JP2022547271A - Ｎｐａｓ２抑制による結合組織の機能および表現型の再生 - Google Patents

Ｎｐａｓ２抑制による結合組織の機能および表現型の再生 Download PDF

Info

Publication number
JP2022547271A
JP2022547271A JP2022513118A JP2022513118A JP2022547271A JP 2022547271 A JP2022547271 A JP 2022547271A JP 2022513118 A JP2022513118 A JP 2022513118A JP 2022513118 A JP2022513118 A JP 2022513118A JP 2022547271 A JP2022547271 A JP 2022547271A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
npas2
wound
drug
sirna
agent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022513118A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021046438A5 (ja
Inventor
ニシムラ，イチロー
ホクゴ，アキシゲ
ササキ，ホダカ
オカワ，ヒロコ
ワン，リシン
ディー． ダモワゾー，ロバート
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of JP2022547271A publication Critical patent/JP2022547271A/ja
Publication of JPWO2021046438A5 publication Critical patent/JPWO2021046438A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/216—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acids having aromatic rings, e.g. benactizyne, clofibrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/27—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carbamic or thiocarbamic acids, meprobamate, carbachol, neostigmine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • A61K31/36—Compounds containing methylenedioxyphenyl groups, e.g. sesamin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4174—Arylalkylimidazoles, e.g. oxymetazolin, naphazoline, miconazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/428—Thiazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/45—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cycloheximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/765—Polymers containing oxygen
    • A61K31/775—Phenolic resins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本発明は、対象の創傷治癒を改善または促進するための方法であって、時計遺伝子の発現を抑制する薬剤を、それを必要とする対象の創傷に投与することを含み、時計遺伝子がニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（Ｎｐａｓ２）である、方法を提供する。本発明はまた、対象の骨喪失部位または創傷部位、特に開いた創傷部位に、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤を投与することを含む、歯槽骨を再生するための方法、創傷部位で結合組織を再生するための方法、および創傷領域サイズを減少させるための方法に関する。【選択図】図２９

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月４日に出願された米国仮出願第６２／８９５，８２１号の利益および優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、対象の創傷治癒を改善または促進するための方法であって、時計遺伝子の発現を抑制する薬剤を、それを必要とする対象の創傷に投与することを含む、方法に関し、時計遺伝子はニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（Ｎｐａｓ２）である。本発明はまた、歯槽骨を再生するための方法であって、それを必要とする対象の骨喪失部位に、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤を投与することを含む、方法に関する。本発明はさらに、創傷部位における結合組織の再生を必要とする対象の創傷部位において結合組織を再生するための方法であって、治療有効量のＮｐａｓ２発現抑制剤を創傷に投与することを含む、方法に関する。本発明はまた、対象の開いた創傷部位に、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤を局所投与することを含む、創傷領域サイズを減少させるための方法に関する。
皮膚および口腔内の閉鎖されていない開いた創傷は、現在の医学的および歯科的治療にとって大きな脅威となっている。軟部組織の創傷管理の治療目標は、感染の制御および創傷の閉鎖である。ＥｌｉａｓｏｎおよびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎが１９３４年に術後の創傷合併症に関する古典的なレビューを発表したとき、彼らの焦点は主に手術部位の感染症であった。抗生物質および無菌的操作の効果的な使用により、今日において手術部位の感染リスクが大幅に減少した。しかしながら、瘢痕を抑制するという課題は依然として残っている。創傷の閉鎖を達成するための現在のアプローチは、１世紀以上にわたって本質的に変化しておらず、縫合糸および接着剤（４）を使用するというものである。
顔部および頭部は、事故、暴行、または戦場での負傷が原因で負傷の最も頻繁に発生しうる領域である。顔面の傷はすべての救急科の訪問の４％～７％を占め、救急科では、臨床医が様々な創傷閉鎖方法を利用できることにより、顔面の軟部組織の損傷のほぼ９０％が治療される。顔面のがん、火傷または骨折などの、大規模な顔面の負傷は、明らかに患者に対して多くの社会的影響をもたらすが、小規模な顔面の負傷でさえも、重大な心理社会的影響を示し、人生への満足度の低下、身体画像の認識の変化、および心的外傷後ストレス障害、アルコール依存症、服役、失業または夫婦間の問題などの発生率の上昇をもたらし得る。
口腔内の歯周炎の主な病変は、歯肉と歯表面との間に歯周ポケットと呼ばれる開いた空間を生じさせ、これが口腔微生物叢に対し異常な環境を提供し、病原菌の増殖をもたらす。歯周ポケットの閉鎖は現在、ポケットを縮小させる手術によってのみ行われている。米国の文民の非入院集団に対する国民健康栄養調査は、６，４７０万人に相当する歯を持つ成人の４６％が歯周炎に罹患していることを報告している。歯周炎の有病率は、加齢と正の相関があり、８．９％の人々が重度または侵襲性の歯周炎を発症している。同様に、歯周炎はコンパニオンドッグで最も多く見られる口腔疾患である。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｅｎｔａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅによると、歯周病は最も一般的な臨床症状であり、一部のイヌ血統では有病率が９０％を超える可能性があり、獣医患者の多数に対するケアが不十分な状況である。
したがって、対象の創傷、特に皮膚および口腔の開いた皮膚創傷部に投与して、創傷治癒を促進し、歯槽骨を再生し、および／または創傷部における結合組織を再生することができる薬剤を同定することは非常に重要である。
一態様では、本発明は、対象の創傷治癒を改善または促進するための方法であって、時計遺伝子の発現を抑制する薬剤を、それを必要とする対象の創傷に投与することを含み、時計遺伝子がニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（Ｎｐａｓ２）である、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、歯槽骨を再生するための方法であって、それを必要とする対象の骨喪失部位に、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤を投与することを含む、方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は、創傷部位における結合組織の再生を必要とする対象の創傷部位において結合組織を再生するための方法であって、治療有効量のＮｐａｓ２発現抑制剤を創傷に投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤を対象の開いた創傷部位に局所投与することを含む、創傷領域サイズを減少させるための方法を提供する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、実施例、および図面から明らかになろう。しかし、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および修正がこの詳細な説明から当技術分野の当業者には明らかになるので、本発明の特定の実施形態を示す一方で詳細な説明および特定の実施例は、例示としてのみ示されることを理解されたい。適切な場合はいつでも、本発明の任意の実施形態は、その実施形態が本発明の異なる態様の下で説明されているとしても、本発明の１つ以上の他の実施形態と組み合わせることができる。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、その発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することによってより良く理解することができる。本特許または出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面を有する本特許または特許出願公開のコピーは、要求に応じて、必要な手数料を支払うことにより、官庁から提供される。
Ｎｐａｓ２－／－マウスにおいて全層皮膚パンチ創傷の治癒が促進されることを示す。図１Ａは、手術後０～１２日で得られた皮膚創傷の標準化された写真であり、創傷の閉鎖および収縮が進行していることを示す。図１Ｂは、２、４、６、および１２日に算出された創傷面積の相対値を示す。Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスは、１２日目にはＷＴマウスよりも有意に小さい創傷面積を示した（＊＊Ｐ＜０．０１）。図１Ｃは、７日目の創傷の組織学的観察において、肉芽組織（ＧＴ）の形成および上皮の完全性（ＥＰ）の回復が示されたことを示すが、創傷縁（点線）が明瞭に観察された。１４日目では、毛包（ＨＦ）によって強調された創傷縁は不明瞭となり、肉芽組織（ＧＴ）に近づいていた。 ＷＴ、Ｎｐａｓ２＋／－、およびＮｐａｓ２－／－の皮膚線維芽細胞の特性を示す。図２Ａは、ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって決定された各線維芽細胞バッチの遺伝子型を示す。野生型のＮｐａｓ２対立遺伝子では、２５０ｂｐのＰＣＲ産物が生成されたが、変異体対立遺伝子では、３５０ｂｐのＰＣＲ産物が生成された。図２Ｂは、ＷＳＴ－１アッセイにおいてＮｐａｓ２ ＫＯ線維芽細胞の細胞増殖率の増加が示されたことを示す（＊＊Ｐ＜０．０１、Ｔｕｋｅｙ分析により時点でＷＴと比較した有意差）。図２Ｃは、コア時計遺伝子の発現を示し、ＬａｃＺレポーター遺伝子を、ＲＴ－ＰＣＲによって６時間ごとに４８時間測定した（図中のＰ値：時間と遺伝子型因子との間の相互作用の二元配置分散分析。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、Ｔｕｋｅｙ分析による時点でのＷＴと比較した有意差）（図２Ｃ）。 ＷＴ、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－ ／－線維芽細胞を用いたインビトロ創傷治癒実験を示す。図３Ａは、擦傷治癒アッセイの進展を捉えた低速度撮影顕微鏡写真の画像である。図３Ｂは、擦傷のある領域内の移動した細胞の数が、１２時間および２４時間でＮｐａｓ２ ＫＯ群で有意に多かったことを示す（＊＊Ｐ＜０．０１）。図３Ｃは、Ｎｐａｓ２ ＫＯ線維芽細胞群における、コラーゲンゲルの収縮の増加を示した、標準化された浮遊コラーゲンゲルの画像を示す。図３Ｄは、コラーゲンゲルの面積が時間の経過とともに減少したことを示す。ゲルの収縮速度は、Ｎｐａｓ２ ＫＯ線維芽細胞の方が速かった（＊＊Ｐ＜０．０１、ＷＴと比較した場合にのみ有意差が示された）。図３Ｅは、ＦＬＥＣＳベースの単一細胞収縮の概略図である。図３Ｆは、Ｎｐａｓ２ ＫＯ線維芽細胞において収縮細胞の比率が増加したことを示す。図３Ｇは、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異が、皮膚線維芽細胞におけるβ－アクチン（Ａｃｔｂ）およびα－ＳＭＡ（Ａｃｔａ２）の遺伝子発現に影響を与えなかったことを示す。図３Ｈ（ａ）～３Ｈ（ｃ）は、皮膚線維芽細胞におけるインテグリンサブユニットαＶ（ＩｔｇａＶ）、β３（Ｉｔｇｂ３）、およびβ５（Ｉｔｇｂ５）の定常状態の遺伝子発現レベルが、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異の影響を受けなかったことを示す。 インビトロでのＷＴ、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－ ／－線維芽細胞によるコラーゲン合成を示す。図４Ａは、Ｉ型（Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ１ａ２）、ＩＩＩ型（Ｃｏｌ３ａ１）、ＸＩＩ型（Ｃｏｌ１２ａ１）、およびＸＩＶ型（Ｃｏｌ１４ａ１）コラーゲンの遺伝子発現を示す（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ＷＴとのみ比較した有意差）。ＸＩＩ型およびＸＩＶ型のＦＡＣＩＴコラーゲンは、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－線維芽細胞において、有意に増加した定常状態のｍＲＮＡレベルを示した。図４Ｂは、ピクロシリウスレッド染色によりコラーゲン線維の合成を強調した培養線維芽細胞の画像を示す。図４Ｃは、インビトロにおけるコラーゲン線維沈着が、ピクロシリウスレッド染色によって測定されたことを示す（＊＊Ｐ＜０．０１、事後ホルム検定による一元配置分散分析による）。 創傷治癒部位のコラーゲン線維構造の評価を示す。図５Ａは、手術後１４日目にピクロシリウスレッドで染色されたコラーゲン線維構造を示す共焦点レーザー走査顕微鏡像を示す。図５Ｂは、ＩＳＡにより標準化した、肉芽組織面積（ＧＴ：ｂ）を差し引いた皮筋層（ＰＣ）間のＩＳＡ（ａ）の幅として算出された創傷閉鎖面積（ＷＣＡ）を使用した、創傷閉鎖比率の測定を示す。図５Ｃは、創傷閉鎖比率がＮｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスで１４日目に大きかったことを示すが、統計的有意性は、ＷＴ群とＮｐａｓ２－／－群の間でのみ見られた。 Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスの、抜歯により誘導された歯槽骨の再生を示す。図６Ａでは、Ｃ５７Ｂｌ６Ｊ（Ｂ６）野生型（ＷＴ）マウスに対し、上顎左第１大臼歯の抜歯処置を行い、口腔粘膜と歯槽骨の両方の創傷治癒を行った（矢印）。Ｂ６バックグラウンドのＮｐａｓ２ ＫＯマウスは、抜歯窩での急速な創傷閉鎖および強力な骨再生を示した。図６Ｂは、２週目における抜歯創傷治癒のＭｉｃｒｏＣＴ画像を示す。図６Ｃは、１週目（Ｗ１）および２週目（Ｗ２）のＮｐａｓ２ ＫＯマウスにおいて急速な骨充満を示した、３つのルートソケットの各ＭｉｃｒｏＣＴベースの三次元データ分析（ＢＶ／ＴＶ）を示す。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１。図６Ｄは、骨髄ＭＳＣのインビトロにおけるミネラル化作用を示す。骨形成培地で２８日間培養した後、ＭＳＣは、アリザリンレッド陽性のミネラル化結節領域を合成し、これはＮｐａｓ２ ＫＯ ＢＭＳＣで有意に増加した。図６Ｅは、ＲＴ－ＰＣＲによるＢＭＰ－２の発現を示す。Ｎｐａｓ２ ＫＯ ＭＳＣ（骨髄由来間葉系間質／幹細胞）は、骨形成培地でのインキュベーション後にＢＭＰ－２発現を強力に増加させた。統計分析：図６Ｃ、６Ｄは、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１、また図６ＥはＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定、＊＊：ｐ＜０．０１。 骨髄間質細胞の骨形成分化に対するレセルピンの効果を示す。図７Ａは、レセルピンを添加した骨形成培地で培養された野生型ＢＭＳＣ（Ｄｗｎ－Ｃ）が、培養２１日目にアリザリンレッド陽性のインビトロミネラル化作用の増加を示したことを示す。バー：ｐ＜０．０５のＴｕｋｅｙ分析。図７Ｂは、２１日間の培養後にＢＭＳＣから調製した全ＲＮＡを、オステオポンチン（Ｏｐｎ）およびオステオカルシン（Ｏｃｎ）、ならびにハウスキーピング遺伝子（Ｇａｐｄｈ）についてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲに供した結果を示す。発現値を０日目のＲＮＡにより正規化した。 マウス背部の皮膚パンチが、レセルピンカプセル化ＤＮＶで治療されたことを示す。 マウス歯周炎モデルにおける歯周組織の再生を示す。図９Ａは、歯周炎によって誘導された歯槽骨吸収、およびリガチャーによって誘導されたマウス歯周炎のＭｉｃｒｏＣＴ画像を示す。図９Ｂは、リガチャー除去後にレセルピン＋ＤＮＶが局所的に適用されたリガチャー誘導性歯周炎のマウスモデルのフロー図である。図９Ｃは、リガチャーの配置が、歯周炎と一致する重度の炎症、上皮過形成および結合組織のコラーゲンの乱れを誘導したことを示す。リガチャーの除去は炎症反応を鎮めたが、上皮および結合組織の異常が残った。歯槽骨の高さは変わらなかった（黒い矢印）。レセルピン＋ＤＮＶ処置群では、上皮組織および結合組織が正常化された。歯槽骨が再生された明確な徴候が見られた（白および黒の矢印の間）。レセルピン＋ＤＮＶ処置群は、対照と同様に歯肉結合組織のコラーゲンの再配列を示し、歯槽骨の再生も観察された。 トップの抑制化合物であるＤｗｎＣの滴定アッセイを示す。Ｄｗｎ１を１００μＭ～０．２ｎＭまで段階希釈し、ＭＳＣ Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺに適用した。有効濃度（ＥＣ）はＬａｃＺ発現によって測定し、阻害濃度（ＩＣ）はカルセインＡＭ／Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色を使用した細胞生存率によって測定した。ＤｗｎＣおよびＤｗｎ１はいずれもレセルピンである。 Ｎｐａｓ２抑制化合物Ｄｗｎ１（レセルピン）のインビトロ生物学的アッセイの結果を示す。図１１Ａは、ＭＳＣのインビトロミネラル化作用がＤｗｎ１の補充によって用量依存的に増加したことを示す。Ｄｗｎ１（１μＭ）は、ＢＭＰ－２（１００ｎｇ／ｍｌ）の補充と同様の効果を示した。図１１Ｂは、Ｄｗｎ１によってＤ２１から発現レベルが上昇したオステオカルシン（ＯＣＮ）の発現を示す。図１１Ｃは、Ｄｗｎ１がＢｍａｌ１の発現に影響を与えなかったことを示す。図１１Ｄ（ａ）～１１Ｄ（ｂ）は、Ｎｐａｓ２＋／－ ＭＳＣがＤｗｎ１に応答した一方で、Ｎｐａｓ２－／－が応答しなかったことを示しており、Ｄｗｎ１の効果がＮｐａｓ２抑制を介するものであったことを示唆する。＊＊：Ｔｕｋｅｙ分析による、未処置対照に対するｐ＜０．０１。 マウスにおける、修飾されたリガチャー誘導性歯周炎におけるＤｗｎ１の効果を示す。図１２Ａは、５．０シルク縫合糸を上顎左第２大臼歯（Ｍ２）に１４日間配置し、その後除去したことを示す。図１２Ｂは、歯肉の腫れがリガチャーによって誘導された歯周炎を示すことを示す。図１２Ｃは、歯肉組織のＲＴ－ＰＣＲの結果、炎症性サイトカインの発現が確認されたことを示す。図１２Ｄは、歯槽骨喪失の進行を示すＭｉｃｒｏＣＴを示す。図１２Ｅは、口腔器具を使用して変形可能なナノスケールのベシクル（ＤＮＶ）を口蓋歯肉に適用したことを示す。経口腔粘膜による薬物投与を、歯槽骨上の蛍光ビスホスホネートによって実証した。図１２Ｆは、縫合糸を除去した後、Ｄｗｎ１／ＤＮＶを口蓋歯肉に適用したことを示す。ビヒクル対照は異常な上皮肥厚を示した（白い矢印）。図１２Ｇは、Ｄｗｎ１で処置した口蓋側では骨の高さが増加しているが、未処置の頬側では骨の高さが増加していないことを示すＭｉｃｒｏＣＴを示す。図１２ＨはＨ＆Ｅ（上段）およびシリウスレッド（下段）で染色された組織切片を示し、歯槽骨の再生（上段）、およびシャーピー線維（ＳＦ）による歯肉／ＰＤＬ結合組織の再生（下段）を示す。＊：ｐ＜０．０５、＊：ｐ＜０．０１。 インプラントの骨結合の基礎となる分子的機構を決定するために使用した、バイアスなしの化学的遺伝学的解析を示す。図１３Ａは、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺレポーター系を担持するＢＭＳＣを使用した化学的遺伝学的解析のフロー図である。図１３Ｂは、マウスＢＭＳＣのＮｐａｓ２－ＬａｃＺ発現のための、ＬＯＰＡＣ１２８０化合物のハイスループットスクリーニングを示す。ヒット化合物は、ｚスコア＞２．５または＜－２．５として識別された。図１３Ｃは、３組の実験におけるヒット化合物のＮｐａｓ２－ＬａｃＺ発現の検証を示す。化合物（黒いバー）は、未処理の対照（白いバー）と比較して、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺの発現を有意に調節した（ｐ＜０．０５）。 Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスが、骨再生によって骨損傷に反応したことを示す。図１４Ａは、Ｃ５７Ｂｌ６Ｊ野生型（ＷＴ）およびＢ６バックグラウンドのＮｐａｓ２－／－マウスの頭蓋骨を限界のサイズにまで欠損させ、３２５ｎｇのＢＭＰ２を担持するコラーゲンスポンジで処置し、インビボｍｉｃｒｏＣＴで４週間モニターした結果を示す。図１４は、Ｎｐａｓ２－／－マウスの再生骨量がＷＴマウスよりも有意に大きかったことを示す。図１４Ｃは、Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスにおける抜歯誘導性の歯槽骨再生を示す。ＷＴマウスを上顎第１大臼歯の抜歯により処置し、口腔粘膜および歯槽骨の両方の創傷治癒を行わせた（矢印）。Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスは、抜歯窩における急速な創傷閉鎖および強力な骨再生を示した。図１４Ｄは、２週目のＮｐａｓ２ ＫＯマウスの急速な骨充満を示す３つのルートソケットにおける各ＭｉｃｒｏＣＴデータ分析（ＢＶ／ＴＶ）を示す。図１４Ｂは、スチューデントのＴ検定、＊＊：ｐ＜０．０１。図１４Ｄは、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、＊：ｐ＜０．０５、＊：ｐ＜０．０１。 マウスにおけるリガチャー誘導性の歯周炎、およびＮｐａｓ２－／－マウスにおけるリガチャー除去後の歯槽骨再生を示す。図１５Ａは、１４日（Ｄ）上顎第２臼歯（Ｍ２）の周りへのリガチャー配置が、歯肉の炎症（点線）を進行させたことを示す。図１５Ｂは、口蓋歯肉のリガチャーに配置された側での、ＩＬ－１７ａの増加などの、炎症性サイトカインの組織における発現を示す。図１５Ｃは、ｍｉｃｒｏＣＴによってモニターしたとき、歯槽骨の喪失が徐々に増加することを示す。図１５Ｄは、歯肉におけるＮｐａｓ２の発現が徐々に増加することを示す。図１５Ｅは、１４日目にリガチャーを除去し、スケーリングとルートプレーニング（ＳＲＰ）を模倣したことを示す。２８日目に歯肉の炎症は治まった。ＷＴマウスでは、Ｍ２の周りに歯肉欠損（白い矢印）が見られたが、これはＮｐａｓ２－／－マウスでは目立たなかった。図１５Ｆは、１４日目の縫合糸除去前に、ＷＴおよびＮｐａｓ２－／－マウスでは歯周炎によって誘導された同等の歯槽骨喪失が示されたことを示す。図１５Ｇは、ＷＴマウスの歯槽骨の高さが低いままであるのに対し、Ｎｐａｓ２－／－マウスでは骨の高さの増加を示し、骨の再生を示唆する。＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．００１。 ＨＴＳにおいて、Ｎｐａｓ２抑制化合物（Ｄｗｎ１）による歯槽骨の再生が同定されたことを示す。図１６Ａは、リガチャーがＤ１４で除去され（図１５Ｅ）、Ｄｗｎ１が口蓋歯肉に局所的に適用されたことを示す。Ｄ２８では、対照マウス（ｃｏｎｔ．）に見られる歯肉欠損が、Ｄｗｎ１処理マウスでは目立たなかった。図１６Ｂは、Ｄｗｎ１が適用された口蓋側で歯槽骨の喪失が減弱したことを示す。図１６Ｃは、Ｄｗｎ１を適用した口蓋側において、セメント－エナメル質接合部における正常化した歯肉（白い矢印）、および吸収された歯槽骨（黒い矢印）上の新しい骨（赤い矢印）が示されたことを示す。図１６Ｄは、Ｄｗｎ１処置により、歯槽骨（Ｂ）への上皮（Ｅｐ）の付着部の下にシャーピー線維（ＳＦ）を有するよう正常化された、シリウスレッド染色された歯肉コラーゲンが整列したことを示す。＊：ｐ＜０．０５ ＨＴＳデータを化学的ゲノミクス分析に適用したことを示す。薬物標的は、モノアミン関連受容体、輸送体、およびシグナル伝達経路の化学的空間内で大部分が重複していた。 ＭＳＣが、ニューロンのモノアミン輸送体、ベシクルのモノアミン輸送体（ＶＭＡＴ）、原形質膜のモノアミン輸送体（ＰＭＡＴ）、ニューロン外のモノアミン輸送体（ＥＭＴ）、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）およびノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）を発現したことを示す。 Ｄｗｎ１（汎モノアミン輸送体阻害剤）が、ＢＭＰ２補充（１００ｎｇ／ｍｌ）と同等のレベルで、インビトロでのミネラル化作用を用量依存的に増加させたことを示す。＊＊：対照に対してｐ＜０．０１（白いバー）。 Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスのＭＳＣの挙動を示す。図２０Ａは、ＭＳＣを骨形成、軟骨形成および脂肪生成用の分化培地に曝露したことを示す。Ｎｐａｓ２－／－ＭＳＣは、ＷＴのＭＳＣよりも高い多能性分化能を示した。図２０Ｂは、自己複製活性がＮｐａｓ２－／－ＭＳＣで増加したことを示す。図２０Ｃは、幹細胞マーカーであるＮａｎｏｇおよびＫＬＦ４の発現がＮｐａｓ２－／－ＭＳＣで高い状態で維持されたことを示す。 肥厚性瘢痕を示し、これは、過剰な量のコラーゲンの沈着（中央）および隆起した瘢痕（左）を特徴とし、高密度のコラーゲン繊維は、マッソントリクローム染色において強く青色に染色される。 概日リズムと創傷治癒の関係を示すが、これは、夜間に発生したヒトにおける熱傷が、昼間に発生したものより長い治療期間を要することを示した、全内容を本明細書に参照により組み込むＨｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．，２０１７を応用したものである。創傷治癒には、線維芽細胞（ＦＢ）の遊走が必要である。線維芽細胞の遊走を試験するために、Ｈｙｄｅらは、インビトロでの創傷治癒の一般的な方法であるインビトロでの擦傷モデルを使用した。皮膚のＦＢをプレート上で培養し、夜間または昼間にプレートに擦傷を与えた。示されるように、昼間に擦傷を受けたＦＢは、夜間に擦傷を受けたＦＢよりも速く遊走した。これは、速い遊走がより良好な治癒を意味することを示す。 時計分子であるＮｐａｓ２が、インプラントによる創傷治癒に重要な役割を果たすことを示す。小さなチタンインプラントをラットの大腿骨に外科的に配置した。４週間後、インプラント周囲組織の全ゲノムマイクロアレイを実施した。Ｎｐａｓ２は、インプラントによる創傷治癒の役割において最も重要な時計分子であることが明らかとなった。Ｎｐａｓ２ノックアウト変異体マウスを作製し、先行文献と同じ（それぞれ、参照により全体を本明細書に組み込むＭｅｎｇａｔｔｏ ｅｔ ａｌ，ＰｌｏｓＯｎｅ，２０１１、およびＭｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１９に記載される）方法でインプラント手術を実施した。野生型群では、インプラント周囲の高密度のコラーゲン組織が、骨の統合に有益である。驚くべきことに、Ｎｐａｓ２ノックアウトマウスは、高密度のコラーゲン線維組織を形成しなかった。高密度コラーゲン繊維は、肥厚性瘢痕の一般的な構造であることがわかった。Ｎｐａｓ２の抑制は「線維症」形成を減少させる、という仮説を立てた。 マウスにおけるＮｐａｓのノックアウト（ＫＯ）は、皮膚パンチ創傷治癒のマウスモデルにおいて、創傷治癒を改善し、瘢痕化を最小限に抑えることを示す（参照により全体を本明細書に組み込む、Ｓａｓａｋｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｔ Ｒｅｃ（Ｈｏｂｏｋｅｎ）．２０１９を参照）。 インビトロにおける、皮膚線維芽細胞に対するＮｐａｓ２の抑制効果を示す。インビトロ創傷治癒モデルとして知られる擦傷治癒およびコラーゲンゲル収縮アッセイを実施した。Ｎｐａｓ２ノックアウト線維芽細胞は、高い細胞遊走および収縮能力を示す。これらの結果は、Ｎｐａｓ２ ＫＯ皮膚線維芽細胞がインビトロモデルで創傷治癒を改善することを示す。 Ｎｐａｓ２抑制化合物を探索するためのプラットフォームを示す。まず、レポーター遺伝子を含むマウス皮膚線維芽細胞を作製し、ＦＤＡが承認した１，０００を超える化合物を使用するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を開始した。スクリーニング後、Ｎｐａｓ２を下方制御する１０個のヒット化合物を同定した。あるヒット化合物は、その毒性故にＮｐａｓ２を下方制御する。細胞生存率アッセイをＨＴＳと組み合わせて、偽陽性を排除することに成功し、上位５つのヒット化合物を得た。 Ｄｗｎ１がインビトロで線維芽細胞の遊走およびゲル収縮を促進することを示す。Ｄｗｎ１のインビトロでの創傷治癒能力を、前述の方法を使用して試験した。 Ｄｗｎ１が最小限の瘢痕で裂開した創傷の治癒を改善したことを示す。Ｄｗｎ１を使用してインビボでの創傷治癒を試験するために、中央に縫合糸を有する、１．５×１０ｍｍの皮膚裂開モデルを作成し、３つの群でデザインした。このモデルは、皮膚の創傷の臨床状態に類似する。皮膚を縫合のみした場合では、目視できる創傷治癒効果はなかった。臨床観察において、縫合糸および１０％ＤＭＳＯのビヒクルの対照は、縫合糸のみの場合よりも明らかに創傷治癒が優れていた。ビヒクルの水分が創傷治癒を改善する可能性があるとの仮説も立て得る。第３の群では、１０％ＤＭＳＯ中のＤｗｎ１が、上記の他の２つの群と比較し、最良の創傷治癒を示した。 Ｄｗｎ１が最小限の瘢痕で裂開した創傷の治癒を改善したことを示す。マッソントリクローム染色を使用して、コラーゲン沈着を青色に染色した。肉芽組織だけでなく、末梢の創傷にも濃い青色のコラーゲン沈着が見られた。１０％ＤＭＳＯを用いたビヒクル対照の組織学的染色は、対照と同様であった。濃いコラーゲン沈着が観察された。対照的に、１０％ＤＭＳＯ中のＤｗｎ１は、コラーゲン沈着の領域が非常に小さかった。これらの結果は、Ｄｗｎ１が最小限の瘢痕で裂開した創傷の治癒を改善したことを示した。 細胞内の概日リズムが、塩基性ヘリックスループヘリックスであるＢＭＡＬ１、ＣＬＯＣＫ、Ｎｐａｓ２、ならびに抑制遺伝子であるＰｅｒまたはＣｒｙ遺伝子など、様々な時計遺伝子の転写－翻訳フィードバックループによって制御されることを示す（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｃｉ Ｒｅｐ ８：１１９９６，２０１８、およびＭｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１９を参照）。現在まで、これらのコア概日遺伝子は治療標的として研究されてきた。しかしながら、ＢＭＡＬ１またはＣＬＯＣＫ欠損マウスは、異常な表現型またはいくつかの重大な現象を示す。一方、Ｎｐａｓ２欠損マウスでは重大な表現型は報告されていない。したがって、Ｎｐａｓ２はより安全な分子標的である。 レセルピン（Ｒｅｓ）の作用機序を示す。Ｒｅｓは、主にニューロンで発現するベシクルモノアミン輸送体（ＶＭＡＴ）をブロックする（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ：Ａｄｕｌｔ ａｎｄ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ２０１６，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔを参照）。ニューロンのＶＭＡＴのブロックは、シナプス小胞におけるノルエピネフリン、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミンなどのモノアミン神経伝達物質の取り込みを阻害する。モノアミン神経伝達物質と、概日時計、モノアミンオキシダーゼＡ（モノアミンのバランスを維持する）の転写との関係は、時計遺伝子 ＢＭＡＬ１およびＮｐａｓ２およびＰｅｒ２によって調節されている。Ｐｅｒ２変異体マウスは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨａｍｐｐ Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８に記載されるように、モノアミンオキシダーゼＡの活性の低下を示す。これは、概日時計が神経伝達物質を調節することを示す。 レセルピン（Ｒｅｓ）の仮定されたメカニズムと、セロトニンが線維芽細胞機能を上方制御できることと、を示す。（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷａｎｇ Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＰｌｏＳ ＯＮＥ，２０１３を参照）。皮膚におけるレセルピンの作用機序は未だ解明されていないが、レセルピンはＶＭＡＴと同様に神経外モノアミン輸送体（ＥＭＴ）を阻害すると仮定されている。ＲｅｓがＥＭＴをブロックすると、セロトニンなどのモノアミンが細胞外環境に蓄積する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳａｄｉｑ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０１８による以前の研究では、セロトニンの増加が線維芽細胞機能を上方制御できることが示されている。したがって、レセルピンによるＥＭＴのブロックは、線維芽細胞（ＦＢ）の機能および創傷治癒を促進すると理論づけられている。 マウス背部皮膚の直線状の創傷／瘢痕モデルを示す。図３３Ａは、試験で使用した動物モデルの概略図である。左右両側の縦傷（１０×１．５ｍｍ）を、両刃メスにより与えた。創傷の中心を、５－０ナイロン縫合糸を用いて１回の結紮を行った。図３３Ｂは、創傷／瘢痕のグロスイメージを使用して術後７日目まで毎日スコアリングした視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）を示す。図３３Ｃは、定規を使用した創傷／瘢痕の術後のグロスイメージを示す。定規の単位はｍｍである。図３３Ｄは、術後７日目の創傷／瘢痕の中心（左）および側方（右）の組織学的画像を示す。上の２つはヘマトキシリン－エオジン（ＨＥ）で染色した。下の２つはマッソントリクローム（ＭＴ）で染色した。黄色の点線は肉芽組織を示す。スケールバーは１０００μｍである。図３３Ｅは、ＨＥ染色スライスを使用して評価した瘢痕指数を示す。図３３Ｆは、ＭＴ染色スライスを使用して評価した線維組織の面積％を示す。＊はｐ＜０．０５を示す。 インビトロにおける、皮膚線維芽細胞に対するＮｐａｓ２抑制の候補化合物Ｄｗｎ１の選抜および評価を示す。図３４Ａは、ＵＣＬＡのＭＳＳＲにおける、ＦＤＡ承認の化合物ライブラリを使用したインビトロでのハイスループット薬物スクリーニングアッセイの散布図を示す。負のＮｐａｓ２のＺスコアの高い絶対値は、Ｎｐａｓ２の発現が高度に下方制御されたことを示す（Ｘ軸）。高い細胞生存率のＺスコアは、線維芽細胞が高い生存率（Ｙ軸）であったことを示す。候補化合物（Ｄｗｎ１）は、負のＮｐａｓ２のＺスコアの絶対値および生存率の高い順に選抜した。図３４Ｂは、対照と比較した、Ｄｗｎ１（１μＭまたは１０μＭ）で処理されたマウス皮膚線維芽細胞における概日Ｎｐａｓ２発現の評価を示す。図３４Ｃは、Ｄｗｎ１で処理されたマウス皮膚線維芽細胞の細胞遊走の評価を示す。＊はｐ＜０．０５を示す。 マウス皮膚線維芽細胞における、コラーゲン合成に対するＤｗｎ１の及ぼすインビトロでの影響を示す。図３５Ａは、Ｄｗｎ１処理後７日目のマウス皮膚線維芽細胞のピクロシリウスレッド染色を示す。ＡＡ：ｌ－アスコルビン酸。ＯＤ：光学密度。ＣＴＲＬ：ＡＡを含まない対照培地で処理された細胞。図３５Ｂは、Ｄｗｎ１処理後３日目および７日目のコラーゲン（Ｃｏｌ）タイプ１ａ１、１ａ２、３ａ１、１４ａ１の遺伝子発現を示す。＊はｐ＜０．０５を示す。 マウス背側の直線状の創傷／瘢痕モデルに対するＤｗｎ１の効果を示す。図３６Ａは、手術後および創傷へのＤｗｎ１の局所適用の開始後、０日目（Ｄ０）、２日目（Ｄ２）、５日目（Ｄ５）、７日目（Ｄ７）のグロスイメージを示す。Ｖｅｈ：ビヒクル。ビヒクルまたはＤｗｎ１＋ビヒクルを術後２４時間ごとに適用した。図３６Ｂは、ビヒクルまたはビヒクル＋Ｄｗｎ１を適用した創傷の視覚的アナログスコアスケールを示す。図３６Ｃは、術後７日目にビヒクルまたはビヒクル＋Ｄｗｎ１を適用した側部の創傷／瘢痕の組織学的画像を示す。黄色の点線は肉芽組織を示す。左の２つはＨＥで染色し、右の２つはＭＴで染色した。スケールバーは１０００μｍである。図３６Ｄは、ＨＥ染色スライスを使用した瘢痕指数の評価を示す。図３６Ｅは、ＭＴ染色スライスを使用して評価した線維組織の面積％を示す。＊はｐ＜０．０５を示す。 マウスの背側の直線状の創傷／瘢痕モデルに対するＤｗｎ１の分子生物学的効果を示す。図３７Ａは、典型的なレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）画像を示す。スライドは、ＬＣＭの前にヘマトキシリンおよびエオシンで短時間染色した。Ｇ：肉芽組織、Ｗ：創傷組織。図３７Ｂは、肉芽組織（Ｇ）および創傷組織（Ｗ）における、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１）、Ｃｏｌ１４ａ１、Ｔｇｆβ１およびＡｃｔａ２の遺伝子発現を示す。Ｇａｐｄｈは内部対照として使用した。＊はｐ＜０．０５を示す。図３７Ｃは、ビヒクルまたはビヒクル＋Ｄｗｎ１を適用した創傷における、術後７日目のインビボでのαＳＭＡの免疫組織化学的染色を示す。黄色の点線は肉芽組織を示す。スケールバーは１００μｍである。
以下の詳細な説明において、本発明の完全な理解を提供するために、数々の具体的な詳細が明記される。しかしながら、本発明がこれらの具体的な詳細を伴わずに実行されてもよいということが、当業者によって理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしないように、周知の方法、手順、および構成要素は、詳細に記載されていない。
歯槽骨の喪失は、ヒトおよびコンパニオンアニマルにおける歯周炎の進行を特徴付けるものである。歯槽骨の頂上の高さは、健康な被験者のセメントエナメル接合部（ＣＥＪ）の約２ｍｍ下にある。歯槽骨の頂上は、歯周炎の病理学的な発達の際に骨吸収を受ける。中等度および重度の歯周炎の症状は、Ｘ線写真による、歯根の長さ、つまり根端からＣＥＪまでの２５％～５０％および５０％以上の歯槽骨の喪失として定義される。従来の治療では、喪失した歯槽骨が再生されないため、臨床的選択肢として抜歯を行うことがしばしばであった。
喪失した歯槽骨を予測通りに再生できる治療オプションは、依然として主要な臨床的ニーズである。骨の再生および組換え成長因子の臨床応用のために、骨芽細胞の増殖および分化の治療的刺激が研究されてきた。成長因子療法の生物学的根拠は、胚発生のプロセスにある。例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路分子のマウスノックアウト変異は、自発的骨折や骨折修復障害などの顕著な骨格欠損をもたらした。成体組織の再生は、少なくとも部分的に、胚発生プロセスを繰り返すため、成長因子の適用は、歯周欠損における骨再生に必要なシグナル伝達経路を誘導し、ソケット保存として知られる、抽出ソケットにおける骨形成を誘導すると考えられている。
現在の骨再生治療は、ペプチド生物学的製剤および成長因子、すなわち、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）（アメロゲニンを含むブタエナメルマトリックス誘導体製品）、Ｉｎｆｕｓｅ（登録商標）（組換えヒトＢＭＰ－２）、ＧＥＭ２１Ｓ（登録商標）（組換えヒト血小板由来成長因子－ｂｂ）、線維芽細胞成長因子－塩基性１５４（組換えヒト線維芽細胞成長因子－２）、Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）（テリパラチド、組換えヒトＮ末端副甲状腺ホルモン）、ｒｈＧＤＦ－５（組換えヒト成長分化因子－５、ＢＭＰ－１４、フェーズＩ／ＩＩ完了）を利用するものである。
過去数十年間で、組換えペプチド治療薬は、医療／歯科診療において重要な役割を果たし、６０を超えるペプチド薬が米国およびその他の主要な市場で承認されている。ＦＤＡは、組換えペプチド製品の安全性モニタリングに関する特定のガイドラインを公開しており、これは、アナフィラキシー反応に関連する有害事象の厳格なモニタリングが含まれていなければならない。内因性タンパク質の配列を共有する組換えヒトペプチドに対して抗体が生成される場合、それらは潜在的に深刻な自己免疫反応を引き起こす可能性がある。予期しない安全性の問題は、組換えペプチド治療への重大な課題である。２００８年、ＦＤＡは、過度の炎症のリスクの存在を理由に、ＢＭＰ－２に対してブラックボックス警告を発行した。追加の安全性モニタリングは、医薬品開発の時間およびコストに影響を与える可能性がある。歯科再生治療のための組換えペプチド製品は現在、高コストおよび潜在的な副作用の存在から、患者への歯科治療の提供を妨げる重大な要因となっている。
概日リズム（概日時計としても知られている）は、哺乳類細胞における２４時間リズムの内因性の自立的かつ細胞自律的な周期として知られており、広範囲の生理学的恒常性機能に関与しており、このリズムの崩壊は、心血管疾患、糖尿病、代謝および睡眠障害、不妊症、創傷治癒障害などの慢性疾患をもたらす。従来の研究では、ヒトの火傷のデータベースによると、夜間（休息期間）に負傷した傷が日中（活動期間）に獲得した傷よりも治癒が遅いことを報告している。これらの結果は、概日リズムが皮膚の創傷治癒にどのように寄与するかについてのメカニズムがまだ不明ではあるものの、創傷治癒における概日リズムの調節的役割を示唆している。
概日時計は、成体動物の生理的組織再生を調節することが報告されている。概日時計（リズム）は、概日ペースメーカーである、視床下部の視交叉上核（ＳＣＮ）によって、中脳において厳密に維持されている。時計分子である、Ｃｌｏｃｋ、Ｎｐａｓ２、およびＢｍａｌ１転写因子は、ＰｅｒおよびＣｒｙ遺伝子の発現を誘導し、そのタンパク質産物は、Ｃｌｏｃｋ、Ｎｐａｓ２、およびＢｍａｌ１の転写活性を阻害する。コア概日時計（ＳＣＮのフィードフォワード／バック系）に加えて、骨、肝臓、皮膚、心臓などの末梢組織は、独自の概日時計（時計分子の発現など）を維持する。マウス頭蓋冠骨器官の培養では、概日周期での骨ミネラル沈着が示された。マウス頭蓋冠のマイクロアレイ分析の結果、骨の末梢概日リズムの存在と、すべての遺伝子の約３０％の毎日の発現が、２４時間周期に従っていることが明らかとなった（時計制御遺伝子（ＣＣＧ）としても知られる）。末梢の概日時計は、皮膚の創傷および骨折の治癒において調節的役割を果たすことが示されている。
概日リズムコアレギュレーターの１つであるニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（Ｎｐａｓ２）は、転写因子の塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂＨＬＨ）－ＰＡＳファミリーのメンバーであり、概日ロコモーターサイクルｋａｐｕｔ（ＣＬＯＣＫ）のパラログである。Ｎｐａｓ２またはＣＬＯＣＫは、脳および筋肉のＡｒｎｔ様タンパク質－１（ＢＭＡＬ１）と二量体化し、他の２つの概日遺伝子クラスターの遺伝子であるピリオド（ＰＥＲ）およびクリプトクロム（ＣＲＹ）の転写を調節する。次に、ＰＥＲおよびＣＲＹは、転写／翻訳フィードバックループ系によって、ＮＡＰＳ２、ＣＬＯＣＫ、およびＢＭＡＬ１の発現を抑制する。従来の研究では、Ｎｐａｓ２の発現は哺乳類の前脳および中脳で行われるが、ＳＣＮでは行われないことが明らかになっている。しかしながら、Ｎｐａｓ２の明確な発現が、心臓、肝臓、血管系、皮膚などの末梢組織で報告されている。
マウスの皮膚線維芽細胞はＮｐａｓ２を発現することが報告されており、これはＣｌｏｃｋ発現の欠如を補う可能性がある。Ｎｐａｓ２は、マイクロアレイ分析により、老化したヒトの皮膚で有意に上方制御された遺伝子の中で同定された。まとめると、本発明者らは、皮膚線維芽細胞中のＮｐａｓ２が恒常性の維持において重要な役割を果たし、したがって、Ｎｐａｓ２が皮膚創傷治癒における重要な要因であると、仮定した。実施例に記載されるように、本発明の課題は、Ｎｐａｓ２ノックアウトマウスを使用してこの仮説に取り組むことである。
最近、肝臓におけるＮｐａｓ２の異所性上方制御が線維症の形成に関連することがわかった。Ｎｐａｓ２はＣｌｏｃｋのオルソログ分子であり、Ｃｌｏｃｋがない場合、Ｎｐａｓ２は線維芽細胞の末梢時計機能を代替する。したがって、Ｃｌｏｃｋノックアウトマウスの末梢組織における線維症の形成には、置き換えられたＮｐａｓ２の病理学的メカニズムが寄与している可能性がある。最近、Ｎｐａｓ２ノックアウト（ＫＯ）マウスが、最小限の線維症ではるかに速い皮膚創傷治癒を示したことが報告された。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明に係る当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
本発明は、歯槽骨の再生治療のための概日時計分子を標的とする小分子化合物の適用に関する。概日を同期させることで、多くの分子的、生理学的、生物学的プロセスが調節される。概日リズムの調節不全は、神経精神病のみならず、代謝性疾患やがんにおいても報告されている。例えば、悪性胸膜中皮腫およびアルツハイマー病の場合にはＢｍａｌ１など、概日時計分子が治療標的になり得ることを示唆する報告が増えている。概日システムを調節する小分子による治療可能性が、「時間療法」の新しいアプローチとして提案されている。本発明はまた、歯槽骨再生を含むがこれに限定されない、効果的で安全かつ手頃な価格の歯組織再生のための小分子ベースの時間療法を、それを必要とする患者に対して提供するものである。
時間療法における主要な課題の１つは、標的となる時計分子を選択することである。すべてではないが、ほとんどの細胞が、概日時計メカニズムを有するため、治療的調節は広範囲の副作用を引き起こす可能性がある。例えば、Ｂｍａｌ１またはＣｌｏｃｋのＫＯ変異は、末梢骨組織に様々な病理学的表現型を生じさせ、また早期老化症状（サルコペニア、白内障、臓器収縮）を生じさせる。対照的に、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異は、顎骨、椎骨、四肢骨の胚発生上の病理をもたらさなかった。ＳＣＮにおけるＮｐａｓ２発現のレベルは低く、中心的な概日リズムにはほとんど寄与していない。代わりに、Ｎｐａｓ２発現の増加は、病状下の末梢組織に現れる。それぞれを参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｍｅｎｇａｔｔｏ ＣＭ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（１）：ｅ１５８４８、およびＨａｓｓａｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７；１２（８）：ｅ０１８３３５９に記載されるように、骨組織およびＭＳＣにおけるＮｐａｓ２の発現は、それぞれインビボおよびインビトロでチタン（Ｔｉ）生体材料に曝露された場合に有意に増加した。 末梢組織におけるＮｐａｓ２の発現は、創傷を含む環境中の何らかの要因によって刺激された「アドホック」塩基によって誘導される可能性がある。定量的な遺伝子共発現解析の結果、参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｈａｓｓａｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７；１２（８）：ｅ０１８３３５９によって説明されるように、Ｎｐａｓ２が他の概日時計遺伝子とともに調節されないことが示されている。Ｎｐａｓ２ ＫＯ ＭＳＣは、参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｍｏｒｉｎａｇａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１８；１９２：６２－７４によって説明されるように、他のコア時計遺伝子の正常な発現を維持していた。
本発明では、時計遺伝子ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（Ｎｐａｓ２）の発現を抑制する薬剤（別名、Ｎｐａｓ２発現抑制剤、Ｎｐａｓ２抑制剤）を用いて創傷を治癒するための方法、具体的には、対象の開いた創傷部位および／または骨喪失部位に対して、Ｎｐａｓ２発現抑制剤を投与することを含む、創傷の修復および治癒を改善および／または加速するための、骨喪失部位で歯槽骨を再生するための、創傷部位で結合組織を再生するための、および創傷領域のサイズを減少させるための方法を提供する。投与されるＮｐａｓ２の発現を抑制する治療剤（複数可）は、化合物、Ｎｐａｓ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とするよう設計された合成低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、またはそれらの組み合わせであり得る。
本願の発明者らは、Ｎｐａｓ２発現抑制剤が、創傷または慢性炎症を起こした結合組織を再生し、上皮（皮膚）の創傷および歯周組織の創傷を再生し、骨喪失部位での歯槽骨再生を促進することを見出した。
一態様では、本発明は、対象の創傷治癒を改善または促進するための方法であって、時計遺伝子の発現を抑制する薬剤を、それを必要とする対象の創傷に投与することを含み、時計遺伝子がニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（Ｎｐａｓ２）である、方法を提供する。
一実施形態では、投与は、局所投与、経皮投与および／または皮下投与から選択される経路による。別の実施形態では、創傷は皮膚創傷である。いくつかの実施形態では、皮膚創傷は歯周における創傷である。特定の実施形態では、歯周における創傷は、歯肉結合組織の変性または歯槽骨の吸収を含む。特定の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、細胞遊走アッセイにおいてヒト皮膚線維芽細胞の遊走を加速する。
いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤である薬剤は、ノルエピネフリン、ドーパミンおよびセロトニン取り込み阻害剤、酸化的リン酸化阻害剤、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、または中枢神経系（ＣＮＳ）刺激剤から選択される。
特定の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、モノアミン神経伝達物質であるノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、ドーパミンおよびセロトニンのシナプス前貯蔵ベシクルへの取り込みを阻害する、アドレナリン作動性取り込み阻害剤である。一実施形態では、ノルエピネフリン、ドーパミンおよびセロトニンの取り込み阻害剤は、カテコールアミン枯渇性交感神経ブロック薬であるレセルピンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000002
レセルピンは、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅおよび他のＲａｕｗｏｌｆｉａ種に由来し、参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｗｏｏｄｗａｒｄ Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５６ ７８，２０２３およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９５８，２，１に記載の方法により合成され、または、例えば近年Ｓｔｏｒｃｋ，Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，１６２５５－１６２６２に記載されたような方法により合成される。レセルピンは、Ｈ＋共役ベシクルモノアミン輸送体であるＶＭＡＴ１およびＶＭＡＴ２を不可逆的にブロックする。レセルピンによる、ニューロンで発現するＶＭＡＴ２のブロックは、モノアミン神経伝達物質であるノルエピネフリン、ドーパミン、セロトニン、およびヒスタミンのニューロンのシナプス前ベシクルへの取り込みを阻害し、貯蔵を減少させる。レセルピンは従来、降圧剤、抗精神病剤、精神安定剤として使用されてきた。
追加の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、レシンナミン、ベンゾイルレセルピン、３－メトキシベンゾイルレセルピン、４－メトキシベンゾイルレセルピン、３，４－ジメトキシベンゾイルレセルピン、３，５－ジメトキシベンゾジルレセルピン、メチレンジオキシレセルピン、シンナモイルレセルピン、デセルピジン、メチルレセルピン酸、シロシンゴピンおよびエボジアミン、の、レセルピン誘導体および類似体のうちの１つである。
レシンナミンはまた、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅおよび他のＲａｕｗｏｌｆｉａ種から得られ、降圧剤として使用される。レシンナミンの薬学的特性は、鎮静および降圧効果など、レセルピンの薬学的特性と類似している。一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤はレシンナミンであり、これは以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000003
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、ベンゾイルレセルピンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000004
さらなる実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、３－メトキシベンゾイルレセルピンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000005
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、４－メトキシベンゾイルレセルピンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000006
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、３，４－ジメトキシベンゾイルレセルピンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000007
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、３，５－ジメトキシベンゾジルレセルピンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000008
さらに別の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、メチレンジオキシレセルピンであり、以下の化学構造を有する：
Figure 2022547271000009
 。
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、シンナモイルレセルピンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000010
デセルピジンはまた、交感神経ブロック薬であり、すなわち交感神経系を阻害する、降圧、鎮静および抗精神病的な特性を有し、またデセルピジンは、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ Ｌ．およびＡｐｏｃｙａｎａｃｅａｅに由来するが、それはレセルピンから合成することもできる。特定の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、デセルピジンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000011
いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、メチルレゼルペートであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000012
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、シロシンゴピンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000013
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、エボジアミンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000014
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、テトラベナジンであり、それはレセルピンに類似する薬剤である。テトラベナジンは、ドーパミン、セロトニン、ノルエピネフリン、およびヒスタミンをシナプス小胞に輸送するＶＭＡＴ２を可逆的に阻害し、モノアミンの取り込みを減少させ、モノアミン貯蔵を枯渇させ、またテトラベナジンは、シナプス前ニューロンのベシクルへのモノアミンの取り込みを可逆的に阻害することにより、モノアミン、特にドーパミンを可逆的に枯渇させる。テトラベナジンは抗精神病剤として使用されており、現在、様々な運動亢進障害、ハンチントン病に関連する舞踏病、および抗精神病剤の副作用である遅発性ジスキネジアなどの運動障害の徴候の治療に使用されている。テトラベナジンの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000015
いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、テトラベナジンエナンチオマー、またはジヒドロテトラベナジンの８つの立体異性体のうちの１つであり、これらもまたＶＭＡＴ２阻害剤であり、その調製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＹａｏ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１１ Ｍａｙ；４６（５）：１８４１－８に記載されている。
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、６つの水素原子が重水素原子で置き換えられたテトラベナジンの同位体異性体であるデュテトラベナジン（ｄｅｕｔｅｔｒａｂｅｎａｚｉｎｅ）である。デュテトラベナジンの化学構造は以下のとおりである：
Figure 2022547271000016
デュテトラベナジンはまた、ベシクルモノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）を阻害し、ハンチントン病および遅発性ジスキネジアに関連する舞踏病の治療に使用される。
追加の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、酸化的リン酸化阻害剤であるクロルプロマジンである。クロルプロマジンは酸化的リン酸化を阻害するが、ノルエピネフリンおよびセロトニンのレベルを低下させない。クロルプロマジンは、レセルピンとは構造的に無関係であり、次の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000017
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、クロルプロマジン類似体であるブロモプロマジン（ブロモプロマジン塩酸塩）であり、以下の化学構造を有する：
Figure 2022547271000018
クロルプロマジンに類似する１，４－チアジン含有薬としては、プロメタジン、トリメプラジン、プロクロルペラジン、トリフルオペラジン、メトトリメプラジン、およびチオプロペラジンが挙げられ、それぞれの化学構造は以下の（１）～（６）のとおりである。：
Figure 2022547271000019
Figure 2022547271000020
いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、アンチマイシンＡ、ニフルム酸、モリンドン塩酸塩およびメフェキサミド塩酸塩である。
特定の実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、アンチマイシンＡであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000021
アンチマイシンＡはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属菌によって産生される。アンチマイシンＡは酸化的リン酸化の阻害剤であり、シトクロムｃを阻害することによって電子伝達系を破壊し、それによってＡＴＰ産生を停止させる。アンチマイシンＡは、殺虫剤や魚毒として漁業および水産養殖で使用され、小さく敏感な魚種を殺すことでナマズの生産を促進する。アンチマイシンＡ１としても知られるアンチマイシンＡは、抗真菌剤、殺虫剤、ダニ駆除剤としても使用される。
一実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、アンチマイシンＡ２であり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000022
いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤はアンチマイシンＡの誘導体または類似体であり、例えば、ＵＳ２００５／０２３９８７３（特に、２－メトキシアンチマイシンＡ誘導体）、Ｂａｔｒａ，Ｐ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２４６，Ｎｏ．２３，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １０，ｐｐ．７１２５－７１３０，１９７１（特に、アンチマイシンＡのジ－およびトリ－アセテート）、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１６，１８，２３９５－２３９８（特に、アシル化されたアンチマイシンＡ誘導体）、Ａｂｉｄｉ，Ｓ．Ｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４６４（１９８９）４５３－４５８（特に、アンチマイシンＡのホモログまたはアンチマイシンＡのメチルもしくはダンシル誘導体）、およびＡｂｉｄｉ，ＳＬ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４４７（１９８８）６５－７９（特に、アンチマイシンＡのサブコンポーネント、すなわちＡ１ａ、Ａ１ｂ、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ａ３ａ、Ａ３ｂ、Ａ４ａ、およびＡ４ｂ、ならびにアンチマイシンＡ１ａ、Ａ１ｂ、Ａ２ａ、Ａ２ｂのダンシル化またはメチル化誘導体、Ａ３ａ、Ａ３ｂ、Ａ４ａ、および／またはＡ４ｂ）が挙げられ、これら文献は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、アンチマイシンＡ３（ブラストマイシンおよびブラストマイシンとしても知られている）であり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000023
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、アンチマイシンＡ４であり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000024
一実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤はニフルミン酸であり、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤であるニフルム酸は、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000025
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、ニフルム酸のプロドラッグであるタルニフルメートであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000026
一実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤である薬剤は、抗精神病剤である塩酸モリンドンであり、塩酸モリンドンはドーパミンＤ２／Ｄ５受容体アンタゴニストであり、以下の化学構造を有する：
Figure 2022547271000027
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤である薬剤は、非定型抗精神病剤である塩酸モリンドンのリジッドな類似体であるピキンドン（塩酸ピキンドン）であり、それは選択的Ｄ２受容体アンタゴニストであり、以下の化学構造を有する：
Figure 2022547271000028
追加の実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、中枢神経系刺激作用を有する精神療法剤である塩酸メフェキサミド（メフェキサミド）であり、以下の化学構造を有する：
Figure 2022547271000029
様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、硝酸エコナゾール、アセクロフェナク、プラバスタチン、チロキサポール、イソソルビド一硝酸塩、ＭＳ－１５００３８７、（Ｓ）－（－）－アテノロール、塩酸ブテナフィン、塩酸アセクリジン、硫酸アトロピン一水和物、トリメタジオン、クロルフェンシン（Ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｓｉｎ）カルバメート、塩酸マフェニド、ニフェナゾン、塩酸アルチカイン、テオブロミン、ニフロキサジド、ＳＡＭ００１２４６６２６、ドロプロピジン（Ｒ、Ｓ）、クエン酸ジエチルカルバマジン、ＭＳ－１５０１２１４、メシル酸ドラセトロン、エストロン、プレドニゾロン、塩酸ダウノルビシン、シクロヘキシミド、およびモネンシンナトリウム塩から選択される。
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）薬であり、ジクロフェナクの類似体であるアセクロフェナクである。アセクロフェナクは、抗炎症作用および鎮痛作用を有し、関節リウマチ、変形性関節症、関節リウマチ、強直性脊椎炎の治療に使用される。アセクロフェナクはシクロオキシゲナーゼ酵素（ＣＯＸ）を阻害する。アセクロフェナクの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000030
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤であり、血漿コレステロールおよびリポタンパク質レベルを低下させるための抗コレステロール血症剤として使用される、プラバスタチンである。プラバスタチンの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000031
いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、アルキルアリールポリエーテルアルコールタイプの非イオン性液体ポリマーであるチロキサポールである。チロキサポールは、気管支・肺の試験において、粘液分泌物の液化および除去に使用される非イオン性界面活性剤として使用される。チロキサポールはまた、用量および時間依存的に細胞毒性を生じさせ、アポトーシスを誘導することが示されている。チロキサポールの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000032
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、イソソルビド一硝酸塩であり、これは、血管拡張活性を有する有機硝酸塩であるイソソルビドの一硝酸塩形態であり、またイソソルビド一硝酸塩は、狭心症や心不全を治療するための冠状動脈血管拡張剤として使用され、びまん性食道けいれんの治療にも使用されている。イソソルビド一硝酸塩の化学構造は以下のとおりである：
Figure 2022547271000033
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤はＭＳ－１５００３８７であり、これはまたメルカプトプリン、６－メルカプトプリン、６－ＭＰおよびＳＰＥＣＴＲＵＭ１５００３８７とも呼ばれ、これは、プリン代謝拮抗剤、具体的には、抗腫瘍剤、すなわち、急性リンパ性白血病および慢性リンパ性白血病などの白血病を治療するための抗がん剤として使用され、ならびに、潰瘍性大腸炎などの自己免疫性疾患を治療するための免疫抑制剤としても使用される、チオプリン誘導体代謝拮抗剤である。メルカプトプリンの化学構造は以下のとおりである：
Figure 2022547271000034
特定の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、（Ｓ）－（－）－アテノロール、すなわちアテノロールの（Ｓ）－エナンチオマーであり、エサテノロールおよび（Ｓ）－アテノロールとしても知られている。（Ｓ）－（－）－アテノロールは、βアドレナリンブロック薬であり、高血圧、狭心症を治療し、心臓発作後の生存率を改善するためのβブロック薬として使用される。（Ｓ）－（－）－アテノロールの化学構造は以下のとおりである：
Figure 2022547271000035
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、塩酸ブテナフィンであり、それは合成ベンジルアミンであるブテナフィンの塩酸塩形態であり、また塩酸ブテナフィンは抗真菌性化合物である。塩酸ブテナフィンは、真菌細胞膜に必要なステロール形成に必要な酵素であるスクアレンエポキシダーゼを阻害することにより、真菌細胞膜の重要な成分であるエルゴステロールの生合成を妨害する。塩酸ブテナフィンの化学構造は以下のとおりである：
Figure 2022547271000036
追加の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、非選択的ムスカリン性アセチルコリン受容体部分アゴニストである、グラウコスタット（登録商標）としても知られる塩酸アセクリジンである。塩酸アセクリジンは、狭角緑内障の治療に使用される。塩酸アセクリジンの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000037
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、アトロピンの硫酸塩である硫酸アトロピン一水和物であり、それは植物Ａｔｒｏｐａ ｂｅｌｌａｄｏｎａ Ｌ．、Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ Ｌ．、およびＳｏｌａｎａｃｅａｅ科の他の植物から単離される天然アルカロイドである。アトロピンは、ムスカリン性コリン作動性受容体の交感神経性の競合的アンタゴニストとして機能する。硫酸アトロピン一水和物は、コリン作動性受容体アンタゴニストである。硫酸アトロピン一水和物は、鎮痙剤としても作用するが、中枢神経系（ＣＮＳ）に対しては検出可能な効果を示さない。硫酸アトロピン一水和物は、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000038
いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、トリメタジオンであり、これは、うまく機能しなかった他の薬剤を使用した患者のてんかん症状を治療するために使用される抗けいれん薬であり、トリメタジオンの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000039
様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、筋けいれんを治療するために使用される中枢作用性骨格筋弛緩薬であるクロルフェンシンカルバメートであり、クロルフェンシンカルバメートの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000040
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、塩酸マフェニドであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000041
塩酸マフェニドは、酵素であるカルボニックアンヒドラーゼを阻害するスルホンアミド薬剤であり、塩酸マフェニドは、特に火傷の治療における局所抗生物質として使用される。
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、塩酸アーティカインであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000042
アーティカインの塩酸塩形態である塩酸アーティカインは、アミド型の局所麻酔薬であり、通常、血管収縮薬であるエピネフリンと組み合わせて、軽度の手術における痛みを和らげるために使用される。
一実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤はニフェナゾンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000043
ニフェナゾンは非ステロイド性抗炎症剤であり、鎮痛、解熱、血小板阻害の治療作用も有する。
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤はテオブロミンであり、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000044
テオブロミン（３，７－ジメチルキサンチン）は、カカオ植物に由来するプリンアルカロイドであり、またテオブロミンは、アデノシン受容体アンタゴニストであり、気管支拡張薬および血管拡張薬として使用される。テオブロミンは利尿剤および心臓刺激剤としても使用される。
追加の実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、テオブロミンと構造的および薬学的に類似する化合物である。一実施形態では、テオブロミン関連化合物はテオフィリンであり、以下の化学構造を有する：
Figure 2022547271000045
別の実施形態では、テオブロミン関連化合物はカフェインであり、以下の化学構造を有する：
Figure 2022547271000046
一実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、ヒトの下痢および大腸炎を治療するための腸内抗菌剤として使用される抗生物質のニフロキサジドであり、ニフロキサジドの化学構造は以下のとおりである：
Figure 2022547271000047
いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤はＳＡＭ００１２４６６２６であり、塩酸アトモキセチンとしても知られ、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000048
塩酸アトモキセチンはノルエピネフリン再取り込み阻害剤であり、シナプス前のノルエピネフリン輸送体を阻害し、シナプス前のノルエピネフリンの再吸収を阻害し、シナプス間隙におけるノルエピネフリン活性を遅延させることから、塩酸アトモキセチンは、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）の治療に使用される。
一実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、咳抑制剤である、ドロプロピジンまたはジプロピジンとしても知られているドロプロピジン（Ｒ，Ｓ）であり、ドロプロピジンの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000049
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、フィラリア症を治療するために使用される駆虫薬であるクエン酸ジエチルカルバマジンであり、クエン酸ジエチルカルバマジンの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000050
さらなる実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、エナラプリルのマレイン酸塩形態である、マレイン酸エナラプリルとしても知られているＭＳ－１５０１２１４である。マレイン酸エナラプリルは、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤であり、高血圧、うっ血性心不全、糖尿病の腎疾患の治療に使用され、以下の化学構造を有する。：
Figure 2022547271000051
一実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、ドラセトロンメシレート、ドラセトロン（メシレート水和物）、およびドラセトロンとしても知られているメシル酸ドラセトロンである。メシル酸ドラセトロンは、制吐作用のある選択的セロトニン５－ＨＴ３受容体アンタゴニストであり、化学療法後の悪心および嘔吐の治療に使用される。メシル酸ドラセトロン水和物の化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000052
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、エストロン（ｏｅｓｔｒｏｎｅ）としても知られるエストロン（Ｅｓｔｒｏｎｅ）であり、これは、合成的に調製された、または天然に存在するステロイドエストロゲンであり、具体的にはエストロゲン受容体ＥＲ－αおよびＥＲ－βのアゴニストである。エストロンの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000053
追加の実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、抗炎症および免疫調節特性を有する合成糖質コルチコイドであるプレドニゾロンであり、またプレドニゾロンは、コルチコステロイドホルモン受容体アゴニストとして作用する。プレドニゾロンの化学構造は以下のとおりである。
Figure 2022547271000054
一実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、ダウノルビシンおよびダウノマイシンとしても知られる塩酸ダウノルビシンであり、それは白血病、リンパ腫および他のがんを治療するために使用される抗腫瘍活性を有する、アントラサイクリン抗生物質の塩酸塩である。塩酸ダウノルビシンの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000055
いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓによって産生される抗生剤および抗真菌剤であるシクロヘキシミドである。シクロヘキシミドの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000056
別の実施形態では、Ｎｐａｓ２発現抑制剤は、モネンシンナトリウムとしても知られるモネンシンナトリウム塩であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓによって産生される抗原虫剤である。モネンシンナトリウムの化学構造は以下のとおりである。：
Figure 2022547271000057
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、酸化的リン酸化阻害剤である。特定の実施形態では、酸化的リン酸化阻害剤は、アンチマイシンＡであり、以下の化学構造を有する。
Figure 2022547271000058
別の実施形態では、薬剤は、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤、ホルモンアゴニスト、一酸化窒素阻害剤、細胞内Ｃａ＋＋放出剤、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤、およびキナーゼ阻害剤からなる群から選択されるＮｐａｓ２下方制御化合物である。一実施形態では、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤は、ブレフェルジンＡ、コルヒチン、ポドフィロトキシン、または５１７５３４８である。別の実施形態では、ホルモンアゴニストはＡＣ－９３２５３ヨウ化物、一酸化窒素阻害剤はジフェニレンヨードニウムクロリド、細胞内Ｃａ＋＋放出剤はタプシガルギン、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤はＰＤ－１６６２８５水和物、キナーゼ阻害剤はＰＤ－１７３９５２である。
特定の実施形態では、経皮投与は、薬剤をカプセル化する変形可能なナノスケールベシクルの創傷への適用である。一実施形態では、経皮投与は、薬剤でコーティングされたマイクロニードル、組み込まれた薬剤を内部に有する固体ポリマーマトリックス、薬剤を貯蔵するリザーバと半透膜とを備える経皮パッチ、溶解した薬剤を内部に含む経皮ゲル、および溶解した薬剤を内部に含む経皮スプレー、および溶解した薬剤を内部に含む定量的経皮スプレー、からなる群から選択される経皮送達系の創傷への適用である。
特定の実施形態では、薬剤は、Ｎｐａｓ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とするよう設計された合成低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、マイクロニードルアレイ、エレクトロポレーション、圧力、機械的マッサージ、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー媒介送達系、超音波、コンジュゲート送達系、マイクロバブル、リポソームバブル、超音波感受性ナノバブル、カーボンナノチューブ、脂質ベースのナノベクター、非脂質有機ベースのナノベクターおよび無機ナノベクター、金ナノ粒子、ならびに金ナノロッド、からなる群から選択される経路によって投与される。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡは、リボース糖環の２’位、リン酸骨格、核酸塩基およびリボース糖、５’末端の修飾またはコンジュゲーションにおいて化学的に修飾されている。一実施形態では、リボース糖環はグアノシンまたはウリジンであり、２’位の修飾は２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）からなる群から選択される。別の実施形態では、リン酸骨格は、ホスホロジチオエート、トリアゾール二量体、アミドまたはボラノホスフェートで修飾されている。いくつかの実施形態では、核酸塩基およびリボース糖修飾は、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）、２’－Ｏ－メチルホスホロジチオエート（２’Ｏ－ＭｅＰＳ２）、親油性ホウ素クラスター、３－Ｎ－［（１，１２－ジカルバ－クロソ－ドデカカルボラン－１－イル）プロパン－３－イル］チミジン（Ｃ２Ｂ１０Ｈ１１、ＣＢ）、チミジンおよび５－ビス（アミノエチル）－アミノエチル－２’－デオキシウリジンである。特定の実施形態では、５’末端修飾またはコンジュゲーションは、ｓｉＲＮＡの５’末端でのパルミチン酸コンジュゲーション、ｓｉＲＮＡの３’末端への逆チミジン（ｉｄＴ）カップリング、および５’末端でのトパルミチン酸（ｔｏｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）とのｓｉＲＮＡのコンジュゲーション、フェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、およびピレニル誘導体からなる群から選択される芳香族化合物とのｓｉＲＮＡのコンジュゲーション；尿素／チオ尿素が架橋した芳香族化合物による３’オーバーハング領域での化学修飾；センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端でのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲーション；ならびにｓｉＲＮＡのコレステロールコンジュゲーションである。
別の態様では、本発明は、歯槽骨を再生するための方法であって、それを必要とする対象の骨量減少部位に、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、投与は、局所投与、経皮投与および／または皮下投与から選択される経路による。一実施形態では、創傷は皮膚創傷である。別の実施形態では、皮膚創傷は歯周創傷である。さらなる実施形態では、歯周創傷は、歯肉結合組織の変性または歯槽骨の吸収を含む。
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、細胞遊走アッセイにおいてヒト皮膚線維芽細胞の遊走を加速する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ノルエピネフリンおよびセロトニン取り込み阻害剤、酸化的リン酸化阻害剤、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、または中枢神経系（ＣＮＳ）刺激剤から選択される。様々な実施形態では、薬剤はレセルピンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、アンチマイシンＡ、ニフルム酸、塩酸モリンドンおよび塩酸メフェキサミドである。特定の実施形態では、薬剤は、硝酸エコナゾール、アセクロフェナク、プラバスタチン、チロキサポール、イソソルビド一硝酸塩、ＭＳ－１５００３８７、（Ｓ）－（－）－アテノロ（Ａｔｅｎｏｌｏ）、塩酸ブテナフィン、塩酸アセクリジン、硫酸アトロピン一水和物、トリメタジオン、クロルフェンシンカルバメート、塩酸マフェニド、ニフェナゾン、塩酸アルチカイン、テオブロミン、ニフロキサジド、ＳＡＭ００１２４６６２６、ドロプロピジン（Ｒ，Ｓ）、クエン酸ジエチルカルバマジン、ＭＳ－１５０１２１４、メシル酸ドラセトロン、エストロン、プレドニゾロン、塩酸ダウノルビシン、シクロヘキシミド、およびモネンシンナトリウム塩から選択される。特定の実施形態では、薬剤は、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤、ホルモンアゴニスト、一酸化窒素阻害剤、細胞内Ｃａ＋＋放出剤、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤、およびキナーゼ阻害剤からなる群から選択されるＮｐａｓ２下方制御化合物である。一実施形態では、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤は、ブレフェルジンＡ、コルヒチン、ポドフィロトキシン、または５１７５３４８である。別の実施形態では、ホルモンアゴニストはＡＣ－９３２５３ヨウ化物、一酸化窒素阻害剤はジフェニレンヨードニウムクロリド、細胞内Ｃａ＋＋放出剤はタプシガルギン、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤はＰＤ－１６６２８５水和物、キナーゼ阻害剤はＰＤ－１７３９５２である。
特定の実施形態では、経皮投与は、薬剤をカプセル化する変形可能なナノスケールベシクルによるものである。特定の実施形態では、経皮投与は、薬剤でコーティングされたマイクロニードル、組み込まれた薬剤を内部に有する固体ポリマーマトリックス、薬剤を貯蔵するリザーバと半透膜とを備える経皮パッチ、溶解した薬剤を内部に含む経皮ゲル、および溶解した薬剤を内部に含む経皮スプレー、および溶解した薬剤を内部に含む定量的経皮スプレー、からなる群から選択される経皮送達系の創傷への適用である。
様々な実施形態では、薬剤は、Ｎｐａｓ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とするよう設計された合成低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、マイクロニードルアレイ、エレクトロポレーション、圧力、機械的マッサージ、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー媒介送達系、超音波、コンジュゲート送達系、マイクロバブル、リポソームバブル、超音波感受性ナノバブル、カーボンナノチューブ、脂質ベースのナノベクター、非脂質有機ベースのナノベクターおよび無機ナノベクター、金ナノ粒子、ならびに金ナノロッド、からなる群から選択される経路によって投与される。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、リボース糖環の２’位、リン酸骨格、核酸塩基およびリボース糖、５’末端の修飾またはコンジュゲーションにおいて化学的に修飾されている。いくつかの実施形態では、リボース糖環はグアノシンまたはウリジンであり、２’位の修飾は２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）からなる群から選択される。一実施形態では、リン酸骨格は、ホスホロジチオエート、トリアゾール二量体、アミドまたはボラノホスフェートで修飾されている。別の実施形態では、核酸塩基およびリボース糖修飾は、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）、２’－Ｏ－メチルホスホロジチオエート（２’Ｏ－ＭｅＰＳ２）、親油性ホウ素クラスター、３－Ｎ－［（１，１２－ジカルバ－クロソ－ドデカカルボラン－１－イル）プロパン－３－イル］チミジン（Ｃ２Ｂ１０Ｈ１１、ＣＢ）、チミジンおよび５－ビス（アミノエチル）－アミノエチル－２’－デオキシウリジンである。一実施形態では、５’末端修飾またはコンジュゲーションは、ｓｉＲＮＡの５’末端でのパルミチン酸コンジュゲーション、ｓｉＲＮＡの３’末端への逆チミジン（ｉｄＴ）カップリング、および５’末端でのトパルミチン酸コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）とのｓｉＲＮＡのコンジュゲーション、フェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、およびピレニル誘導体からなる群から選択される芳香族化合物とのｓｉＲＮＡのコンジュゲーション；尿素／チオ尿素が架橋した芳香族化合物による３’オーバーハング領域での化学修飾；センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端でのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲーション；ならびにｓｉＲＮＡのコレステロールコンジュゲーションである。
特定の実施形態では、経皮投与は、薬剤をカプセル化する変形可能なナノスケールのベシクルによるものである。いくつかの実施形態では、経皮投与は、薬剤でコーティングされたマイクロニードル、組み込まれた薬剤を内部に有する固体ポリマーマトリックス、薬剤を貯蔵するリザーバと半透膜とを備える経皮パッチ、溶解した薬剤を内部に含む経皮ゲル、および溶解した薬剤を内部に含む経皮スプレー、および溶解した薬剤を内部に含む定量的経皮スプレー、からなる群から選択される経皮送達系の創傷への適用である。
さらなる態様では、本発明は、創傷部位における結合組織の再生を必要とする対象の創傷部位において結合組織を再生するための方法であって、治療有効量のＮｐａｓ２発現抑制剤を創傷に投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、投与は、局所投与、経皮投与および／または皮下投与から選択される経路による。一実施形態では、創傷は皮膚創傷である。別の実施形態では、皮膚創傷は歯周創傷である。特定の実施形態では、歯周における創傷は、歯肉結合組織の変性または歯槽骨の吸収を含む。様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、細胞遊走アッセイにおいてヒト皮膚線維芽細胞の遊走を加速する。特定の実施形態では、薬剤は、ノルエピネフリンおよびセロトニン取り込み阻害剤、酸化的リン酸化阻害剤、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、または中枢神経系（ＣＮＳ）刺激剤から選択される。特定の実施形態では、薬剤はレセルピンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、アンチマイシンＡ、ニフルム酸、塩酸モリンドンおよび塩酸メフェキサミドである。一実施形態では、薬剤は、硝酸エコナゾール、アセクロフェナク、プラバスタチン、チロキサポール、イソソルビド一硝酸塩、ＭＳ－１５００３８７、（Ｓ）－（－）－アテノロ、塩酸ブテナフィン、塩酸アセクリジン、硫酸アトロピン一水和物、トリメタジオン、クロルフェンシンカルバメート、塩酸マフェニド、ニフェナゾン、塩酸アルチカイン、テオブロミン、ニフロキサジド、ＳＡＭ００１２４６６２６、ドロプロピジン（Ｒ，Ｓ）、クエン酸ジエチルカルバマジン、ＭＳ－１５０１２１４、メシル酸ドラセトロン、エストロン、プレドニゾロン、塩酸ダウノルビシン、シクロヘキシミド、およびモネンシンナトリウム塩から選択される。別の実施形態では、薬剤は、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤、ホルモンアゴニスト、一酸化窒素阻害剤、細胞内Ｃａ＋＋放出剤、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤、およびキナーゼ阻害剤からなる群から選択されるＮｐａｓ２下方制御化合物である。一実施形態では、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤は、ブレフェルジンＡ、コルヒチン、ポドフィロトキシン、または５１７５３４８である。別の実施形態では、ホルモンアゴニストはＡＣ－９３２５３ヨウ化物、一酸化窒素阻害剤はジフェニレンヨードニウムクロリド、細胞内Ｃａ＋＋放出剤はタプシガルギン、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤はＰＤ－１６６２８５水和物、キナーゼ阻害剤はＰＤ－１７３９５２である。特定の実施形態では、経皮投与は、薬剤をカプセル化する変形可能なナノスケールベシクルの創傷への適用である。一実施形態では、経皮投与は、薬剤でコーティングされたマイクロニードル、組み込まれた薬剤を内部に有する固体ポリマーマトリックス、薬剤を貯蔵するリザーバと半透膜とを備える経皮パッチ、溶解した薬剤を内部に含む経皮ゲル、および溶解した薬剤を内部に含む経皮スプレー、および溶解した薬剤を内部に含む定量的経皮スプレー、からなる群から選択される経皮送達系の創傷への適用である。
別の実施形態では、薬剤は、Ｎｐａｓ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とするよう設計された合成低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である。さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡは、マイクロニードルアレイ、エレクトロポレーション、圧力、機械的マッサージ、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー媒介送達系、超音波、コンジュゲート送達系、マイクロバブル、リポソームバブル、超音波感受性ナノバブル、カーボンナノチューブ、脂質ベースのナノベクター、非脂質有機ベースのナノベクターおよび無機ナノベクター、金ナノ粒子、ならびに金ナノロッド、からなる群から選択される経路によって投与される。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、リボース糖環の２’位、リン酸骨格、核酸塩基およびリボース糖、５’末端の修飾またはコンジュゲーションにおいて化学的に修飾されている。別の実施形態では、リボース糖環はグアノシンまたはウリジンであり、２’位の修飾は２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）からなる群から選択される。一実施形態では、リン酸骨格は、ホスホロジチオエート、トリアゾール二量体、アミドまたはボラノホスフェートで修飾されている。別の実施形態では、核酸塩基およびリボース糖修飾は、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）、２’－Ｏ－メチルホスホロジチオエート（２’Ｏ－ＭｅＰＳ２）、親油性ホウ素クラスター、３－Ｎ－［（１，１２－ジカルバ－クロソ－ドデカカルボラン－１－イル）プロパン－３－イル］チミジン（Ｃ２Ｂ１０Ｈ１１、ＣＢ）、チミジンおよび５－ビス（アミノエチル）－アミノエチル－２’－デオキシウリジンである。別の実施形態では、５’末端修飾またはコンジュゲーションは、ｓｉＲＮＡの５’末端でのパルミチン酸コンジュゲーション、ｓｉＲＮＡの３’末端への逆チミジン（ｉｄＴ）カップリング、および５’末端でのトパルミチン酸コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）とのｓｉＲＮＡのコンジュゲーション、フェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、およびピレニル誘導体からなる群から選択される芳香族化合物とのｓｉＲＮＡのコンジュゲーション；尿素／チオ尿素が架橋した芳香族化合物による３’オーバーハング領域での化学修飾；センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端でのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲーション；ならびにｓｉＲＮＡのコレステロールコンジュゲーションである。
特定の実施形態では、結合組織は、コラーゲン、真皮様コラーゲン線維、または骨のうちの１つ以上である。一実施形態では、創傷部位は骨喪失の部位である。別の実施形態では、骨喪失は、歯周炎によって誘導された歯槽骨吸収の部位におけるものである。さらなる実施形態では、創傷部位は、歯肉結合組織変性の部位である。
別の態様では、本発明は、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤を対象の開いた創傷部位に局所投与することを含む、創傷領域サイズを減少させるための方法を提供する。特定の実施形態では、投与は、局所投与、経皮投与および／または皮下投与から選択される経路による。一実施形態では、創傷は皮膚創傷である。別の実施形態では、皮膚創傷は歯周創傷である。さらに別の実施形態では、歯周創傷は、歯肉結合組織の変性または歯槽骨の吸収を含む。一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、細胞遊走アッセイにおいてヒトの皮膚線維芽細胞の遊走を加速する。具体的な実施形態では、薬剤は、ノルエピネフリンおよびセロトニン取り込み阻害剤、酸化的リン酸化阻害剤、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、または中枢神経系（ＣＮＳ）刺激剤から選択される。別の具体的な実施形態では、薬剤はレセルピンである。一実施形態では、薬剤は、アンチマイシンＡ、ニフルム酸、塩酸モリンドンおよび塩酸メフェキサミドである。別の実施形態では、薬剤は、硝酸エコナゾール、アセクロフェナク、プラバスタチン、チロキサポール、イソソルビド一硝酸塩、ＭＳ－１５００３８７、（Ｓ）－（－）－アテノロ、塩酸ブテナフィン、塩酸アセクリジン、硫酸アトロピン一水和物、トリメタジオン、クロルフェンシンカルバメート、塩酸マフェニド、ニフェナゾン、塩酸アルチカイン、テオブロミン、ニフロキサジド、ＳＡＭ００１２４６６２６、ドロプロピジン（Ｒ，Ｓ）、クエン酸ジエチルカルバマジン、ＭＳ－１５０１２１４、メシル酸ドラセトロン、エストロン、プレドニゾロン、塩酸ダウノルビシン、シクロヘキシミド、およびモネンシンナトリウム塩から選択される。さらに別の実施形態では、薬剤は、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤、ホルモンアゴニスト、一酸化窒素阻害剤、細胞内Ｃａ＋＋放出剤、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤、およびキナーゼ阻害剤からなる群から選択されるＮｐａｓ２下方制御化合物である。さらなる実施形態では、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤は、ブレフェルジンＡ、コルヒチン、ポドフィロトキシンまたは５１７５３４８である。特定の実施形態では、ホルモンアゴニストはＡＣ－９３２５３ヨウ化物、一酸化窒素阻害剤はジフェニレンヨードニウムクロリド、細胞内Ｃａ＋＋放出剤はタプシガルギン、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤はＰＤ－１６６２８５水和物、キナーゼ阻害剤はＰＤ－１７３９５２である。様々な実施形態では、経皮投与は、薬剤をカプセル化する変形可能なナノスケールベシクルの創傷への適用である。具体的な実施形態では、経皮投与は、薬剤でコーティングされたマイクロニードル、組み込まれた薬剤を内部に有する固体ポリマーマトリックス、薬剤を貯蔵するリザーバと半透膜とを備える経皮パッチ、溶解した薬剤を内部に含む経皮ゲル、および溶解した薬剤を内部に含む経皮スプレー、および溶解した薬剤を内部に含む定量的経皮スプレー、からなる群から選択される経皮送達系の創傷への適用である。別の実施形態では、薬剤は、Ｎｐａｓ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とするよう設計された合成低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である。具体的な実施形態では、ｓｉＲＮＡは、マイクロニードルアレイ、エレクトロポレーション、圧力、機械的マッサージ、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー媒介送達系、超音波、コンジュゲート送達系、マイクロバブル、リポソームバブル、超音波感受性ナノバブル、カーボンナノチューブ、脂質ベースのナノベクター、非脂質有機ベースのナノベクターおよび無機ナノベクター、金ナノ粒子、ならびに金ナノロッド、からなる群から選択される経路によって投与される。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、リボース糖環の２’位、リン酸骨格、核酸塩基およびリボース糖、５’末端の修飾またはコンジュゲーションにおいて化学的に修飾されている。別の実施形態では、リボース糖環はグアノシンまたはウリジンであり、２’位の修飾は２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）からなる群から選択される。さらなる実施形態では、リン酸骨格は、ホスホロジチオエート、トリアゾール二量体、アミドまたはボラノホスフェートで修飾されている。別の実施形態では、核酸塩基およびリボース糖修飾は、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）、２’－Ｏ－メチルホスホロジチオエート（２’Ｏ－ＭｅＰＳ２）、親油性ホウ素クラスター、３－Ｎ－［（１，１２－ジカルバ－クロソ－ドデカカルボラン－１－イル）プロパン－３－イル］チミジン（Ｃ２Ｂ１０Ｈ１１、ＣＢ）、チミジンおよび５－ビス（アミノエチル）－アミノエチル－２’－デオキシウリジンである。特定の実施形態では、５’末端修飾またはコンジュゲーションは、ｓｉＲＮＡの５’末端でのパルミチン酸コンジュゲーション、ｓｉＲＮＡの３’末端への逆チミジン（ｉｄＴ）カップリング、および５’末端でのトパルミチン酸コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）とのｓｉＲＮＡのコンジュゲーション、フェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、およびピレニル誘導体からなる群から選択される芳香族化合物とのｓｉＲＮＡのコンジュゲーション；尿素／チオ尿素が架橋した芳香族化合物による３’オーバーハング領域での化学修飾；センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端でのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲーション；ならびにｓｉＲＮＡのコレステロールコンジュゲーションである。
別の実施形態では、開いた創傷部位は、コラーゲン、真皮様コラーゲン線維、または骨のうちの１つ以上から選択される結合組織を含む。さらなる実施形態では、開いた創傷部位は、骨喪失の部位である。一実施形態では、骨喪失は、歯周炎によって誘導された歯槽骨吸収の部位におけるものである。いくつかの実施形態では、開いた創傷部位は、歯肉結合組織変性の部位である。
一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤および／またはＮｐａｓ２を下方制御する化合物である薬剤は、局所投与、経皮投与および／または皮下投与のための医薬組成物として製剤化される。具体的な実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるように、治療有効量の時計遺伝子Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、それを必要とする対象の創傷部位、特に開いた創傷部位において、骨喪失部位で歯槽骨を再生し、創傷部位で結合組織を再生し、および／または創傷領域サイズを減少させるのに有効な、治療有効量の時計遺伝子Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤を含む。一実施形態では、医薬組成物は、時計遺伝子Ｎｐａｓ２の発現を抑制する少なくとも１つの薬剤を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、時計遺伝子Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤の組み合わせを含む。
末梢概日時計遺伝子および創傷治癒
結合組織の機能および表現型は、皮膚と口腔組織とで異なる。皮膚線維芽細胞、口腔線維芽細胞、および骨形成骨芽細胞は、部位特異的な機能および表現型を維持する結合組織細胞であり、健康の恒常性に貢献している。広い意味での創傷は、結合組織細胞の表現型を改変することによって結合組織細胞に影響を及ぼし、瘢痕化または機能喪失をもたらす。本発明者らは、本明細書において、末梢概日時計が、創傷治癒中にこれまで認識されていなかった役割を果たすことを説明するものである。
概日時計遺伝子は、成体動物の生理的組織再生を調節することが報告されている。コア概日時計は、概日ペースメーカーである視床下部の視交叉上核（ＳＣＮ）において厳密に維持されている。時計分子、すなわち概日ロコモーター出力サイクルｋａｐｕｔ（Ｃｌｏｃｋ）、ニューロンＰＡＳドメイン２（Ｎｐａｓ２）およびアリール炭化水素受容体核トランスロケーター様（Ａｒｎｔｌ、Ｂｍａｌ１）転写因子は、ピリオド（Ｐｅｒ）およびクリプトクロム（Ｃｒｙ）遺伝子の発現を誘導し、次にそのタンパク質産物は、Ｃｌｏｃｋ、Ｎｐａｓ２、Ｂｍａｌ１の転写活性を阻害する。概日リズムは、広範囲の生理学的恒常性機能に関与しており、このリズムの崩壊は、慢性疾患および組織修復障害に関与する。
ＳＣＮのコア概日時計に加えて、線維芽細胞や骨芽細胞などの末梢組織には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｔｓｕｉ ＭＳ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｈｙｔｈｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｋｉｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１６；１７（６）で説明されているように、自律的に機能できる末梢時計が存在する。従来の研究では、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨｏｙｌｅ ＮＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ａｃｔｉｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｒｉｖｅ ｒｈｙｔｈｍｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１７；９（４１５）によって説明されるように、ヒトの火傷のデータベースから、夜間（休息時間）の創傷が、日中（活動時間）の創傷よりも治癒が遅いことが示されたことが報告されている。これらの結果は、概日リズムが皮膚の創傷治癒にどのように寄与するかについてのメカニズムはまだ不明であるが、創傷治癒における概日リズムの調節的役割を示唆している。
マウスの皮膚線維芽細胞はＮｐａｓ２を発現することが報告されており、参照により全体を本明細書に組み込む、Ｌａｎｄｇｒａｆ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，ＮＰＡＳ２ Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｓ ｆｏｒ Ｌｏｓｓ ｏｆ ＣＬＯＣＫ ｉｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｃｉｒｃａｄｉａｎ Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２０１６；１２（２）：ｅ１００５８８２で説明されるように、ＣＬＯＣＫの発現の欠如を補填する可能性がある。 Ｎｐａｓ２は、参照により全体を本明細書に組み込む、Ｇｌａｓｓ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｗｉｔｈ ａｇｅ ｉｎ ｓｋｉｎ，ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｂｒａｉｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１３；１４（７）：Ｒ７５によって説明されるように、マイクロアレイ分析によって、老化したヒトの皮膚で有意に上方制御された遺伝子の中から同定された。最近、Ｓａｓａｋｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎａｌ ＰＡＳ Ｄｏｍａｉｎ ２（Ｎｐａｓ２）－Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ Ｓｋｉｎ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｒｍａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ａｎａｔ Ｒｅｃ（Ｈｏｂｏｋｅｎ）．２０１９によって説明されるように、Ｎｐａｓ２が皮膚創傷治癒の促進に役割を果たすことが観察されている。
Ｎｐａｓ２－／－マウスは、他の群よりも速い皮膚創傷の閉鎖を示した（図１Ａおよび１Ｂ）。Ｎｐａｓ２－／－線維芽細胞の細胞増殖、細胞移動および細胞収縮は、ＷＴ線維芽細胞のものよりも大きかった（ｐ＜０．０１）（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ）。タイプＸＩＩおよびＸＩＶのＦＡＩＣＴコラーゲンの発現の増加および真皮様コラーゲン線維形成が、インビトロでＮｐａｓ２ ＫＯ線維芽細胞において見られた。肉芽組織領域のコラーゲン線維構造は、Ｎｐａｓ２－／－マウスでより良好に再構築された。これらのデータは、概日リズム、特にＮｐａｓ２が皮膚の創傷治癒を調節する可能性があることを示唆する。これらの観察は、治療法開発の新しい機会を探求する理論的根拠を提供するものであった。
上記および本開示全体で用いられるように、以下の用語および略語は、特に明記しない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
本開示では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数形の参照を含み、特定の数値への参照は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、少なくともその特定の値を含む。したがって、例えば、「化合物」への言及は、当業者に知られているそのような化合物およびその均等物の１つまたは複数への言及などである。本明細書で使用される「複数」という用語は、２つ以上を意味する。値の範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」を使用することにより、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。すべての範囲は包括的かつ組み合わせることができる。
本明細書で使用される場合、用語「成分」、「組成物」、「化合物の組成物」、「化合物」、「薬物」、「薬理活性物質」、「薬剤」、「活性剤」、「治療薬」、「治療」、「処置」、または「医薬」は、本明細書では交換可能に使用され、対象（ヒトまたは動物）に投与されたときに、局所的および／または全身的な作用により、所望の薬学的効果および／または生理学的効果を誘導する化合物もしくは化合物（複数可）もしくは組成物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は交換可能に使用され、（ａ）哺乳動物において疾患状態が起こることを防止すること、特に、哺乳動物がかかる疾患状態にかかりやすいが、まだそれを有すると診断されていない場合に、該疾患状態が発生するのを防止すること、（ｂ）疾患状態を阻害する、すなわちその発症を阻止すること、および／または（ｃ）疾患状態を緩和する、すなわちその疾患状態の退行を引き起こすこと、を指す。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、症状、疾患または障害の少なくとも１つの有害反応もしくは悪影響もしくは症状を緩和する、または軽減することを含む。
一実施形態では、「予防すること」は、とりわけ、症状の発症を遅らせること、疾患への再発を予防すること、再発エピソードの数もしくは頻度を減少させること、症候性エピソード間の潜伏期を増加させること、またはそれらの組み合わせを指す。一実施形態では、「抑制する」または「阻害する」は、とりわけ、症状の重症度を低減すること、急性エピソードの重症度を低減すること、症状の数を低減すること、疾患関連症状の発生を低減すること、症状の潜伏期を低減すること、症状を寛解させること、二次症状を低減させること、二次感染を低減させること、患者の生存期間を延長させること、またはこれらの組み合わせを指す。
本明細書で使用される場合、「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」、または「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」という用語は、１つ以上の化合物または組成物を、非経口的、経腸的、または局所的に対象に送達することを指す。一実施形態では、組成物は局所的に適用される。別の実施形態では、組成物は全身的に適用される。投与は、細胞または組織培養物、あるいは生物、例えばヒトに達成することができる。非経口投与の例示的な例には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。経腸投与の例示的な例には、経口、吸入、鼻腔内、舌下、および直腸投与が含まれるが、これらに限定されない。局所投与の例示的な例には、経皮投与および膣内投与が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、薬剤または組成物は、非経口的に、任意選択で、対象への静脈内投与または経口投与によって投与される。
「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、本願明細書において記載されるＮｐａｓ２の発現を抑制する薬剤および／または本発明による医薬組成物によって治療（疾患状態および二次感染の予防的処置および阻害を含む）が提供される動物、例えばヒトを指す。本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」という用語は、本明細書では言い換え可能に使用され、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えば、ネズミまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマなどの哺乳類、ならびに爬虫類、両生類、ニワトリ、およびシチメンチョウなどの非哺乳類が挙げられる。
本発明の方法のいずれかによれば、一実施形態では、本明細書に記載の対象はヒトである。別の実施形態では、対象は非ヒトである。一実施形態では、対象は脊椎動物である。別の実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、対象は霊長類であり、一実施形態では、非ヒト霊長類である。別の実施形態において、対象はネズミ科（ｍｕｒｉｎｅ）であり、これは、一実施形態においてマウスであり、別の実施形態においてラットである。別の実施形態では、対象は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、クマ、キツネ、またはオオカミである。一実施形態では、対象は、ニワトリまたは魚である。
一実施形態では、本発明の組成物は、薬学的に許容される組成物を含む。一実施形態では、組成物は、時計遺伝子の発現を抑制する薬剤を含み、時計遺伝子は、ニューロンのＰＡＳドメインタンパク質２（Ｎｐａｓ２）である。特定の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、本明細書に記載されるＮｐａｓ２の発現を抑制する薬剤のうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、「薬学的に許容される組成物」および「医薬組成物」は、局所投与、経皮投与および／または皮下投与のために製剤化される。一実施形態では、「薬学的に許容される組成物」および「医薬組成物」は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
一実施形態では、「薬学的に許容される」という句は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わないヒトおよび動物の組織との接触での使用に好適であり、妥当な利益／リスク比に釣り合っている化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために本明細書で採用される。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「賦形剤」としては、生理学的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。一実施形態では、製薬上許容される担体は、局所投与、経皮投与および／または皮下投与に適する。好適な局所製剤としては、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、ドロップなどが挙げられる。
一実施形態では、薬学的に許容される担体は、非経口投与に適する。
あるいは、担体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下または経口投与に適するものとすることができる。注射用途に好適な医薬形態としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのかかる溶媒および剤の使用は、当該技術分野において公知である。従来の溶媒または剤が活性化合物と、すなわち、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤と適合しないものでない限り、本明細書に記載の医薬組成物におけるそれらの使用は本発明で企図される。補足的な活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。
治療用医薬組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定である。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適する他の調整された構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、植物油を含有する溶媒または分散媒、ならびにそれらの好適な混合物とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散させる場合に必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアレートおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
さらに、本明細書に記載されるように、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、徐放性製剤、例えば、徐放性ポリマーを含む組成物として投与することができる。Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、インプラントやマイクロカプセル化送達系などの徐放性製剤など、Ｎｐａｓ２を急速放出から保護する担体を使用して調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸、ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤を調製するための多くの方法は、特許が取得されているか、または一般に当業者に公知である。
滅菌注射液は、本明細書に記載のＮｐａｓ２の発現を抑制する薬剤などの活性化合物を、必要に応じて上記で列挙した成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に必要な量で組み込んだ後、濾過滅菌することにより調製できる。一般に、分散液は、活性化合物を、基となる分散媒と、上記で列挙したものからの必要な他の成分とを、滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、その調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥を含み、これにより、有効成分の粉末に加えて、以前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分が得られる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤は、その溶解性を増強する１つ以上の追加の化合物とともに製剤化され得る。
一実施形態では、本発明の組成物は、治療有効量で投与される。一実施形態では、「治療有効量」は、対象の創傷治癒を改善または加速するのに、骨喪失時に歯槽骨を再生する対象の部位、対象の創傷部位で結合組織を再生するのに、および／または薬剤または化合物が投与された、または投与された対象の開いた創傷部位の創傷領域サイズを減少させるのに有効である、本発明の薬剤または化合物の単独での量、または請求された薬剤または化合物の組み合わせの量、または本発明の薬剤または化合物と、時計遺伝子の発現の抑制剤、阻害剤またはダウンレギュレーター、神経ＰＡＳドメインタンパク質２（Ｎｐａｓ２）として作用するのに有効な他の有効成分との組み合わせの量、を含むことを意図する。一実施形態では、本発明の時計遺伝子Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤の「治療有効量」は、組成物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な薬剤の量である。
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をより完全に説明するために示される。しかし、実施例は、決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１
Ｎｐａｓ２欠損線維芽細胞は、皮膚の創傷治癒および皮膚コラーゲンの再構築を促進する
材料および方法
動物倫理に関する声明
この実験では、Ｃ５７Ｂｌ／６ＪバックグラウンドのＮｐａｓ２ノックアウト（ＫＯ）マウス（Ｂ６．１２９Ｓ６－Ｎｐａｓ２ｔｍ１Ｓｌｍ／Ｊ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を使用した。Ｎｐａｓ２ヘテロ接合変異体（Ｎｐａｓ２＋／－）マウスを、凍結保存された精子サンプルから作製し、ＵＣＬＡにおいて良好な繁殖コロニーを確立した。Ｎｐａｓ２－／－マウスとＮｐａｓ２＋／－マウスの両方を
実験群として、およびＣ５７Ｂｌ／６Ｊ野生型（ＷＴ）マウスを対照群として使用した。動物を使用するすべての実験プロトコルは、ＵＣＬＡ動物研究委員会（ａｎｉｍａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＡＲＣ＃２００３－００９）によって検討および承認され、実験動物の人道的ケアおよび使用に関する公共健康サービスポリシー（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐｏｌｉｃｙ）およびＵＣＬＡ動物ケアおよび使用トレーニングマニュアル（ＵＣＬＡ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ）のガイドラインに従った。すべての動物に餌および水を自由に摂取させ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＵＣＬＡにおいて１２時間の明／暗周期で通常の飼育施設で飼育した。
マウス背部皮膚全層切除創傷モデル
体重約２５ｇの９～１４週齢のマウス（ＷＴ：オス４匹およびメス４匹、Ｎｐａｓ２＋／－：オス７匹、Ｎｐａｓ２－／－：オス７匹）を背部皮膚全層創傷実験に使用した。イソフルラン吸入による麻酔後、５ｍｍの皮膚生検パンチ（ＩＮＴＥＧＲＡ，Ｉｎｔｅｇｒａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ＮＪ）を使用して、全層皮膚創傷をパンチし、組織層を通過させることにより、背側皮膚の右側と左側に同時に同一の皮膚創傷を形成させた。これらの手術は午前１１時から午後１時の間に行われ、創傷治癒の過程で標準化された写真を０、２、４、６、および１２日目に撮影した。皮膚の創傷面積を各時点で測定した（ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ ｖｅｒ．１．５１）。創傷面積を毎日、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定およびＤｕｎｎ’ｓ事後検定によって比較した。これらのマウスを、組織学的解析のために、７日目（各群でｎ＝４）および１４日目（ＷＴ：４匹のマウス、Ｎｐａｓ２＋／－：３匹のマウス、およびＮｐａｓ２－／－：３匹のマウス）にと殺した。創傷領域を含む背部皮膚を１ｃｍの正方形として切開し、直ちに１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。組織学的評価のために、切片をヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）で染色した。
皮膚線維芽細胞の培養
３つの遺伝子型のそれぞれのマウス背部皮膚から得た初代線維芽細胞を、外植片法を使用して培養した。細胞を、１０％ウシ胎児血清および１００Ｕペニシリン／０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７＿Ｃ、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で培養した。それらの遺伝子型を、ＷＴおよび変異体Ｎｐａｓ２遺伝子の対立遺伝子を標的とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって決定した。
ＷＳＴ－１細胞増殖アッセイ
ＷＳＴ－１試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して細胞増殖アッセイを実施した。合計２，０００個の細胞を９６ウェルのリーディングプレートに播種し、所定の時点（１、３、５、および７日目）で培養した。各時点で、１０％のＷＳＴ－１試薬を含む培地に培地交換し、３時間インキュベートした（各時点でｎ＝４）。プレートリーダー（ＳＹＨＮＥＲＧＹ Ｈ１プレートリーダー、Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を備えた４５０ｎｍの分光光度計で吸収値を測定し、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で比較した後、各時点でＴｕｋｅｙ検定を行った。
皮膚線維芽細胞における概日遺伝子発現
皮膚線維芽細胞における８つのコア概日遺伝子の定常状態のｍＲＮＡ発現レベルを、Ｔａｑｍａｎ ＭＧＢプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用した定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）によって決定した。線維芽細胞を２４ウェルプレートで培養し、１００ｎＭデキサメタゾンを培地に添加して２時間インキュベートした後、ＤＭＥＭで洗浄することにより、８０％～９０％のコンフルエンシーで同期させた（Ｎａｇｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、同期後０～４８時間（時点当たりｎ＝４）から開始して６時間ごとに全ＲＮＡを抽出し、その質および量に関してＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）により確認した。以下の市販のプライマー／プローブミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用してＲＴ－ＰＣＲを実行した：Ｎｐａｓ２（Ｍｍ０１２３９３１２＿ｍ１）、Ｂｍａｌ１（＝ Ａｒｎｔｌ：Ｍｍ００５００２２３＿ｍ１）、Ｃｌｏｃｋ（Ｍｍ００４５５９５０＿ｍ１）、Ｐｅｒ１（Ｍｍ００５０ １８１３＿ｍ１）、Ｐｅｒ２（Ｍｍ００４７８０９９＿ｍ１）、Ｐｅｒ３（Ｍｍ００４７８１２０＿ｍ１）、Ｃｒｙ１（Ｍｍ００５１４３９２＿ｍ１）、およびＣｒｙ２（Ｍｍ０１３３１５３９＿ｍ１）。Ｇａｐｄｈは内部対照として使用した。さらに、ＬａｃＺレポーター遺伝子発現を測定した。統計分析は、最初に二元配置分散分析によって実施した。二元配置分散分析による有意な相関Ｐ値（Ｐ＜０．０５）および各時点での遺伝子発現を有する群を、さらにＴｕｒｋｅｙ検定に供した。
インビトロ創傷治癒スクラッチプレートアッセイ
線維芽細胞を６ウェルプレートに播種し、上記のように同期させた。２時間後、２０μＬのプラスチックピペットでスクラッチラインを作成し、培地で洗浄した（群当たりｎ＝５）。これらの擦傷の領域を、０～２４時間目に低速度撮影顕微鏡写真によって捕捉した。擦傷の領域に遊走した細胞の数を１２時間目および２４時間目にカウントし、一元配置分散分析および事後ホルム検定で比較した。
浮遊コラーゲンゲル収縮アッセイ
浮遊コラーゲンゲル収縮アッセイは、従来確立されたプロトコルにいくつかの変更を加えて実施した（Ｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。線維芽細胞（５０，０００細胞）を含むコラーゲンゲル混合物（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ，Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）の５００μＬアリコートを、２４ウェルプレート（各群でｎ＝５）に適用し、室温で２０分間静置した。固化したゲルを直径１００ｍｍの皿に移し、培養した（３７＿Ｃ、加湿インキュベーター内、５％ＣＯ２）。ゲルの画像を０、６、１２、２４、４８、および７２時間目にスキャナーでスキャンした。各時点でのコラーゲンゲルの面積を測定し（ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ ｖｅｒ．１．５１）、二元配置分散分析およびそれに続く各時点でのＴｕｋｅｙ検定によって比較した。
単一細胞収縮の評価
単一細胞収縮は、蛍光標識されたエラストマー収縮性表面（ＦＬＥＣＳ）（Ｆｏｒｃｙｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を使用して測定した（Ｋｏｚｉｏｌ－Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。底部に柔らかいフィルム状のシリコーンエラストマーを有するＦＬＥＣＳプレートを、均一な「Ｘ」字型（対角７０μｍ×厚さ１０μｍ）の蛍光フィブリノーゲンでマイクロパターン化した。約３０，０００個の細胞を２４ウェルＦＬＥＣＳプレートのウェルに播種した。プレートを室温で４０分間、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に３０分間置いて細胞を付着させた。Ｘ字型パターンへの最初の細胞接着のためのインキュベーション後、浮遊細胞を培地で洗浄することにより除去し、プレートをさらに８時間インキュベートした。核染色はＨｏｅｃｈｓｔ３３，３４２（１：１０，０００）で行った。Ｘ字型パターンの蛍光フィブリノーゲンの画像は、ローダミンフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用して捕捉した。単一細胞収縮評価では、Ｘ字型の中心に付着した単一核に関連するマイクロパターンを選択し、無細胞パターンと比較して非収縮群または収縮群のいずれかに分類した。キャプチャされた画像（約１，０００個のＸ字型パターンを含む）当たりの収縮パターンの比率を、各遺伝子型間で比較した（ｎ＝５）。統計分析は、事後ホルム検定を使用した一元配置分散分析によって実施した。
アクチン、インテグリン、およびコラーゲンサブユニットの遺伝子発現
上記のように、同期後２４～４８時間にわたり、６時間ごとに線維芽細胞から全ＲＮＡサンプルを抽出した。ＲＮＡサンプルは、ＴａｑｍａｎベースのｑＲＴ－ＰＣＲによって、アクチンサブユニット－β－アクチン（Ａｃｔｂ：Ｍｍ０２６１９５８０＿ｇ１）およびα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ、Ａｃｔａ２：Ｍｍ００７２５４１２＿ｓ１）（図３Ｇ）、インテグリンサブユニット－インテグリンαＶ（ＩｔｇａＶ：Ｍｍ００４３４４８６＿ｍ１）、インテグリンβ３（Ｉｔｇｂ３：Ｍｍ００４４３９８０＿ｍ１）、およびインテグリンβ５（Ｉｔｇｂ５：Ｍｍ００４３９８２５＿ｍ１）（図３Ｈ）、およびコラーゲンサブユニット－タイプＩ（Ｃｏｌ１ａ１：Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１およびＣｏｌ１ａ２：Ｍｍ００４８３８８８＿ｍ１）、タイプＩＩＩ（Ｃｏｌ３ａ１：Ｍｍ００８０２３００＿ｍ１）、タイプＸＩＩ（Ｃｏｌ１２ａ１：Ｍｍ０１１４８５７６＿ｍ１）およびタイプＸＩＶ（Ｃｏｌ１４ａ１：Ｍｍ００８０５２ ６９＿ｍ１）（図４Ａ）の遺伝子発現を評価するために使用した。統計分析は、各時点で二元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ検定によって実施した。
ピクロシリウスレッド染色によるインビトロでのコラーゲン合成の評価
線維芽細胞を２４ウェルプレートに播種し、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）を添加した培地中、８０％～９０％のコンフルエンシーで１、３、７日間培養した。次に、細胞を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、コラーゲンを可視化するためにピクロシリウスレッド（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ、Ｎｉｌｅｓ，ＩＬ）で染色した。吸光度値は、プレートリーダー（ＳＹＨＮＥＲＧＹ Ｈ１プレートリーダー）を備えた５５０ｎｍの分光光度計で測定し、一元配置分散分析および事後ホルム検定によって比較した。
ピクロシリウスレッド染色および共焦点レーザー走査顕微鏡による、皮膚創傷治癒領域のコラーゲン線維構造
手術後７日および１４日での背部皮膚全層創傷実験の組織切片を、創傷治癒中のコラーゲン線維についてピクロシリウスレッドで染色した。肉芽組織（ＧＴ）領域、創傷閉鎖領域（ＷＣＡ）、および無傷の皮膚領域（ＩＳＡ）のコラーゲン線維構造を、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して評価した。元の創傷幅としての組織層の端の間の距離（ａ）、およびＧＴの幅として測定された皮膚パンチ領域での成熟コラーゲンの端の間の距離（ｂ）を評価した。創傷閉鎖の比率は（ａ－ｂ）／ａによって算出され、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定およびＤｕｎｎの事後検定によって比較した。
結果
全層背側皮膚創傷の閉鎖は、Ｎｐａｓ２－／－マウスで加速された。
全層背部皮膚創傷は、手術後２日目から１２日目まで継続的に収縮し、瘢痕形成はすべての遺伝子型で１２日目までに認められた（図１Ａ）。Ｎｐａｓ２－／－マウスの１２日目の相対的な創傷面積は、他の２つの遺伝子型よりも有意に小さかった（Ｐ＜０．０１）（図１Ｂ）。組織学的観察では、術後７日目に過角化症、残存血餅、ＧＴ領域の免疫応答が観察された。さらに、毛包を伴う真皮結合組織の端部は、１４日目までに創傷の中心に向かって移動した。創傷領域の上皮層は無傷の皮膚上皮と類似しているように見え、免疫応答はすべてのサンプルで低下していた（図１Ｃ）。本試験では、マウス背部皮膚全層切除による創傷を、日中（午前１１時から午後１時）に形成させた。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ａｃｔｉｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｒｉｖｅ ｒｈｙｔｈｍｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９：ｅａａｌ２７７４によって説明されるように、ヒトの夜間または休息期間中に生じる皮膚熱傷は、治癒障害を示したことが報告されている。夜行性のマウスの昼間は、ヒトの夜に相当する。ＷＴマウスとＮｐａｓ２ ＫＯマウスとの創傷治癒の違いは、マウスの暗期／活動期に創傷が発生した場合に、より明白になる可能性がある。
皮膚線維芽細胞の増殖および概日リズム遺伝子発現に対する、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異の影響
各線維芽細胞サンプルの遺伝子型を、ＰＣＲによって決定した。マウスＮｐａｓ２対立遺伝子のエクソン２を、ＬａｃＺ発現レポーターカセット（ＬａｃＺ／Ｎｅｏ）で置き換えた。エクソン２はｂＨＬＨ配列をコードしているため、得られたＮｐａｓ２分子はＤＮＡ結合機能を欠いていた。ＷＴよりも大きい、増幅されたＰＣＲ産物は、Ｎｐａｓ２－／－線維芽細胞を認識し、変異体およびＷＴのＰＣＲ産物はいずれも、Ｎｐａｓ２＋／－線維芽細胞を認識した。
ＷＳＴ－１アッセイは、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－線維芽細胞の両方がＷＴ線維芽細胞よりも速く増殖することを示した（Ｐ＜０．０１）（図２Ｂ）。
Ｎｐａｓ２の概日発現は、Ｎｐａｓ２＋／－線維芽細胞で減少し、Ｎｐａｓ２－／－線維芽細胞では検出されなかった。しかしながら、Ｐｅｒ２発現を除いて、他の概日遺伝子の発現パターンに対するＮｐａｓ２ ＫＯ変異の影響は観察されなかった（図２Ｃ）。レポーター遺伝子（ＬａｃＺ発現）はＮｐａｓ２ ＫＯマウスでのみ検出された。Ｘ
スクラッチ試験および浮遊による、Ｎｐａｓ２－／－皮膚線維芽細胞のインビトロ創傷治癒の促進
創傷治癒スクラッチアッセイ、浮遊コラーゲンゲル収縮アッセイ、およびＦＬＥＣＳによる単一細胞力の評価を、インビトロで実施した。遊走したＮｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－線維芽細胞の数は、２４時間の間、ＷＴの数よりも多く（ビデオ：ｈｔｔｐｓ：／／ｐｌａｙｅｒｓ．ｂｒｉｇｈｔｃｏｖｅ．ｎｅｔ／６５６３２６９８９００１／ｄｅｆａｕｌｔ＿ｄｅｆａｕｌｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ？ｖｉｄｅｏＩｄ＝６０１３１９７６７２００１）、これは統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）（図３Ａ、３Ｂ）。しかしながら、Ｎｐａｓ２＋／－線維芽細胞とＮｐａｓ２－／－線維芽細胞との細胞遊走速度に有意差はなかった（図３Ａ、３Ｂ）。浮遊コラーゲンゲル収縮アッセイは、Ｎｐａｓ２－／－線維芽細胞がＷＴおよびＮｐａｓ２＋／－線維芽細胞よりも速く収縮することを示した（Ｐ＜０．０１）（図３Ｃ、３Ｄ）。
単一細胞の収縮ならびにα－ＳＭＡおよびインテグリンの発現
ＦＬＥＣＳを使用した単一細胞収縮の評価（図３Ｅ）により、収縮したＮｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－線維芽細胞の比率がＷＴ線維芽細胞における比率よりも高いことが明らかとなった（Ｐ＜０．０１）（図３Ｆ）。細胞遊走に関連することが知られているβ－アクチン（Ａｃｔｂ）および筋線維芽細胞の収縮活性を上方制御する因子として知られているα－ＳＭＡ（Ａｃｔａ２）の遺伝子発現レベルをＲＴ－ＰＣＲで評価した（図３Ｇ）。両方のアクチンサブユニットの発現は時間とともに減少した。ただし、３つの遺伝子型の間に有意差はなかった。インテグリンαＶ（ＩｔｇａＶ）、インテグリンβ３（Ｉｔｇｂ３）、およびインテグリンβ５（Ｉｔｇｂ５）の発現は、皮膚線維芽細胞で概日リズムを示さなかった。Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異は、解析したインテグリンサブユニットの定常状態のレベルに影響を与えなかった（図３Ｈ）。
Ｎｐａｓ２－／－線維芽細胞では、インビトロで真皮様コラーゲン合成が増加した
この実験において、Ｉ型（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２）、ＩＩＩ型（Ｃｏｌ３ａ１）、ＸＩＩ型（Ｃｏｌ１２ａ１）、ＸＩＶ型（Ｃｏｌ１４ａ１）のコラーゲンサブユニットの遺伝子発現レベルを解析した（図４Ａ）。全体として、これらのコラーゲンｍＲＮＡでは概日パターンは観察されなかった。Ｎｐａｓ２－／－線維芽細胞においてＣｏｌ１ａ１およびＣｏｌ１ａ２は、ＷＴおよびＮｐａｓ２＋／－線維芽細胞よりも高発現していたが、相互作用のＰ値はＣｏｌ１ａ２でのみ有意であった。Ｃｏｌ３ａ１の発現に違いは見られなかった。Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－線維芽細胞においてＣｏｌ１２ａ１発現が増加した。驚くべきことに、Ｃｏｌ１４ａ１の有意に増加した発現は、ＷＴ線維芽細胞と比較してＮｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－線維芽細胞の両方で見られた。アスコルビン酸を補充して培養した線維芽細胞のピクロシリウスレッド染色では、強力な陽性反応が示され、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－線維芽細胞におけるコラーゲン線維の形成および蓄積が示され（図４Ｂ）、その５５０ｎｍでの吸光度は、７日目のＷＴ線維芽細胞よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１）（図４Ｃ）。
Ｎｐａｓ２－／－マウスの皮膚創傷治癒の間での真皮様コラーゲン線維の再建。
シリウスレッド染色された全層皮膚創傷領域の組織切片を、共焦点レーザー走査顕微鏡法によって解析した（図５Ａ）。ＩＳＡのコラーゲン繊維構造に明らかな違いはなかったが、ＧＴ領域およびＷＣＡの両方のコラーゲン繊維は、ＷＴのサンプルよりもＮｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－サンプルの方が太いように見えた。特に、Ｎｐａｓ２－／－サンプルのＧＴのコラーゲン繊維は、より組織化されており、部分的に無傷の皮膚コラーゲン構造に似ているように見えた。創傷閉鎖の組織学的測定は、ピクロシリウスレッドで染色された切片を用いて行った（図５Ｂ）。Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－サンプルの創傷閉鎖の比率はＷＴのそれよりも大きかったが、統計的有意性は１４日目でのＷＴとＮｐａｓ２－／－サンプルとの間でのみ得られた（Ｐ＜０．０１）（図５Ｃ）。
考察
哺乳動物の皮膚は、上皮層（表皮）およびその下の結合組織（真皮）で構成される大きなバリア組織である。本試験は、皮膚の創傷治癒のための、皮膚線維芽細胞における概日時計の新しい役割を提案し、これはおそらく皮膚結合組織コラーゲンの再構築を可能にする可能性がある。皮膚上皮細胞は、損傷を受けると活発に増殖し、創傷上を遊走し、バリア層の急速な確立をもたらす。対照的に、皮膚線維芽細胞は、増殖および創傷領域への遊走が遅い。さらに、創傷における線維芽細胞は、皮膚線維芽細胞の表現型を維持しないが、部分的に、ＧＴの形成および瘢痕化に寄与する新しい表現型を獲得する。本試験は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｏｗａｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＮＯＮＯ ｃｏｕｐｌｅｓ ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０：１５９２－１５９９によって説明されるように、確立された皮膚全層創傷モデルにおける治癒の加速を実証し、またＮｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスにおける、ＷＴマウスよりも速い創傷閉鎖および／または少ない瘢痕化の可能性を示すものである（図１）。このように、本試験は、機構的解析として、皮膚線維芽細胞の挙動に対するＮｐａｓ２ ＫＯ変異の役割に焦点を合わせた。
Ｎｐａｓ２は、塩基性ＨＬＨ転写因子をコードする概日リズムのコア遺伝子であり、皮膚線維芽細胞で高度に発現する。Ｎｐａｓ２は、線維芽細胞での発現率が比較的低いＣｌｏｃｋの役割を補うと仮定されている（図２Ｃ）。網膜細胞の場合、Ｃｌｏｃｋ遺伝子のノックダウンはＮｐａｓ２のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを低下させたが、Ｎｐａｓ２のノックダウンはＣｌｏｃｋのｍＲＮＡまたはタンパク質レベルに影響を与えなかった。本発明におけるデータは、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異がコア概日リズム遺伝子の発現に有意な影響を及ぼさなかったという従来の観察を裏付けた（図２Ｃ）。したがって、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異の影響は、概日リズムの乱れ以外のメカニズムによって媒介される可能性がある。ＳＣＮでのＮｐａｓ２の発現は、マウスの暗期／活動期にピークに達する。マウスの創傷反応は、日周的なリズムを示すと予想される。ただし、この問題は本試験では解析しなかった。
線維芽細胞を含む三次元コラーゲンゲルを用いて、組織リモデリング、創傷収縮、および線維症をモデル化した。線維芽細胞が埋め込まれたゲルの収縮の主なインビトロでのメカニズムは、線維芽細胞の移動力によるものである。細胞の牽引力が基質ＥＣＭに加えられ、コラーゲンゲルの収縮に寄与する。加速されたコラーゲンゲルの収縮は、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－線維芽細胞によって実証され（図３Ｃ、３Ｄ）、線維芽細胞の移動力の増加を示唆する。ヒト結腸直腸がん細胞におけるＮｐａｓ２発現のサイレンシングが細胞移動を加速したことが報告されている。本試験ではまた、インビトロでのスクラッチ試験において、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－線維芽細胞による遊走の加速を示した（ビデオ：ｈｔｔｐｓ：／／ｐｌａｙｅｒｓ．ｂｒｉｇｈｔｃｏｖｅ．ｎｅｔ／６５６３２６９８９００１／ｄｅｆａｕｌｔ＿ｄｅｆａｕｌｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ？ｖｉｄｅｏＩｄ＝６０１３１９７６７２００１、図３Ａ、３Ｂ）。リン酸化による細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）およびホスホイノシチド－３キナーゼ／プロテインキナーゼＢ（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ）の活性化は、細胞遊走、コラーゲンゲル収縮、および皮膚創傷治癒を調節することが公知である。これらのシグナル伝達経路の活性化は、α－ＳＭＡの発現の増加など、線維芽細胞の筋線維芽細胞への表現型変換において示唆された。本試験では、線維芽細胞の表現型変換が、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異によることが示唆されなかったため（図３Ｇ）、コラーゲンゲル収縮および線維芽細胞遊走の調節における筋線維芽細胞様表現型の関与は除外した。しかしながら、ＥＲＫ／Ａｋｔ／ＦＡＫ経路のリン酸化に対するＮｐａｓ２ ＫＯ変異の影響を特徴付けることは重要である。
遊走中、線維芽細胞はインテグリン分子を介して細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に接着し、単一細胞の牽引力を発生させる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｏｚｉｏｌ－Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩ３Ｋ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｄｉｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｍａｌｌ ａｉｒｗａｙｓ ｉｎ ａ ｒｈｏ ｋｉｎａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １７３：２７２６－２７３８、Ｐｕｓｈｋａｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８ Ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ ｓｅｎｓｏｒ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｆｏｒｃｅ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ２：１２４－１３７によって説明されているように、フィブロネクチンでプリントされたＦＬＥＣＳへの細胞接着を必要とする、最近開発された単一細胞収縮アッセイを使用した。 ＦＬＥＣＳアッセイは、マウス皮膚線維芽細胞がＮｐａｓ２ ＫＯ変異によって細胞収縮挙動を増加させることを示した（図３Ｆ）。創傷により誘導される線維芽細胞の筋線維芽細胞への形質転換は、組織収縮および線維症形成において病理学的役割を果たすと仮定されている。これとは別に、フィブロネクチンへの細胞接着を媒介するαおよびβインテグリンの発現の増加は、細胞収縮性によって引き起こされる創傷線維症の形成に重要であると考えられた。例えば、インテグリンαＶβ３の有意に上昇した発現は、特発性肺線維症を引き起こすと仮定されている。本試験では、筋線維芽細胞マーカーα－ＳＭＡ、ならびにインテグリンサブユニットαＶ、β３、およびβ５の定常状態の発現は、皮膚線維芽細胞におけるＮｐａｓ２ ＫＯ変異によって変化しなかった（図３Ｇ、３Ｈ）。したがって、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異による線維芽細胞収縮性の増加は、病理学的創傷収縮または線維症形成の異常な創傷治癒表現型をもたらさないと考えられる。
結合組織のＥＣＭ分子、特にＦＡＣＩＴクラスのコラーゲンは、細胞の遊走およびインテグリンを介する細胞接着による収縮に影響を与えることが示されている。ＦＡＣＩＴクラスのコラーゲンは、コラーゲン繊維の表面を修飾すると仮定されている。ＸＩＩ型およびＸＩＶ型コラーゲンのＮＣ３などの外部に露出したＮ末端球状ドメインは、線維芽細胞を介したコラーゲンゲルの収縮に不可欠であることが示されている。したがって、本発明者らは、Ｎｐａｓ２ ＫＯ線維芽細胞におけるＸＩＩ型およびＸＩＶ型コラーゲンの発現の増加が、遊走およびゲル収縮挙動に影響を与える可能性があると仮定している。
Ｎｐａｓ２の発現の下方制御は、細胞周期の進行およびＤＮＡ修復能力に関連していると報告されているが、細胞増殖に対するＮｐａｓ２の調節の影響については相反する報告が存在する。本試験は、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異が線維芽細胞増殖を増加させたことを示し（図２Ｂ）、これが細胞遊走アッセイを混乱させた可能性がある。低速度顕微鏡検査を評価したところ（ビデオ：ｈｔｔｐｓ：／／ｐｌａｙｅｒｓ．ｂｒｉｇｈｔｃｏｖｅ．ｎｅｔ／６５６３２６９８９００１／ｄｅｆａｕｌｔ＿ｄｅｆａｕｌｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ？ｖｉｄｅｏＩｄ＝６０１３１９７６７２００１）、すべての遺伝子型のスクラッチ領域内において増殖細胞が観察されず、細胞増殖および遊走に対するＮｐａｓ２の効果が細胞増殖以外のメカニズムを介して発生することを示唆している。
過去に、チタンベースの生体材料が、軟骨コラーゲンタイプＩＩ、ＩＸ、およびＸの発現の上昇と同時に、骨髄間葉系間質細胞（ＢＭＳＣ）のＮｐａｓ２発現を増加させることが報告されており、Ｎｐａｓ２が生体材料によるＢＭＳＣ分化を媒介する可能性があることを示唆している。したがって、機械的解剖の最初のステップとして、皮膚関連コラーゲンを介した皮膚線維芽細胞の分化を解析することとした。皮膚の真皮コラーゲンＥＣＭは、主にフィブリルを形成するＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンで構成されており、これらは厚いコラーゲン繊維を形成する。ＦＡＣＩＴコラーゲンのタイプＸＩＩおよびＸＩＶは、皮膚の分化において観察される。タイプＸＩＩおよびＸＩＶのコラーゲンは、コラーゲン線維の表面を装飾し、組織特異的な機能で生理学的なＥＣＭの組織化を調節すると仮定されている。対照的に、創傷線維芽細胞は、ＧＴにおいては異なる特性を有するコラーゲンＥＣＭを多く合成する。本試験では、Ｎｐａｓ２ ＫＯ線維芽細胞によるＦＡＣＩＴコラーゲンタイプＸＩＩおよびＸＩＶの顕著な上方制御を明らかにした（図４Ａ）。ピクロシリウスレッド染色によって示されたインビトロでのコラーゲン線維形成は、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－線維芽細胞の培養において厚いコラーゲン線維を示した（図４Ｂ、４Ｃ）。強力に増加したＦＡＣＩＴの発現は、皮膚創傷における真皮様コラーゲン線維の再編成に寄与する可能性がある。実際、Ｎｐａｓ２－／－マウスは、成熟した真皮様コラーゲン構造を含むＷＣＡの増加を示した（図５Ａ）。さらに、Ｎｐａｓ２－／－マウスのＧＴでは、真皮様のコラーゲン線維構造に部分的に似た、太いコラーゲン線維が示された。まとめると、本発明者らは、Ｎｐａｓ２の発現が減少した線維芽細胞が、筋線維芽細胞またはＧＴ線維芽細胞ではなく皮膚線維芽細胞に分化する可能性があり、そしてＮｐａｓ２抑制線維芽細胞が、部分的に再生しない場合でも、真皮のコラーゲン構造を良好に再構築する能力を誘導しうると考える。
本実施例は、末梢皮膚線維芽細胞におけるＮｐａｓ２抑制が細胞挙動を改変し、それがインビトロでの細胞増殖、細胞遊走および細胞収縮力の加速によって特徴付けられたことを実証する。さらに、Ｎｐａｓ２抑制は、真皮ＦＡＣＩＴコラーゲン合成の増加および厚いコラーゲン線維の形成をもたらした。これらの線維芽細胞の表現型は、皮膚の創傷治癒の改善および真皮コラーゲン構造の再構築の可能性に貢献していると考えられる。本試験の結果から、皮膚の創傷治癒におけるＮｐａｓ２などの概日時計分子のメカニズムは、皮膚特異的な細胞分化を促進する可能性が考えられる。これらの結果から、本発明者らは、Ｎｐａｓ２が皮膚創傷治癒を改善するための魅力的な治療標的となる可能性があると考える。
実施例２
ハイスループットスクリーニングを使用した、Ｎｐａｓ２発現を抑制する小分子化合物のスクリーニング
実施例１では、開発され、検証されたＮｐａｓ２－ＬａｃＺレポーター遺伝子を有するマウス皮膚線維芽細胞が、参照により全体を本明細書に組み込む、Ｓａｓａｋｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎａｌ ＰＡＳ Ｄｏｍａｉｎ ２（Ｎｐａｓ２）－Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ Ｓｋｉｎ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｒｍａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ａｎａｔ Ｒｅｃ（Ｈｏｂｏｋｅｎ）．２０１９によって説明されるように、ＬａｃＺの検出がＮｐａｓ２発現と一致することを確認した。
ＵＣＬＡ学術研究所は、Ｎｐａｓ２を標的とする再生時間療法の試験プラットフォームを確立した：（１）小分子化合物のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）、（２）インビトロ生物学的検証、および（３）マウス歯周炎モデルでのインビボ試験。この試験プラットフォームでは、再生活性を有する化合物であるレセルピンと、Ｎｐａｓ２を抑制する追加の化合物を同定することに成功した。
本発明者らは、ＨＴＳが標的遺伝子の発現を減少させる化合物を同定するのにあまり効果的でないことを見出した。Ｎｐａｓ２を抑制する多くの化合物は、細胞死または増殖抑制につながる細胞毒性のために偽陽性であることが判明した。
ＨＴＳプロトコルを、Ｎｐａｓ２抑制剤をより適切に同定するよう改善した。参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｈａｓｓａｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７；１２（８）：ｅ０１８３３５９によって説明されるように、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺレポーター遺伝子を有するマウスＭＳＣを、大規模なＨＴＳに対応させるためにＳＶ４０を使用して不死化した。不死化された初代ＭＳＣのＬａｃＺレポーター遺伝子の発現は一定していた（データ示さず）。この細胞系を、ＦＤＡ承認の薬剤ライブラリ（１１２０化合物）のスクリーニングに使用した。同じライブラリを用い、カルセインＡＭヘキスト３３３４２染色による細胞生存率についてもスクリーニングした。参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｊｏｙ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ．２０１４；９（２）：ｅ８８３５０によって説明されるように、ＯｒｉｓＴＭ Ｐｒｏ細胞遊走アッセイプレートを使用した細胞遊走アッセイを用い、ヒト皮膚線維芽細胞を使用するハイスループット遊走アッセイを行った。
組み合わせＺスコアを使用して、ヒット化合物を同定した（表１）。Ｎｐａｓ２を抑制する少数の化合物を同定した（表１）。Ｎｐａｓ２発現抑制化合物の最高ヒットの化合物は、Ｄｗｎ１、すなわちレセルピンであった。（Ｎｐａｓ２抑制ｚスコア：－２．５７、および細胞移動ｚスコア：４．１９）。
Ｄｗｎ１は、ＬＯＰＡＣライブラリから以前に同定されたＤｗｎＣ化合物と同一であった。Ｄｗｎ１化合物（レセルピン）を段階希釈分析用に選択した。有効濃度（ＥＣ）は、０．５～１０μＭの範囲であり、阻害濃度（ＩＣ）は＞１２．５μＭであった（図１０）。Ｄｗｎ１を、以下に説明する予備的なインビトロおよびインビボ試験に使用した。Ｎｐａｓ２を抑制する追加の化合物を同定した（表２）。
Figure 2022547271000059
Figure 2022547271000060
実施例３
インビトロ表現型試験
レセルピンを選択し、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）に対するその効果を、骨形成分化について特徴付けた。レセルピンは用量依存的にインビトロでのミネラル化作用を加速した（図７Ａ）。後期骨形成分化マーカーであるオステオクラシン（Ｏｃｎ）の発現は、２１日目に有意に増加したが、オステオポンチン（Ｏｐｎ）への影響は軽度であった（図７Ｂ）。
Ｎｐａｓ２が関与する作用機序を評価するために、レセルピンを、ＷＴ、Ｎｐａｓ２＋／－、およびＮｐａｓ２－／－マウスのＢＭＳＣに適用し、インビトロでの骨形成分化を評価した。レセルピンの効果は、ＷＴおよびＮｐａｓ２＋／－のＢＭＳＣで再現性よく観察された。しかしながら、それはＮｐａｓ２－／－ＢＭＳＣでは調節作用を示さず、ＢＭＳＣの骨形成分化をサポートするレセルピンの作用機序（ＭＯＡ）がＮｐａｓ２を抑制していたことを示唆する。
実施例４
インビボ皮膚創傷治癒試験
レセルピンを使用して、Ｎｐａｓ２抑制の皮膚創傷治癒能力を評価するために、インビボでの適用試験を実施した。レセルピンをカプセル化する変形可能なナノスケールベシクル（ＤＮＶ）を使用した経皮吸収型薬剤のプロトタイプを作製した。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｕｂｂｉａｈ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｆｏｒｍａｂｌｅ Ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ Ａｄａｐｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１７；２０１７：４７５９８３９に示されるように、 ＤＮＶは、マウス皮膚の角質化された表皮に浸透することができる。マウスの背部皮膚パンチ創傷（直径５ミリインチ）を形成させ、カスタムメイドのリングで固定し、その後、ビヒクル（ＭｉｌｌｉＱ水）、空のＤＮＶ、またはレセルピンをカプセル化したＤＮＶを、毎日創傷に適用した。７日目に、レセルピンをカプセル化したＤＮＶで処置された創傷は、他の適用群と比較し、加速された創傷治癒を示した（図８）。
実施例５
マウス歯周炎モデルにおける歯周組織の再生
一般的に使用されるリガチャー誘導性歯周炎のマウスモデルを、病理学的メカニズムの解析に利用した。リガチャーを、０日目に上顎第２大臼歯の周りに配置した。歯周炎による歯槽骨の吸収が観察され（図９Ａ）、また歯肉結合組織の変性が観察された（図９Ｃ）。リガチャーの配置は、歯周炎と一致する重度の炎症、上皮過形成および結合組織のコラーゲンの乱れを誘導した（図９Ｃ）。次に、リガチャーを７日目に取り除き、１週間治癒させた。このプロセスでは、スケーリングの日常的な歯科治療を模倣した。リガチャーの除去は、炎症反応（炎症）を有意に減少させたが、上皮および結合組織の異常は残り、歯槽骨は再生しなかった（図９Ｃ）。このモデルでは、リガチャーを除去した後、ＤＮＶに組み込まれたレセルピン（以下「レセルピン＋ＤＮＶ」）をマウスの歯肉組織に局所的に適用した（図９Ｂ）。レセルピン＋ＤＮＶ治療群は、対照と同様に、歯肉結合組織とコラーゲンの再配列を示した。歯槽骨の再生も観察された（図９Ｃ）。
実施例６
インビトロでの骨形成分化の促進に対するＮｐａｓ２抑制化合物の効力
実施例２において最良の組み合わせｚスコアを得た小分子化合物、Ｄｗｎ１（レセルピン）を、インビトロ生物学的アッセイのために選択した。Ｄｗｎ１を補充した骨形成誘導培地は、ＭＳＣのインビトロでのミネラル化作用を用量依存的に増加させた（図１１Ａ）。ＢＭＰ－２は、ＭＳＣの骨形成分化を促進するためのゴールドスタンダードとして使用されていた（４８、４９）。Ｄｗｎ１（１μＭ）の効果は、ＢＭＰ－２（１００ｎｇ／ｍｌ）の補充と同等であることがわかった（図１１Ａ）。Ｄｗｎ１による骨形成の分化は、オステオカルシン（ＯＣＮ）の発現の加速によっても裏付けられた（図１１Ｂ）。コア時計遺伝子Ｂｍａｌ１の発現は、Ｄｗｎ１の影響を受けなかった（図１１Ｃ）。Ｄｗｎ１は、Ｎｐａｓ２＋／－ＭＳＣのインビトロでのミネラル化作用を増加させたが、Ｎｐａｓ２－／－ＭＳＣでは増加させず（図１１Ｄ）、これは、Ｄｗｎ１（レセルピン）の効果が主にＮｐａｓ２抑制によって促進されたことを意味する。
実施例７
Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスの抜歯ソケットにおける急速な骨再生
Ｃ５７Ｂｌ６Ｊ（Ｂ６）野生型（ＷＴ）マウスに対し、上顎第１大臼歯の抜歯処置を行い、口腔粘膜および歯槽骨の両方の創傷治癒を行なわせた（白い矢印）。Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスの抜歯ソケットで急速な骨再生が観察された（図６Ａ～６Ｃ）。抽出ソケットでの骨形成は、軟骨前駆組織なしで膜内骨化が行われることが過去に実証されている。野生型マウスでは、骨形成は抜歯ソケットの下半分に限定されていた。対照的に、Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスでは、ソケットの８０％～１００％以上が新しい骨で満たされていることが示された。参照により全体を本明細書に組み込む、Ｃｏｏｍｅｓ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｃｃａｌ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｆｌａｐｌｅｓｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ， ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２／ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｃａｒｒｉｅｒ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｐｏｎｇｅ ａｌｏｎｅ．Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ．２０１４；８５（４）：５２５－３５で説明されるように、抽出ソケットの上半分の「骨形成」には、ＢＭＰ－２などの再生剤が必要である。 抜歯窩の上半分は通常、新しい骨で満たされないため、抜歯窩の上半分においてＢＭＰ－２などの再生剤によって誘導される「骨形成」は、新たな骨形成または骨再生と考えられた。Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスの抽出ソケット全体が満たされることは、前例のない骨再生活性であると解釈できる。Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスの骨髄由来の間葉系間質／幹細胞（ＭＳＣ、ＢＭＳＣとも呼ばれる）もまた、骨形成培地に曝露されたとき、強力なインビトロでのミネラル化作用（図６Ｄ）およびＢＭＰ－２発現の増加を示し（図６Ｅ）、概日リズム、特にＮｐａｓ２が骨再生を調節する可能性があることが示唆される。Ｎｐａｓ２ ＫＯ ＭＳＣは、ＢＭＰ受容体の発現増加も示した（データ示さず）。これらの観察は、治療法開発の新しい機会を探求する理論的根拠を提供するものであった。
本発明者らは、Ｎｐａｓ２の治療的抑制は、皮膚線維芽細胞および歯槽骨再生などの結合組織の未修飾機能および表現型の維持能力を高め、それにより、Ｎｐａｓ２の抑制は結合組織再生および歯槽骨再生の能力を高めると考える。
実施例８
リガチャー誘導性歯周炎マウスモデルにおける、歯槽骨再生に対するＮｐａｓ２抑制化合物の効力
実施例２の選択された最高ヒットの化合物であるＤｗｎ１（レセルピン）を、十分に確立されたリガチャー誘導性歯周炎モデルに変更を加えて適用した。１４日目に歯周炎が確立した後、非侵襲的歯周治療であるスケーリングおよびルートプレーニング（ＳＲＰ）を模倣したマウスの臼歯からリガチャーを除去した（図１２Ａ～１２Ｄ）。Ｄｗｎ１を、ＡＢＲ ＬＬＣの独自の経上皮変形可能ナノスケールベシクル（ＤＮＶ）（５７）中に製剤化し、週に１回、口蓋歯肉組織に局所投与した（図１２Ｅ）。実験群は、正常化された歯肉上皮を示した（図１２Ｆ、１２Ｈ）。歯槽骨の再生は、ｍｉｃｒｏＣＴによってＤｗｎ１で処置された口蓋側で示されたが、未処置の頬側では示されなかった（図１２Ｇ）。Ｄｗｎ１群では、歯槽骨のみならず、Ｓｈａｒｐｅｙ線維を含む歯周コラーゲンも再構築されたように見えた（図１２Ｈ）。Ｄｗｎ１（レセルピン）のインビボでの再生効果が明らかに示された。
実施例９
Ｎｐａｓ２下方制御化合物のスクリーニング
Ｎｐａｓ２－／－マウスに由来する大腿骨ＢＭＳＣは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈａｓｓａｎ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１７（Ｔｉｔａｎｉｕｍ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｂｅｒｒａｎｔ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｒｈｙｔｈｍｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２，ｅ０１８３３５９によって説明されるように、ＬａｃＺの発現について過去に特徴付けられ、ＬＯＰＡＣ１２８０のハイスループットスクリーニングに使用された（図１３Ａ）。Ｚスコア＞２．５または＜－２．５について分析したスクリーニングによるアウトプットデータは、合計２４のヒット、すなわちＮｐａｓ２発現を上方制御する７つの化合物、およびＮｐａｓ２を下方制御する１６個の化合物をもたらした（図１３Ｂ）。検証試験により、合計１４種の化合物が同定され（図１３Ｃ）、それらを化学的遺伝学的解析に供した。Ｎｐａｓ２を上方制御する化合物は、細胞内ｃＡＭＰを減少させるか、α２アドレナリン受容体を刺激することがわかった。対照的に、Ｎｐａｓ２を下方制御する化合物は、ｃＡＭＰを刺激または蓄積するか、またはｃＡＭＰ応答エレメント結合（ＣＲＥＢ）の活性化を誘導する（表３）。
Figure 2022547271000061
実施例１０
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）によるＮｐａｓ２発現を調節する小分子化合物の同定
培地をＭｕｌｔｉＤｒｏｐ Ｃｏｍｂｉシステムを使用して３８４ウェルプレートに分注し、選抜されたライブラリからの化合物を、自動化ＢｉｏｍｅｋＦＸシステムを使用して適用する。不死化したＮｐａｓ２－ＬａｃＺ ＭＳＣ（ウェル当たり１，５００細胞）を各ウェルに分注し、３７℃で３６時間（Ｎｐａｓ２のピーク発現時間）インキュベートする。次に、ＭＳＣをＬａｃＺ検出試薬（Ｂｅｔａ－Ｇｌｏ，Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＴ）とインキュベートし、βガラクトシダーゼ活性をルミノメトリーで測定する。ルミノメーターのデータを、ＣＤＤ Ｖａｕｌｔアルゴリズム（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖａｕｌｔ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で分析し、Ｚスコア＜－２．５であるものを抑制剤として第１に同定する。次に、初代ＭＳＣを第１のヒット化合物とインキュベートし、カルセインＡＭ／ヘキスト３３３４２で染色し、ハイスループットスピニングディスク共焦点顕微鏡（ＩｍａｇｅＥｘｐｒｅｓｓ Ｃｏｎｆｏｃａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で観察する。生存率を、細胞の数およびサイズによって決定する。ヒット化合物は、Ｎｐａｓ２ Ｚスコア（＜－２．５）および細胞生存率Ｚスコア（＞－２．５）によって決定する。
検証
ヒット化合物を、３枚の３８４ウェルプレートに分注し、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺレポーター遺伝子を含む初代ＭＳＣを添加する。３６時間のインキュベーション後、βガラクトシダーゼ活性を測定する。検証された化合物は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により、ｐ＜０．０１で、未処理の対照よりも統計的に少ないＮｐａｓ２－ＬａｃＺ発現を示さなければならない。
ＥＣおよびＩＣの滴定
検証済みのヒット化合物を、３枚の３８４ウェルプレートの２０ウェルで１００μＭ～０．２ｎＭで滴定し、初代Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺ ＭＳＣ（ウェル当たり１，５００細胞）を分注する。３６時間のインキュベーション後、細胞数およびベータガラクトシダーゼ活性を測定する。Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺの有意な下方制御および細胞数の減少を伴う化合物の濃度範囲を、それぞれ、ＥＣ範囲およびＩＣ範囲とする。ＥＣ５０≧１０×ＩＣ５０の最小治療指数を有する最終ヒット化合物が同定される。
生物学的変数としての性別
参照により全体を本明細書に組み込む、Ｏｋｕｂｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８３０６によって説明されるように、単離された骨格細胞の概日時計の挙動において、性差は観察されなかった。ＨＴＳ（脊椎動物）では雌雄別のＭＳＣを使用することを提案する。
予想される結果
約４０，０００の化合物から、Ｎｐａｓ２を下方制御する４０（または０．１％）のヒット化合物が同定され、約１００の化合物が検証されると予想される。ヒット化合物は、ＥＣおよびＩＣの指数によってさらに排除される。２０個の候補化合物がさらに分析されると予想される。
潜在的な問題および代替的な計画
ＨＴＳの場合、不死化ＭＳＣを使用することを提案する。対立遺伝子ゲノムのＰＣＲを、安定性を確保するために５継代後に実施する。可能性は低いが、遺伝子の変化やその他の変異が発生する可能性がある。必要に応じて、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺマウス由来の初代ＭＳＣの新しいバッチを使用する。
実施例１１
インビトロでの骨形成分化の加速に対するＮｐａｓ２抑制化合物の効力の確立
ＡＬＰ発現アッセイおよびインビトロミネラル化アッセイ
野生型の雄および雌のマウスのＭＳＣを、３７℃、５％ＣＯ２下、１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養する。セミコンフルエンスに達した後、培地を、ヒット化合物の１つ（０．１％ＤＭＳＯ中０．１、１、および１０μＭ）を含む骨形成培地（１００ｎＭデキサメタゾン、１０ｍｍ βグリセロホスフェート、５０μＭアスコルビン酸）に交換する。デキサメタゾンへの曝露はＭＳＣを同期させることに留意しなければならない。培養７日目に、細胞溶解物の酵素ＡＬＰ活性を、市販のキット（Ａｂｃａｍ ａｂ８３３６９など）を使用して測定する。比色データをＡＬＰ酵素活性に変換する（化合物当たりｎ＝３）。これとは別に、２１日目に、標準プロトコル（ＡＲｅｄ－Ｑ，Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、またはＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍｅ Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｙｗａｒｄ，ＣＡ）に従ってインビトロでのミネラル化を評価する。アリザリンレッドＳ濃度またはＣａ＋＋濃度平均値（ｎ＝３）を得る。
骨形成分化関連遺伝子の発現
「候補」化合物は、経時的なインビトロ骨形成分化について特徴付けを行う。上記の実験から同定された「候補」化合物で、加速骨形成分化のための最良濃度で曝露された野生型ＭＳＣを使用し、３、７、１４および２１日の培養期間での全ＲＮＡサンプルを単離する。リアルタイムＰＣＲを、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｘ、Ｏｃｎ、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐｒ２、Ｃｏｌ１ａ１、Ｏｐｎ、および対照としてのＧａｐｄｈに対して実施する。
対照
未処理の対照として、０．１％ＤＭＳＯを使用したＭＳＣの、ＡＬＰ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ無機化、骨形成遺伝子発現の定量値を得る。陽性対照として、骨形成培地にＢＭＰ－２（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充することを提案する。
データ分析
未処理対照および陽性対照を含むすべてのアッセイデータを、１を最強としてランク付けする。次に、未処理のＭＳＣのランクを超える合計ランクを有する化合物を同定する。このリストから、最強の５つの合計ランクを有するものを「候補」化合物として選抜する。ＢＭＰ－２処理陽性対照と同等の活性を示す可能性のある候補化合物が予想される。
生物学的変数としての性別
骨の体積および構造は第２次性徴であり、雄のＭＳＣは雌のＭＳＣよりも多くのミネラル化した団塊を形成している。雄および雌のＭＳＣの間での固有の分子的相違が示唆されている。雄および雌のＭＳＣ（脊椎動物）を使用することを提案する。
予想される結果
ヒット化合物は、（１）骨代謝回転マーカー、ＡＬＰ発現、ならびに（２）加速された骨形成分化の実証のためのインビトロミネラル化作用、によって好適に評価されることが期待される。ランク付けプロトコルにより、候補化合物を同定できるはずである。ほとんどの化合物は、未処理対照よりも統計的に高いＡＬＰおよびインビトロミネラル化データを生じさせると予想される。トップランクの化合物は、ＢＭＰ－２由来の骨形成分化と同等のレベルを示す可能性がある。骨形成分化関連の遺伝子発現のランクが高い化合物を用いる。「候補」化合物は、骨形成遺伝子の協調的な経時的発現を通じて、加速されたインビトロ骨形成分化を実証するはずである。上位１０個の「候補」化合物を、インビボ試験のために選抜し、マウスリガチャー誘導性歯周炎モデルにおける歯槽骨再生のためのＮｐａｓ２抑制化合物の有効性の実証に用いる。
潜在的な問題および代替的な計画
有効用量は変化し得る。ＥＣの範囲が、ＨＴＳによりＮｐａｓ２発現を調節するものとして同定された小分子化合物について提案される０．１～１０μＭの用量範囲の外である場合、その化合物はカスタマイズされた濃度範囲で試験し、必要に応じて医薬化学的解析に供する。ヒトとマウスのＭＳＣでは、ＢＭＰ－２に対して異なる反応を示すことに留意すべきである。生理学的濃度のＢＭＰ－２を含む高度に生理学的な骨形成分化カクテルは、全体を参照により本明細書に組み込む、Ｈｏｎｄａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：３４２０によって説明されるように、フィードバック系制御アルゴリズムによって以前に開発された。陽性対照には、従来のＢＭＰ－２（１００ｎｇ／ｍｌ）培地を使用することを提案するが、必要に応じて、代替の陽性対照カクテルを使用し得る。
実施例１２
マウスリガチャー誘導性歯周炎モデルにおける、歯槽骨再生に対するＮｐａｓ２抑制化合物の有効性の実証
組換え成長因子の有無における、低侵襲性の外科的デブリードマンは、小さな骨下ポケットにおける同様のＸ線写真による骨充填を示した。歯槽骨の再生をサポートするために、固有の環境が提案されている。想定される時間療法は、異所性骨形成を誘導しないかも知れないが、宿主における治癒環境をサポートする。この仮説を試験するために、上位５つの候補化合物を、修飾されたマウスリガチャー誘導性歯周炎モデルに適用し、インビボでの歯槽骨再生の有効性を決定する。
ＤＮＶの製剤化
水溶性または脂溶性の小分子化合物を、水性成分または脂質成分のいずれかに溶解させる。マイクロフルイディクスを使用して、水性成分と脂質成分を混合して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１６０６２５５２に記載されるようなＤＮＶを生成させる。ＤＮＶを凍結乾燥粉末として得る。
マウス歯周炎
雄および雌の両方のマウスを使用する。歯周炎を誘導するために、５．０シルク縫合糸を上顎第２大臼歯の周りに配置する。１４日後、非外科的デブリードマン治療であるスケーリングおよびルートプレーニング（ＳＲＰ）を模倣して縫合糸を取り除く。ＤＮＶの候補化合物を精製し、滅菌水で再構成し、口蓋歯肉に局所的に適用する（図１２Ｅを参照）。
データ分析
２８日目に、マウスの上顎骨を採取し、ｍｉｃｒｏＣＴ（ｎ＝２０／群）およびカルセイン注射による骨形態計測分析（ｎ＝１０／群）、ならびに脱灰組織学（Ｈ＆Ｅおよびピクロシリウスレッド染色：ｎ＝１０／群）を行う。さらに、骨代謝マーカー（Ｔｒａｃｐ５ｂ、ＣＴＸ、Ｐ１ＮＰおよびＡＬＰ）の血清中レベルを測定する。
サンプルサイズ
過去のｍｉｃｒｏＣＴデータ（図１２Ｇ）から、０．８の力に到達するためには２０のサンプルサイズを提案する。
生物学的変数としての性別
第２次性徴として雄において歯周炎の有病率が高いことが報告されており、とりわけ自然免疫の性差による可能性が考えられる。マウスリガチャー誘導性歯周炎モデルにおいて、歯槽骨再生のためのＮｐａｓ２抑制化合物の有効性を実証するため、本実施例においては雄および雌のマウスを使用することを提案する。（脊椎動物）。
予想される結果
歯槽骨再生の主な結果を、ｍｉｃｒｏＣＴによって評価する。裏付けとなる証拠は、組織形態的計測、組織学的解析、および血清マーカーから得られる。歯肉／ＰＤＬ結合組織の再生に関する探索的結果を、ピクロシリウスレッド染色を行った組織の共焦点レーザー走査顕微鏡によって評価する。実施例「フェーズＩＩ」における試験のための、上位５つの化合物が同定されることが予想される。
潜在的な問題および代替的な計画
候補化合物の製剤化には詳細な最適化が必要であることに留意すべきである。フェーズＩ（本明細書で提案される実施例）の範囲内では、すべての候補化合物に対してＤＮＶ経口上皮薬物製剤を使用することを提案する。最適な製剤については、実施例１３（フェーズＩＩ）で述べる。
実施例１３
フェーズＩＩ
本実施例では、（１）最終的な製剤、（２）イヌの歯周炎における有効性、（３）歯周および歯槽骨の再生のための小分子化合物ベースの時間療法の安全性の決定を目論む。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｏｌ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ａｎｉｍａｌｓ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ’ｓ ｎｅｗ ｂｅｓｔ ｆｒｉｅｎｄｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５；７（３０８）：３０８ｐｓ２１およびＡｒｚｉ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒａｎｉｏｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌｓ．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ．２０１８；９７（４）：３６４－７０によって説明されるように、大型動物（イヌ）における試験を計画する。
実施例１４
頭蓋顔面組織再生におけるＮｐａｓ２の役割
広範囲の損傷および慢性炎症は、しばしば線維症を伴う創傷修復をもたらし、それが組織の再生を妨げる。したがって、「創傷修復遺伝子Ｎｐａｓ２」の抑制は、組織再生に向けた創傷治癒につながる可能性があるとの仮説が立てられた。Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスの頭蓋冠に生じた重大なサイズの欠陥が、低用量のＢＭＰ－２（３２５ｎｇ以降）の存在下、骨および骨髄組織の強力な再生によって治癒した（図１４Ａ、１４Ｂ）。頭蓋冠欠損と同様に、抜歯ソケットでの骨形成は、軟骨前駆組織なしで膜内骨化を起こすが、抜歯後の骨再生は歯槽骨ソケットの下半分に限定されている。現在では、抽出ソケットの上半分を埋める他の唯一の方法は、ＢＭＰ－２などの再生剤を使用することである。Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスは、外因的なＢＭＰまたは幹細胞の適用なしで、抜歯ソケットの８０％～１００％以上を新しい骨で満たした点で独特である（図１４Ｃ、１４Ｄ）。
実施例１５
歯周炎による歯槽骨喪失がＮｐａｓ２ ＫＯマウスで再生された
歯周炎は、口腔微生物病原体の細菌叢異常が、不調和な口腔バリア免疫と相まって引き起こされる慢性炎症である。上顎臼歯の周りへのリガチャーの配置は、マウスに歯周炎を誘導することが示されており、このモデルを、口腔微生物の挙動、歯肉バリア免疫反応、および積極的な歯槽骨吸収を特徴付けるために使用した（図１５Ａ～１５Ｃ）。このマウスモデルにおいて、影響を受けた歯肉組織のＮｐａｓ２発現レベルが徐々に増加することがわかった（図１５Ｄ）。現在行われている治療法は、スケーリングおよびルートプレーニング（ＳＲＰ）によって歯垢および歯石を歯周ポケットから機械的に除去することである。１４日目に縫合糸を取り除き、２週間の治癒を監視（Ｄ２８）することによって、ＳＲＰを模倣した。歯肉の炎症は治まったが（図１５Ｅ）、失われた歯槽骨の高さ（図１５Ｆ）は、ＷＴマウスでは回復しなかった（図１５Ｇ）。この歯周炎モデルをＮｐａｓ２ ＫＯマウスに適用した場合、Ｄ１４での歯槽骨喪失はＷＴマウスと区別できなかった（図２Ｆ）。しかし、「ＳＲＰ」処置を模倣した後、歯槽骨の高さはＮｐａｓ２ ＫＯマウスで有意に回復した（図２Ｇ）。
実施例１６
Ｎｐａｓ２を抑制する小分子化合物は、マウス歯周炎において歯槽骨を再生した
ＵＣＬＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＭＳＳＲ）は、医薬候補化合物のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）をサポートする有料のコア施設である。ＭＳＳＲは、学術機関向けのユニークな施設であり、様々なライブラリに２００，０００を超える化合物、ならびにＣＲＩＳＰＲ、ｃＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡのゲノムワイドなセットのアレイを保存している（ｍｓｓｒ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ）。本発明者らは、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺレポーター系を担持するマウスＭＳＣおよび線維芽細胞を使用して、複数のＨＴＳを実施した。ＨＴＳの２つの目的は、［１］化学的ゲノミクス分析を通じてＮｐａｓ２調節のメカニズムを解明すること、および［２］Ｎｐａｓ２を抑制する化合物が歯槽骨を再生できるか否かを解明すること、とした。
ＦＤＡ承認薬ライブラリ（１１２０化合物）およびＬＯＰＡＣライブラリ（１２８０化合物）から、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺ発現を調節する化合物のリストを特定した。後者の目的のために、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺ発現を下方制御する１つの化合物（Ｄｗｎ１）を選択し、マウス歯周炎／治療モデルに適用した（図１５Ｅ～１５Ｇ）。Ｄｗｎ１を、口蓋歯肉への局所適用用に製剤化した。歯周炎誘導の１４日後、リガチャーを取り除き、Ｄｗｎ１を週１回、口蓋歯肉に局所的に適用した（図１６Ａ）。Ｄ２８では、Ｄｗｎ１が適用された口蓋側でのみ有意な歯槽骨の再生が観察された（図１６Ｂ、１６Ｃ）。歯肉および歯根膜のコラーゲン線維が、シャーピー線維の潜在的な再生とともに再編成されたというさらなる予期しない結果が観察された（図１６Ｄ）。これらの結果は、経口再生時間療法の実行可能なオプションの臨床的および移行的開発を追求するための基礎を提供するものであった。
実施例１７
ＨＴＳ－化学的ゲノミクスからの時間生物学的仮説
ＨＴＳデータの化学的ゲノミクス分析により、モノアミン関連の輸送体および受容体を標的とする薬物のクラスターが特定された（図１７）。モノアミン（すなわち、ノルアドレナリン、セロトニン、ドーパミン、ヒスタミン）は、神経伝達物質として広く特徴付けられており、この軸を標的とする多数の薬剤が開発されている。それらの受容体は、ＭＳＣなどの非神経細胞で発見されており、モノアミン誘導シグナル伝達が骨芽細胞の成長およい分化を調節すると仮定されていることに留意すべきである。さらに、モノアミン輸送体は非神経細胞でも報告されており、すべてのモノアミン輸送体がＭＳＣによって発現されていることがわかった（図１８）。
実際、Ｄｗｎ１は汎モノアミン輸送体の１つの阻害剤であり、Ｎｐａｓ２を下方制御し、組織再生活性を示し（図１６Ａ～１６Ｄ）、これは、モノアミンの受容体および輸送体の調節軸が、Ｎｐａｓ２の発現を調節して、再生能力を誘導する可能性があることを示唆するものである。ＨＴＳ／化学的ゲノミクスのデータを利用して、モノアミン経路軸および下流のＮｐａｓ２発現に焦点を当てた試験において、組織再生の時間生物学的解析を行う。この試験により、歯周組織再生のために提案された時間療法の作用機序（ＭＯＡ）が確立されるはずである。
実施例１８
歯周組織再生のための「時間療法」
概日を同期させることで、多くの分子的、生理学的、生物学的プロセスに影響が及ぶ。概日リズムの調節不全は、神経精神病のみならず、代謝性疾患やがんにおいても報告されている。例えば、悪性胸膜中皮腫およびアルツハイマー病の場合にはＢｍａｌ１など、概日時計分子が治療標的になり得ることを示唆する報告が増えている。概日システムを調節する小分子による治療可能性は、「時間療法」の新しいアプローチとして提案される。このプロジェクトは、歯の組織再生のための革新的な小分子化合物ベースの時間療法を開発することを提案するものである。この目的のために、モノアミン経路軸の化学的空間を、Ｎｐａｓ２発現の調節に関して詳細に試験する。以下のアプローチを使用する。
試験１。化学的空間に特異的なＨＴＳ化合物ライブラリを構築し、Ｎｐａｓ２を調節するための時間治療化合物を同定する（ＡＢＲ ＬＬＣによって実施する）
理論的根拠および目的。予備的なＨＴＳにより、ＭＳＣでのＮｐａｓ２の発現に影響を与えるモノアミン関連の輸送体および受容体を標的とする薬物のクラスターを同定した。この試験の目的は、モノアミン輸送体およびモノアミン受容体の化学的空間で選抜された小分子化合物で構成される、カスタマイズされた化合物ライブラリを使用して、焦点を絞ったＨＴＳを実施することである。この試験は、［１］モノアミン経路の化学的空間用にカスタマイズされた焦点を絞った化合物ライブラリを構築すること、［２］完全なＨＴＳを行うこと、［３］Ｎｐａｓ２の発現およびＭＳＣの骨形成分化を検証すること、［４］有効濃度（ＥＣ）および抑制濃度（ＩＣ）を決定すること、を提案するものである。
ＡＢＲ ＬＬＣは、ＵＣＬＡ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＮＳＩ）にインキュベーター空間を有し、ＵＣＬＡ薬物スクリーニングのコア施設であるＭＳＳＲも収容する。ＡＢＲ ＬＬＣはＭＳＳＲに完全にアクセスでき、そこで化学的空間に特異的なライブラリがカスタマイズされ、ＨＴＳが実施される。ＡＢＲ ＬＬＣは、このプロジェクトの目的を完了すると考えられる。
実験１（化学的空間に特異的なライブラリ）。７つのモノアミン輸送体が存在する（図１８）。ＭＳＳＲには、阻害剤として機能する、モノアミン輸送体を標的とする合計５１の化合物が存在する。これとは別に、アドレナリン受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、ムスカリン／ニコチン性受容体、およびＨ１受容体は、合計２８３の化合物により標的とされる。これらの化合物は、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである。その結果、合計３３４の化合物がモノアミンの化学的空間に特異的な化合物のライブラリに含まれることとなる。化合物ライブラリは、ＨＴＳ用のビヒクルのみの対照ウェルを含む３８４ウェルプレートで構築される。
実験２（ＨＴＳ）。培地をＭｕｌｔｉＤｒｏｐ Ｃｏｍｂｉシステムを使用して３８４ウェルプレートに分注し、化学的空間特異的ライブラリからの化合物を、自動化Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸシステムを使用して適用する。不死化したＮｐａｓ２－ＬａｃＺ ＭＳＣ（ウェル当たり１，５００細胞）を各ウェルに分注し、３７℃で３６時間（Ｎｐａｓ２のピーク発現時間）インキュベートする。ＭＳＣを、細胞生存率測定用のハイスループットスピニングディスク共焦点顕微鏡（ＩｍａｇｅＥｘｐｒｅｓｓ Ｃｏｎｆｏｃａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）用に、カルセインＡＭ／Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、ＬａｃＺ検出剤（Ｂｅｔａ－Ｇｌｏ，Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＴ）とインキュベートする。βガラクトシダーゼ活性は、ルミノメトリーによって測定する。データを、ＣＤＤ Ｖａｕｌｔアルゴリズム（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖａｕｌｔ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で分析し、Ｎｐａｓ２の発現および細胞生存率が測定され、各測定のＺスコアが決定される。上記の予備的データに基づくと、Ｎｐａｓ２のＺスコアの閾値は＞２．５および＜－２．５であり、細胞生存率のＺスコアの閾値は－１．０～＋１．０である。
実験３（検証）。Ｎｐａｓ２の調節に有効な化合物を、３枚の３８４ウェルプレートに分注し、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺレポーター遺伝子を含むＭＳＣを添加する。３６時間のインキュベーション後、βガラクトシダーゼ活性を測定する。検証された化合物は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により、ｐ＜０．０１で、未処理の対照よりも統計的に調節されたＮｐａｓ２－ＬａｃＺ発現を示すはずである。
図１０に滴定アッセイを示す。Ｄｗｎ１を１００μＭ～０．２ｎＭまで段階希釈し、ＭＳＣ Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺに適用した。ＥＣはＬａｃＺ発現によって測定し、ＩＣはカルセインＡＭ／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色を使用した細胞生存率によって測定した。
実験４（ＥＣおよびＩＣの滴定）。Ｎｐａｓ２を抑制することが検証済みのヒット化合物を、３枚の３８４ウェルプレートの２０ウェルで１００μＭ～０．２ｎＭで滴定し、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺ ＭＳＣ（ウェル当たり１，５００細胞）を分注する。３６時間のインキュベーション後、細胞数およびベータガラクトシダーゼ活性を測定する（図１０）。Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺの有意な下方制御および細胞数の減少を伴う化合物の濃度範囲を、それぞれ、ＥＣ範囲およびＩＣ範囲とする。ＥＣ５０≧１０×ＩＣ５０の最小治療的指数を有する最終ヒット化合物が同定される。この試験ではまた、各ヒット化合物の最適濃度も決定される。
実験５（骨形成分化）。０．１％ＤＭＳＯ中の最適濃度のＮｐａｓ２抑制ヒット化合物を、ＷＴの雄および雌のマウスのＭＳＣ用の、従来公知の骨形成培養液に添加する。骨形成分化の程度を、ＡＬＰ活性（例えば、Ａｂｃａｍ ａｂ８３３６９）およびインビトロミネラル化（すなわち、ＡＲｅｄ－Ｑ，Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって測定する（図１９）。さらに、全ＲＮＡサンプルを、３、７、１４、および２１日の培養期間で調製する。リアルタイムＰＣＲを、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｘ、Ｏｃｎ、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐｒ２、Ｃｏｌ１ａ１、Ｏｐｎ、および対照としてのＧａｐｄｈに対して実施する。対照：未処理の対照としての、０．１％ＤＭＳＯを使用したＭＳＣにおける、ＡＬＰ、インビトロミネラル化、および骨形成遺伝子発現の値を測定する。陽性対照には、ＢＭＰ２（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む骨形成培地を使用する。
生物学的変数としての性別。単離された骨格細胞の概日時計の挙動において性差は観察されなかった。実験１～４では、雄雌別のＭＳＣの使用を提案する。骨の体積および構造は第２次性徴であり、雄のＭＳＣは雌のＭＳＣよりも多くのミネラル化した団塊を形成している。雄および雌のＭＳＣの間での固有の分子的相違が示唆されている。実験５では雄および雌のＭＳＣが使用される。
予想される結果。この試験における新しい化学的空間に特異的なＨＴＳに基づく化学的ゲノミクス解析は、ＭＳＣのＮｐａｓ２発現を高解像度で調節する際のモノアミン関連経路の役割をさらに明らかにするはずであり、これは時間療法の機構的理解につながるはずである。非神経細胞におけるモノアミン輸送体の機能が最近研究された。血管周囲脂肪組織（ＰＶＡＴ）におけるノルエピネフリンの代謝が研究された。ＰＶＡＴ脂肪細胞は、モノアミン輸送体（ベシクルモノアミン輸送体（ＶＭＡＴ１、ＶＭＡＴ２）、原形質膜モノアミン輸送体（ＰＭＡＴ）、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ））を発現することがわかった。ノルエピネフリンアナログの蛍光シグナルの細胞内蓄積は、インビトロにおいて、ＶＭＡＴ、ＰＭＡＴおよびＮＥＴの化学的阻害剤によって著しく減少した。したがって、モノアミン輸送体を標的とする化合物は、培地中のモノアミン濃度を調節し、ＭＳＣのモノアミン受容体の機能に影響を与える可能性があると予想される。
これとは別に、モノアミン受容体のアンタゴニストおよびアゴニストは、それらの機能を直接調節し、下流のシグナル伝達経路に影響を与える可能性がある。セロトニンアンタゴニストは、肝細胞の再生の低下に関連しており、血小板や炎症細胞から分泌されるセロトニンは、皮膚の創傷治癒に重要な役割を果たす。最近、セロトニン受容体アゴニストが皮膚の創傷治癒を促進することが示された。本試験では、Ｎｐａｓ２発現に対するアゴニストおよびアンタゴニストの効果を測定する。
化学的ゲノミクス解析により、Ｎｐａｓ２発現を調節するための特定のモノアミン経路が決定できるはずである。特に、Ｎｐａｓ２の発現を低下させる化合物のリストが得られることが期待される。これらの化合物は、統計的に大きなＡＬＰおよびインビトロミネラル化、ならびに骨形成遺伝子の協調的な経時的発現によって評価される骨形成分化を増加させることが期待される。トップランクの化合物は、ＢＭＰ－２由来の骨形成分化と同等のレベルを示す可能性がある。最小治療ＥＣ／ＩＣインデックスを有するこれらのヒット化合物は、フェーズＩＩプロジェクトにおける時間療法開発において同定されるであろう。
潜在的な問題および代替的な計画。ＨＴＳの場合、不死化ＭＳＣを使用することを提案する。対立遺伝子ゲノムのＰＣＲを、安定性を確保するために５継代後に実施する。可能性は低いが、遺伝子の変化やその他の変異が発生する可能性がある。必要に応じて、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺマウス由来の初代ＭＳＣの新しいバッチを使用する。
試験２．ヒトＭＳＣにおけるＮｐａｓ２発現および骨形成分化に対するモノアミン受容体および輸送体の調節的役割を決定する（ＵＣＬＡ研究所によって実施）
理論的根拠および目的。リガチャー誘導性歯周炎の影響を受けた歯肉組織では、Ｎｐａｓ２発現の増加が進行することが明らかにとなった（図１５Ｄ）。これとは別に、ＭＳＣは、従来では神経細胞に特異的であると考えられていたモノアミン輸送体を発現することがわかった（図１８）。ヒトＭＳＣのアドレナリン受容体の発現プロファイルは、培養環境によって敏感に調節されることが示されている。したがって、モノアミン受容体および／または輸送体の発現の環境的調節が、Ｎｐａｓ２発現を介するＭＳＣの分化能に影響を与えるという仮説がさらに立てられる。本試験の目的は、モノアミン関連分子の過剰発現によるヒトＭＳＣの挙動を特徴付けることである。［１］ヒトモノアミン受容体および輸送体のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現プラスミドを、レンチウイルスベクターにおいて調製する。［２］ヒトＭＳＣに、モノアミン受容体および輸送体のそれぞれを過剰発現するように形質導入する［３］Ｎｐａｓ２の発現および骨形成分化を測定する。
ＭＰＩのＵＣＬＡラボにおいて、試験２で提案されたすべてのプロジェクトを実施する。試験１および試験２のプロジェクトは、包括的な目標に対して補完的に取り組むものであることに留意すべきである。
実験１（ＯＲＦ発現プラスミド）。化学的ゲノミクス解析および文献のレビューから、７つのモノアミン輸送体および１７のモノアミン受容体を、このプロジェクトのために選抜した（表４）。
Figure 2022547271000062
ヒトＯＲＦに関する公開されたゲノムスケールのレンチウイルス発現ライブラリ（５０）から、ＯＲＦ発現ベクターのリストを得た。従来公知の第３世代レンチウイルスベクター作製プロトコル（５１、５２）を使用して、ヒトモノアミン関連分子の発現ベクターを構築する。
実験２（モノアミン関連分子を過剰発現するヒトＭＳＣ）。ヒトＭＳＣ（ｉＭＳＣ３、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）に、抗生物質（ブラストサイジン）耐性遺伝子を有するレンチウイルスベクターによって形質導入する。形質導入された細胞を、ブラストサイジンによって選抜する（５μｇ／μｌ：死亡曲線から）。生存したＭＳＣを増殖培地で増殖させ、形質導入された遺伝子の過剰発現を確認する。以下の実験は、形質導入されたＭＳＣを使用して実施する。
実験３（Ｎｐａｓ２の発現）。モノアミン関連分子のそれぞれで形質導入されたＭＳＣに対し、ＲＴ－ＰＣＲを使用してＮｐａｓ２の発現について解析する（５３）。Ｎｐａｓ２は概日リズムのコア遺伝子であるため、ＭＳＣをフォルスコリン（１０μＭ）によって２時間同期させる。ＲＮＡサンプルを、同期後２４時間～７２時間にわたり４時間ごとに調製する。
実験３（骨形成分化）。モノアミン関連分子で形質導入されたＭＳＣを、骨形成分化に供する。インビトロでの骨形成分化については、ＡＬＰ酵素活性によって、またインビトロでのミネラル化については、アリザリンレッド染色によってモニターする。骨形成分化関連遺伝子の経時的発現を、ｑＰＣＲによってモニターする。
実験４（幹細胞マーカーの発現）。Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異を有するＭＳＣは、未分化段階で幹細胞マーカーであるＮａｎｏｇおよびＫｌｆ４を高いレベルで維持しながら、高い多能性分化能を示した（図２０Ａ～２０Ｃ）。歯の起源となるＭＳＣは、歯周組織の再生に重要な役割を果たすと言われている。したがって、幹細胞の特性に対するモノアミン関連分子の過剰発現の影響を解析する。時間経過における増殖、および間葉系幹細胞マーカーであるＮａｎｏｇおよびＫｌｆ４の発現を促成する。
生物学的変数としての性別。雄および雌のＭＳＣの間での固有の分子的相違が示唆されている。しかしながら、供給源情報なく提供されることになる市販のクローン化ＭＳＣを使用することを提案する。
予想される結果。モノアミンに関連するＮｐａｓ２発現の増加は、ＭＳＣの骨形成分化を減少させると予想される。対照的に、Ｎｐａｓ２の発現が減少したＭＳＣは、Ｎｐａｓ２ ＫＯ ＭＳＣと同様の挙動を示すことが予想される（図２０Ａ～２０Ｃ）。試験２の主な目標は、いずれのモノアミン関連分子がＮｐａｓ２の発現を効果的に調節（増加または減少）させるかを決定することである。セロトニンと概日系との相互作用が、ＳＣＮおよび気分障害で報告されている。ドーパミンは、網膜においてＮｐａｓ２の概日発現に影響を与えることが示されている。αアドレナリン受容体の上方制御は、ＭＳＣでのＮｐａｓ２発現を増加させることが示唆されている。ここでの予備的データは、Ｎｐａｓ２発現の調節における汎モノアミン輸送体の関与を示唆した（図１０）。したがって、Ｎｐａｓ２の発現を調節する特定のモノアミン関連分子を同定する可能性が高いと考えられる。
このプロジェクトにおいてモノアミン関連分子が新たに同定されることは、創傷および慢性炎症における再生能力の低下に関する新規な分子メカニズム、すなわち、モノアミン関連分子の環境的な調節が潜在的にＮｐａｓ２の下流の上方制御を通じて病理学的な役割を果たしうることを即座に示唆するはずである。それにより、提案された時間療法のＭＯＡが確立される。
潜在的な問題および代替的な計画。Ｎｐａｓ２はコア時計遺伝子の１つである。他の時計遺伝子がモノアミン関連分子によって調節される可能性があり、これを特徴付けるべきである。
細胞培養用の血清成分には、生理的濃度のモノアミンが含まれている。ただし、モノアミンは培地に補充されることが示されている。
フェーズＩの結果は、インビトロでの完全な特性評価により、化学的空間に特異的なＮｐａｓ２を抑制するモノアミン化合物を効率的に同定して、幹細胞分化におけるＮｐａｓ２の時間生物学的役割を解明するものである。試験１（ＡＢＲ）および試験２（ＵＣＬＡ）プロジェクトは、包括的な目標に補完的に取り組んでいる。ＭＰＩは、提案されたプロジェクトを効率的に管理するために、進捗状況および結果を定期的に交換している。
フェーズＩＩおよび商品化計画には、［１］臨床応用に適する候補小分子の最適な製剤化、［２］マウス歯周炎モデルにおける歯槽骨再生に向けた有効性の評価、［３］イヌの歯周炎を使用した前臨床有効性および安全性に関する試験、［４］ＦＤＡへの申請のための、ＩＳＯ１０９９３－１に準拠した生体適合性／安全性の評価、が含まれ得る。
実施例１９
外科的瘢痕の予防のためのＮｐａｓ２の小分子阻害剤
多くの努力にもかかわらず、瘢痕を最小限に抑える効果的な治療法は十分に開発されていない。世界中で、毎年１億人の患者が、選択的および外傷的な手術のみにより瘢痕を発症させている。外科的症例の４０～７０％において、患者は、コラーゲンが高密度のコラーゲン線維組織を構成することを特徴とする、過剰量のコラーゲン沈着によって引き起こされる肥厚性瘢痕および隆起した瘢痕（「線維症」）を経験する。（図２１）。瘢痕予防のための現在の標準的な治療法は、継続的なコルチコステロイド注射、レーザー治療、外科的切除、および／または放射線療法である。
熱傷創傷治癒について図２２に示されるように、また皮膚線維芽細胞の遊走のインビトロスクラッチモデルにおいて（全体を参照により本明細書に組み込む、Ｈｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ２０１７に記載されるように）、概日リズムは創傷治癒に影響を与える。
全ゲノムのインビボマイクロアレイ解析により、Ｔ字型チタンロッドを埋め込まれたラット大腿骨においてＮｐａｓ２が上方制御され（図２３左）、またＮｐａｓ２ノックアウト（ＫＯ）（Ｎｐａｓ２－／－）マウスでは、それぞれの全内容を参照に本明細書に組み込む、Ｍｅｎｇａｔｔｏ ｅｔ ａｌ，ＰｌｏｓＯｎｅ，２０１１およびＭｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１９によって説明されるように、野生型（ＷＴ）およびＮｐａｓ２＋／－と比較し、チタンインプラント表面の線維組織において高密度コラーゲンが形成されないことが明らかとなった。（図２３の右図）、Ｎｐａｓ２ ＫＯは、参照により全内容を本明細書に組み込む、Ｓａｓａｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｒｅｃｏｒｄ，２０１９によって説明されているように、マウスモデルにおいて創傷治癒を改善する。
インビトロ創傷治癒アッセイは、Ｎｐａｓ２ ＫＯ皮膚線維芽細胞がインビトロモデルで創傷治癒を改善することを示した（図２４～２５および図３Ｃ）。
上記の実施例２は、Ｎｐａｓ２を下方制御する１０の化合物を同定したＮｐａｓ２抑制剤のハイスループットスクリーニングについて説明する（図１３Ａおよび２６に示す）。
本明細書に記載されるように、ニューロンＰＡＳドメイン２（Ｎｐａｓ２）の小分子阻害剤であるＤｗｎ１は、創傷治癒を改善し、瘢痕化を最小限に抑制する。図２７に示すように、Ｄｗｎ１は、（１）擦傷の治癒アッセイにおける線維芽細胞の遊走、および（２）インビトロでのコラーゲンゲルの収縮を促進した。
図２８に示すように、Ｄｗｎ１は、縫合糸による創傷閉鎖のみ、および縫合糸とビヒクル（１０％ＤＭＳＯ）投与の両方、と比較し、縫合糸が使用された創傷に投与された場合、最小限の瘢痕で裂開した創傷の治癒を改善した。さらに、Ｄｗｎ１を縫合糸で閉じた創傷に投与することにより、図２９に示すように、縫合糸のみまたは縫合糸とビヒクル（１０％ＤＭＳＯ）の投与を使用した場合と比較し、創傷上または創傷周辺の過剰なコラーゲン沈着が減少した。
Ｎｐａｓ２の小分子阻害剤は、創傷の閉鎖を促進し、瘢痕化を軽減することが期待される。Ｎｐａｓ２ ＫＯは、胚性および発達性の病理を生じさせなかった。このように、Ｎｐａｓ時間療法、すなわち、Ｎｐａｓ２を抑制し、概日系を調節するためのＮｐａｓ２阻害剤の投与は、コラーゲンによる「線維症」の形成を減少させ、創傷の瘢痕化を減少させる治療薬として提案される。
Ｎｐａｓ２以外にも、Ｂｍａｌ１やＣｌｏｃｋなどの時間療法における標的時計分子が存在するが（図３０）、Ｂｍａｌ１またはＣｌｏｃｋのＫＯ変異は、末梢骨組織における様々な病理学的表現型および未成熟な老化の症状（サルコペニア、白内障、臓器の収縮）を生じさせるため、Ｎｐａｓ２は安全な分子標的であることが示されている。しかしながら、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異は、顎骨、椎骨、四肢骨の胚発生上の病理を生じさせなかった。ＳＣＮにおけるＮｐａｓ２発現のレベルは低く、中心的な概日リズムにはほとんど寄与していない。
レセルピンは、主に神経内分泌細胞およびニューロンで発現するベシクルモノアミン輸送体（ＶＭＡＴ）をブロックする。（図３１）レセルピンによるニューロンＶＭＡＴのブロックは、ニューロンのシナプス小胞における、ノルエピネフリン、ドーパミン、セロトニンおよびヒスタミンなどのモノアミンの取り込みを阻害し、神経伝達物質の貯蔵を減少させる。モノアミンオキシダーゼＡ（ＭＡＯＡ）のプロモーターの転写は、時計成分であるＢＭＡＬ１、Ｎｐａｓ２、およびＰＥＲ２によって制御される。マウスのＰｅｒ２に変異が存在する場合、ＭＡＯＡの活性が低下する。
ＶＭＡＴに類似し、軟骨細胞や平滑筋細胞などの様々な細胞で発現するニューロン外モノアミン輸送体（ＥＭＴ）が存在する（図３０および３２Ａ）。セロトニンをインビトロで投与した場合（図３２Ｂ）、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｄｉｑ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ．Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０２８によって示されるように、スクラッチゾーンの幅が、ビヒクルと比較し減少した。レセルピンは線維芽細胞のＥＭＴをブロックし、線維芽細胞の遊走を加速する細胞外セロトニンの蓄積をもたらすと仮定される。（図３２Ａ）。
実施例２０
外科的瘢痕の治癒／予防のマウスモデル
両刃のメスを使用して、マウスの背中の左側と右側の両方に垂直方向の切り傷（１０×１．５ｍｍ）を与えた。創傷の中心を、５－０ナイロン縫合糸を用いて１回の結紮を行った。（図３３Ａ）創傷／瘢痕のグロスイメージを使用して、術後７日目まで毎日視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）を記録し（図３３Ａ）、創傷／瘢痕の術後グロスイメージを定規で測定した。（図３３Ｃ）術後７日目に、ヘマトキシリン－エオジン（ＨＥ）およびマッソントリクローム（ＭＴ）を用い、創傷に対する組織学的解析を実施した。（図３３Ｄ）ＨＥ染色スライスを使用して瘢痕指数を評価した。（図３３Ｅ）ＭＴ染色スライスを使用して繊維組織の面積％を評価した。（図３３Ｆ）
候補化合物であるＤｗｎ１を選択し、インビトロでの皮膚線維芽細胞に対するＮｐａｓ２抑制について評価した。ＵＣＬＡのＭＳＳＲにおいて、ＦＤＡ承認の化合物ライブラリを使用したインビトロでのハイスループット薬物スクリーニングアッセイの散布図を作成した。（図３４Ａ）負のＮｐａｓ２のＺスコアの高い絶対値は、Ｎｐａｓ２の発現が高度に下方制御されたことを示す（Ｘ軸）。高い細胞生存率のＺスコアは、線維芽細胞が高い生存率（Ｙ軸）であったことを示す。候補化合物（Ｄｗｎ１）は、負のＮｐａｓ２のＺスコアの絶対値および生存率の高い順に選抜した。Ｄｗｎ１（１μＭまたは１０μＭ）で処理したマウス皮膚線維芽細胞における概日Ｎｐａｓ２発現を評価し、対照と比較した。（図３４Ｂ）Ｄｗｎ１で処理されたマウス皮膚線維芽細胞の細胞遊走の評価を行った（＊ｐ＜０．０５）。（図３４Ｃ）
２つの異なる濃度のＤｗｎ１（１μＭまたは１０μＭ）が、インビトロでのマウス皮膚線維芽細胞のコラーゲン合成に及ぼす影響を解析した。マウス皮膚線維芽細胞を２４ウェルプレートに播種し、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）を添加した培地中、８０％～９０％のコンフルエンシーで１、３、および７日間培養した。次に、細胞を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、コラーゲンを可視化するためにピクロシリウスレッド（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ、Ｎｉｌｅｓ，ＩＬ）で染色した。ＡＡ：ｌ－アスコルビン酸。ＯＤ：光学密度。ＣＴＲＬ：ＡＡを含まない対照培地で処理された細胞。アスコルビン酸を補充して培養した線維芽細胞のピクロシリウスレッド染色では、陽性反応の増加が示され、対照および５０μｇ ＡＡと比較して、１μＭまたは１０μＭのＤｗｎ１処理後、７日目において、線維芽細胞におけるコラーゲン線維の形成および蓄積を示した。（図３５Ａ）吸光度値は、プレートリーダー（ＳＹＨＮＥＲＧＹ Ｈ１プレートリーダー）を備えた５５０ｎｍの分光光度計で測定し、一元配置分散分析および事後ホルム検定によって比較した。
コラーゲンタイプＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、およびＣｏｌ１４ａ１の遺伝子発現を、１μＭまたは１０μＭのＤｗｎ１処理または対照（ビヒクル）処理後の肉芽組織および創傷組織で評価した。（図３５Ｂ）内部対照としてＧａｐｄｈを使用した。ビヒクルまたはビヒクル＋Ｄｗｎ１を適用した創傷における、術後７日目のインビボでのαＳＭＡの免疫組織化学的染色を行った。ビヒクルまたはＤｗｎ１＋ビヒクルを術後２４時間ごとに適用し、治療後３日目および７日目にそれぞれ評価した。
マウス背側の直線状の創傷／瘢痕モデルに対するＤｗｎ１の効果を評価した。手術後および創傷へのＤｗｎ１の局所適用の開始後、０日目（Ｄ０）、２日目（Ｄ２）、５日目（Ｄ５）、７日目（Ｄ７）のグロスイメージを示す。Ｖｅｈ：ビヒクル。ビヒクルまたはＤｗｎ１＋ビヒクルを術後２４時間ごとに適用した。（図３６Ａ）ビヒクルまたはビヒクル＋Ｄｗｎ１を適用した創傷の視覚的アナログスコア（ＶＳＡ）スケールを評価した。（図３６Ｂ）術後７日目にビヒクルまたはビヒクル＋Ｄｗｎ１を適用した側部の創傷／瘢痕の組織の画像を示す。（図３６Ｃ）黄色の点線は肉芽組織を示す。左の２つはＨＥで染色し、右の２つはＭＴで染色した。スケールバーは１０００μｍである。ＨＥ染色スライスを使用して瘢痕指数を評価した。（図３６Ｄ）ＭＴ染色スライスを使用して繊維組織の面積を評価した。＊はｐ＜０．０５を示す。（図３６Ｅ）
マウスの背側の直線状の創傷／瘢痕モデルに対するＤｗｎ１の分子生物学的効果を評価した。典型的なレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）画像を撮影した。（図３７Ａ）スライドを、ＬＣＭの前にヘマトキシリンおよびエオシンで短時間染色した。Ｇ：肉芽組織、Ｗ：創傷組織肉芽組織。（Ｇ）および創傷組織（Ｗ）における、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１）、Ｃｏｌ１４ａ１、Ｔｇｆβ１およびＡｃｔａ２の遺伝子発現を評価した。（図３７Ｂ）内部対照としてＧａｐｄｈを使用した。＊はｐ＜０．０５を示す。ビヒクルまたはビヒクル＋Ｄｗｎ１を適用した創傷の、術後７日目のインビボでのαＳＭＡの免疫組織化学的染色を行った。（図３７Ｃ）黄色の点線は肉芽組織を示す。スケールバーは１００μｍである。
本明細書で引用されたすべての特許、特許出願、および科学刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書では本発明の特定の特徴が図示され、説明されてきたが、多くの修正、置換、変更、および同等物がここで、当業者に思いつくであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に収まるように、すべてのそのような修正および変更を網羅することを意図することを理解されたい。

Claims (96)

  1. 対象の創傷治癒を改善または促進するための方法であって、時計遺伝子の発現を抑制する薬剤を、それを必要とする前記対象の創傷に投与することを含み、前記時計遺伝子がニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（Ｎｐａｓ２）である、方法。
  2. 前記投与が、局所投与、経皮投与および皮下投与から選択される経路によるものである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記創傷が皮膚創傷である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記皮膚創傷が歯周創傷である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記歯周創傷が、歯肉結合組織の変性または歯槽骨の吸収を含む、請求項４に記載の方法。
  6. Ｎｐａｓ２の発現を抑制する前記薬剤が、細胞遊走アッセイにおいてヒト皮膚線維芽細胞の遊走を加速する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記薬剤が、ノルエピネフリン、ドーパミンおよびセロトニン取り込み阻害剤、酸化的リン酸化阻害剤、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、または中枢神経系（ＣＮＳ）刺激剤から選択される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記薬剤がレセルピンである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記薬剤が、アンチマイシンＡ、ニフルム酸、塩酸モリンドンおよび塩酸メフェキサミドである、請求項１に記載の方法。
  10. 前記薬剤が、硝酸エコナゾール、アセクロフェナク、プラバスタチン、チロキサポール、一硝酸イソソルビド、ＭＳ－１５００３８７、（Ｓ）－（－）－アテノロ（Ａｔｅｎｏｌｏ）、塩酸ブテナフィン、塩酸アセクリジン、硫酸アトロピン一水和物、トリメタジオン、カルバミン酸クロルフェンシン（Ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｓｉｎ）、塩酸マフェニド、ニフェナゾン、塩酸アルチカイン、テオブロミン、ニフロキサジド、ＳＡＭ００１２４６６２６、ドロプロピジン（Ｒ、Ｓ）、クエン酸ジエチルカルバマジン、ＭＳ－１５０１２１４、メシル酸ドラセトロン、エストロン、プレドニゾロン、塩酸ダウノルビシン、シクロヘキシミド、およびモネンシンナトリウム塩から選択される、請求項１に記載の方法。
  11. 前記薬剤が、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤、ホルモンアゴニスト、一酸化窒素阻害剤、細胞内Ｃａ＋＋放出剤、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤、およびキナーゼ阻害剤からなる群から選択されるＮｐａｓ２下方制御化合物である、請求項１に記載の方法。
  12. 前記細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤が、ブレフェルジンＡ、コルヒチン、ポドフィロトキシンまたは５１７５３４８である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ホルモンアゴニストがヨウ化ＡＣ－９３２５３であり、前記一酸化窒素阻害剤が塩化ジフェニレンヨードニウムであり、前記細胞内Ｃａ＋＋放出剤がタプシガルギンであり、前記キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤がＰＤ－１６６２８５水和物であり、前記キナーゼ阻害剤がＰＤ－１７３９５２である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記経皮投与が、前記薬剤をカプセル化する変形可能なナノスケールのベシクルの前記創傷への適用である、請求項２に記載の方法。
  15. 前記経皮投与が、前記薬剤でコーティングされたマイクロニードル、組み込まれた前記薬剤を内部に有する固体ポリマーマトリックス、前記薬剤を貯蔵するリザーバと半透膜とを備える経皮パッチ、溶解した前記薬剤を内部に含む経皮ゲル、および溶解した前記薬剤を内部に含む経皮スプレー、および溶解した前記薬剤を内部に含む定量的経皮スプレー、からなる群から選択される経皮送達系の前記創傷への適用である、請求項２に記載の方法。
  16. 前記薬剤が、Ｎｐａｓ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とするように設計された合成低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
  17. 前記ｓｉＲＮＡが、マイクロニードルアレイ、エレクトロポレーション、圧力、機械的マッサージ、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー媒介送達系、超音波、コンジュゲート送達系、マイクロバブル、リポソームバブル、超音波感受性ナノバブル、カーボンナノチューブ、脂質ベースのナノベクター、非脂質有機ベースのナノベクターおよび無機ナノベクター、金ナノ粒子、ならびに金ナノロッド、からなる群から選択される経路によって投与される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ｓｉＲＮＡが、リボース糖環の２’位、リン酸骨格、核酸塩基およびリボース糖、５’末端の修飾またはコンジュゲーションにおいて化学的に修飾されている、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記リボース糖環が、グアノシンまたはウリジンであり、前記２’位の修飾が、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記リン酸骨格が、ホスホロジチオエート、トリアゾール二量体、アミドまたはボラノホスフェートで修飾されている、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記核酸塩基およびリボース糖の修飾が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）、２’－Ｏ－メチルホスホロジチオエート（２’Ｏ－ＭｅＰＳ２）、親油性ホウ素クラスター、３－Ｎ－［（１，１２－ジカルバ－クロソ－ドデカカルボラン－１－イル）プロパン－３－イル］チミジン（Ｃ２Ｂ１０Ｈ１１、ＣＢ）、チミジンおよび５－ビス（アミノエチル）－アミノエチル－２’－デオキシウリジンである、請求項１８に記載の方法。
  22. 前記５’末端の修飾またはコンジュゲーションが、前記ｓｉＲＮＡの５’末端でのパルミチン酸コンジュゲーション、前記ｓｉＲＮＡの３’末端への逆チミジン（ｉｄＴ）カップリング、および５’末端でのトパルミチン酸（ｔｏｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）との前記ｓｉＲＮＡのコンジュゲーション、フェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、およびピレニル誘導体からなる群から選択される芳香族化合物との前記ｓｉＲＮＡのコンジュゲーション；尿素／チオ尿素が架橋した芳香族化合物による３’オーバーハング領域での化学修飾；センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端でのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲーション；ならびにｓｉＲＮＡのコレステロールコンジュゲーションである、請求項１８に記載の方法。
  23. 歯槽骨を再生するための方法であって、それを必要とする対象の骨喪失部位に、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤を投与することを含む、方法。
  24. 前記投与が、局所投与および経皮投与から選択される経路によるものである、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記創傷が皮膚創傷である、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記皮膚創傷が歯周創傷である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記歯周創傷が、歯肉結合組織の変性または歯槽骨の吸収を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. Ｎｐａｓ２の発現を抑制する前記薬剤が、細胞遊走アッセイにおいてヒト皮膚線維芽細胞の遊走を加速する、請求項２３に記載の方法。
  29. 前記薬剤が、ノルエピネフリンおよびセロトニン取り込み阻害剤、酸化的リン酸化阻害剤、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、または中枢神経系（ＣＮＳ）刺激剤から選択される、請求項２３に記載の方法。
  30. 前記薬剤がレセルピンである、請求項２３に記載の方法。
  31. 前記薬剤が、アンチマイシンＡ、ニフルム酸、塩酸モリンドンおよび塩酸メフェキサミドである、請求項２３に記載の方法。
  32. 前記薬剤が、硝酸エコナゾール、アセクロフェナク、プラバスタチン、チロキサポール、一硝酸イソソルビド、ＭＳ－１５００３８７、（Ｓ）－（－）－アテノロ、塩酸ブテナフィン、塩酸アセクリジン、硫酸アトロピン一水和物、トリメタジオン、カルバミン酸クロルフェンシン、塩酸マフェニド、ニフェナゾン、塩酸アルチカイン、テオブロミン、ニフロキサジド、ＳＡＭ００１２４６６２６、ドロプロピジン（Ｒ、Ｓ）、クエン酸ジエチルカルバマジン、ＭＳ－１５０１２１４、メシル酸ドラセトロン、エストロン、プレドニゾロン、塩酸ダウノルビシン、シクロヘキシミド、およびモネンシンナトリウム塩から選択される、請求項２３に記載の方法。
  33. 前記薬剤が、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤、ホルモンアゴニスト、一酸化窒素阻害剤、細胞内Ｃａ＋＋放出剤、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤、およびキナーゼ阻害剤からなる群から選択されるＮｐａｓ２下方制御化合物である、請求項２３に記載の方法。
  34. 前記細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤が、ブレフェルジンＡ、コルヒチン、ポドフィロトキシンまたは５１７５３４８である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ホルモンアゴニストがヨウ化ＡＣ－９３２５３であり、前記一酸化窒素阻害剤が塩化ジフェニレンヨードニウムであり、前記細胞内Ｃａ＋＋放出剤がタプシガルギンであり、前記キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤がＰＤ－１６６２８５水和物であり、前記キナーゼ阻害剤がＰＤ－１７３９５２である、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記経皮投与が、前記薬剤をカプセル化する変形可能なナノスケールのベシクルによるものである、請求項２４に記載の方法。
  37. 前記経皮投与が、前記薬剤でコーティングされたマイクロニードル、組み込まれた前記薬剤を内部に有する固体ポリマーマトリックス、前記薬剤を貯蔵するリザーバと半透膜とを備える経皮パッチ、溶解した前記薬剤を内部に含む経皮ゲル、および溶解した前記薬剤を内部に含む経皮スプレー、および溶解した前記薬剤を内部に含む定量的経皮スプレー、からなる群から選択される経皮送達系の前記創傷への適用である、請求項２４に記載の方法。
  38. 前記薬剤が、Ｎｐａｓ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とするように設計された合成低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である、請求項２３に記載の方法。
  39. 前記ｓｉＲＮＡが、マイクロニードルアレイ、エレクトロポレーション、圧力、機械的マッサージ、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー媒介送達系、超音波、コンジュゲート送達系、マイクロバブル、リポソームバブル、超音波感受性ナノバブル、カーボンナノチューブ、脂質ベースのナノベクター、非脂質有機ベースのナノベクターおよび無機ナノベクター、金ナノ粒子、ならびに金ナノロッド、からなる群から選択される経路によって投与される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ｓｉＲＮＡが、リボース糖環の２’位、リン酸骨格、核酸塩基およびリボース糖、５’末端の修飾またはコンジュゲーションにおいて化学的に修飾されている、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記リボース糖環が、グアノシンまたはウリジンであり、前記２’位の修飾が、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記リン酸骨格が、ホスホロジチオエート、トリアゾール二量体、アミドまたはボラノホスフェートで修飾されている、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記核酸塩基およびリボース糖の修飾が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）、２’－Ｏ－メチルホスホロジチオエート（２’Ｏ－ＭｅＰＳ２）、親油性ホウ素クラスター、３－Ｎ－［（１，１２－ジカルバ－クロソ－ドデカカルボラン－１－イル）プロパン－３－イル］チミジン（Ｃ２Ｂ１０Ｈ１１、ＣＢ）、チミジンおよび５－ビス（アミノエチル）－アミノエチル－２’－デオキシウリジンである、請求項４０に記載の方法。
  44. 前記５’末端の修飾またはコンジュゲーションが、前記ｓｉＲＮＡの５’末端でのパルミチン酸コンジュゲーション、前記ｓｉＲＮＡの３’末端への逆チミジン（ｉｄＴ）カップリング、および５’末端でのトパルミチン酸コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）との前記ｓｉＲＮＡのコンジュゲーション、フェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、およびピレニル誘導体からなる群から選択される芳香族化合物との前記ｓｉＲＮＡのコンジュゲーション；尿素／チオ尿素が架橋した芳香族化合物による３’オーバーハング領域での化学修飾；センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端でのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲーション；ならびにｓｉＲＮＡのコレステロールコンジュゲーションである、請求項４０に記載の方法。
  45. 創傷部位における結合組織の再生を必要とする対象の創傷部位において結合組織を再生するための方法であって、治療有効量のＮｐａｓ２発現抑制剤を前記創傷に投与することを含む、方法。
  46. 前記投与が、局所投与および経皮投与から選択される経路によるものである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記創傷が皮膚創傷である、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記皮膚創傷が歯周創傷である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記歯周創傷が、歯肉結合組織の変性または歯槽骨の吸収を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. Ｎｐａｓ２の発現を抑制する前記薬剤が、細胞遊走アッセイにおいてヒト皮膚線維芽細胞の遊走を加速する、請求項４５に記載の方法。
  51. 前記薬剤が、ノルエピネフリンおよびセロトニン取り込み阻害剤、酸化的リン酸化阻害剤、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、または中枢神経系（ＣＮＳ）刺激剤から選択される、請求項４５に記載の方法。
  52. 前記薬剤がレセルピンである、請求項４５に記載の方法。
  53. 前記薬剤が、アンチマイシンＡ、ニフルム酸、塩酸モリンドンおよび塩酸メフェキサミドである、請求項４５に記載の方法。
  54. 前記薬剤が、硝酸エコナゾール、アセクロフェナク、プラバスタチン、チロキサポール、一硝酸イソソルビド、ＭＳ－１５００３８７、（Ｓ）－（－）－アテノロ、塩酸ブテナフィン、塩酸アセクリジン、硫酸アトロピン一水和物、トリメタジオン、カルバミン酸クロルフェンシン、塩酸マフェニド、ニフェナゾン、塩酸アルチカイン、テオブロミン、ニフロキサジド、ＳＡＭ００１２４６６２６、ドロプロピジン（Ｒ、Ｓ）、クエン酸ジエチルカルバマジン、ＭＳ－１５０１２１４、メシル酸ドラセトロン、エストロン、プレドニゾロン、塩酸ダウノルビシン、シクロヘキシミド、およびモネンシンナトリウム塩から選択される、請求項４５に記載の方法。
  55. 前記薬剤が、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤、ホルモンアゴニスト、一酸化窒素阻害剤、細胞内Ｃａ＋＋放出剤、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤、およびキナーゼ阻害剤からなる群から選択されるＮｐａｓ２下方制御化合物である、請求項４５に記載の方法。
  56. 前記細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤が、ブレフェルジンＡ、コルヒチン、ポドフィロトキシンまたは５１７５３４８である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記ホルモンアゴニストがヨウ化ＡＣ－９３２５３であり、前記一酸化窒素阻害剤が塩化ジフェニレンヨードニウムであり、前記細胞内Ｃａ＋＋放出剤がタプシガルギンであり、前記キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤がＰＤ－１６６２８５水和物であり、前記キナーゼ阻害剤がＰＤ－１７３９５２である、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記経皮投与が、薬剤をカプセル化する変形可能なナノスケールベシクルの前記創傷への適用である、請求項４６に記載の方法。
  59. 前記経皮投与が、前記薬剤でコーティングされたマイクロニードル、組み込まれた前記薬剤を内部に有する固体ポリマーマトリックス、前記薬剤を貯蔵するリザーバと半透膜とを備える経皮パッチ、溶解した前記薬剤を内部に含む経皮ゲル、および溶解した前記薬剤を内部に含む経皮スプレー、および溶解した前記薬剤を内部に含む定量的経皮スプレー、からなる群から選択される経皮送達系の前記創傷への適用である、請求項４６に記載の方法。
  60. 前記薬剤が、Ｎｐａｓ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とするように設計された合成低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である、請求項４５に記載の方法。
  61. 前記ｓｉＲＮＡが、マイクロニードルアレイ、エレクトロポレーション、圧力、機械的マッサージ、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー媒介送達系、超音波、コンジュゲート送達系、マイクロバブル、リポソームバブル、超音波感受性ナノバブル、カーボンナノチューブ、脂質ベースのナノベクター、非脂質有機ベースのナノベクターおよび無機ナノベクター、金ナノ粒子、ならびに金ナノロッド、からなる群から選択される経路によって投与される、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記ｓｉＲＮＡが、リボース糖環の２’位、リン酸骨格、核酸塩基およびリボース糖、５’末端の修飾またはコンジュゲーションにおいて化学的に修飾されている、請求項６０に記載の方法。
  63. 前記リボース糖環が、グアノシンまたはウリジンであり、前記２’位の修飾が、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記リン酸骨格が、ホスホロジチオエート、トリアゾール二量体、アミドまたはボラノホスフェートで修飾されている、請求項６２に記載の方法。
  65. 前記核酸塩基およびリボース糖修飾が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）、２’－Ｏ－メチルホスホロジチオエート（２’Ｏ－ＭｅＰＳ２）、親油性ホウ素クラスター、３－Ｎ－［（１，１２－ジカルバ－クロソ－ドデカカルボラン－１－イル）プロパン－３－イル］チミジン（Ｃ２Ｂ１０Ｈ１１、ＣＢ）、チミジンおよび５－ビス（アミノエチル）－アミノエチル－２’－デオキシウリジンである、請求項６２に記載の方法。
  66. 前記５’末端の修飾またはコンジュゲーションが、前記ｓｉＲＮＡの５’末端でのパルミチン酸コンジュゲーション、前記ｓｉＲＮＡの３’末端への逆チミジン（ｉｄＴ）カップリング、および５’末端でのトパルミチン酸コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）との前記ｓｉＲＮＡのコンジュゲーション、フェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、およびピレニル誘導体からなる群から選択される芳香族化合物との前記ｓｉＲＮＡのコンジュゲーション；尿素／チオ尿素が架橋した芳香族化合物による３’オーバーハング領域での化学修飾；センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端でのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲーション；ならびにｓｉＲＮＡのコレステロールコンジュゲーションである、請求項６２に記載の方法。
  67. 前記結合組織が、コラーゲン、真皮様コラーゲン線維、または骨のうちの１つ以上である、請求項４５に記載の方法。
  68. 前記創傷部位が骨喪失の部位である、請求項４５に記載の方法。
  69. 前記骨喪失が、歯周炎によって誘導された歯槽骨吸収の部位におけるものである、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記創傷部位が歯肉結合組織変性の部位である、請求項４５に記載の方法。
  71. 対象の開いた創傷部位に、Ｎｐａｓ２の発現を抑制する薬剤を局所投与することを含む、創傷領域サイズを減少させるための方法。
  72. 前記投与が、局所投与および経皮投与から選択される経路によるものである、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記創傷が皮膚創傷である、請求項７１に記載の方法。
  74. 前記皮膚創傷が歯周創傷である、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記歯周創傷が、歯肉結合組織の変性または歯槽骨の吸収を含む、請求項７４に記載の方法。
  76. Ｎｐａｓ２の発現を抑制する前記薬剤が、細胞遊走アッセイにおいてヒト皮膚線維芽細胞の遊走を加速する、請求項７１に記載の方法。
  77. 前記薬剤が、ノルエピネフリンおよびセロトニン取り込み阻害剤、酸化的リン酸化阻害剤、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、または中枢神経系（ＣＮＳ）刺激剤から選択される、請求項７１に記載の方法。
  78. 前記薬剤がレセルピンである、請求項７１に記載の方法。
  79. 前記薬剤が、アンチマイシンＡ、ニフルム酸、塩酸モリンドンおよび塩酸メフェキサミドである、請求項７１に記載の方法。
  80. 前記薬剤が、硝酸エコナゾール、アセクロフェナク、プラバスタチン、チロキサポール、一硝酸イソソルビド、ＭＳ－１５００３８７、（Ｓ）－（－）－アテノロ、塩酸ブテナフィン、塩酸アセクリジン、硫酸アトロピン一水和物、トリメタジオン、カルバミン酸クロルフェンシン、塩酸マフェニド、ニフェナゾン、塩酸アルチカイン、テオブロミン、ニフロキサジド、ＳＡＭ００１２４６６２６、ドロプロピジン（Ｒ、Ｓ）、クエン酸ジエチルカルバマジン、ＭＳ－１５０１２１４、メシル酸ドラセトロン、エストロン、プレドニゾロン、塩酸ダウノルビシン、シクロヘキシミド、およびモネンシンナトリウム塩から選択される、請求項７１に記載の方法。
  81. 前記薬剤が、細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤、ホルモンアゴニスト、一酸化窒素阻害剤、細胞内Ｃａ＋＋放出剤、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤、およびキナーゼ阻害剤からなる群から選択されるＮｐａｓ２下方制御化合物である、請求項７１に記載の方法。
  82. 前記細胞骨格／ＥＣＭ阻害剤が、ブレフェルジンＡ、コルヒチン、ポドフィロトキシンまたは５１７５３４８である、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記ホルモンアゴニストがヨウ化ＡＣ－９３２５３であり、前記一酸化窒素阻害剤が塩化ジフェニレンヨードニウムであり、前記細胞内Ｃａ＋＋放出剤がタプシガルギンであり、前記キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤がＰＤ－１６６２８５水和物であり、前記キナーゼ阻害剤がＰＤ－１７３９５２である、請求項８１に記載の方法。
  84. 前記経皮投与が、薬剤をカプセル化する変形可能なナノスケールベシクルの前記創傷への適用である、請求項７２に記載の方法。
  85. 前記経皮投与が、前記薬剤でコーティングされたマイクロニードル、組み込まれた前記薬剤を内部に有する固体ポリマーマトリックス、前記薬剤を貯蔵するリザーバと半透膜とを備える経皮パッチ、溶解した前記薬剤を内部に含む経皮ゲル、および溶解した前記薬剤を内部に含む経皮スプレー、および溶解した前記薬剤を内部に含む定量的経皮スプレー、からなる群から選択される経皮送達系の前記創傷への適用である、請求項７２に記載の方法。
  86. 前記薬剤が、Ｎｐａｓ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とするように設計された合成低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である、請求項７１に記載の方法。
  87. 前記ｓｉＲＮＡが、マイクロニードルアレイ、エレクトロポレーション、圧力、機械的マッサージ、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー媒介送達系、超音波、コンジュゲート送達系、マイクロバブル、リポソームバブル、超音波感受性ナノバブル、カーボンナノチューブ、脂質ベースのナノベクター、非脂質有機ベースのナノベクターおよび無機ナノベクター、金ナノ粒子、ならびに金ナノロッド、からなる群から選択される経路によって投与される、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記ｓｉＲＮＡが、リボース糖環の２’位、リン酸骨格、核酸塩基およびリボース糖、５’末端の修飾またはコンジュゲーションにおいて化学的に修飾されている、請求項８６に記載の方法。
  89. 前記リボース糖環が、グアノシンまたはウリジンであり、前記２’位の修飾が、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）からなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記リン酸骨格が、ホスホロジチオエート、トリアゾール二量体、アミドまたはボラノホスフェートで修飾されている、請求項８８に記載の方法。
  91. 前記核酸塩基およびリボース糖修飾が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）、２’－Ｏ－メチルホスホロジチオエート（２’Ｏ－ＭｅＰＳ２）、親油性ホウ素クラスター、３－Ｎ－［（１，１２－ジカルバ－クロソ－ドデカカルボラン－１－イル）プロパン－３－イル］チミジン（Ｃ２Ｂ１０Ｈ１１、ＣＢ）、チミジンおよび５－ビス（アミノエチル）－アミノエチル－２’－デオキシウリジンである、請求項８８に記載の方法。
  92. 前記５’末端の修飾またはコンジュゲーションが、前記ｓｉＲＮＡの５’末端でのパルミチン酸コンジュゲーション、前記ｓｉＲＮＡの３’末端への逆チミジン（ｉｄＴ）カップリング、および５’末端でのトパルミチン酸コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）との前記ｓｉＲＮＡのコンジュゲーション、フェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、およびピレニル誘導体からなる群から選択される芳香族化合物との前記ｓｉＲＮＡのコンジュゲーション；尿素／チオ尿素が架橋した芳香族化合物による３’オーバーハング領域での化学修飾；センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端でのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲーション；ならびにｓｉＲＮＡのコレステロールコンジュゲーションである、請求項８８に記載の方法。
  93. 前記開いた創傷部位が、コラーゲン、真皮様コラーゲン線維、または骨のうちの１つ以上から選択される結合組織を含む、請求項７１に記載の方法。
  94. 前記開いた創傷部位が骨喪失部位である、請求項７１に記載の方法。
  95. 前記骨喪失が、歯周炎によって誘導された歯槽骨吸収の部位におけるものである、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記開いた創傷部位が歯肉結合組織変性の部位である、請求項７１に記載の方法。
JP2022513118A 2019-09-04 2020-09-04 Ｎｐａｓ２抑制による結合組織の機能および表現型の再生 Pending JP2022547271A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962895821P 2019-09-04 2019-09-04
US62/895,821 2019-09-04
PCT/US2020/049529 WO2021046438A1 (en) 2019-09-04 2020-09-04 Regenerating functions and phenotypes of connective tissue through npas2 suppression

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022547271A true JP2022547271A (ja) 2022-11-11
JPWO2021046438A5 JPWO2021046438A5 (ja) 2023-10-02

Family

ID=74853042

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022513118A Pending JP2022547271A (ja) 2019-09-04 2020-09-04 Ｎｐａｓ２抑制による結合組織の機能および表現型の再生

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230013402A1 (ja)
EP (1) EP4025302A4 (ja)
JP (1) JP2022547271A (ja)
KR (1) KR20220054808A (ja)
CN (1) CN114340733A (ja)
CA (1) CA3149833A1 (ja)
WO (1) WO2021046438A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3876871A4 (en) * 2018-11-05 2022-11-02 The Regents of the University of California SMALL MOLECULAR DRUGS AND METHODS TO ACCELERATE BONE INTEGRATION
WO2022246264A1 (en) * 2021-05-20 2022-11-24 The Regents Of The University Of California Compositions and methods of tissue regeneration therapy
CN113786408A (zh) * 2021-10-13 2021-12-14 中国人民解放军海军军医大学第一附属医院 吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用
CN116173218B (zh) * 2023-04-28 2023-08-04 北京大学口腔医学院 蛋白转运抑制剂在制备用于治疗或缓解牙周炎的药物中的用途
CN116196424B (zh) * 2023-04-28 2023-08-01 北京大学口腔医学院 蛋白转运抑制剂在制备用于治疗炎性骨吸收的药物中的用途

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005209231B8 (en) * 2004-01-21 2011-07-28 Emory University Compositions and methods of use for tyrosine kinase inhibitors to treat pathogenic infection
WO2009120878A2 (en) * 2008-03-26 2009-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
US9096853B2 (en) * 2012-09-24 2015-08-04 U.S. Department Of Veterans Affairs Modified siRNA molecules incorporating 5-fluoro-2′-deoxyuridine residues to enhance cytotoxicity
WO2018204764A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Camp4 Therapeutics Corporation Identification and targeted modulation of gene signaling networks
WO2019094679A1 (en) * 2017-11-10 2019-05-16 The Regents Of The University Of California BRAIN DELIVERY OF THE BACE INHIBITOR SAPPALPHA, ANTIBODIES, OR INHIBITORY RNA's USING SYNTHETIC EXOSOMES (DEFORMABLE NANOVESICLES, DNVs)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220054808A (ko) 2022-05-03
EP4025302A1 (en) 2022-07-13
CN114340733A (zh) 2022-04-12
CA3149833A1 (en) 2021-03-11
WO2021046438A1 (en) 2021-03-11
US20230013402A1 (en) 2023-01-19
EP4025302A4 (en) 2023-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022547271A (ja) Ｎｐａｓ２抑制による結合組織の機能および表現型の再生
JP5607176B2 (ja) 新規ペプチドおよびその用途
Uitto et al. Novel molecular therapies for heritable skin disorders
KR20100024951A (ko) 세포를 자극하기 위한 방법 및 조성물
EP3212773B1 (en) Efficient delivery of therapeutic molecules to cells of the inner ear
JP6958933B2 (ja) 異所性骨化を治療する方法
Li et al. GDF‐5 induces epidermal stem cell migration via RhoA‐MMP9 signalling
WO2019148067A1 (en) Treatment of hearing loss
US11207303B2 (en) Therapeutic agent for fibrodysplasia ossificans progressiva
JP2002530331A (ja) 軟骨形成を促進するためのｒａｒアンタゴニストの組成物および使用
KR102619458B1 (ko) mTOR 인히비터를 포함하는, 눈의 증상, 장해 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 및 그 응용
US20230023616A1 (en) Tissue regenerative multi-drug cocktail and apparatus for delivery thereof
US20120316111A1 (en) BMP-2 Upregulating Compounds For Healing Bone Tissue And Screening Methods For Selecting Such Compounds
US10959997B2 (en) Combined agent for cell therapy of corneal endothelial cell
US20110236461A1 (en) Methods for stimulating chondrogenesis utilizing a potassium channel inhibitor
EP4282477A2 (en) Combination comprising sildenafil for use in the treatment of osteoarthritis
Iqbal et al. Targeting WNT signalling pathways as new therapeutic strategies for osteoarthritis
WO2018107157A1 (en) Compositions and methods of modulating endochondral ossification and bone formation
JP2024518910A (ja) 組織再生療法の組成物および方法
US20230181574A1 (en) Acyl-protein thioesterase inhibitor for the treatment and/or prevention of huntington's disease
RU2782613C2 (ru) СОДЕРЖАЩЕЕ ИНГИБИТОР mTOR ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ГЛАЗНЫХ СИМПТОМОВ, НАРУШЕНИЙ ИЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
Li et al. Autophagy in Muscle Stem Cells
JP2022526133A (ja) 線維芽細胞を用いたオピオイド付加の処置及びその製品
JP2013216589A (ja) 歯周炎治療薬
US9216181B2 (en) BMP-2 upregulating compounds for healing bone tissue and screening methods for selecting such compounds

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221108

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230904

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230904

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230921