JP2022536368A - 非結核性マイコバクテリウム疾患用抗生物質の増強 - Google Patents

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Abstract

本発明は、患者に１つ以上の抗生物質（例えば、アミノグリコシド系抗生物質）を投与することと、患者の肺に増強剤組成物（例えば、脂肪族カルボン酸）を投与することと、を含む、非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）感染症を治療するための方法及び組成物に関する。ネブライザーにより投与するための単位用量製剤もまた記載される。【選択図】図４Ａ

Description

優先権
本出願は、その全容を参照により本明細書に援用するところの２０１９年６月１３出願の米国特許仮出願第６２／８６０，９９０号に基づく優先権及びその利益を主張する。
本発明は、非結核性マイコバクテリウム感染症、特に肺の感染症を治療するための方法及び組成物に関する。本発明は、抗生物質の増強剤組成物を提供する。
非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）肺疾患は、マイコバクテリウム、特に結核またはハンセン病を引き起こさないマイコバクテリウム種による感染を特徴とする疾患である。ＮＴＭは環境から獲得され、水及び土中でしばしば見出される。これらの生物は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支拡張症、嚢胞性線維症、喘息、原発性線毛運動不全症、及びα１アンチトリプシン症などの肺基礎疾患を有する人に一般的に感染するが、肺疾患の既往歴のない個人も罹患する場合がある。最も一般的な症状としては、持続性の咳、疲労、体重減少、寝汗、ならびに場合により息切れ及び血の混じった咳（喀血）が挙げられる。罹患者は、反復性呼吸器感染症を有する場合があり、これにより肺に進行性損傷をもたらす場合がある。
現在の治療法には、一般的に、アミノグリコシド（例えば、アミカシンまたはストレプトマイシン）、マクロライド（例えば、アジスロマイシンまたはクラリスロマイシン）、エタンブトール、及びリファンピンのうちの１つ以上による治療などの抗生物質の組み合わせが含まれる。治療はしばしば１８ヶ月以上にわたって継続されるが、治療によって感染が完全に消失しないことがしばしばある（Ｒｙｕ ＹＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ’Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｔｕｂｅｒｃ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．２０１６Ａｐｒ；７９（２）：７４－８４．）。さらに、ＮＴＭに対する現在の抗生物質レジメンには重大な毒性のリスクがある。
したがって、ＮＴＭを治療するための改善された、及び／または代替的な治療法が求められている。
マイコバクテリウムバイオフィルムは、抗生物質による治療時の細菌の生存にとって都合がよく、バイオフィルムはインビボでの感染症の確立にとって重要である。抗生物質に対する細菌の生存能力は、パーシスター細胞（ｐｅｒｓｉｓｔｅｒ ｃｅｌｌ）としても知られる薬剤（抗生物質）耐性細胞の生成をはじめとする多くの防御機構によって説明がなされている。パーシスター細胞はしばしばバイオフィルム中に存在し、こうした薬剤耐性細胞の存在は、治療後の持続性細菌感染症の再発をもたらすおそれがある。
本発明は、異なる態様及び実施形態において、患者のＮＴＭ感染症を治療するための方法及び組成物（単位用量を含む）を提供するものである。本明細書に開示される方法及び組成物は、抗生物質レジメンの有効性を改善し、及び／または抗生物質耐性の発生を防止することにより、従来の治療法と比較して大幅に速やかにＮＴＭ感染症を消失させ、または管理することができる。
いくつかの態様では、本発明は、患者に１つ以上の抗生物質を投与することと、患者の肺に増強剤組成物を投与することと、を含む。さまざまな実施形態において、増強剤組成物は、クレブス回路の代謝産物、β酸化経路の代謝産物、脂質異化の代謝産物、アルカン酸またはアルカン酸塩、及びグリセロールから選択される１つ以上の代謝産物を含む。本発明の各実施形態によれば、抗生物質増強量の代謝産物（複数可）が、肺への増強物質の吸入によって細菌感染／コロニー形成の解剖学的部位に、場合によりアミログリコシド（例えば、アミカシンまたはトブラマイシンなど）などの抗生物質との共製剤として送達される。さまざまな実施形態において、相当量の代謝産物が感染（貪食細胞に侵入し、細胞中で持続するＮＴＭを含む）の局所部位に到達して粘膜バイオフィルムに浸透し、肺上皮ライニング液中で抗生物質の作用を増強させるために利用可能となる。増強剤化合物は、バイオフィルム中、及び栄養制限環境中のＮＴＭによって利用される炭素基質を含む。
いくつかの実施形態では、増強剤組成物は、脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルを含む。いくつかの実施形態では、脂肪族モノまたはジカルボン酸は、直鎖もしくは分枝鎖脂肪酸、またはそれらの塩もしくはエステルである。例示的な実施形態では、増強剤組成物は、プロパン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；ブタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；２－メチルプロパン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；ペンタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；３－メチルブタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；カプロン酸、４－メチルペンタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；セバシン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；及びピルビン酸、またはそれらの塩もしくはエステルのうちの１つ以上を含む。
上記に代えてまたは上記に加えて、増強剤組成物は、グリセロール及び／または酢酸を含む。上記に代えてまたは上記に加えて、増強剤組成物は、ポリソルベートを含む、バイオフィルムＮＴＭ微生物によって炭素基質として利用されうる脂肪族乳化剤化合物を含む。例示的なポリソルベートとしては、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ポリソルベート４０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）、またはポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が挙げられる。
さまざまな実施形態において、増強剤組成物は吸入される粉末またはエアロゾルとして投与することができる。さまざまな実施形態において、増強剤組成物はネブライザーによって投与される。いくつかの実施形態では、増強剤組成物は、本明細書に記載される脂肪族増強剤化合物を含有することができる、リポソームまたはエマルションを含む。増強剤組成物は、共製剤化されるかまたは経口もしくは静脈内投与などによって別々に投与される抗生物質を増強するうえで有効である。
さまざまな実施形態において、患者は、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、エタンブトール、及びリファマイシンから選択される１つ以上のものなど、１つ以上の抗生物質を投与される。いくつかの実施形態では、アミノグリコシド（例えば、アミカシン）は肺に局所投与され、場合により粉末製剤または噴霧製剤である。例えば、増強剤組成物は、アミカシン、及び本明細書に記載される脂肪族増強剤化合物のような増強剤、及び／またはグリセロール及び／または酢酸を含むリポソーム製剤とすることができる。
いくつかの実施形態では、患者は、アジスロマイシンまたはクラリスロマイシンなどのマクロライド系抗生物質を投与される。
さまざまな実施形態において、増強剤組成物及び／または抗生物質療法の単位用量は、少なくとも週３回投与される。いくつかの実施形態では、増強剤組成物及び／または抗生物質療法の単位用量（本明細書に記載される）は、１日１回または２回投与される。いくつかの実施形態では、増強剤組成物の投与では、約１年以下、または約９ヶ月以下、または約６ヶ月以下の投与期間が可能である。すなわち、本明細書に開示される方法及び組成物は、抗生物質療法の有効性を改善することにより、及び／または抗生物質耐性細菌の発生を防止することにより、従来の療法よりも大幅に速やかにＮＴＭ感染症を消失させる。
いくつかの実施形態では、抗生物質またはその塩は、ネブライザーにより投与される水溶液または懸濁液またはエマルションとして製剤化される。いくつかの実施形態では、製剤は、ネブライザーを使用して投与することができる、アミノグリコシド系抗生物質またはその塩（例えば、アミカシン）と、１つ以上の脂肪族増強剤とのリポソーム製剤である。さまざまな実施形態において、本方法及び組成物は、遠位誘導気道が持続性感染症を有する可能性が高い、慢性ＮＴＭ肺疾患を有する患者を含む患者において、アミノグリコシド系抗生物質及び有効量の増強剤（複数可）の遠位誘導気道への送達を可能とする。
さまざまな実施形態において、対象は、Ｍ．Ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｍｉｎｉｓｓｕｉｓ （ＭＡＨ）、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ （ＭＡＣ） （Ｍ．ａｖｉｕｍ及び Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、またはその他のものが関与する非結核性マイコバクテリウム感染症を有する。いくつかの実施形態では、ＮＴＭ感染症は、慢性または再発性である。例えば、いくつかの実施形態では、アミノグリコシドを用いない従来の抗生物質レジメン（少なくとも約６ヶ月にわたって適用される）は、感染症を根絶または管理するうえで有効ではなかった。
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明より明らかとなろう。
Ａ及びＢは、バイオフィルム中のＭ．ａｖｉｕｍは、炭素基質を代謝する能力がより低いことを示す。Ｍ．ａｖｉｕｍの浮遊培養（白い棒）及びバイオフィルム培養（黒い棒）を、Ｂｉｏｌｏｇ ＰＭ１（Ａ）及びＰＭ２Ａ（Ｂ）表現型マイクロアレイプレート中に存在する代謝基質を利用するそれらの能力について試験した。両方の培養を、１００μｌのＢｉｏｌｏｇ接種液（ＧＮ／ＧＰ－ＩＦ－０ａ）中、３７℃で７日間、ＰＭ１及びＰＭ２Ａプレートで培養し、適当な添加剤及び１×Ｂｉｏｌｏｇレドックス色素ミックスＧを添加した。各実験はエンドポイントアッセイとして行った。データは、実施した３つの実験の結果の平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。＊Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。 Ａ～Ｃは、脂肪酸が浮遊Ｍ．ａｖｉｕｍ細胞の増殖を促進することを示す。マイコバクテリウムを、グリセロール（２Ｃ）、プロピオン酸（２Ｂ）、酪酸（２Ａ）を添加した７Ｈ９ブロス中、攪拌下、３７℃で１２日間培養した（各破線）。このアッセイでは、本発明者らは、７Ｈ９培地にｔｗｅｅｎ（登録商標）（２０または８０）も、グリセロールもＯＡＤＣ（オレイン酸、アルブミン、デキストロース、及びカタラーゼ）も添加しなかった。ネガティブコントロールとして、Ｍ．ａｖｉｕｍをいずれの添加物質も加えずに７Ｈ９ブロスのみで培養した（実線）。データは、３重で実施した４つの実験の結果の平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。＊：Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。 Ａ～Ｄは、短鎖脂肪酸及びグリセロールがＭ．ａｖｉｕｍのバイオフィルム形成に影響することを示す。９６ウェルポリスチレンプレートに１×１０８細菌／ｍｌを含む７Ｈ９ブロス中で調製した１００μｌのマイコバクテリウム懸濁液を播種することによってバイオフィルム形成を行った。Ｍ．ａｖｉｕｍ １０４の静的バイオフィルムを３７℃で７日間形成させた後、クリスタルバイオレット法によって評価を行った。アッセイは、プロピオン酸（Ａ）、酪酸（Ｂ）、カプロン酸（Ｃ）、及びグリセロール（Ｄ）を添加するかまたは添加しない７Ｈ９培地中で行った。本実験では、７Ｈ９培地にｔｗｅｅｎ（登録商標）（２０または８０）も、グリセロールも、ＯＡＤＣも添加しなかった。データは、８重の技術的重複で実施した３つの実験の結果の平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。Ａ～Ｃ＊＊：１％の脂肪酸（プロピオン酸、酪酸、及びカプロン酸）、ならびに０．５％の脂肪酸と培養したＭ．ａｖｉｕｍのバイオフィルムは、他の濃度と培養したＭ．ａｖｉｕｍと比較して有意な減少を示した（Ｐ＜０．０５％）。Ｄ＊：Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。 Ａ～Ｄは、グリセロール、酪酸、プロピオン酸、及びカプロン酸との培養がクラリスロマイシンの殺滅能を高めることを示す。９６ウェルポリスチレンプレート中で確立させたＭ．ａｖｉｕｍ １０４のバイオフィルムを、７Ｈ９のみ、代謝産物を添加した７Ｈ９、７Ｈ９＋クラリスロマイシン、及び代謝産物を添加した７Ｈ９＋クラリスロマイシンと７２時間培養した。Ａは、プロピオン酸のデータを示す。Ｂは、酪酸のデータを示す。Ｃは、カプロン酸のデータを示す。Ｄは、グリセロールのデータを示す。次いで、各ウェルをピペッティングで５０回混合して付着した細菌を除去し、各試料を希釈し、生細菌の総数を知るためにコロニー形成単位を得た。データは、４重で実施した各実験の結果の平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。＊：Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
発明の詳細な説明
本発明は、対象の肺の細菌感染症を治療または予防するための、特に患者の肺のＮＴＭ感染症を管理または消失させるための方法及び組成物を提供する。本明細書に開示される方法及び組成物は、抗生物質レジメンの有効性を改善し、及び／または抗生物質耐性の発生を防止することにより、従来の治療法と比較して大幅に速やかにＮＴＭ感染を消失させ、または管理する。
抗生物質による治療は、パーシスターすなわち薬剤耐性細菌の表現型を誘導し、細菌細胞が抗生物質に対して耐性を有する（または忍容性を有する）代謝的な休眠状態に入る。したがって、抗生物質は慢性感染症を管理する助けとはなるが、常にこれを根絶するわけではない。多くの抗生物質の臨床的影響は、この誘導された細菌耐性のために失われてしまう。パーシスターまたは薬剤耐性細胞はしばしばバイオフィルム中に存在し、こうした薬剤耐性細胞の存在は、治療後の持続性細菌感染症の再発をもたらすおそれがある。
さらに、ＮＴＭは、マクロファージの内部の細胞内で増殖及び生存し、これが一部において薬剤耐性を誘導する可能性がある。例えば、ＮＴＭは粘膜に侵入してマクロファージによって貪食されるが、食胞内でＮＴＭは安定した増殖性を示す場合がある。さらに、ＮＴＭパーシスターは、肺病変内ばかりでなく、粘膜及びバイオフィルム内でも出現するものと考えられる。マクロファージ内部の細菌の抗生物質による殺滅性を増強する化合物または組成物は、極めて有用と考えられる。
ＮＴＭの例示的な感染症には、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｍｉｎｉｓｓｕｉｓ （ＭＡＨ）、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＡＣ）（Ｍ．ａｖｉｕｍ及びＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．ｃｈｉｍａｅｒａ、Ｍ．ｃｏｎｓｐｉｃｕｕｍ、Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ （Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ及びＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、またはこれらの組み合わせなどのさまざまな非結核性マイコバクテリウムの種が関与しうる。いくつかの実施形態では、患者は、Ｍ．ａｖｉａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＡＣ）の感染症を有する。
いくつかの実施形態では、患者は、特に、嚢胞性線維症（ＣＦ）、非嚢胞性線維症気管支拡張症（非ＣＦＢＥ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息などの基礎慢性肺疾患状態を有し、これらはＮＴＭ感染によって悪化し、重大な肺障害または肺機能低下のリスクを与える。いくつかの実施形態では、患者は、ＮＴＭ感染症に対する従来の抗生物質療法を受けているが、この療法が少なくとも６ヶ月後に感染を完全に消失することができなかった者である。
いくつかの態様では、本発明は、患者の肺のＮＴＭ感染症を治療するための方法を提供する。本方法は、患者に１つ以上の抗生物質を投与することと、患者の肺に増強剤組成物を投与することと、を含む。さまざまな実施形態において、増強剤組成物は、特に、クレブス回路の代謝産物、β酸化経路の代謝産物、脂質異化の代謝産物、アルカン酸またはアルカン酸塩、及びグリセロールから選択される１つ以上の代謝産物を含む。
本発明の各実施形態によれば、抗生物質増強量の代謝産物（複数可）が、肺への増強物質の吸入によって細菌感染／コロニー形成の解剖学的部位に、場合によりアミログリコシド（例えば、アミカシンまたはトブラマイシンなど）などの肺への送達に適した抗生物質との共製剤として送達される。さまざまな実施形態において、相当量の代謝産物が感染（貪食細胞に侵入し、細胞中で持続するＮＴＭを含む）の局所部位に到達して粘膜バイオフィルムに浸透し、肺上皮ライニング液中で抗生物質の作用を増強させるために利用可能となる。増強剤化合物は、バイオフィルム中、及び栄養制限環境中のＮＴＭによって利用される炭素基質を含む。
いくつかの実施形態では、増強剤組成物は、脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルを含む。いくつかの実施形態では、脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルは、最大１６個の炭素原子を含むか、または最大１０個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、脂肪族モノまたはジカルボン酸は、直鎖もしくは分枝鎖脂肪酸、またはそれらの塩もしくはエステルである。直鎖または分枝鎖脂肪酸は、短鎖脂肪酸、またはそれらの塩もしくはエステルであってよい。増強剤化合物がエステルであるいくつかの実施形態では、増強剤は、メチルまたはエチルエステルのようなアルキルエステルとすることができる。
例示的な実施形態では、増強剤組成物は、プロパン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；ブタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；２－メチルプロパン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；ペンタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；３－メチルブタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；カプロン酸、４－メチルペンタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；セバシン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；及びピルビン酸、またはそれらの塩もしくはエステルのうちの１つ以上を含む。
上記に代えてまたは上記に加えて、増強剤組成物は、グリセロール及び／または酢酸を含む。上記に代えてまたは上記に加えて、増強剤組成物は、ポリソルベートを含む、バイオフィルムＮＴＭ微生物によって炭素基質として利用されうる脂肪族乳化剤化合物を含む。例示的なポリソルベートとしては、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ポリソルベート４０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）、またはポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が挙げられる。
さまざまな実施形態では、増強剤組成物は、１つ以上の短鎖アルカノエートを含む。「短鎖アルカノエート」なる用語は、それらの塩またはエステルを含む脂肪族カルボン酸を指す。したがって、短鎖アルカノエートは、アルキル基などの脂肪族基を有する。短鎖脂肪族基（例えば、アルキル基）には、炭素原子２～６個のものが含まれる。いくつかの実施形態では、増強剤組成物は、プロピオン酸、酪酸及びカプロン酸のうちの１つ以上を含む。
さまざまな実施形態において、増強剤組成物は、患者の肺に局所投与されるように製剤化される。例えば、増強剤組成物は吸入される粉末またはエアロゾルとして投与することができる。さまざまな実施形態において、増強剤組成物はネブライザーによって投与される。いくつかの実施形態では、増強剤組成物は、本明細書に記載される脂肪族増強剤化合物を含有することができる、リポソームまたはエマルションを含む。増強剤組成物は、共製剤化されるかまたは吸入、経口もしくは静脈内投与などによって別々に投与される抗生物質を増強するうえで有効である。
さまざまな実施形態において、患者は、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、エタンブトール、及びリファマイシンから選択される１つ以上のものなど、１つ以上の抗生物質を投与される。
いくつかの実施形態では、患者は、アミカシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アプラマイシン、アルベカシン、アストロマイシン、カプレオマイシン、ジベカシン、フラマイセチン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシンＢ、イセパマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ロデストレプトマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、及びベルダマイシン、または薬学的に許容されるそれらの塩から選択されるアミノグリコシド系抗生物質を投与される。いくつかの実施形態では、患者は、アミカシンまたはストレプトマイシンまたは薬学的に許容されるそれらの塩を投与される。
いくつかの実施形態では、アミノグリコシドは肺に局所投与され、場合により粉末製剤または噴霧製剤である。例えば、いくつかの実施形態では、アミカシンは肺に局所投与され、増強剤組成物中に含有される。例えば、増強剤組成物は、アミカシン、及び本明細書に記載される脂肪族増強剤化合物のような増強剤、及び／またはグリセロール及び／または酢酸を含むリポソーム製剤とすることができる。
これらのまたは他の実施形態では、患者は、マクロライド系抗生物質を投与される。例示的なマクロライド系抗生物質としては、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、カルボマイシンＡ、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン酢酸エステル、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）、タイロシン（ｔｙｌｏｃｉｎｅ）、及びロキシスロマイシン、または薬学的に許容されるそれらの塩が挙げられる。さまざまな実施形態において、マクロライドは経口投与される。例示的な実施形態では、マクロライドは、アジスロマイシンまたはクラリスロマイシンから選択される。
これらまたは他の実施形態では、患者は、リファンピンまたはリファブチンなどのリファンピシンを投与され、これらは経口投与することができる。リファンピンは、結核、マイコバクテリウム・アビウム・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ）、ハンセン病、及びレジオネラ病をはじめとするいくつかのタイプの細菌感染症の治療に用いられる。リファンピシンは、通常、他の抗生物質と併用される。リファンピシンは、細菌ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを阻害することにより、細菌によるＲＮＡ生成を減少させることによって作用する。
これらまたは他の実施形態では、患者は、エタンブトールを投与され、これは経口投与することができる。エタンブトールは、結核及びＮＴＭ感染症の治療に主に用いられる抗生物質である。エタンブトールは、通常、他の薬剤と併用して投与される。エタンブトールは、活発に増殖する細菌に対して静菌作用を有し、細胞壁の形成を阻害することにより作用する。
いくつかの実施形態では、患者は、本明細書に開示される少なくとも２または３種類の抗生物質を含む、少なくとも２、３、または４種類の抗生物質を投与される。いくつかの実施形態では、患者に投与される抗生物質組成物または抗生剤は３または２種類以下であり、これにより特定の抗生物質毒性を防止する。
異なる実施形態では、増強剤組成物及び／または抗生物質療法は、少なくとも週３回または少なくとも週５回投与される。いくつかの実施形態では、増強剤組成物及び／または抗生物質療法は、１日１回または２回投与される。異なる実施形態では、療法の投与期間は少なくとも約６ヶ月であるが、実施形態によっては少なくとも約１２ヶ月、または少なくとも約１８ヶ月である。いくつかの実施形態では、増強剤組成物の投与では、約１年以下、または約９ヶ月以下、または約６ヶ月以下の投与期間が可能である。すなわち、本明細書に開示される方法及び組成物は、抗生物質の有効性を改善することにより、及び／または抗生物質耐性細菌の発生を防止することにより、従来の療法よりも大幅に速やかにＮＴＭ感染症を消失させる。
抗生物質（例えば、アミカシンまたはトブラマイシンなどのアミノグリコシド）が増強剤組成物中に配合される例示的な実施形態では、抗生物質増強剤は、約１０００：１～約１０：１（増強剤：アミノグリコシド）のモル比で存在してよく、または実施形態によっては、約５００：１～約１０：１、または約１００：１～約１０：１、または約５０：１～約１０：１のモル比で存在してよい。いくつかの実施形態では、アミノグリコシドは、アミカシンまたは、アミカシン硫酸塩などのその塩である。いくつかの実施形態では、製剤は、単位用量当たり約２００～約８００ｍｇのアミカシンまたはその塩を含有する。いくつかの実施形態では、製剤は、単位用量（例えば、約６００ｍｇ）当たり約４００～約６００ｍｇのアミカシンまたはその塩を含有する。
いくつかの実施形態では、抗生物質またはその塩は、ネブライザーにより投与される水溶液または懸濁液として製剤化される。いくつかの実施形態では、製剤は、抗生物質またはその塩と増強剤のリポソーム製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、約５ｍＬ～約１２ｍＬ、実施形態によっては、約６ｍＬ～約１０ｍＬの範囲の単位体積で与えられる。
さまざまなタイプのネブライザーが知られている。ネブライザーのタイプは、感染またはコロニー形成部位に到達する抗生物質及び／または増強剤の量に影響しうる。本明細書で使用する「ネブライザー」なる用語は、肺に吸入されるミストの形態で薬剤を投与するための薬剤送達装置のことを指す。ネブライザーは、酸素、圧縮空気、または超音波力を利用して溶液及び懸濁液を、装置のマウスピースから直接吸入することができる小さなエアロゾル液滴に細かくするものである。エアロゾルの肺付着特性及び有効性は、粒子または液滴のサイズに大きく依存し、例えば、粒子が小さいほど末梢に浸透して保持される可能性が高くなる。直径約５μｍよりも小さい粒子は、下気道内に高頻度で付着し、したがって、医薬用エアロゾルとして望ましい。
いくつかの実施形態では、ネブライザーはジェット式ネブライザーである。ジェット式ネブライザーは、圧縮空気または酸素を液体薬剤に通して高速で流すことで液体薬剤をエアロゾルに変えるコンプレッサーにチューブで接続され、エアロゾルはこの後、患者によって吸引される。いくつかの実施形態では、ネブライザーは超音波式ネブライザーである。超音波式ネブライザーは、電子振動子を用いて高周波の超音波を発生し、この超音波が圧電素子の機械的振動を引き起こす。この振動素子は液体リザーバと接触し、その高周波振動は蒸気ミストを発生させるのに充分である。いくつかの実施形態では、ネブライザーは、リポソーム製剤の上下気道への付着を改善するように設計された振動する穿孔された膜を用いる。
いくつかの実施形態では、増強剤組成物は、ネブライザーの使用によって送達される、単位用量当たり約２００～約８００ｍｇの抗生物質またはその塩を含有する水溶液または懸濁液またはエマルションである。いくつかの実施形態では、製剤は、単位用量当たり約４００～約６００ｍｇのアミノグリコシド（例えば、アミカシンまたはトブラマイシン）またはその塩を含有する。いくつかの実施形態では、本発明は、６００ｍｇよりも大幅に低い単位用量で同じかまたはそれ以上の有効性を有しながらアミノグリコシドまたはその塩を送達することを可能とする。いくつかの実施形態では、製剤は、単位用量当たり約２００～約４００ｍｇで抗生物質またはその塩を含有する。単位用量は、個別のアンプルで与えることができる。
アミノグリコシドであるトブラマイシンの局所送達時の嚢胞性線維症患者の肺におけるバイオアベイラビリティーは、以前より研究の対象であった。例えば、ネブライザーによる３００ｍｇのトブラマインの投与の１０分後に喀痰された痰試料は、痰１ｇ当たり１２３７μｇの平均を示した（Ｇｅｌｌｅｒ ＤＥ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ Ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，Ｃｈｅｓｔ １２２（１）（２００２））。喀痰された痰に対して、低張生理食塩水の吸入による痰の誘導によれば、しばしばＣＦにおける感染部位である、より遠位側の誘導気道からの呼吸器分泌物が採取される。この試料採取プロセスを用いることで、３００ｍｇのトブラマイシンがネブライザーによって投与された後の肺上皮液中のトブラマイシン濃度は、１２８μｇ／ｇの範囲にあると推定された（Ｒｕｄｄｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｕｔｕｍ Ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｐｅａｔｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｈａｌｅｄ Ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ，Ｊ．Ａｅｒｏｓｏｌ Ｍｅｄ．Ａｎｄ Ｐｕｌｍｏｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．２６（２）：６９－７５ （２０１３））。
さまざまな実施形態において、本方法及び組成物は、遠位誘導気道が持続性感染症を有する可能性が高い、慢性ＮＴＭ肺疾患を有する患者を含む患者において、アミノグリコシド系抗生物質及び有効量の増強剤の遠位誘導気道への送達を可能とする。
さまざまな実施形態において、ネブライザー製剤（すなわち、単位用量）は、単位用量当たり約４００ｍｇ～約５０００ｍｇの増強剤化合物を含有する。いくつかの実施形態では、製剤は、用量当たり約４００～約２５００ｍｇ、または用量当たり約４００～約２０００ｍｇの増強剤化合物を含有する。いくつかの実施形態では、増強剤及び抗生物質は、ネブライザーによって２～１０ｍＬの溶液中で投与される。ネブライザーによって投与された代謝産物は、感染及び／またはコロニー形成領域に抗生物質の作用を増強するのに充分な濃度で浸透する。
さらに他の実施形態では、製剤は、吸入用の乾燥粉末である。いくつかの実施形態では、単位用量製剤は、単位用量当たり約４００ｍｇ～約５０００ｍｇの増強剤化合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、製剤は、単位用量当たり約４００～約２５００ｍｇ、または単位用量当たり約４００～約２０００ｍｇの増強剤化合物を含有する。いくつかの実施形態では、製剤は、例えば、用量当たり約７５ｍｇ～約２００ｍｇの抗生物質（例えば、アミカシンまたはトブラマイシンなどのアミノグリコシド）またはその塩を含有することができる。粉末の単位用量製剤は、分割用量の形態とすることができ、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多い分割用量（例えば、カプセル）が吸入装置を使用して単一の用量として投与される。
乾燥粉末製剤の投与に適した例示的な吸入装置は、ＴＯＢＩ ＰＯＤＨＡＬＥＲ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。例えば、単一の分割用量を含んだカプセルを装置のカプセルチャンバに挿入し、マウスピースを上からねじ被せ、次いでカプセルを穿孔して粉末内容物を吸入する（一般的には２回の呼吸で）。残りの分割用量を続いて投与して１回の投与とする。
抗生物質（アミカシンなど）のリポソーム製剤の例示的な投与システムについては、例えば、参照によって本明細書にその全容を援用するところの米国特許第１０，５８８，９１８号、同第１０，３９８，７１９号、同第１０，２５１，９００号、同第１０，２３８，６７５号に記載されている。リポソーム製剤は、脂肪族増強剤化合物（複数可）を取り込むための便宜のよい形態であり、充分な量の脂肪族増強剤の製剤化及び細菌感染部位への充分な量の脂肪族増強剤の送達を容易にしうる。例えば、製剤は、分散液（例えば、リポソーム溶液または懸濁液）としてリポソームと複合体化された抗生物質（例えば、アミカシンまたはトブラマイシンなどのアミノグリコシド）を含むことができる。組成物のリポソーム部分は、電気的に中性の脂質を含む脂質成分、ならびに場合によりカチオン性及び／またはアニオン性脂質を含むことができる。例示的な製剤は、ホスファチジルコリン及びステロール（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びコレステロール）を含む。さまざまな実施形態において、噴霧化される際、エアロゾル化された組成物は、約１μｍ～約３．８μｍ、または約１．０μｍ～約４．８μｍ、または約３．８μｍ～約４．８μｍ、または約４．０μｍ～約４．５μｍのエアロゾルの平均液滴径を有する。いくつかの実施形態では、平均液滴径は、約５μｍ未満、または約４μｍ未満、または約３μｍ未満である。さまざまな実施形態において、リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、及びホスファチジン酸（ＰＡ）のうちの１つ以上を含む。
さまざまな実施形態において、対象は、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｍｉｎｉｓｓｕｉｓ （ＭＡＨ）、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＡＣ）（Ｍ．ａｖｉｕｍ及びＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．ｃｈｉｍａｅｒａ、Ｍ．ｃｏｎｓｐｉｃｕｕｍ、Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ （Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ及びＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、またはこれらの組み合わせが関与する非結核性マイコバクテリウム感染症を有する。いくつかの実施形態では、ＮＴＭ感染症は、慢性または再発性である。例えば、いくつかの実施形態では、アミノグリコシドを用いない従来の抗生物質レジメン（少なくとも約６ヶ月にわたって適用される）は、感染症を根絶または管理するうえで有効ではなかった。
いくつかの態様では、本発明は、ネブライザーにより投与するための単位用量製剤であって、１００～６００ｍｇのアミノグリコシド系抗生物質またはそれらの塩と、非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）に対するアミノグリコシド活性を増強するうえで有効量の脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルと、を含む、製剤を提供する。例えば、本明細書に開示されるように、脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルは、最大１６個の炭素原子を含むことができ、または最大１０個の炭素原子を含む。
いくつかの実施形態では、単位用量製剤は、直鎖もしくは分枝鎖脂肪酸、またはそれらの塩もしくはエステルである脂肪族モノまたはジカルボン酸を含む。増強剤は、短鎖脂肪酸、またはそれらの塩もしくはエステルのような１つ以上の直鎖または分枝鎖脂肪酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、短鎖脂肪酸はアルキルエステルとして提供され、アルキルエステルは場合によりメチルまたはエチルエステルである。例示的な増強剤化合物としては、プロパン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；ブタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；２－メチルプロパン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；ペンタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；３－メチルブタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；カプロン酸、４－メチルペンタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；セバシン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；及びピルビン酸、またはそれらの塩もしくはエステルが挙げられる。
これらのまたは他の実施形態では、単位用量はグリセロールをさらに含む。例えば、単位用量は、約０．５重量％～約５重量％のグリセロール、例えば、約１重量％～約５重量％のグリセロール、または約２重量％～約５重量％のグリセロールを含むことができる。上記に代えるかまたは上記に加えて、単位用量は酢酸をさらに含む。
例えば、単位用量は、アミノグリコシド系抗生物質であるアミカシンを含むことができ、アミカシンは、本明細書に記載される１つ以上の脂肪族増強剤化合物とともにリポソームに含まれる。
いくつかの実施形態では、単位用量製剤は、５～１５ｍＬのアンプル、または約５～約１０ｍＬのアンプルにパッケージングされる。
いくつかの実施形態では、製剤は、例えば、参照によって本明細書にその全容を援用するところの米国特許第１０，５８８，９１８号、同第１０，３９８，７１９号、同第１０，２５１，９００号、同第１０，２３８，６７５号に記載される抗生物質（アミカシンなど）のリポソーム製剤である。例えば、製剤は、分散液（例えば、リポソーム溶液または懸濁液）としてリポソームと複合体化された抗生物質（例えば、アミカシンまたはトブラマイシンなどのアミノグリコシド）を含むことができる。組成物のリポソーム部分は、電気的に中性の脂質を含む脂質成分、ならびに場合によりカチオン性及び／またはアニオン性脂質を含むことができる。例示的な製剤は、ホスファチジルコリン及びステロール（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びコレステロール）を含む。さまざまな実施形態において、噴霧化される際、エアロゾル化された組成物は、約１μｍ～約３．８μｍ、または約１．０μｍ～約４．８μｍ、または約３．８μｍ～約４．８μｍ、または約４．０μｍ～約４．５μｍのエアロゾルの平均液滴径を有する。いくつかの実施形態では、平均液滴径は、約５μｍ未満、または約４μｍ未満、または約３μｍ未満である。さまざまな実施形態において、リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、及びホスファチジン酸（ＰＡ）のうちの１つ以上を含む。
製剤とともに使用されるステロールとしては、これらに限定されるものではないが、コレステロール、コレステロールヘミサクシネートを含むコレステロールのエステル、コレステロール硫酸水素塩及びコレステロール硫酸塩を含むコレステロールの塩、エルゴステロール、エルゴステロールヘミサクシネートを含むエルゴステロールのエステル、エルゴステロール硫酸水素塩及びエルゴステロール硫酸塩を含むエルゴステロールの塩、ラノステロール、ラノステロールヘミサクシネートを含むラノステロールのエステル、ラノステロール硫酸水素塩、ラノステロール硫酸塩を含むラノステロールの塩、ならびにトコフェロール類が挙げられる。トコフェロール類としては、トコフェロール、トコフェロールヘミサクシネートを含むトコフェロールのエステル、トコフェロール硫酸水素塩及びトコフェロール硫酸塩を含むトコフェロールの塩を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、単位用量製剤物は、ポリソルベートを含む、バイオフィルムＮＴＭ微生物によって炭素基質として利用されうる他の脂肪族乳化剤化合物を含むことができる。例示的なポリソルベートとしては、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ポリソルベート４０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）、またはポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明は、ネブライザーによって投与するための単位用量製剤であって、水溶液またはリポソーム懸濁液中に、１００～６００ｍｇのアミノグリコシド系抗生物質またはその塩（例えば、アミカシン）と、約１００ｍｇ～約２０００ｍｇの本明細書に記載される増強剤のうちの１つまたは組み合わせ、または実施形態によっては、約５００～約１５００、または約５００～約１０００ｍｇの本明細書に記載される１つ以上の増強剤とを含む、製剤を提供する。製剤は、５～１５ｍＬの体積を有する単位用量アンプル、例えば、約５～約１０ｍＬの単位用量のアンプルにパッケージングすることができる。
いくつかの実施形態では、製剤は、ＮＴＭ肺疾患状態を有するかまたはそのリスクがある患者に投与される。いくつかの実施形態では、患者は、特に、例えば、嚢胞性線維症、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、または喘息などの既存の慢性肺疾患を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び製剤は、そのような患者の肺のＮＴＭ感染症を治療するために用いられる。いくつかの実施形態では、患者は、肺（空洞）内に空洞の瘢痕化（線維症）が認められる、空洞性疾患を有する。
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の実施例より明らかとなろう。
材料及び方法
細菌培養：
ＡＩＤＳ患者の血液から単離されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ亜種ｈｏｍｉｎｉｓｓｕｉｓ１０４（ＭＡＨ１０４）を本試験で用いた。マイコバクテリウムを、１０％ＯＡＤＣ （オレイン酸、アルブミン、デキストロース及びカタラーゼ；ＨＡＲＤＹ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ，Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ，ＣＡ）を添加した７Ｈ１０ミドルブルックブロス培地（ＳＩＧＭＡ）中、３７℃で７日間培養した。いくつかの実験では、ＭＡＨ１０４を、１０％ＯＡＤＣを添加した７Ｈ９培地中、３７℃で７日間培養した。
バイオフィルムの形成：
本試験では、これまでに記載されている静置バイオフィルムを用いた（Ｒｏｓｅ ＳＪ，Ｂｅｒｍｕｄｅｚ ＬＥ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１４；８２：４０５－１２）。簡単に述べると、マイコバクテリウムを７Ｈ１０寒天プレートから採取し、脱イオン水中に再懸濁した（１０９個のコロニー形成単位／ｍｌ；ＣＦＵ／ｍｌ）。次にこの細菌懸濁液を脱イオン水で３回洗浄して残留する７Ｈ１０培地をすべて除去した（３５００ｒｐｍ、２０℃で２０分間）。洗浄後、ＭＡＨ１０４をいずれの炭素源（ＯＡＤＣ、グリセロール、ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及びｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）も含まない７Ｈ９培地（無添加７Ｈ９）中に再懸濁し、懸濁液を静置して凝集した細菌を沈降させた。懸濁液の上半分を新しいチューブに移し、目視濁度及び光学密度を用いて１×１０８ＣＦＵ／ｍｌに調整した。懸濁液を９６ウェルポリスチレンプレート（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）（各ウェル１００μｌ［またはウェル当たり１０７個の細菌」）に接種し、示された時点で７日間または１４日間にわたって３７℃でバイオフィルムを形成させた。クリスタルバイオレットを３３％の酢酸で可溶化し、５７０ｎｍのＯＤを測定した（Ｓｔｅｐａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ２００１；２０：５０２－４）。５７０ｎｍの生ＯＤ値を、ブランクウェル（７Ｈ９培地のみのウェル）の５７０ｎｍの平均ＯＤ値から差し引いた。
浮遊及びバイオフィルムＭＡＨ１０４培養の代謝表現型試験：
９６ウェルプレートＰＭ１及びＰＭ２Ａ（ＢＩＯＬＯＧＴＭ（商標），Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を使用して浮遊培養及びバイオフィルム培養により代謝表現型試験を行った。浮遊細胞及びバイオフィルムを用いたアッセイを同時に行った。各プレートは、各炭素基質と、いずれの基質もなしで細菌を試験した１つのネガティブコントロールウェルを含むものとした。浮遊培養及びバイオフィルム培養を用いた試験を同時に行い、培養接種物を同じ継代数とした。ＢＩＯＬＯＧの推奨にしたがって、プレートＰＭ１及びＰＭ２Ａを、接種培地ＩＦ－０ａ ＧＮ／ＧＰ（１．２Ｘ）に適当なＰＭ添加剤及びＢｉｏｌｏｇ Ｄｙｅ Ｇ Ｍｉｘ（１００Ｘ）を加え、非生物反応について確認するためにＭＡＨ１０４は加えずに３７℃で７日間培養した。各実験はエンドポイントアッセイとして行った。
ＰＭプレートの浮遊細胞の接種物を調製するため、ＭＡＨ１０４を１０％ＯＡＤＣ及び０．０５％のｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を加えた７Ｈ９培地中で培養した。細胞が対数中期（５９５ｎｍのＯＤ＝０．３～０．６）に達した後、培養物を回収し、脱イオン水で３回洗浄し（遠心条件：３５００ｒｐｍ、２０℃で２０分間）、飢餓工程として２５℃で２４時間、水中で培養した。細菌懸濁液を遠心し、ペレットを１ｍｌの接種培地ＩＦ－０ａ ＧＮ／ＧＰ（１．２Ｘ）に再懸濁した。再懸濁した細胞の一部を新しいＦａｌｃｏｎチューブに１０ｍｌのＩＦ－０ａ ＧＮ／ＧＰ（１．２Ｘ）、１２０μｌのＢｉｏｌｏｇ Ｄｙｅ Ｇ Ｍｉｘ（１００Ｘ）、及び１ｍｌのＰＭ添加剤溶液（２４ｍＭ塩化マグネシウム、１２ｍＭ塩化カルシウム、０．００１２％硫酸ナトリウム塩、０．０６％クエン酸鉄アンモニウム、１．２％塩化アンモニウム、０．０１％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）とともに、細胞が透過率８１％に達するまで移した。１００μｌの体積のこの最終細菌懸濁液をＰＭ１及びＰＭ２Ａプレートの各ウェルに接種した。これらのプレートを３７℃で７日間培養し、培養後、各プレートの５９０ｎｍのＯＤを測定した。
各バイオフィルムの培養を、若干の変更を加えた以外は上記に述べたようにしてＰＭ Ｂｉｏｌｏｇプレートではなく通常のポリスチレン９６ウェルプレート中で７日間にわたって確立した。この実験ではバイオフィルムを、無添加７Ｈ９培地の代わりに、ＰＭ添加剤溶液を加えないＩＦ－０ａ ＧＮ／ＧＰ培地（１．２Ｘ）中で形成させた。バイオフィルムが確立された後、ＰＭ１及びＰＭ２Ａプレートを、Ｂｉｏｌｏｇ Ｄｙｅ Ｇ Ｍｉｘ（１００Ｘ）及びＰＭ添加剤溶液を既に含んだ、細菌を含まない１００μｌのＩＦ－０ａ ＧＮ／ＧＰ培地（１．２Ｘ）と、３７℃で３０分間培養してＰＭプレート中に存在する代謝産物を可溶化した。可溶化した基質を含むＩＦ－０ａ ＧＮ／ＧＰ（１．２Ｘ）を、バイオフィルムが形成されたウェルに移し、３７℃でさらに７日間培養した（バイオフィルムを３７℃で合計１４日間培養した）。バイオフィルム培養物から分光光度計測定値（ＯＤ５９０ｎｍ）を得るため、プレートを３５００ｒｐｍ、２０℃で２０分間遠心して細菌の指示値への干渉を低減させ、バイオフィルム上清を新しい９６ウェルプレートに移してＯＤ５９０ｎｍでの測定を行った。
Ｍ．ａｖｉｕｍのＭＡＨ１０４浮遊培養における短鎖脂肪酸及びグリセロールの影響：
ＭＡＨ１０４の浮遊培養物を、プロピオン酸、酪酸、及びグリセロール（いずれもＳＩＧＭＡより購入したもの）と培養してこれらの代謝産物が栄養制限培地（無添加の７Ｈ９）中での浮遊培養の増殖を妨げるかどうかを判定した。７Ｈ１０寒天から得たＭＡＨ１０４を使用して脱イオン水中で細菌懸濁液を調製し（１０９ＣＦＵ／ｍｌ）、次いで懸濁液を３回遠心して細菌細胞を洗浄した（３５００ｒｐｍ、２０℃で２０分間）。洗浄工程の後、細菌懸濁液を７Ｈ９培地中に再懸濁し、懸濁液を静置して凝集した細胞を沈降させた。懸濁液の上半分を新しいチューブに移し、目視濁度及び光学密度を用いて１×１０８ＣＦＵ／ｍｌに調整した。懸濁液を３ｍｌの７Ｈ９中に、異なる濃度のプロピオン酸及び酪酸（１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％）及び０．２％のグリセロールを加えるか、または加えずに接種した（５０個μｌ／５×１０６ ＣＦＵ）。これらの培養物を３７℃で１２日間培養し、ＯＤ９７５ｎｍを７５時間毎に測定した。
プロピオン酸、酪酸及びグリセロールとのバイオフィルムアッセイ：
プロピオン酸、酪酸及びグリセロールとともに培養したバイオフィルムを用いたアッセイを行ってこれらの代謝産物がバイオフィルムの形成に影響するかどうかを試験した。実験はすべて、無添加の７Ｈ９中で行った。これらの代謝産物の影響を、バイオフィルム形成の間に、予め確立されたバイオフィルム及びポリスチレンに予め付着させたＭ．ａｖｉｕｍ細胞で評価した。バイオフィルム形成の間の標的代謝産物の影響を評価するため、上記に既に述べたようにしてマイコバクテリウム懸濁液を９６ウェルポリスチレンプレート中でを調製して培養し、異なる濃度の短鎖脂肪酸（１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％）の存在下または非存在下でバイオフィルムを形成させた。グリセロールは０．２％のみを使用した。各バイオフィルムは７Ｈ９培地中、３７℃で７日間形成させた。予め確立されたバイオフィルムでは、ＭＡＨ１０４を９６ウェルプレートに再接種し、本明細書に記載されるようにしてバイオフィルムを形成させた。７日後にバイオフィルムの上清を捨てて浮遊細菌を除去し、確立されたバイオフィルムを標的代謝産物（プロピオン酸、酪酸、及びグリセロール）の存在下または非存在下で、３７℃で７日間培養した。２４時間毎にＯＤ５９５ｎｍを測定することにより、これらの代謝産物がバイオフィルム中に存在するＭＡＨ１０４細胞の増殖を促進することができるかどうかも評価した。最後に、７Ｈ９ブロス中で調製した低密度のマイコバクテリウム懸濁液（１×１０６細菌／ｍｌを含む）を９６ウェルポリスチレンプレートに播種し、３７℃で７日間培養した。上清を除去し、プレートに付着したＭ．ａｖｉｕｍ細胞を、０．０５％プロピオン酸、０．０５％酪酸及び０．２％グリセロールを添加した、またはしない７Ｈ９と培養した。予め付着させた細胞の増殖を２４時間毎にＯＤ５９５ｎｍによって経過観察した。バイオフィルム形成をクリスタルバイオレットにより標的化した。
抗生物質によるＭＡＨバイオフィルムの処理：
アミカシン（４μｇ／ｍＬ）及びクラリスロマイシン（１６μｇ／ｍＬ）に対するＭＡＨバイオフィルムの抗生物質耐性を評価するため、上記に述べたようにしてバイオフィルムを１４日間にわたって形成させた。この後、上清を静かに取り除き、抗生物質を含む、標的代謝産物（０．０５％プロピオン酸、０．０５％酪酸、または０．２％グリセロール）を添加した、またはしない新しい無添加７Ｈ９培地で３７℃で置換した。ネガティブコントロールとして、バイオフィルムをいずれの抗生物質も加えない無添加７Ｈ９のみと培養した。さらに、ＭＡＨバイオフィルムを、０．０５％プロピオン酸、０．０５％酪酸、または０．２％グリセロールのみを含む無添加７Ｈ９のみと培養した。この後、１００μｌの０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（最終濃度０．０１％）を確立されたバイオフィルムに加えて混合、希釈し、バイオフィルムの集団全体（付着及び非付着）でＣＦＵ分析を行った。
抗生物質によるヒトマクロファージ内部のＭＡＨの処理：
ヒトＴＨＰ－１細胞株（ＴＩＢ－２０２）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＧＥＭＩＮＩ ＢＩＯ－ＰＲＯＤＵＣＴＳ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を加えたＲＰＭＩ－１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。ＴＨＰ－１細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコ中で維持した。これまでに記載されているようにして（Ｒｏｊｏｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１９；１６：３９）、ＰＭＡ（ホルボール １２－ミリスタート１３－アセタート）（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ）によるＴＨＰ－１単球のマクロファージへの分化及び細胞内抗生物質殺滅アッセイを行った。アミカシン処理（４００μｇ／ｍｌで１時間）により細胞外細菌を除去した後、感染させたＴＨＰ－１マクロファージの単層をアミカシン（４μｇ／ｍｌ）、クラリスロマイシン（１６μｇ／ｍｌ）、抗生物質（アミカシンまたはクラリスロマイシン）＋標的代謝産物（０．０５％プロピオン酸、０．０５％酪酸、または０．２％グリセロール）、または標的代謝産物のみのいずれかで処理した。ネガティブコントロールとして、分化したＴＨＰ－１細胞を抗生物質の非存在下かつ代謝産物の非存在下で培養した。ＴＨＰ－１細胞に、抗生物質を含む、または含まない新しい培地を１日置きに補充した。細胞を２時間（ベースライン）及び４日目に溶解し、その後、生細菌の数を７Ｈ１０寒天プレート上のＣＦＵカウントによって決定した。
統計的分析：
対応のない両側ｔ検定を行って各群間の統計的比較を行った。統計的分析及びグラフ出力はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６．０）で行った。
実施例１：バイオフィルム中のＭ．ａｖｉｕｍは、より低い炭素基質の利用能を示した
Ｂｉｏｌｏｇ ＰＭ１及びＰＭ２Ａ表現型マイクロアレイプレートを使用して初期スクリーニングを行って、バイオフィルム中に存在する場合にどの炭素基質がＭＡＨ１０４によって利用されるかを調べた。実験は、バイオフィルム及び浮遊培養を用いた同時のエンドポイントアッセイとして計画し、次いで、両方の培養物について得られたＯＤ５９０ｎｍ値を比較した。データは、浮遊培養が１９０種（８．４％）の基質のうち、１６種を利用することができたのに対して、バイオフィルムは１１種の基質（５．７％）を利用したことを示している（表１）。
Figure 2022536368000002
 実験はエンドポイントアッセイとして３回行った。浮遊培養及び／またはバイオフィルム培養が特定の代謝産物基質を代謝することができた場合、ＮＡＤＨからの電子がレドックス色素を不可逆反応で還元してＰＭプレートのウェルに紫色を呈する。符合（＋）及び（－）は、紫色が生じたか否かをそれぞれ示す。レドックス色素の非生物反応は、細菌を含まないＧＮ／ＧＰ－ＩＦ－０ａ液を加えることによって評価した。ネガティブコントロールは、いずれの代謝産物基質も含まないウェルに相当する。ＰＭ１及びＰＭ２Ａプレートで利用可能とした他のすべての代謝産物基質は、浮遊培養によってもバイオフィルム培養によっても代謝されなかった。
浮遊細胞によって利用された代謝産物群のうち、バイオフィルムは、α－ケトグルタル酸、α－ケト酪酸、α－ヒドロキシ酪酸、アセト酢酸、及びコハク酸モノメチルを代謝することができなかった。さらに、ＭＡＨ１０４バイオフィルムは、有意に低いグリセロール（１１．１４倍低い）、ＴＷＥＥＮ （登録商標）２０ （５．４倍の減少）、ＴＷＥＥＮ（登録商標） ４０ （３．８倍低い）、酢酸（２．５５倍低い）、ＴＷＥＥＮ（登録商標） ８０ （３．４５倍の低下）、プロピオン酸（５．４９倍の低下）、ピルビン酸メチル（１．８倍低い）、ピルビン酸（２．２１倍低い）、及びカプロン酸（４．２７倍の低下）の利用能を示した（図１Ａ、Ｂ）。酪酸（バイオフィルムでＯＤ５９０ｎｍ＝０．４３０±０．０９１，浮遊でＯＤ５９０ｎｍ＝０．２８９±０．０８３，Ｐ＝０．３１）及びセバシン酸（バイオフィルムでＯＤ５９０ｎｍ＝０．４１１±０．０５９、浮遊でＯＤ５９０ｎｍ＝０．２１０±０．０６９，Ｐ＝０．０９２）では有意差は認められなかった。
実施例２：短鎖脂肪酸及びグリセロールは、栄養制限培地中の固着性Ｍ．ａｖｉｕｍの増殖を支持することができる
短鎖脂肪酸であるプロピオン酸及び酪酸、ならびにグリセロールを用いたさらなるアッセイを行って、ＭＡＨ１０４細胞に対するそれらの影響を、栄養制限培地（Ａｎｄｅｒｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２００３，４７：１２５１－６；Ｇｒｅｅｎｄｙｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２００８，５２：２０１９－２６；Ａｒｃｈｕｌｅｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）２００５；８５：１４７－５８）及びバイオフィルム（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ，ａｎｄ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１５；１０：ｅ０１２８７７２）中のＭＡＨ１０４細胞に抗生物質耐性を誘導することが知られている条件下で評価した。これらの代謝産物を選択するために用いた基準として、浮遊細胞によって高度に有意に利用された１つの代謝産物（プロピオン酸）と、浮遊細胞培養とバイオフィルム培養との間で有意差がなかった別の代謝産物（酪酸）を試験した。グリセロールは浮遊培養で既に使用されている周知の化合物であるため、グリセロールも実験に含めた。最近の知見により、遅い増殖は薬剤耐性に直接関連していることが明らかとされており（Ｐｏｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ２０１９；１２）、活発に分裂中の細胞は非分裂細胞よりも抗生物質に対して高い感受性を示すという考え方を支持するいくつかの研究がある（Ａｎｄｅｒｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２００３；４７：１２５１－６；Ｆｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ２００４，１８６：４４８６－９１；Ｇｒａｄｅｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２００２；４９：１８５－８；Ｈｅｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １９９６；４０：２２９６－９）。したがって、栄養制限培地及びバイオフィルム中のマイコバクテリウムの分裂を誘導する化合物は、薬剤耐性細胞に対する殺細菌抗生物質の有効性を高める潜在的候補となりうる。
Ｂｉｏｌｏｇプレート中で利用可能なこれらの代謝産物の量は不明であることから、本発明者らは、無添加７Ｈ９培地中でのＭＡＨ１０４の増殖の最適濃度を決定した。プロピオン酸及び酪酸ではいくつかの濃度（１％、０．５％、０．１％、０．０５％及び０．０１％）を試験し、グリセロールでは濃度を０．２％とした。実験は、バイオフィルムアッセイで用いられた条件である、無添加７Ｈ９培地（いずれの炭素源も含まず、ＯＡＤＣも含まず、グリセロールも含まず、ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０もｔｗｅｅｎ（登録商標）８０も含まないもの）中で行った。結果は、ＭＡＨ１０４の浮遊培養は、プロピオン酸（図２Ｂ）及び酪酸（図２Ａ）を０．０５％とした場合にのみ、無添加７Ｈ９中で増殖できたことを示している。予想されたとおり、グリセロールは無添加７Ｈ９中でのＭＡＨ１０４の増殖を支持することができ、ＭＡＨ１０４は無添加７Ｈ９中で分裂しなかった（図２Ｃ）。
無添加７Ｈ９中のプロピオン酸及び酪酸の最適濃度を決定した後、これらの代謝産物及びグリセロールが栄養制限培地中でＭＡＨ１０４の固着形態の増殖を誘導する能力を試験した。無添加７Ｈ９培地中に低いマイコバクテリウム細胞密度（１０６／ｍｌ）で再懸濁したものを９６ウェルプレートに接種し、３７℃で７日間賠償して細菌をポリスチレン中に付着させた。上清を捨てて浮遊細胞を除去し、予め付着した細菌を栄養制限培地（無添加７Ｈ９）中で７日間培養した。この後、これらの固着性ＭＡＨ１０４細胞を、無添加７Ｈ９中で０．２％グリセロールまたは０．０５％の脂肪酸（プロピオン酸または酪酸）と、３７℃で７日間培養した。細菌細胞の分裂はバイオフィルムの形成と関連していることから、固着性マイコバクテリウムの増殖をＯＤ５９５ｎｍの測定により経過観察し、バイオフィルム形成をクリスタルバイオレット（ＯＤ５７０ｎｍ）によって調べた。固着性ＭＡＨ１０４細胞を無添加７Ｈ９ブロス中で培養した場合、増殖は認められなかった。これに対して、プロピオン酸、酪酸、及びグリセロールは固着形態の増殖を支持した。やはり重要な点として、無添加７Ｈ９と培養した固着性ＭＡＨ１０４形態のＯＤ５７０ｎｍの値（ＯＤ５７０ｎｍ＝０．１１±０．０３９）は、ブランク（ＯＤ５７０ｎｍ＝０．０９１±０．００７）と比較して有意差は認められず（Ｐ＝０．３７）、バイオフィルム形成を示さなかったことを強調しておく。これに対して、プロピオン酸、酪酸、及びグリセロールは固着形態の増殖を支持した。さらに、本発明者らの試験基質と培養した固着性ＭＡＨ１０４のＯＤ５７０ｎｍの値（プロピオン酸ではＯＤ５７０ｎｍ＝０．２５±０．０１、酪酸ではＯＤ５７０ｎｍ＝０．３２±０．０２、カプロン酸ではＯＤ５７０ｎｍ＝０．１７７±０．０１７）は、ブランクからのＯＤ５７０ｎｍの値（ＯＤ５７０ｎｍ＝０．０９１±０．００７）よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１）（図３Ａ～Ｄ）。
実施例３：グリセロールはバイオフィルム中のマイコバクテリウム細胞の増殖を促進するが短鎖脂肪酸は促進しない
次の工程では、試験基質がバイオフィルム中に存在するマイコバクテリウム細胞の増殖を促進する能力を評価することとした。静的バイオフィルムを、グリセロール及び複数の濃度（１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％）の酪酸及びプロピオン酸の存在下で確立した。無添加７Ｈ９の存在下でのＭＡＨ１０４細胞をネガティブコントロールとして用いた。無添加７Ｈ９のみで培養したバイオフィルムと比較して、ＭＡＨ１０４をグリセロールと培養した場合にバイオフィルム形成の有意な増加（３．２倍高い）が認められた。興味深い点として、１％及び０．５％のプロピオン酸と培養したマイコバクテリウムはバイオフィルムを形成することはできず、酪酸でも同じ結果が得られた。これに対して、より低い濃度の短鎖脂肪酸の存在下ではバイオフィルム形成が生じたが、７Ｈ９のみで形成されたバイオフィルムと比較して有意差は認められなかった。
次に、予め確立されたバイオフィルムにおける短鎖脂肪酸及びグリセロールの影響について試験した。これと並行して、予め確立されたバイオフィルム培養物のＯＤ５９５ｎｍも７日間測定してバイオフィルム中の細菌細胞が標的基質の存在下で分裂するかどうかを確認した。グリセロールの存在下では、ＭＡＨ１０４細胞は、２４時間の培養後であっても７Ｈ９のみで培養したＭＡＨ１０４バイオフィルムからのＯＤ５９５ｎｍと比較してＯＤ５９５ｎｍの有意な増加を示した（グリセロールではＯＤ５９５ｎｍ＝０．６０９±０．０６９、７Ｈ９培地ではＯＤ５９５ｎｍ＝０．４５２±０．０４９；Ｐ＝０．０２６）。さらに、本発明者らは、マイコバクテリウムバイオフィルムをグリセロールと培養した場合にバイオフィルム形成（ＯＤ５７０ｎｍの値）の有意な増加を認めた（７Ｈ９ではＯＤ５７０ｎｍ＝０．３３２±０．０７３、グリセロールではＯＤ５７０ｎｍ＝１．５６２±０．１７５１；Ｐ＝０．００２９）。さらに、グリセロールと培養した予め確立されたバイオフィルムは、酪酸及びプロピオン酸と培養した確立されたバイオフィルムよりも高いバイオフィルム形成を示した（グリセロールではＯＤ５７０ｎｍ＝１．５６２±０．１７５１；プロピオン酸ではＯＤ５７０ｎｍ＝０．３８５５±０．０４８；酪酸ではＯＤ５７０ｎｍ＝０．４９０±０．１２１；ＯＤ５７０ｎｍ＝０．３８３±０．０６５）。以上を合わせると、これらの結果は、グリセロールはバイオフィルム中のマイコバクテリウム細胞の分裂を促進するが短鎖脂肪酸は促進しないことを示している。
実施例４：グリセロール及び短鎖脂肪酸との培養は、バイオフィルム中及びマクロファージ中のマイコバクテリウムに対する殺細菌抗生物質の有効性を高める
本明細書で開示される試験は、グリセロール及び短鎖脂肪酸がマイコバクテリウムバイオフィルムによってエネルギー源として利用され、また、栄養制限培地中のマイコバクテリウム細胞の分裂も促進しうることを実証するものである。さらに、本発明者らは、グリセロールがバイオフィルム中のＭＡＨ１０４細胞の分裂も誘導しうることを観察した。以上を合わせると、これらの結果は、短鎖脂肪酸及びグリセロールが、薬剤耐性細胞の出現を誘導する条件下でマイコバクテリウム細胞の代謝速度を高めることを示している。結果として、これらの代謝産物は、栄養制限培地中及びバイオフィルム中のマイコバクテリウムの殺細菌抗生物質に対する感受性を増大させると考えられる。次に、本発明者らは、グリセロール、プロピオン酸、及び酪酸がバイオフィルム中及びマクロファージ内部のＭＡＨ１０４細胞に対するクラリスロマイシン及びアミカシンの有効性を高める能力を評価した。
マイコバクテリウムバイオフィルムを最初に確立した後、抗生物質による処理を行うかまたは行わなかった。これと並行して、抗生物質と標的代謝産物によるバイオフィルムの同時処理も行った。表２は、プロピオン酸及びクラリスロマイシンで処理したバイオフィルム中の細菌数が、クラリスロマイシンのみと培養したバイオフィルムと比較して約２００００倍減少したことを示している（クラリスロマイシンのみでは８．９±０．８×１０７；クラリスロマイシン＋プロピオン酸では２．９±０．３×１０３；Ｐ＜０．０５）。同様のデータがアミカシンとプロピオン酸による同時処理でも記録された（２４７２２．２２倍の減少）（アミカシンのみでは５．８±０．５×１０７；アミカシン＋プロピオン酸では３．６±０．６×１０３；Ｐ＜０．０５）。酪酸に関して、クラリスロマイシンと酪酸によるバイオフィルムの同時処理も、マイコバクテリウムの数をクラリスロマイシンで処理したバイオフィルムと比較して減少させた（クラリスロマイシンのみでは８．９±０．８×１０７；クラリスロマイシン＋酪酸では２．７±×１０３；Ｐ＜０．０５）。
Figure 2022536368000003
次に、マイコバクテリウムはマクロファージ内に存在する場合に抗生物質に対する耐性を示す証拠がある（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１１，１４５：３９－５３；Ｒｏｊｏｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１９；１６：３９）ことから、本発明者らは、プロピオン酸、酪酸、及びグリセロールがアミカシン及びクラリスロマイシンによる細菌殺滅性を高めることができるかどうかを評価した。下記表３は、マイコバクテリウム細胞の集団がＴＨＰ－１細胞株マクロファージの内部に存在する場合、２時間または４日間の抗生物質処理後に生存したことを示している（非処理では８．２±０．３×１０５ＣＦＵ／ｍｌ；クラリスロマイシンでは３．９±０．３×１０４ＣＦＵ／ｍｌ；アミカシンでは４．８±０．５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ）。興味深い点として、殺滅されたマイコバクテリウムの量は、プロピオン酸と抗生物質（クラリスロマイシン及びアミカシン）による同時処理後に有意に増加した。また、データは、酪酸もクラリスロマイシン及びアミカシンの有効性を高めうることを示している（Ｐ＜０．０１）。
Figure 2022536368000004
バイオフィルムは、患者の肺から単離されたＭＡＨ株（ＭＡＨ ３３８８）から確立した。プロピオン酸及び酪酸のアミカシン活性を増強する活性が確認された。
Figure 2022536368000005
均等物
以上、本発明をその具体的な実施形態に関連して説明したが、本発明はさらなる変更が可能であり、本出願は、本発明の原理に一般的に従い、本発明が関連する当該技術分野における周知のまたは従来の慣例に含まれる、上記に記載した基本的な特徴に適用されうる、付属の請求項の範囲に示されるような本開示からの逸脱を含む本発明のあらゆる変形例、用途、または適応例を包含することを意図したものである点は理解されよう。
参照による援用
本明細書で参照するすべての特許及び刊行物は、それらの全容を参照によって本明細書に援用する。

Claims (40)

  1. 患者の非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）感染症を治療するための方法であって、前記患者に１つ以上の抗生物質を投与することと、前記患者の肺に増強剤組成物を投与することと、を含む、前記方法。
  2. 前記増強剤組成物が、クレブス回路の代謝産物、β酸化経路の代謝産物、脂質異化の代謝産物、アルカン酸またはアルカン酸塩、及びグリセロールから選択される１つ以上の代謝産物を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記増強剤組成物が、脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルが、最大１６個の炭素原子を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルが、最大１０個の炭素原子を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記脂肪族モノまたはジカルボン酸が、直鎖もしくは分枝鎖脂肪酸、またはそれらの塩もしくはエステルである、請求項４に記載の方法。
  7. 前記直鎖または分枝鎖脂肪酸が、短鎖脂肪酸、またはそれらの塩もしくはエステルであり、前記短鎖脂肪酸、またはそれらの塩もしくはエステルが場合によりアルキルエステルであり、前記アルキルエステルが場合によりメチルまたはエチルエステルである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記増強剤組成物が、プロパン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；ブタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；２－メチルプロパン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；ペンタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；３－メチルブタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；カプロン酸、４－メチルペンタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；セバシン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；及びピルビン酸、またはそれらの塩もしくはエステルのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記増強剤組成物が、グリセロールを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記増強剤組成物が、吸入用の粉末またはエアロゾルとして投与される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記増強剤組成物が、ネブライザーによって投与される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記増強剤組成物が、リポソームを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記患者が、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、エタンブトール、及びリファマイシンから選択される１つ以上の抗生物質を投与される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記患者が、アミカシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アプラマイシン、アルベカシン、アストロマイシン、カプレオマイシン、ジベカシン、フラマイセチン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシンＢ、イセパマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ロデストレプトマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、及びベルダマイシン、または薬学的に許容されるそれらの塩から選択されるアミノグリコシド系抗生物質を投与される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記患者が、アミカシンもしくはストレプトマイシンまたはそれらの薬学的に許容される塩を投与される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記アミノグリコシドが、肺に局所投与され、場合によりアミカシンの粉末製剤または噴霧製剤である、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 前記アミノグリコシド製剤が、ネブライザーによって投与される水溶液または懸濁液である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記アミノグリコシド製剤が、場合によりアミカシンのリポソーム製剤である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記アミノグリコシドが、前記増強剤組成物中に共製剤化される、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記患者がマクロライド系抗生物質を投与される、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記マクロライドが、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、カルボマイシンＡ、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン酢酸エステル、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）、タイロシン（ｔｙｌｏｃｉｎｅ）、及びロキシスロマイシンまたは薬学的に許容されるそれらの塩から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記マクロライドが経口投与され、場合により、アジスロマイシンまたはクラリスロマイシンから選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記患者が、リファンピンまたはリファブチンを投与される、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記リファンピンが経口投与される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記患者が、エタンブトールを投与される、請求項１３～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記エタンブトールが経口投与される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記非結核性マイコバクテリウム感染症に、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｍｉｎｉｓｓｕｉｓ （ＭＡＨ）、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＡＣ）（Ｍ．ａｖｉｕｍ及びＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．ｃｈｉｍａｅｒａ、Ｍ．ｃｏｎｓｐｉｃｕｕｍ、Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ （Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ及びＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、またはこれらの組み合わせが関与する、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記増強剤組成物が少なくとも週３回投与される、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記増強剤組成物が、週１回または２回投与される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記投与期間が、少なくとも６ヶ月間である、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 前記投与期間が、少なくとも１２ヶ月、または少なくとも１８ヶ月である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記投与期間が１年未満である、請求項３０に記載の方法。
  33. ネブライザーにより投与するための単位用量製剤であって、１００～６００ｍｇのアミノグリコシド系抗生物質またはそれらの塩と、非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）に対するアミノグリコシド活性を増強するうえで有効量の脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルと、を含む、前記単位用量。
  34. 前記脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルが、最大１６個の炭素原子を含む、請求項３３に記載の単位用量。
  35. 前記脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルが、最大１０個の炭素原子を含む、請求項３４に記載の単位用量。
  36. 前記脂肪族モノまたはジカルボン酸が、直鎖もしくは分枝鎖脂肪酸、またはそれらの塩もしくはエステルである、請求項３４に記載の単位用量。
  37. 前記直鎖または分枝鎖脂肪酸が、短鎖脂肪酸、またはそれらの塩もしくはエステルであり、前記短鎖脂肪酸、またはそれらの塩もしくはエステルが場合によりアルキルエステルであり、前記アルキルエステルが場合によりメチルまたはエチルエステルである、請求項３６に記載の単位用量。
  38. 前記脂肪族モノまたはジカルボン酸が、プロパン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；ブタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；２－メチルプロパン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；ペンタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；３－メチルブタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；カプロン酸、４－メチルペンタン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；セバシン酸、またはそれらの塩もしくはエステル；及びピルビン酸、またはそれらの塩もしくはエステルのうちの１つ以上を含む、請求項３３に記載の単位用量。
  39. グリセロールをさらに含む、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の単位用量。
  40. 前記アミノグリコシド系抗生物質がアミカシンであり、前記アミカシンが、前記脂肪族モノもしくはジカルボン酸、またはそれらの塩もしくはエステルとともにリポソーム中に含まれる、請求項３３～３９のいずれか１項に記載の単位用量。
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