Ｂは、ｐＥＴ発現ベクターにおけるＴｒｉＫＥコード配列の配置を示すプラスミドマップである。図２Ｂは、封入体からの精製の第一段階としてＦＦＱイオン交換カラムを通過する際の細菌および標的タンパク質の画分の吸光度トレースを示している。溶離液を８ｍｌのアリコートに回収した。図２Ｃは、第二の精製段階であるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）からの吸光度トレースを示している。両側矢印は、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２がカラムを出たときに収集された標的ピークを示している。図２Ａは、均一な生成物のエビデンスを提供するクーマシーブルー染色を伴うＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分析された場合、最終生成物（画分Ｃ２～Ｄ４）をほとんど単一のバンドとして示している。最終生成物は９０％以上の純度で、分子量は約５５ｋＤａであった。

しかしながら、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥは、他の方法で構築することができる。それぞれが完全な免疫療法化合物の一部の合成をコードおよび指示する複数の構築物を設計することが可能である。たとえば、抗ＨＥＲ２軽鎖（たとえば、配列番号１７）は、１つのプラスミドにコードさていてもよく、抗ＨＥＲ２重鎖（例えば、配列番号１８）は、第二のプラスミドにコードされていてもよい。両方のプラスミドが宿主細胞に導入されて発現されると、抗ＨＥＲ２軽鎖と抗ＨＥＲ２重鎖が二量体化して、免疫療法化合物の標的部分として抗ＨＥＲ２Ｆａｂを形成することができる。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥは、この方法で構築することができる。たとえば、配列番号３１は、例示的な第一のプラスミドから発現されるアミノ酸配列、シグナルペプチド、抗ＨＥＲ２軽鎖、リンカー、ＩＬ－１５アミノ酸配列、第二のリンカー、およびラクダ科抗ＣＤ１６単一ドメイン抗体断片を含むアミノ酸配列を提供する。配列番号３２は、例示的な第二のプラスミドから発現されるアミノ酸配列、シグナルペプチドおよび抗ＨＥＲ２重鎖を含むアミノ酸配列を提供する。

別の例として、単一のプラスミド構築物は、完全な免疫療法化合物のすべての成分を含んでいてもよい。たとえば、配列番号３３は、例示的な単一プラスミド構築物から発現されるアミノ酸配列を提供し、ここで、アミノ酸配列は、シグナル配列、抗ＨＥＲ２重鎖断片、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド、第二のシグナル配列、抗ＨＥＲ２軽鎖断片、リンカー、ＩＬ－１５アミノ酸配列、第二のリンカー、およびラクダ科の抗ＣＤ１６単一ドメイン抗体断片を提供する。発現すると、Ｔ２Ａペプチドは自己切断し、抗ＨＥＲ２重鎖断片を免疫療法化合物の残りの部分から分離して、抗ＨＥＲ２軽鎖断片と二量体化できるようにする。

例示的なｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥでは、ヒトＩＬ－１５ＴｒｉＫＥ部分は、分子の拡張能力を備えている。したがって、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２のＩＬ－１５部分がＮＫ拡張をもたらす能力が同定された。図３Ａおよび図３Ｂは、未治療対照（ＮＴ）およびＩＬ－１５対照と比較した、５０ｎＭのｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥとの７日間のインキュベーション後の高度に増殖したＣＤ５６⁺ＣＤ３^- ＮＫ細胞の割合およびＮＫ細胞の合計の割合を示す。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２とのインキュベーション後、両方とも有意に上昇した。同様に、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２への曝露も、ＮＴ対照と比較して総ＮＫ数を有意に増強した（図３Ｃ）。図３Ｄ～Ｆは、ＣＤ３⁺ＣＤ５６^- Ｔ細胞の割合および生の数が、未治療対照と比較して上昇していないことを示している。総合すると、これらの研究は、ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥがＮＫ細胞の増殖を刺激するが、Ｔ細胞は刺激しないことを示している。データはまた、ＴｒｉＫＥ内のＩＬ－１５部分が機能的であり、実行可能なコンフォメーション配列にあることを示している。

細胞毒性はＮＫ免疫療法の特徴である。抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の効力を確立するために、さまざまな細胞株をＣＤ１０７ａの発現について分析した。これは、ＮＫ細胞の細胞毒性の指標として認められている。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥは、ＳＫＯＶ３およびＳＫ－ＢＲ－３に対して試験した。これは、乳がんおよび一部の卵巣がんの症例がＥＲＢＢ２を過剰発現することが知られており、抗体による標的化の所望の標的となるためである。ＵＭＳＣＣ－１１Ｂ細胞株は、ＨＥＲ２の発現が最小限であるため、陰性対照として試験された。最初に、結合は、様々な薬剤をＦＩＴＣで標識し、次にフローサイトメトリーによって標的への直接結合を試験することによって測定された。ＳＫＯＶ３（図４Ａ）およびＳＫ－ＢＲ－３（図４Ｂ）は、最高レベルのＨＥＲ２ＴｒｉＫＥ結合を示した。ＵＭＳＣＣ－１１Ｂは、より低いレベルの結合を示した（図４Ｃ）。

ＡＤＣＣ活性を測定した場合、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥは、ＩＬ－１５および未治療対照と比較して、ＳＫＯＶ３およびＳＫ－ＢＲ－３細胞株に対して高度に上昇したＣＤ１０７ａ活性を示した（図５Ａ、５Ｃ）。ＡＤＣＣをＵＭＳＣＣ－１１Ｂ細胞株で試験した場合、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥはほとんど効果がなかった（図５Ｅ）。また、ＳＫＯＶ－３（図５Ｂ）およびＳＫ－ＢＲ－３（図５Ｄ）ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２は、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥで治療された場合、上昇したＩＦＮ－γ活性化を示した。

ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥは、乳がん細胞株ＭＣＦ－７Ｌに対してさらに試験された。図６Ａは、標的細胞が追加されていないＣＤ１０７ａエフェクター細胞のバックグラウンドを示している。図６Ｂは、標的が追加されたときのＣＤ１０７ａ活性を示している。最高レベルの死滅は、対照と比較してｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥで観察された。Ｃａｍ１６自体には活性があったが、それほど高くはなかった。ＭＣＦ－７Ｌのサブライン（ＭＣＦ－７Ｌ－ＴａｍＲ）はタモキシフェン耐性があり、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥで治療した場合に同様のＣＤ１０７ａ活性パターンを示した（図６Ｃ）。ＮＫ細胞は、活性化されて死滅するときの、ＩＦＮ－γ等の抗がん性サイトカインの分泌でも知られている。図６Ｅは、細胞内染色によって同じ試料で定量化されたＩＦＮ－γレベルが、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥで上昇し、対照において最小限の影響を受けたことを示し、ＮＫ細胞の活性化を示している。同じことがＭＣＦ－７Ｌ－ＴａｍＲにも当てはまった（図６Ｆ）。図６Ｄは、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥによるＳＫ－ＢＲ－３細胞の死滅を確認し、トラスツズマブと同様に死滅させることを示している。図６Ｈは、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥがトラスツズマブよりもさらに優れたＩＦＮ－γ増強活性を有することを示している。総合すると、これらのデータは、ＨＥＲ２がヒト乳がん細胞の免疫エンゲージの有効な標的であり、先天性免疫療法が薬剤耐性乳がん細胞株に対してｉｎｖｉｔｒｏで非常に効果的であることを示している。

図１２は、ＨＥＲ２を発現する２つの追加の細胞株であるＯＶＣＡＲ－３およびＯＶＣＡＲ－５に対するｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥの活性を示すデータを提供する。この場合も、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥは、対照と比較して、ＣＤ１０７ａ活性（図１２Ａ、１２Ｂ）およびＩＦＮ－γ活性（図１２Ｄ、１２Ｅ）の上昇を示している。ＳＫＯＶ３を評価する反復実験は、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ単独（ｅ２３）、ｃａｍ１６ＶＨＨ単独、ＩＬ－１５単独、および治療対照なしを含む、より広範な数の陰性対照を含む。この場合も、薬物は、対照と比較して、ＣＤ１０７ａ活性の上昇（図１２Ｃ）およびＩＦＮ－γ活性の上昇（図１２Ｆ）を示した。

死滅は、ＩＮＣＵＣＹＴＥＺＯＯＭプラットフォーム（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，ミシガン州アナーバー）を使用して２日間にわたってリアルタイムでさらに評価した。スフェロイドとして培養で増殖したＳＫＯＶ３を研究した。ＮＵＣＬＩＧＨＴＲＥＤ（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，ミシガン州アナーバー）で安定して形質導入されたＳＫＯＶ３を、濃縮ＮＫ細胞およびｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥ、遊離ＩＬ－１５、ｃａｍ１６ＶＨＨ単独、または未処理でインキュベートした。細胞死を検出するために、カスパーゼ３／７グリーン試薬を追加した。死にかけている細胞は緑色になり、死にかけているＮＵＣＬＩＧＨＴＲＥＤＲａｊｉ細胞は黄色になり、残っている生細胞を追跡できるようになる。データが収集されたとき、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥは、ＩＬ－１５、ｃａｍ１６ＶＨＨ単独、および７２時間の連続測定で未処理の対照と比較して、ＳＫＯＶ３スフェロイドサイズ（図７Ａ）およびスフェロイド強度（図７Ｂ）の印象的な低下を引き起こした。図８は、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２が、７２時間にわたって測定された標的細胞の急激な時間依存性の低下を引き起こすことを示す画像を提供する。このダイレクトキルアッセイの結果は、ＣＤ１０７ａアッセイの結果と相関していた。

同意したがん患者由来のＮＫ細胞がアッセイで機能するかどうかを決定するために、ＮＫ細胞は通常のボランティアの代わりに６人の同意した卵巣がん患者から得て、ＭＡ－１４８卵巣がん細胞に対して試験した。図９Ａは、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥまたは対照を使用した場合よりも、がん細胞を伴わないエフェクターの治療において、より低いＣＤ１０７ａバックグラウンドを示している。図９Ｂは、未治療対照と比較して、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥでの治療時に、エフェクターおよび腫瘍標的におけるＣＤ１０７ａ発現の有意な上昇を示している。ＩＦＮ－γ活性に関して、図９Ｅは、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥで治療した場合、標的のないエフェクターで低い活性を示している。エフェクター細胞を添加すると、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥは強化されたＩＦＮ－γ活性を示す（図９Ｆ）。比較のために、図９Ｃは、正常なドナーエフェクター細胞のＣＤ１０７ａバックグラウンドを示し、図９Ｄは、ＭＡ１４８がん細胞を伴う正常なドナー細胞のＣＤ１０７ａ活性を示している。図９Ｇは、正常なドナーエフェクター細胞のＩＦＮ－γバックグラウンドを示し、図９Ｈは、ＭＡ１４８がん細胞を伴う正常なドナー細胞のＩＦＮ－γ活性を示している。正常または患者のＮＫ細胞をがん細胞と混合した場合の傾向は類似していたが、正常細胞の活性はやや高かった。それでも、患者のエフェクター細胞はＴｒｉＫＥ刺激が可能である。

図１０は、ＳＣＩＤ／ｈｕ／ＮＫ異種移植モデルを使用したｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥのｉｎｖｉｖｏでの有効性を示すデータを示している。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞の腹腔内接種の約６週間後のマウスの未治療（図１０Ａ）および治療（図１０Ｂ）群の視覚的画像データを示す。進行した腫瘍の進行は、未治療のマウスの群（図１０Ａ）で明白であり、治療されたマウスの群（図１０Ｂ）で明らかに減少した。

図１１Ａは、４６日間にわたる動物の体重の変化が最小限であることを示しており、これは、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥは毎日の投与にもかかわらず毒性がないことを示している。図１１Ｂは、２つの独立した実験からの総腫瘍生物発光（総フラックス）の比較スナップショットであり、腫瘍投与後４６日目でさえ、腫瘍増殖が治療群対未治療群で有意に阻害されることを示している。図１１Ｃは、時間内の腫瘍成長（生物発光）の全体的な進行を示している。４６日間にわたって、腫瘍増殖は治療群において有意に阻害されるが、腫瘍増殖は３９日目に再発し始める。図１１Ｄは、生存プロットにおけるより長期の結果を示している。未治療群の６匹中５匹は、５２日目までに死亡し、すべての未治療動物は６０日目までに死亡する。対照的に、ここでｃａｍ１６１５ＨＥＲ２治療群では７２日目までにまだ５０％の生存率がある。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２－ＴｒｉＫＥ治療群の残りの動物は依然として腫瘍負荷を示していたため、治療は抑制的であり、治癒的ではなかった。総合すると、これらのデータは、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥがｉｎｖｉｖｏでのヒト卵巣がんの増殖を阻害するのに有効であることを確認している。

したがって、本明細書に提示されるデータは、ＨＥＲ２が、三重特異性キラーエンゲージ（ＴｒｉＫＥ）化合物等の免疫療法化合物によって標的化される場合、卵巣がんおよび乳がんの免疫療法標的として役立つことを実証する。例示的な免疫療法化合物は、タモキシフェン不応性細胞（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｃｅｌｌ）に対して有効であり、したがって、タモキシフェンまたは他の化学療法剤に耐性のあるがん細胞を容易に殺すことができる。本開示はさらに、例示的な免疫治療化合物であるＨＥＲ２標的化ＮＫ結合ＴｒｉＫＥが、腹腔内卵巣がん異種移植モデル（異種マウスにおけるヒトＮＫ細胞およびがん細胞の両方の移植を伴うモデル）においてｉｎｖｉｖｏでがんを阻害できることを実証する。本明細書に提示されるデータは、ＨＥＲ３および／またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマーを標的とする免疫療法化合物の基礎をさらに提供する。

本明細書に記載の免疫療法化合物は、薬学的に許容される担体を配合することができる。本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の溶媒、分散媒、媒体、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤、および／または抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁剤、コロイド等を含む。医薬活性物質のためのそのような媒体および／または薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒体または薬剤が有効成分と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助的な有効成分も組成物に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、生物学的、または他の方法で望ましくなくない材料を指す。すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こしたり、それが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用したりすることなく、免疫療法化合物とともに個体に投与することができる。

したがって、免疫療法化合物は、医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物は、好ましい投与経路に適合した様々な形態で製剤化することができる。したがって、組成物は、たとえば、経口、非経口（たとえば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内等）、または局所（たとえば、鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、皮下、直腸等）。医薬組成物は、たとえば、鼻粘膜または呼吸粘膜への投与（たとえば、スプレー剤またはエアロゾルによる）等によって、粘膜表面に投与することができる。組成物はまた、持続放出または遅延放出を介して投与することができる。特定の実施形態では、組成物は、腹腔内、静脈内、または皮下に投与される。

したがって、免疫療法化合物は、液剤、懸濁剤、乳濁剤、スプレー剤、エアロゾル、または任意の形態の混合物を含むがこれらに限定されない、任意の適切な形態で提供することができる。組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤、担体、または媒体を含む製剤で送達することができる。たとえば、製剤は、たとえば、クリーム、軟膏、エアロゾル製剤、非エアゾールスプレー、ゲル、ローション等の従来の局所剤形で送達することができる。製剤は、たとえば、アジュバント、皮膚浸透促進剤、着色剤、香料、香味剤、保湿剤、増粘剤等を含む一つまたは複数の添加剤をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、組成物は、液剤または懸濁剤に製剤化することができる。

製剤は、単位剤形で都合よく提示することができ、薬局の分野でよく知られている方法によって調製することができる。薬学的に許容される担体を含む組成物を調製する方法は、免疫療法化合物を一つまたは複数の補助成分を構成する担体と結合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性分子を液体担体、細かく分割された固体担体、またはその両方と均一におよび／または密接に結合させ、次いで、必要に応じて、生成物を所望の製剤に成形することによって調製することができる。

したがって、別の態様では、本開示は、対象のがんを治療する方法を記載している。一般に、方法は、がんを治療するのに有効な量の免疫療法化合物を対象に投与することを含む。「治療」またはその変形は、状態に関連する症状または徴候を、ある程度まで、軽減、進行の抑制、改善、または回復させることを指す。本明細書で使用される場合、「改善する」とは、特定の状態に特徴的な症状または臨床徴候の程度、重症度、頻度、および／または可能性の低下を指す；「症状」とは、疾患または患者の状態の主観的なエビデンスを指す；「徴候」または「臨床徴候」は、患者以外の者が発見できる特定の状態に関連する客観的な身体的所見を指す。

「治療」は、治療的または予防的であってもよい。「治療的」およびその変形は、状態に関連する一つまたは複数の既存の症状または臨床的兆候を改善する治療を指す。「予防的」およびその変形は、状態の症状または臨床的兆候の発症および／または出現をある程度制限する治療を指す。一般に、「治療的」治療は、状態が対象に現れた後に開始され、「予防的」治療は、状態が対象に現れる前に開始される。したがって、特定の実施形態では、方法は、状態を発症するリスクのある対象の予防的治療を含んでもよい。「リスクがある」とは、記載されているリスクを実際に有する場合と有さない場合がある対象を指します。したがって、たとえば、特定の状態を発症する「リスクがある」対象は、対象がその状態を有しているまたは発症しているという何らかの症状または臨床徴候を示しているかどうかに関わらず、一つまたは複数の徴候を欠く個人と比較して、特定の状態を有するまたは発症するリスクが高い一つまたは複数の徴候を有する対象である。状態の例示的な徴候は、たとえば、遺伝的素因、祖先、年齢、性別、地理的位置、ライフスタイル、または病歴を含んでもよい。症状が回復した後、たとえば再発を予防または遅延させるために、治療を継続することもできる。

したがって、免疫療法化合物は、対象が最初に状態の症状または臨床徴候を示す前、最中、または後に対象に投与することができる。対象がその状態に関連する症状または臨床徴候を最初に示す前に開始された治療は、免疫療法化合物が投与されていない対象と比較して、対象が状態の臨床的エビデンスを経験する可能性を低下させ、症状および／または臨床徴候の重症度を低下させ、および／または状態を完全に回復させる可能性がある。対象がその状態に関連する症状または臨床徴候を最初に示した後に開始された治療は、免疫療法化合物が投与されていない対象と比較して、状態の症状および／または臨床徴候の重症度を減少させる、および／または状態を完全に回復させる可能性がある。

投与される免疫療法化合物の量は、投与される特定の免疫療法化合物、体重、体調、および／または対象の年齢、および／または投与経路を含むがこれらに限定されない様々な要因に応じて変化し得る。したがって、所与の単位剤形に含まれる免疫療法化合物の絶対重量は大きく変動する可能性があり、対象の種、年齢、体重および体調、ならびに／または投与方法等の要因に依存する。したがって、すべての可能な用途に有効な免疫療法化合物の量を構成する量を一般的に示すことは実用的ではない。しかしながら、当業者は、そのような要因を十分に考慮して、適切な量を容易に決定することができる。

一部の実施形態では、方法は、たとえば、約１００ｎｇ／ｋｇ／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量を対象に提供するのに十分な免疫療法化合物を投与する工程を含んでもよいが、一部の実施形態では、方法はこの範囲外の用量で免疫療法化合物を投与することによって実施することができる。

一部の実施形態では、方法は、たとえば、少なくとも１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも１０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも２５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも５０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも１００μｇ／ｋｇ／日、少なくとも２００μｇ／ｋｇ／日、少なくとも３００μｇ／ｋｇ／日、少なくとも４００μｇ／ｋｇ／日、少なくとも５００μｇ／ｋｇ／日、少なくとも６００μｇ／ｋｇ／日、少なくとも７００μｇ／ｋｇ／日、少なくとも８００μｇ／ｋｇ／日、少なくとも９００μｇ／ｋｇ／日、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日等の少なくとも１００ｎｇ／ｋｇ／日の最小用量を提供するのに十分な免疫療法化合物を投与する工程を含んでもよい。

一部の実施形態では、方法は、たとえば５ｍｇ／ｋｇ／日以下、４ｍｇ／ｋｇ／日以下、３ｍｇ／ｋｇ／日以下、２ｍｇ／ｋｇ／日以下、１ｍｇ／ｋｇ／日以下、９００μｇ／ｋｇ／日以下、８００μｇ／ｋｇ／日以下、７００μｇ／ｋｇ／日以下、６００μｇ／ｋｇ／日以下、５００μｇ／ｋｇ／日以下、４００μｇ／ｋｇ／日以下、３００μｇ／ｋｇ／日以下、２００μｇ／ｋｇ／日以下、１００μｇ／ｋｇ／日以下、９０μｇ／ｋｇ／日以下、８０μｇ／ｋｇ／日以下、７０μｇ／ｋｇ／日以下、６０μｇ／ｋｇ／日以下、５０μｇ／ｋｇ／日以下、４０μｇ／ｋｇ／日以下、３０μｇ／ｋｇ／日以下、２０μｇ／ｋｇ／日以下、または１０μｇ／ｋｇ／日以下等、１０ｍｇ／ｋｇ／日以下の最大用量を提供するのに十分な免疫療法化合物を投与する工程を含む。免疫療法化合物は、免疫療法化合物が存在しないわけではないが、指定された量以下の量で存在する場合、指定された量を「超えない」用量を提供する。

一部の実施形態では、方法は、上記で特定された任意の最小用量および選択された最小用量よりも大きい任意の最大用量によって定義されるエンドポイントを有する範囲によって特徴付けられる用量を提供するのに十分な免疫療法化合物を投与する工程を含む。たとえば、一部の実施形態では、方法は、対象に約１０μｇ／ｋｇ／日～約１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量、約１００μｇ／ｋｇ／日～約１ｍｇ／ｋｇ／日の用量、約５μｇ／ｋｇ／日～約１００μｇ／ｋｇ／日の用量等を提供するのに十分な免疫療法化合物を投与する工程を含んでもよい。

特定の実施形態では、方法は、上記の任意の最小用量または任意の最大用量に等しい用量を提供するのに十分な免疫療法化合物を投与する工程を含む。したがって、たとえば、特定の実施形態では、方法は、１μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日、２５μｇ／ｋｇ／日、５０μｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日、２００μｇ／ｋｇ／日、５００μｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日等の用量を提供するのに十分な免疫療法化合物を投与する工程を含んでもよい。

一部の実施形態では、免疫療法化合物は、たとえば、週に単回投与から複数回投与まで投与することができるが、一部の実施形態では、この範囲外の頻度で免疫療法化合物を投与することによって方法を実施することができる。特定の実施形態では、免疫療法化合物は、月に約１回から週に約５回まで投与することができる。一部の実施形態では、２４時間にわたって投与される免疫療法化合物の量に関して記載される上記の用量は、４日間の治療および３日間の休息の７日サイクルで投与される。

一部の実施形態では、免疫療法化合物は、たとえば、単回投与から複数の治療サイクルまで投与することができるが、一部の実施形態では、方法は、免疫療法化合物をこの範囲外の期間投与することによって実施することができる。一部の実施形態では、免疫療法化合物は、３週間投与することができる。そのような実施形態では、各週は、前の段落で記載した例示的な治療サイクル等の治療サイクルであってもよい。他の実施形態では、免疫療法化合物は、１セットの治療サイクルとその後一連のセットの治療サイクルとの間にギャップなしに、より多くの治療サイクルの間投与することができる。１セットの治療サイクルとその後の一連の治療サイクルとの間のギャップは、１週間以上、１ヶ月以上、または１年以上のギャップであってもよい。

一部の実施形態では、方法は、一つまたは複数の追加の治療薬を投与する工程をさらに含む。一つまたは複数の追加の治療薬（たとえば、化学療法剤）は、免疫療法化合物の投与の前、後、および／または同時に投与することができる。免疫療法化合物および追加の治療薬を同時投与することができる。本明細書で使用される場合、「同時投与される」とは、組み合わせの治療または予防効果が、単独で投与されるいずれかの成分の治療または予防効果よりも大きくなり得るように投与される組み合わせの２つ以上の成分を指す。２つの成分を同時にまたは連続して同時投与することができる。同時に同時投与される成分は、一つまたは複数の医薬組成物で提供され得る。２つ以上の成分の連続同時投与は、各成分が同時に治療部位に存在することができるように成分が投与される場合を含む。あるいは、２つの成分の連続同時投与は、少なくとも一つの成分が治療部位から除去されたが、成分を投与することの少なくとも一つの細胞効果（たとえば、サイトカイン産生、特定の細胞集団の活性化等）は、一つまたは複数の追加の成分が治療部位に投与されるまで、治療部位で持続する場合を含んでもよい。したがって、同時投与される組み合わせは、特定の状況において、互いに化学混合物中に決して存在しない成分を含むことができる。他の実施形態では、免疫療法化合物および追加の治療薬は、混合物またはカクテルの一部として投与することができる。一部の態様では、免疫療法化合物の投与は、他の一つまたは複数の治療薬単独の投与と比較した場合、他の治療法のより低い投与量の有効性を可能にし、それにより、より高用量の他の治療薬が投与されたときに観察される毒性の可能性、重症度、および／または程度を低減する。

例示的な追加の治療薬は、アルトレタミン、アムサクリン、Ｌ－アスパラギナーゼ、コラスパーゼ（ｃｏｌａｓｐａｓｅ）、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、サイトホスファン（ｃｙｔｏｐｈｏｓｐｈａｎｅ）、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、ホテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍａｉｄｅ）、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、ラルチトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、またはビノレルビン、抗ＨＥＲ２抗体治療、抗ＨＥＲ３抗体治療（たとえば、Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５を参照）、または抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマー複合体抗体治療（たとえば、Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１９，ＢｉｏｌＰｒｏｃｅｄＯｎｌｉｎｅ２１：５を参照）を含む。

一部の実施形態では、方法のうち、本明細書に記載の十分な免疫療法化合物を投与する工程、および治療的相乗効果を実証する少なくとも一つの追加の治療薬を投与する工程を含んでもよい。本発明の方法の一部の態様では、本明細書に記載の免疫療法化合物および追加の治療薬の両方を投与した後に観察される治療に対する反応の測定値は、免疫療法化合物または追加の治療薬のいずれかを単独で投与した後に観察された治療に対する反応の同一の測定値よりも改善されている。一部の実施形態では、追加の治療薬は、たとえば、カツマキソマブ等のＥｐＣＡＭ特異的モノクローナル抗体、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３を標的とするモノクローナルハイブリッド抗体を含む、ＥｐＣＡＭを標的とする追加の薬剤を含んでもよい。

一部の実施形態では、免疫療法化合物を対象に投与すると、ｉｎｖｉｖｏで内因性ＮＫ細胞を刺激することができる。ｉｎｖｉｖｏ法の一部として免疫療法化合物を使用することにより、同時共刺激、生存率の増強、および増殖を伴うＮＫ細胞を抗原特異的にすることができる。他の場合には、免疫療法化合物は、ＮＫ細胞養子移入療法のアジュバントとしてｉｎｖｉｔｒｏで使用することができる。

前述の記載および後続の特許請求の範囲において、「および／または」という用語は、リストされた要素の一つまたはすべて、またはリストされた要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、およびそれらの変形は、オープンエンドとして解釈されるべきである。すなわち、追加の要素または工程はオプションであり、存在する場合も存在しない場合もある。特に明記されていない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「少なくとも一つ」は同じ意味で使用され、一つまたは複数を意味する；エンドポイントによる数値範囲の列挙は、その範囲内に含まれるすべての数値を含む（たとえば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。

前述の記載では、明確にするために、特定の実施形態を単独で記載することができる。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と互換性がないことが明示的に指定されていない限り、特定の実施形態は、一つまたは複数の実施形態に関連して本明細書に記載の互換性のある特徴の組み合わせを含むことができる。

個別の工程を含む本明細書に開示される任意の方法について、工程は、任意の実行可能な順序で実施することができる。そして、必要に応じて、２つ以上の工程の任意の組み合わせを同時に実施することができる。

本発明は、以下の実施例によって説明される。特定の例、材料、量、および手順は、本明細書に記載されている本発明の範囲および趣旨に従って広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。

ｃａｍ１６１５ＨＥＲＴｒｉＫＥの構築
ラクダ化抗ＣＤ１６（Ｖｉｎｃｋｅｅｔａｌ．，２００９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（５）：３２７３－３２８４）由来のＣＤＲ領域をコードするＤＮＡ断片は、抗原の特異性および親和性の伝達を伴う抗原結合ループの移植を可能にすることが以前に示された、普遍的なヒト化ナノボディスキャフォールドにスプライスされた（Ｂｅｈａｒｅｔａｌ．，２００８，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ２１（１）：１－１０）。この新規の配列を使用して、ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２（配列番号１）を作成した。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥをコードする完全に組み立てられたハイブリッド遺伝子ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２は、（５’末端から３’末端まで）ＮｃｏＩ制限酵素部位；ＡＴＧ開始コドン；抗ヒトＣＤ１６ＶＨＨ；２０アミノ酸（ａａ）セグメント、ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ（配列番号３）；ヒトＩＬ－１５；７アミノ酸リンカー、ＥＡＳＧＧＰＥ（配列番号５）；抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ（Ｂａｔｒａｅｔａｌ．，１９９２，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９（１３）：５８６７－５８７１）、およびＸｈｏＩ制限酵素部位をコードする。得られたハイブリッド遺伝子（配列番号７）を、イソプロピル－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性Ｔ７プロモーターの制御下でｐＥＴ２８ｃ発現ベクターにスプライシングした。ｃａｍ１６１５ＨＥＲ２をコードするＤＮＡ標的遺伝子は１５１７塩基対であった。野生型ヒトＩＬ－１５を使用したが、サイトカインの変異型ではなかった。ミネソタ州セントポールのミネソタ大学の生物医学ゲノミクスセンターは、標的遺伝子の遺伝子配列およびインフレーム精度を検証した。

封入体からのタンパク質の精製
大腸菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）をプラスミドトランスフェクション後のタンパク質発現に使用した。細菌を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む８００ｍｌのＬＢ培地（Ｌｕｒｉａｂｒｏｔｈ）で一晩培養した。培地が６００ｎｍで０．６５の吸光度に達したときに、ＩＰＴＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州フェアローン）を添加することにより、発現を誘導した。細菌の発現により、標的タンパク質が封入体にパッケージングされた。発現後、細菌を回収し、バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ、５０ｍＭＮａＣｌ、および５ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０）でホモジナイズし、ペレットを超音波処理して遠心分離した。ペレットからタンパク質を抽出するために、０．３％デオキシコール酸ナトリウム、５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１０％グリセリン、５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ、５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、および５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液を使用した。抽出物を３回洗浄した。

封入体からのタンパク質はリフォールディングが必要である。したがって、以前に記載された方法（Ｖａｌｌｅｒａｅｔａｌ．，２００５，ＬｅｕｋＲｅｓ２９（３）：３３１－３４１）から改変されたナトリウムＮ－ラウロイル－サルコシン（ＳＬＳ）空気酸化法を使用した。簡単に説明すると、封入体を１００ｍＭＴｒｉｓ、２．５％ＳＬＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）に溶解した。遠心分離によりペレットを除去した。５０μＭのＣｕＳＯ₄を溶液に添加し、室温で２０時間急速に攪拌しながらインキュベートし、－ＳＨ基を空気酸化させた。ＳＬＳの除去は、６Ｍ尿素および１０％ＡＧ１－Ｘ８樹脂（２００～４００メッシュ、塩化物型）（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を界面活性剤可溶化タンパク質溶液に添加することによって行った。次の工程では、タンパク質溶液に１３．３Ｍグアニジン－ＨＣｌを添加し、３７℃で２～３時間インキュベートした。溶液をリフォールディングバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＬ－アルギニン、１Ｍ尿素、２０％グリセロール、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で２０倍に希釈した。混合物を４℃で２日間インキュベートした。バッファーを除去するために、試料を５倍量の２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０で４℃で４８時間、次に８倍量でさらに１８時間透析した。次に、生成物を最初に高速フローＱイオン交換クロマトグラフィーで精製し、次にサイズ排除カラム（ＳＵＰＥＲＤＥＸ２００、Ｃｙｔｉｖａ、マサチューセッツ州マールボロ）を通過させて精製した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）は、Simply Blue life Stain（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して行い、タンパク質のサイズおよび純度を評価した。

がん細胞株
以下の細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州マナサス）から入手した：ＭＣＦ－７Ｌ（乳管がん）、ＭＣＦ－７Ｌ－ＴａｍＲ（ＭＣＦ－７のタモキシフェン耐性サブライン）、ＳＫＯＶ３（卵巣腹水）、ＳＫ－ＢＲ－３（転移部位に由来する乳がん）、喉頭腫瘍に由来するＵＭＳＣＣ－１１Ｂ扁平上皮がん（Ｗｏｒｓｈａｍｅｔａｌ．，２００６，ＡｒｃｈＯｔｏｌａｒｙｎｇｏｌＨｅａｄＮｅｃｋＳｕｒｇ１３２：６６８－６７７）、ＨＬ－６０（急性前骨髄球性白血病）、ＭＡ－１４８（卵巣がん）、ｏｙｏｂｉＳＫＯＶ３－ｌｕｃ。ｉｎｖｉｖｏ実験のために、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用し、１０μｇ／ｍｌのブラストシジンで選択圧を加えて、ＳＫＯＶ３をルシフェラーゼレポーター構築物でトランスフェクトすることによって作製された。ＵＭＳＣＣ－１１Ｂは、ジョンホプキンス大学のフラグメント分析施設によって実行されたＳＴＲ試験によって認証された。ＭＡ１４８（ミネソタ大学で地元で樹立された）は、ヒト上皮性卵巣がん細胞株である。株は、１０～２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍｍｏｌ／ＬＬ－グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０ＲＰＭＩで維持された。株は、一定の３７℃で５％ＣＯ₂を含む加湿雰囲気で培養した。付着細胞が９０％以上コンフルエントになった場合、分離のためにトリプシン－ＥＤＴＡを使用して継代した。細胞数については、標準的な血球計算盤を使用した。トリパンブルー排除によって決定されたように、生存率が９５％を超える細胞のみを実験に使用した。

細胞毒性およびＮＫ細胞活性化の評価
抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、ＣＤ１０７ａ（リソソーム関連膜タンパク質ＬＡＭＰ－１）フローサイトメトリーアッセイを使用して測定した。エフェクター細胞については、ドナーの同意および倫理委員会の許可を得た後、健常者のボランティアからＰＢＭＣを入手した。がん標的細胞は、上記のように細胞株から増殖させた。患者エフェクター細胞を使用した実験では、ミネソタ大学がんセンター組織調達施設は、施設内審査委員会の承認を受けて、卵巣がんと診断された患者から高悪性度漿液性腹水（ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅｓｅｒｏｕｓａｓｃｉｔｅｓ）試料を入手した。すべての検体は、原発性減量手術（ｐｒｉｍａｒｙｄｅｂｕｌｋｉｎｇｓｕｒｇｅｒｙ）時に進行期の卵巣がんまたは原発性腹膜がんと診断された女性から収集した。細胞をペレット化し、溶解して赤血球を除去し、１０％ＤＭＳＯ／９０％ＦＢＳで凍結保存し、液体窒素で保存した。

ＰＢＭＣを１０％ウシ胎児血清（ＲＰＭＩ－１０）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で一晩（３７℃、５％ＣＯ₂）インキュベートし、ＲＰＭＩ－１０で３回洗浄した後、腫瘍標的細胞または培地で懸濁した。次に、細胞をＴｒｉＫＥまたは対照とともに３７℃で１０分間インキュベートした。次に、フルオレセインイソチオサイト（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＣＤ１０７ａモノクローナル抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を添加し、１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（１：１，５００、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）およびＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（１：１，０００、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を３時間（３７℃、５％ＣＯ₂）添加した。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、細胞をＰＥ／Ｃｙ７結合抗ＣＤ５６ｍＡｂ、ＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗ＣＤ１６ｍＡｂ、およびＰＥ－ＣＦ５９４結合抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）で染色した。細胞を４℃で１５分間インキュベートし、洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定した。

細胞内ＩＦＮ－γは、ＮＫ細胞活性化の指標として測定した。簡単に説明すると、細胞を透過処理バッファー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）に曝露し、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ結合抗ヒトＩＦＮ－γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）と２０分間インキュベートした。最後に細胞を洗浄し、ＣＤ５６⁺ＣＤ３^-細胞をゲーティングするＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を使用した蛍光活性化セルソーティング分析によって評価した。

細胞毒性の効力を、さらにリアルタイムで測定した。磁気ビーズに富むＣＤ５６⁺ＣＤ３^- ＮＫエフェクター細胞を９６ウェル平底ポリスチレン組織培養処理マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、英国フリントシャー）に、赤色標識腫瘍細胞とともにプレーティングし、プレートを３７℃／５％ＣＯ₂のセルインキュベーター内に収容したＩＮＣＵＣＹＴＥＺＯＯＭプラットフォーム（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、ミシガン州アナーバー）に移動した。３つの技術的複製からの画像を、４倍の対物レンズを使用して１５分ごとに４８時間撮影し、ＩＮＣＵＣＹＴＥＢａｓｉｃＳｏｆｔｗａｒｅ（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、ミシガン州アナーバー）を使用して分析した。

ＩＬ－１５刺激によるＮＫ細胞の増殖
機能的なＩＬ－１５部分に依存するＴｒｉＫＥの効力を測定するために、キットの仕様に従って、健康なドナー由来のＰＢＭＣまたは濃縮ＮＫ細胞をＣＥＬＬＴＲＡＣＥｖｉｏｌｅｔｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で標識した。染色後、エフェクター細胞を５０ｎＭのＴｒｉＫＥまたは対照とともに培養し、５％ＣＯ₂を含む加湿雰囲気で３７℃で７日間インキュベートした。細胞を回収し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で生存率を染色し、抗ＣＤ５６ＰＥ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）および抗ＣＤ３ＰＥ－ＣＦ５９４（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）で表面染色し、生存能力のあるＣＤ３^-ＣＤ５６⁺ ＮＫ細胞集団をゲーティングした。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗｊｏエンタープライズＬＣＣ、バージョン７．６．５、オレゴン州アッシュランド）を使用して実行した。

ｉｎｖｉｖｏマウス研究およびイメージング
ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥの有効性は、以前に報告されたｓｃｉｄ／ｈｕマウスモデル（Ｖａｌｌｅｒａｅｔａｌ．，２０１６，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２２（１４）：３４４０－３４５０）で試験されが、ヒト卵巣がん細胞株ＳＣＯＶ３の増殖に合わせて改変した。この株にルシフェラーゼレポーター遺伝子をトランスフェクトし、生物発光イメージングを介して腫瘍の進行をリアルタイムでモニタリングできるようにした。ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄ^cscid Ｉｌ２ｒｇ^tm1Wjl／ＳｚＪ、ｎ＝５／群）に２×１０⁵のＳＣＯＶ３細胞を腹腔内注射し、３～５日後に低線量の全身照射（２７５ｃＧｙ）を行った。翌日、すべての群が高度に濃縮されたＮＫ細胞（磁気的にＣＤ３およびＣＤ１９が枯渇したＰＢＭＣ）を受け、cａｍ１６１５ＨＥＲ２ＴｒｉＫＥによる治療を開始した。単一の治療コースは、５０μｇの薬物を週に５回（ＭＴＷＴｈＦ）、２週間腹腔内投与し、その後、６０日目まで週に３回（ＭＷＦ）維持療法を行うことで構成された。各イメージングセッションで、マウスに１００μｌの３０ｍｇ／ｍｌルシフェリン基質を１０分間注射し、イソフルランガス鎮静下でイメージングした。イメージングデータは、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ２．５ソフトウェア（ＸｅｎｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ホプキントン）を備えたＸｅｎｏｇｅｎＩｖｉｓ１００イメージングシステムを使用して収集した。可能な場合は毎週マウスの体重を測定した。

すべての特許、特許出願、および刊行物、および電子的に入手可能な資料の完全な開示（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑでのヌクレオチド配列の提出、たとえば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢでのアミノ酸配列の提出を含む、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑの注釈付きコーディング領域からの翻訳）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願の開示と参照により本明細書に組み込まれる文書の開示との間に矛盾が存在する場合、本出願の開示が優先するものとする。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明確にするためにのみ提供されている。そこから不必要な制限を理解する必要はない。本発明は、示され、記載された正確な詳細に限定されない。当業者に明らかな変形は、特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれるであろう。

特に明記しない限り、明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量等を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、反対の記載がない限り、明細書および特許請求の範囲に記載されている数値パラメーターは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、均等論を特許請求の範囲の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、少なくとも報告された有効桁数に照らして、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。

SEQ ID NO:1 - cam1615HER2 Amino Acid Sequence:

MEQVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGLT FSSYNMGWFR QAPGQGLEAV ASITWSGRDT FYADSVKGRF TISRDNSKNT LYLQMNSLRA EDTAVYYCAA NPWPVAAPRS GTYWGQGTLV TVSSPSGQAG AAASESLFVS NHAYNWVNVI SDLKKIEDLI QSMHIDATLY TESDVHPSCK VTAMKCFLLE LQVISLESGD ASIHDTVENL IILANNSLSS NGNVTESGCK ECEELEEKNI KEFLQSFVHI VQMFINTSEA SGGPEDVQLT QSPAILSASP GEKVTMTCRA TPSVSYMHWY QQKPGSSPKP WIYTTSNLAS GVPARFSGGG SGTSYSLTVS RVEAEDAATY YCQQWSRSPP TFGGGSKLEI KGSTSGSGKS SEGKGVQLQE SGPEVVKPGG SMKISCKTSG YSFTGHTMNW VKQSHGKNLE WIGLINPYNG DTNYNQKFKG KATFTVDKSS STAYMELLSL TSEDSAVYYC ARRVTDWYFD VWGAGTTVTV S

SEQ ID NO:2 - cam16 (amino acids 3-124 of SEQ ID NO:1)

QVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGLTFS SYNMGWFRQA PGQGLEAVAS ITWSGRDTFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAANP WPVAAPRSGT YWGQGTLVTV
SS

SEQ ID NO:3 - hma linker (amino acids 125-144 of SEQ ID NO:1)

PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY

SEQ ID NO:4 - human IL-15 (amino acids 145-258 of SEQ ID NO:1)

NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS

SEQ ID NO:5 - linker (amino acids 259-265 of SEQ ID NO:1)
EASGGPE

SEQ ID NO:6 - anti-HER2 (amino acids 266-501 of SEQ ID NO:1)

DVQLTQSPAI LSASPGEKVT MTCRATPSVS YMHWYQQKPG SSPKPWIYTT SNLASGVPAR FSGGGSGTSY SLTVSRVEAE DAATYYCQQW SRSPPTFGGG SKLEIKGSTS GSGKSSEGKG VQLQESGPEV VKPGGSMKIS CKTSGYSFTG HTMNWVKQSH GKNLEWIGLI NPYNGDTNYN QKFKGKATFT VDKSSSTAYM ELLSLTSEDS AVYYCARRVT DWYFDVWGAG TTVTVS

SEQ ID NO:7 - cam1615HER2 DNA sequence

CCATGGAGca ggtgcagctg gtggagtctg ggggaggctt ggtgcagcct gggggctctc tgagactctc ctgtgcagcc tctggcctca ccttcagtag ctataacatg ggctggttcc gccaggctcc agggcaaggc cttgaggctg tagcatctat tacctggagt ggtcgggaca cattctatgc agactccgtg aagggccgat tcaccatctc cagagacaac tccaagaaca ctctctatct gcaaatgaac agcctgcgcg cggaggacac ggccgtttat tattgtgctg caaacccctg gccagtggcg gcgccacgta gtggcaccta ctggggccaa gggaccctgg tcaccgtctc ctcaccgtct ggtcaggctg gtgctgctgc tagcgaatct ctgttcgttt ctaaccacgc ttacAACTGG GTGAATGTAA TAAGTGATTT GAAAAAAATT GAAGATCTTA TTCAATCTAT GCATATTGAT GCTACTTTAT ATACGGAAAG TGATGTTCAC CCCAGTTGCA AAGTAACAGC AATGAAGTGC TTTCTCTTGG AGTTACAAGT TATTTCACTT GAGTCCGGAG ATGCAAGTAT TCATGATACA GTAGAAAATC TGATCATCCT AGCAAACAAC AGTTTGTCTT CTAATGGGAA TGTAACAGAA TCTGGATGCA AAGAATGTGA GGAACTGGAG GAAAAAAATA TTAAAGAATT TTTGCAGAGT TTTGTACATA TTGTCCAAAT GTTCATCAAC ACTTCTgaag cttccggagg tcccgagGAC GTCCAGCTGA CCCAGTCTCC AGCAATCCTG TCTGCATCTC CAGGGGAGAA GGTCACAATG ACTTGCAGGG CCACCCCAAG TGTAAGTTAC ATGCACTGGT ATCAGCAGAA GCCAGGATCC TCCCCCAAAC CTTGGATTTA TACCACATCC AACCTGGCTT CTGGAGTCCC TGCTCGCTTC AGTGGCGGTG GGTCTGGGAC CTCTTACTCT CTCACAGTCA GCAGAGTGGA GGCTGAAGAT GCTGCCACTT ATTACTGCCA GCAGTGGAGT CGTAGCCCAC CCACGTTCGG AGGGGGGTCC AAGCTGGAAA TAAAAGGTTC TACCTCTGGT TCTGGTAAAT CTTCTGAAGG TAAAGGTGTG CAGCTGCAGG AGTCAGGACC TGAGGTGGTG AAGCCTGGAG
GTTCAATGAA GATATCCTGC AAGACTTCTG GTTACTCATT CACTGGCCAC ACCATGAACT GGGTGAAGCA GAGCCATGGA AAGAACCTTG AGTGGATTGG ACTTATTAAT CCTTACAATG GTGATACTAA CTACAACCAG AAGTTCAAGG GCAAGGCCAC ATTTACTGTA GACAAGTCGT CCAGCACAGC CTACATGGAG CTCCTCAGTC TGACATCTGA GGACTCTGCA GTCTATTACT GTGCAAGGAG GGTTACGGAC TGGTACTTCG ATGTCTGGGG CGCAGGGACC ACGGTCACCG TCTCCtaata gctcgag

SEQ ID NO:8 - NcoI restriction site and start codon (1-8 of SEQ ID NO:7)

CCATGGAG

SEQ ID NO:9 - cam16 (9-374 of SEQ ID NO:7)

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctgggggctc tctgagactc tcctgtgcag cctctggcct caccttcagt agctataaca tgggctggtt ccgccaggct ccagggcaag gccttgaggc tgtagcatct attacctgga gtggtcggga cacattctat gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa cactctctat ctgcaaatga acagcctgcg cgcggaggac acggccgttt attattgtgc tgcaaacccc tggccagtgg cggcgccacg tagtggcacc tactggggcc aagggaccct ggtcaccgtc tcctca

SEQ ID NO:10 - hma linker (375-434 of SEQ ID NO:7)

ccgtctggtc aggctggtgc tgctgctagc gaatctctgt tcgtttctaa ccacgcttac

SEQ ID NO:11 - human IL-15 (435-776 of SEQ ID NO:7)

AACTGGGTGA ATGTAATAAG TGATTTGAAA AAAATTGAAG ATCTTATTCA ATCTATGCAT ATTGATGCTA CTTTATATAC GGAAAGTGAT GTTCACCCCA GTTGCAAAGT AACAGCAATG AAGTGCTTTC TCTTGGAGTT ACAAGTTATT TCACTTGAGT CCGGAGATGC AAGTATTCAT GATACAGTAG AAAATCTGAT CATCCTAGCA AACAACAGTT TGTCTTCTAA TGGGAATGTA ACAGAATCTG GATGCAAAGA ATGTGAGGAA CTGGAGGAAA AAAATATTAA AGAATTTTTG CAGAGTTTTG TACATATTGT CCAAATGTTC ATCAACACTT CT

SEQ ID NO:12 - Linker (777-797 of SEQ ID NO:7)

gaagcttccg gaggtcccga g

SEQ ID NO:13 - anti-HER2 (798-1505 of SEQ ID NO:7)

GACGTCCAGC TGACCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACA ATGACTTGCA GGGCCACCCC AAGTGTAAGT TACATGCACT GGTATCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA AACCTTGGAT TTATACCACA TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC TTCAGTGGCG GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAG TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTCGTAGCC CACCCACGTT CGGAGGGGGG TCCAAGCTGG AAATAAAAGG TTCTACCTCT GGTTCTGGTA AATCTTCTGA AGGTAAAGGT GTGCAGCTGC AGGAGTCAGG ACCTGAGGTG GTGAAGCCTG GAGGTTCAAT GAAGATATCC TGCAAGACTT CTGGTTACTC ATTCACTGGC CACACCATGA ACTGGGTGAA GCAGAGCCAT GGAAAGAACC TTGAGTGGAT TGGACTTATT AATCCTTACA ATGGTGATAC TAACTACAAC CAGAAGTTCA AGGGCAAGGC CACATTTACT GTAGACAAGT CGTCCAGCAC AGCCTACATG GAGCTCCTCA GTCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG GAGGGTTACG GACTGGTACT TCGATGTCTG GGGCGCAGGG ACCACGGTCA CCGTCTCC

SEQ ID NO:14 - Two stop codons and XhoI restriction site (1506-1517 of SEQ ID NO:7)

taatagctcg aga

SEQ ID NO:15 - e23 anti-HER2 amino acid sequence

DVQLTQSPAI LSASPGEKVT MTCRATPSVS YMHWYQQKPG SSPKPWIYTT SNLASGVPAR FSGGGSGTSY SLTVSRVEAE DAATYYCQQW SRSPPTFGGG SKLEIKGSTS GSGKSSEGKG VQLQESGPEV VKPGGSMKIS CKTSGYSFTG HTMNWVKQSH GKNLEWIGLI NPYNGDTNYN QKFKGKATFT VDKSSSTAYM ELLSLTSEDS AVYYCARRVT DWYFDVWGAG TTVTVS

SEQ ID NO:16 - Trastuzumab-based scFv

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS GSTSGSGKPG SGEGSTKGDI QMTQSPSSLS ASVGDRVTIT CRASQDVNTA VAWYQQKPGK APKLLIYSAS FLYSGVPSRF SGSRSGTDFT LTISSLQPED FATYYCQQHY TTPPTFGQGT KVEIKRTV

SEQ ID NO:17 - Anti-HER2 light chain

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC

SEQ ID NO:18 - Anti-HER2 heavy chain

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDK

SEQ ID NO:19 - Lumretuzumab heavy chain

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFR SSYISWVRQA PGQGLEWMGW IYAGTGSPSY
NQKLQGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARHR DYYSNSLTYW GQGTLVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE
LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG

SEQ ID NO:20 - Lumretuzumab light chain

DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR
ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQSDYSY PYTFGQGTKL EIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS
LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC

SEQ ID NO:21 - Seribantumab heavy chain

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYVMAWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGWTLY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTRGL KMATIFDYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSNFGTQTY TCNVDHKPSN TKVDKTVERK CCVECPPCPA PPVAGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTVVHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPAPI EKTISKTKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ
VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPMLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK

SEQ ID NO:22 - Seribantumab light chain

QSALTQPASV SGSPGQSITI SCTGTSSDVG SYNVVSWYQQ HPGKAPKLII YEVSQRPSGV SNRFSGSKSG NTASLTISGL QTEDEADYYC CSYAGSSIFV IFGGGTKVTV LGQPKAAPSV TLFPPSSEEL QANKATLVCL VSDFYPGAVT VAWKADGSPV KVGVETTKPS KQSNNKYAAS SYLSLTPEQW KSHRSYSCRV THEGSTVEKT VAPAECS

SEQ ID NO:23 - KTN3379 light chain

QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSLSNIG LNYVSWYQQL PGTAPKLLIS RNNQRPSGVP DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCA AWDDSPPGEA FGGGTKLTVL GQPKAAPSVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV AWKADSSPVK AGVETTKPSK QSNNKYAASS YLSLTPEQWK SHRSYSCQVT HEGSTVEKTV APTECS

SEQ ID NO:24 - Patritumab Subunit 1

QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWSWIRQP PGKGLEWIGE INHSGSTNYN
PSLKSRVTIS VETSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDKW TWYFDLWGRG TLVTVSSAST
KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY
SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV
FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK
NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK

SEQ ID NO:25 - Patritumab Subunit 2

QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWSWIRQP PGKGLEWIGE INHSGSTNYN PSLKSRVTIS VETSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDKW TWYFDLWGRG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK

SEQ ID NO:26 - Patritumab Subunit 3

DIEMTQSPDS LAVSLGERAT INCRSSQSVL YSSSNRNYLA WYQQNPGQPP KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQQYYST PRTFGQGTKV EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC

SEQ ID NO:27 - Patritumab Subunit 4

DIEMTQSPDS LAVSLGERAT INCRSSQSVL YSSSNRNYLA WYQQNPGQPP KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQQYYST PRTFGQGTKV EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC

SEQ ID NO:28 - Trastuzumab-based TriKE amino acid sequence

QVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGLTFS SYNMGWFRQA PGQGLEAVAS ITWSGRDTFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAANP WPVAAPRSGT YWGQGTLVTV SSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSGNWVNVI SDLKKIEDLI QSMHIDATLY TESDVHPSCK VTAMKCFLLE LQVISLESGD ASIHDTVENL IILANNSLSS NGNVTESGCK ECEELEEKNI KEFLQSFVHI VQMFINTSGS TSGSGKPGSG EGSTKGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFNIKDTYI HWVRQAPGKG LEWVARIYPT NGYTRYADSV KGRFTISADT SKNTAYLQMN SLRAEDTAVY YCSRWGGDGF YAMDYWGQGT LVTVSSGSTS GSGKPGSGEG STKGDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCRAS QDVNTAVAWY QQKPGKAPKL LIYSASFLYS GVPSRFSGSR SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQHYTTPP TFGQGTKVEI KRTV

SEQ ID NO:29 - Trastuzumab-based TriKE DNA sequence - Human codon optimized

CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTGCAGC CTGGGGGCTC TCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGCCT CACCTTCAGT AGCTATAACA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT CCAGGGCAAG GCCTTGAGGC TGTAGCATCT ATTACCTGGA GTGGTCGGGA CACATTCTAT GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACTCCAAGAA CACTCTCTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG CGCGGAGGAC ACGGCCGTTT ATTATTGTGC TGCAAACCCC TGGCCAGTGG CGGCGCCACG TAGTGGCACC TACTGGGGCC AAGGGACCCT GGTCACCGTC TCCTCATCTG GCGGCGGCGG TTCTGGTGGA GGAGGTAGTG GGGGGGGAGG AAGCGGAGGG GGTGGCTCAG GGAACTGGGT GAATGTAATA AGTGATTTGA AAAAAATTGA AGATCTTATT CAATCTATGC ATATTGATGC TACTTTATAT ACGGAAAGTG ATGTTCACCC CAGTTGCAAA GTAACAGCAA TGAAGTGCTT TCTCTTGGAG TTACAAGTTA TTTCACTTGA GTCCGGAGAT GCAAGTATTC ATGATACAGT AGAAAATCTG ATCATCCTAG CAAACAACAG TTTGTCTTCT AATGGGAATG TAACAGAATC TGGATGCAAA GAATGTGAGG AACTGGAGGA AAAAAATATT AAAGAATTTT TGCAGAGTTT TGTACATATT GTCCAAATGT TCATCAACAC TTCTGGCAGT ACCAGCGGGT CAGGGAAACC TGGCAGTGGG GAAGGTTCCA CAAAAGGTGA GGTTCAGCTC GTGGAATCCG GCGGCGGGCT GGTCCAACCA GGTGGGAGTC TCCGCCTGTC ATGTGCCGCA AGCGGATTCA ATATAAAAGA TACATATATA CATTGGGTAA GACAGGCCCC CGGTAAGGGT CTGGAGTGGG TTGCCAGAAT TTATCCCACT AATGGATACA CTCGTTACGC CGATTCTGTG AAAGGCCGGT TTACCATCTC TGCTGACACC TCAAAGAACA CCGCGTACCT CCAGATGAAC TCCCTGAGGG CAGAGGACAC GGCTGTCTAT TATTGCTCTC GCTGGGGCGG CGACGGGTTT TATGCCATGG ATTACTGGGG TCAGGGGACC CTAGTTACAG TGAGCAGCGG TAGTACTTCT GGGAGCGGCA AGCCTGGCTC CGGAGAAGGA TCCACCAAAG GGGATATCCA GATGACGCAG AGCCCATCAT CATTGAGTGC CAGTGTGGGC GACCGGGTCA CGATCACCTG TAGGGCATCT CAGGACGTAA ACACAGCGGT GGCATGGTAC CAGCAAAAAC CTGGAAAGGC CCCAAAACTT TTGATCTACA GCGCTAGCTT CTTATACTCC GGCGTCCCCT CACGATTCTC CGGCTCCAGA AGTGGAACAG ACTTTACTCT GACAATTTCT TCGCTTCAGC CCGAGGATTT TGCTACCTAT TATTGCCAGC AACACTACAC AACCCCTCCG ACTTTCGGAC AAGGGACAAA GGTGGAAATT AAGAGGACTG TG

SEQ ID NO:30 - Trastuzumab-based TriKE DNA sequence - E. coli codon optimized

CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGTGGCGGC TTGGTGCAGC CTGGTGGCTC TCTGCGCCTG TCCTGTGCGG CCTCTGGCCT CACCTTCAGC AGCTATAACA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT CCAGGACAAG GCCTTGAGGC TGTGGCGTCT ATTACCTGGA GTGGTCGGGA CACCTTCTAT GCGGACTCCG TGAAAGGCCG TTTCACCATC TCGCGTGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG CGCGGAGGAC ACGGCCGTTT ATTATTGTGC GGCAAACCCC TGGCCGGTTG CGGCGCCGCG TAGTGGCACC TACTGGGGCC AAGGGACCCT GGTCACCGTC TCCTCATCTG GCGGCGGCGG TAGCGGTGGC GGAGGTAGCG GGGGGGGTGG AAGCGGTGGT GGTGGCTCAG GGAACTGGGT GAATGTAATA AGTGATTTGA AAAAAATTGA AGATCTGATT CAGAGCATGC ATATTGATGC GACGTTATAT ACGGAATCGG ATGTTCACCC AAGTTGCAAA GTTACAGCAA TGAAATGCTT TTTGTTAGAG TTACAAGTTA TTTCACTTGA GTCGGGAGAT GCAAGTATTC ATGATACTGT AGAAAATCTG ATCATCCTGG CAAACAACAG CTTGTCGTCG AATGGGAATG TAACAGAATC TGGATGCAAA GAATGTGAAG AACTGGAAGA AAAAAATATT AAAGAATTTT TGCAGAGTTT TGTTCACATT GTCCAAATGT TCATCAACAC TTCTGGCAGT ACCAGCGGTT CAGGTAAACC GGGCAGCGGG GAAGGTTCCA CAAAAGGTGA AGTTCAGCTC GTGGAAAGCG GCGGCGGTCT GGTCCAGCCA GGTGGGAGTC TCCGCCTGTC ATGTGCCGCG AGCGGTTTTA ATATCAAAGA TACATATATA CATTGGGTAA GACAGGCCCC GGGTAAGGGT CTGGAGTGGG TTGCGCGTAT TTATCCGACG AATGGATACA CTCGTTACGC CGATTCTGTG AAAGGCCGCT TTACCATCTC AGCCGACACC TCAAAGAACA CCGCGTACTT ACAGATGAAC TCCCTGCGCG CAGAAGACAC GGCTGTCTAT TATTGCTCGC GCTGGGGCGG CGACGGTTTT TATGCCATGG ATTACTGGGG TCAGGGGACC CTAGTTACTG TGAGCAGCGG TAGTACTTCT GGGAGCGGCA AACCTGGCTC CGGAGAAGGT TCGACCAAAG GGGATATCCA GATGACGCAG AGCCCGTCAT CACTGTCGGC CAGTGTGGGC GATCGGGTCA CGATCACCTG CCGTGCATCG CAGGATGTAA ATACAGCGGT GGCATGGTAC CAGCAAAAAC CTGGAAAGGC CCCAAAACTT CTGATCTACA GCGCTAGCTT CTTATACTCC GGCGTCCCGT CACGATTTTC CGGCTCCCGT AGTGGAACGG ACTTTACTCT GACAATTTCT TCGCTTCAGC CCGAGGATTT TGCTACCTAT TATTGCCAGC AACACTACAC CACCCCGCCG ACTTTCGGCC AAGGGACGAA AGTGGAAATT AAGAGGACGG TG

SEQ ID NO:31 - Signal peptide/Anti-HER2 light chain/linker/wtIL15/linker/cam16

MGWSCIILFL VATATGVHSD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRASQDVNT AVAWYQQKPG KAPKLLIYSA SFLYSGVPSR FSGSRSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQH YTTPPTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GECGGGGSGG GGSNWVNVIS DLKKIEDLIQ SMHIDATLYT ESDVHPSCKV TAMKCFLLEL QVISLESGDA SIHDTVENLI ILANNSLSSN GNVTESGCKE CEELEEKNIK EFLQSFVHIV QMFINTSGST SGSGKPGSGE GSTKGQVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GLTFSSYNMG WFRQAPGQGL EAVASITWSG RDTFYADSVK GRFTISRDNS KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAANPWPVAA PRSGTYWGQG TLVTVSS

SEQ ID NO:32 - Signal peptide/Anti-HER2 heavy chain

MGWSCIILFL VATATGVHSE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFNIKD TYIHWVRQAP GKGLEWVARI YPTNGYTRYA DSVKGRFTIS ADTSKNTAYL QMNSLRAEDT AVYYCSRWGG DGFYAMDYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKKVEPK
SCDK

SEQ ID NO:33 - Signal peptide/Anti-HER2 heavy chain Fab/T2A/signal peptide/Anti-HER2 light chain/linker/wtIL15/linker/cam16

MGWSCIILFL VATATGVHSE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFNIKD TYIHWVRQAP GKGLEWVARI YPTNGYTRYA DSVKGRFTIS ADTSKNTAYL QMNSLRAEDT AVYYCSRWGG DGFYAMDYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SCDKEGRGSL LTCGDVEENP GPMGWSCIIL FLVATATGVH SDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQDV NTAVAWYQQK PGKAPKLLIY SASFLYSGVP SRFSGSRSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QHYTTPPTFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGECGGGGS GGGGSNWVNV ISDLKKIEDL IQSMHIDATL YTESDVHPSC KVTAMKCFLL ELQVISLESG DASIHDTVEN LIILANNSLS SNGNVTESGC KECEELEEKN IKEFLQSFVH IVQMFINTSG STSGSGKPGS GEGSTKGQVQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCA ASGLTFSSYN MGWFRQAPGQ GLEAVASITW SGRDTFYADS VKGRFTISRD NSKNTLYLQM NSLRAEDTAV YYCAANPWPV AAPRSGTYWG QGTLVTVSS

SEQ ID NO:34 - Linker

SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SG

SEQ ID NO:35 - Linker

GSTSGSGKPG SGEGSTKG

SEQ ID NO:36 - Signal peptide

MGWSCIILFL VATATGVHS

SEQ ID NO:37 - T2A self-cleaving peptide

EGRGSLLTCG DVEENPGP

Claims

ＣＤ１６に選択的に結合する部分を含むＮＫ細胞結合ドメイン；
ＩＬ－１５またはその機能的断片を含むＮＫ細胞結合ドメインに作動可能に連結されているＮＫ活性化ドメイン；および
ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマー複合体に選択的に結合し、ＮＫ活性化ドメインおよびＮＫ細胞結合ドメインに作動可能に連結されている標的ドメイン（ｔａｒｇｅｔｉｎｇｄｏｍａｉｎ）
を含む、化合物。
前記ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａを含む、請求項１に記載の化合物。
前記ＮＫ細胞結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の化合物。
前記ＮＫ細胞結合ドメインの部分は、抗体またはその結合断片を含む、請求項１に記載の化合物。
前記抗体またはその結合断片は、ヒト、ヒト化、またはラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）である、請求項４に記載の化合物。
前記ＩＬ－１５は、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む、請求項１に記載の化合物。
前記ＩＬ－１５の機能的バリアントは、配列番号４と比較して、Ｎ７２ＤまたはＮ７２Ａアミノ酸置換を含む、請求項６に記載の化合物。
前記標的ドメインは、抗体またはその結合断片を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
前記抗体結合断片は、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、または単一ドメイン抗体断片を含む、請求項８に記載の化合物。
前記標的ドメインは、トラスツズマブ、ｅ２３、ルムレツズマブ（ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、セリバンツマブ（ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、ＫＴＮ３３７９／ＣＤＸ－３３７９、パトリツマブ、エルゲムツマブ（ｅｌｇｅｍｔｕｍａｂ）、Ｕ３－１４０２、ＡＶ－２０３、ＧＳＫ２８４９３３０、ＭＭ－１１１、ＭＣＬＡ－１２８、イスチラツマブ（ｉｓｔｉｒａｔｕｍａｂ）、デュリゴツズマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、ペルツズマブ、またはそれらの機能的バリアントを含む、請求項８に記載の化合物。
前記標的ドメインは、配列番号６、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の化合物。
二つのドメインを連結する少なくとも一つの隣接配列をさらに含む、請求項１に記載の化合物。
二つの連結されたドメインを第三のドメインと連結する第二の隣接配列をさらに含む、請求項１２に記載の化合物。
前記隣接配列は、前記ＮＫ活性化ドメインに隣接している、請求項１３に記載の化合物。
第一の隣接配列はＮＫ細胞結合ドメインのＣ末端であり、第二の隣接配列は抗腫瘍標的ドメインのＮ末端である、請求項１３に記載の化合物。
第二の標的ドメインをさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物。
第二のＮＫ細胞結合ドメインをさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の化合物。
第二のＮＫ活性化ドメインをさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の化合物。
請求項１～１８のいずれか一項に記載の化合物；および
薬学的に許容される担体
を含む、組成物。
追加の治療薬をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
前記追加の治療薬は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマー複合体を標的とする治療薬を含む、請求項２０に記載の組成物。
ＮＫ媒介性のがん細胞の死滅を誘導するのに有効な量の、請求項１～１８のいずれか一項に記載の化合物を対象に投与する工程を含む、方法。
ｉｎｖｉｖｏでＮＫ細胞の増殖を刺激するための方法であって、対象におけるＮＫ細胞の増殖を刺激するのに有効な、請求項１～１８のいずれか一項に記載の化合物の量を該対象に投与する工程を含む、方法。
対象におけるがんを治療する方法であって、がんを治療するのに有効な、請求項１～１８のいずれか一項に記載の化合物の量を該対象に投与する工程を含む、方法。
化学療法、腫瘍の外科的切除、または放射線療法の前、同時、または後に前記化合物を投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
前記化学療法は、アルトレタミン、アムサクリン、Ｌ－アスパラギナーゼ、コラスパーゼ（ｃｏｌａｓｐａｓｅ）、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、サイトホスファン（ｃｙｔｏｐｈｏｓｐｈａｎｅ）、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、ホテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍａｉｄｅ）、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、ラルチトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、またはビノレルビンを含む、請求項２３に記載の方法。
ＮＫ媒介性のがん細胞の死滅を誘導するのに有効な量の、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
ｉｎｖｉｖｏでＮＫ細胞の増殖を刺激するための方法であって、対象におけるＮＫ細胞の増殖を刺激するのに有効な、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の組成物の量を、該対象に投与する工程を含む、方法。
対象におけるがんを治療する方法であって、がんを治療するのに有効な、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の組成物の量を該対象に投与する工程を含む、方法。
化学療法、免疫療法、腫瘍の外科的切除、または放射線療法の前、同時、または後に前記組成物を投与することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
前記化学療法は、アルトレタミン、アムサクリン、Ｌ－アスパラギナーゼ、コラスパーゼ（ｃｏｌａｓｐａｓｅ）、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、サイトホスファン（ｃｙｔｏｐｈｏｓｐｈａｎｅ）、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、ホテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍａｉｄｅ）、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、ラルチトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、またはビノレルビンを含む、請求項３０に記載の方法。
前記免疫療法は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマー複合体を標的とする、請求項３０に記載の方法。