JP2022535386A - 炭素環ヌクレオシド類似体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新規の加水分解的に安定な炭素環５－アザ－２－デオキシシチジンおよび炭素環５－アザ－シチジン化合物ならびに低メチル化剤としてのそれらのプロドラッグに関する。JPEG2022535386000030.jpg65166

Description

本発明は、５－アザ－２’－デオキシシチジンおよび５－アザ－シチジンの新規の加水分解的に安定な炭素環ヌクレオシド類似体ならびに低メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ）剤としてのそれらの使用に関する。
５－アザ－２’－デオキシシチジン（デシタビン、ＡｚａｄＣ）および５－アザ－シチジン（ビダーザ、ＡｚａＣ）は、エピジェネティック情報を操作することによって代謝拮抗剤として作用するヌクレオシド類似体である［１－５］。ＤＮＡにおけるエピジェネティック情報は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）およびメチル化補助因子としてのＳアデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の助けによる、２’－デオキシシチジン（ｄＣ）から５メチル－２’－デオキシシチジン（ｍｄＣ）の形成に関与する［６－７、４］。プロモーター領域におけるｄＣからｍｄＣへのメチル化は、典型的に、遺伝子の転写サイレンシングと関連する［８－９］。ＡｚａｄＣは、細胞内で、対応する活性の三リン酸に転換され、その後に細胞分裂中にゲノム内に取り込まれるプロドラッグである。ＡｚａＣもプロドラッグであり、２’脱酸素化され、その後に、ＤＮＡ内への取り込みのために、対応する５’－三リン酸に転換される。ＡｚａＣはまた、事前に２’－脱酸素化をせずに５’－三リン酸に転換されて、ＲＮＡ内に取り込まれる。Ａｚａ（ｄ）Ｃの作用機構は、図１ａに示されるように、その求電子Ｃ６位の、ＤＮＭＴ活性部位チオール求核剤との反応を含む［１０－１１］。これにより、ＳＡＭ補助因子によってメチル化された共有結合中間体が産生される（極めて接近して維持（ｈｏｌｄ ｉｎ ｃｌｏｓｅ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ））。トリアジンヘテロ環の５位におけるＮ原子に起因して、最終的なβ除去反応（通常、ＤＮＭＴ酵素からｍ（ｄ）Ｃを放出する）は、もはや不可能である。結果として、共有結合のＤＮＡ－ＤＮＭＴまたはＲＮＡ－ＤＮＭＴ架橋が形成される。
Ａｚａ（ｄ）Ｃの投与の結果として、ｍｄＣレベルの大きな減少、すなわち低メチル化効果が観察され、それにより、がん細胞においてサイレンシングされた腫瘍抑制遺伝子の再活性化が生じ［１］、がん細胞を正常な増殖性の細胞に再分化させ、または、細胞死をもたらす。Ａｚａ（ｄ）Ｃは現在のところ、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）［２］および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）［４］の治療のための薬物として使用されている。臨床的に、それは数サイクルで投与され、各サイクルは１週間の治療および３週間の休止を含む。
Ａｚａ（ｄ）Ｃと関連する問題は、図１ｂに示される経路の後に、水溶液中で加水分解することである。この加水分解は、特に長い治療期間にわたり、Ａｚａ（ｄ）Ｃの活性を損なわせる。
本発明者らはこの問題を、脱メチル化する（したがって、Ｓ－求核剤と反応する）ことができ、一方で、加水分解（Ｏ－求核剤との反応）はブロックする、Ａｚａ（ｄ）Ｃの類似体を提供することによって解決した。驚くべきことに、本発明者らは、デオキシリボースの酸素をＣＨ２基で置換することが、ヘテロ環の反応性に対する大きな遠隔効果（ｒｅｍｏｔｅ ｅｆｆｅｃｔ）を有することを見いだした。これらの類似体、特に、Ａｚａ（ｄ）Ｃの炭素環バージョンは、図１ｃに示されるように、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるメチル化を阻害するが、加水分解的に安定である。
さらに、本発明は、以下の図面および実施例によって、より詳細に説明される。
５－アザ－２’－デオキシシチジン（デシタビン、ＡｚａｄＣ）を、その作用機構とともに示す。ａ）活性部位チオールは、ＡｚａｄＣのＣ６位と反応する。ｂ）ＡｚａｄＣのＣ６位と水分子の反応（Ｏ－反応性）を伴う（ｇｏｅｓ ｉｎ ｈａｎｄ ｗｉｔｈ）加水分解性の分解経路。これにより、最終的な塩基欠失および脱塩基部位の形成が生じる。ｃ）炭素環バージョンのｃＡｚａｄＣ １を四角で示す。 観察されたＣ６’－エンド立体構造（ａ）およびＣ２’－エンド立体構造（２Ｔ１）（ｂ）における分子を示す、炭素環５－アザ－２’－デオキシシチジン（ｃＡｚａｄＣ １）の結晶構造。 ＨＰＬＣに基づく安定性測定は、（ａ）異なるｐＨ値において５－アザ－２’－デオキシシチジン（ＡｚａｄＣ）溶液の激しい加水分解性の分解を示し、一方で、（ｂ）炭素環化合物ｃＡｚａｄＣ １は、全ての３つのｐＨ値において安定であった。（ａ）において挿入された表は、ＡｚａｄＣに関するｔ１＝１０分およびｔ２＝２０分の間のクロマトグラムを示す。ＡｚａｄＣシグナルを赤で示す。 ＵＨＰＬＣ－ＭＳ２によって得られた、炭素環５－アザ－２’－デオキシシチジンによって処置された（ｃＡｚａｄＣ １）マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）のＤＮＡ修飾の定量化データを示す。それぞれの条件に関して、３つの生物学的レプリケートを技術的トリプリケートで測定した。それぞれの技術的レプリケートについて、０．５μｇのＤＮＡを消化した。棒グラフは平均を表わし、エラーバーは標準偏差を表わす。ＬＬＯＱは定量化の下限を示す。 デシタビン１の中性溶液（左）対炭素環式（ｃａｒｂａｃｙｃｌｉｃ）化合物ｃＡｚａＣ２０（右）のＨＰＬＣ研究。化合物の１００ｍＭ溶液を純水中で維持し、ｔ＝０時間、１．５時間、３時間、４．５時間、６時間、２４時間、６日において試験した。
本発明の第１の態様は、式Ｉの化合物：

Figure 2022535386000002

ここで、Ｒ１は、Ｈ、遊離もしくは保護された修飾もしくは非修飾リン酸基、または、ヒドロキシル保護基であり、
Ｒ２は、Ｈ、遊離もしくは保護された修飾もしくは非修飾リン酸基、または、ヒドロキシル保護基であり、
Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ３、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３、ＯＨまたはＯＲ６であり、ここでＲ６は、ヒドロキシル保護基であり、および
Ｒ４およびＲ５は、Ｈであり、またはアミノ保護基を形成する、
またはその塩に関する。
式Ｉの化合物において、Ｒ１は、Ｈ、遊離もしくは保護された修飾もしくは非修飾リン酸基、例えば一リン酸、二リン酸または三リン酸基、または、ヒドロキシル保護基から選択されてよい。
用語「リン酸基」は、非修飾リン酸基、例えば、非修飾一リン酸、非修飾二リン酸もしくは非修飾三リン酸基、または、修飾リン酸基、例えば、修飾一リン酸、修飾二リン酸もしくは修飾三リン酸基を含み、ここで、１つまたは複数の酸素原子は、炭素、硫黄および／または窒素原子によって置換される。修飾リン酸基の例は、ホスホネート、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）またはホスホロチオエート基である。用語「リン酸基」はまた、遊離のリン酸基および保護されたリン酸基、例えば、モノエステルおよびジエステルを含むリン酸エステル、ならびに、モノアミデート、ジアミデートおよびアミデートエステルを含むアミデートも含む。保護されたリン酸およびホスホネート基の詳細な概説は、［２８］および［２９］に見られ、その内容は参照によって本明細書中に援用される。したがって、医薬用途において、Ｒ１は、細胞内での切断の際にリン酸、二リン酸または三リン酸基を遊離させる保護されたリン酸、二リン酸または三リン酸基であってよい（プロドラッグ構想）。
ヒドロキシル保護基は、当技術分野、特にヌクレオシド化学の分野で知られており、限定されないが、アセチルもしくはベンゾイルのようなアシル基、ベンジル基、トリチル、メトキシトリチルもしくはジメトキシトリチルのようなトリチル基、トリメチルシリル、ｔ－ブチル－ジメチルシリルもしくはトリ－ｉ－プロピルシリル（ｐｒｏｐｙｓｉｌｙｌ）のようなシリル基、または、メチル、エトキシエチルもしくはβ－メトキシエトキシメチルのようなアルキル－もしくは置換アルキル基を含む。
Ｒ２は、上述のように、Ｈ、非修飾もしくは修飾の遊離もしくは保護されたリン酸基、例えば、一リン酸、二リン酸もしくは三リン酸基、または、上述のヒドロキシル保護基から選択されてよい。したがって、医薬用途において、Ｒ２は、細胞内での切断の際にリン酸、二リン酸または三リン酸基を遊離させる保護されたリン酸、二リン酸または三リン酸基であってよい（プロドラッグ構想）。
特定の実施態様では、Ｒ３はＨであってよい。そのような場合、式Ｉ内の５員炭素環は、環の１’位における酸素原子がＣＨ２基によって置換されているデオキシリボースと考えることができる。さらなる実施態様では、Ｒ３はＯＨまたはＯＲ６であってよく、ここでＲ６は上述のヒドロキシル保護基である。これらの実施態様では、式Ｉにおける５員炭素環は、環の１’位における酸素原子がＣＨ２基によって置換されているリボースと考えられ得る。Ｒ３はまた、ＣＨ３、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３またはＦであってもよい。これらの実施態様では、式Ｉにおける５員炭素環は、環の１’位における酸素原子がＣＨ２基によって置換されているリボース類似体と考えられ得る。
Ｒ４およびＲ５はそれぞれＨであってよく、したがって一級アミノ基ＮＨ２を提供し、またはアミノ保護基を形成してよく、例えばここで、Ｈ原子の一方または両方は、保護基によって置換される。アミノ保護基は、当技術分野、特にヌクレオシド化学の分野において知られており、限定されないが、アセチルもしくはベンゾイルのようなアシル基、ベンジル基、カルボベンジルオキシ基、トシル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基またはｔ－ブチルオキシカルボニル基を含む。
特定の実施態様では、Ｒ１はＨである。
特定の実施態様では、Ｒ２は、Ｈ、または、非修飾もしくは修飾リン酸基、例えば一リン酸、二リン酸または三リン酸基であり、遊離または保護された一リン酸、二リン酸または三リン酸基を含む。
特定の実施態様では、Ｒ３はＨまたはＯＨである。
ある特定の実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれＨであり、または、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれＨであってＲ３はＯＨまたはＯＲ６である。特に特定の実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はＨである。この化合物はＡｚａｄＣ（デシタビン）の炭素環類似体であり、それは、（上記に示したように）メチルトランスフェラーゼ、特にＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対する阻害活性を維持しながら、驚くことに高い加水分解的安定性を有する。さらに特に特定の実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５はＨであってＲ３はＯＨである。この化合物は、ＡｚａＣ（ビダーザ）の炭素環類似体である。
さらに特定の実施態様では、本発明はまた、ＡｚａｄＣおよびＡｚａＣのプロドラッグに関し、特に、Ｒ１および／またはＲ２がＨとは異なる化合物に関する。
本発明はまた、式Ｉの化合物の塩、特に薬学的に許容できる塩も包含する。本発明の化合物は、アミノ基および／またはリン酸基またはそれと同様の基の存在によって酸性塩および／または塩基性塩を形成することが可能である。酸付加塩は、無機酸および有機酸と形成され得て、限定されないが、酢酸塩、安息香酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩（ｔｏｓｙｌａｔｅ）およびトリフルオロ酢酸塩を含む。塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基と形成され得て、限定されないが、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩または一級、二級および三級アミンに由来する塩を含む。
本発明の化合物は、エピジェネティック修飾５－メチル－２’－デオキシシチジン（ｍｄＣ）のレベルを減少させることによって代謝拮抗剤として作用する。それは、増殖性細胞のゲノムおよび／またはＲＮＡ内に取り込まれ得て、ＤＮＡ－および／またはＲＮＡ－メチルトランスフェラーゼを阻害し、ＤＮＡ中のｍｄＣおよびＲＮＡ中のｍＣの減少をもたらす。ＤＮＡ中のｍｄＣ（プロモーター内の転写サイレンサーである）の損失は、腫瘍抑制遺伝子を含む遺伝子の再活性化をもたらし、それにより、抗－過剰増殖性作用が誘発される。
したがって、さらなる発明のさらなる一態様は、医薬、例えば獣医薬またはヒト医薬における使用のための、上述の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容できる塩に関する。
特定の実施態様では、本発明の化合物は、悪性または非悪性の過剰増殖性障害を含む過剰増殖性障害の治療のために用いられる。用語「過剰増殖性障害」は、生物内の細胞、組織および／または臓器の機能障害性の増殖増大に起因する障害、それと関連する障害、および／またはそれを伴う障害に関する。
したがって、本発明はまた、過剰増殖性障害を治療する方法であって、それを必要とする対象、特にヒト対象に、治療的に効果的な用量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容できる塩を投与するステップを含む方法に関する。
特定の実施態様では、本発明の化合物は、がんの治療のために用いられる。特定の実施態様では、本発明の化合物は、白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療のために用いられ、それには、以前に治療された、または治療されていない、一次または二次ＭＤＳ、例えば、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、芽球増加を伴う不応性貧血、移行期（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）における芽球増加を伴う不応性貧血および慢性骨髄単球性白血病、ならびに、中等１、中等２および高リスクのＭＤＳが含まれる。
さらなる実施態様では、本発明の化合物は、デシタビンに関して報告された結果に基づき［２６］、腎不全の治療のために用いられ得る。特定の実施態様では、本発明の化合物は、デシタビンがアテローム性動脈硬化症の病変形成を防ぎ、マクロファージによる炎症性サイトカインの産生を減少させる［２７］という観察に基づき、アテローム性動脈硬化症の治療に用いられ得る。
式Ｉの化合物またはその薬学的に許容できる塩は、活性剤および薬理学的に許容できる担体を含んでいる薬学的組成物として、それを必要とする対象に投与され得る。組成物は、任意の適切な方法で、例えば経口、非経口、吸入および／または皮膚適用によって投与され得る。担体は、任意の適切な製剤担体であってよい。式Ｉの化合物は、治療される対象および障害に基づき熟練した専門家によって決定され得る治療的に効果的な用量で投与される。
医薬用途において、組成物は、固体剤形、例えば錠剤、カプセルなど、または、液体剤形、例えば溶液、エマルション、懸濁液などの形態であってよい。
式Ｉの化合物は、１回または数回の治療サイクルで投与されてよく、各治療サイクルは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７または１０日を含んでよい。
式Ｉの化合物は、単剤療法として、または、さらなる薬物、特に上述の過剰増殖性障害の治療に適切な薬物と組み合わせて投与されてよい。特定の実施態様では、式Ｉの化合物は、式Ｉとは異なる抗－がん剤と共に併用療法として投与され得る。
さらに、式Ｉの化合物はまた、非医療用途、例えば一般に、基礎研究、診断および／または薬物スクリーニングの分野においても有用である。したがって、特定の実施態様では、本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸のメチル化を阻害するための、特にＤＮＡのメチル化を阻害するための、より特にゲノムＤＮＡのメチル化を阻害するための、式Ｉの化合物のインビトロでの使用に関する。したがって、その化合物は、細胞、例えば真核生物細胞、例えば、哺乳類およびヒト細胞を含む動物細胞における、ゲノム分析、特にエピジェネティック分析に有用である。
式Ｉの化合物の調製に関する一般スキームを以下のスキームに示す。合成は、ＤＮＡ損傷類似体を合成するために以前に用いられた［１２－１５］、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）によって保護されたアミノシクロペンタン誘導体２によって開始する。化合物２を、最初にベンジル保護して３にして、Ｂｏｃ脱保護して４にして、それから、カルビマゾール（ｃａｒｂｉｍｉｄａｚｏｌｅ）５（イソメチル尿素（ｉｓｏｍｅｔｈｙｌｕｒｅａ）６から２ステップで、水酸化カリウムによる遊離塩基７の生成およびカルボニルジイミダゾールと７の反応の後に調製される）と反応させた。これにより、カルバモイル尿素－シクロペンタンヌクレオシド類似体８が提供される。続いて、トリアジン塩基９への環化をオルトギ酸トリエチルによって行なった。メタノール中でのＮＨ３との９の反応およびジクロロメタン中でのＢＣｌ３によるベンジル基の脱保護によって、最終化合物ｃＡｚａｄＣ １が遊離ヌクレオシドとして提供された。
Figure 2022535386000003
高温メタノールによる化合物ｃＡｚａｄＣ １の再結晶によって無色針状物が得られ、それにより、図２に示される結晶構造を解明することができた。ｃＡｚａｄＣ １が結晶において２つの異なるシクロペンタン立体構造で存在することが観察されたことは興味深い。これらの立体構造の１つは、ＤＮＡにおける２’－デオキシヌクレオシドに典型的であり、ｃＡｚａｄＣ １ヌクレオシドが、正しいＤＮＡ型の立体構造をとることができること、および、リン酸化されてゲノム内へ組み込まれる潜在性を有することを示す。
式Ｉの化合物の調製に関する別の一般スキームを以下に示し、アザシチジン（ビダーザ）ｃＡｚａＣの炭素環式（ｃａｒｂａｃｙｃｌｉｃ）バージョン（２０）の合成を示す：
Figure 2022535386000004
式Ｉの化合物のプロドラッグの調製に関する一般スキームを以下に示し、ｃＡｚａＣ（２０）の５’ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）プロドラッグ２４の合成を示す：
Figure 2022535386000005
実施例１－ｃＡｚａｄＣ（１）に関する合成手順
Ｔｅｒｔ．－ブチル－Ｎ－［（１Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－ヒドロキシ－４－（ヒドロキシメチル）シクロペンチル］－カルバメート（２）

Figure 2022535386000006
化合物２を、以前に記載されたように［１］、ｔｅｒｔ－ブチル－Ｎ－（（１Ｓ，２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－（（ｔｅｒｔ－ブチル－ジメチルシリルオキシ）メチル）－６－オキサ－ビシクロ－［３．１．０］－ヘキサ－２－イル）－カルバメートから合成した。
Ｔｅｒｔ．－ブチル－Ｎ－［（１Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－３－ベンジルオキシ－４－（ベンジルオキシメチル）－シクロペンチル］－カルバメート（３）

Figure 2022535386000007
Ｂｏｃによって保護された２（３．１０７ｇ、１３．４３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を、乾燥ＤＭＦ（７５ｍＬ）中に溶解させた。溶液を０℃まで冷却し、ＮａＨ（鉱油中、６０％分散、１．１８２ｇ、２９．５５ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ．）を３ポーションで添加した。０℃で１５分後、ベンジルブロミド（４．００ｍＬ、３３．５８ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ．）を滴下した。反応混合物を０℃で１．５時間攪拌し、室温でさらに２時間攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）を用いて反応混合物を希釈し、反応を飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）でクエンチングさせた。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３（１×４００ｍＬ、２×１００ｍＬ）で３回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空中で除去した。粗生成物を、段階的勾配ｉＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ（９：１→７：１→４：１）によってシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物３を無色固体（３．３９ｇ、８．２４ｍｍｏｌ、６１％）として得た。
Ｒｆ＝０．６７（ｉＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ＝２：１）
Ｍｐ＝７４－７６°Ｃ
ＨＲＭＳ［ＥＳＩ＋］：［Ｃ２５Ｈ３３ＮＯ４Ｎａ］＋、［Ｍ＋Ｎａ＋］＋ 計算値：４３４．２２９２、実測値：４３４．２２９９
１Ｈ－ＮＭＲ（５９９ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝７．３９－７．２６（ｍ，１０Ｈ，Ａｒ－Ｈ），４．７６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．５３－４．３７（ｍ，４Ｈ，Ｃ７－ＨおよびＣ８－Ｈ），４．１８－４．０８（ｍ，１Ｈ，Ｃ１－Ｈ），３．９６－３．８７（ｍ，１Ｈ，Ｃ３－Ｈ），３．５３－３．４１（ｍ，２Ｈ，Ｃ５－Ｈ），２．３６－２．２５（ｍ，２Ｈ，Ｃ６－Ｈａ，Ｃ４－Ｈ），２．１１－２．０５（ｍ，１Ｈ，Ｃ２－Ｈａ），１．７７－１．６８（ｍ，１Ｈ，Ｃ２－Ｈｂ），１．４３（ｓ，９Ｈ，Ｃ２’－Ｈ），１．２９－１．２０（ｍ，１Ｈ，Ｃ６－Ｈｂ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５１ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１５５．５（Ｃ１’），１３８．６０，１３８．２３，１２８．３６，１２８．２８，１２７．５９，１２７．５６，１２７．４２（Ｃ－Ａｒ），８１．０（Ｃ３），７９．２（Ｃ２’），７３．３（Ｃ８），７１．９（Ｃ５），７１．３（Ｃ７），５０．４（Ｃ１），４４．９（Ｃ４），３９．６（Ｃ２），３５．０（Ｃ６），２８．６（Ｃ２’）。
ＦＴＩＲ（ＡＴＲ）：ν／ｃｍ-１＝３３３９（ｗ），２９７３（ｗ），２９２９（ｗ），２８５８（ｗ），１６９２（ｍ），１４９６（ｍ），１４５３（ｍ），１３９０（ｗ），１３６４（ｍ），１２７４（ｍ），１２４７（ｍ），１１６６（ｓ），１０９１（ｓ），１０６７（ｓ），１０２７（ｍ），１０１２（ｍ）。
（１Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－１－アミノ－３－ベンジルオキシ－４－（ベンジルオキシメチル）シクロペンタン（４）

Figure 2022535386000008
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（２８ｍＬ）中の、Ｂｏｃによって保護されたアミン３（３．３５１ｇ、８．１４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）およびトリフルオロ酢酸（１２ｍＬ、３０％（ｖ／ｖ））の溶液を、室温で１時間攪拌した。溶媒を真空中で除去した後、残渣を飽和Ｎａ２ＣＯ３（１００ｍＬ）中に再懸濁させて、１０分間攪拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出して、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、遊離アミン４を粘性の褐色油状物として取得し、それを、Ｏ２に対する不安定さのため、さらなる精製をせずに用いた。
精製された４の分析データ：
ＨＲＭＳ［ＥＳＩ＋］：［Ｃ２３Ｈ２９Ｎ４Ｏ４Ｎａ］＋、［Ｍ＋Ｎａ＋］＋ 計算値：３１２．１９５８、実測値：３１２．１９５５
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝７．３８－７．２０（ｍ，１０Ｈ，Ｃ－Ａｒ），４．５７－４．３６（ｍ，４Ｈ，Ｃ７，Ｃ８），３．９５－３．８５（ｍ，１Ｈ，Ｃ１），３．６２－３．５０（ｍ，１Ｈ，Ｃ３），３．５０－３．３９（ｍ，２Ｈ，Ｃ５），２．４１－２．２８（ｍ，１Ｈ，Ｃ４），２．２８－２．１３（ｍ，１Ｈ，Ｃ６－Ｈａ），２．１３－１．９６（ｍ，３Ｈ，ＮＨ２，Ｃ２－Ｈａ），１．６５－１．５０（ｍ，１Ｈ，Ｃ２－Ｈｂ），１．１９－１，．０８（ｍ，１Ｈ，Ｃ６－Ｈａ）、
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１３８．８，１３８．４，１２８．５，１２８．５，１２７．７９，１２７．７５，１２７．７，１２７．６（Ｃ－Ａｒ），８１．８２（Ｃ３），７３．２３（Ｃ７），７２．５８（Ｃ５），７１．１０（Ｃ８），５１．４０（Ｃ１），４５．６３（Ｃ４），４２．０７（Ｃ２），３８．０８（Ｃ６）。
２－メチル－１－（１－イミダゾイルカルボニル）－イソ尿素（５）

Figure 2022535386000009
－１５℃のＥｔ２Ｏ：Ｈ２Ｏ（３９：１）中、Ｏ－メチルイソ尿素塩酸塩６（５．００ｇ、４５．６５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）の溶液に、ＫＯＨ粉末（５１．２２ｇ、９１２．９６ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ．）を一定の攪拌下で少しずつ（ｐｏｒｔｉｏｎ ｗｉｓｅ）添加した。３０分後、混合物を濾過し、残渣を氷冷Ｅｔ２Ｏ（３×５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機相を真空中で２０ｍＬに濃縮した。－２０℃に冷却して沈殿を生じさせた。Ｎ２流の下での真空濾過によって、Ｏメチルイソ尿素７を無色ワックスとして取得した（１．７５９ｇ、２３．７４ｍｍｏｌ、５２％）。乾燥ＴＨＦ（３５ｍＬ）中、７（１．２４ｇ、１６．７４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）およびカルボニルジイミダゾール（２．９０ｇ、１７．９１ｍｍｏｌ、１．０７ｅｑ．）の溶液を、室温で３時間攪拌した。１時間後、無色沈殿物が観察された。反応混合物を真空中で３ｍＬに濃縮し、濾過した。残渣を氷冷ＴＨＦ（２×３ｍＬ）で洗浄し、合わせた有機相を凍結乾燥して、無色固体５を得た（１．９４６ｇ、１１．５７ｍｍｏｌ、６９％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝８．６０（ｂｒ ｓ，１Ｈ，Ｎ－Ｈ），８．３５（ｓ，１Ｈ，Ａｒ－Ｈ），７．５８（ｓ，１Ｈ，Ａｒ－Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ，Ａｒ－Ｈ），６．０４（ｂｒ ｓ，１Ｈ，Ｎ－Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ，Ｃ２－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１６５．７（Ｃ１），１５７．３（Ｃ３），１３７．５（Ａｒ），１３０．０（Ａｒ），１１７．２（Ａｒ），５５．３（Ｃ２）。
１－［（１’Ｒ，３’Ｓ，４’Ｒ）－３’－ベンジルオキシ－４’－（ベンジルオキシメチル）－シクロペンチル］－メチルイソビウレット（８）

Figure 2022535386000010
粗生成物４を乾燥アセトニトリル（７５ｍＬ）中に溶解させて、カルボニルイミダゾール５（１．５０６ｇ、８．９６ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を添加した。混合物を２時間還流させた。溶媒を真空中で除去した。粗生成物を、ｉＨｅｘ／ＥｔｏＡｃ（２：１→１：１）の段階的勾配によってシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、メチルイソビウレット８を黄色油状物として得た（２．６１３ｇ、６．３５ｍｍｏｌ、７８％）。
Ｒｆ＝０．５１（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１９：１）
ＨＲＭＳ［ＥＳＩ＋］：［Ｃ２３Ｈ２９Ｎ４Ｏ４Ｎａ］＋、［Ｍ＋Ｎａ＋］＋ 計算値：４３４．２０５０、実測値：４３４．２０４９
１Ｈ－ＮＭＲ（５９９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝７．３５－７．１６（ｍ，１０Ｈ，Ａｒ－Ｈ），５．４２（ｄ，３Ｊ１’，Ｎ１＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｎ１－Ｈ），４．５０－４．３４（ｍ，４Ｈ，Ｃ７’－Ｈａ，ｂ，Ｃ８’－Ｈａ，ｂ），４．３３－４．１６（ｍ，１Ｈ，Ｃ１’－Ｈ），３．９３－３．８１（ｍ，１Ｈ，Ｃ３’－Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ，Ｃ６－Ｈ），３．４３－３．３１（ｍ，２Ｈ，Ｃ５’－Ｈ），２．３４－２．１８（ｍ，２Ｈ，Ｃ６’－Ｈａ，Ｃ４’－Ｈ），２．０６（ｄｄｄ，２Ｊ２’ａ，２’ｂ＝１３，０Ｈｚ，３Ｊ２’ａ，１’／３’＝６，９Ｈｚ，３Ｊ２’ａ，１’／３’＝４，６Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２’－Ｈａ），１．７３（ｄｄｄ，２Ｊ２’ａ，２ｂ’ ＝ １３．０Ｈｚ，３Ｊ２’ｂ，１’／３’＝７．０Ｈｚ，３Ｊ２’ｂ，１’／４’＝７．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ２’－Ｈｂ），１．２８－１．１１（ｍ，１Ｈ，Ｃ６’－Ｈｂ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１６３．８（Ｃ２），１６２．３（Ｃ４），１３８．９（ＣＡｒ），１３８．５（ＣＡｒ），１２８．５１（ＣＡｒ），１２８．４１（ＣＡｒ），１２７．７６（ＣＡｒ），１２７．７４（ＣＡｒ），１２７．７０（ＣＡｒ），１２７．５６（ＣＡｒ），８１．１（Ｃ３’），７３．３（Ｃ７’），７１．９（Ｃ５’），７１．２（Ｃ８’），５３．８（Ｃ６），４９．５（Ｃ１’），４５．０（Ｃ４’），３９．５（Ｃ２’），３５．０（Ｃ６’）。
４－エトキシ－１－［（１’Ｒ，３’Ｓ，４’Ｒ）－３’－ベンジルオキシ－４’－（ベンジルオキシメチル）－シクロペンチル］－１Ｈ－［１、３、５］－トリアジン－２－オン（９ａ）および４－メトキシ－１－［（１’Ｒ，３’Ｓ，４’Ｒ）－３’－ベンジルオキシ－４’－（ベンジルオキシメチル）－シクロペンチル］－１Ｈ－［１，３，５］－トリアジン－２－オン（９ｂ）
Figure 2022535386000011
トリフルオロ酢酸（７５μＬ）を、オルトギ酸トリエチル（６０ｍＬ）中、８の溶液（２．６１３ｇ、６．３５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）に添加した。混合物を３時間還流させた。溶媒を真空中で除去した。ＭｅＯＨを用いて残渣を１回、共蒸発させて（ｃｏ－ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ）、粗生成物を、ｉＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ（２：１→１：１→１：２）の段階的勾配によってシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、９ａ（１．７７４ｇ、４．０７ｍｍｏｌ、６４％、無色固体）および９ｂ（２６８．０ｍｇ、０，６４ｍｍｏｌ、１０％、無色油状物）を得た。
９ａ：
Ｒｆ＝０．７１（ｉＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ，１：３）
ＨＲＭＳ［ＥＳＩ＋］：［Ｃ２５Ｈ３０Ｎ３Ｏ４Ｈ］＋、［Ｍ＋Ｈ＋］＋ 計算値：４３６．２２３２、実測値：４３６．２２３１。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝８．２３（ｓ，１Ｈ，Ｃ６－Ｈ），７．３８－７．２４（ｍ，１０Ｈ，Ａｒ－Ｈ），５．０７－４．８９（ｍ，１Ｈ，Ｃ１’－Ｈ），４．５６－４．３９（ｍ，６Ｈ，Ｃ７’－Ｈａ，ｂ，Ｃ８’－Ｈａ，ｂ，Ｃ７－Ｈａ，ｂ），４．０７－３．０８（ｍ，１Ｈ，Ｃ３’－Ｈ），３．６１－３．４６（ｍ，２Ｈ，Ｃ５’－Ｈａ，ｂ），２．５２－２．３６（ｍ，２Ｈ，Ｃ６’－Ｈａ，Ｃ４’－Ｈ），２．２８（ｄｄｄ，１Ｈ，２Ｊ２’ａ，２’ｂ＝１３，３Ｈｚ，３Ｊ＝７，６Ｈｚ，３Ｊ＝２，７Ｈｚ，Ｃ２’－Ｈａ），２．１１（ｄｄｄ，１Ｈ，２Ｊ２’ａ，２’ｂ＝１３．３Ｈｚ，３Ｊ＝１０．０Ｈｚ，３Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｃ２’－Ｈｂ），１．８４－１．６８（ｍ，１Ｈ，Ｃ６’－Ｈｂ），１．４０（ｔ，３Ｈ，３Ｊ８，７＝７，１Ｈｚ，Ｃ８－Ｈ）、
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１６９．３（Ｃ４），１５８．４（Ｃ６），１５５．０（Ｃ２），１３８．２（ＣＡｒ），１３８．１（ＣＡｒ），１２８．６（ＣＡｒ），１２８．６（ＣＡｒ），１２７．９３（ＣＡｒ），１２７．８５（ＣＡｒ），１２７．８２（ＣＡｒ），８０．４（Ｃ３’），７３．４（Ｃ７’／８’），７１．２６（Ｃ７’／８’），７１．２５（Ｃ５’），６５．１（Ｃ７），５６．８（Ｃ１’），４４．９（Ｃ４’），３６．９（Ｃ２’），３２．６（Ｃ６’），１４．２（Ｃ８）。
９ｂ：
Ｒｆ＝０．６３（ｉＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ，１：３）
ＨＲＭＳ［ＥＳＩ＋］：［Ｃ２４Ｈ２８Ｎ３Ｏ４］＋、［Ｍ＋Ｈ＋］＋ 計算値：４２２．２０７４、実測値：４２２．２０７５。
１Ｈ－ＮＭＲ（５９９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝＝８．２３（ｓ，１Ｈ，Ｃ６－Ｈ），７．３８－７．２５（ｍ，１０Ｈ，Ａｒ－Ｈ），５．０４－４．９３（ｍ，１Ｈ，Ｃ１’－Ｈ），４．５７－４．４３（ｍ，６Ｈ，Ｃ７’－Ｈａ，ｂ，Ｃ８’－Ｈａ，ｂ），４．０９－３．９８（ｍ，４Ｈ，Ｃ３’－Ｈ，Ｃ７－Ｈ），３．６０ －３．５０（ｍ，２Ｈ，Ｃ５’－Ｈａ，ｂ），２．５０－２．３９（ｍ，２Ｈ，Ｃ６’－Ｈａ，Ｃ４’－Ｈ），２．２８（ｄｄｄ，１Ｈ，２Ｊ２’ａ，２’ｂ＝１３，１ Ｈｚ，３Ｊ＝７，４Ｈｚ，３Ｊ＝２，７Ｈｚ，Ｃ２’－Ｈａ），２．１１（ｄｄｄ，１Ｈ，２Ｊ２’ａ，２’ｂ＝１３．１Ｈｚ，３Ｊ＝１０．１Ｈｚ，３Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｃ２’－Ｈｂ），１．８０－１．６８（ｍ，１Ｈ，Ｃ６’－Ｈｂ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１６９．９（Ｃ４），１５８．５（Ｃ６），１５５．０（Ｃ２），１３８．３（ＣＡｒ），１３８，０ （ＣＡｒ），１２８．６３（ＣＡｒ），１２８．５７（ＣＡｒ），１２７．９３（ＣＡｒ），１２７．８４（ＣＡｒ），１２７．８２（ＣＡｒ），８０．４（Ｃ３’），７３．５（Ｃ７’／８’），７１．３（Ｃ７’／８’），５６．９（Ｃ１’），５６．０（Ｃ７），４４．９（Ｃ４’），３６．９（Ｃ２’），３２．６（Ｃ６’）。
４－アミノ－１－［（１’Ｒ，３’Ｓ，４’Ｒ）－３’－ベンジルオキシ－４’－（ベンジルオキシメチル）－シクロペンチル］－１Ｈ－［１，３，５］トリアジン－２－オン（１０）

Figure 2022535386000012
エトキシトリアジン９ａ（１．６３０ｇ、３．７４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を、メタノール溶解性ＮＨ３（ＭｅＯＨ中、７Ｎ、６０ｍＬ）中に溶解させて、室温で３時間攪拌した。混合物をＨ２Ｏ（３４０ｍＬ）で希釈して無色沈殿物を取得し、それをＥｔＯＡｃ（３×２００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて乾燥させて、溶媒を真空中で除去することによって、ベンジルによって保護されたｃＡｚａｄＣ １０（１．４７８ｇ、３．６３ｍｍｏｌ、９７％）を無色泡状物として取得した。１０の合成は、メトキシトリアジン９ｂでスタートして同じ手順に従っても成功した。
Ｒｆ＝０．５０（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９：１）
ＨＲＭＳ［ＥＳＩ＋］：［Ｃ２３Ｈ２７Ｎ４Ｏ３］＋、［Ｍ＋Ｈ＋］＋ 計算値：４０７．２０７８、実測値：４０７．２０８１。
１Ｈ－ＮＭＲ（５９９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝８．０１（ｓ，１Ｈ，Ｃ６－Ｈ），７．３５－７．２３（ｍ，１０Ｈ，Ａｒ－Ｈ），５．７８（ｓ，２Ｈ，ＮＨ），４．９２－４．７６（ｍ，４Ｈ，Ｃ７’－ＨおよびＣ８’－Ｈ），４．５９－４．４６（ｍ，１Ｈ，Ｃ１’－Ｈ），４．０７－３．９５（ｍ，１Ｈ，Ｃ３’－Ｈ），３．５５－３．４５（ｍ，２Ｈ，Ｃ５’－Ｈ），２．４４－２．２８（ｍ，２Ｈ，Ｃ６’－Ｈａ，Ｃ４’－Ｈ），２．２４－２．１６（ｍ，１Ｈ，Ｃ２’－Ｈａ），２．１４－２．０５（ｍ，１Ｈ，Ｃ２’－Ｈｂ），１．７８－１．６７（ｍ，１Ｈ，Ｃ６’－Ｈｂ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１６５．７（Ｃ４），１５７．１（Ｃ６），１５４．２（Ｃ２），１３８．３，１３８．３，１２８．６，１２８．５，１２７．８４，１２７．７８（Ｃ－Ａｒ），８０．４（Ｃ３’），７３．４（Ｃ８’），７１．４（Ｃ５’），７１．２（Ｃ８’），５６．７（Ｃ１’），４４．９（Ｃ４’），３６．８（Ｃ２’），３２．５（Ｃ６’）。
４－アミノ－１－［（１’Ｒ，３’Ｓ，４’Ｒ）－３’－ヒドロキシ－４’－（ヒドロキシメチル）－シクロペンチル］－１Ｈ－［１，３，５］トリアジン－２－オン（ｃＡｚａｄＣ，１）

Figure 2022535386000013
ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中、ベンジルによって保護された１０の溶液（１．４７８ｇ、３．６３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を－７８℃に冷却して、ＢＣｌ３（ＤＣＭ中、１Ｍ、１２．７ｍＬ、１２．７ｍｍｏｌ、３．５ｅｑ．）を滴下した。混合物を－７８℃で１時間攪拌して、室温でさらに２時間攪拌した。反応を、一定の攪拌下でＭｅＯＨ（８５ｍＬ）を添加することによってクエンチングさせた。溶媒を真空中で除去した。粗生成物を、段階的勾配ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９：１→７：３）によってシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、ｃＡｚａｄＣを得た（１、０．７４０ｇ、３．２７ｍｍｏｌ、９０％）。高温ＭｅＯＨによる再結晶化により、５７％ ｃＡｚａｄＣ（１，４６５．３ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）を無色の針状単結晶として取得した。
Ｒｆ＝０．１（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９：１）
Ｍｐ．：１９８－２００°Ｃ
ＨＲＭＳ［ＥＳＩ＋］：［Ｃ９Ｈ１５Ｎ４Ｏ３］＋、［Ｍ＋Ｈ＋］＋計算値：２２７，１１３８、実測値：２２７，１１３９。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ／ｐｐｍ＝８．２９（ｓ，１Ｈ，Ｃ６－Ｈ），４．９０－４．６２（ｍ，１Ｈ，Ｃ１’－Ｈ，Ｄ２Ｏシグナルと重複），４．２９－４．１６（ｍ，１Ｈ，Ｃ３’－Ｈ），３．７３（ｄｄ，２Ｊ５’ａ，５’ｂ＝１１．２Ｈｚ，３Ｊ５’ａ，４’＝５．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ５’ａ－Ｈ），３．６２（ｄｄ，２Ｊ５’ａ，５’ｂ＝１１．２Ｈｚ，３Ｊ５’ｂ，４’＝６．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ５’ｂ－Ｈ），２．４１－２．２９（ｍ，１Ｈ，Ｃ６’ａ－Ｈ），２．２８－２．１８（ｍ，１Ｈ，Ｃ２’ａ－Ｈ），２．１７－２．０２（ｍ，２Ｈ，Ｃ２’ｂ－Ｈ，Ｃ４’ｂ－Ｈ），１．７７－１．５５（ｍ，１Ｈ，Ｃ６’ｂ－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１６５．５（Ｃ４），１５８．５（Ｃ６），１５６．４（Ｃ２），７２．２（Ｃ３’），６２．８（Ｃ５’），５６．２（Ｃ１’），４８．１１（Ｃ４’），３８．０（Ｃ２’），３２．０（Ｃ６’）。
ＦＴＩＲ（ＡＴＲ）：ν／ｃｍ-１＝３１９４（ｍ），１６５３（ｍ），１５４０（ｓ），１４３７（ｓ），１２７８（ｓ），１０３６（ｓ）。
実施例２－ｃＡｚａｄＣのＸ線結晶構造解析
ｃＡｚａｄＣ単結晶を、Ｘ線結晶構造解析によって解析した。表１は、結晶における２つの異なるシクロペンタン立体構造における、ｃＡｚａｄＣ １の解明された構造を示す。一方の立体構造異性体はＣ６’－エンド（Ｐ＝８８．２°、ｍａｘ＝４７．８°）立体構造をとり（図２ａ）、２つめは、Ｃ２’－エンド－Ｃ３’－エキソ（Ｓｏｕｔｈ、Ｐ＝１５０．８°、ｍａｘ＝４５．４°）立体構造異性体として存在する（図２ｂ）。後者の立体構造は、ＤＮＡ中の２’－デオキシヌクレオシドに関する典型である。
さらなる図を、プログラムＭｅｒｃｕｒｙ ３．５．１．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて作成した。そのデータは、ＣＣＤＣ １９１０９５２の下で寄託されている。

Figure 2022535386000014

実施例３－加水分解的安定性に関する試験
我々は次に、製剤ＡｚａｄＣに対する直接比較において、ｃＡｚａｄＣ １の加水分解的安定性について研究した。
両方のヌクレオシドを、水性ＫＨ２ＰＯ４バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．４、５．５および８．５）中に１００ｍＭ濃度で溶解させた。溶液をＨＰＬＣによって直ちに分析し（ｔ＝０ｈ）、その後のＨＰＬＣ分析を１．５時間ごとに、または示された時点で行なった。固定相として、ＥＣ ２５０／４ ＮＵＣＬＥＯＳＩＬ １２０－３ Ｃ１８（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）クロマトグラフィーカラムを用いた。移動相は、流速０．５ｍＬ／分の水（バッファーＡ）およびアセトニトリル（バッファーＢ）からなり、以下のとおりであった：０→２５分、０→５％バッファーＢ；２５分→２８分、５％→８０％；２８分→３８分、８０％；３８分→４３分 ８０％→０％；４３分→４５分、０％。
ＡｚａｄＣに関する１回の処置サイクルは４週にわたり行われるので、我々は、半サイクル（１４日）に関する時点での安定性を測定することにした。溶液を室温で維持した後にＮＭＲスペクトルを測定した。
腫瘍細胞はしばしば酸性の微小環境を提供するので［１６］、弱酸性ｐＨでの安定性が特に参考になる。図３に示されるデータから明らかなように、製剤ＡｚａｄＣは、この１４日以内で非常に分解された。重要なことに、ｐＨ＝５．５およびｐＨ＝８．５では、無傷のＡｚａｄＣは、もはやほとんど検出すらされなかった。生理学的ｐＨ（７．４）では、ＡｚａｄＣは１４日後もまだ存在したが、分解レベルは著しかった。
これらの結果と対照的に、ｃＡｚａｄＣ １については、驚くべきことに、ｐＨ＝５．５を含む全ての試験されたｐＨ値において分解は観察されなかった。この結果から、単純にＯをＣＨ２に交換することによって、水との反応が止まるようにトリアジン環の特性が変化すると考えられる強い遠隔解除効果（ｒｅｍｏｔｅ ｄｉｓａｒｍｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）が生じるという驚くべき知見が導かれた。
実施例４－生物学的機能に関する試験
ｃＡｚａｄＣ処理に関するｍＥＳＣの細胞培養
フィーダー非依存性ｗｔ Ｊ１（１２９Ｓ４／ＳｖＪａｅ株）［２４］細胞を、以前に説明されたとおりに［２５］、血清およびＬＩＦの存在下で培養した。２ｉ／Ｌ培地中、ゼラチン化プレート上にルーチン的に維持した。プライミング実験のために、２ｉ培養物を、適切な場合は、上記のとおりＦＢＳおよびＬＩＦで補充されているが阻害剤を含まないＤＭＥＭ中で継代培養した。薬物処理のために、２ｉを培地から除去することによって、細胞をプライミング状態へ移行させた。６ウェルプレート（ＶＷＲ）内で、ＦＢＳおよびＬＩＦで補充されたＤＭＥＭ中で細胞を２日インキュベートした。分裂後、２×１０５細胞を６ウェルプレート培養皿へ移し、１μＭ（０．０１％ＤＭＳＯ中）または５μＭのｃＡｚａｄＣ（０．０５％ＤＭＳＯ中）のいずれかで補充し、７２時間処理した。培地を除去して細胞をＤＰＢＳで洗浄した後に、以前に文献において記載されたように［１８］、ＲＬＴ＋バッファーを用いて直接溶解させた。
ｇＤＮＡ単離、完全酵素消化およびＵＨＰＬＣ－ＭＳ ２
以前に記載されたように［１８］、ｇＤＮＡを単離した。ｇＤＮＡを完全酵素消化に直接供して、以前の文献において記載されたように［１９］、ＵＨＰＬＣ－ＭＳ２を用いて分析した。純粋ｃＡｚａｄＣを連続的に希釈することによって外部検量線を作成し［２０ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌ、２．５ｐｍｏｌ、１．２５ｐｍｏｌ、０．６２５ｐｍｏｌ、０．３１２５ｐｍｏｌ］、各測定の前に技術的トリプリケートで測定した。線形回帰をＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ２０１６Ｇによって行なった。
結果
我々は、実施例３に示される解除効果が生物学的機能に影響するかどうか試験した。この目的のために我々は、ナイーブからプライミング状態にかけてｍｄＣレベルが増加するので［１７］、血清／Ｌｉｆ中でプライミングされたマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）をモデル系として用いた。我々は、４８時間プライミングされたｍＥＳＣに、２つの異なる濃度（１μＭおよび５μＭ）でｃＡｚａｄＣ １を添加し、ｃＡｚａｄＣ １の存在下でプライミング状態の下でさらに７２時間、細胞をさらに増殖させた。７２時間後、細胞を回収してＤＮＡを単離し、我々が記載したプロトコル［１８］を用いてＤＮＡをヌクレオシドレベルまで消化した。
ｍｄＣのレベルを最終的に、同位体希釈ＵＨＰＬＣ－ＭＳ２を用いて正確に定量化した。この目的を達成するために、同位体的に標識されたヌクレオシド標準を正確な定量化のために添加した（ｓｐｉｋｅｄ－ｉｎ）［１９、１８］。ｍｄＣに加えて、５－ヒドロキシメチル－２’－デオキシシチジン（ｈｍｄＣ）（ＴＥＴ酵素の作用によってｍｄＣから形成される［２０－２１］）のレベルを定量化した。ｍＥＳＣにおいて、ｈｍｄＣの絶対レベルは、ｍｄＣレベルよりも１０倍以上低い［２０、２２］。その結果、ｍｄＣが相当減少した後でさえ、ｈｍｄＣレベルを一定に維持するのに十分なｍｄＣが存在するはずである。したがって、ｈｍｄＣレベルが影響を受けたかどうか、および、どれくらい多く影響を受けたかという疑問は、エピジェネティックの再プログラム化がどのように編成されるのかについて情報を与え得る。
ｍｄＣおよびｈｍｄＣの定量化と並行して、我々はまた、ｃＡｚａｄＣ １自体がどの程度、ｍＥＳＣのゲノム内に取り込まれるのか定量化した。処理された細胞のゲノム中のＡｚａｄＣの検出は、ＮａＢＨ４によるＤＮＡの処理後にのみ可能である。ＮａＢＨ４の適用は、Ｃ（５）＝Ｃ（６）二重結合を還元し、その定量化が可能になるように化合物を安定化させる［２３、１９］。喜ばしいことに、我々は、ｃＡｚａｄＣ １の安定化によって、この前処理をせずにその定量化が可能になることを見いだした。また、用いた酵素消化プロトコルによって、多量のｃＡｚａｄＣ １の存在下でさえゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を消化することが可能であることも見いだした。合わせると、外部検量線を用いたＵＨＰＬＣ－ＭＳ２によるｃＡｚａｄＣ １の定量化が、標準的およびエピジェネティック基準の定量化と並行して可能であった。
１μＭのｃＡｚａｄＣ １濃度において、５×１０－４ ｃＡｚａｄＣ／ｄＮのｃＡｚａｄＣ １レベルが検出された（図４ａ）。これは要するに、３００万近いｃＡｚａｄＣヌクレオチドがゲノム内に組み込まれたということになる。より高い濃度（５μＭのｃＡｚａｄＣ １）では、レベルは３倍増加して１．７×１０－３ ｃＡｚａｄＣ／ｄＮになり、その結果、ゲノムあたり８００万を超えるｃＡｚａｄＣが組み込まれた。１μＭで適用した場合に１．２×１０－３ ＡｚａｄＣ／ｄＮに達するＡｚａｄＣの組み込みと比較して［１９］、ｃＡｚａｄＣ １のレベルはこのレベルの約３分の１である。データは、ＡｚａｄＣの炭素環バージョン（ｃＡｚａｄＣ １）が取り込まれること、および、ゲノムにおいて５μＭ濃度で最終的に匹敵するレベルに到達することを明らかに示す。
重要なことに、培地中、１ＭのｃＡｚａｄＣでｍＥＳＣを７２時間曝露した後に、ｍｄＣ値の３０％近い減少が検出された（図４ｂ）。培地中５Ｍの濃度では、ｍｄＣレベルは、元の値の約５０％にさらに低下した。５０％への低減は、ＡｚａｄＣに関しても観察される。しかしながらここで、５０％減少は、より早く（２４時間）、より低いＡｚａｄＣ濃度（１μＭ）で既に到達している［１９］。
データは、炭素環バージョンｃＡｚａｄＣ １が同量でｍｄＣレベルに影響を及ぼすためには、単純により多くの時間が必要であることを示す。この効果は、ｃＡｚａｄＣ １の三リン酸への変換が潜在的により遅いことに起因すると我々は考えている。しかしながら、ｃＡｚａｄＣ １のより遅い反応速度は、病院で適用される長い処置時間を考慮すれば、必ずしも不利益ではない。
ｈｍｄＣレベルが、１μＭの実験において既に約５０％まで減少したという発見も非常に興味深い。５μＭでは、０．５μｇのゲノムＤＮＡを用いて、バックグラウンドレベルよりも高いｈｍｄＣを検出することすらできなかった。結果は、ｈｍｄＣレベルはｍｄＣレベルよりもさらに速く低下したことを示すが、ｈｍｄＣはゲノムにおいて１０倍以上量が少ない。この結果は興味深い。このことは、ｈｍｄＣは細胞分裂中のｍｄＣ維持プロセスにおいて主に産生されるのかもしれないという潜在性を示している。我々はここで、化合物ｃＡｚａｄＣ １は、ｄＣのｍｄＣへのメチル化およびｍｄＣのｈｍｄＣへの酸化の間の相互作用に関するさらなる洞察を得ることを可能にする完璧なツール分子であると考えている。新規の化合物ｃＡｚａｄＣ １を手に入れたことで我々は、ＤＮＡ損傷効果を損なわずに、ゲノムの脱メチル化を、対応する細胞の効果と見事に関連付けることができる。最後に、ｃＡｚａｄＣ １は、価値のあるツール化合物であり得るだけでなく、まさに次世代のエピジェネティック製剤であり得る。
要約
ＣＨ２単位による環内Ｏ原子の置換が、製剤を安定化させ、それにより、水とのその求核反応が止まることを示す。新規のヌクレオシドｃＡｚａｄＣ １は、細胞内のリン酸化酵素によって受け取られ、対応するｃＡｚａｄＣ－三リン酸がゲノム内に効率的に組み込まれる。ｃＡｚａｄＣ １は、数百万ヌクレオチドを有するゲノムに組み込まれ、ｍｄＣレベルをコントロールレベルに対して７０％まで低減させる。
実施例５－ｃＡｚａＣ（２０）に関する合成手順
Ｔｅｒｔ－ブチル－（１Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）－５，６－ジヒドロキシ－３－オキソ－２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－カルボキシレート １２

Figure 2022535386000015


Ｂｏｃによって保護されたＶｉｎｃｅラクタム１１［３０］（１１．６６ｇ、５５．７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を、２１４ｍＬ ＴＨＦ、９２ｍＬ ｔｅｒｔ－ブタノールおよび３１ｍＬ Ｈ２Ｏ中に溶解させ、２２．５９ｇ Ｎ－メチルモルホリノ－Ｎ－オキシド（１６７．２ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）および１．０３ｇ Ｋ２ＯｓＯ４二水和物（２．７９ｍｍｏｌ、５ｍｏｌ％）を添加して、混合物を室温で１６時間攪拌させた。その後に、２００ｍＬの水および３５．１ｇのＮａ２ＳＯ３（２７８．５ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ．）を添加して、混合物をさらに１時間、室温で攪拌した。それから、反応混合物をＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液（３００ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空中で蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ４０：１→ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ３０：１）によって精製して、２．９１ｇのエキソ－ビスヒドロキシル化された生成物１２（１２．０ｍｍｏｌ、２２％）を黄色い泡状物として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝４．３５－４．３２（ｍ，１Ｈ，１－Ｈ），４．２３（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ，５－Ｈ），４．０８（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ，６－Ｈ），３．８９-３．８０（ｂｒ ｓ，－ＯＨ），３．７８－３．６８（ｂｒ ｓ，－ＯＨ）２．８２－２．７６（ｍ，１Ｈ，４－Ｈ），２．０９（ｄｔ，Ｊ＝１０．９，１．５Ｈｚ，１Ｈ，７－Ｈ），１．９７（ｍ，１Ｈ，７－Ｈ），１．５１（ｓ，９Ｈ，３’－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１７３．３０（３－Ｃ），１４９．２０（１’－Ｃ），８３．８２（２’－Ｃ），７０．５７（６－Ｃ），６８．１４（５－Ｃ），６２．２９（１－Ｃ），５３．７４（４－Ｃ），３１．９９（７－Ｃ），２８．１６（３’－Ｃ）。
ＩＲ（ＡＴＲ）：ν（ｃｍ－１）＝３４１５（ｗ），２９７９（ｗ），１７７７（ｍ），１７１４（ｍ），１４５７（ｗ），１３９４（ｗ），１３６８（ｍ），１３５０（ｍ），１３２６（ｍ），１２９７（ｍ），１２５６（ｍ），１１４４（ｓ），１０８１（ｓ），１０４３（ｗ），１０３１（ｗ），１０１６（ｍ），９４７（ｓ），９０２（ｗ），８３８（ｗ），７７６（ｍ），７３３（ｓ），７０２（ｍ）。
Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ２０：１）：０．２４。
Ｔｅｒｔ－ブチル－（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－２，３－ジヒドロキシ－４－（ヒドロキシメチル）－シクロペンチル）－カルバメート １３

Figure 2022535386000016
４０ｍＬ乾燥ＭｅＯＨ中、ビスヒドロキシル化ラクタム１２（２．９０ｇ、１１．９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）の溶液を０℃に冷却し、ＮａＢＨ４（２．２５ｇ、５９．６１ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ．）を５ポーションで１５分にわたって添加した。混合物を、０℃で４５分間さらに攪拌して、室温に温めて、室温でさらに１時間攪拌した。その後に、１００ｍＬの酢酸（ＭｅＯＨ中１０％ｖ／ｖ）およびシリカゲルを添加して、混合物を真空中で乾燥状態まで濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製（乾燥充填、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ５：１→ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ４：１）および乾燥トルエン（２×１５０ｍＬ）を用いた共蒸発（ｃｏｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）によって、生成物３１３を、その酢酸塩（２．９６ｇ、９．６ｍｍｏｌ、８１％）として、茶色がかった油状物として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ／ｐｐｍ＝６．７０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ），３．６５－３．４９（ｍ，２Ｈ，１－Ｈ，３－Ｈ），３．５２（ｄｄ，Ｊ＝６．３，５．２Ｈｚ，１Ｈ，２－Ｈ），３．３７（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，５．８Ｈｚ，１Ｈ，５－Ｈ），３．３０（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，６．２Ｈｚ，１Ｈ，５－Ｈ），１．９８（ｄｔ，Ｊ＝１３．１，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６－Ｈ），１．８６－１．７７（ｍ，４Ｈ，４－Ｈ，ＯＡｃ），１．３７（ｓ，９Ｈ，３´－Ｈ），１．０４－０．９０（ｍ，１Ｈ，６－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ／ｐｐｍ＝１７３．２８（ＯＡｃ－Ｃ１），１５５．２３（Ｃ－１’），７７．３７（２’－Ｃ），７５．９３（２－Ｃ），７２．０７（１－Ｃ），６３．０２（５－Ｃ），５５．０７（３－Ｃ），４４．９４（４－Ｃ），３０．６１（６－Ｃ），２８．３０（３’－Ｃ），２２．４９（ＯＡｃ－Ｃ２）。
Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ８：１）：０．４３。
Ｔｅｒｔ－ブチル－（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－２，３－ビス（ベンジルオキシ）－４－（（ベンジルオキシ）メチル）－シクロペンチル）－カルバメート １４

Figure 2022535386000017
６７ｍＬ乾燥ＤＭＦ中、シクロペンタン１３（２．９３ｇ、９．５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）の溶液を、０℃に冷却して、ＮａＨ（１．５７ｇ、３９．３ｍｍｏｌ、４．１ｅｑ．、鉱油中６０％）を３ポーションで添加した。混合物を１５分間０℃で攪拌した後、５．３１ｍＬのＢｎＢｒ（４４．６ｍｍｏｌ、４．７ｅｑ、）をゆっくり添加して、反応混合物を０℃で２．５時間および室温で３時間攪拌した。それから、２２０ｍｇのＴＢＡＩ（０．６ｍｍｏｌ、６ｍｏｌ％）および追加で３．１８ｍＬのＢｎＢｒ（２６．８ｍｍｏｌ、２．８ｅｑ．）を添加して、混合物を８０℃まで３．５時間温めた。その後に、混合物を室温に冷却して、３００ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ３水溶液中に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×３００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（３００ｍＬ）で洗浄して、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、５０℃にて真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ １０：１→ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８：１→ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ７：１→ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ６：１→ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ４：１）によって精製して、トリベンジルによって保護された生成物１４（２．４７ｇ、４．８ｍｍｏｌ、５１％）を無色固体ワックスとして得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝７．４５－７．０９（ｍ，１５Ｈ，３ｘＯＣＨ２Ｐｈ），４．９５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．７６－４．２５（ｍ，６Ｈ，３ｘＯＣＨ２Ｐｈ），４．１５－３．９０（ｍ，１Ｈ，１－Ｈ），３．８２（ｄｄ，Ｊ＝６．７，４．４Ｈｚ，１Ｈ．３－Ｈ），３．７９－３．６３（ｍ，１Ｈ，２－Ｈ），３．５７－３．３４（ｍ，２Ｈ，５－Ｈ），２．５１－２．２４（ｍ，２Ｈ，４－Ｈ，６－Ｈ），１．５０－１．３４（ｍ，９Ｈ，３’－Ｈ），１．３１－１．１９（ｍ，１Ｈ，６－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１５５．０９（１’－Ｃ），１３８．４８（Ａｒ－Ｃ），１３８．４３（Ａｒ－Ｃ），１３８．１３（Ａｒ－Ｃ），１２８．４４（Ａｒ－Ｃ），１２８．３０（Ａｒ－Ｃ），１２８．２４（Ａｒ－Ｃ），１２８．０３（Ａｒ－Ｃ），１２７．８８（Ａｒ－Ｃ），１２７．８２（Ａｒ－Ｃ），１２７．７０（Ａｒ－Ｃ），１２７．５４（Ａｒ－Ｃ），１２７．５１（Ａｒ－Ｃ），８１．２７（２－Ｃ），７９．２９（３－Ｃ），７９．１３（２’－Ｃ），７３．３０（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７１．５２（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７１．０２（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７０．４１（５－Ｃ），５２．８５（１－Ｃ），４１．４９（１－Ｃ），３０．３４（６－Ｃ），２８．４６（３’－Ｃ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：計算値は、Ｃ３２Ｈ４０ＮＯ５ ＋［Ｍ＋Ｈ］＋ ５１８．２９０１；実測値：５１８．２９１１。
ＩＲ（ＡＴＲ）：ν（ｃｍ－１）＝３３３１（ｂｒ ｗ）、３０２９（ｗ）、２９７４（ｗ）、２８６７（ｗ）、１７０５（ｓ）、１４９５（ｍ）、１４５３（ｍ）、１３９０（ｗ）、１３６４（ｓ）、１２４５（ｍ）、１１６５（ｓ）、１０９２（ｓ）、１０７１（ｓ）、１０２７（ｍ）、７３２（ｓ）、６９５（ｓ）。
Ｒｆ（ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ４：１）：０．６９。
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－２，３－ビス（ベンジルオキシ）－４－（（ベンジルオキシ）メチル）－シクロペンタン－１－アミン １５

Figure 2022535386000018
Ａｒ雰囲気下で、１．０２ｇのＢｏｃによって保護されたシクロペンタン１４（１．９７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を７．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中に溶解させ、３．０ｍＬのＴＦＡを添加して、混合物を室温で１時間攪拌した。その赤い溶液（Ｔｈｅ ｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を乾燥状態まで濃縮して、２０．０ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加して、混合物を室温で１０分間攪拌した。それから、６０ｍＬ ＥｔＯＡｃを添加して、相を分離して、水相をＥｔＯＡｃ（２×６０ｍＬ）でさらに抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、真空中で乾燥状態まで濃縮して、脱保護アミン１５を黄色油状物（８８２ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）として得て、それを、酸化に対する不安定さのため、さらなる精製をせずに次のステップに用いた。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝７．３９－７．２６（ｍ，１５Ｈ，３ｘＯＣＨ２Ｐｈ），４．６３－４．３３（ｍ，６Ｈ，３ｘＯＣＨ２Ｐｈ），３．８１（ｄｄ，Ｊ＝５．０，３．１Ｈｚ，１Ｈ，３－Ｈ），３．４９（ｄｔ，Ｊ＝９．１，７．８Ｈｚ，１Ｈ，１－Ｈ），３．４１（ｄｄ，Ｊ＝９．２，５．１Ｈｚ，１Ｈ，５－Ｈ），３．３４－３．２６（ｍ，２Ｈ，２－Ｈ，５－Ｈ），２．４７－２．３４（ｍ，１Ｈ，４－Ｈ），２．２４－２．１３（ｍ，１Ｈ，６－Ｈ），１．０６－０．９４（ｍ，１Ｈ，６－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１３８．６６（Ａｒ－Ｃ），１３８．５２（Ａｒ－Ｃ），１３８．４８（Ａｒ－Ｃ），１２８．７２（Ａｒ－Ｃ），１２８．５２（Ａｒ－Ｃ），１２８．４７（Ａｒ－Ｃ），１２８．３８（Ａｒ－Ｃ），１２８．３１（Ａｒ－Ｃ），１２８．００（Ａｒ－Ｃ），１２７．７４（Ａｒ－Ｃ），１２７．６７（Ａｒ－Ｃ），１２７．１３（Ａｒ－Ｃ），８６．１０（２－Ｃ），７８．１１（３－Ｃ），７３．２１（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７２．２７（５－Ｃ），７１．８６（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７０．８９（ＯＣＨ２－Ｐｈ），５４．３２（１－Ｃ），４１．４９（４－Ｃ），３２．１９（６－Ｃ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：計算値は、Ｃ２７Ｈ３２ＮＯ３ ＋［Ｍ＋Ｈ］＋ ４１８．２３７７；実測値：４１８．２３７８。
１－［（１’Ｒ，２’Ｓ，３’Ｒ，４’Ｒ）－２’，３’－ビス（ベンジルオキシ）－４’－（（ベンジルオキシ）メチル）－シクロペンチル］－メチルイソビウレット １６

Figure 2022535386000019
Ａｒ雰囲気下で、８８２ｍｇシクロペンチルアミン１５（１．８７ｍｍｏｌ、１．９７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を１８．２０ｍＬの乾燥ＭｅＣＮ中に溶解させ、４３１ｍｇの２－メチル－１－（１－イミダゾイルカルボニル）－イソ尿素［１］（２．５６ｍｍｏｌ、１．３ｅｑ．）を添加した。混合物を９２℃で２時間還流して、その後に、室温に冷却して乾燥状態まで蒸発させた。残渣をシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製して（ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ３：１→ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ５：２→ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ２：１→ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ １：１）、メチルイソビウレット１６を無色油状物として得た（８８６ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、８７％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝７．４３－７．２２（ｍ，１５Ｈ，３ｘＯＣＨ２Ｐｈ），５．６０（ｓ，１Ｈ，１－Ｈ），４．８０－４．６１（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．５５－４．４１（ｍ，３Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．３２（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．２４（ｔｄ，Ｊ＝７．６，３．４Ｈｚ，１Ｈ，１’－Ｈ），３．８７（ｄｄ，Ｊ＝６．９，４．５Ｈｚ，１Ｈ，３’－Ｈ），３．８２（ｄｄ，Ｊ＝４．５，３．１Ｈｚ，１Ｈ，２’－Ｈ），３．６１（ｓ，２Ｈ，３－Ｈ，５－Ｈ），３．５７－３．４５（ｍ，２Ｈ，５’－Ｈ），２．５４－２．３９（ｍ，２Ｈ，４’－Ｈ，６’－Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ，６－Ｈ），１．３９－１．３１（ｍ，１Ｈ，６’－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝２０７．１１（４－Ｃ），１６２．２７（２－Ｃ），１３８．７４（Ａｒ－Ｃ），１３８．７１（Ａｒ－Ｃ），１３８．４５（Ａｒ－Ｃ），１２８．５１（Ａｒ－Ｃ），１２８．３４（Ａｒ－Ｃ），１２８．２８（Ａｒ－Ｃ），１２７．８６（Ａｒ－Ｃ），１２７．７０（Ａｒ－Ｃ），１２７．５９（Ａｒ－Ｃ），１２７．５６（Ａｒ－Ｃ），８１．６５（２’－Ｃ），７９．７９（３´－Ｃ），７３．３５（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７１．６４（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７１．２０（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７０．６０（５’－Ｃ），５２．５６（１’－Ｃ），４１．６８（４’－Ｃ），３１．０７（６－Ｃ），３０．５７（６’－Ｃ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：計算値は、Ｃ３０Ｈ３６Ｎ３Ｏ５ ＋［Ｍ＋Ｈ］＋ ５１８．２６５０；実測値：５１８．２６５２。
ＩＲ（ＡＴＲ）：ν（ｃｍ－１）＝３３８４（ｂｒ ｗ）、３０２８（ｗ）、２８５７（ｗ）、１６９４（ｗ）、１６３５（ｓ）、１４９５（ｓ）、１４５３（ｍ）、１３６４（ｍ）、１３００（ｗ）、１１９７（ｗ）、１０９６（ｓ）、１０２７（ｍ）７９９（ｗ）、７３６（ｍ）、６９７（ｓ）。
Ｒｆ（ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ２：１）：０．３７。
４－メトキシ－１－［（１’Ｒ，２’Ｓ，３’Ｒ，４’Ｒ）－２’，３’－ビス（ベンジルオキシ）－４’－（（ベンジルオキシ）メチル）－シクロペンチル］－１Ｈ－［１，３，５］－トリアジン－２－オン（１７）および４－エトキシ－１－［（１’Ｒ，２’Ｓ，３’Ｒ，４’Ｒ）－２’，３’－ビス（ベンジルオキシ）－４’－（（ベンジルオキシ）メチル）－シクロペンチル］－１Ｈ－［１，３，５］－トリアジン－２－オン（１８）

Figure 2022535386000020
メチルイソビウレット１６（８３７ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を１５．３０ｍＬのオルトギ酸トリエチル中に溶解させ、２０μＬのＴＦＡを添加した。混合物を９０℃に３時間加熱して、その後に、室温まで冷却して真空中で５０℃にて濃縮した。乾燥ＭｅＯＨを用いて残渣を共蒸発させて、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製して（ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ３：１→ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ５：２→ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ２：１→ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ １：１→ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ １：２）、３７３ｍｇのエトキシトリアジン１８（０．６９ｍｍｏｌ、４３％）を無色ワックスとして、および、３８９ｍｇのメトキシトリアジン１７（０．７３ｍｍｏｌ、４６％）を無色固体として得た。
メトキシトリアジン１７：
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝７．９６（ｓ，１Ｈ，６－Ｈ），７．３８－７．１７（ｍ，１５Ｈ，３ｘＯＣＨ２Ｐｈ），４．７０－４．４０（ｍ，６Ｈ，１’－Ｈ，２．５ｘＯＣＨ２Ｐｈ），４．３６－４．２４（ｍ，２Ｈ，２’－Ｈ，０．５ｘＯＣＨ２Ｐｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ，７－Ｈ），３．９３（ｄｄ，Ｊ＝４．９，３．１Ｈｚ，１Ｈ，３’－Ｈ），３．５４－３．４０（ｍ，２Ｈ，５’－Ｈ），２．５１（ｄｄｔ，Ｊ＝９．８，４．４，２．３Ｈｚ，１Ｈ，４’－Ｈ），２．３５（ｄｔ，Ｊ＝１３．３，９．４Ｈｚ，１Ｈ，６’－Ｈ），１．８２（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．４，９．０，６．７Ｈｚ，１Ｈ，６’－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１６９．８７（４－Ｃ），１５９．５９（６－Ｃ），１５４．６７（２－Ｃ），１３８．１６（Ａｒ－Ｃ），１３８．１４（Ａｒ－Ｃ），１３７．６３（Ａｒ－Ｃ），１２８．６３（Ａｒ－Ｃ），１２８．６０（Ａｒ－Ｃ），１２８．５１（Ａｒ－Ｃ），１２８．２４（Ａｒ－Ｃ），１２８．２０（Ａｒ－Ｃ），１２８．１７（Ａｒ－Ｃ），１２７．９０（Ａｒ－Ｃ），１２７．８６（Ａｒ－Ｃ），７８．７８（２’－Ｃ），７７．２７（３’－Ｃ），７３．４０（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７２．１７（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７１．４１（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７１．２０（５’－Ｃ），６３．３４（１’－Ｃ），５５．９５（７－Ｃ），４１．１４（４´－Ｃ），２６．７５（６’－Ｃ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：計算値は、Ｃ３１Ｈ３４Ｎ３Ｏ５ ＋［Ｍ＋Ｈ］＋５２８．２４９３；実測値：５２８．２４９８。
ＩＲ（ＡＴＲ）：ν（ｃｍ－１）＝３０２９（ｗ）、２８６７（ｗ）、１６９８（ｓ）、１６１３（ｓ）、１５１５（ｍ）、１４６４（ｍ）、１４５３（ｍ）、１３９８（ｍ）、１３３７（ｍ）、１２６５（ｗ）、１２１１（ｗ）、１０９６（ｍ）、１０７０（ｍ）、１０２７（ｍ）、９１３（ｗ）、８０２（ｍ）、７３３（ｓ）、６９６（ｓ）。
Ｒｆ（ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ２：１）：０．２７。
エトキシトリアジン１８：
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝７．９７（ｓ，１Ｈ，６－Ｈ），７．３９－７．１５（ｍ，１５Ｈ，３ｘＯＣＨ２Ｐｈ），４．６６－４．２１（ｍ，１０Ｈ，１’－Ｈ，２’－Ｈ，７－Ｈ，３ｘＯＣＨ２Ｐｈ），３．９６－３．８７（ｍ，１Ｈ，３’－Ｈ），，３．５４－３．３６（ｍ，２Ｈ，５’－Ｈ），２．５６－２．４１（ｍ，１Ｈ，４’－Ｈ），２．３３（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．５，９．５，４．７Ｈｚ，１Ｈ，６’－Ｈ），１．８８－１．７４（ｍ，１Ｈ，６’－Ｈ），１．２５（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ，８－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１６９．３１（４－Ｃ），１５９．５３（６－Ｃ），１５４．７４（２－Ｃ），１３８．１８（Ａｒ－Ｃ），１３８．１６（Ａｒ－Ｃ），１３７．６４（Ａｒ－Ｃ），１２８．７９（Ａｒ－Ｃ），１２８．６４（Ａｒ－Ｃ），１２８．６１（Ａｒ－Ｃ），１２８．５１（Ａｒ－Ｃ），１２８．２５（Ａｒ－Ｃ），１２８．２０（Ａｒ－Ｃ），１２８．１９（Ａｒ－Ｃ），１２７．９０（Ａｒ－Ｃ），１２７．８７（Ａｒ－Ｃ），７９．１１（２’－Ｃ），７７．３６（３’－Ｃ），７３．４６（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７２．２８（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７１．５５（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７１．２０（５’－Ｃ），６５．０６（７－Ｃ），６３．３３（１’－Ｃ），４１．１５（４’－Ｃ），２６．８１（６’－Ｃ），１４．２４（８－Ｃ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：計算値は、Ｃ３２Ｈ３６Ｎ３Ｏ５ ＋［Ｍ＋Ｈ］＋ ５４２．２６５０；実測値：５４２．２６５６。
ＩＲ（ＡＴＲ）：ν（ｃｍ－１）＝３０６４（ｗ）、３０３０（ｗ）、２９２４（ｗ）、２９６２（ｗ）、１６９４（ｓ）、１６１５（ｓ）、１５１４（ｍ）、１４９５（ｍ）、１４５２（ｓ）、１３６１（ｍ）、１３２６（ｍ）、１２７０（ｍ）、１２０６（ｗ）、１０９６（ｓ）、１０７０（ｓ）、１０２７（ｍ）、８０３（ｗ）、７３４８ｓ）、６９７（ｓ）。
Ｒｆ（ｉＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ２：１）：０．３０。
４－アミノ－１－［（１’Ｒ，２’Ｓ，３’Ｒ，４’Ｒ）－２’，３’－ビス（ベンジルオキシ）－４’－（（ベンジルオキシ）メチル）－シクロペンチル］－１Ｈ－［１，３，５］－トリアジン－２－オン １９

Figure 2022535386000021
エトキシトリアジン１８（３５８ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）およびメトキシトリアジン１７（３６３ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の混合物をＭｅＯＨ中２６．８ｍＬの７Ｎ ＮＨ３中に溶解させ、室温で３時間攪拌した。その後に、１２５ｍＬのＨ２Ｏを反応混合物に添加して、それをＥｔＯＡｃ（３×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、真空中で乾燥状態まで蒸発させて、５９３ｍｇのアミノ化生成物１９（１．１６ｍｍｏｌ、８６％）を無色泡状物として得て、それを、さらに精製せずに次のステップに用いた。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝７．８０（ｓ，１Ｈ，６－Ｈ），７．２６（ｍ，１５Ｈ，３ｘＯＣＨ２Ｐｈ），５．７０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．６３－４．４２（ｍ，６Ｈ，１’－Ｈ，２．５ｘＯＣＨ２Ｐｈ），４．３９－４．２８（ｍ，２Ｈ，２’－Ｈ，０．５ｘＯＣＨ２Ｐｈ），３．９１（ｄｄ，Ｊ＝５．０，３．５Ｈｚ，１Ｈ，３’－Ｈ），３．５３－３．４２（ｍ，２Ｈ，５’－Ｈ），２．５９－２．３５（ｍ，１Ｈ，４’－Ｈ），２．２６（ｄｔ，Ｊ＝１３．３，９．３Ｈｚ，１Ｈ，６’－Ｈ），１．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．３，９．２，７．１Ｈｚ，１Ｈ，６’－Ｈ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１６５．８４（４－Ｃ），１５８．３０（６－Ｃ），１５４．１１（２－Ｃ），１３８．２７（Ａｒ－Ｃ），１３８．２４（Ａｒ－Ｃ），１３７．８３（Ａｒ－Ｃ），１２８．５７（Ａｒ－Ｃ），１２８．５６（Ａｒ－Ｃ），１２８．４７（Ａｒ－Ｃ），１２８．２１（Ａｒ－Ｃ），１２８．１２（Ａｒ－Ｃ），１２８．０５（Ａｒ－Ｃ），１２７．８４（Ａｒ－Ｃ），１２７．８２（Ａｒ－Ｃ），１２７．７８（Ａｒ－Ｃ），７８．９９（２’－Ｃ），７７．３９（３’－Ｃ），７３．３０（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７２．１８（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７１．３９（ＯＣＨ２－Ｐｈ），７１．３（５’－Ｃ）７，６３．５３（１’－Ｃ），４１．２１（４’－Ｃ），２６．７９（６’－Ｃ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：計算値は、Ｃ３０Ｈ３３Ｎ４Ｏ４ ＋［Ｍ＋Ｈ］＋ ５１３．２４９６；実測値：５１３．２４９６。
ＩＲ（ＡＴＲ）：ν（ｃｍ－１）＝３３３１（ｂｒ ｗ）、３１８２（ｂｒ ｗ）、３０６０（ｗ）、３０２８（ｗ）、２９２５（ｗ）、２８５７（ｗ）、１６３３（ｓ）、１５０６（ｍ）、１４９５８ｍ）、１４７０（ｍ）、１４５２８ｓ）、１３６１（ｗ）、１２６２（ｗ）、１０９２（ｓ）、１０７０（ｓ）、１０２７（ｍ）、９１２（ｗ）、７９９（ｍ）、７３４（ｓ）、６９６（ｓ）。
Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ １５：１）：０．４２。
４－アミノ－１－［（１’Ｒ，２’Ｓ，３’Ｒ，４’Ｒ）－２’，３’－ビスヒドロキシ－４’－（ヒドロキシメチル）－シクロペンチル］－１Ｈ－［１，３，５］－トリアジン－２－オン ２０

Figure 2022535386000022
ベンジルによって保護された５－アザ－ｃａｒｂａＣ １９（５７６ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）の溶液を、Ａｒ雰囲気下で３０．８ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中に溶解させ、－７８℃に冷却した。それから、５．８８ｍＬのＢＣｌ３（ＣＨ２Ｃｌ２中、１Ｍ、５．８８ｍｍｏｌ、５．２５ｅｑ．）を滴下して、混合物を－７８℃で１時間および室温で２時間攪拌した。その後に、４０ｍＬの乾燥ＭｅＯＨを添加し、混合物をさらに２０分間、室温で攪拌して、真空中で乾燥状態まで濃縮した。残渣を、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィーにより精製して（乾燥充填、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ８：１→ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ５：１→ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ４：１→ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ７：３）、２２８ｍｇの脱保護化合物２０（０．９４ｍｍｏｌ、８４％）を無色固体として得た。
細胞生物学的適用のために、３４．５ｍｇの化合物を逆相ＨＰＬＣによってさらに精製して（Ｈ２Ｏ中０％～３％ＭｅＣＮ、４５分、流速５ｍＬ／分）、２５．３ｍｇのＨＰＬＣ精製２０を得た（７３％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ／ｐｐｍ＝８．３２（ｓ，１Ｈ，６－Ｈ），４．５７－４．３３（ｍ，２Ｈ，１’－Ｈ，２’－Ｈ），４．０４（ｄｄ，Ｊ＝５．３，４．４Ｈｚ，１Ｈ，３’－Ｈ），３．７６－３．５７（ｍ，２Ｈ，５’－Ｈ），２．２９（ｄｔ，Ｊ＝１３．０，８．２Ｈｚ，１Ｈ，６’－Ｈ），２．２３－２．１５（ｍ，１Ｈ，４’－Ｈ），１．７６－１．５９（ｍ，１Ｈ，６’－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ／ｐｐｍ＝１６５．４５（４－Ｃ），１５９．０３（６－Ｃ），１５６．１５（２－Ｃ），７３．１２（２’－Ｃ），７１．７７（３’－Ｃ），６３．５５（１’－Ｃ），６２．９０（５’－Ｃ），４４．４２（４’－Ｃ），２７．１７（６’－Ｃ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：計算値は、Ｃ９Ｈ１５Ｎ４Ｏ４ ＋［Ｍ＋Ｈ］＋ ２４３．１０８８；実測値：２４３．１０８６。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－）：計算値は、Ｃ９Ｈ１３Ｎ４Ｏ４ －［Ｍ－Ｈ］－ ２４１．０９４２；実測値：２４１．０９４１。
Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ７：３）：０．２９。
ＨＰＬＣ安定性試験において、炭素環式（ｃａｒｂａｃｙｃｌｉｃ）化合物ｃＡｚａＣ ２０は、アザシチジン（デシタビン）よりもさらに安定であることが示された（図５）。
実施例６
ｃＡｚａＣプロドラッグ２４に関する合成手順
細胞内への送達の改善のために、我々は、ｃＡｚａＣ ２０の５’－ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）プロドラッグ２４も調製した。
４－アミノ－１－（（３ａＳ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロ－４Ｈ－シクロペンタ－［ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）－１，３，５－トリアジン－２（１Ｈ）－オン ２１

Figure 2022535386000023
加熱乾燥したフラスコ内に、５－アザ－ｃａｒｂａＣ ２０（６４ｍｇ、２６４μｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を６．６０ｍＬの乾燥アセトン中に懸濁した。ｐ－トルエンスルホン酸（５ｍｇ、触媒量）および２，２－ジメトキシプロパン（４９μＬ、３９６μｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を添加し、混合物を室温で１８時間攪拌した。生じた溶液に、１５０μＬのＮＥｔ３（１．０８ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を室温でさらに１０分攪拌した。その後に、混合物を乾燥状態まで濃縮して、得られた残渣をシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製して（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ １０：１、１％ ＮＥｔ３を含む）、８１ｍｇのイソプロピリデン－アセタールによって保護された化合物２１（１８２μｍｏｌ、６９％、１．６ｅｑ．ＮＥｔ３を付加）を無色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ３ＣＯＤ）：δ／ｐｐｍ＝８．２９（ｓ，１Ｈ，６－Ｈ），４．９４（ｄｄ，Ｊ＝７．０，４．９Ｈｚ，１Ｈ，２’－Ｈ），４．６２－４．３９（ｍ，２Ｈ，１’－Ｈ，３’－Ｈ），３．７３－３．５１（ｍ，２Ｈ，５’－Ｈ），３．２１（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１０Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３），２．３２－２．０７（ｍ，３Ｈ，４’－Ｈ，６’－Ｈ），１．５０（ｓ，３Ｈ，１’’－Ｈ），１．３２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１５Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３），１．２９（ｓ，３Ｈ，１’’－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，Ｄ３ＣＯＤ）：δ／ｐｐｍ＝１６７．８７（４－Ｃ），１５９．８８（６－Ｃ），１５６．６６（２－Ｃ），１１４．３１（２’’－Ｃ），８３．９５（２’－Ｃ），８２．９８（３’－Ｃ），６６．２６（１’－Ｃ），６４．１７（５’－Ｃ），４７．８８（Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３），４７．８１（４’－Ｃ），３３．７２（６’－Ｃ），２７．９７（１’’－Ｃ），２５．５３（１’’－Ｃ），９．２３（Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：計算値は、Ｃ１２Ｈ１９Ｎ４Ｏ４ ＋ ２８３．１４０１［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値：２８３．１３９７．
ＩＲ（ＡＴＲ）：ν（ｃｍ－１）＝３３４６（ｂｒ ｗ（、２９８３（ｗ）、２６５８（ｗ）、１６３４（ｓ）、１４７２（ｓ）、１２１０（ｍ）、１１６０（ｍ）、１０６５（ｍ）、８６８（ｗ）、８００（ｍ）、６８２（ｗ）。
Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ６：１）：０．３６。
イソプロピル（（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）－６－（４－アミノ－２－オキソ－１，３，５－トリアジン－１（２Ｈ）－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロ－４Ｈ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）－Ｌ－アラニナト ２２

Figure 2022535386000024
保護された５－アザ－ｃａｒｂａＣ ２１（６９ｍｇ、１５５μｍｏｌ、１．０ｅｑ．、１．６ｅｑ．として、ＮＥｔ３付加）を、２．４０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中に懸濁して、－７８℃に冷却した。それから、８５５μＬのｔＢｕＭｇＣｌ溶液（ＴＨＦ中、１．０Ｍ、８５５μｍｏｌ、５．５ｅｑ．）を添加し、混合物を０℃まで直接温めて、この温度で３０分間攪拌した。その後に、混合物を再度－７８℃に冷却して、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｘｙａｒｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄａｔｅ［３１］２３（ＴＨＦ中、１．０Ｍ、５３８μｍｏｌ、３．５ｅｑ．）の溶液を５３８μＬ滴下した。反応混合物を室温までゆっくり温めて、１７時間攪拌した。生じた鮮明な黄色の溶液をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）の添加によってクエンチングして、水相をＥｔＯＡｃで抽出した（３×２５ｍＬ）。合わせた有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液（２５ｍＬ）で洗浄して、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して、真空中で乾燥状態まで濃縮した。残渣をシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製して（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ６０：１→ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ５０：１→ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ４０：１）、８３ｍｇの生成物１２（７８μｍｏｌ、５１％、５．０ｅｑ．ＮＥｔ３を付加）を、Ｐにおける（ｏｎ Ｐ）両方のジアステレオ異性体の混合物として、無色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（８００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝８．０５（２ｘｓ，１Ｈ），７．３２－７．２７（ｍ，２Ｈ，ＯＰｈ），７．２３－７．１７（ｍ，２Ｈ，ＯＰｈ），７．１５－７．０７（ｍ，１Ｈ，ＯＰｈ），５．０４－４．８７（ｍ，２Ｈ，２’－Ｈ，４’’’－Ｈ），４．５９－４．５４（ｍ，１Ｈ，３’－Ｈ），４．３１－４．１３（ｍ，３Ｈ，１’－Ｈ，５’－Ｈ），４．０２－３．９３（ｍ，１Ｈ，２’’’－Ｈ），３．７８（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），３．０９（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３０Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３），２．５３－２．１７（ｍ，３Ｈ，４’－Ｈ，６’－Ｈ），１．４９－１．４７（ｍ，３Ｈ，１’’－Ｈ），１．３９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４５Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３），１．３７－１．３４（ｍ，３Ｈ，３’’－Ｈ），１．２６－１．２４（ｍ，３Ｈ，１’’－Ｈ），１．２１－．１８（ｍ，６Ｈ，５’’’－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（２０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝１７３．１０（１’’’－Ｃ），１６５．３９（４－Ｃ），１５８．５７（６－Ｃ），１５３．１３（Ｏ－ＣＡｒ），１５０．８３（２－Ｃ），１２９．７３（ＣＨＡｒ），１２４．９９（ＣＨＡｒ），１２０．４５（ＣＨＡｒ），１１３．５７（２’’－Ｃ），８２．４２（２’－Ｃ），８１．１７（３’－Ｃ），６９．２８（４’’’－Ｃ），６７．５０（１’－Ｃ），６５．９３（５’－Ｃ），５０．５０（２’’’－Ｃ），４５．９１（Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３），４４．９３（４’－Ｃ），３２．３４（６’－Ｃ），２９．７９（５’’’－Ｃ），２７．７３（１’’－Ｃ），２５．３６（１’’－Ｃ），２１．７２（５’’’－Ｃ），２１．１３（３’’’－Ｃ），８．７５（Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）３）。
３１Ｐ－ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝２．４６，２．３６。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：計算値は、Ｃ２４Ｈ３５Ｎ５Ｏ８Ｐ＋ ５５２．２２１８［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値：５５２．２２１１。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－）：計算値は、Ｃ２４Ｈ３３Ｎ５Ｏ８Ｐ－ ５５０．２０７２［Ｍ－Ｈ］－；実測値：５５０．２０７４。
ＩＲ（ＡＴＲ）：ν（ｃｍ－１）＝３３７９（ｍ）、２９８０（ｓ）、２９４６（ｍ）、２６０６（ｓ）、２４９８（ｓ）、１６４０（ｓ）、１４７６（ｓ）、１３９８（ｍ）、１３８３（ｍ）、１２１２（ｓ）、１１５８（ｍ）、１１０７（ｗ）、１０７０（ｍ）、１０３７（ｓ）、９２９（ｍ）、８０２（ｗ）、７３０（ｍ）。
Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ２０：１）：０．２５。
イソプロピル（（（（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）－４－（４－アミノ－２－オキソ－１，３，５－トリアジン－１（２Ｈ）－イル）－２，３－ジヒドロキシ－シクロペンチル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）－Ｌ－アラニナト ２４

Figure 2022535386000025
イソプロピリデンアセタールによって保護された化合物２２（３８ｍｇ、６９μｍｏｌ、１．０ｅｑ．）に、１．０ｍＬの８０％ＴＦＡ（ｄｄＨ２Ｏ中）を添加して、混合物を３０℃で２０分間攪拌した。それから、混合物を５．０ｍＬのｄｄＨ２Ｏ中に注いで凍結乾燥した。生じた残渣を、５００μＬのＭｅＣＮ、５００μＬのＤＭＳＯおよび４．０ｍＬのｄｄＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ含有）の混合物中に溶解させて、混濁した溶液を濾過して、逆相ＨＰＬＣ（ｄｄＨ２Ｏ ｃｏｎｔ．０．１％ＴＦＡ中５％ＭｅＣＮ～ｄｄＨ２Ｏ ｃｏｎｔ．０．１％ＴＦＡ中６０％ＭｅＣＮ、４５分、流速５ｍＬ／分）によって精製して、１０．４ｍｇの標的化合物２４（２０μｍｏｌ、２９％）を無色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ３ＣＣＮ）：δ／ｐｐｍ＝８．１１（ｓ，１Ｈ），７．５０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ２），７．４１－７．２９（ｍ，２Ｈ，ＯＰｈ），７．２５－７．１５（ｍ，３Ｈ，ＯＰｈ），６．６１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ２），４．９８－４．８８（ｍ，１Ｈ，４’’－Ｈ），４．３９－４．２３（ｍ，３Ｈ，１’－Ｈ，２’－Ｈ，ＮＨ），４．２０－４．０７（ｍ，２Ｈ，５’－Ｈ），３．９７（ｄｔ，Ｊ＝５．２，３．８Ｈｚ，１Ｈ，３’－Ｈ），３．９３－３．８２（ｍ，１Ｈ，２’’－Ｈ），２．３３－２．０９（ｍ，２Ｈ，４’－Ｈ，６’－Ｈ），１．８３－１．６７（ｍ，１Ｈ，６’－Ｈ），１．３０－１．２６（ｍ，３Ｈ，３’’－Ｈ），１．１９（ｄｔ，Ｊ＝６．２，３．４Ｈｚ，６Ｈ，５’’－Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，Ｄ３ＣＣＮ）：δ／ｐｐｍ＝１７４．００（１’’－Ｃ），１６５．９２（４－Ｃ），１５９．９２（６－Ｃ），１５３．８４（２－Ｃ），１５１．９７（Ｏ－ＣＡｒ），１３０．６２（ＣＨＡｒ），１２５．７５（ＣＨＡｒ），１２１．３６（ＣＨＡｒ），１２１．３１（ＣＨＡｒ），７４．１２（２’－Ｃ），７２．５０（３’－Ｃ），６９．６４（４’’－Ｃ），６８．５３（５’－Ｃ），６４．９６（１’－Ｃ），５１．４４（２’’－Ｃ），４４．４４（４’－Ｃ），２８．０８（６’－Ｃ），２１．８９（５’’－Ｃ），２１．８１（５’’－Ｃ），２０．８０（３’’－Ｃ）。
３１Ｐ－ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｄ３ＣＣＮ）：δ／ｐｐｍ＝３．０８，２．９２。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：計算値は、Ｃ２１Ｈ３１Ｎ５Ｏ８Ｐ＋ ５１２．１９０５［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値：５１２．１９０１。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－）：計算値は、Ｃ２１Ｈ２９Ｎ５Ｏ８Ｐ－ ５１０．１７５９［Ｍ－Ｈ］－；実測値：５１０．１７５７。
Figure 2022535386000026
Figure 2022535386000027
Figure 2022535386000028

Claims (17)

  1. 式Ｉの化合物：
    Figure 2022535386000029

    ここで、Ｒ１は、Ｈ、遊離もしくは保護された修飾もしくは非修飾リン酸基、または、ヒドロキシル保護基であり、
    Ｒ２は、Ｈ、遊離もしくは保護された修飾もしくは非修飾リン酸基、または、ヒドロキシル保護基であり、
    Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ３、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３、ＯＨまたはＯＲ６であり、ここでＲ６はヒドロキシル保護基であり、
    Ｒ４およびＲ５はそれぞれ、Ｈであり、またはアミノ保護基を形成する、
    またはその塩。
  2. 請求項１の化合物であって、各リン酸基は独立に、
    以下：
    （ｉ）リン酸基が一リン酸、二リン酸または三リン酸基である、遊離または保護された非修飾リン酸、および
    （ｉｉ）遊離または保護された修飾リン酸、例えば一リン酸、二リン酸または三リン酸基であって、ここで前記修飾リン酸基は、ホスホネート、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）またはホスホロチオエート基から選択される、遊離または保護された修飾リン酸
    から選択される、
    化合物。
  3. Ｒ１がＨである、請求項１または２の化合物。
  4. Ｒ２がＨである、請求項１から３のいずれか一項の化合物。
  5. Ｒ３がＨまたはＯＨである、請求項１から４のいずれか一項の化合物。
  6. Ｒ４およびＲ５がＨである、請求項１から５のいずれか一項の化合物。
  7. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５がそれぞれＨである、または、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５がそれぞれＨであってＲ３がＯＨもしくはＯＲ６である、
    請求項１から６のいずれか一項の化合物。
  8. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５がそれぞれＨである、
    請求項１から７のいずれか一項の化合物。
  9. Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５がそれぞれＨであってＲ３がＯＨである、
    請求項１から７のいずれか一項の化合物。
  10. 医薬において使用するための、請求項１から９のいずれか一項の化合物またはその薬学的に許容できる塩。
  11. 過剰増殖性障害の治療のための、請求項１から９のいずれか一項の化合物またはその薬学的に許容できる塩。
  12. がんの治療のための、請求項１から９のいずれか一項の化合物またはその薬学的に許容できる塩。
  13. 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療のための、請求項１から９のいずれか一項の化合物またはその薬学的に許容できる塩。
  14. アテローム性動脈硬化症または腎不全の治療のための、請求項１から９のいずれか一項の化合物またはその薬学的に許容できる塩。
  15. 核酸、特にＤＮＡのメチル化を阻害するための、請求項１から９のいずれか一項の化合物のインビトロでの使用。
  16. エピジェネティック分析のための、請求項１５の使用。
  17. 過剰増殖性障害の治療のための方法であって、
    治療的に効果的な用量の請求項１から９のいずれか一項の化合物またはその薬学的に許容できる塩を、それを必要とする対象、特にヒト対象へ投与するステップを含む、
    方法。
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