JP2022536353A - 細菌、肺パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ）由来のＣａｓ９タンパク質に基づくＤＮＡカット剤 - Google Patents
細菌、肺パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ）由来のＣａｓ９タンパク質に基づくＤＮＡカット剤 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、細菌、肺パスツレラ菌（Ｐ． ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ）由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の新規細菌ヌクレアーゼ、ならびにＤＮＡ分子において厳密に特異的な二本鎖カットを生成するための前記ヌクレアーゼの使用を記載する。このヌクレアーゼは独自の特性を有し、そして単細胞および多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列中の厳密に特定された位置で、変化を導入するための装置として使用可能である。したがって、本発明は、利用可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の多用途性を増加させ、多数の特定の部位で、そして多様な条件下で、ゲノムまたはプラスミドＤＮＡをカットするため、多様な生物由来のＣａｓ９ヌクレアーゼの使用を可能にするであろう。
Description
本発明は、バイオテクノロジーに関し、特に、ＤＮＡをカットし、そして多様な生物のゲノムを編集するために用いられる、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の新規Ｃａｓヌクレアーゼ酵素に関する。この技術を、遺伝性ヒト疾患の遺伝子治療のため、ならびに他の生物のゲノムを編集するために、将来、用いてもよい。
ＤＮＡ配列の修飾は、今日のバイオテクノロジー分野における時事問題の１つである。真核および原核生物のゲノムの編集および修飾、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡの操作は、ＤＮＡ配列における二本鎖切断のターゲティングされた導入を必要とする。
この問題を解決するため、現在、以下の技術：ジンクフィンガー型のドメインを含有する人工的ヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系、および細菌ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が用いられる。最初の２つの技術は、特定のＤＮＡ配列の認識のため、ヌクレアーゼアミノ酸配列を最適化する労力を要する。対照的に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の場合は、ＤＮＡターゲットを認識する構造はタンパク質ではなく、小分子ガイドＲＮＡである。特定のＤＮＡターゲットのカットには、ヌクレアーゼまたはその遺伝子を新規に合成する必要はなく、ターゲット配列に相補的なガイドＲＮＡを用いることによって行われる。このため、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は、多様なＤＮＡ配列をカットするための好適でそして効率的な手段となっている。該技術は、異なる配列のガイドＲＮＡを用いて、いくつかの領域でＤＮＡを同時にカットすることを可能にする。こうしたアプローチはまた、真核生物において、いくつかの遺伝子を同時に修飾するためにも用いられる。
その性質により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ウイルス遺伝物質内に非常に特異的に切断を導入することが可能な、原核生物免疫系である（Ｍｏｊｉｃａ Ｆ． Ｊ． Ｍ．ら Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ／／Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２００５． Ｖｏｌ． ６０． Ｉｓｓｕｅ ２． ｐｐ．１７４－１８２）。略語ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、「クラスター化され、規則的に間隔を空けられた、短いパリンドローム反復およびＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅｓ）」（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５）を表す。すべてのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲカセットおよび多様なＣａｓタンパク質をコードする遺伝子からなる（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５）。ＣＲＩＳＰＲカセットは、各々、ユニークなヌクレオチド配列を有するスペーサー、および反復パリンドロームリピートからなる（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５）。ＣＲＩＳＰＲカセットの転写、その後のそのプロセシングの結果、ガイドｃｒＲＮＡが形成され、該ガイドｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質とともに、エフェクター複合体を形成する（Ｂｒｏｕｎｓ Ｓ． Ｊ． Ｊ．ら Ｓｍａｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８． Ｖｏｌ． ３２１． Ｉｓｓｕｅ ５８９１． ｐｐ．９６０－９６４）。ｃｒＲＮＡおよびプロトスペーサーと呼ばれるターゲットＤＮＡ部位の間の相補的対形成によって、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡターゲットを認識し、そしてその中に、非常に特異的に切断を導入する。
単一エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、系に含まれるＣａｓタンパク質に応じて、６つの異なるタイプ（Ｉ～ＶＩ型）にグループ分けされる。２０１３年、ヒト細胞のゲノムＤＮＡを編集するためにＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を使用することが初めて提唱された（Ｃｏｎｇ Ｌ，ら， Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９－２３）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、単純な組成および活性機構が特徴であり、すなわちその機能には、１つのＣａｓ９タンパク質および以下のような２つの小分子ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）のみからなるエフェクター複合体の形成しか必要としない。トレーサーＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲリピートから生じるｃｒＲＮＡ領域と相補的に対形成して、ガイドＲＮＡがＣａｓエフェクターに結合するために必要な二次構造を形成する。ガイドＲＮＡの配列を決定することは、それまでに研究されていないＣａｓオルソログの特徴づけにおいて重要な工程である。Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ターゲットＤＮＡの相補鎖内に切断を導入する２つのヌクレアーゼドメイン（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を持ち、したがって、二本鎖ＤＮＡ切断を形成する、ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼである（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ．ら ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ／／Ｎａｔｕｒｅ． ２０１１． Ｖｏｌ． ４７１． Ｉｓｓｕｅ ７３４０． ｐ．６０２）。
これまでに、ＤＮＡ中に二本鎖切断をターゲティングし、そして特異的に導入することが可能な、いくつかのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼが知られる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術は、細菌株からヒト細胞に渡る多様な生物のＤＮＡにおいて切断を導入し、またｉｎ ｖｉｔｒｏ適用も提供する、最新のそして迅速に発展しつつある技術の１つである（Ｓｏｎｇ Ｍ． Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ： Ｔｈｅｉｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｓｔａｒｔｕｐｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． ２０１７ Ｊｕｌ；３３（４）：１０３５－１０４５）。
Ｃａｓ９およびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖からなるエフェクター・リボ核酸複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）は、ｃｒＲＮＡスペーサー－プロトスペーサー相補性に加えて、ＤＮＡの認識およびそれに続く加水分解のため、ＤＮＡターゲット上に、ＰＡＭ（プロトスペーサー調節モチーフ）の存在を必要とする（Ｍｏｊｉｃａ Ｆ． Ｊ． Ｍ．ら ２００９）。ＰＡＭは、オフターゲット鎖上のプロトスペーサーの３’端に隣接するかまたは数ヌクレオチド離れて、ＩＩ型系中に位置する、数ヌクレオチドの厳密に定義された配列である。ＰＡＭが存在しない場合、二本鎖切断の形成を伴うＤＮＡ結合の加水分解は起こらない。ターゲット上にＰＡＭ配列の存在が必要であるために、認識特異性は増加するが、同時に、切断を導入するために、ターゲットＤＮＡ領域の選択に制約が課される。したがって、３’端からＤＮＡターゲットに隣接する望ましいＰＡＭ配列の存在は、任意のＤＮＡ部位でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用することを制限する特徴である。
異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、その活性において、異なる特有のＰＡＭ配列を用いる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび生存生物ゲノムの両方で、任意のＤＮＡ領域を修飾することを可能にするには、新規の多様なＰＡＭ配列を持つＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の使用が必要である。真核ゲノムの修飾はまた、細胞内へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のＡＡＶ仲介性送達を提供するため、小さいサイズのヌクレアーゼの使用も必要とする。
ＤＮＡをカットし、そしてゲノムＤＮＡ配列を修飾するための多くの技術が知られるが、多様な生物において、そしてＤＮＡ配列の厳密に特定の部位で、ＤＮＡを修飾するための新規の有効な手段に関する必要性がなおある。
Ｍｏｊｉｃａ Ｆ． Ｊ． Ｍ．ら Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ／／Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２００５． Ｖｏｌ． ６０． Ｉｓｓｕｅ ２． ｐｐ．１７４－１８２
Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５
Ｂｒｏｕｎｓ Ｓ． Ｊ． Ｊ．ら Ｓｍａｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８． Ｖｏｌ． ３２１． Ｉｓｓｕｅ ５８９１． ｐｐ．９６０－９６４
Ｃｏｎｇ Ｌ，ら， Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９－２３
Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ．ら ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ／／Ｎａｔｕｒｅ． ２０１１． Ｖｏｌ． ４７１． Ｉｓｓｕｅ ７３４０． ｐ．６０２
Ｓｏｎｇ Ｍ． Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ： Ｔｈｅｉｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｓｔａｒｔｕｐｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． ２０１７ Ｊｕｌ；３３（４）：１０３５－１０４５
本発明の目的は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いて、単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列を修飾するための新規手段を提供することである。現存する系は、修飾しようとするＤＮＡ領域の３’端に存在しなければならない、特定のＰＡＭ配列のため、使用に制限がある。他のＰＡＭ配列を持つ新規Ｃａｓ９酵素の検索は、多様な生物のＤＮＡ分子における望ましい厳密に特定された部位に、二本鎖切断を形成するための利用可能な手段の範囲を拡張するであろう。この問題を解決するため、著者らは、肺パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ）（Ｐ． ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ）に関して以前予期されていたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＰｐＣａｓ９を特徴づけた。該酵素は、上記のおよび他の生物の両方のゲノム内に定向性修飾を導入することに使用可能である。本発明は、以下の本質的な特徴：（ａ）他の既知のＰＡＭ配列とは異なる短いＰＡＭ配列；（ｂ）１０５５アミノ酸残基（ａ．ａ．ｒ．）である、比較的小さいサイズの特徴づけられたＰｐＣａｓ９タンパク質を有することで特徴づけられる。
前記問題は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして配列番号１と非保存性アミノ酸残基においてのみ異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を用いて、ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’の直前に位置する、前記ＤＮＡ分子中の二本鎖切断を形成することによって、解決される。本発明のいくつかの態様において、この使用は、３５℃～４５℃の温度で、ＤＮＡ分子中に二本鎖切断が形成されることで特徴づけられる。
前記問題は、単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列を修飾するための方法であって、前記生物の少なくとも１つの細胞内に、有効量の：ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸のいずれか、ならびにｂ）ヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’にすぐ隣接する生物のゲノムＤＮＡ領域のヌクレオチド配列と二重鎖を形成し、そして二重鎖形成後に前記タンパク質と相互作用する配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列のいずれか、を前記生物の少なくとも1つの細胞に導入する工程を含み；ここにおいて、前記タンパク質とガイドＲＮＡおよびヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’との相互作用が、配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’にすぐ隣接するゲノムＤＮＡ配列中の二本鎖切断の形成を生じる、前記方法を提供することによって、さらに解決される。本発明のいくつかの態様において、方法は、ガイドＲＮＡと同時に、外因性ＤＮＡ配列の導入をさらに含むことで特徴づけられる。
ターゲットＤＮＡ領域およびＰｐＣａｓ９タンパク質と複合体を形成可能であるｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の混合物を、ガイドＲＮＡとして用いてもよい。本発明の好ましい態様において、ｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡに基づいて構築されたハイブリッドＲＮＡをガイドＲＮＡとして用いてもよい。ハイブリッドガイドＲＮＡを構築するための方法は、当業者に知られる（Ｈｓｕ ＰＤら， ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８２７－３２）。ハイブリッドＲＮＡを構築するためのアプローチの１つを、以下の実施例に開示している。
本発明を、ターゲットＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏカットのため、そしていくつかの生存生物のゲノムを修飾するための両方に用いてもよい。直接方式で、すなわち対応する部位でゲノムをカットすることによって、ならびに相同修復を通じて、外因性ＤＮＡ配列を挿入することによって、ゲノムを修飾してもよい。
投与に用いる以外の生物ゲノム由来の二本鎖または一本鎖ＤＮＡの任意の領域（またはそれら自体の中のこうした領域の組成物、および他のＤＮＡ断片を含むもの）を外因性ＤＮＡ配列として用いてもよく、ここで前記領域（または領域の組成物）は、ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼによって誘導されて、ターゲットＤＮＡ中の二本鎖切断の部位内に組み込まれるよう意図される。本発明のいくつかの態様において、ＰｐＣａｓ９タンパク質の導入のために用いられ、突然変異（ヌクレオチド置換）によって、ならびに１つまたはそれより多いヌクレオチドの挿入または欠失によって、さらに修飾されている、生物ゲノム由来の二本鎖ＤＮＡ領域を、外因性ＤＮＡ配列として用いてもよい。
本発明の技術的結果は、利用可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の多用途性を増加させて、より多数の特定の部位および特定の条件で、ゲノムまたはプラスミドＤＮＡをカットするためのＣａｓ９ヌクレアーゼの使用を可能にすることである。
本発明の説明で用いた際、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「他のものの中でも、含む」を意味するよう解釈されるべきである。前記用語は、「のみからなる」と解釈されるとは意図されない。別に定義しない限り、本出願中の技術的および科学的用語は、科学的および技術的文献中に一般的に認められる典型的な意味を有する。
本明細書において、用語「２つの配列の相同性パーセント」は、用語「２つの配列の同一性パーセント」と同等である。配列同一性は、参照配列に基づいて決定される。配列分析のためのアルゴリズムが当該技術分野に知られ、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５， ｐｐ．４０３－１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴがある。本発明の目的のため、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の間の同一性および類似性のレベルを決定するため、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の比較を用いてもよく、これは、標準パラメータを伴い、ギャップ化整列を用いて、米国バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって提供されるＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）によって実行される。２つの配列の同一性パーセントは、整列による２つの配列の最適比較のために挿入されるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れて、これらの２つの配列中の同一アミノ酸の位置の数によって決定される。同一性パーセントは、配列整列を考慮に入れ、所定の位置で同一であるアミノ酸の数を、位置の総数で割り、そして１００を乗じたものに等しい。
用語「特異的にハイブリダイズする」は、２つの一本鎖核酸分子または十分に相補的な配列の間の会合を指し、これは、当該技術分野において典型的に用いられるあらかじめ決定された条件下でのこうしたハイブリダイゼーションを可能にする。
句「ヌクレオチドＰＡＭ配列の直前に位置する二本鎖切断」は、ターゲットＤＮＡ配列中の二本鎖切断が、ヌクレオチドＰＡＭ配列の０～２５ヌクレオチド前の距離で作製されることを意味する。
ガイドＲＮＡと同時に導入される外因性ＤＮＡ配列は、ガイドＲＮＡの特異性によって決定される切断部位で、二本鎖ターゲットＤＮＡの特異的修飾のために特に調製されたＤＮＡ配列を指すよう意図される。こうした修飾は、例えば、ターゲットＤＮＡにおける切断部位での特定のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。外因性ＤＮＡは、異なる生物由来のＤＮＡ領域またはターゲットＤＮＡのものと同じ生物由来のＤＮＡ領域のいずれであってもよい。
特定のアミノ酸配列を含むタンパク質は、前記アミノ酸配列、および前記アミノ酸配列にペプチド結合によって連結されるありうる他の配列で構成されるアミノ酸配列を有するタンパク質を指すよう意図される。他の配列の例は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、または前記アミノ酸配列の機能性増加を提供する他の配列であってもよい。
ガイドＲＮＡと同時に導入される外因性ＤＮＡ配列は、ガイドＲＮＡの特異性によって決定される切断の部位での二本鎖ターゲットＤＮＡの特異的修飾のために特に調製されるＤＮＡ配列を指すよう意図される。こうした修飾は、例えば、ターゲットＤＮＡ中の切断部位での特定のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。外因性ＤＮＡは、異なる生物由来のＤＮＡ領域またはターゲットＤＮＡのものと同じ生物由来のＤＮＡ領域のいずれであってもよい。
細胞内に導入されるタンパク質およびＲＮＡの有効量は、前記細胞内に導入された際、機能的複合体、すなわちターゲットＤＮＡに特異的に結合し、そして該ＤＮＡ中で、ガイドＲＮＡおよびＤＮＡ上のＰＡＭ配列によって決定される部位で二本鎖切断を生じるであろう複合体を形成可能であるような、タンパク質およびＲＮＡの量を指すよう意図される。このプロセスの効率は、当業者に知られる慣用的技術を用いて、前記細胞から単離されたターゲットＤＮＡを分析することによって評価されうる。
多様な技術によって、タンパク質およびＲＮＡを細胞に送達してもよい。例えば、タンパク質を、このタンパク質の遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドとして、細胞質においてこのタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡとして、またはこのタンパク質およびガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体として、送達してもよい。当業者に知られる多様な技術によって、送達を行ってもよい。
系の構成要素をコードする核酸を、以下のように：当業者に知られる方法による細胞のトランスフェクションまたは形質転換によって、組換えウイルスの使用によって、細胞に対する操作、例えばＤＮＡマイクロインジェクション等によって、直接または間接的に細胞内に導入してもよい。
ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡおよび外因性ＤＮＡ（必要な場合）からなるリボ核酸複合体を、複合体を細胞内にトランスフェクションすることによって、または複合体を細胞内に機械的に導入することによって、例えばマイクロインジェクションによって、送達してもよい。
細胞内に導入しようとするタンパク質をコードする核酸分子は、染色体内に組み込まれてもよいし、または染色体外で複製されるＤＮＡであってもよい。いくつかの態様において、細胞内に導入されたＤＮＡでのタンパク質遺伝子の有効な発現を確実にするために、多様な生物ゲノムのコード領域において、同義のコドンの出現頻度は不均等であるため、発現のためコドンを最適化するように、細胞タイプにしたがって、前記ＤＮＡの配列を修飾することが必要である。コドン最適化は、動物、植物、真菌、または微生物細胞において、発現を増加させるために必要である。
配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一である配列を有するタンパク質が、真核細胞において機能するには、このタンパク質が、最終的にこの細胞の核中に行きつくことが必要である。したがって、本発明のいくつかの態様において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして１つまたはそれより多い核局在化シグナルの付加によって一端または両端でさらに修飾されている配列を有するタンパク質を用いて、ターゲットＤＮＡ中に二本鎖切断を形成する。例えば、ＳＶ４０ウイルス由来の核局在化シグナルを用いてもよい。核への効率的な送達を提供するため、例えば、Ｓｈｅｎ Ｂら ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｍａｙ；２３（５）：７２０－３に記載される、スペーサー配列によって、主要タンパク質配列から核局在化シグナルを分離してもよい。さらに、他の態様において、異なる核局在化シグナル、または前記タンパク質を細胞核内に送達するための代替法を用いてもよい。
本発明は、厳密に特定される位置で、ＤＮＡ分子内に二本鎖切断を導入するための、以前特徴づけられたＣａｓ９タンパク質に相同である肺パスツレラ菌生物由来のタンパク質の使用を含む。ゲノムにターゲティング化修飾を導入するためのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの使用は、いくつかの利点を有する。第一に、系の活性の特異性は、ｃｒＲＮＡ配列によって決定され、これは、すべてのターゲット遺伝子座に対して１つのタイプのヌクレアーゼを使用することを可能にする。第二に、該技術は、異なる遺伝子ターゲットに相補的ないくつかのガイドＲＮＡを、細胞内に同時に送達することを可能にし、それによって、いくつかの遺伝子を同時に修飾することを可能にする。
ＰｐＣａｓ９は、動物肺に住む齧歯類病原体である、肺パスツレラ菌ＡＴＣＣ３５１４９に見られるＣａｓヌクレアーゼである。肺パスツレラ菌（Ｐ． ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９系（以後、ＣＲＩＳＰＲ ＰｐＣａｓ９と称する）はＩＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に属し、そしてユニークなスペーサーの配列によって間隔をあけた、配列５’ＡＴＴＡＴＡＧＣＡＣＴＧＣＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣ３’を有する４つのダイレクトリピート（ＤＲ）を所持するＣＲＩＳＰＲカセットからなる。該系のスペーサーはいずれも、現在知られるバクテリオファージまたはプラスミドと配列が一致せず、この事実から、関心対象のＰｐＣａｓ９ ＰＡＭをバイオインフォマティクス分析によって決定することは不可能である。ＣＲＩＳＰＲカセットに対して、エフェクターＣａｓ９タンパク質ＰｐＣａｓ９の遺伝子とともに、新規スペーサーの適応および組込みに関与するＣａｓ１およびＣａｓ２タンパク質の遺伝子が隣接する。Ｃａｓ遺伝子近傍に、ダイレクトリピートに部分的に相補的であり、そしてトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であると意図される、特徴的な二次構造にフォールディングする配列が見られた（図１）。
ＩＩ－Ｃ型系のＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体の特徴的な構築の知見は、ＣＲＩＳＰＲカセットの転写方向を予測することを可能にした：プレ－ｃｒＲＮＡはＣａｓ遺伝子と反対の方向で転写される（図１）。
したがって、ＰｐＣａｓ９遺伝子座配列の分析によって、トレーサーおよびガイドＲＮＡの配列を予測することが可能になった（表１）
表１． バイオインフォマティクス法によって決定された、ＣＲＩＳＰＲ ＰｐＣａｓ９系のガイドＲＮＡの配列。太字は、ダイレクトリピート、ＤＲの配列を示す。
表１． バイオインフォマティクス法によって決定された、ＣＲＩＳＰＲ ＰｐＣａｓ９系のガイドＲＮＡの配列。太字は、ダイレクトリピート、ＤＲの配列を示す。
ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼの活性を検証し、そして関心対象のＰｐＣａｓ９ ＰＡＭを決定するため、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡカット反応を再現する実験を行った。ＰｐＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を決定するため、二本鎖ＰＡＭライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏカットを使用した。この目的に向けて、以下のようなＰｐＣａｓ９エフェクター複合体のすべての構成要素：ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼを組換え型で得る必要があった。ガイドＲＮＡ配列の決定によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子を合成することが可能になった。ＮＥＢ ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キットを用いて、合成を行った。二本鎖ＤＮＡライブラリーは、３’端からランダム化７ヌクレオチド（５’－ＮＮＮＮＮＮＮ－３’）が隣接した、プロトスペーサー配列を含む、３７４塩基対（ｂｐ）断片であった：
このターゲットをカットするため、以下の配列のガイドＲＮＡを用いた：
ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ｔｒａｃｒＲＮＡ：
およびｃｒＲＮＡ：
太字は、プロトスペーサー（ターゲットＤＮＡ配列）に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を示す。
組換えＰｐＣａｓ９タンパク質を産生するため、その遺伝子をプラスミドｐＥＴ２１ａ内にクローニングした。組込みＤＮＡ技術（ＩＤＴ）によって合成されたＤＮＡを、遺伝子をコードするＤＮＡとして用いた。配列をコドン最適化して、肺パスツレラ菌ゲノムでは稀にしか見られないコドンを排除した。生じたプラスミドｐＥＴ２１ａ－６ｘＨｉｓ－ＰｐＣａｓ９で大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｒｏｓｅｔｔａ細胞を形質転換した。
組換えＰｐＣａｓ９タンパク質を産生するため、その遺伝子をプラスミドｐＥＴ２１ａ内にクローニングした。組込みＤＮＡ技術（ＩＤＴ）によって合成されたＤＮＡを、遺伝子をコードするＤＮＡとして用いた。配列をコドン最適化して、肺パスツレラ菌ゲノムでは稀にしか見られないコドンを排除した。生じたプラスミドｐＥＴ２１ａ－６ｘＨｉｓ－ＰｐＣａｓ９で大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｒｏｓｅｔｔａ細胞を形質転換した。
５００μｌの一晩培養物を５００ｍｌのＬＢ培地中で希釈し、そして０．６Ｒｕの光学密度が得られるまで、３７℃で細胞を増殖させた。ＩＰＴＧを１ｍＭの濃度まで添加することによって、ターゲットタンパク質の合成を誘導し、次いで、細胞を２０℃で６時間インキュベーションした。次いで、細胞を５，０００ｇで３０分間遠心分離し、生じた細胞沈殿物を－２０℃で凍結した。
沈殿物を氷上で３０分間融解し、１５ｍｇのリゾチームを補充した１５ｍｌの溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｂ－メルカプトエタノール１ｍＭ、イミダゾール１０ｍＭ）中に再懸濁し、そして氷上で３０分間再度インキュベーションした。次いで、３０分間の超音波処理によって、細胞を破壊し、そして１６，０００ｇで４０分間遠心分離した。生じた上清を０．２μｍフィルターに通過させ、そしてＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に１ｍｌ／分で適用した。
ＡＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、１ｍｌ／分でクロマトグラフィを行った。適用されたタンパク質を含むカラムを、３０ｍＭイミダゾールを補充した２０ｍｌの溶解緩衝液で洗浄し、その後、３００ｍＭイミダゾールを補充した溶解緩衝液でタンパク質を洗浄した。
次いで、アフィニティクロマトグラフィの経過で得たタンパク質分画を、以下の緩衝液：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬゲル濾過カラム（２４ｍｌ）に通過させた。Ａｍｉｃｏｎ濃縮装置（３０ｋＤａフィルターを含む）を用いて、ＰｐＣａｓ９タンパク質の単量体型に対応する分画を３ｍｇ／ｍｌに濃縮し、その後、１０％グリセロールを含有する緩衝液中、精製タンパク質を－８０℃で保存した。
以下の条件下、２０μｌの体積中で、直鎖ＰＡＭライブラリーをカットするｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を行った。反応混合物は：１ｘＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）、５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｎＭ ＰＡＭライブラリー、２μＭ ｔｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ、４００ｎＭ ＰｐＣａｓ９タンパク質からなった。対照として、ＲＮＡをまったく含有しない試料を同様の方式で調製した。試料を異なる温度でインキュベーションし、そして２％アガロースゲル中のゲル電気泳動によって分析した。ＤＮＡがＰｐＣａｓ９タンパク質によって正しく認識されそして特異的にカットされた場合、約３２６塩基対および約４８塩基対の２つのＤＮＡ断片が生成されるはずである（図２を参照されたい）。
実験結果は、ＰｐＣａｓ９がヌクレアーゼ活性を示し、そしてＰＡＭライブラリー断片の部分をカットすることを示した。温度勾配（図３）は、タンパク質が３５～４５℃の温度範囲で活性であることを示した。次いで、研究は、作業温度として４２℃の温度を用いた。
選択した条件下で、ライブラリーカット反応を繰り返した。反応産物を１．５％アガロースゲル上に適用し、そして電気泳動に供した。長さ３７４ｂｐのアンカットＤＮＡ断片をゲルから抽出し、そしてＮＥＢ ＮｅｘｔＵｌｔｒａ ＩＩキットを用いてハイスループット配列決定のために調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で試料を配列決定し、そして次いで、バイオインフォマティクス法を用いて、配列分析を行った：本発明者らはＭａｘｗｅｌｌ ＣＳら， Ａ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｃｉｐｈｅｒ ＣＲＩＳＰＲ ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１８ Ｊｕｌ １；１４３：４８－５７に記載されるアプローチを用いて、対照試料に比較した際のＰＡＭ（ＮＮＮＮＮＮＮ）の個々の位置でのヌクレオチドの出現の相違を決定した。さらに、結果を分析するため、ＰＡＭロゴを構築した（図４）。
データ分析に対するどちらのアプローチも（図４）、ＰＡＭ ５位、６位および７位の重要性を示す。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析によって、以下のようなＰｐＣａｓ９の推定上のＰＡＭ配列：ＮＮＮＮＡＴＴを確立することが可能になった。しかしこの配列は、ＰＡＭを決定するためのスクリーニングアプローチによって得られた不正確な結果を考慮すると、推定上のものでしかない。
これに関連して、個々のＰＡＭ配列の位置の重要性を、配列のより正確な決定のために検証した。この目的のため、本発明者らは、ＰＡＭ配列
が隣接するＤＮＡターゲット５’－ａｔｃｔｃｃｔｔｔｃａｔｔｇａｇｃａｃ－３’を含有するＤＮＡ断片（またはその誘導体）カットのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を行った：
すべてのＤＮＡカット反応を以下の条件下で行った：
１ｘＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液
４００ｎＭ ＰｐＣａｓ９
２０ｎＭ ＤＮＡ
２μＭ ｃｒＲＮＡ
２μＭ ｔｒａｃｒＲＮＡ
インキュベーション時間は３０分間であり、反応温度は４２℃であった。
１ｘＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液
４００ｎＭ ＰｐＣａｓ９
２０ｎＭ ＤＮＡ
２μＭ ｃｒＲＮＡ
２μＭ ｔｒａｃｒＲＮＡ
インキュベーション時間は３０分間であり、反応温度は４２℃であった。
４つすべてのありうるヌクレオチド変異体でのＰＡＭ １位の置換は、タンパク質活性効率に影響を及ぼさなかった（図５）。
各ＰＡＭ位置における一塩基置換（ピリミジンでのプリンのそしてその逆の）によって、５位および６位の予測される重要性を確認した。置換を５位および６位で行うと、タンパク質は実質的にその活性を停止した。置換を７位で行うと、ＰｐＣａｓ９活性の効率は２倍減少し、この事実は、この位置でのヌクレオチドに関する必要性が減少していることを反映する（図６）。したがって、ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭスクリーニングの結果にしたがって、ＰＡＭ ５位の最もありうるヌクレオチドはアデニンまたはグアニンであり、この事実を実験的に確認した（図７）。ＡからＧへの置換は、断片のカット効率を減少させなかった。
各ＰＡＭ位置における一塩基置換（ピリミジンでのプリンのそしてその逆の）によって、５位および６位の予測される重要性を確認した。置換を５位および６位で行うと、タンパク質は実質的にその活性を停止した。置換を７位で行うと、ＰｐＣａｓ９活性の効率は２倍減少し、この事実は、この位置でのヌクレオチドに関する必要性が減少していることを反映する（図６）。したがって、ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭスクリーニングの結果にしたがって、ＰＡＭ ５位の最もありうるヌクレオチドはアデニンまたはグアニンであり、この事実を実験的に確認した（図７）。ＡからＧへの置換は、断片のカット効率を減少させなかった。
ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングの結果にしたがって、７位に「Ｔ」または「Ｃ」を持つ断片は、より効率的に認識されるはずである。さらなる実験を行って、この位でのヌクレオチドの重要性を決定的に検証した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の結果、７位でのヌクレオチド「Ｔ」をＡまたはＧで置換すると、カット効率が４０～５０％減少することが示された（図８）。したがって、ＰＡＭ ７位は、５位および６位に比較してより保存されておらず：７位のプリンは、認識効率を減少させるのみであり、ＰｐＣａｓ９タンパク質がＤＮＡ内に二本鎖切断を導入するのを防止しない。
研究結果は以下の通りであった：ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼに認識されるＰＡＭは、以下の式、５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’に対応する。配列ＮＮＮＮＲＴＹ（ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）－Ｔ－（Ｔ／Ｃ））は、ＮＮＮＮＲＴＲ（ＮＮＮＮ－（Ａ／Ｇ）－Ｔ－（Ａ／Ｇ））に比較した際、より効率的に認識される。
以下の、方法の例示的態様は、本発明の特性を開示する目的のために提供され、そしていかなる意味でも本発明の範囲を制限するとは見なされないものとする。
実施例１． 多様なＤＮＡターゲットのカットにおけるＰｐＣａｓ９タンパク質の活性の試験。
実施例１． 多様なＤＮＡターゲットのカットにおけるＰｐＣａｓ９タンパク質の活性の試験。
配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’が隣接している多様なＤＮＡ配列を認識するＰｐＣａｓ９の能力をチェックするため、ヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子配列由来のＤＮＡターゲット（表２を参照されたい）のｉｎ ｖｉｔｒｏカットに対する実験を行った。
表２． ヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子由来のＤＮＡターゲット
ＰＡＭコンセンサス配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’にしたがって、ＰｐＣａｓ９によっておそらく認識可能である認識部位（表２）を所持するｇｒｉｎ２ｂ遺伝子のＰＣＲ断片を、カット反応におけるターゲットとして用いた。ＰｐＣａｓ９をこれらの部位に向けるｃｒＲＮＡを合成して、これらの配列を認識させた。
ＰｐＣａｓ９に関して選択された条件下で、カット反応を行った；結果を図９に示す。図９は、ＰｐＣａｓ９酵素が、適切なＰＡＭを含む４つのターゲットのうち、３つのカットに成功することを示す。
レーン６上のターゲットは、ＰＡＭ配列ＣＡＧＣＡＴＴを有し、これは枯渇分析（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）の結果に基づく予測によれば、該タンパク質に効率的に認識されるはずであった。しかし、この断片の認識はこの実験中には起こらなかった。
したがって、ＰＡＭ ＣＡＧＣＡＴＴを、同じＰＡＭに制限された別のプロトスペーサー・ターゲット上でさらに検証した（図１０）。この場合、ＰＡＭは有効に認識され、ＤＮＡのカットを生じた。したがって、該タンパク質は、ＤＮＡターゲット配列のある程度のさらなる優先性を有する。この優先性はおそらく、ＤＮＡの二次構造に関連する。
したがって、研究は、ＰｐＣａｓ９におけるヌクレアーゼ活性の存在を示し、そしてまた、そのＰＡＭ配列を決定し、そしてガイドＲＮＡの配列を検証することを可能にした。
ＰｐＣａｓ９リボ核タンパク質複合体は、プロトスペーサーの５’端からのＰＡＭ ５’ ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ ３’に制限されるターゲット中の切断を特異的に導入する。ＰｐＣａｓ９／ＲＮＡ複合体のスキームを図１１に示す。
ＰｐＣａｓ９リボ核タンパク質複合体は、プロトスペーサーの５’端からのＰＡＭ ５’ ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ ３’に制限されるターゲット中の切断を特異的に導入する。ＰｐＣａｓ９／ＲＮＡ複合体のスキームを図１１に示す。
実施例２． ＤＮＡターゲットをカットするためのハイブリッドガイドＲＮＡの使用。
ｓｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡの１つの型であり、融合したｔｒａｃｒＲＮＡ（トレーサーＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡである。最適なｓｇＲＮＡを選択するため、本発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ二重鎖の長さが異なる、この配列の３つの変異体を構築した。ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、そしてＤＮＡターゲットのカットに対して、これらに関する実験を行った（図１２）。
ｓｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡの１つの型であり、融合したｔｒａｃｒＲＮＡ（トレーサーＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡである。最適なｓｇＲＮＡを選択するため、本発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ二重鎖の長さが異なる、この配列の３つの変異体を構築した。ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、そしてＤＮＡターゲットのカットに対して、これらに関する実験を行った（図１２）。
ハイブリッドＲＮＡとして、以下のＲＮＡ配列を用いた：
太字は、ターゲットＤＮＡとの対形成を提供する２０ヌクレオチド配列を示す（ｓｇＲＮＡの可変部分）。さらに、実験は、ＲＮＡを含まない対照試料、およびｃｒＲＮＡ＋ｔｒＲＮＡを用いたターゲットのカットである陽性対照を用いた。
対応するコンセンサス配列ＰＡＭ ＣＡＡＣＡＴＴを含む認識部位５’ ｔａｔｃｔｃｃｔｔｔｃａｔｔｇａｇｃａｃ ３’を含有する配列を、ＤＮＡターゲットとして用いた：
太字は認識部位を示し、大文字はＰＡＭを表す。
反応を以下の条件下で行った：ＰＡＭ（ＣＡＡＣＡＴＴ）を含有するＤＮＡ配列の濃度は２０ｎＭであり、タンパク質濃度は４００ｎＭであり、ＲＮＡ濃度は２μＭであり；インキュベーション時間は３０分間であり、インキュベーション温度は３７℃であった。
反応を以下の条件下で行った：ＰＡＭ（ＣＡＡＣＡＴＴ）を含有するＤＮＡ配列の濃度は２０ｎＭであり、タンパク質濃度は４００ｎＭであり、ＲＮＡ濃度は２μＭであり；インキュベーション時間は３０分間であり、インキュベーション温度は３７℃であった。
選択したｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２は、天然ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ配列として効率的であることが見出された：カットは、ＤＮＡターゲットの８０％より多くで起こった（図１２）。
これらのハイブリッドＲＮＡ変異体を用いて、ＤＮＡターゲットと直接対形成する配列を修飾した後、任意の他のターゲットＤＮＡを切断してもよい。
実施例３． 肺パスツレラ菌に属する近縁生物由来のＣａｓ９タンパク質。
実施例３． 肺パスツレラ菌に属する近縁生物由来のＣａｓ９タンパク質。
今日まで、肺パスツレラ菌ではＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９酵素は特徴づけられてこなかった。サイズが匹敵する黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９タンパク質は、ＰｐＣａｓ９と２８％同一である（ＢＬＡＳＴｐソフトウェア、デフォルトパラメータによって、同一性の度合いを計算した）。他の既知のＣａｓ９タンパク質において類似の度合いの同一性が存在する（未提示）。
したがって、ＰｐＣａｓ９タンパク質は、今日までに研究されている他のＣａｓ９タンパク質とは、アミノ酸配列が有意に異なる。
遺伝子操作の当業者は、本出願者らによって得られ、そして特徴づけられているＰｐＣａｓ９タンパク質配列変異体を、タンパク質自体の機能を変化させずに修飾しうる（例えば機能活性に直接影響を及ぼさないアミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （１９８９）， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ．１５．３－１５．１０８））ことを認識するであろう。特に、当業者は、タンパク質機能性に関与する（タンパク質機能または構造を決定する）残基に影響を及ぼすことなく、非保存性アミノ酸残基を修飾しうることを認識するであろう。こうした修飾の例には、相同のものでの非保存性アミノ酸残基の置換が含まれる。非保存性アミノ酸残基を含有する領域のいくつかを図１２に示す。本発明のいくつかの態様において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして非保存性アミノ酸残基でのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を使用して、ＤＮＡ分子において、前記ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’の直前に位置する二本鎖切断を形成することが可能である。対応する核酸分子を突然変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ仲介性突然変異誘発）することによって、相同タンパク質を得て、その後、本明細書に記載する機能分析にしたがって、その機能の保持に関して、コードされる修飾Ｃａｓ９タンパク質を試験してもよい。
遺伝子操作の当業者は、本出願者らによって得られ、そして特徴づけられているＰｐＣａｓ９タンパク質配列変異体を、タンパク質自体の機能を変化させずに修飾しうる（例えば機能活性に直接影響を及ぼさないアミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （１９８９）， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ．１５．３－１５．１０８））ことを認識するであろう。特に、当業者は、タンパク質機能性に関与する（タンパク質機能または構造を決定する）残基に影響を及ぼすことなく、非保存性アミノ酸残基を修飾しうることを認識するであろう。こうした修飾の例には、相同のものでの非保存性アミノ酸残基の置換が含まれる。非保存性アミノ酸残基を含有する領域のいくつかを図１２に示す。本発明のいくつかの態様において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして非保存性アミノ酸残基でのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を使用して、ＤＮＡ分子において、前記ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’の直前に位置する二本鎖切断を形成することが可能である。対応する核酸分子を突然変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ仲介性突然変異誘発）することによって、相同タンパク質を得て、その後、本明細書に記載する機能分析にしたがって、その機能の保持に関して、コードされる修飾Ｃａｓ９タンパク質を試験してもよい。
実施例４． 本発明記載のＰｐＣａｓ９系を、ガイドＲＮＡと組み合わせて用いて、真核生物を含む多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列を修飾してもよい。この生物の細胞内に（すべての細胞内にまたは一部の細胞内に）、ガイドＲＮＡを含む複合体中のＰｐＣａｓ９系を導入するため、当業者に知られる多様なアプローチを適用してもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を生物の細胞に送達するための方法は、情報源中（Ｌｉｕ Ｃら， Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０１７ Ｎｏｖ ２８；２６６：１７－２６； Ｌｉｎｏ ＣＡら， Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ２０１８ Ｎｏｖ；２５（１）：１２３４－１２５７）に、そしてこれらの情報源内にさらに開示される情報源中に開示されている。
真核細胞におけるＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼの有効な発現のため、当業者に知られる方法（例えば、ＩＤＴコドン最適化ツール）によって、ＰｐＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列に関してコドンを最適化することが望ましいであろう。
真核細胞におけるＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼの有効な活性のため、真核細胞の核内にタンパク質を移入することが必要である。これは、Ｓｈｅｎ Ｂら ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｍａｙ；２３（５）：７２０－３に記載されるスペーサー配列を通じて、またはスペーサー配列を含まずに、ＰｐＣａｓ９配列に連結された、ＳＶ４０ Ｔ抗原（Ｌａｎｆｏｒｄら， Ｃｅｌｌ， １９８６， ４６：５７５－５８２）由来の核局在化シグナルを用いることによって行われてもよい。したがって、真核細胞の核内に輸送されるべきヌクレアーゼの完全アミノ酸配列は、以下の配列であろう：ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ－ＰｐＣａｓ９－ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（以後、ＰｐＣａｓ９ ＮＬＳと称される）。上記アミノ酸配列を含むタンパク質を、少なくとも２つのアプローチを用いて送達してもよい。
遺伝子送達は、プロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）の制御下でＰｐＣａｓ９ ＮＬＳ遺伝子を、そしてＵ６プロモーターの制御下でガイドＲＮＡをコードする配列を所持するプラスミドを生成することによって達成される。ＤＮＡターゲットとして、５’－ＮＮＮＮ（Ｇ／Ａ）Ｔ－３’が隣接するＤＮＡ配列を用い、これは例えばヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子の配列である：
したがって、ｓｇＲＮＡ発現カセットは以下のようになる：
太字は、Ｕ６プロモーター配列を示し、この後に、ＤＮＡターゲット認識に必要な配列が続き、そしてさらに、赤で強調されたｓｇＲＮＡ構造を形成する配列が続く。
プラスミドＤＮＡを精製し、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクションする。細胞を７２時間インキュベーションし、その後、ゲノムＤＮＡ精製カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、そこからゲノムＤＮＡを抽出する。定向性二本鎖切断、その後、その修復によりターゲット部位で行われたＤＮＡ中の挿入／欠失の数を決定するため、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で配列決定することによって、ターゲットＤＮＡ部位を分析する。
プラスミドＤＮＡを精製し、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクションする。細胞を７２時間インキュベーションし、その後、ゲノムＤＮＡ精製カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、そこからゲノムＤＮＡを抽出する。定向性二本鎖切断、その後、その修復によりターゲット部位で行われたＤＮＡ中の挿入／欠失の数を決定するため、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で配列決定することによって、ターゲットＤＮＡ部位を分析する。
切断導入の推定部位に隣接するプライマーを用いて、ターゲット断片の増幅を行う。
増幅後、ハイスループット配列決定のためのＩｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ）試薬試料調製プロトコルのためのＵｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡライブラリープレップキットにしたがって、試料を調製する。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上、３００サイクル、直接読み取りで、配列決定を行う。バイオインフォマティクス法によって、配列決定結果を分析する。ターゲットＤＮＡ配列中のいくつかのヌクレオチドの挿入または欠失を、カット検出と見なす。
増幅後、ハイスループット配列決定のためのＩｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ）試薬試料調製プロトコルのためのＵｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡライブラリープレップキットにしたがって、試料を調製する。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上、３００サイクル、直接読み取りで、配列決定を行う。バイオインフォマティクス法によって、配列決定結果を分析する。ターゲットＤＮＡ配列中のいくつかのヌクレオチドの挿入または欠失を、カット検出と見なす。
ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）中、ガイドＲＮＡと組換えＰｐＣａｓ９ ＮＬＳをインキュベーションすることによって、リボ核酸複合体としての送達を行う。サイズ排除（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）を伴うアフィニティクロマトグラフィ（ＮｉＮＴＡ、Ｑｉａｇｅｎ）により、組換えタンパク質を精製することによって、産生細菌細胞から組換えタンパク質を産生する。
タンパク質を、１：２（ＰｐＣａｓ９ ＮＬＳ：ｓｇＲＮＡ）の比でＲＮＡと混合し、該混合物を室温で１０分間インキュベーションし、そして次いで細胞内にトランスフェクションする。
次に、そこから抽出したＤＮＡを、ターゲットＤＮＡ部位での挿入／欠失に関して分析する（上述の通り）。
細菌、肺パスツレラ菌由来の本発明で開示されるＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼは、以前開示されたＣａｓ９タンパク質に比較して、いくつかの利点を有する。
細菌、肺パスツレラ菌由来の本発明で開示されるＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼは、以前開示されたＣａｓ９タンパク質に比較して、いくつかの利点を有する。
ＰｐＣａｓ９は、他の既知のＣａｓヌクレアーゼとは異なり、系が機能するために必要な、短い２文字ＰＡＭを有する。本発明は、プロトスペーサーから４ヌクレオチド離れた位置の短いＰＡＭ（ＲＴ）の存在が、ＰｐＣａｓ９が機能するために十分であることを示した。
ＤＮＡ内に二本鎖切断を導入可能な、これまでに知られているＣａｓヌクレアーゼの大部分は、多文字の複雑なＰＡＭを有し、これがカットに適切な配列の選択を制限する。今日までに研究される、短いＰＡＭを認識するＣａｓヌクレアーゼの中で、ＰｐＣａｓ９のみが、ＲＴモチーフが隣接する配列を認識しうる。
ＰｐＣａｓ９の第二の利点は、小さいタンパク質サイズ（１０５５ａａｒ）である。今日まで、該酵素は、２文字ＲＴ ＰＡＭ配列を有する、研究される唯一の小サイズタンパク質である。
ＰｐＣａｓ９は、他のヌクレアーゼの現在知られるＰＡＭ配列とは異なる、短い使いやすいＰＡＭを伴う新規の小サイズＣａｓヌクレアーゼである。ＰｐＣａｓ９タンパク質は、３７℃を含めて高い効率で多様なＤＮＡターゲットを切断し、そして新規ゲノム編集ツールの基礎となりうる。
本発明は、開示する態様に言及して記載されてきているが、当業者は、詳細に記載される特定の態様が、本発明を例示する目的のために提供されており、そしていかなる意味でも本発明の範囲を限定するとは見なされないことを認識するであろう。本発明の精神から逸脱することなく、多様な修飾を行ってもよいことが理解されるであろう。
Claims (5)
- 配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして非保存性アミノ酸残基でのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含む、タンパク質の、ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’の直前に位置する、前記ＤＮＡ分子中の二本鎖切断を形成するための使用。
- ３５℃～４５℃の温度で、ＤＮＡ分子中に二本鎖切断が形成されることで特徴づけられる、請求項１記載の使用。
- タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のタンパク質の使用。
- 単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列を修飾するための方法であって、有効量の：ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸のいずれか、ならびにｂ）ヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’にすぐ隣接する生物のゲノムＤＮＡ領域のヌクレオチド配列と二重鎖を形成し、そして二重鎖形成後に前記タンパク質と相互作用する配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列のいずれか、を前記生物の少なくとも1つの細胞内に導入する工程を含む、
ここで、前記タンパク質と該ガイドＲＮＡおよびヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’の相互作用が、配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）Ｔ－３’に直接隣接するゲノムＤＮＡ配列中の二本鎖切断の形成を生じる
前記方法。 - ガイドＲＮＡと同時に、外因性ＤＮＡ配列の導入をさらに含む、請求項４記載の方法。
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