JP2022535918A - 生理活性ペプチドおよびそれらを含む組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、皮膚コラーゲンの保護におけるそれらの有効性のために、しわ、小じわ、ならびに皮膚のハリおよび弾力性の喪失などの皮膚老化の徴候の予防または処置に有用な、生理活性ペプチドおよびそれらを含む薬用化粧品組成物に関する。【選択図】図１
Description
本発明は、概して、薬用化粧品（ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌ）分野に関する。より正確には、本発明は、生理活性ペプチドおよびそれらを含む薬用化粧品組成物、ならびにしわおよび小じわ、皮膚の弾力性およびハリの喪失などの皮膚老化の徴候を予防または処置するために、対象の皮膚にこの組成物を塗布するステップを含む化粧方法に関する。本発明はまた、皮膚コラーゲンのターンオーバーにおける欠陥が関連する病態の処置、および美容外科手術後の処置に使用するための、生理活性ペプチドを含む医薬組成物に関する。
合成ペプチドは、医薬技術および薬用化粧品技術の分野でますます関心が高まっている有効成分のクラスとして知られており、「薬用化粧品」は、薬学に特有の方法および基準を使用して製剤を処理および製造する、近年開発された化粧品の一分野を意味する。
この分野で最も一般的な製品の中には、加齢と共に減速を受け、よって、皮層におけるコラーゲン欠如、結果として皮膚のハリおよび弾力性の喪失をもたらす、皮膚コラーゲンのターンオーバー機構に作用する生理活性ペプチドに基づく抗老化製剤がある。加齢の徴候（弾力性の喪失、しわ、表情線の強調等）は強調もされる。加齢に関連する生理学的原因に加えて、皮膚コラーゲンの欠如はまた、病理学的原因のために起こり得る。これらの生理活性ペプチドは、コラーゲンの生合成を刺激することと、その分解を阻害することとの両方によって作用することができ、よって、生理学的原因と病理学的原因の両方による皮膚コラーゲンの欠如を埋め合わせることができる。
この状況は、適切な阻害剤でコラーゲンの皮内分解を遮断または減速することができる活性化合物によって修正することができる：このようにして、線維芽細胞によって行われる繊細な生合成プロセスに介入することなく、天然コラーゲンの皮膚濃度が増加する。したがって、その生合成の刺激ではなくコラーゲン分解の阻害が、この種の製剤中の有効成分の好ましい作用経路である。
コラーゲン分解は、２つの酵素ファミリー、すなわちマトリックスメタルプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびセリンプロテアーゼによって調節されることが知られているが、今日まで、皮膚コラーゲンの分解を制御することによって皮膚老化の徴候を予防または処置するために、ほぼ排他的に、ＭＭＰファミリーが薬用化粧品としての関心を有する酵素阻害剤の標的とみなされてきた。
セリンプロテアーゼに関しては、本発明者らは、セルピンＡ１と呼ばれるセリンプロテアーゼ阻害剤およびそのＣ末端領域の断片を使用して、コラーゲンターンオーバーの薬理学的調節についての研究を行った。Ｃｉｐｒｉａｎｉ Ｃ．らによる論文、Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２０１８）４２：１３４０～１３４８において、本発明者らは、ＳＡ１－ＩＩＩと呼ばれるセルピンＡ１分子のＣ末端ペプチド断片４０９～４１８のコラーゲン調節に対する活性を、コラーゲン産生を増加させることができると既に他の著者によって記載されている（例えば、Ｄａｂｂａｇｈら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００１）１８６：７３～８１参照）、同じセルピンＡ１の活性と比較して具体的に評価した。
上記論文において、本発明者らは、コラーゲンの分解の減少を生じる前記断片ＳＡ１－ＩＩＩによる処理による、様々な年齢の対象から得られた線維芽細胞における細胞外コラーゲンのレベル増加を報告した。
集団の老化の増加および快適で健康的な審美的側面に対する人々の増え続ける注目は、活性ペプチドに基づくさらなるより活性な薬用化粧品製品の必要性を大いに感じさせる。これらのペプチドは、皮膚老化の徴候に対してセリンプロテアーゼの阻害剤として有効に作用し、細胞増殖効果を引き起こすことなく皮膚コラーゲンの有効な保護作用を発揮することが必要である。
ここで、本出願人らは、薬用化粧品組成物の調製、皮膚の皮膚老化の徴候の予防および処置、ならびに美容外科手術後の処置のための医薬組成物の調製に有用な、セリンプロテアーゼの驚くほど高い阻害活性を有する新規なペプチドを合成した。
本発明者らによって以前特定されたセルピンＡ１およびその断片よりも驚くほど高い皮膚コラーゲンの分解に対する阻害活性を有することに加えて、本生理活性ペプチドは、望ましくない細胞増殖の効果を示さなかった。さらに、これらは、工業レベルで大規模にも容易に合成することができる短鎖ペプチドである。
さらに、本発明の新規な生理活性ペプチドは、若齢対象および高齢対象に由来する線維芽細胞に対しても、本発明者らによって行われ、以下に記載されるインビトロ試験において、コラーゲンに対する高い保護有効性を示した。これは、皮膚コラーゲン分解速度が、対象がそれを合成する能力を超える、生理学的皮膚老化状態と若年対象の病態による皮膚老化徴候の両方にも有用であることを証明している。
したがって、本発明の主題は、その本質的な特徴が添付の特許請求の範囲の第一項に定義されている、式（Ｉ）の新規な生理活性ペプチドである。本発明のさらなる主題は、その本質的な特徴が本明細書に添付の請求項６、７、１１および１０によってそれぞれ定義されている、ペプチドの調製方法、前記ペプチドの少なくとも１つを含む薬用化粧品または医薬組成物、および皮膚に組成物を塗布するステップを含む化粧方法である。
ペプチド、それらの調製方法、それらを含む組成物、および本発明による化粧方法のさらに重要な特徴は、従属請求項の主題であり、以下の詳細な説明に例示される。
本発明において、「化粧品組成物」および「薬用化粧品組成物」という用語は、医薬製剤に典型的な方法を使用することによって製剤化および製造された組成物を意味するために区別なく使用される。
本発明の生理活性ペプチド誘導体は、以下の一般式（Ｉ）：
Ｘ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－Ｙ（Ｉ）
（式中、
Ｘは、アスパラギンのＮ末端に連結したアシル基－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎＣＨ３であり、ｎは０～２０の間の範囲の整数であり、かつ
Ｙは、リジンのＣ末端の－ＯＨ基を表すか、またはリジンのＣ末端に連結したアミン基－ＮＲ１Ｒ２であり、Ｒ１およびＲ２は、互いに等しいかまたは異なり、Ｈとアルキル基－（ＣＨ２）ｍＣＨ３との間から選択され、ｍは０～２の間の範囲の整数である）
を有する、Ｄ系列のみのアミノ酸からなるテトラペプチドである。
Ｘ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－Ｙ（Ｉ）
（式中、
Ｘは、アスパラギンのＮ末端に連結したアシル基－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎＣＨ３であり、ｎは０～２０の間の範囲の整数であり、かつ
Ｙは、リジンのＣ末端の－ＯＨ基を表すか、またはリジンのＣ末端に連結したアミン基－ＮＲ１Ｒ２であり、Ｒ１およびＲ２は、互いに等しいかまたは異なり、Ｈとアルキル基－（ＣＨ２）ｍＣＨ３との間から選択され、ｍは０～２の間の範囲の整数である）
を有する、Ｄ系列のみのアミノ酸からなるテトラペプチドである。
したがって、これらは、一般式（Ｉ）で上に示されるＤアミノ酸の配列を有し、アミノ酸アスパラギンのＮ末端でアシル化され、場合によりリジンのＣ末端でアミド化されたテトラペプチドである。
本発明の好ましい実施形態によると、Ｙが－ＮＲ１Ｒ２である場合、Ｒ１およびＲ２は共にＨである。
本発明の特定の実施形態では、本ペプチドは、ｎが０および１４から選択される整数であり、したがって、Ｘがそれぞれアセチル（以下、記号「Ａｃ」でも示される）またはパルミトイルである前記式（Ｉ）を有する。
本発明によると、以下のテトラペプチド誘導体が好ましい：
Ｈ３Ｃ－ＣＯ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－ＮＨ２（配列番号１）、および
Ｈ３Ｃ－（ＣＨ２）１４－ＣＯ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－ＮＨ２（配列番号２）。
Ｈ３Ｃ－ＣＯ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－ＮＨ２（配列番号１）、および
Ｈ３Ｃ－（ＣＨ２）１４－ＣＯ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－ＮＨ２（配列番号２）。
本発明のペプチド誘導体主題は、合成によって調製することができる。例えば、これらは、ペプチドの単一アミノ酸を、式（Ｉ）におけるそれらの位置の同じ順序で、固体支持体上、例えば適切に官能化された樹脂上に固定化された第１のアミノ酸に添加し、付着させる、固相上でのペプチド合成によって調製することができる。次いで、これらは、樹脂から脱離する前にＮ末端で適切にアシル化される。本発明のペプチドは、以下の実験部に詳細に記載されているような戦略９－フルオレニル－メトキシカルボニル／ｔｅｒｔ－ブチル（Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ）を使用することによって有利に調製することができる。
本発明者らは、本発明のペプチド、特にＡｃ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－ＮＨ２（配列番号１）が、皮膚コラーゲンの分解に対する驚くべき保護活性を有することを見出した。さらに、これらはインビボでより高い安定性を有し、よって、コラーゲンに対するそれらの保護効果を長期間保証することができる。したがって、これらは化粧品または薬用化粧品組成物における有効成分として特に有用である。したがって、本発明の主題はまた、少なくとも上に定義される式（Ｉ）のペプチドを、１種または複数の化粧品として許容される賦形剤、アジュバントまたは担体と共に含む組成物である。組成物中に存在する式（Ｉ）のペプチドの量は、例えば、組成物の総重量に対して０．０１～１重量％の間に含まれ得、これは、１種または複数のさらなる化粧品有効成分を伴い得る。化粧品として許容される賦形剤、アジュバントまたは担体の例は、香料、着色剤、湿潤／保湿剤、保存剤、機能性および／または強調表示成分、溶媒、およびこれらの混合物の中から選択され得る。本発明の一態様では、本組成物は、局所投与のために、例えばセラム（ｓｅｒｕｍ）、ゲル、ローション、軟膏、クリームまたはムースの形態で製剤化される。
当業者であれば、本発明のペプチド組成物を製剤化して所望の最終形態を得るために最も適した賦形剤、アジュバントおよび／または担体を容易にかつ努力なしに選択することができるだろう。均一で安定な組成物の調製の最適な条件も確立することができるだろう。このようにして調製された本発明の組成物は、ジャー容器に詰めることができるか、または典型的には化粧用ローションおよびゲルに使用されるポンプディスペンサによって分配することができる。
さらに、本発明の主題は、しわ、小じわ、皮膚のハリおよび弾力性の喪失などの皮膚の皮膚老化を予防および処置するための化粧方法であって、それを必要とする対象の皮膚に本化粧品組成物を塗布するステップを含む方法である。
本発明のペプチドは、皮膚コラーゲンに対するそれらの特性のために、例えば、スレッドリフト（ｔｈｒｅａｄ ｌｉｆｔｉｎｇ）処置などの後のコラーゲン産生の刺激または皮膚コラーゲンの分解に対する保護が要求される美容外科手術後の処置に有用な医薬組成物における有効成分としての用途もさらに見出すことができる。したがって、本発明の主題はまた、少なくとも上に定義される式（Ｉ）のペプチドを、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤、アジュバントまたは担体と共に含むこのような医薬組成物；および美容外科手術後の処置におけるコラーゲンの産生の刺激またはコラーゲン分解に対する保護に使用するための同組成物である。
本発明の化粧品組成物および医薬組成物は、少なくとも式（Ｉ）の活性ペプチドに加えて、それぞれ化粧品および／または医薬／皮膚科学的活性を有する１種または複数のさらなる成分も含むことができる。
実験部で以下に示されるように、本発明のペプチドは、本発明者らによって以前特定されたセルピンＡ１およびその断片に対しても驚くほど高い皮膚コラーゲンの分解阻害活性を備える。さらに、これらは、望ましくない細胞増殖の効果がなく、皮膚コラーゲンに対する保護作用のみを有することが証明されている。この作用は、高齢対象に由来する細胞と若齢対象に由来する細胞の両方に有効であることが証明され、よって、生理学的皮膚老化状態に対する本ペプチドの有用性を示すが、病理学的状態のために、新たなコラーゲンを合成する対象の能力に関する皮膚コラーゲンの過剰な分解速度の場合にも有望な優れた保護結果を示す。
本発明のペプチドはさらにテトラペプチドであり、したがって、これらは短鎖ペプチドであり、工業的に大規模でも、合成がより容易である。
以下の実験部は、本発明の例示的で非限定的な例として提供される。
実験部
ペプチドＡｃ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－ＮＨ２（配列番号１）の合成
以下およびコードＡＡＴ１１ＲＩで図１にも示される本発明による標記のペプチドを、樹脂Ｒｉｎｋ－Ａｍｉｄｅ ＡＭおよび９－フルオレニル－メトキシカルボニル／ｔｅｒｔ－ブチル戦略（Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ）を使用して、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって手動で調製した。最終アミノ酸を樹脂に付着させた後、ペプチドを無水酢酸を用いてＮ末端でアセチル化し、次いで、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＳ：ＥＤＴ（９４：２．５：１：２．５）の混合物を用いて固体支持体から脱離した。
ペプチドＡｃ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－ＮＨ２（配列番号１）の合成
以下およびコードＡＡＴ１１ＲＩで図１にも示される本発明による標記のペプチドを、樹脂Ｒｉｎｋ－Ａｍｉｄｅ ＡＭおよび９－フルオレニル－メトキシカルボニル／ｔｅｒｔ－ブチル戦略（Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ）を使用して、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって手動で調製した。最終アミノ酸を樹脂に付着させた後、ペプチドを無水酢酸を用いてＮ末端でアセチル化し、次いで、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＳ：ＥＤＴ（９４：２．５：１：２．５）の混合物を用いて固体支持体から脱離した。
このようにして得られた原ペプチドを、半分取ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって精製して９８％のクロマトグラフィー純度を得て、次いで、凍結乾燥した。最後に、このようにして得られた精製された標記のペプチドを、分析ＨＰＬＣクロマトグラフィーおよびエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって特性評価した。
細胞培養
新生児ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、Ｌｏｎｚａから入手した。成人皮膚線維芽細胞の培養物は、ＰａｎｉらＪ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓ．（２００９）１８：８２９－４１に記載されているように、異なる年齢の健康なドナー、Ｃ６（３６歳男性）、Ｃ３（５７歳女性）およびＣ１２（８４歳女性）の皮膚生検から調製した。１９８３年に概説されているように、Ｃａｒｅｇｇｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（フィレンツェ、イタリア）の倫理委員会および１９７５年のヘルシンキ宣言によって示されたガイドラインに従って、これらの皮膚細胞を使用するための書面によるインフォームドコンセントを、関与する全てのドナー対象から入手した。全ての細胞培養物を、実験開始時に６から９までの同様の数のステップに供し、５％のＣＯ２を含有する加湿インキュベーター中、３７℃で、ＦＢＳ １０％（Ｇｉｂｃｏ）、１００単位／ｍｌのペニシリンＧ、０．０５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよびグルタミン２ｍＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を添加した改変ダルベッコイーグル培養培地（ＤＭＥＭ、Ｌｏｎｚａ）中で保存した。
新生児ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、Ｌｏｎｚａから入手した。成人皮膚線維芽細胞の培養物は、ＰａｎｉらＪ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓ．（２００９）１８：８２９－４１に記載されているように、異なる年齢の健康なドナー、Ｃ６（３６歳男性）、Ｃ３（５７歳女性）およびＣ１２（８４歳女性）の皮膚生検から調製した。１９８３年に概説されているように、Ｃａｒｅｇｇｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（フィレンツェ、イタリア）の倫理委員会および１９７５年のヘルシンキ宣言によって示されたガイドラインに従って、これらの皮膚細胞を使用するための書面によるインフォームドコンセントを、関与する全てのドナー対象から入手した。全ての細胞培養物を、実験開始時に６から９までの同様の数のステップに供し、５％のＣＯ２を含有する加湿インキュベーター中、３７℃で、ＦＢＳ １０％（Ｇｉｂｃｏ）、１００単位／ｍｌのペニシリンＧ、０．０５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよびグルタミン２ｍＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を添加した改変ダルベッコイーグル培養培地（ＤＭＥＭ、Ｌｏｎｚａ）中で保存した。
細胞を１２ウェルプレート（３００００細胞／ウェル）に播種し、翌日ペプチドＡＡＴ１１ＲＩ（２０ｍＭ）で処理した。並行して、同じ細胞を、ＴＧＦ－β１（１０ｎｇ／ｍＬ）、および陽性対照としての、Ｃｉｐｒｉａｎｉ Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２０１８）４２：１３４０～１３４８に以前記載されたペプチドであるペプチドＳＡ１ＩＩＩ（配列番号３）で処理した。さらに、同じ細胞を、本発明の一部ではない比較ペプチド、ペプチド１（Ａｃ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－ＮＨ２－配列番号４）およびペプチド２（Ａｃ－ＤＬｙｓ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＡｓｎ－ＮＨ２－配列番号５）でも処理した。
電気泳動移動における干渉を回避するために、全ての処理をＦＢＳの非存在下で行った。７２時間のインキュベーション後、培養培地を回収し、２５０×ｇで５分間遠心分離した；上清を等分し、コラーゲンの分析およびザイモグラフィーのために－２０℃で保存した。細胞タンパク質を、セルスクレーパーの助けを借りて、１％のプロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤の混合物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液で抽出した。次いで、細胞溶解物を超音波処理し、遠心分離によって精製し、上清を回収し、－２０℃で保存した。溶解物中のタンパク質含有量を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＣタンパク質アッセイキットを使用して測定した。
細胞生存率の試験
細胞生存率アッセイを、試験製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示に従って、上記処理の７２時間後に、９６ウェルマイクロプレート（８，０００細胞／ウェル）でのＭＴＳ細胞増殖試験を用いて行った。全ての細胞培養物は、処理後にそれらの初期生存率を維持していた。
細胞生存率アッセイを、試験製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示に従って、上記処理の７２時間後に、９６ウェルマイクロプレート（８，０００細胞／ウェル）でのＭＴＳ細胞増殖試験を用いて行った。全ての細胞培養物は、処理後にそれらの初期生存率を維持していた。
分析ウエスタンブロット（Ａｎａｌｉｓｉ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）
各細胞試料について上記のようにして得られた３０～４０μｇのタンパク質溶解物を、標準的な変性および還元条件下で、４～１２％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ ＢＯＬＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたポリアクリルアミドゲル上での電気泳動分離に供し、次いで、これらをポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。コラーゲンＩおよびＧＡＰＤＨタンパク質（後者はロードコントロールとして使用）を、一次ポリクローナルウサギ抗体：抗コラーゲンＩ型、ａｂ３４７１０、Ａｂｃａｍ；抗ＧＡＰＤＨ、１４Ｃ１０（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびペルオキシダーゼにコンジュゲートした適切な二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いた免疫組織化学法によって決定した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）基質を用いた増強化学発光手順を使用することによってタンパク質バンドを可視化し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ－Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いたデンシトメトリー分析によって免疫反応性バンドを定量化した。各密度測定値を、対応するＧＡＰＤＨレベルを内部対照として使用することによって正規化した。
各細胞試料について上記のようにして得られた３０～４０μｇのタンパク質溶解物を、標準的な変性および還元条件下で、４～１２％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ ＢＯＬＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたポリアクリルアミドゲル上での電気泳動分離に供し、次いで、これらをポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。コラーゲンＩおよびＧＡＰＤＨタンパク質（後者はロードコントロールとして使用）を、一次ポリクローナルウサギ抗体：抗コラーゲンＩ型、ａｂ３４７１０、Ａｂｃａｍ；抗ＧＡＰＤＨ、１４Ｃ１０（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびペルオキシダーゼにコンジュゲートした適切な二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いた免疫組織化学法によって決定した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）基質を用いた増強化学発光手順を使用することによってタンパク質バンドを可視化し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ－Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いたデンシトメトリー分析によって免疫反応性バンドを定量化した。各密度測定値を、対応するＧＡＰＤＨレベルを内部対照として使用することによって正規化した。
培養培地中のＩ型可溶性コラーゲンを測定するために、５００μｌの各試料を、３～３０Ｋのカットオフを有する遠心濾過器（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で１０回濃縮した。次いで、およそ２０μｌの各試料をウエスタンブロット分析に使用した。各密度測定値を、対応するウェル中の細胞のタンパク質含有量によって正規化した。参照対照として、いくつかの実験では、Ｉ型ヒトコラーゲン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を調査中の実験試料と共に使用した。使用したマーカーは、Ｍａｇｉｃ Ｍａｒｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、化学発光で目に見える）およびＰａｇｅ Ｒｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、光で可視）であった。
図１は、上記の手順に従って、上記の様々な処理および未処理線維芽細胞の試料である対照を用いて細胞培養物で検出されたＩ型プロコラーゲン濃度の平均を示すヒストグラムである。
これらのデータから、本発明のテトラペプチドＡＡＴ１１ＲＩが、コラーゲン調節の活性について既に知られている陽性対照として使用した生成物とも比較して、試験した全ての他の生成物よりも驚くほど高い、インビトロでプロコラーゲンの濃度を増加させる能力を有することを観察することができる。さらに、本発明のペプチドの能力は、比較的低濃度で明らかになっており、よって、ペプチドの高い有効性を反映している。
さらに、本発明者らは、新生児線維芽細胞の細胞培養物ならびに成人対象と高齢対象の両方から得られた細胞の培養物について本発明のペプチドの同じ正の効果を検出した。したがって、試験されたペプチドは、対象の年齢による生理学的状態と、コラーゲンを産生する細胞の能力が低下しているために二次的な効果として皮膚老化を有する疾患によって引き起こされる病理学的状態の両方である、皮膚老化の異なる状態の処置における有用性を示している。
測定され、図１のグラフで報告される全ての値は、平均±標準誤差として表される。統計分析は、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用することによって行った。スチューデントｔ検定を対データの分析に使用した。ｐ≦０．０５を統計学的有意差とみなした。
本発明を、その好ましい実施形態を参照して上で説明した。以下に示される特許請求の範囲の保護の範囲によって定義される、同じ本発明のコアに属する他の実施形態が存在し得ることを理解すべきである。
配列表１～５ ＜２２３＞合成ペプチド
Claims (12)
- 式（Ｉ）
Ｘ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－Ｙ（Ｉ）
（式中、
Ｘは、アスパラギンＮ末端に連結したアシル基－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎＣＨ３であり、ｎは０～２０の間に含まれる整数であり、かつ
Ｙは、リジンＣ末端の－ＯＨであるか、またはリジンＣ末端に連結したアミノ基－ＮＲ１Ｒ２であり、Ｒ１およびＲ２は、互いに等しいかまたは異なり、Ｈとアルキル基－（ＣＨ２）ｍＣＨ３との間から選択され、ｍは０～２の間に含まれる整数である）
を有するペプチド誘導体。 - Ｙが－ＮＲ１Ｒ２である場合、Ｒ１およびＲ２が共にＨである一般式（Ｉ）を有する、請求項１に記載のペプチド。
- ｎが０である一般式（Ｉ）を有する、請求項１または２に記載のペプチド。
- ｎが１４である一般式（Ｉ）を有する、請求項１または２に記載のペプチド。
- Ｈ３Ｃ－ＣＯ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－ＮＨ２（配列番号１）およびＨ３Ｃ－（ＣＨ２）１４－ＣＯ－ＤＡｓｎ－ＤＶａｌ－ＤＶａｌ－ＤＬｙｓ－ＮＨ２（配列番号２）から選択される、請求項１に記載のペプチド。
- 請求項１から５に定義されるペプチド誘導体を調製する方法であって、第１のアミノ酸を固体支持体上に固定化するステップと、引き続いて、第２～第４のアミノ酸の各々を一般式（Ｉ）の同じ順序で添加するステップと、引き続いてＡｓｎ Ｎ末端でアシル化するステップと、場合により、引き続いてＬｙｓ Ｃ末端でアミド化するステップとを含む方法。
- 少なくとも請求項１から５に定義される一般式（Ｉ）のペプチド誘導体と、１種または複数の化粧品として許容される賦形剤、アジュバントまたは担体とを含む化粧品組成物。
- 前記化粧品として許容される賦形剤、アジュバントまたは担体が、香料、着色剤、湿潤／保湿剤、保存剤、機能性成分および／または強調表示成分、溶媒、およびこれらの混合物から選択される、請求項７に記載の化粧品組成物。
- 局所施用のための、セラム、ローション、クリーム、ゲル、軟膏またはムースの形態である、請求項７または８のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
- 皮膚に請求項７から９に定義される化粧品組成物を塗布するステップを含む、皮膚老化の徴候を予防および処置するための化粧方法。
- 少なくとも請求項１から５に定義される一般式（Ｉ）のペプチド誘導体と、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤、アジュバントまたは担体とを含む医薬組成物。
- 美容外科手術後の皮膚の局所処置に使用するための、請求項１１に定義される医薬組成物。
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