JP2022536481A - Ｇａｔａ１遺伝子療法を使用するｄｂａの治療のための組成物および方法 - Google Patents

Ｇａｔａ１遺伝子療法を使用するｄｂａの治療のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本明細書において、ダイアモンド・ブラックファン貧血を治療するためのGATA-1遺伝子療法に関連する方法および組成物が記載される。TIFF2022536481000078.tif77159

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、2019年6月10日に出願された米国仮出願第62/859,369号の35 U.S.C.§119（e）に基づく恩典を主張する。
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号R1 DK103794およびR33 HL120791の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる配列表を含む。2020年6月3日に作成された該ASCIIコピーは、701039-094470WOPT＿SL.txtという名称であり、サイズは188,598バイトである。
技術分野
本明細書において記載される技術は、ダイアモンド・ブラックファン貧血を治療するためのGATA-1遺伝子療法の組成物および方法ならびにその使用に関する。
背景
ダイアモンド・ブラックファン貧血（DBA）は、遺伝性骨髄不全症候群（IBMFS）のまれな群の1つであり、赤血球不全、先天性異常の存在、および癌素質を特徴とする。DBAは、通常、小児では生後1年の間に診断される。DBAを有する小児では、体内の他の全細胞に酸素を運ぶ細胞である赤血球が十分に産生されない。DBAを有する小児では、赤血球になるであろう細胞の多くは、発達する前に死滅する。DBAはまた、遺伝性骨髄不全症候群であることに加えて、症例の50％超では、この症候群が小さいサブユニット関連リボソームタンパク質または大きいサブユニット関連リボソームタンパク質のいずれかのハプロ不全に起因すると思われることから、リボソーム病として分類される。
DBAは、他の造血系列に欠陥を伴わない、赤血球（赤芽）細胞およびそれらの前駆体の産生の特異的減少を特徴とする。過去10年間にわたって、リボソームタンパク質遺伝子RPS19における変異の解明、それに続く9つの他のリボソームタンパク質遺伝子における変異の発見は、DBAがリボソーム生合成の障害であるという仮説をもたらしてきた。ただし、これらの症例におけるあらゆるリボソームタンパク質遺伝子および他の候補遺伝子の系統的シーケンシングにもかかわらず、DBA症例の約50％は未だ同定されていない分子変異を有する。
GATA-1遺伝子は、X染色体上に位置し、赤血球の発達を調節する転写因子をコードする。近年、ダイアモンド・ブラックファン貧血（DBA）患者では、GATA-1に機能喪失変異が見出された。しかし、赤芽細胞におけるGATA-1増強を特異的に標的とする治療は現在利用できない。したがって、有効な治療を提供するためには、赤芽細胞のGATA-1機能障害を直接標的とする治療法が必要である。
概要
近年の試験は、ダイアモンド・ブラックファン貧血（DBA）では、赤芽細胞におけるGATA-1増強が治療効果を有し得ることを示している。ただし、GATA-1を含む治療用タンパク質の系列特異的発現をインビボで増加させることは、依然として困難である。既存の技術を用いてGATA1発現を増加させようとすると、細胞（例えば、HSC）内でそこでは対象にとって圧倒的に有害であるGATA1発現が必然的に増加し、いかなる可能な治療効果も打ち消された。
本明細書において記載されるように、本発明者らは、ダイアモンド・ブラックファン貧血を治療するための遺伝子治療法として、造血幹細胞ではなく初期赤芽球前駆細胞内でGATA1の系列特異的発現を特異的に増加させる組成物および方法を特定した。DBAは、他の造血系列に欠陥を伴わない、赤血球（赤芽）細胞およびそれらの前駆体の産生の特異的減少を特徴とする。
態様のいずれかの一局面では、造血エンハンサーエレメント（hematopoietic enhancer element）、およびHSC拘束性miRNA（HSC restricted miRNA）に対するmiRNA結合部位から選択される少なくとも1つの異種調節配列と、GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列とを含む核酸配列が、本明細書において記載される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸配列は、少なくとも1つの造血エンハンサーエレメントを含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、エンハンサーエレメントは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:38および/またはSEQ ID NO:39からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同性の配列を含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、エンハンサーエレメントは、Kellメタロエンドペプチダーゼ（KEL）、5’アミノレブリン酸シンターゼ2（ALAS2）およびグリコホリンA（GYPA）からなる群より選択される遺伝子のエンハンサーエレメントを含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸は、少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位を含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位は、miR10aT、miR125、miR155、miR130aT、miR142T、miR196bT、miR99、miR126miR126、miR181、miR193、miR223T、miR542およびlet7eに対するmiR結合部位からなる群より選択される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸は、少なくとも1つの造血エンハンサーエレメントと、少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位とを含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、(ii)少なくとも20ヌクレオチド酸（nucleotide acid）の配列、および/または(iii)1～25個の上流コドンuAUGを含む、異種5’UTR；および/または(b)造血エンハンサーミニ遺伝子を含む。
態様のいずれかの一局面では、(i)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、(ii)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または(iii)1～25個の上流コドンuAUGを含む5’UTRと、GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列とを含む核酸配列が、本明細書において記載される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、5’UTRは、Runt関連転写因子1（RUNX1）、LIMドメインオンリー2（LIM Domain Only 2）（LMO2）またはETSバリアント6（ETS Variant 6）（ETV6）からなる群より選択される遺伝子の5’UTRを含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸は、少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント、HSC拘束性miRNAに対するmiRNA結合部位、および/または造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）をさらに含む。
態様のいずれかの一局面では、造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）；GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列を含む核酸配列が、本明細書において記載される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、造血エンハンサーミニ遺伝子（mG1HEM）は、SEQ ID NO:13のヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同性の配列を含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸は、(i)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、(ii)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または(iii)1～25個の上流コドンuAUG；を含む、5’UTR；および/または
少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント；および/または
HSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位
をさらに含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸は、Runt関連転写因子1（RUNX1）、少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント、および/またはHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位からなる群より選択される遺伝子の5’UTRを含む5’UTRをさらに含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸配列は、(a)および(b)のエレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、プロモーターは、GATA1プロモーターではない。
局面のいずれかのいくつかの態様では、プロモーターは、伸長因子1-アルファ1（eEF1a1）のプロモーター配列を含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列は、ヒトGATA1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも60％の配列同一性を含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸配列は、GATA1ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された転写後調節エレメントを含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）を含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸配列は、配列内リボソーム進入部位をさらに含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、配列内リボソーム進入部位は、マーカー遺伝子に作動可能に連結され、マーカー遺伝子は、光学的に可視のタンパク質または酵素をコードする。
局面のいずれかのいくつかの態様では、配列は、SEQ ID NO:8、9および62から選択される配列を含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸配列はベクターである。
局面のいずれかのいくつかの態様では、ベクターは、プラスミド、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。
態様のいずれかの一局面では、核酸配列を含むレンチウイルス粒子が、本明細書において記載される。
態様のいずれかの一局面では、核酸配列または粒子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物が、本明細書において記載される。
態様のいずれかの一局面では、治療有効量の核酸配列、粒子または組成物を患者に投与する工程を含む、その必要がある対象においてダイアモンド・ブラックファン貧血を治療する方法が、本明細書において記載される。
態様のいずれかの一局面では、初期赤芽球前駆細胞を含む細胞集団を核酸配列、粒子または組成物と接触させる工程を含む、初期赤芽球前駆細胞特異的GATA1発現を回復させる方法が、本明細書において記載される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、初期赤芽球前駆細胞は、DBA関連遺伝子変異を含む。
態様のいずれかの一局面では、それを必要とする対象のダイアモンド・ブラックファン貧血の治療に使用するための、本明細書において記載される核酸配列、粒子または組成物が、本明細書において記載される。
ダイアモンド・ブラックファン貧血（DBA）の病因に関与する分子経路の概略図を示す。 DBA分子的損傷を伴うリボソームレベルの低下を示す。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図2C-1の続きの図である。 RP遺伝子変異（ここに示された患者に存在するRPS19、RPL5およびRPL35Aの変異）を有するDBA患者由来の造血幹細胞（HSPC）におけるGATA1発現レベルの低下を示す。 GATA1レンチウイルス形質導入によるDBA患者HSPCにおける赤芽球系列の関与および分化の救済（形態（図4B）、および最終分化のマーカー（図4C）によって評価した場合；底部）を示す。図4A：示された患者3例は、RPS19（患者2および3）およびRPL35A（患者1）に変異を有する。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 調節されたGATA1発現を可能にする、特許請求されるベクターの概略図を示す。内因性GATA1遺伝子座をpRRL.PPT.EFSベクターの上下に示す（安全性改変を伴う自己不活性化長末端反復エレメント［LTR］、およびウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメントを含む）。ベクターは、内因性GATA1プロモーターまたは短いEF1α（EFS）プロモーターのいずれかを含む。GATA1 cDNAは、発現を改善するためにコドン最適化されている。図5は、出現順にSEQ ID NO:67～69をそれぞれ開示している。 初代ヒト造血細胞における、特許請求されるGATA1ベクターの使用の概略図を示す。 造血幹細胞ではなく初期赤芽球前駆細胞を対象にGATA1の発達的に忠実な発現を達成するためのベクターの様々な組合せの概略図を示す。 ヒトGATA1のゲノムプロット、および2つのベクターの図を示す。図8Aは、ヒトGATA1の上流のクロマチンアクセシビリティを示す。図8Bは、造血幹細胞ではなく初期赤芽球前駆細胞においてGATA1の発達的に忠実な発現を達成するための2つのベクターを示す。 図8Aの説明を参照のこと。 造血幹細胞ではなく初期赤芽球前駆細胞を対象にGATA1の発達的に忠実な発現を達成するための対照ベクターを含む5つのベクターを示す。図9A：R18 EF-1α IRES GFP対照。図9B：R21 EF-1α IRES GFP miR126。図9C：R49 EF-1α 1ピークエンハンサーGFP。図9D：R50 3ピークエンハンサーGFP。図9E：エンハンサーおよびmiR126結合部位を有するGATA1ベクター。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 R18 EF-1α IRES GFP対照をトランスフェクトした細胞のFACS分析プロットを示す。インビトロ分化中のCD71およびCD235aの4日目、9日目および11日目。細胞が第1象限から第4象限に移動するにつれて、それらは赤芽球系列に成熟しつつある。 R21 EF-1α IRES GFPをトランスフェクトした細胞のFACS分析プロットを示す。 R21 EF-1α IRES GFP miR126をトランスフェクトした細胞のFACS分析プロットを示す。 R49 EF-1α 1ピークエンハンサーGFPをトランスフェクトした細胞のFACS分析プロットを示す。 R49 EF-1α 3ピークエンハンサーGFPをトランスフェクトした細胞のFACS分析プロットを示す。 R18 EF-1α IRES GFP対照、R21 EF-1α IRES GFP miR126、R49 EF-1α 1ピークエンハンサーGFP、R50 3ピークエンハンサーGFPをトランスフェクトした細胞のFACS分析プロットを示す。 図15-1の続きの図である。 ヒトGATAエンハンサーのR50 3ピークエンハンサーGFPが、CD34＋細胞ではなく赤芽球導入遺伝子発現を優先的に促進することを示す。 Ef1a-GFP、miR126、miR223T、1ピーク、3ピーク、1ピーク-miR126、1ピーク-miR223T、3ピーク-miR126および3ピーク-miR223TのHSC d4を使用したFACS分析プロットを示す。実験概要:D0:CD34＋細胞をSSII＋cc100＋TPOに解凍し、5％O2で培養する。D2:レンチウイルス感染、SSII＋cc100＋TPO中で一晩回復させる。HSC D3:分割培養-HSC条件で半分、RBC分化条件で半分。HSC D4およびD7:フローサイトメトリーによる分析。RBC D4:フローサイトメトリーによる分析（3～4日毎に継続）。 図17-1の続きの図である。 図17-2の続きの図である。 図17-3の続きの図である。 図17-4の続きの図である。 4日目（図18A）および7日目（図18B）のCD34＋CD38-CD45RA-CD90＋サブセットにおけるGFP発現を示す棒グラフを示す。 Ef1a-GFP、miR126、miR223T、1ピーク、3ピーク、1ピーク-miR126、1ピーク-miR223T、3ピーク-miR126および3ピーク-miR223TのRBC D4を使用したFACS分析プロットを示す。 図19-1の続きの図である。 図19-2の続きの図である。 RBC d4、CD71＋CD235＋のGFP発現を示す棒グラフを示す。 赤芽球サブセットにおけるGFPの％を示す。CD71-CD235-、CD71＋CD235-およびCD71＋CD235＋。 RBC対HSCの％GFP倍数増加を示す棒グラフを示す。Ef1a-GFP、miR126、miR223T、1ピーク、3ピーク、1ピーク-miR126、1ピーク-miR223T、3ピーク-miR126および3ピーク-miR223Tに関する結果が示されている。 RPS19ノックダウンが赤芽球分化を損なうことを示すFACs分析プロットを示す。実験概要:D0:細胞を第I相培地に解凍する。D2:shRNAレンチ＋/-GATA1発現構築物を用いてスピンフェクト（spinfect）する。D4:ピューロ（puro）選択を開始する。D6:ピューロを除去する。D7フロー分析。 GATA1過剰発現によって救済されたRPS19ノックダウンのFACs分析プロットを示す。 GATA1過剰発現によって救済されたRPS19ノックダウンのFACs分析プロットを示す。 EF1a-GFP、EF1a-GATA-IRES-GFP、1ピーク-GATA-GFP、3ピーク-GATA-GFPおよびHMD-GATA-GFPのCD235＋/CD235-レベルを示す棒グラフを示す。 DBAを治癒させるためのGATA1遺伝子療法ベクターの重要な特徴と実験検証の概要とを示す概略図を示す。 GATA1の発達的に調節された発現がインビトロでDBA表現型を救済することを示す。図28A：HSPCから網赤血球への降順でヒトGATA1の上流にアクセス可能なクロマチン（上）、および調節されたGATA1発現を達成するためのレンチウイルスベクターの概略図（下）。図28B：初代ヒトHSPCにおけるRPS19のshRNAノックダウンは、赤芽球発達を損ない、GATA1発現によって救済される。図28C：マウスG1E細胞の赤芽球分化は、調節されたGATA1発現によって達成される。図28D：HSCと比較した赤芽球前駆細胞におけるGFP比は、発達的に調節された発現を示す。 赤芽球分化中の外因性GATA1発現を示す。図29A：赤芽球前駆体を分化させると、最初にCD71が発現し、続いてCD235が発現し、最後に末期赤芽球分化中にCD71が失われる。図29B：4日目にCD71（濃い灰色）またはCD71およびCD235の両方（薄い灰色）を発現する赤芽球前駆細胞の割合は、GATA1ウイルスによる感染後の方が高い。図29C：CD71＋CD235＋細胞と比較したCD71-CD235＋細胞のGFP発現の比は、内因性GATA1発現を模倣する、末期赤芽球分化中のhG1Eからの発現の減少を明らかにする。 調節されたGATA1は、RPS19編集後に赤芽球ブロック（erythroid block）を救済する。図30A：CD235も発現するCD71＋細胞の割合は、GATA1感染後の方が高い。図30B：調節されたGATA1は、赤芽球コロニー形成を促進する。
詳細な説明
本明細書において記載されるように、ダイアモンド・ブラックファン貧血（DBA）では、赤芽細胞におけるGATA-1増強が治療効果を有し得る。ただし、赤芽細胞内のGATA-1発現を増加させる既存の方法は、他の細胞型、例えば、造血幹細胞内の発現も必然的に増加させる。これらのオフターゲット効果は、有害な副作用をもたらす可能性があり、対象に実際の治療を提供するためには回避されなければならない。とはいえ、GATA-1を含む治療用タンパク質の系列特異的発現をインビボで増加させることは困難であることが証明されており、未だ成功していない。
本明細書において記載されるように、本発明者らは、初期赤芽球前駆細胞特異的GATA1発現を回復させ、それによって、DBAのための治療法を可能にすることができる調節配列を含む核酸配列を同定した。要約すると、本明細書において記載される方法は、DBAのための治療法として、造血幹細胞ではなく初期赤芽球前駆細胞内のGATA1の系列特異的発現を増加させるための組成物および方法に関する。さらに具体的には、限定されることなく、DBA関連遺伝子変異を含む細胞を含む初期赤芽球前駆細胞集団を本明細書において記載される核酸配列、粒子または組成物と接触させることによって、初期赤芽球前駆細胞特異的GATA1発現を回復させる方法が、本明細書において記載される。
DBAは、他の造血系列に欠陥を伴わない、赤血球（赤芽）細胞およびそれらの前駆体の産生の特異的減少を特徴とする。本明細書において記載されるように、限定されることなく、DBA患者のための広く適用可能な造血遺伝子療法手法を開発するための特定の遺伝子調節エレメントを有するベクターを含む核酸配列、粒子または組成物の治療有効量を投与する工程を含む、その必要がある対象においてダイアモンド・ブラックファン貧血を治療する方法が、本明細書において提供される。
さらに、初期赤芽球前駆細胞を含む細胞集団を本明細書において記載される核酸配列、粒子または組成物と接触させる工程を含む、初期赤芽球前駆細胞特異的GATA1発現を回復させる方法が、本明細書において提供される。
ダイアモンド・ブラックファン貧血（DBA）は、通常乳児期に発症する先天性赤芽球ろうである。DBAは、他の血液成分（血小板および白血球）に実質的に影響を及ぼすことなく、赤血球数の低下（貧血）を引き起こす。また、罹患個体の約47％は、頭蓋顔面奇形、親指または上肢の異常、心臓の欠陥、泌尿生殖器奇形、および口蓋裂を含む様々な先天性異常を有する。低出生体重、および全身の成長遅延が時折認められる。DBA患者は、白血病および他の悪性腫瘍を発症する中程度のリスクを有する。
DBAは、他の造血系列に欠陥を伴わない、赤血球（赤芽）細胞およびそれらの前駆体の産生の特異的減少を特徴とする。50％を超える症例では、DBAは、RPL5遺伝子、RPL11遺伝子、RPL35A遺伝子、RPS10遺伝子、RPS17遺伝子、RPS19遺伝子、RPS24遺伝子およびRPS26遺伝子を含む、リボソームタンパク質をコードする11個の遺伝子のうちの1つのヘテロ接合機能喪失変異（ハプロ不全）によって引き起こされる。ダイアモンド・ブラックファン貧血に関連するこれらおよび他の遺伝子は、リボソームタンパク質を作製するための説明書を提供する。ダイアモンド・ブラックファン貧血を有する個体の約25％は、RPS19遺伝子に変異を有する。この障害を有する個体の別の約25～約35％は、RPL5遺伝子、RPL11遺伝子、RPL35A遺伝子、RPS10遺伝子、RPS17遺伝子、RPS24遺伝子またはRPS26遺伝子に変異を有する。これらの遺伝子のいずれかの変異は、リボソーム機能に問題を引き起こすと考えられている。そのような遍在的に発現されるリボソームタンパク質の変異が、そのような特定のヒト障害をもたらすことは驚くべきことである。試験では、機能性リボソームの不足が骨髄内の血液形成細胞の自己破壊を増加させ、貧血をもたらし得ることが示されている。細胞分裂の異常な調節、またはアポトーシスの不適切な誘発は、ダイアモンド・ブラックファン貧血を有する一部の個体に影響を及ぼす他の健康問題の一因となり得る。これらの疾患の根底にある病因について多数の理論が提案されている。ただし、これらのモデルは、DBAおよび他のリボソーム障害の精緻な細胞型特異性を説明することができない。
リボソームタンパク質のハプロ不全は、先天性無脾およびTリンパ球性白血病を含む、ヒトの他の細胞型特異的疾患の一因となり得る。そのような遍在的に発現されるリボソームタンパク質の変異が、そのような特定のヒト障害をもたらすことは驚くべきことである。これらの疾患の根底にある病因について多数の理論が提案されている。ただし、これらのモデルは、DBAおよび他のリボソーム障害の精緻な細胞型特異性を説明することができない。
様々な態様では、初期赤芽球前駆細胞を含む細胞集団を本明細書において記載される核酸配列、粒子または組成物と接触させる工程を含む、初期赤芽球前駆細胞特異的GATA1発現を回復させる方法が、本明細書において記載される。さらに、本明細書において記載される核酸配列、粒子または組成物を使用して、DBAのための治療を必要とする患者に本明細書において記載される核酸配列、粒子または組成物の治療有効量を投与することによって、DBAを治療することができると考えられる。
本明細書において使用される場合、「GATA-1」、「GATA1」または「GATA結合タンパク質1」は、GATA1遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、転写因子のGATAファミリーのタンパク質である。該タンパク質は、成体ヘモグロビンへの胎児ヘモグロビンの切替えを調節することによって、赤芽球発達に重要な役割を果たす。GATA1遺伝子は、X染色体（Xp11.23）上に位置し、赤血球の発達を調節する転写因子をコードする。GATA-1の機能喪失変異は、DBAを含む造血障害に関連する。
GATA-1ポリペプチドは、3つの機能的ドメイン、すなわち、転写活性化活性に必須のN末端トランス活性化ドメイン（TD）と、N末端ジンクフィンガー（NF）と、DNAへの結合を担うC末端ジンクフィンガー（CF）とを有する。赤血球異形成貧血、血小板減少症、サラセミアおよび赤血球生成性ポルフィリン症を有する家族では、エクソン4変異が同定されている。関連する生殖系列変異も記載されている。DBAでは、GATA-1の機能喪失変異は、GATA-1遺伝子のエクソン2のドナースプライス部位で起こり、エクソンスキッピングを引き起こす。
GATA1の配列は、いくつかの種について公知であり、例えば、ヒトGATA1（GATA1 NCBI遺伝子IDは2623である）mRNA配列（例えば、NM＿002049.3、XM＿011543897.2、XM＿011543898.2およびXM＿024452363.1）およびポリペプチド配列（例えば、NP＿002040.1、XP＿011542199.1、XP＿011542200.1、XP＿024308131.1）が当技術分野において公知である。これらは、同じ反応を触媒する任意の天然の対立形質のスプライス変異体、およびそのプロセシングされた形態とともに、本明細書において記載される方法および組成物での使用のために企図される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1核酸は、以下の核酸配列CCDS14305.1（SEQ ID NO:1）を有するヒトGATA1を含むか、それに由来する。
Figure 2022536481000002
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1 mRNA配列は、以下の配列NM＿002049.3（SEQ ID NO:2）を有するヒトGATA1を含むか、それに由来する:
Figure 2022536481000003
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1 mRNA配列は、以下の配列XM＿011543898.2（SEQ ID NO:3）を有するヒトGATA1を含むか、それに由来する:
Figure 2022536481000004
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1 mRNA配列は、以下の配列XM＿024452363.1（SEQ ID NO:4）を有するヒトGATA1を含むか、それに由来する:
Figure 2022536481000005
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1 mRNA配列は、以下の配列XM＿011543897.2（SEQ ID NO:5）を有するヒトGATA1を含むか、それに由来する:
Figure 2022536481000006
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列NP＿002040.1（SEQ ID NO:6）を有するヒトGATA1を含むか、それに由来する:
Figure 2022536481000007
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列XP＿011542199.1（SEQ ID NO:7）を有するヒトGATA1を含むか、それに由来する:
Figure 2022536481000008
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列XP＿011542200.1（SEQ ID NO:64）を有するヒトGATA1を含むか、それに由来する:
Figure 2022536481000009
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列XP＿024308131.1（SEQ ID NO:65）を有するヒトGATA1を含むか、それに由来する:
Figure 2022536481000010
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列は、ヒトGATA1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも60％の配列同一性を含む。局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列は、ヒトGATA1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1ポリペプチドをコードする配列は、SEQ ID NO:1～5のいずれかから選択される核酸配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる。局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1ポリペプチドをコードする配列は、SEQ ID NO:1～5のうちの1つに対して少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる。局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1ポリペプチドをコードする配列は、GATA1野生型活性を保持する、例えば、本明細書において記載される転写因子活性を有するポリペプチドをコードする、SEQ ID NO:1～5のうちの1つに対して少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる。
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1ポリペプチドは、SEQ ID NO:6、7、64および/または65のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる。局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1ポリペプチドは、SEQ ID NO:6、7、64および/または65のうちの1つに対して少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる。局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1ポリペプチドは、GATA1野生型活性を保持する、例えば、本明細書において記載される転写因子活性を有する、SEQ ID NO:6、7、64および/または65のうちの1つに対して少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる。
造血幹細胞（HSC）は、他の血液細胞を生じさせる幹細胞である。このプロセスは造血と呼ばれる。このプロセスは、赤色骨髄、ほとんどの骨の中心部で起こる。胚発生では、赤色骨髄は、中胚葉と呼ばれる胚の層に由来する。造血は、あらゆる成熟血液細胞が産生されるプロセスである。それは、膨大な産生の必要性と、循環中の各血液細胞型の数を正確に調節する必要性とのバランスをとらなければならない。脊椎動物では、造血の大部分は骨髄で起こり、多分性かつ広範囲の自己再生が可能な限られた数のHSCに由来する。HSCは、成人の骨髄、特に骨盤、大腿骨および胸骨に見出される。それらはまた、臍帯血中、および少数ではあるが末梢血中に見出される。哺乳動物の造血は、約10の異なる細胞型を産生し、そのうちの最も豊富なものは赤芽球系列に属する。赤血球生成は、発達中の胚組織、胎児組織および成体組織への酸素の供給に関与する多数の赤血球の産生をもたらす。それらはまた、血液粘度を維持するのに役立ち、血管の発達およびリモデリングに必要な剪断応力を提供する。
本明細書において使用される場合、用語「造血幹細胞」または「HSC」は、B細胞、T細胞、NK細胞、リンパ系樹状細胞、骨髄樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、巨核球および赤芽細胞を含む、造血系のあらゆる細胞型に最終的に分化することができるクローン原性自己再生多能性細胞を指す。造血系の他の細胞と同様に、HSCは、細胞マーカーの特徴的なセットの存在によって定義され得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、HSCは、CD34、CD90またはそれらの組合せを発現する細胞であり得る。HSCを同定するために使用される他のマーカーシグネチャーには、限定されることなく、EMCN＋、CD34＋、CD59＋、CD90＋、CD117＋、CD133＋、CD38-、lin-、CD150＋、CD48-およびCD244-が含まれる。
DBA患者由来のHSCではGATA1タンパク質レベルは抑制され、それらの細胞内のGATA1発現を特異的に増加させることにより、DBAに特徴的な、赤芽球系列が関与する欠陥を改善することができる。末期赤血球生成中のGATA1の発現を調節する必要がある。
態様のいずれかの一局面では、(a)(i)造血エンハンサーエレメントおよび/または(ii)HSC拘束性miRNAに対する結合部位から選択される少なくとも1つの異種調節配列と、(b)GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列とを含む、核酸配列が、本明細書において記載される。
本明細書において開示される調節配列には、限定されることなく、それらが作動可能に連結されている遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。そのような調節配列は、例えば、Goeddel；Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.（1990）に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列の例には、哺乳動物細胞内の高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび/またはエンハンサーが挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーター、伸長因子1-アルファ1（eEF1a1）プロモーターまたはβ-グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列が使用され得る。真核生物プロモーターは、転写因子IID（TFIID）に結合し、転写開始複合体の成分のその後の配位を可能にし、RNAポリメラーゼIIの動員および転写の開始を促進する遺伝子の上流に位置するDNAの調節領域である。
局面のいずれかのいくつかの態様では、造血前駆細胞内のGATA1の慎重に調節された発現を可能にして、造血に対して望ましくない影響を及ぼすことなくDBAの赤血球生成を改善する異種調節配列またはその組合せが、本明細書において開示される。
本明細書において使用される場合、例えば、調節配列に関して使用される「HSC拘束性」は、造血系統の他の細胞（例えば、赤血球または赤芽球前駆体）と比較して、HSCに優先的に生じるか存在する活性またはエレメントである。局面のいずれかのいくつかの態様では、該活性またはエレメントは、造血系統の他の細胞（例えば、赤血球または赤芽球前駆体）内の少なくとも10倍、少なくとも100倍またはそれ以上のレベルで、HSC内に生じるか存在する。さらに具体的には、HSC拘束性miRNAは、造造血系統の他の細胞（例えば、赤血球または赤芽球前駆体）内よりも高い（例えば、10倍、100倍またはそれ以上）レベルでHSC内で発現されるmiRNAである。
用語「異種」は、天然に存在しないエレメントの組合せを指す。例えば、異種調節配列とは、考慮されているコード配列に作動可能に接続した状態で天然には見られないものである。局面のいずれかのいくつかの態様では、異種調節配列は、その種に天然には見られない調節配列であり得る。
本明細書において使用される場合、「調節配列」は、特定の遺伝子、核酸配列またはポリペプチドの発現を増加または減少させることができる核酸配列を指す。
局面のいずれかのいくつかの態様では、異種調節配列は、造血エンハンサーエレメントである。造血エンハンサーエレメントとは、造血細胞、例えば、HSCおよび/または赤芽球系列の他の細胞内で活性であるエンハンサーエレメントである。いくつかの態様では、造血エンハンサーエレメントは、赤血球生成を受けている細胞内で活性である。造血エンハンサーエレメントは、上記の細胞のいずれにおいても必ずしも排他的に活性ではない。あるいは、局面のいずれかのいくつかの態様では、造血エンハンサーエレメントは、HSC拘束性赤芽球前駆体/前駆細胞であり得、およびまたは赤芽球前駆体/前駆細胞に制限され得る。いくつかの態様では、エンハンサーエレメントは、GATA1をコードする配列の遠位に位置し、例えば、遠位エンハンサーエレメントである。好適なエンハンサーエレメントは、当業者によって、例えば、赤芽球系列の1つまたは複数の細胞型についてワールドワイドウェブ上で自由に利用可能な発現データを閲覧すること、およびそれらの細胞内で発現されるか高度に発現される遺伝子を同定することによって容易に同定され得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、異種エンハンサーエレメントは、以下の核酸配列を含む:
ホモサピエンスX染色体上のNC＿000023.11:48638900-48639300、GRCh38.p12一次アセンブリ（SEQ ID NO:10）:
Figure 2022536481000011
局面のいずれかのいくつかの態様では、異種エンハンサーエレメントは、以下の核酸配列を含む:ホモサピエンスX染色体上のNC＿000023.11:48641200-48641700、GRCh38.p12一次アセンブリ（SEQ ID NO:11）:
Figure 2022536481000012
局面のいずれかのいくつかの態様では、異種エンハンサーエレメントは、以下の核酸配列を含む:
ホモサピエンスX染色体上のNC＿000023.11:48644250-48645100、GRCh38.p12一次アセンブリ（SEQ ID NO:12）:
Figure 2022536481000013
局面のいずれかのいくつかの態様では、異種エンハンサーエレメントは、以下の核酸配列（SEQ ID NO:38）を含む:
Figure 2022536481000014
局面のいずれかのいくつかの態様では、異種エンハンサーエレメントは、以下の核酸配列（SEQ ID NO:39）を含む:
Figure 2022536481000015
局面のいずれかのいくつかの態様では、造血エンハンサーエレメントは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:38および/またはSEQ ID NO:39からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同性の配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる。局面のいずれかのいくつかの態様では、造血エンハンサーエレメントは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:38および/またはSEQ ID NO:39のうちの1つに対して少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる。いずれかの局面のいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸配列は、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも13、または少なくとも14、または少なくとも15、または少なくとも16、または少なくとも17、または少なくとも20、または少なくとも25、または少なくとも30の造血エンハンサーエレメントを含む。3つの前述の造血エンハンサーエレメントのサブセットが使用される場合、造血エンハンサーエレメントの任意の組合せが、本明細書において記載される局面の様々な態様の各々において使用され得る。例えば、本明細書において、3つの造血エンハンサーエレメントの任意の対の組合せ、例えば、表1に示される任意の組合せを使用することができることが具体的に企図される。
（表１）
エンハンサーエレメントの企図される例示的な組合せを「X」によって示す。
Figure 2022536481000016
局面のいずれかのいくつかの態様では、造血エンハンサーエレメントは、Kellメタロエンドペプチダーゼ（KEL）、5’-アミノレブリン酸シンターゼ2（ALAS2）、グリコホリンA（GYPA）からなる群より選択される遺伝子のエンハンサーエレメントであり得る。
本明細書において使用される場合、「KEL」、「ECE3」；「CD238」または「Kellメタロエンドペプチダーゼ」は、高度に多型性のKell血液型抗原であるII型膜貫通糖タンパク質である。KELの配列は、いくつかの種について公知であり、例えば、ヒトKEL（KEL NCBI遺伝子IDは3792である）、核酸配列（例えば、NG＿007492.2）、mRNA配列（例えば、NM＿000420.3）およびポリペプチド配列（例えば、NP＿000411.1）が当技術分野において公知である。これらは、同じ反応を触媒する任意の天然の対立形質のスプライス変異体、およびそのプロセシングされた形態とともに、本明細書において記載される方法および組成物での使用のために企図される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、KELエンハンサーエレメントは、以下の核酸配列NG＿007492.2（SEQ ID NO:40）を有するヒトKEL配列を含むか、それに由来する:
Figure 2022536481000017
Figure 2022536481000018
Figure 2022536481000019
Figure 2022536481000020
Figure 2022536481000021
Figure 2022536481000022
Figure 2022536481000023
Figure 2022536481000024
本明細書において使用される場合、「ALAS2」、「ASB」；「ANH1」または「5’-アミノレブリン酸シンターゼ2」は、赤芽球特異的ミトコンドリアに位置する酵素である。ALAS2の配列は、いくつかの種について公知であり、例えば、ヒトALAS2（ALAS2 NCBI遺伝子IDは212である）、核酸配列（例えば、NG＿008983.1）、mRNA配列（例えば、NM＿001037967.3）およびポリペプチド配列（例えば、NP＿001033056.1）が当技術分野において公知である。これらは、同じ反応を触媒する任意の天然の対立形質のスプライス変異体、およびそのプロセシングされた形態とともに、本明細書において記載される方法および組成物での使用のために企図される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、ALAS2エンハンサーエレメントは、以下の核酸配列NG＿008983.1（SEQ ID NO:41）を有するヒトALAS2配列を含むか、それに由来する:
Figure 2022536481000025
Figure 2022536481000026
Figure 2022536481000027
Figure 2022536481000028
Figure 2022536481000029
Figure 2022536481000030
Figure 2022536481000031
Figure 2022536481000032
本明細書において使用される場合、「GYPA」、「GPA」；「MN」または「グリコホリンA」は、MN血液型およびSs血液型に対する抗原決定基を有するヒト赤血球膜のシアロ糖タンパク質である。いくつかの種について配列が公知であり、例えば、ヒトGYPA（GYPA NCBI遺伝子IDは2993である）、核酸配列（例えば、NG＿007470.3）、mRNA配列（例えば、NM＿001308190.1）およびポリペプチド配列（例えば、NP＿001295119.1）が当技術分野において公知である。これらは、同じ反応を触媒する任意の天然の対立形質のスプライス変異体、およびそのプロセシングされた形態とともに、本明細書において記載される方法および組成物での使用のために企図される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、GYPAエンハンサーエレメントは、以下の核酸配列NG＿007470.3（SEQ ID NO:42）を有するヒトGYPA配列を含むか、それに由来する:
Figure 2022536481000033
Figure 2022536481000034
Figure 2022536481000035
Figure 2022536481000036
Figure 2022536481000037
Figure 2022536481000038
Figure 2022536481000039
Figure 2022536481000040
Figure 2022536481000041
Figure 2022536481000042
Figure 2022536481000043
Figure 2022536481000044
本明細書において記載される核酸に使用されるエンハンサーエレメントは、エンハンサーエレメント配列の単一インスタンス、または1つもしくは複数の個々の固有のエンハンサーエレメント配列の連結もしくは反復であり得る。連結および反復は、単一配列の2、3、4、5個もしくはそれ以上のインスタンス、または2、3、4、5個もしくはそれ以上の区別可能なエンハンサーエレメント配列（例えば、1つの遺伝子からの異なるエレメント、または異なる遺伝子からの異なるエレメント）の集合を含み得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、造血エンハンサーエレメントは、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも約5kb、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも約5kb、少なくとも約6kb、少なくとも約7kb、少なくとも約8kb、少なくとも約9kb、少なくとも約10kbまたはそれ以上に位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、造血エンハンサーエレメント配列は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも5kb、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも5kb、少なくとも6kb、少なくとも7kb、少なくとも8kb、少なくとも9kb、少なくとも10kbまたはそれ以上に位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、造血エンハンサーエレメント配列は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から約5kbに、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から約5kbに、約6kbに、約7kbに、約8kbに、約9kbに、または約10kbに位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、造血エンハンサーエレメント配列は、遺伝子間配列にあり得るか、介在遺伝子の配列にあり得る。本明細書において記載される局面のいずれかのいくつかの態様では、標的配列は、オープンリーディングフレームの末端から約500bp～約10kb、例えば、オープンリーディングフレームから約1kb～約9kb、約2kb～約8kb、約3kb～約7kbまたは約4kb～約6kbの配列内で同定され得る。本明細書において記載される局面のいずれかのいくつかの態様では、造血エンハンサーエレメント配列は、オープンリーディングフレームの末端から500bp～10kb、例えば、オープンリーディングフレームから1kb～9kb、2kb～8kb、3kb～7kbまたは4kb～6kbの配列内に位置し得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、異種調節配列は、GATA1造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）である。G1HEMは、例えば、ダイアモンド・ブラックファン貧血の治療のための遺伝子治療法として、造血幹細胞ではなく初期赤芽球前駆細胞内でGATA1の系列特異的発現を特異的に可能にすることができる。GATA1造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）は、初期赤芽球前駆細胞内のGATA1の系列特異的発現を特異的に達成するための4つの異なる調節エレメントの連結を含む。本明細書において開示されるG1HEMエレメントは、-3kb造血エンハンサーと、上流二重GATAモチーフと、上流CACCCボックスと、GATA1の第1のイントロンのセグメントとを含む。実際、このミニ遺伝子に存在する979個のヌクレオチドは、Gata1ノックアウトマウスを救済し、一見正常な赤血球生成を可能にするようにGata1 cDNAを適切に促進するのに十分である。
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）は、以下の核酸配列（SEQ ID NO:13）を含む:
Figure 2022536481000045
局面のいずれかのいくつかの態様では、SEQ ID NO:13に対して少なくとも80％相同性の配列を含むか、それからなるか、それから本質的になるGATA1造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）が、本明細書において記載される。局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）は、SEQ ID NO:13に対して少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる。
局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸配列は、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも13、または少なくとも14、または少なくとも15、または少なくとも16、または少なくとも17、または少なくとも20、または少なくとも25、または少なくとも30のGATA1造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）を含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1造血エンハンサーミニ遺伝子は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも約5kb、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも約5kb、少なくとも約6kb、少なくとも約7kb、少なくとも約8kb、少なくとも約9kb、少なくとも約10kbまたはそれ以上に位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1造血エンハンサーミニ遺伝子配列は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも5kb、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも5kb、少なくとも6kb、少なくとも7kb、少なくとも8kb、少なくとも9kb、少なくとも10kbまたはそれ以上に位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1造血エンハンサーミニ遺伝子は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から約5kbに、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から約5kbに、約6kbに、約7kbに、約8kbに、約9kbに、または約10kbに位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1造血エンハンサーミニ遺伝子配列は、遺伝子間配列にあり得るか、介在遺伝子の配列にあり得る。本明細書において記載される局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1造血エンハンサーミニ遺伝子配列は、オープンリーディングフレームの末端から約500bp～約10kb、例えば、オープンリーディングフレームから約1kb～約9kb、約2kb～約8kb、約3kb～約7kbまたは約4kb～約6kbに位置し得る。本明細書において記載される局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1造血エンハンサーミニ遺伝子配列は、オープンリーディングフレームの末端から500bp～10kb、例えば、オープンリーディングフレームから1kb～9kb、2kb～8kb、3kb～7kbまたは4kb～6kbに位置する。
局面のいずれかのいくつかの態様では、造血前駆細胞内のGATA1の調節された発現を可能にして、造血に対して望ましくない影響を及ぼすことなくDBAの赤血球生成を改善する、HSC拘束性miRNAに対する結合部位が、本明細書において開示される。
HSC拘束性miRNAの非限定的な例には、miR10aT、miR125、miR155、miR130aT、miR142T、miR196bT、miR99、miR126、miR181、miR193、miR223T、miR542およびlet7eが挙げられる。これらのmiRNAの配列は、いくつかの種、例えば、ヒトのmiR10aT、miR125、miR155、miR130aT、miR142T、miR196bT、miR99、miR126miR126、miR181、miR193、miR223T、miR542およびlet7eについて当技術分野において公知である。
これらのmiRNAの各々に対する結合部位は、当技術分野において同様に公知であり、miRBase、miRDBおよび/またはTargetScanに対して容易に利用可能である結合部位を含む。要約すると、動物のmiRNA結合部位は、miRNAの配列の少なくとも「シード領域」（6～8nt長）に相補的である。本明細書において記載される、miRNAの各々に対するシード領域は、例えば、本明細書において表2で提供されるTargetScanおよびSEQ ID NO:43～55で公的に入手可能である。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される所与のmiRNAに対する結合部位は、そのmiRNAのシード領域に相補的な配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる配列であり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸配列は、単一のHSC拘束性miRNAのシード領域に相補的な配列の2回、3回、4回またはそれ以上の反復を含むことができる。そのような配列は、個々の配列の反復および/または直列の異なる配列の組合せを含むことができる。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される2つ以上のmiRNAに対する結合部位は、それらのmiRNAのシード領域に相補的な配列を含むか、それらからなるか、それらから本質的になる配列であり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される2つ以上のmiRNAに対する結合部位は、それらのmiRNAのシード領域に相補的な配列の2回、3回、4回またはそれ以上の反復を有する配列を含むか、それらからなるか、それらから本質的になる配列であり得る。そのような配列は、個々の配列の反復および/または直列の異なる配列の組合せを含むことができる。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される1つまたは複数のmiRNAに対する結合部位は、SEQ ID NO:31～37から選択される単数または複数の配列を含むか、それらからなるか、それらから本質的になる配列であり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される1つまたは複数のmiRNAに対する結合部位は、SEQ ID NO:31～37から選択される2つ、3つ、4つまたはそれ以上の配列を有する配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる配列であり得る。そのような配列は、個々の配列の反復および/または直列の異なる配列の組合せを含むことができる。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸配列は、SEQ ID NO:31～37から選択される配列の4回の反復を含むか、それらからなるか、それらから本質的になる配列を含み得る。
（表２）HSC拘束性miRNA名、miRBaseアクセッション番号、ヌクレオチド配列、例示的なシード領域、およびmiRNA結合部位の例示的なヌクレオチド配列の非限定的な例
Figure 2022536481000046
Figure 2022536481000047
態様のいずれかの一局面では、miR10aT、miR125、miR155、miR130aT、miR142T、miR196bT、miR99、miR126、miR181、miR193、miR223T、miR542およびlet7eに対するmiR結合部位からなる群より選択される、少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位を含む核酸配列が、本明細書において記載される。態様のいずれかの一局面では、miR10aT、miR125、miR155、miR130aT、miR142T、miR196bT、miR99、miR126、miR181、miR193、miR223T、miR542およびlet7eに対するmiR結合部位からなる群より選択される、少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも8つ、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12の結合部位を含む核酸配列が、本明細書において記載される。前述のmiRNAに対するmiRNA結合部位のサブセットが使用される場合、miRNA結合部位の任意の組合せが、本明細書において記載される局面の様々な態様の各々において使用され得る。例えば、本明細書において、12のmiRNAに対する結合部位の任意の対の組合せ、例えば、表3に示される任意の組合せを使用することができることが具体的に企図される。
態様のいずれかの一局面では、少なくとも1つの造血エンハンサーエレメントと、少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくともmiRNA結合部位とを含む核酸配列が、本明細書において記載される。態様のいずれかの一局面では、少なくとも1つの造血エンハンサーエレメントと、少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つの結合部位とを含む核酸配列、およびGATA1ポリペプチドをコードする配列が、本明細書において記載される。
（表３）
miRNA結合部位の企図される例示的な組合せを「X」によって示す。
Figure 2022536481000048
Figure 2022536481000049
局面のいずれかのいくつかの態様では、miRNA結合部位は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも約5kb、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも約5kb、少なくとも約6kb、少なくとも約7kb、少なくとも約8kb、少なくとも約9kb、少なくとも約10kbまたはそれ以上に位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、miRNA結合部位配列は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも5kb、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも5kb、少なくとも6kb、少なくとも7kb、少なくとも8kb、少なくとも9kb、少なくとも10kbまたはそれ以上に位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、miRNA結合部位配列は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から約5kbに、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から約5kbに、約6kbに、約7kbに、約8kbに、約9kbに、または約10kbに位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、miRNA結合部位配列は、遺伝子間配列にあり得るか、介在遺伝子の配列にあり得る。本明細書において記載される局面のいずれかのいくつかの態様では、オープンリーディングフレームの末端から約500bp～約10kb、例えば、オープンリーディングフレームから約1kb～約9kb、約2kb～約8kb、約3kb～約7kbまたは約4kb～約6kbの配列内に位置する標的配列。本明細書において記載される局面のいずれかのいくつかの態様では、miRNA結合部位配列は、オープンリーディングフレームの末端から約500bp～約10kb、例えば、オープンリーディングフレームから1kb～9kb、2kb～8kb、3kb～7kbまたは4kb～6kbに位置する。
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1ポリペプチドをコードする配列と、異種5’UTRとを含む核酸配列が、本明細書において開示される。このような組合せは、初期赤芽球前駆細胞内のGATA1の系列特異的発現を特異的に可能にする。
遺伝子発現のキャップ分析を使用して、赤芽球分化における機能的欠陥が生じる段階である、赤芽球系列の関与を受けているHSPC内の転写産物の5’非翻訳領域（UTR）を定義した。ベースラインで最も高度に翻訳され、短く、かつ構造化されていない5’UTRを有した転写産物は、RPハプロ不全の状況では、翻訳レベルでダウンレギュレートされた転写産物である傾向がある。5’UTRまたは「5’非翻訳領域」または5’リーダー配列とは、翻訳されないmRNAの領域を指す。あらゆる造血マスター転写産物因子（hematopoietic master transcript factor）の中でGATA1のみが短い5’UTRを有し、この5’UTRを他の転写産物因子（限定されることなく、RUNX1、LMO2またはETV6を含む）の5’UTRに置き換えるとGATA1造血転写因子の翻訳が変化するという発見が、本明細書において記載される。
態様のいずれかの一局面では、(i)(a)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、(b)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または(c)1～25個の上流コドンuAUGを含む異種5’UTRと、(ii)GATA1ポリペプチドをコードする核酸配列とを含む核酸配列が、本明細書において記載される。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸配列は、(a)(a)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、(b)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または(c)1～25個の上流コドンuAUGを含む異種5’UTRをさらに含むことができる。
5’UTRの長さは、変異、例えば、5’UTRの置換、欠失または挿入によって改変され得る。5’UTRは、天然に存在する開始コドンまたは翻訳開始部位を、そのコドンがもはや開始コドンとして機能せず、翻訳が代替の開始部位で開始し得るように変異させることによってさらに改変され得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列は、Runt関連転写因子1（RUNX1）、LIMドメインオンリー2（LMO2）およびETSバリアント6（ETV6）からなる群より選択される遺伝子の5’UTRであり得る。
本明細書において使用される場合、「RUNX1」、「ANL1」または「Runt関連転写因子1」は、正常な造血の発達に関与していると考えられているヘテロ二量体コア結合因子（CBF）転写因子のαサブユニットを指す。RUNX1はそれ自体が転写因子であり、CBFB補因子と複合体を形成してCBFを形成する。RUNX1の配列は、いくつかの種について公知であり、例えば、ヒトRUNX1（RUNX1 NCBI遺伝子IDは861である）mRNA配列（例えば、NM＿001001890.2）およびポリペプチド配列（例えば、NP＿001001890.1）が当技術分野において公知である。これらは、同じ反応を触媒する任意の天然の対立形質のスプライス変異体、およびそのプロセシングされた形態とともに、本明細書において記載される方法および組成物での使用のために企図される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、RUNX1 5’UTRは、以下の核酸配列、すなわち、第21染色体上のNG＿011402.2:940414-1201911ホモサピエンスRUNXファミリー転写因子1（RUNX1）、RefSeqGene（LRG＿482）、（SEQ ID NO:14）:
Figure 2022536481000050
を含むか、それからなるか、それから本質的になるか、それに由来する5’UTRを含む。
本明細書において使用される場合、「LMO2」、「TTG2」または「LIMドメインオンリー2」は、卵黄嚢赤血球生成に必要な、システインに富む2つのLIMドメインタンパク質を指す。LMO2の配列は、いくつかの種について公知であり、例えば、ヒトLMO2（LMO2 NCBI遺伝子IDは4005である）mRNA配列（例えば、NM＿001142315.1）およびポリペプチド配列（例えば、NP＿001135787.1）が当技術分野において公知である。これらは、同じ反応を触媒する任意の天然の対立形質のスプライス変異体、およびそのプロセシングされた形態とともに、本明細書において記載される方法および組成物での使用のために企図される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、LMO2 5’UTRは、以下の核酸配列、すなわち、NC＿000011.10:c33892289-33858576ホモサピエンス第11染色体、GRCh38.p12、（SEQ ID NO:15）:
Figure 2022536481000051
を含むか、それからなるか、それから本質的になるか、それに由来する5’UTRを含む。
本明細書において使用される場合、「ETV6」、「TEL」または「ETSバリアント6」は、2つの機能的ドメイン、すなわち、それ自体および他のタンパク質とのタンパク質-タンパク質相互作用に関与するN末端ポインテッド（N-terminal pointed）（PNT）ドメイン、およびC末端DNA結合ドメインを有する転写因子を指す。ETV6の配列は、いくつかの種について公知であり、例えば、ヒトETV6（ETV6 NCBI遺伝子IDは2120である）mRNA配列（例えば、NM＿001987.4）およびポリペプチド配列（例えば、NP＿001978.1）が当技術分野において公知である。これらは、同じ反応を触媒する任意の天然の対立形質のスプライス変異体、およびそのプロセシングされた形態とともに、本明細書において記載される方法および組成物での使用のために企図される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、ETV6 5’UTRは、以下の核酸配列、すなわち、第12染色体上のNG＿011443.1:5001-250549ホモサピエンスETSバリアント6（ETV6）、RefSeqGene（LRG＿609）（SEQ ID NO:16）:
Figure 2022536481000052
を含むか、それからなるか、それから本質的になるか、それに由来する5’UTRを含む。
本明細書において記載される核酸配列/エレメントは、それらが直接的または間接的に相互作用して、意図された機能、例えば、核酸配列の発現の媒介または調節を行うことができるように、作動可能に連結され得る。「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素がそれらの通常の機能を行うように構成されているエレメントの配置を指す。したがって、オープンリーディングフレームに作動可能に連結された制御エレメントは、オープンリーディングフレームの発現を行うことができる。制御エレメントは、それらがその発現を導くように機能する限り、オープンリーディングフレームと連続している必要はない。したがって、例えば、介在する翻訳されていないが転写された配列がプロモーター配列とオープンリーディングフレームとの間に存在することができ、プロモーター配列はオープンリーディングフレームに「作動可能に連結された」と依然として考えられ得る。作動可能に連結された配列の相互作用は、例えば、作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質によって媒介され得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、プロモーターは、本明細書において開示されるエレメントのいずれか、例えば、異種5’UTR、少なくとも1つの遠位造血幹細胞（HSC）拘束性エンハンサーエレメント、HSC拘束性miRNAに対する結合部位を含む核酸配列、および/またはGATA1ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結され得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、プロモーターは、GATA1プロモーターではない。
局面のいずれかのいくつかの態様では、プロモーターは、伸長因子1-アルファ1（eEF1a1）のプロモーター配列を含む。本明細書において使用される場合、「eEF1a1」、「CCS-3」または「LENG7」は、リボソームへのアミノアシルtRNAの酵素的送達を担う伸長因子-1複合体のαサブユニットを指す。eEF1a1の配列は、いくつかの種について公知であり、例えば、ヒトeEF1a1（eEF1a1 NCBI遺伝子IDは1915である）は、当技術分野において公知である。局面のいずれかのいくつかの態様では、eEF1a1プロモーターは、以下の核酸配列、すなわち、NC＿000006.12:c73521032-73515750ホモサピエンス第6染色体、GRCh38.p12一次アセンブリ（SEQ ID NO:17）:
Figure 2022536481000053
Figure 2022536481000054
Figure 2022536481000055
を含むか、それからなるか、それから本質的になるか、それに由来するプロモーターを含む。
複雑な細胞および発達のプロセスは、mRNAおよびタンパク質のレベルおよび活性の正確な時空間的調節に依存する。そのような調節は、転写レベル、転写後レベルおよび翻訳後レベルで本質的に生じる。転写後調節とは、RNAレベル、したがって、遺伝子の転写と翻訳との間での遺伝子発現の制御である。転写後調節は、タンパク質-RNA相互作用およびRNA-RNA相互作用の両方によって制御され得る。本明細書において使用される場合、転写後調節エレメントは、限定されることなく、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントを含むヌクレオチド配列を含む。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸配列は、GATA1ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された転写後調節エレメントをさらに含むことができる。
局面のいずれかのいくつかの態様では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントを含む。ウッドチャック肝炎ウイルス（WHP）転写後調節エレメント、略してWPREは、転写されると、発現を増強する三次構造を形成するDNA配列である。WPREは、γ成分、α成分およびβ成分を有する、3つに分かれた調節エレメントである。
局面のいずれかのいくつかの態様では、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）は、以下のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:56）を含むか、それからなるか、それから本質的になる:
Figure 2022536481000056
局面のいずれかのいくつかの態様では、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）は、以下のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:63）を含むか、それからなるか、それから本質的になる:
Figure 2022536481000057
例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるPatel and Olsen RNA Virus Vectors 11:S322（2005）に記載されているように、代替的なおよび/または最適化されたWPREも当技術分野において公知である。
局面のいずれかのいくつかの態様では、WPREは、SEQ ID NO:56および/またはSEQ ID NO:63のものであるヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同性の配列を含む。局面のいずれかのいくつかの態様では、WPREは、SEQ ID NO:56および/またはSEQ ID NO:63に対して少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。局面のいずれかのいくつかの態様では、WPREは、SEQ ID NO:56および/またはSEQ ID NO:63に対して少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％またはそれ以上の配列同一性を有し、SEQ ID NO:56および/またはSEQ ID NO:63の野生型活性を保持する配列を含む。本明細書において記載される核酸配列は、複数の転写後調節エレメントを含むことができ、例えば、核酸配列は、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも13、または少なくとも14、または少なくとも15、または少なくとも16、または少なくとも17、または少なくとも20、または少なくとも25、または少なくとも30の転写後調節エレメントを含む。
局面のいずれかのいくつかの態様では、転写後調節エレメントは、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも約5kb、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも約5kb、少なくとも約6kb、少なくとも約7kb、少なくとも約8kb、少なくとも約9kb、少なくとも約10kbまたはそれ以上に位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、転写後調節エレメント配列は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも5kb、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも5kb、少なくとも6kb、少なくとも7kb、少なくとも8kb、少なくとも9kb、少なくとも10kbまたはそれ以上に位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、転写後調節エレメント配列は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から約5kbに、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から約5kbに、約6kbに、約7kbに、約8kbに、約9kbに、または約10kbに位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、転写後調節エレメント配列は、遺伝子間配列にあり得るか、介在遺伝子の配列にあり得る。本明細書において記載される局面のいずれかのいくつかの態様では、転写後調節エレメント配列は、オープンリーディングフレームの末端から約500bp～約10kb、例えば、オープンリーディングフレームから約1kb～約9kb、約2kb～約8kb、約3kb～約7kbまたは約4kb～約6kbの配列内に位置し得る。本明細書において記載される局面のいずれかのいくつかの態様では、転写後調節エレメント配列は、オープンリーディングフレームの末端から約500bp～約10kb、例えば、オープンリーディングフレームから1kb～9kb、2kb～8kb、3kb～7kbまたは4kb～6kbに位置し得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸配列は、配列内リボソーム進入部位をさらに含むことができる。配列内リボソーム進入部位、略してIRESは、タンパク質合成の比較的大きなプロセスの一部として、キャップ非依存的な様式での翻訳開始を可能にするRNAエレメントである。真核生物翻訳では、開始複合体の構築には5’キャップ認識が必要であるため、開始はmRNA分子の5’末端で典型的に起こる。IRESエレメントの位置は多くの場合5’UTRにあるが、mRNAの他の場所にも存在し得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、配列内リボソーム進入部位は、以下のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:66）を含むか、それからなるか、それから本質的になる：
Figure 2022536481000058
局面のいずれかのいくつかの態様では、SEQ ID NO:66のものであるヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同性の配列を含むIRESが、本明細書において記載される。局面のいずれかのいくつかの態様では、IRESは、SEQ ID NO:66に対して少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％またはそれ以上の配列同一性の配列を含む。局面のいずれかのいくつかの態様では、IRESは、SEQ ID NO:66に対して少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％またはそれ以上の配列同一性を有し、SEQ ID NO:66の野生型活性を保持する配列を含む。
本明細書において記載される核酸配列は、複数のIRES’を含むことができ、例えば、核酸配列は、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも13、または少なくとも14、または少なくとも15、または少なくとも16、または少なくとも17、または少なくとも20、または少なくとも25、または少なくとも30のIRES配列を含むことができる。
局面のいずれかのいくつかの態様では、IRESは、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも約5kb、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも約5kb、少なくとも約6kb、少なくとも約7kb、少なくとも約8kb、少なくとも約9kb、少なくとも約10kbまたはそれ以上に位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、IRES配列は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも5kb、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から少なくとも5kb、少なくとも6kb、少なくとも7kb、少なくとも8kb、少なくとも9kb、少なくとも10kbまたはそれ以上に位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、IRES配列は、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から約5kbに、例えば、GATA-1遺伝子のオープンリーディングフレームの境界から約5kbに、約6kbに、約7kbに、約8kbに、約9kbに、または約10kbに位置する。局面のいずれかのいくつかの態様では、IRES配列は、遺伝子間配列にあり得るか、介在遺伝子の配列にあり得る。本明細書において記載される局面のいずれかのいくつかの態様では、IRES配列は、オープンリーディングフレームの末端から約500bp～約10kb、例えば、オープンリーディングフレームから約1kb～約9kb、約2kb～約8kb、約3kb～約7kbまたは約4kb～約6kbの配列内に位置し得る。本明細書において記載される局面のいずれかのいくつかの態様では、IRES配列は、オープンリーディングフレームの末端から500bp～10kb、例えば、オープンリーディングフレームから1kb～9kb、2kb～8kb、3kb～7kbまたは4kb～6kbの配列内に位置し得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸配列は、自己切断2 Aポリペプチドをさらに含むことができる。自己切断ペプチドまたは2Aペプチドは、その一部であるポリペプチド、例えば、本明細書において記載される組換えGATA-1の切断を誘導することができるポリペプチドである。したがって、2Aペプチドを使用して、比較的長いペプチドを2つの比較的短いペプチドに切断することができ、それによって、1つの転写産物により2つのペプチドを生成することができる。2Aペプチドは、ウイルスのゲノム内の2A領域に由来する。2Aペプチド媒介性切断は、翻訳後に開始する。切断は、2AペプチドのC末端におけるプロリン（P）とグリシン（G）との間のペプチド結合の切断によって誘発される。2Aポリペプチドは、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個または少なくとも40個のアミノ酸を含むことができる。
局面のいずれかのいくつかの態様では、2Aペプチドを単一の核酸配列内のIRESエレメントと組み合わせ、それによって、単一の転写産物内にコードされる3つの別個のポリペプチドを生成することができる。
本明細書において記載される方法とともに使用され得る例示的な2Aペプチドには、限定されることなく、P2A、E2A、F2AおよびT2Aが含まれる（表4、SEQ ID NO:57～60も参照）。F2Aは口蹄疫ウイルス18に由来し、E2Aはウマ鼻炎Aウイルスに由来し、P2Aはブタテッショウウイルス-1 2Aに由来し、T2Aはゾーシー・アシグナウイルス（thosea asigna virus）2Aに由来する。
（表４）本明細書において記載される様々な態様において使用され得る2Aペプチドの名称および配列
列挙した2AペプチドのN末端に、任意のリンカー「GSG」（Gly-Ser-Gly）（太字）を付加することができる。
Figure 2022536481000059
局面のいずれかのいくつかの態様では、IRESおよび/または自己切断2Aポリペプチドは、マーカー遺伝子、例えば、光学的に検出可能なタンパク質または酵素をコードするマーカー遺伝子に作動可能に連結され得る。光学的に検出可能なタンパク質/酵素は、光学的に検出可能な標識を含むことができ、および/または検出可能なシグナルを生成する能力（例えば、化合物を検出可能な生成物に変換する反応を触媒することによって）を含むことができる。検出可能な標識は、例えば、光吸収部分または蛍光部分を含むことができる。検出可能な標識、マーカー遺伝子、それらを検出する方法、およびそれらを試薬（例えば、抗体および核酸プローブ）に組み込む方法は、当技術分野において周知である。
光学的に検出可能な標識/シグナルは、ヒトの眼に可視のもの、または光学機器を用いて、例えば、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電磁的手段、放射化学的手段もしくは化学的手段、例えば、蛍光、化学蛍光もしくは化学発光、もしくは任意の他の適切な手段によって検出可能なものを含み得る。検出可能な標識には、限定されることなく、放射性同位体、生物発光化合物、発色団、抗体、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素が含まれ得る。
マーカー遺伝子は当技術分野において周知であり、例えば、マーカー遺伝子には、限定されることなく、天然蛍光タンパク質、例えば、オワンクラゲ（Aequorea Victoria）の緑色蛍光タンパク質（GFP）（Cubitt,A. B. et al. 1995. Understanding,improving,and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20:448-455；Chalfie,M.,and Prasher,D.C.米国特許第5,491,084号）、βガラクトシダーゼ酵素をコードするlacZ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ-V-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-VI-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれ得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸配列は、SEQ ID NO:8、9、61および62から選択される配列を含み得るか、それからなり得るか、それから本質的になり得る。
SEQ ID NO:61（R18 EF1a IRES GFPとも呼ばれる）は、EF1Aプロモーター、GFPをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたIRES配列を含む:
Figure 2022536481000060
Figure 2022536481000061
Figure 2022536481000062
Figure 2022536481000063
SEQ ID NO:8（R21 miR126とも呼ばれる）は、EF1Aプロモーターと、GFPをコードするヌクレオチド配列およびHSC拘束性miRNA miR126に対する4つのmiRNAa結合部位に作動可能に連結されたIRES配列とを含む:
Figure 2022536481000064
Figure 2022536481000065
Figure 2022536481000066
SEQ ID NO:9（R49 1ピークエンハンサーとも呼ばれる）は、GFPをコードするヌクレオチド配列および1つの造血エンハンサーエレメントに作動可能に連結されたIRES配列を含む:
Figure 2022536481000067
Figure 2022536481000068
Figure 2022536481000069
SEQ ID NO:62（R50 3ピークエンハンサーとも呼ばれる）は、GFPをコードするヌクレオチド配列および3つの造血エンハンサーエレメントに作動可能に連結されたIRES配列を含む:
Figure 2022536481000070
Figure 2022536481000071
Figure 2022536481000072
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸配列は、ベクターであるか、ベクターによって含まれるか、ベクターに提供される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであり得る。本明細書において使用される場合、用語「レトロウイルス」は、それが侵入する宿主細胞のDNAにそのゲノムのコピーを挿入し、ひいては、その細胞のゲノムを変化させる一種のRNAウイルスを指す。そのようなウイルスは、一本鎖RNAまたは二本鎖DNAウイルスのいずれかである。局面のいずれかのいくつかの態様では、レトロウイルスは、アルファレトロウイルスである。本明細書において使用される場合、用語「レンチウイルス」は、複合レトロウイルスの群（または属）を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞型および活発に分裂する細胞型に感染することができるが、標準的なレトロウイルスは、有糸分裂的に活性な細胞型にのみ感染することができる。例示的なレンチウイルスには、限定されることなく、HIV（ヒト免疫不全ウイルス；HIV 1型およびHIV 2型を含む）；ビスナ・マエディ（visna-maedi）ウイルス（VMV）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAEV）；ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）；ネコ免疫不全ウイルス（FIV）；ウシ免疫不全ウイルス（BIV）；およびサル免疫不全ウイルス（SIV）が含まれる。本明細書において使用される場合、用語「アデノウイルス」は、二本鎖DNAゲノムを含む正二十面体ヌクレオカプシドを有する無エンベロープウイルスを指す。本明細書において使用される場合、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも1つのエレメントを含み、かつウイルスベクター粒子に包装される能力を有する核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、必須ではないウイルス遺伝子の代わりに、本明細書において記載される核酸を含むことができる。ベクターおよび/または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで任意の核酸を細胞に移すために利用され得る。当技術分野において、多数の形態のウイルスベクターが公知である。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸配列および/またはベクターは、ウイルス粒子（例えば、レンチウイルス粒子）によって含まれるか、ウイルス粒子（例えば、レンチウイルス粒子）に提供されるか、ウイルス粒子（例えば、レンチウイルス粒子）に位置する。
態様のいずれかの一局面では、本明細書において記載される核酸配列、ベクターまたは粒子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物が、本明細書において記載される。
態様のいずれかの一局面では、本明細書において記載される核酸配列（および/またはそのような核酸配列を含むベクターまたはウイルス粒子）と、任意で薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物が、本明細書において記載される。局面のいずれかのいくつかの態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書において記載される核酸（および/またはそのような核酸配列を含むベクターまたはウイルス粒子）を含む。局面のいずれかのいくつかの態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書において記載される核酸（および/またはそのような核酸配列を含むベクターまたはウイルス粒子）からなる。薬学的に許容される担体および希釈剤には、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒および/または分散媒が含まれる。そのような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体として機能することができる材料のいくつかの非限定的な例には、（1）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（2）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン；（3）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロース；（4）トラガント末；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（8）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス；（9）油、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（10）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（11）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）；（12）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（13）寒天；（14）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（15）アルギン酸；（16）パイロジェンフリー水；（17）等張食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝液；（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび/またはポリ無水物；（22）増量剤、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸；（23）血清成分、例えば、血清アルブミン、HDLおよびLDL；（22）C2～C12アルコール、例えば、エタノール；ならびに（23）薬学的製剤に使用される他の非毒性適合性物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤および酸化防止剤も製剤中に存在することができる。用語「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などは、本明細書において区別なく使用される。局面のいずれかのいくつかの態様では、担体は、活性作用物質の分解、例えば、本明細書において記載されるGATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列を含む核酸の分解を阻害する。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるGATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列を含む核酸配列（および/またはそのような核酸配列を含むベクターまたはウイルス粒子）を含む薬学的組成物は、非経口投与剤形であり得る。非経口剤形の投与は、典型的には、汚染物質に対する患者の自然防御を回避するため、非経口剤形は、好ましくは滅菌されているか、患者に投与する前に滅菌され得る。非経口剤形の例には、限定されることなく、注射用に準備された溶液、注射用の薬学的に許容されるビヒクルに溶解または懸濁させるように準備された乾燥製品、注射用に準備された懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。さらに、限定されることなく、DUROS（登録商標）型剤形および用量ダンピング（dose-dumping）を含む制御放出非経口剤形を患者の投与のために調製することができる。
本明細書において記載されるGATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列を含む核酸配列（および/またはそのような核酸配列を含むベクターまたはウイルス粒子）を含む薬学的組成物の非経口剤形を提供するために使用され得る好適なビヒクルは、当業者に周知である。例には、限定されることなく、滅菌水；注射用水USP；生理食塩水；グルコース溶液；水性ビヒクル、例えば、限定されることなく、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、および乳酸加リンゲル注射液；水混和性ビヒクル、例えば、限定されることなく、エチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール；ならびに非水性ビヒクル、例えば、限定されることなく、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルおよび安息香酸ベンジルが挙げられる。また、従来の非経口剤形および制御放出非経口剤形を含む、本開示の非経口剤形に、本明細書において開示される薬学的組成物の薬学的に許容される塩の溶解度を変化させるか改変する化合物が組み込まれ得る。
本明細書において開示されるGATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列を含む核酸配列（および/またはそのような核酸配列を含むベクターまたはウイルス粒子）を含む薬学的組成物はまた、例えば、別個の剤形、例えば、限定されることなく、錠剤（限定されることなく、刻み目のある錠剤またはコーティングされた錠剤を含む）、丸剤、カプレット、カプセル、チュアブル錠、粉末パケット、カシェ剤、トローチ剤、ウエハー剤、エアロゾルスプレーまたは液体、例えば、限定されることなく、水性液体、非水性液体、水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョン中のシロップ、エリキシル、溶液または懸濁液として経口投与に適しているように製剤化され得る。そのような組成物は、開示された化合物の所定量の薬学的に許容される塩を含有し、当業者に周知の薬学の方法によって調製され得る。一般に、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams,and Wilkins,Philadelphia PA.（2005）を参照されたい。
従来の剤形は、一般に、製剤からの迅速なまたは即時の薬物放出を提供する。薬物の薬理および薬物動態に応じて、従来の剤形の使用は、患者の血液および他の組織中の薬物の濃度の大きな変動をもたらし得る。これらの変動は、多くのパラメーター、例えば、用量頻度、作用開始、有効期間、治療血中レベルの維持、毒性、副作用などに影響を及ぼし得る。有利には、制御放出製剤を使用して、薬物の作用開始、作用持続時間、治療域内の血漿レベル、およびピーク血中レベルを制御することができる。特に、制御放出剤形もしくは持続放出剤形または制御放出製剤もしくは持続放出製剤を使用して、薬物の最大効果が達成されることを確実にしながら、薬物の過少投与（すなわち、最小治療レベルを下回ること）および薬物の毒性レベルを超えることの両方から起こり得る潜在的な有害作用および安全性の懸念を最小限に抑えることができる。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において開示されるGATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列を含む核酸配列（および/またはそのような核酸配列を含むベクターまたはウイルス粒子）を含むことを、徐放性製剤で投与することができる。
制御放出医薬製品は、それらの非制御放出対応物によって達成されるよりも薬物療法を改善するという共通の目標を有する。理想的には、医療処置では、最適に設計された制御放出調製物の使用は、最小限の時間で状態を治癒させるか制御するために使用される最小限の原薬を特徴とする。制御放出製剤の利点には、1）薬物の活性の延長；2）投与頻度の減少；3）患者コンプライアンスの向上；4）総薬物使用量の低下；5）局所的または全身的な副作用の減少；6）薬物蓄積の最小化；7）血中レベル変動の減少；8）治療の効果の改善；9）薬物活性の増強または喪失の減少；および10）疾患または状態の制御速度の向上が含まれる。Kim,Cherng-ju,Controlled Release Dosage Form Design,2（Technomic Publishing,Lancaster,Pa.:2000）。
ほとんどの制御放出製剤は、所望の治療効果を迅速にもたらす量の薬物（活性成分）を最初に放出し、このレベルの治療効果または予防効果を長期間にわたって維持するために他の量の薬物を徐々におよび連続的に放出するように設計される。体内でこの一定レベルの薬物を維持するために、薬物は、代謝され身体から排出される薬物の量を置き換える速度で剤形から放出されなければならない。活性成分の制御放出は、限定されることなく、pH、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水、および他の生理学的条件または化合物を含む様々な条件によって刺激され得る。
様々な公知の制御放出剤形または持続放出剤形、制御放出製剤または持続放出製剤、および装置を、本開示の塩および組成物との使用に適合させることができる。例には、限定されることなく、各々参照により本明細書に組み入れられる米国特許第3,845,770号、米国特許第3,916,899号、米国特許第3,536,809号、米国特許第3,598,123号、米国特許第4,008,719号、米国特許第5674,533号、米国特許第5,059,595号、米国特許第5,591,767号、米国特許第5,120,548号、米国特許第5,073,543号、米国特許第5,639,476号、米国特許第5,354,556号、米国特許第5,733,566号および米国特許第6,365,185号に記載されているものが挙げられる。これらの剤形は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧系（例えば、OROS（登録商標）（Alza Corporation,Mountain View,Calif. USA））またはそれらの組合せを使用して1つまたは複数の活性成分の徐放または制御放出をもたらして、所望の放出プロファイルを様々な割合で提供するために使用することができる。
態様のいくつかの局面では、本明細書において記載される核酸配列、粒子または組成物の治療有効量を患者に投与する工程を含む、その必要がある対象においてダイアモンド・ブラックファン貧血を治療する方法が、本明細書において記載される。
本明細書において記載される組成物は、DBAを有するかDBAを有すると診断された対象に投与され得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される方法は、DBAの症状を軽減するために、本明細書において記載される組成物、例えば、本明細書において記載されるGATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列を含む核酸の有効量を対象に投与する工程を含む。本明細書において使用される場合、「症状を軽減する」とは、DBAに関連する任意の状態または症状を改善することである。同等の未治療対照と比較して、そのような低減は、任意の標準的な技術によって測定した場合に、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％またはそれ以上である。本明細書において記載される組成物を対象に投与するための様々な手段が当業者に公知である。そのような方法には、限定されることなく、経口投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気道（エアロゾル）投与、肺投与、皮膚投与、局所投与または注射投与が含まれ得る。投与は、局所的または全身的であり得る。
本明細書において使用される用語「有効量」は、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を軽減するのに必要な活性作用物質の量を指し、所望の効果をもたらすのに十分な量の薬理学的組成物に関する。したがって、用語「治療有効量」は、典型的な対象に投与した場合に特定の効果をもたらすのに十分な活性作用物質の量を指す。本明細書において使用される有効量はまた、様々な状況において、疾患の症状の発現を遅延させる、症状疾患の経過を変化させる（例えば、限定されることなく、疾患の症状の進行を遅らせる）、または疾患の症状を逆転させるのに十分な量を含む。したがって、正確な「有効量」を特定することは、一般に実用的ではない。ただし、任意の所与の場合では、適切な「有効量」は、常用的な実験のみを使用して当業者によって決定され得る。
有効量、毒性および治療効果は、例えば、LD50（集団の50％に対して致死的な用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物を対象とした標準的な薬学的手順によって決定され得る。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて変化し得る。毒性作用と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比LD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。また、用量は、細胞培養で決定されるIC50（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する、活性作用物質の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するための動物モデルを対象として、または適切な動物モデルを対象として製剤化され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、例えば、好適なバイオアッセイ、例えば、とりわけ、赤血球および/または赤血球生成のレベルのアッセイによって監視することができる。投与量は、医師によって決定され、必要に応じて治療の観察された効果に適合するように調整され得る。
本明細書において記載される組成物の投与量は、医師によって決定され、必要に応じて治療の観察された効果に適合するように調整され得る。治療の持続時間および頻度に関して、治療がいつ治療利益を提供しているかを決定するために、および投与量を増加または減少させるか、投与頻度を増加または減少させるか、治療を中止するか、治療を再開するか、治療レジメンに他の変更を加えるかどうかを決定するために、熟練した臨床医が対象を監視することが一般的である。投与スケジュールは、活性作用物質に対する対象の感受性などのいくつかの臨床的因子に応じて、週に1回から連日まで変化し得る。所望の用量または活性化量は、一度に投与され得るか、分割用量、例えば、2～4回の分割用量に分割され得、ある期間にわたって、例えば、1日または他の適切なスケジュールを通して適切な間隔で投与され得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、投与は、長期的、例えば、数週間または数ヶ月にわたる連日1回または複数回の用量および/または治療であり得る。投与スケジュールおよび/または治療スケジュールの例には、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月もしくは6ヶ月またはそれ以上の期間にわたる連日、1日2回、1日3回または1日4回以上の投与がある。本明細書において開示されるGATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列を含む核酸配列（および/またはそのような核酸配列を含むベクターまたはウイルス粒子）組成物は、ある期間にわたって、例えば、5分、10分、15分、20分または25分の期間にわたって投与され得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、初期治療レジメンの後、さらに低い頻度で治療が施され得る。例えば、3ヶ月間にわたる治療を隔週で行った後、治療を月に1回、6ヶ月間または1年以上にわたって繰り返すことができる。本明細書において記載される方法による治療は、状態のマーカーまたは症状のレベルを少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％もしくは少なくとも90％またはそれ以上低下させることができる。
本明細書において記載される方法による、本明細書において開示されるGATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列を含む核酸配列（および/またはそのような核酸配列を含むベクターまたはウイルス粒子）の投与のための投与量範囲は、例えば、阻害剤の形態、その効力、および本明細書において記載される症状、マーカーまたは症状の指標が低減されることが望まれる程度、例えば割合に依存する。一般に、投与量は、患者の年齢、状態および性別によって異なり、当業者によって決定され得る。投与量はまた、いずれかの合併症の場合に個々の医師によって調整され得る。
例えば、DBAもしくは本明細書において記載される任意の他の状態の治療に対する、または本明細書において記載される応答を誘導するための、本明細書において開示されるGATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列を含む核酸配列（および/またはそのような核酸配列を含むベクターまたはウイルス粒子）の効果は、熟練した臨床医によって決定され得る。ただし、治療は、該用語が本明細書において使用される場合、本明細書において記載される状態の徴候もしくは症状のうちの1つもしくは複数が有益な様式で変化する場合、他の臨床的に許容される症状が改善されるか、さらには改良される場合、または所望の応答が、例えば、本明細書において記載される方法による治療後に少なくとも10％誘導される場合、「有効な治療」と考えられる。有効性は、例えば、本明細書において記載される方法または適切な任意の他の測定可能なパラメーターに従って治療された状態のマーカー、指標、症状および/または発生率を測定することによって評価され得る。有効性はまた、入院によって評価されるように個体が悪化しないことによって、または医学的介入（すなわち、疾患の進行が停止される）の必要性によっても測定され得る。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、および/または本明細書において記載されている。治療は、個体または動物（いくつかの非限定的な例には、ヒトまたは動物が挙げられる）の疾患の任意の治療を含み、（1）疾患を阻害すること、例えば、症状の悪化を予防すること、または（2）疾患の重症度を軽減すること、例えば、症状の後退を引き起こすことを含む。疾患の治療のための有効量は、それを必要とする対象に投与された際に、その疾患について、その用語が本明細書において定義されるような有効な治療をもたらすのに十分な量を意味する。作用物質の有効性は、状態または所望の応答の物理的指標を評価することによって決定され得る。そのようなパラメーターのいずれか1つ、またはパラメーターの任意の組合せを測定することによって投与および/または治療の有効性を監視することは、十分に当業者の能力の範囲内である。有効性は、本明細書において記載される状態、例えば、DBAの治療の動物モデルを対象として評価され得る。
態様のいずれかの一局面では、初期赤芽球前駆細胞を含む細胞集団を本明細書において記載される核酸配列、粒子または組成物と接触させる工程を含む、初期赤芽球前駆細胞特異的GATA1発現を回復させる方法が、本明細書において記載される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、初期赤芽球前駆細胞は、限定されることなく、表5に列挙されたものを含むDBA関連遺伝子変異を含む。局面のいずれかのいくつかの態様では、赤芽球前駆細胞は、1つまたは複数のDBA関連遺伝子変異を含む。DBA関連遺伝子変異は当技術分野において周知であり、DBA関連遺伝子変異には、限定されることなく、表5に列挙される変異が含まれる（例えば、Int J Hematol. 2010 Oct；92（3）:413-8を参照）。
（表５）例示的なDBA関連遺伝子変異
Figure 2022536481000073
局面のいずれかのいくつかの態様では、GATA-1のレベルは、非限定的な例として、ウエスタンブロット；免疫沈降；酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）；放射免疫学的アッセイ（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織染色；ラジオイムノメトリックアッセイ；免疫蛍光アッセイ；質量分析および/または免疫電気泳動アッセイによって測定され得る。
RNA分子および/またはDNA分子は、血液試料などの生体試料から単離、誘導または増幅され得る。mRNA発現を検出するための技術は当業者に公知であり、mRNA発現を検出するための技術には、限定されることなく、PCR手順、RT-PCR、定量RT-PCRノーザンブロット分析、差次的遺伝子発現、RNAse保護アッセイ、マイクロアレイベースの分析、次世代シーケンシング、ハイブリダイゼーション法などが含まれ得る。
一般に、PCR手順は、（i）核酸試料または核酸ライブラリー内の特定の遺伝子または配列に対するプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ii）熱安定性DNAポリメラーゼを使用した複数回のアニーリング、伸長および変性を含むその後の増幅、ならびに（iii）正しいサイズのバンドについてPCR産物をスクリーニングすることから構成される遺伝子増幅の方法を記載する。使用されるプライマーは、重合を開始するのに十分な長さの適切な配列のオリゴヌクレオチドであり、すなわち、各プライマーは、増幅されるゲノム遺伝子座の鎖に相補的であるように特異的に設計される。代替的な態様では、本明細書において記載される遺伝子発現産物のmRNAレベルは、逆転写（RT）PCR法および定量RT-PCR（QRT-PCR）法またはリアルタイムPCR法によって決定され得る。RT-PCRおよびQRT-PCRの方法は、当技術分野において周知である。
局面のいずれかのいくつかの態様では、mRNAのレベルは、定量的シーケンシング技術、例えば、定量的次世代配列技術によって測定され得る。核酸配列をシーケンシングする方法は、当技術分野において周知である。要約すると、対象から得られた試料を、標的遺伝子配列に隣接する一本鎖核酸配列に特異的にハイブリダイズする1つまたは複数のプライマーと接触させることができ、相補鎖が合成される。いくつかの次世代技術では、アダプター（二本鎖または一本鎖）が試料中の核酸分子にライゲーションされ、合成が、アダプターまたはアダプター適合性プライマーから進行する。一部の第3世代技術では、配列は、例えば、プローブのハイブリダイゼーションの位置およびパターンを決定することによって、またはセンサを通過する際の単一分子の1つもしくは複数の特性を測定することによって（例えば、核酸分子がナノポアを通過する際の電場の調節）決定され得る。シーケンシングの例示的な方法には、限定されることなく、Sangerシーケンシング、ジデオキシチェーンターミネーション、ハイスループットシーケンシング、次世代シーケンシング、454シーケンシング、SOLiDシーケンシング、ポロニーシーケンシング、Illuminaシーケンシング、Ion Torrentシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ナノポアシーケンシング、Helioscopeシーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング、RNAPシーケンシングなどが含まれる。これらのシーケンシング方法を行うための方法およびプロトコルは当技術分野において公知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる’’Next Generation Genome Sequencing’’ Ed. Michal Janitz,Wiley-VCH；’’High-Throughput Next Generation Sequencing’’ Eds. Kwon and Ricke,Humanna Press,2011；およびSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（4 ed.）,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA（2012）を参照されたい。
核酸分子およびリボ核酸（RNA）分子は、当技術分野において周知のいくつかの手順のいずれかを使用して特定の生体試料から単離することができ、選択された特定の単離手順は特定の生体試料に適している。例えば、凍結融解手順およびアルカリ溶解手順は、固体材料から核酸分子を得るために有用であり得、熱およびアルカリ溶解手順は、尿から核酸分子を得るために有用であり得、プロテイナーゼK抽出を使用して、血液から核酸を得ることができる（Roiff,A et al. PCR:Clinical Diagnostics and Research,Springer（1994））。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される試薬（例えば、抗体試薬および/または核酸プローブ）のうちの1つまたは複数は、検出可能な標識を含むことができ、および/または検出可能なシグナルを生成する能力（例えば、化合物を検出可能な生成物に変換する反応を触媒することによって）を含むことができる。検出可能な標識は、例えば、光吸収色素、蛍光色素または放射性標識を含むことができる。検出可能な標識、それらを検出する方法、およびそれらを試薬（例えば、抗体および核酸プローブ）に組み込む方法は、当技術分野において周知である。
局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電磁的手段、放射化学的手段または化学的手段、例えば、蛍光、化学蛍光もしくは化学発光、または任意の他の適切な手段によって検出され得る標識を含み得る。本明細書において記載される方法に使用される検出可能な標識は、一次標識（ここで、標識は、直接検出可能な部分、または直接検出可能な部分を生成する部分を含む）または二次標識（ここで、検出可能な標識は、例えば、二次抗体および三次抗体を使用する免疫学的標識では一般的であるように、検出可能なシグナルを生成するために別の部分に結合する）であり得る。検出可能な標識は、共有結合的手段または非共有結合的手段によって試薬に連結され得る。あるいは、例えば、リガンド-受容体結合対配列または他のそのような特異的認識分子を介して試薬への結合を達成する分子を直接標識することによって、検出可能な標識を連結することができる。検出可能な標識には、限定されることなく、放射性同位体、生物発光化合物、発色団、抗体、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素が含まれ得る。
他の態様では、検出試薬は蛍光化合物によって標識される。蛍光標識試薬が適切な波長の光に曝露されると、蛍光によりその存在を検出することができる。局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、蛍光色素分子、またはフルオロフォア、例えば、限定されることなく、フルオレセイン、フィコエリトリン、フィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレスカミン、Cy3（商標）、Cy5（商標）、アロフィコシアニン、テキサスレッド、ペリジニンクロロフィル、シアニン、タンデムコンジュゲート、例えば、フィコエリトリン-Cy5（商標）、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびOregon Green（商標）、ローダミンおよび誘導体（例えば、テキサスレッドおよびテトラローダミンイソチオシアネート（TRITC））、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDyes（商標）、6-カルボキシフルオレセイン（一般に、略称FAMおよびFによって知られている）、6-カルボキシ-2’,4’,7’,4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン（JOEまたはJ）、N,N,N’,N’-テトラメチル-6カルボキシローダミン（TAMRAまたはT）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROXまたはR）、5-カルボキシローダミン-6G（R6G5またはG5）、6-カルボキシローダミン-6G（R6G6またはG6）、およびローダミン110；シアニン色素、例えば、Cy3色素、Cy5色素およびCy7色素；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンズイミド色素、例えば、Hoechst 33258；フェナントリジン色素、例えば、テキサスレッド；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えば、シアニン色素、例えば、Cy3、Cy5など；BODIPY色素およびキノリン色素であり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、限定されることなく、3H、125I、35S、14C、32Pおよび33Pを含む放射性標識であり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、限定されることなく、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む酵素であり得る。酵素標識は、例えば、化学発光シグナル、色シグナルまたは蛍光シグナルを生成し得る。抗体試薬を検出可能に標識するための使用について企図される酵素には、限定されることなく、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ-V-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-VI-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、限定されることなく、ルシゲニン、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルを含む化学発光標識である。局面のいずれかのいくつかの態様では、検出可能な標識は、限定されることなく、コロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレンおよびラテックス）ビーズを含むスペクトル比色標識であり得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、検出試薬はまた、検出可能なタグ、例えば、c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、HISまたはビオチンによって標識され得る。他の検出系、例えばビオチン-ストレプトアビジン系も使用することができる。この系では、関心対象のバイオマーカーと免疫反応性の（すなわち、それに特異的な）抗体がビオチン化される。ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび色素原基質を使用して、バイオマーカーに結合したビオチン化抗体の量を決定する。そのようなストレプトアビジンペルオキシダーゼ検出キットは、例えば、DAKO；Carpinteria,CAから市販されている。試薬は、152Euなどの蛍光発光金属、またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識することもできる。これらの金属は、金属キレート基、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を使用して試薬に結合させることができる。
参照レベルを下回るレベルは、参照レベルと比較して少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約80％、少なくとも約90％またはそれ以下だけ下回るレベルであり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、参照レベルを下回るレベルは、参照レベルを統計的に有意に下回るレベルであり得る。
参照レベルを超えるレベルは、参照レベルを少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約200％、少なくとも約300％、少なくとも約500％またはそれ以上だけ超えるレベルであり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、参照レベルを超えるレベルは、参照レベルを統計的に有意に超えるレベルであり得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、参照は、肺感染症および/または肺炎症の徴候または症状を有しない、または有すると診断されない、および/または示さない対象の集団における標的のレベルであり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、参照はまた、対照試料、対照個体のプールされた試料、またはそれに基づく数値もしくは値の範囲における標的のレベルであり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、参照は、比較的早い時点で同じ対象から得られた試料中の標的のレベルであり得、例えば、本明細書において記載される方法を使用して、所与の療法に対する対象の感受性または応答が経時的に変化しているかどうかを決定することができる。
前述の局面のいくつかの態様では、所与の遺伝子の発現レベルは、1つまたは複数の参照遺伝子または参照タンパク質の発現レベルに対して正規化され得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、参照レベルは、好中球蓄積および/またはポリPのレベルが決定される試料/対象と同様の細胞型、試料タイプ、試料処理の試料中のレベルであり得、および/または好中球蓄積および/またはポリPのレベルが決定される試料/対象と同様の年齢、性別および他の背景因子パラメーターの対象から得られ得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、試験試料および対照参照試料は、同じタイプのものであり、すなわち、同じ生物学的供給源から得られ、同じ組成、例えば、同じ数およびタイプの細胞を含む。
本明細書において使用される用語「試料」または「試験試料」は、生物学的生物から採取または単離された試料、例えば、対象から得られた血液または血漿試料を意味する。局面のいずれかのいくつかの態様では、本発明は、生体試料のいくつかの例を包含する。局面のいずれかのいくつかの態様では、生体試料は、細胞または組織または末梢血または体液である。例示的な生体試料には、限定されることなく、生検、腫瘍試料、生物流体試料；血液；血清；血漿；尿；精子；粘液；組織生検；臓器生検；滑液；胆汁液；脳脊髄液；粘膜分泌物；滲出液；汗；唾液；および/または組織試料などが含まれる。該用語はまた、上述の試料の混合物を含む。用語「試験試料」はまた、未処理の、または予め処理された（または前処理された）生体試料を含む。局面のいずれかのいくつかの態様では、試験試料は、対象から得られた細胞を含むことができる。局面のいずれかのいくつかの態様では、試験試料は、肺試料、肺吸引物、痰試料、気道試料、血清試料などであり得る。
試験試料は、対象から試料を除去することによって得ることができるが、以前に単離された試料（例えば、以前の時点で単離され、同じまたは別の人によって単離される）を使用することによって得ることもできる。
局面のいずれかのいくつかの態様では、試験試料は、未処理試験試料であり得る。本明細書において使用される場合、「未処理試験試料」という語句は、溶液中の希釈液および/または懸濁液を除いて、事前の試料前処理を有しない試験試料を指す。試験試料を処理するための例示的な方法には、限定されることなく、遠心分離、濾過、超音波処理、均質化、加熱、凍結および解凍、ならびにそれらの組合せが含まれる。局面のいずれかのいくつかの態様では、試験試料は、凍結試験試料、例えば凍結組織であり得る。凍結試料は、本明細書において記載される方法、アッセイおよびシステムを使用する前に解凍され得る。解凍後、凍結試料を遠心分離してから、本明細書において記載される方法、アッセイおよびシステムに供することができる。局面のいずれかのいくつかの態様では、試験試料は、例えば、遠心分離によって、および清澄化された試験試料を含む上清の収集によって、清澄化された試験試料である。局面のいずれかのいくつかの態様では、試験試料は、前処理された試験試料、例えば、遠心分離、濾過、解凍、精製およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される処理から生じる上清または濾液であり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、試験試料は、化学試薬および/または生物学的試薬によって処理され得る。処理中に、化学試薬および/または生物学的試薬を使用して、その中に生体分子（例えば、核酸およびタンパク質）を含む試料の安定性を保護および/または維持することができる。1つの例示的な試薬はプロテアーゼ阻害剤であり、プロテアーゼ阻害剤は一般に、処理中のタンパク質の安定性を保護または維持するために使用される。当業者であれば、本明細書において記載される発現産物のレベルの決定に必要な生体試料の前処理に適切な方法およびプロセスを十分に承知している。
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語および語句の意味を以下に提供する。特に明記されていない限り、または文脈から暗示されている場合を除き、以下の用語および語句は、以下に提供される意味を含む。定義は、特定の態様の説明を支援するために提供され、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用と本明細書において提供されるその定義との間に明らかな不一致がある場合、本明細書内で提供される定義を優先するものとする。
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語がここに集められている。
用語「低下する（decrease）」、「減少した（reduced）」、「減少（reduction）」または「阻害する（inhibit）」はいずれも、統計的に有意な量の減少を意味するために本明細書において使用される。局面のいずれかのいくつかの態様では、「減少する（reduce）」、「減少（reduction）」または「低下する（decrease）」または「阻害する（inhibit）」は、典型的には、参照レベル（例えば、所与の治療または作用物質の非存在）と比較して少なくとも10％の減少を意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％またはそれ以上の減少を含み得る。本明細書において使用される場合、「減少（reduction）」または「阻害（inhibition）」は、参照レベルと比較して完全な阻害または減少を包含しない。「完全な阻害」は、参照レベルと比較して100％の阻害である。低下は、好ましくは、所与の障害のない個体について正常範囲内として認められるレベルまで低下し得る。
用語「増加した（increased）」、「増加する（increase）」、「増強する（enhance）」または「活性化する（activate）」はいずれも、統計的に有意な量の増加を意味するために本明細書において使用される。局面のいずれかのいくつかの態様では、用語「増加した（increased）」、「増加する（increase）」、「増強する（enhance）」または「活性化する（activate）」は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加、もしくは最大100％の増加、もしくは10～100％のいずれかの増加、または参照レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、もしくは2倍～10倍以上のいずれかの増加を意味し得る。マーカーまたは症状の文脈では、「増加する（increase）」は、そのようなレベルの統計学的に有意な増加である。
本明細書において使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物とは、霊長類、齧歯類、家畜または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが含まれる。齧歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、家ネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、例えば、マス、ナマズおよびサケが含まれる。局面のいずれかのいくつかの態様では、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。用語「個体」、「患者」および「対象」は、本明細書において区別なく使用される。
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るが、これらの例に限定されるわけではない。ある状態の動物モデルを表す対象として、ヒト以外の哺乳動物を有利に使用することができる。対象は、男性または女性であり得る。
対象は、治療を必要とする状態またはそのような状態に関連する1つもしくは複数の合併症と以前に診断されているか、それに罹患しているかそれを有すると特定されており、任意で、該状態または該状態に関連する1つもしくは複数の合併症のための治療を既に受けている対象であり得る。あるいは、対象は、該状態または該状態に関連する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されていない対象であってよい。例えば、対象は、該状態もしくは該状態に関連する1つもしくは複数の合併症に対する1つもしくは複数のリスク因子を示す対象、またはリスク因子を示さない対象であり得る。
特定の状態のための治療を「必要とする対象」は、その状態を有する対象、その状態を有すると診断された対象、またはその状態を発現するリスクがある対象であり得る。
本明細書において記載される様々な態様では、記載される特定のポリペプチドのいずれかの変異体（天然に存在するかそうでないか）、対立遺伝子、ホモログ、保存的に改変された変異体および/または保存的置換変異体が包含されることがさらに企図される。アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされた配列内の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変化させる核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加が、その変化によってアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸によって置換され、ポリペプチドの所望の活性を保持する「保存的に改変された変異体」であることを認識するであろう。そのような保存的に改変された変異体は、本開示と一致する多型変異体、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えられ、それらを除外しない。
所与のアミノ酸は、類似の物理化学的特性を有する残基、例えば、ある脂肪族残基を別の脂肪族残基に置換すること（例えば、互いにIle、Val、LeuまたはAlaなど）、またはある極性残基を別の極性残基に置換すること（例えば、LysとArgとの間；GluとAspとの間；またはGlnとAsnとの間）によって置換することができる。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する領域全体の置換が周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、所望の活性、例えば、天然または参照ポリペプチドの活性および特異性が保持されていることを確認するために、本明細書において記載されるアッセイのいずれか1つで試験され得る。
アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ分けされ得る（A. L. Lehninger,in Biochemistry,second ed.,pp. 73-75,Worth Publishers,New York（1975））:（1）非極性:Ala（A）、Val（V）、Leu（L）、Ile（I）、Pro（P）、Phe（F）、Trp（W）、Met（M）；（2）無電荷極性:Gly（G）、Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Tyr（Y）、Asn（N）、Gln（Q）；（3）酸性:Asp（D）、Glu（E）；（4）塩基性:Lys（K）、Arg（R）、His（H）。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられ得る:（1）疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；（2）中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性:Asp、Glu；（4）塩基性:His、Lys、Arg；（5）鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro；（6）芳香族:Trp、Tyr、Phe。非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。特定の保存的置換には、例えば、AlaからGlyまたはSer；ArgからLys；AsnからGlnまたはHis；AspからGlu；CysからSer；GlnからAsn；GluからAsp；GlyからAlaまたはPro；HisからAsnまたはGln；IleからLeuまたはVal；LeuからIleまたはVal；LysからArg、GlnまたはGlu；MetからLeu、TyrまたはIle；PheからMet、LeuまたはTyr；SerからThr；ThrからSer；TrpからTyr；TyrからTrp；および/またはPheからVal、IleまたはLeuが含まれる。
用語「miRNA」および「マイクロRNA」は、内因性遺伝子に由来する21～25ntの非コードRNAを指す。それらは、pre-miRNAと呼ばれるさらに長い（約75nt）ヘアピン様前駆体からプロセシングされる。マイクロRNAは、miRNPと呼ばれる複合体に集合し、アンチセンス相補性によってそれらの標的を認識する。マイクロRNAがそれらの標的と100％マッチする場合、すなわち、相補性が完全である場合、標的mRNAは切断され、miRNAはsiRNAのように作用する。マッチが不完全である場合、すなわち、相補性が部分的である場合、標的mRNAの翻訳は阻止される。
用語「miRNA標的部位」または「マイクロRNA標的部位」は、mRNA標的内のマイクロRNAの特異的標的結合配列を指す。miRNAとその標的部位との間の相補性は、完全である必要はない。
本明細書において使用される場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、隣接する残基のα-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基を指すために本明細書において区別なく使用される。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、そのサイズまたは機能にかかわらず、改変アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含む、アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関して使用されることが多いのに対して、用語「ペプチド」は、小さなポリペプチドに関して使用されることが多いが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複する。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、遺伝子産物およびその断片を指す場合、本明細書において区別なく使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片ならびに前述のものの他の等価物、変異体、断片およびアナログが含まれる。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書において記載されるアミノ酸配列のうちの1つの機能的断片であり得る。本明細書において使用される場合、「機能的断片」は、本明細書において以下に記載されるアッセイによる野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも50％を保持する、ペプチドの断片またはセグメントである。機能的断片は、本明細書において開示される配列の保存的置換を含み得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるポリペプチドは、本明細書において記載される配列の変異体であり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、変異体は、保存的に改変された変異体である。保存的置換変異体は、例えば、天然のヌクレオチド配列の変異によって得ることができる。本明細書において言及される「変異体」は、天然または参照ポリペプチドと実質的に相同であるが、欠失、挿入または置換のうちの1つまたは複数のために天然または参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変異体ポリペプチドコードDNA配列は、天然または参照DNA配列と比較した場合、ヌクレオチドの1つまたは複数の付加、欠失または置換を含むが、活性を保持する変異体タンパク質またはその断片をコードする配列を包含する。多種多様な、PCRに基づく部位特異的変異誘発手法が当技術分野において公知であり、当業者によって適用され得る。
変異体アミノ酸配列または変異体DNA配列は、天然または参照配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上同一であり得る。天然配列と変異体配列との間の相同性の程度（パーセント同一性）は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために一般的に使用される自由に入手可能なコンピュータプログラム（例えば、デフォルト設定のBLASTpまたはBLASTn）を使用して2つの配列を比較することによって決定することができる。
当業者に公知のいくつかの技術のいずれかによって、天然アミノ酸配列の変化を達成することができる。例えば、天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位に隣接する変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に変異を導入することができる。ライゲーション後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する類似体をコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド指向部位特異的変異誘発手順を使用して、必要な置換、欠失または挿入に従って変化させた特定のコドンを有する変化したヌクレオチド配列をもたらすことができる。そのように変化させるための技術は非常によく確立されており、そのような技術には、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWalder et al.（Gene 42:133,1986）；Bauer et al.（Gene 37:73,1985）；Craik（BioTechniques,January 1985,12-19）；Smith et al.（Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981）；ならびに米国特許第4,518,584号および米国特許第4,737,462号によって開示されているものが含まれる。ポリペプチドの適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、一般にセリンによって置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合をポリペプチドに付加して、その安定性を改善するか、オリゴマー化を促進することができる。
本明細書において使用される場合、用語「赤血球生成」は、赤血球幹細胞から成熟赤血球への発達である、赤血球を産生する過程である。本明細書において使用される場合、用語「赤芽細胞」は赤血球を指す。
本明細書において使用される場合、用語「核酸」または「核酸配列」は、任意の分子、好ましくは、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはそれらの類似体の単位を組み込んだポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖核酸は、変性した二本鎖DNAの1本の核酸鎖であり得る。あるいは、一本鎖核酸は、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸であり得る。態様のいずれかの一局面では、核酸はDNAであり得る。別の局面では、核酸はRNAであり得る。好適なDNAには、例えば、ゲノムDNAまたはcDNAが含まれ得る。好適なRNAには、例えば、mRNAが含まれ得る。
用語「発現」は、RNAおよびタンパク質の産生、ならびに適切な場合にはタンパク質の分泌、例えば、適用可能な場合には、限定されることなく、例えば、転写、転写産物プロセシング、翻訳およびタンパク質フォールディング、改変およびプロセシングに関与する細胞プロセスを指す。発現とは、本発明の単数または複数の核酸断片に由来するセンス（mRNA）またはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄積、および/またはポリペプチドへのmRNAの翻訳を指し得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるバイオマーカー、標的または遺伝子/ポリペプチドの発現は組織特異的である。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるバイオマーカー、標的または遺伝子/ポリペプチドの発現は全体的である。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるバイオマーカー、標的または遺伝子/ポリペプチドの発現は全身性である。
本明細書において使用される場合、「発現産物」には、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。用語「遺伝子」は、適切な調節配列に作動可能に連結された場合にインビトロまたはインビボでRNAに転写される（DNA）核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域の前後の領域、例えば、5’非翻訳（5’UTR）または「リーダー」配列および3’UTRまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
本明細書において使用される場合、「5’UTR」または「5’非翻訳領域」または「5’リーダー配列」は、翻訳されないmR Aの領域を指す。5’UTRは、典型的には、転写開始部位で始まり、翻訳開始部位、またはコード領域の開始コドン（通常、mRNAではAUG、DNA配列ではATG）の直前で終わる。5’UTRの長さは、変異、例えば、5’UTRの置換、欠失または挿入によって改変され得る。5’UTRは、天然に存在する開始コドンまたは翻訳開始部位を、そのコドンがもはや開始コドンとして機能せず、翻訳が代替の開始部位で開始し得るように変異させることによってさらに改変され得る。
本明細書において使用される場合、「発現エンハンサー」、「エンハンサー配列」または「エンハンサーエレメント」は、それらが作動可能に連結されている下流の異種オープンリーディングフレーム（ORF）の発現を増強することができる核酸配列を指す。
本明細書において使用される場合、用語「転写後調節」は、遺伝子の転写と翻訳との間でのRNAレベルでの遺伝子発現の制御を指す。
本明細書において使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、直接的または間接的に相互作用して、意図された機能、例えば、核酸配列の発現の媒介または調節を行う配列を指す。作動可能に連結された配列の相互作用は、例えば、作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質によって媒介され得る。典型的には、それは、転写調節配列と転写配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーター配列は、適切な宿主細胞または他の発現系内でオープンリーディングフレームの転写を刺激または調節する場合、オープンリーディングフレームに作動可能に連結される。一般に、転写配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接している、すなわちシス作用性である。ただし、エンハンサーなどのいくつかの転写調節配列は、それらが転写を増強するオープンリーディングフレームに物理的に隣接しているか近接して位置する必要はない。
本発明の文脈では、「マーカー」は、対照対象（例えば、健常対象）から採取された同等の試料と比較して、増加した好中球蓄積および/またはポリPを有する対象から採取された試料中に差次的に存在する発現産物、例えば、核酸またはポリペプチドを指す。用語「バイオマーカー」は、用語「マーカー」と区別なく使用される。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される方法は、少なくとも1つのマーカーのレベルを測定、検出または決定することに関する。本明細書において使用される場合、用語「検出」または「測定」は、例えば、プローブ、標識または標的分子からのシグナルを観察して、試料中の分析物の存在を示すことを指す。特定の標識部分を検出するための、当技術分野において公知の任意の方法を検出に使用することができる。例示的な検出方法には、限定されることなく、分光学的方法、蛍光的方法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、電気的方法、光学的方法または化学的方法が含まれる。局面のいずれかのいくつかの態様では、測定は定量的観察であり得る。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるポリペプチド、核酸または細胞を操作することができる。本明細書において使用される場合、「操作された」は、人間の手によって操作されているという側面を指す。例えば、ポリペプチドの少なくとも1つの側面、例えば、その配列が、本来存在する側面とは異なるように人間の手によって操作されている場合、ポリペプチドは「操作された」と考えられる。一般的な慣行であり、当業者によって理解されるように、操作された細胞の子孫は、実際の操作が以前の実体に対して行われたとしても、典型的には依然として「操作された」と呼ばれる。
本明細書において使用される場合、用語「遠位」は、追加の調節エレメント（例えば、遠位プロモーターエレメントは、それらが調節する遺伝子から数キロベース離れていてもよい調節DNA配列である）を含み得る、遺伝子の上流の核酸配列を指す。DNAまたはRNAの各鎖は、デオキシリボース（またはリボース）環上の炭素位置に基づいて命名された5’末端および3’末端を有する。本明細書において使用される場合、用語「上流」は、DNAおよび/またはRNA内の遺伝暗号の相対的な位置を指す。それぞれRNA転写が起こる5’→3’方向。
用語「外因性」は、その天然の供給源以外の細胞に存在する物質を指す。本明細書において使用される場合の用語「外因性」は、核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）またはポリペプチドであって、その核酸またはポリペプチドが通常は見出されず、その核酸またはポリペプチドをそのような細胞または生物に導入することが望まれる生物系、例えば、細胞または生物に、人間の手を含むプロセスによって導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。あるいは、「外因性」は、核酸またはポリペプチドであって、その核酸またはポリペプチドが比較的少量に見出され、細胞または生物内のその核酸またはポリペプチドの量を増加させて、例えば、異所性の発現またはレベルをもたらすことが望まれる生物系、例えば、細胞または生物に、人間の手を含むプロセスによって導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。対照的に、用語「内因性」は、生物系または細胞にとって天然の物質を指す。本明細書において使用される場合、「異所性」は、普通でない位置および/または量で見出される物質を指す。異所性物質は、所与の細胞内に通常見出されるが、はるかに少ない量および/または異なる時間に見出されるものであり得る。異所性には、その天然の環境では所与の細胞内に自然に見出されない、または発現されない物質、例えば、ポリペプチドまたは核酸も含まれる。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載される核酸、例えば阻害性核酸は、ベクターに含まれる場合に提供または投与される。本明細書において記載されるいくつかの局面では、核酸配列は、ベクターに作動可能に連結される。本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間での移動のために設計された核酸構築物を指す。本明細書において使用される場合、ベクターはウイルス性または非ウイルス性であり得る。
用語「ベクター」は、適切な制御エレメントと関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移入することができる任意の遺伝子エレメントを包含する。ベクターには、限定されることなく、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンが含まれ得る。ベクターは、プラスミドまたはレンチウイルスベクターであり得る。
本明細書において使用される場合、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも1つの要素を含み、かつウイルスベクター粒子に包装される能力を有する核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、必須ではないウイルス遺伝子の代わりに、本明細書において記載されるポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。ベクターおよび/または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで任意の核酸を細胞に移すために利用され得る。当技術分野において、多数の形態のウイルスベクターが公知である。
「組換えベクター」とは、異種核酸配列、またはインビボで発現することができる「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。本明細書において記載されるベクターは、局面のいずれかのいくつかの態様では、他の好適な組成物および治療法と組み合わせることができることを理解されたい。局面のいずれかのいくつかの態様では、ベクターはエピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象の関心対象のヌクレオチドを高コピー数の染色体外DNAに維持する手段を提供し、それによって、染色体統合の潜在的な影響を排除する。局面のいずれかのいくつかの態様では、ベクターは組換えであり、例えば、少なくとも2つの異なる供給源に由来する配列を含む。局面のいずれかのいくつかの態様では、ベクターは、少なくとも2つの異なる種に由来する配列を含む。局面のいずれかのいくつかの態様では、ベクターは、少なくとも2つの異なる遺伝子に由来する配列を含み、例えば、少なくとも1つの非天然（例えば、異種）遺伝子制御エレメント（例えば、プロモーター、サプレッサー、アクチベーター、エンハンサー、応答エレメントなど）に作動可能に連結された発現産物をコードする融合タンパク質または核酸を含む。
本明細書において使用される場合、用語「異種」は、外来種に由来するか、同じ種に由来する場合その元の形態から実質的に改変されている核酸配列またはポリペプチドを意味する。
局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターまたは核酸は、コドン最適化されており、例えば、核酸配列の天然配列または野生型配列は、改変または操作された核酸が天然/野生型配列と同じポリペプチド発現産物をコードするが、所望の発現系では改善された効率で転写および/または翻訳されるように代替コドンを含むように改変または操作されている。局面のいずれかのいくつかの態様では、発現系は、天然/野生型配列の供給源以外の生物（またはそのような生物から得られた細胞）である。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび/または核酸配列は、哺乳動物または哺乳動物細胞、例えば、マウス、マウス細胞またはヒト細胞内の発現のためにコドン最適化されている。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび/または核酸配列は、ヒト細胞内の発現のためにコドン最適化されている。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび/または核酸配列は、酵母または酵母細胞内の発現のためにコドン最適化されている。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび/または核酸配列は、細胞内の発現のためにコドン最適化されている。局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび/または核酸配列は、大腸菌（E.coli）細胞内の発現のためにコドン最適化されている。
本明細書において使用される場合、用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのRNAまたはポリペプチドの発現を導くベクターを指す。発現される配列は、必ずしもではないが、細胞に対して異種であることが多い。発現ベクターは、追加のエレメントを含み得、例えば、発現ベクターは、2つの複製系を有し、したがって、発現ベクターを2つの生物内で、例えば、発現のためのヒト細胞内ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主内で維持することを可能にし得る。
用語「調節配列」は、それらが作動可能に連結されている遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。そのような調節配列は、例えば、Goeddel；Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.（1990）に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列の例には、哺乳動物細胞内の高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび/またはエンハンサーが挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーター、伸長因子1-アルファ1（eEF1a1）プロモーターまたはβ-グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列が使用され得る。真核生物プロモーターは、転写因子IID（TFIID）に結合し、転写開始複合体の成分のその後の配位を可能にし、RNAポリメラーゼIIの動員および転写の開始を促進する遺伝子の上流に位置するDNAの調節領域である。複雑なプロモーターを有する遺伝子は、エンハンサーおよびサイレンサーなどの調節エレメントを選択的に利用する可能性が高く、必要に応じて様々なレベルの発現を可能にする。
本明細書において使用される場合、用語「治療する（treat）」、「治療（treatment）」「治療（treating）」または「改善（amelioration）」は、治療的処置を指し、その目的は、疾患または障害、例えば、肺感染症および/または肺炎症に関連する状態の進行または重症度を逆転、軽減、改善、阻害、減速または停止することである。用語「治療する（treating）」は、状態に関連する状態、疾患または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を低減または軽減することを含む。1つまたは複数の症状または臨床マーカーが低下している場合、治療は一般に「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減または停止している場合、治療は「有効」である。すなわち、「治療」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、治療がない場合に予測されるものと比較して、症状の進行または悪化の停止または少なくとも遅延も含む。有益なまたは所望の臨床結果には、限定されることなく、検出可能であろうと検出不能であろうと、1つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の減弱、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の延長または遅延、疾患状態の改善または緩和、寛解（部分的であろうと全体的であろうと）、および/または死亡率の低下が含まれる。疾患の「治療」という用語はまた、疾患の症状または副作用の軽減（緩和処置を含む）を提供することを含む。
本明細書において使用される場合、用語「薬学的組成物」は、薬学的に許容される担体、例えば、製薬業界で一般的に使用される担体と組み合わせた活性作用物質を指す。「薬学的に許容される」という語句は、穏当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、合理的な利益/リスク比に相応した、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した化合物、材料、組成物および/または剤形を指すために本明細書において使用される。局面のいずれかのいくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、水以外の担体であり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、クリーム、エマルジョン、ゲル、リポソーム、ナノ粒子および/または軟膏であり得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、人工担体または操作された担体、例えば、活性成分が天然に存在することが見出されないであろう担体であり得る。
本明細書において使用される場合、用語「投与する」は、所望の部位に作用物質の少なくとも部分的な送達をもたらす方法または経路による、対象への本明細書において開示される化合物の配置を指す。本明細書において開示される化合物を含む薬学的組成物は、対象に対して効果的な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。局面のいずれかのいくつかの態様では、投与は、物理的な人間の活動、例えば、注射、摂取行為、適用行為、および/または送達装置または機械の操作を含む。そのような活動は、例えば、医療専門家および/または治療されている対象によって行われ得る。
本明細書において使用される場合、「接触する」は、少なくとも1つの細胞に作用物質を送達または曝露するための任意の好適な手段を指す。例示的な送達方法には、限定されることなく、細胞培養培地への直接送達、灌流、注射、または当業者に周知の他の送達方法が含まれる。局面のいずれかのいくつかの態様では、接触は、物理的な人間の活動、例えば、注射；分配、混合および/またはデカンテーションの行為；および/または送達装置または機械の操作を含む。
用語「統計的に有意」または「有意に」は、統計的有意性を指し、一般に、2標準偏差（2SD）以上の差を意味する。
動作例以外、または他に示されている場合を除き、本明細書において使用される構成要素の量、または反応条件を表すあらゆる数字は、用語「約」によっていずれの場合も修飾されると理解されるべきである。用語「約」は、割合に関連して使用される場合、±1％を意味し得る。
本明細書において使用される場合、用語「含む（comprising）」は、提示された定義された要素に加えて他の要素も存在し得ることを意味する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
用語「からなる（consisting of）」は、本明細書において記載される組成物、方法およびそれらのそれぞれの構成要素を指し、態様のその説明に記載されていないいかなる要素も除外する。
本明細書において使用される場合、用語「から本質的になる」は、所与の態様に必要な要素を指す。該用語は、本発明のその態様の基本的および新規または機能的な特性に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を可能にする。
本明細書において使用される場合、用語「特異的結合」は、2つの分子、化合物、細胞および/または粒子間の化学的相互作用を指し、ここで、第1の実体は、非標的である第3の実体に結合するよりも高い特異性および親和性で第2の標的実体に結合する。局面のいずれかのいくつかの態様では、特異的結合とは、第2の標的実体に対する第1の実体の親和性を指し得、この親和性は、第3の非標的実体に対する親和性の少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍またはそれ以上である。所与の標的に特異的な試薬とは、利用されているアッセイの条件下でその標的に特異的な結合を示す試薬である。
単数形の用語「a」、「an」および「the」は、文脈上別途明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という語句は、文脈上別途明確に示されない限り、「および」を含むことを意図している。本明細書において記載されるものと同様または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。略語「例えば（e.g.）」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書において非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「例えば（e.g.）」は、用語「例えば（for example）」の同義語である。
本明細書において開示される、本発明の代替的な要素または態様の群分けは、限定として解釈されるべきではない。各群構成要素は、個別に、または群の他の構成要素もしくは本明細書において見出される他の要素と任意に組み合わせて参照および特許請求され得る。便宜および/または特許性の理由から、ある群の1つまたは複数の構成要素が、ある群に包含されるか、ある群から削除され得る。そのようないずれかの包含または削除が生じる場合、本明細書は、本明細書において、改変された群を含み、したがって、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の記述された説明を満たすと見なされる。
本明細書において別途定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書において記載される特定の方法、プロトコルおよび試薬などに限定されず、それ自体が変化し得ることを理解されたい。本明細書において使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。免疫学および分子生物学の一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,20th Edition,published by Merck Sharp＆Dohme Corp.,2018（ISBN 0911910190,978-0911910421）；Robert S. Porter et al.（eds.）,The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine,published by Blackwell Science Ltd.,1999-2012（ISBN 9783527600908）；and Robert A. Meyers（ed.）,Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995（ISBN 1-56081-569-8）；Immunology by Werner Luttmann,published by Elsevier,2006；Janeway’s Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver（eds.）,W.W.Norton＆Company,2016（ISBN 0815345054,978-0815345053）；Lewin’s Genes XI,published by Jones＆Bartlett Publishers,2014（ISBN-1449659055）；Michael Richard Green and Joseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA（2012）（ISBN 1936113414）；Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA（2012）（ISBN 044460149X）；Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Jon Lorsch（ed.）Elsevier,2013（ISBN 0124199542）；Current Protocols in Molecular Biology（CPMB）,Frederick M. Ausubel（ed.）,John Wiley and Sons,2014（ISBN 047150338X,9780471503385）,Current Protocols in Protein Science（CPPS）,John E. Coligan（ed.）,John Wiley and Sons,Inc.,2005；およびCurrent Protocols in Immunology（CPI）（John E. Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe,（eds.）John Wiley and Sons,Inc.,2003（ISBN 0471142735,9780471142737））に見出すことができ、これらの内容はいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
他の用語は、本発明の様々な局面の説明の中で本明細書において定義されている。
本出願にわたって引用された参照文献、交付済み特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含むすべての特許および他の刊行物は、例えば、本明細書において記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記述される方法を説明および開示する目的のために、参照により本明細書に明白に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日よりも前のそれらの開示のために単に提供される。この点に関していかなるものも、本発明者らが、先行発明であるとの理由で、または他のいずれかの理由により、そのような開示に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきではない。これらの文献の日付に関する言明または内容に関する説明はいずれも、本出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付または内容が正確であると決して認めるものではない。
本開示の態様の説明は、網羅的であることも、本開示を厳密な開示された形式に限定することも意図するものではない。本開示の特定の態様および実施例は、説明目的のために本明細書において記載されているが、関連技術の当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の改変が可能である。例えば、方法の工程または機能は所与の順序で示されているが、代替的な態様は、異なる順序で機能を行ってもよいか、機能が実質的に同時に行われてもよい。本明細書において提供される本開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書において記載される様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。本開示の局面は、本開示のなおさらなる態様を提供するために、必要であれば、上記の参考文献および出願の組成物、機能および概念を使用するように変更することができる。さらに、生物学的機能の等価性の考慮に起因して、種類または量の点で生物学的作用または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくらかの変更を加えることができる。これらおよび他の変更は、詳細な説明に照らして本開示に加えることができる。そのようなすべての改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるように意図される。
前述の態様のいずれかの特定の要素は、他の態様の要素と組み合わせるか、他の態様の要素に置き換えることができる。さらに、本開示の特定の態様に関連する利点がこれらの態様の文脈において説明されてきたが、他の態様もそのような利点を示し得、また、必ずしもすべての態様が本開示の範囲内に入るためにそのような利点を示す必要はない。
本明細書に記載された技術のいくつかの態様は、以下の番号のパラグラフのいずれかに従って定義され得る。
1. (a)造血エンハンサーエレメント、および
HSC拘束性miRNAに対するmiRNA結合部位
から選択される少なくとも1つの異種調節配列と、
(b)GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列と
を含む、核酸配列。
2. 少なくとも1つの造血エンハンサーエレメントを含む、パラグラフ1の核酸配列。
3. エンハンサーエレメントが、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:38および/またはSEQ ID NO:39からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同性の配列を含む、パラグラフ2の核酸配列。
4. エンハンサーエレメントが、
Kellメタロエンドペプチダーゼ（KEL）、5’アミノレブリン酸シンターゼ2（ALAS2）およびグリコホリンA（GYPA）
からなる群より選択される遺伝子のエンハンサーエレメントを含む、パラグラフ2の核酸配列。
5. 少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位を含む、パラグラフ1～4のいずれかの核酸配列。
6. 少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位が、miR10aT、miR125、miR155、miR130aT、miR142T、miR196bT、miR99、miR126miR126、miR181、miR193、miR223T、miR542およびlet7eに対するmiR結合部位からなる群より選択される、パラグラフ1～5のいずれかの核酸配列。
7. 少なくとも1つの造血エンハンサーエレメントと、少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位とを含む、パラグラフ1～6のいずれかの核酸配列。
8. (a)(i)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、
(ii)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または
(iii)1～25個の上流コドンuAUG
を含む、異種5’UTR；および/または
(b)造血エンハンサーミニ遺伝子
をさらに含む、パラグラフ1～7のいずれかの核酸配列。
9. (a)(i)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、
(ii)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または
(iii)1～25個の上流コドンuAUG
を含む、5’UTR；
(b)GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列
を含む、核酸配列。
10. 5’UTRが、Runt関連転写因子1（RUNX1）、LIMドメインオンリー2（LIM Domain Only 2）（LMO2）またはETSバリアント6（ETS Variant 6）（ETV6）からなる群より選択される遺伝子の5’UTRを含む、パラグラフ1～9のいずれかの核酸配列。
11. 少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント、HSC拘束性miRNAに対するmiRNA結合部位、および/または造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）をさらに含む、パラグラフ1～10のいずれかの核酸配列。
12. (a)造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）；
(b)GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列
を含む、核酸配列。
13. 造血エンハンサーミニ遺伝子（mG1HEM）が、SEQ ID NO:13のヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同性の配列を含む、パラグラフ12の核酸配列。
14. (i)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、
(ii)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または
(iii)1～25個の上流コドンuAUG
を含む、5’UTR；および/または
少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント；および/または
HSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位
をさらに含む、パラグラフ12または13の核酸配列。
15. GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列が、
Runt関連転写因子1（RUNX1）、少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント、および/またはHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位
からなる群より選択される遺伝子の5’UTR配列である、パラグラフ14の核酸配列。
16. 少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する結合部位が、SEQ ID NO:31～37および43～55から選択される配列を含む、パラグラフ1～15のいずれかの核酸配列。
17. 造血エンハンサーエレメントが、SEQ ID NO:10、11、12、38および39から選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む、パラグラフ1～16のいずれかの核酸配列。
18. 5’UTR配列が、SEQ ID NO:14、15および16から選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む、パラグラフ1～17のいずれかの核酸配列。
19. (a)および(b)のエレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む、パラグラフ1～18のいずれかの核酸配列。
20. プロモーターが、GATA1プロモーターではない、パラグラフ19の核酸配列。
21. プロモーターが、伸長因子1-アルファ1（eEF1a1）のプロモーター配列を含む、パラグラフ20の核酸配列。
22. GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列が、ヒトGATA1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも60％の配列同一性を含む、パラグラフ1～21のいずれかの核酸配列。
23. GATA1ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された転写後調節エレメント
をさらに含む、パラグラフ1～22のいずれかの核酸配列。
24. 転写後調節エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）を含む、パラグラフ23の核酸配列。
25. 配列内リボソーム進入部位をさらに含む、パラグラフ1～24のいずれかの核酸配列。
26. 配列内リボソーム進入部位が、マーカー遺伝子に作動可能に連結され、マーカー遺伝子が、光学的に可視のタンパク質または酵素をコードする、パラグラフ25の核酸配列。
27. SEQ ID NO:8、9、61および62から選択される配列を含む、パラグラフ1～26のいずれかの核酸配列。
28. ベクターである、パラグラフ1～27のいずれかの核酸配列。
29. ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、パラグラフ28の核酸配列。
30. パラグラフ1～30のいずれかの核酸配列を含む、レンチウイルス粒子。
31. パラグラフ1～31のいずれかの核酸配列または粒子と薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
32. その必要がある対象においてダイアモンド・ブラックファン貧血を治療する方法であって、パラグラフ1～31のいずれかの核酸配列、粒子または組成物の治療有効量を患者に投与する工程を含む、前記方法。
33. 初期赤芽球前駆細胞特異的GATA1発現を回復させる方法であって、初期赤芽球前駆細胞を含む細胞集団をパラグラフ1～31のいずれかの核酸配列、粒子または組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
34. 初期赤芽球前駆細胞が、DBA関連遺伝子変異を含む、パラグラフ33の方法。
本明細書に記載された技術のいくつかの態様は、以下の番号のパラグラフのいずれかに従って定義され得る。
1. (a)造血エンハンサーエレメント、および
HSC拘束性miRNAに対するmiRNA結合部位
から選択される少なくとも1つの異種調節配列と、
(b)GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列と
を含む、核酸配列。
2. 少なくとも1つの造血エンハンサーエレメントを含む、パラグラフ1の核酸配列。
3. エンハンサーエレメントが、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:38および/またはSEQ ID NO:39からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同性の配列を含む、パラグラフ2の核酸配列。
4. エンハンサーエレメントが、
Kellメタロエンドペプチダーゼ（KEL）、5’アミノレブリン酸シンターゼ2（ALAS2）およびグリコホリンA（GYPA）
からなる群より選択される遺伝子のエンハンサーエレメントを含む、パラグラフ2の核酸配列。
5. 少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位を含む、パラグラフ1～4のいずれかの核酸配列。
6. 少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位が、miR10aT、miR125、miR155、miR130aT、miR142T、miR196bT、miR99、miR126miR126、miR181、miR193、miR223T、miR542およびlet7eに対するmiR結合部位からなる群より選択される、パラグラフ1～5のいずれかの核酸配列。
7. 少なくとも1つの造血エンハンサーエレメントと、少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位とを含む、パラグラフ1～6のいずれかの核酸配列。
8. (a)(i)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、
(ii)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または
(iii)1～25個の上流コドンuAUG
を含む、異種5’UTR；および/または
(b)造血エンハンサーミニ遺伝子
をさらに含む、パラグラフ1～7のいずれかの核酸配列。
9. (a)(i)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、
(ii)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または
(iii)1～25個の上流コドンuAUG
を含む、5’UTR；
(b)GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列
を含む、核酸配列。
10. 5’UTRが、Runt関連転写因子1（RUNX1）、LIMドメインオンリー2（LIM Domain Only 2）（LMO2）またはETSバリアント6（ETS Variant 6）（ETV6）からなる群より選択される遺伝子の5’UTRを含む、パラグラフ1～9のいずれかの核酸配列。
11. 少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント、HSC拘束性miRNAに対するmiRNA結合部位、および/または造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）をさらに含む、パラグラフ1～10のいずれかの核酸配列。
12. (a)造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）；
(b)GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列
を含む、核酸配列。
13. 造血エンハンサーミニ遺伝子（mG1HEM）が、SEQ ID NO:13のヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同性の配列を含む、パラグラフ12の核酸配列。
14. (i)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、
(ii)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または
(iii)1～25個の上流コドンuAUG
を含む、5’UTR；および/または
少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント；および/または
HSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位
をさらに含む、パラグラフ12または13の核酸配列。
15. GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列が、
Runt関連転写因子1（RUNX1）、少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント、および/またはHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位
からなる群より選択される遺伝子の5’UTR配列である、パラグラフ14の核酸配列。
16. 少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する結合部位が、SEQ ID NO:31～37および43～55から選択される配列を含む、パラグラフ1～15のいずれかの核酸配列。
17. 造血エンハンサーエレメントが、SEQ ID NO:10、11、12、38および39から選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む、パラグラフ1～16のいずれかの核酸配列。
18. 5’UTR配列が、SEQ ID NO:14、15および16から選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む、パラグラフ1～17のいずれかの核酸配列。
19. (a)および(b)のエレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む、パラグラフ1～18のいずれかの核酸配列。
20. プロモーターが、GATA1プロモーターではない、パラグラフ19の核酸配列。
21. プロモーターが、伸長因子1-アルファ1（eEF1a1）のプロモーター配列を含む、パラグラフ20の核酸配列。
22. GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列が、ヒトGATA1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも60％の配列同一性を含む、パラグラフ1～21のいずれかの核酸配列。
23. GATA1ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された転写後調節エレメント
をさらに含む、パラグラフ1～22のいずれかの核酸配列。
24. 転写後調節エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）を含む、パラグラフ23の核酸配列。
25. 配列内リボソーム進入部位をさらに含む、パラグラフ1～24のいずれかの核酸配列。
26. 配列内リボソーム進入部位が、マーカー遺伝子に作動可能に連結され、マーカー遺伝子が、光学的に可視のタンパク質または酵素をコードする、パラグラフ25の核酸配列。
27. SEQ ID NO:8、9、61および62から選択される配列を含む、パラグラフ1～26のいずれかの核酸配列。
28. ベクターである、パラグラフ1～27のいずれかの核酸配列。
29. ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、パラグラフ28の核酸配列。
30. パラグラフ1～30のいずれかの核酸配列を含む、レンチウイルス粒子。
31. パラグラフ1～31のいずれかの核酸配列または粒子と薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
32. その必要がある対象においてダイアモンド・ブラックファン貧血を治療する方法であって、パラグラフ1～31のいずれかの核酸配列、粒子または組成物の治療有効量を患者に投与する工程を含む、前記方法。
33. 初期赤芽球前駆細胞特異的GATA1発現を回復させる方法であって、初期赤芽球前駆細胞を含む細胞集団をパラグラフ1～31のいずれかの核酸配列、粒子または組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
34. 初期赤芽球前駆細胞が、DBA関連遺伝子変異を含む、パラグラフ33の方法。
35. その必要がある対象におけるダイアモンド・ブラックファン貧血の治療に使用するための、パラグラフ1～31のいずれかの核酸配列、粒子または組成物。
本明細書において記載される技術は、以下の実施例によってさらに説明されており、以下の実施例はさらに限定的であると決して解釈されるべきではない。
実施例1:GATA1遺伝子療法を使用するDBAの治療のための方法
先天性低形成性貧血としても知られるダイアモンド・ブラックファン貧血（DBA）は、1938年に最初に記載された症状であり、患者の骨髄内の赤血球前駆細胞および赤血球前駆体の欠乏を特徴とするが、造血の他のあらゆる側面は、表面上正常な様式で起こる（1、2）。DBAは、100,000～200,000人の出生に約1人発生すると推定されているが（3）、これは、発現度の変動を有することが判明しているか誤診された可能性がある多数の個体を考慮すると過小評価であり得る。何十年もの間、DBAの診断は臨床基準に基づいて主に行われ、DBA患者の約80％で上昇するバイオマーカー、赤血球アデノシンデアミナーゼの使用によって補助された（3）。
1990年代の大部分にまたがる広範囲なマッピング作業の後、DBAでは、変異した最初の遺伝子が、第19染色体上の転座を有する個体の特定を通じて1999年に発見された（4）。驚くべきことに、DBA症例の約20～約25％では、遍在的に発現されるリボソームタンパク質（RP）遺伝子RPS19であるこの初期変異遺伝子にヘテロ接合機能喪失変異が同定された。これは、根底にある機構、およびRPS19のリボソーム性または非リボソーム性の役割が関与し得るかどうかに関して多くの推測を直ちにもたらした。いくつかのその後の試験では、リボソーム生合成障害が、RPハプロ不全の結果として、この表現型に対する主要な寄与因子であると思われることが実証され、リボソーム活性/レベルがこの表現型に果たす役割が示唆された（5）。ただし、この障害の赤芽球特異性の根本的な根拠は依然として不明であった。
標的化シーケンシング、一塩基多型マイクロアレイ/比較ゲノムハイブリダイゼーションを使用したコピー数変異の評価、または全エクソームシーケンシングのいずれかを使用した、DBA患者のコホートを対象としたその後の試験により、RPハプロ不全をもたらすヘテロ接合機能喪失変異を有する合計19個の異なるRPが明らかにされた（6、7）。まとめると、これらの変異により、DBA症例の約60～約80％の原因が明らかにされる。これらの19個のRP遺伝子変異は、リボソーム全体に不均一に分布しており、リボソームの大（60 S）サブユニットおよび小（40 S）サブユニットの両方を含む。リボソームの特定の構造領域上に変異のクラスターは存在しない（8）。さらに最近では、本発明者らは、DBAと診断された患者450例超のコホートに対する全エクソームシーケンシングによって、今回、追加の7個のRP遺伝子変異を同定し、この障害に関与するRP遺伝子の総数を、DBA症例の約80％の根本的な根拠を集合的に明らかにする26個（リボソームを構成するRPのほぼ1/3）まで持って行った（9）。
DBAの遺伝的原因の大部分の理解が進んだにもかかわらず、2つの主要な制限が存在している。大部分のDBA症例におけるヘテロ接合RP機能喪失変異の堅固な発見にもかかわらず、これがどのようにしてDBAの赤芽球特異的造血欠陥をもたらし得るかは不可解なままである（10）。第2に、現時点でDBA患者を治療するために利用可能な治療法は非常に限られている（3、10）。一部の患者はコルチコステロイドに応答するが、患者の大部分では、この治療法の長期的な効果を制限する重大な副作用が存在することが多い。多くの患者は慢性的な赤血球輸血を必要とし、慢性的な赤血球輸血は重大かつ鉄過剰を制御するのが困難であり得る。最後に、一部の患者は、同種骨髄移植の使用によって治癒させることができるが、この症状での非血縁ドナー移植で認められる不良な転帰を考慮すると、一般に、これは適合した兄弟ドナーを有する患者に限定される（11）。現在までに開発された実験的治療法の候補は限られており、多くは残念ながら、後の段階の前臨床試験または臨床試験では堅固な効果を示していない（12）。したがって、RP遺伝子に主に影響を及ぼす多数の異なる変異に起因して、この症状を有する患者の大部分に対して有効であり得る、DBAのための新規かつ改善された治療法が大いに必要とされている。
これらの制限を念頭に置いて、本発明者らは、機構的追跡と組み合わせたヒト遺伝学の使用を通してDBAをさらに試験することによって、この障害への洞察がさらに深まり、改善された治療戦略を特定することが可能になり得ると判断した。その後、本発明者らは、この障害における最初の非RP遺伝子変異を特定した。本発明者らは、造血マスター転写因子GATA1の長いタンパク質形態の産生を損なう変異を有するDBAと診断された数例の患者を特定した（13）。同様のタイプの変異を有する数例の他の患者も続いて報告された（14～16）。これらの知見は、GATA1変異がDBAに似た表現型を引き起こし得ることを実証したが、さらに一般的に観察されるRP遺伝子変異とGATA1変異との間に分子的なつながりがあるかどうかは不明のままであった。
本発明者らは、DBAの最も一般的な原因であるRPハプロ不全がGATA1翻訳を変化させ得るかどうかを試験した。本発明者らは、初代ヒト造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）ならびにDBA患者試料におけるRP抑制を使用して、GATA1 mRNA翻訳はRPハプロ不全の状況では損なわれたが、この状況では様々な他の赤芽球重要転写産物はそれらの翻訳に関して影響を受けなかったことを実証することができた（15）。さらに、本発明者らは、レンチウイルス発現によるGATA1タンパク質レベルの増加が、様々なRP遺伝子変異を有するDBA患者由来の単核細胞に存在する赤芽球分化欠陥を（正常個体に見られるレベルまで）救済するのに十分であることを実証した。これらの結果は、図1に示すように、DBAの病因に関するモデルをもたらした。
ただし、いくつかの疑問が残っている。（1）RPハプロ不全の状況では、リボソームがどのように変化しているのかは正確には不明であった。この場合、リボソームの組成を変化させることが可能であったが、この症状における28個の異なるRP変異の発見により、これは可能性が低いように思われた。相互に排他的ではないが、別の可能性は、RPハプロ不全の状況ではリボソームレベルが低下したことであった。（2）初期の試験で特異的に試験されたものを超える転写産物の範囲、およびそれらの転写産物に共通する特徴は不明のままであった。（3）これらの欠陥が出現した造血の段階も不明であった。
次いで、本発明者らは、どの転写産物が、DBA関連分子的損傷に起因してリボソームレベルのこの減少によって影響を受けたかをゲノムレベルでさらによく理解するために、リボソームプロファイリング手法を使用した（19、20）。本発明者らは、赤芽球分化における機能的欠陥が生じる段階である、赤芽球系列の関与を受けているRPハプロ不全HSPCから高品質リボソームプロファイリングデータを得ることができた。重要なことに、このデータの分析を通して、本発明者らは、約500個の転写産物の限定されたセットが、RPハプロ不全の状況（RPS19またはRPL5の抑制に類似）では翻訳効率の最も顕著な変化を示すことを示すことができた。本発明者らがポリソーム分析からの知見を以前に標的としたことと一致して、GATA1 mRNAは、翻訳効率に関して最もダウンレギュレートされた転写産物の1つであった。興味深いことに、翻訳ダウンレギュレーションを示す他の転写産物の大部分は、あらゆるRPならびに様々な翻訳開始因子および伸長因子を含むリボソームまたはリボソーム関連因子のあらゆる成分であった。本発明者らは、遺伝子発現のキャップ分析を使用してこれらの転写産物の5’非翻訳領域（UTR）を定義することによってさらに分析すると、ベースラインで最も高度に翻訳され、短く、かつ構造化されていない5’UTRを有する転写産物が、RPハプロ不全の状況では翻訳レベルでダウンレギュレートされる傾向があることを示すことができた。興味深いことに、あらゆる造血マスター転写産物因子の中で、GATA1のみが短い5’UTRを有し、本発明者らは、この5’UTRを他のマスターレギュレーター（例えば、RUNX1、LMO2またはETV6）の5’UTRに置き換えると、この重要な造血転写因子の翻訳が変化したことを示すことができた。
最後に、本発明者らはまた、これがDBA患者ではインビボで起こることを実証し、本発明者らはこれらの病変が現れる造血の段階を評価した。本発明者らは、骨髄生検標本中のGATA1に対する免疫組織化学的検査、および細胞内フローサイトメトリーの使用によって、DBA患者由来の造血前駆細胞ではGATA1レベルが低下したことを示した。重要なことに、本発明者らは、対照試料と比較して、DBA患者骨髄細胞由来の非常に原始的なCD34＋CD38-HSPCでは、GATA1レベルがその最も早い発現であっても低下したことを実証した（図3）。さらに、本発明者らは、GATA1レベルがさらに成熟したCD34＋CD38＋HSPCでは増加したとしても、DBA患者細胞ではGATA1レベルが比較的低いままであることを見出した。これらの結果は、造血系統の関与が幹細胞および前駆細胞の最も原始的な段階で起こるという新たなモデルと一致しており、ヒト疾患に対するこれらの知見の関連性を実証している（21～23）。
これらの機構的所見はいずれも、DBAの病因の理解を改善するために重要な意味を有する。ただし、DBAに対してどのようにしてさらに良好な治療法を開発することができるかに関して依然として課題が残っていた。上述のように、現在利用可能な唯一の治療法は、コルチコステロイドの慢性的使用、定期的な輸血、または同種造血幹細胞移植である（10）。代替的かつ有益な手法では、遺伝子療法と組み合わされた自家造血幹細胞移植が使用されるであろう（24）。実際、RPS19の産生増加を可能にするレンチウイルスベクターを開発しようと試みられている（25）。DBA患者に存在する多面的なRP遺伝子変異（これまでに28の変異が同定されている）を考慮すると、この手法が患者の大部分にどのように有用であり得るかを想定するのは困難である。GATA1タンパク質産生の障害があらゆるDBA症例の根底にあり、GATA1タンパク質の増加がこれらの患者に存在する赤芽球分化欠陥を救済するのに十分であるという本発明者の知見を考慮すると、GATA1遺伝子療法の開発は、DBA患者に対して治癒的治療を達成するための有益な手法である。主な制限は、以下に詳細に説明するように、造血幹細胞（HSC）区画内のGATA1の発現が幹細胞を早期に分化させ、最終赤血球生成中のGATA1の発現を調節する必要があることである。
DBA患者由来のHSPCではGATA1タンパク質レベルは抑制され、GATA1発現を増加させることにより、DBAに特徴的な、赤芽球系列が関与する欠陥を改善することができるが、GATA1の発現調節不全が問題となり得る。HSCは、外因性GATA1発現を伴う早期分化を受ける可能性があり、効果的な最終赤血球生成は、GATA1レベルの調節を必要とする。
本発明者の機構的試験に基づくと、DBAの治療のためのGATA1遺伝子療法の開発は説得力があり、有望な手法であると思われる。本発明者らは、様々なRP遺伝子に様々な分子的損傷を有するDBA患者由来の初代HSPCでは、GATA1発現の増加が、赤芽球分化欠陥を救済し得ることを実証することができた。さらに、本発明者らはまた、RNA干渉に基づく手法によって、初代HSPCでモデル化された様々なDBA関連分子的損傷にわたって同じ結果を定期的にもたらすことができることを示すことができた（15、17）。これらの場合、レンチウイルスの使用によってGATA1の増大した発現が達成され、この場合、変化した5’および3’UTRエレメントを含むGATA1 cDNAが、高レベルかつ遍在的な発現を示すレンチウイルスLTRの転写制御下にあった。治療目的では、そのような発現は、分化プロセスの様々な段階で調節および調整されなければならない。GATA1レベルは、造血のいかなる変動も避けるために制御されなければならない。
以前の試験では、マウスHSC内のGata1の外因性の調節されていない発現が、長期生着が可能な自己再生HSCの維持を防止しながら、巨核球系列および赤芽球系列への早期分化を促進し得ることが示されている（26、27）。実際、外因性Gata1発現は、他の造血系列を再プログラムして赤芽球運命を担うことができる（26）。ただし、Gata1導入遺伝子の調節された発現は、HSCの長期維持を可能にし得る（27）。ヒトの状況においてこれらの知見を強化するために、本発明者らは、培養時に数日間にわたってヒトHSCの長期生着の維持を可能にする（免疫不全異種移植片レシピエントを生着させることができる）無血清培養系を利用した。この状況では、レンチウイルスLTRエレメントによって調節された外因性GATA1発現の導入は、これらの細胞の早期分化を引き起こすのに対して、対照細胞は、長期造血移植片を生じさせるそれらの表現型および機能的能力を維持した。これらの知見は、マウスモデルにおける以前に公開された結果を拡大する（26）。これらの結果はまた、治癒的レンチウイルス遺伝子療法手法に必要とされるように、効果的な生着を可能にするために初期HSC内のGATA1発現を防止する必要性を集合的に強調する。さらに、GATA1レベルは、効果的な赤血球生成を損なう可能性があるため、最終赤芽球分化中に過度に上昇させてはならない（28）。これらの問題に対処するために、本発明者らは、レンチウイルスベクターからのGATA1の調節された発現を可能にする重要な調節エレメントを同定するための一連の試験を行った。
効果的な遺伝子療法のためのGATA1の調節された発現を達成するために、本発明者らは、2つの相補的かつ相乗的な手法を採用して、潜在的に有害な異所性発現がないことを確実にしたほか、赤芽球分化の過程でGATA1のレベルも調節した。いずれかの手法を単独で使用することができるか、それらを組み合わせることができることが本明細書において企図される。
遺伝子療法ベクターに使用されている第1の調節エレメントは、造血中にGATA1の忠実な発現を達成するために4つの異なる調節エレメントを連結するGATA1造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）である（27、29）。これらのエレメントには、-3kb造血エンハンサー、上流二重GATAモチーフ、上流CACCCボックス、およびGATA1の第1のイントロンのセグメントが含まれる。実際、このミニ遺伝子に存在する979個のヌクレオチドは、Gata1ノックアウトマウスを救済し、一見正常な赤血球生成を可能にするようにGata1 cDNA発現を適切に促進するのに十分である。
臨床的に使用可能であり、上記の第1の転写調節エレメントを含むGATA1発現ベクターを開発するために、本発明者らは、ヒト臨床試験で有効であることが既に証明されている安全でよく設計されたベクターを利用する。様々なヒト造血細胞型において制御され、かつ十分に調節された外因性cDNA発現を示し、臨床現場で利用されているpRRL.PPT.EFSベクター（30）は、そのようなベクターの1つである。G1HEMは、代替的かつ相補的な手法として、内因性プロモーターによって、または改変された（短縮された）遍在性EF1αプロモーター（EFS）によってともに促進されるGATA1 cDNAの上流に組み込むことができる。重要なことに、上述のように、マウス由来のG1HEMに含まれるGata1調節エレメントは、Gata1が通常発現される細胞型においてのみマーカー遺伝子の調節された発現を促進することができ、Gata1 cDNAを使用してノックアウトマウスの適切な救済を可能にするのに十分である（27、31）。
本発明者らは、合計4つの異なるベクター（いずれの場合もマウスおよびヒトの両方の調節エレメントが使用されている、図6に示す2つ）を作製した。本発明者らは、GATA1 cDNAの後に自己切断2Aペプチド（P2A）エレメント、続いてVenus蛍光マーカーを組み込んで、GATA1を発現する細胞をリアルタイムで容易に追跡することができた。フローサイトメトリーアッセイを使用して、試験した様々な造血細胞型に見られるVenus発現の程度を定量した。この転写因子を通常発現する細胞型におけるGATA1発現の増加の程度は、特定の集団の細胞選別を行うことによって評価することができる。最後に、本発明者らは、この初代細胞培養手法を使用して、GATA1発現とともに生じる表現型の変異を評価することができる（32～34）。この強力な手法により、本発明者らが、インビボでの造血のプロセスに直接関連する合理化された手法を使用して、造血分化に対する有効性、特異性および効果を同時に決定することが可能になる。発現の特異性および有効性の両方を確認するために、2～3個の独立した初代ヒト造血細胞試料を対象として試験したあらゆるベクター。
G1HEMを構成する上述の転写調節エレメントはGATA1 cDNAの調節された発現を可能にするが、試験では、この調節エレメントを使用するとHSC区画内で発現の漏れがある可能性があることが示されている（27）。これは、長期生着を得る能力に重大な影響を及ぼし得るため（26）、HSC区画内の発現を防止しなければならない。これを達成するために、本発明者らは、ウッドチャック肝炎ウイルス（PRE）の転写後調節エレメントの後に、例えば、改変pRRL.PPT.EES誘導体に、HSC拘束性マイクロRNA（miR）、miR126に対する第2の遺伝子調節エレメントである結合エレメントを組み込んだ。PREの後の3つの反復miR126結合エレメントの挿入は、HSC区画内の導入遺伝子の発現を防止する。本発明者らはまた、これらのmiR126エレメントも含むように、G1HEMおよびGATA1 cDNAによってpRRL.PPT.EFSを改変した。有効かつ選択的な発現を確実にするために、初代ヒト造血細胞を対象としてインビトロ試験を行う。ヒト造血異種移植モデル（36）を作製するために以前に首尾よく広範囲に使用されたNOD.Cg-KitW-41J Tyr＋Prkdcscid Il2rgtm1Wjl（NBSGW）マウスモデルに移植されるHSCを形質導入することができる。次いで、表現型マーカーの定量、NBSGWレシピエントへの二次移植を使用し、表現型HSC区画内のVenus発現を評価することによって、16週間の生着後にHSC機能を試験することができる。
遺伝子療法に使用するためのGATA1 cDNAの調節された発現を可能にする、臨床グレードのレンチウイルスベクターの開発が、本明細書において記載される。初代ヒト造血におけるインビトロおよびインビボ試験は、重要なセットの転写調節エレメント（G1HEMまたはその誘導体）およびmiR126結合エレメントの両方を組み込んだ複数の独立したベクターのスクリーニングを可能にする。
参考文献
Figure 2022536481000074
Figure 2022536481000075
Figure 2022536481000076
Figure 2022536481000077
実施例2:ダイアモンド・ブラックファン貧血のための治療法としてのGATA1の系列特異的発現のためのベクター設計
局面のいずれかのいくつかの態様では、以下のレンチウイルスベクターの様々な組合せが、本明細書において記載される（図7）:
1）レンチウイルス骨格:EF1aプロモーターによって駆動され、初期の特性評価および試験のためにIRES-GFP配列を含むが、最終ベクター配列から除去されるpHIV-GFP（Welm et al Cell Stem Cell. 2008 Jan 10.2（1）:90-102）に基づく第3世代自己不活性化レンチウイルス骨格。
2）マウスGATA1造血エンハンサーミニ遺伝子（mG1HEM）:造血幹細胞ではなく赤芽細胞内でGATA1の発現を忠実に可能にすることが示されている、マウスGATA1転写開始部位の上流の3つの配列とマウスGATA1の第1のイントロンからの第4の配列との連結（Takai et al. Blood. 2013 Nov 14 122（20）:3450-3460）。
3）最小プロモーター（minP）:マウスGATA1の5’UTR由来、またはホタルルシフェラーゼレポーターベクターpGL4.25由来のいずれか、Genbankアクセッション番号DQ904457.1
4）FLAGタグを有するまたは有しないヒト細胞内の最適な発現のためのコドン最適化を伴うヒトGATA1 cDNA（GATA1）
5）導入遺伝子mRNAの安定性を高めるためのウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）
6）miR126結合部位（miR126 BS）:造血幹細胞内で発現されるマイクロRNAであるmiR126によって結合され、幹細胞区画内の導入遺伝子発現の低下を引き起こす反復配列（Gentner et al. Sci Trans Med. 2010 Nov 17 2（58）:58-84）。
参考文献:
Welm et al Cell Stem Cell. 2008 Jan 10.2（1）:90-102. Gentner et al. Sci Trans Med. 2010 Nov 17 2（58）:58-84.
実施例3:ダイアモンド・ブラックファン貧血の治療法としてのGATA1遺伝子療法
本発明者らによる前臨床試験は、赤芽細胞におけるGATA-1増強がダイアモンド・ブラックファン貧血（DBA）に対する治療効果を示すことを示した。本明細書において、本発明者らは、造血幹細胞ではなく赤芽球前駆体内のGATA1発現の調節された増加がDBAに対する治療効果をもたらすことを実証する追加の実験の結果を示す。
DBAのための臨床的に重要なGATA1遺伝子療法ベクターは、4つの重要な機能を達成しなければならない（図27）。第1に、遺伝子療法ベクターが長期未分化造血幹細胞（LT-HSC）のゲノムに組み込まれるという要件にもかかわらず、HSC内のGATA1発現は自己再生幹細胞の喪失をもたらすため、幹細胞区画内のGATA1導入遺伝子の発現は極めて少なくなければならない。第2に、DBAの特徴である赤芽球分化欠陥を克服するために、遺伝子療法ベクターは、赤芽球分化に関与した後、初期前駆細胞内で堅牢な発現を促進しなければならない。第3に、内因性GATA1発現のパターンを模倣し、正常な最終赤芽球分化を達成するために、遺伝子療法ベクターからの発現は、赤芽球発達の後期段階で低下するはずである。第4に、GATA1発現の発達的に調節された増加は、実験モデル系および一次患者試料においてリボソームタンパク質ハプロ不全によって引き起こされる赤芽球成熟ブロックを克服するのに十分でなければならない。
上記の4つの重要な特徴を組み込んだベクターを設計するために、本発明者らは、GATA1の上流のアクセス可能なクロマチンピークを最初に分析し、HSCまたは他の初期前駆細胞ではなく赤芽球細胞の分化時に開いているクロマチンを同定した。本発明者らは、DNAのこれらの領域が、GATA1の赤芽球特異的発現に関与する調節エレメントを含むという証拠を提供する。本発明者らは、DNAの3つの領域をGATA1の上流のオープンクロマチンと連結することによって、ヒトGATA1エンハンサー（hG1E）エレメントを構築した（図28A）。本発明者らは、hG1Eエレメントを使用して、2つの遺伝子間に配列内リボソーム進入部位（IRES）配列を含めることによってGATA1およびGFPの両発現を促進するベクターを開発した。発達的に調節された導入遺伝子発現を達成するための追加の機構として、本発明者らは、hG1Eエレメントと、HSC区画内で導入遺伝子発現を制限するために以前に使用されていたmiR223T結合部位とを組み合わせた。
hG1E-GATA1構築物またはhG1E-GATA1-miR構築物がGATA1発現の十分な増加を促進することができるかどうかを評価するために、本発明者らはDBAのインビトロモデルを使用した。本発明者らが以前に示したDBA遺伝子RPS19を標的とするshRNAベクターに感染させた初代ヒトCD34＋HSPCは、DBAに特徴的なインビトロでの赤芽球分化欠陥を模倣することができた。本発明者らは、赤血球新生条件下で培養した場合に赤芽球マーカーを発現する細胞の割合として赤芽球比を定義した。hG1E-GATA1ベクターまたはhG1E-GATA1-miRベクターに共感染させた場合、CD34＋HSPCは、HMD-GATA1ベクターによる構成的GATA1過剰発現に匹敵するレベルで、RPS19ノックダウン後に回復した赤芽球比を有し、DBA表現型の救済を示した（図28B）。本発明者らは、hG1E-GATA1ベクターおよびhG1E-GATA1-miRベクターが生理学的に重要であるのに十分なGATA1発現を促進することができるという追加の証拠として、内因性GATA1発現を欠くG1Eマウス造血細胞株を使用した。Ter119発現によって測定した場合、hG1E-GATA1ベクターおよびhG1E-GATA1-miRベクターによるG1E細胞の感染は、最終赤芽球分化を誘導した（図28C）。
赤芽球前駆細胞内のGATA1発現の機能的に十分な増加が達成され、本発明者らは、これらの細胞内のGATA1発現が骨髄内の幹細胞の維持を損なうため、本発明者らの新規調節エレメントがLT-HSC区画内のGATA1発現を制限し得るかどうかを決定しようとした。本発明者らは、CD34＋HSPCにhG1E-GATA1ベクターまたはhG1E-GATA1-miRベクターを感染させ、それらをインビトロでの短期HSC維持を可能にする条件で培養した。感染の2日後、GFP発現と、LT-HSCマーカーの表面発現とをフローサイトメトリーによって評価して、LT-HSC内の導入遺伝子発現を定量した。次いで、これらの細胞を赤芽球発達を促進する培地に移し、分化赤芽球前駆体内のGFP発現を測定した。GATA1の構成的発現を有するHMD-GATA1ウイルスと比較して、hG1E-GATA1ウイルスおよびhG1E-GATA1-miRウイルスに感染させた細胞では、赤芽細胞内のGFP発現とHSC内のGFPとの比（RBCGFP/HSCGFP比）が有意に増加した（図28D）。RBCGFP/HSCGFP比の増加は、HSC内の実験ベクターの発現の制限に起因する。これらのデータにより、赤芽球前駆体内の調節された増加したGATA1発現は、2つの異なるインビトロDBAモデルにおいて分化ブロックを克服するのに十分であり、LT-HSC区画内の発現を制限したことが明らかにされる。GATA1発現のこの発達的に忠実な増加は、調節されたGATA1過剰発現に基づく遺伝子療法手法が、ダイアモンド・ブラックファン貧血の実行可能な治療法であり得ることを示す。
発達中の赤芽細胞内のhG1E-GATA1ベクターからのGATA1の発現をさらに調査するために、本発明者らは、三相培養系を使用して、完全にヘモグロビンを発現した脱核赤血球にインビトロで分化するようにヒトHSPCを誘導した。インビトロ分化中、発達中の赤芽球前駆細胞および赤芽球前駆体は、高レベルのトランスフェリン受容体CD71を最初に発現する。数日後、グリコホリンA（CD235a）が高度に発現され、続いて最終分化RBC内でCD71発現が失われる（図5a）。HMD-GATA1またはhG1E-GATA1による形質導入後、赤芽球発達のために既にプライミングされている細胞は、陰性対照と比較したCD71を発現する細胞の割合によって測定される比較的迅速な初期分化を受ける（図29B）。次に、本発明者らは、最終分化CD71-CD235a＋サブセットにおけるGFP発現と、それよりも原始的なCD71＋CD235a＋サブセットにおけるGFP発現（赤血球GFP/前駆細胞GFP）とを比較した。最終分化赤血球ではhG1E-GATA1ベクターからのGFP発現が有意に減少し、最終分化中のGATA1発現の減少パターンを忠実に再現している。特に、予想外ではないが、このGFP発現の減少はHMD-GATA1試料では見られず、調節されていないGATA1発現を伴う最終分化の障害が示された（図29C）。
次に、本発明者らは、RPS19のCRISPR/Cas9媒介性遺伝子破壊を使用することによって、健常成人ドナーから単離された初代HSPCにおけるRPS19ハプロ不全を再現しようとした。本発明者らは、RPS19の効率的な編集が、初期赤芽球培養中にCD71を発現する細胞が著しく少なくなる赤芽球成熟ブロックをもたらすことを示した。次いで、本発明者らは、RPS19編集HSPCをHMD空ウイルス、HMD-GATA1ウイルスまたはhG1E-GATA1ウイルスを用いて形質導入した。培養4日目に赤芽球分化に関与した細胞（CD71発現によって測定）のうち、HMD-GATA1ウイルスまたはhG1E-GATA1ウイルスに感染させた集団の方が多くのCD235発現を有し（図30A）、DBAに見られるリボソームタンパク質の喪失によって誘導される赤芽球分化のブロックを救済するためのGATA1発現の制御された増加の能力が確認された。最後に、hG1E-GATA1によって部分的に救済されたRPS19編集後のメチルセルロースコロニー形成アッセイで検出された赤芽球コロニーの有意な減少があった（図30B）。全体として、本発明者らのデータは、hG1E-GATA1ベクターが、DBAのための遺伝子療法治療であるために必要とされる4つの基準をいずれも満たすことを明らかにしている（図27）。

Claims (35)

  1. (a)造血エンハンサーエレメント、および
    HSC拘束性miRNAに対するmiRNA結合部位
    から選択される少なくとも1つの異種調節配列と、
    (b)GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列と
    を含む、核酸配列。
  2. 少なくとも1つの造血エンハンサーエレメントを含む、請求項1記載の核酸配列。
  3. エンハンサーエレメントが、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:38および/またはSEQ ID NO:39からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同性の配列を含む、請求項2記載の核酸配列。
  4. エンハンサーエレメントが、
    Kellメタロエンドペプチダーゼ（KEL）、5’アミノレブリン酸シンターゼ2（ALAS2）およびグリコホリンA（GYPA）
    からなる群より選択される遺伝子のエンハンサーエレメントを含む、請求項2記載の核酸配列。
  5. 少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位を含む、請求項1～4のいずれか一項記載の核酸配列。
  6. 少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位が、miR10aT、miR125、miR155、miR130aT、miR142T、miR196bT、miR99、miR126miR126、miR181、miR193、miR223T、miR542およびlet7eに対するmiR結合部位からなる群より選択される、請求項1～5のいずれか一項記載の核酸配列。
  7. 少なくとも1つの造血エンハンサーエレメントと、少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位とを含む、請求項1～6のいずれか一項記載の核酸配列。
  8. (a)(i)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、
    (ii)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または
    (iii)1～25個の上流コドンuAUG
    を含む、異種5’UTR；および/または
    (b)造血エンハンサーミニ遺伝子
    をさらに含む、請求項1～7のいずれか一項記載の核酸配列。
  9. (a)(i)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、
    (ii)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または
    (iii)1～25個の上流コドンuAUG
    を含む、5’UTR；
    (b)GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列
    を含む、核酸配列。
  10. 5’UTRが、Runt関連転写因子1（RUNX1）、LIMドメインオンリー2（LIM Domain Only 2）（LMO2）またはETSバリアント6（ETS Variant 6）（ETV6）からなる群より選択される遺伝子の5’UTRを含む、請求項1～9のいずれか一項記載の核酸配列。
  11. 少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント、HSC拘束性miRNAに対するmiRNA結合部位、および/または造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）をさらに含む、請求項1～10のいずれか一項記載の核酸配列。
  12. (a)造血エンハンサーミニ遺伝子（G1HEM）；
    (b)GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列
    を含む、核酸配列。
  13. 造血エンハンサーミニ遺伝子（mG1HEM）が、SEQ ID NO:13のヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同性の配列を含む、請求項12記載の核酸配列。
  14. (i)GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列、
    (ii)少なくとも20ヌクレオチド酸の配列、および/または
    (iii)1～25個の上流コドンuAUG
    を含む、5’UTR；および/または
    少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント；および/または
    HSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位
    をさらに含む、請求項12または13記載の核酸配列。
  15. GATA1以外の造血転写因子の5’UTR配列が、
    Runt関連転写因子1（RUNX1）、少なくとも1つの造血エンハンサーエレメント、および/またはHSC拘束性miRNAに対する少なくとも1つのmiRNA結合部位
    からなる群より選択される遺伝子の5’UTR配列である、請求項14記載の核酸配列。
  16. 少なくとも1つのHSC拘束性miRNAに対する結合部位が、SEQ ID NO:31～37および43～55から選択される配列を含む、請求項1～15のいずれか一項記載の核酸配列。
  17. 造血エンハンサーエレメントが、SEQ ID NO:10、11、12、38および39から選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む、請求項1～16のいずれか一項記載の核酸配列。
  18. 5’UTR配列が、SEQ ID NO:14、15および16から選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む、請求項1～17のいずれか一項記載の核酸配列。
  19. (a)および(b)のエレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項1～18のいずれか一項記載の核酸配列。
  20. プロモーターが、GATA1プロモーターではない、請求項19記載の核酸配列。
  21. プロモーターが、伸長因子1-アルファ1（eEF1a1）のプロモーター配列を含む、請求項20記載の核酸配列。
  22. GATA結合因子1（GATA1）ポリペプチドをコードする配列が、ヒトGATA1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも60％の配列同一性を含む、請求項1～21のいずれか一項記載の核酸配列。
  23. GATA1ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された転写後調節エレメント
    をさらに含む、請求項1～22のいずれか一項記載の核酸配列。
  24. 転写後調節エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）を含む、請求項23記載の核酸配列。
  25. 配列内リボソーム進入部位をさらに含む、請求項1～24のいずれか一項記載の核酸配列。
  26. 配列内リボソーム進入部位が、マーカー遺伝子に作動可能に連結され、マーカー遺伝子が、光学的に可視のタンパク質または酵素をコードする、請求項25記載の核酸配列。
  27. SEQ ID NO:8、9、61および62から選択される配列を含む、請求項1～26のいずれか一項記載の核酸配列。
  28. ベクターである、請求項1～27のいずれか一項記載の核酸配列。
  29. ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項28記載の核酸配列。
  30. 請求項1～30のいずれか一項記載の核酸配列を含む、レンチウイルス粒子。
  31. 請求項1～31のいずれか一項記載の核酸配列または粒子と薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
  32. その必要がある対象においてダイアモンド・ブラックファン貧血を治療する方法であって、請求項1～31のいずれか一項記載の核酸配列、粒子または組成物の治療有効量を患者に投与する工程を含む、前記方法。
  33. 初期赤芽球前駆細胞特異的GATA1発現を回復させる方法であって、初期赤芽球前駆細胞を含む細胞集団を請求項1～31のいずれか一項記載の核酸配列、粒子または組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
  34. 初期赤芽球前駆細胞が、DBA関連遺伝子変異を含む、請求項33記載の方法。
  35. その必要がある対象におけるダイアモンド・ブラックファン貧血の治療に使用するための、請求項1～31のいずれか一項記載の核酸配列、粒子または組成物。
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