JP2022546834A

JP2022546834A - ５－メチルテトラヒドロ葉酸の使用

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Publication number: JP2022546834A
Application number: JP2022514615A
Authority: JP
Inventors: ヨンチーチョン; ツォンリンリエン; ルイクー
Original assignee: LIANYUNGANG JINKANG HEXIN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: LIANYUNGANG JINKANG HEXIN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2019-09-03
Filing date: 2020-09-03
Publication date: 2022-11-09
Also published as: US20230043678A1; CN114340635A; EP4026548A1; EP4026548A4; WO2021043196A1

Abstract

妊娠準備期及び／又は妊娠期の女性において新生児の先天性心疾患を予防するための薬物又は保健機能食品の調製における５－メチルテトラヒドロ葉酸の使用である。５－メチルテトラヒドロ葉酸は先天性心疾患を予防する作用を有し、５－メチルテトラヒドロ葉酸の予防用量は１ｍｇ以上であってもよく、合成葉酸と比較し、高用量で使用しても催奇形作用がなく、高用量で先天性欠損の予防を実現し、新生児の先天性心疾患を予防するために用いることができる。

Description

本発明は医薬の分野に属し、妊娠準備期及び／又は妊娠期の女性において新生児の先天性心疾患、流産、死胎を予防するための薬物又は保健機能食品の調製における５－メチルテトラヒドロ葉酸を含む組成物の新しい使用に関する。

先天性心疾患（先心病と略称する）はすでに先天性欠損の主な病種となっており、児童期に最もよく見られる心疾患でもある。先天性心疾患はすでに病児の生命と生活の質に深刻な危害を及ぼし、０～５歳の児童の死亡を引き起こす重要な原因である。

先天性心疾患は複数種のサブタイプに分類されている。ここで、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、動脈管開存症（ＰＤＡ）、ファロー四徴症（ＴＯＦ）、大動脈転位症（ＴＧＡ）、三尖弁閉鎖症や狭窄症、及び肺動脈狭窄症（ＰＳ）が上位７種の最もよく見られるサブタイプである。

現在、葉酸を用いて神経管欠損を予防する効果はすでに確認されているが、葉酸を用いた先天性心疾患の予防については、各国の専門家間で論争がある。現在、ほとんどの学者は葉酸の補給が先天性心疾患の予防に役立つと考えており、さらに、葉酸をより高い用量で用いることにより先天性心疾患を予防すべきであると提案する人もいる［ＨｕｈｔａＪＣ，ＬｉｎａｓｋＫ．Ｗｈｅｎｓｈｏｕｌｄｗｅｐｒｅｓｃｒｉｂｅｈｉｇｈ－ｄｏｓｅｆｏｌｉｃａｃｉｄｔｏｐｒｅｖｅｎｔｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｓ？［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２０１５，３０（１）：１２５－１３１．］。葉酸は、プテロイルグルタミン酸を意味し、合成葉酸であり、ビタミンＢ９、ビタミンＭとも呼ばれ、英語名がｆｏｌｉｃａｃｉｄである。医薬使用において、葉酸は新生児の神経管奇形の予防、巨赤芽球性貧血の予防と治療に使用され、世界保健機関は授乳中の母親、妊婦の毎日の摂取量が４００μｇ／日であることを推奨している。葉酸の大量摂取により、血液循環中に未代謝葉酸及び還元葉酸（５－メチルテトラヒドロ葉酸及びその誘導体）が存在する。

葉酸は合成の酸化形態であり、天然食品では発見されていない。葉酸はヒトジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）によってテトラヒドロ葉酸に転化されなければ人体に利用できないが、人体ではこの過程が遅い。研究によると、ヒト肝臓における葉酸の代謝速度は生理ｐＨでラットの１．７９％であることが示されているため、葉酸を服用すると、血液中に未代謝の葉酸が検出される可能性があり、学者の報告によると、２００μｇ以上の葉酸を服用した数時間後、血漿中に未代謝の葉酸が検出されることができる［ＢａｉｌｅｙＳＷ，ＡｙｌｉｎｇＪＥ．Ｔｈｅｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｌｏｗａｎｄｖａｒｉａｂｌｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｉｎｈｕｍａｎｌｉｖｅｒａｎｄｉｔｓｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｈｉｇｈｆｏｌｉｃａｃｉｄｉｎｔａｋｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００９；１０６（３６）：１５４２４－１５４２９．］。また、未代謝葉酸が細胞内に蓄積するとＤＨＦＲ活性が低下する可能性がある。

既存の葉酸と先心病の関連性の研究を振り返ると、初期の北米地域でのいくつかの研究は言う価値がある。そのうちの１つの研究では、１９８７年～１９９８年にカリフォルニアで心臓円錐動脈幹異常を伴って出産した２０７例の母親とランダムに選択された奇形のない４８１例の母親に電話インタビューを行ったところ、ビタミンや葉酸強化穀物を多く摂取した母親の乳児では、錐状動脈性心疾患のリスクが低下したことを示した［ＳｈａｗＧＭ，Ｏ’ＭａｌｌｅｙＣＤ，ＷａｓｓｅｒｍａｎＣＲ，ＴｏｌａｒｏｖａＭＭａｎｄＬａｍｍｅｒＥＪ．Ｍａｔｅｒｎａｌｐｅｒｉｃｏｎｅｐｔｉｏｎａｌｕｓｅｏｆｍｕｌｔｉｖｉｔａｍｉｎｓａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｒｉｓｋｆｏｒｃｏｎｏｔｒｕｎｃａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｓａｎｄｌｉｍｂｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓａｍｏｎｇｏｆｆｓｐｒｉｎｇ．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ．１９９５；５９：５３６－５４５．］。しかし、この研究に関する推定値は顕著ではなかった。その後、１９９９年～２００４年にカリフォルニアの研究では、葉酸複合ビタミンが心臓円錐動脈幹異常に予防作用を示すことは認められなかった［ＳｈａｗＧＭ，ＣａｒｍｉｃｈａｅｌＳＬ，ＹａｎｇＷａｎｄＬａｍｍｅｒＥＪ．Ｐｅｒｉｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎａｌｎｕｔｒｉｅｎｔｉｎｔａｋｅｓａｎｄｒｉｓｋｓｏｆｃｏｎｏｔｒｕｎｃａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｓ．ＢｉｒｔｈＤｅｆｅｃｔｓＲｅｓＡＣｌｉｎＭｏｌＴｅｒａｔｏｌ．２０１０；８８：１４４－５１．］。１９９３～１９９６年に、カナダのボストン、アメリカのフィラデルフィア、カナダのトロントの病院で行われた対照研究によると、産前に摂取した葉酸を含むビタミンと心臓欠陥のタイプとの間に顕著な関連は認められなかった［ＷｅｒｌｅｒＭＭ，ＨａｙｅｓＣ，ＬｏｕｉｋＣ，ＳｈａｐｉｒｏＳａｎｄＭｉｔｃｈｅｌｌＡＡ．Ｍｕｌｔｉｖｉｔａｍｉｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｉｏｎａｎｄｒｉｓｋｏｆｂｉｒｔｈｄｅｆｅｃｔｓ．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．１９９９；１５０：６７５－６８２．］。ボルチモア・ワシントンの研究では、妊娠前に葉酸を４００ｍｇ／日で補給することによる予防作用は認められなかった［ＳｃａｎｌｏｎＫＳ，ＦｅｒｅｎｃｚＣ，ＬｏｆｆｒｅｄｏＣＡ，ｅｔａｌ．Ｐｒｅｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎａｌｆｏｌａｔｅｉｎｔａｋｅａｎｄｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｃａｒｄｉａｃｏｕｔｆｌｏｗｔｒａｃｔ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ－ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＩｎｆａｎｔＳｔｕｄｙＧｒｏｕｐ．［Ｊ］．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，１９９８，９（１）：９５－９８．］。１９９７年～２００４年に米国先天性欠損予防研究報告では、母体糖尿病と葉酸を含む多種類のビタミンの多種類の心臓欠陥に対する結合作用の多施設研究により、未調整ＯＲ値が０．９５（９５％ＣＩ０．８５～１．０６）であり、両者の関係は大きくないと指摘した［ＣｏｒｒｅａＡ，ＧｉｌｂｏａＳＭ，ＢｏｔｔｏＬＤ，ＭｏｏｒｅＣＡ，ＨｏｂｂｓＣＡ，ＣｌｅｖｅｓＭＡ，Ｒｉｅｈｌｅ－ＣｏｌａｒｕｓｓｏＴＪ，ＷａｌｌｅｒＤＫ，ＲｅｅｃｅＥＡａｎｄＮａｔｉｏｎａｌＢｉｒｔｈＤｅｆｅｃｔｓＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎＳ．Ｌａｃｋｏｆｐｅｒｉｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎａｌｖｉｔａｍｉｎｓｏｒｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｔｈａｔｃｏｎｔａｉｎｆｏｌｉｃａｃｉｄａｎｄｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｂｉｒｔｈｄｅｆｅｃｔｓ．ＡｍＪＯｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌ．２０１２；２０６：２１８ｅ１－１３．］。

ハンガリーの研究チームは１９８４～１９９１年に葉酸を補給して神経管奇形を予防する無作為化対照研究で、実験群は妊娠前１ヶ月から妊娠後３ヶ月まで０．８ｍｇの葉酸を含む複合ビタミンを摂取し、対照群は神経管奇形の発生率が極めて低下したとともに、先心病の発生率も４０％低下したことを発見したと指摘した［Ｃｚｅｉｚｅｌ，ＡｎｄｒｅｗＥ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｃｏｎｇｅｎｉｔａｌａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓｂｙｐｅｒｉｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎａｌｍｕｌｔｉｖｉｔａｍｉｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．［Ｊ］．Ｂｍｊ，１９９３，３０６（６８９３）：１６４５－１６４８．］。しかし、上記の研究には、組み込まれた先心病症例は少なく、１０例の暴露心臓欠陥症例と１７例の未暴露心臓欠陥症例しかなかったなど、欠陥がある。その後の評価研究では、インフルエンザと一般風邪に伴う合併症のある妊婦は円錐動脈幹異常リスクが高いことに関連しており、高用量の葉酸により円錐動脈幹異常リスクを低減できることが発見された［Ｃｓａｋｙ－Ｓｚｕｎｙｏｇｈ，Ｍｅｌｉｎｄａ，ＶｅｒｅｃｚｋｅｙＡ，Ｋｏｓａ，Ｚｓｏｌｔ，ｅｔａｌ．Ｒｉｓｋａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｏｒｉｇｉｎｏｆｃｏｎｏｔｒｕｎｃａｌｄｅｆｅｃｔｓｏｆｈｅａｒｔ－－ａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｓｔｕｄｙ．［Ｊ］．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓＰａｒｔＡ，２０１３，１６１（１０）：２４４４－２４５２．］。

オーストラリアで１９９７年～１９９８年の研究によると、葉酸と後代の心臓欠陥のリスクの間には関連がないことが明らかになった［ＢｏｗｅｒＣ，ＭｉｌｌｅｒＭ，ＰａｙｎｅＪ，ＳｅｒｎａＰ．Ｆｏｌａｔｅｉｎｔａｋｅａｎｄｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｎｏｎ－ｎｅｕｒａｌｂｉｒｔｈｄｅｆｅｃｔｓ．ＡｕｓｔＮＺＪＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ．２００６；３０（３）：２５８－２６１．］。オランダ北部の症例対照研究では、葉酸を用いた女性が出産した乳児の心臓欠陥リスクは約２０％低下したと指摘したが、心疾患サブタイプの分析では、房室中隔欠損症のリスクは葉酸補給により上昇し、ＯＲ値は１．２８（９５％ＣＩ０．３３～４．９５）であった［ｖａｎＢｅｙｎｕｍＩＭ，ＫａｐｕｓｔａＬ，ＢａｋｋｅｒＭＫ，ｄｅｎＨｅｉｊｅｒＭ，ＢｌｏｍＨＪ，ｄｅＷａｌｌｅＨＥ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｅｒｉｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎａｌｆｏｌｉｃａｃｉｄｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｏｎｔｈｅｒｉｓｋｏｆｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｓ：ａｒｅｇｉｓｔｒｙ－ｂａｓｅｄｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｓｔｕｄｙｉｎｔｈｅｎｏｒｔｈｅｒｎＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．ＥｕｒＨｅａｒｔＪ．２０１０；３１（４）：４６４－４７１．］。

ノルウェーの研究チーム［ＬｅｉｒｇｕｌＥ，ＧｉｌｄｅｓｔａｄＴ，ＮｉｌｓｅｎＲＭ，ｅｔａｌ．ＰｅｒｉｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎａｌＦｏｌｉｃＡｃｉｄＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄＩｎｆａｎｔＲｉｓｋｏｆＣｏｎｇｅｎｉｔａｌＨｅａｒｔＤｅｆｅｃｔｓｉｎＮｏｒｗａｙ１９９９－２００９［Ｊ］．ＰａｅｄｉａｔｒｉｃａｎｄＰｅｒｉｎａｔａｌＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，２０１５，２９（５）：３９１－４００．］は、妊娠準備期における葉酸補給が重症先心病の発生率の低下につながることが認められなかったと指摘した。また、葉酸を０．４ｍｇ補給した後、中隔欠損型先心病の発生リスクは２０％増加することが分かった。さらに、２０００年～２００９年にノルウェーで、１９９６年～２００３年にデンマークで１９７１２３例の乳児症例分析研究では、一部のデータが前述の研究を含む可能性があり、葉酸は後代の先天性欠損症である先心病（深刻な欠損、円錐欠損または室中隔欠損を含む）のリスクと関係していないと結論した［ＯｙｅｎＮ，ＯｌｓｅｎＳＦ，ＢａｓｉｔＳ，ｅｔａｌ．ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＢｅｔｗｅｅｎＭａｔｅｒｎａｌＦｏｌｉｃＡｃｉｄＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｇｅｎｉｔａｌＨｅａｒｔＤｅｆｅｃｔｓｉｎＯｆｆｓｐｒｉｎｇｉｎＢｉｒｔｈＣｏｈｏｒｔｓＦｒｏｍＤｅｎｍａｒｋａｎｄＮｏｒｗａｙ．ＪＡｍＨｅａｒｔＡｓｓｏｃ．２０１９；８（６）：ｅ０１１６１５．］。

学者は、カナダ・アルバータ省でも１９９５～２００２年に２０万人程度の出生例の統計を取った［ＢｅｄａｒｄＴ，ＬｏｗｒｙＲＢ，ＳｉｂｂａｌｄＢ，ｅｔａｌ．ＦｏｌｉｃａｃｉｄｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｂｉｒｔｈｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｃａｓｅｓｉｎＡｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ［Ｊ］．ＢｉｒｔｈＤｅｆｅｃｔｓＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｔＡ：ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｅｒａｔｏｌｏｇｙ，２０１３，９７（８）：５６４－５７０．］ところ、１９９８年の葉酸強化政策の実施前後で、総先心病の発生率は変化していないことが分かった。

中国では、同様にいくつかの葉酸による先心病の予防研究が展開され、広東、湖北、福建、山西の病院の症例対照研究によると、葉酸補給剤は先心病の心臓欠陥リスクを６５％低下させることができる［ＬｉＸ，ＬｉＳ，ＭｕＤ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｅｒｉｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎａｌｆｏｌｉｃａｃｉｄｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｓ：ａｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｓｔｕｄｙｉｎＣｈｉｎａ．ＰｒｅｖＭｅｄ．２０１３；５６（６）：３８５－３８９．］。中国の学者［ＢａｏｈｏｎｇＭ，ＪｉｅＱ，ＮａｎＺ，ｅｔａｌ．Ｍａｔｅｒｎａｌｆｏｌｉｃａｃｉｄｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｄｉｅｔａｒｙｆｏｌａｔｅｉｎｔａｋｅａｎｄｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｓ［Ｊ］．ＰＬＯＳＯＮＥ，２０１７，１２（１１）：ｅ０１８７９９６－．］は、２０１０年～２０１２年に甘粛省の出生コホート研究では、葉酸により新生児が先心病に罹患する確率を低下させ、低摂取量での妊婦が先心病児を産むリスクは葉酸補給群に比べてほぼ２倍増加したと指摘した。注意すべきなのは、上記の研究報告でも、２２１．０３μｇ／日より大きい葉酸を摂取すると、房室中隔欠損症のリスクを増加させ、ＯＲ値１．２０（９５％ＣＩ０．５８～２．５１）であった。２００４年～２０１６年に広東の研究では、約８３７９例の先心病症例と６９１８例の対照例をもとに、著者らは妊娠早期の妊婦が葉酸を使用することにより、冠状動脈性心疾患の低リスクにつながると考えている［ＱｕＹ，ＬｉｎＳ，ＺｈｕａｎｇＪ，ｅｔａｌ．Ｆｉｒｓｔ－ＴｒｉｍｅｓｔｅｒＭａｔｅｒｎａｌＦｏｌｉｃＡｃｉｄＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎＲｅｄｕｃｅｄＲｉｓｋｓｏｆＳｅｖｅｒｅａｎｄＭｏｓｔＣｏｎｇｅｎｉｔａｌＨｅａｒｔＤｉｓｅａｓｅｓｉｎＯｆｆｓｐｒｉｎｇ：ＡＬａｒｇｅＣａｓｅ－ＣｏｎｔｒｏｌＳｔｕｄｙ．ＪＡｍＨｅａｒｔＡｓｓｏｃ．２０２０；９（１３）：ｅ０１５６５２．］。このデータの結果が先人と一致しないとは、中国で２０１０年に無料葉酸補給計画の前に、葉酸を使用する妊婦は少なく、その葉酸レベルがもともと低いと解釈されており、この研究では妊婦の食事中の葉酸レベルと妊婦自身の葉酸レベルを調査しておらず、用量などの関連要素は検討されていない。また、著者らは、統計した症例の中で先心病のサブタイプを示すのは少数であり、代表的ではないかもしれないことを認めている。

因果を検討する前提条件は、葉酸補給剤の使用と乳児の心臓欠陥リスクに関する具体的な情報を設計する研究であるが、設計、偏見、混同により上述したいくつかの研究結果が矛盾し、地域の食習慣における葉酸レベルの違いによって解釈されてもよい。

以上より、葉酸の先心病に対する作用は依然として疑問視されており、葉酸が先心病に関連する上述の１５項の臨床研究の中で、葉酸が先心病の予防に役立つことを明確に裏付けるのは８項であり、そのうちハンガリーの研究症例数は少なく、オランダ、ノルウェー、中国の研究報告は葉酸が先心病のリスクを低減するのに役立つことを裏付けるが、報告の細部にも、葉酸補給により房室中隔欠損症のリスクを高める可能性があることが示されている。上記の研究は臨床データ統計や電話フォローアップ調査にすぎず、二重盲検対照試験ではなく、研究者らの従来技術に対する認識偏見のため、先心病が葉酸に関連しているかどうかは、さらに確認する必要がある。

現在、国際医学界の大部分では、妊娠準備期の女性が葉酸を補充することにより、先心病の発生リスクを低減するのに役立つことを認めており、中国では妊婦が葉酸を補充することも共通認識であるが、先心病の発症率は依然として増加している。世界各国の先心病の発症率、特に心房中隔欠損（ＡＳＤ）に関するデータ（説明書の図１を参照）を統計した結果、１９９８年以降、世界の北米地域とアジアではＡＳＤに関する出生率が著しく上昇したが、ヨーロッパと南米地域では一定低下したことが驚くべきことに見出された［ＬｉｕＹ，ＣｈｅｎＳ，ＺｕｈｌｋｅＬ，ｅｔａｌ．Ｇｌｏｂａｌｂｉｒｔｈｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｓ１９７０－２０１７：ｕｐｄａｔｅｄｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗａｎｄｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ２６０ｓｔｕｄｉｅｓ．ＩｎｔＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ．２０１９；４８（２）：４５５－４６３．］。注意すべきなのは、１９９８年に米国が穀物、小麦粉、パンなどの主食に葉酸を強制添加する要求を公布し、カナダも同様の要求を出した。欧州では強制要求がなく、また、欧州諸国では葉酸補給剤の依存性が低く、２００９年に発表された欧州先天異常モニタリング報告によると、葉酸補給剤の依存性は５％～４０％であることが明らかになった。

中国では１９８０年以降、ＡＳＤに関する出生率が急速に上昇した。発明者らは研究を行った結果、中国で先心病について、都市人口の発症率は農村人口よりはるかに高く、徐々に拡大する傾向があることを発見した。世界保健機関（ＷＨＯ）の推定によると、世界の低所得国の先天性欠損の発生率は６．４２％で、中所得国は５．５７％で、高所得先進国は４．７２％であり、中国の経済発展が急速であり、生活レベルと医療保健レベルが急速に向上し、特に東部の先進都市、例えば上海、蘇南地区全体は先進国のレベルに達しているが、乳児の先天性欠損率は、対応するレベルで制御されていない。逆に都市人口は農村人口より先天性欠損率が高く、文献の報告から分かるように、先心病について、近年、中国の先心病ＣＨＤ欠陥の発生率が大幅に上昇し、１９８０年～２００４年に緩やかに上昇し、２００５年～２０１９年に大幅に上昇した。研究報告［ＺｈａｏＬ，ＣｈｅｎＬ，ＹａｎｇＴ，ｅｔａｌ．ＢｉｒｔｈｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅｉｎＣｈｉｎａ，１９８０－２０１９：ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗａｎｄｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ６１７ｓｔｕｄｉｅｓ．ＥｕｒＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ．２０２０；３５（７）：６３１－６４２．］によると、中国の先心病児出生率は、１９８０～１９８４年に乳児１０００人当たり０．２０１から２０１５～２０１９年に乳児１０００人当たり４．９０５になった。注意すべきなのは、中国では１９８０年～２０１９年に、時間が経つにつれてＡＳＤの出生率が著しく増加し、１９８０年に約０．２５‰から２０００年に０．５‰になり、２０００年以降、３‰に急速に上昇し、ＡＳＤはほとんど先心病の半分を占めている。

この間、全中国で妊婦の葉酸補給が開始され、一部の地域で葉酸無料政策が実施され、神経管奇形の発生率は葉酸の補給によって著しく低下したが、先心病の発生率はかえって大幅に増加した。疫学統計と現地の葉酸使用状況により、発明者らは、葉酸の補給が先心病の発生率の向上と一定の相関があるかどうかを慎重に疑い、本発明に開示された研究において、葉酸（未代謝葉酸）が先心病の発症率の向上をもたらすことを確認した。

ホルムアルデヒドは無色の刺激性ガスであり、水とエタノールに溶けやすく、化学工業、木材工業、紡績工業、防腐工事を含む人間工業生産において広く使用されている。健康に対する要求が高まるにつれて、環境中のホルムアルデヒドの危害がますます重視されている。家屋装飾過程でホルムアルデヒドが不可避的に発生し、これらのホルムアルデヒドは完全に除去することが難しい。そのため、新宅中のホルムアルデヒドの含有量は安全値より高いことが多く、妊婦の流産や胎児の健康被害の危険も高まっている。発明者らは、先心病の研究過程において、５－メチルテトラヒドロ葉酸がホルムアルデヒドの影響を受けたゼブラフィッシュ胚を救うことができるとともに、高濃度の５－メチルテトラヒドロ葉酸は毒性がなく、催奇形性がないことを意外にも見出した。

本発明は動物実験に基づき、研究した結果、妊娠中に葉酸を服用すると、未代謝葉酸により胚に催奇形性を示し、葉酸の長期又は過剰な補給により先天性心疾患の発生を引き起こすことがあることを見出した。ただし、５－メチルテトラヒドロ葉酸は催奇形性がなく、妊娠中に服用すると先天性心疾患の発生を予防する作用を有する。

本発明は、５－メチルテトラヒドロ葉酸を含み、妊婦に対して新生児の先天性心疾患を予防するために用いられる薬物又は保健機能食品を提供する。

本発明の薬物又は保健機能食品によれば、妊婦に対して新生児の先天性心疾患の発生を予防するために用いられる。

本発明の薬物又は保健機能食品によれば、前記先天性心疾患は、最もよく見られる先天性奇形であり、胚発育期間に心臓及び大血管の形成障害又は形成異常による異常な解剖学的構造、又は出生後に自動的に閉鎖すべき通路が閉鎖できないことを意味する。

本発明の薬物又は保健機能食品によれば、前記先天性心疾患は、三つのサブグループの疾患を含む。
１）動脈管開存症、大動脈狭窄症、肺動脈狭窄症、肺動脈閉鎖症及び他の先天性大動脈奇形を含む先天性大動脈奇形、２）房室中隔欠損症（ＡＶＳＤｓ）、心室中隔欠損症（ＶＳＤｓ）、心房中隔欠損症（ＡＳＤｓ）、ファロー四徴症、大動脈肺動脈中隔欠損症及び他の先天性中隔奇形を含む先天性心臓中隔奇形、３）心腔の先天性接合奇形、先天性大動脈及び僧帽弁奇形を含む他の先天性心疾患。

本発明の薬物又は保健機能食品によれば、前記薬物又は保健機能食品は、有効量の５－メチルテトラヒドロ葉酸を含み、薬学的に許容される補助材料又は補助剤をさらに含む。

本発明に記載の薬物又は保健機能食品によれば、本分野で知られている様々な剤形であってもよい。例えば経口投与、舌下投与又は直腸投与などの経腸投与剤形である。例としては、経口剤形は、錠剤、カプセル、経口液剤、滴下丸剤、丸剤、粉剤、顆粒剤であってもよい。例としては、注射剤形は、粉末注射剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤であってもよい。

本発明の薬物又は保健機能食品によれば、前記５－メチルテトラヒドロ葉酸の使用量は０．０５～５０ｍｇ／日であり、好ましくは０．２～０．８ｍｇ／日である。

本発明の別の態様は、ホルムアルデヒドによる妊婦の流産を防止し、胎児を保護するための薬物又は保健食品を提供する。

前記のホルムアルデヒドによる妊婦の流産を防止し、胎児を保護するための薬物又は保健食品によれば、ホルムアルデヒド環境への長期暴露による妊婦の流産を予防することができる。

前記のホルムアルデヒドによる妊婦の流産を防止し、胎児を保護するための薬物又は保健食品によれば、ホルムアルデヒドによる妊婦の切迫流産症状の治療に使用できる。

本発明に記載のホルムアルデヒドによる妊婦の流産を防止し、胎児を保護するための薬物又は保健機能食品によれば、本分野で知られている様々な剤形であってもよい。例えば経口投与、舌下投与又は直腸投与などの経腸投与剤形である。例としては、経口剤形は、錠剤、カプセル、経口液剤、滴下丸剤、丸剤、粉剤、顆粒剤であってもよい。例としては、注射剤形は、粉末注射剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤であってもよい。

本発明に記載のホルムアルデヒドによる妊婦の流産を防止し、胎児を保護するための薬物又は保健機能食品によれば、前記５－メチルテトラヒドロ葉酸の使用量は０．０５～５０ｍｇ／日であり、好ましくは０．２～０．８ｍｇ／日であり、切迫流産の治療用量は０．８～２００ｍｇ／日であり、好ましくは２０ｍｇ／日である。

明らかに、本発明の上記内容によれば、本分野の一般的な技術知識及び慣用手段に従い、本態様の上記基本技術思想から逸脱することなく、他の多様な形式の修正、置換又は変更を行うこともできる。

特に指摘すべきなのは、各国の法律法規の違いにより、例えば米国の食事栄養補給剤は関連機能を強調することができる（ＦＤＡにより、食事栄養補給剤は、食品又は食事成分と健康状態又は疾患リスク低下との関係を説明することができることが認められている）ため、５－メチルテトラヒドロ葉酸は先天性心疾患、流産及び死胎を予防するための薬物又は保健機能食品の調製に使用できるだけでなく、上記機能を有するサプリメント、特殊医学用途調製食品の調製にも使用できる。例としては、例えば５－メチルテトラヒドロ葉酸を含む複合ビタミン錠、妊婦用調製粉乳などである。

胎児の心臓奇形を予防するための薬物又は保健機能食品の調製における５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムの使用である。

前記心臓奇形は、好ましくはエタノール、硝酸鉛、アリストロキア酸による心臓奇形である。
前記５－メチルテトラヒドロ葉酸は、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその薬学的に許容される塩を含む。

前記５－メチルテトラヒドロ葉酸は、５－メチル－（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸、５－メチル－（６Ｒ）テトラヒドロ葉酸、又は５－メチル（６Ｒ，Ｓ）テトラヒドロ葉酸から選択され、即ち５－メチルテトラヒドロ葉酸の光学異性体、光学異性体の混合物、特に純粋な天然光学異性体を含む。

前記薬学的に許容される塩は、５－メチルテトラヒドロ葉酸中の塩基性基から変換された対応する酸付加塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸中の酸性基から変換された対応する塩基付加塩を含み、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムとアンモニウム塩、置換アンモニウム塩、又はアルギニンやリジンとともに形成した塩であることが好ましい。

重金属、アルコール、薬物による先天性心疾患を予防するための薬物の調製における５－メチルテトラヒドロ葉酸の使用である。

１９８０～２０１９年に中国での異なるサブタイプの先天性心疾患の出生率と、１９７０年～２０１７年に世界での異なる地域における心房中隔欠損症の出生率である。ａは、実験例１における、ゼブラフィッシュ胚の生存率に対する１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａの影響であり、ｂは、実験例１における、ゼブラフィッシュ胚の発達に対するＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａの影響である。実験例１における、４８ｈｐｆと７２ｈｐｆでのゼブラフィッシュの心拍数と体長に対するＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａの影響である。ａは、実験例２におけるゼブラフィッシュ胚の生存率に対するＭＴＸ及びＭＴＸ＋Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａの影響であり、ｎｓは、コントロールと比較して有意差がないことを示し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．００５を示す。ｂは、ゼブラフィッシュ胚の発育に対するＭＴＸモデル群及びＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａレスキュー群の影響である。実験例２におけるゼブラフィッシュ胚の心膜水腫率、心拍数、体長に対するＭＴＸ及びＭＴＸ＋Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａの影響である。ｎｓは、コントロールと比較して有意差がないことを示し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．００５を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．０１を示し、＊は、ｐ＜０．１を示す。ａは、実験例３におけるゼブラフィッシュ胚の生存率に対する異なる濃度の葉酸の影響である。ｂは、ゼブラフィッシュ胚の心拍数に対する異なる濃度の葉酸の影響である。実験例３における８ｈｐｆ及び２４ｈｐｆでゼブラフィッシュ胚の形態に対する異なる濃度の葉酸の影響である。実験例３において１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ、８ｍＭのＦＡ、６ｍＭのＦＡ、及び４ｍＭのＦＡが７２ｈｐｆでゼブラフィッシュの心臓に及ぼす影響である。左図は、７２ｈｐｆで、異なる濃度の葉酸での心臓胚の発育状況を顕微鏡観察したところ、心膜水腫奇形／心房と心室伸長、腸下網状血管発育障害が見られた。右図は、７２ｈｐｆでゼブラフィッシュの体長に対する葉酸の影響である。実験例４のゼブラフィッシュ胚における異なる転写因子の発現に対する葉酸の影響である。実験例４のゼブラフィッシュ胚における異なる転写因子の発現に対する５－メチルテトラヒドロ葉酸の影響である。ａは、実験例５におけるゼブラフィッシュ胚の生存率に対するＦＡ及びＦＡ＋Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａの影響である。ｂは、実験例５におけるゼブラフィッシュ胚の発育に対するＦＡ及びＦＡ＋Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａの影響である。実験例５における４８ｈｐｆゼブラフィッシュ胚の心膜水腫率、心拍数、及び７２ｈｐｆゼブラフィッシュ胚の体長である。ａは、実験例６におけるゼブラフィッシュ胚の生存率に対するホルムアルデヒドとホルムアルデヒド＋Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａの影響である。ｂは、ゼブラフィッシュ胚の発育に対するホルムアルデヒドとホルムアルデヒド＋Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａの影響である。実験例６における４８ｈｐｆゼブラフィッシュ胚の心拍数と７２ｈｐｆゼブラフィッシュ胚の体長の影響である。ａは、実験例７における心筋小柱に対する低ホモシステインの影響である。ｂは、低ホモシステインにより心筋細胞ギャップへの少量のリンパ球浸潤が起こる。ｃは、低ホモシステインにより薄紅色の漿液性物質は右心室に見られる。ｄは、高ホモシステインにより胎児マウスの筋肉細胞質が赤色に染色する。実験例７における、胎児マウスの心臓に対する高ホモシステインの影響である。実験例８における正常群のラットの心臓切片図である。実験例８における、胎児マウスの心臓に対する高用量（３６．４４ｍｇ／ｋｇ）の葉酸の影響である。実験例８における、胎児マウスの心臓に対する高用量（１８．２２ｍｇ／ｋｇ）の葉酸の影響である。実験例８における、胎児マウスの心臓に対する高用量（９．１１ｍｇ／ｋｇ）の葉酸の影響である。実験例９における２．２７７５ｍｇ／ｋｇの葉酸群の胎児マウスの典型的な心臓切片図である。実験例９における０．９１１ｍｇ／ｋｇの葉酸群の胎児マウスの典型的な心臓切片図である。実験例１０における６日齢の新生児マウスの心エコー図であり、それぞれコントロール（Ａ）、低用量葉酸群（Ｂ）、高用量葉酸群（Ｃ）、低用量メチルテトラヒドロ葉酸群（Ｄ）、高用量メチレンテトラヒドロ葉酸群（Ｅ）である。実験例１０における６日齢の新生児マウスの心エコー図のデータであり、それぞれコントロール（Ａ）、低用量葉酸群（Ｂ）、高用量葉酸群（Ｃ）、低用量メチルテトラヒドロ葉酸群（Ｄ）、高用量メチレンテトラヒドロ葉酸群（Ｅ）である。実験例１０における各群の胎児マウスの典型的な心臓切片図である。ａは、実験例１１において、Ｐｂ（ＮＯ_３）_２及びＰｂ（ＮＯ_３）_２＋Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａによるゼブラフィッシュ胚の生存率試験である。ｂは、ゼブラフィッシュ胚の発育に対するＰｂ（ＮＯ_３）_２モデル群及びＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａレスキュー群の影響である。実験例１１における酢酸鉛とメチルテトラヒドロ葉酸の影響を受けた４８ｈｐｆゼブラフィッシュ胚の心拍数及び７２ｈｐｆゼブラフィッシュ胚の体長と奇形率である。Ａは、実験例１１におけるエタノール及びエタノール＋Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａによるゼブラフィッシュの生存率である。Ｂは、ゼブラフィッシュの発育に対するエタノール及びＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａの影響である。実験例１１におけるエタノール及びメチルテトラヒドロ葉酸の影響を受けたゼブラフィッシュ胚の心拍数及びゼブラフィッシュ胚の体長及び奇形率である。実験例１１におけるアリストロキア酸Ａ及びアリストロキア酸Ａ＋Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａによるゼブラフィッシュ胚の生存率試験である。実験例１１におけるゼブラフィッシュ胚の発育に対するアリストロキア酸Ａモデル群及びＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ＋アリストロキア酸Ａ群の影響である。実験例１１におけるアリストロキア酸Ａ及び５－メチルテトラヒドロ葉酸の影響を受けた４８ｈｐｆでのゼブラフィッシュ胚の心膜水腫率、心拍数及び７２ｈｐｆでのゼブラフィッシュ胚の体長である。

本発明において、「５－メチルテトラヒドロ葉酸」という用語は、５－メチル－（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸、５－メチル－（６Ｒ）テトラヒドロ葉酸、５－メチル（６Ｒ，Ｓ）テトラヒドロ葉酸を含み、即ち５－メチルテトラヒドロ葉酸の光学異性体、特に純粋な天然光学異性体、光学異性体の混合物、例えばラセミ混合物、及びそれらの生理学的に許容される塩を含む。それらの中でも、５－（メチル）－（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸は特に好ましい。

前記生理学的に許容される塩は、５－メチルテトラヒドロ葉酸中の塩基性基から変換された対応する酸付加塩を意味し、前記酸は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸のような無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸又はニコチン酸のような有機酸であってもよい。

前記生理学的に許容される塩は、５－メチルテトラヒドロ葉酸中の酸性基から変換された対応する塩基付加塩を意味してもよく、適切な塩としては、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムとアンモニウム塩、置換アンモニウム塩、及びアルギニンやリジンとともに形成した塩である。
本発明に記載の葉酸は、プテロイルグルタミン酸を意味し、合成葉酸であり、ビタミンＢ９、ビタミンＭとも呼ばれ、英語名がｆｏｌｉｃａｃｉｄである。研究論文［ＢａｏｈｏｎｇＭ，ＪｉｅＱ，ＮａｎＺ，ｅｔａｌ．Ｍａｔｅｒｎａｌｆｏｌｉｃａｃｉｄｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｄｉｅｔａｒｙｆｏｌａｔｅｉｎｔａｋｅａｎｄｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｓ［Ｊ］．ＰＬＯＳＯＮＥ，２０１７，１２（１１）：ｅ０１８７９９６－．］により、妊娠前１ヶ月に、毎日２６６．５μｇ以上の葉酸を摂取している妊婦は、毎日１１５．９７～２６５．５μｇの葉酸を摂取している妊婦群に比べて、新生児の房室中隔欠損症（ＡＳＤ）の発生率が高いことが明らかになったが、著者はこの現象を無視し、依然として葉酸の補給により新生児の先天性心疾患の発生率の低下に有利であると考えている。２６５．５μｇ／日は依然として国連が推奨する摂取量を下回っている現象については、著者がさらに検討していない。葉酸補給により新生児の先天性心疾患の発生率を増加させるという論点は、転覆的な論点であり、発見されていない。主な理由は、新生児欠損の発症例の絶対値がもともと非常に低いことである可能性がある。先天性欠損症である先天性心疾患は、主なタイプであるが、５‰以下であり、直接臨床対照により検証するために数万人の妊婦を含めることは非現実的であり、以前の研究報告では、医療記録の統計分析により、含めた症例自身の葉酸レベル及び食事の影響を制御できず、その影響を除外することは困難である。

妊婦に葉酸を補給すると、血液循環に未代謝の葉酸が存在することもある。アメリカの学者は、妊婦への葉酸補給に関する研究［ＯｂｅｉｄＲ，ＫａｓｏｈａＭ，ＫｉｒｓｃｈＳＨ．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｕｎｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｄｆｏｌｉｃａｃｉｄａｎｄｐｒｉｍａｒｙｆｏｌａｔｅｆｏｒｍｓｉｎｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎａｔｄｅｌｉｖｅｒｙａｎｄｉｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｂｌｏｏｄ［Ｊ］．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１０，９２（６）：１４１６－１４２２．］で、妊娠中に葉酸を補給する２５人の妊婦の血清中に０．１９ｎｍｏｌ／Ｌの未代謝葉酸が検出され、臍帯血中の葉酸濃度は０．２７ｎｍｏｌ／Ｌと高いことを記載しており、未代謝葉酸が母親よりも胎児に高濃度で蓄積する可能性があることを示唆している。

本発明の発明者らは、葉酸がゼブラフィッシュ胚に対して催奇形作用を示すことを発見した。葉酸の介入により、ゼブラフィッシュ胚の心膜水腫、心拍数緩慢、体長短縮を引き起こす。顕微鏡観察により、葉酸はゼブラフィッシュの心膜水腫、色素沈着障害、体節間血管発育不全を引き起こすことが発見された。これから分かるように、葉酸は同様にヒト胚発生に催奇形作用を示すことがある。ヒト胚発生、心臓形成に肝心な期間は８週間前であり、胎児の早期心循環は妊娠６～８週間で形成される。葉酸は、血管発生と心膜発生のいずれにも催奇形作用を示し、新生児の心血管異常や隔膜奇形を引き起こし、先天性心疾患を引き起こしてしまう。

発明者らは更にゼブラフィッシュにより５－メチルテトラヒドロ葉酸がゼブラフィッシュ胚に催奇形作用を示さず、正常胚群と５－メチルテトラヒドロ葉酸介入群に差はなく、５－メチルテトラヒドロ葉酸の介入により、ゼブラフィッシュ胚の心臓外形は正常であり、腸下網状血管の発育は正常であった。

１つの実施例において、発明者らは、葉酸を介入した異なる時間（２４ｈ、４８ｈ）のゼブラフィッシュ胚を収集し、定量ＰＣＲ技術を用いてゼブラフィッシュ胚における異なる転写因子の発現を検出した。その結果、葉酸の介入により、ゼブラフィッシュ胚における転写因子ＮＫｘ２．５、ａｍｈｃ、ｖｍｈｃ、ｈａｎｄ２、ｈａｓ２、ｍｅｆ２ａ、ｍｅｆ２ｃ、ｂｍｐ２ｂ、ｅｐｈｒｉｎＢ２、ｅｐｈＢ４の発現はいずれも影響され、ＮＫｘ２．５、ｈａｎｄ２、ｈａｓ２、ｍｅｆ２ｃ、ｅｐｈＢ４はいずれも心臓発育過程における重要な転写因子であることが証明されており、発明者らは葉酸がｍｅｆ２ｃ、ｂｍｐ２ｂ、ｖｍｈｃ、ｈａｓ２、ｅｐｈｂ４に大きな影響を及ぼすことを発見した。

ヒトｍｅｆ２ファミリーは、ｍｅｆ２ａ、ｍｅｆ２ｂ、ｍｅｆ２ｃ及びｍｅｆ２ｄの４つのメンバーを含み、ｍｅｆ２ｂ及びｍｅｆ２ｃがまず７日目に胚のうち心臓胚で活性化され、ｍｅｆ２ｃは胚の発育過程で原始心臓管の中胚葉細胞を形成するキーメンバーであり、ｍｅｆ２ｃの欠失は深刻な心臓構造異常、特に、心房中隔欠損又は心室中隔欠損の原因となる［ＱｉａｏＸＨ，ＷａｎｇＦ，ＺｈａｎｇＸＬ，ｅｔａｌ．ＭＥＦ２Ｃｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎｍｕｔａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｓ．ＩｎｔＪＭｅｄＳｃｉ．２０１７；１４（１１）：１１４３－１５３．］。葉酸はｍｅｆ２ｃの発現に影響し、これもＡＳＤ出生率増加の可能原因となる。また、ヒアルロン酸は心臓発育において高度に発現し、細胞移動と形質転換において重要な役割を果たし、ヒトｈａｓ遺伝子の発現によりヒアルロン酸の合成を調節し、ｈａｓ２遺伝子変異が胚において心臓中隔の形成に影響を及ぼす可能性が報告されている［ＺｈｕＸ，ＤｅｎｇＸ，ＨｕａｎｇＧ，ｅｔａｌ．ＡｎｏｖｅｌｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＨｙａｌｕｒｏｎａｎｓｙｎｔｈａｓｅ２ｇｅｎｅｉｎＣｈｉｎｅｓｅｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｐｔａｌｄｅｆｅｃｔ．ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１４；９（２）：ｅ８７４３７．］。

発明者らは、５－メチルテトラヒドロ葉酸を介入した異なる時間（２４ｈ、４８ｈ）のゼブラフィッシュ胚を同時に収集し、定量ＰＣＲ技術を用いてゼブラフィッシュ胚における異なる転写因子の発現を検出した。その結果、５－メチルテトラヒドロ葉酸の介入が転写因子の発現に及ぼす影響は認められず、転写因子に関する発現は正常コントロールと比較して差がなかった。

１つの実施例において、５－メチルテトラヒドロ葉酸は、合成葉酸による心膜水腫によるゼブラフィッシュ胚の奇形を救うことはできないが、ゼブラフィッシュの心拍数緩慢、体長短縮という奇形表現を救うことができることを発明者らが見出した。

さらに葉酸の胚心臓発育への影響を確認するために、実施例９において、異なる用量の葉酸が胎児マウスの心臓に及ぼす影響を考察した結果、一定の用量では、胎児マウスの心臓に心室壁が薄すぎ、個別に心室中隔欠損症が認められ、実施例１０において葉酸を摂取した母マウス及び５－メチルテトラヒドロ葉酸を摂取した母マウスの胎児を比較したところ、低用量葉酸群の母マウスの先心病発症率は５．９５％であり、高用量葉酸群の母マウスの先心病発症率は２２．２％であり、５－メチルテトラヒドロ葉酸群は先心病のない胎児マウスであり、胚心臓発育に及ぼす葉酸の影響をさらに証明した。

さらに、発明者らは、５－メチルテトラヒドロ葉酸がアルコール、硝酸鉛、アリストロキア酸Ａにより誘導される胚心臓奇形を予防する作用を有することを見出した。前記物質は、それぞれアルコール中毒、重金属、薬物などの異なる環境要因による新生児の心臓奇形を示しているため、５－メチルテトラヒドロ葉酸は先心病の発生を予防する広範な作用を有する。

本発明の一実施例において、５－メチルテトラヒドロ葉酸は葉酸欠乏による心臓奇形を予防できることを発明者らが見出した。

本発明の薬物又は保健食品は、１回用量当たり０．１ｍｇ～２００ｍｇの５－メチルテトラヒドロ葉酸を含有し、予防用薬である場合、１回用量当たり０．１ｍｇ～１ｍｇの５－メチルテトラヒドロ葉酸を用いることが好ましい。その具体的な用量は、患者の年齢、体重、投与時間及び経路、個体の状況などの様々な要因に依存し、好ましくは最適用量が０．１～１ｍｇ／日であり、例えば０．８ｍｇ／日である。

本発明において、前記薬物又は保健機能食品は、水、油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、グリセリントリアセテート、ゼラチン、レシチン、シクロデキストリン、ラクトビオース又はデンプン等の糖類、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカゲル又はセルロース等の各種の担体、賦形剤及び／又は補助機能剤を含む。補助機能剤は、例えば、安定剤、抗酸化剤、緩衝剤、抗菌剤などである。本発明の一実施形態において、賦形剤又は担体は、微結晶セルロースであるか、又は微結晶セルロースと架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムとの組合せであるか、又は微粉末シリカゲルである。

本発明は、妊婦が葉酸を服用した後、血液循環に入る未代謝葉酸が先天性心疾患を引き起こすことを初めて発見した。葉酸は合成の酸化形態であり、天然食品では発見されておらず、ヒトジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）によりテトラヒドロ葉酸に転化されなければ人体に利用できないが、人体ではこの過程が遅く、２００μｇ以上の葉酸を服用した数時間後、血漿中に未代謝の葉酸が検出でき、これも葉酸が先心病の臨床統計結果と混同し、結論が一致していない可能原因である。本発明も先人の研究が互いに矛盾している原因を説明し、上世紀８０～９０年代に栄養、葉酸補給政策が出されていないため、妊婦自身の葉酸レベルが比較的低い可能性があり、肯定的な結論を出しやすい。栄養補給用葉酸を含む食品がますます多くなるにつれて、高用量の葉酸では、葉酸と先心病の相関性を認めることが難しい。また、２０００年以前、中隔欠損症の発症率は非常に低かったため、統計的に葉酸がこのサブタイプと一定の相関がある可能性があることが発見されたが、研究者らは認知欠陥と偏見でこの現象を無視したり、統計的偏差と考えたりした。

葉酸は胎児の先天奇形の予防に大規模に使用されているが、本発明は疫学的資料と当該地域の葉酸補給状況を分析した結果、葉酸補給後に先心病発症率が高くなるという矛盾した結果が得られ、葉酸補給により先心病発症率が高くなることを慎重に提案し、本発明の動物実験とエピジェネティクスの結果もこの結論を実証した。

本発明は、５－メチルテトラヒドロ葉酸が先天性心疾患を予防する作用を有し、５－メチルテトラヒドロ葉酸に関する予防用量が１ｍｇ以上であってもよく、合成葉酸に比べて高用量で使用しても催奇形作用がなく、高用量で先天性欠損の予防を実現でき、特に新生児の先天性心疾患の予防において著しい進歩性があることも発見した。

実施例１
５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム塩０．４ｇと微結晶セルロース７００ｇを混合し、乾式造粒した後、１０００カプセルに充填し、１カプセルあたり０．４ｍｇの５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムを含むカプセル製剤を調製した。

実施例２
５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム塩１ｇに微粉末シリカゲル２００ｇを加え、均一に混合した後、打錠機にて打錠成形し、１錠あたり２ｍｇの５－メチルテトラヒドロ葉酸を含む錠剤を調製した。

実験例１
５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム（Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ）がゼブラフィッシュ胚の生存率と心血管発育に及ぼす影響
トランスジェニックゼブラフィッシュ（ｆｌｉ－１：ＥＦＰ）は南京大学モデル動物研究所から購入された。実験に用いた魚は１年齢未満の成体ゼブラフィッシュで、飼育水体のｐＨ値は７±０．２で、温度は２８℃程度で、光照射と遮光の時間比は１４ｈ：１０ｈであり、豊年虫卵を１日２回与えた。前日の夜、１雌２雄計３匹のゼブラフィッシュを産卵箱に入れ、翌朝に卵を集めた。魚卵を胚培養液（０．２ｇ／Ｌの海塩を配置したもの）に入れ、２８℃で培養した。１ウェル当たり１０匹（ｎ＝１０）で、胚培養液を１ｍＬ予め加えた２４ウェルプレートで培養した。各群の試験を３回繰り返した。ゼブラフィッシュ胚は受精後２ｈ（２ｈｐｆ）から７２ｈｐｆまで投与を開始した。８、２４、４８、７２ｈｐｆに各群の死亡数を記録した。投与期間に餌を与えず、胚が死亡すると速やかに整理した。奇形の表現型を観察し、奇形があるすべての異常ゼブラフィッシュの数を記録した。生存率、形態学的欠陥、心拍数、心臓形態などの指標をＳＭＺ７４５Ｔ倒立実体顕微鏡で観察して評価した。

試験結果は以下の通りである。１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａは胚生存率に影響を与えておらず、正常群と比較して８ｈｐｆの場合、正常胚と１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ胚の表現型は類似しており、被覆はほぼ完了していることが分かった。２４ｈｐｆでは正常胚は１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａと類似しており、頭部と尾部が発育し、尾部に揺動現象があった。４８ｈｐｆ後、各群の頭部尾部が完全に発育し、全身色素が形成され、心臓拍動は明らかであり、体節間血管発育は正常であり、血液が全身を流れていることが分かった。７２ｈｐｆでは、各群の心臓の外形は正常であり、腸下網状血管の発育は正常であった（図２を参照）。４８ｈｐｆでゼブラフィッシュ胚の心拍数を測定し、７２ｈｐｆでゼブラフィッシュ胚の体長を測定したところ、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａとコントロールとは、心拍数及び体長に差がないことが分かった（図３を参照）。

実験例２
Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａがメトトレキサート（ＭＴＸ）による葉酸欠乏しているゼブラフィッシュ胚モデルの心血管発育系に及ぼす影響
トランスジェニックゼブラフィッシュ（ｆｌｉ－１：ＥＦＰ）は南京大学モデル動物研究所から購入された。実験に用いた魚は１年齢未満の成体ゼブラフィッシュで、飼育水体のｐＨ値は７±０．２で、温度は２８℃程度で、光照射と遮光の時間比は１４ｈ：１０ｈであり、豊年虫卵を１日２回与えた。前日の夜、１雌２雄計３匹のゼブラフィッシュを産卵箱に入れ、翌朝に卵を集めた。魚卵を胚培養液（０．２ｇ／Ｌの海塩を配置したもの）に入れ、２８℃で培養した。ゼブラフィッシュ胚を６ｈｐｆで２４ウェルプレートに入れ、薬を投与して培養し、１０ｈｐｆまで、１ウェル当たり１０匹で１．５ｍＭのＭＴＸ溶液を１ｍＬ加えた後、卵液に移して７２ｈｐｆまで培養を継続した。胚が死亡すると直ちに整理した。奇形の表現型を観察し、奇形があるすべての異常ゼブラフィッシュの数を記録し、各群の奇形率とレスキュー率を計算した。形態学的欠陥、心拍数、心臓形態などの指標をＳＭＺ７４５Ｔ倒立実体顕微鏡で観察して評価した。

結果は以下の通りである（図４を参照）。１．５ｍＭのＭＴＸは胚生存率を大幅に低下させ（生存率が０．１未満）、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを加えた群では、１．５ｍＭのＭＴＸが胚生存率に及ぼす影響を救うことができ、コントロールとは差が顕著ではないことが分かった。正常コントロールと比較して、異なる時点におけるゼブラフィッシュ胚の表現型を評価し、１．５ｍＭのＭＴＸと１．５ｍＭのＭＴＸ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａはいずれも明らかな胚発育遅延が認められなかった。２４ｈｐｆでは、１．５ｍＭのＭＴＸはゼブラフィッシュの発育不全を招き、小頭、短尾などの奇形が現れた。４８ｈｐｆでは、１．５ｍＭのＭＴＸはゼブラフィッシュの体幹の曲がり、体節間血管発育不全、心膜水腫を引き起こした。７２ｈｐｆでは、１．５ｍＭのＭＴＸでゼブラフィッシュの体長が短くなり、腸下網状血管発育不全を引き起こした。一方、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａは１．５ｍＭのＭＴＸによる胚発育奇形を救うことができた。ＭＴＸ群の奇形率は１００％であったが、Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを添加した後の奇形率はわずか１０％であった。

ＭＴＸに対する１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａのレスキュー効果をさらに定量的に評価するため、４８ｈｐｆでのゼブラフィッシュ胚の心膜水腫、１０ｓ心拍数及び７２ｈｐｆでの各群間のゼブラフィッシュの体長を評価した。図５から分かるように、１．５ｍＭのＭＴＸはゼブラフィッシュの心膜水腫、心拍数緩慢、体長短縮を引き起こしたが、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを加えた群では、ゼブラフィッシュの心膜水腫、心拍数緩慢、体長短縮という奇形表現型を救うことができた。

実験例３
葉酸（ＦＡ）のゼブラフィッシュ胚に対する催奇形作用
トランスジェニックゼブラフィッシュ（ｆｌｉ－１：ＥＦＰ）は南京大学モデル動物研究所から購入された。実験に用いた魚は１年齢未満の成体ゼブラフィッシュで、飼育水体のｐＨ値は７±０．２で、温度は２８℃程度で、光照射と遮光の時間比は１４ｈ：１０ｈであり、豊年虫卵を１日２回与えた。前日の夜、１雌２雄計３匹のゼブラフィッシュを産卵箱に入れ、翌朝に卵を集めた。魚卵を胚培養液（０．２ｇ／Ｌの海塩を配置したもの）に入れ、２８℃で培養した。ゼブラフィッシュ胚を２ｈｐｆから２４ウェルプレートに入れ、薬を投与して培養し、１ウェル当たり５匹（ｎ＝５）で、７２ｈｐｆまで各ウェルにそれぞれ２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３溶液１ｍＬ、１０ｍＭのＦＡ溶液（溶媒は２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３であった）１ｍＬ、８ｍＭのＦＡ溶液（溶媒は２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３であった）１ｍＬ、６ｍＭのＦＡ溶液（溶媒は２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３であった）１ｍＬ、４ｍＭのＦＡ溶液（溶媒は２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３であった）１ｍＬ、２ｍＭのＦＡ（溶媒は２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３であった）１ｍＬ、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ（溶媒は２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３であった）１ｍＬを加えた。胚が死亡すると直ちに整理した。各群の試験を３回繰り返した。胚が死亡すると直ちに整理した。奇形の表現型を観察し、奇形があるすべての異常ゼブラフィッシュの数を記録し、各群の奇形率とレスキュー率を計算した。形態学的欠陥、心拍数、心臓形態などの指標をＳＭＺ７４５Ｔ倒立実体顕微鏡で観察して評価した。

その結果、２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３はゼブラフィッシュの生存率に影響を与えておらず、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａもゼブラフィッシュの生存率に影響を与えておらず、すべてのＦＡ群はいずれも胚の生存率が低く、用量が増加するにつれてゼブラフィッシュ胚死亡率も絶えず向上し（図６を参照）、また、葉酸も胚の心拍数に影響を及ぼし、特に４８ｈｐｆでの胚心拍数に最も大きい影響を及ぼしたことが分かった。葉酸もゼブラフィッシュ胚の体長に影響を及ぼし、特に７２ｈｐｆでは８ｍＭ濃度の葉酸により胚の体長が著しく短くなったことも観察された。

正常コントロールと比較して、異なる時点における各コントロールのゼブラフィッシュ胚の表現型を評価し、８ｈｐｆ正常コントロール、Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ群、ＮａＨＣＯ_３群、２ｍＭのＦＡはすべて完全に被覆されたが、他の濃度の葉酸試験群のゼブラフィッシュ胚はいずれも被覆が不完全な現象を示し、２４ｈｐｆでは葉酸が胚の頭と尾の発育奇形を引き起こしたことが分かった（図７を参照）。７２ｈｐｆでは、正常ゼブラフィッシュ、Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ群、ＮａＨＣＯ_３群、２ｍＭのＦＡは、胚心臓外形が正常であり、腸下網状血管の発育は正常であったが、４ｍＭ以上の濃度のＦＡ群ではゼブラフィッシュ胚の心膜水腫奇形、心房と心室伸長、腸下網状血管発育障害が認められた（図８を参照）。

実験例４
葉酸（ＦＡ）がゼブラフィッシュ胚の発育過程における異なる転写因子の発現に及ぼす影響
葉酸がゼブラフィッシュ胚の発育過程でそのエピジェネティクスに及ぼす影響を検討するため、異なる発育時期のゼブラフィッシュ胚を収集して検出した。トランスジェニックゼブラフィッシュ（ｆｌｉ－１：ＥＦＰ）は南京大学モデル動物研究所から購入された。実験に用いた魚は１年齢未満の成体ゼブラフィッシュで、飼育水体のｐＨ値は７±０．２で、温度は２８℃程度で、光照射と遮光の時間比は１４ｈ：１０ｈであり、豊年虫卵を１日２回与えた。前日の夜、１雌２雄計３匹のゼブラフィッシュを産卵箱に入れ、翌朝に卵を集めた。魚卵を胚培養液（０．２ｇ／Ｌの海塩を配置したもの）に入れ、２８℃で培養した。ゼブラフィッシュ胚を２ｈｐｆから２４ウェルプレートに入れ、薬を投与して培養し、１ウェル当たり１０匹（ｎ＝１０）で、各ウェルにそれぞれ８ｍＭのＦＡ溶液（溶媒は２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３であった）１ｍＬ、８ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ（溶媒は２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３であり、６Ｓ－５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム）１ｍｌを加え、それぞれ２４ｈ、４８ｈｐｆで４％パラホルムアルデヒド溶液で一晩固定し、メタノール溶液に保存し、使用するまで－２０℃で保存した。ゼブラフィッシュ胚に２ｈｐｆから薬を投与し、２４ｈ毎に表現型が明らかな１０匹のゼブラフィッシュを収集し、説明書に従ってＴｒｉｚｏｌで各群のゼブラフィッシュのＲＮＡを抽出し、各群で２４、４８ｈｐｆの２時点の胚を抽出して次の実験に供した。

本ｑＲＴ－ＰＣＲ実験は蛍光染料であるＳＹＢＲＧｒｅｅｎ染料を用いた。ｑＲＴ－ＰＣＲはＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘキットの説明書に従って操作し、最後にＡＢＩ（ＨＴ７９００）ＰＣＲ計で検出した。使用した遺伝子プライマーは金唯智生物科学技術有限公司により合成され、具体的な情報は表１に示される。β－ａｃｔｉｎの表現量を内部参照とし、ΔΔＣｔ法により他の遺伝子の相対発現レベルを計算した。

その結果、ゼブラフィッシュ卵は受精後４８ｈに完全な心臓を形成し、心房と心室からなり、心房と心室の間に弁膜が存在した。種々のシグナル分子の作用下で、Ｎｋｘ－２ファミリー遺伝子、Ｍｅｆ２ファミリー遺伝子などを含む心臓形成細胞の心筋形成遺伝子を発現させた。葉酸は種々の遺伝子の発現を妨げ、正常コントロールと比較して、種々の遺伝子の発現はいずれも異なる程度影響され（図９を参照）、５－メチルテトラヒドロ葉酸（６Ｓ－５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム）は正常コントロールと差がなかった（図１０を参照）。葉酸欠乏は先心病の形成に関与すると考えられるが、葉酸（ｆｏｌｉｃａｃｉｄ）自体も先心病の形成に関与した。葉酸は２４ｈｐｆでｍｅｆ２ｃ遺伝子の発現を向上させたが、ｂｍｐ２ｂ遺伝子の発現を低下させ、４８ｈｐｆではｈａｓ２、ｍｅｆ２ｃ、ｅｐｈｂ４遺伝子の発現を抑制したが、ｖｍｈｃの発現を向上させた。ｍｅｆ２ｃは胚発育過程で原始心臓管の胚葉細胞を形成するキーメンバーであり、ｈａｓ２も胚心臓中隔の形成に影響し、これもＡＳＤ出生率が著しく増加する可能原因であった。

実験例５
Ｌ－５－ＭＴＨＦ－ＣａによるＦＡがゼブラフィッシュ胚の奇形、生存率、心拍数及び体長に及ぼす影響のレスキュー
５－メチルテトラヒドロ葉酸がＦＡによる催奇形性を低下させることができるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。トランスジェニックゼブラフィッシュ（ｆｌｉ－１：ＥＦＰ）は南京大学モデル動物研究所から購入された。実験に用いた魚は１年齢未満の成体ゼブラフィッシュで、飼育水体のｐＨ値は７±０．２で、温度は２８℃程度で、光照射と遮光の時間比は１４ｈ：１０ｈであり、豊年虫卵を１日２回与えた。前日の夜、１雌２雄計３匹のゼブラフィッシュを産卵箱に入れ、翌朝に卵を集めた。魚卵を胚培養液（０．２ｇ／Ｌの海塩を配置したもの）に入れ、２８℃で培養した。ゼブラフィッシュ胚を２ｈｐｆから２４ウェルプレートに入れ、薬を投与して培養し、７２ｈｐｆまで、１ウェル当たり１０匹で６ｍＭのＦＡ溶液（溶媒は２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３であった）を１ｍＬ加えた。胚が死亡すると直ちに整理した。各群の試験を３回繰り返した。６ｍＭのＦＡを選択してモデルを作り、同時に１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａでレスキュー試験を行い、２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３である溶媒コントロールを設定した。奇形の表現型を観察し、奇形があるすべての異常ゼブラフィッシュの数を記録し、各群の奇形率とレスキュー率を計算した。形態学的欠陥、心拍数、心臓形態などの指標をＳＭＺ７４５Ｔ倒立実体顕微鏡で観察して評価した。

結果は以下のとおりであった。６ｍＭのＦＡを選択してモデルを作り、同時に１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａでレスキュー試験を行い、２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３である溶媒コントロールを設定したところ、２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３はゼブラフィッシュの生存率に影響を与えておらず、６ｍＭのＦＡは胚生存率を非常に低くしたが、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを加えた群では、６ｍＭのＦＡが胚生存率に及ぼす影響をレスキューできたことが分かった。正常コントロールと比較して、異なる時点におけるゼブラフィッシュ胚の表現型を評価し（図１１を参照）、８ｈｐｆで正常胚はほぼ被覆が完了し、６ｍＭのＦＡと６ｍＭのＦＡ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ群のいずれでもゼブラフィッシュ胚の発育が遅延した。２４ｈｐｆで、正常ゼブラフィッシュ胚は頭部と尾部が発育し、尾部に揺動現象があった。６ｍＭのＦＡによりゼブラフィッシュに小頭、短尾が発生したが、６ｍＭのＦＡ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａはこの奇形を緩和した。４８ｈｐｆで、６ｍＭのＦＡと６ｍＭのＦＡ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａはいずれもゼブラフィッシュの心膜水腫、色素形成障害、体節間血管発育不全を引き起こした。７２ｈｐｆにおいて、６ｍＭのＦＡ及び６ｍＭのＦＡ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ群では、いずれもゼブラフィッシュの腸下網状血管発育障害があった。しかし、２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３（溶媒コントロール）は、それぞれの時点で観察されたところ、その表現型は正常群と類似していた。

６ｍＭのＦＡに対する１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａのレスキュー効果をさらに定量的に評価するために、４８ｈｐｆでのゼブラフィッシュ胚の心膜水腫、１０ｓ心拍数及び７２ｈｐｆでの各群間のゼブラフィッシュの体長を評価した。図１２から分かるように、６ｍＭのＦＡによりゼブラフィッシュの心膜水腫が深刻であり、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａにより心膜水腫の奇形を救うことができなかった。６ｍＭのＦＡによりゼブラフィッシュの心拍数が緩慢で体長が短くなったが、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを加えた群では、ゼブラフィッシュの心拍数が緩慢で体長が短くなったという奇形表現型を救うことができた。２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３（溶媒コントロール）では、ゼブラフィッシュ胚の心臓、心拍数及び体長がいずれも影響を受けなかった。

以上より、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａにより、６ｍＭのＦＡによるゼブラフィッシュ胚の生存率低下、心拍数過緩及び体長短縮を救うことができるが、心膜水腫や色素発達障害を救うことはできない。

実験例６
Ｌ－５－ＭＴＨＦ－ＣａによるホルムアルデヒドＨＣＨＯがゼブラフィッシュ胚の生存率に及ぼす影響のレスキュー
トランスジェニックゼブラフィッシュ（ｆｌｉ－１：ＥＦＰ）は南京大学モデル動物研究所から購入された。実験に用いた魚は１年齢未満の成体ゼブラフィッシュで、飼育水体のｐＨ値は７±０．２で、温度は２８℃程度で、光照射と遮光の時間比は１４ｈ：１０ｈであり、豊年虫卵を１日２回与えた。前日の夜、１雌２雄計３匹のゼブラフィッシュを産卵箱に入れ、翌朝に卵を集めた。魚卵を胚培養液（０．２ｇ／Ｌの海塩を配置したもの）に入れ、２８℃で培養した。ゼブラフィッシュ胚を２ｈｐｆから２４ウェルプレートに入れ、薬（１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ）を投与して培養し、１ウェルあたり１０匹で３０ｍＭのＨＣＨＯ溶液を１ｍＬ加えた。胚が死亡すると直ちに整理した。各群の試験を３回繰り返した。奇形の表現型を観察し、奇形があるすべての異常ゼブラフィッシュの数を記録し、各群の奇形率とレスキュー率を計算した。形態学的欠陥、心拍数、心臓形態などの指標をＳＭＺ７４５Ｔ倒立実体顕微鏡で観察して評価した。

結果は以下のとおりであった。３０ｍＭのＨＣＨＯを選択してモデルを作り、同時に１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａでレスキューしたところ、３０ｍＭのＨＣＨＯにより胚生存率が大幅に低下したが、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを加えた群では、３０ｍＭのＨＣＨＯが胚生存率に及ぼす影響をレスキューできた。コントロールと比較して異なる時点におけるゼブラフィッシュ胚の表現型を評価した（図１３を参照）。８ｈｐｆで正常胚はほぼ被覆が完了したが、３０ｍＭのＨＣＨＯ及び３０ｍＭのＨＣＨＯ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ群では、いずれもゼブラフィッシュ胚の発育が遅延した。２４ｈｐｆで、正常ゼブラフィッシュ胚は頭部と尾部が発育し、尾部に揺動現象があり、３０ｍＭのＨＣＨＯと３０ｍＭのＨＣＨＯ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａはコントロールのゼブラフィッシュの表現型と類似した。４８ｈｐｆで、ゼブラフィッシュ胚を明視野と蛍光顕微鏡で観察して撮影し、正常胚と３０ｍＭのＨＣＨＯ及び３０ｍＭのＨＣＨＯ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ作用群とは類似し、頭部尾部が完全に発育し、全身色素が形成され、心臓拍動が明らかで、体節間血管の発育が正常で、血液が全身を流れたことが見られた。７２ｈｐｆで、正常胚と３０ｍＭのＨＣＨＯ及び３０ｍＭのＨＣＨＯ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ作用群とは、心臓の外形が正常であり、腸下網状血管の発育が正常であった。

３０ｍＭのＨＣＨＯに対する１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａのレスキュー効果をさらに定量的に評価するために、４８ｈｐｆでのゼブラフィッシュ胚の心膜水腫、１０ｓ心拍数及び７２ｈｐｆでの各群間のゼブラフィッシュの体長を評価した。図１４から、３０ｍＭのＨＣＨＯ及び３０ｍＭのＨＣＨＯ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａでは、ゼブラフィッシュの心膜、心拍数、体長がいずれも影響を受けなかったことが分かった。

以上より、３０ｍＭのＨＣＨＯによりゼブラフィッシュは死亡したが奇形がなく、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａにより３０ｍＭのＨＣＨＯによるゼブラフィッシュ胚の生存率低下を救うことができる。この発見によると、Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａにより長期にわたってホルムアルデヒド環境に暴露した妊婦の胚の高死亡率を救うことができることを示している。

実験例７
ホモシステインが胎児マウスの発育に及ぼす影響
ホモシステインが胎児の心臓に及ぼす影響を考察するため、ＳＤラットを選択し、雌雄ラットを１：１の割合で同じケージに入れて一晩交配させ、翌朝に膣栓を検査し、膣栓が見られた日を妊娠０日目とし、妊娠マウスを単独で飼育した。１％ホモシステイン溶液（ＨＣＹ）を用い、１ｍｌ／１００ｇの注射体積で注射量を計算し、用量は（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ）であり、妊娠マウスの妊娠７日目から妊娠１７日目まで１日１回腹腔内注射し、妊娠１９日目に１回注射し、注射ごとに液体が回流しないようにし、妊娠２０日目に抱水クロラールで麻酔させ、帝王切開で胎児を採取した。上記と同様の方法で高ＨＣＹモデル妊娠マウスを考察し、用量は（２００ｍｇ／ｋｇ／ｄ）であり、残りの条件は同じであった。胎児マウスを解剖して心臓を採取し、スライスして観察した。その結果は以下のとおりであった。
低ＨＣＹにより胎児マウスの心筋小柱が拡大し、心房内に赤血球が充満した（図１５ａを参照）。心筋ギャップに少量のリンパ球が浸潤した（図１５ｂを参照）。右心筋ギャップに少量のリンパ球が浸潤した（図１５ｃを参照）。黒い矢印に示すように、高ＨＣＹにより胎児マウスの筋細胞質が赤くなった（図１５ｄ参照）。心室、心房に赤血球が充満し、心筋小柱が拡大した（図１６を参照）。上記の実験により、ＨＣＹがマウスの心臓に影響を及ぼすことが示されており、ヒトホモシステインの高レベルによりも同様に先心病が発生する可能性があると推測されている。

実験例８
高用量葉酸がマウスの心臓に及ぼす影響（予備実験）
重量が約２００～２５０ｇであり、ＳＰＦ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ有限公司から購入された、健全な成体雌雄ＳＤラットをそれぞれ２８匹選択した。すべての動物を購入した後、動物の一般的な生理学的指標、体重、摂食状況を観察した。１週間適応させて飼育した。標準ペレット飼料を与え、水を自由に摂取させた。自然昼夜光線で照明し、室温１８～２６℃、相対湿度４０％～７０％であった。

得られた１６匹の妊娠マウスを体重別１群４匹で、正常群、高用量葉酸群、中用量葉酸群、低用量葉酸群の４群にランダムに分けた。それぞれ３６．４４ｍｇ／ｋｇの高用量葉酸群、１８．２２ｍｇ／ｋｇの中用量葉酸群、９．１１ｍｇ／ｋｇの低用量葉酸群及びブランクコントロールであり、投与方式は胃内投与であり、投与経路は１ｍｌ／１００ｇ溶液であった。正常群に純水を与えた以外、他の各群に、群を分けた後２日目から投与し、１日１回、２１日間連続投与し、各群の妊娠マウスをすべて自由に水を摂取させた。雌マウスに投与した７日後、雌雄ラットを１：１の割合で同じケージに入れて交配させ、翌朝に膣栓を検査し、膣栓が見られた日を妊娠０日目とし、妊娠マウスを単独で飼育し、さらに２１日間投与し続け、帝王切開で胎児を採取した。

通常の組織病理学的パラフィンサンプルを調製し、連続してスライスし（厚さ５ｕｍ）、ＨＥ染色を行った。サンプルの調製：通常の組織学的サンプルであるパラフィンをスライスして調製し、１サンプルあたり１個のパラフィンブロックであった。スライス：各番号のサンプルずつ２０枚にスライスした。表装がスライスを起点とした場合、パラフィンブロックには心室表装切片が見られ、スライドガラス１枚あたり平均４つの連続組織点が表装された。ＨＥ染色：各サンプルずつ２０枚のスライドガラスに置き、１枚おきに１枚を取り、計１０枚ＨＥ染色を行った。観察分析：Ｌｅｉｃａパノラマ画像を撮影し、比較分析を行った。胎児マウスの心臓を解剖し、スライスして観察を行った。その結果は以下のとおりであった。

正常群では、心房と心室の分化は良好で、心膜、心内膜と心外膜は完全であった。心筋繊維の縦断、斜め切断又は横断面が同時に観察された。心筋繊維は配列がきとんと規則的で、テクスチャがはっきりし、筋繊維が分岐してネットワークに吻合した。心筋繊維は疎性結合組織によって大小の異なる繊維束に分けられ、束内に豊富な血管が見られた。心房と心室内に心筋小柱が密集して発達した。心筋細胞は正常で、細胞核は整然と配列し、卵円形あるいは円球形を呈し、淡青色に染色された。心筋繊維間には赤色に染色された円形又は楕円形の血球が少量存在した。明らかな病理学的変化はなかった。発育又は切断角度によっては、一部の動物には心室につながった大動脈構造が見られなかった（図１７を参照）。

高用量葉酸群では、多数の動物は、心臓発育が遅延し（ｎ＝３）、心臓体積が小さく、心壁が薄い（Ｃ９－１、Ｃ９－４、Ｃ９－５）ことが共通の特徴であった。一部の動物は、心室中隔が消失し（ｎ＝１）、右心室が欠損し（ｎ＝４）、固形筋組織であり、又は小さな空洞のみがあり、心筋小柱はほとんど見られなかった。左心室の空洞内壁の心筋小柱が欠損したり、短くて太い少量の心筋小柱しかなかった。左右心房はほぼ正常であった（Ｃ９－２、Ｃ９－３、Ｃ９－４、Ｃ９－５）。個別の動物の心臓に異なる顕微鏡的特徴があり、左右心房の空洞が明らかに拡張し、左右心室の空洞の大きさが類似し、左心室にはまばらな心筋小柱があり、右心室の内壁は滑らかで、心筋小柱はほとんど見られなかった（Ｃ９－１）。発育又は切断角度によっては、一部の動物には心室につながった大動脈構造（Ｃ９－３、Ｃ９－４）が見られなかった（図１８を参照）。

中用量葉酸群では、心室と心房を分化形成し、完全な心膜と心内膜、心外膜が認められた。心筋繊維の縦断、斜め切断又は横断面が認められた。心筋繊維は、発育が発達し、配列が規則的で、テクスチャがはっきりした。組織球の変性・壊死又は炎症性細胞の浸潤は認められなかった。しかし、個別の動物の心室と心房はある程度発育が遅延し（ｎ＝１）、心室と心室の体積は小さかった（Ｄ１－３）。一部の動物には心室腔狭窄、分化遅延、心室内壁平滑、さらに心室欠損（ｎ＝２）が認められ、心室腔はほとんど認められず、固形筋組織であり、心筋小柱は短くてまばらであり（Ｄ１－３、Ｄ１－５）、心房に心筋小柱が希少であった（Ｄ１－３）（図１９を参照）。

低用量葉酸群では、心房と心室の分化が完了し、心筋繊維が束状に整然と配列しており、心筋繊維の異なる断面が見られ、テクスチャがはっきりしており、心筋繊維の間には毛細血管が豊富であった。しかし、一部の動物は、心室の分化が遅延し、右心室が欠損し（ｎ＝３）、小さな空洞しかなかったことが共通の特徴であった。左右心房の空洞はやや拡張し、ほぼ正常であった（Ｅ３－３、Ｅ３－４）。個別の動物は、心臓の発育が明らかに遅延し（ｎ＝１）、心臓の体積が小さく、心室中隔が消失し、右心室が欠損し、固形筋組織であり、心筋小柱が見られなかった。左心室は、空洞が小さくなり、内壁に少量の心筋小柱しかなかった。左右心房が萎縮して小さくなった（Ｅ３－５）（図２０を参照）。

統計データは以下の表２に示される。図から分かるように、葉酸はラットの出産率にも影響し、高用量では出産率が低下することがある。

実験例９薬理学的用量の葉酸が胎児マウスの心臓に及ぼす影響
薬理学的用量の葉酸が胎児ラットの心臓に及ぼす影響を考察するため、試験では葉酸群（６群）及びブランクコントロールに分けられた。葉酸コントロールはそれぞれ４．５５５ｍｇ／ｋｇ／ｄの葉酸（１群）、２．２７７５ｍｇ／ｋｇ／ｄの葉酸（２群）、０．９１１ｍｇ／ｋｇ／ｄの葉酸（３群）、０．４５５５ｍｇ／ｋｇ／ｄの葉酸（４群）、０．２２７７５ｍｇ／ｋｇ／ｄの葉酸（５群）、０．１１３８７５ｍｇ／ｋｇの葉酸（６群）であった。葉酸群及びブランクコントロールは１群あたり４匹の妊娠マウスであり、４．５５５ｍｇ／ｋｇ／ｄ（１群）、２．２７７５ｍｇ／ｋｇ／ｄの葉酸（２群）、０．９１１ｍｇ／ｋｇ／ｄの葉酸（３群）を腹腔内投与し、０．４５５５ｍｇ／ｋｇ／ｄの葉酸（４群）、０．２２７７５ｍｇ／ｋｇ／ｄの葉酸（５群）、０．１１３８７５ｍｇ／ｋｇの葉酸（６群）を胃内投与し、ブランクコントロールでは自然飼育した。雌ラットに投与した７日後、雌雄ラットを１：１の割合で同じケージに入れて交配させ、翌朝に膣栓を検査し、膣栓が見られた日を妊娠０日目とし、妊娠ラットを単独で飼育し、２１日間投与し続け、帝王切開で胎児を採取し、各群の胎児ラットの数は図３０に示される。マウスの心臓を採取して病理学的検査を行った。その結果は以下のとおりであった。

図に示されるように、４．５５５ｍｇ／ｋｇ（１群）では、基本的に心房と心室を分化形成し、心膜及び心内膜、心外膜、心筋層に明らかな病理学的変化は見られなかった。左右心房の発育は基本的に正常で、右心房の断面は一般的に左心房よりやや大きく、空洞の内壁には豊富な心筋小柱が見られた。個別の個体は心房の空洞が小さかった。左右心室は基本的に形成され、心室壁に血管が豊富で、左心壁が厚く、空洞が狭く、さらに明らかな左心室の空洞が見られず（ｎ＝３）、あるいは緊密に配列した心筋小柱しか見られなかった。個別の個体の右心室も空洞狭窄を示した。個別の個体では右心室壁が薄すぎることも認められた。切片にはいずれも心室につながった大血管腔が認められ、一部の断面には管腔内の弁膜が認められた。

２．２７７５ｍｇ／ｋｇ（２群）では、基本的に心室と心房を分化形成し、心膜が完全で、心筋層、心外膜と心内膜が完全で、壊死と炎症性細胞の浸潤は見られなかった。左右心房に豊富な心筋小柱が認められ、個別の個体の左心房に小部分の断面のみが認められた（図２１ｄ）。個別の個体に心房中隔欠損が認められた（図２１ｄ）。左右心室は基本的に発育し、心室に心筋小柱が豊富で、つながった血管腔が見られ、個別に血管内の弁膜が見られた（図２１ｂ、ｅ）。個別の断面には心房心室開口及び僧帽弁が認められた（図２１ｄ）。一部の個体は左心室が欠損し（ｎ＝２）、又は明らかな空洞が見られず、まばらな心筋小柱しか見られなかった（図２１ｂ、ｃ）。一部の個体には右心室壁が薄すぎることも認められた（図２１ｂ、ｄ）。

０．９１１ｍｇ／ｋｇ（３群）では、基本的に心室と心房を分化形成し、心膜が完全であり、心筋層、心外膜と心内膜が完全であり、壊死と炎症性細胞の浸潤は認められなかった。左右心房はいずれも充満しており、心房に心筋小柱は豊富であった。一部の個体の切片には小部分の左心房しか認められなかった（図２２ｃ、ｅ）。左右心室はほぼ発育し、個別の個体は左心室の心壁が厚く、空洞が狭かった（図２２ｄ）。心室壁に血管が豊富で、心室内には豊富な心筋小柱が見られた。大部分の切片には心室につながった大血管及び管腔内の弁膜構造が認められた（図２２ａ、ｂ、ｄ、ｅ）。個別の切片には僧帽弁及び右心房室開口が認められた（図２２ｃ）。個別の個体では右心室壁が薄すぎることも認められた（図２２ｃ、ｅ）。個別の心房又は心室壁に欠損があった（ｎ＝１）。

０．４５５５ｍｇ／ｋｇ（４群）では、左右心房に心筋小柱が豊富で、心房断面が小さかった。左右心室壁は厚く、空洞は狭く、心筋小柱は緊密に配列し、心室壁に血管は豊富であった。個別の個体は心室断面が小さく、染色が深かった。

０．２２７７５ｍｇ／ｋｇ（５群）では、左右心房に心筋小柱が豊富であり、左右心室壁が厚く、空洞が狭く、心筋小柱が緊密に配列し、心室壁に血管が豊富であり、一部の個体では左心室空洞は認められなかった（ｎ＝５）。心室につながった大血管及び管腔内の弁膜は、大部分の断面に認められ、個別に認められなかった。

０．１１３８７５ｍｇ／ｋｇ（６群）では、基本的に心室と心房を分化形成し、心膜は完全であり、個別の切片のみに完全な心膜、心筋層、心外膜と心内膜が認められず、壊死と炎症性細胞の浸潤は認められなかった。左右心房はいずれも充満しており、心房に心筋小柱は豊富であった。一部の個体では心房壁が破損し（ｎ＝１）、心包腔内に血が溜まり、対応する病理学的変化がなかったため、サンプリングと関係がある可能性がある。個別の個体は、心臓が小さかった。左右心室に心筋小柱は豊富で、一部の個体は左心室壁が厚く、左心室の空洞が狭かった。個別の個体では心室中隔欠損（ｎ＝３）、右心室狭窄が認められ、あるいは右心室壁が薄すぎることが認められた。
すべての葉酸群を以下のように統計した。

サンプル量は少なかったため、統計学的にまとめられなかった。しかし、病理学的結果から分かるように、葉酸により心室欠陥や中隔欠損が発生しやすかった。

実験例１０
葉酸と５－メチルテトラヒドロ葉酸が胎児マウスの発育に及ぼす影響
上海霊暢生物科学技術有限公司により提供され、合格証番号：ＳＣＸＫ（上海）２０１８－０００３であった、７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスを７５匹、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスを２５匹使用した。動物購入後、雌マウスの体重が約２０ｇになり、雄マウスの体重が約２５ｇになるまで１０日間適応させて飼育し、成体になった後に実験を開始した。雌マウスを体重別、溶媒コントロール、１５１．６６μｇ／ｋｇの葉酸、３０３．３２μｇ／ｋｇの葉酸、１５１．６６μｇ／ｋｇの５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム（葉酸換算）、３０３．３２μｇ／ｋｇの５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム（葉酸換算）の５群にランダムに分けた。単位質量１．１２７５の５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムは、単位質量１の葉酸に相当する。

１群あたり１５匹で、指切り法で番号を付けた。群を分けた翌日から１日１回胃内投与した。１週間予備投与した後、雌雄マウスを３：１の割合で同じケージに入れ、翌日から毎日膣栓を観察し、膣栓が見られた日を妊娠０．５日とした。同じケージに入れた１４日後、雌マウスへの投与を停止し、雄マウスを取り出し、妊娠雌マウスを出産まで単独で飼育した。

当日の新生マウスを取り出し、体重を測った。各群から新生マウスの一部をランダムに選択し、出生当日に心電図検出を行った（ＮｅｏＮａｔａｌＭｏｕｓｅ，ｉＷｏｒｘ，Ｄｏｖｅｒ，ＮＨ，ＵＳＡ）。
また、各群から４～５匹のマウスをランダムに選択し、６日齢まで成長させて小動物心臓超音波検査を行った（Ｖｅｖｏ２１００ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ，ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）。

検出終了後にマウスの胸腔及び腹腔を切開し、実体顕微鏡（ＳＭＺ１６８，Ｍｏｔｉｃ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ）で心臓形態及び心拍数を観察し、写真を撮りビデオを撮影して記録した（ＭｏｔｉｃＩｍａｇｅＰｌｕｓ３．０，Ｍｏｔｉｃ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ）。その後死亡させ、心臓、肝臓、腎臓、肺を採取した。各群から新生マウスの心臓及び肝臓を採取し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋切片を行い、Ｈ＆Ｅ染色を行った。他の組織の半分をＲＮＡｌａｔｅｒに浸漬して固定し、残りの半分を直接液体窒素に浸漬して凍結し、後続の実験に用いた。

結果は次のとおりである。

新生マウスの心臓超音波に対する葉酸の影響については、コントロール（Ａ）、低用量葉酸群（Ｂ）、高用量葉酸群（Ｃ）、低用量メチルテトラヒドロ葉酸群（Ｄ）及び高用量メチルテトラヒドロ葉酸群（Ｅ）では、動力学の基礎知識から、Ｂ及びＣは、動的流相がコントロールに比べて有意差があり、Ｄ及びＥ群はコントロールと比較的類似した。６日齢の新生マウスの超音波心動図を図２３に示した。

心室中隔拡張末期厚及び収縮末期厚（ミリメートル）は有意差がなかった（Ａ～Ｂ）。高用量葉酸群は、左室拡張末期及び収縮末期内径（ミリメートル）が他群より有意に低く、左室拡張末期内径と他群との差が統計学的に有意であった（Ｃ、Ｄ）。各群間には、駆出率と短軸短縮率（％）に有意な統計学的差異（Ｅ、Ｆ）は認められなかった。６日齢の新生マウスの超音波心動図データを図２４に示した。
１日齢の新生マウスを撲滅した後心臓を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包埋した後スライスし、Ｈ＆Ｅ染色を行い、一般顕微鏡で写真を撮った。コントロール、低用量メチルテトラヒドロ葉酸群、高用量メチルテトラヒドロ葉酸群では、新生マウスの心筋が完全であった。高低用量葉酸群では、新生マウスの左心房及び心室間の部分に小さな心壁欠陥が認められた（Ｂ、Ｃ）。図２５に示される。

新生マウスには、成体マウスのように皮下に電極を挿入することなく、皮膚と接触させるのみであったため、測定された信号は安定ではなく、統計的にまとめられなかった。

以上の結果から、５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムは心臓発育奇形を直接引き起こす能力がなく、葉酸は先天性心疾患を引き起こす可能性があることが明らかになった。

実験例１１
５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムによる心臓奇形予防の研究
トランスジェニックゼブラフィッシュ（ｆｌｉ－１：ＥＦＰ）は南京大学モデル動物研究所から購入された。実験に用いた魚は１年未満の成体ゼブラフィッシュで、飼育水体のｐＨ値は７±０．２で、温度は２８℃程度で、光照射と遮光の時間比は１４ｈ：１０ｈであり、豊年虫卵を１日２回与えた。前日の夜、１雌２雄計３匹のゼブラフィッシュを産卵箱に入れ、翌朝に卵を集めた。卵は胚培養液（０．２ｇ／Ｌの海塩を調製したもの）に入れ、２８℃で培養した。

文献調査によると、３つの異なるタイプを選択し、文献によると、先心病を引き起こす物質が報告されており、それぞれエタノール、硝酸鉛、アリストロキア酸であった。次の表に示される。

ゼブラフィッシュ胚を２ｈｐｆから２４ウェルプレートに入れ、薬を投与して培養し、８ｈｐｆまで、１ウェルあたり１０匹で上記の表に記載の濃度の薬物溶液をそれぞれ添加し、胚を洗浄した後、卵液に移して７２ｈｐｆまで培養した。胚が死亡すると直ちに整理した。各群の試験を３回繰り返した。

５－メチルテトラヒドロ葉酸による奇形の予防実験で選択した濃度を表に記録した。奇形の表現型を観察し、奇形があるすべての異常ゼブラフィッシュの数を記録し、各群の奇形率とレスキュー率を計算した。形態学的欠陥、心拍数、心臓形態などの指標をＳＭＺ７４５Ｔ倒立実体顕微鏡で観察して評価した。

１）５－メチルテトラヒドロ葉酸による硝酸鉛による心臓奇形の予防の結果
２．４ｍＭのＰｂ（ＮＯ_３）_２により胚の生存率を低下させることができたが、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを加えた群では、２．４ｍＭのＰｂ（ＮＯ_３）_２が胚の生存率に及ぼす影響をレスキューできず、コントロールと比較して、異なる時点におけるゼブラフィッシュ胚の表現型を評価し、８ｈｐｆでは、２．４ｍＭのＰｂ（ＮＯ_３）_２と２．４ｍＭのＰｂ（ＮＯ_３）_２＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａにはいずれも明らかな胚発育遅延は認められなかった。２４ｈｐｆでは、２．４ｍＭのＰｂ（ＮＯ_３）_２はゼブラフィッシュの発育成長に明らかな影響を与えておらず、ゼブラフィッシュ胚は頭部と尾部が発育し、尾部に揺動現象があった。４８ｈｐｆでは、２．４ｍＭのＰｂ（ＮＯ_３）_２はゼブラフィッシュの体節間血管の発育に影響を与えておらず、心膜水腫の現象もなかった。７２ｈｐｆでは、２．４ｍＭのＰｂ（ＮＯ_３）_２でゼブラフィッシュの体長が短くなり、大量の胚に奇形が出現し、主に体幹が曲がり、尾が短くなったが、腸下網状血管の発育に有意差は認められなかった。一方、１０ｍＭのＬ－５－ＬＭＴＨＦ－Ｃａにより２．４ｍＭのＰｂ（ＮＯ_３）_２による胚発育奇形を救うことができる（図２６を参照）。

Ｐｂ（ＮＯ_３）_２に対する１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａのレスキュー効果をさらに定量的に評価するために、胚心膜水腫は認められなかったため、４８ｈｐｆでのゼブラフィッシュ胚の１０ｓ心拍数と７２ｈｐｆでの各群間のゼブラフィッシュの体長のみを評価した。図２７に示すように、Ｐｂ（ＮＯ_３）_２によりゼブラフィッシュの心拍数が緩慢で体長が短くなり、胚奇形率が高くなり、顕著な濃度依存性を示したが、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを加えた群では、ゼブラフィッシュの心拍数が緩慢で、体長が短くなり、体幹が異常に曲がったという奇形表現型を救うことができる。

以上のように、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａにより２．４ｍＭのＰｂ（ＮＯ_３）_２によるゼブラフィッシュ胚の発育奇形をすべて救うことができる。

２）５－メチルテトラヒドロ葉酸によるアルコールによる心臓奇形の予防の結果
１．２％ＥｔＯＨ群はコントロールに比べて、生存率に有意差があったが、１．２％ＥｔＯＨ＋１０ｍＭＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ群では生存率を救うことができ、その生存率とコントロールとの間に差はなかった（図２８Ａ）。７２ｈｐｆでは、０．６％及び０．９％ＥｔＯＨ群はゼブラフィッシュの形態がコントロールと類似しており、１．２％ＥｔＯＨによりゼブラフィッシュの腸下網状血管発育障害が発生し、１．２％ＥｔＯＨ＋１０ｍＭＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ群ではこの欠陥が改善されなかった（図２８Ｂ）。

４８ｈｐｆでは、０．９％ＥｔＯＨ群と１．２％ＥｔＯＨ群では、ゼブラフィッシュ胚の心拍数が緩慢な奇形表現型があり、色素成長と体節間血管発育に影響を及ぼさなかった。０．９％と１．２％ＥｔＯＨ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａでは、心拍数緩慢が緩和された。４８ｈｐｆでは、各濃度のＥｔＯＨによりゼブラフィッシュ胚に心膜水腫の奇形表現型があり、０．６％の濃度で１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを加えると心膜水腫率を低下させることができる。１．２％ＥｔＯＨ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａ群では、心膜水腫の緩和に役割を果たしなかった（図２９を参照）。

以上より、エタノールにより、ゼブラフィッシュ胚は、早期胚胎発育遅延、心膜水腫、心拍数緩慢、体長短縮、腸下網状血管発育障害という奇形表現型を示し、色素成長、体節間血管の発育に影響を与えておらず。１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを添加すると、低濃度（０．６％）のＥｔＯＨの条件下で心膜水腫を緩和し、高濃度（１．２％）のＥｔＯＨの条件下で体長が短くなることを緩和し、胚の生存率を高めることができ、中高濃度（０．９％、１．２％）のＥｔＯＨの条件下で、Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａは心拍数緩慢を緩和することが顕著であり、奇形予防作用がある。

３）５－メチルテトラヒドロ葉酸による、アリストロキア酸Ａによる奇形の予防作用
１～５μＭのアリストロキア酸Ａをを選択してモデルを作り、同時に１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａでレスキュー試験を行い、２～５μＭのアリストロキア酸Ａにより胚生存率が大幅に低下し、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを加えるとアリストロキア酸Ａの胚生存率への影響を救うことができる（図３０）が、高濃度のアリストロキア酸Ａ群（５μＭ）については、Ｌ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａによるレスキュー効果は顕著ではなかった。

コントロール群と比較して、異なる時点におけるゼブラフィッシュ胚の表現型を評価した場合（図３１を参照）、８ｈｐｆ及び２４ｈｐｆでは、１～５μＭのアリストロキア酸Ａと１～５μＭのアリストロキア酸Ａ＋１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａはいずれも明らかな胚発育遅延、奇形及び死亡現象を示さなかった。４８ｈｐｆでは、アリストロキア酸Ａ処理群で胚はアリストロキア酸Ａの濃度が上昇するにつれて、次第に心膜水腫、心拍数緩慢、体幹曲がり、全身血流消失、血溜まり、卵黄嚢の不透明化などの現象を示し、アリストロキア酸Ａの濃度が上昇するにつれて深刻になった。同時に、高濃度群では体節間血管の発育不良現象が現れた。１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａはアリストロキア酸Ａによる心膜水腫、心拍数緩慢、体節間血管発育不良などの奇形を救うことができる。７２ｈｐｆでは、アリストロキア酸Ａ処理群でゼブラフィッシュの腸下網状血管の発育に完全に欠損した現象が現れ、体長も短くなるが、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａはある程度アリストロキア酸Ａによるゼブラフィッシュの体長が短くなり、腸下網状血管の発育が欠損する現象を救うことができる。

１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａのアリストロキア酸Ａに対するレスキュー効果をさらに定量的に評価するために、４８ｈｐｆでのゼブラフィッシュ胚の心膜水腫率、１０ｓ心拍数及び７２ｈｐｆでの各群間のゼブラフィッシュの体長を評価した。図３２から分かるように、１～５μＭのアリストロキア酸Ａによりゼブラフィッシュの心膜水腫、心拍数緩慢、体長短縮が起こり、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａを加えるとゼブラフィッシュの心膜水腫、心拍数緩慢、体長短縮という奇形表現型をある程度救うことができる。

以上より、１０ｍＭのＬ－５－ＭＴＨＦ－Ｃａｎにより、１～５μＭのアリストロキア酸Ａによるゼブラフィッシュ胚の発育奇形及び死亡をある程度救うことができる。

Claims

妊娠準備期及び／又は妊娠期の女性において新生児の先天性心疾患を予防するための薬物又は保健機能食品の調製における、５－メチルテトラヒドロ葉酸の使用。
前記先天性心疾患は以下のいずれかのサブグループの疾患から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
１）動脈管開存症、大動脈狭窄症、肺動脈狭窄症、肺動脈閉鎖症又は他の先天性大動脈奇形のうちのいずれか一つを含む先天性大動脈奇形、２）房室中隔欠損症（ＡＶＳＤｓ）、心室中隔欠損症（ＶＳＤｓ）、心房中隔欠損症（ＡＳＤｓ）、ファロー四徴症、大動脈肺動脈中隔欠損症又は他の先天性中隔奇形のうちのいずれか一つを含む先天性心臓中隔奇形、３）心腔の先天性接合奇形、先天性大動脈又は僧帽弁奇形のうちのいずれか一つを含む他の先天性心疾患。
前記先天性心疾患は、重金属、アルコール又は薬物による先天性心疾患である、請求項１に記載の使用。
前記５－メチルテトラヒドロ葉酸は、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその薬学的に許容される塩を含む、請求項１に記載の使用。
前記５－メチルテトラヒドロ葉酸は、５－メチル－（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸、５－メチル－（６Ｒ）テトラヒドロ葉酸、又は５－メチル（６Ｒ，Ｓ）テトラヒドロ葉酸から選択され、即ち５－メチルテトラヒドロ葉酸の光学異性体、光学異性体の混合物、特に純粋な天然光学異性体を含む、請求項４に記載の使用。
前記薬学的に許容される塩は、５－メチルテトラヒドロ葉酸中の塩基性基から変換された対応する酸付加塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸中の酸性基から変換された対応する塩基付加塩を含み、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムとアンモニウム塩、置換アンモニウム塩、又はアルギニンやリジンとともに形成した塩であることが好ましいことを特徴とする、請求項４に記載の使用。
前記薬物又は保健機能食品の剤形は、注射剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、経口液剤、顆粒剤又は散剤を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用。
妊娠準備期及び／又は妊娠期の女性において流産又は死胎を予防するための薬物又は保健機能食品の調製における、５－メチルテトラヒドロ葉酸の使用。
前記流産又は死胎は、胎児の心臓発育奇形によって引き起こされることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
前記流産又は死胎は、妊娠準備期及び／又は妊娠期の女性がホルムアルデヒドを含む環境に曝露されたことで発生したものであることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
前記５－メチルテトラヒドロ葉酸は、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその薬学的に許容される塩を含む、請求項８に記載の使用。
前記５－メチルテトラヒドロ葉酸は、５－メチル－（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸、５－メチル－（６Ｒ）テトラヒドロ葉酸、５－メチル（６Ｒ，Ｓ）テトラヒドロ葉酸を含み、即ち５－メチルテトラヒドロ葉酸の光学異性体、光学異性体の混合物、特に純粋な天然光学異性体を含む、請求項１１に記載の使用。
前記薬学的に許容される塩は、５－メチルテトラヒドロ葉酸中の塩基性基から変換された対応する酸付加塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸中の酸性基から変換された対応する塩基付加塩を含み、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムとアンモニウム塩、置換アンモニウム塩、又はアルギニンやリジンとともに形成した塩であることが好ましいことを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
前記薬物又は保健機能食品の剤形は、注射剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、経口液剤、顆粒剤又は散剤を含むことを特徴とする、請求項８～１３のいずれか一項に記載の使用。
胎児の心臓奇形を予防するための薬物又は保健機能食品の調製における、５－メチルテトラヒドロ葉酸の使用。
前記心疾患は、重金属、アルコール又は薬物による先天性心疾患であることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
前記心臓奇形は、エタノール、硝酸鉛、アリストロキア酸による心臓奇形であることを特徴とする、請求項１６に記載の使用。
前記５－メチルテトラヒドロ葉酸は、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその薬学的に許容される塩を含む、請求項１５に記載の使用。
前記５－メチルテトラヒドロ葉酸は、５－メチル－（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸、５－メチル－（６Ｒ）テトラヒドロ葉酸、又は５－メチル（６Ｒ，Ｓ）テトラヒドロ葉酸から選択され、即ち５－メチルテトラヒドロ葉酸の光学異性体、光学異性体の混合物、特に純粋な天然光学異性体を含む、請求項１８に記載の使用。
前記薬学的に許容される塩は、５－メチルテトラヒドロ葉酸中の塩基性基から変換された対応する酸付加塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸中の酸性基から変換された対応する塩基付加塩を含み、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムとアンモニウム塩、置換アンモニウム塩、又はアルギニンやリジンとともに形成した塩であることが好ましいことを特徴とする、請求項１５に記載の使用。