JP2022546430A - 振動分光法によるバイオマーカー発現の無標識評価 - Google Patents

振動分光法によるバイオマーカー発現の無標識評価 Download PDF

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Abstract

本開示は、生物学的検体の試料中の１つ以上のバイオマーカーの発現を予測するための自動化されたシステムおよび方法に関する。いくつかの実施形態では、試料は、未知の固定状態を有する試料、または試料が対象とした固定期間が未知の試料である。いくつかの実施形態では、予測される発現は、１つ以上のバイオマーカーの陽性率の定量的推定である。他の実施形態では、予測される発現は、１つ以上のバイオマーカーの染色強度の定量的推定である。いくつかの実施形態では、システムおよび方法は、複数の訓練試料によって訓練された訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを利用し、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、試料からバイオマーカー発現特徴を導出するように適合される。いくつかの実施形態では、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、潜在構造回帰モデルへの投影に基づく機械学習アルゴリズムを備える。いくつかの実施形態では、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、ニューラルネットワークを含む。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月２８日に出願された米国特許出願第６２／８９２，６８０号の出願日の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
疾患生物から採取された組織または細胞試料の解釈に基づく疾患の診断は、過去数年にわたって劇的に拡大してきた。伝統的な組織学的染色技術および免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイに加えて、現在、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）およびインサイチュポリメラーゼ連鎖反応などのインサイチュ技術が、ヒトにおける疾患状態の診断を助け、組織切片における遺伝子発現部位を解明するために使用されている。したがって、細胞形態だけでなく、細胞および組織内の特定の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質）の存在も評価することができる様々な技術が存在する。これらの技術のそれぞれは、試料細胞または組織が、試料をアルデヒド（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）、ホルマリン置換物、アルコール（エタノール、メタノール、イソプロパノールなど）などの化学物質で固定すること、または試料をパラフィン、セロイジン、寒天、ポリマー、樹脂、極低温媒体もしくは様々なプラスチック埋め込み媒体（エポキシ樹脂およびアクリルなど）などの不活性材料に埋め込むことを含むことができる準備手順を経ることを必要とする。他の試料組織または細胞調製物は、凍結（凍結組織切片）または細針による吸引（細針吸引（ＦＮＡ））などの物理的操作を必要とする。
続いて、試料細胞または組織は、固体媒体、典型的にはパラフィンワックスに包埋されて、１つ以上の十分に保存された二次元切片が取得されることを可能にする。典型的には、これらの切片は、３～７μｍの厚さであり、ガラス顕微鏡スライド上に置かれる。次いで、スライドが洗浄され、特定のプロトコルで染色され、顕微鏡下で観察するために準備されるか、またはイメージングのためにプレシードする。次いで、訓練された病理学者は、染色された試料を分析して、例えば、疾患の結果としての組織形態およびそのような形態の変化、１つ以上のバイオマーカーの発現などを確認する。
病理学者は、組織の特徴付けおよび疾患の診断を助けるために分子技術をますます使用している。免疫組織化学的（ＩＨＣ）試料染色は、組織切片の細胞内のタンパク質を特定するために利用可能であるため、生体組織内の癌性細胞や免疫細胞など、異なる種類の細胞の研究に広く使用されている。したがって、ＩＨＣ染色は、免疫反応研究のために、癌性組織における免疫細胞（Ｔ細胞やＢ細胞など）の差次的に発現するバイオマーカーの分布と局在を理解するための研究に使用されることができる。例えば、腫瘍は、免疫細胞の浸潤物を含んでいることが多く、これは、腫瘍の発生を妨げたり、腫瘍の増殖を促進したりする場合がある。
インサイチュハイブリッド形成（ＩＳＨ）が使用されて、顕微鏡で見ると形態学的に悪性であるように見える細胞内に特異的に遺伝子を生じさせる癌の増幅などの遺伝的異常または状態の存在を探すことができる。インサイチュハイブリッド形成（ＩＳＨ）は、標的遺伝子配列または転写物に対してアンチセンスである標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ分子を使用して、細胞または組織試料内の標的核酸標的遺伝子を検出または局在化する。ＩＳＨは、スライドガラスに固定化された細胞または組織試料を、細胞または組織試料内の所与の標的遺伝子に特異的にハイブリッド形成することができる標識核酸プローブに曝露することによって実行される。複数の異なる核酸タグによって標識された複数の核酸プローブに細胞または組織試料を曝露することにより、いくつかの標的遺伝子を同時に分析することができる。異なる発光波長を有する標識を利用することにより、単一の標的細胞または組織試料に対して単一のステップで同時多色分析が実行されることができる。
組織学および細胞学試料の分析、したがって疾患の認識は、空間パターン認識を必要とする手動プロセスである。例えば、病理学者は、任意の組織病理学または細胞学試料におけるパターンを認識し、細胞の詳細を評価しなければならない。これらの視覚的合図によって、病理学者は、試料から診断情報を確認し、例えば、癌の証拠についての試料を評価し、および／またはその重症度を特徴付けることができる。病理学における様々な問題の原因は、染色検体の手動検査の性質に起因することができると考えられる。さらに、試料の質および試料の調製は、病理学者が試料を正確に評価する能力に影響を及ぼすことができると考えられる。同様に、ＩＨＣおよびＩＳＨ染色は、正確な診断を行うためにオペレータの技能ならびに実験条件および方法に依存する。さらに悪いことに、境界的な症例および疾患の模倣薬は問題であり、したがって試料を評価する際の潜在的な問題にさらに寄与する。組織または細胞試料またはその調製方法または保存方法にかかわらず、技術者および病理学者の目標は、データの正確な解釈を可能にする正確で読み取り可能で再現可能な結果を得ることである。
疾患およびその空間パターンを自動的に検出する堅牢な手段が非常に望ましい。上記のように、臨床病理技術は、生物医学試料における形態学的パターンを明らかにするために組織学的または細胞学的染色を使用する。多くの場合、目的のバイオマーカーごとに別々の組織切片が得られ、これは費用と時間がかかる。一方、振動分光イメージングは、単一の組織切片から複数のバイオマーカーに関する情報を提供することができると考えられる。
本開示は、生物学的検体に由来する試料中の１つ以上のバイオマーカー（例えば陽性率、染色強度）の発現を推定するためのシステムおよび方法を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、生物学的検体中のバイオマーカーの完全に無標識の分子分析を可能にするシステムおよび方法を提供する。いくつかの実施形態では、試料中の１つ以上のバイオマーカーの発現の推定は、生物学的検体から取得された振動スペクトルデータに存在するバイオマーカー発現特徴の同定に基づく。いくつかの実施形態では、生物学的検体から取得された振動スペクトルデータ内に存在するバイオマーカー発現特徴は、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用して識別される。１つ以上のバイオマーカー（陽性率など；染色強度）の推定発現は、それらの識別されたバイオマーカー発現特徴に基づいて計算されることができる。したがって、本開示のシステムおよび方法は、（例えば、ＩＨＣアッセイまたはＩＳＨアッセイにおける染色を必要とせずに、生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現の予測など）「標識なし」診断を可能にすることができる。現在開示されているシステムおよび方法は、「標識なし」診断を提供するために単独で使用されることができるが、試料のさらなる分析を提供するために、例えばホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）試料の同じまたは連続切片で、１つ以上のＩＨＣおよび／またはＩＳＨアッセイと組み合わせて、またはそれと併せて使用されることもできることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、生物学的検体は染色されていない。これらの実施形態では、本開示のシステムおよび方法は、固定期間が未知であるか、またはマスキング解除状態が未知である試料などの、染色されていない試料におけるバイオマーカー発現推定を可能にする。他の実施形態では、生物学的検体は、１つ以上のバイオマーカー、例えば、１つのバイオマーカー、２つのバイオマーカー、３つのバイオマーカー、または４つ以上のバイオマーカーの存在について染色される。
本開示はまた、グラウンドトゥルースデータ、例えば、１つ以上のクラス標識を含む訓練振動スペクトルデータに基づいて、生物学的検体中の１つ以上のバイオマーカーの発現の無標識定量的推定を可能にするためにバイオマーカー発現推定エンジンを訓練するためのシステムおよび方法を記載する。いくつかの実施形態では、訓練振動スペクトルデータは、差次的に調製された生物学的検体、例えば、差次的に固定および／または差次的にマスキングされていない生物学的検体を含む。このようにして、バイオマーカー発現推定エンジンは、異なる程度（例えば、可変的に固定された試料；可変的にマスクされていない試料）に調製された（例えば、固定および／またはマスクされていない）生物学的検体中の１つ以上のバイオマーカーの発現を推定するように訓練されることができる。本明細書に記載されるように、試料調製は、バイオマーカー発現に影響を及ぼすことができ、バイオマーカー発現を推定するための本明細書に記載されるシステムおよび方法は、この変動性を考慮に入れる。これらおよび他の実施形態は、本明細書でより詳細に説明される。
本開示の態様は、試験生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現を予測するためのシステムであって、（ｉ）１つ以上のプロセッサと、（ｉｉ）１つ以上のプロセッサに結合された１つ以上のメモリであって、１つ以上のメモリが、１つ以上のプロセッサによって実行されると、試験生物学的検体から試験スペクトルデータを取得することであって、取得された試験スペクトルデータが、生物学的検体の少なくとも一部に由来する振動スペクトルデータを含む、取得することと、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用して、取得された試験スペクトルデータからバイオマーカー発現特徴を導出することと、導出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて、試験生物学的検体の１つ以上のバイオマーカーの発現を予測することと、を含む動作をシステムに実行させるコンピュータ実行可能命令を記憶する、１つ以上のメモリと、を備える、システムである。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は染色されていない。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される。
いくつかの実施形態では、予測されるバイオマーカー発現は、予測される陽性率または予測される染色強度のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、予測されるバイオマーカー発現は、予測される陽性率および予測される染色強度の双方を含む。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体の固定状態（例えば、固定品質、固定期間）は未知である。いくつかの実施形態では、マスキング解除状態（例えば、マスキング解除品質）は未知である。
いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジンは、１つ以上の訓練スペクトルデータセットを使用して訓練され、各訓練スペクトルデータセットは、複数の訓練組織試料に由来する複数の訓練振動スペクトルを含み、各訓練組織試料は、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色され、各訓練振動スペクトルは、１つ以上のクラス標識を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のクラス標識は、１つ以上のバイオマーカーについての既知のバイオマーカー発現レベルを含む。いくつかの実施形態では、既知のバイオマーカー発現レベルは、１つ以上のバイオマーカーについての既知の陽性率および１つ以上のバイオマーカーについての既知の染色強度のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、システムは、既知のマスキング解除期間、既知のマスキング解除温度、マスキング解除状態の定性的評価、既知の固定期間、および固定状態の定性的評価からなる群から選択される１つ以上の追加のクラス標識をさらに含む。
いくつかの実施形態では、訓練スペクトルデータセットは、以下によって導出される：（ｉ）訓練生物学的検体を取得すること；（ｉｉ）取得された訓練生物学的検体を複数の訓練組織試料に分割すること；（ｉｉｉ）複数の訓練組織試料のそれぞれを、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色すること；および（ｉｖ）１つ以上のバイオマーカーの発現を定量的に評価すること。いくつかの実施形態では、各訓練組織試料は、染色の前に差次的に調製される。いくつかの実施形態では、複数の訓練組織試料の各訓練組織試料は、差次的にマスキング解除されるか、差次的に固定されるか、または差次的にマスキング解除されて差次的に固定される。いくつかの実施形態では、訓練組織試料中の１つ以上のバイオマーカーの定量的評価は、１つ以上のバイオマーカーの染色強度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、訓練組織試料中の１つ以上のバイオマーカーの定量的評価は、１つ以上のバイオマーカーの陽性率を決定することを含む。いくつかの実施形態では、定量的評価は、病理学者によって行われる。いくつかの実施形態では、定量的評価は、１つ以上の画像分析アルゴリズムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、複数の訓練組織試料は、免疫組織化学アッセイで染色される。いくつかの実施形態では、複数の訓練組織試料は、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイで染色される。いくつかの実施形態では、複数の訓練組織試料は、多重アッセイで染色される。
いくつかの実施形態では、試験スペクトルデータは、複数の正規化および補正振動スペクトルから導出された平均振動スペクトルを含む。いくつかの実施形態では、複数の正規化および補正された振動スペクトルは、以下によって取得される：（ｉ）試験生物学的検体内の複数の空間領域を特定すること、；（ｉｉ）複数の特定された領域の各個々の領域から振動スペクトルを取得すること；（ｉｉｉ）個々の領域ごとに補正された振動スペクトルを提供するために、個々の領域ごとに取得された振動スペクトルを補正すること；および（ｉｖ）各個々の領域からの補正された振動スペクトルを所定の大域最大値に振幅正規化して、各領域の振幅正規化振動スペクトルを提供すること。いくつかの実施形態では、各個々の領域から取得された振動スペクトルは、以下によって補正される：（ｉ）取得された各振動スペクトルを大気効果について補償して、大気補正振動スペクトルを提供すること；および（ｉｉ）散乱のために大気補正振動スペクトルを補償すること。
いくつかの実施形態では、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、次元縮小に基づく機械学習アルゴリズムを含む。いくつかの実施形態では、次元縮小は、潜在構造回帰モデルへの投影を含む。いくつかの実施形態では、次元縮小は、主成分分析および判別分析を含む。いくつかの実施形態では、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、ニューラルネットワークを含む。
いくつかの実施形態では、システムは、試験生物学的検体の不十分なマスキング解除および／または不十分な固定のために１つ以上のバイオマーカーの予測発現を補正するための動作をさらに含む。例えば、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンの使用によって取得された試験生物学的検体中の１つ以上のバイオマーカーの予測発現は、以下によって補正されることができる：（ｉ）バイオマーカー固定感度曲線を取得すること；（ｉｉ）試験生物学的試料の実際の固定時間を推定すること；および（ｉｉｉ）取得された固定感度曲線を用いて、試験生物学的検体について取得された予測バイオマーカー発現量を固定補償発現量に補正すること。
いくつかの実施形態では、システムは、試験生物学的検体の実際のバイオマーカー発現を試験生物学的検体の１つ以上のバイオマーカーの予測発現と比較するための動作をさらに含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、少なくともアミドＩバンドの振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約３２００から約３４００ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約２８００から約２９００ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約１０２０から約１１００ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約１５２０から約１５８０ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。
本開示の第２の態様は、処理された試験生物学的検体中の１つ以上のバイオマーカーの発現を予測するための命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体であって、命令が、試験生物学的検体から試験スペクトルデータを取得することであって、試験スペクトルデータが、生物学的検体の少なくとも一部に由来する振動スペクトルデータを含む、試験スペクトルデータを取得することと、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用して、取得された試験スペクトルデータからバイオマーカー発現特徴を導出することであって、バイオマーカー発現推定エンジンが、複数の差次的に調製された訓練生物学的検体から取得された訓練スペクトルデータセットを使用して訓練され、訓練スペクトルデータセットが、１つ以上のバイオマーカーについての既知のバイオマーカー発現のクラス標識を含む、導出することと、導出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて、試験生物学的検体の１つ以上のバイオマーカーの発現を予測することと、を含む、非一時的コンピュータ可読媒体である。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は、未知の固定状態および／または未知のマスキング解除状態を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカーの予測発現は、予測された陽性率または予測された染色強度のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカーの予測発現は、予測された陽性率および予測された染色強度の双方を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカーの予測発現は定量的である。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は染色されていない。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される。
いくつかの実施形態では、各訓練スペクトルデータセットは、以下によって導出される：（ｉ）訓練生物学的検体を取得すること；（ｉｉ）取得された訓練生物学的検体を複数の訓練組織試料に分割すること；（ｉｉｉ）複数の訓練組織試料の各訓練組織試料を、異なる調製条件のもとで調製すること；（ｉｖ）１つ以上のバイオマーカーの存在について複数の訓練組織試料のそれぞれを染色すること；および（ｖ）１つ以上のバイオマーカーの発現を定量的に評価すること。いくつかの実施形態では、異なる調製条件は、異なるマスキング解除条件を含む。いくつかの実施形態では、異なる調製条件は、異なる固定期間を含む。いくつかの実施形態では、訓練生物学的検体は、試験生物学的検体と同じ組織タイプを含む。いくつかの実施形態では、訓練生物学的検体は、試験生物学的検体とは異なる組織タイプを含む。
いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、少なくともアミドＩバンドの振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約３２００から約３４００ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約２８００から約２９００ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約１０２０から約１１００ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約１５２０から約１５８０ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。
本開示の第３の態様は、試験生物学的検体中の１つ以上のバイオマーカーの発現を予測する方法であって、試験生物学的検体から試験スペクトルデータを取得することであって、試験スペクトルデータが、生物学的検体の少なくとも一部に由来する振動スペクトルデータを含む、試験スペクトルデータを取得することと、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用して、取得された試験スペクトルデータからバイオマーカー発現特徴を導出することであって、バイオマーカー発現推定エンジンが、複数の差次的に調製された訓練生物学的検体から取得された訓練スペクトルデータセットを使用して訓練され、訓練スペクトルデータセットが、１つ以上のバイオマーカーについての既知のバイオマーカー発現のクラス標識を含む、導出することと、導出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて、試験生物学的検体の１つ以上のバイオマーカーの発現を予測することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、予測されるバイオマーカー発現は、予測される陽性率または予測される染色強度のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、予測されるバイオマーカー発現は、予測される陽性率および予測される染色強度の双方を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカーは、少なくとも１つの癌バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は、未知の固定状態および／または未知のマスキング解除状態を有する。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は染色されていない。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される。
いくつかの実施形態では、各訓練スペクトルデータセットは、以下によって導出される：（ｉ）訓練生物学的検体を取得すること；（ｉｉ）取得された訓練生物学的検体を複数の訓練組織試料に分割すること；および（ｉｉｉ）異なる調製条件下で複数の訓練組織試料の各訓練組織試料を調製すること。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のバイオマーカーの存在について複数の訓練組織試料のそれぞれを染色することと、１つ以上のバイオマーカーについての既知の陽性率および／または既知の染色強度を定量的に評価することと、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、次元縮小に基づく機械学習アルゴリズムを含む。いくつかの実施形態では、次元縮小は、潜在構造回帰モデルへの投影を含む。いくつかの実施形態では、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、ニューラルネットワークを含む。いくつかの実施形態では、方法は、試験生物学的検体の不十分なマスキング解除および／または不十分な固定のために１つ以上のバイオマーカーの予測発現を補償することをさらに含む。例えば、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンの使用によって取得された試験生物学的検体中の１つ以上のバイオマーカーの予測発現は、以下によって補正されることができる：（ｉ）バイオマーカー固定感度曲線を取得すること；（ｉｉ）試験生物学的試料の実際の固定時間を推定すること；および（ｉｉｉ）取得された固定感度曲線を用いて、試験生物学的検体について取得された予測バイオマーカー発現量を固定補償発現量に補正すること。
いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、少なくともアミドＩバンドの振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約３２００から約３４００ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約２８００から約２９００ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約１０２０から約１１００ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約１５２０から約１５８０ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。
本開示の特徴の一般的な理解のために、図面を参照する。図面では、同一の要素を特定するために、全体を通して同様の参照符号が使用されている。
本開示の一実施形態にかかる、画像取得装置およびコンピュータシステムを含む代表的なデジタル病理学システムを示している。 本開示の一実施形態にかかる、試験生物学的試料のマスキング解除状態を定量的または定性的に予測するために、システムまたはデジタル病理ワークフロー内で利用されることができる様々なモジュールを記載している。 本開示の一実施形態にかかる、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用して、染色されていない試験生物学的検体内の１つ以上のバイオマーカーの発現を推定する様々なステップを示すフローチャートを記載している。 本開示の一実施形態にかかる、２つの異なる訓練生物学的検体から複数の訓練組織試料、例えば、差次的調製（例えば、差分固定および／または差分マスキング）のための訓練試料１、２、３、４、５、および６を取得するプロセスを示している。いくつかの実施形態では、訓練組織試料１、２、および３は、第１の訓練スペクトルデータセットが取得されることができる訓練組織試料の第１のセットに属することができる一方で、訓練組織試料４、５、および６は、第２の訓練データセットが取得されることができる訓練組織試料の第２のセットに属することができる。 本開示の一実施形態にかかる、２つの異なる訓練生物学的検体から取得された複数の訓練組織試料の異なる調製を示し、２つの異なる訓練スペクトルデータセットの準備をさらに示している。 本開示の一実施形態にかかる複数の訓練組織試料の調製を示している。 本開示の一実施形態にかかる複数の訓練組織試料の調製を示している。 本開示の一実施形態にかかる複数の訓練組織試料の調製を示している。 本開示の一実施形態にかかる複数の訓練組織試料の調製を示している。 本開示の一実施形態にかかる複数の訓練組織試料の調製を示している。 本開示の一実施形態にかかる、訓練生物学的検体の振動スペクトルを取得する様々なステップを示すフローチャートを記載している。 本開示の一実施形態にかかる、試験生物学的検体の平均振動スペクトルを取得する様々なステップを示すフローチャートを記載している。 本開示の一実施形態にかかる、試験生物学的検体および訓練生物学的検体を含む、生物学的検体に由来する取得されたスペクトルを補正、正規化、および平均化する様々なステップを示すフローチャートを記載している。 ＢＣＬ２（図９Ａ）、ｋｉ－６７（図９Ｂ）およびＦＯＸＰ３（図９Ｃ）のＩＨＣ発現（陽性率）の定量的分析を記載している。 ＢＣＬ２（図９Ａ）、ｋｉ－６７（図９Ｂ）およびＦＯＸＰ３（図９Ｃ）のＩＨＣ発現（陽性率）の定量的分析を記載している。 ＢＣＬ２（図９Ａ）、ｋｉ－６７（図９Ｂ）およびＦＯＸＰ３（図９Ｃ）のＩＨＣ発現（陽性率）の定量的分析を記載している。 ３つ全てのバイオマーカーのＩＨＣ発現対固定時間のプロットを示しており、ここで、平均発現が正規化されたスケールでプロットされているため、各バイオマーカー対固定時間の相対的変化が観察されることができる。バーは、両側順位和検定によって決定されるｐ＜０．０５の有意なレベルを表している。 Ｋｉ－６７に対して生じた抗血清で標識された扁桃組織の例を提供している。扁桃組織のみ画像分析が行われた（左画像の丸部分）。時折、高いバックグラウンドを示したが、他の切片には存在しなかった結合組織が除外された。 識別された複数の領域を有する例示的な組織切片の可視画像を提供している。図は、可視画像内の示された領域から収集され、平均化され、処理され、正規化された振動スペクトルの例をさらに提供している。 中間ＩＲ吸収スペクトルを提供し、具体的には、取得された中間ＩＲスペクトル内のタンパク質バンドを示している。 アミドＩバンドの一次導関数対バンドのＦＷＨＭのピーク位置を記載し、これは、回収されていないスペクトルが他の回収された組織とは有意に異なるスペクトルを有することを明確にしている。 バイオマーカー発現推定エンジン、具体的にはＰＬＳＲ機械学習アルゴリズムを訓練する例を記載している。最初に、モデルは、既知の分類を有する入力振動スペクトルで訓練され、各波長が応答（例えば、マスキング解除時間）に対してどの程度相関する（または反相関する）かにおおよそ対応する各波長に重みを割り当てるモデルが開発される。最後に、モデルは、それがマスキング解除時間をどれだけ正確に予測するかを評価するために訓練された振動スペクトルデータに適用される。 コラーゲンの典型的なＦＲ－ＩＲおよびラマンスペクトルを示している。 訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン（取得された中程度のＩＲスペクトルを使用して訓練された）がＣ４ｄ染色を予測することができる、ＰＬＳＲモデルに基づくバイオマーカー発現推定エンジンを示している。盲検スペクトル間の予測精度は、Ｃ４ｄ陽性細胞の０．４％であった。 訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン（取得された中程度のＩＲスペクトルを使用して訓練された）がＫｉ－６７染色を予測することができる、ＰＬＳＲモデルに基づくバイオマーカー発現推定エンジンを示している。盲検スペクトル間の予測精度は、Ｋｉ－６７陽性細胞の０．８％であった。 時間－温度経過において中ＩＲによってイメージングされた４つの組織の写真を提供している。バイオマーカー発現推定エンジンは、（図の右側および図の下部に沿って）３つの組織検体を含む丸で囲まれた領域に提供された組織で訓練された。バイオマーカー発現推定エンジンの予測力は、１つの組織検体のみを含む「より小さい」丸で囲まれた領域内の組織によって評価された（図の左側）。 訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンの予測精度を、盲検化された扁桃試料中の全ての時間および温度にわたって示している。全ての試験時間および試験温度にわたって、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、機能的Ｃ４ｄ染色強度を約１０％よりも良好に予測することができた。時間と温度の交点の値は、予測されたＣ４ｄ染色強度と実際のＣ４ｄ染色強度との間のパーセント誤差を示す。 生物学的試料の赤外およびラマン特性周波数を示す表を提供している。 生物学的試料の赤外およびラマン特性周波数を示す表を提供している。 ＢＣＬ２のＩＨＣ発現（染色強度）の定量的分析を記載している。 ＦＯＸＰ３のＩＨＣ発現（染色強度）の定量的分析を記載している。 ｋｉ－６７のＩＨＣ発現（染色強度）の定量的分析を記載している。 固定実験のためのＢＣＬ２バイオマーカーについての推定ＤＡＢ染色対予測ＤＡＢ染色を示している。特に、図２３Ａは、０時間（例えば、不十分に／不適切に固定される）から２４時間（例えば、完全に／適切に固定される）の範囲の様々な時間にわたって室温ＮＢＦ中で固定された組織試料についての、専らＢＣＬ２陽性細胞におけるＢＣＬ２濃度の箱ひげプロットを提供している。実験タンパク質濃度は、明視野画像を画像分析アルゴリズムで分析することによって決定された。予測濃度は、ＰＬＳＲベースのアルゴリズムで訓練された訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンから予測される推定ＢＣＬ２濃度を表す。左側のボックス（「訓練」）は、ＭＩＤ－ＩＲスペクトルの訓練セットからなされたＢＣＬ２予測を表し、右側のボックス（「ホールドアウト」）は、モデルが以前に「見られた」ことがない盲検スペクトル、例えば検証スペクトルに対して行われたＢＣＬ２予測を表す。結果は、ＰＬＳＲ予測モデルが、差次的に固定された組織（完全に固定されていない）のＢＣＬ２濃度を正確に予測することができることを示している。 図２３Ａに表示されたＢＬＣ２バイオマーカーについての推定および予測されたＤＡＢ染色の累積分布関数をプロットしている。横軸は、明視野画像の分析からの実際のタンパク質濃度と、組織およびＰＬＳＲベースの予測エンジンからのＭＩＤ－ＩＲスペクトルを使用して計算されたＭＩＤ－ＩＲ予測タンパク質濃度との間の差であると定義されたモデルの誤差の絶対値である。訓練セット（「訓練」）についてのモデルの予測誤差は、予測／検証データについての予測誤差と同様であり、ＭＩＤ－ＩＲスペクトルのノイズに過度に適合しない十分に訓練されたモデルを示す。 ０時間（例えば、不十分に／不適切に固定される）から２４時間（例えば、完全に／適切に固定される）の範囲の様々な時間にわたって室温ＮＢＦ中で固定された組織試料についての、専らＦＯＸＰ３陽性細胞におけるＦＯＸＰ３濃度の箱ひげプロットを提供している。実験タンパク質濃度は、明視野画像を画像分析プログラムで分析することによって決定された。予測濃度は、ＰＬＳＲベースのアルゴリズムで訓練された訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンから予測される推定ＦＯＸＰ３濃度を表す。左側のボックス（「点線ボックス」）は、訓練セットＭＩＤ－ＩＲスペクトルから作成されたＦＯＸＰ３予測を表し、右側のボックス（「対角線を有するボックス」）は、モデルがこれまで見られたことのない盲検スペクトル、例えば検証スペクトルに対して行われたＦＯＸＰ３予測を表す。結果は、ＰＬＳＲ予測モデルが、差次的に固定された組織（完全に固定されていない）のＦＯＸＰ３濃度を正確に予測することができることを示す。 図２４Ａに示されるＦＯＸＰ３バイオマーカーについての推定および予測されたＤＡＢ染色の累積分布関数をプロットしている。横軸は、明視野画像の分析からの実際のタンパク質濃度と、組織およびＰＬＳＲベースの予測エンジンからのＭＩＤ－ＩＲスペクトルを使用して計算されたＭＩＤ－ＩＲ予測タンパク質濃度との間の差であると定義されたモデルの誤差の絶対値である。訓練セット（実線）のモデルの予測誤差は、予測／検証データのものと同様であり、ＭＩＤ－ＩＲスペクトルのノイズに過度に適合しない十分に訓練されたモデルを示す。 ０時間（例えば、不十分に／不適切に固定される）から２４時間（例えば、完全に／適切に固定される）の範囲の様々な時間にわたって室温ＮＢＦ中で固定された組織試料についての、専らｋｉ－６７陽性細胞におけるｋｉ－６７濃度の箱ひげ図を提供している。実験タンパク質濃度は、明視野画像を画像分析プログラムで分析することによって決定された。予測濃度は、ＰＬＳＲベースのアルゴリズムで訓練された訓練済バイオマーカー発現推定エンジンから予測された推定ｋｉ－６７濃度を表す。左側のボックス（「点線ボックス」）は、訓練セットＭＩＤ－ＩＲスペクトルから作成されたｋｉ－６７予測を表し、右側のボックス（「対角線を有するボックス」）は、モデルがこれまで見られたことのない盲検スペクトル、例えば検証スペクトルに対して行われたｋｉ－６７予測を表す。結果は、ＰＬＳＲ予測モデルが、差次的に固定された組織（完全に固定されていない）のｋｉ－６７濃度を正確に予測することができることを示す。 図２５Ａに表示されたｋｉ－６７バイオマーカーの推定および予測されたＤＡＢ染色の累積分布関数をプロットしている。横軸は、明視野画像の分析からの実際のタンパク質濃度と、組織およびＰＬＳＲベースの予測エンジンからのＭＩＤ－ＩＲスペクトルを使用して計算されたＭＩＤ－ＩＲ予測タンパク質濃度との間の差であると定義されたモデルの誤差の絶対値である。訓練セット（実線）のモデルの予測誤差は、予測／検証データのものと同様であり、ＭＩＤ－ＩＲスペクトルのノイズに過度に適合しない十分に訓練されたモデルを示す。 ０時間（例えば、不十分に／不適切に固定される）から２４時間（例えば、完全に／適切に固定される）の範囲の様々な時間にわたって室温ＮＢＦ中で固定された組織試料についての、ＦＯＸＰ３に対して陽性である組織のパーセントの箱ひげプロットを提供している。実験タンパク質濃度は、明視野画像を画像分析プログラムで分析することによって決定された。予測濃度は、ＰＬＳＲベースのアルゴリズムで訓練された訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンから予測される推定ＦＯＸＰ３濃度を表す。左側のボックス（「点線ボックス」）は、訓練セットＭＩＤ－ＩＲスペクトルから作成されたＦＯＸＰ３予測を表し、右側のボックス（「対角線を有するボックス」）は、モデルがこれまで見られたことのない盲検スペクトル、例えば検証スペクトルに対して行われたＦＯＸＰ３予測を表す。結果は、ＰＬＳＲ予測モデルが、差次的に固定された組織（完全に固定されていない）のＦＯＸＰ３濃度を正確に予測することができることを示す。 図２６Ａに示されるＦＯＸＰ３バイオマーカーについての組織陽性の推定および予測されたパーセントについての累積分布関数をプロットしている。横軸は、明視野画像の分析からの実際のタンパク質濃度と、組織およびＰＬＳＲベースの予測エンジンからのＭＩＤ－ＩＲスペクトルを使用して計算されたＭＩＤ－ＩＲ予測タンパク質濃度との間の差であると定義されたモデルの誤差の絶対値である。訓練セット（実線）のモデルの予測誤差は、予測／検証データのものと同様であり、ＭＩＤ－ＩＲスペクトルのノイズに過度に適合しない十分に訓練されたモデルを示す。 ０時間（例えば、不十分に／不適切に固定される）から２４時間（例えば、完全に／適切に固定される）の範囲の様々な時間にわたって室温ＮＢＦ中で固定された組織試料についての、ＢＣＬ２に対して陽性の組織のパーセントの箱ひげプロットを提供している。実験タンパク質濃度は、明視野画像を画像分析プログラムで分析することによって決定された。予測濃度は、ＰＬＳＲベースのアルゴリズムで訓練された訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンから予測される推定ＢＣＬ２濃度を表す。左側のボックス（「点線ボックス」）は、訓練セットＭＩＤ－ＩＲスペクトルから作成されたＢＣＬ２予測を表し、右側のボックス（「対角線を有するボックス」）は、モデルがこれまで見られたことのない盲検スペクトル、例えば検証スペクトルに対して行われたＢＣＬ２予測を表す。結果は、ＰＬＳＲ予測モデルが、差次的に固定された組織（完全に固定されていない）のＢＣＬ２濃度を正確に予測することができることを示す。 図２７Ａに示されるＢＣＬ２バイオマーカーについての組織陽性の推定および予測パーセントについての累積分布関数をプロットしている。横軸は、明視野画像の分析からの実際のタンパク質濃度と、組織およびＰＬＳＲベースの予測エンジンからのＭＩＤ－ＩＲスペクトルを使用して計算されたＭＩＤ－ＩＲ予測タンパク質濃度との間の差であると定義されたモデルの誤差の絶対値である。訓練セット（実線）のモデルの予測誤差は、予測／検証データのものと同様であり、ＭＩＤ－ＩＲスペクトルのノイズに過度に適合しない十分に訓練されたモデルを示す。 室温ＮＢＦ中で０時間（例えば、不十分に／不適切に固定される）から２４時間（例えば、完全に／適切に固定される）の範囲の様々な時間にわたって固定された組織試料についての、ｋｉ－６７陽性組織のパーセントの箱ひげプロットである。実験タンパク質濃度は、明視野画像を画像分析プログラムで分析することによって決定された。予測濃度は、ＰＬＳＲベースのアルゴリズムで訓練された訓練された予測エンジンから予測された推定ｋｉ－６７濃度を表す。左側のボックス（「点線ボックス」）は、訓練セットＭＩＤ－ＩＲスペクトルから作成されたｋｉ－６７予測を表し、右側のボックス（「対角線を有するボックス」）は、モデルがこれまで見られたことのない盲検スペクトル、例えば検証スペクトルに対して行われたｋｉ－６７予測を表す。結果は、ＰＬＳＲ予測モデルが、差次的に固定された組織（完全に固定されていない）のｋｉ－６７濃度を正確に予測することができることを示す。 図２５Ａに示されるｋｉ－６７バイオマーカーについての組織陽性の推定および予測されたパーセントについての累積分布関数をプロットしている。横軸は、明視野画像の分析からの実際のタンパク質濃度と、組織およびＰＬＳＲベースの予測エンジンからのＭＩＤ－ＩＲスペクトルを使用して計算されたＭＩＤ－ＩＲ予測タンパク質濃度との間の差であると定義されたモデルの誤差の絶対値である。訓練セット（実線）のモデルの予測誤差は、予測／検証データのものと同様であり、ＭＩＤ－ＩＲスペクトルのノイズに過度に適合しない十分に訓練されたモデルを示す。 ９．６℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃または１４０℃のいずれかの温度で３０分間回収された組織試料のＣ４ｄ染色結果を提供している。左側のグラフは、ＰＬＳＲに基づく訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用して、抗原回収温度にかかわらず、および１２０℃の変曲点にもかかわらず、盲検スペクトルによる訓練が全ての組織のＣ４ｄ陽性率の予測を容易にすることができることを実証している。右側のグラフは、ＤＡＢ画像分析アルゴリズムから、染色強度（上部、曲線、ひし形）および陽性率（下部、曲線、正方形）の双方が、１３０℃まで回収温度とともに増加する一方で、検出されたＣ４ｄの量が減少することを実証している。 ２５℃、７０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１０５℃または１１０℃のいずれかの温度で６０分間回収された組織試料のＫｉ－６７染色結果を提供している。左側のグラフは、染色強度（ひし形）および陽性率（四角）の双方が回収温度とともに増加するが、ＤＡＢ画像分析アルゴリズムからのデータに基づいて１００℃付近で飽和することを実証している。右側のグラフは、ＭＩＤ－ＩＲスペクトルを使用して、抗原回収温度にかかわらず、またＰＣＤＡに基づく訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用したより高い回収温度での飽和にもかかわらず、全ての組織のｋｉ－６７陽性率染色を決定することができることを実証している。 本開示の一実施形態にかかる、取得された予測バイオマーカー発現レベルを補正するステップを示すフローチャートを記載している。 本開示の一実施形態にかかる、取得された予測バイオマーカー発現レベルを補正するステップを示すフローチャートを記載している。
反対に明確に示されない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書において特許請求の範囲に記載される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が記載される順序に限定されないことも理解されたい。
本明細書における「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「例示的な実施形態（ａｎ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｖｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」などへの言及は、記載された実施形態が特定の特徴、構造、または特性を含むことができることを示すが、全ての実施形態がその特定の特徴、構造、または特性を必ずしも含んでも含まなくてもよい。さらに、そのような語句は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性が実施形態に関連して記載されている場合、明示的に記載されているか否かにかかわらず、他の実施形態に関連してそのような特徴、構造、または特性に影響を及ぼすことは当業者の知識の範囲内であると考えられる。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という単語は、文脈が別途明確に指示しない限り、「および」を含むことを意図している。「含む」という用語は、「ＡまたはＢを含む」がＡ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むことを意味するように、包括的に定義される。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有することを理解されたい。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるものとする。すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが、複数、および必要に応じて追加のリストに記載されていない項目を含むと解釈される。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」など、反対に明確に示される用語のみは、数または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」など、排他的な用語が先行する場合にのみ、排他的な代替案（例えば、「一方または他方であるが双方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。「から本質的に構成される」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」などは、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、各用語は、「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という一般的な米国特許法の定義と一致して定義されているため、「少なくとも以下」を意味するオープンな用語として解釈され、また、追加の特徴、制限、態様などを除外しないように解釈される。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、およびｃを有する装置」は、装置が少なくとも構成要素ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。同様に、文言：「ステップａ、ｂ、およびｃを含む方法」は、その方法が少なくともステップａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。さらに、ステップおよびプロセスは、ここにおいて特定の順序で概説され得るが、当業者は、順序付けのステップおよびプロセスが変化し得ることを認識するであろう。
本明細書の明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という句は、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的にリスト化されているありとあらゆる要素の少なくとも１つを含まなくてもなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外するものではない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定されるそれらの要素に関連するかどうかにかかわらず、必要に応じて存在することができることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）を指すことができ、別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）を指すことができ、さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＡを含み、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＢを含む（および必要に応じて、他の要素を含む）を指すことができるなどである。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体、抗体類似体（例えばアプタマー）、または抗体断片が結合する物質を指す。抗原は内因性であってもよく、それによって、正常もしくは異常な細胞代謝の結果として、またはウイルスもしくは細胞内細菌感染のために細胞内で生成される。内因性抗原は、異種（非相同）、自己およびイディオタイプまたは同種（相同）抗原を含む。抗原はまた、腫瘍特異的抗原とすることができるか、または腫瘍細胞によって提示されることができる。この場合、それらは、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）と呼ばれ、一般に腫瘍特異的変異に起因する。抗原はまた、腫瘍細胞および正常細胞によって提示される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とすることができる。抗原はまた、ＣＤ抗原も含み、これは白血球によって発現されるいくつかの細胞表面マーカーのいずれかを指し、細胞系統または発達段階を区別するために使用されることができる。そのようなマーカーは、特異的モノクローナル抗体によって同定されることができ、それらの分化クラスターによって番号付けされる。
本明細書で使用される場合、「生物学的検体」、「試料」、または「組織試料」という用語は、ウイルスを含む任意の生物から得られる生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、またはそれらの組み合わせなど）を含む任意の試料を指す。生物の他の例は、哺乳類（人間、猫、犬、馬、牛、および豚などの獣医動物、ならびにマウス、ラット、霊長類などの実験動物など）、昆虫、環形動物、クモ形類動物、有袋類、爬虫類、両生類、細菌、および菌類などを含む。生物学的検体は、組織試料（組織切片や組織の針生検など）、細胞試料（Ｐａｐ塗抹検体もしくは血液塗抹検体などの細胞学的塗抹検体、またはマイクロダイセクションによって得られた細胞の試料など）、または細胞分画、断片または細胞小器官（細胞を溶解し、遠心分離などによってそれらの成分を分離することによって得られる）を含む。生物学的検体の他の例は、血液、血清、尿、精液、糞便、脳脊髄液、間質液、粘膜、涙、汗、膿、生検組織（例えば、外科的生検または針生検によって得られる）、乳頭吸引物、耳垢、乳、膣液、唾液、ぬぐい液（頬スワブなど）、または最初の生物学的検体に由来する生体分子を含む任意の材料を含む。特定の実施形態では、本明細書で使用される「生物学的検体」という用語は、対象から得られた腫瘍またはその一部から調製された試料（均質化または液化された試料など）を指す。
本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」または「マーカー」という用語は、何らかの生物学的状態または状態の測定可能な指標を指す。特に、バイオマーカーは、特異的に染色されることができ、細胞の生物学的特徴、例えば細胞の細胞型または生理学的状態を示す、核酸、脂質、炭水化物、またはタンパク質もしくはペプチド、例えば表面タンパク質とすることができる。バイオマーカーが使用されて、身体が疾患または症状の処置にどの程度よく応答するか、または対象が疾患または症状にかかりやすいかを決定することができる。免疫細胞マーカーは、哺乳動物の免疫応答に関する特徴を選択的に示すバイオマーカーである。癌の文脈において、バイオマーカーは、体内の癌の存在を示す生体物質を指す。バイオマーカーは、腫瘍によって分泌される分子、または癌の存在に対する身体の特異的応答とすることができる。遺伝子バイオマーカー、エピジェネティックバイオマーカー、プロテオミクスバイオマーカー、グリコームバイオマーカーおよびイメージングバイオマーカーは、癌の診断、予後診断および疫学のために使用されることができる。そのようなバイオマーカーは、血液または血清などの非侵襲的に収集された生体流体でアッセイされることができる。ＡＦＰ（肝臓癌）、ＢＣＲ－ＡＢＬ（慢性骨髄性白血病）、ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２（乳癌／卵巣癌）、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ（黒色腫／結腸直腸癌）、ＣＡ－１２５（卵巣癌）、ＣＡ１９．９（膵臓癌）、ＣＥＡ（結腸直腸癌）、ＥＧＦＲ（非小細胞肺癌）、ＨＥＲ－２（乳癌）、ＫＩＴ（消化管間質腫瘍）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、Ｓ１００（黒色腫）などを含むがこれらに限定されないいくつかの遺伝子およびタンパク質ベースのバイオマーカーが既に患者ケアに使用されている。バイオマーカーは、診断薬（初期癌を同定するため）および／または予後診断薬（癌がどの程度侵攻性であるかを予測するため、および／または対象が特定の処置にどのように応答するかおよび／または癌がどの程度再発する可能性があるかを予測するため）として有用とすることができる。
本明細書で使用される場合、「細胞学的試料」という用語は、試料が細胞試料が得られた対象に存在したときの細胞の空間的関係をもはや反映しないように、試料の細胞が部分的または完全に脱凝集している細胞試料を指す。細胞学的試料の例は、組織擦過物（子宮頸部擦過物など）、細針吸引物、対象の洗浄によって得られた試料などを含む。
本明細書で使用される場合、「免疫組織化学」という用語は、抗原と抗体などの特異的結合剤との相互作用を検出することによって、試料中の抗原の存在または分布を決定する方法を指す。試料は、抗体－抗原結合を可能にする条件下で抗体と接触される。抗体－抗原結合は、抗体にコンジュゲートされた検出可能な標識（直接検出）によって、または一次抗体に特異的に結合する二次抗体にコンジュゲートされた検出可能な標識（間接検出）によって検出されることができる。いくつかの例では、間接検出は、抗原の検出可能性をさらに高めるのに役立つ三次以上の抗体を含むことができる。検出可能な標識の例は、酵素、フルオロフォアおよびハプテンを含み、これらは、酵素の場合、発色性または蛍光発生性基質と共に使用されることができる。
本明細書で使用される場合、「陽性率」という用語は、陽性染色細胞の数を、陰性染色細胞の数と組み合わせた陽性染色細胞の数で割ったものを指す。
本明細書で使用される場合、「スライド」という用語は、生物学的検体が分析のために配置される任意の適切な寸法の任意の基材（例えば、全体的または部分的に、ガラス、石英、プラスチック、シリコンなどから作製された基材）、より具体的には、標準の３インチ×１インチの顕微鏡スライドまたは標準の７５ｍｍ×２５ｍｍの顕微鏡スライドなどの「顕微鏡スライド」を指す。スライド上に配置されることができる生物学的検体の例は、限定されるものではないが、細胞学的塗抹検体、薄い組織切片（生検からのものなど）、および生物学的検体の配列、例えば、組織配列、細胞配列、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む。したがって、一実施形態では、組織切片、ＤＮＡ試料、ＲＮＡ試料、および／またはタンパク質は、スライド上の特定の位置に配置される。いくつかの実施形態では、スライドという用語は、ＳＥＬＤＩおよびＭＡＬＤＩチップ、ならびにシリコンウェーハを指すことができる。
本明細書で使用される場合、「特異的結合実体」という用語は、特異的結合対のメンバーを指す。特異的結合対は、他の分子への結合を実質的に排除して互いに結合することを特徴とする分子の対である（例えば、特異的結合対は、生物学的試料中の他の分子との結合対の２つのメンバーのいずれかの結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ－１大きい、１０４Ｍ－１大きいまたは１０５Ｍ－１大きい結合定数を有することができる）。特異的結合部分の特定の例は、特異的結合タンパク質（例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジンなどのアビジン、およびプロテインＡ）を含む。特異的結合部分はまた、そのような特異的結合タンパク質によって特異的に結合される分子（またはその部分）を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「スペクトルデータ」という用語は、分光計などを用いて、生物学的検体またはその任意の部分から取得された生の画像スペクトルデータを包含する。
本明細書で使用される場合、「スペクトル」という用語は、電磁放射の特定の波長または波数範囲「において」またはその範囲内で得られた情報（吸収、透過、反射）を指す。波数範囲は、４０００ｃｍ－１ほど大きくてもよく、０．０１ｃｍ－１ほど狭くてもよい。いわゆる「シングルレーザ波長」での測定は、典型的には、小さなスペクトル範囲（例えば、レーザ線幅）をカバーし、したがって、用語「スペクトル」が本原稿を通して使用されるときはいつでも含まれることに留意されたい。例えば、量子カスケードレーザの固定波長設定での透過測定は、本明細書では、本出願全体を通してスペクトルという用語に含まれるものとする。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「染色」、「染色している」などの用語は、一般に、生物学的検体中の特定の分子（脂質、タンパク質、または核酸など）または特定の構造（正常または悪性の細胞、細胞質ゾル、核、ゴルジ装置、または細胞骨格など）の存在、位置、および／または量（濃度など）を検出および／または区別する生物学的検体の任意の処理を指す。例えば、染色は、特定の分子または特定の細胞構造と生物学的検体の周囲の部分との間のコントラストを提供することができ、染色の強度は、検体中の特定の分子の量の尺度を提供することができる。染色は、明視野顕微鏡だけでなく、位相差顕微鏡、電子顕微鏡、および蛍光顕微鏡などの他の観察ツールを使用して、分子、細胞構造、および生物の観察を支援するために使用されることができる。システムによって実行されるいくつかの染色は、細胞の輪郭を視覚化するために使用されることができる。システムによって実行される他の染色は、他の細胞成分の染色なしで、または比較的少ない染色で、染色される特定の細胞成分（分子または構造など）に依存することができる。システムによって実行される染色方法のタイプの例は、これらに限定されるものではないが、組織化学的方法、免疫組織化学的方法、および核酸分子間のハイブリッド形成反応などの分子間の反応（非共有結合相互作用を含む）に基づく他の方法を含む。特定の染色法は、これらに限定されるものではないが、一次染色法（例えば、Ｈ＆Ｅ染色、Ｐａｐ染色など）、酵素結合免疫組織化学的方法、および蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）などの原位置ＲＮＡおよびＤＮＡハイブリッド形成法を含む。
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、存在、位置、および／または濃度が判定される、または判定されることができる任意の分子を指す。標的分子の例は、タンパク質、エピトープ、核酸配列、およびタンパク質に共有結合したハプテンなどのハプテンを含む。標的分子は通常、特異的な結合分子と検出可能な標識との、１つ以上の抱合体を用いて検出される。
本明細書で使用される場合、「組織試料」という用語は、試料が得られた対象内に存在した細胞間の断面の空間的関係を保存する細胞試料を指すものとする。「組織試料」は、初代組織試料（例えば、対象によって産生された細胞および組織）および異種移植片（例えば、対象に埋め込まれた外来細胞試料）の双方を包含するものとする。
本明細書で使用される場合、「マスク解除」または「マスキング解除」という用語は、抗原または標的を回収すること、および／または固定組織内の抗原、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、および／または他の標的の検出を改善することを指す。例えば、そうでなければ検出されない可能性がある抗原部位は、例えば、マスキング解除中に抗原を取り囲むタンパク質架橋の一部を破壊することによって明らかにされることができると考えられる。いくつかの実施形態では、抗原および／または他の標的は、１つ以上のマスキング解除剤（以下に定義される）、熱および／または圧力の適用によってマスキング解除される。いくつかの実施形態では、１つ以上のマスキング解除剤のみが検体に適用されて、マスキング解除を達成する。他の実施形態では、マスキング解除を達成するために熱のみが加えられる。いくつかの実施形態では、マスキング解除は、水および追加の熱の存在下でのみ行われてもよい。マスキング解除動作の例は、米国特許出願公開第２００９／０１７００１５２号明細書に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
概要
いくつかの実施形態では、本開示は、診断、例えばＩＨＣおよび／またはＩＳＨアッセイなどの生物学的検体の染色の非存在下でのバイオマーカー発現の予測を可能にする「標識なし」システムおよび方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるシステムおよび方法は、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを利用して、生物学的検体から取得された振動スペクトルデータを評価し、振動スペクトルデータの評価に基づいて、１つ以上のバイオマーカーの発現の推定値を出力として提供する。
いくつかの実施形態では、開示されたシステムおよび方法の出力は、１つ以上のバイオマーカーの染色強度の定量的推定値、または１つ以上のバイオマーカーの陽性率の定量的推定値である。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカーの染色強度および／または陽性率の定量的推定値は、未知の条件に従って調製された生物学的検体について提供されることができ、例えば、生物学的検体の固定期間および／またはマスキング解除状態が未知である。
全体として、出願人は、開示されたシステムおよび方法が、機械学習アルゴリズムの使用を介して、染色されていない生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現の迅速且つ正確な予測を可能にし、最終的にＩＨＣおよび／またはＩＳＨアッセイ結果および患者ケアの改善を促進することを提出する。システムおよび方法はまた、いくつかの実施形態では染色アッセイが必要とされないため、時間および費用を節約すると考えられる。同時に、またいくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカーの発現の評価は、試料調製またはＩＨＣおよび／またはＩＳＨ分析の不一致によって影響されない。これらおよび他の実施形態は、本明細書でさらに説明される。
システム
本開示の少なくともいくつかの実施形態は、生物学的検体から取得された振動スペクトルデータを分析するためのコンピュータシステムに関する。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は染色されていない。
いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は、未知の固定状態および／またはマスキング解除状態を有する。本開示によれば、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンが使用されて、生物学的検体（例えば、染色されていない試験生物学的検体）内の１つ以上のバイオマーカーの発現の定量的推定値を提供することができる。いくつかの実施形態では、本開示のシステムは、試験生物学的検体（例えば、染色されていない試験生物学的検体）からの試験振動スペクトルデータを入力として受信することができ、陽性率または染色強度を含む１つ以上のバイオマーカーの発現の定量的推定値を出力として提供することができる。いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジンがどのように訓練されたかに応じて、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、バイオマーカー発現の推定に加えて、固定状態および／またはマスキング解除状態の一方または双方の定量的または定性的推定も出力として提供することができる。
いくつかの実施形態では、出力は、生成されたレポートの形態とすることができる。他の実施形態では、出力は、試験生物学的検体の画像に重ね合わされたオーバーレイであってもよい。さらに他の実施形態では、任意の出力は、システム（例えば、記憶システム２４０）に結合されたメモリに記憶されることができ、その出力は、試験生物学的検体および／または他の患者データに関連付けられることができる。
スペクトルデータ、例えば振動スペクトルデータを取得し、生物学的検体（試験生物学的検体および訓練生物学的検体を含む）を分析するためのシステム２００が図１および図２に示される。システムは、生物学的検体（またはその任意の部分）の振動スペクトル（例えば、中ＩＲスペクトルまたはラマンスペクトル）を取得するように構成されたものなどのスペクトル取得装置１２と、コンピュータ１４とを含むことができ、それによってスペクトル取得装置１２とコンピュータとは、互いに通信可能に結合されることができる（例えば、直接的に、またはネットワーク２０を介して間接的に）。コンピュータシステム１４は、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タブレットなど、デジタル電子回路、ファームウェア、ハードウェア、メモリ２０１、コンピュータ記憶媒体（２４０）、コンピュータプログラムまたは一連の命令（例えば、メモリまたは記憶媒体内にプログラムが記憶される）、１つ以上のプロセッサ（２０９）（プログラムされたプロセッサを含む）、および（本明細書でさらに記載されるような）任意の他のハードウェア、ソフトウェア、ファームウェアモジュールまたはそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、図１に示されるシステム１４は、ディスプレイ装置１６およびエンクロージャ１８を備えたコンピュータを備えることができる。コンピュータシステムは、取得されたスペクトルデータを、メモリ、サーバ、または別のネットワーク接続された装置などにローカルに記憶することができる。
振動分光法は、電磁放射線の吸収または放出による遷移に関係する。これらの遷移は、１０２から１０４ｃｍ－１の範囲に現れ、任意の所与の試料中の分子を構成する核の振動に由来すると考えられる。分子内の化学結合は、多くの方法で振動することができると考えられており、それぞれの振動は、振動モードと呼ばれる。分子振動には、伸縮と屈曲の２種類がある。伸縮振動は、原子間距離の増加または減少に伴う結合軸に沿った移動を特徴とするが、屈曲振動は、分子の残りの部分に対する結合角の変化からなる。振動エネルギーに基づく２つの広く使用されている分光技術は、ラマン分光法および赤外分光法である。レーザ光の非弾性散乱を利用する中赤外（ＭＩＲ）吸収分光法およびラマン分光法の双方が、標的体積中の分子の比振動エネルギーレベルを探る。２つの技術は相補的であり、振動選択則に基づいて異なる振動モードを調査し、任意の分子内で原子がその分子のいくつかの明確な明確に定義された周波数特性で振動するという事実に基づいている。試料は、入射放射線のビームが照射されると、分子内に存在する化学結合の振動の周波数に特徴的な周波数でエネルギーを吸収する。化学結合の振動によるエネルギーのこの吸収は、赤外線スペクトルをもたらす。
ＩＲおよびラマン分光法は分子の振動エネルギーを測定するが、双方の方法は異なる選択規則、例えば吸収プロセスおよび散乱効果に依存する。それらのコントラスト機構は異なり、各方法論はそれぞれの長所と短所を有するが、各モダリティから得られたスペクトルは相関することが多い（例えば、図１４および図１９を参照）。
赤外分光法は、電磁放射の吸収に基づくのに対して、ラマン分光法は、電磁放射の非弾性散乱に依存する。赤外分光法は、吸収技術から反射技術および分散技術まで、広範囲の波数に拡張され、試料分子中に存在する異なる結合が定性的および定量的目的の双方に使用するのに適した多数の一般的且つ特徴的なバンドを提供する近赤外領域、中赤外領域および遠赤外領域を含む多数の分析ツールを提供する。試料には、ＩＲ分光法でＩＲ光が照射され、電気双極子モーメントによって誘起される振動を検出する。
ラマン分光法は散乱現象であり、入射放射周波数と散乱放射周波数との間の差に起因して生じる。これは、散乱光を利用して分子振動に関する知識を獲得し、分子の構造、対称性、電子環境、および結合に関する情報を提供することができる。ラマン分光法では、試料は、レーザ源からの単色の可視光または近ＩＲ光によって照射され、電気分極率変化中のその振動が決定される。
本開示のシステムでは、任意の振動スペクトル取得装置が利用されることができる。中赤外スペクトルの取得に使用するのに適したスペクトル取得装置またはそのような装置の構成要素の例は、米国特許出願公開第２０１８／０１０９０７８号明細書および米国特許出願公開第２０１６／００９１７０４号明細書、ならびに米国特許第１０，０４１，８３２号明細書、米国特許第８，０３６，２５２号明細書、米国特許第９，０４６，６５０号明細書、米国特許第６，９７２，４０９号明細書、および米国特許第７，２８０，５７６号明細書に記載されており、これらの特許の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
生物学的検体の代表的な中赤外スペクトルを生成するのに適した任意の方法が使用されることができる。フーリエ変換赤外分光法およびその生物医学的用途は、例えば、Ｐ．Ｌａｓｃｈ，Ｊ．Ｋｎｅｉｐｐ（Ｅｄｓ．）Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ’’ ２００８（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に記載されている。しかしながら、より最近では、波長可変量子カスケードレーザは、それらの高いスペクトル出力密度のために生物医学検体の迅速な分光法および顕微鏡法を可能にした（Ｎ．Ｋｒoｇｅｒら、：Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ＶＩ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａ．Ｍａｈａｄｅｖａｎ－Ｊａｎｓｅｎ，Ｗ．Ｐｅｔｒｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．ｏｆ ＳＰＩＥ Ｖｏｌ．８９３９，８９３９０Ｚ；Ｎ．Ｋｒoｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．１９（２０１４）１１１６０７；Ｎ．Ｋｒoｇｅｒ－Ｌｕｉら、Ａｎａｌｙｓｔ １４０（２０１５）２０８６を参照）。これらの刊行物のそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。この研究は、調査がはるかに速く（例えば、１８時間の代わりに５分）、液体窒素冷却を必要とせず、実質的に低コストで画像当たりより多くのピクセルを提供するという点で、（前述の赤外線顕微鏡のセットアップと比較して）適用性に対する進歩を構成すると考えられる。未染色組織の品質評価の文脈におけるＱＣＬベースの顕微鏡法の特定の利点の１つは、例えば６４０×４８０ピクセルのマイクロボロメータアレイ検出器によって可能にされる（ＦＴ－ＩＲ撮像と比較して）より大きな視野である。
いくつかの実施形態では、スペクトルは、広い波長範囲、１つ以上の狭い波長範囲にわたって、または単一の波長のみ、またはそれらの組み合わせでさえも取得されることができる。例えば、アミドＩバンドおよびアミドＩＩバンドのスペクトルが取得されることができる。別の例として、スペクトルは、約３２００から約３４００ｃｍ－１、約２８００から約２９００ｃｍ－１、約１０２０から約１１００ｃｍ－１、および／または約１５２０から約１５８０ｃｍ－１の範囲の波長にわたって取得されてもよい。いくつかの実施形態では、スペクトルは、約３２００から約３４００ｃｍ－１の範囲の波長にわたって取得されることができる。いくつかの実施形態では、スペクトルは、約２８００から約２９００ｃｍ－１の範囲の波長にわたって取得されることができる。いくつかの実施形態では、スペクトルは、約１０２０から約１１００ｃｍ－１の範囲の波長にわたって取得されることができる。いくつかの実施形態では、スペクトルは、約１５２０から約１５８０ｃｍ－１の範囲の波長にわたって取得されることができる。スペクトル範囲を狭めることは、通常、特に量子カスケードレーザを使用する場合、取得速度の点で有利であると考えられる。いくつかの実施形態では、単一の波長可変レーザは、次々にそれぞれの波長に調整される。あるいは、特定の周波数での測定に必要なレーザをオンおよびオフに切り替えることによって波長選択が行われるように、固定周波数の非同調レーザのセットが使用されることができる。
スペクトルは、例えば、透過または反射測定を使用して取得されることができる。透過測定のために、フッ化バリウム、フッ化カルシウム、シリコン、薄いポリマー膜、またはセレン化亜鉛が、通常、基材として使用される。反射測定のために、金または銀メッキされた基板、ならびに標準的な顕微鏡ガラススライド、または中間ＩＲ反射コーティング（例えば、多層誘電体コーティングまたは薄スライバコーティング）でコーティングされたガラススライドが一般的である。さらに、ナノアンテナのような構造化表面のような、表面増強（例えば、配列）を使用するための手段が実装されてもよい。
いくつかの実施形態では、他のコンピュータ装置またはシステムが利用されることができ、本明細書に記載のコンピュータシステムは、追加の構成要素、例えば顕微鏡、イメージング装置、スキャナ、他のイメージングシステム、自動スライド調製装置などに通信可能に結合されることができる。これらの追加の構成要素のいくつか、および利用できる様々なコンピュータ、ネットワークなどは、本明細書でさらに説明される。
例えば、いくつかの実施形態では、システム２００は、イメージング装置をさらに含んでもよく、イメージング装置から取り込まれた任意の画像は、ローカルまたはサーバ上などのバイナリ形式で記憶されてもよい。いくつかの実施形態では、取り込まれた画像は、バイオマーカー発現推定値および／または記憶サブシステム２４０などの任意の患者データと共に記憶されてもよい。取り込まれたデジタル画像は、ピクセルのマトリックスに分割されることもできる。ピクセルは、ビット深度によって定義される１以上のビットのデジタル値を含むことができる。一般に、イメージング装置（またはメモリに記憶された事前走査画像を含む他の画像ソース）は、１つ以上の画像撮像装置を含むことができるが、これに限定されない。画像撮像装置は、限定されるものではないが、カメラ（例えば、アナログカメラ、デジタルカメラなど）、光学系（例えば、１つまたは複数のレンズ、センサフォーカスレンズ群、顕微鏡対物レンズなど）、画像化センサ（例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）、相補的金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサなど）、写真フィルムなどを含む。デジタル実施形態では、画像撮像装置は、オンザフライフォーカシングを証明するために協働する複数のレンズを含むことができる。イメージセンサ、例えば、ＣＣＤセンサは、検体のデジタル画像を撮像することができる。
いくつかの実施形態では、イメージング装置は、明視野イメージングシステム、マルチスペクトルイメージング（ＭＳＩ）システムまたは蛍光顕微鏡システムである。デジタル化された組織データは、例えば、ＶＥＮＴＡＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｉｎｃ．（アリゾナ州トゥーソン）によるＶＥＮＴＡＮＡ ＤＰ２００スキャナなどの画像スキャンシステムまたは他の適切なイメージング装置によって生成されることができる。さらなるイメージング装置およびシステムは、本明細書でさらに説明される。いくつかの実施形態では、イメージング装置によって取得されたデジタルカラー画像は、従来、基本カラー画素から構成される。各色付きピクセルは、それぞれが同じビット数を含む３つのデジタルコンポーネントでコード化されることができ、各コンポーネントは、「ＲＧＢ」コンポーネントという用語によっても示される、一般に赤、緑、または青の原色に対応する。
図２は、本開示のシステム２００およびシステム内で利用される様々なモジュールの概要を提供する。いくつかの実施形態では、システム２００は、１つ以上のプロセッサ２０９および１つ以上のメモリ２０１を有するコンピュータ装置またはコンピュータ実装方法を使用し、１つ以上のメモリ２０１は、１つ以上のプロセッサに本明細書に記載の特定の命令を実行させるために、１つ以上のプロセッサによる実行のための非一時的コンピュータ可読命令を記憶する。
いくつかの実施形態では、上述したように、システムは、得られた生物学的検体（例えば、図３のステップ３１０を参照）またはその任意の部分（例えば、図３のステップ３２０を参照）の中間ＩＲスペクトルまたはラマンスペクトルなどの振動スペクトルを取得するためのスペクトル取得モジュール２０２を含む。いくつかの実施形態では、システム２００は、取得された振動スペクトルデータを処理するように適合されたスペクトル処理モジュール２１２をさらに含む。いくつかの実施形態では、スペクトル処理モジュール２１２は、スペクトルデータを前処理するように構成される。いくつかの実施形態では、スペクトル処理モジュール２１２は、取得された振動スペクトルを補正および／または正規化するか、または取得された透過スペクトルを吸収スペクトルに変換する。他の実施形態では、スペクトル処理モジュール２１２は、単一の生物学的検体から取得された複数の振動スペクトルを平均化するように構成される。さらに他の実施形態では、スペクトル処理モジュール２１２は、取得された振動スペクトルの一次導関数、二次導関数などを計算するなどのために、取得された振動スペクトルをさらに処理するように構成される。
いくつかの実施形態では、システム２００は、訓練振動スペクトルデータを受信し、受信した訓練振動スペクトルデータを使用してバイオマーカー発現推定エンジン２１０を訓練するように適合された訓練モジュール２１１をさらに含む。
いくつかの実施形態では、システム２００は、試験振動スペクトルデータ（例えば、図３のステップ３４０を参照）内のバイオマーカー発現特徴を検出し、検出されたバイオマーカー発現特徴（例えば、図３のステップ３５０を参照）に基づいて生物学的検体のバイオマーカー発現（例えば、染色強度または陽性率）の推定値を提供するように訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン２１０を含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、１つ以上の機械学習アルゴリズムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の機械学習アルゴリズムは、本明細書でさらに説明するように次元縮小に基づく。いくつかの実施形態では、次元縮小は、判別分析を伴う主成分分析などの主成分分析を利用した。他の実施形態では、次元縮小は、潜在構造回帰への投影である。いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、ニューラルネットワークを含む。他の実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、サポートベクターマシンなどの分類器を含む。
いくつかの実施形態では、追加のモジュールがワークフローまたはシステム２００に組み込まれることができる。いくつかの実施形態では、画像取得モジュールが実行されて、生物学的検体またはその任意の部分のデジタル画像を取得する。他の実施形態では、細胞が検出、分類、および／またはスコア付けされることができるように、自動画像分析アルゴリズムが実行されることができる（例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０３７２１１７号明細書を参照）。他の適切な画像分析アルゴリズムは、国際公開第２０１９／１２１５６４号、国際公開第２０１９／１１０５８３号、国際公開第２０１９／１１０５６７号、国際公開第２０１９／１１０５６１号、国際公開第２０１９／０２５５３３号、国際公開第２０１９／０２５５１５号および国際公開第２０１８／１２２０５６号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
分光取得モジュールおよび取得された分光データ
図２を参照すると、いくつかの実施形態では、システム２００は、スペクトル取得モジュール２０２を実行して、生物学的検体（例えば、試験生物学的検体または訓練生物学的検体）の少なくとも一部から振動スペクトルを取得する（例えば、上述したもののいずれかなどのスペクトルイメージング装置１２を使用して）。他の実施形態では、（本明細書にさらに記載される）試験生物学的検体は染色されておらず、例えば、１つ以上のバイオマーカーの存在を示す染色を含まない。いくつかの実施形態では、および（本明細書にさらに記載される）生物学的検体を訓練するために、生物学的検体は、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される。スペクトル取得モジュール２０２を使用して振動スペクトルが取得されると、取得された振動スペクトルは、記憶モジュール２４０（例えば、ローカル記憶モジュールまたはネットワーク記憶モジュール）に記憶されることができる。
いくつかの実施形態では、振動スペクトルは、生物学的検体の一部から取得されることができる（本明細書でさらに説明するように、これは、検体が訓練生物学的検体であるか試験生物学的検体であるかに関係しない）。そのような場合、スペクトル取得モジュール２０２は、例えばランダムサンプリングによって、または試料全体をカバーするグリッドにわたって規則的な間隔でサンプリングすることによって、試料の所定の部分から振動スペクトルを取得するようにプログラムされてもよい。これは、試料の特定の領域のみが分析に関連する場合にも有用とすることができる。
例えば、関心領域は、特定の種類の組織、または別の関心領域と比較して特定の種類の細胞の比較的高い集団を含むことができる。例えば、扁桃組織を含むが結合組織を含まない関心領域が選択されることができる。そのような場合、スペクトル取得モジュール２０２は、例えばランダムサンプリングによって、または試料全体をカバーするグリッドにわたって規則的な間隔でサンプリングすることによって、試料の所定の部分から振動スペクトルを取得するようにプログラムされてもよい。試料が１つ以上の染色を含む実施形態では、染色を含まないか、または他の領域よりも比較的少ない染色を含む関心領域から振動スペクトルが取得されることができる。
いくつかの実施形態では、生物学的検体の少なくとも２つの領域がサンプリングされ、少なくとも２つの領域のそれぞれについて振動スペクトルが取得される（また、これは、検体が訓練生物学的検体であるか試験生物学的検体であるかに関係しない）。他の実施形態では、生物学的検体の少なくとも１０個の領域がサンプリングされ、少なくとも１０個の領域のそれぞれについて振動スペクトルが取得される。さらに他の実施形態では、生物学的検体の少なくとも３０個の領域がサンプリングされ、少なくとも３０個の領域のそれぞれについて振動スペクトルが取得される。さらなる実施形態では、生物学的検体の少なくとも６０個の領域がサンプリングされ、少なくとも６０個の領域のそれぞれについて振動スペクトルが取得される。またさらなる実施形態では、生物学的検体の少なくとも９０個の領域がサンプリングされ、少なくとも９０個の領域のそれぞれについて振動スペクトルが取得される。なおさらなる実施形態では、生物学的検体の約３０個の領域と約１５０個の領域との間がサンプリングされ、各領域について振動スペクトルが取得される。
いくつかの実施形態では、生物学的検体の領域ごとに単一の振動スペクトルが取得される。他の実施形態では、生物学的検体の領域ごとに少なくとも２つの振動スペクトルが取得される。さらに他の実施形態では、生物学的検体の領域ごとに少なくとも３つの振動スペクトルが取得される。
いくつかの実施形態では、記憶モジュール２４０に記憶される取得振動スペクトルまたは取得振動スペクトルデータ（本明細書では互換的に使用される）は、「訓練スペクトルデータ」を含む。いくつかの実施形態では、訓練スペクトルデータは、訓練生物学的検体から導出され、訓練生物学的検体は、組織学的検体、細胞学的検体、またはそれらの任意の組み合わせとすることができる。
いくつかの実施形態では、訓練スペクトルデータは、本明細書に記載の訓練モジュール２１１の使用などによって、バイオマーカー発現エンジン２１０を訓練するために使用される。いくつかの実施形態では、訓練スペクトルデータは、バイオマーカー発現レベル（例えば陽性率、染色強度）、マスキング解除状態（例えば、マスキング解除時間、マスキング解除期間、「未回収」、「完全に回収」、および「部分的に回収」などの相対マスキング解除品質情報）、固定状態（例えば、固定期間、「部分的に固定」、「完全に固定」、「適切に固定」、「不適切に固定」などの相対的な固定品質）などのクラス標識を含む。いくつかの実施形態では、訓練スペクトルデータは、複数のクラス標識を含む。いくつかの実施形態では、クラス標識は、組織タイプの識別、任意の染色アッセイで利用される特異的結合剤、組織調製情報、患者情報などを含む。
いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジンを訓練するために、複数の訓練振動スペクトルデータセットが使用される。いくつかの実施形態では、各訓練スペクトルデータセットは、複数の訓練組織試料（例えば、第１の訓練組織試料、第２の訓練組織試料、および第ｎの訓練組織試料）などの複数の部分に分割された単一の訓練生物学的検体から導出されてもよく（図４Ａを参照）、各訓練組織試料は、異なって調製されてもよい。例えば、以下にさらに説明するように、各訓練組織試料は、別個に調製されてもよく、例えば、異なるように染色されてもよく、異なるように固定されてもよく、および／または異なるようにマスクされなくてもよい（図４Ｂを参照）。これに関して、単一の訓練生物学的検体は、異なる状態および／または組織調製状態の連続体を表す複数の別個に調製された試料を生じることができる。もちろん、異なる各訓練振動スペクトルデータセットは、異なる対象または患者に由来してもよく、異なる組織タイプ（例えば、扁桃組織対乳房組織）に由来してもよく、および／または異なる特異的結合実体（例えば、ＣＤ８マーカーを認識する特異的結合実体対ＣＤ３バイオマーカーを認識する特異的結合実体；第１の製造者からのＣＤ８を認識する特異的結合実体対第２の製造者からのＣＤ８を認識する特異的結合実体）によって処置されてもよい。
いくつかの実施形態では、訓練生物学的検体およびそれに由来する訓練組織試料のそれぞれは、バイオマーカー発現（例えば陽性率および／または染色強度）が訓練試料ごとに（例えば、訓練された病理学者によって、または１つ以上の画像分析アルゴリズムを使用して）評価されることができるように、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される。例えば、各個々の訓練試料は、ＢＣＬ２、Ｃ４ｄ、ｋｉ－６７、ＦＯＸＰ３などの１つ以上によって染色されることができる。検出および分類に適した他のバイオマーカーは、本明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、各訓練組織試料は、単一のバイオマーカーの存在について染色され、次いで、訓練組織試料の画像が、イメージングデバイスを使用して取り込まれて分析される（各個々の訓練組織試料中のバイオマーカーの染色強度および／または陽性率が決定されることができるように）。他の実施形態では、各訓練組織試料は、２つ以上のバイオマーカーの存在について染色され、次いで、訓練組織試料の画像は、イメージング装置を使用して取り込まれて分析される（ここでも、２つ以上のバイオマーカーのそれぞれの染色強度および／または陽性率が独立して分析されるように）。２つ以上のバイオマーカーの存在について染色されたそれらの訓練組織試料について、それらの訓練組織試料の取り込まれた画像は、最初に非混合とすることができ、次いで、各非混合画像チャネル画像は、染色強度および／または陽性率が特定の非混合画像チャネル画像に存在する染色信号を評価されることができるように評価されることができる。混合解除方法は、国際公開第２０１９／１１０５８３号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、試料固定および試料内の標的（例えば、タンパク質および／または核酸標的）のマスキング解除のステップを含む、任意の訓練組織検体の調製は、バイオマーカー発現に影響を及ぼすことができる。本明細書の実施例１は、３つの異なるバイオマーカー、すなわち、ＬＬＣ２、ｋｉ－６７、およびＦＯＸＰ３の発現に対する固定時間の影響、特に、測定された陽性率に対する固定時間の影響を示す（図９Ａ～図９Ｄも参照）。同様に、図２０～図２２は、これらの同じ３つのバイオマーカーの染色強度に対する固定時間の影響を示している。
本明細書の実施例２は、同様に、ｋｉ－６７バイオマーカーまたはＣ４ｄバイオマーカーの発現に対するマスキング解除の質の影響を示す。実施例２にさらに記載されるように、異なるバイオマーカーは、マスキング解除処理の増加に対して異なる応答を示すことができることが示された。例えば、染色強度および標識された細胞の数におけるＣ４ｄから、その後の強度および陽性度が低下する時点までである。逆に、ｋｉ６７は、さもなければ生物学的検体を損傷するであろうマスキング解除条件下であっても、飽和が生じるまで適用されたマスキング解除プロセスの期間を通じて強度および陽性の増加を続ける（例えば、図１５のドットおよび関連する組織画像を参照）。
上記を考慮すると、いくつかの実施形態では、訓練振動スペクトルデータセットは、以下に説明するように、別個に固定および／または別個にマスキング解除された訓練組織試料を含むことができる。このようにして、バイオマーカー発現推定エンジンは、異なる固定および／またはマスキング解除状態の連続体にまたがる訓練スペクトルデータによって訓練されることができ、その結果、バイオマーカー発現推定エンジンは、試験生物学的検体の実際の固定および／またはマスキング解除状態に関係なく、および／または試験生物学的検体の固定および／またはマスキング解除状態が既知であるか未知であるかに関係なく、染色されていない試験生物学的検体内の１つ以上のバイオマーカーの発現を決定することができる。
いくつかの実施形態では、訓練生物学的検体は差次的に固定される。差次的固定は、複数の訓練組織試料の各訓練組織試料（上記のようにそれぞれ単一の訓練生物学的検体に由来する）が異なる固定プロセスを受けるプロセスである。いくつかの実施形態では、任意の訓練組織試料は、任意の所定の時間、例えば、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間などの間固定されてもよい。この点に関して、複数の訓練組織試料は、それぞれ、異なる程度などに部分的に固定されてもよい（例えば、試料が「完全に固定」または「十分に固定」と見なされるのに十分な期間、固定剤で処理されない）。さらに、訓練組織試料のセットは、固定されていない組織試料（例えば、０時間の固定）を含むことができる。
いくつかの実施形態では、訓練生物学的検体は、差次的にマスキングされていない。差次的固定は、複数の訓練組織試料の各訓練組織試料（それぞれ、上記のように単一の訓練生物学的検体に由来する）が、異なるマスキング解除条件、例えば、異なるマスキング解除試薬、異なるマスキング解除期間、異なるマスキング解除温度、および／または異なるマスキング解除圧力に供されるプロセスである。例えば、いくつかの実施形態では、単一の訓練生物学的検体に由来する複数の訓練試料は、それぞれ同じ温度で、異なる期間にわたってマスキングされない。例えば、単一の訓練生物学的検体に由来する各訓練組織試料は、同じ温度（例えば９８．６℃）でマスキング解除されることができるが、マスキング解除の期間は変化することができる（５分、３０分、６０分など）。
別の例として、および他の実施形態では、単一の訓練生物学的検体に由来する複数の訓練組織試料は、それぞれ同じ期間、異なる温度でマスキングされない。例えば、各訓練組織試料は、同じ期間（例えば１０分）であるが、マスキング解除の温度が変化する場合（９８．６℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃など）、マスキング解除されることができる。いくつかの実施形態では、マスキング解除時間および温度の双方を変えることができる。上述した実施形態のように、第１の組の訓練組織試料は、第１の温度であるが異なる期間でマスキング解除され、第１のセットの訓練組織試料を提供することができる。第２のセットおよび第３のセットの訓練組織試料は、それぞれ第２の温度および第３の温度で、また異なる期間にわたってマスキング解除されることができ、第２および第３のセットの訓練組織試料を提供する。
いくつかの実施形態では、単一の訓練生物学的試料は、複数の訓練組織試料に分割されることができ、複数の訓練組織試料の各個々の訓練組織試料は、（ｉ）同じ所定の期間（例えば１２時間）固定されることができるが、（ｉｉ）差次的にマスキング解除されることができる。いくつかの実施形態では、個々の組織試料は、それぞれ、「十分な」または「完全な」固定を提供する期間固定されることができる。これが図５Ａに示される。
例として、再び図５Ａを参照すると、「所定の固定１」は、１２時間の固定期間とすることができる。「染色剤１」は、訓練組織試料に適用された１つ以上の染色を指すことができる。一方、「マスキング解除条件１、２、３、および４」は、それぞれ、１０分間の期間を有することができるが、マスキング解除温度は、それぞれ変化し、例えば、それぞれ９８．６℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃である。図５Ａは、訓練スペクトルデータの単一のセットの作成および取得を示しているが、複数の追加の訓練スペクトルデータセットを同様に作成および取得することができるが、固定期間、マスキング解除条件、適用される染色、組織の種類などのいずれかが変化する。
さらに他の実施形態では、単一の訓練生物学的試料は、訓練組織試料の２つのセットに分割されてもよく、訓練組織試料の各異なるセットは、複数の個々の訓練組織試料を含む。この特定の例に続いて、第１のセットの訓練組織試料は、それぞれ、「十分に固定」と見なされる試料を提供する期間にわたって固定されることができる。次いで、第１のセットの訓練組織試料内の個々の訓練組織試料のそれぞれが、差次的にマスキング解除されることができる。同様に、第２のセットの訓練組織試料は、それぞれ、「固定が不十分」と見なされる試料を提供する期間にわたって固定されることができる。次いで、第２のセットの訓練組織試料内の個々の訓練組織試料のそれぞれが、差次的にマスキング解除されることができる。これが図５Ｂに示される。
他の実施形態では、単一の訓練生物学的試料は、複数の訓練組織試料に分割されることができ、複数の訓練組織試料の各個々の訓練組織試料は、（ｉ）差次的に固定（例えば１２時間）されることができるが、（ｉｉ）同じマスキング解除条件下でマスキング解除されることができる。これが図５Ｃに示される。いくつかの実施形態では、マスキング解除条件は、固定の期間、ならびに利用される組織の種類およびマスキング解除試薬を考慮すると、試料「十分に」をマスキング解除されると見なされる条件とすることができる。
いくつかの実施形態では、固定プロセスの長さは、任意のマスキング解除プロセス（例えば、より長い期間にわたって固定された試料には、より長いマスキング解除時間が必要とされることができる）で利用される条件における決定要因とすることができる。したがって、なおさらなる実施形態では、単一の訓練生物学的試料は、複数の訓練組織試料セットに分割されてもよく、各異なるセットの訓練組織試料は、複数の個々の訓練組織試料を含み、訓練組織試料の各異なるセットは、異なる期間にわたって固定される。
所定の期間にわたって固定された各異なる訓練組織試料セット内で、各個々の訓練組織試料は、図５Ｄに示すように、差次的にマスキング解除されることができる。このようにして、これらの差次的に固定された訓練組織試料のそれぞれは、各試料「十分に」をマスキング解除される所定の時間量および所定の条件下でマスキング解除されることができる。換言すれば、各差次的に固定された試料は、特定の時間量および設定条件下でマスキング解除されて、その特定の訓練組織試料「十分に」をマスキング解除されることができる。次いで、各訓練組織試料は、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色されることができる。
図５Ｅは、未知の時間量にわたって固定された訓練生物学的検体から１つ以上の訓練スペクトルデータセットを取得するプロセスを示すフローチャートを記載している。ここで、訓練生物学的検体が分割され、差次的にマスキング解除され、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される。次いで、得られた染色された訓練組織試料がイメージングされ、細胞を検出および／または分類され、次いで、各訓練組織試料について振動スペクトルが取得される。結果として得られるデータ（例えば、画像、クラス標識、振動分光データなど）セットは、後の検索のためにサーバまたは他の記憶装置に記憶されてもよい。これらの方法は、実施例３にさらに記載されている。出願人は、未知の固定時間を有する生物学的検体を訓練することさえも、バイオマーカー発現推定エンジンを訓練するのに有益であることを発見した。実際、図１５および図１６に示され、実施例３に記載されるように、バイオマーカー発現推定エンジンは、未知の固定期間を有する訓練生物学的検体に由来する訓練スペクトルデータセットのみで訓練され、試験生物学的検体中の１つ以上のバイオマーカーの高精度な推定を可能にする。
１つ以上のバイオマーカーの存在について染色された差次的に調製された試料からスペクトルデータを取得するプロセスが図６に示されている。上記のように、まず、１つ以上の訓練生物学的検体が取得される（ステップ４１０）。次いで、１つ以上の訓練生物学的検体のそれぞれは、少なくとも２つの部分に分割される（ステップ４２０）。このようにして、１つ以上の訓練生物学的検体のそれぞれは、少なくとも２つの「訓練組織試料」を提供する。これらの訓練組織試料のそれぞれは、別個に調製されてもよく、例えば、それぞれが別個に固定および／または別個にマスキング解除されてもよい（ステップ４３０）。少なくとも２つの訓練組織試料の差次的調製後、少なくとも２つの訓練組織試料のそれぞれは、タンパク質および／または核酸バイオマーカーを含む１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される（ステップ４３５）。染色に続いて、少なくとも２つの差次的に調製され、染色された訓練組織試料のそれぞれにおける複数の領域が識別される（ステップ４４０）。
次に、複数の識別された領域のうちの識別された領域のそれぞれについて、少なくとも１つの振動スペクトルが取得される（ステップ４５０）。各識別された領域（または以下にさらに説明されるようなそのさらなる処理された変形）から取得された各振動スペクトルの平均が計算されて、その訓練試料の平均振動スペクトルを提供する（ステップ４６０）。ステップ４００から４６０は、複数の異なる訓練生物学的検体について繰り返されてもよい（点線４７０を参照）。いくつかの実施形態では、記憶モジュール２４０などに、全ての訓練生物学的検体からの全ての訓練組織試料からの平均振動スペクトル「訓練スペクトルデータセット」が記憶される（ステップ４８０）。このようにして、訓練スペクトルデータまたは訓練スペクトルデータセットは、バイオマーカー発現推定エンジン２１０の訓練のために訓練モジュール２１１によって記憶モジュール２４０から取得されることができる。全ての訓練試料からの平均振動スペクトルを記憶することに加えて、記憶モジュール２４０はまた、平均振動スペクトルに関連する任意のクラス標識（例えば、１つ以上のバイオマーカーの実際に測定された発現（病理学者によって評価されるか、または１つ以上の画像分析アルゴリズムを使用して決定される）、マスキング解除状態、固定状態など）を記憶するように適合される。
訓練生物学的検体を調製し、そのような検体からスペクトルデータを取得するための上述したプロセスは、複数の異なる訓練生物学的検体について繰り返されてもよく（ステップ４７０を参照）、複数の異なる訓練生物学的検体のそれぞれは、同じ組織タイプであってもよく、または異なる組織タイプ（例えば、扁桃組織または乳房組織）であってもよい。本明細書の実施例セクションでは、バイオマーカー発現推定エンジン２１０の訓練に使用するための訓練生物学的検体の調製方法およびスペクトルデータの取得をさらに説明する。
いくつかの実施形態では、記憶モジュール２４０に記憶された取得スペクトルデータは、「試験スペクトルデータ」を含む。いくつかの実施形態では、試験スペクトルデータは、対象（例えば、ヒト患者）に由来する検体などの試験生物学的検体に由来し、試験生物学的検体は、組織学的検体、細胞学的検体、またはそれらの任意の組み合わせとすることができる。いくつかの実施形態では、試験スペクトルデータは、染色されていない試験片に由来する。他の実施形態では、試験スペクトルデータは、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色された生物学的検体に由来する。
図７を参照すると、試験生物学的検体が取得されることができ（ステップ５１０）、次いで、試験生物学的検体内の複数の空間領域が識別されることができる（ステップ５２０）。各識別された領域について少なくとも１つの振動スペクトルが取得されることができる（ステップ５３０）。次いで、全ての領域から取得した振動スペクトルが補正され、正規化され、平均化され、試験生物学的検体の平均振動スペクトル（「試験スペクトルデータ」）を提供することができる。本明細書にさらに説明するように、試験スペクトルデータは、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン２１０に供給され、試験生物学的検体内の１つ以上のバイオマーカーの発現を予測することができる。次いで、１つ以上のバイオマーカーの予測発現は、下流プロセスまたは下流の意思決定、例えば試料のスコアリングに使用されることができ、スコア化された試料が使用されて処置選択肢を導くことができる。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は、未知の時間量の間固定され、および／または未知の条件下でマスキングされていない。
上述したように、スペクトルデータが訓練または試験生物学的検体から取得されるかどうかにかかわらず、例えば試料の空間的不均一性を説明するために、各生物学的検体について複数の振動スペクトルが取得される。いくつかの実施形態では、スペクトル処理モジュール２１２は、取得された各振動透過スペクトルを振動吸収スペクトルに変換するために最初に利用される。いくつかの実施形態では、透過スペクトルおよび吸光度スペクトルは、式吸光度＝ｌｎ（ブランク透過／組織を通る透過）を介して直接関連しており、したがって、取得された透過スペクトルは、吸収スペクトルに変換されることができる。
振動スペクトルの全てが透過から吸光度に変換されると、いくつかの実施形態では、スペクトル処理モジュール２１２は、様々な領域の全てから取得されたスペクトルの全てを平均化し、それは下流分析、例えばバイオマーカー発現の訓練または予測に使用される平均化された振動スペクトルである。いくつかの実施形態では、図８を参照すると、複数の空間領域のそれぞれから取得された振動スペクトルは、それらの平均化の前に最初に正規化および／または補正される。いくつかの実施形態では、各領域からの振動スペクトルは、補正された振動スペクトルを提供するために個別に補正される（ステップ６２０）。例えば、補正は、大気効果について各取得振動スペクトルを補正すること（ステップ６３０）と、次いで散乱について各大気補正振動スペクトルを補正すること（ステップ６４０）とを含むことができる。次いで、各補正された振動スペクトルは、検体の厚さおよび組織密度の差を緩和するために、例えば最大値２に正規化される（ステップ６５０）。続いて、振幅正規化スペクトルの集合が平均化される（ステップ６６０）。
バイオマーカー発現推定エンジン
本開示のシステムおよび方法は、機械学習技術を使用してスペクトルデータをマイニングする。訓練モードのバイオマーカー発現推定エンジンの場合、バイオマーカー発現推定エンジンは、複数の取得および処理された訓練振動スペクトル（記憶モジュール２４０内に記憶された訓練振動スペクトルなど）から特徴を学習し、それらの学習された特徴を訓練スペクトルに関連するクラス標識（例えば、１つ以上のバイオマーカーの既知のバイオマーカー発現、既知のマスキング解除温度、既知のマスキング解除持続時間、組織の質など）と相関させることができる。訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンの場合、訓練されたバイオマーカー発現エンジンは、染色されていない試験生物学的検体からバイオマーカー発現特徴を導出し、学習されたデータセットに基づいて、導出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて染色されていない試験生物学的検体内の１つ以上のバイオマーカーの発現を予測することができる。
機械学習は、一般に、明示的にプログラムされることなく学習する能力をコンピュータに提供する一種の人工知能（ＡＩ）として定義されることができる。機械学習は、新たなデータにさらされたときに成長および変化することを自らに教えることができるコンピュータプログラムの開発に焦点を合わせている。換言すれば、機械学習は、コンピュータに明示的にプログラムされることなく学習する能力を与えるコンピュータ科学のサブフィールドとして定義されることができる。
機械学習は、データから学習し、データ上で予測を行うことができるアルゴリズムの研究および構築を探求し、そのようなアルゴリズムは、試料入力からモデルを構築することによって、データ駆動予測または決定を行うことによって厳密に静的なプログラム命令にしたがうことを克服する。本明細書に記載の機械学習は、Ｓｕｇｉｙａｍａ、Ｍｏｒｇａｎ Ｋａｕｆｍａｎｎによる 「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ」、２０１６、５３４ページ；「Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ，ａｎｄ Ｉｍｉｔａｔｉｖｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ」、Ｊｅｂａｒａ，ＭＩＴ Ｔｈｅｓｉｓ、２００２、２１２ページ；および「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ）」、Ｈａｎｄら、ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ、２００１、５７８ページに記載されているようにさらに実行されることができ、これらは、本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。本明細書に記載の実施形態は、これらの参考文献に記載されているようにさらに構成されることができる。
いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、試験生物学的検体に由来する試験スペクトルのバイオマーカー発現を予測するタスクのために「教師あり学習」を使用する。教師あり学習は、例示的な入出力対に基づいて入力を出力にマッピングする関数を学習する機械学習タスクである。これは、訓練例のセット（ここでは訓練スペクトル）からなる標識付き訓練データ（ここで、バイオマーカー発現は、訓練スペクトルデータに関連する標識である）から関数を推論する。教師あり学習では、各例は、入力オブジェクト（典型的にはベクトル）と所望の出力値（監視信号とも呼ばれる）とからなるペアである。教師あり学習アルゴリズムは、訓練データを分析し、新たな例をマッピングするために使用されることができる推測関数を生成する。最適なシナリオは、アルゴリズムが見えないインスタンスのクラス標識を正しく決定することを可能にする。
バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、当業者に知られている任意の種類の機械学習アルゴリズムを含むことができる。適切な機械学習アルゴリズムは、回帰アルゴリズム、類似度ベースのアルゴリズム、特徴選択アルゴリズム、正則化方法ベースのアルゴリズム、決定木アルゴリズム、ベイジアンモデル、カーネルベースのアルゴリズム（例えば、サポートベクターマシン）、クラスタリングベースの方法、人工ニューラルネットワーク、深層学習ネットワーク、アンサンブル方法、および次元縮小方法を含む。適切な次元縮小方法の例は、主成分分析（主成分分析および判別分析など）および潜在構造回帰への投影を含む。
いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、主成分分析を利用する。主成分分析（ＰＣＡ）の主なアイデアは、データセットに存在する変動を最大限まで保持しながら、互いに相関する多くの変数からなるデータセットの次元を縮小することである。同じことが、変数を新たな変数のセットに変換することによって行われ、これらは、主成分（または単に、ＰＣ）として知られており、元の変数に存在する変動の保持が、それらが順序を下って移動するにつれて減少するように直交して並べられる。このようにして、第１の主成分は、元の成分に存在していた最大の変動を保持する。主成分は、共分散行列の固有ベクトルであるため、直交する。主成分分析およびそれを使用する方法は、米国特許出願公開第２００５／０１２３２０２号明細書ならびに米国特許第６，８９４，６３９号明細書および米国特許第８，５６５，４８８号明細書に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＰＣＡおよび線形判別分析は、Ｋｈａｎら、「Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ－Ｌｉｎｅａｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」、ＩＪＣＳＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｓｓｕｅｓ，Ｖｏｌ．８，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｎｏ．２，２０１１年１１月によってさらに記載されており、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、潜在構造回帰（ＰＬＳＲ）への投影を利用する。ＰＬＳＲは、ＰＣＡと多重線形回帰との特徴を組み合わせて一般化する技術である。その目的は、独立変数または予測子のセットから従属変数のセットを予測することである。この予測は、予測器から、最良の予測力を有する潜在変数と呼ばれる直交因子のセットを抽出することによって達成される。これらの潜在変数を使用して、ＰＣＡディスプレイに似たディスプレイを作成することができる。ＰＬＳ回帰モデルから得られた予測の品質は、ブートストラップおよびジャックナイフなどの交差検証技術で評価される。ＰＬＳ回帰には２つの主な変形がある。最も一般的なものは、従属変数と独立変数の役割を分離する。第２のものは、従属変数および独立変数に同じ役割を与える。ＰＬＳＲは、Ａｂｄｉ、「Ｐａｒｔｉａｌ Ｌｅａｓｔ Ｓｑｕａｒｅｓ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｌａｔｅｎｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（ＰＬＳ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）」、ＷＩＲＥｓ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２０１０によってさらに記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供される実施例セクションは、ＰＬＳＲに基づく訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを説明し、ＰＬＳＲベースの訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン２１０を使用して、バイオマーカー発現レベルの少なくとも定量的な推定値を提供することができることを示す。
いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、Ｔ分布確率的近隣埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）を利用する。Ｔ－ＳＮＥは、２次元または３次元の低次元空間に視覚化のための高次元データを埋め込むのに適した非線形次元縮小技術である。具体的には、類似オブジェクトが近くのポイントでモデル化され、非類似オブジェクトが遠くのポイントでモデル化される確率が高くなるように、各高次元オブジェクトを２次元または３次元のポイントでモデル化する。
ｔ－ＳＮＥアルゴリズムは、２つの主要な段階を含む。第一に、ｔ－ＳＮＥは、類似のオブジェクトがピッキングされる確率が高く、非類似のポイントがピッキングされる確率が非常に低いように、高次元オブジェクトのペアにわたる確率分布を構築する。第二に、ｔ－ＳＮＥは、低次元マップ内のポイントにわたって同様の確率分布を定義し、マップ内のポイントの位置に関して２つの分布間のＫｕｌｌｂａｃｋ－Ｌｅｉｂｌｅｒ発散を最小化する。元のアルゴリズムは、その類似度メトリックのベースとしてオブジェクト間のユークリッド距離を使用するが、これは適切に変更されるべきであることに留意されたい。Ｔ－ＳＮＥは、国際公開第２０１９／０８４６９７号および米国特許出願公開第２０１８／０３５６９４９号明細書および米国特許出願公開第２０１８／０３４０８９０号明細書にさらに記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、強化学習を利用する。強化学習（ＲＬ）は、エージェントがその前の行動を評価するために次の時間ステップにおいて遅延報酬を受け取る機械学習方法の一種である。換言すれば、ＲＬは、累積報酬の概念を最大化するためにソフトウェアエージェントが環境内でどのように行動を起こすべきかに関するモデルなし機械学習パラダイムである。典型的には、ＲＬ設定は、２つの構成要素、エージェント、および環境から構成される。環境は、エージェントが作用しているオブジェクトを指し、エージェントは、ＲＬアルゴリズムを表す。環境は、エージェントに状態を送信することによって開始し、次いで、エージェントは、その知識に基づいてその状態に応答してアクションを実行する。その後、環境は、次の状態と報酬のペアをエージェントに送り返す。エージェントは、その最後の行動を評価するために、環境によって返された報酬でその知識を更新する。ループは、環境が終端状態を送信するまで継続し、これはエピソードまで終了する。強化学習アルゴリズムは、米国特許第１０，２７９，４７４号明細書および米国特許第７，３９５，２５２号明細書にさらに記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムは、サポートベクターマシン（「ＳＶＭ」）である。一般に、ＳＶＭは、非線形入力データセットが非線形の場合のカーネルを介して高次元線形特徴空間に変換される統計的学習理論に基づく分類技術である。サポートベクターマシンは、カーネル関数Ｋによって、２つの異なるクラスを表す訓練データＥのセットを高次元空間に投影する。この変換されたデータ空間において、非線形データは、クラス分離を最大化するようにクラスを分離するためにフラットラインを生成することができるように変換される（識別超平面）。次いで、試験データは、Ｋを介して高次元空間に投影され、試験データ（以下に列挙される特徴またはメトリックなど）は、それらが超平面に対してどこに位置するかに基づいて分類される。カーネル関数Ｋは、データを高次元空間に射影する方法を定義する。
いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、ニューラルネットワークを含む。いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークは、深層学習ネットワークとして構成される。一般的に言えば、「深層学習」は、データ内の高レベル抽象化をモデル化しようと試みるアルゴリズムのセットに基づく機械学習の分野である。深層学習は、データの表現を学習することに基づく機械学習方法の広範なファミリの一部である。観測は、ピクセルごとの強度値のベクトルなどの多くの方法で、またはエッジのセット、特定の形状の領域などとしてより抽象的な方法で表されることができる。いくつかの表現は、学習タスクを単純化する点で他の表現よりも優れている。深層学習の約束の１つは、ハンドクラフトされた特徴を、教師なしまたは半教師付き特徴学習および階層的特徴抽出のための効率的なアルゴリズムに置き換えることである。
いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークは、生成的ネットワークである。「生成的」 ネットワークは、一般に、本質的に確率的であるモデルとして定義されることができる。換言すれば、「生成的」 ネットワークは、フォワードシミュレーションまたはルールベースの手法を実行するものではない。代わりに、生成的ネットワークは、適切な訓練データのセット（例えば、複数の訓練スペクトルデータセット）に基づいて学習されることができる（そのパラメータを学習することができるという点で）。いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークは、深層生成的ネットワークとして構成される。例えば、ネットワークは、ネットワークが複数のアルゴリズムまたは変換を実行する複数の層を含むことができるという点で、深層学習アーキテクチャを有するように構成されることができる。
いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークは、オートエンコーダを含む。オートエンコーダニューラルネットワークは、逆伝播を適用する教師なし学習アルゴリズムであり、目標値を入力と等しくなるように設定する。オートエンコーダの目的は、信号「ノイズ」を無視するようにネットワークを訓練することによって、典型的には次元縮小のために、データセットの表現（符号化）を学習することである。縮小側と共に、再構成側が学習され、オートエンコーダは、縮小された符号化からその元の入力に可能な限り近い表現を生成しようと試みる。オートエンコーダに関する追加情報は、ｈｔｔｐ：／／ｕｆｌｄｌ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｔｕｔｏｒｉａｌ／ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ／Ａｕｔｏｅｎｃｏｄｅｒｓ／に見出すことができ、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークは、世界を訓練するために供給されたデータに従って世界をモデル化する重みのセットを有する深層ニューラルネットワークであってもよい。ニューラルネットワークは、典型的には複数の層からなり、信号経路は、層の間を前後に横切る。この目的のために、任意のニューラルネットワークが実装されることができる。適切なニューラルネットワークは、ＬｅＮｅｔ、ＡｌｅｘＮｅｔ、ＺＦｎｅｔ、ＧｏｏｇＬｅＮｅｔ、ＶＧＧＮｅｔ、ＶＧＧ１６、ＤｅｎｓｅＮｅｔ、およびＲｅｓＮｅｔを含む。いくつかの実施形態では、Ｌｏｎｇら、「Ｆｕｌｌｙ Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｆｏｒ Ｓｅｍａｎｔｉｃ Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ（ＣＶＰＲ），２０１５ ＩＥＥＥ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，２０１５年６月（ＩＮＳＰＥＣ受託番号：１５５２４４３５）に記載されているような、完全畳み込みニューラルネットワークが利用され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークは、ＡｌｅｘＮｅｔとして構成される。例えば、分類ネットワーク構造は、ＡｌｅｘＮｅｔとすることができる。「分類ネットワーク」という用語は、本明細書では、１つ以上の完全接続層を含むＣＮＮを指すために使用される。一般に、ＡｌｅｘＮｅｔは、いくつかの畳み込み層（例えば、５つ）と、それに続く、データを分類するように組み合わせて構成および訓練されたいくつかの完全接続層（例えば、３つ）とを含む。
他の実施形態では、ニューラルネットワークは、ＧｏｏｇｌｅＮｅｔとして構成される。ＧｏｏｇｌｅＮｅｔアーキテクチャは、（特に本明細書に記載のいくつかの他のニューラルネットワークと比較して）比較的多数の層を含むことができるが、層のいくつかは、並列に動作することができ、互いに並列に機能する層のグループは、一般に、開始モジュールと呼ばれる。他の層が順次動作してもよい。したがって、ＧｏｏｇｌｅＮｅｔは、層の全てが順次構造に配置されているわけではないという点で、本明細書に記載の他のニューラルネットワークとは異なる。ＧｏｏｇｌｅＮｅｔとして構成されたニューラルネットワークの例は、参照により本明細書に完全に記載されているかのように組み込まれる、Ｓｚｅｇｅｄｙらによる「Ｇｏｉｎｇ Ｄｅｅｐｅｒ ｗｉｔｈ Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎｓ」、ＣＶＰＲ ２０１５に記載されている。
他の実施形態では、ニューラルネットワークは、ＶＧＧネットワークとして構成される。例えば、分類ネットワーク構造は、ＶＧＧとすることができる。ＶＧＧネットワークは、アーキテクチャの他のパラメータを固定しながら畳み込み層の数を増加させることによって作成された。畳み込み層を追加して深さを増加させることは、全ての層において実質的に小さい畳み込みフィルタを使用することによって可能になる。
他の実施形態では、ニューラルネットワークは、深層残差ネットワークとして構成される。例えば、分類ネットワーク構造は、Ｄｅｅｐ Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＮｅｔまたはＲｅｓＮｅｔとすることができる。本明細書に記載の他のいくつかのネットワークと同様に、深層残差ネットワークは、畳み込み層と、それに続く完全接続層とを含むことができ、それらは組み合わせて、検出および／または分類のために構成および訓練される。深層残差ネットワークでは、層は、参照されていない関数を学習する代わりに、層入力を参照して残差関数を学習するように構成される。特に、いくつかの積層された各層が所望の基礎となるマッピングに直接適合することを望む代わりに、これらの層は、ショートカット接続を有するフィードフォワードニューラルネットワークによって実現される残差マッピングに明示的に適合することが可能にされる。ショートカット接続は、１つ以上の層をスキップする接続である。
深層残差ネットは、畳み込み層を含むプレーンニューラルネットワーク構造を取り、ショートカット接続を挿入することによって作成されることができ、それによってプレーンニューラルネットワークを取り、それを残差学習の相手にする。深層残差ネットの例は、参照により本明細書に完全に記載されているかのように組み込まれる、Ｈｅらによる「Ｄｅｅｐ Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」、ＮＩＰＳ ２０１５に記載されている。本明細書に記載のニューラルネットワークは、この参考文献に記載されているようにさらに構成されることができる。
バイオマーカー発現推定エンジン
いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、訓練モードで動作するように適合される。いくつかの実施形態では、訓練モジュール２１１は、任意の適切な訓練アルゴリズムに従って、訓練スペクトルデータをバイオマーカー発現推定エンジン２１０に提供し、バイオマーカー発現推定エンジン２１０をその訓練モードで動作させるように動作することができる。いくつかの実施形態では、訓練モジュール２１１は、バイオマーカー発現推定エンジン２１０と通信しており、訓練スペクトルデータ（または訓練吸光度スペクトルデータのさらなる処理された変形、例えば、訓練スペクトルデータの一次または二次導関数、訓練スペクトルデータ内の個々の帯域の大きさ、訓練スペクトルデータ内の帯域の積分、訓練スペクトルデータ内の２つ以上の帯域強度の比、訓練スペクトルデータの二次および三次導関数からの比など）を受信し、訓練スペクトルデータをバイオマーカー発現推定エンジン２１０に供給するように構成される。
いくつかの実施形態では、訓練モジュール２１１はまた、実際のバイオマーカー発現値（例えば、陽性率、染色強度）を含む訓練スペクトルデータに関連するクラス標識を供給するように適合される。いくつかの実施形態では、訓練スペクトルデータに関連するクラス標識は、実際のバイオマーカー発現値（訓練された病理学者によって確認されたもの、または１つ以上の画像分析アルゴリズムを使用して計算されたものなど）、ならびに染色前の試料調製に関する情報（例えば、固定状態、マスキング解除状態）を含むことができる。
いくつかの実施形態では、訓練アルゴリズムは、（本明細書に記載されるような）既知の訓練振動スペクトルデータのセットおよび（例えば、バイオマーカー発現レベルなどの）既知の出力クラス標識の対応するセットを利用し、入力訓練スペクトルデータの処理が所望の対応するクラス標識を提供するように、バイオマーカー発現推定エンジン２１０内の内部接続を変化させるように構成される。
バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、当業者に公知の任意の方法に従って訓練されることができる。標識の追加の例は、米国特許出願公開第２０１５／０２６８２５５号、同第２０１９／０１０２６７５号、同第２０１５／０３５６４６１号、同第２０１３／０１３２７８６、同第２０１３／０２４００１０号、同第２０１４／０１３４６１６号、および同第２０１９／０１０８３４４号に開示されており、それらの開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。
いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、交差検証法を使用して訓練される。交差検証は、分類器を開発するときにモデル選択および／またはパラメータ調整を支援するために使用されることができる技術である。交差検証は、標識付き事例のセットからの事例の１つ以上のサブセットを試験セットとして使用する。例えば、ｋ倍交差検証では、標識付き事例のセットは、ｋ個の「折り畳み」に等しく分割され、例えば、Ｋ倍交差検証は、機械学習モデルを評価するために使用される再サンプリング手順である。一連の訓練－試験サイクルが実行され、各サイクルにおいて異なる折り畳みが試験セットとして使用され、残りの折り畳みが訓練セットとして使用されるように、ｋ個の折り畳みを反復する。各折り畳みがある時点で試験セットとして使用されるため、標識付きケースのセット内のランダムでない選択されたケースは、交差検証にバイアスをかけるように見える。例えば、５倍交差検証（ｋ＝５）のシナリオでは、データセットは５倍に分割される。第１の反復では、第１の折り畳みが使用されてモデルを試験し、残りが使用されてモデルを訓練する。第２の反復では、第２の倍数が試験セットとして使用され、残りは訓練セットとして機能する。このプロセスは、５つの折り畳みの各折り畳みが試験セットとして使用されるまで繰り返される。閾値処理の追加の方法は、国際公開第２０１４／０２７９７３４号および国際公開第２００５／０２３４７５３号に記載されており、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＰＬＳＲに基づく機械学習アルゴリズムを利用するバイオマーカー発現推定エンジン２１０との関連において、図１３は、ＰＬＳＲモデルが訓練スペクトル内のバイオマーカー発現特徴について振動スペクトルをマイニングするように訓練されることを示している。いくつかの実施形態では、ＰＬＳＲモデルはまた、異なる種類の組織および／または異なる種類の分子（タンパク質、核酸）に対するこれらの特徴の変化を認識するように訓練される。いくつかの実施形態では、ＰＬＳＲアルゴリズムは、振動スペクトルデータ（例えば、吸収スペクトル、一次導関数、二次導関数）を取得し、どの特徴（波長）が応答変数（バイオマーカー発現など）を最も予測するかを決定するために使用されるモデルを作成する。いくつかの実施形態では、生成されたモデルは、性能評価および最適化のために同じ未知の振動スペクトルデータを使用して、性能についてさらに評価されることができる。
主成分分析に基づく機械学習アルゴリズムを利用するバイオマーカー発現推定エンジン２１０との関連において、ＰＣＡは、ＰＣＡ変換行列を生成するためにデフォルト試料サイズの初期訓練データセットに対して実行される。第２のＰＣＡは、初期訓練データセットおよび試験データセットを含む結合データセットに対して実行される。その後、初期訓練データセット内の試料数がインクリメントされて、拡張訓練データセットが生成される。拡張訓練データセットのＰＣＡが実行されて、拡張訓練データセットのＰＣＡ数が初期訓練データセットと同じであるかどうかが判定される。そうである場合、初期試験データセットと拡張試験データセットとの間の誤差は、最終的な解誤差を推定するためにＰＣＡ信号およびＰＣＡ変換行列に基づいて評価される。結合データセットのＰＣＡ行列は、試験データセット推定値を生成するために第１のＰＣＡからの変換行列を使用して初期訓練データセット領域（例えば、スペクトル領域）に変換し戻される。この方法は、ＰＣＡ数が収束して最終的な誤差目標が達成されるまで、訓練行列のサイズを拡張して反復する。誤差目標に到達すると、識別されたサイズの訓練データセットは、指定された入力パラメータ範囲に含まれる訓練目標機能情報を適切に表す。次いで、機械学習システム（例えば、バイオマーカー発現推定エンジン２１０）は、識別されたサイズの訓練行列で訓練されることができる。閾値処理の追加の方法は、国際公開第２０１７／８，４５２，７１８号および国際公開第２０１８／７，７３４，０８７号に記載されており、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
バイオマーカー発現推定エンジン２１０がニューラルネットワークを含む実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０を訓練するために逆伝播アルゴリズムが使用されることができる。逆伝播は、ネットワークノード間の接続にいくつかのランダムな初期値が与えられ、ネットワークが入力ベクトルのセット（訓練スペクトルデータセット）の対応する出力ベクトルを計算するように操作される反復プロセスである。出力ベクトルは、訓練スペクトルデータセットの所望の出力と比較され、所望の出力と実際の出力との間の誤差が計算される。計算された誤差は、出力ノードから入力ノードに逆伝播され、誤差を低減するためにネットワーク接続重みの値を修正するために使用される。そのような各反復の後、訓練モジュール２１１は、訓練セット全体の総誤差を計算することができ、次いで、訓練モジュール２１１は、別の反復でプロセスを繰り返すことができる。バイオマーカー発現推定エンジン２１０の訓練は、総誤差が最小値に到達すると完了する。所定の反復回数の後に総誤差の最小値に到達しない場合、および総誤差が一定でない場合、訓練モジュール２１１は、訓練プロセスが収束しないと考えることができる。
上述したような複数の差次的に調製された染色された訓練組織試料から導出された取得スペクトルデータを用いた訓練の文脈では、各取得された訓練スペクトルは、１つ以上のバイオマーカー（ここで、１つ以上のバイオマーカーの既知の発現レベルは、本明細書中に記載されるようなクラス標識として役立つ）の既知の発現レベルと関連付けられる。いくつかの実施形態では、また、複数の差次的に調製された染色された訓練組織試料から導出された取得スペクトルデータを用いた訓練の文脈では、各取得訓練スペクトルは、（ｉ）１つ以上のバイオマーカーの既知の発現レベル、および（ｉｉ）既知の試料調製条件および／または試料調製状態（例えば、固定期間、固定品質、マスキング解除条件、マスキング解除状態）に関連付けられることができる。例えば、図４Ｂに示される２つの訓練スペクトルデータセット（セット１および２を示す点線ボックスを参照）は、１つ以上のバイオマーカーの既知の発現レベルおよび任意の追加のクラス標識とともに、バイオマーカー発現推定エンジン２１０の訓練のために訓練モジュール２１１に提供されることができる。
バイオマーカー発現推定エンジン２１０の訓練が完了すると、システム２００は、試験スペクトルデータ内のバイオマーカー発現特徴を検出し、検出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて、染色されていない試験生物学的検体内の１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを推定するように動作する準備が整う。いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、入力データの変動に適応するように定期的に再訓練されることができる。
バイオマーカー発現の推定
上述したようにバイオマーカー発現推定エンジン２１０が適切に訓練されると、それが使用されて、染色されていない試験生物学的検体から取得された試験スペクトルデータなどの試験振動スペクトルデータ内のバイオマーカー発現特徴を検出し、検出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて、染色されていない試験生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現を予測することができる。いくつかの実施形態では、図３を参照すると、染色されていない試験生物学的検体が取得され（ステップ３１０）（例えば、特定の疾患を有する疑いがあるか、または特定の疾患を有することが知られている対象から）、次いで、その染色されていない試験生物学的検体から試験振動スペクトルデータが取得される（ステップ３２０）（図７も参照）。いくつかの実施形態では、試験振動スペクトルデータは、吸光度スペクトル、吸光度スペクトルの一次および／または二次導関数、訓練スペクトルデータ内の個々の帯域の大きさ、訓練スペクトルデータ内の帯域の積分、訓練スペクトルデータ内の２つ以上の帯域強度の比、訓練スペクトルデータの二次および三次導関数からの比などを含む。
上述した試験スペクトルデータおよび／またはその変形が取得されて処理されると、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン２１０を使用して、試験スペクトルデータからバイオマーカー発現特徴が導出されることができる（ステップ３４０）。いくつかの実施形態では、導出されたバイオマーカー発現特徴は、各波数が回収状態の予測にどの程度関連するかのマッピングを含む。０に近い値はほとんど有意性がない。いくつかの実施形態では、検出されることができるバイオマーカー発現特徴は、ピーク振幅、ピーク位置、ピーク比、スペクトル値の和（特定のスペクトル範囲にわたる積分など）、勾配の１つ以上の変化（一次微分）または曲率の変化（二次微分）などを含む。導出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて、１つ以上のバイオマーカーの発現の推定値が計算されることができる（ステップ３５０）。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカーの推定発現は、１つ以上のバイオマーカーの染色強度の定量的推定および／または１つ以上のバイオマーカーの陽性率の定量的推定を含み、１つ以上のバイオマーカーの発現の「標識なし」スコアリングを可能にする。
図２３Ａ、図２４Ａおよび図２５Ａは、それぞれ、ＢＣＬ２陽性細胞、ＦＯＸＰ３陽性細胞およびｋｉ－６７陽性細胞の予測された染色強度レベルに対する、ＢＣＬ２陽性細胞（図２３Ａ）、ＦＯＸＰ３陽性細胞（図２４Ａ）およびｋｉ－６７陽性細胞（図２５Ａ）の測定された（実験的な）染色強度レベルを示している。各例において、ＭＩＤ－ＩＲスペクトルを使用して３つのバイオマーカーのそれぞれの染色強度を予測することができた別個のモデルが訓練された（実施例４を参照）。この例では、一次導関数スペクトルが使用され、スペクトルの２つの領域１７５０～２８００ｃｍ－１および３７００～４０００ｃｍ－１が０に設定されたが、理想的な性能を達成するためには各モデルで異なる数の成分が必要であった。
図２３Ａ、図２４Ａおよび図２５Ａのデータから分かるように、本開示の方法は、固定時間にわたって発現強度が有意に変化するにもかかわらず、３つ全てのタンパク質のバイオマーカー強度を予測することができる。図２３Ａ、図２４Ａおよび図２５Ａは、それぞれ、様々な固定期間での１つ以上のバイオマーカーの発現レベル（例えば、ＤＡＢの染色強度などの染色強度レベル）に関するデータで訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン２１０を使用して、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを定量的に予測することができ、これを高精度で行うことができることを示している。図２３Ｂ、図２４Ｂ、および図２５Ｂは、上述したバイオマーカーのそれぞれについての推定および予測されたＤＡＢ染色の累積分布関数（ＣＤＦ）を示している。
図２６Ａ、図２７Ａおよび図２８Ａは、それぞれ、ＦＯＸＰ３（図２７Ａ）、ＢＣＬ２（図２７Ａ）およびｋｉ－６７（図２８Ａ）陽性細胞の測定された（実験的）発現レベル対ＦＯＸＰ３、ＢＬＣ２およびｋｉ－６７陽性細胞の予測発現レベル（陽性率）を示している。図２６Ａ、図２７Ａおよび図２８Ａは、それぞれ、様々な固定期間での１つ以上のバイオマーカーの発現レベルに関するデータで訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン２１０を使用して、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを定量的に予測することができ、これを高精度で行うことができることを示している。図２６Ｂ、図２７Ｂおよび図２８Ｂは、上述したバイオマーカーのそれぞれについての組織陽性の推定および予測されたパーセントについての累積分布関数（ＣＤＦ）を示している。
図１５および図１６は、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン２１０を使用して、未知の固定時間を有する組織試料中の２つの異なるバイオマーカーの発現を決定することによって達成された結果を示している。図１５および図１６は、本明細書中に記載されるシステムおよび方法を使用した２つの異なるバイオマーカー（ｃｄ４およびｌｉｆｅ－６７）の予測された陽性率を、未知の期間にわたって固定された差次的にマスキングされていない試験生物学的検体についての既知の陽性率値（例えば、組織染色および検出および分類アルゴリズムによる分析の後に導出されるなどの実験的に導出された値）と比較して示している。少なくともこれらの図に示すように、バイオマーカー発現推定エンジン２１０は、差次的にマスキングされていない検体（および、試料の固定状態が未知であった場合）にわたるバイオマーカー発現情報を正確に予測することができる。
図１８は、本開示のシステムおよび方法の予測力をさらに示している。実際に、図１８は、未知の固定期間の盲検扁桃試料における全ての時間および温度にわたる訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンの予測精度を示している。全ての試験時間および試験温度にわたって、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、機能的Ｃ４ｄ染色強度を約１０％よりも良好に予測することができた。時間と温度の交点の値は、予測されたＣ４ｄ染色強度と実際のＣ４ｄ染色強度との間のパーセント誤差を示す。
この例では、３つの別個のＰＬＳＲ予測エンジンが訓練された。第１のモデルでは、組織が様々な温度（９８。６℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃）でそれぞれ約５分間取得された。いくつかの組織が訓練セットとして処理された。これは、ＭＩＤ－ＩＲ顕微鏡でイメージングされ、そのデータセットでＰＬＳＲモデルが訓練されたことを意味する。次いで、盲検組織がＭＩＤ－ＩＲ顕微鏡でイメージングされ、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンが使用されて、その組織が染色すると予想されるＣ４ｄ染色の量を計算した。モデルの予測値は、明視野ＤＡＢ画像をデジタル分析することから計算される平均染色強度と比較され、パーセント誤差が、１００＊（ＭＩＤ－ＩＲ予測染色－明視野のグラウンドトゥルース染色）／明視野のグラウンドトゥルース染色として標準的な方法で計算された。
次いで、同じ抗原回収温度であるが、３０分および６０分の回収時間を使用して、このプロセスが繰り返された。したがって、この実施例では、３つの別個のエンジンが訓練されて検証された。上記を考慮して、いくつかの実施形態では、データは、検体からの取得されたＭＩＤ－ＩＲスペクトルのみに基づいて、試料の回収時間および温度に関係なくバイオマーカー染色を決定することができる全体的予測モデルを訓練するために使用されることができる。
バイオマーカー発現推定エンジン２１０がバイオマーカー発現レベルおよび試料調製状態（例えば、固定状態および／またはマスキング解除状態）を含むクラス標識で訓練される実施形態では、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン２１０は、（ｉ）試験片の調製状態に基づく試験片の１つ以上のバイオマーカーの発現レベル（例えば、固定期間）と、（ｉｉ）異なる条件下で調製された同じ試験片の１つ以上のバイオマーカーの予想発現レベル（例えば、異なる期間にわたって固定された試料）との間の予測差を出力としてさらに提供することができる。これは、試験生物学的検体が十分な期間固定されなかったおよび／または適切にマスキング解除されなかった場合に有用とすることができ、したがって、関心対象のバイオマーカーの固定期間および／またはマスキング解除状態が「不十分」と見なされることができると考えられる。いくつかの実施形態では、予測差は、固定期間および／またはマスキング解除状態に基づいて１つ以上のバイオマーカーの発現レベルが増加または減少するように使用されることができ、固定レベルの増加または減少またはマスキング解除状態の変化は下流スコアリングに使用されることができる。
図３０Ａを参照すると、いくつかの実施形態では、システムは、試験生物学的検体の不十分なマスキング解除および／または不十分な固定のために１つ以上のバイオマーカーの予測発現を補正するための動作をさらに含む。例えば、バイオマーカー固定感度曲線が取得されることができる（ステップ９１０）。適切なバイオマーカー固定感度曲線の例が図９Ｄに示されている。そこでは、グラフは、３つの異なるバイオマーカー対固定時間の正規化された陽性率を示し、より具体的には、平均発現が正規化されたスケールにプロットされているため、各バイオマーカー対固定時間の相対的変化を観察することができ、この例のように、得られた予測バイオマーカー発現レベルを補正する際のバイオマーカー固定感度曲線として使用される。
次に、試験生物学的検体の固定時間が取得される（ステップ９１１）。続いて、本開示の訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンが使用されて、試験生物学的検体の予測バイオマーカー発現レベルを取得する（９１２）。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は、染色されていない試験生物学的検体である。ステップ９１３において、試験生物学的検体について取得された予測バイオマーカー発現レベルは、取得された固定感度曲線を使用して固定補償発現レベルを提供するように補正される。図３０Ｂは、実際のバイオマーカー発現レベルが測定され（ステップ９１４）、次いで、取得された固定感度曲線を使用して補償される（ステップ９１５）代替方法を示している。
いくつかの実施形態では、本開示のシステムは、１つ以上の発現スコア（Ｈスコアなど）が出力として受信された予測バイオマーカー発現データに基づいて推定されることができるように、１つ以上のスコアリングモジュールを含むことができる。その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３４７７０２号明細書に開示されているスコアリング方法のいずれかは、バイオマーカー発現スコアを決定するために利用されることができ、バイオマーカー発現値は、本明細書に記載の訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン２１０を使用して推定される。
いくつかの実施形態では、出力として提供される情報は、さらに下流のプロセスで使用されてもよく、試験生物学的検体を１つ以上の特異的結合実体で処理すべきかどうかに関する決定を下すために使用されてもよい。
実施例１
３つの異なるバイオマーカー（ＢＣＬ２、ＦＯＸＰ３、およびｋｉ６７）の発現対固定時間の比較が本明細書で提供される。各固定時間の組織ブロックが各バイオマーカーについて染色され、スライド全体にわたる発現が画像分析アルゴリズムで定量化された（例えば、各染色の発現レベルを定量的に決定するように適合されたもの、例えば、スライド上の組織を最初にセグメント化し、次いで、関心のない組織の領域を決定する自動化されたアルゴリズムなど；次いで、アルゴリズムは、所与のタンパク質バイオマーカーについて組織が陽性であるか陰性であるかを自動的に判定する）。ＢＣＬ２、ｋｉ－６７、およびＦＯＸＰ３について、固定時間に対する箱および箱ひげプロットの形態の要約結果がそれぞれ図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃに表示される。ＢＣＬ２およびＦＯＸＰ３は、それらの発現レベルが固定時間とともに単調に増加することから分かるように、特に不安定であり、不適切な固定を受けやすいことが見出された。
一方、ｋｉ－６７は、生物学的検体をＮＢＦ中で少なくとも１時間固定する限り、不適切な固定に対して比較的堅牢であることが見出された。最後に、これらの３つの図が図９Ｄに要約され、図９Ｄは、３つ全てのバイオマーカーについて２４時間での最大発現に正規化されたスケールで、各バイオマーカーの平均発現レベル対固定時間を示している。
図２０、図２１および図２２を参照すると、染色組織／細胞のバイオマーカー発現レベルがデジタル的に分析され、各バイオマーカーの相対濃度が定量化されたところ、結果は、以下に示され、より長く固定された組織がより強く／より暗く染色する傾向があることを示す。箱ひげプロット対固定時間が再び示される。上記と同様に、ＢＣＬ２およびＦＯＸＰ３は、それらの発現レベルが固定時間とともに単調に増加することから分かるように、特に不安定であり、不適切な固定を受けやすいことが見出された。一方、Ｋｉ－６７は、不適切な固定に対して比較的堅牢であることが見出された。
実施例２
反射赤外研究用のＭｉｒｒＩＲ顕微鏡スライド（オハイオ州チェスターランドのＫｅｖｌｅｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が中間ＩＲスペクトル測定に使用された。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）扁桃組織の４ミクロン連続切片を前処理したＭｉｒｒＩＲスライド上に置いた。扁桃組織の脱パラフィン化を、ＯＰ２１００－０２５に従って手動で行った。簡単に述べると、キシレンステップ後、スライドを、降順のグレードのエタノールを通して水和させ、次いで、ＶＥＮＴＡＮＡ細胞調整１（ＣＣ１）溶液中で急速抗原回収（ＲＡＲ）試験床に移した。
抗原回収は、ヒーターをオンにする前に３０ｐｓｉに予め加圧したＲＡＲチャンバ内のＣＣ１溶液中で行われた。任意の所与の実験の総加熱時間は、９０秒間の上昇時間および２分間の冷却時間を含んだ。抗原回収ステップの後、スライドを脱イオン水で穏やかに洗浄し、室温で風乾した。無傷の扁桃組織を有する乾燥スライドを中間ＩＲ測定に使用した。個々の抗原回収実験の説明は、ＬＮ ＃３６８５（Ｂｏｈｕｓｌａｖ Ｄｖｏｒａｋ）、５２～５９ページおよび６４～６９ページに記載されている。
免疫反応性データを全ての試料について収集し、処理を中間ＩＲ分光法で分析した。簡単に述べると、脱パラフィンおよび抗原回収を手動で行うハイブリッド手順を用いて試料を処理した。脱パラフィン（ｄｅｐａｒ）をキシレンを使用して行い、続いてＯＰ２１００－０２５に従って段階的アルコール系列を通して再水和した。次いで、試料をＣＣ１（カタログ番号：９５０－１２４）に入れた。抗原回収後、過酸化物阻害剤から対比染色までのその後の処理ステップのために、試料を反応緩衝液（カタログ番号９５０－３００）中でＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＵＴＬＲＡ装置に移した。
ここに提示される研究では、扁桃試料をＫｉ－６７（３０－９）またはＣ４ｄ（ＳＰ９１）に対して生じた抗血清で標識した。これらのマーカーは、増加する抗原回収処理に対して異なる応答を示すために選択した。Ｋｉ－６７は、染色強度および標識された細胞の数が増加し、その後、強度および陽性が減少することが見出された。
逆に、Ｃ４ｄは、そうでなければ試料に損傷を与える抗原回収条件を介して強度および陽性が増加し続けることが発見された。Ｃ４ｄは、現在の回収方法で処理した場合には性能が低いが、高温抗原回収で処理した場合には明らかな免疫反応性を示すため、さらに選択した（この挙動は、急速抗原回収からの染色品質の改善と題されたＤ０８１９７３の補遺に詳細に記載されている）。
実施例３－訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用したバイオマーカー発現の推定
要約
この実験は、組織学的組織切片における分子の振動状態を調べるために中赤外（中間ＩＲ）分光法を利用した。この研究では、差次的に回収された扁桃組織に起因する中間ＩＲスペクトルの変化を研究し、バイオマーカー発現推定エンジンを訓練するために使用した。中間ＩＲスペクトルの特定されたシフトは、Ｋｉ－６７およびＣ４ｄタンパク質の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色と相関していた。
序文
中赤外分光法（ＭＩＤ－ＩＲ）は、組織内の個々の分子の振動状態をプローブする強力な光学技術であり、タンパク質の立体配座状態に非常に敏感である。内因性および外因性材料の存在およびさらには立体配座状態は、生物学的検体の中間ＩＲ吸収プロファイルの変化を通じて明らかになるため、この極端な感度は、中間ＩＲ分光法を顕微鏡用途に理想的に適合させる。振動分光法は、例えば健康な組織と癌性組織とを区別するための診断用途にも使用されている。
方法および材料
取得手順
反射赤外研究用のＭｉｒｒＩＲ顕微鏡スライド（オハイオ州チェスターランドのＫｅｖｌｅｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が中間ＩＲスペクトル測定に使用された。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）扁桃組織の４ミクロン連続切片を前処理したＭｉｒｒＩＲスライド上に置いた。扁桃組織の脱パラフィン化を、ＯＰ２１００－０２５に従って手動で行った。簡単に述べると、キシレンステップ後、スライドを、降順のグレードのエタノールを通して水和させ、次いで、ＶＥＮＴＡＮＡ細胞調整１（ＣＣ１）溶液中で急速抗原回収（ＲＡＲ）試験床に移した。
抗原回収ステップは、ヒーターをオンにする前に３０ｐｓｉに予め加圧したＲＡＲチャンバ内のＣＣ１溶液中で行われた。任意の所与の実験の総加熱時間は、９０秒間の上昇時間および２分間の冷却時間を含んだ。抗原回収ステップの後、スライドを脱イオン水で穏やかに洗浄し、室温で風乾した。無傷の扁桃組織を有する乾燥スライドを中間ＩＲ測定に使用した。個々の抗原回収実験の説明は、ＬＮ ＃３６８５（Ｂｏｈｕｓｌａｖ Ｄｖｏｒａｋ）、５２～５９ページおよび６４～６９ページに記載されている。
ＩＨＣ染色および定量
免疫反応性データを全ての試料について収集し、処理を中間ＩＲ分光法で分析した。これらの試料は、Ｄ０８１９７３急速抗原回収産物およびプロセス可能性報告に詳細に記載されている方法を用いて作製した。簡単に述べると、脱パラフィンおよび抗原回収を手動で行うハイブリッド手順を用いて試料を処理した。脱パラフィン（ｄｅｐａｒ）をキシレンを使用して行い、続いてＯＰ２１００－０２５に従って段階的アルコール系列を通して再水和した。次いで、試料をＣＣ１（カタログ番号：９５０－１２４）に入れた。
ＲＡＲ試験床（品番：１０１４３０３００）を使用して、この報告に記載される時間および温度設定で抗原回収を行った。抗原回収後、過酸化物阻害剤から対比染色までのその後の処理ステップのために、試料を反応緩衝液（カタログ番号９５０－３００）中でＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＵＴＬＲＡ装置に移した。
Ｌｅｉｃａ Ａｐｅｒｉｏ ＡＴ２（独国ヌスロッホのＬｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）スライドスキャナを用いて試料スライドをスキャンし、Ａｐｅｒｉｏ Ｉｍａｇｅｓｃｏｐｅソフトウェアと共に供給される「正画素数ｖ９」アルゴリズムを用いて免疫反応性の強度および染色された組織の割合を定量した。各組織について、染色が予想される扁桃組織を含むように関心領域（ＲＯＩ）を選択した。図１０に示すように、いくつかの染色処理で高いバックグラウンドを示したが、他の染色処理では欠けていた結合組織を除外した。
この定量化方法は、試料間で再現可能であり、実験内で比較することができる強度単位を生成する。しかしながら、強度測定値、または病理学者のスコアに報告された陽性画素の割合をマッピングまたは一致させる試みは行われなかった。
中間ＩＲデータの収集
中間ＩＲスペクトルは、付属の光干渉計（Ｖｅｒｔｅｘ ７０）を備えたフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）顕微鏡（Ｂｒｕｋｅｒ Ｈｙｐｅｒｉｏｎｉ ３０００、マサチューセッツ州ビレリカのＢｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ）で収集した。扁桃腺ブロックからの連続切片を４マイクロメートルの厚さで中間ＩＲ反射スライド（Ｋｅｖｌｅｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭｉｒｒＩＲ）上に切片化し、差次的に回収し、中間ＩＲ顕微鏡でイメージングした。
異なる実験条件下で回収した扁桃組織切片をＦＴＩＲ顕微鏡に置き、視野（ＦＯＶ）をラスタスキャンすることによって組織切片全体を可視対物レンズでイメージングした。ＢｒｕｋｅｒソフトウェアＯＰＵＳを使用して、水銀－カドミウム－テルル（ＭＣＴ）検出器を使用して中間ＩＲスペクトルを収集した組織の領域をランダムに選択した。典型的には、各組織試料から２０～８０個のスペクトルを収集した。吸収スペクトルを４ｃｍ－１の分解能で収集し、選択した各ＲＯＩを６４回サンプリングし、これらのスペクトルを一緒に平均して所与の位置の最終スペクトルを得た。例示的な組織画像、サンプリングパターン、および単一のＲＯＩについて得られた平均スペクトルが図１１において以下に示される。全てのスペクトルは、約２００μｍ×２００μｍのＦＯＶを生成する１５×ＩＲ対物レンズを用いて収集された。
中間ＩＲデータの前処理
収集したスペクトルを前処理してアーチファクトを除去し、スペクトルのフォーマットを標準化し、組織の中間ＩＲ吸収を単離した。顕微鏡は、中間ＩＲ透過を直接測定する。透過スペクトルを吸収スペクトルに変換するために、参照透過スペクトルを試料の外側の空間位置で収集し、組織を通して収集されたスペクトルを分割するために使用した。この計算は、組織によって減衰（吸収および散乱）された光の量を提供する。次いで、主に水蒸気および二酸化炭素からの大気吸収を、ＯＰＵＳソフトウェアのアルゴリズムを使用して除去した。次いで、ベースライン補正を使用して、凹状ゴムバンド補正（８反復、６４ベースラインポイント）を使用して組織散乱を補正した。得られたスペクトルは、試料組織による吸収を表す。最後に、全てのスペクトルを最大値２に正規化して、切片厚および組織密度の差を緩和した。
実験設計および結果
一定の抗原回収温度における抗原回収時間の変動
この実験では、抗原回復を９８．６℃で０、１０、３０、６０、または１２０分間のいずれかで扁桃組織に対して行った。各処理を２つ組の試料に対して行った。中間ＩＲスペクトルは、抗原回復処理と緩やかに相関した、アミドＩバンドと呼ばれる一次タンパク質バンドの顕著なシフトを示す。このアミドＩシフトの例が図１２Ａに示されている。アミドＩバンドのピーク波長対半値全幅（ＦＷＨＭ）の定量化は、抗原回収処理を未回収と、部分的、完全および過剰回収（図１２Ｂ）とに経時的に区別することを可能にする。
主成分分析、アミドＩバンドの積分、散乱を補正するためのいくつかのバンドへの正規化、ならびにメチルおよびメチレンピークの定量化を含む複数の他の測定基準を、このプロジェクトを通して評価した。残念なことに、これらの他の測定基準のいずれも、組織の抗原回収状態の層別化のレベルを改善することができなかった。最後に、教師あり機械学習モデルを確立して、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを示す中間ＩＲスペクトルの明白でないシグネチャを利用した。
スペクトルのこれらの小さな差は、潜在構造回帰（ＰＬＳＲ）法への投影を使用して識別された。このアルゴリズムは、中間ＩＲ信号（例えば、吸収スペクトル、一次微分、二次微分）を取得し、どの特徴（波長）が応答変数（抗原回収状況、標的回収状況など）を最も予測するかを決定するために使用されるモデルを作成する。次いで、生成されたモデルを、性能評価および最適化のために同じ未知の中間ＩＲデータを使用して性能について評価した。図１３は、ＰＬＳＲモデルがどのようにして抗原回収シグネチャのための中間ＩＲスペクトルを取得するように訓練されるかを示している。この実験では、モデルの精度は３分であった。
これらの研究は、教師あり機械学習モデルがデータを取得し、扁桃試料中のバイオマーカー発現レベルを決定するために使用されることができるモデルを開発することができることを実証している。モデルが真のバイオマーカー発現シグネチャを認識していることをさらに検証するために、アルゴリズムが訓練されていない一連のスペクトルをモデルに与えて、盲検予測をどれだけうまく行うことができるかを判定した。さらに、ＰＬＳＲモデルは、固定時間が未知の試料について、Ｋｉ－６７およびＣ４ｄタンパク質（図１５および図１６参照）のＩＨＣ染色強度と中間ＩＲスペクトルの差を相関させることができることが実証されている。
抗原回収時間および温度の変動
この研究では、機械学習モデルと組み合わせた中間ＩＲスペクトルを調査して、固定時間が未知であり、マスキング解除条件が変化した試料の１つ以上のバイオマーカー（例えば陽性率；染色強度）の発現を推定するために使用されることができるかどうかを判定した。４つの別個の扁桃組織を有する５つの多組織スライドを９８．６℃から１４０℃の温度で５分間回収した。
３つの扁桃組織（図１７、３つの組織検体を含む丸で囲まれた部分）からの中間ＩＲスペクトルを使用して、ＰＬＳＲモデルを訓練した。次いで、このモデルが使用されて、「未知」扁桃組織における抗原回復条件を推論した（図１７、単一の組織検体のみを含む丸で囲んだ部分）。図１１からの結果は、少なくとも扁桃腺組織において、ＰＬＳＲと結合した中間ＩＲスペクトルが、全ての時間および温度にわたって、未知の試料が回収される程度および未知の試料がＣ４ｄについて染色する程度を正確に定量することができることを実証している。時間および温度が抗原回収に影響を及ぼす２つの最も重要な変数であるため、これは極めて重要である。
実施例４－予測歪み領域または強度モデルの訓練
ＰＬＳＲモデルは、機能的染色データを使用して訓練されることができる。この場合、入力データ（スペクトル）が選択され、キュレートされるプロセスは、固定時間を予測するためにモデルを訓練することと同様である。しかしながら、訓練は異なる。この場合、全てのスライドが明視野スキャナでイメージングされ、デジタル病理アルゴリズムに供給される。有意なタンパク質発現データを得るために、組織の全ての非染色領域（間質、結合組織、孔、重なり合う組織／ひだ）が分析領域のために除去される。タンパク質について陽性であると判定された細胞を識別し、所与のバイオマーカーについて陽性である活性組織の領域をデジタルで定量する。次いで、スライドは、組織の陽性率によって特徴付けられ、これは、実際に染色している潜在的に染色する組織領域の割合を意味する。このプロセスは、全ての組織について繰り返される。次いで、モデルは、以下の２つのプロセスのうちの１つに従って訓練されることができる：
（ａ）所与の固定時間に対する平均バイオマーカー発現。所与の固定時間からの全ての組織は、目的のタンパク質の平均発現をもたらすように訓練される。所与の固定時間の全ての組織が同じ出力（固定時間／品質）について訓練されるため、固定時間の訓練モデルと同様である。長所および短所：ノイズが少なく、平均性能に最適化されたモデルであり、少ないデータで訓練されることができる。
（ｂ）各組織のバイオマーカー発現を個別に使用してモデルが訓練されることができる。例えば、同じ固定時間の２つの組織が異なるバイオマーカー発現を有する場合、それらのスペクトルが個別にマイニングされて、差次的染色を最もよく説明するスペクトル特徴を見つける。利点：より強力で一般化可能なモデル、個々の性能に最適化されたモデルは、大きな訓練セットを必要とした。
機能的染色を決定するための代替方法は、現在染色している細胞間のバイオマーカーの強度を定量することであろう。これは、バイオマーカーについて陽性である細胞／組織の領域を同定し、ＤＡＢ発現をスペクトル的に混合解除してタンパク質濃度に比例する数を得ることによって行われる（あるいは、単に検出器からの生の強度読み取り値を使用して）。強度のこの最終測定値は、組織が所与のタンパク質をどれだけ強く染色するかを予測するために使用されることができるモデルを訓練するために使用されることができる。さらに、病理学者の読み取り値に基づいて染色陽性または強度を予測するようにモデルが訓練されることができる。
バイオマーカーの例
以下に特定されるのは、本開示の検体処理アセンブリ、システム、および方法を使用してマスキング解除されることができるバイオマーカーの非限定的な例である。特定のマーカーは、特定の細胞の性質である一方、他のマーカーは、特定の疾患または状態に関連付けられたものとして特定される。既知の予後マーカーの例は、例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼＩＩ、ニューロン特異的エノラーゼ、プロトンＡＴＰアーゼ－２および酸性ホスファターゼなどの酵素マーカーを含む。ホルモンまたはホルモン受容体マーカーは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、副腎皮質刺激ホルモン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ｇＣ１ｑ－Ｒ／ｐ３３補体受容体、ＩＬ－２受容体、ｐ７５ニューロトロフィン受容体、ＰＴＨ受容体、甲状腺ホルモン受容体およびインスリン受容体を含む。
リンパ系マーカーは、アルファ－１－抗キモトリプシン、アルファ－１－抗トリプシン、Ｂ細胞マーカー、ｂｃｌ－２、ｂｃｌ－６、Ｂリンパ球抗原３６ｋＤ、ＢＭ１（骨髄系マーカー）、ＢＭ２（骨髄系マーカー）、ガレクチン－３、グランザイムＢ、ＨＬＡクラスＩ抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＰ）抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＱ）抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＲ）抗原、ヒト好中球デフェンシン、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、カッパ軽鎖、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、リンパ球／組織球抗原、マクロファージマーカー、ムラミダーゼ（リゾチーム）、ｐ８０未分化リンパ腫キナーゼ、形質細胞マーカー、分泌白血球プロテアーゼ阻害剤、Ｔ細胞抗原受容体（ＪＯＶＩ １）、Ｔ細胞抗原受容体（ＪＯＶＩ ３）、ターミドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、非クラスター化Ｂ細胞マーカーを含む。
腫瘍マーカーは、アルファフェトプロテイン、アポリポタンパク質Ｄ、ＢＡＧ－１（ＲＡＰ４６タンパク質）、ＣＡ１９－９（シアリルルイス）、ＣＡ５０（癌腫関連ムチン抗原）、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）、ＣＡ２４２（腫瘍関連ムチン抗原）、クロモグラニンＡ、クラステリン（アポリポタンパク質Ｊ）、上皮膜抗原、上皮関連抗原、上皮特異的抗原、上皮成長因子受容体、エストロゲン受容体（ＥＲ）、肉眼的嚢胞性疾患流体タンパク質－１５、肝細胞特異的抗原、ＨＥＲ２、ヘレグリン、ヒト胃ムチン、ヒト乳脂肪球、ＭＡＧＥ－１、マトリックスメタロプロテイナーゼ、メランＡ、メラノーママーカー（ＨＭＢ４５）、メソテリン、メタロチオネイン、微小フタル転写因子（ＭＩＴＦ）、Ｍｕｃ－１コア糖タンパク質、Ｍｕｃ－１糖タンパク質、Ｍｕｃ－２糖タンパク質、Ｍｕｃ－５ＡＣ糖タンパク質、Ｍｕｃ－６糖タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ、Ｍｙｆ－３（横紋筋肉腫マーカー）、Ｍｙｆ－４（横紋筋肉腫マーカー）、ＭｙｏＤ１（横紋筋肉腫マーカー）、ミオグロビン、ｎｍ２３タンパク質、胎盤アルカリホスファターゼ、プレアルブミン、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺インヒビンペプチド、ＰＴＥＮ、腎細胞癌マーカー、小腸粘液性抗原、テトラネクチン、甲状腺転写因子－１、マトリックスメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ２の組織阻害剤、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質－１、ビリン、フォンウィルブランド因子、ＣＤ３４、ＣＤ３４、クラスＩＩ、ＣＤ５１ Ａｂ－１、ＣＤ６３、ＣＤ６９、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、クラスピンＣ－ｍｅｔ、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＲＥＢ、サイクリンＤ１、サイトケラチン、サイトケラチン８、ＤＡＰＩ、デスミン、ＤＨＰ（１－６ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン）、Ｅ－カドヘリン、ＥＥＡ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＭＡ（上皮膜抗原）、ＥＲ、ＥＲＢ３、ＥＲＣＣ１、ＥＲＫ、Ｅ－セレクチン、ＦＡＫ、フィブロネクチン、ＦＯＸＰ３、ガンマ－Ｈ２ＡＸ、ＧＢ３、ＧＦＡＰ、ジャイアンチン、ＧＭ１３０、Ｇｏｌｇｉｎ ９７、ＧＲＢ２、ＧＲＰ７８ＢｉＰ、ＧＳＫ３ベータ、ＨＥＲ－２、ヒストン３、ヒストン３＿Ｋ１４－エース［抗アセチル－ヒストンＨ３（Ｌｙｓ １４）］、ヒストン３＿Ｋ１８－エース［ヒストンＨ３－アセチルＬｙｓ １８）、ヒストン３＿Ｋ２７－ＴｒｉＭｅ、［ヒストンＨ３（トリメチルＫ２７）］、ヒストン３＿Ｋ４－ｄｉＭｅ［アンチジメチル－ヒストンＨ３（Ｌｙｓ ４）］、ヒストン３＿Ｋ９－エース［アセチル－ヒストンＨ３（Ｌｙｓ ９）］、ヒストン３＿Ｋ９－ｔｒｉＭｅ［ヒストン３－トリメチルＬｙｓ９］、ヒストン３＿Ｓ１０－Ｐｈｏｓ［抗Ｐｈｏｓｐｈｏ ヒストンＨ３（Ｓｅｒ １０）、有糸分裂マーカー］、ヒストン４、ヒストンＨ２Ａ．Ｘ－５１３９－Ｐｈｏｓ［Ｐｈｏｓｐｈｏ ヒストンＨ２Ａ．Ｘ（Ｓｅｒ１３９）抗体］、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３＿ＤｉＭｅｔｈｙｌ Ｋ４、ヒストンＨ４＿ＴｒｉＭｅｔｈｙｌ Ｋ２０－Ｃｈｉｐ ｇｒａｄ、ＨＳＰ７０、ウロキナーゼ、ＶＥＧＦ Ｒ１、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＧＦ－１レセプタベータ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－ＩＩＲ、ＩＫＢ－Ａｌｐｈａ ＩＫＫＥ、ＩＬ６、ＩＬ８、インテグリンアルファＶベータ３、インテグリンアルファＶベータ６、インテグリンアルファＶ／ＣＤ５１、インテグリンＢ５、インテグリンＢ６、インテグリンＢ８、インテグリンベータ１（ＣＤ ２９）、インテグリンベータ３、インテグリンベータ５インテグリンＢ６、ＩＲＳ－１、Ｊａｇｇｅｄ １、抗プロテインキナーゼＣ Ｂｅｔａ２、ＬＡＭＰ－１、ライトチェーンＡｂ－４（カクテル）、ラムダ軽鎖、カッパ軽鎖、Ｍ６Ｐ、Ｍａｃｈ ２、ＭＡＰＫＡＰＫ－２、ＭＥＫ １、ＭＥＫ １／２（Ｐｓ２２２）、ＭＥＫ ２、ＭＥＫ１／２（４７Ｅ６）、ＭＥＫ１／２ブロッキングペプチド、ＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＧＭＴ、ミトコンドリア抗原、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ９、Ｅ－カドヘリン、ｍＴＯＲ、ＡＴＰａｓｅ、Ｎ－カドヘリン、ネフリン、ＮＦＫＢ、ＮＦＫＢ ｐ１０５／ｐ５０、ＮＦ－ＫＢ Ｐ６５、ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ＯｘＰｈｏｓ複合体ＩＶ、ｐ１３０Ｃａｓ、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ｐ４４／４２ＭＡＰＫ抗体、Ｐ５０４Ｓ、Ｐ５３、Ｐ７０、Ｐ７０ Ｓ６Ｋ、パンカドヘリン、パキシリン、Ｐ－カドヘリン、ＰＤＩ、ｐＥＧＦＲ、ホスホＡＫＴ、ホスホＣＲＥＢ、ホスホＥＧＦ受容体、ホスホＧＳＫ３ベータ、ホスホＨ３、ホスホＨＳＰ－７０、ホスホＭＡＰＫＡＰＫ－２、ＰＨｏｓｐｈｏ ＭＥＫ１／２、ｐｈｏｓｐｈｏ ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ、Ｐｈｏｓｐｈｏ ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ、Ｐｈｏｓｐｈｏ ｐ５３、Ｐｈｏｓｐｈｏ ＰＫＣ、Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｓ６リボソームタンパク質、Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｓｒｃ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｂａｄ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＩＫＢ－ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｍＴＯＲ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＮＦ－カッパＢ Ｐ６５、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ３８、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ７０ Ｓ６キナーゼ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｒｂ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｍａｄ２、ＰＩＭ１，ＰＩＭ２，ＰＫＣβ，ポドカリキシン、ＰＲ、ＰＴＥＮ、Ｒ１、Ｒｂ ４Ｈ１、Ｒ－カドヘリン、リボヌクレオチドレダクターゼ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ１１、ＳＬＣ７Ａ５、ＮＤＲＧ、ＨＴＦ９Ｃ、ＨＴＦ９Ｃ、ＣＥＡＣＡＭ、ｐ３３、Ｓ６リボソームタンパク質、Ｓｒｃ、サバイビン、シナポポディン、シンデカン４、タリン、テンシン、チミジル酸シンターゼ、ツベリン、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ビメンチン、凝集素、ＹＥＳ、ＺＡＰ－７０およびＺＥＢを含む。
細胞周期関連マーカーは、アポトーシスプロテアーゼ作動因子－１、ｂｃｌ－ｗ、ｂｃｌ－ｘ、ブロモデオキシウリジン、ＣＡＫ（ｃｄｋ作動キナーゼ）、細胞アポトーシス感受性タンパク質（ＣＡＳ）、カスパーゼ２、カスパーゼ８、ＣＰＰ ３２（カスパーゼ－３）、ＣＰＰ ３２（カスパーゼ－３）、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＤ３、サイクリンＥ、サイクリンＧ、ＤＮＡ断片化因子（Ｎ末端）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質、Ｆａｓリガンド、Ｆｅｎ－１、ＩＰＯ－３８、Ｍｃ１－１、ミニ染色体維持タンパク質、ミスマッチ修復タンパク質（ＭＳＨ２）、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ、増殖細胞核抗原、ｐ１６タンパク質、ｐ２７タンパク質、ｐ３４ｃｄｃ２、ｐ５７タンパク質（Ｋｉｐ２）、ｐ１０５タンパク質、Ｓｔａｔ１α、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩα、トポイソメラーゼＩＩＩα、トポイソメラーゼＩＩβを含む。
神経組織マーカーおよび腫瘍マーカーは、αＢクリスタリン、α－インターネキシン、αシヌクレイン、アミロイド前駆体タンパク質、βアミロイド、カルビンジン、コリンアセチルトランスフェラーゼ、興奮性アミノ酸輸送体１、ＧＡＰ４３、グリア原線維酸性タンパク質、グルタミン酸受容体２、ミエリン塩基性タンパク質、神経成長因子受容体（ｇｐ７５）、神経芽細胞腫マーカー、神経線維６８ ｋＤ、神経線維１６０ ｋＤ、神経線維２００ ｋＤ、ニューロン特異的エノラーゼ、ニコチン性アセチルコリン受容体アルファ４、ニコチン性アセチルコリン受容体ベータ２、ペリフェリン、タンパク質遺伝子産物９、Ｓ－１００タンパク質、セロトニン、ＳＮＡＰ－２５、シナプシンＩ、シナプトフィシン、タウ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ユビキチンを含む。
クラスター分化マーカーは、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３ｄｅｌｔａ、ＣＤ３ｅｐｓｉｌｏｎ、ＣＤ３ｇａｍｍａ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ８ｂｅｔａ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤｗ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤｗ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤｗ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８ａ、ＣＤｗ１２８ｂ、ＣＤ１３０、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１４９、ＣＤｗ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２，ＣＤ１６３，ＣＤ１６４，ＣＤ１６５，ＣＤ１６６，およびＴＣＲゼータを含む。
他の細胞マーカーは、セントロメアタンパク質－Ｆ（ＣＥＮＰ－Ｆ）、ジアンチン、インボルクリン、ラミンＡ＆Ｃ［ＸＢ １０］、ＬＡＰ－７０、ムチン、核孔複合体タンパク質、ｐ１８０層状体タンパク質、ｒａｎ、ｒ、カテプシンＤ、Ｐｓ２タンパク質、Ｈｅｒ２－ｎｅｕ、Ｐ５３、Ｓ１００、上皮マーカー抗原（ＥＭＡ）、ＴｄＴ、ＭＢ２、ＭＢ３、ＰＣＮＡおよびＫｉ６７を含む。
組織染色
本開示の訓練生物学的検体は、特定のバイオマーカーまたは様々な種類の細胞もしくは細胞区画と直接反応する色素または染色剤、組織化学物質、核酸プローブまたは免疫組織化学物質などの任意の試薬またはバイオマーカーラベルを使用して染色されることができる。そのような組織化学品は、透過型顕微鏡検査法により検出可能な発色団、又は、蛍光顕微鏡検査法により検出可能な発蛍光団であってよい。一般的に、細胞を含む試料は、対象の化学グループに直接反応する、又はそれらと結合する、少なくとも１つの組織化学品を含む溶液を用いて培養され得る。いくつかの組織化学品は、典型的には、染色を可能にする色止め料又は金属を用いて共に培養される。細胞を含む試料は、対象のコンポーネントを染色する少なくとも１つの組織化学品と、対比染色剤として作用し、対象のコンポーネントの外側の領域に結合する別の組織化学品と、の混合物を用いて培養され得る。代替的に、複数のプローブの混合物が、染色において使用され得、これが、特定のプローブの位置を特定する方法を提供する。本開示の訓練生物学的検体は、目的の細胞成分である酵素のための適切な基質および酵素活性部位に着色沈殿物を生じる適切な試薬と共インキュベートされることができる。
免疫組織化学は、最も高感度で特異的な組織化学技術の１つである。本開示の任意の訓練生物学的検体は、特異的結合剤を含む標識結合組成物と組み合わせられることができる。フルオロフォア、または光を吸収するかまたは蛍光を発する生成物を生成する酵素などの様々な標識が使用されることができる。単一の結合事象に関して強い信号を提供する多種多様な標識が知られている。染色に使用される複数のプローブは、２つ以上の識別可能な蛍光標識で標識されることができる。これらの色の違いは、特定のプローブの位置を識別する方法を提供する。フルオロフォアとタンパク質、例えば抗体とのコンジュゲートを調製する方法は、文献に広く記載されており、ここでの例示を必要としない。
研究に使用され、限られた症例では様々な疾患の診断に使用される適切な免疫組織化学染色の例には、例えば、抗エストロゲン受容体抗体（乳癌）、抗プロゲステロン受容体抗体（乳癌）、抗ｐ ５３抗体（多発性癌）、抗Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ抗体（多発性癌）、抗ＥＧＦＲ抗体（上皮成長因子、複数の癌）、抗カテプシンＤ抗体（乳癌および他の癌）、抗Ｂｃｌ－２抗体（アポトーシス細胞）、抗Ｅ－カドヘリン抗体、抗ＣＡ １２５抗体（卵巣癌および他の癌）、抗ＣＡ １５－３抗体（乳癌）、抗ＣＡ １９－９抗体（結腸癌）、抗ｃ－ｅｒｂＢ－２抗体、抗Ｐ－糖タンパク質（ＭＤＲ、多剤耐性）、抗ＣＥＡ抗体（癌胎児性抗原）、抗網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）抗体、抗ｒａｓネオタンパク質（ｐ ２１）抗体、抗Ｘ（ＣＤ １５とも呼ばれる抗Ｋｉ－６７抗体、抗増殖抗体（細胞増殖）、抗ＰＣＮＡ（多発性癌）抗体、抗ＣＤ ３抗体（Ｔ細胞）、抗ＣＤ ４抗体（ヘルパーＴ細胞）、抗ＣＤ ５抗体（Ｔ細胞）、抗ＣＤ ７抗体（胸腺細胞、未成熟Ｔ細胞、ＮＫキラー細胞）、抗ＣＤ ８抗体（サプレッサーＴ細胞）、抗ＣＤ ９／ｐ ２４抗体（ＡＬＬ）、抗ＣＤ １０（ＣＡＬＬＡとも呼ばれる）抗体（一般的な急性リンパ芽球性白血病）、抗ＣＤ １１ ｃ抗体（単球、顆粒球、ＡＭＬ）、抗ＣＤ １３抗体（骨髄単球性細胞、ＡＭＬ）、抗ＣＤ １４抗体（成熟単球、顆粒球）、抗ＣＤ １５抗体（ホジキン病）、抗ＣＤ １９抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ ２０抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ ２２抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ ２３抗体（活性化Ｂ細胞、ＣＬＬ）、抗ＣＤ ３０抗体（活性化Ｔ細胞およびＢ細胞、ホジキン病）、抗ＣＤ ３１抗体（血管新生マーカー）、抗ＣＤ ３３抗体（骨髄系細胞、ＡＭＬ）、抗ＣＤ ３４抗体（内皮幹細胞、間質腫瘍）、抗ＣＤ ３５抗体（樹状細胞）、抗ＣＤ ３８抗体（上皮成長因子、複数の癌）、抗ＣＤ ４１抗体（ＭＤＲ、多剤耐性）、抗ＬＣＡ／ＣＤ ４５抗体（白血球共通抗原）、抗ＣＤ ４５ ＲＯ抗体（胸腺細胞、未成熟Ｔ細胞、ＮＫキラー細胞）、抗ＣＤ ４５ ＲＡ抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ ３９、ＣＤ １００抗体、抗ＣＤ ９５／Ｆａｓ抗体（アポトーシス）、抗ＣＤ ９９抗体（単球、顆粒球、ＡＭＬ）、抗ＣＤ １０６抗体（骨髄単球性細胞、ＡＭＬ）、抗ユビキチン抗体（アルツハイマー病）、抗ＣＤ ７１（トランスフェリン受容体）抗体、抗ｃ－ｍｙｃ（癌タンパク質およびハプテン）抗体、抗サイトケラチン（トランスフェリン受容体）抗体、抗ビメンチン（内皮細胞）抗体（ＢおよびＴ細胞）、抗ＨＰＶタンパク質（ヒトパピローマウイルス）抗体、抗カッパ軽鎖抗体（Ｂ細胞）、抗ラムダ軽鎖抗体（Ｂ細胞）、抗メラノソーム（ＨＭＢ ４５）抗体（黒色腫）、抗前立腺特異抗原（ＰＳＡ）抗体（前立腺癌）、抗Ｓ－１００抗体（成熟単球、顆粒球）、抗タウ抗原抗体（アルツハイマー病）、抗フィブリン抗体（上皮細胞）、抗ケラチン抗体、抗サイトケラチン抗体（腫瘍）、抗アルファ－カテニン（細胞膜）、抗Ｔｎ抗原抗体（活性化Ｂ細胞、ＣＬＬ）；抗－１，８－ＡＮＳ（１－アニリノナフタレン－８－スルホン酸）抗体；抗Ｃ ４抗体；抗２ Ｃ ４ ＣＡＳＰグレード抗体；抗２ Ｃ ４ ＣＡＳＰ抗体；抗ＨＥＲ－２抗体；抗アルファＢクリスタリン抗体；抗αガラクトシダーゼＡ抗体；抗α－カテニン抗体；抗ヒトＶＥＧＦ Ｒ １（Ｆｌｔ－１）抗体；抗インテグリンＢ ５抗体；抗インテグリンベータ６抗体；抗ホスホ－ＳＲＣ抗体；抗バッグ抗体；抗ＢＣＬ－２抗体；抗ＢＣＬ－６抗体；抗βカタニン抗体；抗βカテニン抗体；抗インテグリンαＶβ３抗体；抗ｃ ＥｒｂＢ－２ Ａｂ－１２抗体；抗カルネキシン抗体；抗カルレティキュリン抗体；抗カルレティキュリン抗体；抗ＣＡＭ ５．２（抗サイトケラチン低モル。重量）抗体；抗カルジオチン（Ｒ ２ Ｇ）抗体；抗カテプシンＤ抗体；ガラクトシダーゼαに対するニワトリのポリクローナル抗体；抗ｃ－Ｍｅｔ抗体；抗ＣＲＥＢ抗体；抗ＣＯＸ ６ Ｃ抗体；抗サイクリンＤ １ Ａｂ－４抗体；抗サイトケラチン抗体；抗デスミン抗体；抗ＤＨＰ（１－６ジフェニルー１，３，５－ヘキサトリエン）抗体；ＤＳＢ－Ｘ Ｂｉｏｔｉｎヤギ抗ニワトリ抗体；抗Ｅ－カドヘリン抗体；抗ＥＥＡ １抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ＥＭＡ（上皮膜抗原）抗体；抗ＥＲ（エストロゲン受容体）抗体；抗ＥＲＢ ３抗体；抗ＥＲＣＣ １ ＥＲＫ（Ｐａｎ ＥＲＫ）抗体；抗Ｅ－セレクチン抗体；抗ＦＡＫ抗体；抗フィブロネクチン抗体；ＦＩＴＣ－ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体；抗ＦＯＸＰ ３抗体；抗ＧＢ ３抗体；抗ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）抗体；抗Ｇｉａｎｔｉｎ抗体；抗ＧＭ １３０抗体；抗ヤギ抗ｈＭｅｔ抗体；抗Ｇｏｌｇｉｎ ９７抗体；抗ＧＲＢ ２抗体；抗ＧＲＰ ７８ ＢｉＰ抗体；抗ＧＳＫ－３β抗体；抗肝細胞抗体；抗ＨＥＲ－２抗体；抗ＨＥＲ－３抗体；抗ヒストン３抗体；抗ヒストン４抗体；抗ヒストンＨ ２ Ａ Ｘ抗体；抗ヒストンＨ ２ Ｂ抗体；抗ＨＳＰ ７０抗体；抗ＩＣＡＭ－１抗体；抗ＩＧＦ－１抗体；抗ＩＧＦ－１受容体抗体；抗ＩＧＦ－１受容体ベータ抗体；抗ＩＧＦ－ＩＩ抗体；抗ＩＫＢ－α抗体；抗ＩＬ ６抗体；抗ＩＬ ８抗体；抗インテグリンベータ３抗体；抗インテグリンベータ５抗体；抗インテグリンｂ ８抗体；抗Ｊａｇｇｅｄ １抗体；抗プロテインキナーゼＣベータ２抗体；抗ＬＡＭＰ－１抗体；抗Ｍ ６ Ｐ（マンノース６リン酸受容体）抗体；抗ＭＡＰＫＡＰＫ－２抗体；抗ＭＥＫ １抗体；抗ＭＥＫ ２抗体；抗ミトコンドリア抗原抗体；抗ミトコンドリアマーカー抗体；抗マイトトラッカーグリーンＦＭ抗体；抗ＭＭＰ－２抗体；抗ＭＭＰ ９抗体；抗Ｎａ＋／Ｋ ＡＴＰアーゼ抗体；抗Ｎａ＋／Ｋ ＡＴＰａｓｅ Ａｌｐｈａ １抗体；抗Ｎａ＋／Ｋ ＡＴＰａｓｅ Ａｌｐｈａ ３抗体；抗Ｎ－カドヘリン抗体；抗ネフリン抗体；抗ＮＦ－ＫＢ ｐ ５０抗体；抗ＮＦ－ＫＢ Ｐ ６５抗体；抗Ｎｏｔｃｈ １抗体；抗ＯｘＰｈｏｓ複合体ＩＶ－Ａｌｅｘａ ４８８複合体抗体；抗ｐ １３０ Ｃａｓ抗体；抗Ｐ ３８ ＭＡＰＫ抗体；抗ｐ ４４／４２ ＭＡＰＫ抗体；抗Ｐ ５０４ Ｓクローン１３ Ｈ ４抗体；抗Ｐ ５３抗体；抗Ｐ ７０ Ｓ ６ Ｋ抗体；抗Ｐ ７０ホスホキナーゼブロッキングペプチド抗体；抗Ｐａｎ Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体；抗パキシリン抗体；抗Ｐ－カドヘリン抗体；抗ＰＤＩ抗体；抗ホスホＡＫＴ抗体；抗ホスホＣＲＥＢ抗体；抗ホスホＧＳＫ－３－ベータ抗体；抗ホスホＧＳＫ－３β抗体；抗ホスホＨ ３抗体；抗ホスホＭＡＰＫＡＰＫ－２抗体；抗ホスホＭＥＫ抗体；抗ホスホｐ ４４／４２ ＭＡＰＫ抗体；抗ホスホｐ ５３抗体；抗ホスホ－ＮＦ－ＫＢ ｐ ６５抗体；抗ホスホ－ｐ ７０ Ｓ ６キナーゼ抗体；抗ホスホＰＫＣ（Ｐａｎ）抗体；抗ホスホＳ ６リボソームタンパク質抗体；抗ホスホＳｒｃ抗体；抗リンパッド抗体；抗ホスホ－ＨＳＰ ２７抗体；抗ホスホ－ＩＫＢ－ａ抗体；抗ホスホ－ｐ ４４／４２ ＭＡＰＫ抗体；抗ホスホ－ｐ ７０ Ｓ ６キナーゼ抗体；抗ホスホ－Ｒｂ（Ｓｅｒ ８０７／８１１）（網膜芽細胞腫）抗体；抗Ｐｈｏｓｏｐｈｏ ＨＳＰ－７抗体；抗Ｐｈｓｏｆｆ－ｐ ３８抗体；抗Ｐｉｍ－１抗体；抗Ｐｉｍ－２抗体；抗ＰＫＣβ抗体；抗ＰＫＣβ１１抗体；抗ポドカリキシン抗体；抗ＰＲ抗体；抗ＰＴＥＮ抗体；抗Ｒ １抗体；抗Ｒｂ ４ Ｈ １（網膜芽細胞腫）抗体；抗Ｒ－カドヘリン抗体；抗ＲＲＭ １抗体；抗Ｓ ６リボソームタンパク質抗体；抗Ｓ－１００抗体；抗シナプトポジン抗体；抗シナプトポジン抗体；抗シンデカン４抗体；抗タリン抗体；抗テンシン抗体；抗ツベルリン抗体；抗ウロキナーゼ抗体；抗ＶＣＡＭ－１抗体；抗ＶＥＧＦ抗体；抗ビメンチン抗体；抗ＺＡＰ－７０抗体；および抗ＺＥＢ。
一次抗体にコンジュゲートさせることができるフルオロフォアとしては、限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ ２、Ｃｙ ３、Ｃｙ ５、ＶＥＣＴＯＲレッド、ＥＬＦ（商標）（酵素標識蛍光）、Ｃｙ ０、Ｃｙ ０．５、Ｃｙ １、Ｃｙ １．５、Ｃｙ ３、Ｃｙ ３．５、Ｃｙ ５、Ｃｙ ７、Ｆｌｕｏｒ Ｘ、カルセイン、カルセイン－ＡＭ、ＣＲＹＰＴＯＦＬＵＯＲ（商標）’Ｓ、オレンジ（４２ ｋＤａ）、タンゲリン（３５ ｋＤａ）、金（３１ ｋＤａ）、レッド（４２ ｋＤａ）、クリムソン（４０ ｋＤａ）、ＢＨＭＰ、ＢＨＤＭＡＰ、Ｂｒ－オレゴン、ルシファーイエロー、Ａｌｅｘａ色素ファミリー、Ｎ－［６－（７－ニトロベンゼン－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）－アミノ］カプロイル］（ＮＢＤ）、ＢＯＤＩＰＹ（商標）、ボロンジピロメテンジフルオリドフッ化物、オレゴングリーン、ＭＩＴＴＲＡＣＫＥＲ（商標）レッド、ＤｉＯＣ ７（３）、ＤｉＩＣ １８、フィコエリトリン、フィコビリタンパク質ＢＰＥ（２４０ ｋＤａ）ＲＰＥ（２４０ ｋＤａ）ＣＰＣ（２６４ ｋＤａ）ＡＰＣ（１０４ ｋＤａ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｂｌｕｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ａｑｕａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｏｌｄ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、Ｉｎｆｒａ－Ｒｅｄ（ＩＲ）Ｄｙｅｓ、Ｃｙｃｌｉｃ ＧＤＰ－Ｒｉｂｏｓｅ（ｃＧＤＰＲ）、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ、リサミン、ウンベリフェロン、チロシンおよびトリプトファン。多種多様な他の蛍光プローブは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ８ ｔｈ Ｅｄから入手可能であり、および／またはＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ８ ｔｈ Ｅｄに広く記載されている。（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇから入手可能。、ならびに他の多くの製造業者を含む。
シグナルのさらなる増幅は、特異的結合剤、例えば抗体および抗抗体の組み合わせを使用することによって達成することができ、ここで、抗抗体は、標的抗体プローブの保存領域に結合し、特に、抗体は異なる種に由来する。あるいは、ビオチン－ストレプトアビジンなどの特異的結合リガンド－受容体対を使用してもよく、一次抗体は対の一方のメンバーにコンジュゲートされ、他方のメンバーは検出可能なプローブで標識される。したがって、第１の結合メンバーが細胞成分に結合し、二次結合を提供するように働く結合メンバーのサンドイッチを効果的に構築し、二次結合メンバーは標識を含んでも含まなくてもよく、三次結合メンバーが標識を提供する三次結合をさらに提供してもよい。
二次抗体、アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチンは、それぞれ独立して、検出可能な部分で標識されており、これは、実質的に不溶性の呈色反応生成物、蛍光色素（染色）、発光色素または非蛍光色素を有する基質の比色反応を指示する酵素であり得る。これらの選択肢のそれぞれに関する例を以下に列挙する。
原則として、（ｉ）一次抗体に結合体化され得るか、または一次抗体に間接的に結合し得る（例えば、コンジュゲート化アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、二次抗体を介して）、および（ｉｉ）可溶性基質を使用して不溶性生成物（沈殿物）を提供する任意の酵素を使用することができる。使用される酵素は、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼおよび／またはグルコースオキシダーゼであり得る。基質は、それぞれアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータであり得る。－ガラクトシダーゼまたはグルコースオキシダーゼ基質。
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）基質としては、ＡＰ－Ｂｌｕｅ基質（青色沈殿物、Ｚｙｍｅｄカタログｐ。６１）が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＰ－オレンジ基板（オレンジ色、沈殿物、Ｚｙｍｅｄ）、ＡＰ－Ｒｅｄ基板（赤色、赤色沈殿物、Ｚｙｍｅｄ）、５－ブロモ、４－クロロ、３－インドリホスフェート（ＢＣＩＰ基質、ターコイズ沈殿物）、５－ブロモ、４－クロロ、３－インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム／ヨードニトロテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＩＮＴ基板、黄褐色沈殿物、Ｂｉｏｍｅｄａ）、５－ブロモ、４－クロロ、３－インドリホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基板、青／紫）、５－ブロモ、４－クロロ、３－インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム／ヨードニトロニトロニトロテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ／ＩＮＴ）、褐色沈殿物、ＤＡＫＯ、ファーストレッド（Ｒｅｄ）、マゼンタ－ホス（マゼンタ）、ナフトールＡＳ－ＢＩ－ホスフェート（ＮＡＢＰ）／ファーストレッドＴＲ（Ｒｅｄ）、ナフトールＡＳ－ＢＩ－ホスフェート（ＮＡＢＰ）／ニューフクシン（Ｒｅｄ）、ナフトールＡＳ－ＭＸ－ホスフェート（ＮＡＭＰ）／ニューフクシン（Ｒｅｄ）、新しいフクシンＡＰ基質（赤色）、ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ、黄色、水溶性）、ＶＥＣＴＯＲ（商標）ブラック（黒色）、ＶＥＣＴＯＲ（商標）ブルー（青色）、ＶＥＣＴＯＲ（商標）レッド（赤色）、Ｖｅｇａレッド（ラズベリー赤色）。
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、略してＰＯ）基質としては、２，２’アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ、緑色、水溶性）、アミノエチルカルバゾール、３－アミノ、９－エチルカルバゾールＡＥＣ（３ Ａ ９ ＥＣ、赤）が挙げられるが、これらに限定されない。α－ナフトールピロニン（赤）、４－クロロ－１－ナフトール（４ Ｃ １ Ｎ、青色、青黒色）、３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ、褐色）、オルトジアニシジン（緑）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ、褐色、水溶性）、ＴＡＣＳ Ｂｌｕｅ（青）、ＴＡＣＳ Ｒｅｄ（赤）、３，３’、５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、緑色または緑色／青色）、ＴＲＵＥ ＢＬＵＥＴＭ（青）、ＶＥＣＴＯＲ（商標）ＶＩＰ（紫）、ＶＥＣＴＯＲ（商標）ＳＧ（滑らかな青灰色）、およびＺｙｍｅｄ Ｂｌｕｅ ＨＲＰ基質（鮮やかな青）。
グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）基質としては、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、紫色沈殿）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ、黒色沈殿物）、２－（４－ヨードフェニル）－５－（４－ニトロフェニル）－３－フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ、赤色または橙色の沈殿物）、テトラゾリウムブルー（青）、ニトロテトラゾリウムバイオレット（紫）および３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、紫色）が挙げられるが、これらに限定されない。全てのテトラゾリウム基質は、共基質としてグルコースを必要とする。グルコースが酸化され、テトラゾリウム塩が還元され、色沈殿物を形成する不溶性ホルマザンを形成する。
β－ガラクトシダーゼ基質としては、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドイルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－ｇａｌ、青色沈殿）が挙げられるが、これらに限定されない。列挙した各基質に関連する沈殿物は、固有の検出可能なスペクトルシグネチャ（成分）を有する。
酵素はまた、限定されないがルシフェリンおよびＡＴＰまたはセレンテラジンおよびＣａなどの第２の基質の発光または第２の反応を指示することができる実質的に不溶性の反応生成物を有する、限定されないがルシフェラーゼおよびエクオリンなどの基質の発光反応を触媒することを対象とすることができる。２＋、発光生成物を有する。
核酸バイオマーカーは、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を使用して検出され得る。一般に、核酸配列プローブは、蛍光プローブまたは検出可能な部分で標識されたビオチン／アビジンなどのリガンド：受容体対の１つのメンバーのいずれかで合成および標識される。例示的なプローブおよび部分は、前のセクションに記載されている。配列プローブは、細胞内の標的ヌクレオチド配列に相補的である。標的ヌクレオチド配列を含む各細胞または細胞区画は、標識プローブに結合することができる。
分析に使用されるプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのいずれかとすることができ、天然に存在するヌクレオチドだけでなく、ジオキシゲニンｄＣＴＰ、ビオチンｄｃＴＰ ７－アザグアノシン、アジドチミジン、イノシンまたはウリジンなどのそれらの類似体を含むことができる。他の有用なプローブは、ペプチドプローブおよびその類似体、分枝遺伝子ＤＮＡ、ペプチド模倣物、ペプチド核酸および／または抗体を含む。プローブは、標的核酸配列とプローブとの間で安定且つ特異的な結合が起こるように、目的の標的核酸配列に対して十分な相補性を有するべきである。安定なハイブリダイゼーションに必要な相同性の程度は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって異なる。ＩＳＨ、ハイブリダイゼーションおよびプローブ選択のための従来の方法論は、Ｌｅｉｔｃｈら、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ，Ｏｘｆｏｒｄ ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ ｖ．２７（１９９４）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。
他のシステム構成要素
本開示のシステム２００は、組織検体に対して１つまたは複数の調製プロセスを実行することができる検体処理装置に結び付けられることができる。調製プロセスは、限定されるものではないが、検体の脱パラフィン、検体のコンディショニング（例えば、細胞コンディショニング）、検体の染色、抗原検索の実行、免疫組織化学染色（標識を含む）または他の反応の実行、および／またはインサイチュハイブリッド形成（例えば、ＳＩＳＨ、ＦＩＳＨなど）染色（標識を含む）または他の反応の実行、ならびに顕微鏡検査、微量分析、質量分析法、または他の分析方法のための検体を調製するための他のプロセスを含むことができる。
処理装置は、検体に固定液を塗布することができる。固定剤は、架橋剤（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ならびに非アルデヒド架橋剤）、酸化剤（例えば、四酸化オスミウムおよびクロム酸などの金属イオンおよび複合体）、タンパク質変性剤（例えば、酢酸、メタノール、エタノール）、メカニズム不明の固定剤（例えば、塩化水銀、アセトン、およびピクリン酸）、配合試薬（例えば、カルノイ固定剤、メタカーン、ブアン液、Ｂ５固定剤）、ロスマンの液体、およびゲンドレの液体、マイクロ波、およびその他の固定剤（例えば、容積固定および蒸気固定を除外）を含むことができる。
検体がパラフィンに埋め込まれた試料である場合、試料は、適切な脱パラフィン液を使用して脱パラフィン化されることができる。パラフィンを除去した後、任意の数の物質を連続して検体に塗布することができる。物質は、前処理（例えば、タンパク質架橋を逆転させる、核酸を露出させるなど）、変性、ハイブリッド形成、洗浄（例えば、厳密洗浄）、検出（例えば、視覚的またはマーカ分子のプローブへの連結）、増幅（例えば、タンパク質、遺伝子などの増幅）、逆染色、カバースリップなどのためのものとすることができる。
検体処理装置は、検体に幅広い物質を塗布することができる。物質は、これらに限定されるものではないが、染色剤、プローブ、試薬、リンス、および／またはコンディショナを含む。物質は、流体（例えば、気体、液体、または気体／液体混合物）などとすることができる。液体は、溶媒（例えば、極性溶媒、非極性溶媒など）、溶液（例えば、水溶液または他のタイプの溶液）などとすることができる。試薬には、染色剤、湿潤剤、抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体など）、抗原回収液（例えば、水性または非水性ベースの抗原回収溶液、抗原回収緩衝液など）が含まれ得るが、これらに限定されない。プローブは、検出可能な標識またはレポータ分子に付着した、単離された核酸または単離された合成オリゴヌクレオチドとすることができる。標識は、放射性同位元素、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光または蛍光剤、ハプテン、および酵素を含むことができる。
検体が処理された後、ユーザは、検体を含むスライドを画像化装置に輸送することができる。いくつかの実施形態では、画像化装置は、明視野イメージャスライドスキャナである。明視野イメージャの１つは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．によって販売されているｉＳｃａｎ ＨＴおよびＤＰ２００（Ｇｒｉｆｆｉｎ）明視野スキャナである。自動化された実施形態では、画像化装置は、「ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ」と題された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２（特許公開第ＷＯ／２０１１／０４９６０８号）号に開示された、または２０１１年９月９日に出願され、「ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＡＳＳＥＴＴＥＳ，ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ」と題された米国特許出願第６１／５３３，１１４号に開示されたデジタル病理装置である。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２号および米国特許出願第６１／５３３，１１４号は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
本明細書に記載の主題および動作の実施形態は、デジタル電子回路、または本明細書に開示される構造およびそれらの構造的均等物を含むコンピュータソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェア、またはそれらの１つ以上の組み合わせで実装されることができる。本明細書に記載の主題の実施形態は、１つ以上のコンピュータプログラム、すなわち、データ処理装置による実行のために、またはデータ処理装置の動作を制御するためにコンピュータ記憶媒体上に符号化されたコンピュータプログラム命令の１つ以上のモジュールとして実装されることができる。本明細書で説明されるモジュールのいずれも、プロセッサによって実行されるロジックを含むことができる。本明細書で使用される「ロジック」は、プロセッサの動作に影響を与えるために適用されることができる命令信号および／またはデータの形態を有する任意の情報を指す。ソフトウェアはロジックの例である。
コンピュータ記憶媒体は、コンピュータ可読記憶装置、コンピュータ可読記憶基板、ランダムまたはシリアルアクセスメモリアレイまたは装置、あるいはそれらの１つ以上の組み合わせとすることができるか、またはそれらに含まれることができる。さらに、コンピュータ記憶媒体は伝搬信号ではないが、コンピュータ記憶媒体は、人工的に生成された伝搬信号に符号化されたコンピュータプログラム命令のソースまたは宛先とすることができる。コンピュータ記憶媒体はまた、１つ以上の別個の物理的コンポーネントまたは媒体（例えば、複数のＣＤ、ディスク、または他の記憶装置）とすることができるか、またはそれらに含まれることができる。本明細書に記載されている動作は、１つ以上のコンピュータ可読記憶装置に記憶されているか、または他のソースから受信されたデータに対してデータ処理装置によって実行される動作として実装されることができる。
「プログラムされたプロセッサ」という用語は、データを処理するためのあらゆる種類の装置、装置、およびマシンを包含し、例えば、プログラム可能なマイクロプロセッサ、コンピュータ、チップ上のシステム、または前述の複数のもの、またはそれらの組み合わせを含む。装置は、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）などの特別な目的のロジック回路を含むことができる。装置はまた、ハードウェアに加えて、当該コンピュータプログラムの実行環境を作成するコード、例えば、プロセッサファームウェア、プロトコルスタック、データベース管理システム、オペレーティングシステム、クロスプラットフォームランタイム環境、仮想マシン、またはそれらの１つ以上の組み合わせを構成するコードを含むことができる。装置および実行環境は、ウェブサービス、分散コンピューティング、グリッドコンピューティングインフラストラクチャなど、様々な異なるコンピューティングモデルインフラストラクチャを実現することができる。
コンピュータプログラム（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、スクリプト、またはコードとも呼ばれる）は、コンパイルまたは解釈された言語、宣言言語または手続き型言語を含む、あらゆる形式のプログラミング言語で記述されることができ、スタンドアロンプログラムとして、またはモジュール、コンポーネント、サブルーチン、オブジェクト、またはコンピューティング環境での使用に適したその他のユニットとして含む、あらゆる形式で展開されることができる。コンピュータプログラムは、ファイルシステム内のファイルに対応することができるが、対応する必要はない。プログラムは、他のプログラムまたはデータを保持するファイルの一部（例えば、マークアップ言語ドキュメントに保存された１つ以上のスクリプト）、当該プログラム専用の単一ファイル、または複数の調整されたファイル（例えば、１つ以上のモジュール、サブプログラム、またはコードの一部を記憶するファイル）に記憶されることができる。コンピュータプログラムは、１台のコンピュータ、または１つのサイトに配置されているか、複数のサイトに分散され、通信ネットワークによって相互接続されている複数のコンピュータで実行されるように展開されることができる。
本明細書に記載のプロセスおよびロジックフローは、１つ以上のコンピュータプログラムを実行する１つ以上のプログラム可能なプロセッサによって実行され、入力データを操作して出力を生成することによってアクションを実行することができる。プロセスおよびロジックフローは、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）などの特殊用途のロジック回路によって実行されることもでき、装置は、それらとして実装されることもできる。
コンピュータプログラムの実行に適したプロセッサは、例として、汎用および特殊目的の双方のマイクロプロセッサ、および任意の種類のデジタルコンピュータの任意の１つ以上のプロセッサを含む。一般に、プロセッサは、読み取り専用メモリまたはランダムアクセスメモリ、あるいはその双方から命令とデータを受信する。コンピュータの本質的な要素は、命令に従ってアクションを実行するためのプロセッサと、命令およびデータを記憶するための１つ以上のメモリ装置である。一般に、コンピュータはまた、データを記憶するための１つ以上の大容量記憶装置、例えば、磁気ディスク、光磁気ディスク、または光ディスクを含むか、またはデータを受信するか、データを転送するか、またはその双方に動作可能に結合される。しかしながら、コンピュータは、そのような装置を必要とするわけではない。さらに、コンピュータは、ほんの数例を挙げると、別の装置、例えば、携帯電話、携帯情報端末（ＰＤＡ）、モバイルオーディオまたはビデオプレーヤ、ゲームコンソール、全地球測位システム（ＧＰＳ）受信機、またはポータブル記憶装置（例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）フラッシュドライブ）に組み込まれることができる。コンピュータプログラムの命令およびデータを記憶するのに適した装置は、例として半導体メモリ装置、例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、およびフラッシュメモリ装置を含む、全ての形態の不揮発性メモリ、メディアおよびメモリ装置、磁気ディスク、例えば、内蔵ハードディスクまたはリムーバブルディスク、光磁気ディスク、およびＣＤ－ＲＯＭおよびＤＶＤ－ＲＯＭディスクを含む。プロセッサおよびメモリは、特別な目的のロジック回路によって補完され、またはこれに組み込まれることができる。
ユーザとの相互作用を提供するために、本明細書に記載の主題の実施形態は、ディスプレイ装置、例えば、ＬＤＣ（液晶ディスプレイ）、ＬＥＤ（発光ダイオード）ディスプレイ、またはＯＬＥＤ（有機発光ダイオード）ディスプレイ、ユーザに情報を表示するためのディスプレイ、およびユーザがコンピュータに入力を提供することができる、キーボードおよびポインティング装置、例えば、マウスまたはトラックボールを有するコンピュータ上に実装されることができる。いくつかの実装形態では、タッチスクリーンが使用されて、情報を表示し、ユーザからの入力を受け取ることができる。他の種類の装置が使用されて、ユーザとの対話を提供することもできる。例えば、ユーザに提供されるフィードバックは、視覚的フィードバック、聴覚的フィードバック、または触覚的フィードバックなど、任意の形態の感覚的フィードバックとすることができる。また、ユーザからの入力は、音響、音声、または触覚入力を含む任意の形式で受信されることができる。さらに、コンピュータは、例えば、Ｗｅｂブラウザから受信した要求に応答して、ユーザのクライアント装置上のＷｅｂブラウザにＷｅｂページを送信することによるなど、ユーザが使用する装置との間でドキュメントを送受信することにより、ユーザと対話することができる。
本明細書に記載される主題の実施形態は、例えば、データサーバとしてのバックエンドコンポーネントを含むか、またはアプリケーションサーバなどのミドルウェアコンポーネントを含むか、または、例えば、ユーザがこの明細書に記載されている主題の実装と対話することができるグラフィカルユーザインタフェースまたはＷｅｂブラウザを有するクライアントコンピュータなどのフロントエンドコンポーネント、または１つ以上のそのようなバックエンド、ミドルウェア、またはフロントエンドコンポーネントの任意の組み合わせを含むコンピューティングシステムに実装されることができる。システムのコンポーネントは、デジタルデータ通信の任意の形式または媒体、例えば通信ネットワークによって相互接続されることができる。通信ネットワークの例は、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）およびワイドエリアネットワーク（「ＷＡＮ」）、ネットワーク間（例えば、インターネット）、およびピアツーピアネットワーク（例えば、アドホックピア－ピアツーピアネットワーク）を含む。例えば、図１のネットワーク２０は、１つ以上のローカルエリアネットワークを含むことができる。
コンピューティングシステムは、任意の数のクライアントおよびサーバを含むことができる。クライアントおよびサーバは、通常、互いにリモートであり、通常、通信ネットワークを介して相互作用する。クライアントおよびサーバの関係は、それぞれのコンピュータ上で実行され且つクライアント－サーバの関係を互いに有するコンピュータプログラムによって発生する。いくつかの実施形態では、サーバは、（例えば、データを表示し、クライアント装置と対話するユーザからのユーザ入力を受信する目的で）データ（例えば、ＨＴＭＬページ）をクライアント装置に送信する。クライアント装置で生成されたデータ（例えば、ユーザの操作の結果）は、サーバにおいてクライアント装置から受信されることができる。
代替実施形態
本開示の別の態様は、染色されていない試験生物学的検体から試験スペクトルデータを取得することを含む、未知の時間量にわたって固定されて処理された染色されていない試験生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現を予測する方法であって、試験スペクトルデータが、生物学的検体の少なくとも一部に由来する振動スペクトルデータを含み、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用して、取得された試験スペクトルデータからバイオマーカー発現特徴を導出することと、バイオマーカー発現特徴に基づいて、試験生物学的検体の１つ以上のバイオマーカーの発現を予測することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、予測されるバイオマーカー発現は、予測される陽性率または予測される染色強度のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、予測されるバイオマーカー発現は、予測される陽性率および予測される染色強度の双方を含む。いくつかの実施形態では、染色されていない試験生物学的検体の固定状態は未知である。
いくつかの実施形態では、バイオマーカー発現推定エンジンは、１つ以上の訓練スペクトルデータセットを使用して訓練され、各訓練スペクトルデータセットは、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色された複数の訓練組織試料に由来する複数の訓練振動スペクトルを含み、各訓練振動スペクトルは、１つ以上のクラス標識を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のクラス標識は、１つ以上のバイオマーカーについての既知のバイオマーカー発現レベルを含む。いくつかの実施形態では、既知のバイオマーカー発現レベルは、１つ以上のバイオマーカーについての既知の陽性率および１つ以上のバイオマーカーについての既知の染色強度のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、システムは、既知のマスキング解除期間、既知のマスキング解除温度、マスキング解除状態の定性的評価、既知の固定期間、および固定状態の定性的評価からなる群から選択される１つ以上のクラス標識をさらに含む。
いくつかの実施形態では、訓練スペクトルデータセットは、以下によって導出される：（ｉ）訓練生物学的検体を取得すること；（ｉｉ）取得された訓練生物学的検体を複数の訓練組織試料に分割すること；（ｉｉｉ）取得された複数の訓練組織試料のそれぞれを、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色すること；および（ｉｖ）１つ以上のバイオマーカーの発現を定量的に評価すること。いくつかの実施形態では、複数の訓練組織試料の各訓練組織試料は、差次的にマスキング解除されるか、差次的に固定されるか、または差次的にマスキング解除されて差次的に固定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカーの定量的評価は、１つ以上のバイオマーカーの染色強度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカーの定量的評価は、１つ以上のバイオマーカーの陽性率を決定することを含む。いくつかの実施形態では、定量的評価は、病理学者によって行われる。いくつかの実施形態では、定量的評価は、１つ以上の画像分析アルゴリズムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、複数の訓練組織試料は、免疫組織化学アッセイで染色される。いくつかの実施形態では、複数の訓練組織試料は、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイで染色される。
いくつかの実施形態では、試験スペクトルデータは、複数の正規化および補正振動スペクトルから導出された平均振動スペクトルを含む。いくつかの実施形態では、複数の正規化および補正された振動スペクトルは、以下によって取得される：（ｉ）試験生物学的検体内の複数の空間領域を特定すること、；（ｉｉ）複数の特定された領域の各個々の領域から振動スペクトルを取得すること；（ｉｉｉ）個々の領域ごとに補正された振動スペクトルを提供するために、個々の領域ごとに取得された振動スペクトルを補正すること；および（ｉｖ）各個々の領域からの補正された振動スペクトルを所定の大域最大値に振幅正規化して、各領域の振幅正規化振動スペクトルを提供すること。いくつかの実施形態では、各個々の領域から取得された振動スペクトルは、以下によって補正される：（ｉ）取得された各振動スペクトルを大気効果について補償して、大気補正振動スペクトルを提供すること；および（ｉｉ）散乱のために大気補正振動スペクトルを補償すること。
いくつかの実施形態では、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、次元縮小に基づく機械学習アルゴリズムを含む。いくつかの実施形態では、次元縮小は、潜在構造回帰モデルへの投影を含む。いくつかの実施形態では、次元縮小は、主成分分析および判別分析を含む。いくつかの実施形態では、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、ニューラルネットワークを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、試験生物学的検体の実際のバイオマーカー発現を、試験生物学的検体の１つ以上のバイオマーカーの予測発現と比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、試験生物学的検体の不十分なマスキング解除および／または不十分な固定のために１つ以上のバイオマーカーの予測発現をさらに含む。いくつかの実施形態では、試験スペクトルデータは、少なくともアミドＩバンドの振動スペクトル情報を含む。いくつかの実施形態では、取得された試験スペクトルデータは、約３２００から約３４００ｃｍ－１、約２８００から約２９００ｃｍ－１、約１０２０から約１１００ｃｍ－１、および／または約１５２０から約１５８０ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む。
本開示の別の態様は、試験生物学的検体から試験スペクトルデータを取得する、未知の時間量にわたって固定されて処理された試験生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現を予測する方法であって、試験スペクトルデータが、生物学的検体の少なくとも一部に由来する振動スペクトルデータを含み、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用して、取得された試験スペクトルデータからバイオマーカー発現特徴を導出することと、バイオマーカー発現特徴に基づいて、試験生物学的検体の１つ以上のバイオマーカーの発現を予測することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、予測されるバイオマーカー発現は、予測される陽性率または予測される染色強度のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、予測されるバイオマーカー発現は、予測される陽性率および予測される染色強度の双方を含む。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体の固定状態は未知である。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は、上記列挙されたバイオマーカーのいずれかを含む、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される。他の実施形態では、試験生物学的検体は染色されない。
本開示の別の態様は、染色されていない試験生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現を予測するためのシステムであって、（ｉ）１つ以上のプロセッサと、（ｉｉ）１つ以上のプロセッサに結合された１つ以上のメモリであって、１つ以上のプロセッサによって実行されると、試験生物学的検体から試験スペクトルデータを取得することであって、試験スペクトルデータが、生物学的検体の少なくとも一部に由来する振動スペクトルデータを含む、試験スペクトルデータを取得することと、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用して、取得された試験スペクトルデータからバイオマーカー発現特徴を導出することであって、バイオマーカー発現推定エンジンが、複数の差次的に調製された訓練生物学的検体から取得された訓練スペクトルデータセットを使用して訓練され、訓練スペクトルデータセットが、１つ以上のバイオマーカーについての既知のバイオマーカー発現のクラス標識を含む、導出することと、導出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて、染色されていない生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現を予測することと、を含む動作をシステムに実行させるコンピュータ実行可能命令を記憶する、１つ以上のメモリと、を備える、システムである。
いくつかの実施形態では、予測されるバイオマーカー発現は、予測される陽性率または予測される染色強度のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、予測されるバイオマーカー発現は、予測される陽性率および予測される染色強度の双方を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカーは、少なくとも１つの癌バイオマーカーを含む。
いくつかの実施形態では、各訓練スペクトルデータセットは、以下によって導出される：（ｉ）訓練生物学的検体を取得すること；（ｉｉ）取得された訓練生物学的検体を複数の訓練組織試料に分割すること；および（ｉｉｉ）異なる調製条件下で複数の訓練組織試料の各訓練組織試料を調製すること。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のバイオマーカーの存在について取得された複数の訓練組織試料のそれぞれを染色することと、１つ以上のバイオマーカーについての既知の陽性率および／または既知の染色強度を定量的に評価することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、次元縮小に基づく機械学習アルゴリズムを含む。いくつかの実施形態では、次元縮小は、潜在構造回帰モデルへの投影を含む。いくつかの実施形態では、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンは、ニューラルネットワークを含む。いくつかの実施形態では、方法は、試験生物学的検体の不十分なマスキング解除および／または不十分な固定のために１つ以上のバイオマーカーの予測発現を補償することをさらに含む。
本開示の別の態様は、試験生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現を予測するためのシステムであって、（ｉ）１つ以上のプロセッサと、（ｉｉ）１つ以上のプロセッサに結合された１つ以上のメモリであって、１つ以上のプロセッサによって実行されると、試験生物学的検体から試験スペクトルデータを取得することであって、試験スペクトルデータが、生物学的検体の少なくとも一部に由来する振動スペクトルデータを含む、試験スペクトルデータを取得することと、訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンを使用して、取得された試験スペクトルデータからバイオマーカー発現特徴を導出することであって、バイオマーカー発現推定エンジンが、複数の差次的に調製された訓練生物学的検体から取得された訓練スペクトルデータセットを使用して訓練され、訓練スペクトルデータセットが、１つ以上のバイオマーカーについての既知のバイオマーカー発現のクラス標識を含む、バイオマーカー発現特徴を導出することと、導出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて、生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現を予測することと、を含む動作をシステムに実行させるコンピュータ実行可能命令を記憶する、１つ以上のメモリと、を備える、システムである。いくつかの実施形態では、試験生物学的検体は、上記列挙されたバイオマーカーのいずれかを含む、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される。他の実施形態では、試験生物学的検体は染色されない。
本明細書中で言及されるおよび／または出願データシートにおいてリスト化される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願、および刊行物の概念を使用してさらに別の実施形態を提供するように変更されることができる。
本開示は、いくつかの例示的な実施形態を参照して説明されてきたが、本開示の原理の精神および範囲内に含まれるであろう多くの他の変更および実施形態が当業者によって考案されることができることを理解されたい。より具体的には、合理的な変形および変更は、本開示の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、および添付の特許請求の範囲内の主題の組み合わせ構成の構成部品および／または配置において可能である。構成部品および／または配置の変形および変更に加えて、代替の使用法も当業者にとって明らかであろう。

Claims (52)

  1. 試験生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現を予測するためのシステム（２００）であって、（ｉ）１つ以上のプロセッサ（２０９）と、（ｉｉ）前記１つ以上のプロセッサ（２０９）に結合された１つ以上のメモリ（２０１）とを備え、前記１つ以上のメモリ（２０１）はコンピュータ実行可能命令を記憶し、前記コンピュータ実行可能命令は、前記１つ以上のプロセッサ（２０９）によって実行されると、前記システム（２００）に、
    ａ．前記試験生物学的検体から試験スペクトルデータを取得させることであって、取得された前記試験スペクトルデータが、前記生物学的検体の少なくとも一部に由来する振動スペクトルデータを含む、試験スペクトルデータを取得すること、
    ｂ．訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン（２１０）を使用して、取得された前記試験スペクトルデータからバイオマーカー発現特徴を導出すること、および、
    ｃ．前記導出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて、前記試験生物学的検体の前記１つ以上のバイオマーカーの発現を予測すること、を含む動作を実行させる、システム（２００）。
  2. 前記１つ以上のバイオマーカーの予測発現が、予測された陽性率または予測された染色強度のうちの１つを含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記１つ以上のバイオマーカーの予測発現が、予測された陽性率および予測された染色強度の双方を含む、請求項１に記載のシステム。
  4. 前記試験生物学的検体の固定状態が未知である、請求項１から３のいずれか一項に記載のシステム。
  5. 前記バイオマーカー発現推定エンジンが、１つ以上の訓練スペクトルデータセットを使用して訓練され、各訓練スペクトルデータセットが、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色された複数の訓練組織試料に由来する複数の訓練振動スペクトルを含み、各訓練振動スペクトルが、１つ以上のクラス標識を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のシステム。
  6. 前記１つ以上のクラス標識が、１つ以上のバイオマーカーについての既知のバイオマーカー発現レベルを含む、請求項５に記載のシステム。
  7. 前記既知のバイオマーカー発現レベルが、１つ以上のバイオマーカーについての既知の陽性率および１つ以上のバイオマーカーについての既知の染色強度のうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載のシステム。
  8. 既知のマスキング解除期間、既知のマスキング解除温度、マスキング解除状態の定性的評価、既知の固定期間、および固定状態の定性的評価からなる群から選択される１つ以上のクラス標識をさらに含む、請求項６に記載のシステム。
  9. 各訓練スペクトルデータセットが、（ｉ）訓練生物学的検体を取得することと、（ｉｉ）取得された前記訓練生物学的検体を複数の訓練組織試料に分割することと、（ｉｉｉ）前記複数の訓練組織試料を、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色することと、（ｉｖ）前記複数の訓練組織試料の各訓練組織試料の前記１つ以上のバイオマーカーの発現を定量的に評価することと、によって導出される、請求項５から８のいずれか一項に記載のシステム。
  10. 前記複数の訓練組織試料の各訓練組織試料が、差次的にマスキング解除されるか、差次的に固定されるか、または差次的にマスキング解除され且つ差次的に固定される、請求項９に記載のシステム。
  11. 前記１つ以上のバイオマーカーの定量的評価が、前記１つ以上のバイオマーカーの染色強度を決定することを含む、請求項９に記載のシステム。
  12. 前記１つ以上のバイオマーカーの定量的評価が、前記１つ以上のバイオマーカーの陽性率を決定することを含む、請求項９に記載のシステム。
  13. 前記１つ以上のバイオマーカーの定量的評価が病理学者によって行われる、請求項９に記載のシステム。
  14. 前記１つ以上のバイオマーカーの定量的評価が、１つ以上の画像分析アルゴリズムを使用して行われる、請求項９に記載のシステム。
  15. 前記複数の訓練組織試料が免疫組織化学アッセイで染色される、請求項９に記載のシステム。
  16. 前記複数の訓練組織試料が、それぞれ、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイで染色される、請求項９に記載のシステム。
  17. 取得された前記試験スペクトルデータが、複数の正規化および補正された振動スペクトルから導出された平均振動スペクトルを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
  18. 前記複数の正規化および補正された振動スペクトルが、（ｉ）前記試験生物学的検体内の複数の空間領域を特定することと、（ｉｉ）前記複数の特定された領域の各個々の領域から振動スペクトルを取得することと、（ｉｉｉ）個々の領域ごとに補正された振動スペクトルを提供するために、個々の領域ごとに取得された前記振動スペクトルを補正することと、（ｉｖ）各個々の領域からの前記補正された振動スペクトルを所定の大域最大値に振幅正規化して、各領域の振幅正規化振動スペクトルを提供することと、によって取得される、請求項１７に記載のシステム。
  19. 各個々の領域からの取得された前記振動スペクトルが、（ｉ）取得された各振動スペクトルを大気効果について補償して、大気補正振動スペクトルを提供することと、（ｉｉ）散乱のために前記大気補正振動スペクトルを補償することと、によって補正される、請求項１８に記載のシステム。
  20. 前記訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンが、次元縮小に基づく機械学習アルゴリズムを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のシステム。
  21. 前記次元縮小が、潜在構造回帰モデルへの投影を含む、請求項２０に記載のシステム。
  22. 前記次元縮小が、主成分分析および判別分析を含む、請求項２０に記載のシステム。
  23. 前記訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンがニューラルネットワークを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のシステム。
  24. 前記試験生物学的検体の実際のバイオマーカー発現を、前記試験生物学的検体の前記１つ以上のバイオマーカーの予測発現と比較するための動作をさらに含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のシステム。
  25. 前記試験生物学的検体の不十分なマスキング解除および／または不十分な固定のために、前記１つ以上のバイオマーカーの予測発現を補償するための動作をさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のシステム。
  26. 取得された前記試験スペクトルデータが、少なくともアミドＩバンドの振動スペクトル情報を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のシステム。
  27. 取得された前記試験スペクトルデータが、約３２００から約３４００ｃｍ－１、約２８００から約２９００ｃｍ－１、約１０２０から約１１００ｃｍ－１、および／または約１５２０から約１５８０ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載のシステム。
  28. 前記試験生物学的検体が染色されていない、請求項１に記載のシステム。
  29. 前記試験生物学的検体が、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される、請求項１に記載のシステム。
  30. 未知の固定状態および／または未知のマスキング解除状態を有する、処理された試験生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現を予測するための命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記命令が、
    （ａ）前記試験生物学的検体から試験スペクトルデータを取得することであって、取得された前記試験スペクトルデータが、前記生物学的検体の少なくとも一部に由来する振動スペクトルデータを含む、試験スペクトルデータを取得することと、
    （ｂ）訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン（２１０）を使用して、取得された前記試験スペクトルデータからバイオマーカー発現特徴を導出することであって、前記バイオマーカー発現推定エンジンが、複数の差次的に調製された訓練生物学的検体から取得された訓練スペクトルデータセットを使用して訓練され、前記訓練スペクトルデータセットが、１つ以上のバイオマーカーについての既知のバイオマーカー発現のクラス標識を含む、バイオマーカー発現特徴を導出することと、
    （ｃ）前記導出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて、前記試験生物学的検体の前記１つ以上のバイオマーカーの発現を予測することと、を含む、非一時的コンピュータ可読媒体。
  31. 前記１つ以上のバイオマーカーの予測発現が、予測された陽性率または予測された染色強度のうちの１つを含む、請求項３０に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
  32. 前記１つ以上のバイオマーカーの予測発現が、予測された陽性率および予測された染色強度の双方を含む、請求項３０または３１に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
  33. 各訓練スペクトルデータセットが、（ｉ）訓練生物学的検体を取得することと、（ｉｉ）取得された前記訓練生物学的検体を複数の訓練組織試料に分割することと、（ｉｉｉ）前記複数の訓練組織試料の各訓練組織試料を、異なる調製条件のもとで調製することと、（ｉｖ）１つ以上のバイオマーカーの存在について前記複数の訓練組織試料の各訓練組織試料を染色することと、（ｖ）前記訓練組織試料のそれぞれにおいて前記１つ以上のバイオマーカーの発現を定量的に評価することと、によって導出される、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
  34. 前記異なる調製条件が異なるマスキング解除条件を含む、請求項３３に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
  35. 前記異なる調製条件が異なる固定期間を含む、請求項３３に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
  36. 前記訓練生物学的検体が、前記試験生物学的検体と同じ組織タイプを含む、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
  37. 前記訓練生物学的検体が、前記試験生物学的検体とは異なる組織タイプを含む、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
  38. 前記試験生物学的検体が染色されていない、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
  39. 前記試験生物学的検体が、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
  40. 未知の時間量にわたって固定された試験生物学的検体における１つ以上のバイオマーカーの発現を予測する方法であって、
    ａ．前記試験生物学的検体から試験スペクトルデータを取得することであって、取得された前記試験スペクトルデータが、前記生物学的検体の少なくとも一部に由来する振動スペクトルデータを含む、試験スペクトルデータを取得すること（３２０）と、
    ｂ．訓練されたバイオマーカー発現推定エンジン（２１０）を使用して、取得された前記試験スペクトルデータからバイオマーカー発現特徴を導出すること（３４０）であって、前記バイオマーカー発現推定エンジンが、複数の差次的に調製された訓練生物学的検体から取得された訓練スペクトルデータセットを使用して訓練され、前記訓練スペクトルデータセットが、１つ以上のバイオマーカーについての既知のバイオマーカー発現のクラス標識を含む、バイオマーカー発現特徴を導出することと、
    ｃ．前記導出されたバイオマーカー発現特徴に基づいて、前記試験生物学的検体の前記１つ以上のバイオマーカーの発現を予測すること（３５０）と、を含む、方法。
  41. 前記１つ以上のバイオマーカーの予測発現が、予測された陽性率または予測された染色強度のうちの１つを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記１つ以上のバイオマーカーの予測発現が、予測された陽性率および予測された染色強度の双方を含む、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. 各訓練スペクトルデータセットが、（ｉ）訓練生物学的検体を取得することと、（ｉｉ）取得された前記訓練生物学的検体を複数の訓練組織試料に分割することと、（ｉｉｉ）異なる調製条件下で前記複数の訓練組織試料の各訓練組織試料を調製することと、によって導出される、請求項４０から４１のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記複数の訓練組織試料のそれぞれを、前記１つ以上のバイオマーカーの存在について染色することと、前記１つ以上のバイオマーカーについての既知の陽性率および／または既知の染色強度を定量的に評価することと、を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンが、次元縮小に基づく機械学習アルゴリズムを含む、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記次元縮小が、潜在構造回帰モデルへの投影を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記訓練されたバイオマーカー発現推定エンジンがニューラルネットワークを含む、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記試験生物学的検体の不十分なマスキング解除および／または不十分な固定のために、前記１つ以上のバイオマーカーの前記予測発現を補償することをさらに含む、請求項４０から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記１つ以上のバイオマーカーが少なくとも１つの癌バイオマーカーを含む、請求項４０から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記試験生物学的検体が染色されていない、請求項４０から４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記試験生物学的検体が、１つ以上のバイオマーカーの存在について染色される、請求項４０から４９のいずれか一項に記載の方法。
  52. 取得された前記試験スペクトルデータが、約３２００から約３４００ｃｍ－１、約２８００から約２９００ｃｍ－１、約１０２０から約１１００ｃｍ－１、および／または約１５２０から約１５８０ｃｍ－１の範囲の波長の振動スペクトル情報を含む、請求項４０から５１のいずれか一項に記載の方法。

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