JP2022539016A - 安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルス - Google Patents
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Abstract
本発明は、安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルス、及びその使用に関する。本発明に係る安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ(TK)活性を有しないがGCV又はACVをリン酸化することができる最小アミノ酸配列からなるエフェクタードメインを含むHSV-TK断片、又はGCV又はACVをリン酸化するそのバリアントを発現することができ、腫瘍溶解性ウイルスに感染したがん細胞及び隣接するがん細胞であっても殺傷することができる。さらに、GCV又はACVは、ウイルス増殖の抑制に関与し、従って、高用量のウイルスの投与に際してさえ、ウイルス誘導性副作用を制御し得る。さらに、ウイルス増殖に対するGCVの抑制によりウイルス粒子数が減少しても、抗がん効果が増大する。従って、本発明に係る安全性及び抗がん効果が向上した腫瘍溶解性ウイルスは、がんの治療に有利に使用することができる。【選択図】図14
Description
本発明は、安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルス、及びその使用に関する。
遺伝子組換え技術の本格的な使用により、腫瘍選択性及び抗がん効力が増大した腫瘍溶解性ウイルスを用いる臨床研究が開始された。文献に報告された最初の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルスであった。それ以来、他のウイルスを用いた腫瘍溶解の研究が活発に行われている。
ヘルペスウイルスをベースとしたT-Vec(タリモジェンラヘルパレプベク)が欧米で進行メラノーマの治療に商業化されたことから、近年、腫瘍溶解性ウイルスの有用性が注目されている。一方、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子欠損ワクシニアウイルスは臨床的有用性が高いものの、治療域が狭いため、臨床効果を最大限に発揮するには限界がある。TK欠損ワクシニアウイルスの場合、治療域が狭いことは、高用量のウイルスが大きな臨床的有効性を有するが、ウイルスの毒性のために臨床的リスクを伴うことを意味する。
実際に、原発肝がん患者30例を対象としたPexa-Vec(JX-594;SillaJen, Inc.)の第II相臨床試験において、高用量群(109pfu)は低用量群(108pfu)と比較して生存率が高いことが示された。しかし、腫瘍内投与による第I相臨床試験での3×109pfuで用量制限毒性(DLT)が認められ、これが最大耐用量(MTD)を1×109pfuに制限した。薬剤との関連性はないとの報告がある。しかしながら、腫瘍溶解性ウイルスによる治療後の早期死亡が頻繁に報告されており、望ましくないウイルスの増殖が予測できない結果をもたらす可能性があることを示している。これらの用量依存性の効力の増加及び用量制限毒性は、より安全でより効果的なワクシニアウイルスを開発する必要があることを意味する。
一方、ガンシクロビル(GCV)は単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルスに有効な抗ウイルス薬である。GCVが単純ヘルペスウイルスのTKに結合すると、その5’末端がリン酸化されてガンシクロビル-三リン酸(GCV-TP)に変換される。GCV-TPはDNAポリメラーゼの活性を阻害し、ウイルスDNAの3’末端に結合してDNA伸長を終結させる。毒性の強い物質であるGCV-TPは細胞内でもDNA合成を阻害し、それによって細胞毒性を示す。
最近、HSV1-TKを腫瘍溶解性ウイルスに挿入し、得られた腫瘍溶解性ウイルスをGCVと共投与して腫瘍細胞死を誘導する抗がん研究が行われている。研究によると、まず、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞に感染し、直接的な抗がん効果を誘導する。HSV1-TK(自殺遺伝子)によりリン酸化されたGCVは、腫瘍細胞増殖を抑制することにより、さらなる抗がん効果を示す(Oliver W et al.、Human Gene Therapy、Vol.10、No.16、1999)。HSV1-TK/GCVシステムは主にアデノウイルスをベクターとする腫瘍溶解性ウイルス療法に用いられた。しかしながら、GCVの共投与によって予想されるさらなる細胞毒性効果については、依然として議論の余地がある。
具体的には、HSV-TK遺伝子を複製能を有するアデノウイルスに挿入して得られた腫瘍溶解性ウイルスをGCVと共投与した場合、グリオーマ細胞において細胞毒性が有意に増強されることが観察された。一方、HSV-TKを複製能を有するアデノウイルスに挿入した他の多くの研究では、GCVの投与によって引き起こされるさらなる抗がん効果は一貫して示されていない(Lambright ESet al.、Gene Ther、8:946 - 53)。これは、HSV-TK/GCVシステムが腫瘍細胞増殖の抑制のみならず、ウイルス増殖の抑制にも関与しており、これらの作用が逆で互いに相殺されているためと報告されている。
したがって、HSV-TK/GCVシステムを腫瘍溶解性ウイルスに適用するに際して、安全性を確保しつつ、抗がん効果を増強することができる特定の方法について検討する必要がある。
[発明の開示]
[技術的課題]
そこで、本発明者らは、安全性及び抗がん効果が向上した腫瘍溶解性ウイルスの開発を検討した結果、チミジンキナーゼ(TK)活性を有さず、GCV又はACVをリン酸化することができる腫瘍溶解性ウイルスを開発し、この腫瘍溶解性ウイルスをGCVと共投与した場合に優れた安全性及び抗がん効果を示すことを確認し、本発明を完成させた。
[技術的課題]
そこで、本発明者らは、安全性及び抗がん効果が向上した腫瘍溶解性ウイルスの開発を検討した結果、チミジンキナーゼ(TK)活性を有さず、GCV又はACVをリン酸化することができる腫瘍溶解性ウイルスを開発し、この腫瘍溶解性ウイルスをGCVと共投与した場合に優れた安全性及び抗がん効果を示すことを確認し、本発明を完成させた。
[課題を解決するための手段]
上記目的を達成するために、本発明の一態様では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)に由来するエフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスであって、前記エフェクタードメインは、配列番号1によって表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)に由来する、腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
上記目的を達成するために、本発明の一態様では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)に由来するエフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスであって、前記エフェクタードメインは、配列番号1によって表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)に由来する、腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
本発明の別の態様では、腫瘍溶解性ウイルスを有効成分として含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物が提供される。
本発明のさらに別の態様では、がんを予防又は治療するための医薬組成物であって、有効成分として、腫瘍溶解性ウイルス及びガンシクロビル(GCV)又はアシクロビル(ACV)を含む、医薬組成物が提供される。
本発明のさらに別の態様において、変異型HSV-TKをコードする遺伝子を含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを製造する方法であって、i)ワクシニアウイルスからTK遺伝子を除去し、ワクシニアウイルスを野生型HSV-TK遺伝子と組換えさせる工程;及びii)宿主細胞においてブロモデオキシウリジン(BrdU)の存在下で組換えワクシニアウイルスの連続継代培養を行う工程を含む方法が提供される。
[発明の効果]
本発明に係る安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ(TK)活性を有しないがGCV又はACVをリン酸化することができる最小アミノ酸配列からなるエフェクタードメインを含むHSV-TK断片、又はGCV又はACVをリン酸化するためのそのバリアントを発現することができ、それにより、腫瘍溶解性ウイルスに感染したがん細胞及び隣接するがん細胞であっても殺傷することができる。さらに、GCV又はACVはまた、ウイルス増殖の阻害に関与し、従って、ウイルスの高用量の投与に際してさえ、ウイルス誘導性副作用を制御し得る。さらに、腫瘍溶解性ウイルスは、GCVによって引き起こされるウイルス増殖の阻害によってウイルス粒子の数が減少しても、増大した抗がん効果を示す。従って、本発明に係る安全性及び抗がん効果が向上した腫瘍溶解性ウイルスは、がんの治療に有効に用いることができる。
本発明に係る安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ(TK)活性を有しないがGCV又はACVをリン酸化することができる最小アミノ酸配列からなるエフェクタードメインを含むHSV-TK断片、又はGCV又はACVをリン酸化するためのそのバリアントを発現することができ、それにより、腫瘍溶解性ウイルスに感染したがん細胞及び隣接するがん細胞であっても殺傷することができる。さらに、GCV又はACVはまた、ウイルス増殖の阻害に関与し、従って、ウイルスの高用量の投与に際してさえ、ウイルス誘導性副作用を制御し得る。さらに、腫瘍溶解性ウイルスは、GCVによって引き起こされるウイルス増殖の阻害によってウイルス粒子の数が減少しても、増大した抗がん効果を示す。従って、本発明に係る安全性及び抗がん効果が向上した腫瘍溶解性ウイルスは、がんの治療に有効に用いることができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の態様において、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスであって、該エフェクタードメインが配列番号1で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)に由来する、腫瘍溶解性ウイルスが提供される。
本明細書において、「単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)」という用語は、単純ヘルペスウイルスにおけるDNA合成の間の初期リン酸化反応に関与する酵素を指す。また、HSV-TKは抗ウイルス薬であるガンシクロビル(GCV)やアシクロビル(ACV)のリン酸化にも関与している。特に、HSV1-TKは、GCV又はACVに対して、他のウイルスに存在するTKの約10倍の感度で反応する。HSVは単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)又は単純ヘルペスウイルス2型(HSV2)である。具体的には、HSVはHSV1であり得る。さらに、HSV-TKは、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ(HSV1-TK)であり得る。
本明細書中で用いるように、用語「エフェクタードメイン」とは、配列番号15で表され、376個のアミノ酸からなる、野生型HSV-1TKの1~145位の連続したアミノ酸からなるタンパク質ドメインを指す。エフェクタードメインは、野生型HSV-1TKと比較して、TK活性が低いか又は全くなく、従って、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスは、それ自体を増殖できない。しかし、エフェクタードメインはATP結合部位を含み、GCV又はACVをリン酸化することができる。エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスに感染した細胞を、GCV又はACVで処理する場合、GCV又はACVはリン酸化され得る。
エフェクタードメインを含むポリペプチドは、エフェクタードメインのC末端に連結された0~231個のアミノ酸をさらに有し得る。ここで、該ポリペプチドは、野生型HSV-1TKと比較して、TK活性が低いか又は全くなく、従って、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスは、それ自体を増殖できない。さらに、該ポリペプチドはGCV又はACVをリン酸化することができる。該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスに感染した細胞をGCV又はACVで処理する場合、GCV又はACVはリン酸化され得る。
具体的には、エフェクタードメインを含むポリペプチドは、エフェクタードメインのC末端に連結された0~231、10~200、20~150、又は40~100個のアミノ酸をさらに有していてもよい。好ましくは、エフェクタードメインを含むポリペプチドは、エフェクタードメインのC末端に連結された36、82、又は231個のアミノ酸をさらに有し得る。
該エフェクタードメインを含むポリペプチドは、配列番号1、3、5、7、9、11又は13によって表されるアミノ酸配列からなるものであってよい。該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号1、3、5、7、9、11又は13によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であってもよい。特に、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号2、4、6、8、10、12又は14によって表されるヌクレオチド配列であってもよい。
本発明者らは、安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルスを開発するために、野生型HSV1-TK遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを作製し、次いで、TKの非存在下でウイルスを適応進化させた。適応進化したワクシニアウイルスをルシフェラーゼ活性、ゲノム解析、GCVに対する感受性の実験に供した。実験を通して、HSV1-TK断片又はそのバリアントを発現する変異ワクシニアウイルス(C1、C3、C40、C45、C52、及びC57)を選択した。また、配列番号15に示すアミノ酸配列の一部を変異させて得られたHSV-TKバリアントをコードする遺伝子を含む変異ワクシニアウイルス(WOTS-418、OTS-418)を作製した。変異ワクシニアウイルス(C1、C3、C40、C45、C52、C57、WOTS-418)のヌクレオチド配列を解析した。その結果、配列番号15で示される野生型HSV-1TKの145位(基準点)までのアミノ酸配列は、TK活性を有さないものの、GCV又はACVをリン酸化することが確認された。
本明細書中で使用される用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、ウイルスががん細胞を破壊できるように、その遺伝子ががん細胞中で特異的に複製するように操作されている組換えウイルスを指す。腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、レオウイルス、アデノ随伴ウイルス、ミキソーマウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ニューカッスル病、パルボウイルス、コクサッキーウイルス、セネカウイルス、ワクシニアウイルス、又はポックスウイルスに由来し得る。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスに由来し得る。
ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルス株、すなわち、ウェスタンリザーブ(Western Reserve(WR))、ニューヨークワクシニアウイルス(NYVAC)、ワイス(Wyeth(The New York City Board of Health;NYCBOH))、LC16m8、リスター(Lister)、コペンハーゲン(Copenhagen)、Tian Tan、USSR、タシケント(TashKent)、エヴァンス(Evans)、International Health Division-J(IHD-J)、又はInternational Health Division-White(IHD-W)であり得る。
本発明の別の態様では、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスを有効成分として含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物であって、該エフェクタードメインが、配列番号1で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)に由来する、医薬組成物が提供される。
医薬組成物中に有効成分として含まれる腫瘍溶解性ウイルスは、上記の通りである。
腫瘍溶解性ウイルスの投与量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の種類、投与経路及び投与期間に依存して変化し、当業者によって適切に選択され得る。用量は、患者が1×103~1×1018のウイルス粒子、感染性ウイルス単位(TCID50)、又はプラーク形成単位(pfu)を受けるようなものであり得る。具体的には、患者に1×103、2×103、5×103、1×104、2×104、5×104、1×105、2×105、5×105、1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018又はそれ以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位、又はプラーク形成単位が投与される用量であればよく、これらの数値の間に種々の数値や範囲が含まれていてもよい。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは1×103~1×1010pfuの用量で投与することができる。
がんは、肺がん、大腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかであってもよい。
本発明の医薬組成物は、生理学的に許容される担体をさらに含むことができる。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の調製において一般的に使用される適切な賦形剤及び希釈剤をさらに含み得る。また、医薬組成物は、常法に従って注射剤の形態で製剤化することができる。
非経口投与のための製剤として製剤化する場合、医薬組成物は、滅菌水溶液、非水溶液、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥製剤、坐剤などに製剤化することができる。非水溶液又は懸濁液としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能なエステル等を用いることができる。坐剤の基剤としては、Witepsol(登録商標)、マクロゴール、Tween(登録商標)61、カカオバター、ラウリン脂肪、グリセロゼラチン等を用いることができる。
投与経路、用量及び投与回数に関して、医薬組成物は、患者の状態及び副作用の有無に依存して、種々の方法及び量で対象に投与することができる。また、その最適な投与経路、用量、投与回数は、当業者が適切な範囲で選択することができる。また、医薬組成物は、治療効果が既知である他の薬剤や生理活性物質と組み合わせて投与してもよいし、他の薬剤と組み合わせて製剤化してもよい。
医薬組成物は、非経口的に投与することができ、このような投与は、任意の適切な方法、例えば、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、リンパ節内、及び静脈内投与によって行うことができる。これらの中でも、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与が好ましい。一方、医薬組成物の用量は、投与スケジュール、総用量、及び患者の健康状態に応じて決定することができる。
本発明のさらに別の態様では、腫瘍溶解性ウイルスとガンシクロビル(GCV)又はアシクロビル(ACV)とを有効成分として含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物であって、前記腫瘍溶解性ウイルスがエフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記エフェクタードメインが、配列番号1で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)に由来する、医薬組成物が提供される。
医薬組成物に含まれる腫瘍溶解性ウイルス及びGCV又はACVは、同時に投与され得るか、又は逐次的にもしくは逆の順序で共投与され得る。具体的には、医薬組成物に含まれる腫瘍溶解性ウイルスとGCV又はACVとを同時に投与することができる。さらに、医薬組成物の投与は、腫瘍溶解性ウイルスが最初に投与され、次いで、GCV又はACVが投与され、これらの成分が医薬組成物に含まれるようなものであり得る。 さらに、医薬組成物の投与は、腫瘍溶解性ウイルスが最初に投与され、次いでGCV又はACVが投与され、次いで再び腫瘍溶解性ウイルスが投与され、ここで、これらの成分が医薬組成物に含まれるようなものであり得る。
医薬組成物中に有効成分として含まれる腫瘍溶解性ウイルスは、上記の通りである。
腫瘍溶解性ウイルスの用量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の種類、投与経路及び投与期間に依存して変化し、当業者によって適切に選択され得る。用量は、患者が1×103~1×1018のウイルス粒子、感染性ウイルス単位(TCID50)、又はプラーク形成単位(pfu)を受けるようなものであり得る。具体的には、患者に1×103、2×103、5×103、1×104、2×104、5×104、1×105、2×105、5×105、1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018又はそれ以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位(TCID50)、又はプラーク形成単位(pfu)が投与される用量であればよく、これらの数値の間に種々の数値や範囲が含まれていてもよい。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは1×103~1×1010pfuの用量で投与することができる。
本明細書で使用される用語「GCV」は、ガンシクロビルと呼ばれ、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び水痘・帯状疱疹ウイルスに対して有効な抗ウイルス剤を指す。GCVはウイルスのTKによって5´末端がリン酸化され、ガンシクロビル三リン酸(GCV-TP)に変換される。GCV-TPはウイルスDNAポリメラーゼの活性を阻害し、ウイルスDNAの3´末端に結合してDNA伸長を終結させる。さらに、リン酸化されたGCVは細胞のDNA複製を停止させることができるので、細胞増殖を阻害する。GCVは式1で表される。
本明細書で使用する「ACV」という用語は、アシクロビルと呼ばれ、単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、及びエプスタイン-バーウイルスに対して有効な抗ウイルス剤を指す。ACVはウイルスのTKによってリン酸化され、アシクロビル三リン酸(ACV-TP)に変換される。ACV-TPはウイルスDNAポリメラーゼの活性を阻害し、ウイルスDNAの3´末端に結合してDNA伸長を終結させる。ACVは式2で表される。
さらに、GCV又はACVを0.1μg/kg~50mg/kgの用量で投与することができる。具体的には、GCV又はACVを0.1μg/kg~50mg/kg、1μg/kg~40mg/kg、5μg/kg~30mg/kg、又は10μg/kg~20mg/kgの用量で投与することができる。
がんが、肺がん、大腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかであることができる。
本発明の医薬組成物は、生理学的に許容される担体をさらに含むことができる。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬的組成物の調製において一般的に使用される適切な賦形剤及び希釈剤をさらに含み得る。また、医薬組成物は、常法に従って注射剤の形態で製剤化することができる。
非経口投与のための製剤として製剤化する場合、医薬組成物は、滅菌水溶液、非水溶液、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥製剤、坐剤などに製剤化することができる。非水溶液又は懸濁液としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能なエステル等を用いることができる。坐剤の基剤としては、Witepsol(登録商標)、マクロゴール、Tween(登録商標)61、カカオバター、ラウリン脂肪、グリセロゼラチン等を用いることができる。
投与経路、用量及び投与回数に関して、医薬組成物は、患者の状態及び副作用の有無に依存して、種々の方法及び量で対象に投与することができる。また、その最適な投与経路、用量、投与回数は、当業者が適切な範囲で選択することができる。また、医薬組成物は治療効果が既知である他の薬剤や生理活性物質と組み合わせて投与してもよいし、他の薬剤と組み合わせて製剤化してもよい。
医薬組成物は、非経口的に投与することができ、このような投与は、任意の適切な方法、例えば、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、リンパ節内、及び静脈内投与によって行うことができる。これらの中でも、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与が好ましい。一方、医薬組成物の用量は、投与スケジュール、総用量、及び患者の健康状態に応じて決定することができる。
本発明のさらに別の態様において、腫瘍溶解性ウイルスとガンシクロビル(GCV)又はアシクロビル(ACV)とを投与する工程を含み、該腫瘍溶解性ウイルスは、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該エフェクタードメインは、配列番号1で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)に由来するものである、がんを治療するための方法を提供する。
腫瘍溶解性ウイルス、GCV及びACVは上記の通りである。
本明細書中で使用される場合、用語「個体」は、本発明の腫瘍溶解性ウイルス及びGCV又はACVを投与することによって軽減、阻害、又は治療することができる状態の疾患を有するか、又はそれに罹患している人を指す。
本発明のさらにもう1つの態様において、がんの治療のための腫瘍溶解性ウイルスの使用であって、該腫瘍溶解性ウイルスは、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該エフェクタードメインは、配列番号1で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)に由来する、使用が提供される。
本発明のさらに別の態様において、変異型HSV-TKをコードする遺伝子を含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを製造する方法であって、i)ワクシニアウイルスからTK遺伝子を除去し、ワクシニアウイルスを野生型HSV-TK遺伝子と組換えさせる工程及びii)宿主細胞においてブロモデオキシウリジン(BrdU)の存在下で組換えワクシニアウイルスの連続継代培養を行う工程を含む方法が提供される。
野生型HSV-TK遺伝子は、配列番号16で表されるヌクレオチド配列であってもよい。
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはTK活性が低いか又は全くなく、GCV又はACVをリン酸化することができる。
継代培養は、少なくとも3回連続して行うことができ、好ましくは少なくとも10回連続して行うことができる。
本発明のさらに別の態様において、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシ尿素を有効成分として含み、該腫瘍溶解性ウイルスが、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該エフェクタードメインは、配列番号1で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)に由来する、がんを予防又は治療するための医薬組成物を提供する。腫瘍溶解性ウイルスについては、上記の説明を参照のこと。
本明細書で使用する「ヒドロキシ尿素」という用語は、以下の式を有する化合物を指す。
ヒドロキシ尿素はDNA合成を阻害する抗がん剤として知られている。しかしながら、その正確なメカニズムは解明されていない。また、ヒドロキシ尿素は、ヒドロキシ尿素を含有する商品化薬物として、医薬組成物中に含有させてもよい。ヒドロキシ尿素を含有する商品化薬物の例は、限定されるものではないが、Hydroxyurea(登録商標)、Hydrea(登録商標)、Droxia(商標)、Mylocel(商標)、Siklos(登録商標)及びHydrine(登録商標)キャップを含み得る。ヒドロキシ尿素は経口摂取が可能であり、非経口投与も可能である。
医薬組成物に含まれる腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシ尿素は、同時に投与され得るか、又は逐次的にもしくは逆の順序で共投与され得る。具体的には、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシ尿素を同時に投与することができる。さらに、ヒドロキシ尿素を最初に投与し、続いて腫瘍溶解性ウイルスを投与することができる。さらに、腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、次いでヒドロキシ尿素を投与することができる。さらに、ヒドロキシ尿素を最初に投与し、続いて腫瘍溶解性ウイルスを投与し、次いで再びヒドロキシ尿素を投与することができる。
さらに、ヒドロキシ尿素は、1mg/kg/日~100mg/kg/日、又は10mg/kg/日から90mg/kg/日の用量で投与することができる。具体的には、ヒドロキシ尿素を10mg/kg/日~90mg/kg/日、15mg/kg/日~80mg/kg/日、20mg/kg/日~70mg/kg/日、25mg/kg/日~65mg/kg/日、30mg/kg/日~60mg/kg/日の用量で投与することができる。本発明の実施形態において、ヒドロキシ尿素は30mg/kg/日又は60mg/kg/日で投与された。用量に応じて、医薬組成物を1日に数回に分けて投与することができる。具体的には、医薬組成物は、1日1~4回又は1日1~2回などの分割用量で投与することができる。
がんは、肺がん、大腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかであってよい。
本発明の医薬組成物は、生理学的に許容される担体をさらに含むことができる。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の調製において一般的に使用される適切な賦形剤及び希釈剤をさらに含み得る。また、医薬組成物は、常法に従って注射剤の形態で製剤化することができる。
非経口投与のための製剤として製剤化する場合、医薬組成物は、滅菌水溶液、非水溶液、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥製剤、坐剤などに製剤化することができる。非水溶液又は懸濁液としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能なエステル等を用いることができる。坐剤の基剤としては、Witepsol(登録商標)、マクロゴール、Tween(登録商標)61、カカオバター、ラウリン脂肪、グリセロゼラチン等を用いることができる。
投与経路、用量及び投与回数に関して、医薬組成物は、患者の状態及び副作用の有無に依存して、種々の方法及び量で対象に投与することができる。また、その最適な投与経路、用量、投与回数は、当業者が適切な範囲で選択することができる。また、医薬組成物は、治療効果が既知である他の薬剤や生理活性物質と組み合わせて投与してもよいし、他の薬剤と組み合わせて製剤化してもよい。
医薬組成物は、非経口的に投与することができ、このような投与は、任意の適切な方法、例えば、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、リンパ節内、及び静脈内投与によって行うことができる。これらの中でも、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与が好ましい。一方、医薬組成物の投与量は、投与スケジュール、総用量、及び患者の健康状態に応じて決定することができる。
本発明のさらに別の態様において、腫瘍溶解性ウイルスを投与する工程を含む、がんを治療する方法が提供される。
本発明のさらに別の態様において、がんの治療のための腫瘍溶解性ウイルスの使用が提供される。
本発明のさらに別の態様では、がんを治療するための医薬の製造のための腫瘍溶解性ウイルスの使用が提供される。
本発明のさらに別の態様において、がんを予防又は治療するための医薬組成物を投与する工程を含む、がんを治療する方法が提供される。
本発明のさらに別の態様において、がんの治療のための、がんを予防又は治療するための医薬組成物の使用が提供される。
本発明のさらに別の態様では、がんを治療するための医薬の製造のための、がんを予防又は治療するための医薬組成物の使用が提供される。
[実施例]
以下、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、以下の実施例は例示のためだけであり、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
以下、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、以下の実施例は例示のためだけであり、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
実施例1.変異ワクシニアウイルスの作製
実施例1.1.シャトルプラスミドベクターの構築
シャトルプラスミドベクターは、1型HSVTK遺伝子(pSE/L プロモーター)及びホタルルシフェラーゼレポーター(p7.5プロモーター)遺伝子を合成し、これらの遺伝子をpUC57amp+プラスミド(Genewiz、米国)に組み込んで作製したシャトルプラスミドベクターを用いた。
実施例1.1.シャトルプラスミドベクターの構築
シャトルプラスミドベクターは、1型HSVTK遺伝子(pSE/L プロモーター)及びホタルルシフェラーゼレポーター(p7.5プロモーター)遺伝子を合成し、これらの遺伝子をpUC57amp+プラスミド(Genewiz、米国)に組み込んで作製したシャトルプラスミドベクターを用いた。
実施例1.2.変異ワクシニアウイルス(C1、C3、C40、C45、C52、及びC57)の構築
変異ワクシニアウイルスの製造方法を図1に示す。具体的には、まず、組換えウイルスを得るために、HeLa細胞(ATCC)を6ウェルプレートに4×105細胞/ウェルで播種し、10%ウシ胎児血清を含むEMEM培地を添加した。Wyeth株野生型ワクシニアウイルス(NYC Department of Health strain,WR-1536,ATCC)による0.05MOIでの処理を行った。2時間後、培地を、2%ウシ胎児血清を含有するEMEM培地と交換し、Xfect(商標)ポリマー(Clonetech631317、米国)を使用して、実施例1.1で構築したシャトルプラスミドベクター4μgを細胞に送達した。培養4時間後、培地を、2%ウシ胎児血清を含有するEMEM培地で置換し、HeLa細胞をさらに72時間培養した。HSV1-TK遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを、HeLa細胞におけるルシフェラーゼ活性をチェックすることによって得た。
変異ワクシニアウイルスの製造方法を図1に示す。具体的には、まず、組換えウイルスを得るために、HeLa細胞(ATCC)を6ウェルプレートに4×105細胞/ウェルで播種し、10%ウシ胎児血清を含むEMEM培地を添加した。Wyeth株野生型ワクシニアウイルス(NYC Department of Health strain,WR-1536,ATCC)による0.05MOIでの処理を行った。2時間後、培地を、2%ウシ胎児血清を含有するEMEM培地と交換し、Xfect(商標)ポリマー(Clonetech631317、米国)を使用して、実施例1.1で構築したシャトルプラスミドベクター4μgを細胞に送達した。培養4時間後、培地を、2%ウシ胎児血清を含有するEMEM培地で置換し、HeLa細胞をさらに72時間培養した。HSV1-TK遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを、HeLa細胞におけるルシフェラーゼ活性をチェックすることによって得た。
次いで、TK活性を欠くHSV1-TKを引き起こす突然変異を、TK-骨肉腫(143B TK-)細胞株(ATCC)において、BrdU(チミジン類似体、15μg/ml)の存在下でTK機能を欠く細胞の選択を可能にする生化学環境(TK-選択圧)を適用した状態で、10回連続継代培養を行うことによって誘導した。ルシフェラーゼ活性を有する変異ワクシニアウイルスクローンのライセートをプレート上に分注し、次いで、ルシフェラーゼ活性を有する100個の単一プラークを単離した。次いで、単一プラークを増幅し、次いで、異なるタンパク質サイズのHSV-TK断片を発現するクローン(S3C4#1_C1~S3C4#1_C100)をウェスタンブロッティングによって同定した。
具体的には、100個のクローンをそれぞれ15μlで処理して、HeLa細胞株に感染させた。次いで、24時間後、細胞を回収し、溶解してタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質を変性させ、各試料40μgをSDS-PAGEゲルに負荷して電気泳動を行った。電気泳動後、試料をPVDF膜に転写し、一次抗体である抗HSV1-TK抗体(Bethyl A50-101P)と反応させた。次いで、PBSTで洗浄後、二次抗体であるHRP標識抗ヤギ抗体(SantaCruz,sc-28037)と反応させた。試料を再びPBSTで洗浄し、化学発光試薬で処理し、化学発光画像システム(Davinch K)を用いてチェックした。その結果、ウイルスではHSV1-TK断片タンパク質が発現していることが確認された(図2~図13)。
100種類の異なるクローンは基本的にTK活性をもたない。なぜなら、それらはTK機能を欠く細胞を選択できる生化学的環境で培養されたからである。一方、GCVに対して感受性を有するクローンをスクリーニングするために、96ウェルプレート中でGCVの存在下で4日間の培養を行いながら、リアルタイムの細胞イメージング及び分析システムであるIncucyte(登録商標)(Essen Biosciences)を用いて、リアルタイムイメージングによってアポトーシスが生じた10個のクローンを最初に選択した。一般に、ウイルス誘導細胞毒性はプラーク形成後に徐々に増加する。しかし、GCV誘導細胞毒性の場合、プラーク形成後15時間以内に一度に全体的な細胞毒性が生じる。したがって、GCV誘導細胞毒性を定性的にチェックした。
画像解析の結果、最初に選択されたコロニーについて、GCV投与によるウイルス増殖及び細胞毒性の抑制を確認した。次いで、コロニーS3C4#1_C1、S3C4#1_C3、S3C4#1_C40、S3C4#1_45、S3C4#1_C52、及びS3C4#1_C57における変異ワクシニアウイルスを最終的に選択した。コロニーS3C4#1_C1、S3C4#1_C3、S3C4#1_C40、S3C4#1_45、S3C4#1_C52及びS3C4#1_C57における変異ワクシニアウイルスは、それぞれ「C1」、「C3」、「C40」、「C45」、「C52」及び「C57」と命名された。
C1、C3、C40、C45、C52及びC57のアミノ酸配列決定は、Macrogen(ソウル、韓国)に依頼した。その結果、C40とC45のアミノ酸配列は同一であることが確認された。また、C1、C3、C40/C45、C52及びC57は、配列番号15、17、19、21、23及び25のアミノ酸配列を有することが確認された。特に、選択された変異ワクシニアウイルスのHSV1-TKでは、変異がN末端の145番目のアミノ酸から開始することが確認された(図14)。
実施例1.3.変異ワクシニアウイルス(WOTS-418/OTS-418)の産生
HSV-TKにおける最も多く報告されている突然変異は、430~436位(7G)及び548~583位(6C)の塩基配列部位において生じる塩基の挿入又は欠失によって引き起こされるフレームシフト突然変異である。野生型HSV-TKをワクシニアウイルスに挿入した後、変異の98%以上がこれらの部位で起こった。そこで、塩基配列部位にサイレント変異を起こさせるために、430~436位の塩基配列であるGGGGGGGをGGTGGTGに、548~583位の塩基配列であるCCCCCCをCCCCTCに変更した。また、シャトルプラスミドベクターは、配列番号15のHSV-TKの167位のアラニンをチロシンに置換したHSV-TKバリアントをコードする遺伝子と、ホタルルシフェラーゼレポーター(p7.5プロモーター)遺伝子を合成し、これらの遺伝子をpUC57amp+プラスミド(Genewiz、米国)に組換えたものを用いた。次いで、シャトルプラスミドベクター及びウェスタンリザーブ株(ATCC)又はワイス株ワクシニアウイルスを用いて、実施例1.2と同様にして変異ワクシニアウイルスを作製した。ウェスタンリザーブ株ワクシニアウイルスを用いて作製した変異ワクシニアウイルスを「WOTS-418」、ワイス株ワクシニアウイルスを用いて作製した変異ワクシニアウイルスを「OTS-418」とした。
HSV-TKにおける最も多く報告されている突然変異は、430~436位(7G)及び548~583位(6C)の塩基配列部位において生じる塩基の挿入又は欠失によって引き起こされるフレームシフト突然変異である。野生型HSV-TKをワクシニアウイルスに挿入した後、変異の98%以上がこれらの部位で起こった。そこで、塩基配列部位にサイレント変異を起こさせるために、430~436位の塩基配列であるGGGGGGGをGGTGGTGに、548~583位の塩基配列であるCCCCCCをCCCCTCに変更した。また、シャトルプラスミドベクターは、配列番号15のHSV-TKの167位のアラニンをチロシンに置換したHSV-TKバリアントをコードする遺伝子と、ホタルルシフェラーゼレポーター(p7.5プロモーター)遺伝子を合成し、これらの遺伝子をpUC57amp+プラスミド(Genewiz、米国)に組換えたものを用いた。次いで、シャトルプラスミドベクター及びウェスタンリザーブ株(ATCC)又はワイス株ワクシニアウイルスを用いて、実施例1.2と同様にして変異ワクシニアウイルスを作製した。ウェスタンリザーブ株ワクシニアウイルスを用いて作製した変異ワクシニアウイルスを「WOTS-418」、ワイス株ワクシニアウイルスを用いて作製した変異ワクシニアウイルスを「OTS-418」とした。
その結果、シャトルプラスミドベクター及びウェスタンリザーブ株ワクシニアウイルスで処理したHeLaがん細胞株の培養液から分離した上清及びペレットの両方において、ルシフェラーゼ活性が確認された(図15及び16)。また、シャトルプラスミドベクター及びワイス株ワクシニアウイルスで処理したHeLaがん細胞株の培養液から分離した上清において、ルシフェラーゼ活性が確認された(図17)。これらの結果から,HSV-TKバリアントをコードする遺伝子がウェスタンリザーブ株又はワイス株ワクシニアウイルスに導入されたことが確認された。
実施例2.GCV投与後の変異ワクシニアウイルス(C1,C3,C45,C52)の増殖抑制の確認(in vitro)
実施例1.2で製造したC1、C3、C45及びC52のGCV投与による増殖能の抑制を確認した。ここで、コロニーS3C4#1_C19中の変異ワクシニアウイルスを陰性対照として用い、これを「C19」と命名した。C1、C3、C19、C45又はC52をGCV処理した後のウイルス粒子数の違いを確認するため、ワクシニアウイルスのみに特異的に発現するE9L遺伝子を用いて定量PCR解析(qPCR)を行った。
実施例1.2で製造したC1、C3、C45及びC52のGCV投与による増殖能の抑制を確認した。ここで、コロニーS3C4#1_C19中の変異ワクシニアウイルスを陰性対照として用い、これを「C19」と命名した。C1、C3、C19、C45又はC52をGCV処理した後のウイルス粒子数の違いを確認するため、ワクシニアウイルスのみに特異的に発現するE9L遺伝子を用いて定量PCR解析(qPCR)を行った。
具体的には、DNAの2つの相補鎖のうちの1つのみに結合しながらE9L遺伝子を認識するプローブ(配列番号19及び20)を調製した。調製したプローブは、ウイルス増殖が起こるたびに1回の発光を測定するものであった。NCI-H460がん細胞株を1.5×104細胞/ウェルで播種し、次いで、0.01~1のMOIでウイルスC1、C3、C19、C45又はC52に感染させた。2時間後、60μMの濃度のGCVとの共処理を行った。培養を48時間行った後、ウイルス抽出キット(QIAamp MinElute Virus Spin,QIAGEN,57704)を用いて抽出した。抽出したDNAを1ng/5μlの濃度に希釈し、qPCRに供した。
その結果、C19については、GCV投与にもかかわらず、ウイルス増殖は抑制されなかった。一方、C1、C3、C45及びC52については、GCV投与に続いてウイルス増殖が抑制された(図18)。これらの結果から、GCV投与によりC1、C3、C45及びC52の増殖能が低下することが確認された。
実施例3.GCV投与後の変異ワクシニアウイルス(C40、C57)の増殖能低下の確認(in vitro)
実施例1.2で製造したC40及びC57の増殖能を、GCVを投与して確認した。GCVで処理した場合のC40又はC57の増殖レベルの変化を調べるために、E9L遺伝子を用いて定量PCR解析(qPCR)を行った。
実施例1.2で製造したC40及びC57の増殖能を、GCVを投与して確認した。GCVで処理した場合のC40又はC57の増殖レベルの変化を調べるために、E9L遺伝子を用いて定量PCR解析(qPCR)を行った。
具体的には、DNAの2つの相補鎖のうちの1つのみに結合しながら、E9L遺伝子を認識するプローブを調製した。調製したプローブは、ウイルス増殖が起こるたびに1回の発光を測定するものであった。HeLaがん細胞株を1×104細胞/ウェルで播種し、又はNCI-H460がん細胞株を1.5×104細胞/ウェルで播種した。次いで、細胞を0.1のMOI(0.1pfu/細胞)でウイルスC40又はC57に感染させた。2時間後、50μMの濃度のGCVとの共処理を行った。48時間培養後、ウイルス抽出キットを用いてDNAを抽出した。抽出したDNAを1ng/5μlの濃度に希釈し、qPCRに供した。
その結果、C40及びC57については、GCV投与によりウイルス増殖が抑制されることが確認された(図19及び20)。これらの結果から、GCV投与によりC40及びC57の増殖能が低下することが確認された。
実施例4.GCV投与後の変異ワクシニアウイルス(C1,C3,C45,C52)の細胞毒性の確認(in vitro)
C1、C3、C45及びC52が実施例2においてGCVによる増殖阻害を示したが、C1、C3、C45及びC52がGCVの投与に際して細胞毒性を維持するかどうかを確認するために、細胞毒性の比較のためにC1、C3、C19、C45又はC52とGCVとの共処理を行った。具体的には、NCI-H460がん細胞株を1.5×104細胞/ウェルで播種し、次いで0.01~1のMOIでC1、C3、C19、C45又はC52に感染させた。2時間後、60μMの濃度のGCVと共処理を行った。72時間培養した後、CCK8キット(Cell Counting Kit8、同仁堂、熊本、日本)を用いて細胞毒性を分析した。
C1、C3、C45及びC52が実施例2においてGCVによる増殖阻害を示したが、C1、C3、C45及びC52がGCVの投与に際して細胞毒性を維持するかどうかを確認するために、細胞毒性の比較のためにC1、C3、C19、C45又はC52とGCVとの共処理を行った。具体的には、NCI-H460がん細胞株を1.5×104細胞/ウェルで播種し、次いで0.01~1のMOIでC1、C3、C19、C45又はC52に感染させた。2時間後、60μMの濃度のGCVと共処理を行った。72時間培養した後、CCK8キット(Cell Counting Kit8、同仁堂、熊本、日本)を用いて細胞毒性を分析した。
その結果、C1、C3、C45又はC52とGCVとの共処理を行った場合、C1、C3、C45及びC52におけるGCVによるウイルス増殖抑制にもかかわらず、NCI-H460がん細胞株はさらに約25%以上も多く殺傷された。一方、C19とGCVの共処理を行った場合には、C19のみで処理した場合と同程度にNCI-H460がん細胞株は殺傷された(図21)。これらの結果から、C1、C3、C45又はC52とGCVを共投与した場合に、C1、C3、C45又はC52の細胞毒性が増加することが確認された。
実施例5.GCV投与後の変異ワクシニアウイルス(C40,C57)の細胞毒性の確認(in vitro)
C40及びC57が実施例3においてGCVによるウイルス増殖阻害を示したが、C40及びC57がGCVの投与に際して細胞毒性を維持するかどうかを確認するために、C40又はC57とGCVとの共処理を行い、それらの細胞毒性を分析した。
C40及びC57が実施例3においてGCVによるウイルス増殖阻害を示したが、C40及びC57がGCVの投与に際して細胞毒性を維持するかどうかを確認するために、C40又はC57とGCVとの共処理を行い、それらの細胞毒性を分析した。
具体的には、HeLaがん細胞株を1×104細胞/ウェルで播種し、又はNCI-H460がん細胞株を1.5×104細胞/ウェルで播種した。次いで、0.1のMOI(0.1pfu/細胞)でのC40又はC57と50μMの濃度でのGCVとの共処理を、細胞に対して感染させるために2時間行った。48時間培養後、CCK8キット(Cell Counting Kit8)を用いて細胞毒性を分析した。
その結果、C40又はC57とGCVとの共処理を行った場合には、C40及びC57においてGCVによるウイルス増殖抑制が認められたにもかかわらず、HeLaがん細胞株及びNCI-H460がん細胞株は、C40又はC57のみで処理した場合と同程度に殺傷された(図22及び23)。これらの結果から,C40又はC57とGCVとを共投与した場合、C40又はC57の細胞毒性が増加することが確認された。
実施例6.変異ワクシニアウイルス(WOTS-418)の細胞毒性の確認(in vitro)
実施例1.3で作製したWOTS-418のがん細胞に対する細胞毒性を確認するために、96ウェルプレートに、ヒト肺がん細胞株(A549、NCI-H460)、ヒト腎がん細胞株(A498、Caki-1)、ヒト大腸がん細胞株(HT-29、HCT116)、ヒト乳がん細胞株(MDA-MB-231、MCF)、マウス乳がん細胞株(4T1)、及びマウス腎がん細胞株(Renca)の10種のがん細胞株をそれぞれ3×103細胞/ウェルで播種し、細胞を1MOI(1pfu/細胞)でWOTS-418で処理した。72時間培養後、CCK8キット(Cell Counting Kit8)を用いて細胞毒性を分析した。ここで、ヒト肺がん細胞株(A549)及びマウス乳がん細胞株(4T1)は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手した。また、Korea Cell Line Bank(KCLB)から、ヒト腎がん細胞株(A498)、ヒト大腸がん細胞株(HT-29、HCT-116)、ヒト肺がん細胞株(NCI-H460)、ヒト乳がん細胞株(MDA-MB-231、MCF)及びマウス腎がん細胞株(Renca)を入手した。
実施例1.3で作製したWOTS-418のがん細胞に対する細胞毒性を確認するために、96ウェルプレートに、ヒト肺がん細胞株(A549、NCI-H460)、ヒト腎がん細胞株(A498、Caki-1)、ヒト大腸がん細胞株(HT-29、HCT116)、ヒト乳がん細胞株(MDA-MB-231、MCF)、マウス乳がん細胞株(4T1)、及びマウス腎がん細胞株(Renca)の10種のがん細胞株をそれぞれ3×103細胞/ウェルで播種し、細胞を1MOI(1pfu/細胞)でWOTS-418で処理した。72時間培養後、CCK8キット(Cell Counting Kit8)を用いて細胞毒性を分析した。ここで、ヒト肺がん細胞株(A549)及びマウス乳がん細胞株(4T1)は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手した。また、Korea Cell Line Bank(KCLB)から、ヒト腎がん細胞株(A498)、ヒト大腸がん細胞株(HT-29、HCT-116)、ヒト肺がん細胞株(NCI-H460)、ヒト乳がん細胞株(MDA-MB-231、MCF)及びマウス腎がん細胞株(Renca)を入手した。
その結果、ヒト肺がん細胞株(A549)、ヒト腎がん細胞株(A498、Caki-1)、ヒト大腸がん細胞株(HT-29、HCT-116)及びヒト乳がん細胞株(MDA-MB-231、MCF)で60%以上の細胞毒性が観察された(図24)。
実施例7.ACV、GCV又はBrdU投与後の変異ワクシニアウイルス(WOTS-418)の増殖能低下の確認(in vitro)
実施例1.3で作製したWOTS-418の増殖能を、GCVの投与に際して確認した。WOTS-418をGCV処理した後のウイルス粒子数の違いを調べるために、E9L遺伝子を用いて定量PCR解析(qPCR)を行った。
実施例1.3で作製したWOTS-418の増殖能を、GCVの投与に際して確認した。WOTS-418をGCV処理した後のウイルス粒子数の違いを調べるために、E9L遺伝子を用いて定量PCR解析(qPCR)を行った。
具体的には、DNAの2つの相補鎖のうちの1つのみに結合しながら、E9L遺伝子を認識するプローブを調製した。調製したプローブは、ウイルス増殖が起こるたびに1回の発光を測定するものであった。A549がん細胞株を1×104細胞/ウェルで播種し、次いで0.1MOI(0.1pfu/細胞)でWOTS-418に感染させた。2時間後、200μM又は300μMの濃度のACV、GCV又はBrdUでの共処理を行った。48時間培養後、ウイルス抽出キットを用いてDNAを抽出した。抽出したDNAを1ng/5μlの濃度に希釈し、qPCRに供した。
その結果、WOTS-418では、ACV、GCV又はBrdUの共投与後にウイルス増殖が著しく阻害されたことが確認された(図25)。
さらに、NCI-H460がん細胞株を1.5×104細胞/ウェルで播種し、次いで、0.1MOI(0.1pfu/細胞)でWOTS-418に感染させた。2時間後、100μMの濃度のGCVで共処理を行った。48時間培養後、ウイルス抽出キットを用いてDNAを抽出した。抽出したDNAを1ng/5μlの濃度に希釈し、qPCRに供した。
その結果、WOTS-418について、WOTS-418とGCVとの共投与後にウイルス増殖が顕著に抑制されることが確認された(図26)。これらの結果から、WOTS-418はACV、GCV及びBrdUに対して感受性を有し、ACV、GCV又はBrdUの投与により増殖能の低下を示すことが確認された。
実施例8.GCV投与後の変異ワクシニアウイルス(WOTS-418)の増殖能低下の確認(in vitro)
WOTS-418の増殖能を、ヒト大腸がん細胞株(HCT-116、5×106細胞/ml)を移植したマウス(Balb/c nu/nu)モデルにおけるqPCR解析によって確認した。
WOTS-418の増殖能を、ヒト大腸がん細胞株(HCT-116、5×106細胞/ml)を移植したマウス(Balb/c nu/nu)モデルにおけるqPCR解析によって確認した。
具体的には、KOATECH(韓国)から購入したマウス(balb/c nu/nu)を1週間の馴化期間に供した後、ヒト大腸がん細胞株であるHCT-116がん細胞株(Korea Cell Line Bank)を5×106個の細胞で異種移植した。腫よう体積を100mm3~150mm3になるまで観察し、次いで、WOTS-418とGCVを腫瘍内に共投与した。ここで、WOTS-418(1×106pfu)を腹腔内投与した。4日後から、GCV(50mg/kg)を1日1回、3日間投与した(D5、D6、D7)。5日目から、各群3匹のマウスを屠殺し、腫瘍を分離した。分離した腫瘍を、サンプル均質化システム(OMNI Bead Ruptor24)を用いてホモジナイズし、次いで、qPCRによってウイルス粒子の数を定量した。
その結果、GCV処理によるウイルス増殖抑制は、3日目から起こることが確認された(図27)。
実施例9.変異ワクシニアウイルス(WOTS-418)の細胞毒性の確認(in vitro)
WOTS-418が実施例7及び8においてGCVによる増殖抑制を示したが、このウイルスがGCVの投与により細胞毒性を維持するかどうかを確認するために、WOTS-418及びGCVの共処理を行い、細胞毒性を比較した。具体的には、NCI-H460がん細胞株を1.5×104細胞/ウェルで播種した。次いで、細胞を0.02MOI(0.02pfu/細胞)でWOTS-418に感染させた。2時間後、60μM又は100μMの濃度のGCVで共処理を行った。72時間培養後、CCK8キット(Cell Counting Kit8)を用いて細胞毒性を分析した。
WOTS-418が実施例7及び8においてGCVによる増殖抑制を示したが、このウイルスがGCVの投与により細胞毒性を維持するかどうかを確認するために、WOTS-418及びGCVの共処理を行い、細胞毒性を比較した。具体的には、NCI-H460がん細胞株を1.5×104細胞/ウェルで播種した。次いで、細胞を0.02MOI(0.02pfu/細胞)でWOTS-418に感染させた。2時間後、60μM又は100μMの濃度のGCVで共処理を行った。72時間培養後、CCK8キット(Cell Counting Kit8)を用いて細胞毒性を分析した。
その結果、WOTS-418とGCVとを共処理した場合、NCI-H460がん細胞株は、GCVによるWOTS-418でのウイルス増殖抑制にもかかわらず、さらに約30%以上も多く殺傷された(図28)。これらの結果から,WOTS-418とGCVとを共投与した場合、WOTS-418の細胞毒性が増加することが確認された。
実施例10.変異ワクシニアウイルス(OTS-418)の細胞毒性の確認(in vitro)
GCV投与時のOTS-418の細胞毒性を確認するために、OTS-418とGCVの共処理を行い、細胞毒性を比較した。具体的には、NCI-H460がん細胞株を3×103細胞/ウェルで播種した。次いで、0.02MOI(0.02pfu/細胞)で細胞をOTS-418に感染させた。2時間後、6μM又は60μMの濃度のGCVとの共処理を行った。72時間培養後、CCK8キット(Cell Counting Kit8)を用いて細胞毒性を分析した。
GCV投与時のOTS-418の細胞毒性を確認するために、OTS-418とGCVの共処理を行い、細胞毒性を比較した。具体的には、NCI-H460がん細胞株を3×103細胞/ウェルで播種した。次いで、0.02MOI(0.02pfu/細胞)で細胞をOTS-418に感染させた。2時間後、6μM又は60μMの濃度のGCVとの共処理を行った。72時間培養後、CCK8キット(Cell Counting Kit8)を用いて細胞毒性を分析した。
その結果、OTS-418とGCVとを共処理した場合、GCVによりOTS-418の細胞毒性が増大することが確認された。特に、OTS-418と60μMの濃度のGCVとを共処理した場合には、NCI-H460がん細胞株はさらに約20%以上も多く殺傷された(図29)。これらの結果から,OTS-418とGCVとを共投与した場合に細胞毒性が増加することが確認された。
実施例11.ヒト乳がん細胞株移植マウス:MDA-MB-231における組換えワクシニアウイルス(WOTS-418)及びヒドロキシ尿素の抗がん効果の確認
ORIENT BIO(Busan、韓国)から購入したBalb/c nu/nuマウス(雌、8週齢)を1週間の順化馴化期間に供した後、ヒト乳がん細胞株(MDA-MB-231)を5×106細胞で異種移植した。腫瘍体積が50mm3になるまで観察し、薬剤投与を開始した。31日後、腫瘍体積を測定した。
ORIENT BIO(Busan、韓国)から購入したBalb/c nu/nuマウス(雌、8週齢)を1週間の順化馴化期間に供した後、ヒト乳がん細胞株(MDA-MB-231)を5×106細胞で異種移植した。腫瘍体積が50mm3になるまで観察し、薬剤投与を開始した。31日後、腫瘍体積を測定した。
作製したヒト乳がん細胞株移植マウスを4群(n=5)に分けた。生理食塩水を腹腔内投与した群を対照群とし,ヒドロキシ尿素(HU、30mg/kg)を投与した群、WOTS-418(1×107pfu)を投与した群、及び、WOTS-418とHUの両方を投与した群を実験群とした。WOTS-418を計2回、0日目に腹腔内投与し、10日目に腫瘍内投与した(D0,D10)。ヒドロキシ尿素を1日2回毎日(6回/週)腹腔内投与した(図30)。
腫瘍体積を31日間測定した。その結果、対照群では、腫瘍体積がゆっくりと増加し、17日目以降に劇的に増加し、31日目の腫瘍体積が最初の腫瘍体積より6倍以上大きくなった。また、HU投与群のマウスでは腫瘍体積が徐々に増加し、31日目の腫瘍体積が最初の腫瘍体積の5倍以上に増加した。
一方、WOTS-418を投与した実験群のマウスの腫瘍体積については、14日目から腫瘍の成長が抑制され、31日目まで腫瘍は変化しなかった。また、WOTS-418及びヒドロキシ尿素を投与した実験群のマウスにおける腫瘍体積について、17日目から腫瘍の成長が抑制され、腫瘍体積の減少傾向が認められた(図31)。
これらの結果から、WOTS-418は腫瘍成長を抑制する効果があることが見出され、ヒドロキシ尿素単独で処理した場合には腫瘍成長は抑制されなかったが、WOTS-418とヒドロキシ尿素を共投与した場合には、WOTS-418又はヒドロキシ尿素単独で処理した場合と比較して、抗がん効果が向上することが確認された。
実施例12.マウス腎がん細胞株移植マウス:Rencaにおける組換えワクシニアウイルス(WOTS-418)及びヒドロキシ尿素の抗がん効果の確認
ORIENT BIO(Busan、韓国)から購入したBalb/c nu/nuマウス(雌、8週齢)を1週間の馴化期間に供した後、マウス腎がん細胞株(Renca、Korea Cell Line Bank)と同種移植した。腫瘍体積が100mm3になるまで観察し、薬剤投与を開始した。28日後、腫瘍体積を測定した。
ORIENT BIO(Busan、韓国)から購入したBalb/c nu/nuマウス(雌、8週齢)を1週間の馴化期間に供した後、マウス腎がん細胞株(Renca、Korea Cell Line Bank)と同種移植した。腫瘍体積が100mm3になるまで観察し、薬剤投与を開始した。28日後、腫瘍体積を測定した。
作製したマウス腎がん細胞株移植マウスを3群(n=7)に分けた。生理食塩水を腹腔内投与した群を対照群とし、WOTS-418及びヒドロキシ尿素(1×106pfu、30mg/kg)を単回投与した群と、WOTS-418及びヒドロキシ尿素(1×106/1×107pfu、30mg/kg)を反復投与した群を実験群とした。WOTS-418を0日目及び14日目に腹腔内投与し、ヒドロキシ尿素を1日2回毎日(6回/週)腹腔内投与した。
その結果、WOTS-418及びヒドロキシ尿素を投与された実験群のマウスでは、対照群と比較して腫瘍体積が顕著に抑制されることが確認され、単回投与群と比較して、反復投与された群では腫瘍体積がさらに抑制されることが確認された。また、反復投与された群において、WOTS-418の2回目投与時の濃度が高いほど、抗がん効果が増強されることが確認された(図32)。
実施例13.マウス大腸がん細胞株移植マウス:CT-26における組換えワクシニアウイルス(WOTS-418)及びヒドロキシ尿素の抗がん効果の確認
実施例13.1.マウス大腸がん細胞移植マウスの作製と薬剤投与
ORIENT BIO(Busan、韓国)から購入したBalb/cマウス(雌、8週齢)を1週間の馴化期間に供した後、マウス大腸がん細胞株(CT-26、Korea Cell Line Bank)で同種移植した。腫瘍体積が100mm3になるまで観察し、薬剤投与を開始した。
実施例13.1.マウス大腸がん細胞移植マウスの作製と薬剤投与
ORIENT BIO(Busan、韓国)から購入したBalb/cマウス(雌、8週齢)を1週間の馴化期間に供した後、マウス大腸がん細胞株(CT-26、Korea Cell Line Bank)で同種移植した。腫瘍体積が100mm3になるまで観察し、薬剤投与を開始した。
作製したマウス大腸がん細胞移植マウスを4群(G1、G2、G3:n=15、及び、G4:n=14)に分けた。生理食塩水を腹腔内投与した群を対照群とし、ヒドロキシ尿素(30mg/kg)のみを腹腔内投与した群、WOTS-418のみを、2回腹腔内投与した群(1×108pfu、腹腔内(i.p.)、D0、D3)及び2回腫瘍内投与した群(1×107pfu、腫瘍内(i.t.)、D14、D21)、ならびにWOTS-418とヒドロキシ尿素を同じ用量及びレジメンで共投与した群を実験群とした。WOTS-418を0日目及び3日目に腹腔内投与した後、14日目及び21日目に腫瘍内投与し、ヒドロキシ尿素をウイルス投与直前から26日目まで1日1回毎日(週6回/週)腹腔内投与した(図33)。
25日目に腫瘍体積を測定し、マウスを屠殺した。次いで、免疫細胞をそれから単離し、インターフェロン-γアッセイに供した。
実施例13.2 腫瘍体積の変化の確認
実施例13.1において各群のマウスに薬剤投与を行い、25日目に腫瘍体積を測定した。その結果、WOTS-418のみを投与された実験群、ヒドロキシ尿素のみを投与された実験群、及びWOTS-418とヒドロキシ尿素を共投与された実験群のマウスは、対照群と比較して腫瘍体積が抑制されたことが確認された。特に、WOTS-418とヒドロキシ尿素を共投与した実験群のマウスで腫瘍体積が顕著に抑制されたことが確認された(図34)。
実施例13.1において各群のマウスに薬剤投与を行い、25日目に腫瘍体積を測定した。その結果、WOTS-418のみを投与された実験群、ヒドロキシ尿素のみを投与された実験群、及びWOTS-418とヒドロキシ尿素を共投与された実験群のマウスは、対照群と比較して腫瘍体積が抑制されたことが確認された。特に、WOTS-418とヒドロキシ尿素を共投与した実験群のマウスで腫瘍体積が顕著に抑制されたことが確認された(図34)。
実施例13.3 インターフェロンγアッセイ
実施例13.1の各群のマウスに薬剤投与を行った。次いで、免疫細胞をそれから単離し、インターフェロン-γアッセイに供した。
実施例13.1の各群のマウスに薬剤投与を行った。次いで、免疫細胞をそれから単離し、インターフェロン-γアッセイに供した。
特に、各群のマウスの脾臓内のCD8+T細胞を(Ly-2)MicroBeadsキット及び磁気活性化細胞選別(MACS)を用いて単離し、次いでCT-26細胞株(1×104細胞)と共培養した。IFN-γを分泌するCD8+T細胞をELISPOT(MABTECH、スウエーデン)実験に供し、スポットをスキャンし、LK Bioscience(Seoul、韓国)により計数した。
その結果、対照マウスの脾臓から単離されたCD8+T細胞と比較して、WOTS-418のみを投与された実験群、ヒドロキシ尿素のみを投与された実験群及びWOTS-418とヒドロキシ尿素を共投与された実験群のマウスの脾臓から単離されたCD8+T細胞において、IFN-γを分泌するCD8+T細胞が豊富であることが確認された。特に、WOTS-418とヒドロキシ尿素とを共投与した実験群のマウスでは、腫瘍体積が顕著に抑制されることが確認された(図35及び36)。
Claims (23)
- エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、腫瘍溶解性ウイルスであって、
前記エフェクタードメインは、配列番号1によって表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)に由来する、腫瘍溶解性ウイルス。 - 前記HSVが単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)である、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記ポリペプチドが、エフェクタードメインのC末端に連結された0~231アミノ酸の配列をさらに有する、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記ポリペプチドが、前記エフェクタードメインのC末端に連結された36、82、又は231アミノ酸の配列をさらに有する、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1、3、5、7、9、11又は13によって表されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号2、4、6、8、10、12、又は14によって表されるヌクレオチド配列である、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、又はポックスウイルスに由来する、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記腫瘍溶解性ウイルスがワクシニアウイルスに由来する、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 有効成分として請求項1~8のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含む、
がんを予防又は治療するための医薬組成物。 - 前記がんが、肺がん、大腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかである、請求項9に記載の医薬組成物。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス;ならびに
ガンシクロビル(GCV)又はアシクロビル(ACV)を、有効成分として含む、
がんを予防又は治療するための医薬組成物。 - 前記医薬組成物に含まれる前記腫瘍溶解性ウイルス及びGCV又はACVが、同時に又は逐次的に投与される、請求項11に記載の医薬組成物。
- GCV又はACVが0.1μg/kg/日~50mg/kg/日の用量で投与される、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記がんが、肺がん、大腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織がん、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかである、請求項11に記載の医薬組成物。
- 変異型HSV-TKをコードする遺伝子を含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを製造する方法であって、
i)ワクシニアウイルスからTK遺伝子を除去し、前記ワクシニアウイルスを野生型HSV-TK遺伝子と組換えさせる工程;及び
ii)宿主細胞においてブロモデオキシウリジン(BrdU)の存在下で前記組換えワクシニアウイルスの連続継代培養を行う工程、を含む方法。 - 前記野生型HSV-TK遺伝子が、配列番号16によって表されるヌクレオチド配列である、請求項15に記載の方法。
- 前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスがTK活性を有さず、GCV又はACVをリン酸化する、請求項15に記載の方法。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを投与する工程を含む、がんを治療する方法。
- がんの治療のための、請求項1~8のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスの使用。
- がんを治療するための医薬の製造のための、請求項1~8のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスの使用。
- 請求項11~14のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、がんを治療する方法。
- 請求項11~14のいずれか一項に記載の医薬組成物の、がんの治療のための使用。
- がんを治療するための医薬の製造のための、請求項11~14のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
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