JP2022535992A - 単胃動物の腸内において微生物の集団を成長させるための組成物および方法 - Google Patents

単胃動物の腸内において微生物の集団を成長させるための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、単胃動物の腸内において微生物の集団を成長させるための組成物、および単胃動物の腸内において微生物の集団を成長させるための方法に関する。本発明はまた、単胃動物の平均１日増体量を増大させるための方法に関する。

Description

本発明は、単胃動物の腸内において微生物の集団を成長させるための組成物、および単胃動物の腸内において微生物の集団を成長させるための方法に関する。本発明はまた、単胃動物の平均１日増体量を増大させるための方法に関する。
健常で疾患のない動物が、病気の動物または免疫負荷された動物よりも、速く成長するまたは飼料を効率的に体組織に変換できることは公知である。動物における、より速い成長または望ましい体組織への飼料のより効率的な変換は、経済的にも生態学的にも、食品のために飼育される動物においては特に、重要であることは明白である。この理由および他の理由から、動物が疾患と接するのを予防することが望ましい。
動物を健康に保つための１つのアプローチは、動物に抗生物質を与えることである。しかし、そのアプローチは、食品に抗生物質残留物が存在し得るため、食品のために飼育される動物には望ましくない。さらに、抗生物質の使用は、抗生物質耐性細菌を選択するリスクを増加させ、これは、ヒトの健康にとって非常に重要な懸念事項である。
別のアプローチにおいて、反芻動物への生酵母の補給は、繊維消化を増大させ、その成長を改善することが示されている。多数のインビボ実験により、反芻動物で、繊維消化の増大における生酵母の効果が証明され（Wohlt et al., 1988; Guedes et al., 2008; Marden et al., 2008）、これを達成する主なメカニズムの１つが、フィブロバクター・スクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）を含む繊維分解性細菌群の成長および活性を増加させることによるものであることが結論付けられている（Chaucheyras-Durand and Fonty, 2002; Mosoniet al., 2007; Wallace and Newbold, 2007）。フィブロバクター門（Fibrobacteres）は、反芻動物において最初に記載された細菌門である。この門については、フィブロバクター属（Fibrobacter）のみが記載されており、この属は現在、正式に培養された記載されている種、フィブロバクター・インテスティナリス（Fibrobacter intestinalis）およびフィブロバクター・スクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）のみを含む。フィブロバクター門（Fibrobacteres）は、独特の一連のヘミセルロース分解酵素を持つことが公知であり、その単一エネルギー源としてのセルロースの効率的で多産な分解菌である（Suen et al., 2011）。
しかし、単胃動物、より特定するとブタにおけるフィブロバクター門（Fibrobacteres）に関する知識は、あまり進歩していない。選択培地を使用する培養依存的なアプローチおよび１６ＳｒＤＮＡを標的とする培養非依存的技術により、フィブロバクター属（Fibrobacter）を含む、ブタの腸集団に生息する潜在的なコア集団が確認された。フィブロバクター・インテスティナリス（Fibrobacter intestinalis）およびフィブロバクター・スクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）は共に、ブタの腸内で確認されている。単胃動物におけるプロバイオティクスとフィブロバクター門（Fibrobacteres）との相互作用についてはほとんど知られていない。唯一の公表されている結果は、離乳後の仔ブタに離乳後２８日間プロバイオティクス細菌を補給すると、フィブロバクター門（Fibrobacteres）の集団が減少するという研究である（Li et al., 2016）。反芻動物において公知であって観察されていることとは逆に、単胃動物における繊維分解性群集、より正確にはフィブロバクター門（Fibrobacteres）の活性および成長に対する酵母の効果は実証されていない。
別の研究の少ない門は、放線菌門（Actinobacteria）であり、この門は、相対存在量の点からはマイナーであると考えられるが、機能の重要性がますます主張されるようになっている。重要な繊維分解性の科であるビフィドバクテリウム科（Bifidobacteriaceae）は、放線菌門（Actinobacteria）の一部である。同様に、コリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）も、放線菌門（Actinobacteria）に属する。この科の一部である数種の細菌は、動物の飼料効率および成長能力を促進する興味深い標的である、胆汁酸の代謝に関与している。
繊維分解は、数ある利点の中でも結腸細胞のエネルギー源である短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を生成するので、例えばブタのような単胃動物にとって重要である。
同様に、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換による成長能力の改善（Ipharaguerre et al., 2018）もまた、重要性が増しつつある。したがって、腸内微生物叢の調節による一次胆汁酸と二次胆汁酸とのバランスの促進は、単胃動物の飼料利用および成長能力を最適化するために興味深い。
フィブロバクター門（Fibrobacteres）および放線菌門（Actinobacteria）は、相対存在量の点からはマイナー細菌門であるが、それらが繊維分解効果を発揮しかつ放線菌門（Actinobacteria）が胆汁酸を変換できる細菌（例えば、コリンセラ属（Collinsella）の種およびオルセネラ属（Olsenella）の種）を含むという事実により、実際に重要な機能的役割を果たすことができる。腸内において、コリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）は、重要な機能、例えば、胆汁塩およびステロイドの変換ならびに食餌性ポリフェノールの活性化を行う（Clavel et al., 2014）。コリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）は、コリオバクテリウム目（Coriobacteriales）（放線菌門（Actinobacteria））内の科である。
したがって、単胃動物の繊維消化を増大させるために、単胃動物および／またはその同腹仔の腸内における繊維消化、胆汁酸の変換または両方に関与する微生物の集団を維持するまたは成長させることが必要である。また、単胃動物の平均１日増体量を増大させる必要性も高まっている。
本開示は、単胃動物の平均１日増体量を増大させるのに有効な量のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物と好適な担体とを含む組成物を提供する。
本開示はまた、単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させるのに有効な量のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物と好適な担体とを含む組成物を提供する。本開示の一態様において、微生物の集団は、繊維消化、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換または両方に関与する。
本発明はさらに、本開示の実施形態において定義される組成物を含む飼料または食品添加物を提供する。
本開示はまた、単胃動物の平均１日増体量を増大させるための、本開示の実施形態において定義される組成物の使用を提供する。
本開示はまた、単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させる方法であって、本開示の実施形態において定義される組成物の有効量を単胃動物に給餌するステップを含む、方法を提供する。
本開示はまた、単胃動物の平均１日増体量を増大させるための方法であって、本開示の実施形態において定義される組成物の有効量を単胃動物に給餌するステップを含む、方法を提供する。
全試験期間において、抗生物質のみ（対照（Ｃｔｌ））、抗生物質と組み合わされたサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９（Ｔ１）、および抗生物質を含まないサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９（Ｔ２）が給餌された仔ブタにおいて得られた、平均１日増体量（ＡＤＧ）および飼料変換比を示すグラフである。 抗生物質のみ（対照（Ｃｔｌ＋ＡＢ））、抗生物質と組み合わされたサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９（ＬＳＢ＋ＡＢ）、および抗生物質を含まないサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９（ＬＳＢ）が給餌された仔ブタにおける、異なる時点（１０日目、３４日目および５０日目（Ｄ１０、Ｄ３４およびＤ５０））におけるおよび平均での、フィブロバクター門（Fibrobacteres）の平均存在量および検出頻度を示すグラフである。第１のプロット（左側）は、時点（１０日目、３４日目および５０日目）毎の結果を示す。第２のプロット（中間）は、同じ結果を、全実験期間における処置毎の平均で表したものを示し、最後の図（右側）は、処理毎の平均検出頻度を示す。 抗生物質のみ（Ｃｔｌ＋ＡＢ）、サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９＋抗生物質（ＬＳＢ＋ＡＢ）、およびサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９のみ（ＬＳＢ）が給餌された仔ブタにおける、放線菌門（Actinobacteria）、コリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）ならびにコリンセラ属（Collinsella）種およびオルセネラ属（Olsenella）種の存在量の中央値を示すグラフである。 対照食餌（Ｃｔｌ）またはサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９（ＬＳＢ）が給餌された雌ブタにおける、フィブロバクター門（Fibrobacteres）の平均存在量を、平均で（左側パネル）および出産歴毎に（右側パネル）示すグラフである。 左側：対照食餌（Ｃｔｌ）またはサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９（ＬＳＢ）のいずれかが給餌された母親からの仔ブタにおけるフィブロバクター・インテスティナリス（Fibrobacter intestinalis）の検出頻度、右側：雌ブタ（ＣｔｌまたはＬＳＢ）および仔ブタ（ＡＢ：抗生物質を含む陽性対照；Ｃｔｌ：抗生物質を含まない陰性対照およびＳＢ：サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９食餌）が受けた処置の、時点（０日目、６日目および２０日目）毎のＦ．インテスティナリス（F. intestinalis）の、検出頻度に対する効果を示すグラフである。仔ブタに抗生物質を与えると、雌ブタにサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が給餌された場合を除いて、仔ブタ糞便中にＦ．インテスティナリス（F. intestinalis）は検出されない。仔ブタが陰性対照（Ｃｔｌ）を受けた場合、雌ブタへのサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９の補給は、仔ブタ糞便中におけるＦ．インテスティナリス（F. intestinalis）の検出頻度の増加をもたらす。 分娩（farrowing）前の雌ブタにおけるフィブロバクター門（Fibrobacteres）の相対存在量（％）と仔ブタの平均離乳時体重（ｋｇ）との正の相関を示すグラフである。
飼料からのほとんどの栄養素は、化学的に消化されて、小腸によって吸収される。これは一般に、タンパク質、脂質および可消化性炭水化物にも当てはまる。しかし、非消化性炭水化物の大部分は後腸に到達し、そこで局所の微生物群集である微生物叢によって部分的に消費されることになる。この微生物発酵の産物として短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）が形成される。これは、局所的に吸収されて、宿主のエネルギー源として使用されることが可能である。飼料の繊維画分は非常に不均一であり、以下を含み得る：
例えば、フルクタン、ガムおよび／またはペクチンなどの、容易に発酵される可溶性成分；
セルロースおよび／またはヘミセルロースなどの、部分的に分解可能な構造成分；
キチンおよび／またはリグニンのような、実際には不消化の細胞壁保護物質。
ブタの食餌に繊維を含めると、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）の含有量と関連して消化輸送の速度が刺激され、アニマルウェルフェアに役立ち、便秘の発生率、常動行動およびストレスが低減される（Gerrits and Verstegen, 2006）。
発酵性繊維の割合は、可溶性繊維の含有量と正の関連を示し、リグニンのレベルと負の関連を示す。これは、腸内環境（ｐＨ、アンモニア濃度、ＳＣＦＡの産生）の変化に関連する。可溶性の低リグニン化繊維（例えば、甜菜パルプ）および不溶性のリグニン化繊維（例えば、オーツ麦ふすま）の両方のタイプの繊維は、異なるメカニズムによってブタの腸の健康に影響を与える：ａ）後腸発酵によるＳＣＦＡの産生、ならびにｂ）腸の運動性および機能性の改善（Nutritional requirements for swine, FEDNA, 2013）。
雌ブタは繊維を消化するようによく適応している。雌ブタは、仔ブタまたは肥育ブタよりも容積の大きい大腸を備えている。消化管内容物は、総消化時間の７０～８５％の間、大腸にとどまり、後腸の微生物叢と接触させられる。この特殊性は、例えば、幼若ブタよりもはるかに高いセルロース分解活性を雌ブタに与える。実際、雌ウシのルーメンに局在する、繊維を消化できる細菌の多くは、雌ブタの結腸でも確認できる。セルロース分解性細菌は、増殖し且つ代謝的に活性となるためには嫌気性環境を必要とすることに留意することが重要である。しかし、腸粘膜を刺激する巨大な血管新生が酸素をもたらし、微生物プロファイルに悪影響を及ぼす可能性があるため、これは必ずしも当てはまるとは限らない。雌ブタの微生物叢が仔ブタの早期コロニー形成に強い影響を与えることがはっきりと実証されているため、雌ブタにおける繊維分解性細菌集団の増加は、仔ブタの場合にも興味深い可能性がある。
胆汁酸が、成長促進剤としての抗生物質の使用に代わる効果的なものを開発するための有望な標的として浮上している。実際、ブタにおいて成長の刺激または離乳後の腸炎を予防に一般的に使用される用量での抗生物質および酸化亜鉛の使用は、腸における胆汁酸（ＢＡ）の微生物産生の促進に集中することが実証されている。これは、ＢＡの割合を組織特異的に変更し、それによって腸、肝臓および白色脂肪組織におけるＢＡシグナル伝達が増幅される。ＢＡ調節経路の活性化は、細菌感染ならびに体液および電解質の病的分泌に対する腸の保護を最終的に強化し、結腸の炎症を減弱し、肝臓におけるタンパク質および脂質代謝を変化させる。これらの変化は、成長のための栄養素を節約し、処置された単胃動物の代謝効率を改善する可能性があると考えられる。したがって、これら胆汁酸を産生できる細菌集団の促進は、動物の成長を促進するために興味深い。
本開示は、単胃動物へのサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株またはそれを含む組成物の給餌が、下部腸内発酵に影響を及ぼすことによって単胃動物の繊維消化性を増大させることによって、およびまた、胆汁酸代謝に関連する細菌集団を刺激することによって、単胃動物の飼料効率におよび単胃動物の平均１日増体量に影響を与えるという予想外の発見から得られる。
特定の理論に縛られるものではないが、単胃動物の腸内におけるサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の作用機序の一部は、盲腸および結腸の両方において酵母によって行われる酸素の急速な消費と関係があると考えられる。これにより、セルロース分解性細菌および胆汁酸代謝に関与する細菌を含む嫌気性細菌が増殖できる、より良好な嫌気性条件が作り出される。結果として、ＳＣＦＡの形態でのより多くのエネルギーが同じ食餌からより短時間で放出される一方で、胆汁酸代謝の変化がより良好な成長効率をもたらす。
本開示は、単胃動物の平均１日増体量を増大させるのに有効な量のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物と好適な担体とを含む組成物を提供する。
本開示は、単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させるのに有効な量のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物と好適な担体とを含む組成物をさらに提供する。一実施形態において、微生物の集団は繊維消化、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換または両方に関与する。
一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、プロバイオティクス株である。さらなる一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）株である。なおさらなる一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、ＣＮＣＭ（すなわち、ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ ＤＥ ＣＵＬＴＵＲＥＳ ＤＥ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＳ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、２５－２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ、７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５、フランス）にアクセッション番号Ｉ－１０７９で寄託されているサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）株である。
本明細書中で使用する場合、「有効な量の（で）」という表現は、単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させるのに少なくとも十分である、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物の量を指すと理解するものとする。この表現はまた、単胃動物の平均１日増体量を増大させるのに少なくとも十分である、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物の量も指す。
一実施形態において、単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させるのに少なくとも十分である、または単胃動物からの子孫の平均１日増体量を増大させるのに少なくとも十分である、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物の量は、組成物１キログラム当たり少なくとも１×１０７ＣＦＵ、組成物１キログラム当たり少なくとも１×１０８または組成物１キログラム当たり少なくとも１×１０９ＣＦＵの量である。さらなる一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、組成物１キログラム当たり１×１０７ＣＦＵ～１×１０１２ＣＦＵの範囲の量である。なおさらなる一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、組成物１キログラム当たり１×１０８ＣＦＵ～１×１０１２ＣＦＵの範囲の量である。いっそうさらなる一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、組成物１キログラム当たり１×１０９ＣＦＵ～１×１０１２ＣＦＵの範囲の量である。
一実施形態において、好適な担体は、飼料または食品、より具体的には単胃動物に好適な、任意の経口摂取可能な動物用飼料または食品である。当業者ならば、飼料または食品は単胃動物によって異なり得ることがわかるであろう。飼料および食品としては、ブタおよび家禽用のスープ、ペレットもしくはミールベースの食餌、またはイヌおよびネコ用のキブル、ウェットタイプの食品およびおやつが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらなる一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、単胃動物の基礎食餌と混合することができる。代替の一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、飼料または食品上にトップドレッシングする（top-dress）ことができる。さらなる代替の一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、単胃動物の基礎食餌上にトップドレッシングすることができる。
一実施形態において、単胃動物は、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギもしくは家禽である。さらなる一実施形態において、ブタは、雌ブタ、成長中および肥育中のブタならびに仔ブタを含む。なおさらなる一実施形態において、家禽はメンドリおよびヒヨコを含む。なおいっそうの一実施形態において、単胃動物は、その子孫である。
代替的な一実施形態において、前述の組成物は、少なくとも１種の追加の微生物株を
らに含むことができる。追加の微生物株としては、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．リケフォルミス（B. licheniformis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、ペディオコッカス・アシディラクチシ（Pediococcus acidilacti）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．カゼイ（L. casei）、Ｌ．プランタルム（L. plantarum）、Ｌ．ラムノサス（L. rhamnosus）またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
別の代替的実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物を含む組成物は、エンテロコッカス属（Enterococcus）株を含まない。組成物は細菌株を含まなくてもよく、および／または追加の酵母株を含まなくてもよい。組成物は、追加の微生物株を含まなくてもよい。組成物は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の１種または複数の生物学的に純粋な培養物と、好適な担体とからなってもよく、またはそれらから本質的になってもよい。
本明細書による組成物は、単胃動物に出される任意の形態であることができる。当業者ならば、各単胃動物種にどの形態が好ましいかをわかるであろう。利用可能な種々の形態を例示するために、本開示による組成物は、ゼラチンカプセル剤、プレス錠、ゲルキャップ剤、動物用飼料またはサプリメント、動物用食品または液体飲料の形態であることができる。
本明細書中で使用する場合、「繊維消化に関与する微生物の集団」という表現は、セルロース分解酵素およびヘミセルロース分解酵素を合成する能力のおかけで複雑な植物多糖類を処理することができる微生物（しばしば、繊維分解性細菌と称される）を一般に指すと理解するものとする。多糖類は、植物細胞の細胞壁に、主にセルロースおよびヘミセルロースから構成されるコンパクトな繊維の形態で存在する。
本明細書中で使用する場合、「一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換に関与する微生物の集団」という表現は、一次胆汁酸を代謝できる微生物を一般に指すと理解するものとする。胆汁酸は、哺乳類の肝臓によってコレステロールおよび他の酸性ステロイドから産生される。
一実施形態において、繊維消化に関与する微生物の集団は、フィブロバクター門（Fibrobacteres）、放線菌門（Actinobacteria）または両方の微生物の集団である。さらなる一実施形態において、繊維消化に関与する微生物の集団は、フィブロバクター属（Fibrobacter）、ビフィドバクテリウム科（Bifidobacteriaceae）または両方の微生物の集団である。いっそうさらなる一実施形態において、繊維消化に関与する微生物の集団は、フィブロバクター・インテスティナリス（Fibrobacter intestinalis）、フィブロバクター・スクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）または両方である。
一実施形態において、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換に関与する微生物は、放線菌門（Actinobacteria）の微生物である。さらなる一実施形態において、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換に関与する微生物は、コリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）の微生物である。なおさらなる一実施形態において、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換に関与する微生物は、コリンセラ属（Collinsella）の種およびオルセネラ属（Olsenella）の種または両方の微生物である。
いずれの場合にも、微生物の集団は、単胃動物の平均１日増体量を増大させることもできる。
本開示は、これまでの実施形態の全てに定義されている組成物を含む飼料または食品添加物をさらに提供する。
本開示は、単胃動物の繊維消化性を増大させるための、前記の実施形態の全てに記載された組成物の使用をさらに提供する。使用の一実施形態において、前記の種々の実施形態において定義された組成物が給餌された単胃動物の繊維消化性は、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の繊維消化性と比較した場合、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％増大される。
別の実施形態において、前記実施形態に記載された組成物は、単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させるのに使用される。使用のさらなる一実施形態において、前記組成物が給餌された単胃動物の腸内の微生物の集団は、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の微生物の集団と比較した場合、少なくとも１０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５または３００％増大される。使用のさらなる一実施形態において、微生物の集団は、繊維消化、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換、または両方に関与する。
なおさらなる一実施形態において、前記実施形態の全てに記載された組成物は、単胃動物の平均１日増体量を増大させるのに使用される。さらなる一実施形態において、前記組成物が給餌された単胃動物の平均１日増体量は、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の平均１日増体量と比較した場合、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％増大される。
本開示は、単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させる方法であって、前記実施形態において定義された組成物の有効量を単胃動物に給餌するステップを含む、方法をさらに提供する。一実施形態において、微生物の集団は、繊維消化、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換または両方を可能にする、またはそれに関与する。方法の別の実施形態において、単胃動物の腸内の微生物の集団の成長は、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の微生物の集団と比較した場合、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５または３００％増大される。方法の別の実施形態において、組成物は、動物の基礎食餌と混合することができる。
方法のさらなる一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物の量は、組成物１キログラム当たり少なくとも１×１０７ＣＦＵ、組成物１キログラム当たり少なくとも１×１０８、または組成物１キログラム当たり少なくとも１×１０９ＣＦＵの量である。さらなる一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、組成物１キログラム当たり１×１０７ＣＦＵ～１×１０１２ＣＦＵの範囲の量である。なおさらなる一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、組成物１キログラム当たり１×１０８ＣＦＵ～１×１０１２ＣＦＵの範囲の量である。いっそうさらなる一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物は、組成物１キログラム当たり１×１０９ＣＦＵ～１×１０１２ＣＦＵの範囲の量である。
方法の一実施形態において、組成物の有効量を単胃動物に給餌するステップは、毎日行われる。方法のなおさらなる一実施形態において、組成物の有効量を前記単胃動物に給餌するステップは、少なくとも１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０日間の期間にわたって毎日行われる。
前述の方法の一実施形態において、単胃動物は、妊娠中、授乳中、離乳中または成長中である。
方法の一実施形態において、単胃動物に組成物の有効量を給餌するステップは、分娩（whelping）の少なくとも５日前に行う。本明細書による組成物の単胃動物への給餌はまた、子孫の腸にも有益であることが判明した。さらなる一実施形態において、前記組成物が給餌された単胃動物からの子孫の腸内の微生物の集団の成長は、前記組成物が給餌されなかった単胃動物からの子孫の腸内の、繊維消化に関与する微生物の集団と比較した場合、増大される。より具体的には、前記組成物が給餌された単胃動物からの子孫の腸内の、繊維消化に関与する微生物の集団の成長は、前記組成物が給餌されなかった単胃動物からの子孫における微生物の集団と比較した場合、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５または３００％増大される。
前記実施形態に記載された方法の代替の実施形態において、単胃動物に組成物を給餌するステップは、少なくとも１種の抗生物質および／または酸化亜鉛と組み合わせて行うことができる。抗生物質は、単胃動物を成長させるために農業で通常使用されるものである。使用される抗生物質は、例えば、アモキシシリン、ドキシサイクリン、リンコマイシン、コリスチン、チアムリン、またはそれらの任意の組み合わせであることができるが、これらに限定されるものではない。他の好適な抗生物質も、前述の方法において本開示による組成物と組み合わせて使用することができる。
本開示は、単胃動物からの子孫の平均１日増体量を増大させるための方法であって、前記実施形態の全てに記載された組成物の有効量を単胃動物に給餌するステップを含む、方法をさらに提供する。この方法の一実施形態において、本明細書による組成物の有効量が給餌された単胃動物からの子孫の平均１日増体量は、前記組成物の有効量が給餌されなかった単胃動物からの子孫の平均１日増体量と比較して、少なくとも２１日以内に増加される。この方法の別の実施形態において、前記組成物が給餌された単胃動物からの子孫の平均１日増体量は、前記組成物が給餌されなかった単胃動物からの子孫の平均１日増体量と比較した場合、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％増大される。
前述の使用および方法のいずれにおいても、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物を含む組成物は、エンテロコッカス属（Enterococcus）株を含まなくてもよい。組成物は細菌株を含まなくてもよく、および／または追加の酵母株を含まなくてもよい。組成物は、追加の微生物株を含まなくてもよい。前記方法および使用は、エンテロコッカス属（Enterococcus）株の投与を含まなくてもよい。前記方法および使用は、追加の細菌株および／または追加の酵母株の投与を含まなくてもよい。前記方法および使用は、追加の微生物株の投与を含まなくてもよい。
前述の使用は、非治療的であってもよい。前述の方法は、非治療的であってもよい。本明細書中には、単胃動物の平均１日増体量を増大させるための方法に使用するための、または単胃動物および／もしくはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するもしくは成長させるための方法に使用するための、前述の組成物も記載する。この方法は、治療による動物体の処置のための方法であってもよい。
前述の実施形態の全てにおいて、単胃動物は、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、家禽またはその子孫である。ブタは、雌ブタ、成長中および肥育中のブタ、ならびに仔ブタを含み得る。単胃動物は、妊娠中、授乳中、離乳中または成長中であることができる。
[実施例１]
サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が補給された離乳後の仔ブタ
材料および方法
離乳後の２８８匹の仔ブタについて実施した５０日間の試験中に、糞便試料を収集した。仔ブタは２１日齢で離乳させ、３相の給餌プログラムに従った。基礎食餌に、最初の２つの相（Ｄ０～Ｄ１１およびＤ１２～Ｄ３３）においては抗生物質およびＺｎＯを、第３の相（Ｄ３４～Ｄ５０）においては抗生物質のみを補給した。仔ブタを３つの群：基礎食餌、２×１０９ＣＦＵ／ｋｇのサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が補給された基礎食餌、Ｄ１１に投薬を行わずに２×１０９ＣＦＵ／ｋｇのサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が補給された食餌に割り当てた。Ｄ１０、Ｄ３４およびＤ５０に処置群当たり２４匹の仔ブタから、糞便試料を収集した。畜産学的能力も測定した：体重（ＢＷ）を、試験の開始時および終了時、ならびに食餌変更毎に個別に記録した。飼料摂取量（ＦＩ）を、食餌の変更毎、畜舎毎に測定した。
Figure 2022535992000002
微生物のＤＮＡ抽出および１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシング
収集した糞便試料を、Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮＡ抽出キットを使用して処理した。微生物ＤＮＡの抽出は、４０～６０ｍｇの糞便からＺＲ－９６ Ｓｏｉｌ Ｍｉｃｒｏｂｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ（商標）（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）を使用して製造元の指示に従って行った。Ｒｅｔｓｃｈ ＭＭ４００ Ｍｉｘｅｒ Ｍｉｌｌを使用して、３０Ｈｚで１５分のビードビートステップを適用した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３およびＶ４超可変領域を、以下のプライマーを使用して増幅させた：
Ｖ３－Ｖ４領域
Ｖ３Ｖ４－３４３Ｆ ５’－ＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＧＧＲＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’
Ｖ３Ｖ４-７８３Ｒ ５’－ＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴ－３’
ＭｉＳｅｑシーケンサーでＲｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３を使用して、製造元の指示（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従って、ハイスループットシーケンシングを実行した。
バイオインフォマティクス分析
バイオインフォマティクス分析は、ＧｅｎｏＴｏｕｌバイオインフォマティクス施設（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）を使用して実行した。作成されたペアエンド２５０ｂｐ配列を、Ｆｌａｓｈソフトウェアを使用してアセンブルした（最小オーバーラップ１０ｂｐ、最大ミスマッチ１０％）。アセンブルした配列を、ＦＲＯＧＳパイプラインを使用して処理した（Escudie et al., 2018）。簡潔には、ＳＷＡＲＭアルゴリズムを使用してＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）で配列をクラスター化した（Mahe et al., 2014）。次に、キメラ配列を、ＵＣＨＩＭＥアルゴリズムを使用して試料毎に検出し、全ての試料から取り除いた（Edgar et al., 2011）。各シーケンシングデータセットに希薄化ステップを適用して、シーケンシング深度の差異によるバイアスを回避した。フィルタリングステップを適用して、全てのシングルトン（すなわち、１回のみの読み取りで表されるＯＴＵ）を取り除いた。作成されたＯＴＵカウントテーブルを、累計スケーリングによって正規化した。ＯＴＵの分類学的アノテーションを、ＳＩＬＶＡ ＳＳＵデータベースならびにＢＬＡＳＴ＋およびＲＤＰアルゴリズムを使用して実行した。同一性アライメントおよびカバレッジアライメントが９９％を超えるＢＬＡＳＴヒットを、アノテーションのために保存した。それ以外の場合は、種は不明としてアノテートし、ＲＤＰ分類子の結果をより上位のランクに使用した。属ランクおよびそれより上位のランクにおけるアノテーションのために、ブートストラップ閾値をそれぞれ０．９および０．８に設定した。門、科および属の相対存在量の表を作成した。
統計分析
畜産学的能力。平均１日増体量（ＡＤＧ）、飼料摂取量（ＦＩ）および飼料変換比（ＦＣＲ）を、畜舎毎での繰り返し測定のためにＳＡＳ（Ｔｈｅ ＳＡＳ Ｓｔａｔ． ｖ．９．３）のＭＩＸＥＤ手順によって実行した。統計モデルは、処置と時間、処置と性別および処置×時間×性別の間の相互作用も考慮して、処置、性別および時間の主効果を明らかにした。実験単位は畜舎とした。有意水準はＡ、ＢについてはＰ≦０．０１に、ａ、ｂについてはＰ≦０．０５に固定し、０．０５＜Ｐ≦０．１をトレンドと考えた。
微生物叢の分析。微生物叢の統計分析は、ＲソフトウェアおよびＲＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行った。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ順位和検定とそれに続く、平均順位和の多重比較のためのペアワイズ検定（Ｃｏｎｏｖｅｒ検定、ＰＭＣＭＲ Ｒパッケージ）を使用して、組成データを分析した。差異分析は、全配列の０．００５％超が相当する分類群についてのみ実行した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇの手順を使用して、生成されたＰ値を調整した。コンティンジェンシーデータを、Ｆｉｓｃｈｅｒの正確確率検定を使用して分析した。
結果
畜産学的能力。総合的には、平均１日増体量（ＡＤＧ）に有意差（Ｐ＜０．０１）が認められ、Ｔ１（酵母＋抗生物質）が給餌された仔ブタは、Ｃｔｌ（Ｃｔｌ＋抗生物質）およびＴ２（酵母のみ）が給餌された仔ブタよりも速く成長しているものであった（図１）。飼料変換比（ＦＣＲ）において効果が認められ、Ｔ１が給餌された仔ブタは、Ｃｔｌが給餌されたブタよりも飼料の体重増体量への変換が良好であった。飼料摂取量については、有意差は認められず、全ての仔ブタは、処置がいずれであっても同じ量の飼料を摂食した。
微生物叢の分析。フィブロバクター門（Fibrobacteres）の相対存在量は、処置がいずれであっても、おそらくは結腸に到達する繊維量の増加により、時間と共に増加した（Ｐ＜０．００１）。酵母の補給により、フィブロバクター門（Fibrobacteres）の平均存在量（％として表す）およびフィブロバクター門（Fibrobacteres）検出頻度（％、Ｐ＜０．０５；図２）が増加した。これは、仔ブタにサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９を補給した場合には、対照仔ブタに比べて、その結腸内のフィブロバクター門（Fibrobacteres）の存在量が多いこと、およびこれらの仔ブタの結腸ではフィブロバクター門（Fibrobacteres）の存在が高頻度に検出されたことを意味する。
放線菌門（Actinobacteria）およびコリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）の相対存在量も、サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が給餌された仔ブタからの糞便において、１０日目および５０日目に増加していることが認められた（図３）。コリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）は、放線菌門（Actinobacteria）の中で、８０％超を占める最も優勢な科であった。コリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）の中では、２つの属、オルセネラ属（Olsenella）およびコリンセラ属（Collinsella）が、サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が給餌された仔ブタにおいてＤ１０およびＤ５０に増加した。
[実施例２]
妊娠および授乳中にサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が補給された雌ブタ
材料および方法
実験計画
糞便試料は、雌ブタ（分娩の４週間前から離乳まで）および関連する離乳後の仔ブタに対して行った試験中に収集した。雌ブタに、１０９ＣＦＵ／ｋｇのサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が補給された食餌または補給されていない（それぞれ、ＣｔｌまたはＬＳＢ食餌）を給餌した。仔ブタは２１日齢で離乳させ、２相の給餌プログラムに従った。その後、対照またはサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９で処置した雌ブタから生まれた仔ブタを、３つの群：基礎食餌（Ｃｔｌ）、２５００ｐｐｍのＺｎＯ、４２０ｐｐｍの抗生物質が補給された基礎食餌（抗生物質群；ＡＢ）、２×１０９ＣＦＵ／ｋｇのサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が補給された基礎食餌（ＳＢ）に割り当てた。糞便試料は、初産および出産歴２回の雌ブタについて、処置毎に１３匹および２２匹の雌ブタからそれぞれ収集した。同じ雌ブタから、分娩舎に移動してから２日後および分娩の翌日に試料採取した。糞便試料は、処置群毎に１０匹の仔ブタ、したがって合計６０匹の仔ブタから採取した。仔ブタから試料採取は、離乳日、離乳後６日目および離乳後２０日目に行った。
微生物のＤＮＡ抽出および１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシング
収集した糞便試料を以下のようにして処理した：微生物ＤＮＡの抽出は、４０～６０ｍｇの糞便からＺＲ－９６ Ｓｏｉｌ Ｍｉｃｒｏｂｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ（商標）（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）を使用して製造元の指示に従って行った。Ｒｅｔｓｃｈ ＭＭ４００ Ｍｉｘｅｒ Ｍｉｌｌを使用して、３０Ｈｚで１５分のビードビートステップを適用した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４およびＶ５超可変領域を、以下のプライマーを使用して増幅させた：
Ｖ４－Ｖ５領域
Ｖ４Ｖ５－５１５Ｆ ５’－ＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＴＧＹＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡ－３’
Ｖ４Ｖ５－９２８Ｒ ５’－ＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＣＣＣＧＹＣＡＡＴＴＣＭＴＴＴＲＡＧＴ－３’
ＭｉＳｅｑシーケンサーでＲｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３を使用して、製造元の指示（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従って、ハイスループットシーケンシングを実行した。
バイオインフォマティクス分析
バイオインフォマティクス分析は、ＧｅｎｏＴｏｕｌバイオインフォマティクス施設（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）を使用して実行した。作成されたペアエンド２５０ｂｐ配列を、Ｆｌａｓｈソフトウェアを使用してアセンブルした（最小オーバーラップ１０ｂｐ、最大ミスマッチ１０％）。アセンブルした配列を、ＦＲＯＧＳパイプラインを使用して処理した（Escudie et al., 2018）。簡潔には、ＳＷＡＲＭアルゴリズムを使用してＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）で配列をクラスター化した（Mahe et al., 2014）。次に、キメラ配列を、ＵＣＨＩＭＥアルゴリズムを使用して試料毎に検出し、全ての試料から取り除いた（Edgar et al., 2011）。各シーケンシングデータセットに希薄化ステップを適用して、シーケンシング深度の差異によるバイアスを回避した。フィルタリングステップを適用して、全てのシングルトン（すなわち、１回のみの読み取りで表されるＯＴＵ）を取り除いた。作成されたＯＴＵカウントテーブルを、累計スケーリングによって正規化した。ＯＴＵの分類学的アノテーションを、ＳＩＬＶＡ ＳＳＵデータベースならびにＢＬＡＳＴ＋およびＲＤＰアルゴリズムを使用して実行した。同一性アライメントおよびカバレッジアライメントが９９％を超えるＢＬＡＳＴヒットを、アノテーションのために保存した。それ以外の場合は、種は不明としてアノテートし、ＲＤＰ分類子の結果をより上位のランクに使用した。属ランクおよびそれより上位のランクにおけるアノテーションのために、ブートストラップ閾値をそれぞれ０．９および０．８に設定した。門、科および属の相対存在量の表を作成した。
統計分析
畜産学的能力。平均１日増体量（ＡＤＧ）、飼料摂取量（ＦＩ）および飼料変換比（ＦＣＲ）を、繰り返し測定のためにＳＡＳ（Ｔｈｅ ＳＡＳ Ｓｔａｔ． ｖ．９．３）のＭＩＸＥＤ手順によって実行した。統計モデルは、相互作用も考慮して、雌ブタの処置、仔ブタの性別および時間の主効果を明らかにした。有意水準はＡ、ＢについてはＰ≦０．０１に、ａ、ｂについてはＰ≦０．０５に固定し、０．０５＜Ｐ≦０．１をトレンドと考えた。
微生物叢の統計分析。微生物叢の統計分析は、ＲソフトウェアおよびＲＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行った。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ順位和検定とそれに続く、平均順位和の多重比較のためのペアワイズ検定（Ｃｏｎｏｖｅｒ検定、ＰＭＣＭＲ Ｒパッケージ）を使用して、組成データを分析した。差異分析は、全配列の０．００５％超が相当する分類群についてのみ実行した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇの手順を使用して、生成されたＰ値を調整した。コンティンジェンシーデータを、Ｆｉｓｃｈｅｒの正確確率検定を使用して分析した。
結果
畜産学的能力。雌ブタにサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９を補給すると、離乳時における仔ブタの体重が有意に増加した（表１）。さらに、雌ブタへの補給の、成長能力に対する効果を、３５日齢までの離乳後能力について示す（表２）。
これらの結果は、雌ブタにサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９を給餌した場合、それらの子ブタの成長は、その母親にサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が給餌されなかった仔ブタにおいて得られる成長よりもめざましかった。
Figure 2022535992000003
Figure 2022535992000004
微生物叢の分析。雌ブタにおいて、本発明者らは、サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９補給の、微生物叢のアルファ多様性に対する効果を立証した。サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９群内で、試料のより高い均一性が観察された。
雌ブタにおけるサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９補給は、分娩前のフィブロバクター門（Fibrobacteres）の有意に高い相対存在量と関連していた（図４）。
加えて、本発明者らは、その母親にサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９補給物が給餌された仔ブタにおいて、フィブロバクター・インテスティナリス（Fibrobacter intestinalis）の出現頻度がより高いことを観察した（図５）。際だったことに、これらの母親効果は、離乳後の食餌が何であっても、離乳後２０日まで持続していた。さらにまた、仔ブタにおける投薬がフィブロバクター・インテスティナリス（Fibrobacter intestinalis）の出現頻度を低減したのに対し；興味深いことに、雌ブタにおけるサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９補給は、仔ブタにおける投薬の効果を遅延させた（図５）。このような結果は、雌ブタにサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が給餌された場合における、おそらくそれらの仔ブタの早期コロニー形成に影響を与えることによる、母体刷り込み効果を示唆している。
図６に示されるように、分娩前の雌ブタにおけるフィブロバクター門（Fibrobacteres）の相対存在量と仔ブタの能力（平均離乳時体重）との間に正の相関も見られた。
これらの結果を全て、総合すると、サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９の補給は、フィブロバクター門（Fibrobacteres）の集団を、雌ブタの結腸内において増加させたが、サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）ＣＮＣＭ Ｉ－１０７９が給餌された雌ブタの仔ブタの結腸内においても増加させたことが示唆される。第１の実施例においては、フィブロバクター門（Fibrobacteres）に対する効果に加えて、本発明者らは、放線菌門（Actinobacteria）、特に、一次胆汁酸を代謝できると記載されている２つの属、コリンセラ属（Collinsella）およびオルセネラ属（Olsenella）に対する効果を観察した。示した２つの実施例において、仔ブタは同時により大きな成長を示した。
本発明をそれらの具体的な実施形態に関連して記載したが、特許請求の範囲の範囲は、実施例中に記載した好ましい実施形態によって限定されるべきではなく、全体としての明細書と一致する最も広範な解釈を与えられるべきであると理解するものとする。
発明のさらなる実施形態：
１．単胃動物の平均１日増体量を増大させるのに有効な量のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物と好適な担体とを含む、組成物。
２．単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させるのに有効な量のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物と好適な担体とを含む、組成物。
３．（ａ）微生物の集団が繊維消化、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換もしくは両方に関与する、場合によっては、繊維消化に関与する微生物がフィブロバクター門（Fibrobacteres）、放線菌門（Actinobacteria）もしくは両方の微生物である、好ましくは、繊維消化に関与する微生物がフィブロバクター門（Fibrobacteres）の属、ビフィドバクテリウム科（Bifidobacteriaceae）もしくは両方の微生物である、より好ましくは繊維消化に関与する微生物がフィブロバクター・インテスティナリス（Fibrobacter intestinalis）株である；または
（ｂ）一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換に関与する微生物が放線菌門（Actinobacteria）の微生物である、場合によっては、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換に関与する微生物がコリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）の微生物である、
実施形態２の組成物。
４．微生物の集団が単胃動物の平均１日増体量を増大させることができる、実施形態２または３の組成物。
５．（ａ）サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株がプロバイオティクス株である；
（ｂ）サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株が、サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）株である；
（ｃ）サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株が、ＣＮＣＭにアクセッション番号Ｉ－１０７９で寄託されているサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）株である；
（ｄ）好適な担体が飼料である；
（ｅ）サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物が、組成物１キログラム当たり少なくとも１×１０９ＣＦＵの量である；
（ｆ）組成物が少なくとも１種の追加の微生物株をさらに含む；
（ｇ）組成物が、ゼラチンカプセル剤、プレス錠、ゲルキャップ剤、動物飼料または液体飲料の形態である；ならびに／あるいは
（ｈ）単胃動物が、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギもしくは家禽またはその子孫である、
実施形態１から４のいずれかの組成物。
６．実施形態１から５のいずれか１つに記載の組成物を含む、飼料または食品添加物。
７．単胃動物の平均１日増体量を増大させるための、実施形態１、４および５のいずれかに記載の組成物の使用。
８．組成物が給餌された単胃動物の平均１日増体量が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の平均１日増体量と比較した場合、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％増大される、実施形態７の使用。
９．単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させるための、実施形態２から５のいずれか１つに記載の組成物の使用。
１０．（ａ）組成物が給餌された単胃動物の腸内の微生物の集団が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の微生物の集団と比較した場合、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５もしくは３００％増大される、および／または
（ｂ）微生物の集団が、繊維消化、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換もしくは両方に関与する、
実施形態９の使用。
１１．単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させる方法であって、実施形態２から５のいずれか１つに記載の組成物の有効量を前記単胃動物に給餌するステップを含む、方法。
１２．（ａ）単胃動物の腸内の微生物の集団の成長が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の微生物の集団と比較した場合、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５もしくは３００％増大される；
（ｂ）方法が、前記組成物を前記動物の基礎食餌と混合するステップを含む；
（ｃ）前記組成物の有効量を前記単胃動物に給餌するステップが、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０日間の期間にわたって毎日行われる；
（ｄ）前記単胃動物に給餌される前記組成物が、少なくとも１種の抗生物質、酸化亜鉛もしくはそれらの混合物をさらに含み、場合により、前記抗生物質がアモキシシリン、ドキシサイクリン、リンコマイシン、コリスチン、チアムリン、もしくはそれらの任意の組み合わせである；
（ｅ）単胃動物が、妊娠中、授乳中、離乳中もしくは成長中である；および／または
（ｆ）前記組成物が給餌された単胃動物からの子孫の腸内の微生物の集団の成長が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物からの子孫の腸内の微生物の集団と比較した場合に増大される、場合によっては、前記組成物が給餌された単胃動物からの子孫の腸内の微生物の集団の成長が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物からの子孫における微生物の集団と比較した場合、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００％増大される、
実施形態１１の方法。
１３．単胃動物の平均１日増体量を増大させるための方法であって、実施形態１、４および５のいずれか１つに記載の組成物の有効量を単胃動物に給餌するステップを含む、方法。
１４．（ａ）前記組成物の有効量が給餌された単胃動物の平均１日増体量が、前記組成物の有効量が給餌されなかった単胃動物の平均１日増体量と比較して、少なくとも２１日以内に増加される；
（ｂ）前記組成物が給餌された単胃動物の平均１日増体量が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の平均１日増体量と比較した場合、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００％増大される；
（ｃ）単胃動物が、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、家禽もしくはその子孫である；場合によっては、前記ブタが、雌ブタ、成長中および肥育中のブタならびに仔ブタからなる群から選択される；ならびに／または
（ｄ）単胃動物が、妊娠中、授乳中、離乳中もしくは成長中である、
実施形態１３の方法。

Claims (40)

  1. 単胃動物の平均１日増体量を増大させるのに有効な量のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物と好適な担体とを含む、組成物。
  2. 単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させるのに有効な量のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物と好適な担体とを含む、組成物。
  3. 前記微生物の集団が、繊維消化、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換または両方に関与する、請求項２に記載の組成物。
  4. 繊維消化に関与する前記微生物が、フィブロバクター門（Fibrobacteres）、放線菌門（Actinobacteria）または両方の微生物である、請求項３に記載の組成物。
  5. 繊維消化に関与する前記微生物が、フィブロバクター門（Fibrobacteres）の属、ビフィドバクテリウム科（Bifidobacteriaceae）または両方の微生物である、請求項４に記載の組成物。
  6. 繊維消化に関与する前記微生物が、フィブロバクター・インテスティナリス（Fibrobacter intestinalis）株である、請求項５に記載の組成物。
  7. 一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換に関与する前記微生物が、放線菌門（Actinobacteria）の微生物である、請求項２に記載の組成物。
  8. 一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換に関与する前記微生物が、コリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）の微生物である、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記微生物の集団が、単胃動物の平均１日増体量の増大を可能にする、請求項２から８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株がプロバイオティクス株である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株が、サッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）株である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株が、ＣＮＣＭにアクセッション番号Ｉ－１０７９で寄託されているサッカロミセス・セレビシエ変種ブラウディ（Saccharomyces cerevisiae var. boulardii）株である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記好適な担体が飼料である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の前記少なくとも１種の生物学的に純粋な培養物が、前記組成物１キログラム当たり少なくとも１×１０９ＣＦＵの量である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 少なくとも１種の追加の微生物株をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. ゼラチンカプセル剤、プレス錠、ゲルキャップ剤、動物用飼料または液体飲料の形態である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記単胃動物がブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギもしくは家禽またはそれらの子孫である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物を含む、飼料または食品添加物。
  19. 単胃動物の平均１日増体量を増大させるための、請求項１および９から１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  20. 前記組成物が給餌された単胃動物の前記平均１日増体量が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の前記平均１日増体量と比較した場合、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％増大される、請求項１９に記載の使用。
  21. 単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において前記微生物の集団を維持するまたは成長させるための、請求項２から１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  22. 前記組成物が給餌された単胃動物の腸内の前記微生物の集団が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の前記微生物の集団と比較した場合、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５または３００％増大される、請求項２１に記載の使用。
  23. 前記微生物の集団が、繊維消化、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換または両方に関与する、請求項２１または２３に記載の使用。
  24. 単胃動物および／またはその同腹仔の腸内において微生物の集団を維持するまたは成長させる方法であって、請求項２から１７のいずれか一項に記載の組成物の有効量を前記単胃動物に給餌するステップを含む、方法。
  25. 単胃動物の腸内の前記微生物の集団の成長が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の前記微生物の集団と比較した場合、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５または３００％増大される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記組成物を前記動物の基礎食餌と混合するステップを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 前記組成物の有効量を前記単胃動物に給餌するステップが、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０日間の期間にわたって毎日行われる、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記単胃動物に給餌される前記組成物が、少なくとも１種の抗生物質、酸化亜鉛またはそれらの混合物をさらに含む、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記抗生物質が、アモキシシリン、ドキシサイクリン、リンコマイシン、コリスチン、チアムリン、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記単胃動物が、妊娠中、授乳中、離乳中または成長中である、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記組成物が給餌された単胃動物からの子孫の腸内の前記微生物の集団の成長が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物からの子孫の腸内の前記微生物の集団と比較した場合、増大される、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記組成物が給餌された単胃動物からの子孫の腸内の前記微生物の集団の成長が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物からの子孫の腸内の前記微生物の集団と比較した場合、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％増大される、請求項３１に記載の方法。
  33. 単胃動物の平均１日増体量を増大させるための方法であって、請求項１および９から１７のいずれか一項に記載の組成物の有効量を単胃動物に給餌するステップを含む、方法。
  34. 前記組成物の有効量が給餌された単胃動物の前記平均１日増体量が、前記組成物の有効量が給餌されなかった単胃動物の前記平均１日増体量と比較して、少なくとも２１日以内に増加される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記組成物が給餌された単胃動物の前記平均１日増体量が、前記組成物が給餌されなかった単胃動物の前記平均１日増体量と比較した場合、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％増大される、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記単胃動物がブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、家禽またはそれらの子孫である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ブタが、雌ブタ、成長中および肥育中のブタならびに仔ブタからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記単胃動物が、妊娠中、授乳中、離乳中または成長中である、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記組成物がエンテロコッカス属（Enterococcus）株を含まない、請求項１から１４および１６から３８のいずれか一項に記載の組成物、方法または使用。
  40. 前記組成物が細菌の株および／もしくは追加の酵母株を含まない、または追加の微生物株を含まない、請求項３９に記載の組成物、方法または使用。
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