JP2022540197A - エーリキアワクチンおよび免疫原性組成物 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、いくつかの局面ではエーリキア・カニスなどのエーリキア属に対する免疫応答を誘導するために用いることができる、免疫原性組成物を提供する。いくつかの態様では、前記免疫原性組成物は、E.カニスバクテリン、および／またはアジュバント、たとえばエマルジョンもしくはリポソームアジュバントなどを含む。エーリキア症の診断のためまたはエーリキア症に対するワクチン接種のためなどの関連する方法も提供する。

Description

発明の背景
本願は、2019年7月12日出願の米国特許仮出願第62/873,843号、2019年7月29日出願の米国特許仮出願第62/879,762号、および2020年7月8日出願の米国特許仮出願第63/049,476号の恩典を主張するものであり、それらの全文が参照により本明細書に組み入れられる。
1.発明の分野
本発明は、広くは、分子生物学および医薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）に対する免疫原性またはワクチン組成物、および関連の方法に関する。
2.関連技術の説明
ヒト単球性（monocytotropic）エーリキア症（HME）は、NIAIDの第1群の新興疾病であり、その病原因子であるエーリキア・シャフェンシス（Ehrlichia chaffeensis）は、カテゴリーCの重点的病原体に分類される。HMEは、生命にかかわる未分化の熱性疾病であり、臨床診断が難しく、たいていの場合、診断確定は遡及的である（Walker and Dumler, 1997; Walker et al., 2004; Dumler et al., 2007）。2012年の時点で8,000件を優に超える事例が疾病管理センターに報告されているが、この数は実際の事例数を100分の1に過小評価していると考えられる（Olano et al., 2003）。この疾患は、発症に関連する非特異的な症状のせいでしばしば診断未確定となるが、結果的に事例の43～62%で患者を入院させることになる（Fishbein et al., 1994）。疾患の進行は致死的転帰となる場合があり、かつしばしば多系統不全を伴い、急性呼吸促迫症候群（ARDS）および髄膜脳炎が致死事例の多くに共通している（Fishbein et al., 1994; Paparone et al., 1995）。新規に発生するエーリキア因子により公衆衛生に対する脅威は増加しつつあるが、ヒトエーリキア症のワクチンは得られておらず、治療選択肢は限られている。エーリキア・カニス（E.カニス）はイヌに感染し得る近縁体であり、類似の獣医学的および臨床的問題をもたらす。明らかに、E.カニスなどのエーリキア属（Ehrlichia）の診断およびそれに対するワクチン接種のための、新規なかつ改良された方法の必要性がある。
本発明は、いくつかの局面では、エーリキア・カニスに対する免疫応答の生成に用いられ得る新規な組成物および方法を提供することにより、先行技術の限界を克服する。いくつかの態様では、組成物は、本明細書に記載される、少なくとも2つのE.カニスタンパク質または免疫原性ペプチド、およびアジュバントを含有する。E.カニスに対する免疫応答を生成する、関連の方法も提供する。いくつかの態様では、哺乳類対象（たとえばイヌ）における免疫応答を、対象に（i）E.カニスバクテリン、（ii）（たとえば、Quil A、コレステロール、および免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む）アジュバント、ならびに（iii）1つまたは複数のTRPタンパク質またはペプチドを投与することにより、誘導することができ、これらの構成要素は、単一の薬学的組成物（バクテリン、アジュバント、および1つまたは複数のTRPタンパク質またはペプチドを含む）として投与されても、複数の薬学的組成物として投与されてもよい。たとえば、対象は、第1の薬学的組成物（TRPタンパク質およびアジュバントを含む）と、第2の薬学的組成物（バクテリンおよびアジュバントを含む）の両方を投与されてもよく、ここで第1の薬学的組成物と第2の薬学的組成物とは、実質的に同時に、または時間をずらして、投与される。
いくつかの局面では、本発明は、（i）TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、TRP95、TRP19、および／またはTRP120のうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはすべて（たとえば、TRP140、TRP36、および／またはTRP19）;ならびに、SEQ ID NO:1～16のいずれか1つのペプチドを含むかまたはそれからなる少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のペプチド;（ii）TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、TRP95、TRP19および／またはTRP120のうちの少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはすべて（たとえば、TRP140、TRP36、および／またはTRP19）;（iii）E.カニスバクテリン、および、TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、TRP95、TRP19、またはTRP120のうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはすべて（たとえば、TRP140、TRP36、および／またはTRP19）;（iv）E.カニスバクテリン、および、SEQ ID NO:1～16のいずれか1つのペプチドを含むかまたはそれからなる少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のペプチド;あるいは（v）E.カニスバクテリン、TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、TRP95、TRP19、TRP120のうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはすべて（たとえば、TRP140、TRP36、および／またはTRP19）、および、SEQ ID NO:1～16のいずれか1つのペプチドを含むかまたはそれからなる少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のペプチド、ならびに、薬学的に許容される賦形剤を含む、免疫原性組成物に関する。任意で、免疫原性組成物は、Ank200、Ank153、OMP-1、および／またはP30/28のうちの1つ、2つ、3つ、すべてを含んでもよい。いくつかの態様では、免疫原性組成物は、TRP120を含まない。いくつかの態様では、薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントを含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、アジュバントは、トリテルペノイドサポニン（たとえばQuil A）、ステロール（たとえばコレステロール）、および免疫賦活性オリゴヌクレオチド（たとえばCpG含有ODN）を含む。いくつかの態様では、トリテルペノイドサポニンはQuil Aであり、ステロールはコレステロールであり、かつ免疫賦活性オリゴヌクレオチドはCpG含有ODNである。CpG含有ODNは、
Figure 2022540197000001
であってもよく、ここで「*」はホスホロチオアート結合を指し、「-」はホスホジエステル結合を指し、かつ「JU」は5’-ヨード-2’-デオキシウリジンを指す。組成物は、TRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、またはすべてを含んでもよい。組成物は、TRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの1つ、2つ、またはすべてを含むキメラタンパク質を含んでもよい。組成物は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、および／またはSEQ ID NO:14のうちの1つ、2つ、またはすべてを含むポリペプチドを含んでもよい。アジュバントは、エマルジョンまたはリポソームであってもよいか、あるいはアジュバントは脂質を含んでもよい。いくつかの態様では、エマルジョンは、水中油型（O/W）エマルジョンまたは油中水型（W/O）エマルジョンである。アジュバントは、トリテルペノイド、ステロール、免疫調節物質、ポリマー、および／または免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの態様では、ポリマーは、ジエチル-アミノエチル（DEAE）-デキストラン、ポリエチレングリコール、またはポリアクリル酸である。免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、CpG含有ODNであってもよい。いくつかの態様では、アジュバントは、DEAEデキストラン、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、および鉱物油などの油を含み、ここで免疫賦活性オリゴヌクレオチドはCpG含有ODNであり、かつアジュバント製剤は油中水型（W/O）エマルジョンである。アジュバントは、サポニン、ステロール、四級アンモニウム化合物、ポリマー、およびORN/ODNを含んでもよい。いくつかの態様では、サポニンは、Quil Aまたはその精製された画分であり、ステロールはコレステロールであり、四級アンモニウム化合物はジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）であり、ポリマーはポリアクリル酸であり、かつORN/ODNはCpG含有オリゴヌクレオチドである。サポニンは、1用量あたり約1 μg～約5,000 μgの量で存在してもよく、ステロールは、1用量あたり約1 μg～約5,000 μgの量で存在してもよく、四級アンモニウム化合物は、1用量あたり約1 μg～約5,000 μgの量で存在してもよく、かつポリマーは、約0.0001% v/v～約75% v/vの量で存在してもよい。アジュバントは、たとえばN-（2-デオキシ-2-L-ロイシルアミノ-β-D-グルコピラノシル）-N-オクタデシルドデカンアミドアセタートなどの糖脂質をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、アジュバントは、トリテルペノイドサポニン、ステロール、四級アンモニウム化合物、およびポリアクリル酸ポリマーを含む。いくつかの態様では、サポニンは、Quil Aまたはその精製された画分であり、ステロールはコレステロールであり、かつ四級アンモニウム化合物はジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）である。いくつかの態様では、サポニンが1用量あたり約1 mg～約5,000 mgの量で存在する場合、ステロールは、1用量あたり約1 mg～約5,000 mgの量で存在し、四級アンモニウム化合物は、1用量あたり約1 mg～約5,000 mgの量で存在し、かつポリアクリル酸ポリマーは、約0.0001% v/v～約75% v/vの量で存在する。いくつかの態様では、アジュバントは、油中水型エマルジョンを含むか、または油中水型エマルジョンである。油中水型エマルジョンは、油相および水相、ポリカチオン性担体（たとえばDEAEデキストラン）、ならびにCpG含有免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含んでもよい。組成物は、水酸化アルミニウムゲルをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、ポリカチオン性担体はDEAEデキストランである。組成物は、エマルジョンまたは水中油型（O/W）エマルジョンを含んでもよいか、またはそれであってもよい。いくつかの態様では、エマルジョンは水相を含み、水相が、アルキル-ポリアクリル酸（アルキル-PAA）、またはアクリルポリマーとジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）の両方含む。いくつかの態様では、水中油型エマルジョンの水相は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）およびアルキル-ポリアクリル酸（アルキル-PAA）を含む。いくつかの態様では、アルキル-PAAはデシル-PAA、オクチル-PAA、ブチル-PAA、またはメチル-PAである。いくつかの態様では、アクリルポリマーは、ポリアリルスクロースとともに架橋されたアクリル酸のポリマーである。組成物は、非鉱物油と乳化剤とを含む油中水型（W/O）エマルジョンを含んでもよいか、またはそれであってもよい。いくつかの態様では、乳化剤は、マンニドモノオレアート乳化剤である。いくつかの態様では、アジュバントは、MF59、AS01、AS02、AS03、AS04、ビロソーム、CAF01、CAF04、CAF05、アクリルポリマー/DDAエマルジョン、CpG/DEAEエマルジョン、サポニン/コレステロール/DDAアジュバント、またはポリアクリル酸ポリマーエマルジョンである。
いくつかの態様では、免疫原性組成物は、TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、TRP95、およびTRP19のうちの少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、またはすべてを含む。いくつかの態様では、組成物は、（TRP153およびTRP36）、（TRP153およびTRP140）、（TRP153およびTRP28）、（TRP153およびTRP95）、（TRP36およびTRP140）、（TRP36およびTRP28）、（TRP36およびTRP95）、（TRP140およびTRP28）、（TRP140およびTRP95）、（TRP28およびTRP95）、（TRP19およびTRP153）、（TRP19およびTRP36）、（TRP19およびTRP140）、（TRP19およびTRP28）、（TRP19およびTRP95）、（TRP120およびTRP153）、（TRP120およびTRP36）、（TRP120およびTRP140）、（TRP120およびTRP28）、（TRP120およびTRP95）、または（TRP120およびTRP19）を含む。いくつかの態様では、組成物は、TRP120、TRP140、およびTRP36を含む。いくつかの態様では、組成物は、TRP140、TRP36、およびTRP19を含む。組成物は、E.カニスバクテリンをさらに含んでもよい。E.カニスバクテリンは、熱失活または化学失活バクテリンであってもよい。いくつかの態様では、化学失活バクテリンは、ホルムアルデヒド、ホルマリン、bi-エチレンアミン、放射線、紫外線、β-プロピオラクトン処理、またはホルムアルデヒドにより失活させた。いくつかの態様では、組成物は、（SEQ ID NO:2、および（SEQ ID NO:3～11もしくは16）のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:12～13のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:14）、（（SEQ ID NO:3～11もしくは16）のうちの少なくとも1つ、およびSEQ ID NO:12～13のうちの少なくとも1つ）、（（SEQ ID NO:3～11もしくは16）のうちの少なくとも1つ、およびSEQ ID NO:14）、（SEQ ID NO:12～13のうちの少なくとも1つ、およびSEQ ID NO:14）、（SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2）、（SEQ ID NO:1、および（SEQ ID NO:3～11もしくは16）のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:1、およびSEQ ID NO:12～13のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:14）、（SEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:2）、（SEQ ID NO:15、および（SEQ ID NO:3～11もしくは16）のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:15、およびSEQ ID NO:12～13のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:14）、または（SEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:1）を含む。いくつかの態様では、組成物は、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:14、および（SEQ ID NO:3～11または16のいずれか1つ）を含む。いくつかの態様では、組成物は、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、およびSEQ ID NO:1を含む。組成物は、E.カニスバクテリンをさらに含んでもよい。E.カニスバクテリンは、熱失活または化学失活バクテリンであってもよい。いくつかの態様では、化学失活バクテリンは、ホルムアルデヒド、ホルマリン、bi-エチレンアミン、放射線、紫外線、β-プロピオラクトン処理、またはホルムアルデヒドにより失活させた。いくつかの態様では、組成物は、E.カニスバクテリンを含む。E.カニスバクテリンは、熱失活または化学失活バクテリンであってもよい。いくつかの態様では、化学失活バクテリンは、ホルムアルデヒド、ホルマリン、bi-エチレンアミン、放射線、紫外線、β-プロピオラクトン処理、またはホルムアルデヒドにより失活させた。
本発明の別の局面は、エーリキア属（Ehrlicia）もしくはE.カニスへの曝露またはそれによる感染症を診断する方法に関し、方法は、a）哺乳類対象から生物学的試料を得ること、ならびに、b）生物学的試料を、TRP120、TRP140、および／もしくはTRP36、または、そのペプチド、たとえばSEQ ID NO:3～11、14、15、もしくは16のいずれかに対する免疫反応性について試験することを含み、TRP120、TRP140、および／またはTRP36に対する免疫反応性によって、対象がエーリキア属またはE.カニスに曝露されたことがあるかまたは感染したことがあることが示される。いくつかの態様では、哺乳類対象はイヌである。いくつかの態様では、方法は、TRP120およびTRP36、または、生物学的試料を、その免疫反応性ペプチド、たとえばSEQ ID NO:3～11、14、もしくは16のいずれかに対する免疫反応性について試験することを含む。いくつかの態様では、方法は、生物学的試料を、TRP120、TRP140、およびTRP36、または、その免疫反応性ペプチド、たとえばSEQ ID NO:3～11、14、15、もしくは16のいずれかに対する免疫反応性について試験することを含む。いくつかの態様では、方法は、哺乳類対象を治療する方法をさらに含み、かつ、哺乳類対象は、薬理的に適切な量または治療的に適切な量の抗生物質、たとえばドキシサイクリンなどを投与される。
本発明のさらに別の局面は、哺乳類対象において免疫応答を誘導する方法に関し、方法は、対象に、上記のまたは本明細書に記載される薬学的に適切な量の免疫原性組成物を投与することを含む。免疫原性組成物は、アジュバントを含んでもよい。いくつかの態様では、アジュバントは、トリテルペノイドサポニン（たとえばQuil A）、ステロール（たとえばコレステロール）、および免疫賦活性オリゴヌクレオチド（たとえばCpG含有ODN）を含む。いくつかの態様では、トリテルペノイドサポニンはQuil Aであり、ステロールはコレステロールであり、かつ免疫賦活性オリゴヌクレオチドはCpG含有ODNである。いくつかの態様では、CpG含有ODNは、
Figure 2022540197000002
であり、ここで「*」はホスホロチオアート結合を指し、「-」はホスホジエステル結合を指し、かつ「JU」は5’-ヨード-2’-デオキシウリジンを指す。いくつかの態様では、免疫原性組成物は、TRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、またはすべてを含む。免疫原性組成物は、TRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの1つ、2つ、またはすべてを含むキメラタンパク質を含んでもよい。いくつかの態様では、免疫原性組成物は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、および／またはSEQ ID NO:14のうちの1つ、2つ、またはすべてを含むポリペプチドを含む。免疫原性組成物は、アジュバント、ならびにTRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの1つ、2つ、またはすべてを含んでもよい。方法は、第2の免疫原性組成物を対象に投与することをさらに含んでもよく、第2の免疫原性組成物は、エーリキアバクテリン（たとえばE.カニスバクテリン）を含む。第2の免疫原性組成物は、アジュバントを含んでもよく、好ましくはアジュバントは、トリテルペノイドサポニン（たとえばQuil A）、ステロール（たとえばコレステロール）、および免疫賦活性オリゴヌクレオチド（CpG含有ODN）を含む。いくつかの態様では、第2の免疫原性組成物中のアジュバントは、Quil A、コレステロール、およびCpG含有ODNを含む。いくつかの態様では、CpG含有ODNは、
Figure 2022540197000003
であり、ここで「*」はホスホロチオアート結合を指し、「-」はホスホジエステル結合を指し、かつ「JU」は5’-ヨード-2’-デオキシウリジンを指す。いくつかの態様では、哺乳類対象はイヌである。
いくつかの態様では、アジュバントは、シャボンノキ（Quillaja saponaria）の樹皮に由来する免疫学的活性サポニンの画分を含んでもよいかまたはそれからなってもよい。サポニンは、たとえばQuil Aでもよいか、または市販品として入手することができる別の精製もしくは部分精製サポニン調製物でもよい。Quil Aは、たとえばE.M. Sergeant Pulp & Chemical Company（米国ニュージャージー州クリフトン）から市販されている。アジュバントは、QS-7、QS-17、QS-18、およびQS-21を含んでもよいか、またはそれらからなってもよい。QS-7、QS-17、QS-18、およびQS-21も、たとえばAntigenics（米国マサチューセッツ州フラミンガム）から、市販されている。サポニン抽出物は、アジュバント中混合物として用いることができるか、またはQS-7、QS-17、QS-18、およびQS-21などの精製された個々の構成要素がアジュバントに含まれてもよい。いくつかの態様では、Quil Aは、少なくとも約85%純粋である。ほかの態様では、Quil Aは、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または約99%純粋である。
前記アジュバントは、有利には、Pクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチド、より好ましくは修飾Pクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含んでもよい。Pクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのパリンドロームを含む、典型的には6～20ヌクレオチド長のCpGオリゴヌクレオチドである。いくつかの好ましい態様では、Pクラスオリゴヌクレオチドは、インビトロおよび／またはインビボで、自発的に自己会合してコンカテマーになることができる。Pクラスオリゴヌクレオチドは個別には一本鎖であるが、パリンドロームの存在により、複数のPクラスオリゴヌクレオチド（たとえば、同じヌクレオチド配列を有する複数のPクラスオリゴヌクレオチド）同士のコンカテマーまたはステム・アンド・ループ構造の形成が可能になる。いくつかの態様では、Pクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチドの長さは、19～100ヌクレオチド、たとえば19～30ヌクレオチド、30～40ヌクレオチド、40～50ヌクレオチド、50～60ヌクレオチド、60～70ヌクレオチド、70～80ヌクレオチド、80～90ヌクレオチド、90～100ヌクレオチド、またはそこで導き出せる任意の範囲である。
いくつかの好ましい態様では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、5'TLR活性化ドメイン、および少なくとも2つのパリンドローム領域を含み、たとえば5'パリンドローム領域である少なくとも6ヌクレオチド長の第1のパリンドローム領域が、3'パリンドローム領域である少なくとも8ヌクレオチド長の第2のパリンドローム領域と接続しており、第1のパリンドローム領域と第2のパリンドローム領域とは、直接、または間接的に（たとえばスペーサーを介して）接続している。TLR-9活性化モチーフは公知であり、限定ではないが、TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT、およびTTTTが挙げられる。5’TLRエリアは、5’パリンドローム領域に完全にまたは部分的に含まれてもよいか、あるいは5’パリンドローム領域の上流にあってもよい。3’パリンドロームまたは3’相補エリアは、特定の態様では、少なくとも8塩基長であり、概してCおよびGを多く含む。
Pクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の技法にしたがい修飾されてもよい。たとえば、J修飾を用いてヨード修飾ヌクレオチドを生成することができる。E修飾を用いてエチル修飾ヌクレオチドを生成することができる。いくつかの態様では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、E修飾Pクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチドである。E修飾Pクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、エチル化された少なくとも1つのヌクレオチド（好ましくは5'ヌクレオチド）を含む、Pクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチドである。用いることができる追加の修飾としては、6-ニトロ-ベンズイミダゾール付加、O-メチル化、プロイニル-dUによる修飾、イノシン修飾、および／または（好ましくはウリジンへの）2-ブロモビニル付加が挙げられる。
Pクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、限定ではないがホスホジエステル結合およびホスホロチオアート結合などの、修飾ヌクレオチド間結合も含んでよい。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、合成してもよいか、組換え生産してもよいか、または市販源から入手してもよい。
アジュバントに含有されるのに好適なステロールとしては、β-シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、および／またはコレステロールが挙げられる。これらのステロールは当技術分野で周知であり、市販品を購入することができる。たとえば、コレステロールは、Merck Index, 12th Ed., p. 369に開示されている。アジュバント組成物に含まれるステロールの量は、用いられるステロールの性質に依存し得る。いくつかの態様では、ステロールは、約1 μg～約5,000 μg/mlの量でアジュバント中に含まれる。それらはまた、約1 μg～約4,000 μg/ml;約1 μg～約3,000 μg/ml;約1 μg～約2,000 μg/ml;および約1 pg～約1,000 μg/mlの量で用いられる。それらはまた、約5 μg～約750 μg/ml;約5 μg～約500μg/ml;約5 μg～約200 μg/ml;約5 μg～約100 μg/ml;約15 μg～約100 μg/ml;および約30 μg～約75 μg/mlの量で用いられる。
特定の態様では、アジュバントは、ステロール（たとえばコレステロール）、サポニン（たとえばQuil-A）、ならびに免疫賦活性オリゴヌクレオチド（たとえばCpGオリゴヌクレオチド、および／もしくはPクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチド）を含むことができるか、またはそれらからなることができる。さまざまな態様では、アジュバントは、（ステロールおよびサポニン）、（サポニンおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド）、または（ステロールおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド）を含んでもよいことが予想される。本発明のサポニンおよびステロールを含有するアジュバントの調製は、当技術分野における通常の技術の範囲内に含まれる。たとえば、本明細書に記載される抗原性タンパク質またはペプチド（たとえば、TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、TRP95、TRP19、および／またはTRP120からの1つまたは複数の抗原性ペプチド。E.カニスバクテリンまたはE.シャフェンシスバクテリンをさらに含んでもよい）、Pクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ならびにサポニンを含む、水性混合物を調製することができる。次に、この混合物にステロールを徐々にまたは滴下して加えることができる。
「バクテリン」は、本明細書で使用する場合、ワクチンまたは免疫原性組成物の構成要素として用いることができる1つまたは複数の失活細菌を指す。バクテリンは懸濁液中に含まれてもよい。いくつかの好ましい態様では、バクテリンは、熱失活エーリキア（たとえば熱失活E.カニス）または化学失活エーリキア（たとえば化学失活E.カニス）である。
「アジュバント」は、本明細書で使用する場合、抗原に対する体液性または細胞性免疫応答を高める任意の物質を指す。いくつかの態様では、アジュバントは、ワクチン注射部位からの抗原の制御された放出を可能にすること、およびワクチン組成物を受ける対象の免疫系を刺激することの両方のために用いられる。
本明細書で使用する場合、指定の構成要素に関して「本質的に含まない」とは、どの指定の構成要素も、意図的に組成物に製剤されたわけではないこと、および／または汚染物質としてもしくは微量に存在するに過ぎないことを意味するために用いられる。組成物の何らかの意図せぬ汚染を原因とする指定の構成要素の総量は、好ましくは0.01%未満である。最も好ましいのは、標準的分析法では指定の構成要素の量が検出できない組成物である。
本明細書で使用する場合、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、1つまたは複数を意味してもよい。本明細書で請求項において「～を含む（comprising）」という単語と一緒に使用する場合、「1つの（a）」または「1つの（an）」という単語は、1つ、または2つ以上を意味してもよい。
請求項における「または（or）」という用語の使用は、代替だけを指すと明言しないかぎり、または代替が互いに排他的でないかぎり、「および／または」を意味するのに用いられるが、本開示は、代替のみおよび「および／または（and/or）」を指す、という定義を支持する。本明細書で使用する場合、「別の」は、少なくとも二つ目またはそれ以上を意味してもよい。
本願全体を通して、「約」という用語は、ある値が、値を決定するのに用いられる方法、デバイスに固有の誤差のばらつき、または調査対象間に存在するばらつきを含むことを示すのに用いられる。
本発明のほかの目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになろう。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示すが、当業者にはこの詳細な説明から本発明の趣旨および範囲内でさまざまな変更および改造が明らかになるため、例示としてのみ記載されることを理解されたい。
例示的な態様の説明
本発明は、いくつかの局面では、エーリキア・カニス（E.カニス）などのエーリキア属に対する免疫応答の生成に用いられ得る新規な組成物および方法を提供することにより、先行技術の限界を克服する。いくつかの態様では、組成物は、本明細書に記載される、少なくとも2つのE.カニスタンパク質または免疫原性ペプチド、およびアジュバントを含有する。E.カニスに対する免疫応答を生成する関連する方法も提供する。いくつかの局面では、E.カニスタンパク質もしくは免疫原性ペプチドを、E.カニスバクテリンおよび／またはアジュバントと組み合わせて含有することで、たとえばイヌなどの哺乳類対象における免疫または防御免疫応答を相乗作用的に向上させることができると予想される。
I. エーリキア・カニス免疫原性タンパク質およびペプチド
いくつかの局面では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、少なくとも2つのE.カニス免疫原性タンパク質またはペプチド、およびアジュバントを含んでもよい。たとえば、免疫原性組成物は、少なくとも2つのE.カニス免疫原性タンパク質、およびアジュバントを含んでもよい。いくつかの態様では、免疫原性組成物は、1つのE.カニスタンパク質、1つのE.カニス免疫原性ペプチド（たとえば、ペプチドまたはポリペプチド中に免疫原性ペプチドが含まれてもよい）、およびアジュバントを含む。いくつかの態様では、免疫原性組成物は、少なくとも2つのE.カニス免疫原性ペプチド（たとえば、ペプチドまたはポリペプチド中に免疫原性ペプチドが含まれてもよい）、およびアジュバントを含む。
いくつかの態様では、エーリキア（たとえば、E.カニス）免疫原性タンパク質は、TRP153（たとえばUS 7204992の記載ではgp153とも呼ばれる）、TRP36（たとえばUS 9645148の記載ではgp36とも呼ばれる）、TRP140（たとえばUS 9250240の記載ではp140とも呼ばれる）、TRP28（たとえばMcBride et al. Gene. 2000 Aug 22;254(1-2):245-52ではp28とも呼ばれる）、TRP95（たとえばMcBride et al., Infect Immun. 2011 Aug;79(8):3178-87）、TRP19（たとえばAguiar et al. Ticks Tick Borne Dis. 2016 Feb;7(1):142-145）、またはTRP120（たとえばZhu et al., Infect Immun. 2011 Nov;79(11):4370-81）、あるいはその免疫原性領域を含むかまたはそれからなる、1つまたは複数のペプチドであり;いくつかの態様では、本明細書に開示されるワクチン組成物は、これらの免疫原性タンパク質の1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上、および本明細書に記載されるアジュバントを含んでもよい。たとえば、いくつかの態様では、免疫原性組成物は、（TRP140、TRP36、およびTRP19）ならびに／またはその免疫反応性ペプチドを含む。
いくつかの態様では、エーリキア免疫原性タンパク質は、E.カニスタンパク質の免疫原性領域を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、E.カニス免疫原性タンパク質は、表1のペプチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様では、ワクチン組成物は、アジュバント、および表1の免疫原性ペプチドの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上を含み、後者は任意でペプチドまたはポリペプチドに含まれてもよい。
（表１）エーリキア免疫原性ペプチド
Figure 2022540197000004
いくつかの態様では、本明細書に記載される免疫原性組成物は、TRP140（またはSEQ ID NO:14を含むかもしくはそれからなるペプチド）、TRP36（またはSEQ ID NO:3～11もしくは16のいずれかを含むかもしくはそれからなるペプチド）、およびアジュバントを含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される免疫原性組成物は、TRP140（またはSEQ ID NO:14を含むかもしくはそれからなるペプチド）、TRP36（またはSEQ ID NO:3～11もしくは16のいずれかを含むかもしくはそれからなるペプチド）、TRP19（またはSEQ ID NO:1を含むかもしくはそれからなるペプチド）、TRP120（またはSEQ ID NO:15のいずれかを含むかもしくはそれからなるペプチド）、およびアジュバントを含む。いくつかの態様では、免疫原性組成物は、TRP19を含まない。いくつかの態様では、本明細書に記載される免疫原性組成物は、TRP140（またはSEQ ID NO:14を含むかもしくはそれからなるペプチド）;TRP36（またはSEQ ID NO:3～11もしくは16のいずれかを含むかもしくはそれからなるペプチド）;TRP95（またはSEQ ID NO:12～13の片方もしくは両方を含む、もしくはそれ（ら）からなるペプチド）、およびアジュバントを含む。いくつかの態様では、免疫原性組成物は、TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、および／またはTRP95のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、またはすべてを含み、かつ免疫原性組成物は、本明細書に記載されるアジュバントをさらに含んでもよい。たとえば、免疫原性組成物は、（TRP153およびTRP36）、（TRP153およびTRP140）、（TRP153およびTRP28）、（TRP153およびTRP95）、（TRP36およびTRP140）、（TRP36およびTRP28）、（TRP36およびTRP95）、（TRP140およびTRP28）、（TRP140およびTRP95）、（TRP28およびTRP95）、（TRP19およびTRP153）、（TRP19およびTRP36）、（TRP19およびTRP140）、（TRP19およびTRP28）、（TRP19およびTRP95）、（TRP120およびTRP153）、（TRP120およびTRP36）、（TRP120およびTRP140）、（TRP120およびTRP28）、（TRP120およびTRP95）、または（TRP120およびTRP19）を含んでもよく、ここで免疫原性組成物は、好ましくはアジュバントを含む。
II. E.カニスバクテリン
いくつかの態様では、本明細書に開示される免疫原性またはワクチン組成物は、エーリキアバクテリン、好ましくはE.カニスバクテリンを含む。E.カニスバクテリンは、E.カニス細菌を熱失活または化学失活させることにより調製してもよい。
さまざまな方法を用いてE.カニスバクテリンを生成することができる。たとえば、紫外線の存在下、熱またはソラレンによりバクテリンを失活させてもよい。失活E.カニスバクテリンの有効免疫量は、選ばれた株によって異なり得る。さまざまな態様で、任意の量のE.カニスバクテリンを、単独で、または防御免疫応答を引き起こすのに十分な（i）ほかのE.カニス免疫原性タンパク質もしくはペプチド（たとえば表1に記載のもの）および／または（ii）アジュバントと組み合わせて用いてもよいことが予想される。いくつかの態様では、少なくとも約1×104のTCID50失活E.カニスバクテリンを含む投与単位を用いることができる。E.カニスバクテリンを生成するのに用いることができる追加の方法としては、限定ではないが、熱、ホルムアルデヒド、ホルマリン、bi-エチレンアミン、放射線、およびβ-プロピオラクトン処理による、E.カニスの処理が挙げられる。E.カニスバクテリンは、利用可能な任意の好適な方法により失活させてもよいことが予想される。エーリキアまたはE.カニスバクテリンを生成するのに用いることができる追加の方法としては、たとえばWO 2005087803、EP 2433646、Vega et al. （Vaccine (2007) 25:519-525）、またはStuen et al. （Acta Vet Scand (2015):57:40）に記載されるものが挙げられる。
いくつかの態様では、E.カニスバクテリンは、失活E.カニス細菌に基づく失活粗抗原を含む。たとえば、いくつかの態様では、E.カニスを含有する冷凍バフィーコート（たとえば、10 mlの冷凍バフィーコート）を入手する場合があり、材料を、0.3%ホルムアルデヒドを用いて室温で48時間かけて失活させた。次いで材料を、インビトロの方法により、またはインビボの動物モデルを用いて、感染力の欠如について試験することができる。ホルムアルデヒドを用いて細菌を失活させる方法は、Tollersrud et al. （Vaccine (2001) 19:3896-3903）にさらに記載されている。得られたE.カニスバクテリンを、（i）1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上の（たとえば表1に記載される）E.カニス免疫原性タンパク質もしくはペプチド、および／または（ii）アジュバントとともに含めて、免疫原性またはワクチン組成物を形成することができる。たとえば、失活E.カニスバクテリンを懸濁液として調製してもよく、次いでたとえば以下に記載のようにエマルジョンアジュバントに含めてもよい。
III. アジュバント
いくつかの局面では、（たとえばTRP153、TRP36、TRP140、HSP、TRP28、TRP19、TRP140、および／もしくはTRP120の免疫原性ペプチドもしくはタンパク質、または表1のペプチドを含むかもしくはそれからなるペプチドもしくはポリペプチドの、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上を含有する）本明細書に開示される免疫原性またはワクチン組成物が、アジュバントを含有する。含まれ得るさまざまなアジュバントが公知である。たとえば、MF59、AS01、AS02、AS03、AS04、ビロソーム、CAF01、CAF04、CAF05、Montanide ISA(商標) 720、またはMontanide ISA（商標） 51などのアジュバント（たとえば Bonam et al., Trends in Pharmacological Sciences (2017) 38(9): 771-778）。
いくつかの態様では、免疫原性またはワクチン組成物が、トリテルペノイド、ステロール、免疫調節物質、ポリマー、および／またはTh2刺激因子を含むアジュバントを含む。たとえば、いくつかの態様では、アジュバントは、DEAEデキストラン、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、および油（たとえば軽質鉱物油）を含み、ここで免疫賦活性オリゴヌクレオチドはCpG含有ODNであり、かつアジュバント製剤は油中水型（W/O）エマルジョンである。ワクチンアジュバントは、（熱失活E.カニスなどの）E.カニスバクテリン、および／または表1のもしくは本明細書に開示される免疫原性E.カニスタンパク質もしくはペプチドの1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上を含んでもよい。いくつかの態様では、免疫原性またはワクチン組成物は、抗原構成要素、ならびにサポニン（たとえば、1用量あたり約1 μg～約5,000 μgの量で存在する）、ステロール（たとえば、1用量あたり約1 μg～約5,000 μgの量で存在する）、四級アンモニウム化合物（たとえば、1用量あたり約1 μg～約5,000.mu.gの量で存在する）、ポリマー（たとえば約0.0001%v/v～約75%v/vの量で存在する）、およびORN/ODNを含むアジュバント製剤を含み;サポニンはQuil Aまたはその精製された画分であってもよく、ステロールはコレステロールであってもよく、四級アンモニウム化合物はジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）であってもよく、ポリマーはポリアクリル酸であってもよく、かつORN/ODNはCpGであってもよい。アジュバントは、N-（2-デオキシ-2-L-ロイシルアミノ-β-D-グルコピラノシル）-N-オクタデシルドデカンアミドアセタートなどの糖脂質を含んでもよい。アジュバントは、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ポリアクリル酸ポリマー、ならびに（a）ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）;（b）ステロール;および／または（c）N-（2-デオキシ-2-L-ロイシルアミノ-β-D-グルコピラノシル）-N-オクタデシルドデカンアミドアセタートのうちの少なくとも2つを含んでもよい。たとえば、ワクチン組成物は、たとえば米国特許第10,238,736号、米国特許第8,580,280号、または米国特許出願公開第2019/0008953号に記載されるアジュバントを含んでもよい。
いくつかの態様では、免疫原性またはワクチン組成物は、抗原構成要素、ならびにトリテルペノイドサポニン、ステロール、四級アンモニウム化合物、およびポリアクリル酸ポリマーを含むアジュバント製剤を含み、ここで抗原構成要素は、E.カニスバクテリン（たとえば熱失活E.カニス）、および／または、E.カニス免疫原性タンパク質もしくはペプチド（たとえば、本明細書に記載される1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上のE.カニスタンパク質、および／または1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上の表1のペプチド）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様では、サポニンは、1用量あたり約1 mg～約5,000 mgの量で存在し、ステロールは、1用量あたり約1 mg～約5,000 mgの量で存在し、四級アンモニウム化合物は、1用量あたり約1 mg～約5,000 mgの量で存在し、かつポリアクリル酸ポリマーは、約0.0001%v/v～約75%v/vの量で存在する。たとえば、ワクチン組成物は、たとえば米国特許第9,662,385号に記載されるアジュバントを含んでもよい。
いくつかの局面では、本明細書に開示される免疫原性またはワクチン組成物は、（熱失活E.カニスなどの）E.カニスバクテリン、および／または本明細書に記載される1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上のE.カニス免疫原性タンパク質もしくはペプチドを含む油ベースのアジュバントを含む。たとえば、アジュバント製剤は、油相および水相、ポリカチオン性担体（たとえばDEAEデキストラン）、ならびにCpG含有免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含んでもよく、ここでワクチンは油中水型エマルジョンである。アジュバントは、任意で、水酸化アルミニウムゲルをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、CpG含有免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、1用量あたり約50～約400 μgの量で存在し、かつDEAEデキストランは、1用量あたり約10～約300 mgの量で存在する。アジュバント製剤は、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ポリカチオン性担体、ステロール、サポニン、四級アミン、TLR-3アゴニスト、糖脂質、および／またはMPL-A（またはその類似体）をオイルエマルジョン中に含んでもよい。たとえば、ワクチン組成物は、たとえば米国特許第10,117,921号またはUS 2019/0038737に記載されるアジュバントを含んでもよい。
いくつかの態様では、免疫原性組成物は、（i）（熱失活E.カニスなどの）E.カニスバクテリン、および／または（ii）本明細書（たとえば表1）に記載される1つ、2つ、3つ、4つ、もしくはそれ以上のE.カニス免疫原性タンパク質もしくはペプチドを含むエマルジョンである。たとえば、エマルジョン組成物は、アクリルポリマーおよび／またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）などのアジュバントを水相に含んでもよい。エマルジョンは、いくつかの態様では、抗原（たとえば、熱失活E.カニスなどのE.カニスバクテリン、および／または本明細書に記載される1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上のE.カニス免疫原性タンパク質もしくはペプチド）およびアジュバントを含有する水相を、乳化剤の存在下、油相と混合することにより調製することができる。いくつかの態様では、アジュバント構成要素は、水中油型エマルジョンを含み、ここで水中油型エマルジョンの水相は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）および／またはアルキル-ポリアクリル酸（アルキル-PAA）を含む。いくつかの態様では、水中油型エマルジョン中の油は、鉱物油、テルペン油、大豆油、オリーブ油、またはプロピレングリコール誘導体である。アジュバントは、CpG DNA、リポポリサッカライド、および／またはモノホスホリル脂質Aをさらに含むアジュバント構成要素をさらに含んでもよい。ワクチンは、1つまたは複数の乳化剤をさらに含んでもよい。たとえば、ワクチン組成物は、たとえば米国特許第9,545,439号または米国特許第8,980,288号に記載されるアジュバントを含んでもよい。
前記アジュバントは、リポソームまたはエマルジョン製剤であってもよい。リポソームは、単層、複層、または多胞性であってもよい。いくつかの態様では、免疫原性またはワクチン組成物は、脂質または脂質含有アジュバントを含む。いくつかの態様では、リポソームは、カチオン性リポソームである。さまざまな態様では、MF59（たとえば Calabro et al. (2013) Vaccine 31: 3363-3369）、AS01（Didierlaurent, et al. (2014) J. Immunol. 193, 1920-1930）、AS02（Garcon and Van Mechelen (2011) Expert Rev. Vaccines 10, 471-486）、AS03（Morel, S. et al. (2011) Vaccine 29, 2461-2473）、AS04（Didierlaurent, et al. (2009) J. Immunol. 183: 6186-6197.）、ビロソーム（Kunzi, et al. (2009) Vaccine 27, 3561-3567）、 CAF01（Tandrup Schmidt, et al. (2016) Pharmaceutics 8, 7.）、CAF04（Billeskov, et al. (2016) PLoS One 11, e0161217）、CAF05（Billeskov, et al. (2016) PLoS One 11, e0161217）、Montanide ISA（商標） 720（Aucouturier, et al. (2002) Expert Rev. Vaccines 1, 111-118）、またはMontanide ISA（商標） 51（Aucouturier, et al. (2002) Expert Rev. Vaccines 1, 111-118）などのアジュバントを用いることができる。表2は、さまざまな態様で用いることができる製剤含有アジュバントの例のリストを提供している。
（表２）製剤を含有するアジュバント例
Figure 2022540197000005
IV. 免疫原性およびワクチン組成物
いくつかの態様では、本明細書に開示される免疫原性タンパク質またはペプチドの1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上が、任意でたとえば本明細書に記載されるE.カニスバクテリンおよび／またはアジュバントとともに、薬学的組成物に含まれてもよい。薬学的組成物は、たとえばE.カニスなどのエーリキア属に対する防御免疫応答を誘導するために、イヌなどの哺乳類対象に投与されてもよい。いくつかの態様では、薬学的組成物はワクチンとして用いられる。
選択された態様では、対象におけるエーリキア・カニスによる感染症を実質的に予防または改善することができる、対象における防御免疫応答を誘導するために、対象（たとえばイヌ）に、免疫反応性組成物またはワクチン組成物が投与される。対象において薬学的に使用されるワクチン組成物は、本明細書に開示される免疫原性タンパク質またはペプチドの2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の免疫反応性ポリペプチド、本明細書に開示されるアジュバント、および薬学的に許容される担体を含んでもよい。
「薬学的」、「薬学的に許容される」、または「薬理的に許容される」という語句は、たとえばヒトなどの動物に適切に投与された場合に有害な、アレルギーの、またはほかの不都合な反応を生じない、分子部分および組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者であれば知っているような、任意のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（たとえば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存料、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、香料、色素、それらと同様の材料、およびそれらの組み合わせを含む（たとえば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1289-1329, 1990を参照）。任意の一般的な担体が活性成分と不適合でないかぎり、本開示のワクチン組成物におけるその使用が想定される。
本明細書で使用する場合、「防御免疫応答」は、エーリキア抗原に対する哺乳類宿主の免疫系の応答を指し、その結果、次にエーリキア病原体に曝露したとき、哺乳類宿主の免疫系による抗原認識および抗体生産が増大する。防御免疫応答は、次にエーリキア・シャフェンシスまたはエーリキア・カニスに曝露した結果としての症状を、実質的に軽減または予防することができる。
医薬分野の当業者であれば、動物またはヒト患者に実際に投与されるワクチン組成物の投与量は、患者の体重、状態の重篤度、治療中の疾患のタイプ、以前または現在の治療的介入、突発性疾患などの物理的および生理的要因により、ならびに投与経路に応じて決定され得ることを理解しよう。いずれにしても、投与を担当する医療従事者が、個々の対象のために組成物中の活性成分の濃度、および適切な用量を決定する。
特定の態様では、ワクチン組成物は、たとえば、式Iのポリペプチドまたは表2のポリペプチドを含むエーリキア免疫反応性ポリペプチドを少なくとも約0.1%含んでもよい。ほかの態様では、活性化合物が、たとえば単位の重量の約2%～約75%、または約25%～約60%、およびそこで導き出せる任意の範囲を構成してもよい。多くのワクチン組成物と同様、投与の頻度、ならびに投与量は、免疫学の当業者であれば予測できるように、動物またはヒトの集団の構成員間で異なる。非限定的な例として、薬学的組成物およびワクチンは、注射（たとえば皮内、筋内、静脈内、もしくは皮下）、鼻腔内（たとえば吸引による）、または経口により投与することができる。1～3用量が1～36週間にわたり投与されてもよい。好ましくは、3用量が3～4カ月おきに投与され、その後は定期的にブースターワクチンを与えてもよい。
いくつかの態様では、「好適な用量」は、上述したように投与されると、免疫された患者において、次にエーリキア生物に曝露したとき対象をエーリキア感染症から守るのに十分な免疫応答を引き起こす能力のある、免疫反応性ポリペプチドの量である。一般に、好適な用量中に存在する（または用量中の核酸によりインサイチューで生産される）ペプチドの量は、宿主1 kgあたり約1 pg～約500 mg、典型的には約10 pg～約10 mg、好ましくは約100 pg～約1 mg、より好ましくは約100 pg～約100マイクログラムの範囲であってもよい。
本開示のワクチン組成物は、それが固体、液体、またはエアロゾルの形態で投与されるかどうか、そしてそのような経路の注射としての投与のために滅菌の必要があるかどうかに応じて、異なるタイプの担体を含んでもよい。本明細書に開示されるワクチン組成物は、筋内に、皮内に、皮下に、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、外用として、腫瘍内に、筋内に、腹腔内に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、局所的に、経口で、鼻腔内に、または吸入、注射、点滴、持続点滴、洗浄、もしくは局所的灌流により、投与されることができる。ワクチン組成物はまた、カテーテルを介して、クリーム（creme）に入れて、脂質組成物に入れて、バリスティック粒子送達により、あるいは当業者であれば知っているようなほかの方法または前述のものの任意の組み合わせにより、対象に投与してもよい（たとえば、参照により本明細書に組み入れられるRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed. Lippincott Williams and Wilkins, 2005を参照）。
当業者には公知の任意の好適な担体が、本発明のワクチン組成物に使用され得るが、担体のタイプは投与モードに応じて異なる。皮下注射などの非経口投与では、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、またはバッファーを含む。経口投与では、上記のいずれかの担体、またはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムなどの固体担体を使用してもよい。生分解性マイクロスフェア（たとえばポリ乳酸ガラクチド（galactide））も、本発明の薬学的組成物の担体として使用してもよい。好適な生分解性マイクロスフェアは、たとえば、米国特許第4,897,268号および同第5,075,109号に開示されている。
本開示の一局面で特に関心対象であるのが、微小構造の経皮またはバリスティック粒子送達により投与することができるワクチン組成物である。ワクチン製剤の担体としての微小構造は、ワクチン施用の望ましい構成であり、当技術分野で広く知られている（たとえば、米国特許第5,797,898号、同第5,770,219号、および同第5,783,208号、ならびに米国特許出願公開第2005/0065463号）。そのようなバリスティック粒子送達用に製剤されるワクチン組成物は、支持基体の表面に固定化された、表1、2、または3の単離された免疫反応性ポリペプチドを含んでもよい。これらの態様では、支持基体としては、限定ではないが、マイクロカプセル、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
本明細書に開示されるエーリキア免疫反応性ポリペプチドの支持基体となる微小構造またはバリスティック粒子は、生分解性材料および非生分解性材料で構成されていてもよく、そのような支持基体は、合成ポリマー、シリカ、脂質、炭水化物、タンパク質、レクチン、イオン剤、架橋剤、および当技術分野で入手可能なほかの微小構造構成要素で構成されていてもよい。本発明のペプチドをそのような材料で作られた支持基体に固定化するためのプロトコルおよび試薬は、商品として、また当技術分野で、広く入手可能である。
ほかの態様では、ワクチン組成物が、固定化またはカプセル化された本明細書に開示される免疫反応性ポリペプチドまたはペプチド、本明細書に開示されるアジュバント、および支持基体を含む。これらの態様では、支持基体としては、限定ではないが、脂質マイクロスフェア、脂質ナノ粒子、エトソーム、リポソーム、ニオソーム、リン脂質、スフィンゴソーム、界面活性剤、トランスフェロソーム、エマルジョン、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。リポソームおよびほかの脂質ナノおよびマイクロ担体製剤の形成および使用は、当業者には一般に公知であり、リポソーム、マイクロ粒子、ナノカプセル等の使用は、治療剤の送達で広く用いられるようになった（たとえば、全文が参照により本明細書に具体的に組み入れられる米国特許第5,741,516号）。ペプチドのカプセル化を含め、可能な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の多くの方法が論評されている（それぞれ全文が参照により本明細書に具体的に組み入れられる、米国特許第5,567,434号、同第5,552,157号、同第5,565,213号、同第5,738,868号、および同第5,795,587号）。
本明細書に記載される送達の方法に加えて、本開示のワクチン組成物を投与するための代替の技法もいくつか想定される。非限定的な例として、ワクチン組成物は、循環系内におよび循環系を通して薬物を浸透させる速度および有効性を高めるために用いられている、米国特許第5,656,016号に記載されているソノフォレーシス（すなわち超音波）、骨内注射（米国特許第5,779,708号）、またはフィードバック制御送達（米国特許第5,697,899号）により投与されてもよく、本段落のこれらの特許はそれぞれ、その全文が参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
さまざまなアジュバントのいずれかを本発明のワクチンに使用して、非特異的に免疫応答を高めてもよい。ほとんどのアジュバントは、抗原を急速な異化から保護するように設計された物質、たとえば水酸化アルミニウムまたは鉱物油、および免疫応答の非特異的刺激因子、たとえば脂質A、百日咳菌（Bortadella pertussis）、または結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含有する。好適なアジュバントは、たとえばFreund's Incomplete AdjuvantおよびFreund's Complete Adjuvant（ミシガン州デトロイトのDifco Laboratories）、ならびにMerck Adjuvant 65（ニュージャージー州ローウェイのMerck and Company, Inc.）として市販されている。ほかの好適なアジュバントとしては、ミョウバン、生分解性マイクロスフェア、モノホスホリル脂質A、およびquil Aが挙げられる。
ポリペプチドを中性または塩の形態の組成物に製剤してもよい。薬学的に許容される塩としては酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成）が挙げられ、それらはたとえば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸により形成される。遊離カルボキシル基により形成する塩も、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等などの有機塩基から誘導することができる。
いずれの場合も、組成物は、1つまたは複数の構成要素の酸化を遅らせるために、さまざまな抗酸化剤を含んでもよい。加えて、限定ではないがパラベン（たとえばメチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれらの組み合わせを含め、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤などの保存料により、微生物の作用の防止をもたらすことができる。
滅菌注射液は、必要量の活性ペプチドを、必要に応じて上述したさまざまなほかの成分とともに適切な溶媒に組み入れ、続いて濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散系は、さまざまな滅菌活性成分を、基本分散媒および／またはほかの成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることにより調製される。滅菌注射液、懸濁液、またはエマルジョンを調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥法または凍結乾燥法であり、その滅菌濾過済みの液体培地から、活性成分に加えて任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。液体培地は必要に応じて適切に緩衝すべきであり、注射前にまずは希釈液を十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする。直接注射するための高濃縮組成物の調製も想定され、その場合は、溶媒としてDMSOを使用することにより極めて高速な浸透をもたらし、高濃度の活性剤を小面積に送達することが、考えられる。
前記組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定していなくてはならず、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対し守られなくてはならない。エンドトキシン汚染を安全レベル、たとえばタンパク質1 mgあたり0.5 ng未満で、最小限にとどめるべきであることが理解される。
特定の態様では、たとえばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはそれらの組み合わせなどの吸収遅延剤を組成物に使用することにより、注射用組成物の長時間に及ぶ吸収をもたらすことができる。
V. エーリキアワクチン接種用キット
いくつかの態様では、本明細書に開示される免疫原性ポリペプチドまたは免疫原性ペプチドを含む、対象（たとえばイヌ）のE.カニス感染症に対するワクチン接種用のキットが提供される。いくつかの態様では、組成物は、E.カニス感染症に対する防御免疫応答を誘導するために、対象に投与してもよい。
実施されている方法にとって適切な場合、キットは、組成物を対象に送達するための、またはそれ以外に本発明の組成物を取り扱うための1つまたは複数の装置をさらに含んでもよい。非限定的な例として、キットは、シリンジ、点眼器、バリスティック粒子アプリケーター（たとえば米国特許第5,797,898号、同第5,770,219号、および同第5,783,208、ならびに米国特許出願公開第2005/0065463号に開示されるアプリケーター）等である装置を含んでもよい。
キットを構成する試薬および／または構成要素が凍結乾燥された形態（凍結乾燥剤）または乾燥粉末として提供される場合、凍結乾燥剤または粉末は、好適な溶媒の添加により再構成することができる。特定の態様では、溶媒は、滅菌された薬学的に許容されるバッファーおよび／またはほかの希釈剤であってもよい。そのような溶媒もキットの一部として提供され得ることが考えられる。
キットの構成要素が1つおよび／またはそれ以上の溶液中に提供される場合、溶液は、非限定的な例として、滅菌水溶液であってもよい。組成物を投与用組成物に製剤することもできる。その場合、容器手段自体がシリンジ、ピペット、外用アプリケーター等であってもよく、製剤はそれから身体の患部に適用されてもよく、対象に注射されてもよく、かつ／またはキットのほかの構成要素に加えられるかもしくはそれらと混合されてもよい。
VI. 免疫反応性ポリペプチドを生産する方法
本開示の免疫反応性ポリペプチドは、細胞からのタンパク質の組換え生産、インビトロ転写翻訳（IVTT）法、および／またはペプチド合成（たとえば固相合成法を用いる）を含む、さまざまな方法を用いて生産することができる。
IVTTは、さまざまな細胞型（たとえば細菌細胞、哺乳類細胞、大腸菌（E. coli）、酵母、および昆虫細胞その他）を用いてタンパク質を組換え生産するのに用いることができる。さまざまなIVTTアプローチが当技術分野で公知であり、さまざまな態様で用いることができる。IVTTは一般に、DNAからタンパク質を生産または合成するための、細胞フリーの方法をとる。タンパク質生産のための細胞フリー系は、たとえば大腸菌抽出物、原虫抽出物、酵母抽出物、ヒト細胞抽出物、コムギ胚芽抽出物、哺乳類抽出物、培養されたヒト細胞系からの抽出物、ウサギ網状赤血球ライセート、昆虫細胞抽出物、または再構成され精製された大腸菌構成要素を用い得る。さまざまなキットが市販されており、たとえばRTS（カリフォルニア州サンフランシスコのFivePrime）、Expressway（商標）（Life Technologies）;S30 T7ハイイイールド（Promega）、ワンステップヒトIVT（Thermo Scientific）、WEPRO（登録商標）（CellFree Sciences）、TNT（登録商標）coupled（Promega）、RTS CECF（5 PRIME）、TNT（登録商標）Coupled（Promega）、ReticライセートIVT（商標）（Life Technologies）;TNT（登録商標）T7（Promega）、EasyXpress Insectキット（Qiagen/RiNA）、PURExpress（登録商標）（New England Biolabs）、およびPURESYSTEM（登録商標）（BioComber）が挙げられる。そのような方法は、所望により非天然アミノ酸をタンパク質に組み入れるのに用いることができる。さまざまな態様で用いられ得る細胞フリー発現系は、たとえばZemella et al., 2015にも記載されている。
本明細書に開示される単離された免疫反応性タンパク質は、いくつかの態様では、有機化学の技術分野で公知の適切な方法を用いて生産することができる。たとえば、ペプチドは、当技術分野で周知の確立された固相ペプチド合成法の一つを用いて生産することができる。いくつかの態様では、ペプチドは、Perkin Elmer（カリフォルニア州フォスターシティー）などの業者から広く入手可能な自動ペプチド合成機を用いて合成してもよいか、またはペプチドはCarpino et al., 2003もしくは米国特許出願公開第2009/0005535号に記載されているような液相合成法を用いて化学合成してもよい。いくつかの態様では、ペプチドまたは短めのタンパク質は、たとえば固相ペプチド合成法（SPPS）、t-Boc固相ペプチド合成法、またはFmoc固相ペプチド合成法を用いて合成してもよい。
いくつかの態様では、本明細書に記載される免疫反応性タンパク質は、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸から組換え調製することができる。そのような核酸は、発現ベクターに機能的に連結してもよい。非限定的な例として、免疫反応性タンパク質をベクターから発現させ、そしてベクターを含む宿主細胞の成長培地から単離してもよい。いくつかの態様では、免疫反応性タンパク質は、細胞フリー系で、ペプチドをコードする核酸から生産してもよい。
一般に、調製の方法にかかわらず、本明細書に開示される免疫反応性タンパク質は、好ましくは実質的に純粋な形態で調製される。好ましくは、免疫反応性タンパク質は、少なくとも約80%純粋、より好ましくは少なくとも約90%純粋、さらに好ましくは少なくとも95%純粋、最も好ましくは少なくとも約99%純粋である。
VII. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明者により発見された、本発明の実施において良好に機能する技法であること、したがって、その実施のための好ましいモードをなすとみなされ得ることを、当業者は理解すべきである。しかし、当業者は、本開示に鑑み、開示されている具体的な態様に多くの変更が加えられ得ること、それでもなお本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解すべきである。
実施例1 - ビーグル犬におけるエーリキア・カニスバクテリンおよび組換えTRP抗原のワクチン有効性評価
本研究の目的は、Quil A、コレステロール、およびSEQ ID NO:17（
Figure 2022540197000006
ここで「*」はホスホロチオアート結合を指し、「-」はホスホジエステル結合を指し、「JU」は5’-ヨード-2’-デオキシウリジンを指す）のCpG ODNからなる新規なアジュバント製剤（QCT;各構成要素は50 μg/用量で存在）中の、異なるプロセスにより生産された、エーリキア・カニスバクテリンワクチンの、初回ワクチン接種時およそ12週齢であったイヌにおける異種エーリキア・カニス（E.カニス）エボニー株（Ebony strain）攻撃誘発に対する有効性を評価することであった。追加で、19、36、および120 kDaの大きさのE.カニスの組換えタンデムリピートタンパク質（TRP）を含有するワクチンの有効性を、三種併用ワクチンとして、または（バクテリンとQCT）+（TRP抗原とQCT）の同時投与併用ワクチンとして評価した。
およそ12週齢の雄のビーグル犬72匹を、6つの治療群（12匹／治療群）の一つに完全乱塊法により無作為に割り当てた。治療群は、T01は、生理食塩水対照; T02は、E.カニス シーバ ホールセル シルバーソン（Sheba Whole Cell Silverson）バクテリン、BEI（バイナリーエチレンイミン）失活 + QCT; T03は、E.カニス シーバ ホールセル シルバーソン バクテリン、BEI失活 + QCT; T04は、[E.カニス シーバ ホールセル シルバーソン バクテリン、BEI失活 + QCT]および[TRP 140、36、19 + QCT]（同時投与）; T05は、ホルマリン失活バクテリン + QCT;そしてT06は、TRP 140、36、19 + QCTと定義した（表1）。
どのイヌも健康であり、0日目のワクチン接種の前はIDEXX SNAP 4Dx PlusによるとE.カニス陰性であった。0日目および28日目に、全動物に、プラシーボ（生理食塩水）または治験用動物医薬品（IVP）のどちらかを皮下ワクチン接種した。2回目のワクチン接種から6週間後、動物を、静脈内経路を介してE.カニスエボニー株で攻撃誘発した。鼓室温度を毎日検温し、全動物のE.カニス感染の臨床徴候を研究終了（134日目）まで毎日観測した。攻撃誘発後3日ごとの全血球化学（CBC）検査のほか攻撃誘発7日後からのqPCR試験のために血液試料を採取した。0、28、49、および134日目のIDEXX SNAP（登録商標）4Dx Plus試験;0、28、49、68～70、および134日目のELISA試験;ならびに0、35、83、および104日目のCMI分析のため、追加の血液試料を採取した。
（表１）研究計画
Figure 2022540197000007
*0日目のワクチン接種は右肩領域で実施した。28日目のワクチン接種は左肩領域で実施した。
本研究の有効性は、攻撃誘発後の血小板減少症（血小板数<143×103/μL、およびベースラインからの>50%の減少）および臨床的疾患（主として熱）の軽減に基づき決定した。攻撃誘発後、T01対照と比べて、T02、T03、T04、T05、および／またはT06治療群の血小板減少症または臨床的疾患が有意に少ない場合、ワクチン効果が確認されるものとした。
結果
本研究では、バルク抗原についてqPCRを実施して、失活バクテリンゲノムに基づくワクチン製剤を標準化した。本研究の標的ワクチンは、失活バクテリン400 μgで、ブレンドした。
攻撃誘発後の血小板減少症（血小板数<143×103/μL）の存在は、治療群T01（100%）と比べて、治療群T02（67%、P = 0.0497）、T03（67%、P = 0.0497）、およびT04（58%、P = 0.0141）で有意に低下した。治療群T05（75%）およびT06（83%）では、治療群T01（対照）と比べて血小板減少症の有意な低下がなかった（表2および3）。
（表２）治療群別の血小板減少症の存在
Figure 2022540197000008
T01 - 生理食塩水対照
T02 - E.カニス シーバ ホールセル シルバーソン バクテリン（BEI失活）+ QCT
T03 - E.カニス シーバ ホールセル シルバーソン バクテリン（培地フリー; BEI失活）+ QCT
T04 - [E.カニス シーバ ホールセル シルバーソン バクテリン（BEI失活）+ QCT] + [TRP 140、36、19 + QCT]
T05 - E.カニス シーバ ホールセル シルバーソン バクテリン（ホルマリン失活）+ QCT
T06 - TRP 140、36、19 + QCT
（表３）血小板減少症の治療群間比較に関する存在する有意性
Figure 2022540197000009
T01 - 生理食塩水対照
T02 - E.カニス シーバ ホールセル シルバーソン バクテリン（BEI失活）+ QCT
T03 - E.カニス シーバ ホールセル シルバーソン バクテリン（培地フリー; BEI失活）+ QCT
T04 - [E.カニス シーバ ホールセル シルバーソン バクテリン（BEI失活）+ QCT] + [TRP 140、36、19 + QCT]
T05 - E.カニス シーバ ホールセル シルバーソン バクテリン（ホルマリン失活）+ QCT
T06 - TRP 140、36、19 + QCT
血小板減少症の持続時間は、血小板減少症の両測定値により対照群T01と比べると、同時投与治療群T04で有意に短かった。血小板数<143×103/μLにより血小板減少症を測定した場合、T04の血小板減少症の持続時間は、T01の47.42日と比べて23.08日(LSM)であった（P=0.0014）。ベースラインからの血小板数の>50%の減少により血小板減少症を測定した場合、T04の持続時間は、T01の47.92日と比べて23.83日であった（P=0.0020）。
バクテリン含有（T02～T05）ワクチン接種治療群のすべてが、治療群T01（対照）と比べて、血小板減少症の持続時間の有意な短縮を有した。TRP抗原 + アジュバントだけを含有する治療群T06は、血小板減少症をベースラインからの血小板数の>50%の減少と定義した場合は、対照群と比べて有意な血小板減少症の持続時間の短縮を有さなかったが、血小板減少症を血小板数<143×103/μLと定義した場合は、有意性を有した（データ記載せず）。血小板減少症の持続時間を短縮させるには失活バクテリンが必要であり、それはタンデムリピートタンパク質の添加により増強される、との可能性がある。しかし、単独型ワクチンとしてのこのタンデムリピートタンパク質の用量では、血小板減少症の持続時間は短縮されなかった。
対照群（T01）と比べて、各ワクチン接種群（T02～T06）の抗体タイターは、28日目（T06を除く）、49日目、68日目、69日目、および70日目に有意差があった。ワクチン調製物はすべて、E.カニスに対し抗体応答を生じた（データ記載せず）。研究終了時の134日目、T01と比べてどのワクチン接種群（T02～T06）も、抗体タイター間の有意差はなかった。
動物が攻撃誘発後に臨床的疾患を有したか否かの治療群間比較は完了しなかった。それは、攻撃誘発後に少なくとも1つの臨床徴候を有することにより定義すると、治療群T03の1匹を除くすべての動物が臨床的疾患を有したためである。
臨床的に、E.カニスを原因とするイヌの疾患の最も妥当な徴候は、血小板減少症および熱ということになる。この定義によると、対照動物11匹（91.7%）が攻撃誘発後に疾患を有し、バクテリンのみの調製物群T02およびT03の動物8匹（66.7%）が攻撃誘発後に疾患を有し、バクテリンおよびTRP同時投与群T04の動物6匹（50%）が攻撃誘発後に疾患を有し、ホルマリンによるバクテリン調製物の動物9匹（75%）、そしてTRPのみのワクチン群T05の動物10匹（83.3%）が攻撃誘発後に疾患を有した。
熱+血小板減少症により定義した場合、対照群（T01）と比べて唯一有意な攻撃誘発後疾患の改善が見られたのは、T04のホールセル、培地フリーバクテリンワクチン + TRPワクチンの同時投与群であった（P = 0.0399）。
結論
本研究の有効性は、攻撃誘発後の血小板減少症および臨床徴候すなわち熱の軽減に基づき決定された。0日目のIDEXX SNAP 4Dx PlusおよびqPCRによると、すべての動物がE.カニス陰性であった。
攻撃誘発後、すべての対照動物（T01）が血小板減少症（主要変数）を発症した。それに対し、治療群T04では動物12匹中7匹だけが血小板減少症を有し、T01対照群と比べて有意な低下を有した（P=0.0141）。T04同時投与ワクチン群では、血小板減少症（≦143,000）の日数としての持続時間も、T01対照群と比べると短かった。
攻撃誘発後、対照動物（T01）12匹中11匹が発熱した（>39.7℃）。治療群T04の動物は、イヌ12匹のうち7匹が攻撃誘発後発熱した。T02およびT03ではイヌ12匹のうち8匹が攻撃誘発後発熱し、T05およびT06ではイヌ12匹のうち10匹が攻撃誘発後発熱した。
同時投与ワクチン群（T04）は、攻撃誘発後、疾患を血小板減少症および熱として定義した場合、有意な軽減を有した（P = 0.0399）。T04群に同時投与されたワクチン（E.カニスバクテリンワクチン + 組換えTRPタンパク質ワクチン）は、有効性水準を満たした。
実施例2 - ビーグル犬におけるエーリキア・カニスバクテリンおよび組換えTRP抗原のワクチン有効性の確認
本研究の目的は、Quil A、コレステロール、およびCpGからなるアジュバント製剤（QCT）中、互いにブレンドされたエーリキア・カニス（E.カニス）バクテリンおよび組換えタンデムリピートタンパク質（TRP）のワクチンの、初回ワクチン接種時およそ12週齢であったイヌにおける異種E.カニス（エボニー株）攻撃誘発に対する暫定的な有効性を確認することである。暫定的な有効性は、先に、QCTとともに失活バクテリンを含有する別個のワクチン、ならびに3つのTRPタンパク質およびQCTを含有するワクチンを、28日間の間隔をおいて同時皮下投与したときに確立された。加えて、バクテリンおよびキメラE.カニスタンパク質を両方とも含有するワクチンの有効性も評価する。
およそ12週齢の雌のビーグル犬48匹を、4つの治療群（12匹／治療群）の一つに完全乱塊法により無作為に割り当てる。治療群は、T01は、生理食塩水対照、T02は、[E.カニス シーバ ホールセル（Sheba Whole Cell） バクテリン、BEI（バイナリーエチレンイミン）失活 + QCT]および[TRP 140、36、19 + QCT]（同時投与）、T03は、E.カニス シーバ ホールセル バクテリン、BEI失活 + TRP 140、36、19 + QCT（ブレンド）、T04は、E.カニス Whole Cell バクテリン、BEI失活 + QCT + キメラタンパク質と定義する（表4）。
どのイヌも健康であり、IDEXX SNAP 4DXおよびqPCRによると0日目はE.カニス陰性となる。0日目および28日目に、全動物に、プラシーボ（生理食塩水）または治験用動物医薬品（IVP）のどちらかを皮下ワクチン接種する。2回目のワクチン接種から3週間後、動物を、静脈内経路を介してE.カニスエボニー株で攻撃誘発する。鼓室温度を毎日検温し、全動物のE.カニス感染の臨床徴候を研究終了まで毎日観測する。全血球化学（CBC）検査のため攻撃誘発後3日ごとに血液試料を採取し、攻撃誘発7日後からqPCR試験を行う。IDEXX SNAP（登録商標） 4Dx PlusおよびELISA試験のため、追加の血液試料を採取する。
（表４）研究計画
Figure 2022540197000010
Figure 2022540197000011
1 0日目のワクチン接種は右肩領域で実施する。28日目のワクチン接種は左肩領域で実施する。
2 目標の攻撃誘発用量は、1.0 mL中500個の感染細胞であり、静脈内投与される。
主要変数は、血小板減少症（血小板数が143×103/μLを下回る、または攻撃誘発前レベルと比べて>50%の減少）および臨床的疾患となる。攻撃誘発後、T01対照と比べて、T02、T03、および／またはT04治療群が有意に少ない血小板減少症または臨床的疾患を有する場合、ワクチン効果が確認される（p≦0.10）。ワクチン効果は、T02、T03、およびT04をT01と比べたマッチドペア予防率の90%信頼区間の下側限界が0を上回る場合にも実証される。ワクチン効果は、少なくとも1つのワクチン接種群の血小板減少症の持続時間が対照（T01）よりも有意に短い場合、かつ／またはマッチドペア緩和率で90%信頼区間の下側限界が0を上回る場合、ならびに五数要約（最小;第1四分位;中央値;第3四分位;最大）のシフトを有する場合に確認される。
血小板減少症（治療群T01～T04）は、可能であれば二項分布およびロジットリンク関数を用いて、一般化線形混合モデルで分析する。固定効果は治療とし、ランダム効果はブロックとする。そうしない場合は、フィッシャーの正確検定を用いてデータを分析する。一般化線形混合モデルが収束する場合、最小二乗平均、標準誤差、および90%信頼区間を逆変換する。血小板減少症ありのマッチドペア予防率を、治療群T02、T03、およびT04についてT01に対し相対的に90%信頼区間で計算する。ペアリングはブロックに基づく。
血小板数が<143×103/μLであること、および攻撃誘発前レベルからの>50%の減少に基づく血小板減少症の持続時間を、攻撃誘発後の各動物について計算する。持続時間は、血小板減少症の最初の発生から最後の日までの日数であるか、あるいは動物が血小板減少症を有さなければ0となる。持続時間は、一般線形混合モデルで、治療を固定効果とし、ブロックおよび残差をランダム効果として分析する。治療の最小二乗平均、標準誤差、90%信頼限界、最小、最大を計算する。治療群T01を、治療群T02、T03、T04と、対比により比較する。T01とほかの治療群とのマッチドペア緩和率、ならびにそれらの90%信頼限界を計算する。ペアリングはブロックに基づく。
疾患は、攻撃誘発後のいずれかの時点で動物が熱（上昇した体温≧39.5℃）および血小板減少症（血小板数<143×103/μL）を有すること、と定義する。臨床的疾患の頻度分布を各治療群について計算する。臨床的疾患（治療群T01～T04）は、可能であれば二項分布およびロジットリンク関数を用いて、一般化線形混合モデルで分析する。固定効果は治療とし、ランダム効果はブロックとする。そうしない場合は、フィッシャーの正確検定を用いてデータを分析する。治療群T02～T04を、対比によりT01と比較する。一般化線形混合モデルが収束する場合、最小二乗平均、標準誤差、および90%信頼区間を逆変換する。臨床的疾患ありのマッチドペア予防率を、治療群T02、T03、およびT04についてT01に対し相対的に90%信頼区間で計算する。ペアリングはブロックに基づく。
本明細書に開示される、および特許請求される方法はすべて、本開示に鑑み、過度な実験をすることなく実施しかつ実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様の点から記載してきたが、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく本明細書に記載される方法および方法の工程の順序に変更を加えられ得ることは、当業者には明白になろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連のある特定の剤を、本明細書に記載される剤と置き換えることができるが、同じまたは類似の結果が得られることが明白になろう。当業者には明白なそのような類似の置換および改造はすべて、添付の請求項に定められる本発明の概念、趣旨、および範囲に含まれるものとする。
参照文献
以下の参照文献は、それらが本明細書に記載のものを補う例示的な手順またはその他の詳細を提供する範囲で、参照により具体的に本明細書に組み入れられる。
Figure 2022540197000012
Figure 2022540197000013
Figure 2022540197000014
Figure 2022540197000015
Figure 2022540197000016

Claims (80)

  1. （i）TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、TRP95、TRP19、もしくはTRP120のうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、もしくはすべて;および、SEQ ID NO:1～16のいずれか1つのペプチドを含むかもしくはそれからなる少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくはそれ以上のペプチド;
    （ii）TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、TRP95、TRP19、もしくはTRP120のうちの少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、もしくはすべて;
    （iii）E.カニス（E.canis）バクテリン、および、TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、TRP95、TRP19、もしくはTRP120のうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、もしくはすべて;
    （iv）E.カニスバクテリン、および、SEQ ID NO:1～16のいずれか1つのペプチドを含むかもしくはそれからなる少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくはそれ以上のペプチド;または
    （v）E.カニスバクテリン、TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、TRP95、TRP19、TRP120のうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、もしくはすべて、および、SEQ ID NO:1～16のいずれか1つのペプチドを含むかもしくはそれからなる少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくはそれ以上のペプチド、
    ならびに、薬学的に許容される賦形剤
    を含む、免疫原性組成物。
  2. 前記薬学的に許容される賦形剤が、アジュバントを含むかまたはそれからなる、請求項1記載の免疫原性組成物。
  3. 前記アジュバントが、トリテルペノイドサポニン、ステロール、および免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む、請求項2記載の免疫原性組成物。
  4. 前記トリテルペノイドサポニンがQuil Aである、請求項3記載の免疫原性組成物。
  5. 前記ステロールがコレステロールである、請求項3～4のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  6. 前記免疫賦活性オリゴヌクレオチドがCpG含有ODNである、請求項3～5のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  7. 前記トリテルペノイドサポニンがQuil Aであり、前記ステロールがコレステロールであり、かつ前記免疫賦活性オリゴヌクレオチドがCpG含有ODNである、請求項3記載の免疫原性組成物。
  8. 前記CpG含有ODNが、
    Figure 2022540197000017
    であり、ここで「*」がホスホロチオアート結合を指し、「-」がホスホジエステル結合を指し、「JU」が5’-ヨード-2’-デオキシウリジンを指す、請求項6～7のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  9. TRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの少なくとも1つを含む、請求項7記載の免疫原性組成物。
  10. TRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの少なくとも2つを含む、請求項9記載の免疫原性組成物。
  11. TRP140、TRP36、およびTRP19を含む、請求項10記載の免疫原性組成物。
  12. TRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの1つ、2つ、またはすべてを含むキメラタンパク質を含む、請求項7記載の免疫原性組成物。
  13. SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、および／またはSEQ ID NO:14のうちの1つ、2つ、またはすべてを含むポリペプチドを含む、請求項7記載の免疫原性組成物。
  14. 前記アジュバントが、エマルジョンもしくはリポソームであるか、または脂質を含む、請求項2～13のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  15. 前記エマルジョンが、水中油型（O/W）エマルジョンまたは油中水型（W/O）エマルジョンである、請求項14記載の免疫原性組成物。
  16. 前記アジュバントが、トリテルペノイド、ステロール、免疫調節物質、ポリマー、および／または免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む、請求項2記載の免疫原性組成物。
  17. 前記ポリマーが、ジエチル-アミノエチル（DEAE）-デキストラン、ポリエチレングリコール、またはポリアクリル酸である、請求項16記載の免疫原性組成物。
  18. 前記免疫賦活性オリゴヌクレオチドがCpG含有ODNである、請求項16～17のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  19. 前記アジュバントが、DEAEデキストラン、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、および鉱物油などの油を含み、前記免疫賦活性オリゴヌクレオチドがCpG含有ODNであり、かつ前記アジュバント製剤が油中水型（W/O）エマルジョンである、請求項16～18のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  20. 前記アジュバントが、サポニン、ステロール、四級アンモニウム化合物、ポリマー、およびORN/ODNを含む、請求項2記載の免疫原性組成物。
  21. 前記サポニンが、Quil A またはその精製された画分であり、前記ステロールがコレステロールであり、前記四級アンモニウム化合物がジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）であり、前記ポリマーがポリアクリル酸であり、かつ前記ORN/ODNがCpGである、請求項20記載の免疫原性組成物。
  22. 前記サポニンが、1用量あたり約1 μg～約5,000 μgの量で存在し、前記ステロールが、1用量あたり約1 μg～約5,000 μgの量で存在し、前記四級アンモニウム化合物が、1用量あたり約1 μg～約5,000 μgの量で存在し、かつ前記ポリマーが、約0.0001% v/v～約75% v/vの量で存在する、請求項21記載の免疫原性組成物。
  23. 前記アジュバントが糖脂質をさらに含む、請求項21～22のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  24. 前記糖脂質が、N-(2-デオキシ-2-L-ロイシルアミノ-β-D-グルコピラノシル)-N-オクタデシルドデカンアミドアセタートである、請求項23記載の免疫原性組成物。
  25. 前記アジュバントが、トリテルペノイドサポニン、ステロール、四級アンモニウム化合物、およびポリアクリル酸ポリマーを含む、請求項2記載の免疫原性組成物。
  26. 前記サポニンが、Quil Aまたはその精製された画分であり、前記ステロールがコレステロールであり、かつ前記四級アンモニウム化合物がジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）である、請求項25記載の免疫原性組成物。
  27. 前記サポニンが、1用量あたり約1 mg～約5,000 mgの量で存在し、前記ステロールが、1用量あたり約1 mg～約5,000 mgの量で存在し、前記四級アンモニウム化合物が、1用量あたり約1 mg～約5,000 mgの量で存在し、かつ前記ポリアクリル酸ポリマーが、約0.0001% v/v～約75% v/vの量で存在する、請求項25～26のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  28. 前記アジュバントが油中水型エマルジョンを含む、請求項2記載の免疫原性組成物。
  29. 前記油中水型エマルジョンが、油相および水相、ポリカチオン性担体（たとえばDEAEデキストラン）、ならびにCpG含有免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む、請求項28記載の免疫原性組成物。
  30. 水酸化アルミニウムゲルをさらに含む、請求項29記載の免疫原性組成物。
  31. 前記ポリカチオン性担体がDEAEデキストランである、請求項29～30のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  32. エマルジョンまたは水中油型（O/W）エマルジョンを含む、請求項2記載の免疫原性組成物。
  33. 前記エマルジョンが水相を含み、前記水相が、アルキル-ポリアクリル酸（アルキル-PAA）、または、アクリルポリマーとジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）の両方を含む、請求項32記載の免疫原性組成物。
  34. 前記水中油型エマルジョンの前記水相が、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）およびアルキル-ポリアクリル酸（アルキル-PAA）を含む、請求項33記載の免疫原性組成物。
  35. 前記アルキル-PAAが、デシル-PAA、オクチル-PAA、ブチル-PAA、またはメチル-PAである、請求項34記載の免疫原性組成物。
  36. 前記アクリルポリマーが、ポリアリルスクロースとともに架橋されたアクリル酸のポリマーである、請求項33～35のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  37. 非鉱物油と乳化剤とを含む油中水型（W/O）エマルジョンを含む、請求項2記載の免疫原性組成物。
  38. 前記乳化剤がマンニドモノオレアート乳化剤である、請求項37記載の免疫原性組成物。
  39. 前記アジュバントが、MF59、AS01、AS02、AS03、AS04、ビロソーム、CAF01、CAF04、CAF05、アクリルポリマー/DDAエマルジョン、CpG/DEAEエマルジョン、サポニン/コレステロール/DDAアジュバント、またはポリアクリル酸ポリマーエマルジョンである、請求項2記載の免疫原性組成物。
  40. TRP153、TRP36、TRP140、TRP28、TRP95のうちの少なくとも2つ、3つ、4つ、またはすべて、請求項1～39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  41. （TRP153およびTRP36）、（TRP153およびTRP140）、（TRP153およびTRP28）、（TRP153およびTRP95）、（TRP36およびTRP140）、（TRP36およびTRP28）、（TRP36およびTRP95）、（TRP140およびTRP28）、（TRP140およびTRP95）、（TRP28およびTRP95）、（TRP19およびTRP153）、（TRP19およびTRP36）、（TRP19およびTRP140）、（TRP19およびTRP28）、（TRP19およびTRP95）、（TRP120およびTRP153）、（TRP120およびTRP36）、（TRP120およびTRP140）、（TRP120およびTRP28）、（TRP120およびTRP95）、または（TRP120およびTRP19）を含む、請求項1～39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  42. TRP120、TRP140、およびTRP36を含む、請求項41記載の免疫原性組成物。
  43. TRP140、TRP36、およびTRP19を含む、請求項41記載の免疫原性組成物。
  44. E.カニスバクテリンをさらに含む、請求項41記載の免疫原性組成物。
  45. 前記E.カニスバクテリンが熱失活バクテリンまたは化学失活バクテリンである、請求項41記載の免疫原性組成物。
  46. 前記化学失活バクテリンが、ホルムアルデヒド、ホルマリン、bi-エチレンアミン、放射線、紫外線、β-プロピオラクトン処理、またはホルムアルデヒドにより失活された、請求項45記載の免疫原性組成物。
  47. （SEQ ID NO:2、および（SEQ ID NO:3～11もしくは16）のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:12～13のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:14）、（（SEQ ID NO:3～11もしくは16）のうちの少なくとも1つ、およびSEQ ID NO:12～13のうちの少なくとも1つ）、（（SEQ ID NO:3～11もしくは16）のうちの少なくとも1つ、およびSEQ ID NO:14）、（SEQ ID NO:12～13のうちの少なくとも1つ、およびSEQ ID NO:14）、（SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2）、（SEQ ID NO:1、および（SEQ ID NO:3～11もしくは16）のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:1、およびSEQ ID NO:12～13のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:14）、（SEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:2）、（SEQ ID NO:15、および（SEQ ID NO:3～11もしくは16）のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:15、およびSEQ ID NO:12～13のうちの少なくとも1つ）、（SEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:14）、または（SEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:1）を含む、請求項1～39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  48. SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:14、および(SEQ ID NO:3～11または16のいずれか1つ）を含む、請求項47記載の免疫原性組成物。
  49. SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、およびSEQ ID NO:1を含む、請求項47記載の免疫原性組成物。
  50. E.カニスバクテリンをさらに含む、請求項47記載の免疫原性組成物。
  51. 前記E.カニスバクテリンが熱失活バクテリンまたは化学失活バクテリンである、請求項47記載の免疫原性組成物。
  52. 前記化学失活バクテリンが、ホルムアルデヒド、ホルマリン、bi-エチレンアミン、放射線、紫外線、β-プロピオラクトン処理、またはホルムアルデヒドにより失活された、請求項51記載の免疫原性組成物。
  53. E.カニスバクテリンを含む、請求項1～39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  54. 前記E.カニスバクテリンが熱失活バクテリンまたは化学失活バクテリンである、請求項53記載の免疫原性組成物。
  55. 前記化学失活バクテリンが、ホルムアルデヒド、ホルマリン、bi-エチレンアミン、放射線、紫外線、β-プロピオラクトン処理、またはホルムアルデヒドにより失活された、請求項54記載の免疫原性組成物。
  56. エーリキア属（Ehrlicia）もしくはE.カニスへの曝露またはそれによる感染症を診断する方法であって、
    前記方法が、
    a）哺乳類対象から生物学的試料を得ること、ならびに
    b）前記生物学的試料を、TRP120、TRP140、および／もしくはTRP36、または、そのペプチド、たとえばSEQ ID NO:3～11、14、15、もしくは16のいずれかに対する免疫反応性について試験すること
    を含み、
    TRP120、TRP140、および／またはTRP36に対する免疫反応性によって、前記対象がエーリキア属またはE.カニスに曝露されたことがあるかまたは感染したことがあることが示される、
    前記方法。
  57. 前記哺乳類対象がイヌである、請求項56記載の方法。
  58. 前記生物学的試料を、TRP120およびTRP36、または、その免疫反応性ペプチド、たとえばSEQ ID NO:3～11、14、もしくは16のいずれかに対する免疫反応性について試験することを含む、請求項56～57のいずれか一項記載の方法。
  59. 前記生物学的試料を、TRP120、TRP140、およびTRP36、または、その免疫反応性ペプチド、たとえばSEQ ID NO:3～11、14、15、もしくは16のいずれかに対する免疫反応性について試験することを含む、請求項58記載の方法。
  60. 前記方法が、前記哺乳類対象を治療する方法をさらに含み、かつ、前記哺乳類対象が、薬理的に適切な量または治療的に適切な量の抗生物質を投与される、請求項56～58のいずれか一項記載の方法。
  61. 前記抗生物質がドキシサイクリンである、請求項60記載の方法。
  62. 薬学的に適切な量の請求項1～55のいずれか一項記載の免疫原性組成物を、哺乳類対象に投与すること
    を含む、前記哺乳類対象において免疫応答を誘導する方法。
  63. 前記免疫原性組成物がアジュバントを含み、かつ前記アジュバントが、トリテルペノイドサポニン、ステロール、および免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む、請求項62記載の方法。
  64. 前記トリテルペノイドサポニンがQuil Aである、請求項63記載の方法。
  65. 前記ステロールがコレステロールである、請求項63～64のいずれか一項記載の方法。
  66. 前記免疫賦活性オリゴヌクレオチドがCpG含有ODNである、請求項63～65のいずれか一項記載の方法。
  67. 前記トリテルペノイドサポニンがQuil Aであり、前記ステロールがコレステロールであり、かつ前記免疫賦活性オリゴヌクレオチドがCpG含有ODNである、請求項63記載の方法。
  68. 前記CpG含有ODNが、
    Figure 2022540197000018
    であり、ここで「*」がホスホロチオアート結合を指し、「-」がホスホジエステル結合を指し、かつ「JU」が5’-ヨード-2’-デオキシウリジンを指す、請求項66～67のいずれか一項記載の方法。
  69. 前記免疫原性組成物が、TRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの少なくとも1つを含む、請求項67記載の方法。
  70. 前記免疫原性組成物が、TRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの少なくとも2つを含む、請求項69記載の方法。
  71. 前記免疫原性組成物がTRP140、TRP36、およびTRP19を含む、請求項70記載の方法。
  72. 前記免疫原性組成物が、TRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの1つ、2つ、またはすべてを含むキメラタンパク質を含む、請求項67記載の方法。
  73. 前記免疫原性組成物が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、および／またはSEQ ID NO:14のうちの1つ、2つ、またはすべてを含むポリペプチドを含む、請求項67記載の方法。
  74. 前記免疫原性組成物が、アジュバント、ならびに、TRP140、TRP36、および／またはTRP19のうちの1つ、2つ、またはすべてを含む、請求項62記載の方法。
  75. 前記方法が、第2の免疫原性組成物を前記対象に投与することをさらに含み、前記第2の免疫原性組成物がエーリキアバクテリンを含む、請求項62～74のいずれか一項記載の方法。
  76. 前記エーリキアバクテリンがE.カニスバクテリンである、請求項75記載の方法。
  77. 前記第2の免疫原性組成物がアジュバントを含み、好ましくは前記アジュバントが、トリテルペノイドサポニン、ステロール、および免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む、請求項75～76のいずれか一項記載の方法。
  78. 前記第2の免疫原性組成物中の前記アジュバントが、Quil A、コレステロール、およびCpG含有ODNを含む、請求項77記載の方法。
  79. 前記CpG含有ODNが、
    Figure 2022540197000019
    であり、ここで「*」がホスホロチオアート結合を指し、「-」がホスホジエステル結合を指し、かつ「JU」が5’-ヨード-2’-デオキシウリジンを指す、請求項78記載の方法。
  80. 前記哺乳類対象がイヌである、請求項62～78のいずれか一項記載の方法。
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