JP2022540457A - 新規リプログラミング方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、体細胞をリプログラミングする方法であって、該体細胞を1つ以上の山中因子の存在下で培養すること、及び該体細胞を該1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養することを含む、前記方法に関する。さらに、本発明は、本明細書で規定される方法により製造されるリプログラミングされた体細胞に関する。また、治療又は幼若化における使用のための美容方法、美容組成物、リプログラミングされた体細胞、及び組成物、並びに本明細書で規定される方法及びリプログラミングされた体細胞を含む、年齢調節物質、因子、及び/又は細胞プロセスをスクリーニングするための方法も提供される。【選択図】図１

Description

(発明の分野)
本発明は、体細胞をリプログラミングする方法であって、該体細胞を1つ以上の山中因子の存在下で培養すること、及び該体細胞を該1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養することを含む、前記方法に関する。さらに、本発明は、本明細書で規定される方法により製造されるリプログラミングされた体細胞に関する。また、治療又は幼若化における使用のための美容方法、美容組成物、リプログラミングされた体細胞、及び組成物、並びに本明細書で規定される方法及びリプログラミングされた体細胞を含む、年齢調節剤、因子、及び/又は細胞プロセスをスクリーニングするための方法も提供される。
(発明の背景)
老化は、分子、細胞、組織、及び生命体レベルで生じるゆっくりとした機能の喪失を特徴とする。加齢が進むにつれて、クロマチンレベルでのDNAメチル化のパターンが変化し、ある部位はこの標識を得て、ある部位はこの標識を失う。DNAメチル化は、哺乳動物細胞において、転位因子サイレンシングからX染色体不活性化の範囲にわたる多くの役割を果たすエピジェネティックな修飾であり、従って、エピジェネティックな標識の変化及び進行性の蓄積は、異常な遺伝子発現及び調節、幹細胞の枯渇、老化、及び組織ホメオスタシスの調節不全と関連する。これらの変化は、個体間で比較的一貫しており、年齢を予測するのに使用することができる。そのような予測材料(例えば、ホルヴァートのエピジェネティック時計)は、DNAメチル化年齢(別名;エピジェネティック年齢)と呼ばれる値を生じさせ、これは、個体又は組織の生物学的年齢を表すと考えられている。加齢プロセスに影響を及ぼす生活習慣因子(例えば、食事)も、DNAメチル化年齢に影響を及ぼすことがある。しかしながら、エピジェネティック時計及びDNAメチル化年齢の根底にある生物学は、不明なままである。
人工多能性幹(iPS)細胞リプログラミングのプロセスの間に、体細胞は、多能性幹細胞へと変換されるか又は脱分化する。遺伝子発現プロファイリングにより、リプログラミングの3つの期:開始期、成熟期、及び安定化期が明らかにされている。開始期は、即時の間葉上皮移行を特徴とし、成熟期には、多能性関連遺伝子(OCT4、NANOG、及びSALL4)のサブセットの発現が、検出される。最終のiPS細胞状態の獲得には、残りの多能性関連遺伝子(例えば、UTF1、LIN28、DPPA2、及びDPPA4など)の発現によって特色づけられる末期の安定化期が必要とされる。得られるiPS細胞は、それの複数の細胞型へと分化する能力を含めて、多くの点で天然の多能性幹細胞(例えば、胚性幹(ES)細胞)に類似している。しかしながら、iPS細胞リプログラミングの間に、DNAメチル化年齢は、体細胞を得たドナー組織の年齢にかかわらずゼロ歳に再設定される。従って、iPS細胞リプログラミングのプロセスは、体細胞のエピジェネティックシグネチャーを胚様の状態へと再設定し、体細胞系列独自性(somatic cell lineage identity)の喪失を引き起こす。
従って、減少したDNAメチル化年齢又はエピジェネティック年齢を有するが、系列独自性を保持しているリプログラミングされた体細胞を製造する必要性がある。そのようなリプログラミングされた細胞は、多数の治療及び美容上の応用において、並びに加齢性又は変性疾患及び障害の治療及び/又は改善において用途を見出だすであろう。
(発明の概要)
本発明の第1の態様により、体細胞を多能性様の状態又は幼若化された状態へとリプログラミングする方法であって:
i)該体細胞を、1つ以上の山中因子の存在下で、少なくとも5日の期間、かつ/又は多能性マーカーの発現が、該体細胞の表面又は該体細胞の内部に検出可能となるまで、かつ/又は体細胞系列特異的マーカーが、該体細胞の表面にもはや検出可能ではなくなるまで培養すること;
ii)該体細胞を、該1つ以上の山中因子の非存在下で、該多能性マーカーの発現が該体細胞の表面又は該体細胞の内部で減少するまで、かつ/又は体細胞系列特異的マーカーの発現が該体細胞の表面に検出されるまでさらに培養すること
を含む、前記方法が提供される。
本発明のさらなる態様により、本明細書で規定される方法により製造されるリプログラミングされた体細胞が提供される。
本発明の別の態様により、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む医薬組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様により、変性又は加齢性の疾患又は障害の治療及び/又は改善における使用のため、あるいは組織又は器官の幼若化における使用のための本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞又は本明細書で規定される医薬組成物が提供される。
さらなる一態様により、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む美容組成物が提供される。
なおさらなる態様により、皮膚を再生又は幼若化させる美容方法であって、それを必要としている対象への、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞又は本明細書で規定される美容組成物の投与又は塗布を含む、前記方法が提供される。
さらなる態様により、年齢調節因子(age modulating agent)をスクリーニングする方法であって:
(i)本明細書で規定される方法を試験因子(test agent)の存在下及び非存在で行って、リプログラミングされた体細胞を生じさせること;及び
(ii)該リプログラミングされた体細胞の前記エピジェネティックシグネチャーなどの前記分子シグネチャーを決定すること
を含み、
該試験因子の存在下で生じさせたリプログラミングされた体細胞に対して決定された該分子シグネチャーと該試験因子の非存在下で生じさせたリプログラミングされた体細胞に対して決定された該分子シグネチャーとの間の差が、該因子の年齢調節作用の指標となる、前記方法が提供される。
なおさらなる態様により、年齢調節因子又は細胞プロセスをスクリーニングする方法であって:
(i)本明細書で規定される方法により患部組織又は器官由来の体細胞をリプログラミングすること;及び
(ii)患部組織又は器官由来の該リプログラミングされた体細胞と本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞あるいは該患部組織又は器官由来のリプログラミングされていない体細胞との前記エピジェネティックシグネチャーなどの前記分子シグネチャーを決定すること
を含み、
患部組織又は器官由来の該リプログラミングされた体細胞に対して決定された該分子シグネチャーと本明細書で規定される該リプログラミングされた体細胞あるいは該患部組織又は器官由来の該リプログラミングされていない体細胞に対して決定された該分子シグネチャーとの間の差が、該疾患に関連する年齢調節因子又は細胞プロセスの指標となる、前記方法が提供される。
(図面の簡単な説明)
図1:山中因子の発現を伴う13日間の培養後のヒト体細胞線維芽細胞上でのCD13及びSSEA4の表面発現を示すフローサイトメトリーのプロット(「+」を付したプロット)。陰性対照の培養物は、山中因子を発現しなかった(下のプロット;「-」を付したもの)。 図2:山中因子の発現を伴う13日間の培養及び山中因子の発現の非存在下での4週間のさらなる培養(本明細書で規定される「復帰」)後のヒト体細胞線維芽細胞上でのCD13及びSSEA4の表面発現を示すフローサイトメトリーのプロット。「+ SSEA4」を付したプロットは、第13日時点でCD13- SSEA4+と確認された細胞を示す。「+ CD13」及び「-」を付したプロットは、それぞれ、第13日時点でCD13+ SSEA4-と確認された細胞及び山中因子の発現を伴って培養されなかった細胞を示す(すなわち、陰性対照の培養物)。 図3:山中因子の発現を伴う培養の第13日時点でCD13- SSEA4+と確認されたヒト体細胞線維芽細胞の、山中因子の発現の非存在下でさらなる16日間の培養後(「復帰」)の明視野位相差像。 図4:本明細書で規定される方法による部分的なリプログラミング及び復帰後のヒト体細胞線維芽細胞のDNAメチル化年齢(ホルヴァートのエピジェネティック時計を用いて決定されたもの)を示す棒グラフ。「+OSKM SSEA4」は、山中因子の発現を伴う培養の第13日時点でSSEA4+と確認され、本明細書で規定される方法により山中因子の発現の非存在下でさらに培養された細胞を表す。「+OSKM CD13」及び「-OSKM CD13」は、それぞれ、培養の第13日時点でCD13+と確認された細胞、及び山中因子の発現を伴って培養されていない細胞を表す(すなわち、陰性対照の培養物、エラーバーは、2標準偏差を表す)。 図5:一過性リプログラミング実験の概略図。 図6:一過性リプログラミングの間及びその後の細胞の形態。ドキシサイクリン処理後、細胞は、iPSC様となり、コロニー構造を形成していた。細胞は、ドキシサイクリンの非存在下で培養された後に、線維芽細胞様の形態に戻った。 図7:一過性にリプログラミングされた細胞、線維芽細胞、リプログラミング細胞、及びiPSCのメチロームの主成分分析。PC1は、リプログラミングの程度に基づいて細胞を分離し、一過性にリプログラミングされた細胞が線維芽細胞に似ていることを示唆している。 図8: Oct4遺伝子座全体のDNAメチル化レベル。灰色の長方形は、Oct4遺伝子(黒色の長方形)の近傍のプロモーターエレメント(アンサンブル調節ビルド(the Ensembl regulatory build)由来)を意味する。Oct4プロモーターは、iPSCでは脱メチル化されているが、しかしながら、それは、一過性にリプログラミングされた細胞においては過剰メチル化されたままであった。 図9: FSP1遺伝子座全体のDNAメチル化レベル。灰色の長方形は、FSP1遺伝子(黒色の長方形)の近傍のプロモーターエレメント(アンサンブル調節ビルド(the Ensembl regulatory build)由来)を意味する。FSP1プロモーターは、iPSCでは過剰メチル化されているが、しかしながら、それは、一過性にリプログラミングされた細胞においては脱メチル化されたままであった。 図10:一過性にリプログラミングされた細胞、線維芽細胞、リプログラミング細胞、及びiPSCのトランスクリプトームの主成分分析。PC1は、リプログラミングの程度に基づいて細胞を分離し、一過性にリプログラミングされた細胞が線維芽細胞に似ていることを示唆している。 図11:平均線維芽細胞特異的タンパク質1(FSP1)発現レベル。FSP1は、一過性にリプログラミングされた細胞、対照群、及び参照線維芽細胞においては高発現され、iPSCにおいては低発現されている。エラーバーは、標準偏差を表す。 図12:平均Nanog発現レベル。Nanogは、一過性にリプログラミングされた細胞、対照群、及び参照線維芽細胞においては発現されず、iPSCにおいては発現されている。エラーバーは、標準偏差を表す。 図13:試料の平均DNAメチル化年齢。エラーバーは、標準偏差を表す。一過性リプログラミングは、対照群と比較して、最高で30～40歳まで転写年齢を幼若化させた。最高幼若化は、13日間のドキシサイクリン処理で観察された。 図14:免疫蛍光法によって測定された個々の細胞におけるH3K9me3レベルの箱ひげ図。H3K9me3レベルは、年齢とともに低下するものであり、一過性リプログラミングによって回復した。 図15:試料の平均転写年齢。エラーバーは、標準偏差を表す。一過性リプログラミングは、対照群と比較して約30～40歳転写年齢を幼若化させた。幼若化は、ドキシサイクリン処理の全期間にわたって観察された。 図16:コラーゲン遺伝子の平均発現。エラーバーは、標準偏差を表す。P値は、DESeq2を用いて計算された。＊ p＜0.05、＊＊＊ p＜0.001。一過性リプログラミングは、一部のコラーゲン遺伝子の発現を増加させる。 図17:免疫蛍光法によって測定された個々の細胞におけるI型コラーゲンレベルの箱ひげ図。コラーゲンレベルは、年齢とともに低下するものであるが、10日間の一過性リプログラミングによって回復した。
(発明の詳細な説明)
本発明の第1の態様により、体細胞を多能性様の状態又は幼若化された状態へとリプログラミングする方法であって:
i)該体細胞を、1つ以上の山中因子の存在下で、少なくとも5日の期間、かつ/又は多能性マーカーの発現が、該体細胞の表面又は該体細胞の内部に検出可能となるまで、かつ/又は体細胞系列特異的マーカーが、該体細胞の表面にもはや検出可能ではなくなるまで培養すること;
ii)該体細胞を、該1つ以上の山中因子の非存在下で、該多能性マーカーの発現が該体細胞の表面又は該体細胞の内部で減少するまで、かつ/又は体細胞系列特異的マーカーの発現が該体細胞の表面に検出されるまでさらに培養すること
を含む、前記方法が提供される。
本開示から認識されるであろうように、これまでに知られていることとは対照的に、驚くべきことに、体細胞を山中因子の存在下で長期間培養すると、該体細胞のリプログラミングを行い得ることが本明細書において示されている。例えば、Sarkarらの文献(2019)、bioRxiv 573386 (doi: https://doi.org/10.1101/573386)は、OCT4、KLF4、c-MYC、SOX2、LIN28、及びNANOGをコードするmRNAのカクテルを用いる体細胞の一過性リプログラミングが、最長で4日間までの培養で達成することができることをこれまでに示している。そのため、こられの因子の存在下での培養の第5日が、体細胞リプログラミングの「回帰不能点(point of no return)」となることが提唱されている。山中因子の存在下でのこの5日間の培養時点の「回帰不能点」の後は、細胞系列独自性(cell lineage identity)を規定するエピジェネティックシグネチャーが削除され、人工多能性幹(iPS)細胞様の状態へのリプログラミングが不可逆的であることが示唆されている。このように、Sarkarらの文献によれば、多能性様の状態又は幼若化された状態やより多能性の状態へと体細胞を部分的にリプログラミングするためには、山中因子の存在下での該体細胞の培養は、一過性に(すなわち、5日未満で)かつiPS細胞リプログラミングの「開始」期の間のみで行われなければならない。
iPS細胞リプログラミングのプロセスの間に、体細胞は、多能性幹細胞へと変換されるか又は脱分化される。そのようなiPS細胞は、複数の細胞型へと分化する能力を含めて、多くの点で天然の多能性幹細胞(例えば、胚性幹(ES)細胞)と類似している。しかしながら、iPS細胞リプログラミングの間に、DNAメチル化年齢は、体細胞を得たドナー組織の年齢にかかわらずゼロ歳に再設定される。そのため、iPS細胞リプログラミングのプロセスは、体細胞のエピジェネティックシグネチャーを胚様の状態へと再設定し、体細胞系列独自性の喪失を引き起こす。
従って、本発明のある実施態様により、体細胞を多能性様の状態又は幼若化された状態(特に、幼若化された状態)へとリプログラミングするための方法であって、該リプログラミングが、不完全なリプログラミングであり、かつ/又は部分的なリプログラミングであり、かつ/又は一過性リプログラミングである、前記方法が本明細書で提供される。本明細書における「不完全な」及び/又は「部分的な」及び/又は「一過性の」リプログラミングへの言及は、高いレベルの分化能を有する細胞(例えば、ES細胞又はiPS細胞)と比較されることが認識されるであろう。さらなる実施態様において、該体細胞のリプログラミングは、iPS細胞と比較して不完全、かつ/又は部分的、かつ/又は一過性なリプログラミングである。
本明細書における「体細胞」への言及は、生殖細胞及び未分化幹細胞を除く生物の体を構成する任意の種類の細胞を指す。従って、体細胞としては、例えば、皮膚、心臓、筋肉、神経、骨、又は血液細胞が挙げられる。本発明の一実施態様において、体細胞は、皮膚細胞である。さらなる実施態様において、体細胞は、線維芽細胞などの結合組織由来の細胞である。なおさらなる実施態様において、体細胞は、血液細胞である。一実施態様において、体細胞は、骨髄細胞である。従って、ある実施態様において、体細胞が、血液又は血液の一部を形成し得ることが認識されるであろう。別の実施態様において、体細胞は、中枢神経系及び/又は末梢神経系由来の細胞などの神経細胞である。従って、一実施態様において、細胞は、ニューロンである。さらなる実施態様において、細胞は、感覚ニューロンである。別の実施態様において、細胞は、運動ニューロンである。別の実施態様において、細胞は、介在ニューロンである。さらなる実施態様において、ニューロンは、脳細胞である。なおさらなる実施態様において、細胞は、膵細胞である。従って、一実施態様において、細胞は、膵臓のα細胞である。別の実施態様において、細胞は、膵臓のβ細胞である。別の実施態様において、細胞は、膵臓のδ細胞である。さらなる実施態様において、細胞は、膵臓のF細胞である。なおさらなる実施態様において、細胞は、心細胞である。従って、一実施態様において、細胞は、心筋細胞(cardiac myocyte)(別名:心臓の筋肉細胞(cardiac muscle cell)、心筋細胞(cardiomyocyte)、及び心筋細胞(myocardiocyte))である。別の実施態様において、細胞は、洞房(sinatrial)又はペースメーカー細胞である。
一実施態様において、体細胞は、動物由来のものである。さらなる実施態様において、体細胞は、哺乳動物由来のものである。さらなる実施態様において、哺乳動物は、ヒトである。従って、特定の実施態様において、体細胞は、ヒト由来のものであり、ヒト体細胞である。別の実施態様において、哺乳動物は、マウスであり、体細胞は、マウス体細胞である。さらに別の実施態様において、体細胞は、ネコ、イヌ、又はウマなどの非ヒト哺乳動物由来のものである。例えば、本発明の体細胞の幼若化の性質は、ペットの寿命の延長において特に有用となる。
さらなる実施態様において、不完全な及び/又は部分的な及び/又は一過性のリプログラミングは、iPS細胞リプログラミングの開始及び/又は成熟期の範囲内とみなされるある期間、1つ以上の山中因子の存在下で体細胞を含む。なおさらなる実施態様において、不完全な及び/又は部分的な及び/又は一過性のリプログラミングは、iPS細胞リプログラミングの安定化期の前であるとみなされる時点で、前記体細胞を1つ以上の山中因子の存在下で培養することを含む。特定の実施態様において、不完全な及び/又は部分的な及び/又は一過性のリプログラミングは、リプログラミングの成熟期内であるとみなされる時点で、前記体細胞を1つ以上の山中因子の存在下で培養することを含む。従って、ある実施態様において、前記1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、iPS細胞リプログラミングの安定化期には行われない。
本明細書における「不完全なリプログラミング/不完全にリプログラミングすること」及び/又は「部分的なリプログラミング/部分的にリプログラミングすること」及び/又は「一過性のリプログラミング/一過性にリプログラミングすること」への言及は、それによって、体細胞を得たドナー組織又は生物よりも若い又は少ない分子シグネチャー又はDNAメチル化年齢を含む多能性様の状態又は幼若化された状態(特に、幼若化された状態)へと、体細胞がリプログラミングされる、1種以上のプロセスを指す。体細胞を得たドナー組織又は生物よりも若い又は少ないDNAメチル化年齢は、組織又は生物のライフサイクルにおいてより早期の時点由来の体細胞のものに対応するエピジェネティックシグネチャーを含む。従って、本明細書における「不完全な」及び/又は「部分的な」リプログラミング及び/又は「一過性の」リプログラミングへの言及はまた、リプログラミングされた体細胞が、体細胞を得た組織又は生物のライフサイクルにおいてより早期の時点由来の体細胞のものに対応するエピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャーを含む場合を指す。
従って、一実施態様において、リプログラミングされた体細胞は、組織及び/又は生物のライフサイクルにおいてより早期の時点由来の体細胞のものに対応するエピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャーを含む。さらなる実施態様において、エピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャーは、それを得た組織及び/又は生物のライフサイクルにおけるより早期の時点由来の体細胞のものに対応する。
本明細書における「不完全な」、「部分的な」、又は「一過性の」リプログラミングへの言及は、さらに、体細胞が、体細胞を得たドナー組織又は生物よりも若い、又は老化度が低いの分子シグネチャーを含む多能性様の状態又は幼若化された状態(特に、幼若化された状態)へとリプログラミングされることを指す。体細胞を得たドナー組織又は生物よりも若い、又は老化度が低い分子シグネチャーは、組織又は生物のライフサイクルにおけるより早期の時点由来の体細胞のものに対応するエピジェネティックシグネチャーを含む。さらなる分子シグネチャーとしては:トランスクリプトームプロファイル、γ-H2AXフォーカスの数、活性酸素種の濃度、ヒストンマーク(例えば、H3K9me3及びH4K20me3)の増加、コラーゲンタンパク質レベル、ビメンチン及びE-カドヘリンタンパク質レベル、老化関連β-ガラクトシダーゼ活性、細胞増殖速度、並びに/又は核型シグネチャーが挙げられる。
ある実施態様において、リプログラミングされた体細胞、リプログラミングされていない体細胞、及び/又は参照細胞(例えば、iPS細胞)のエピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャーは、ホルヴァートのエピジェネティック時計を用いて決定される。さらなる実施態様において、リプログラミングされた体細胞、リプログラミングされていない体細胞、及び/又は参照細胞のDNAメチル化年齢は、ホルヴァートのエピジェネティック時計を用いて決定される。ホルヴァートのエピジェネティック時計は、DNAにおけるCpGジヌクレオチドモチーフでのDNAメチル化に基づく年齢推定方法として用いることができる。DNAメチル化年齢(さらに、「予測年齢」としても知られる)は、以下の性質:それが、ES及びiPS細胞ではゼロに近いこと;それが、細胞継代数と相関していること;それが、年齢加速の高度に遺伝性の尺度を生じさせること;及びそれが、チンパンジー組織に適用可能であることを特徴とする。血液のDNAメチル化年齢が、既知のリスク因子について調整した後であってもその後の人生における総死亡率を予測することが示されており、それが、老化を引き起こすプロセスに関連していることを示唆している。同様に、身体的及び精神的健康(physical and mental fitness)のマーカーが、エピジェネティック時計と関連している。ホルヴァートのエピジェネティック時計の1つの顕著な特徴は、その高い正確度及び広い範囲の組織及び細胞型への適応性である。それが、同一の対象由来の異なる組織及び細胞(リプログラミングされた体細胞と、同一の組織由来のリプログラミングされていない体細胞やiPS細胞などの多能性細胞を含む)の年齢を対比することを可能とするために、それを使用して、疾患を原因とする加速された年齢のエビデンスを示す組織及び細胞を特定することができる。さらに、ホルヴァートのエピジェネティック時計を用いて、リプログラミングなどの処置によって引き起こされるDNAメチル化年齢の何らかの変化を特定し得る。
さらなる実施態様において本明細書で規定される分子シグネチャーは、トランスクリプトーム時計を用いて決定される。従って、一実施態様において、分子シグネチャーは、遺伝子発現シグネチャー又は遺伝子発現シグネチャーを用いて決定される。さらなる実施態様において、トランスクリプトーム時計は、Fleischerらの文献、(2018) Genome Biology 19, 221に記載されている方法を用いて決定される。
一実施態様において、リプログラミングされた体細胞の分子シグネチャー及び/又はDNAメチル化年齢は、該体細胞を得たのと同じ組織又は生物由来の体細胞、又はリプログラミング前の該体細胞のそれよりも若い又は少ない。さらなる実施態様において、リプログラミングされた体細胞の分子シグネチャー及び/又はDNAメチル化年齢は、該体細胞を得たのと同じ組織又は生物由来のより若い又はより老化度が低い体細胞又はリプログラミングされていない体細胞であることを表すエピジェネティックシグネチャーの形態である。ある実施態様において、リプログラミングされた体細胞のDNAメチル化年齢及び/又はエピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャーは、別の組織又は生物由来の体細胞(「参照」)のそれと比較される。そのような場合には、リプログラミングされた体細胞のDNAメチル化年齢及び/又はエピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャーが、該体細胞を得た組織又は生物と同じ年齢であるか、それよりも老いているか、又はそれよりも若い参照細胞、組織又は生物と比較されることもあることが認識されるであろう。別の実施態様において、リプログラミングされた体細胞のDNAメチル化年齢及び/又はエピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャーは、iPS細胞などの多能性細胞と比較される。
さらなる実施態様において、リプログラミングされた体細胞の、ホルヴァートのエピジェネティック時計を用いて計算されるDNAメチル化年齢及び/又は前記エピジェネティックシグネチャーなどの前記分子シグネチャーは、リプログラミングされていない体細胞よりも少なくとも10歳、少なくとも15歳、少なくとも20歳、少なくとも25歳、少なくとも30歳、少なくとも35歳、又は少なくとも40歳若いもしくは低い年齢又はDNAメチル化年齢を示す。さらなる実施態様において、リプログラミングされた体細胞の、エピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャー及び/又はDNAメチル化年齢は、該リプログラミングされた体細胞を得た組織又は生物由来の体細胞よりも少なくとも10歳、少なくとも15歳、少なくとも20歳、少なくとも25歳、少なくとも30歳、少なくとも35歳、又は少なくとも40歳若い又は低い年齢を示す。さらなる実施態様において、エピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャー又はDNAメチル化年齢は、リプログラミングされていない体細胞、又は該リプログラミングされた体細胞を得たのと同一の組織又は生物由来の体細胞よりも少なくとも20歳若い、又は20歳低い年齢を示す。さらなる実施態様において、エピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャー、又はDNAメチル化年齢は、リプログラミングされていない体細胞、又は該リプログラミングされた体細胞を得たのと同一の組織又は生物由来の体細胞よりも少なくとも30歳若い、又は30歳低い年齢を示す。さらなる実施態様において、エピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャー、又はDNAメチル化年齢は、リプログラミングされていない体細胞、又は該リプログラミングされた体細胞を得たのと同一の組織又は生物由来の体細胞よりも少なくとも40歳若い、又は40歳低い年齢を示す。
さらなる実施態様において、リプログラミングされた体細胞の、ホルヴァートのエピジェネティック時計を用いて計算されるDNAメチル化年齢及び/又は前記エピジェネティックシグネチャーなどの前記分子シグネチャーは、リプログラミングされていない体細胞よりも少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％若い、少なくとも70％若い、少なくとも80％若い、又は少なくとも90％若い又は低い年齢又はDNAメチル化年齢を示す。さらなる実施態様において、リプログラミングされた体細胞のエピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャー、又はDNAメチル化年齢は、該リプログラミングされた体細胞を得た組織又は生物由来の体細胞よりも少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％若い、少なくとも70％若い、少なくとも80％若い、又は少なくとも90％若いもしくは低い年齢を示す。さらなる実施態様において、エピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャー又はDNAメチル化年齢は、リプログラミングされていない体細胞、又は該リプログラミングされた体細胞を得たのと同一の組織又は生物由来の体細胞よりも少なくとも10％若い又は10％低い年齢を示す。さらなる実施態様において、エピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャー、又はDNAメチル化年齢は、リプログラミングされていない体細胞、又は該リプログラミングされた体細胞を得たのと同一の組織又は生物由来の体細胞よりも少なくとも40％若い又は40％低い年齢を示す。なおさらなる実施態様において、エピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャー、又はDNAメチル化年齢は、リプログラミングされていない体細胞、又は該リプログラミングされた体細胞を得たのと同一の組織又は生物由来の体細胞よりも少なくとも70％若い又は70％低い年齢を示す。
本明細書で使用される「不完全な/不完全に」及び/又は「部分的な/部分的に」及び/又は「一過性の/一過性に」リプログラミング/リプログラミングすることが、リプログラミングされた体細胞が、リプログラミングされていない体細胞の表現型を保持しかつ/又はそれを含む場合を含むことがさらに認識されるであろう。そのようなリプログラミングされていない体細胞の表現型の保持及び/又は該表現型を含むことは、体細胞の細胞系列又は独自性を表す表面マーカーの発現が保持されている場合を含む。さらに、そのような保持及び/又は含むことは、リプログラミングされていない体細胞系列又は独自性のエピジェネティックシグネチャーが、リプログラミングされた体細胞によって保持されておりかつ/又は含まれている場合も含み得る。
従って、一実施態様において、リプログラミングされた体細胞は、リプログラミングされていない体細胞の表現型を保持している。さらなる実施態様において、リプログラミングされた体細胞は、リプログラミングされていない体細胞の表現型を含む。なおさらなる実施態様において、リプログラミングされた体細胞は、該リプログラミングされた体細胞を得た組織のリプログラミングされていない体細胞の表現型を保持しかつ/又は該表現型を含む。別の実施態様において、リプログラミングされた体細胞は、体細胞の細胞系列又は独自性を表す表現型及び/又はエピジェネティックシグネチャーを保持しかつ/又はそれを含む。
本明細書における1つ以上の山中因子への言及は:OCT4、KLF4、c-MYC、及びSOX2のうちの1つ以上を含む。一実施態様において、該1つ以上の山中因子は、LIN28及びNANOGをさらに含んでいてもよい。別の実施態様において、前記1つ以上の山中因子は:OCT4、KLF4、c-MYC、SOX2、LIN28、NANOG、ESSRRB、NR5A2、及び/又はC/EBPαのうちの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、又は全てから選択されてもよい。さらなる実施態様において、前記1つ以上の山中因子は:OCT4、KLF4、c-MYC、及び/又はSOX2から選択される。なおさらなる実施態様において、前記1つ以上の山中因子は:OCT4、KLF4、及び/又はSOX2から選択される。別の実施態様において、前記1つ以上の山中因子は:OCT4、SOX2、及び/又はESRRBから選択される。別の実施態様において、前記1つ以上の山中因子は:KLF4、SOX2、及び/又はNR5A2から選択される。別の実施態様において、前記1つ以上の山中因子は:OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、及び/又はC/EBPαから選択される。別の実施態様において、前記1つ以上の山中因子は:OCT4、KLF4、及び/又はc-MYCから選択される。さらなる実施態様において、前記1つ以上の山中因子は:OCT4及び/又はKLF4から選択される。別の実施態様において、前記1つ以上の山中因子は:OCT4、SOX2、LIN28 及び/又はNR5A2から選択される。さらなる実施態様において、前記1つ以上の山中因子は: OCT4及び/又はSOX2から選択される。別の実施態様において、前記1つ以上の山中因子は:OCT4、SOX2、及び/又はNR5A2から選択される。さらなる実施態様において、前記1つ以上の山中因子は:OCT4である。
さらなる実施態様において、本明細書で規定される体細胞をリプログラミングする方法は、該体細胞を、1つ以上の山中因子の存在下で、少なくとも5日の期間培養することを含む。なおさらなる実施態様において、該体細胞は、1つ以上の山中因子の存在下で、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも8日、少なくとも9日、少なくとも10日、少なくとも11日、少なくとも12日、少なくとも13日、少なくとも14日、少なくとも15日、又は少なくとも16日の期間培養される。特定の実施態様において、該体細胞は、1つ以上の山中因子の存在下で、少なくとも13日間培養される。なおさらなる実施態様において、該体細胞は、1つ以上の山中因子の存在下で、17日を超えない、16日を超えない、15日を超えない、又は14日を超えない期間培養される。特定の一実施態様において、該体細胞は、1つ以上の山中因子の存在下で、13日間培養される。別の実施態様において、該体細胞は、1つ以上の山中因子の存在下で、15日間培養される。さらに別の実施態様において、該体細胞は、1つ以上の山中因子の存在下で、17日間培養される。
本明細書における1つ以上の山中因子の存在下での17日間の体細胞の培養への言及は、本明細書に記載される方法のプロトコールに正確に従う場合に超えるべきではない期間に関連すると認識されるであろう。体細胞が、1つ以上の山中因子の存在下で培養される期間が、該体細胞の素性(identity)に応じて異なり得ることがさらに認識されるであろう。例えば、体細胞が線維芽細胞である場合、1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、少なくとも5日にわたるもの、少なくとも13日にわたるもの、少なくとも15日にわたるもの、17日を超えないもの、15日を超えないもの、又は13、15、もしくは17日にわたるものであり得る。あるいは、細胞が線維芽細胞ではない場合、1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、本明細書で規定されるものよりも少ない日数にわたるもの、又は本明細書で規定されるものよりも多い日数にわたるものであってもよい。
一実施態様において、本明細書で規定される体細胞をリプログラミングする方法は、該体細胞を、1つ以上の山中因子の存在下で、多能性マーカーの発現が、該体細胞の表面に又は該体細胞内部に検出可能となるまで培養することを含む。本明細書における「多能性マーカー」への言及が、多能性と関連するか又は多能性様の状態又は幼若化された状態(特に、幼若化された状態)と関連するリプログラミングを受けた体細胞により発現される任意のマーカーを含み得ることが認識されるであろう。そのようなマーカーは、体細胞の表面に発現され得るか、又は細胞内に発現され得る(すなわち、例えば、多能性関連転写因子の場合のように「内部に(in)」)。一実施態様において、多能性マーカーは:OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-1-54、SSEA1、及び/又はSSEA4から選択される。さらなる実施態様において、多能性マーカーは、転写因子であり、発現は、細胞内に検出され、かつ該多能性マーカーは:OCT4、SOX2、NANOG、及び/又はKLF4から選択される。なおさらなる実施態様において、多能性マーカーは、体細胞の表面に検出され、かつTRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-54、SSEA1、SSEA3及び/又はSSEA4から選択される。
特定の実施態様において、体細胞の表面に検出される多能性マーカーは、SSEA4(ステージ特異的胚性抗原-4)である。
ステージ特異的胚性抗原-4(SSEA4)は、ヒト胚性癌腫(EC)細胞、胚性生殖(EG)細胞、未分化ES細胞、及びiPS細胞、及び間葉系幹細胞のサブセット、並びにアカゲザルES細胞株の表面に発現される糖脂質炭水化物抗原である。SSEA4の発現は、ヒトEC、ES、及びiPS細胞の分化後に下方制御される。従って、SSEA4表面発現を、多能性様の状態又は幼若化された状態(特に、幼若化された状態)への体細胞の脱分化又はリプログラミングのマーカーとして用いてもよい。
別の実施態様において、体細胞の表面に検出される多能性マーカーは、SSEA1(ステージ特異的胚性抗原-1、別名:CD15)である。
ステージ特異的胚性抗原-1(SSEA1)は、マウスの胚性癌腫細胞、胚性幹細胞、及び生殖細胞の表面に発現されるが、ヒト生殖細胞上のみに発現されるラクトース系(lactoseries)オリゴ糖である。ヒト細胞上のSSEA1の発現は、分化の際に増加し、一方で、マウス細胞の分化は、低下した発現に繋がる。
別の実施態様において、体細胞の表面に検出される多能性マーカーは、SSEA3(ステージ特異的胚性抗原-3)である。
ステージ特異的胚性抗原-3(SSEA3)は、スフィンゴ脂質に接続された5つの炭水化物ユニットで構成されるスフィンゴ糖脂質オリゴ糖である。そのようなスフィンゴ脂質は、細胞情報伝達の重要な担い手として働き、SSEA3が、多能性の特徴及び幹細胞様の特徴を有する多くの種類の哺乳動物細胞を識別するのに重要な役割を果たすことが示されている。
別の実施態様において、体細胞の表面に検出される多能性マーカーは:TRA-1-60、TRA-1-81、及び/又はTRA-2-54から選択される。TRA-1-60、TRA-1-81、及びTRA-2-54は、ヒトES細胞の表面に発現される硫酸ケラチン抗原である。
さらなる実施態様において、多能性マーカーは、多能性又は多能性様の状態もしくは幼若化された状態(特に、幼若化された状態)に関連する転写因子などの転写因子である。従って、一実施態様において、多能性マーカーは、OCT4である。
オクタマー結合性転写因子4(OCT4)は、ヒトにおいてPOU5F1遺伝子によってコードされるPOUファミリーのホメオドメイン転写因子である。これは、未分化胚性幹細胞の自己再生に重大な関与を示し、卵母細胞内において母性因子として初めは活性であり、着床前の期間全体にわたって胚において活性であり続ける。OCT4の遺伝子ノックダウンは、分化を促進し、ヒト胚性幹細胞自己再生におけるこれらの因子の役割を実証している。Oct4欠損のマウス胚又は低いOct4の発現レベルを有するマウス胚は、内部細胞塊を形成できず、多能性を失い、栄養外胚葉へと分化する。従って、マウスにおけるOct4発現のレベルは、多能性及び早期の細胞分化を調節するのにきわめて重要である。
さらなる実施態様において、多能性マーカーは、SOX2である。
SRY(性決定領域Y)-box 2 (SOX2)は、未分化胚性幹細胞の自己再生又は多能性を維持するのに必須の転写因子である。SOX2は、転写因子のSoxファミリーの一員であり、胚性幹細胞及び神経系幹細胞の維持において重要な役割を有していることが示されている。SOX2は、非回文配列においてOCT4と協同的にDNAに結合して、重要な多能性因子の転写を活性化する。従って、本明細書に記載されるように、OCT4及びSOX2を、互換的及び/又は協同的に用いることができることが認識されるであろう。
なおさらなる実施態様において、多能性マーカーは、NANOGである。
NANOGは、細胞決定因子を抑制することによってES細胞が多能性を維持するのに役立つ転写因子であるホメオボックスタンパク質である。NANOGは、OCT4及びSOX2などの他の因子と協力して働いて、ES細胞の独自性(ES cell identity)を確立すると考えられている。
一実施態様において、多能性マーカーは、KLF4である。
クルッペル様因子4(KLF4、別名:消化管濃縮クルッペル様因子又はGKLF)は、増殖、分化、アポトーシス、及び体細胞リプログラミングの調節に関与するジンクフィンガー転写因子である。ES細胞では、KLF4が、幹様の能力の良い指標であることが示されており、間葉系幹細胞においても同じことがあてはまることが示唆されている。
ある特定の実施態様により、多能性マーカーが転写因子(例えば、OCT4、SOX2、NANOG、及び/又はKLF4)である場合、該多能性マーカーは、本明細書で規定される方法により体細胞がその存在下で培養される1つ以上の山中因子と一致しないことが認識されるであろう。多能性マーカーが転写因子である場合、該多能性マーカーの発現は、体細胞の表面には検出されず、体細胞内での該転写因子多能性マーカーの発現が、該転写因子のレポーター又は下流エフェクターの発現及び/又は活性化によって検出され得ることがさらに認識されるであろう。
さらなる実施態様において、本明細書で規定される体細胞をリプログラミングする方法は、該体細胞を、1つ以上の山中因子の存在下で、体細胞系列特異的マーカー(例えば、CD13)の発現が、該体細胞の表面にもはや検出されなくなるまで培養することを含む。別の実施態様において、1つ以上の山中因子の存在下で前記体細胞を培養することは、体細胞系列特異的マーカーの発現が該体細胞の表面で下方制御されるか又は減少するまで行われる。本明細書における「もはや検出されない」、「下方制御される」、及び「減少する」への言及が、リプログラミングされていない体細胞と比較した又はリプログラミング前の該体細胞と比較した、マーカーの喪失を含む表面発現のいかなる変化をも包含し、ここで、該リプログラミングされていない体細胞が、より高い又は多い該マーカーの発現を含むことが認識されるであろう。また、本明細書におけるそのような言及が、ES細胞又はiPS細胞などの参照多能性細胞と比較され得ることがさらに認識されるであろう。
本明細書における「1つ以上の山中因子の存在下で培養すること」への言及が、本明細書で規定される1つ以上の山中因子を、任意の形態で培養下の前記体細胞に提供することを含むと認識されるであろう。そのような1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、一実施態様において、タンパク質又はペプチド形態での培養培地(複数可)への1つ以上の山中因子の添加を含み得る。さらなる実施態様において、1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、前記体細胞を、本明細書で規定される1つ以上の山中因子を発現している細胞の存在下で培養することを含む。さらなる実施態様において、前記1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、前記体細胞内での該1つ以上の山中因子の発現を含む。従って、一実施態様により、本明細書で規定される1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、前記体細胞の内在性の1つ以上の山中因子をコードする遺伝子からの発現を含む。本実施態様によれば、前記体細胞における1つ以上の山中因子の発現は、外来性の配列のトランスフェクション、形質導入、又は導入を含まない。さらなる実施態様において、前記体細胞における1つ以上の山中因子の発現は、1つ以上の山中因子をコードする遺伝子の発現を上方制御するか又は「オンにする」化合物及び/又は処理を用いる刺激による発現を含む。従って、一実施態様において、1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、1つ以上の山中因子をコードする遺伝子の発現を引き起こすことが知られている化合物の添加を含む。特定の実施態様において、前記化合物は、前記体細胞内で前記1つ以上の山中因子をコードする遺伝子の発現を引き起こすことが知られている。
別の実施態様において、1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、該体細胞内に、本明細書で規定される該1つ以上の山中因子をコードする外来性の配列を導入することを含む。従って、一実施態様において、1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、1つ以上の外来性の配列からの該1つ以上の山中因子の発現を含む。
一実施態様において、本明細書で規定される1つ以上の山中因子をコードする外来性の配列は、山中因子をコードしているmRNAの形態である。従って、一実施態様において、1つ以上の山中因子の存在下で前記体細胞を培養することは、該体細胞を、山中因子をコードするmRNAの存在下で培養することを含む。さらなる実施態様において、山中因子の存在下での体細胞の培養は、前記体細胞に山中因子をコードするmRNAを提供することを含む。
一実施態様において、本明細書で規定される1つ以上の山中因子をコードする外来性の配列は、トランスフェクションによって前記体細胞内に導入される。別の実施態様において、前記外来性の配列は、ウイルス形質導入などの形質導入によって前記体細胞内に導入される。ウイルス形質導入が、何らかの特定のウイルスに限定されないことが認識されるであろう。しかしながら、特定の非限定的な一実施態様において、該ウイルス形質導入は、レンチウイルス形質導入である。別の実施態様において、該ウイルス形質導入は、レトロウイルス形質導入である。一実施態様において、本明細書で規定される外来性の1つ以上の山中因子をコードする配列は、前記体細胞内にトランスフェクションさせたベクターの形態で該体細胞内に導入され得る。一実施態様において、該ベクターは、トランスポゾンベクターである。体細胞などの宿主細胞内への本明細書で使用される1つ以上の山中因子の発現の導入に適したベクターは、当技術分野において周知である。また、ベクターは、標的配列の転写及び/又は翻訳を制御するさまざまな調節/応答配列又は要素(本明細書で規定される誘導性の発現を可能にする応答要素など)を含有していてもよい。ベクターの例としては:ウイルスベクター、トランスポゾンベクター、プラスミドベクター、又はコスミドベクターが挙げられる。また、上記山中因子を、CRISPR/Cas-9法によって前記体細胞などの宿主細胞内に導入してもよいことが認識されるであろう。そのような方法は、薬物(すなわち、ドキシサイクリン(dox))誘導性又は非誘導性のCRISPR/Cas-9法であってもよく、当業者に周知である。
トランスポゾンベクターは、トランスポゾンとして知られる移動可能な遺伝子要素を利用して、「カットアンドペースト」機構を用いて、ベクター及び染色体への標的配列の出し入れを行う。トランスポゾンベクターの例としては、PiggyBacベクター(System Biosciences)又はEZ-Tn5(商標)トランスポゾン構築ベクター(Illumina社)が挙げられる。
ウイルスベクターは、遺伝子操作されたウイルスの内部のDNA又はRNAからなる。ウイルスベクターを用いて、標的配列を宿主細胞ゲノム内に組み込んでもよい(すなわち、組み込み型ウイルスベクター)。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクター(例えば、HIV)が挙げられる。ウイルスベクターを、ウイルス形質導入の手段で体細胞などの宿主細胞内に導入してもよい。従って、一実施態様により、前記体細胞における1つ以上の山中因子の発現及び/又は1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、1つ以上の山中因子をコードする配列の該体細胞のゲノム内への組み込みを含む。さらなる実施態様において、前記体細胞における1つ以上の山中因子の発現及び/又は1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、該1つ以上の山中因子をコードする配列を前記体細胞のゲノム内に組み込むためのウイルスベクターの使用を含む。
プラスミドベクターは、概して環状の二本鎖DNAからなる。大部分の改変ベクターのようなプラスミドベクターは、複数のクローニングサイト(MCS)を有しており、これは、対象となるDNA断片が容易に挿入されるのを可能とするいくつかのよく使用される制限部位を含有する短い領域である。
本明細書における「トランスフェクション」への言及は、それによって、標的配列が発現されるように、ベクターが宿主細胞(例えば、体細胞)内に導入されるプロセスを指す。宿主細胞にベクターをトランスフェクションさせる方法としては、電気穿孔、ソノポレーション、又は光学的トランスフェクションが挙げられ、これらは、当技術分野において周知である。
一実施態様において、本明細書で規定される1つ以上の山中因子の発現は、発現カセットの形態で体細胞に導入及び/又は提供されされてもよい。さらなる実施態様において、1つ以上の山中因子の存在下で培養することは、発現カセットの形態での前記体細胞内への1つ以上の山中因子をコードする配列の導入を含む。従って、一実施態様において、本明細書で規定される1つ以上の山中因子の発現は、発現カセット由来のものである。そのような発現カセットは、特定の実施態様において、本明細書に記載される1つ以上の山中因子をコードするmRNA由来の配列を含んでもよい。さらなる実施態様において、発現カセットは、さらに、発現カセットの発現の確認を可能とするタンパク質又はマーカーをコードする配列を含む。特定の実施態様において、発現の確認を可能とするタンパク質又はマーカーは、蛍光タンパク質である。ある実施態様において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)である。
従って、一実施態様において、体細胞は、発現カセット内に含まれるタンパク質又はマーカーの発現に基づいて選択されてもよい。特定の実施態様において、体細胞は、発現の確認を可能とする蛍光タンパク質(例えば、GFP)の発現に基づいて選択される。本明細書で使用される「選択される」には、蛍光標識細胞分取(FACS)などのフローサイトメトリー法が含まれ得ることが認識されるであろう。
さらなる実施態様において、発現の確認を可能とするマーカーは、薬剤耐性遺伝子から選択されてもよい。薬剤耐性遺伝子の例としては:ピューロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、又はクロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられる。細胞は、適切な薬物を含有する培地(すなわち、選択培地)中で培養することができ、薬剤耐性遺伝子を組み入れて発現する細胞のみが生き残るであろう。従って、選択培地を用いて細胞を培養することによって、薬剤耐性遺伝子を備える細胞を容易に選択することが可能である。
発現の確認を可能にする別のマーカーとしては、発色性の酵素遺伝子が挙げられる。発色性の酵素遺伝子の例としては:β-ガラクトシダーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、又は分泌型アルカリホスファターゼSEAP遺伝子が挙げられる。これらの発色性の酵素遺伝子を発現する細胞は、マーカー遺伝子を発現している細胞が、検出可能な色(例えば、青白スクリーニング試験においては青色)を生じるように適切な発色性の基質(例えば、βガラトシダーゼ(β galatosidase)の場合のX-gal)を与えることによって検出することができる。
さらなる実施態様において、発現カセットは、適当な化合物又は処理での発現の誘導時に1つ以上の山中因子をコードする配列の発現又は共発現を可能とする誘導性発現カセットである。そのような誘導性発現カセットは、転写及び/又は翻訳を促進すること又は転写及び/又は翻訳から阻害を取り除くことのいずれかによって該カセットの発現を可能とする応答要素を含んでいると認識されるであろう。一実施態様において、該応答要素は、テトラサイクリン応答要素である。従って、ある実施態様において、前記誘導性発現カセットは、テトラサイクリン、特に、ドキシサイクリンなどの抗生物質の添加時に1つ以上の山中因子をコードする配列の発現又は共発現を可能とする(本明細書で提供されるデータに例示されている)。
従って、一実施態様により、1つ以上の山中因子の存在下で前記体細胞を培養することが、前記誘導性発現カセットからの発現を誘導することができる化合物の添加又は処理を含むことが認識されるであろう。ある実施態様において、1つ以上の山中因子の存在下で前記体細胞を培養することは、テトラサイクリンの添加を含む。
一実施態様において、本明細書で規定される1つ以上の山中因子をコードする外来性の配列は、山中因子をコードするmRNAから発現されるタンパク質の形態である。適当なタンパク質送達方法を用いて、発現されるタンパク質(すなわち、山中因子をコードするmRNAから発現されるタンパク質)を、前記体細胞内に直接移送(すなわち、トランスフェクション)し得ることが認識されるであろう。そのような細胞内へのタンパク質の直接移送のための適当な方法は、当業者に周知であり、機能的ツインアルギニン透過(Tat)系が含まれることが認識されるであろう。あるいは、該タンパク質は、ナノ粒子送達系などの標的化送達系によって体細胞に直接移送され得る。ここでも、そのような標的化送達系は、当業者に周知である。
なおさらなる実施態様において、本明細書で規定される体細胞をリプログラミングする方法は、少なくとも2週の期間、該体細胞を、上記1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養することを含む。さらなる実施態様において、前記体細胞は、上記1つ以上の山中因子の非存在下で、少なくとも2.5週、少なくとも3週、少なくとも3.5週、又は少なくとも4週の期間さらに培養される。なおさらなる実施態様において、体細胞は、上記1つ以上の山中因子の非存在下で、5週間を超えず、4週間を超えず、3週間を超えず、又は2.5週間を超えずにさらに培養される。特定の実施態様において、体細胞は、上記1つ以上の山中因子の非存在下で、4週間さらに培養される。別の実施態様において、体細胞は、上記1つ以上の山中因子の非存在下で、3週間さらに培養される。もう1つの別の実施態様において、体細胞は、上記1つ以上の山中因子の非存在下で、2週間さらに培養される。
一実施態様において、本明細書で規定される体細胞をリプログラミングする方法は、該体細胞の表面で又は該体細胞内部で多能性マーカーの発現が、下方制御されるか又は減少するまで、該体細胞を上記1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養することを含む。さらなる実施態様において、体細胞は、上記1つ以上の山中因子の非存在下で、多能性マーカーの発現が、該体細胞の表面に又は該体細胞内部にもはや検出可能ではなくなるまでさらに培養される。本実施態様によるそのような「下方制御される」、「減少する」、又は「もはや検出可能ではなくなる」への言及は、上記1つ以上の山中因子の非存在下でのさらなる培養の前の該体細胞及び/又は参照多能性細胞との比較によるものであると認識されるであろう。
これらの実施態様による多能性マーカーが、1つ以上の山中因子の存在下で培養された体細胞の表面又はその内部に検出される多能性マーカーと同一であっても異なっていてもよいことが認識されるであろう。従って、特定の一実施態様において、1つ以上の山中因子の非存在下での培養時に体細胞の表面又はその内部で下方制御されるか又はもはや検出されない多能性マーカーの発現は、1つ以上の山中因子の存在下での培養後に該体細胞の表面に又はその内部に検出可能な該多能性マーカーである。
さらなる実施態様において、本明細書で規定される体細胞をリプログラミングする方法は、該体細胞を、上記1つ以上の山中因子の非存在下で、体細胞系列特異的マーカー(例えば、CD13)の発現が、該体細胞の表面に検出可能となるまでさらに培養することを含む。別の実施態様において、上記1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養することは、体細胞系列特異的マーカーの発現が、体細胞の表面で上方制御されるか又は増加するまで行われる。本明細書における「上方制御される」及び「増加する」への言及は、上記1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養する工程の前の体細胞と比較した、マーカーの表面発現の増加を含むいかなる変化をも包含する。そのような場合には、上記1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養する工程の前の体細胞が、体細胞系列特異的マーカーのより低下した発現、より少ない発現、又は無発現を含むことが認識されるであろう。さらに、本明細書における「検出可能な」、「上方制御された」、及び「増加した」への言及は、iPS細胞などの参照多能性細胞とも比較され得る。別の実施態様において、上記1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養することは、体細胞系列特異的マーカーの発現が、該1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養する工程の前のリプログラミングされた体細胞のものと比較して、又は1つ以上の山中因子の存在下での培養の前の体細胞と比較して、又はリプログラミングされていない体細胞と比較して回復するまで行われる。
従って、本明細書で規定される上記1つ以上の山中因子の発現の非存在下でさらに培養することを、「復帰」又は「回復」と呼ぶことができることが認識されるであろう。
なおさらなる実施態様において、上記体細胞を上記1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養することは、誘導性発現カセットからの発現を誘導することができる化合物又は処理を取り除くことを含む。ある実施態様において、体細胞を該1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養することは、テトラサイクリンを取り除くことを含む。別の実施態様において、上記1つ以上の山中因子の非存在下でさらに培養することは、前記誘導性発現カセットからの発現を妨げる又は停止させることができる化合物又は処理を含む。
本発明の別の態様により、本明細書で規定される方法により製造されるリプログラミングされた体細胞が提供される。本明細書における「1つの(a)」又は「前記(the)」リプログラミングされた体細胞への言及が、単一の又は少数の細胞と、数が多くてもよいリプログラミングされた体細胞の集団とを含むことが認識されるであろう。従って、本明細書における単数形への言及は全て、複数形を含み、かつ逆もまた同様であることが認識されるであろう。
一実施態様において、本明細書で規定される方法により製造されるリプログラミングされた体細胞は、リプログラミングされていない体細胞又は該リプログラミングされた体細胞を入手した組織又は生物由来の体細胞よりも若い又は少ないDNAメチル化年齢、エピジェネティック年齢、又は分子シグネチャーを含む。さらなる実施態様において、リプログラミングされた体細胞は、リプログラミングされていない体細胞又は該リプログラミングされた体細胞を得た組織又は生物由来の体細胞よりも若い又は低いエピジェネティック年齢を表すエピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャーを含む。特定の実施態様において、本明細書で規定される方法により製造されるリプログラミングされた体細胞は、該体細胞を得た組織又は生物のライフサイクルにおいてより早期の時点由来の体細胞のそれと類似のエピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャーを含む。さらなる実施態様において、本明細書で規定される方法により製造されるリプログラミングされた体細胞は、リプログラミングされていない体細胞のそれと類似の表現型及び/又はエピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャーを含む。
(リプログラミングされた体細胞を含む組成物)
本発明のさらなる態様により、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む医薬組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様により、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む美容組成物が提供される。
ある実施態様により、医薬組成物又は美容組成物は、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含むことに加えて、1種以上の医薬として許容し得る賦形剤をさらに含む。さらなる実施態様において、医薬組成物又は美容組成物は、本明細書で規定される方法により製造されるリプログラミングされた体細胞を含むことに加えて、1種以上の医薬として許容し得る賦形剤をさらに含む。
一般に、本医薬組成物及び美容組成物は、薬理学的に適切な賦形剤又は担体とともに利用されるであろう。通常、これらの賦形剤又は担体には、生理食塩水及び/又は緩衝培地などの水溶液もしくはアルコール性/水性溶液、乳濁液、又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、並びに乳酸リンゲル液が含まれる。個別の場所で本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む組成物を保存するのに必要であれば、適当な生理学的に許容し得るアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、及びアルギン酸などの増粘剤から選択し得る。静脈内ビヒクルには、リンゲルのブドウ糖ベースのものなどの流体及び栄養素補充剤、及び電解質補充剤が含まれる。抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、及び不活性ガスなどの防腐剤及び他の添加剤が、存在していてもよい(Mackの文献、(1982)レミントン薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第16版)。
本明細書で規定される医薬組成物の投与経路は、当業者によく知られているもののうちのいずれかであり得る。例えば、投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚、又は経皮を含む任意の適切な様式によるものであり得る。特定の実施態様において、本明細書で規定される医薬組成物は、静脈内投与又は経皮投与され得る。
さらに、ここで規定される美容組成物の投与経路も、当業者によく知られているもののうちのいずれかであり得る。例えば、投与は、上で言及したものなどの任意の適切な様式よるものであり得る。特定の実施態様において、本明細書で規定される美容組成物は、外用的に、皮膚に、又は経皮的に投与され得る。
(治療的使用及び方法)
本発明の方法及び組成物が、加齢性又は変性の疾患及び/又は障害の治療及び/又は改善において、あるいは、組織又は器官の幼若化において特定の有用性を見出だすことが本明細書で提供される開示から分かるであろう。
従って、一態様により、加齢性又は変性の疾患又は障害の治療及び/又は改善のための本明細書で規定される方法により製造されるリプログラミングされた体細胞を含む方法であって、該リプログラミングされた体細胞を、それを必要としている対象に投与することをさらに含む、前記方法が提供される。別の実施態様において、加齢性又は変性の疾患又は障害の治療及び/又は改善のための本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む方法であって、該リプログラミングされた体細胞を、それを必要としている対象に投与することをさらに含む、前記方法が提供される。一実施態様において、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む方法は、皮膚の加齢性又は変性の疾患又は障害の治療及び/又は改善のためのものである。別の実施態様において、前記本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む方法は、2型糖尿病の治療又は改善のためなどの、膵臓の加齢性又は変性の疾患又は障害の治療又は改善のためのものである。さらなる実施態様において、前記本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む方法は、加齢性疾患又は障害の治療及び/又は改善のためのものであり、ここで、該加齢性疾患又は障害は、神経変性障害である。なおさらなる実施態様において、前記本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む方法は、加齢性疾患又は障害の治療及び/又は改善のためのものであって、ここで、該加齢性疾患又は障害は、血液及び/又は骨髄の疾患又は障害である。なおさらなる実施態様において、前記本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む方法は、加齢性疾患又は障害の治療及び/又は改善のためのものであって、ここで、該加齢性疾患又は障害は、心臓のものである。従って、一実施態様において、疾患又は障害は、心血管系疾患である。さらなる実施態様において、疾患又は障害は、心筋症である。別の実施態様において、疾患又は障害は、虚血性心疾患である。なおさらなる実施態様において、疾患又は障害は、心臓の不整脈である。別の実施態様において、疾患又は障害は、心不全である。
さらなる実施態様において、加齢性又は変性の疾患又は障害の治療及び/又は改善における本明細書で規定される及び/又は本明細書で規定される方法により製造されるリプログラミングされた体細胞の使用が提供される。なおさらなる実施態様において、加齢性又は変性の疾患又は障害の治療及び/又は改善のための本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を製造する方法が提供される。
さらなる態様により、変性又は加齢性の疾患又は障害の治療及び/又は改善における使用のための、又は組織又は器官の幼若化における使用のための本明細書で規定される医薬組成物が提供される。一実施態様において、該医薬組成物は、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む。別の実施態様において、該医薬組成物は、本明細書で規定される方法により製造されるリプログラミングされた体細胞を含む。
一実施態様において、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む前記使用のための医薬組成物又は本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞は、皮膚の治療における使用のため又は皮膚の疾患又は障害の治療及び/又は改善のためのものである。従って、ある実施態様において、加齢性疾患又は障害は、皮膚の疾患又は障害を含む。さらなる実施態様において、皮膚の治療は、皮膚の老化を予防、阻止、減少、及び/又は反転させることである。皮膚の老化の例としては、しわ、乾燥、弾力性の喪失、脆弱性、及び/又はバリアー性の喪失が挙げられる。
別の実施態様において、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む前記使用のための医薬組成物又は本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞は、膵臓の疾患又は障害の治療及び/又は改善における使用のためのものである。従って、ある実施態様において、加齢性疾患又は障害は、膵臓の疾患又は障害を含む。さらなる実施態様において、膵臓の疾患又は障害は、2型糖尿病である。
さらなる実施態様において、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む前記使用のための医薬組成物又は本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞は、神経変性障害の治療及び/又は改善における使用のためのものである。
なおさらなる実施態様において、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む前記使用のための医薬組成物又は本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞は、血液及び/又は骨髄の疾患又は障害の治療及び/又は改善における使用のためのものである。
さらなる実施態様において、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む前記使用のための医薬組成物又は本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞は、心臓の疾患又は障害の治療及び/又は改善における使用のためのものである。
さらなる実施態様において、本明細書で規定される組織又は器官は:皮膚、肝臓、膵臓、心臓、脳、中枢神経系、末梢神経系、血液、及び/又は骨髄から選択される。従って、一実施態様により、組織又は器官は、血液から選択され、治療及び/又は改善は、該血液又は血液細胞に対して、本明細書で規定される方法のうちの1つ以上を行うこと、及び該血液又は血液細胞を、それを必要としている患者又は対象に提供することを含む。さらなる実施態様において、組織又は器官は、骨髄から選択され、幼若化は、該骨髄又は骨髄細胞に対して本明細書で規定される方法のうちの1つ以上を行うこと、及び該骨髄又は骨髄細胞を、それを必要としている患者又は対象に提供することを含む。
特定の実施態様において、組織又は器官は、肝臓から選択され、本明細書で規定される方法及び医薬組成物は、肝臓の幼若化における使用のためのものである。本実施態様により、そのような幼若化が、肝組織又は器官の一部又は肝組織又は器官由来の体細胞のみを幼若化させること、及び該幼若化された肝組織又は肝組織細胞を、それを必要としている患者又は対象に提供することを含み得ることが認識されるであろう。さらなる実施態様において、本明細書で規定される幼若化された肝臓は、インビボで幼若化し続けるか又はさらに幼若化することもある。
さらなる実施態様において、組織又は器官は、心臓から選択され、本明細書で規定される方法及び医薬組成物は、心臓又は心臓組織の幼若化における使用のためのものである。従って、一実施態様により、組織又は器官は、心臓から選択され、治療及び/もしくは改善、又は幼若化は、心筋細胞などの心細胞に対して、本明細書で規定される方法のうちの1つ以上を行うこと、及び該心細胞を、それを必要としている患者又は対象に提供することを含む。さらなる実施態様において、組織又は器官は、心臓から選択され、幼若化は、心筋細胞などの心細胞に対して、本明細書で規定される方法のうちの1つ以上を行うこと、及び該心細胞を、それを必要としている患者又は対象に提供することを含む。別の実施態様において、組織又は器官は、心臓から選択され、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞は、心筋細胞などの心細胞であり、治療及び/もしくは改善、又は幼若化は、該リプログラミングされた体細胞性心細胞を、それを必要としている患者又は対象に提供することを含む。
本明細書に記載される実施態様により、組織又は器官が、それを必要としている患者又は対象由来であるか、あるいは、ドナー対象から誘導されるかのいずれかであり得ることが認識されるであろう。
本明細書におけるそれを必要としている患者又は対象への言及は、動物とヒトとに等しく関連すること、及び本発明が、該動物においても存在する上述の疾患、障害、及び状態のいずれかの獣医学的治療において特定の有用性を見出だすことが認識されるであろう。
本明細書における「治療」及び「改善」への言及が、「予防」、「反転」、及び「抑制」のような用語を含むことが認識されるであろう。さらに、そのような言及は、疾患又は障害の発症前の、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞又は該リプログラミングされた体細胞を含む組成物の投与を含む。また、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞又は該リプログラミングされた体細胞を含む組成物の投与は、疾患又は障害の誘導事象の後であって、該疾患又は障害の臨床的症状の前又は症状が現れた後のいずれかに見込まれ得る。
(美容上の使用及び方法）
本発明の一態様により、皮膚を再生又は幼若化させる美容方法であって、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞又は本明細書で規定される美容組成物の、それを必要としている対象への投与又は塗布を含む、前記方法が提供される。
別の態様において、美容方法は、それを必要としている組織又は器官を幼若化させるためのものであり、ここで、該組織又は器官は、皮膚ではない。別の態様において、本明細書で規定される美容組成物は、それを必要としている組織又は器官の幼若化のために用いてもよく、ここで、該組織又は器官は、皮膚ではない。
本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む美容組成物及び方法が、皮膚の再生又は幼若化のために好適に使用され得ることが認識されるであろう。さらに、そのような美容組成物及び方法は、瘢痕形成の低減及び結合組織の再生に有用であり得る。あるいはかつ/又はさらに、本明細書で規定される美容組成物は、美容外科手術中又は美容外科手術後に用いられる皮膚及び/又は結合組織の再生又は幼若化に有用であり得る。好適には、本明細書で規定される美容組成物は、DNAメチル化年齢又はエピジェネティック年齢などの年齢を低下させること、又は皮膚及び/又は結合組織をより若くすることを含む皮膚及び/又は結合組織の再生又は幼若化に有用である。
さらに、本明細書で規定される美容方法は、美容外科手術後の皮膚及び/又は結合組織の再生に有用であり得る。本明細書で規定される美容方法は、美容外科手術において用いられる皮膚及び/又は結合組織の再生において特定の有用性を見出すことが期待される。
さらに、本明細書で規定される美容組成物が、予防的に投与及び/又は利用され得ることが認識されるであろう。例えば、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞を含む美容組成物を、組織及び/又は生物のライフサイクルにおける早期の時点などの組織及び/又は生物が高齢のであるかつ/又は老いているとみなされる前の時点で用いてもよい。
(スクリーニング方法)
さらなる態様により、年齢調節因子をスクリーニングする方法であって:
(i)本明細書で規定される方法を試験因子の存在下及び非存在で行って、リプログラミングされた体細胞を生じさせること;及び
(ii)該リプログラミングされた体細胞の前記エピジェネティックシグネチャーなどの前記分子シグネチャーを決定すること
を含み、
該試験因子の存在下で生じさせたリプログラミングされた体細胞に対して決定された該分子シグネチャーと該試験因子の非存在下で生じさせたリプログラミングされた体細胞に対して決定された該分子シグネチャーとの間の差が、該因子の年齢調節作用の指標となる、
前記方法が提供される。
本発明のこの態様により、試験因子は、細胞、組織、器官、又は生物の老化を増加、高速化(speed-up)、又は加速(accelerate)させ得るか、あるいは、細胞、組織、器官、又は生物の老化を低減、低速化(slow-down)、又は減速(decelerate)させ得る任意の化合物、処理、条件、又はプロセスを含み得ることが認識されるであろう。従って、一実施態様において、試験因子は、細胞、組織、又は生物の老化を加速、高速化、又は増加させる。別の実施態様において、試験因子は、細胞、組織又は生物の老化を減速、低速化、又は低減させる。さらなる実施態様において、試験因子は、本明細書で規定されるリプログラミング方法の作用を低減させる。別の実施態様において、試験因子は、本明細書で規定されるリプログラミング方法の作用を増加させる。別の実施態様において、試験因子は、本明細書で規定される方法のリプログラミング作用を妨げる。
一実施態様において、分子シグネチャー間の差は、試験因子を受けさせた本明細書で規定されるか又は本明細書で規定される方法により生じさせたリプログラミングされた体細胞と、試験因子を受けさせていない本明細書で規定されるか又は本明細書で規定される方法により生じさせたリプログラミングされた体細胞との間で決定される。従って、一実施態様において、分子シグネチャー間の差は、試験因子の存在下でリプログラミングされた体細胞及び試験因子の非存在下でリプログラミングされた体細胞に対して決定された分子シグネチャーに対して決定される。さらなる実施態様において、分子シグネチャー間の差は、本明細書で規定される方法によりリプログラミングされた体細胞又は本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞と試験因子を受けたリプログラミングされていない体細胞との間で決定される。なおさらなる実施態様において、分子シグネチャー間の差は、本明細書で規定される方法によりリプログラミングされた体細胞又は試験因子を受けた本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞とリプログラミングされていない体細胞との間で決定される。
なおさらなる態様により、年齢調節因子又は細胞プロセスをスクリーニングする方法であって:
(i)本明細書で規定される方法により患部組織又は器官由来の体細胞をリプログラミングすること;及び
(ii)患部組織又は器官由来の該リプログラミングされた体細胞と、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞又は該患部組織又は器官由来のリプログラミングされていない体細胞との前記エピジェネティックシグネチャーなどの前記分子シグネチャーを決定すること
を含み、
患部組織又は器官由来の該リプログラミングされた体細胞に対して決定された該分子シグネチャーと、本明細書で規定されるリプログラミングされた体細胞又は該患部組織又は器官由来の該リプログラミングされていない体細胞に対して決定された該分子シグネチャーとの間の差が、該疾患に関連する年齢調節因子又は細胞プロセスの指標となる、
前記方法が提供される。
一実施態様において、年齢調節因子は、細胞、組織、器官、又は生物の年齢又は老化に関与しているかもしくはそれを調節するか、又はそれに関与しているかもしくはそれを調節すると思われている、体細胞内に発現されるか又は存在する因子である。さらなる実施態様において、年齢調節細胞プロセスは、細胞、組織、器官、又は生物の年齢又は老化に関与しているかもしくはそれを調節するか、又はそれに関与しているかもしくはそれを調節すると思われている細胞プロセスである。さらなる実施態様において、年齢調節因子又は細胞プロセスは、加齢性疾患又は障害に関与しているかもしくはそれを調節するか、又はそれに関与しているかもしくはそれを調節すると思われている。
一実施態様において、体細胞は、患部組織又は器官から得られ、ここで、疾患は、加齢性疾患又は障害である。ある実施態様において、加齢性疾患又は障害は、本明細書に記載される加齢性疾患又は障害から選択される。
従って、一実施態様において、分子シグネチャー間の差は、患部組織又は器官から得られるリプログラミングされた体細胞と任意の又は該患部組織又は器官から得られるリプログラミングされていない体細胞との間で決定される。さらなる実施態様において、分子シグネチャー間の差は、患部組織又は器官から得られるリプログラミングされた体細胞と非患部組織又は器官から得られるリプログラミングされていない体細胞との間で決定される。別の実施態様において、分子シグネチャー間の差は、非患部組織又は器官から得られるリプログラミングされた体細胞と、患部組織又は器官から得られるリプログラミングされていない体細胞との間で決定される。これらの実施態様により、前記リプログラミングされた体細胞及び/又はリプログラミングされていない体細胞を得る上記患部組織もしくは器官又は非患部組織もしくは器官は、同一の組織又は器官、例えば、該該組織又は器官の異なる部分であっても、異なる組織又は器官由来であってもよいことが認識されるであろう。
(実施例)
(材料及び方法)
3名の異なるドナー由来のヒト線維芽細胞を、ポリブレン(8μg/ml)の存在下で、ドキシサイクリン応答トランス活性化因子(www.addgene.orgから入手可能)及びtetO-GFP-hOKMS構築体(本明細書で規定される山中因子をコードする誘導性発現カセット)を含有するレンチウイルスに同時に感染させた。次に、形質導入効率を向上させるために、該ウイルスの添加後に細胞を1時間1000rpmで遠心分離した。感染の24時間後(第0日)に、ドキシサイクリン(2μg/ml)を、線維芽細胞培地(DMEM-F12、10％ FBS、1×Glutamax、1×MEM-NEAA、1×β-ME、0.2×Pen/Strep、16ng/ml FGF2)に添加した。その後、ドキシサイクリン処理の第2日に、細胞をGFP発現に関してフローで選別し(FACS)、ゼラチン被覆ディッシュ上に再プレーティングした。感染後第7日に、細胞を、照射マウス胚性線維芽細胞(iMEF)を含有するディッシュ上に継代培養し、翌日、培地をヒト胚性幹細胞培地(DMEM-F12、20％ KSR、1×Glutamax、1×MEM-NEAA、1×β-ME、0.2×Pen/Strep、8ng/ml FGF2)に交換した。第13日、第15日、及び第17日に、リプログラミングを受けた細胞を、CD13及びSSEA4表面発現に関してこれらのマーカーに対する抗体(Biolegendから入手)を用いてフローで選別した(FACS)。CD13+ SSEA4-集団及びCD13- SSEA4+集団の双方を採取し、iMEFを含有するディッシュ上の線維芽細胞培地中に再プレーティングした。再プレーティングした細胞を、該細胞がそれらの初めの細胞型に復帰(本明細書で規定される「復帰(reversion)」)できるようにドキシサイクリンなしで4週間生育させた。4週間の復帰の最後に、細胞をフローサイトメトリー分析、DNAメチル化アレイ、及びRNAシークエンシング用に回収した。
(DNAメチル化アレイ)
ゲノムDNAを、製造業者の説明書に従ってかつ任意選択のRNase消化工程を含めて、DNeasy血液及び組織キット(Qiagen)を用いて細胞試料から抽出した。ゲノムDNA試料を、Barts and the London Genome Centreでさらに処理し、Infinium MethylationEPICアレイ(Illumina)にかけた。
(RNA-Seq)
RNAを、製造業者の説明書に従ってRNeasyミニキット(Qiagen)を用いて細胞試料から抽出した。RNA試料を、DNase(Thermo Scientific)で処理して、混入したDNAを取り除いた。RNA-Seqライブラリーを、Wellcome Sanger Instituteで調製し、HiSeq 2500システム(Illumina)で50bpのシングルエンドシークエンシングにかけた。
(DNAメチル化分析)
アレイデータを、minfi Rパッケージ及びNOOB正規化(NOOB normalisation)で処理して、ベータ値を出した。DNAメチル化年齢を、ホルヴァートのエピジェネティック時計(Horvathの文献、(2013) Genome Biology 14, R115)を用いて計算した。線維芽細胞及びiPSCのリプログラミングの参照データセットは、Ohnukiらの文献、(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. 111、12426-12431及びBanovichらの文献、(2018) Genome Res 28、122-131から得た。また、参照データセットは、CytoTune(商標)-iPS 2.0センダイリプログラミングキット(Invitrogen)でリプログラミングされつつある線維芽細胞の中間ステージを調査した未公開データを含んでいた。
(RNA-Seq解析)
リードを、Trim Galore(バージョン0.6.2)でトリミングし、Hisat2(バージョン2.1.0)を用いてヒトゲノム(GRCh38)と整列させた。未加工カウント及びlog2変換カウントを、Seqmonkを用いて得た。線維芽細胞及びiPSCの参照データセットは、Fleischerらの文献、(2018) Genome Biol. 19、221及びBanovichらの文献、(2018) (上記)から得た。また、参照データセットは、CytoTune(商標)-iPS 2.0センダイリプログラミングキット(Invitrogen)でリプログラミングされつつある線維芽細胞の中間ステージを調査した未公開データを含んでいた。
(免疫蛍光法及びイメージング)
抗体染色を、既に述べられているように(Santosらの文献、(2003) Curr. Biol. 13、1116-1121)、カバーガラス上で育てられた又はサイトスピンされた細胞に対して、2％ PFAを用いる室温で30分間の固定化後に行った。簡単に述べると、細胞を、PBS中の0.5％ トリトンX-100で1時間透過処理した;PBS中の0.05％Tween20中1％のBSA(BS)で1時間ブロッキングした;BS中に希釈した適当な一次抗体のインキュベーション;それに続く、BS及び二次抗体中での洗浄。二次抗体は全て、BS中に1:1000で希釈され、30分間インキュベーションされた、Alexa Fluorにコンジュゲートされたもの(Molecular Probes)であった。インキュベーションは、室温で行われた。DNAを、PBS中の5μg/mL DAPIで対比染色した。光学断面を、Zeiss LSM780顕微鏡で撮像した(63×油浸対物レンズ)。蛍光半定量分析を、Volocity 6.3(Improvision)で行った。用いた抗体を、以下に示す:
抗H3K9me3; 07-442, Merck/ Millipore (1:500);
抗コラーゲンI; ab254113, Abcam (1:400)。
(実施例1:部分的にリプログラミングされた体細胞は、線維芽細胞様である)
プロトコールの中間ステージで、山中因子を発現していた細胞は、不均質となっていた。一部の細胞は、CD13+ SSEA4-のままであり、非リプログラミングとして分類され、一方で、一部の細胞は、CD13- SSEA4+となり、リプログラミング成功として分類された(図1を参照されたい)。これらの集団を双方とも、フロー選別し(FACS)、ドキシサイクリンを用いずにさらに4週間培養した(本明細書で規定される「復帰」)。この期間の最後に、リプログラミング成功細胞は、線維芽細胞表現型に戻り、CD13+ SSEA4-となった(図2を参照されたい)。また、これらの細胞は、形態的には線維芽細胞に類似していた(図3を参照されたい)。非リプログラミングの細胞(「+ CD13」を付したプロットに示す)又は山中因子の存在下で培養されなかった細胞(「-」条件)は、全期間にわたり線維芽細胞様のままであった。
類似の所見が、より長い期間のリプログラミングで見られた(データは示していない)。
(実施例2:部分的にリプログラミングされた体細胞は、より若いエピジェネティック年齢を示す)
山中因子の存在下での13日間の培養後にリプログラミング成功であり、その後復帰させた細胞は、それらそれぞれの対照よりも30～40歳若いDNAメチル化年齢を示した。復帰フェーズ前により長い期間のリプログラミング(15又は17日)を実施すると、幼若化作用が僅かに減少した。山中因子を発現していた非リプログラミング細胞は、山中因子を一度も発現しなかった陰性対照と同じ年齢であった(図4を参照されたい)。
従って、本明細書で提供されるデータは、山中因子を単独で短い期間(すなわち、iPS細胞リプログラミングの開始フェーズの範囲内の、SSEA4などの多能性マーカーの発現前、体細胞系列特異的マーカー発現が、細胞表面にもはや検出可能ではなくなる前の期間、又は5日未満)発現させることは、エピジェネティック年齢を幼若化させることや、より若いDNAメチル化年齢/エピジェネティックシグネチャーを示すように体細胞を成功裏にリプログラミングすることに十分ではないことを示す。また、このデータは、リプログラミング成功とみなされるためには、細胞は、リプログラミング/多能性マーカーSSEA4陽性ともなければならないことを示唆する。
(実施例3:一過性リプログラミング実験)
((a)実験設計)
一過性リプログラミングの可能性を調査するために、本発明者らは、高齢ドナー由来の線維芽細胞に、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、及びGFPを含有するドキシサイクリン誘導性リプログラミング構築体を感染させた。また、一部の線維芽細胞を、該構築体を用いずに「疑似感染」させて」、陰性対照を調製した。感染後、フロー選別によってGFP発現細胞について正の選択を行い、陰性対照については、同数の生細胞をフロー選別した。その後、細胞を、種々の期間ドキシサイクリンで処理してから、細胞表面マーカー:CD13及びSSEA4に基づくリプログラミング成功細胞及びリプログラミング失敗細胞についてのフロー選別を行った。最後に、少なくとも4週の期間、選別した細胞を、ドキシサイクリンの非存在下で成長させてから、分析(図5)のために細胞を集めた。該プロセスの終了時に、細胞は、線維芽細胞に形態的に類似していた(図6)。
((b)一過性にリプログラミングされた細胞は、後成的に線維芽細胞に類似している)
本発明者らは、完全な線維芽細胞リプログラミングを調査している参照データセットと並べて、一過性にリプログラミングされた細胞のメチロームに対して主成分分析を行った。予想通りに、主成分1は、リプログラミングの程度に基づいて細胞を分離しており、参照データセットを含むリプログラミングトラジェクトリーが得られた。特に、一過性にリプログラミングされた細胞(及び対照群)は、リプログラミングトラジェクトリーの開始点にあり、これらが、リプログラミング中間体やiPSCよりもむしろ線維芽細胞に似ていることを示唆していた(図7)。
iPSCリプログラミングの間には、多くのDNAメチル化の変化が、プロモーターなどの調節エレメントで生じる。特に、Oct4プロモーターは、iPSCリプログラミングの間に脱メチル化される。しかしながら、本発明者らが、一過性にリプログラミングされた細胞におけるOct4プロモーターを調査したところ、それが、対照群及び参照線維芽細胞に類似のレベルでいまだ過剰メチル化されていたことが見いだされた(図8)。同じく、FSP1(線維芽細胞マーカー遺伝子)のプロモーターが、iPSCにおいて過剰メチル化されていたことが認められた。一過性にリプログラミングされた細胞内にではあるが、このプロモーターがいまだ脱メチル化されていることを見出だした(図9)。
((c)一過性にリプログラミングされた細胞は、転写的に線維芽細胞に類似している)
また、本発明者らは、完全な線維芽細胞リプログラミングを調査している参照データセットと共に、一過性にリプログラミングされた細胞のトランスクリプトームに対して主成分分析を行った。メチローム解析と同様に、主成分1は、リプログラミングの程度に基づいて試料を分離しており、参照データセットを含むリプログラミングトラジェクトリーが得られた。一過性にリプログラミングされた細胞のトランスクリプトームは、このトラジェクトリーの始めにあり、これらの細胞が、転写的にも線維芽細胞に似ていることを示唆している(図10)。
iPSCリプログラミングの間には、最初の細胞型のマーカー遺伝子が下方制御され、多能性遺伝子が上方制御される。本発明者らは、FSP1(図11)などの線維芽細胞マーカー遺伝子が、一過性にリプログラミングされた細胞においては下方制御されず、Nanog(図12)などの多能性マーカー遺伝子が、上方制御されないことを見出だした。
((d)一過性リプログラミングは、多くの老化マーカーを幼若化させる)
エピゲノムに対する一過性リプログラミングの幼若化作用を調査するために、本発明者らは、一過性リプログラミング後の細胞のDNAメチル化年齢を、ホルヴァートのエピジェネティック時計を用いて計算した。対照群と比較して、一過性リプログラミングが、DNAメチル化を最高で40歳幼若化させたことを見出だした。特に、13日間のドキシサイクリン処置での一過性リプログラミングは、最も大きい幼若化をもたらし、これが、エピジェネティックな幼若化に最適な量であることを示唆している(図13)。
グローバルレベルのヒストン修飾などのエピゲノムの他の特徴は、老化に伴い変化する。H3K9me3レベルは、老化に伴い低下するが、本発明者らは、一過性リプログラミングが、H3K9me3を若年のレベルまで増加させる可能性を有することを見出だした(図14)。
トランスクリプトームに対する一過性リプログラミングの幼若化作用を調査するために、本発明者らは、線維芽細胞から得た公表済みデータ(Fleischerらの文献、(2018)、上記を参照)に対して、ランダムフォレスト回帰を用いて転写クロックを訓練した。この転写クロックは、13.48歳の中央絶対誤差で年齢を予測した。このクロックを用いて、一過性リプログラミングが、転写年齢を約30～40歳幼若化させたことを見出だし、これは、エピジェネティック時計を用いて認められた幼若化の程度と類似していた。エピジェネティック時計とは反対に、転写年齢の幼若化は、調査したドキシサイクリン処理の全期間で観察された(図15)。
コラーゲンの分泌は、線維芽細胞の重要な機能である。本発明者らは、一過性リプログラミングが、いくつかのコラーゲン遺伝子の発現を増加させることを見出だした。特に、これらの増加は、COL4A1及びCOL4A2について非常に顕著であった(図16)。また、免疫蛍光法によってI型コラーゲンのタンパク質レベルを調査して、一過性リプログラミング(10日間のドキシサイクリン処理によるもの)が、コラーゲンタンパク質を若年レベルへと回復させたことを見出だした(図17)。

Claims (30)

  1. 体細胞を多能性様の状態又は幼若化された状態へとリプログラミングする方法であって:
    i)該体細胞を、1つ以上の山中因子の存在下で、少なくとも5日の期間、かつ/又は多能性マーカーの発現が、該体細胞の表面又は該体細胞の内部に検出可能となるまで、かつ/又は体細胞系列特異的マーカーが、該体細胞の表面にもはや検出可能ではなくなるまで培養すること;
    ii)該体細胞を、該1つ以上の山中因子の非存在下で、該多能性マーカーの発現が該体細胞の表面又は該体細胞の内部で減少するまで、かつ/又は体細胞系列特異的マーカーの発現が該体細胞の表面に検出されるまでさらに培養すること
    を含む、前記方法。
  2. 体細胞を、幼若化された状態へとリプログラミングする、請求項1記載の方法。
  3. 前記体細胞が、前記1つ以上の山中因子の存在下で、少なくとも6日又は少なくとも13日の期間培養される、請求項1記載の方法。
  4. 前記体細胞が、前記1つ以上の山中因子の存在下で、17日を超えない又は15日を超えない期間培養される、請求項1～3のいずれか1項記載の方法。
  5. 前記体細胞が、前記1つ以上の山中因子の存在下で、多能性マーカーの発現が、該体細胞の表面に又は該体細胞内に検出可能となるまで培養される、請求項1～4のいずれか1項記載の方法。
  6. 前記多能性マーカーが、ステージ特異的胚性抗原-4(SSEA4)である、請求項1～5のいずれか1項記載の方法。
  7. 前記体細胞が、前記1つ以上の山中因子の存在下で、体細胞系列特異的マーカーの発現が、該体細胞の表面にもはや検出されなくなるまで培養される、請求項1～6のいずれか1項記載の方法。
  8. 前記体細胞が、前記1つ以上の山中因子の非存在下で、前記多能性マーカーの発現が、該体細胞の表面で減少するまで培養される、請求項1～7のいずれか1項記載の方法。
  9. 前記体細胞が、前記1つ以上の山中因子の非存在下で、体細胞系列特異的マーカーの発現が該体細胞の表面に検出されるまで培養される、請求項1～8のいずれか1項記載の方法。
  10. 前記体細胞のリプログラミングが、不完全であり、かつ/又は部分的なリプログラミングであり、かつ/又は一過性リプログラミングである、請求項1～9のいずれか1項記載の方法。
  11. 前記体細胞が、前記1つ以上の山中因子の存在下で、リプログラミングの成熟期の範囲内で培養される、請求項1～10のいずれか1項記載の方法。
  12. 前記リプログラミングされた体細胞が、組織のライフサイクルにおいてより早期の時点由来の体細胞に対応する、エピジェネティックシグネチャーなどの分子シグネチャーを含む、請求項1～11のいずれか1項記載の方法。
  13. 前記リプログラミングされた体細胞が、リプログラミングされていない体細胞の表現型及び/又は前記エピジェネティックシグネチャーなどの前記分子シグネチャーを保持している、請求項1～12のいずれか1項記載の方法。
  14. 前記リプログラミングされた体細胞及び/又はリプログラミングされていない体細胞の前記分子シグネチャーが、前記エピジェネティックシグネチャーであり、かつホルヴァートのエピジェネティック時計を用いて決定され、例えば、ここで、該リプログラミングされた体細胞の該エピジェネティックシグネチャーが、該リプログラミングされていない体細胞よりも少なくとも10％若い、少なくとも40％若い、又は少なくとも70％若いエピジェネティック年齢を示す、請求項1～13のいずれか1項記載の方法。
  15. 前記1つ以上の山中因子が、前記体細胞内に形質導入又はトランスフェクションされた誘導性発現カセットから提供され、例えば、ここで、該1つ以上の山中因子の存在下での前記培養が、該誘導性発現カセットからの発現を誘導することができる化合物の添加をさらに含む、請求項1～14のいずれか1項記載の方法。
  16. 前記1つ以上の山中因子の非存在下での前記培養が、前記誘導性発現カセットからの発現を誘導することができる前記化合物の除去を含む、請求項1～15のいずれか1項記載の方法。
  17. 前記1つ以上の山中因子が、山中因子をコードするmRNAの形態で提供される、請求項1～16のいずれか1項記載の方法。
  18. 前記1つ以上の山中因子の非存在下での前記培養が、培養物からの前記山中因子をコードするmRNAの除去を含む、請求項17記載の方法。
  19. 前記1つ以上の山中因子が、山中因子をコードするmRNAから発現されるタンパク質の形態で提供される、請求項1～16のいずれか1項記載の方法。
  20. 前記タンパク質が、機能的ツインアルギニン透過(Tat)系又はナノ粒子送達系などの標的化送達系によって前記体細胞に直接送達される、請求項19記載の方法。
  21. 前記山中因子が、薬物(すなわち、ドキシサイクリン(dox))誘導性又は非誘導性のCRISPR/Cas-9などのCRISPR/Cas-9によって前記体細胞内に導入される、請求項1～16のいずれか1項記載の方法。
  22. 前記1つ以上の山中因子が:OCT4、KLF4、c-MYC、SOX2、LIN28及び/又はNANOGのうちの1つ以上から選択され、或いは、好ましくは:OCT4、KLF4、c-MYC、及び/又はSOX2のうちの1つ以上、又は2つ以上、又は3つ以上、又は全てから選択される、請求項1～21のいずれか1項記載の方法。
  23. 請求項1～22のいずれか1項記載の方法により製造されたリプログラミングされた体細胞。
  24. 請求項23記載のリプログラミングされた体細胞を含む医薬組成物。
  25. 変性又は加齢性の疾患又は障害の治療及び/又は改善における使用のため、又は皮膚、血液、骨髄、肝臓、又は心臓などの組織又は器官の幼若化における使用のための、請求項23記載のリプログラミングされた体細胞又は請求項24記載の医薬組成物であって、該変性又は加齢性の疾患又は障害が:皮膚の疾患もしくは障害;又は膵臓の疾患もしくは障害、例えば、2型糖尿病;又は神経変性障害を含む、前記リプログラミングされた体細胞又は医薬組成物。
  26. ヒト対象又は動物対象への投与のためのものである、請求項25記載の使用のための請求項23記載のリプログラミングされた体細胞又は請求項24記載の医薬組成物。
  27. 請求項23記載のリプログラミングされた体細胞を含む美容組成物。
  28. 皮膚を再生又は幼若化させる美容方法であって、それを必要としている対象への請求項23記載のリプログラミングされた体細胞又は請求項27記載の美容組成物の投与又は塗布を含む、前記方法。
  29. 年齢調節因子をスクリーニングする方法であって:
    (i)請求項1～22のいずれか1項記載の方法を、試験因子の存在下及び非存在で行って、リプログラミングされた体細胞を生じさせること;及び
    (ii)該リプログラミングされた体細胞の前記エピジェネティックシグネチャーなどの前記分子シグネチャーを決定することを含み、
    該試験因子の存在下で生じさせたリプログラミングされた体細胞に対して決定された該分子シグネチャーと該試験因子の非存在下で生じさせたリプログラミングされた体細胞に対して決定された該分子シグネチャーとの間の差が、該因子の年齢調節作用の指標となる、前記方法。
  30. 年齢調節因子又は細胞プロセスをスクリーニングする方法であって:
    (i)患部組織又は器官由来の体細胞を、請求項1～22のいずれか1項記載の方法によってリプログラミングすること;及び
    (ii)患部組織又は器官由来の該リプログラミングされた体細胞と請求項23記載のリプログラミングされた体細胞又は該患部組織又は器官由来のリプログラミングされていない体細胞との前記エピジェネティックシグネチャーなどの前記分子シグネチャーを決定すること
    を含み、
    患部組織又は器官由来の該リプログラミングされた体細胞に対して決定された該分子シグネチャーと請求項23記載の該リプログラミングされた体細胞又は該患部組織又は器官由来の該リプログラミングされていない体細胞に対して決定された該分子シグネチャーとの間の差が、該疾患に関連する年齢調節因子又は細胞プロセスの指標となる、前記方法。
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