JP2022534445A - Rnaシークエンシング法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年7月10日に出願された米国仮出願第62/872,558号に基づく優先権の利益を主張しており、前記仮出願は、すべての目的のために、参照により本明細書に援用される。
mRNA分子内の目的の領域をシークエンシングするための方法が、本明細書に記載される。
メッセンジャーRNA(mRNA)シークエンシングは、リアルタイム遺伝子発現、異なる組織中の遺伝子発現プロファイル、および遺伝子発現のレベルについての情報を提供することができる。特定の遺伝子の発現レベルにおける変動は、環境刺激に応答して、異なる発達段階の間に、または原因であるか結果であるかについての疾患との関係において、変動し得る。
ある特定の非常に効率的なシークエンシング法は、核酸分子をシークエンシングするために非終結ヌクレオチドを用いる。これらのシークエンシング法は、「フローシークエンシング」、「自然な合成によるシークエンシング」または「非終結型の合成によるシークエンシング」法と呼ばれることがある(例えば、その全体が参照により本明細書に取り込まれる米国特許第8,772,473号を参照されたい)。
mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法が、本明細書に記載される。
mRNA分子内の目的の領域(例えば、コード領域、3’非翻訳領域(3’-UTR)および/または5’非翻訳領域(5’-UTR))の配列を決定する方法が、本明細書に記載される。この方法により、ホモポリマー領域(例えば、ポリA領域またはその相補体、ポリT領域)の全部または実質的に一部のシークエンシングを回避しながら、mRNA分子内の目的の領域をシークエンシングすることが可能になる。mRNA分子のポリA領域は、一般に、それがmRNA配列または遺伝子発現レベルについての重大な情報を提供しないので、関心をひかない、および有益な情報をもたらさないと考えられる。したがって、ポリヌクレオチドのより情報価値のある領域に達するように、ホモポリマー領域をわたってシークエンシングプライマーが伸長するために必要なコストおよび時間の低減において実質的な利益が存在する。例えば、コストは、非標識ヌクレオチド対応物よりも実質的に費用がかかる標識ヌクレオチドの使用を低減または排除しながら、シークエンシングプライマーを伸長することによって、低減することができる。さらに、シークエンシングプライマーの伸長時間は、取り込まれた各塩基に対する検出ステップをスキップすること、およびプライマーがホモポリマー領域をわたって連続的に伸長するのを可能にすることによって、低減することができる。
定義
ポリヌクレオチド
フローシークエンシング法
バーコード領域設計による制御されたプライマー伸長
ホモポリマー領域内で失速するプライマー伸長
共通フロー長さを有するバーコード領域
二重プライマーシークエンシング
切断可能なリンカーを有するプライマー
失速したプライマー伸長の再開
(実施例1)
(実施例2)
(実施例3)
(実施例4)
(実施例5)
(実施例6)
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、前記バーコード領域が、前記ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基を除外する、ステップ;
(b)前記ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基の相補的塩基を欠く標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ;
(c)前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基に相補的なヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップ;ならびに
(d)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
(項目2)
ステップ(b)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
ステップ(c)で使用される前記ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドを含む、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
ステップ(d)で使用される前記ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
ステップ(b)で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記標的領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記バーコード領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
ステップ(b)、ステップ(c)またはステップ(d)で使用される全ヌクレオチドの50%以下が、標識されている、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
ステップ(c)で使用される全ヌクレオチドの0.1%以下が、標識されている、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記プライマーが前記ホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、ステップ(c)を1または複数回反復することをさらに含み、取り込まれていないヌクレオチドが、反復ステップの間で除去される、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ;
(b)標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第1の割合で使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ;
(c)前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基に相補的な標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第2の割合で使用して、前記プライマーを伸長するステップであって、前記第2の割合が、前記第1の割合よりも大きく、プライマー伸長が、前記ホモポリマー領域内で失速する、ステップ;
(d)前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基に相補的な非標識ヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域の末端まで伸長するステップ;ならびに
(e)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
(項目15)
ステップ(b)で使用される前記標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドおよび非終結非標識ヌクレオチドを含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
ステップ(c)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目14または15に記載の方法。
(項目17)
ステップ(d)で使用される前記非標識ヌクレオチドが、非終結非標識ヌクレオチドを含む、項目14から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
ステップ(e)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目14から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記標的領域の配列が、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを使用して決定される、項目14から18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
ステップ(b)または(e)で使用される前記ヌクレオチドの50%またはそれ未満が、標識されている、項目14から19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
ステップ(c)で使用される前記ヌクレオチドの50%より多くが、標識されている、項目14から20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
ステップ(d)で使用される前記ヌクレオチドの0.1%またはそれ未満が、標識されている、項目14から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
ステップ(d)で使用される前記ヌクレオチドのすべてが、標識されていない、項目14から22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
ステップ(d)が、前記プライマーが前記ホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、1または複数回、反復して、取り込まれていないヌクレオチドを除去すること、および新鮮なヌクレオチドを添加することを含む、項目14から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、項目14から24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目14から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記バーコード領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目14から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、ステップ;
(b)複数の所定のサイクルで標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップであって、前記プライマーが、前記ホモポリマー領域中に伸長される前に、前記複数のポリヌクレオチドにわたって前記バーコード領域の末端まで伸長されるように、前記所定のサイクルおよび前記ポリヌクレオチドの前記バーコード領域が構成されている、ステップ;
(c)非標識ヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップ;ならびに
(d)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
(項目29)
ステップ(b)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
ステップ(c)で使用される前記非標識ヌクレオチドが、非終結非標識ヌクレオチドを含む、項目28または29に記載の方法。
(項目31)
ステップ(d)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目28から30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
ステップ(b)またはステップ(d)で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、項目28から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
ステップ(b)またはステップ(d)で使用される前記ヌクレオチドの50%またはそれ未満が、標識されている、項目28から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
ステップ(c)で使用される前記ヌクレオチドの0.1%またはそれ未満が、標識されている、項目28から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
ステップ(c)で使用される前記ヌクレオチドのすべてが、標識されていない、項目28から34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記プライマーが前記ホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、ステップ(c)を1または複数回反復することをさらに含み、取り込まれていないヌクレオチドが、ステップ(c)を反復する前に除去される、項目26から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目26から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目26から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、項目26から38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドを第1のプライマーとハイブリダイズして、第1の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ;
(b)標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ;
(c)前記複数のポリヌクレオチドを第2のプライマーとハイブリダイズして、第2の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記第2のプライマーが、前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域中の前記塩基に相補的な複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域を含む、ステップ;ならびに
(d)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
(項目41)
ステップ(b)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
ステップ(d)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目40または41に記載の方法。
(項目43)
ステップ(b)またはステップ(d)で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、項目40から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
ステップ(c)およびステップ(d)が、ステップ(a)およびステップ(b)の前に実行される、項目40から43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
ステップ(a)およびステップ(b)が、ステップ(c)およびステップ(d)の前に実行される、項目40から43のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
ステップ(b)の後に前記第1のプライマーを、またはステップ(d)の後に前記第2のプライマーを除去するステップを含む、項目40から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記第2のプライマーが、前記プライマーの3’末端に3’アンカーを含み、前記3’アンカーが、前記第2のプライマーの前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基以外の塩基を含む、項目40から46のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記第2のプライマーが、前記プライマーの5’末端に5’アンカーを含み、前記アンカーが、リンカーを介して前記第2のプライマーの前記ホモポリマー領域に共有結合されている、項目40から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記5’アンカーが、前記第1のプライマーの少なくとも一部と同一の配列を含む核酸セグメントを含む、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記リンカーが、1つまたは複数の核酸を含む、項目48または49に記載の方法。
(項目51)
前記リンカーが、PEGホスホルアミダイトリンカーである、項目48から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
ヌクレオチドを使用して、前記第2のプライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップをさらに含む、項目40から51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記ホモポリマー領域内の前記第2のプライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドを含む、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記ホモポリマー領域内の前記第2のプライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、項目52または53に記載の方法。
(項目55)
前記標的領域または前記バーコード領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、項目40から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目40から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目40から56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、項目40から57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、前記プライマーが、第1のプライマーセグメント、前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域中の前記塩基に相補的な複数の塩基を含むホモポリマー領域を含む第2のプライマーセグメント、および前記第1のプライマーセグメントおよび前記第2のプライマーセグメントの間に切断可能なリンカーを含む、ステップ;
(b)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ;
(c)前記切断可能なリンカーで前記プライマーを切断するステップ;ならびに
(d)標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
(項目60)
ステップ(b)で前記標的領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目59に記載の方法。
(項目61)
ステップ(d)で前記バーコード領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目59または60に記載の方法。
(項目62)
ステップ(b)またはステップ(d)で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、項目59から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記切断可能なリンカーが、1つまたは複数の核酸を含む、項目59から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
前記切断可能なリンカーが、ウラシル塩基を含み、前記プライマーが、前記プライマーをウラシル特異的切断酵素と接触させることにより切断される、項目59から63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
ヌクレオチドを使用して、前記第2のプライマーセグメントを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップをさらに含む、項目59から64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
前記第2のプライマーセグメントを前記ホモポリマー領域内で伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドを含む、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記第2のプライマーセグメントを前記ホモポリマー領域内で伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、項目65または66に記載の方法。
(項目68)
前記標的領域または前記バーコード領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、項目59から67のいずれか一項に記載の方法。
(項目69)
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目59から68のいずれか一項に記載の方法。
(項目70)
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目59から69のいずれか一項に記載の方法。
(項目71)
各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、項目59から70のいずれか一項に記載の方法。
(項目72)
mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ;
(b)前記同じ塩基のヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域中に伸長するステップであって、前記プライマーが、前記ホモポリマー領域内で失速し、取り込まれていないヌクレオチドを除去する、ステップ;
(c)ステップ(b)を1または複数回反復して、前記プライマーが前記ホモポリマー領域にわたって伸長するステップ;ならびに
(d)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
(項目73)
ステップ(b)で前記プライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目72に記載の方法。
(項目74)
ステップ(d)で前記標的領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目72または73に記載の方法。
(項目75)
ステップ(b)で使用される前記ヌクレオチドが、標識ヌクレオチドを含む、項目72から74のいずれか一項に記載の方法。
(項目76)
ステップ(b)で使用される前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、項目72から75のいずれか一項に記載の方法。
(項目77)
前記標的領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、項目72から76のいずれか一項に記載の方法。
(項目78)
前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域をさらに含み、前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられ、前記方法が、標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップをさらに含む、項目72から77のいずれか一項に記載の方法。
(項目79)
前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域中の前記塩基が、アデニンまたはチミン塩基である、項目1から78のいずれか一項に記載の方法。
(項目80)
前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域が、少なくとも8つの連続する同一の塩基を含む、項目1から79のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域が、少なくとも50の連続する同一の塩基を含む、項目1から80のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
前記バーコード領域が、試料バーコードを含む、項目1から71および78から81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
前記バーコード領域の決定された配列を、同じ標的核酸分子由来のmRNAコード領域に関連する決定された配列に関連付けるステップをさらに含む、項目1から71および78から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
前記ポリヌクレオチドが、cDNA分子である、項目1から83のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
前記mRNA分子の前記目的の領域が、前記mRNA分子のコード領域を含む、項目1から84のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
前記mRNA分子の前記目的の領域が、前記mRNA分子の3’-非翻訳領域または5’-非翻訳領域を含む、項目1から85のいずれか一項に記載の方法。
Claims (86)
- mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、前記バーコード領域が、前記ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基を除外する、ステップ;
(b)前記ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基の相補的塩基を欠く標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ;
(c)前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基に相補的なヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップ;ならびに
(d)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。 - ステップ(b)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)で使用される前記ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の方法。
- ステップ(d)で使用される前記ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バーコード領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)、ステップ(c)またはステップ(d)で使用される全ヌクレオチドの50%以下が、標識されている、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)で使用される全ヌクレオチドの0.1%以下が、標識されている、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーが前記ホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、ステップ(c)を1または複数回反復することをさらに含み、取り込まれていないヌクレオチドが、反復ステップの間で除去される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ;
(b)標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第1の割合で使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ;
(c)前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基に相補的な標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第2の割合で使用して、前記プライマーを伸長するステップであって、前記第2の割合が、前記第1の割合よりも大きく、プライマー伸長が、前記ホモポリマー領域内で失速する、ステップ;
(d)前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基に相補的な非標識ヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域の末端まで伸長するステップ;ならびに
(e)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。 - ステップ(b)で使用される前記標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドおよび非終結非標識ヌクレオチドを含む、請求項14に記載の方法。
- ステップ(c)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項14または15に記載の方法。
- ステップ(d)で使用される前記非標識ヌクレオチドが、非終結非標識ヌクレオチドを含む、請求項14から16のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項14から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域の配列が、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを使用して決定される、請求項14から18のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)または(e)で使用される前記ヌクレオチドの50%またはそれ未満が、標識されている、請求項14から19のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)で使用される前記ヌクレオチドの50%より多くが、標識されている、請求項14から20のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)で使用される前記ヌクレオチドの0.1%またはそれ未満が、標識されている、請求項14から21のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)で使用される前記ヌクレオチドのすべてが、標識されていない、請求項14から22のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)が、前記プライマーが前記ホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、1または複数回、反復して、取り込まれていないヌクレオチドを除去すること、および新鮮なヌクレオチドを添加することを含む、請求項14から23のいずれか一項に記載の方法。
- 各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、請求項14から24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項14から25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バーコード領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項14から26のいずれか一項に記載の方法。
- mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、ステップ;
(b)複数の所定のサイクルで標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップであって、前記プライマーが、前記ホモポリマー領域中に伸長される前に、前記複数のポリヌクレオチドにわたって前記バーコード領域の末端まで伸長されるように、前記所定のサイクルおよび前記ポリヌクレオチドの前記バーコード領域が構成されている、ステップ;
(c)非標識ヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップ;ならびに
(d)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。 - ステップ(b)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項28に記載の方法。
- ステップ(c)で使用される前記非標識ヌクレオチドが、非終結非標識ヌクレオチドを含む、請求項28または29に記載の方法。
- ステップ(d)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項28から30のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)またはステップ(d)で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、請求項28から31のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)またはステップ(d)で使用される前記ヌクレオチドの50%またはそれ未満が、標識されている、請求項28から32のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)で使用される前記ヌクレオチドの0.1%またはそれ未満が、標識されている、請求項28から33のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)で使用される前記ヌクレオチドのすべてが、標識されていない、請求項28から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーが前記ホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、ステップ(c)を1または複数回反復することをさらに含み、取り込まれていないヌクレオチドが、ステップ(c)を反復する前に除去される、請求項26から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項26から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項26から37のいずれか一項に記載の方法。
- 各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、請求項26から38のいずれか一項に記載の方法。
- mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドを第1のプライマーとハイブリダイズして、第1の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ;
(b)標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ;
(c)前記複数のポリヌクレオチドを第2のプライマーとハイブリダイズして、第2の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記第2のプライマーが、前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域中の前記塩基に相補的な複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域を含む、ステップ;ならびに
(d)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。 - ステップ(b)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項40に記載の方法。
- ステップ(d)で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項40または41に記載の方法。
- ステップ(b)またはステップ(d)で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、請求項40から42のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)およびステップ(d)が、ステップ(a)およびステップ(b)の前に実行される、請求項40から43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)およびステップ(b)が、ステップ(c)およびステップ(d)の前に実行される、請求項40から43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)の後に前記第1のプライマーを、またはステップ(d)の後に前記第2のプライマーを除去するステップを含む、請求項40から45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーが、前記プライマーの3’末端に3’アンカーを含み、前記3’アンカーが、前記第2のプライマーの前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基以外の塩基を含む、請求項40から46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーが、前記プライマーの5’末端に5’アンカーを含み、前記アンカーが、リンカーを介して前記第2のプライマーの前記ホモポリマー領域に共有結合されている、請求項40から47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記5’アンカーが、前記第1のプライマーの少なくとも一部と同一の配列を含む核酸セグメントを含む、請求項48に記載の方法。
- 前記リンカーが、1つまたは複数の核酸を含む、請求項48または49に記載の方法。
- 前記リンカーが、PEGホスホルアミダイトリンカーである、請求項48から50のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレオチドを使用して、前記第2のプライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップをさらに含む、請求項40から51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ホモポリマー領域内の前記第2のプライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドを含む、請求項52に記載の方法。
- 前記ホモポリマー領域内の前記第2のプライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、請求項52または53に記載の方法。
- 前記標的領域または前記バーコード領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、請求項40から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項40から55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項40から56のいずれか一項に記載の方法。
- 各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、請求項40から57のいずれか一項に記載の方法。
- mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、前記プライマーが、第1のプライマーセグメント、前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域中の前記塩基に相補的な複数の塩基を含むホモポリマー領域を含む第2のプライマーセグメント、および前記第1のプライマーセグメントおよび前記第2のプライマーセグメントの間に切断可能なリンカーを含む、ステップ;
(b)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ;
(c)前記切断可能なリンカーで前記プライマーを切断するステップ;ならびに
(d)標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ
を含む方法。 - ステップ(b)で前記標的領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項59に記載の方法。
- ステップ(d)で前記バーコード領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項59または60に記載の方法。
- ステップ(b)またはステップ(d)で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、請求項59から61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記切断可能なリンカーが、1つまたは複数の核酸を含む、請求項59から62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記切断可能なリンカーが、ウラシル塩基を含み、前記プライマーが、前記プライマーをウラシル特異的切断酵素と接触させることにより切断される、請求項59から63のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレオチドを使用して、前記第2のプライマーセグメントを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップをさらに含む、請求項59から64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセグメントを前記ホモポリマー領域内で伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドを含む、請求項65に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセグメントを前記ホモポリマー領域内で伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、請求項65または66に記載の方法。
- 前記標的領域または前記バーコード領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、請求項59から67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項59から68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項59から69のいずれか一項に記載の方法。
- 各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、請求項59から70のいずれか一項に記載の方法。
- mRNA分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
(a)mRNAに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびmRNA分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ;
(b)前記同じ塩基のヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域中に伸長するステップであって、前記プライマーが、前記ホモポリマー領域内で失速し、取り込まれていないヌクレオチドを除去する、ステップ;
(c)ステップ(b)を1または複数回反復して、前記プライマーが前記ホモポリマー領域にわたって伸長するステップ;ならびに
(d)標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。 - ステップ(b)で前記プライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項72に記載の方法。
- ステップ(d)で前記標的領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項72または73に記載の方法。
- ステップ(b)で使用される前記ヌクレオチドが、標識ヌクレオチドを含む、請求項72から74のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)で使用される前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、請求項72から75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、請求項72から76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域をさらに含み、前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられ、前記方法が、標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップをさらに含む、請求項72から77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域中の前記塩基が、アデニンまたはチミン塩基である、請求項1から78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域が、少なくとも8つの連続する同一の塩基を含む、請求項1から79のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域が、少なくとも50の連続する同一の塩基を含む、請求項1から80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バーコード領域が、試料バーコードを含む、請求項1から71および78から81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バーコード領域の決定された配列を、同じ標的核酸分子由来のmRNAコード領域に関連する決定された配列に関連付けるステップをさらに含む、請求項1から71および78から82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、cDNA分子である、請求項1から83のいずれか一項に記載の方法。
- 前記mRNA分子の前記目的の領域が、前記mRNA分子のコード領域を含む、請求項1から84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記mRNA分子の前記目的の領域が、前記mRNA分子の3’-非翻訳領域または5’-非翻訳領域を含む、請求項1から85のいずれか一項に記載の方法。
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