JP2022541174A

JP2022541174A - アッセイ

Info

Publication number: JP2022541174A
Application number: JP2022502187A
Authority: JP
Inventors: スーザンキンバー; フィリップルイス
Original assignee: University of Manchester
Current assignee: University of Manchester
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2022-09-22
Also published as: EP4004542A1; WO2021014154A1; US20220252576A1

Abstract

本発明は、マーカータンパク質の存在を決定することにより幹細胞培養物の多能性状態を評価する方法、関連するキット及び使用に関する。【選択図】図１（１）

Description

本発明は、マーカータンパク質の存在を決定することにより幹細胞培養物の多能性状態を評価する方法、関連するキット及び使用に関する。

緒言
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、基礎研究、医薬品開発（創薬）、及び臨床細胞治療のための、事実上あらゆる種類の細胞の重要な供給源となる可能性を持っている。ヒト多能性幹細胞を用いたアプローチを含む再生医療の臨床的可能性は他の追随を許さないものの、有望な治療法をスケーラブルで再現性の高い商業的プロセスに移行させるには大きなハードルが存在する。特に、ｈＰＳＣを多能性状態に維持することは、困難で手間がかかることが判明している。ＳｅｌｅｃＴ（ＴＡＰｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ティーエーピー・バイオシステムズ）－ハーフォードシャー（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ）、英国）、ＦｒｅｅｄｏｍＥＶＯ（ＴＥＣＡＮＴｒａｄｉｎｇＡＧ（テカン・トレーディング）、スイス）システムの開発、又は東京エレクトロン（京都、日本）によって開発された技術等によって、高品質のＰＳＣの培養及び増殖の自動化が進んでいるが、あらゆる規模のＰＳＣ培養において克服すべき課題として残っているのは、多能性培養物のための迅速で再現性があり非侵襲的かつ定量的な測定基準がないことである。

最も一般的に使用されている技術は、いずれもＰＳＣ製造に使用するには大きな欠点がある。例えば、コアとなる多能性転写因子及び細胞表面マーカーを評価するために免疫蛍光法を使用すると、培養物全体の多能性の初期喪失を正確に拾うことができず、むしろ個々の細胞における多能性の喪失を拾い上げる。免疫蛍光法は不正確でもあり、非定量的でもあるため、製造プロセスに組み込むことができず、検査した細胞を再びプロセスに戻すことができない。多能性マーカーの喪失を特定するためにフローサイトメトリを使用すると、ランのばらつきが見られ、しかも細胞産物を犠牲にしてしまう。現在、利用できる最も定量化可能な多能性の測定基準は、Ｐｌｕｒｉ－ｔｅｓｔ［１］及びＳｃｏｒｅＣａｒｄ［２］等の細胞に対するＲＮＡベースのアッセイ、又はテラトーマアッセイ［３］である。しかしながら、これらの測定基準は現在のところ費用対効果が高くはなく、細胞産物を犠牲にする必要があり、リスクのある培養物に対して結果を提供するには時間がかかりすぎ、そのため、そのような細胞は結果が出るまでに永久に損なわれてしまう可能性が高い。研究者が現在持っている最も迅速で費用対効果の高いツールは、細胞形態の分析であるが、しかしながら、これは本質的に主観的なものである。ＰＳＣの形態学的特徴を自動化し、定量化する試みがなされているが［４、５］、多能性を測定する方法としては、依然として低分解能のままである［６］。従って、多能性のごく初期の喪失を拾い上げることができる便利な定量的アッセイは存在しない。

Ｔｒａｎｓ－ＰｒｏｔｅｏｍｉｃＰｉｐｅｌｉｎｅ，ａｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄｄａｔａｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｐｉｐｅｌｉｎｅｆｏｒｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ａ．、Ｗ．Ｓ．Ｒａｓｂａｎｄ、及びＫ．Ｗ．Ｅｌｉｃｅｉｒｉ、ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ、２０１２．９（７）：６７１－６７５頁Ｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．Ｊ．ら、ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ、２０１１．８（４）：３１５－７頁Ｂｏｃｋ，Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ、２０１１．１４４（３）：４３９－５２頁Ａｖｉｏｒ，Ｙ．、Ｊ．Ｃ．Ｂｉａｎｃｏｔｔｉ、及びＮ．Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ、ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ、２０１５．４（６）：９６７－７４頁Ｋｅｒｚ，Ｍ．ら、ＪＢｉｏｍｏｌＳｃｒｅｅｎ、２０１６．２１（９）：８８７－９６頁

本発明の目的は、多能性喪失の現在の評価に関連する１つ以上の課題に対処することである。多能性の喪失、内在する喪失、又は潜在的な喪失を特定するために使用することができる１つ以上のバイオマーカーを特定することが望ましいであろう。細胞増殖の阻害を最小限に抑え、分析に細胞溶解液を使用しないように、１つ以上のバイオマーカーが培養培地中で検出可能であれば、さらに望ましい。さらには、多能性の喪失を評価又は検出する方法であって、迅速で信頼性が高く、実施しやすい方法を提供することが望まれる。

本発明は、幹細胞培養物の多能性状態を評価する方法に関する。本発明者らは、ＰＳＣのセクレトームには、多能性解消時に急速に減少又は増加するタンパク質が多数存在することを示した。このようにして、多能性細胞の状態と一貫した相関を示す、信頼度の高いタンパク質バイオマーカーがいくつか特定された。これらのタンパク質バイオマーカーは、多能性喪失の迅速な診断法として利用されてもよい。

加えて、本発明者らは、新規な対にされたタンパク質の比率という測定基準（指標）を開発することにより、分泌タンパク質の定量のための機能的な正規化方法の欠如を克服することに努めた。これは、同じ刺激に反応して増加又は減少するタンパク質は、他の正規化標準よりも、互いに対してより一貫して検出可能に変化するという観察に基づいていた。使用される細胞及び培養物の種類に関係なく、多能性幹細胞培養物を非多能性幹細胞培養物から一貫して確実に区別するタンパク質対比を与える、ＰＳＣのセクレトームの中のタンパク質バイオマーカーが数多く特定された。

幹細胞培養物の多能性状態を判断するためのタンパク質対の評価は、幹細胞培養物中の個々のタンパク質の存在量を評価するよりもさらに有益である。タンパク質対の評価は、多能性幹細胞の状態をより確実に、統計的に有意に、信頼性高く、かつ迅速に定量的に読み取ることをもたらす。これは、幹細胞産物を犠牲にすることなく多能性の喪失を回復できる段階で、培養物の質の低下の早期警告として使用することができる。本発明のタンパク質バイオマーカー、特に本発明のタンパク質対の評価により、細胞治療用のＰＳＣのスケールアップ及び製造中、又は医薬品の開発及び毒性試験におけるその使用のための断続的若しくは連続的な培養モニタリングも可能となる。

従って、１つの態様では、本発明は、幹細胞培養の多能性状態を判断する方法であって、幹細胞を培養する工程と、
ａ）アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（Ｃｏｃｈｌｉｎ）（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（Ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎａｎｄｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｗｉｔｈｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎｍｏｔｉｆｓ８）（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＧＦ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｆｉｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎ）（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン（ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ）様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン（ｎｅｕｒｏｎａｌｐｅｎｔｒａｘｉｎ）－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及びＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）から選択される２種のタンパク質の相対存在量を測定し、この相対存在量を基準値と比較する工程、並びに／又は
ｂ）アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及びＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）から選択される１つ以上のタンパク質の絶対存在量を測定し、この絶対存在量を基準値と比較する工程と
を含む方法に関する。

本発明は、幹細胞培養物の多能性状態を評価することにおける、アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及びＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）から選択される１つ以上のタンパク質バイオマーカーの使用にも関する。例えば、本明細書に例示される対が使用される。

本発明は、
ａ）以下のタンパク質、ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ１、ＳＴＯＭ、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＰＰ、Ｂ３ＧＮＴ７、ＣＨＧＡ、ＥＦＥＭＰ１、ＥＰＨＡ１、ＥＸＴＬ２、ＦＢＬＮ２、ＦＧＦ２、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬＮＴ、ＧＧＨ、ＨＥＸＢ、ＩＧＦＢＰ４、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＮＴＳ、ＰＣＤＨＢ５、ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＦＲＰ２、ＴＩＭＰ４、ＴＮＦＲＳＦ８及び／又はＷＦＤＣ２の１つ以上に結合する、若しくはその他の方法で検出することができる１つ以上の成分、並びに任意に
ｂ）上記１つ以上の成分と上記１つ以上のタンパク質との結合及び／又は検出を定量するための手段、例えば抗体又は抗体断片
を含むキットにも関する。
ｂ）．

本発明は、以下の非限定的な図においてさらに説明される。

試料採取及びデータ処理のための実験デザイン。Ａ）実験開始前に、細胞を少なくとも２継代、Ｅ８で培養した。その後、細胞を、Ｒｏｃｋ阻害剤を含むＥ８培地でビトロネクチン－Ｎコーティングフラスコにプレーティングし、実験条件の開始前に２４時間静置した。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、半数はＥ８で、半数はＥ６で培養し、２４時間後に培地を全量交換した。実験条件下で４８時間培養後、培地を回収し、回転し、濃縮し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ用に処理した。この細胞を回収し、品質管理、及びＲＮＡ－Ｓｅｑ分析のために処理した。これらのデータは、次に、多重統合された方法によって分析され、その後、タンパク質のサブセットがさらなる標的分析のために選択された。Ｂ）Ｅ８（対照）で培養したＭａｎ－１３細胞又はＥ６で４８時間培養した後のＭａｎ－１３細胞の免疫細胞化学。試料採取及びデータ処理のための実験デザイン。Ｃ）Ｅ８で培養したＲｅｂｌ．ＰＡＴ及びＭａｎ－１３細胞、又はＥ６で４８時間培養した後のＲｅｂｌ．ＰＡＴ及びＭａｎ－１３細胞のフローサイトメトリ。Ｒｅｂｌ．ＰＡＴ細胞については、２４時間時点の細胞状態を観察できるように、実験用フラスコと一緒に余分なフラスコを培養した（Ｒｅｂｌ．ＰＡＴについて示す）。プロテオミクスの概要。Ａ）プロテオミクス実験のインプット及びアウトプットの概要。Ｂ）ＳｉｇｎａｌＰ４．０（古典的）若しくはＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ２．０（非古典的）による、又はＵｎｉｐｒｏｔペプチド配列による、分泌されたと特定されたタンパク質の割合を示す円グラフ。タンパク質の分類に使用した細胞外遺伝子オントロジー（ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ、ＧＯ）タームは、細胞外マトリクス、細胞外空間、細胞外ベシクル（細胞外小胞）、細胞表面、細胞外領域であった。この分析に使用したすべてのタンパク質は、１つ以上のユニークなペプチドを持ち、３回のプロテオミクスランすべてにおいて信頼度スコアが３０以上であった。プロテオミクスの概要。Ｃ）Ｃで説明した各カテゴリーで一般的なＧＯタームのＷｅｂＧｅｓｔａｌｔからのＧｏＳｌｉｍ細胞内構成要素（ＣｅｌｌｕｌａｒＣｏｍｐｏｎｅｎｔ）の概要。ｐ＜０．０５への濃縮。細胞外ＧＯタームは黒いバーで強調されている。ｍＲＮＡとタンパク質とのデータの間の条件間ｌｏｇ（対数）倍率変化の間の相関。Ｅ６／Ｅ８の条件間ｌｏｇ倍率変化は、プロテオミクスによって特定されたタンパク質についてＥｎｔｒｅｚＩＤがすぐに利用可能であるセクレトミクス（分泌液網羅解析）と対応するＲＮＡ－Ｓｅｑデータで比較された。これらのデータは、プロテオミクスデータと対応するＲＮＡ－ｓｅｑデータとの間の変化の方向がよく一致していることを示す。生物学的関連性の低い確率的変化から保護するために、セクレトミクス及びＲＮＡ－Ｓｅｑデータによってｑ＜０．０５有意であったデータ識別名（ＩＤ）のみをこの比較に使用した。同じＲＮＡ－Ｓｅｑデータセットを、Ｍａｎ－１３プロテオミクスの両実行に対する比較に使用した。タンパク質対比率の方法論。Ａ）分泌型プロテオミクスは、総タンパク質存在量の変化に非常に脆弱である。生物学的及び技術的なばらつきに加え、（Ａ）で明らかにされた異なるタンパク質源の相対的な寄与は、関心のあるタンパク質の正規化に影響を与え、統計的ノイズを増加させる可能性がある。正規化された個別のタンパク質存在量は変化しても、関心のある同じ刺激に強く応答するタンパク質の相対存在量は、それらの条件下で比較的一貫しているはずである。例えば、Ｂ）に提示された２つのマーカータンパク質は、それぞれの質量分析ランでＥ８とＥ６に有意な変化を示したが（ｑ＜０．０５）、しかしながら、これらのタンパク質の個別の存在量はラン間で劇的に変化する。箱ひげ図のひげは外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｃ）これらのタンパク質の間の関係を調べることにより、外れ値を除いたすべてのランで、すべての例において、ＮＰＴＸ２の個別の存在量はＥ６のＯＬＦＭＬ３の３倍未満であるが、しかしながらＥ８のＯＬＦＭＬ３の個別の存在量の９倍を超えることが明らかになる。Ｄ）すべての試料におけるこれらのタンパク質の相対存在量を計算することにより、この測定基準による条件間の差は、個別の存在量を比較する場合よりも大きくなり、ＭＳ／ＭＳラン間でより一貫性がある。対にされたタンパク質の比率分析による確実なマーカータンパク質の特定。Ａ）タンパク質の相対存在量の比率が、すべてを別のタンパク質と比較することにより算出された。これらの比率は、Ｅ８とＥ６との間でＦＤＲ調整された統計的有意性について検定された。Ｍａｎ－１３ラン１（Ｍ１３Ｒ１）、Ｍａｎ－１３ラン２（Ｍ１３Ｒ２）及びＲｅｂｌ．ＰＡＴでｑ＜０．０５を示したタンパク質対の組み合わせが、ネットワークを作成するために使用された。タンパク質がノードとして働き、Ｅ８とＥ６との間のこれらのタンパク質の相対存在量の有意な変化は、タンパク質の対の間のエッジとして働く。Ｂ）他のタンパク質に対して最も一貫した変化を示したタンパク質は、最も相互に関連した３０種のタンパク質を特定することにより分離された。Ｃ）統計学的及び生物学的特性の両方に基づいて抗体アッセイ用に選択された８種のタンパク質のデータ概要。ウエスタンブロットで確認するために選択されたマーカータンパク質のＭＳ／ＭＳ個別存在量及び相対存在量の箱ひげ図。示された個別の存在量（左列及び最上行）並びに相対存在量タンパク質対（対応する行と列の交点）は、対の相対存在量に基づいてウエスタンブロットにより確認するために選択されたマーカータンパク質のものである。箱ひげ図のｙ軸は、Ｌｏｇ２変換した個別の存在量（個々のマーカーについて）、又はＬｏｇ２変換したＥ８マーカーの個別の存在量から差し引かれたＬｏｇ２変換したＥ６マーカーの個別の存在量として表現した相対存在量のいずれかを示す。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ａ）７日間の救出後のマーカー相対存在量の再確立。Ｍａｎ－１細胞は（１．Ａ）に記載されたように培養されたが、４８時間後の培地回収後、Ｅ６培養細胞は継代されて７日間Ｅ８に戻された。各タンパク質対は、１枚の膜で試験した。（Ｂ）ＯＬＦＭＬ３／ＮＩＤ１及び（Ｃ）ＦＳＴ／ＮＰＴＸ２についての救出実験からの使用済み培地の代表的なウエスタンブロットバンドと対応するデンシトメトリー測定を示す。デンシトメトリーは、ＩｍａｇｅＪで計算した。膜は、ＬＩＣＯＲＯｄｙｓｓｅｙシステムを使用して画像化した。条件培地中のマーカータンパク質のウエスタンブロット。各条件で等量の濃縮条件培地を泳動させ、各対で同じ膜を両方の抗体でプロービングした。膜はＬＩＣＯＲＯｄｙｓｓｅｙシステムを用いて画像化された。これらのブロットの定量化は、図７Ａに示されている。Ｅ８（Ｍａｎ１３）又は４８時間後にＥ６（Ｍａｎ１３又はＲｅｂｌＰａｔ）で培養され、その後Ｅ８で７日間回復させたヒト多能性幹細胞の皮下移植によって生成されたテラトーマのパラフィン切片（７μｍ）を、形態マーカー及び３つの胚葉のタンパク質マーカーについて染色した。パラフィン切片は、ヘマトキサリン及びエオシン、又は初期内胚葉に対する抗体（ＧＡＴＡ６）、神経外胚葉に対する抗体（β３チューブリン）又は中胚葉の平滑筋アクチンに対する抗体（αＳＭＡ）で染色した。スケールバー［＝１／６幅＝］１００ｕｍ。Ａ）ＡＤＡＭＴＳ８／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＡＤＡＭＴＳ８個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＡＰＰ／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＡＰＰ個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）Ｂ３ＧＮＴ７／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。Ｂ３ＧＮＴ７個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＣＨＧＡ／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＣＨＧＡ個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＥＦＥＭＰ１／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＥＦＥＭＰ１個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＥＰＨＡ１／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＥＰＨＡ１個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＥＸＴＬ２／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＥＸＴＬ２個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＦＢＬＮ２／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＦＢＬＮ２個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＦＧＦ２／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＦＧＦ２個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＦＵＣＡ２／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＦＵＣＡ２個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＧＡＬＮＴ１／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＧＡＬＮＴ１個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＧＧＨ／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＧＧＨ個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＨＥＸＢ／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＨＥＸＢ個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＩＧＦＢＰ４／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＩＧＦＢＰ４個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＮＩＤ１／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＮＩＤ１個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＮＰＴＸ２／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＮＰＴＸ２個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＮＴＳ／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＮＴＳ個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＰＣＤＨＢ５／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＰＣＤＨＢ５個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＳＥＭＡ３Ａ／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＳＥＭＡ３Ａ個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＳＥＭＡ３Ｆ／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＳＥＭＡ３Ｆ個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＳＦＲＰ２／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＳＦＲＰ２個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＴＩＭＰ４／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＴＩＭＰ４個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＴＮＦＲＳＦ８／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＴＮＦＲＳＦ８個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。Ａ）ＷＦＤＣ２／Ｅ６マーカータンパク質－相対存在量。ＷＦＤＣ２個別の存在量を選択された各Ｅ６マーカータンパク質の個別の存在量で割ることによって計算された相対存在量を示す箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。Ｂ）各条件及び細胞株における各タンパク質対の相対存在量、並びに対応する条件間倍率変化及び条件間の差の有意性についてのＴ検定を示す表。プロテオミクスデータ（１）におけるＥ８マーカータンパク質、すなわち、Ｅ６培地においてよりも多能性培地Ｅ８において存在量が大きいタンパク質の個別の存在量の箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。プロテオミクスデータ（２）におけるＥ８マーカータンパク質、すなわち、Ｅ６培地においてよりも多能性培地Ｅ８において存在量が大きいタンパク質の個別の存在量の箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。プロテオミクスデータ（３）におけるＥ８マーカータンパク質、すなわち、Ｅ６培地においてよりも多能性培地Ｅ８において存在量が大きいタンパク質の個別の存在量の箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。プロテオミクスデータにおけるＥ６マーカータンパク質、すなわち、多能性Ｅ８培地においてよりも多能性喪失培地Ｅ６において存在量が大きいタンパク質の個別の存在量の箱ひげ図。箱ひげ図のひげは、外れ値（点として表示されている）を除いた最小値及び最大値を表す。ＲＮＡ及びタンパク質の個別の存在量に関する条件間ｌｏｇ倍率変化及びＦＤＲ調整ｐ値を示す表。代替培地で培養された幹細胞培養物におけるＮＰＴＸ２／ＦＳＴの相対存在量の評価。Ａ）は、異なる濃度の培地ＴｅＳＲ１におけるＮＰＴＸ２、ＦＳＴ及びＮＩＤタンパク質の検出を示す。Ｅ６培地中のそれらタンパク質の濃度も対照として示されている。Ｂ）は、ＴＥＳＲ１培地で成長した細胞、並びに２４時間（ｈｒ）後及び４８時間後のステージ１軟骨細胞分化培地で成長した細胞を示す。２４時間後及び４８時間後に、分化培地でＮＰＴＸ２の消失とともにフォリスタチンが増加していることが明確に観察される。代替培地で培養された幹細胞培養物におけるＮＰＴＸ２／ＦＳＴの相対存在量の評価。Ｃ）は、ＴｅＳＲ１多能性培地対ステージ１軟骨細胞分化培地で成長した細胞から濃縮した培地の中のＮＰＴＸ２／ＦＳＴ比を示す。これは、ＮＰＴＸ２／ＦＳＴの相対存在量の減少は多能性の喪失を示唆するということを示す。この知見は、図２４Ａ）及びＢ）に示すように、Ｅ８／Ｅ６培地を用いた培地における知見と一致するため、本明細書に記載されるタンパク質対の相対存在量は、異なる培地を用いた多能性状態の指標として用いることができることを実証する。

これより本発明がさらに説明される。以下の節では、本発明の異なる態様がより詳細に規定される。このように規定された各態様は、組み合わせることができないと明確に示されない限り、他の任意の態様（複数可）と組み合わされてもよい。特に、好ましい又は有利であるとして示された任意の特徴は、好ましい又は有利であるとして示された任意の他の特徴（複数可）と組み合わされてもよい。本発明の実施は、特段の記載がない限り、当業者の技術範囲内にある細胞生物学、微生物学、組織培養、分子生物学、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、バイオインフォマティクスの従来技術を採用することになる。このような技術は、文献で十分に説明されている。

本発明者らは、幹細胞培養物の多能性状態の指標、例えば多能性喪失の指標を提供するためのマーカーとして使用することができる、多能性幹細胞のセクレトーム中のタンパク質バイオマーカーを特定した。このバイオマーカーは、培養された胚性幹細胞（Ｍａｎ－１３）及び人工多能性幹細胞（Ｒｅｂｌ．ＰＡＴ）からの使用済み培地のプロテオーム分析で特定された。細胞は、多能性を維持する培地であるＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｅ８）で成長後、Ｅ６培地（Ｅ６）に４８時間移され、多能性の早期の無指向性解消を再現した。Ｅ６はＥ８培地と同一であるが、成長因子であるＦＧＦ２及びＴＧＦβを欠き、従って分化を誘導する。従って、Ｅ６は分化培地と説明することができる。それゆえ、Ｅ６培地は、多能性を失った細胞が多能性を持つ細胞と比較して、どのタンパク質が異なって産生されるかを試験するために使用することができる。Ｅ８とＥ６の両方の培養液から培地が回収され、２つの培地間のトランスクリプトームの変化が分析され、多能性マーカーが特定された。Ｅ８培地（「多能性培地」）及びＥ６培地（「分化培地」）で異なるレベルで存在するタンパク質バイオマーカーが特定された。このように、多能性の早期喪失に関連するタンパク質マーカーを決定することができた。

加えて、特定のタンパク質対の比率を評価した。４つのＥ８濃縮タンパク質及び４つのＥ６濃縮タンパク質は、２つの細胞状態（すなわち、多能性対分化）を一貫して確実に区別する１６のタンパク質対の比率を与えることが実証された。本発明者らはさらに、４８時間Ｅ６培養した細胞を７日間Ｅ８に戻すと、健全なレベルの多能性を回復し、セクレトーム中の多能性関連マーカーの比率がこれを反映していることを明らかにした。その後の実験により、細胞培養物の多能性状態のバイオマーカーであるさらなるタンパク質対が特定された。このように、２つのタンパク質の比率、すなわちタンパク質の相対存在量を評価することは、幹細胞培養物の多能性状態を評価する信頼性が高く確実な方法を提供する。それゆえ、本発明の方法によれば、多能性細胞培養物の基準値又はベースライン値（例えば、タンパク質の絶対存在量又は相対存在量のベースライン値）を確立し、次にタンパク質の絶対存在量及び／又は相対存在量を監視することによって、任意の与えられた幹細胞株及び培地における幹細胞培養物の状態を監視することが可能である。基準値からの偏差は、多能性状態の変化を示す。本明細書において、基準値又はベースライン値という用語は、互換的に使用される。

従って、第１の態様では、本発明は、幹細胞培養物の多能性状態を判断する方法であって、幹細胞を培養する工程と、
ａ）アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及びＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）から選択される２種のタンパク質の相対存在量を測定し、この相対存在量を基準値と比較する工程、並びに／又は
ｂ）アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及びＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）から選択される１つ以上のタンパク質の絶対存在量を測定し、この絶対存在量を基準値と比較する工程と
を含む方法に関する。

本明細書で使用する場合、用語「幹細胞」（「ＳＣ」）は、自己再生及び複数の系譜に分化することができる細胞を指す。幹細胞は、発生学的に多能性又は多分化能の細胞である。幹細胞は分裂して２つの娘幹細胞、あるいは１つの娘幹細胞と１つの前駆（「トランジット」）細胞を作り出し、次にこれが組織の成熟した完全に形成された細胞へと増殖することができる。幹細胞は、例えば、胚由来のもの（「胚性幹細胞」）であってもよいし、成体由来のものであってもよい。本発明によれば、異なる幹細胞株が使用されてもよく、これにはＭａｎ－１３及びＲｅｂｌ．ＰＡＴが含まれるが、これらに限定されない。

成体幹細胞の例としては、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、及び骨髄間質細胞が挙げられるが、これらに限定されない。これらの幹細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、筋細胞、骨髄間質細胞、及び胸腺間質（間葉系幹細胞）、肝細胞、血管細胞、筋肉細胞（造血幹細胞）、筋細胞、肝細胞、及びグリア細胞（骨髄間質細胞）、さらには３つのすべての胚葉からの細胞（成体神経幹細胞）等様々な種類の細胞への分化能を有していることが確認されている。

本明細書で使用する場合、「多能性細胞」又は「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）という用語は、完全な分化汎用性、例えば、哺乳動物の身体の約２６０種の細胞型のいずれかに成長する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、インビトロで及び胚内で一過性に自己再生することができる。多能性幹細胞という用語には、体細胞からリプログラミングされて多能性幹細胞の性質を持つようになった人工多能性幹細胞も含まれる。全能性細胞（例えば、受精した二倍体卵細胞）とは異なり、多能性細胞は、多能性胚性幹細胞であっても、通常、新たな胚盤胞を形成することができない。本発明の様々な態様によれば、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であってもよい。

哺乳動物胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞である。ＥＳ細胞は、発育中の胚の外側の栄養外胚葉層を除去し、内側の細胞塊を非成長細胞の支持細胞層上で培養することにより単離することができる。適切な条件下で、増殖中の未分化なＥＳ細胞のコロニーが生成される。このコロニーを取り出し、個々の細胞に解離させた後、新しい支持細胞層に再プレーティングすることができる。再プレーティングされた細胞は増殖を続け、未分化ＥＳ細胞の新しいコロニーを生成することができる。次に、この新しいコロニーを取り出し、解離させ、再び再プレーティングし、成長させることができる。この未分化ＥＳ細胞の「継代培養」又は「継代」のプロセスを何回か繰り返して、未分化ＥＳ細胞を含む細胞株を作製することができる。

本明細書で使用する場合、用語「胚性幹細胞」（「ＥＳ細胞」又は「ＥＳＣ」）は、胚盤胞（例えば、４～５日齢のヒト胚）の内部細胞塊に由来し、成熟動物に存在する多くの又はすべての細胞型をもたらす能力を有する多能性細胞を指す。ヒト胚性幹細胞の非限定的な例としては、ＨＩ、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧＯｌ、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦｌ、ＨＳＦ６、ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３Ｂ、ＭＡＮ１－１６及びＨ１４が挙げられる。多能性細胞は、以下でより詳細に議論されるように、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。ｉＰＳＣの非限定的な例としては、ＲｅｂｌＰａｔが挙げられる。

マウスＥＳ細胞を取得する方法は周知である。１つの方法では、１２９系マウス由来の着床前胚盤胞がマウス抗血清で処理されて栄養外胚葉が除去され、その内部細胞塊が化学的に不活性化されたマウス胎仔線維芽細胞の支持細胞層上でウシ胎仔血清含有培地中で培養される。発育した未分化ＥＳ細胞のコロニーは、ウシ胎仔血清の存在下でマウス胎仔線維芽細胞の支持細胞層上で継代培養され、ＥＳ細胞の集団が作製される。ある方法では、マウスＥＳ細胞は、サイトカインである白血病抑制因子（ＬＩＦ）を血清含有培養培地に添加することにより、支持細胞層の不存在下で成長させることができる。

ＥＳ細胞のもう１つの供給源は、樹立されたＥＳ細胞株である。様々なマウス細胞株及びヒトＥＳ細胞株が公知であり、それらの成長及び増殖のための条件は、当該技術分野において明確にされている。本発明の実施が、本発明の実施に向けてｈＥＳ細胞又は胚性幹細胞を製造するために、ヒト胚盤胞を解体することを必要とすることは決してない。実際、ｈＥＳ細胞は、公的寄託機関（例えば、ＷｉＣｅｌｌ研究所（ＷｉＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州、米国、又はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅｃｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、バージニア州、米国）から入手可能な確立された系統から得ることが可能である。

ＰＳＣは、「人工多能性幹細胞」（「ｉＰＳＣ」）、すなわち、体細胞、例えば分化した体細胞からリプログラミングすることによって誘導された幹細胞であってもよい。ｉＰＳ細胞は、ＥＳＣと同様にして自己再生して成熟細胞へと分化することができる。

本明細書で使用する場合、用語「支持細胞」は、いくつかの組織培養系で成長支持体として使用される細胞を指す。支持細胞は、胚性線条体細胞又は間質細胞であってもよい。

本発明は、幹細胞を培養するために用いられる特定の培養培地に限定されるものではなく、当業者であれば、当該技術分野で開示されるような多数の異なる培地を用いることができることを知っているであろう。適切な培地は、多能性を支持し、ＰＳＣの自己再生を維持する。特定の態様では、細胞は、線維芽細胞等の支持細胞とともに、又は線維芽細胞条件培地中で成長させられてもよい。しかしながら、好ましくは、幹細胞が、支持細胞の不存在下で成長させられることが好ましい場合がある。いくつかの態様では、細胞は、ＴｅＳＲ１培地（米国特許出願公開第２００６／０８４１６８号明細書参照）等の限定培地中で成長させられてもよい。このような培地は、ＥＳ細胞の無血清培養のために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、培地は、必要な成長因子を供給するためにウシ又はヒトの血清を補充される。

例えば、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、ＧＭＥＭ、又はｎｅｕｒｏｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ、ＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲ－Ｅ８、ＲＳｅＴ及びＮａｉｖｅＣｕｌｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ステムセル・テクノロジー））、ＳｔｅｍＰｒｏ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック））、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｌｕｒｉｐｒｏ（ＣｅｌｌＧｕｉｄａｎｃｅＳｙｓｔｅｍｓ（セル・ガイダンス・システムズ））、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア））、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素）、又はＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング））から選択することができる。１つの実施形態では、培養培地は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｅ８）である。ＴｅＳＲ２等、これらの培地の一部には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むものがあるが、ＴｅＳＲ２由来の、より最近広く使用されているＥ８培地は、ＨＳＡ及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれも含まない。Ｅ８培地は、ヒト多能性幹細胞の成長及び拡大のために特別に調合されたゼノフリー及びフィーダー（支持体）フリーの培地である［１８］。

幹細胞培養培地は、血清を含むことができるし、又は無血清培地であることも可能である。無血清培地は、外因性成長因子を添加せずに用いることができるし、又は塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子－２（ＩＧＦ－２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８）、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）等の成長因子又はビタミンＣを補充することも可能である。非付着面は、低付着性組織培養プラスチックとすることができる。

培地は、Ｒｏｃｋ阻害剤等の付加的な因子を含んでいてもよい。Ｙ－２７６３２等のＲｏｃｋ阻害剤でＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）活性を阻害すると、凍結保存ストックからのｈＥＳ細胞の回収が著しく高まり、ｈＥＳ細胞のコロニー数及びコロニーサイズが増加するということが知られている。培養培地は、塩類、ビタミン類、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、γアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム及びトランスフォーミング成長因子βを、複数回の連続的な継代培養によりヒト幹細胞を未分化な状態に維持するのに十分な量で含有してもよい。

本明細書で使用する場合の「絶対存在量」又は「個別の存在量」という用語は、試験試料、すなわち幹細胞培養物中の関心のある（目的の）個々のタンパク質のレベル、すなわち濃度を指す。それゆえ、これは、試料中に存在する個々のタンパク質の量を表す。これは、以下にさらに例示され、そして質量分析に基づく方法を含む当該技術分野で既知の方法によって決定することができる。値は、ＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓＩＱプロテオミクスソフトウェア［１］又はＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェア［２］のいずれかによって提供される数値であることができ、個々のタンパク質の量を表す。

本明細書で使用する場合の「相対存在量」という用語は、同じ試料中のタンパク質Ｘの存在量／タンパク質Ｙの存在量を指す。従って、相対存在量を評価するためには、タンパク質の対が分析される。相対存在量は、タンパク質Ｘの個別の存在量をタンパク質Ｙの個別の存在量で割ることによって計算される。このことは、実施例及び図でさらに説明される。従って、相対存在量の値は、関心のある２つのタンパク質間の存在量の差を表す。相対タンパク質存在量を測定することは、個々のタンパク質の絶対存在量を測定することと比較して、より信頼性が高く、統計的に有意で、再現性のある比較を提供する。相対存在量を評価することにより、マーカー発現は「正規化」され、これは、動態内及び動態間のばらつき（試料間及びラン間のばらつき）を補正する。正規化されたデータは、タンパク質の発現を定量化する際に特に有用である。従って、本発明の方法は、タンパク質の定量的発現（疾患体液バイオマーカーの発見及び評価のように）に依存せず、むしろ、個々の細胞株に適用される制御条件間、すなわち多能性維持条件及び早期自然分化又は誘導分化誘導条件との間、の比率に依存する。このため、この方法は、体液／組織中の新規（例えば、疾患）バイオマーカーを定量化する際、並びに異なる性別、年齢、環境の影響及び合併症等を有する全く異なる個体間を比較する際（このような場合、修飾及びアイソフォームによってデータが不明瞭になり／歪むことになる）に特有の困難を大幅に回避する。異なる条件下での中央値（すなわち、たった１つのイオンや平均値に依存しない）を用いてペプチド比の差を指定する中央値（平均値ではない）ベースの統計が、計算に使用される。

本明細書で使用する場合の「基準値」又は「ベースライン値」という用語は、幹細胞基準培養物において確立された値を指す。「基準培養物」は、陽性対照であってもよいし陰性対照であってもよい。基準培養物が陽性対照である場合、細胞の基準培養物は、ＰＳＣを含む。好ましくは、このような基準培養物は、既知の割合のＰＳＣを含む。従って、試験されるタンパク質マーカーに応じて、試験される細胞の培養物におけるマーカーレベルが、細胞の基準培養物におけるマーカーレベルよりも低いことは、培養細胞における残存する未分化なＰＳＣの不存在又は存在を示す。１つの例では、試験される細胞の培養物中のマーカーレベルが細胞の基準培養物中のマーカーレベルより低いことは、培養細胞中の残存する未分化のＰＳＣの存在を示すが、細胞の基準培養物中のＰＳＣの既知の割合より低い割合での存在であることを示す。基準培養物は、試験培養物と同じ細胞株を含み、試験培養物と同じ培地を用いて培養される。例えば、試験培養物は、細胞が多能性を失ったか否かを評価するために、一定期間培養維持された基準培養物に由来するものであってもよい。基準培養物の多能性を確立するための基準培養物の多能性は、フローサイトメトリ［例えばＴｒａ１８１及びＮａｎｏｇを用いる］、免疫細胞化学、細胞を培養すること等による標準法を用いて、成長及びさらなる継代とともに分化の合図に対する応答及び３胚層胚様体形成を評価することによって、評価することができる。

本発明の方法によれば、基準値から離れた偏差は、本明細書でさらに説明するように、多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失（多能性の喪失の可能性）又は多能性の回復を示してもよい。

用語「条件間ｌｏｇ倍率変化」、「条件間対数倍率変化」は、例えばＥ８及びＥ６細胞培地での培養物のような、関心のある２つの条件間のタンパク質存在量の差を表す数値を意味することが意図されている。

本明細書で使用する「多能性状態」という用語は、幹細胞培養物における幹細胞の多能性、すなわち、幹細胞が多能性であるか否かを指す。

試験タンパク質又は試験タンパク質対という用語は、分析されている関心のあるタンパク質／タンパク質対を指す。同様に、試験培養物という用語は、多能性状態について評価されている関心のある幹細胞培養物を指す。１つの実施形態では、当該方法は、１つ以上のタンパク質対の相対存在量を測定することを含み、このタンパク質対は、以下の群の１つから選択される単一群に列挙された２つのタンパク質によって形成される。
ａ）ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａ（すなわち、図６に示すように１６の可能な対）、好ましくは第１のタンパク質は、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ及びＯＬＦＭＬ３を含む第１の組のタンパク質から選択され、第２のタンパク質は、ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２及びＳＥＭＡ３Ａを含む第２の組のタンパク質から選択される、
ｂ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＡＤＡＭＴＳ８、
ｃ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＡＰＰ、
ｄ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＢ３ＧＮＴ７、
ｅ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＣＨＧＡ、
ｆ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＥＦＥＭＰ１、
ｇ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＥＰＨＡ１、
ｈ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＥＸＴＬ２、
ｉ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＦＢＬＮ２、
ｊ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＦＧＦ２、
ｋ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＦＵＣＡ２、
ｌ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＧＡＬＮＴ１、
ｍ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＧＧＨ、
ｎ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＨＥＸＢ、
ｏ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＩＧＦＢＰ４、
ｐ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＮＩＤ１、
ｑ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＮＰＴＸ２、
ｒ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＮＴＳ、
ｓ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＰＣＤＨＢ５、
ｔ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＳＥＭＡ３Ａ、
ｕ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＳＥＭＡ３Ｆ、
ｖ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＳＦＲＰ２、
ｗ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＴＩＭＰ４、
ｘ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＴＮＦＲＳＦ８、
ｙ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＴＯＭと対になったＷＦＤＣ２。

測定された２つのタンパク質の相対存在量は、基準値と比較される。１つの実施形態では、基準値は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）培養物、すなわち既知の割合のＰＳＣを含む幹細胞培養物、好ましくは高い割合のＰＳＣを含む幹細胞培養物、又はより好ましくは初期状態のｐＳＣの純粋培養物を含む幹細胞培養物で測定された２つのタンパク質の相対存在量である。相対存在量の差は、幹細胞が多能性を失っているか否か、すなわち、試験された幹細胞が、細胞の基準培養物中のＰＳＣの割合よりも低い割合の未分化細胞（従って、細胞の基準培養物中のＰＳＣの割合よりも高い割合の分化細胞）を含むか否かを示す。これらの方法工程を適用すると、図６、図７、図９～図３２に示すように、以下のタンパク質対のうちの１つ以上の相対存在量が測定され、幹細胞培養物の多能性状態が判断される。
ａ）ＣＯＣＨ／ＣＨＧＡ、ＣＯＣＨ／ＮＩＤ１、ＣＯＣＨ／ＮＰＴＸ２、ＣＯＣＨ／ＳＥＭＡ３Ａ、ＦＧＦＲ１／ＣＨＧＡ、ＦＧＦＲ１／ＮＩＤ１、ＦＧＦＲ１／ＮＰＴＸ２、ＦＧＦＲ１／ＳＥＭＡＳ３Ａ、ＦＳＴ／ＣＨＧＡ、ＦＳＴ／ＮＩＤ１、ＦＳＴ／ＮＰＴＸ２、ＦＳＴ／ＳＥＭＡＡ３、ＯＬＦＭＬ３／ＣＨＧＡ、ＯＬＦＭＬ／ＮＩＤ１、ＯＬＦＭＬ３／ＮＰＴＸ２、又はＯＬＦＭＬ３／ＳＥＭＡ３Ａ、各対について、相対存在量の増加は多能性の喪失を示す、
ｂ）ＡＤＡＭＴＳ８／ＡＳＳ１、ＡＤＡＭＴＳ８／ＣＫＢ、ＡＤＡＭＴＳ８／ＣＮＭＤ、ＡＤＡＭＴＳ８／ＣＯＣＨ、ＡＤＡＭＴＳ８／ＦＧＦＲ１、ＡＤＡＭＴＳ８／ＦＳＴ、ＡＤＡＭＴＳ８／ＯＬＦＭＬ３、ＡＤＡＭＴＳ８／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＡＤＡＭＴＳ８／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｃ）ＡＰＰ／ＡＳＳ１、ＡＰＰ／ＣＫＢ、ＡＰＰ／ＣＮＭＤ、ＡＰＰ／ＣＯＣＨ、ＡＰＰ／ＦＧＦＲ１、ＡＰＰ／ＦＳＴ、ＡＰＰ／ＯＬＦＭＬ３、ＡＰＰ／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＡＰＰ／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｄ）Ｂ３ＧＮＴ７／ＡＳＳ１、Ｂ３ＧＮＴ７／ＣＫＢ、Ｂ３ＧＮＴ７／ＣＮＭＤ、Ｂ３ＧＮＴ７／ＣＯＣＨ、Ｂ３ＧＮＴ７／ＦＧＦＲ１、Ｂ３ＧＮＴ７／ＦＳＴ、Ｂ３ＧＮＴ７／ＯＬＦＭＬ３、Ｂ３ＧＮＴ７／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＢ３ＧＮＴ７／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｅ）ＣＨＧＡ／ＡＳＳ１、ＣＨＧＡ／ＣＫＢ、ＣＨＧＡ／ＣＮＭＤ、ＣＨＧＡ／ＣＯＣＨ、ＣＨＧＡ／ＦＧＦＲ１、ＣＨＧＡ／ＦＳＴ、ＣＨＧＡ／ＯＬＦＭＬ３、ＣＨＧＡ／ＳＥＲＰＩＮＢ９、又はＣＨＧＡ／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｆ）ＥＦＥＭＰ１／ＡＳＳ１、ＥＦＥＭＰ１／ＣＫＢ、ＥＦＥＭＰ１／ＣＮＭＤ、ＥＦＥＭＰ１／ＣＯＣＨ、ＥＦＥＭＰ１／ＦＧＦＲ１、ＥＦＥＭＰ１／ＦＳＴ、ＥＦＥＭＰ１／ＯＬＦＭＬ３、ＥＦＥＭＰ１／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＥＦＥＭＰ１／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｇ）ＰＨＡ１／ＡＳＳ１、ＥＰＨＡ１／ＣＫＢ、ＥＰＨＡ１／ＣＮＭＤ、ＥＰＨＡ１／ＣＯＣＨ、ＥＰＨＡ１／ＦＧＦＲ１、ＥＰＨＡ１／ＦＳＴ、ＥＰＨＡ１／ＯＬＦＭＬ３、ＥＰＨＡ１／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＥＰＨＡ１／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｈ）ＥＸＴＬ２／ＡＳＳ１、ＥＸＴＬ２／ＣＫＢ、ＥＸＴＬ２／ＣＮＭＤ、ＥＸＴＬ２／ＣＯＣＨ、ＥＸＴＬ２／ＦＧＦＲ１、ＥＸＴＬ２／ＦＳＴ、ＥＸＴＬ２／ＯＬＦＭＬ３、ＥＸＴＬ２／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＥＸＴＬ２／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｉ）ＦＢＬＮ２／ＡＳＳ１、ＦＢＬＮ２／ＣＫＢ、ＦＢＬＮ２／ＣＮＭＤ、ＦＢＬＮ２／ＣＯＣＨ、ＦＢＬＮ２／ＦＧＦＲ１、ＦＢＬＮ２／ＦＳＴ、ＦＢＬＮ２／ＯＬＦＭＬ３、ＦＢＬＮ２／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＦＢＬＮ２／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｊ）ＦＧＦ２／ＡＳＳ１、ＦＧＦ２／ＣＫＢ、ＦＧＦ２／ＣＮＭＤ、ＦＧＦ２／ＣＯＣＨ、ＦＧＦ２／ＦＧＦＲ１、ＦＧＦ２／ＦＳＴ、ＦＧＦ２／ＯＬＦＭＬ３、ＦＧＦ２／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＦＧＦ２／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｋ）ＦＵＣＡ２／ＡＳＳ１、ＦＵＣＡ２／ＣＫＢ、ＦＵＣＡ２／ＣＮＭＤ、ＦＵＣＡ２／ＣＯＣＨ、ＦＵＣＡ２／ＦＧＦＲ１、ＦＵＣＡ２／ＦＳＴ、ＦＵＣＡ２／ＯＬＦＭＬ３、ＦＵＣＡ２／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＦＵＣＡ２／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｌ）ＧＡＬＮＴ１／ＡＳＳ１、ＧＡＬＮＴ１／ＣＫＢ、ＧＡＬＮＴ１／ＣＮＭＤ、ＧＡＬＮＴ１／ＣＯＣＨ、ＧＡＬＮＴ１／ＦＧＦＲ１、ＧＡＬＮＴ１／ＦＳＴ、ＧＡＬＮＴ１／ＯＬＦＭＬ３、ＧＡＬＮＴ１／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＧＡＬＮＴ１／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｍ）ＧＧＨ／ＡＳＳ１、ＧＧＨ／ＣＫＢ、ＧＧＨ／ＣＮＭＤ、ＧＧＨ／ＣＯＣＨ、ＧＧＨ／ＦＧＦＲ１、ＧＧＨ／ＦＳＴ、ＧＧＨ／ＯＬＦＭＬ３、ＧＧＨ／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＧＧＨ／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｎ）ＨＥＸＢ／ＡＳＳ１、ＨＥＸＢ／ＣＫＢ、ＨＥＸＢ／ＨＥＸＢ／ＣＮＭＤ、ＨＥＸＢ／ＣＯＣＨ、ＨＥＸＢ／ＦＧＦＲ１、ＨＥＸＢ／ＦＳＴ、ＨＥＸＢ／ＯＬＦＭＬ３、ＨＥＸＢ／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＨＥＸＢ／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｏ）ＩＧＦＢＰ４／ＡＳＳ１、ＩＧＦＢＰ４／ＣＫＢ、ＩＧＦＢＰ４／ＣＮＭＤ、ＩＧＦＢＰ４／ＣＯＣＨ、ＩＧＦＢＰ４／ＦＧＦＲ１、ＩＧＦＢＰ４／ＦＳＴ、ＩＧＦＢＰ４／ＯＬＦＭＬ３、ＩＧＦＢＰ４／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＩＧＦＢＰ４／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｐ）ＮＩＤ１／ＡＳＳ１、ＮＩＤ１／ＣＫＢ、ＮＩＤ１／ＣＮＭＤ、ＮＩＤ１／ＣＯＣＨ、ＮＩＤ１／ＦＧＦＲ１、ＮＩＤ１／ＦＳＴ、ＮＩＤ１／ＯＬＦＭＬ３、ＮＩＤ１／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＮＩＤ１／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｑ）ＮＰＴＸ２／ＡＳＳ１、ＮＰＴＸ２／ＣＫＢ、ＮＰＴＸ２／ＣＮＭＤ、ＮＰＴＸ２／ＣＯＣＨ、ＮＰＴＸ２／ＦＧＦＲ１、ＮＰＴＸ２／ＦＳＴ、ＮＰＴＸ２／ＯＬＦＭＬ３、ＮＰＴＸ２／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＮＰＴＸ２／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｒ）ＮＴＳ／ＡＳＳ１、ＮＴＳ／ＣＫＢ、ＮＴＳ／ＣＮＭＤ、ＮＴＳ／ＣＯＣＨ、ＮＴＳ／ＦＧＦＲ１、ＮＴＳ／ＦＳＴ、ＮＴＳ／ＯＬＦＭＬ３、ＮＴＳ／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＮＴＳ／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｓ）ＰＣＤＨＢ５／ＡＳＳ１、ＰＣＤＨＢ５／ＣＫＢ、ＰＣＤＨＢ５／ＣＮＭＤ、ＰＣＤＨＢ５／ＣＯＣＨ、ＰＣＤＨＢ５／ＦＧＦＲ１、ＰＣＤＨＢ５／ＦＳＴ、ＰＣＤＨＢ５／ＯＬＦＭＬ３、ＰＣＤＨＢ５／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＰＣＤＨＢ５／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｔ）ＳＥＭＡ３Ａ／ＡＳＳ１、ＳＥＭＡ３Ａ／ＣＫＢ、ＳＥＭＡ３Ａ／ＣＮＭＤ、ＳＥＭＡ３Ａ／ＣＯＣＨ、ＳＥＭＡ３Ａ／ＦＧＦＲ１、ＳＥＭＡ３Ａ／ＦＳＴ、ＳＥＭＡ３Ａ／ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＭＡ３Ａ／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＥＭＡ３Ａ／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｕ）ＳＥＭＡ３Ｆ／ＡＳＳ１、ＳＥＭＡ３Ｆ／ＣＫＢ、ＳＥＭＡ３Ｆ／ＣＮＭＤ、ＳＥＭＡ３Ｆ／ＣＯＣＨ、ＳＥＭＡ３Ｆ／ＦＧＦＲ１、ＳＥＭＡ３Ｆ／ＦＳＴ、ＳＥＭＡ３Ｆ／ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＭＡ３Ｆ／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＥＭＡ３Ｆ／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｖ）ＳＦＲＰ２／ＡＳＳ１、ＳＦＲＰ２／ＣＫＢ、ＳＦＲＰ２／ＣＮＭＤ、ＳＦＲＰ２／ＣＯＣＨ、ＳＦＲＰ２／ＦＧＦＲ１、ＳＦＲＰ２／ＦＳＴ、ＳＦＲＰ２／ＯＬＦＭＬ３、ＳＦＲＰ２／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＳＦＲＰ２／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｗ）ＴＩＭＰ４／ＡＳＳ１、ＴＩＭＰ４／ＣＫＢ、ＴＩＭＰ４／ＣＮＭＤ、ＴＩＭＰ４／ＣＯＣＨ、ＴＩＭＰ４／ＦＧＦＲ１、ＴＩＭＰ４／ＦＳＴ、ＴＩＭＰ４／ＯＬＦＭＬ３、ＴＩＭＰ４／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＴＩＭＰ４／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｘ）ＴＮＦＲＳＦ８／ＡＳＳ１、ＴＮＦＲＳＦ８／ＣＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ８／ＣＮＭＤ、ＴＮＦＲＳＦ８／ＣＯＣＨ、ＴＮＦＲＳＦ８／ＦＧＦＲ１、ＴＮＦＲＳＦ８／ＦＳＴ、ＴＮＦＲＳＦ８／ＯＬＦＭＬ３、ＴＮＦＲＳＦ８／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＴＮＦＲＳＦ８／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す、
ｙ）ＷＦＤＣ２／ＡＳＳ１、ＷＦＤＣ２／ＣＫＢ、ＷＦＤＣ２／ＣＮＭＤ、ＷＦＤＣ２／ＣＯＣＨ、ＷＦＤＣ２／ＦＧＦＲ１、ＷＦＤＣ２／ＦＳＴ、ＷＦＤＣ２／ＯＬＦＭＬ３、ＷＦＤＣ２／ＳＥＲＰＩＮＢ９又はＷＦＤＣ２／ＳＴＯＭ、各対について、相対存在量の減少は多能性の喪失を示す。

本明細書で説明されるように、基準値を参照することによって言及される減少又は増加。

上記に示した異なる実施形態では、上記の１つのグループからの１つ以上の対の相対タンパク質存在量が測定され、例えば、グループａからの１対、２対、３対、４対、５対、６対、７対、８対、９対、１０対、１１対、１２対、１３対、１４対、１５対若しくは１６対又はグループｂ）～ｙ）のいずれかからの１対、２対、３対、４対、５対、６対、７対、８対若しくは９対が、それぞれ測定される。

別の実施形態では、当該方法は、異なるグループから選択される１対、２対又はそれより多い対、例えばグループａ）～ｙ）のそれぞれから選択される１対、２対若しくはそれより多い対又はグループａ）～ｙ）の組み合わせから選択される１対、２対若しくはそれより多い対の相対タンパク質存在量を測定することを含む。

１つの実施形態では、グループａ）から選択される１対、２対又はそれより多い対は、グループｂ）～ｙ）の１つ以上から選択される１対、２対又はそれより多い対と一緒に測定される。

１つの実施形態では、上記の対のすべてが測定される。従って、当該方法は、多重法であることができる。

当業者であれば、上記の対が、タンパク質Ｘ（例えばＮＴＳ）を分子とし、タンパク質Ｙ（例えばＡＳＳ１等のＥ６マーカー）を分母として示されることを理解するであろう。本発明は、このように分子及び分母を指定することに限定されるものではなく、タンパク質Ｙ／タンパク質Ｘを測定することにより、これらの対の相対存在量を異なって測定することも勿論可能である。

別の態様では、本発明は、アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及びＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）から選択される１つ以上のタンパク質の絶対存在量を測定し、この絶対存在量を基準値と比較することに関する。例えば、少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種、２９種、３０種、３１種、３２種又は３３種のタンパク質の存在量を測定することができる。

１つの実施形態では、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２及び／又はＳＥＭＡ３Ａの絶対存在量が測定される。これらのタンパク質の絶対存在量は、図６に示されている。例えば、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３の絶対存在量は、多能性培養物と比較して多能性を喪失した培養物において高く、ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａの絶対存在量は、多能性培養物と比較して多能性を喪失した培養物において低い。

ＡＰＰ、ＡＤＡＭＴＳ８、Ｂ３ＧＮＴ７、ＣＨＧＡ、ＥＦＥＭＰ１、ＥＰＨＡ１、ＥＸＴＬ２、ＦＢＬＮ２、ＦＧＦ２、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬＮＴ１、ＧＧＨ、ＨＥＸＢ、ＩＧＦＢＰ４、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＮＴＳ、ＰＣＤＨＢ５、ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＦＲＰ２、ＴＩＭＰ４、ＴＮＦＲＳＦ８及びＷＦＤＣ２の絶対存在量は、多能性を失った培養物と比較して、多能性を有する培養物において高い（図３３～図３５を参照）。ＡＳＳ１ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣｏｃｈＦＧＦｒ１、ＦＳｔ及びＯＬＦＭＬ３及びＳＴＯＭの絶対存在量は、多能性培養物と比較して多能性を喪失した培養物において高い（図３６を参照のこと）。

別の実施形態では、当該方法は、上記のように相対タンパク質存在量を測定し、加えて、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａ、ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＳＥＲＩＮＢ９、ＳＴＯＭ、ＡＰＰ、Ｂ３ＧＮＴ７、ＥＦＥＭＰ１、ＥＰＨＡ１Ｍ、ＥＸＴＬ２、ＦＢＬＮ２、ＦＧＦ２、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬＮＴ１、ＧＧＨ、ＨＥＸＢ、ＩＧＦＢＰ４、ＮＴＳ、ＰＣＤＨＢ５、ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＲＰ２、ＴＩＭＰ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＷＦＤＣ２及び／又はＡＤＡＭＴＳ８のうちの１つ以上の絶対的なタンパク質存在量を測定することを含む。別の実施形態では、当該方法は、上記のように相対タンパク質存在量を測定し、加えて、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２及び／又はＳＥＭＡ３Ａのうちの１つ以上の絶対タンパク質存在量を測定することを含む。

当該方法は、試験タンパク質又は試験タンパク質対の相対存在量又は絶対存在量の基準値を決定する工程を含んでもよい。この工程は、幹細胞培養物の多能性状態を判断する方法の最初の工程として、上記方法細胞が培養され基準値が決定されるように、当該方法の最初の工程を形成してもよい。この工程に続いて、次に、試験用幹細胞培養物ａを評価することができる。これは、基準培養物と同じ培養物であってもよいが、その後、多能性喪失を評価するために２４時間、４８時間又は７２時間等の時間にわたって評価されるものである。本明細書で説明するように、基準値は、多能性細胞培養物において決定されてもよい。

上記に挙げたタンパク質は、すべて細胞のセクレトームの一部であり、すなわち、それらは、細胞外に輸送されるか、又は細胞外膜に存在する。従って、タンパク質又はそのペプチド部分は、培養培地中で測定することができる。

幹細胞は培養培地中にあってもよく、本明細書で上述したようなタンパク質の存在量は、培養培地中のタンパク質の存在量であってもよい。有利には、上記タンパク質は、細胞によって培養培地中に分泌又はその他の方法で放出されるので、使用済み培養培地を、当該方法によって評価することができる。

培養培地は、幹細胞を播種してから１２時間、２４時間、４８時間及び／又は７２時間以上、例えば４日、５日、６日、７日、８日、９日又は１０日後等、一定の時間間隔で評価されてもよい。代替的に又は追加的に、培養培地は、成長条件を変更してから１２時間、２４時間、４８時間及び／又は７２時間以上、例えば４日、５日、６日、７日、８日、９日又は１０日後に評価されてもよい。培養培地は、代替的に、連続的に、例えば１２時間、２４時間、４８時間及び／又は７２時間以上、例えば４日、５日、６日、７日、８日、９日又は１０日間評価されてもよい。

当業者には、タンパク質の存在量は、タンパク質の同定及び定量に使用される多くの手段によって評価されてよいことが明らかであろう。例えば、タンパク質の存在量は、質量分析（ＭＳ）によって評価されてもよい。マーカータンパク質は、ゲル電気泳動（例えば、ウエスタンブロット又は二次元ゲル電気泳動）、デンシトメトリー（濃度測定）、蛍光、ルミネセンス、及び／又は放射活性を含むプロセスによって定量化されてもよい。

代替的に又は追加的に、タンパク質の存在量は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体（例えばＶＨ若しくはＶＨＨドメイン）又は抗体模倣タンパク質を含む１種以上の抗体によって評価される。多能性培養物における多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失を評価するように、多くの既存の研究キットを適合させることができることも明らかであろう。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び／又は類似の技術は、タンパク質の存在量を評価するために採用することができよう。

関連する態様では、本明細書で上述したような方法は、多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失、安定した多能性状態の回復、又は実際に安定した健全な多能性培養物の成長の継続を検出することにおいて使用するためのものであってよい。

さらなる関連する態様では、本明細書に記載される方法は、多能性培養物における多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失を回復することにおいて使用するためのものであってよい。この態様では、当該方法は、多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失について細胞を評価するために用いられ、そのような喪失が判断された場合、その細胞を多能性の望ましい状態に回復させるように細胞に改善剤を提供する（及び／又は行動をとる）ことができ、それによって多能性はその後、上述のような方法を用いて評価される。さらなる関連する態様では、本明細書に記載される方法は、細胞培養物中のＰＳＣを検出することにおいて使用するためのものであってもよい。

ＰＳＣ細胞を多能性状態に維持する方法であって、そのＰＳＣ細胞を、以下のタンパク質、ＡＰＰ、ＡＤＡＭＴＳ８、Ｂ３ＧＮＴ７、ＣＨＧＡ、ＥＦＥＭＰ１、ＥＰＨＡ１、ＥＸＴＬ２、ＦＢＬＮ２、ＦＧＦ２ＦＵＣＡ２、ＧＡＬＮＴ１、ＧＧＨ、ＨＥＸＢ、ＩＧＦＢＰ４、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＮＴＳ、ＰＣＤＨＢ５、ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＦＲＰ２、ＴＩＭＰ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＷＦＤＣ２、ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａのうちの１つ以上をより高いレベルで発現させることを含む方法。

本発明のさらなる態様によれば、ＰＳＣを成長させる方法であって、
ａ）成長培地にＰＳＣを播種し、その細胞を、成長を可能にするのに有効な条件下でインキュベートする工程と、
ｂ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ１、ＳＴＯＭ、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＰＰ、Ｂ３ＧＮＴ７、ＣＨＧＡ、ＥＦＥＭＰ１、ＥＰＨＡ１、ＥＸＴＬ２、ＦＢＬＮ２、ＦＧＦ２、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬＮＴ、ＧＧＨ、ＨＥＸＢ、ＩＧＦＢＰ４、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＮＴＳ、ＰＣＤＨＢ５、ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＦＲＰ２、ＴＩＭＰ４、ＴＮＦＲＳＦ８及び／又はＷＦＤＣ２のタンパク質又は列挙されたタンパク質のうちの２つから選択されるタンパク質対の１つ以上の個別の存在量及び／又は相対存在量の変化について、成長培地を試験する工程
を含み、上記変化した個別の存在量及び／又は相対存在量は、上記細胞の多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失を示唆する方法が提供される。
を含む方法が提供される。

本発明の関連する態様では、細胞は、多能性の喪失を阻止するために１つ以上の薬剤を添加するか、又は多能性の喪失を阻止するための改善措置をとることにより、多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失から回復される。

多能性は、細胞の継代培養、及び／又は新鮮な培地への培養培地の交換、及び／又は多能性の喪失を阻止若しくは逆転させるための１つ以上の薬剤の使用によって回復されてもよい。

本発明のさらなる態様によれば、多能性幹細胞培養物の多能性状態を評価するための部品のキットであって、
ａ）以下のタンパク質、ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ１、ＳＴＯＭ、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＰＰ、Ｂ３ＧＮＴ７、ＣＨＧＡ、ＥＦＥＭＰ１、ＥＰＨＡ１、ＥＸＴＬ２、ＦＢＬＮ２、ＦＧＦ２、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬＮＴ、ＧＧＨ、ＨＥＸＢ、ＩＧＦＢＰ４、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＮＴＳ、ＰＣＤＨＢ５、ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＦＲＰ２、ＴＩＭＰ４、ＴＮＦＲＳＦ８及び／又はＷＦＤＣ２の１つ以上に結合する、若しくはその他の方法で検出することができる１つ以上の成分、並びに任意に
ｂ）上記１つ以上の成分と上記１つ以上のタンパク質との結合及び／又は検出を定量するための手段、例えば抗体又は抗体断片
を含む部品キットが提供される。

当該キットは、細胞が多能性状態にあるときに細胞培地中に予想されるタンパク質の定量値又はタンパク質存在量を表す対照を含んでいてもよく、使用者が自身の培養系における多能性細胞のベースライン値を確立して当該方法の適用性及び精度を高めることが可能であるようになっていてもよい。

上記１つ以上の成分と上記１つ以上のタンパク質との定量的な結合を検出するための手段はさらに、１つ以上のタンパク質が試料中で増加しているか減少しているかを示してもよい。

当該キットは、１種、２種又はそれより多い、例えば１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種、２９種、３０種、３１種、３２種又は３３種の別々のタンパク質と結合できる１つ、２つ又はそれより多い成分を含んでいてもよく、定量的な結合を検出するための手段はその２つ以上の成分とその２種の別々のタンパク質との定量的結合を検出する。好ましくは、当該キットは、ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ１、ＳＴＯＭから選択される第１のタンパク質に結合できる第１の成分と、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＰＰ、Ｂ３ＧＮＴ７、ＣＨＧＡ、ＥＦＥＭＰ１、ＥＰＨＡ１、ＥＸＴＬ２、ＦＢＬＮ２、ＦＧＦ２、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬＮＴ、ＧＧＨ、ＨＥＸＢ、ＩＧＦＢＰ４、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＮＴＳ、ＰＣＤＨＢ５、ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＦＲＰ２、ＴＩＭＰ４、ＴＮＦＲＳＦ８及び／又はＷＦＤＣ２から選択される第２のタンパク質に結合できる第２の成分を含むであろう。

定量的結合を検出するための手段は、２つ以上のタンパク質の個別の存在量及び／又は相対存在量を計算できるように、２つ以上の別々のタンパク質の各々の相対的な量を示してもよい。

当該キットは、その成分が使用済みの又は条件付けられた（馴化された）成長培地（若しくはその画分）と混合されることを可能にするように、１つ以上の反応容器をさらに含んでもよい。

上記１つ以上の成分は、抗体又はその抗体断片等を含んでもよい。

当該キットは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び／又は類似の技術を含んでもよい。

当該キットは、質量分析を用いてタンパク質を検出することにおける使用に適した成分を含んでいてもよい。

一態様では、当該キットは、多能性幹細胞培養物の使用済みの又は条件付けられた成長培地中の多能性幹細胞培養物の多能性状態を評価することにおいて使用するためのものであってもよい。

上述の開示は、本発明の製造及び使用の方法並びにその最良の態様を含む、本発明の範囲内に包含される主題の一般的な説明を提供するが、以下の実施例は、当業者が本発明をさらに実施することができ、その完全な書面による説明を提供するために提供されるものである。しかしながら、当業者は、これらの実施例の具体的な内容は、本発明を限定するものとして読むべきではなく、本発明の範囲は、本開示に添付された請求項及びその均等物から理解されるべきであると理解するであろう。本発明の様々なさらなる態様及び実施形態は、本開示の観点から当業者には明らかであろう。

配列データベース識別子への言及を含め、本明細書で言及されたすべての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特段の記載がない限り、配列データベース識別子が参照される場合、バージョン番号は１である。本明細書で使用される「及び（並びに）／又は（若しくは）」は、２つの指定された特徴又は構成要素のそれぞれについて、他方を含むか含まないかの具体的な開示として解釈されるものとする。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれについて、それぞれが本明細書に個別に記載されているのと同様に、具体的な開示とみなされるものとする。

文脈と矛盾しない限り、上記に記載された特徴の説明及び定義は、本発明の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載されるすべての態様及び実施形態に等しく適用される。

本発明はさらに、以下の実施形態に関する。

１．以下のタンパク質、アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及び／若しくはＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）の１つ以上の個別の存在量並びに／又は相対存在量を決定することにより、多能性幹細胞培養物の多能性状態を評価する方法。

２．多能性が、以下のタンパク質、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、及び／若しくはセマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）の１つ以上の個別の存在量並びに／又は相対存在量を決定することにより評価される実施形態１に記載の方法。

３．上記１つ以上のタンパク質の個別の存在量及び／又は相対存在量を、その１つ以上のタンパク質の既知若しくはベースラインの個別の存在量及び／又は相対存在量と比較することを含む実施形態１又は実施形態２に記載の方法。

４．上記１つ以上のタンパク質の個別の存在量及び／若しくは相対存在量の増加又は減少が、多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失を示す実施形態１から実施形態３のいずれか１つに記載の方法。

５．ベースラインの個別の存在量及び／又は相対存在量を決定することを含む実施形態１から実施形態４のいずれか１つに記載の方法。

６．上記ベースラインの個別の存在量及び／又は相対存在量が、多能性を示す細胞の個別のタンパク質存在量及び／若しくは相対タンパク質存在量並びに／又はセクレトームを評価することによって決定されてもよい実施形態５に記載の方法。

７．上記ベースラインからの個別の存在量及び／又は相対存在量の偏差が、多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失を示すことができる実施形態５又は実施形態６に記載の方法。

８．上記タンパク質のうちの２つ以上の個別の存在量及び／又は上記タンパク質のうちの２つ以上の間の相対存在量を決定することを含む実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載の方法。

９．上記方法が、上記２つ以上のタンパク質の個別の存在量及び／又は上記２つ以上のタンパク質間の相対存在量を決定することを含み、第１のタンパク質は、アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）を含む第１の組のタンパク質から選択され、第２のタンパク質は、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及び／又はＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）を含む第２の組のタンパク質から選択される実施形態８に記載の方法。

１０．好ましくは、第１のタンパク質が、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）及びオルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）を含む第１の組のタンパク質から選択され、第２のタンパク質が、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ナイドジェン１（ＮＩＤ－１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、及び／又はセマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）を含む第２の組のタンパク質から選択される実施形態９に記載の方法。

１１．上記個別のタンパク質存在量及び／又は上記相対タンパク質存在量が、多能性の喪失若しくは多能性の潜在的な喪失、及び／又は多能性の回復を示してもよい実施形態１から実施形態１０のいずれか１つに記載の方法。

１２．上記２つ以上のタンパク質間のベースラインの相対存在量が決定される実施形態８から実施形態１１のいずれか１つに記載の方法。

１３．上記２つ以上のタンパク質間のベースライン相対存在量が、多能性を示す細胞の個々の相対タンパク質存在量及び／又はセクレトームを評価することによって決定されてもよい実施態様１２に記載の方法。

１４．上記ベースラインからの偏差が、多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失を示す実施形態１２又は実施形態１３に記載の方法。

１５．個別のタンパク質存在量及び／又は相対タンパク質存在量が、多能性の喪失及び／又は多能性の潜在的な喪失及び／又は多能性の回復を示す実施形態１から実施形態１４のいずれか１つに記載の方法。

１６．多能性幹細胞が培養培地中に存在する実施形態１から実施形態１５のいずれか１つに記載の方法。

１７．上記タンパク質の存在量が、培養培地中の上記タンパク質の存在量である実施形態１から実施形態１６のいずれか１つに記載の方法。

１８．上記培養培地が、多能性幹細胞を播種してから７２時間後に評価される実施形態１から実施形態１７のいずれか１つに記載の方法。

１９．上記培養培地が一定の時間間隔で又は連続的に評価される実施形態１から実施形態１８のいずれか１つに記載の方法。

２０．上記タンパク質の存在量が質量分析（ＭＳ）によって評価される実施形態１から実施形態１９のいずれか１つに記載の方法。

２１．上記タンパク質の存在量が、１つ以上の抗体によって評価される実施形態１から実施形態２０のいずれか１つに記載の方法。

２２．上記タンパク質の存在量が、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び／又は類似の技術によって評価される実施形態２１に記載の方法。

２３．多能性の喪失若しくは多能性の潜在的な喪失及び／又は安定した多能性状態の回復を検出することにおいて使用するための実施形態１から実施形態２２のいずれか１つに記載の方法。

２４．多能性幹細胞における多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失を回復することにおいて使用するための実施形態１から実施形態２２のいずれか１つに記載の方法であって、当該方法は、多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失について上記細胞を評価するために用いられ、そのような喪失が判断された場合、その細胞を多能性の望ましい状態に回復させるように細胞に改善剤を提供することができ、かつ／又は改善処置を取ることができ、それによって多能性がその後、実施形態１から実施形態２２のいずれか１つに記載の方法を用いて評価される方法。

２５．多能性幹細胞を成長させる方法であって、
ａ）成長培地に多能性幹細胞を播種し、その細胞を、成長を可能にするのに有効な条件下でインキュベートすることと、
ｂ）以下のタンパク質、アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及び／若しくはＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）の１つ以上の個別の存在量並びに／又は相対存在量の変化について上記成長培地を試験することと
を含み、上記個別の存在量及び／又は相対存在量の変化は、上記細胞の多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失を示唆する方法。

２６．上記１つ以上のタンパク質の個別の存在量及び／若しくは相対存在量を、予め決定されたベースラインと比較すること、又は上記ベースラインを確立することを含む実施形態２５に記載の方法。

２７．多能性の喪失を阻止するために１つ以上の薬剤を添加すること、又は多能性の喪失を阻止するための改善措置をとることによって、上記細胞が多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失から回復される実施形態２５又は実施形態２６に記載の方法。

２８．細胞の継代培養、及び／又は新鮮な培地への培養培地の交換、及び／又は多能性の喪失を阻止するための１つ以上の薬剤の使用によって多能性が回復されてもよい実施形態２５から実施形態２７のいずれか１つに記載の方法。

本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに説明される。

本発明者らは、培養中のヒト幹細胞の健全な多能性状態をモニタリングするための非侵襲的な方法を開発することを目的として、培養した胚性幹細胞（Ｍａｎ－１３）及び人工多能性幹細胞（Ｒｅｂｌ．ＰＡＴ）の使用済み培地のプロテオーム分析を実施した。細胞をＥ８培地で成長させて多能性を維持し、次いでＥ６培地（同一であるが成長因子ＦＧＦ２及びＴＧＦβを欠く）に４８時間移し、多能性の早期無指向性解消を再現した。４８時間の成長因子飢餓の後、条件培地（馴化培地）を回収し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。本発明者らは、両細胞株における多能性の早期喪失に関連する明確なプロテオミクス的足跡、及びトランスクリプトームの変化との強い相関を特定した。多能性喪失の迅速な診断に利用されてもよいように、多能性状態と一貫した相関を示す信頼性の高いタンパク質バイオマーカーを複数特定した。加えて、新しい対になったタンパク質の比率の測定基準を開発することにより、分泌タンパク質の定量に機能的な正規化法がないことを克服しようとした。本発明者らは、同じ刺激に反応して増加又は減少するタンパク質は、他の正規化基準よりも互いに対してより一貫して検出可能に変化すると仮定した。本発明者らは、４種類のＥ８濃縮タンパク質と４種類のＥ６濃縮タンパク質が、両細胞株で２つの細胞状態を一貫して確実に区別する１６種のタンパク質対比を与えることを明らかにし、さらに３つの細胞株でウエスタンブロット法により確認した。さらに、４８時間Ｅ６で培養した細胞を７日間Ｅ８に戻すと、健全なレベルの多能性が回復し、セクレトーム中の多能性関連マーカーの比率がこれを反映していることを明らかにした。これらのタンパク質マーカーを将来的に使用するための検証をさらに進める作業により、多能性幹細胞の状態を迅速に定量的に読み取り、幹細胞産物を犠牲にすることなく回復可能な段階で培養品質の劣化を早期に警告することができるようになる。

ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を用いたアプローチを含む再生医療の臨床的可能性は、他の追随を許さないものの、有望な治療法をスケーラブルで再現性の高い商業的プロセスに移行させるには大きなハードルが存在する。特に、ｈＰＳＣを多能性状態に維持することは、困難で手間がかかることが判明している。ＳｅｌｅｃＴ（ＴＡＰｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－ハーフォードシャー、英国）、ＦｒｅｅｄｏｍＥＶＯ（ＴＥＣＡＮＴｒａｄｉｎｇＡＧ、スイス）システムの開発、又は東京エレクトロン（京都、日本）によって開発された技術等によって、高品質のＰＳＣの培養及び増殖の自動化が進んでいるが、あらゆる規模のＰＳＣ培養において克服すべき課題として残っているのは、多能性培養物のための迅速で再現性があり非侵襲的かつ定量的な測定基準がないことである。

最も一般的に使用されている技術は、いずれもＰＳＣ製造に使用するには大きな欠点がある。例えば、コアとなる多能性転写因子及び細胞表面マーカーを評価するために免疫蛍光法を使用すると、培養物全体の多能性の初期喪失を正確に拾うことができず、むしろ個々の細胞における比較的遅い多能性の喪失を拾い上げる。免疫蛍光法は不正確でもあり、非定量的でもあるため、製造プロセスに組み込むことができず、検査した細胞は培養から失われてしまう。多能性マーカーの喪失を特定するためにフローサイトメトリを使用すると、大きいランのばらつきが見られ、しかも同じく細胞産物を犠牲にしてしまう。現在、利用できる最も定量化可能な多能性の測定基準は、Ｐｌｕｒｉ－ｔｅｓｔ［３］及びＳｃｏｒｅＣａｒｄ［４］等の細胞に対するＲＮＡベースのアッセイ、又はテラトーマアッセイ［５］である。しかしながら、これらの測定基準は現在のところ費用対効果が高くはなく、細胞産物を犠牲にする必要があり、リスクのある培養物に対して結果を提供するには時間がかかりすぎ、そのため、そのような細胞は結果が出るまでに永久に損なわれてしまう可能性が高い。研究者が現在持っている最も迅速で費用対効果の高いツールは、細胞形態の分析であるが、しかしながら、これは本質的に主観的なものである。ＰＳＣの形態学的特徴を自動化し、定量化する試みがなされているが［６、７］、多能性を測定する方法としては、依然として低分解能のままである［８］。従って、多能性のごく初期の喪失を拾い上げることができる便利な定量的アッセイは存在しない。

これらの制限に対処するため、本発明者らは、潜在的な多能性の喪失が始まってから４８時間以内に使用済み培養培地中で特定できる分泌タンパク質バイオマーカーを特定しようとした。ｈＰＳＣのセクレトームは過去に研究されているが［９～１３］、多能性状態及びその喪失を示唆する培地中のタンパク質を特定することを目的とした比較研究はまだ存在しない。ｈＰＳＣは、その自己再生のために、ＦＧＦ－２及びＴＧＦβのファミリーのメンバーの下流のシグナル伝達経路に依存することがよく確立されている［１４～１６］。標準的なｈＰＳＣ培養培地からこれらの成長因子を除去した後は、細胞は系統分化の前提条件である強固な制御多能性ネットワークを失う［１７］。それゆえ、本発明者らは、培地からＦＧＦ－２及びＴＧＦβを除去することを用いて培養物の劣化を再現し、細胞産物の救出が可能なうちに使用済み培地において検出できるタンパク質バイオマーカーを特定することを目指した。本発明者らは、条件培地のＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して、セクレトーム中の４つのＥ８濃縮タンパク質及び４つのＥ６濃縮タンパク質を特定し、これらは健全な又は不安定な多能性培養物を強く示唆するものである。加えて、本発明者らは、Ｅ６中で富むタンパク質に対してＥ８中で富むタンパク質を多重化することにより、多能性解消及び培養物の劣化のごく初期の兆候に対する高感度アッセイの開発につながるような、条件間の変化の規模と確実性を高めることができることを実証する。本発明者らはさらに、これらのマーカーの有用性を、Ｅ６培養物をＥ８培地に戻して、本発明者らのマーカータンパク質、及びテラトーマアッセイの両方によって判定されるように多能性の完全な回復を導くことにより、実証する。使用済み培地中のこのような指標は、細胞のサンプリング及び産物の損失を回避しながら培養物の劣化を逆転させるために、スケールアップした培養環境において特に有用であり、簡単な検出アッセイにも順応できる。

結果
ＦＧＦ２／ＴＧＦβ除去から４８時間後の多能性喪失は、フローサイトメトリ及び免疫細胞化学（ＩＣＣ）による検出の限界であった。

ＨＥＳＣ（Ｍａｎ－１３：［１８］）及びｉＰＳＣ（Ｒｅｂｌ．ＰＡＴ：［１９］）株（総称してＰＳＣと呼ぶ）を多能性維持培地（Ｅ８［２０］）、又は多能性維持因子ＦＧＦ２及びＴＧＦβ１を欠く同一培地（Ｅ６［２１］）で４８時間培養し、その後分析した（図１．Ａ）。以前の研究では、この条件下では、系統特異的マーカータンパク質ｍＲＮＡは少なくとも４日目までは明確に発現しないが、多能性喪失のマーカーはＦＧＦ２／ＴＧＦβの喪失後わずか４８時間でＲＮＡマイクロアレイにより検出可能であることが示された［１７］。それゆえ、この早い時点で多能性の解消の始まりに関連するセクレトームの変化を特定することができるはずであり、培養物をそれらが救出できる時点で特定することができると仮定した。

４８時間後、免疫細胞化学（ＩＣＣ）は、Ｅ８とＥ６の両方の細胞が、Ｅ６でＮＡＮＯＧ及びＴＲＡ１６０がわずかに減少し、多能性マーカーＯＣＴ４とＳＳＥＡ３がほぼ同等のレベルを呈することを示した（図１Ｂ）。ＳＳＥＡ１（初期分化マーカー）はＥ６でやや高いレベルで観察された（図１Ｂ）。フローサイトメトリでも、Ｅ６で２４時間培養後と４８時間培養後の両方で同様の発現パターンが観察され、多能性関連マーカーのＮＡＮＯＧとＴＲＡ１－８１はＥ６でごくわずかに減少した（図１Ｃ）。

ＩＣＣ及びフローサイトメトリの両方で、Ｓｏｘ２はＦＧＦ２／ＴＧＦβ喪失の４８時間後に中程度に増加することが観察された。Ｓｏｘ２は多能性関連マーカーであるが、Ｓｏｘ２の発現はＳＭＡＤ２／３阻害及びＦＧＦ２欠乏により増加する［２２］。ＰＳＣにおけるＳｏｘ２発現の増加は分化を開始させることができ［２３、２４］、Ｓｏｘ２は神経外胚葉系へのＰＳＣの特化と分化に重要な役割を持つ［２５～２７］（図１．Ｂ、Ｃ）。最後に、これらの細胞からのＲＮＡに対してｑＰＣＲを行ったところ、Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇは有意な変化を示さず、Ｓｏｘ２が一貫して有意に上方制御された。加えて、Ａｐｏｔｏｘ－Ｇｌｏアッセイ［２８］又はＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒＮＣ－２００Ｖｉａ－１カセットのいずれによっても、条件間の細胞の生存率に有意な変化は観察されなかった（データは示していない）。

これらのデータは、現在のルーチンの測定基準は４８時間の成長因子除去後に多能性関連マーカーにおけるいくつかの微妙な変化を識別できるものの、これらは、その試料を高品質の多能性対照と比較した場合にのみ区別可能であり、幹細胞培養の品質劣化を示唆するものとして単独で識別することはほとんど不可能であろうということを示す。

ＦＧＦ２／ＴＧＦβ除去の４８時間後にセクレトームにおける一貫した検出可能な変化が観察できる。Ｍａｎ－１３細胞及びＲｅｂｌ．ＰＡＴ細胞を、プロテオーム分析のためにプレーティングする前に、Ｅ８培地でビトロネクチンＮコートしたＴ７５フラスコで３継代培養した。培地を除去し、交換し、回収した後、図１Ａ並びに材料及び方法に記載されているように、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ用にタンパク質を調製し濃縮した。Ｒｅｂｌ．ＰＡＴ細胞の５生物学的反復×３技術的反復を実施し、ラベルフリー質量分析によってすべて一緒に分析した（図２Ａ）。Ｍａｎ－１３試料は、特定されたバイオマーカーがいずれもランのばらつきに強いことを確認するため、２生物学的反復×３技術的反復の２バッチでＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した（図２Ａ）。４８時間の時点における細胞のサブセットも、ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析のために収集し処理した。

条件間の一般的なデータ傾向として、Ｅ８培地ではＥ６に比べて少数のタンパク質が濃縮され（ｐ＜０．０５）、これらのタンパク質は、Ｅ６濃縮タンパク質よりも高い倍率変化を示し、細胞株及び実験反復の間でより一貫性があった（図２Ａ）。タンパク質濃縮の分布は条件によって非対称であり、Ｅ６ではＥ８よりも多くのタンパク質が濃縮されていたが、しかしながらＥ６ではＥ８よりも濃縮度が低く、細胞内タンパク質の割合が増加し、試料間の一貫性も低かった（図２Ｂ）。

Ｅ８で濃縮されたタンパク質は、アミノ酸分泌タグ（ＳｉｇｎａｌＰ）、非古典的分泌を示唆するアミノ酸配列（ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ）の存在、又は細胞外空間、細胞外ベシクル、細胞表面、又は細胞外領域の細胞成分遺伝子オントロジー（ＧＯ）タグによる注釈で識別されるように、主に古典的分泌物であった（図２Ｂ）。対照的に、Ｅ６で濃縮された（ｐ＜０．０５）タンパク質のうち、上記の測定基準により古典的な分泌物として特定されたものは少なかった。しかしながら、古典的に分泌されたＥ６で濃縮されたタンパク質は、他のｐ＜０．０５濃縮されたタンパク質よりもより高いレベルの統計的一貫性を示し、これは、これらの変化が、細胞の溶解や漏出のわずかな増加に起因すると考えられるセクレトーム中の細胞内タンパク質のより確率的な濃縮よりも、より生物学的に根ざしている可能性があることを示唆している。

最後に、両細胞株で有意に濃縮されたタンパク質（ｐ＜０．０５）のＧＯタームについて、セクレトームを分析した。これらは、Ｅ８で濃縮されたタンパク質では「細胞外空間」カテゴリーを最も一般的と特定したのに対し、Ｅ６では同じカテゴリーはかなり低く、「膜」及び「細胞外マトリクス」カテゴリーがはるかに上位にランクされていた（図２Ｃ）。

条件間のタンパク質及びＲＮＡの存在量の変化の相関性
観察されたプロテオミクス的変化が、単にＦＧＦ２／ＴＧＦβ１受容体の直下流シグナル環境に限定された一過性の効果ではなく、細胞の多能性状態における根本的変化を示しているか否かを特定するために、セクレトームにおける有意な変化（ｑ＜０．０５）を、同じ細胞のトランスクリプトームにおける有意な変化（ｑ＜０．０５）と比較した（図３）。Ｅ８細胞とＥ６細胞との間の有意な変化の方向は、強いタンパク質／ＲＮＡの一致を示した（Ｍ１３Ｒ１ｒ＝０．８５；Ｍ１３Ｒ２ｒ＝０．７８、Ｒｅｂｌ．ＰＡＴｒ＝０．６６）。さらに、ＲＮＡ／タンパク質の濃縮が一致しない場合、これらのタンパク質は分泌型ではなく、細胞内型であることが一般的であった。

２種のタンパク質の比率マーカー
Ｅ８及びＥ６の培地は共に高濃度のトランスフェリンを有するため、培地中の総タンパク質含有量に対して幹細胞の分泌プロテオームを正規化すると、統計的に不確かで誤差が生じる可能性がある。密度、生存率、成長率の違いによって生じる、条件培地中の総タンパク質含有量に対する細胞及び培地の相対的寄与のわずかな変動は、細胞による一貫した分泌にもかかわらず、分泌タンパク質の正規化された量を大きく変化させることがある（図４Ａ）。

この問題を回避するために、関心のある条件に反応して変化するタンパク質を特定する新しい分析戦略を開発した。すべてのタンパク質を１つの正規化因子と比較するのではなく、複数のタンパク質の対を識別することを目指した。これらの相対存在量は、条件間の正確な識別に使用できた。それぞれの個別の試料内のこれらのタンパク質対の比率を特定することで、総タンパク質存在量が変動する問題を取り除くことができる。というのも、両方のタンパク質が、細胞密度又は同様の細胞の変動によって同じように影響を受けるからである。これは図４に示されており、Ｒで書かれたスクリプトで、タンパク質のすべての組み合わせの間の存在量の対ごとの比率を計算し、条件間の識別力を持つものを特定する。これらの対が条件を区別する能力は、ＦＤＲ調整されたｐ値がｑ＜０．０５に達するか否かで判断した。この閾値を超えたタンパク質を特定し、各タンパク質をノード、対の比率をエッジとしたネットワークとして表現した（図５Ａ）。最も相互作用の強いタンパク質を、より厳密な分析のために選択した（図５Ｂ～Ｃ）。

ウエスタンブロット法によるマーカータンパク質対の確認
すべての分析方法における成功、生物学的関連性、及びＲＮＡレベルの対応する変化に基づいて、８つのタンパク質をウエスタンブロットに選んだ（図５Ｃ）。加えて、すべての場合において、選択したタンパク質の相対存在量は、各タンパク質の存在量と個別に比較すると、条件間の統計的な差異を改善することが示された（データは示していない）。各条件で濃縮された４つのタンパク質を選択した結果、両方の細胞株のすべての試料で多能性喪失を診断する１６の比率対が得られた（図６）。これらのタンパク質のうち、コクリン（ＣＯＣＨ）、ＦＧＦ受容体－１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）及びオルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）はＥ６でＥ８に比べて増加し、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）及びセマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）はＥ６に比べＥ８で増加していた。この分析では、Ｍａｎ－１３ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの両ランからのデータがうまくプールされ、これらのマーカー比率が、技術的反復及び生物学的反復だけでなく、異なるラベルフリーＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験においても一貫していることが確認され、上記マーカータンパク質がランによるばらつきに強いことが示されたことは特筆される。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータにおけるこれらのマーカーの強度に基づき、ｈＥＳＣ株Ｍａｎ－１、Ｍａｎ－７、Ｍａｎ－１３、Ｈ９及びｉＰＳＣ株Ｒｅｂｌ．ＰＡＴからの条件培地試料（図１Ａに記載のように採取）を、これらのマーカータンパク質の相対存在量についてウエスタンブロットによりプローブした（図７）。示した各タンパク質対は、同じ膜上でプローブされ、存在量比はＩｍａｇｅＪのデンシトメトリーによって計算した。これらのウエスタンブロットから、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで観察された変化は、異なる遺伝的背景を持つ細胞間で非常に頑健で識別可能であることが確認された。また、複数の系統間、及び異なるタンパク質の組み合わせ間における比率の変化の一貫性は、ＰＳＣ系統間の初期多能性喪失の判別基準としての当該方法論の一般性を確認するものである。

Ｅ６培地で４８時間培養した後のタンパク質対の存在量比の回復
多能性喪失が間近に迫り、ＰＳＣ培養物の品質が低下した場合のアッセイの重要な要素は、細胞が回復可能な状態で培養物品質の劣化を検出する能力である。それゆえ、本発明者らは、上記の実験を繰り返したが、今回は一部の細胞をＥ６培地で２日間培養した後、Ｅ８培地に７日間移し替えた。Ｍａｎ－１細胞を用いると、本発明者らの分析から選択した２対のタンパク質バイオマーカー（ＯＬＦＭＬ３－ＮＩＤ１及びＦＳＴ－ＮＰＴＸ２）の比率が、Ｅ８回復の７日後に多能性レベルに戻ることが明らかになった（図８Ａ、Ｂ）。さらに、Ｅ６で４８時間培養し、Ｅ８培地で７日間回復させた細胞もテラトーマを形成することができ（図８Ｂ）、３つの胚葉すべての組織への分化が実証された。このことは、これらの細胞の多能性がＥ６での４８時間後に完全に回復することを示唆するだけでなく、本発明者らのマーカータンパク質がこの回復をしっかりと追跡できることを示唆している。これは、観察される変化が単に成長因子の消失直後の分子マーカーではないことを確認する。上記タンパク質は数日かけてベースラインに戻るのであり、ＦＧＦ２及びＴＧＦβ１が回復するとすぐに戻るのではない。従って、多能性の喪失がこれらの初期マーカーの変化によって認識される時点では、培養物はまだ回復可能である。

考察
本研究では、本発明者らは、多能性幹細胞培養物の劣化に関わる分泌型の初期マーカータンパク質として機能する一連のタンパク質を特定した。このマーカータンパク質の長いリスト（図５Ｂのネットワークに要約されている）のうち、ウエスタンブロットでさらに分析するための８つのタンパク質の短いリストを特定した。これらのプロテオームの変化は、遺伝子転写の変化にも反映されていた。

マーカータンパク質の生物学的関連性
ｈＥＳＣ株及びｉＰＳＣ株の両方のプロテオームは、過去に様々な質量分析技術によって研究されてきたが［９～１２］、これらの細胞のタンパク質セクレトームについては、ほとんど研究されていない［１３］。本発明者らは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ及びバイオインフォマティクス解析の組み合わせを用い、ウエスタンブロット法で確認することにより、健全な多能性幹細胞又は早期（４８時間）の多能性解消解離を示唆するセクレトーム中のいくつかのマーカーを特定した。重要なことは、これらのセクレトームマーカーは、ＬＣ／ＭＳによる分析のために選択されたｉＰＳ株及びｈＥＳＣ株Ｒｅｂｌ．Ｐａｔ及びＭａｎ１３以外のｈＥＳＣ株で独立して検証されたことである。さらに、Ｅ６で４８時間培養した後でＥ８に戻した細胞は回復し、再び多能性状態と相関するセクレトームマーカータンパク質を発現することも示された。

膜貫通型ＦＧＦ２受容体ＦＧＦＲ１は、多能性解消についての最も高い発現量を示した分泌型マーカーの１つであった。Ｅ６条件培地中のＦＧＦＲ１の発現量が増加したことを説明するには、いくつかの可能性がある。まず、ＦＧＦＲ１は、ＭＭＰ２によるその膜隣接細胞外ドメインの切断により、細胞外空間に放出されることが知られている［２９］。ＦＧＦＲ１タンパク質は基質結合時に細胞によってエンドサイトーシスされ、リソソームで分解されるため［３０～３２］、ＦＧＦ２の存在量が減少すると、ＦＧＦＲ１の表面存在量が増加し、それに伴って表面メタロプロテイナーゼによって切断されるＦＧＦＲ１の量も増加する可能性は十分にある。実際、本発明者らのプロテオミクス研究でＥ６条件下で有意に増加したと特定されたＦＧＦＲ１ペプチドの大部分は、想定されるＭＭＰ２切断部位のＮ末端であった。ＦＧＦＲ１の細胞外領域の分泌型がＦＧＦ２活性を阻害することが以前に報告されているので［３３］、ＦＧＦ２欠損培地におけるＦＧＦＲ１の蓄積は、残存するＦＧＦ２シグナル伝達をさらに阻害するのではないかと推測される。

実際、Ｅ６で濃縮されたタンパク質バイオマーカーの生物学的機能は、分化を誘発された細胞が、成長因子と結合して調節する因子を培地に放出し、ＦＧＦ２及びＴＧＦβ１等の多能性促進因子を隔離してその局所利用率を下げ、他の分化促進因子のシグナル伝達を増強するという仮説と一致する。これは、元の多能性解消シグナルのフィードフォワード増幅を発生させる。フォリスタチンは周知の幹細胞分化因子であり、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーと結合して中和することで機能するＴＧＦβ阻害剤である［１６］。同様に、ＯＬＦＭＬ３もＥ６で濃縮されるが、これはＢＭＰ４と結合してこれを安定化し、内皮細胞におけるＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達を増強することが示されている［３４］。ＢＭＰ４はＦＧＦの不存在下でヒト胚性幹細胞から栄養膜細胞への分化を開始することから［３５～３７］、ＦＧＦ２／ＴＧＦβ喪失後４８時間以降、これらの細胞は近傍細胞で分化を促進し、それらをこの状態に付する因子を分泌すると結論づけることができよう［３８］。

軸索誘導に関与するニューロンシグナル伝達タンパク質であるＳＥＭＡ３Ａは、セクレトミクス及びＲＮＡｓｅｑの両方でＥ８状態に非常に濃縮されており、その膜貫通型受容体であるＮＲＰ１はＥ６トランスクリプトームで非常に濃縮（ｑ＜０．０１）される［３９～４１］。ＮＲＰ１もＦＧＦ２及びＴＧＦβの両方に結合し、それらのシグナル伝達を調節していることから、これは重要なことである。ＨＵＶＥＣ細胞では、ＮＲＰ１の発現が増加するとＴＧＦβ－β刺激によるＳｍａｄ２／３の活性化が抑制され、ＴＧＦβに応答するＳＭＡＤ標的遺伝子の発現がＮＲＰ１欠損ＨＵＶＥＣ細胞で増加することが実証されており［４２］、この関係はマウス内皮細胞においてインビボで再現されている［４３］。ＮＲＰ１は非常に無差別の（プロミスキャスな）受容体であるため、リガンドはＮＲＰ１との結合を巡って競合する［４４］。ＳＥＭＡ３ＡとＶＥＧＦＡ［４４］との間、及びＶＥＧＦＡとＴＧＦβ［４５］との間にリガンド競合が存在することが明らかにされている。このことを確認する実験的証拠が必要であるが、これはＳＥＭＡ３ＡがＴＧＦＢの隔離及びＮＲＰ１による負の調節を防ぐ方法でＮＲＰ１の結合についてＴＧＦβと競合する可能性を示唆する。

ＣＨＧＡは、いくつかの神経内分泌シグナル伝達タンパク質の前駆体タンパク質である。ＣＨＧＡ分子全体からのペプチドは、Ｅ６条件培地よりもＥ８条件培地に高度に濃縮されていることがほぼ共通に特定された。しかしながら、多能性状態との関連は不明である。一般に、ＣＨＧＡは分泌顆粒の形成及び放出を促進する［４６、４７］と言われており、多能性解消中の幹細胞におけるその存在量の減少は、全体の分泌量の減少を反映している可能性がある。このことは、Ｅ６と比較してＥ８条件培地で特定された分泌タンパク質の数が多いことと矛盾しないであろう（図２Ｂ）。

ＮＩＤ１は分泌型糖タンパク質であり、柔軟な鎖で隔てられた２つの主要なタンパク質結合ドメイン（Ｇ２及びＧ３）を持つ［４８］。ＮＩＤ１は、基底膜の異なる成分とドメイン特異的に結合することにより、基底膜の複数の成分を架橋し基底膜を安定化させている［４９、５０］。ＮＩＤ１は、機械的ストレスに対するさらなる弾力性が必要な場所に多く存在し、逆に柔軟性が必要な場所や組織の性質が固定されていない場所ではあまり存在せず［５１］、例えば基底膜が分解されるときに活発に分解される［５２］。プロテオミクス分析により、ＮＩＤ１は、ｈＥＳＣによってかなりの量で発現されることが明らかにされている［１３、５３］。今回のデータでは、Ｅ８と比較してＥ６培地ではＮＩＤ１の存在量が劇的に減少していることが観察される。ＮＩＤ１は基底膜に対して安定化効果を有することから、多能性幹細胞から初期前駆細胞への移行に特有の上皮間葉転換の前に存在量が減少している可能性がある。これは、多くの細胞外マトリクス複合体の分解を伴うことになる。卵巣癌細胞では、ナイドジェンがこのＥＭＴ転換に重要な役割を果たす［５４］。

ＣＯＣＨは分泌されることが公知であるが［５５］、内耳の細胞外マトリクスでの役割を超えるその機能については、比較的ほとんど知られていない［５６］。マウスＥＳ細胞では、ＣＯＣＨはＢＭＰ４シグナル伝達に応答して発現することが報告されており、これは自己再生をサポートすることが示唆された［５７］。本発明者らの研究では、ＣＯＣＨはＥ８培地で増強される。ヒトとマウスとの間でのＥＳＣの多能性状態の分子的な違いは、マウスのＥＳＣの表現型が早くナイーブであり、ヒトのＥＳＣの表現型が後にプライムされたものであることを反映していると考えられており［５８］、これは、マウス及びヒトの幹細胞維持に必要なシグナル伝達の違いに関する多くのデータによって支持されている［１４、１５、５９、６０］。従って、ＢＭＰシグナル伝達はｈＥＳＣとマウスＥＳＣとで異なる効果を持ち、後者では幹細胞維持に活性がある［３６、６０］。ＢＭＰシグナル伝達はｈＥＳＣの中胚葉系及び栄養外胚葉系への分化に強く関連していることから［３５、６１～６４］、これは、ＢＭＰの下流のＣＯＣＨ等の標的と多能性を解消して初期の系統分化を促進させることとの相関関係と合致すると思われる。

ＮＰＴＸ２は、神経組織においてα－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体サブユニットグルタミン酸受容体４（ＧＲＩＡ４）に結合する［６５］以外の機能については、ほとんど情報がない。確かにＧＲＩＡ４の転写物発現もＥ６よりＥ８ではるかに高いことは注目に値する［データは示さず］。

対比率法の利点についての考察
これらの分析の注意点は、すべてのセクレトミック研究で遭遇することであるが、条件間の変化を確実に特定するために、どのタンパク質を比較するかに対する適切な正規化標準がないことである。通常、「オミクス」研究では、総タンパク質若しくは総ｍＲＮＡ、又はＧＡＰＤＨ若しくはアクチン等のハウスキーピング遺伝子若しくはハウスキーピングタンパク質に対して正規化する。これらの対照により、条件間又は実験間の信頼性、再現性のある比較が可能になる。しかしながら、細胞プロテオームの分泌された補体を分析する場合、そのようなハウスキーピングタンパク質は存在せず、条件間のタンパク質存在量全体は、培地タンパク質の存在及び濃度、細胞の密度、細胞の生存率の違い、細胞質の漏れ、その他の多くの要因に起因して非常に変動しやすくなっている。本研究では、実験条件間の識別性を高める比率を提供するために、互いに多重化できるマーカータンパク質を特定した。細胞セクレトームにおける他の変化にかかわらず、これらのタンパク質の相対存在量は、個々の遺伝的背景の中で比較的一定であるはずだと考えられる。そのため、対照条件下で個々の細胞株のベースライン比が特定されると、これらの比は、感度、価格、迅速な時間スケールにおいて現在のどの方法よりも優れた、培養ＰＳＣにおける切迫した多能性喪失の迅速かつ定量的警告を提供すると予想される。

要約すると、ＰＳＣのセクレトームには、多能性が消失する過程で急速に減少又は増加するタンパク質が多数存在することが示された。このようなタンパク質を４種類ずつ集めたマトリクスを用いると、安定した多能性又はその初期の喪失を示唆するタンパク質の確実な比率が明らかになった。さらに、このような比率はＭＳ／ＭＳによっても特定され（図９～３２）、今後の分析の優れたターゲットとなると思われる。このようなタンパク質は、細胞治療用のＰＳＣのスケールアップ及び製造中、又は医薬品の開発及び毒性試験におけるその使用のための断続的若しくは連続的な培養モニタリングを可能にするマーカーとして、非常に有用であると考えられる。しかしながら、このようなマーカーをモニタリングする費用対効果の高い方法があれば、それらは研究室でも同様に有用であり、どちらの状況でも細胞産物を失うことなく培養状態を迅速に評価することができる。

方法
細胞培養
細胞は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｅ８）培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ライフ・テクノロジーズ））でビトロネクチン－Ｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で維持し、ＴｒｙｐＬＥ解離試薬を用いて継代した。セクレトーム分析のための試料採取に先立ち、１０μＭＲｏｃｋ阻害剤を２４時間添加したＥ８培地に、７５ｃｍ^２培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２０，０００（Ｒｅｂｌ．ＰＡＴ）又は２５，０００（Ｍａｎ－１３）細胞／ｃｍ^２の密度で細胞をプレーティングした。プレーティングから２４時間後（実験時間０）、細胞に新鮮なＥ８培地を与えたか、又は細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ６（Ｅ６）培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移した。プレーティング後４８時間及び７２時間（それぞれ実験時間２４時間及び４８時間）に細胞に供給し、これらの時点で培地を回収し、－９℃で１，０００×ｇで５分間回転させ、次いでｌｏ－ｂｉｎｄ２ｍｌ遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（エッペンドルフ））に分注し、液体窒素で急速凍結した。プレーティング後７２時間（実験時間４８時間）に、細胞をＴｒｙｐＬＥで解離させ、ＰＢＳ中で１，０００×ｇで５分間回転させ、上清を除去し、ペレットを液体窒素中で急速凍結した。この時点の細胞のサブセットも回収し、ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析用に処理した。Ｒｅｂｌ．ＰＡＴについては、５つの生物学的反復を実施し、それぞれが３つの技術的反復からなり、すべての試料は１回のランでＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。複数の分析にわたって特定されたマーカータンパク質の定量的再現性を確保するために、４つのＭａｎ－１３生物学的反復が収集され、これらはそれぞれ２つの生物学的反復からなる２つの独立したＬＣ－ＭＳ／ＭＳランで分析した。ＰＳＣ培養物の質の低下に関するアッセイの重要な要素は、細胞が回収可能である間に培養物の質の低下を検出する能力である。上記の実験を繰り返したが、Ｅ６で２日間培養した後、細胞をＥ８培地に戻して７日間培養し、完全な多能性を回復できるか否かを評価した。培地は４８時間ごとに新しくし、２４時間ごとに条件培地の試料をウエスタンブロットによる分析のために採取した。

多能性マーカーの免疫化学的染色
細胞を２４ウェルプレートに２０，０００（Ｒｅｂｌ．ＰＡＴ）又は２５，０００（Ｍａｎ－１３）細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、プロテオーム分析及びＲＮＡ－Ｓｅｑ分析用に準備した試料（図１Ａ）と同じように処理した。多能性ｈＥＳＣに特徴的な細胞表面マーカー及び転写因子は、免疫細胞化学を用いて検出した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ステージ特異的胎児性抗原ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１（Ａｂｃａｍ（アブカム））及び転写因子ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ（ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（セル・シグナリング・テクノロジーズ））、及びＯＣＴ－４（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ビーディー・バイオサイエンシーズ））に対する抗体と４℃で一晩インキュベートした。Ｑ－Ｉｍａｇｉｎｇカメラ（ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ（マイクロ・イメージング・アプリケーション・グループ）、バッキンガムシャー（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ）、英国）を搭載したＢＸ５１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（オリンパス）、ハーフォードシャー（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ）、英国）を用いて、一次抗体の種及びアイソタイプに特異的で、ＦＩＴＣ又はＴＲＩＴＣに結合した二次抗体（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を検出に使用した。画像処理は、Ｑ－ＣａｐｔｕｒｅＰｒｏソフトウェアパッケージ（ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ）の助けを借りて行った。

フローサイトメトリ
細胞を、各実験でプレーティング時、４８時間時点、及び実験のサブセットについては２４時間時点で回収した。すべてのフローサイトメトリ分析は、ＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）セルアナライザー（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ベクトン・ディッキンソン）、サンノゼ（ＳａｎＪｏｓｅ）、カリフォルニア州）で行った。細胞はＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン））を用いて解離させ、４％パラホルムアルデヒド中で室温、７分間暗所で固定し、５％ＦＢＳで２時間ブロックし、氷冷した７０％メタノール中で細胞内染色のために透過処理した。使用したすべての抗体は、蛍光色素と直接結合していた。非特異的結合をコントロールするために、各抗体に種と蛍光色素をマッチさせたアイソタイプ対照を使用した。

細胞を、以下の希釈で、室温で３０分間一次抗体とともにインキュベートした；フィコエリトリン結合マウスα－ＴＲＡ１－８１（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（イーバイオサイエンス）１２－８８８３－８０）１：３００；フィコエリトリン結合マウスアイソタイプ対照（Ｓａｎｔａ－Ｃｒｕｚ（サンタクルーズ）、ＳＣ２８７０）１：７５；Ａｌｅｘａ４８８結合マウスα－Ｎａｎｏｇ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ５６０７９１）、１：１０；Ａｌｅｘａ４８８結合マウスアイソタイプ対照（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ５５７７０２）１：１００；Ａｌｅｘａ６４７結合マウスα－Ｓｏｘ２（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ５６１３９）１：８０；Ａｌｅｘａ６４７結合マウスアイソタイプ対照（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ５５７７１４）１：８０。フローサイトメトリデータを収集し、ＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ソフトウェアで予備処理した後、ＦｌｏｗＪｏ（いずれもＢｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）で分析と図の作成を行った。

プロテオミクス試料の調製
培地試料を、以下の改変を加えた改変フィルター支援試料調製（Ｆｉｌｔｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄＳａｍｐｌｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、ＦＡＳＰ）法を用いて消化した。この試料を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ－１０ｋＤａ遠心フィルターユニット（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（メルクミリポア））を用いて、１４，０００×ｇの速度で約５０μＬに濃縮した。その後、これを１００μＬの２５ｍＭ炭酸水素アンモニウムを加えながら３回洗浄及び遠心を行ってバッファ交換し、その後、タンパク質を５０μＬの２５ｍＭ炭酸水素アンモニウムで再構成した。タンパク質濃度はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＤｉｒｅｃｔＤｅｔｅｃｔ（登録商標）分光計で決定し、５０μｇ（Ｍａｎ－１３）又は２５μｇ（Ｒｅｂｌ．ＰＡＴ）のタンパク質を新しい１０ｋＤａフィルターチューブに加え、フィルターチューブを使って還元、アルキル化、及び消化を行った。消化後、ペプチドを遠心分離で回収し、この試料をマイクロプレートシステム上のＯＬＩＧＯ（商標）Ｒ３逆相媒体で脱塩し、５％アセトニトリル及び０．１％ギ酸で再構成した。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ＲａｐｉｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎＬＣ（ＲＳＬＣ、ＤｉｏｎｅｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ダイオネックス・コーポレーション）、サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）、カリフォルニア州）とＯｒｂｉｔｒａｐＥｌｉｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ州）質量分析計を組み合わせて使用して、消化された試料をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。ペプチド混合物は、２５０ｍｍ×７５μｍ（内径）１．７ｍＭＢＥＨＣ１８分析カラム（Ｗａｔｅｒｓ（ウォーターズ））を用いて、０．１％ギ酸中５％から３３％アセトニトリルまでのグラジエントを用いて４４分間、３００ｎＬ／分で分離した。ペプチドは、データに応じて自動的にフラグメンテーションの対象として選択された。

ペプチドの特定と定量
取得したＭＳデータは、ＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓＬＣ－ＭＳ（ｖ４．１、ＮｏｎｌｉｎｅａｒＤｙｎａｍｉｃｓ（ノンリニア・ダイナミクス））を用いて解析した。各試料の保持時間は、１つのＬＣ－ＭＳランを基準として整列させ、次に「ＡｕｔｏｍａｔｉｃＡｌｉｇｎｍｅｎｔ（自動アライメント）」アルゴリズムを使用して２次元フィーチャーマップの最大限のオーバーレイを作成し、必要に応じて最小限の手動調整を用いてアライメントスコアを８０％以上に増加させた。電荷が＋５以上のフィーチャーはマスクされ、３つ以下の同位体ピークを持つフィーチャーと同様に、さらなる分析から除外した。得られたピークリストは、Ｍａｓｃｏｔｖ２．５．１（ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ（マトリクス・サイエンス））を用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（リリース２０１６－０４）及びＴｒｅｍｂｌ（リリース２０１６－０４）データベースに対して検索した。検索パラメータは、前駆体許容量５ｐｐｍ、及びフラグメント許容量０．６Ｄａを含んでいた。酵素特異性はトリプシンに設定し、１つの残存の切断部位を許容した。システインのカルバミドメチル修飾は固定修飾とし、メチオニン酸化は可変修飾とした。Ｍａｓｃｏｔの結果を、ペプチドピークのアノテーションのためにＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓＬＣ－ＭＳにインポートした。

プロテオミクスデータ処理
Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ及びＴｒｅｍｂｌデータ識別名を使用して、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースから遺伝子名、Ｕｎｉｐｒｏｔデータ識別名、ペプチド配列、及びＥｎｔｒｅｚデータ識別名を取得した。ＵｎｉｐｒｏｔのエントリーにＥｎｔｒｅｚデータ識別名がないものについては、それらは、オンラインアノテーションデータベースＤＡＶＩＤで遺伝子名を検索するか、又は遺伝子名及び説明文を用いて手動でキュレーションして特定した。重複するＥｎｔｒｅｚデータ識別名は、定量信頼度が最も高い（２種類以上のユニークペプチドが存在する、又は信頼度スコアが最も高い）エントリーの保持によって１つのエントリーに統合した。

分泌経路
すべてのタンパク質のペプチド配列をＳｉｇｎａｌＰ４．１サーバー［６６］にアップロードし、古典的な分泌シグナルペプチド配列を持つタンパク質の割合を特定した。非古典的な分泌は、ペプチド配列をＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ２．０サーバー［６７］にアップロードして特定し、推奨カットオフスコア０．６を使用して非古典的経路で分泌されると思われるタンパク質の割合を定量した。細胞外関連ＧＯタームは、全タンパク質のＥｎｔｒｅｚデータ識別名をＤＡＶＩＤＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＲｅｓｏｕｒｃｅ６．８［６８］にアップロードして特定し、ＧＯターム（細胞表面、細胞外領域、細胞外空間、細胞外マトリクス、及び細胞外ベシクル）を持つタンパク質についてタンパク質リストを取得した。

統計解析
すべての存在量データをＬｏｇ２変換し、その分布の正規性を向上させ、統計的検定の検出力を高め、データの非対称性を低減させた。プロテオミクスのｐ値（ウェルチ（Ｗｅｌｃｈ）のＴ検定）及びｑ値（ベンジャミニ－ホッホベルク（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）法による多重比較調整）は、いずれもＲの関数ｔ．ｔｅｓｔ（）及びｐ．ａｄｊｕｓｔ（ｍｅｔｈｏｄ＝”ｆｄｒ”）を用いて算出した。

タンパク質－タンパク質の比率存在量を用いたマーカー特定
細胞多能性への変化を示唆する新規のタンパク質対関係を特定するために、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ信頼度スコアが３０を超えるタンパク質のすべての正規化タンパク質存在量データを、すべてのタンパク質のすべての試料についてタンパク質対の組み合わせを計算するカスタムＲスクリプトに入力した。Ｅ８とＥ６との間のすべての比率のｐ値及びＦＤＲを計算した。Ｅ８とＥ６との条件間で非常に有意な変化を示す比率対は、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ［６９］を使用してネットワークとして表現した。他のタンパク質と最も変化したタンパク質対の組み合わせを形成した３０個のタンパク質を分離し、それらの相互作用、生物学的機能、及び相対存在量を個別に評価した。

ウエスタンブロット法
ＭＡＮ－１３及びＲｅｂｌ．ＰＡＴに加え、Ｍａｎ－１、Ｍａｎ－７及びＨ９等の様々な細胞株からの培地を図１Ａに記載したように採取し、３ｍｌの培地をＭｉｃｒｏｃｏｎ－１０ｋＤａ遠心フィルターユニット（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）で５０～１００μｌまで濃縮した。試料を、ＭＥＳＳＤＳＲｕｎｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ（サーモ）＃Ｂ０００２）を用いて、ＭｉｎｉＧｅｌＴａｎｋ（Ｔｈｅｒｍｏ＃Ａ２５９７７）上で１０％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ＃ＮＷ００１００ＢＯＸ）で広範囲マーカー（１１～２４５ＫＤａ、ＮＥＢ＃Ｐ７７１２Ｓ）と共に泳動させた。各レーンは２０μｇのタンパク質を含み、Ｐｉｅｒｃｅレーンマーカー還元バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ＃３９０００）中で、９５℃で１０分間加熱した。ゲルは、ＩＢｌｏｔ２ＧｅｌＴｒａｎｓｆｅｒデバイス（Ｔｈｅｒｍｏ＃ＩＢ２１００１）を用いて、ｉＢｌｏｔ２Ｔｒａｎｓｆｅｒスタック（ニトロセルロース膜、Ｔｈｅｒｍｏ＃ＩＢ２３００１）を用いて転写した。細胞は、以下の抗体を用いた免疫ブロット法によって分析した：１／２００マウスα－クロモグラニンＡ（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｓ（ノヴス・バイオロジカルズ）、ＮＢＰ２－４４７７４）；１／１００ウサギα－ＣＯＣＨ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７０２６６）；１／５００マウスα－ＦＧＦＲ１（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（アールアンドディー・システムズ）、ＭＡＢ６５８）；１／１０００ウサギα－フォリスタチン（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５７４７１）；１／１０００ウサギα－エンタクチン／ＮＩＤ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３３６８６）；ウサギα－神経ペントラキシン２（Ａｂｃａｍ、ａｂ１９１５６３）；１／１０００ウサギα－ニューロテンシン（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７２１１４）；１／３００ウサギα－オルファクトメジン様３（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１１７１２）；１／５００マウスα－セマフォリン３Ａ（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ１２５０）；１／５００マウスα－分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ６８３８）。二次抗体染色は、１／２０，０００ＩＲＤｙｅ８００ＣＷヤギα－マウス、又は１／２０，０００ＩＲＤｙｅ６８０ＲＤロバα－ウサギ（それぞれＰ／Ｎ９２５－３２２１０及び９２５－６８０７１、いずれもＬＩ－ＣＯＲ）を用いて行った。これらの蛍光二次抗体は、ＯｄｙｓｓｅｙＣＬｘイメージングシステム（ＬＩ－ＣＯＲ）を用いて、通常、ウサギ及びマウスの抗体のペアで一緒にイメージングした。画像の明るさ／コントラストの調整及びデンシトメトリーの定量は、すべてＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で行った。

ＴｅＳＲ１培地での評価
図３８に示すように、Ｍａｎ１３細胞培養物をＴｅＳＲ１で評価した。この培地はウエスタンブロット法を妨害するＨＳＡを多く含んでいるため、ゲルを泳動にかける前にＨＳＡを除去する必要があった。

図３８Ａは、この代替の一般的に使用されているＴｅＳＲ１培地を、５０μｇ、１００μｇ及び２００μｇの濃度の３つの異なる濃度で示す。ＮＩＤ１及びＮＰＸ２はＴｅＳＲ培地で確認できるが、ＮＩＤ１はＨＳＡ抽出後の２００μｇで泳動した後でしか検出できなかった（これはＨＳＡで一部除去されている可能性がある）。Ｅ６培地は、２０μｇのタンパク質をロードしただけで検出できる。強いフォリスタチンのバンドがあり（これは分化で増加する）、これも分化培地Ｅ６で２０μｇのタンパク質のみを用いて強く検出され、５０μｇのＴＥＳＲ１よりも強い。

図３８Ｂ）は、ＴＥＳＲ１で成長した細胞並びに２４時間及び４８時間分化させた後の２レーンを示す。２４時間後及び４８時間後にフォリスチンが増加している。３８Ａ）は、ＮＰＴＸ２が欠損した分化培地（軟骨形成培地）を示す。定量結果は図３８Ｃにあり、これは、ＴｅＳＲ１多能性培地対ステージ１軟骨細胞分化培地で成長した細胞から濃縮した培地中のＮＰＴＸ２／ＦＳＴ比を示す。

参考文献
１．Ｔｒａｎｓ－ＰｒｏｔｅｏｍｉｃＰｉｐｅｌｉｎｅ，ａｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄｄａｔａｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｐｉｐｅｌｉｎｅｆｏｒｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．
２．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ａ．、Ｗ．Ｓ．Ｒａｓｂａｎｄ、及びＫ．Ｗ．Ｅｌｉｃｅｉｒｉ、ＮＩＨＩｍａｇｅｔｏＩｍａｇｅＪ：２５ｙｅａｒｓｏｆｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ、２０１２．９（７）：６７１－６７５頁．
３．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．Ｊ．ら、Ａｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｓｓａｙｆｏｒｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ、２０１１．８（４）：３１５－７頁．
４．Ｂｏｃｋ，Ｃ．ら、ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭａｐｓｏｆｈｕｍａｎＥＳａｎｄｉＰＳｃｅｌｌｖａｒｉａｔｉｏｎｅｎａｂｌｅｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ、２０１１．１４４（３）：４３９－５２頁．
５．Ａｖｉｏｒ，Ｙ．、Ｊ．Ｃ．Ｂｉａｎｃｏｔｔｉ、及びＮ．Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ、ＴｅｒａｔｏＳｃｏｒｅ：ＡｓｓｅｓｓｉｎｇｔｈｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＰｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＨｕｍａｎＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓｂｙＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＴｅｒａｔｏｍａｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ、２０１５．４（６）：９６７－７４頁．
６．Ｋｅｒｚ，Ｍ．ら、ＡＮｏｖｅｌＡｕｔｏｍａｔｅｄＨｉｇｈ－ＣｏｎｔｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓＷｏｒｋｆｌｏｗＣａｐｔｕｒｉｎｇＣｅｌｌＰｏｐｕｌａｔｉｏｎＤｙｎａｍｉｃｓｆｒｏｍＩｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌＬｉｖｅＩｍａｇｉｎｇＤａｔａ．ＪＢｉｏｍｏｌＳｃｒｅｅｎ、２０１６．２１（９）：８８７－９６頁．
７．Ｐｅｒｅｓｔｒｅｌｏ，Ｔ．ら、Ｐｌｕｒｉ－ＩＱ：ＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｔｈｒｏｕｇｈａｎＩｍａｇｅ－ＢａｓｅｄＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ、２０１７．９（２）：６９７－７０９頁．
８．Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．、Ｋ．Ｇｌｅｎ、及びＲ．Ｔｈｏｍａｓ、Ａｕｔｏｍａｔｅｄｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｐｒｏｃｅｓｓｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｓｔｅｍｃｅｌｌｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ、２０１６．３２（１）：２１５－２３頁．
９．Ｍｕｎｏｚ，Ｊ．ら、Ｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｅｓｏｆｈｕｍａｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＭｏｌＳｙｓｔＢｉｏｌ、２０１１．７：５５０頁．
１０．Ｐｈａｎｓｔｉｅｌ，Ｄ．Ｈ．ら、ＰｒｏｔｅｏｍｉｃａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｈｕｍａｎＥＳａｎｄｉＰＳｃｅｌｌｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ、２０１１．８（１０）：８２１－７頁．
１１．Ｙａｍａｎａ，Ｒ．ら、Ｒａｐｉｄａｎｄｄｅｅｐｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｐｒｏｔｅｏｍｅｂｙｏｎｅ－ｓｈｏｔＮａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈｍｅｔｅｒ－ｓｃａｌｅｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃｓｉｌｉｃａｃｏｌｕｍｎｓ．ＪＰｒｏｔｅｏｍｅＲｅｓ、２０１３．１２（１）：２１４－２１頁．
１２．Ｐｒｉｐｕｚｏｖａ，Ｎ．Ｓ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｐａｎｅｌｆｏｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ｈｉＰＳＣｓ）ｕｓｉｎｇｇｌｏｂａｌｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓ、２０１５．１４（３）：３２３－３８頁．
１３．Ｓｏｔｅｒｉｏｕ，Ｄ．ら、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅａｎｄｕｎｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｆｏｒｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、２０１３．２８８（２６）：１８７１６－３１頁．
１４．Ｘｕ，Ｒ．Ｈ．ら、ＢａｓｉｃＦＧＦａｎｄｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＭＰｓｉｇｎａｌｉｎｇｓｕｓｔａｉｎｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＥＳｃｅｌｌｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ、２００５．２（３）：１８５－９０頁．
１５．Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｇ．Ｍ．ら、ＡｃｔｉｖｉｎＡｍａｉｎｔａｉｎｓｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、２００５．２３（４）：４８９－９５頁．
１６．Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．、Ｍ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、及びＲ．Ａ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ａｃｔｉｖｉｎ／ＮｏｄａｌａｎｄＦＧＦｐａｔｈｗａｙｓｃｏｏｐｅｒａｔｅｔｏｍａｉｎｔａｉｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＪＣｅｌｌＳｃｉ、２００５．１１８（Ｐｔ１９）：４４９５－５０９頁．
１７．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｋ．Ａ．ら、ＤｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｏｎＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔａｔｅＤｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎｂｙＣｅｌｌ－ＣｙｃｌｅＰａｔｈｗａｙｓ．Ｃｅｌｌ、２０１５．１６２（３）：５６４－７９頁．
１８．Ｙｅ，Ｊ．ら、Ｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙｃｌｉｎｉｃａｌｇｒａｄｅｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｆｒｅｓｈｄｉｓｃａｒｄｅｄｅｍｂｒｙｏｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓＴｈｅｒ、２０１７．８（１）：１２８頁．
１９．Ｈａｍｍａｄ，Ｍ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｍｅｒｓｕｒｆａｃｅａｄｓｏｒｂｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｉｃａｔｅｄｉｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｅｘｐａｎｓｉｏｎ．ＢｉｏｍａｔｅｒＳｃｉ、２０１６．４（９）：１３８１－９１頁．
２０．Ｃｈｅｎ，Ｇ．ら、ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙｄｅｆｉｎｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｈｕｍａｎｉＰＳＣｄｅｒｉｖａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ、２０１１．８（５）：４２４－９頁．
２１．Ｌｉｐｐｍａｎｎ，Ｅ．Ｓ．、Ｍ．Ｃ．Ｅｓｔｅｖｅｚ－Ｓｉｌｖａ、及びＲ．Ｓ．Ａｓｈｔｏｎ、Ｄｅｆｉｎｅｄｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｅｎａｂｌｅｓｈｉｇｈｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｗｉｔｈｏｕｔｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、２０１４．３２（４）：１０３２－４２頁．
２２．Ｇｒｅｂｅｒ，Ｂ．ら、ＣｏｎｓｅｒｖｅｄａｎｄｄｉｖｅｒｇｅｎｔｒｏｌｅｓｏｆＦＧＦｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｍｏｕｓｅｅｐｉｂｌａｓｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ、２０１０．６（３）：２１５－２６頁．
２３．Ｋｏｐｐ，Ｊ．Ｌ．ら、ＳｍａｌｌｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＳｏｘ２ｔｒｉｇｇｅｒｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、２００８．２６（４）：９０３－１１頁．
２４．Ｂｏｅｒ，Ｂ．ら、ＥｌｅｖａｔｉｎｇｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＳｏｘ２ｉｎｅｍｂｒｙｏｎａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓａｎｄｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｏｘ２：Ｏｃｔ－３／４ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、２００７．３５（６）：１７７３－８６頁．
２５．Ｚｈａｏ，Ｓ．ら、ＳｏｘＢｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｓｐｅｃｉｆｙｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌｌｉｎｅａｇｅｃｈｏｉｃｅｉｎＥＳｃｅｌｌｓ．ＭｏｌＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃｉ、２００４．２７（３）：３３２－４２頁．
２６．Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｍ．ら、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｆａｃｔｏｒｓｉｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｏｇｅｒｍｌａｙｅｒｓ．Ｃｅｌｌ、２０１１．１４５（６）：８７５－８９頁．
２７．Ｗａｎｇ，Ｚ．ら、ＤｉｓｔｉｎｃｔｌｉｎｅａｇｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｏｌｅｓｆｏｒＮＡＮＯＧ，ＯＣＴ４，ａｎｄＳＯＸ２ｉｎｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ、２０１２．１０（４）：４４０－５４頁．
２８．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓ．ＤｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＴｏｘｉｃｉｔｙＵｓｉｎｇａＳｉｎｇｌｅ－ＷｅｌｌＭｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄＡｓｓａｙ．２００９［２０１９年引用；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｕｋ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｈｕｂ／ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ－ｔｈｅ－ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ－ｍｅｃｈａｎｉｓｍ－ｏｆ－ｔｏｘｉｃｉｔｙ－ｗｉｔｈ－ａｐｏｔｏｘ－ｇｌｏ／から閲覧可能．
２９．Ｌｅｖｉ，Ｅ．ら、Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２ｒｅｌｅａｓｅｓａｃｔｉｖｅｓｏｌｕｂｌｅｅｃｔｏｄｏｍａｉｎｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ１．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、１９９６．９３（１４）：７０６９－７４頁．
３０．Ｈａｕｇｓｔｅｎ，Ｅ．Ｍ．ら、ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｏｆＦＧＦ１ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅｄｂｙｔｈｅｆｏｕｒｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓＦＧＦｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＪＣｅｌｌＳｃｉ、２００５．１１８（Ｐｔ１７）：３８６９－８１頁．
３１．Ａｕｃｉｅｌｌｏ，Ｇ．ら、ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｎａｌｌｉｎｇａｎｄｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｂｙＳｒｃａｎｄＥｐｓ８．ＪＣｅｌｌＳｃｉ、２０１３．１２６（Ｐｔ２）：６１３－２４頁．
３２．Ｓｏｒｏｋｉｎ，Ａ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｉｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙａｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎａｔｔｙｒｏｓｉｎｅ７６６．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、１９９４．２６９（２５）：１７０５６－６１頁．
３３．Ｇｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ，Ｘ．ら、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）ｓｏｌｕｂｌｅｒｅｃｅｐｔｏｒ１ａｃｔｓａｓａｎａｔｕｒａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＦＧＦ２ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｄｕｒｉｎｇｒｅｔｉｎａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ、１９９８．９（１０）：２７８５－８０２頁．
３４．Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃ－Ｌｉｃｉｎａ，Ｍ．ら、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ－ｌｉｋｅ３ｉｎｈｉｂｉｔｓｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｂｙｉｍｐａｉｒｉｎｇａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｐｅｒｉｃｙｔｅｃｏｖｅｒａｇｅ．ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ、２０１２．１１（１２）：２５８８－９９頁．
３５．Ｐｅｒａ，Ｍ．Ｆ．ら、ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｂｙＢＭＰ－２ａｎｄｉｔｓａｎｔａｇｏｎｉｓｔｎｏｇｇｉｎ．ＪＣｅｌｌＳｃｉ、２００４．１１７（Ｐｔ７）：１２６９－８０頁．
３６．Ｏｎｉｓｈｉ，Ｋ．ら、ＬｏｃａｌＢＭＰ－ＳＭＡＤ１ｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｃｒｅａｓｅｓＬＩＦｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＳＴＡＴ３ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓａｎｄｐｒｉｍｅｄ－ｔｏ－ｎａｉｖｅｍｏｕｓｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ、２０１４．３（１）：１５６－６８頁．
３７．Ａｍｉｔａ，Ｍ．ら、ＣｏｍｐｌｅｔｅａｎｄｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｂｙＢＭＰ４．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、２０１３．１１０（１３）：Ｅ１２１２－２１頁．
３８．Ｘｕ，Ｒ．Ｈ．ら、ＢＭＰ４ｉｎｉｔｉａｔｅｓｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００２．２０（１２）：１２６１－４頁．
３９．Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎｓｌｏｃｋｓｅｃｒｅｔｅｄｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓｏｎｔｏｐｌｅｘｉｎｓｉｎａｔｅｒｎａｒｙｓｉｇｎａｌｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ、２０１２．１９（１２）：１２９３－９頁．
４０．Ｌｅｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｙ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅｒｏｌｅｏｆｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ－３ＡｏｎＴｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｎｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ、２００６．３６（７）：１７８２－９３頁．
４１．Ｃａｔａｌａｎｏ，Ａ．、Ｔｈｅｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ－３Ａｒｅｄｕｃｅｓｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅａｒｔｈｒｉｔｉｓ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ、２０１０．１８５（１０）：６３７３－８３頁．
４２．Ａｓｐａｌｔｅｒ，Ｉ．Ｍ．ら、Ａｌｋ１ａｎｄＡｌｋ５ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙＮｒｐ１ｃｏｎｔｒｏｌｓｖａｓｃｕｌａｒｓｐｒｏｕｔｉｎｇｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｏｆＮｏｔｃｈ．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ、２０１５．６：７２６４頁．
４３．Ｈｉｒｏｔａ，Ｓ．ら、Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ１ｂａｌａｎｃｅｓｂｅｔａ８ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＴＧＦｂｅｔａｓｉｇｎａｌｉｎｇｔｏｃｏｎｔｒｏｌｓｐｒｏｕｔｉｎｇａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｔｈｅｂｒａｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０１５．１４２（２４）：４３６３－７３頁．
４４．Ｂａｃｈｅｌｄｅｒ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｃｏｍｐｅｔｉｎｇａｕｔｏｃｒｉｎｅｐａｔｈｗａｙｓｉｎｖｏｌｖｉｎｇａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１ｌｉｇａｎｄｓｒｅｇｕｌａｔｅｃｈｅｍｏｔａｘｉｓｏｆｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、２００３．６３（１７）：５２３０－３頁．
４５．Ｇｌｉｎｋａ，Ｙ．及びＧ．Ｊ．Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ、Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１ｉｓａｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａ－１，ａｃｔｉｖａｔｅｓｉｔｓｌａｔｅｎｔｆｏｒｍ，ａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙ．ＪＬｅｕｋｏｃＢｉｏｌ、２００８．８４（１）：３０２－１０頁．
４６．Ｓｔｅｔｔｌｅｒ，Ｈ．ら、ＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｆｏｒｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎＡｓｏｒｔｉｎｇｉｎｔｏｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐａｔｈｗａｙａｒｅａｌｓｏｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｇｒａｎｕｌｅ－ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｎｎｏｎ－ｅｎｄｏｃｒｉｎｅｃｅｌｌｓ．ＢｉｏｃｈｅｍＪ、２００９．４１８（１）：８１－９１頁．
４７．Ｈｅｎｄｙ，Ｇ．Ｎ．ら、Ｔａｒｇｅｔｅｄａｂｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎａ（Ｃｈｇａ）ｇｅｎｅ：ｎｏｒｍａｌｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅｄｅｎｓｅ－ｃｏｒｅｓｅｃｒｅｔｏｒｙｇｒａｎｕｌｅｓａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｏｔｈｅｒｇｒａｎｉｎｓ．ＭｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２００６．２０（８）：１９３５－４７頁．
４８．Ｆｏｘ，Ｊ．Ｗ．ら、ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｎｉｄｏｇｅｎｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆｔｈｒｅｅｇｌｏｂｕｌａｒｄｏｍａｉｎｓａｎｄｍｅｄｉａｔｅｓｂｉｎｄｉｎｇｏｆｌａｍｉｎｉｎｔｏｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅＩＶ．ＥＭＢＯＪ、１９９１．１０（１１）：３１３７－４６頁．
４９．Ｈｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎｉｄｏｇｅｎｓ－Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘｌｉｎｋｅｒｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＭｉｃｒｏｓｃＲｅｓＴｅｃｈ、２００８．７１（５）：３８７－９５頁．
５０．ＭｃＫｅｅ，Ｋ．Ｋ．ら、Ｒｏｌｅｏｆｌａｍｉｎｉｎｔｅｒｍｉｎａｌｇｌｏｂｕｌａｒｄｏｍａｉｎｓｉｎｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅａｓｓｅｍｂｌｙ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、２００７．２８２（２９）：２１４３７－４７頁．
５１．Ｐｏｓｃｈｌ，Ｅ．ら、ＣｏｌｌａｇｅｎＩＶｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｂｕｔｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅｆｏｒｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆｉｔｓａｓｓｅｍｂｌｙｄｕｒｉｎｇｅａｒｌｙｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００４．１３１（７）：１６１９－２８頁．
５２．Ｍａｙｅｒ，Ｕ．ら、Ｓｉｔｅｓｏｆｎｉｄｏｇｅｎｃｌｅａｖａｇｅｂｙｐｒｏｔｅａｓｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｉｓｓｕｅｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓａｎｄｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ、１９９３．２１７（３）：８７７－８４頁．
５３．Ｅｖｓｅｅｎｋｏ，Ｄ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎｓｔｈａｔｐｒｏｍｏｔｅｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌａｓｓｅｍｂｌｙ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｅｖ、２００９．１８（６）：９１９－２８頁．
５４．Ｚｈｏｕ，Ｙ．ら、ＮＩＤ１，ａｎｅｗｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆＥＭＴｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓａｎｄｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、２０１７．８（２０）：３３１１０－３３１２１頁．
５５．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆｎｏｒｍａｌｃｏｃｈｌｉｎ，ａｎｄｏｆｍｕｔａｎｔｓｃａｕｓｉｎｇｔｈｅｓｅｎｓｏｒｉｎｅｕｒａｌｄｅａｆｎｅｓｓａｎｄｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｄｉｓｏｒｄｅｒ，ＤＦＮＡ９．ＪＭｅｄＧｅｎｅｔ、２００３．４０（７）：４７９－８６頁．
５６．Ｎａｇｙ，Ｉ．、Ｍ．Ｔｒｅｘｌｅｒ、及びＬ．Ｐａｔｔｈｙ、ＴｈｅｓｅｃｏｎｄｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｔｙｐｅＡｄｏｍａｉｎｏｆｃｏｃｈｌｉｎｈａｓｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｆｏｒｔｙｐｅＩ，ｔｙｐｅＩＩａｎｄｔｙｐｅＩＶｃｏｌｌａｇｅｎｓ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ、２００８．５８２（２９）：４００３－７頁．
５７．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、ＢＭＰｉｎｄｕｃｅｓｃｏｃｈｌｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌａｎｄｓｕｐｐｒｅｓｓｎｅｕｒａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、２０１３．２８８（１２）：８０５３－６０頁．
５８．Ｔｅｓａｒ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｎｅｗｃｅｌｌｌｉｎｅｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｅｐｉｂｌａｓｔｓｈａｒｅｄｅｆｉｎｉｎｇｆｅａｔｕｒｅｓｗｉｔｈｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ、２００７．４４８（７１５０）：１９６－９頁．
５９．Ｋｕｎａｔｈ，Ｔ．ら、ＦＧＦｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＥｒｋ１／２ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｃａｓｃａｄｅｔｒｉｇｇｅｒｓｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｏｆｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌｔｏｌｉｎｅａｇｅｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００７．１３４（１６）：２８９５－９０２頁．
６０．Ｙｉｎｇ，Ｑ．Ｌ．ら、ＢＭＰｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆＩｄｐｒｏｔｅｉｎｓｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｓｕｓｔａｉｎｓｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌｉｎｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎｗｉｔｈＳＴＡＴ３．Ｃｅｌｌ、２００３．１１５（３）：２８１－９２頁．
６１．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｍ．ら、ＳｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｆｒｏｍｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｘｐｏｓｅｄｔｏＢＭＰ４．ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ、２０１８．９９（１）：２１２－２２４頁．
６２．Ｏｌｄｅｒｓｈａｗ，Ｒ．Ａ．ら、Ｄｉｒｅｃｔｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｔｏｗａｒｄｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１０．２８（１１）：１１８７－９４頁．
６３．Ｋｕｒｅｋ，Ｄ．ら、ＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓＷＮＴｓｉｇｎａｌｓｍｅｄｉａｔｅＢＭＰ－ｉｎｄｕｃｅｄａｎｄｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｅｐｉｂｌａｓｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ、２０１５．４（１）：１１４－２８頁．
６４．Ｌｏｈ，Ｋ．Ｍ．ら、ＭａｐｐｉｎｇｔｈｅＰａｉｒｗｉｓｅＣｈｏｉｃｅｓＬｅａｄｉｎｇｆｒｏｍＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｔｏＨｕｍａｎＢｏｎｅ、Ｈｅａｒｔ，ａｎｄＯｔｈｅｒＭｅｓｏｄｅｒｍＣｅｌｌＴｙｐｅｓ．Ｃｅｌｌ、２０１６．１６６（２）：４５１－４６７頁．
６５．ｖｏｎＲｏｅｍｅｌｉｎｇ，Ｃ．Ａ．ら、Ｎｅｕｒｏｎａｌｐｅｎｔｒａｘｉｎ２ｓｕｐｐｏｒｔｓｃｌｅａｒｃｅｌｌｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｂｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｈｅＡＭＰＡ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｇｌｕｔａｍａｔｅｒｅｃｅｐｔｏｒ－４．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、２０１４．７４（１７）：４７９６－８１０頁．
６６．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｎ．ら、ＳｉｇｎａｌＰ４．０：ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｓｆｒｏｍｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ、２０１１．８（１０）：７８５－６頁．
６７．Ｂｅｎｄｔｓｅｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｆｅａｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌａｎｄｌｅａｄｅｒｌｅｓｓｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ、２００４．１７（４）：３４９－５６頁．
６８．Ｈｕａｎｇｄａ，Ｗ．、Ｂ．Ｔ．Ｓｈｅｒｍａｎ、及びＲ．Ａ．Ｌｅｍｐｉｃｋｉ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｔｏｏｌｓ：ｐａｔｈｓｔｏｗａｒｄｔｈｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌａｒｇｅｇｅｎｅｌｉｓｔｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、２００９．３７（１）：１－１３頁．
６９．Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ：ａｓｏｆｔｗａｒｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｆｏｒｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｍｏｄｅｌｓｏｆｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｎｅｔｗｏｒｋｓ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ、２００３．１３（１１）：２４９８－５０４頁．

Claims

幹細胞培養物の多能性状態を判断する方法であって、幹細胞を培養する工程と、
ａ）アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及びＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）から選択される２種のタンパク質の相対存在量を測定し、前記相対存在量を基準値と比較する工程、並びに／又は
ｂ）アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及びＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）から選択される１つ以上のタンパク質の絶対存在量を測定し、前記絶対存在量を基準値と比較する工程と
を含む方法。
以下のタンパク質対の１つ以上の相対存在量が測定される請求項１に記載の方法。
ａ）ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａと対になったＣＯＣＨ；ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａと対になったＦＧＦＲ１；ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａと対になったＦＳＴ；及び／若しくはＯＬＦＭＬ３ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３ＡＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａ、
ｂ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＡＤＡＭＴＳ８、
ｃ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＡＰＰ、
ｄ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＢ３ＧＮＴ７、
ｅ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＣＨＧＡ、
ｆ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＥＦＥＭＰ１、
ｇ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＥＰＨＡ１、
ｈ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＥＸＴＬ２、
ｉ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＦＢＬＮ２、
ｊ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＦＧＦ２、
ｋ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＦＵＣＡ２、
ｌ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＧＡＬＮＴ１、
ｍ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＧＧＨ、
ｎ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＨＥＸＢ、
ｏ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＩＧＦＢＰ４、
ｐ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＮＩＤ１、
ｑ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＮＰＴＸ２、
ｒ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＮＴＳ、
ｓ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＰＣＤＨＢ５、
ｔ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＳＥＭＡ３Ａ、
ｕ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＳＥＭＡ３Ｆ、
ｖ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＳＦＲＰ２、
ｗ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＴＩＭＰ４、
ｘ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＴＮＦＲＳＦ８、並びに／又は
ｙ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＷＦＤＣ２。
ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａから選択される１つ以上のタンパク質の絶対存在量を測定する工程を含む請求項１に記載の方法。
ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａと対になったＣＯＣＨ；ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａと対になったＦＧＦＲ１；ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａと対になったＦＳＴ；及び／又はＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａと対になったＯＬＦＭＬ３から選択される１つ以上のタンパク質対の相対存在量を測定する工程を含む請求項１に記載の方法。
２つのタンパク質の相対存在量が基準値と比較され、前記基準値が多能性幹細胞（ＰＳＣ）培養物における前記２つのタンパク質の相対存在量である請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
２つのタンパク質の絶対存在量が基準値と比較され、前記基準値が多能性幹細胞（ＰＳＣ）培養物における前記２つのタンパク質の絶対存在量である請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
測定された相対存在量又は絶対存在量を、前記培養物中の未分化細胞の存在と相関させる工程をさらに含む請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
前記１つ以上のタンパク質の個別の存在量及び／又は前記１つ以上のタンパク質対の相対存在量の基準値と比較した増加又は減少が、多能性の喪失又は多能性の潜在的な喪失を示す請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
基準の個別の存在量及び／又は相対存在量を決定する工程を含む請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
前記基準の個別の存在量及び／又は相対存在量が、多能性幹細胞培養物中の前記個別のタンパク質存在量及び／又は相対タンパク質存在量を評価することによって決定される請求項９に記載の方法。
前記ＰＳＣがｉＰＳＣである請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞が、以下の培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、ＧＭＥＭ、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ、ＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲ－Ｅ８、ＲＳｅＴ及びＮａｉｖｅＣｕｌｔ、ＳｔｅｍＰｒｏ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８、ＳｔｅｍＦｌｅｘ、Ｐｌｕｒｉｐｒｏ、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＳｔｅｍＦｉｔ又はＮｕｔｒｉｓｔｅｍのうちの１つで培養される請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
前記タンパク質の存在量が、培養培地中の存在量である請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
培養培地が、多能性幹細胞を播種してから一定の時間間隔、例えば１２時間、２４時間、４８時間又は７２時間後に評価される請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
培養培地が連続的に評価される請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
前記タンパク質の前記絶対存在量又は相対存在量が質量分析（ＭＳ）によって評価される請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
前記タンパク質の前記絶対存在量又は相対存在量が１つ以上の抗体又は抗体断片によって評価される請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
前記タンパク質の前記絶対存在量又は相対存在量が、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び／又は類似の技術によって評価される請求項１７に記載の方法。
多能性の喪失若しくは多能性の潜在的な喪失及び／又は安定した多能性状態の回復を検出することにおいて使用するための、請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
幹細胞培養物の多能性状態を評価することにおける、アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、コンドロモジュリン－１（ＣＮＭＤ）、コクリン（ＣＯＣＨ）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、オルファクトメジン様３（ＯＬＦＭＬ３）、セルピンＢ１（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ストマチン（ＳＴＯＭ）、トロンボスポンジン８型モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ８）、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素７（Ｂ３ＧＮＴ７）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）、エフリンＡ型受容体１（ＥＰＨＡ１）、エキソストシン様２（ＥＸＴＬ２）、フィビュリン２（ＦＢＬＮ２）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血漿α－Ｌ－フコシド分解酵素（ＦＵＣＡ２）、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（ＧＡＬＮＴ）、γ－グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ（ＨＥＸＢ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、ナイドジェン１（ＮＩＤ１）、神経ペントラキシン－２（ＮＰＴＸ２）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）、プロトカドヘリンβ－５（ＰＣＤＨＢ５）、セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）、セマフォリン３Ｆ（ＳＥＭＡ３Ｆ）、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、メタロプロテアーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）及びＷＡＰ４ジスルフィドコアドメインタンパク質２（ＷＦＤＣ２）から選択される１つ以上のタンパク質バイオマーカーの使用。
前記タンパク質の絶対存在量が評価される請求項２０に記載の使用。
１対以上のタンパク質の相対存在量が評価される請求項２１記載の使用。
幹細胞培養物の多能性状態を評価することにおける、以下から選択される１つ以上のタンパク質バイオマーカー対の使用。
ａ）ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａと対になったＣＯＣＨ；ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａと対になったＦＧＦＲ１；ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａと対になったＦＳＴ；及び／若しくはＯＬＦＭＬ３ＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３ＡＣＨＧＡ、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＳＥＭＡ３Ａ、
ｂ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＡＤＡＭＴＳ８、
ｃ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＡＰＰ、
ｄ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＢ３ＧＮＴ７、
ｅ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＣＨＧＡ、
ｆ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＥＦＥＭＰ１、
ｇ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＥＰＨＡ１、
ｈ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＥＸＴＬ２、
ｉ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＦＢＬＮ２、
ｊ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＦＧＦ２、
ｋ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＦＵＣＡ２、
ｌ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＧＡＬＮＴ１、
ｍ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＧＧＨ、
ｎ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＨＥＸＢ、
ｏ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＩＧＦＢＰ４、
ｐ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＮＩＤ１、
ｑ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＮＰＴＸ２、
ｒ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＮＴＳ、
ｓ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＰＣＤＨＢ５、
ｔ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＳＥＭＡ３Ａ、
ｕ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＳＥＭＡ３Ｆ、
ｖ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＳＦＲＰ２、
ｗ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＴＩＭＰ４、
ｘ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＴＮＦＲＳＦ８、並びに／又は
ｙ）ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ９若しくはＳＴＯＭと対になったＷＦＤＣ２。
ａ）以下のタンパク質、ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ１、ＳＴＯＭ、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＰＰ、Ｂ３ＧＮＴ７、ＣＨＧＡ、ＥＦＥＭＰ１、ＥＰＨＡ１、ＥＸＴＬ２、ＦＢＬＮ２、ＦＧＦ２、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬＮＴ、ＧＧＨ、ＨＥＸＢ、ＩＧＦＢＰ４、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＮＴＳ、ＰＣＤＨＢ５、ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＦＲＰ２、ＴＩＭＰ４、ＴＮＦＲＳＦ８及び／若しくはＷＦＤＣ２の１つ以上に結合する、若しくはその他の方法で検出することができる１つ以上の成分、並びに任意に
ｂ）前記１つ以上の成分と前記１つ以上のタンパク質との結合及び／又は検出を定量するための手段、例えば抗体又は抗体断片
を含むキット。
細胞が多能性状態にあるときに予想される前記タンパク質及び／又はタンパク質存在量の定量値を表す対照を含む請求項２４に記載のキット。
前記対照により、使用者が自身の培養系における多能性細胞のベースライン値を確立し、前記方法の適用性及び精度を高めることが可能である請求項２５記載のキット。
前記１つ以上の成分と前記１つ以上のタンパク質との定量的な結合を検出するための手段が、さらに、前記１つ以上のタンパク質が試料中で増加しているか減少しているかを示す請求項２４から請求項２６のいずれか１項に記載のキット。
前記キットが２つ以上の別々のタンパク質と結合できる２つ以上の成分を含み、前記定量的結合を検出するための手段が、前記２つ以上の成分と前記２つ以上の別々のタンパク質との定量的結合を検出する請求項２４から請求項２７のいずれか１項に記載のキット。
ＡＳＳ１、ＣＫＢ、ＣＮＭＤ、ＣＯＣＨ、ＦＧＦＲ１、ＦＳＴ、ＯＬＦＭＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ１、ＳＴＯＭから選択される第１のタンパク質に結合できる第１の成分と、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＰＰ、Ｂ３ＧＮＴ７、ＣＨＧＡ、ＥＦＥＭＰ１、ＥＰＨＡ１、ＥＸＴＬ２、ＦＢＬＮ２、ＦＧＦ２、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬＮＴ、ＧＧＨ、ＨＥＸＢ、ＩＧＦＢＰ４、ＮＩＤ１、ＮＰＴＸ２、ＮＴＳ、ＰＣＤＨＢ５、ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＦＲＰ２、ＴＩＭＰ４、ＴＮＦＲＳＦ８及び／又はＷＦＤＣ２）から選択される第２のタンパク質に結合できる第２の成分とを含む請求項２４から請求項２８のいずれか１項に記載のキット。
前記定量的結合を検出するための手段が、２つ以上のタンパク質の個別の存在量及び／又は相対存在量を計算できるように、前記２つ以上の別々のタンパク質の各々の相対的な量を示す請求項２４から請求項２９のいずれか１項に記載のキット。
前記キットが、成分が使用済みの又は条件付けられた成長培地（若しくはその画分）と混合されることを可能にするように、１つ以上の反応容器をさらに含む請求項２４から請求項３０のいずれか１項に記載のキット。
前記１つ以上の成分が抗体又はその抗体断片を含む請求項２４から請求項３１のいずれか１項に記載のキット。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び／又は類似の免疫測定法を含む請求項２４から請求項３２のいずれか１項に記載のキット。
質量分析を用いてタンパク質を検出することにおける使用に適した成分を含む請求項２４から請求項３３のいずれか１項に記載のキット。
多能性幹細胞の使用済みの又は条件付けられた成長培地中の前記多能性幹細胞の多能性状態を評価することにおいて使用するための請求項２４から請求項３４のいずれか１項に記載のキット。