JP2022534406A - タウの立体配座特異的エピトープ、それらに対する抗体、およびそれらに関連する方法 - Google Patents

タウの立体配座特異的エピトープ、それらに対する抗体、およびそれらに関連する方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、オリゴマータウ中の立体配座エピトープ、それらに対する抗体、ならびに免疫原およびそれらに特異的な抗体を作製および使用する方法に関する。抗体はタウの活性中和部位に結合する。タウオパチーを治療するための方法を含む、作製および使用するための方法も提供される。【選択図】図２Ａ

Description

関連出願
この特許協力条約出願は、２０１９年５月２７日に出願された米国仮出願第６２／８５３，１２１号および２０１９年１０月１６日に出願された米国仮出願第６２／９１５，９３１号の優先権の利益を主張し、それぞれ本明細書に全体が組み込まれる。
本開示は、タウエピトープおよびそれに対する抗体、より詳細には、ミスフォールドした（例えばオリゴマー）タウにおいて選択的にアクセス可能であると予測される配列および立体配座特異的タウエピトープ、ならびに関連する抗体組成物、その作製方法および使用に関する。
タウタンパク質は、中枢神経系ニューロンの微小管を安定させる上で重要な役割を果たす。タウのミスフォールドした形態の発達は、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症、および反復的な頭部外傷（慢性外傷性脳症）によるもの等の他のタウオパチーに見られる毒性および異常な微小管機能につながる。
オリゴマータウに対する抗体は、例えば、米国特許第８，７７８，３４３号に記載されている。
いくつかの治療用タウ抗体が開発中であるが、それらが最も効果的な標的エピトープおよびタウ種に対するものであるかは依然として不明である。例えば、Ｎ末端エピトープに結合する抗体は、タウの播種および凝集の阻害剤としては不十分であることが報告されている（Ｃｏｕｒａｄｅ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ）。ＢｉｏｇｅｎおよびＡｂｂｖｉｅのＮ末端エピトープに対する２つの抗体は、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）の臨床試験で失敗している。抗体がモノマーに結合すると、生理学的タウによる治療用抗体の「吸収」が生じる可能性がある。
ミスフォールドしたオリゴマータウをモノマータウよりも優先的または選択的に結合し、タウの播種または他の病理学的活性を阻害または中和する抗体が望ましい。
本明細書に記載されているのは、タウの立体配座エピトープである。立体配座エピトープは、配列および立体配座特異的エピトープであり、抗体は、モノマータウポリペプチドと比較して、ミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドおよび／または可溶性フィブリルにおいて立体配座が異なる特定のアミノ酸配列を認識する。本発明者らは、いくつかの残基がミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドに選択的に曝露されることを特定し、試薬を設計し、また活性中和部位でミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドおよび／または可溶性フィブリルに対して選択的な抗体を生成した。本明細書に記載される他の態様は、当該試薬および抗体を作製する方法、ならびにミスフォールドしたオリゴマータウを検出するためにそれらを使用する方法を含む。エピトープは、ミスフォールドしたタウのオリゴマー種に選択的に曝露され、タウモノマーでの利用可能性はより低い。
一態様は、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）、任意選択でＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、またはＫＬＤＦＫ（配列番号１）および任意選択でリンカーを含む、および／またはそれらからなるタウペプチドを含む環状化合物を含む。また、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）、任意選択でＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、またはＫＬＤＦＫ（配列番号１）の４つ以上の残基、および任意選択でリンカーを含む、および／またはそれらからなるタウペプチドを含む線形化合物が提供される。
さらなる態様は、本明細書に記載の環状化合物を含む免疫原である。免疫原は免疫原性である。
別の態様は、対応する線状化合物と比較して本明細書に記載の環状化合物中のタウペプチドおよび／もしくは可溶性フィブリルに選択的に結合する、ならびに／またはモノマータウポリペプチドと比較してミスフォールドしたオリゴマータウに選択的に結合する、ならびに／または本明細書に記載の免疫原もしくは当該免疫原を含む組成物を使用して産生される抗体を含む。そのような抗体は、異なるエピトープに結合し得、ならびに／またはタウに結合する既存の抗体よりも改善された結合特性および／もしくは標的化特性を有し得る。例えば、抗体は、タウ活性中和部位の立体配座エピトープを模倣する免疫原に産生された。
本明細書に記載の抗体をコードする核酸も含まれる。いくつかの実施形態において、核酸は、ベクターに含まれる。
さらなる態様は、ミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドおよび／または可溶性フィブリルを発現する細胞または組織を本明細書に開示される抗体と接触させることを含む、タウ凝集／凝集体および／または増殖を低減または阻害する方法を含む。
本明細書に開示される別の態様は、タウオパチーの治療を必要とする対象におけるタウオパチーを治療する方法であって、有効量の本明細書に開示される抗体または当該抗体を含む組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の趣旨および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい実施形態を示しながら単なる例示として与えられることを理解されたい。
本開示の実施形態は、これより、以下の図面に関して記載される。
ＰＤＢ５Ｏ３Ｌに示される１０本の鎖を含むタウの概略図である。 フィブリル構造を部分的に無秩序化するための集合座標偏向後の１０本の鎖を含むタウの概略図である。 予測されるエピトープの予測強度を示す概略図である。 予測されるＫＬＤＦＫ（配列番号１）エピトープが重ね合わされたタウＰＤＢ ５０３Ｌの概略図である。 ２つのアンサンブル間の非類似度の尺度であるジェンセン－シャノン距離（ＪＳＤ）の散布図である。Ｘ軸は環状ペプチドとタウモノマーと間のＪＳＤであり、Ｙ軸は環状ペプチドと偏向または応力（または偏向）フィブリルとの間のＪＳＤである。プロットの各点は、所与の環状ペプチド足場に対応する。 ２つのアンサンブル間の非類似度の尺度であるジェンセン－シャノン距離（ＪＳＤ）の散布図である。Ｘ軸は環状ペプチドとタウモノマーと間のＪＳＤであり、Ｙ軸は環状ペプチドと偏向または応力（または偏向）フィブリルとの間のＪＳＤである。プロットの各点は、所与の環状ペプチド足場に対応する。 ２つのアンサンブル間の非類似度の尺度であるジェンセン－シャノン距離（ＪＳＤ）の散布図である。Ｘ軸は環状ペプチドとタウモノマーと間のＪＳＤであり、Ｙ軸は環状ペプチドと偏向または応力（または偏向）フィブリルとの間のＪＳＤである。プロットの各点は、所与の環状ペプチド足場に対応する。 固定化されたタウオリゴマーへの産生抗体（ハイブリドーマ上清）の結合を示す散布図である。 固定化されたタウモノマーへの産生抗体（ハイブリドーマ上清）の結合を示す散布図である。 産生された各抗体のタウオリゴマーおよびタウモノマーへの抗体（ハイブリドーマ上清）の結合を示す、散布図に結合の結果を重ね合わせた棒グラフである。 は、各抗体（ハイブリドーマ上清）のタウオリゴマー／タウモノマーに対する結合反応の比率を示す散布図である。 ＳＰＲアッセイにおける様々な濃度のタウオリゴマーまたはモノマーへの精製抗体の結合を示す一連のグラフである。 ＳＰＲアッセイにおける様々な濃度のタウオリゴマーまたはモノマーへの精製抗体の結合を示す一連のグラフである。 ＳＰＲアッセイにおける様々な濃度のタウオリゴマーまたはモノマーへの精製抗体の結合を示す一連のグラフである。 ＳＰＲアッセイにおける様々な濃度のタウオリゴマーまたはモノマーへの精製抗体の結合を示す一連のグラフである。 ＳＰＲアッセイにおける様々な濃度のタウオリゴマーまたはモノマーへの精製抗体の結合を示す一連のグラフである。 ＳＰＲアッセイにおける様々な濃度のタウオリゴマーまたはモノマーへの精製抗体の結合を示す一連のグラフである。 ＳＰＲアッセイにおける様々な濃度のタウオリゴマーまたはモノマーへの精製抗体の結合を示す一連のグラフである。 ＳＰＲアッセイにおける様々な濃度のタウオリゴマーまたはモノマーへの精製抗体の結合を示す一連のグラフである。 対照を示すグラフである。 対照を示すグラフである。 ＳＰＲアッセイにおけるＡＤ患者からの可溶性脳抽出物中のタウ種との精製ｍＡｂクローン８Ｇ７（試験ｍＡｂ）の結合を示す棒グラフである。 ＳＰＲアッセイにおける単一のＡＤ脳（左パネル）または３つのＡＤ脳のプール（右パネル）からの可溶性脳抽出物中のタウ種への精製ｍＡｂの結合を示す一連の棒グラフである。 ＳＰＲアッセイにおける可溶性タウ予備形成フィブリル（ＰＦＦ）への精製抗体の結合を示す棒グラフである。 細胞蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）アッセイを使用して、予備形成タウフィブリル（ＰＦＦ）によって誘導される細胞内タウ凝集体の形成を阻害または低減する精製抗体の能力を示す棒グラフである。 タウＲＤ Ｐ３０１Ｓ ＦＲＥＴバイオセンサー細胞を使用するＦＲＥＴアッセイで評価された、ＡＤ脳ホモジネートの播種活性を阻害するタウｍＡｂの能力を示す棒グラフである。 ＡＤ脳播種に結合して枯渇させるタウｍＡｂの能力を示す棒グラフである。
本明細書で示されるのは、立体配座特異的抗体および当該抗体を生成するための免疫原の生成である。本発明者らは、活性中和部位でミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチド上に存在する可能性がより高い標的を同定した。
未変性タンパク質領域に対して産生された抗体は、オリゴマー種等のミスフォールドしたタンパク質に対して選択的でない傾向があり、したがって、ミスフォールドしたタンパク質だけでなく未変性タウタンパク質にも結合する可能性があり得る。
本明細書に記載されるように、タウのミスフォールドしたオリゴマー形態に対して選択的な抗体を開発するために、本発明者らは、フィブリルとの関連で破壊されやすい場合があり、したがってミスフォールドのための触媒基質として作用し得るミスフォールドしたタンパク質オリゴマーの表面に曝露され得る、タウ配列の領域を同定した。同定されたタウの領域は、当該立体配座に結合する抗体がミスフォールドしたタウの播種およびミスフォールドしたタウの増殖を阻害することができるため、ミスフォールドしたタウ疾患活性にとって重要であり得る。
フィブリル構造の実験的に検証された構造モデルは、分子動力学を使用して部分的にアンフォールドされるその報告された立体配座から全体的に偏向されて、異常な細胞環境等の外部チャレンジで無秩序になりやすい隣接する一次配列の領域を生成した。
これらの弱く安定した領域は、ミスフォールドしたオリゴマータンパク質、またはミスフォールドした病原性種に選択的に曝露される可能性があると仮定した。したがって、それらは、オリゴマー選択的エピトープ予測および／または天然のモノマータウとは異なる予測を構成し得る。
実施例に記載されているように、本発明者らは、いくつかの基準を満たすことによって、推定上の選択的エピトープを模倣するために、同定されたエピトープを含む環状化合物を設計した。モノクローナル抗体は、オリゴマータウに優先的に結合し、ミスフォールドしたタウの播種およびミスフォールドしたタウの増殖を阻害することができる抗体を生成するために、本明細書に記載の環状化合物を含む免疫原を使用して生成された。
Ｉ．定義
本明細書で使用される「タウ」という用語は、本明細書で使用される場合、および文脈に応じて、野生型配列タウ、モノマータウ、およびすべての種からのその突然変異形態を含むミスフォールドした形態、特にヒトタウ（すなわちｈｕｔａｕ）を含むタウのすべての形態よびアイソフォームを意味し得る。人間の脳では、タウタンパク質は３５２～４４１アミノ酸の範囲で選択的スプライシングされたアイソフォームのファミリーを構成する。中枢神経系の最長のアイソフォーム（ｔａｕ－Ｆまたはｔａｕ－４）は４つの反復単位（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４）ならびに２つのインサートを有し、合計４４１アミノ酸であるが、最短のアイソフォームは３つの反復（Ｒ１、Ｒ３およびＲ４）有し、インサートは有さず、合計３５２アミノ酸である。アミノ酸配列（例えば、タウ－４のＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号、Ｐ１０６３６－８）およびヌクレオチド配列（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子名／ＩＤ：ＭＡＰＴ／４１３７）は、以前に特徴付けられている。
本明細書で使用される「野生型」は、例えば、ヒトにおいて見出される非変異体または天然型タウタンパク質の任意のアイソフォームの一次アミノ酸配列を指す。
本明細書で使用される「天然タウポリペプチド」は、微小管または正常細胞に見られる細胞質ゾルに関連するかどうかにかかわらず、タウモノマーを指す。単離されたモノマー構造は、本明細書に記載されているように、ＰＤＢフィブリル（ＰＤＢ ５Ｏ３Ｌ）からの鎖の１つを使用して予測することができる。未変性タウポリペプチドは、例えば、タウオパチーに罹患していない脳において、ｐａｎ抗体を使用して検出することができる。
本明細書で使用される「タウオパチー」という用語は、タウタンパク質の病理学的凝集に関連する神経変性疾患のクラスを指し、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、ピック病、前頭側頭型認知症または前頭側頭葉変性症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、原発性加齢性タウオパチー、慢性外傷性脳症、亜急性硬化性汎脳炎、前頭側頭型認知症、および染色体１７に関連するパーキンソン病を含む。
本明細書で使用される「構造化フィブリル」、「非応力フィブリル」、または「非偏向フィブリル」は、タウタンパク質のフィブリルについて熱平衡で観察されると予想される立体配座を指し、例えば、ＰＤＢ ５Ｏ３Ｌは、その代表的な例である。
本明細書で使用される「ミスフォールドしたオリゴマー」は、マルチサブユニットポリペプチドまたはポリペプチド凝集の二次および三次構造を指し、オリゴマーポリペプチドまたはその中のサブユニットが、未変性モノマーによって典型的に採用されるものとは異なる立体配座を（例えば、１つ以上の位置で）採用したことを示す。ミスフォールドは、アミノ酸の欠失、置換、または付加等のタンパク質中の変異によって引き起こされ得るが、野生型配列タンパク質はまた、疾患においてミスフォールドされ、例えば、微小環境条件の変化、またはフィブリル形成への経路上もしくは経路外にあり得るオリゴマー形成の結果として、疾患特異的または疾患選択的エピトープを曝露することもできる。したがって、本明細書においてポリペプチドを指す場合の「ミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチド」または「ミスフォールドしたオリゴマータウ」は、そのサブユニットがモノマータウの単位とは異なる立体配座を示すタウポリペプチドオリゴマーを指す。例えば、ミスフォールドしたオリゴマータウは、フィブリル構造の一部を含む、部分的に秩序化された立体配座、ならびにモノマー、および／またはフィブリルタウのいずれかではなく交互の立体配座を有するアミノ酸のポリマーセグメントを含む、部分的に無秩序な立体配座を含み得る。ミスフォールドしたオリゴマータウは、選択的に提示されるか、または結合のためにアクセス可能な立体配座エピトープを含み、ミスフォールドしたオリゴマータウのエピトープ配列は、モノマーに関連する対応する配列と立体配座的に異なる可能性がある。
本明細書で使用される「可溶性フィブリル」という用語は、間質液に可溶性であるフィブリルフラグメントおよびプロトフィブリルを指す。
「変異タウ」という用語は、タウの形態、特に前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）に特徴的な置換等、例えばアミノ酸置換をもたらす遺伝子変異の結果として生じるタウの内因性形態を指す。タウタンパク質の突然変異は、一般に家族性のＡＤとは関連しないが、ＦＴＤおよびその他のいくつかのタウオパチー（ピック病、進行性核上性麻痺、およびパーキンソン病に関与するものを含む；例えば、既知の病原性突然変異のリストについては、参照により本明細書に組み込まれるｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ／ｍｕｔａｔｉｏｎｓ／ｍａｐｔを参照されたい）を引き起こす可能性がある。
「ＫＬＤＦ（配列番号２）」という用語は、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列：リジン、ロイシン、アスパラギン、フェニルアラニンを意味する。同様に、ＫＬＤＦＫ、（配列番号１）、および他の配列は、１文字のアミノ酸コードによって特定されるアミノ酸配列を指す。文脈に応じて、アミノ酸配列の参照は、タウの配列または単離されたペプチド、例えば環状化合物のエピトープ部分のアミノ酸配列を指し得る。配列ＫＬＤＦ（配列番号２）およびＬＤＦＫ（配列番号３）は、それぞれ、Ｐ１０６３６－８に示されるタウアミノ酸一次配列の残基３４３～３４６および残基３４４～３４７からなる。前述のように、タウの他のアイソフォームがあり、当業者は、別のアイソフォームの番号付けを容易に確認することができるであろう。例えば、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）は、ｆａｓｔａファイルＰ１０６３６－４に対応するアイソフォームタウ－ｂのアミノ酸２８３～２８７である。
アミノ酸配列ＫＬＤＦＫ（配列番号１）は、ヒトの脳で発現する６つのタウアイソフォームすべてに存在する。
本明細書で使用される「ＫＬＤＦＫ（配列番号１）中のエピトープ」という用語は、抗体によって特異的に結合されるその任意の部分を指す。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、配列中のアミノ酸（またはそのサブセット）が、抗体または結合断片、例えば本明細書に記載の抗体または結合断片によって特異的に認識される、抗原中のアミノ酸の配列を意味する。エピトープは、１つ以上の抗原決定基を含み得る。例えば、立体配座エピトープに対応する単離されたペプチドに対して生成された抗体は、該エピトープ配列の一部またはすべてを認識する。
本明細書で使用される「ミスフォールドしたオリゴマータウで選択的に提示またはアクセス可能なエピトープ」という用語は、多量体、オリゴマー、または凝集形態であるかどうかにかかわらず、ＡＤおよびＦＴＤ等のタウオパチーに存在するミスフォールドしたオリゴマータウで選択的に提示またはアクセス可能な立体配座エピトープを指すが、通常インビボで見られるように、タウのモノマーポリペプチドの分子表面または微小管結合タウの表面のいずれにもない。
本明細書で使用される場合、「立体配座エピトープ」という用語は、アミノ酸の配列またはタンパク質の種において特定の三次元構造を有するそれらの抗原決定基を指し、少なくとも三次元構造の態様は、存在するか、または対応する非偏向フィブリル構造またはモノマー構造、または微小管関連タウタンパク質等の別の種と比較して、抗体結合によりアクセス可能である。別の立体配座に対する立体配座エピトープに選択的に結合する抗体は、その立体配座特異的エピトープのアミノ酸のうちの１つ以上の空間配列を認識する。例えば、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）の立体配座エピトープは、別の立体配座、任意選択でタウモノマーの領域、または対応する線状ペプチドもしくはその一部を使用して生成された抗体と比較して例えば少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、または少なくとも４倍以上の選択性で抗体によって選択的に認識されるＫＬＤＦＫ（配列番号１）の立体配座を指すことができる。
本明細書における「環状ペプチド」への言及は、完全にタンパク質性の化合物（例えば、リンカーが２、３、４、５、６、７、または８アミノ酸である）を指し得る。実施例において決定された環状ペプチドについて記載された特性は、非アミノ酸リンカー分子を含む他の化合物（例えば、環状化合物）に組み込むことができることが理解される。「環状ペプチド」および「環状化合物」は、環状化合物がアミノ酸で構成されている場合、同義的に使用され得る。
「アミノ酸」という用語は、天然型アミノ酸のすべて、ならびに修飾されたＬ－アミノ酸を含む。アミノ酸の原子は、例えば、異なる同位体を含むことができる。例えば、アミノ酸は、水素の代わりに重水素、窒素－１４の代わりに窒素－１５、および炭素－１２の代わりに炭素－１３、および他の同様の変化を含むことができる。
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質の所望の特性を損なうことなく、１つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置き換えられるものである。好適な保存的アミノ酸置換は、同様の疎水性、極性、およびＲ基サイズを持つアミノ酸を互いに置換することによって行うことができる。保存的アミノ酸置換の例は、以下を含む。
Figure 2022534406000002
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖、ヒト化および他のキメラ抗体、ならびにそれらの結合断片を含むことを意図している。抗体は、組換え源に由来し、かつ／またはトランスジェニック動物で産生され得る。また、生化学的技法を使用して産生され得るか、またはライブラリーから単離され得るヒト抗体も含まれている。ヒト化またはキメラ抗体は、１つ以上のアイソタイプまたはクラスからの配列を含み得る。本開示の抗体または複数の抗体への言及は、例えば、本明細書に記載の免疫原に対して産生され、かつ／または本明細書に記載のエピトープ、例えば、ＬＤＦＫ（配列番号３）、ＫＬＤＦ（配列番号２）、もしくはＫＬＤＦＫ（配列番号１）、または例えばエピトープ、ミスフォールドしたオリゴマータウ、および／もしくは該エピトープ配列のうちの１つを含む立体配座化合物との関連でその一部に対して選択的である、本明細書に記載の抗体または複数の抗体を指す。
「単離された抗体」という語句は、抗体を産生する供給源、例えば、動物、ハイブリドーマ、または他の細胞株（抗体を産生する組換え細胞等）から除去された、インビボまたはインビトロで産生される抗体を指す。単離された抗体は、任意に「精製」され、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の純度を意味する。
本明細書で使用される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、エピトープ結合に寄与すると一般に推定される抗体の特定の超可変領域を指す。ＣＤＲ配列を特定するための計算方法は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴを含む。本開示に記載されているＣＤＲは、ＩＭＧＴブラストを使用して特定される。本明細書に含まれる配列に関する当業者はまた、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ等に基づいてＣＤＲ配列を同定することができるであろう。そのような抗体も同様に包含される。
無傷または完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含み、抗原に結合するか、または無傷の抗体と競合する、抗体または抗体鎖の一部または部分に対する本明細書で使用される「結合断片」という用語。例示的な結合断片には、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ダイマー、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディ、およびそれらのマルチマーが含まれる。断片は、無傷または完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理によって得ることができる。断片はまた、組換え手段によって得ることができる。例えば、Ｆ（ａｂ′）２断片は、抗体をペプシンで処理することによって生成することができる。得られたＦ（ａｂ′）２断片を処理して、ジスルフィド架橋を低減し、Ｆａｂ′断片を産生することができる。パパイン消化は、Ｆａｂ断片の形成につながり得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ′、およびＦ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、および他の断片もまた、組換え発現技法によって構築され得る。
抗体が、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）等のエピトープに結合すると言われる場合、その抗体が、指定された残基もしくはその一部、例えば少なくとも１つの残基もしくは少なくとも２つの残基を含むポリペプチドまたは化合物に特異的に結合することを意味する。このような抗体は、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）のすべての残基に接触する必要はなく、当該エピトープ内のすべての単一のアミノ酸置換または欠失は、結合親和性に必ずしも顕著に、または等しく影響を与える必要はない。
本明細書で使用される「検出可能な標識」という用語は、ペプチド配列、本明細書に記載のペプチドまたは化合物に付加または導入することができ、直接または間接的に検出可能なシグナルを産生することができる、蛍光タンパク質等の部分を指す。例えば、標識は、３Ｈ、１３Ｎ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等の放射線不透過性陽電子放出放射性核種（例えば、ＰＥＴ撮像において使用するための）もしくは放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン等の蛍光（蛍光色素分子）もしくは化学発光（発色団）化合物；アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素；撮像剤；または金属イオンであり得る。検出可能な標識はまた、例えば、二次抗体を使用して間接的に検出可能であり得る。
本明細書で使用される「より高い親和性」という用語は、抗体Ｘが標的Ｚよりも強く（Ｋｏｎ）および／またはより小さな解離定数（Ｋｏｆｆ）で標的Ｙに結合する抗体結合の程度を指し、これに関連して、抗体Ｘは、Ｚよりも標的Ｙに対してより高い親和性を有する。同様に、本明細書における「より低い親和性」という用語は、抗体Ｘが標的Ｚよりも弱くおよび／またはより大きな解離定数で標的Ｙに結合する抗体結合の程度を指し、これに関連して、抗体Ｘは、Ｚよりも標的Ｙに対してより低い親和性を有する。抗体とその標的抗原との間の結合の親和性は、ＫＡ＝１／ＫＤとして表現され得、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎである。ｋｏｎおよびｋｏｆｆ値は、表面プラズモン共鳴を使用して測定され得る（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを使用して測定可能）。
また、本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、抗体の産生を誘発し、リンパ球または免疫原の抗原性部分に対して向けられた他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。
本明細書で使用される「免疫原」は、免疫応答を誘起し、抗体の産生を引き起こし、例えば、多抗原性ペプチドとしてコンジュゲートされ、かつ／またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の免疫原性増強剤に融合された、本明細書に記載の環状ペプチドを含み得る物質を意味する。本明細書に記載のコンジュゲートに加えて、同定されたエピトープ、例えば、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）、ＫＬＤＦ（配列番号２）、またはＬＤＦＫ（配列番号３）に対する交差反応性抗体を誘発する免疫原性ペプチド模倣体は、免疫原を構成する。有用な免疫原として機能するために、タウペプチドは、望ましくは、少なくとも約４、５、６、または７個のタウ残基を組み込み、例えば、Ｋ３４３、Ｌ３４４、Ｄ３４５、Ｆ３４６、Ｋ３４７の４つ以上、および任意選択で１つ、２つまたは３つの追加の隣接残基をタウに含み、例えば、環状化合物に関連して最大２残基のＮ末端および最大３残基のＣ末端を含む。免疫原はまた、より大きい、例えば１２または１３アミノ酸またはサブユニットまでであってもよく、タウペプチド、例えばＫＬＤＦ（配列番号２）またはＬＤＦＫ（配列番号３）を含み得る。
環状化合物に関する「対応する線状化合物」という用語は、環状化合物と同じ配列もしくは化学部分を含むか、またはそれらからなるが線状（非環化）形態である化合物、任意にペプチドを指す。
本明細書で使用される「核酸配列」という用語は、天然型塩基、糖、および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語はまた、非天然型モノマーまたはその一部を含む、修飾または置換された配列を含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む天然型塩基を含み得る。配列はまた、修飾された塩基を含み得る。そのような修飾された塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸は、二本鎖または一本鎖のいずれかである可能性があり、センス鎖を表す。さらに、「核酸」という用語は、相補性核酸配列、ならびにコドン最適化または同義のコドン同等物を含む。本明細書で使用される「単離された核酸配列」という用語は、組換えＤＮＡ技法によって産生される場合は細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まない核酸、または化学的に合成される場合は化学前駆体、もしくは他の化学物質を指す。単離された核酸はまた、核酸が由来する核酸に自然に隣接する配列（すなわち、核酸の５′および３′末端に位置する配列）を実質的に含まない。
タウの形態（例えばモノマー、またはミスフォールドしたオリゴマータンパク質）に優先的に結合する抗体に関して本明細書で使用される「選択的」または「選択的に結合する」という用語は、結合タンパク質が少なくとも１．５倍、２倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、またはそれ以上の親和性でその形態に結合することを意味する。したがって、特定の立体配座（例えば、ミスフォールドしたタンパク質）に対してより選択的である抗体は、別の形態と比較して少なくとも２倍等のより高い親和性で特定の形態のタウに優先的に結合する。
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、化学部分、好ましくは免疫原性が低いかまたは非免疫原性であり、ペプチドＮ末端および／またはＣ末端に結合される、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）、任意にＫＬＤＦ（配列番号２）、またはＬＤＦＫ（配列番号３）エピトープペプチドの少なくとも３つのアミノ酸を含む、タウペプチドＮ末端および／またはＣ末端に直接または間接的に共有結合できることを意味する。リンカー端部は、例えば、接合して環状化合物を産生することができる。リンカーは、１つ以上のシステイン（Ｃ）残基等の１つ以上の官能化可能な部分を含み得る。リンカーは、官能化可能な部分を介して、担体タンパク質またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）もしくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の免疫原増強剤に連結することができる。リンカーを含む環状化合物は、ペプチド自体よりも長さが長い。すなわち、（例えば、３つのアミノ酸残基の）リンカーを有するペプチドを環化すると、リンカーを有しないペプチドよりも大きな閉じた円が作製される。リンカーは、アミノ酸グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）等の非免疫原性部分、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の繰り返しを含み得るが、これらに限定されない。リンカーは、例えば、９アミノ酸、任意選択でＧＧＧＧＣＧＧＧＧ（配列番号７４）、または８アミノ酸、任意選択でＧＧＧＣＧＧＧＧ（配列番号６７）、ＧＧＣＧＧＧＧＧ（配列番号６８）もしくはＧＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号６９）、または７アミノ酸、任意選択でＧＧＧＧＣＧＧ（配列番号６５）、ＧＧＧＣＧＧＧ（配列番号７０）、ＧＧＣＧＧＧＧ（配列番号７１）もしくはＧＣＧＧＧＧＧ（配列番号７２）、６アミノ酸、任意選択でＧＧＧＣＧＧ（配列番号７３）、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号４５）もしくはＧＣＧＧＧＧ（配列番号４７）、５アミノ酸、任意選択でＧＣＧＧＧ（配列番号４４）もしくはＧＧＧＣＧ（配列番号４６）、４アミノ酸、例えばＧＣＧＧ（配列番号４３）もしくはＧＧＣＧ（配列番号１８６）、または３アミノ酸、例えばＧＣＧであってもよい。リンカーは、ペプチドの両端の残基数に応じて参照され得、例えば、３，１は、システイン等の官能化可能な部分およびタウペプチドに対してＮ末端である３アミノ酸およびＣ末端である１アミノ酸を有するリンカーを指す。リンカーの例は、配列番号１８６、４３～４７および６５～７４に提供されている。
本明細書で使用される「官能化可能な部分」という用語は、本明細書で使用される場合、別の原子群または単一原子（いわゆる「相補性官能基」）と反応して、２つの群または原子間の化学的相互作用を形成する原子群または単一原子を指す「官能基」を有する化学実体を指す。システイン（Ｃ）の場合、官能基は、反応されてジスルフィド結合を形成することができる－ＳＨであり得る。したがって、リンカーは、例えば、ＣＣＣであり得る。別の原子群との反応は、例えば、
Figure 2022534406000003
を有し得るビオチン－ストレプトアビジン結合の場合のように、共有結合または強い非共有結合であり得る。本明細書で使用される強い非共有結合は、少なくとも１ｅ－９、少なくとも１ｅ－１０、少なくとも１ｅ－１１、少なくとも１ｅ－１２、少なくとも１ｅ－１３、または少なくとも１ｅ－１４のＫｄとの相互作用を意味する。
タンパク質および／または他の薬剤は、免疫原性を助けるために、またはインビトロ研究においてプローブとして作用するために、環状化合物に結合され得る。この目的のために、反応することができる（例えば、共有結合または非共有結合であるが強い結合を作製する）任意の官能化可能な部分を使用することができる。特定の一実施形態では、官能化可能な部分は、目的のタンパク質上の非対合システインとジスルフィド結合を形成するように反応するシステイン残基であり、これは、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の免疫原性増強剤、またはインビトロ免疫ブロットもしくは免疫組織化学的アッセイに使用されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の担体タンパク質であり得る。
本明細書で使用される「～と反応する」という用語は、一般に、化学的相互作用の形成をもたらす電子の流れまたは静電荷の移動が存在することを意味する。
本明細書で使用される「動物」または「対象」という用語は、任意で、ヒトを含むかまたは除外する哺乳動物を含む動物界のすべてのメンバーを含む。
本明細書で使用され、当該技術分野でよく理解されている「治療すること」または「治療」という用語は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは望ましい臨床結果には、１つ以上の症状または状態の緩和または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の拡大の防止、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、疾患の再発の減少、および寛解（部分的または全体的）、検出の可否が含まれ得るが、これらに限定されない。「治療すること」および「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存率と比較して、生存率を延長することも意味し得る。本明細書で使用される「治療すること」および「治療」は、予防的治療も含む。例えば、発症前の対象が進行を防ぐために治療され得る。そのような対象は、進行を防ぐために、本明細書に記載の化合物、抗体、免疫原、免疫複合体または組成物で治療することができる。
本明細書で使用される場合、「有効量」という語句は、所望の結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を意味する。対象に投与される場合、有効量は、対象の病状、年齢、性別、体重等の要因によって異なり得る。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整することができる。
１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、抗体を単独で、または他の成分と組み合わせて含み（ｃｏｎｔａｉｎ）得る。
［００１０３］本明細書で使用される「投与される」という用語は、治療有効量の本開示の化合物または組成物の、細胞または対象への投与を意味する。
本開示の範囲の理解において、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」およびその派生語という用語は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、要素、成分、群、整数、および／またはステップの存在を指定し、他の述べられていない特徴、要素、成分、群、整数、および／またはステップの存在を除外する、制限的用語であることが意図される。
本明細書での終点による数的範囲の列挙は、その範囲内に包含されるすべての数および分数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５等を含む）。また、そのすべての数および分数は、「約」という用語によって修飾されると推定されることも理解されたい。
本明細書で使用される場合、「実質的に」、「約」、および「およそ」等の程度の用語は、最終結果が顕著に変化しないように修正された用語の妥当な量の偏差を意味する。
「約」という用語は、参照されている数値のプラスまたはマイナス０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、または２０％を意味する。
さらに、特定のセクションに記載される定義および実施形態は、当業者によって理解されるように、それらが好適である本明細書で記載される他の実施形態に適用可能であるように意図される。例えば、以下の節では、異なる態様がより詳細に定義されている。そのように定義された各態様は、反対に明らかに示されない限り、任意の他の態様または複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示される任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される任意の他の特徴または複数の特徴と組み合わせることができる。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形には、文脈で明らかに別段の指示がない限り、複数形の参照が含まれる。例えば、「化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含むことができる。
ＩＩ．エピトープ
本発明者らは、アミノ酸位置３４３～３４７、３４３～３４６、および３４４～３４７において、それぞれＫＬＤＦＫ（配列番号１）、ＫＬＤＦ（配列番号２）、およびＬＤＦＫ（配列番号３）を含むタウタンパク質中のエピトープを同定した。（アイソフォームタウ－ＦのＦａｓｔａファイルＰ１０６３６－８．ｆａｓｔａに従ってインデックス付けされる）。本発明者らはさらに、エピトープまたはその一部が立体配座エピトープであり得ること、ならびにＫＬＤＦ（配列番号２）およびＬＤＦＫ（配列番号３）またはそれらのいずれかの一部がミスフォールドしたタウのオリゴマー種における抗体結合に選択的にアクセス可能であり得ることを特定した。
モノマーで偏向のタウフィブリルアンサンブルで同定されたエピトープ間で同定された１つ以上の立体配座の違いに基づいて、本発明者らは、抗体を産生するための立体配座が制限された化合物および免疫原を設計した。
実施例に示されるように、該免疫原を使用して産生された抗体は、ミスフォールドしたオリゴマータウを検出または標的化するのに有用である。
実施例に記載されるように、表２および４に記載される環状ペプチド等の環状化合物、ならびに抗体を産生するために使用される環状コンストラクト、例えばＣＧＧＧＫＬＤＦＧ（配列番号１５（３，１リンカー））、ＣＧＧＧＫＬＤＦＧＧ（配列番号１６（３，２リンカー））およびＣＧＧＧＧＫＬＤＦＧ（配列番号１９（４，１リンカー））が、モノマー種に対するタウのミスフォールドしたオリゴマー種における対応するエピトープの立体配座の違いを把握するために特定された。これは、環状化合物が、モノマータウに提示される配列とは立体配座的に異なる立体配座エピトープを提供する可能性があることを示唆している。
したがって、本開示は、アミノ酸ＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、もしくはＫＬＤＦＫ（配列番号１）からなるタウ、またはその一部、例えばタウのアミノ酸残基３４６～３４７に対応するＦＫもしくはタウのアミノ酸３４５～３４７に対応するＤＦＫにおける立体配座エピトープを同定する。実施例に示されるように、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）またはその一部、例えばＫＬＤＦ（配列番号２）もしくはＬＤＦＫ（配列番号３）は、応力タウフィブリルにおいて無秩序になりやすい領域として同定された。残基ＫＬＤＦ（配列番号２）およびＬＤＦＫ（配列番号３）は、実施例に記載されるような集団座標法を使用する予測において出現した。
一態様は、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）、任意選択でＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）またはＫＬＤＦＫ（配列番号１）の少なくとも３つまたは少なくとも４つのアミノ酸を含むタウペプチドを含む化合物を含む。実施形態では、タウペプチドは、ＫＬＤＦ（配列番号２）、またはＬＤＦＫ（配列番号３）から選択される。
タウペプチドはまた、タウのＫＬＤＦＫ（配列番号１）に対してＮ末端および／もしくはＣ末端のいずれかの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸、または１つ、２つもしくは３つのＮ末端アミノ酸残基を有するそのようなＫＬＤＦの内部配列（配列番号２）、または１つ、２つもしくは３つのＣ末端アミノ酸残基を有するＬＤＦＫ（配列番号３）を含み得る。一実施形態では、タウペプチドは、配列番号１の最大２アミノ酸のＮ末端および／または最大３アミノ酸のＣ末端を含む。
実施形態では、化合物は、リンカーをさらに含む。リンカーは、１つ以上の官能化可能な部分を含み得る。リンカーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９アミノ酸および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分等の同等に機能する分子、ならびに／あるいはそれらの組み合わせを含むことができる。実施形態では、リンカーアミノ酸は、ＧまたはＡ等の非免疫原性または低免疫原性アミノ酸残基から選択され、例えば、リンカーは、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＡＧ、Ｇ（ＰＥＧ）Ｇ、ＰＥＧ－ＰＥＧ（ＰＥＧ２とも称される）－ＧＧ等であり得る。例えば、化合物を薬剤もしくは検出可能なタグ、またはＢＳＡ等の担体、またはＫＬＨ等の免疫原性増強剤に結合するために、官能基を有する１つ以上の官能化可能な部分、例えばアミノ酸を含めることができる。
実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つのアミノ酸を含む。
実施形態では、リンカーは、ＧＣ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＧＣ、ＧＣＧ、またはＰＥＧ２－ＣＧを含む。別の実施形態では、リンカーは、ＧＧＣＧ（配列番号１８６；１，２リンカー）、ＧＣＧＧ（配列番号４３；２，１リンカー）、ＧＣＧ（１，１リンカー）、ＧＣＧＧＧ（配列番号４４；３，１リンカー）、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号４５；リンカー３、２）、ＧＧＧＣＧ（配列番号４６；１，３リンカー）、またはＧＣＧＧＧＧ（配列番号４７；リンカー４、１）を含むか、またはそれらからなる。
実施形態では、リンカーは、ＧＧＣＧ（配列番号１８６；１，２リンカー）を含むか、またはそれからなる。実施形態では、リンカーは、ＧＣＧＧ（配列番号４３；２，１リンカー）を含むか、またはそれからなる。実施形態では、リンカーは、ＧＣＧ（１，１リンカー）を含むか、またはそれからなる。実施形態では、リンカーは、ＧＣＧＧＧ（配列番号４４；３，１リンカー）を含むか、またはそれからなる。実施形態では、リンカーは、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号４５；リンカー３，２）を含むか、またはそれからなる。実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＣＧ（配列番号４６；１，３リンカー）を含むか、またはそれからなる。実施形態では、リンカーは、ＧＣＧＧＧＧ（配列番号４７；リンカー４，１）を含むか、またはそれからなる。他のリンカーは、表２、４および／または７に提供されている（タウペプチドを含むコンストラクトで示されている）。実施形態では、リンカーは、配列番号６５～７４のいずれか１つから選択される配列を含むか、またはそれからなる。
化合物のタンパク質性部分（もしくはリンカーもタンパク質性である化合物）は、固相合成または均質溶液中での合成等のタンパク質の化学でよく知られている技法を使用する化学合成によって調製することができる。
化合物は線形であってもよい。好ましくは、化合物は、Ｋ３４３、Ｌ３４４、Ｄ３４５、Ｆ３４６、および／またはＫ３４７残基のうちの少なくとも１つが、モノマーおよび／またはフィブリルアンサンブルにおける対応する残基よりも、化合物中で交互の立体配座にあるような立体配座化合物である。実施例に示されるように、これは、タウペプチドを含む環状ペプチドを使用して達成することができる。
したがって、一態様は、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）、任意選択でＫＬＤＦ（配列番号２）、またはＬＤＦＫ（配列番号３）の少なくとも４つのアミノ酸を含むタウペプチド、およびリンカーを含む環状化合物を任意選択で提供し、リンカーは、タウペプチドに直接または間接的に共有結合している。実施形態では、化合物は環状化合物である。実施形態では、環状化合物は、本明細書に記載のタウペプチドおよびリンカーを含む。実施形態では、環状化合物は、ＫＬＤＦ（配列番号２）、またはＬＤＦＫ（配列番号３）、および最大６つのタウ残基（例えば、ＫＬＤＦ（配列番号２）もしくはＬＤＦＫ（配列番号３）に対する１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸Ｎおよび／もしくはＣ末端）、およびリンカーを含むタウペプチドを含み、リンカーは、ペプチドのＮ末端残基およびタウペプチドのＣ末端残基に直接または間接的に共有結合している。環状ペプチドの残基の曝露は、モノマーおよび／もしくはフィブリルアンサンブル、または細胞のモノマーおよび／もしくはフィブリル状タウにおいて、対応する残基とは異なり得る。例えば、環状化合物では、Ｋ３４３、Ｌ３４４、Ｄ３４５、Ｆ３４６、および／またはＫ３４７のうちの少なくとも１つは、モノマーアンサンブルで占められている立体配座よりも多くの表面曝露を有する。
ＫＬＤＦ（配列番号２）を含むペプチドが、ＫＬＤＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に対してＮおよび／またはＣ末端であるタウにおいてみられる１つ、２つまたは３つの追加的な残基を含む場合実施形態では、環化された化合物におけるリンカーは、タウの追加的な残基のＮおよび／またはＣ末端に共有結合している。同様に、タウペプチドがＫＬＤＦ（配列番号２）である場合、リンカーは、残基ＫおよびＦに共有結合し、タウペプチドがＬＤＦＫ（配列番号３）である場合、リンカーは残基ＬおよびＫに共有結合し、タウペプチドがＫＬＤＦＫ（配列番号１）である場合、リンカーは、残基ＫおよびＫに共有結合している。
実施形態では、環状化合物は、ＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、またはＫＬＤＦＫ（配列番号１）を含むかまたはそれからなるペプチドと、リンカーとを含み、リンカーは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に結合される。
実施形態では、環状ペプチド（または線状ペプチド）は、表２、４または７に記載の化合物から選択され、任意選択で、環状化合物は、シクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３１）、シクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号４）、シクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３９）、シクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧＧ）（配列番号５）、シクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧＧＧＧ）（配列番号３４）、シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３５）、シクロ（ＣＧＫＬＤＦＧ）（配列番号７）、シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１５）、シクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１９）、シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧＧ）（リンカー３，２を有する配列番号１６）、シクロ（ＣＧＧＬＤＦＫＧ）（配列番号５２）またはシクロ（ＣＧＬＤＦＫＧＧ）（配列番号４９）から選択される。
実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３１）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号４）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３９）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧＧ）（配列番号５）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧＧＧＧ）（配列番号３４）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３５）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＫＬＤＦＧ）（配列番号７）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１５）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１９）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧＧ）（配列番号１６）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＬＤＦＫＧ）（配列番号５２）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＬＤＦＫＧＧ）（配列番号４９）である。
環化ペプチドを作製するための方法は、当該技術分野で知られており、ＳＳ環化またはアミド環化（頭－尾、または骨格環化）を含む。方法については、実施例のセクションでさらに説明する。例えば、そのＮ末端およびＣ末端に「Ｃ」残基、例えば、ＣＧＧＧＫＬＤＦＧＧＣ（配列番号６４）を含むペプチドは、ＳＳ環化によって反応されて、環状ペプチドを産生することができる。環状化合物は、環化前に、タウペプチド、任意にＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、もしくは関連エピトープを含む、例えば、Ｃおよび／もしくはＮ末端タウ配列を含む、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合したリンカーを有する線状分子として合成することができる。あるいは、リンカーの一部は、Ｎ末端に共有結合し、一部は、環化前にＣ末端に共有結合される。いずれの場合も、線状化合物は、例えば、頭－尾環化（例えば、アミド結合環化）で環化される。
実施例に記載されるように、環状化合物は、同定された立体配座エピトープとの関連性について評価され、合成され、免疫原を調製するために使用され、ミスフォールドしたオリゴマータウに選択的な抗体を産生するために使用され得る。本明細書に記載のエピトープＫＬＤＦＫ（配列番号１）、ＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）は、ミスフォールドしたタウの増殖株における潜在的な標的であり得、また立体配座エピトープを認識する抗体は、例えば、そのような増殖株を検出するのに有用であり得る。
前述のように、タウペプチドを含む上記の環状化合物は、例えば抗体を産生するための免疫原として使用することができる。
したがって、別の態様は、本明細書に記載の環状化合物を含む免疫原（例えば免疫原性化合物）を含む。実施形態では、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の免疫原性増強剤を含む。免疫原性増強剤は、アミド結合を介する等して直接、または化学リンカーを介して間接的に化合物に結合させることができる。あるいは、免疫原は、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）であり得る。
免疫原は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｔｅｅｆ ｅｔ ａｌ ２００７に記載の方法を使用して、制限されたタウエピトープペプチドを含む環状化合物を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の免疫原性増強剤またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の担体にコンジュゲートすることによって産生することができる。環状ペプチドは、短縮型狂犬病糖タンパク質（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）等のタンパク質担体にコンジュゲートすることができる。実施形態では、実施例に記載の方法が使用される。
ＩＩＩ．抗体
したがって、本明細書に記載のＫＬＤＦＫ（配列番号１）の任意の３または４アミノ酸残基、例えばタウペプチドＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）またはＫＬＤＦＫ（配列番号１）を含む化合物、特に環状化合物を使用して、当該タウペプチドを含む環状化合物に選択的に結合する、および／またはミスフォールドしたオリゴマータウを含むミスフォールドした形態のタウにも結合する抗体を産生することができる。抗体は、ミスフォールドしたオリゴマータウにおいて、ＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、またはＫＬＤＦＫ（配列番号１）またはその一部に選択的に結合し得る。実施例に示されるように、環状化合物は、モノマータウとは異なり、部分的に折りたたまれていない、または応力繊維状タウ（偏向タウ）に似た１つまたは複数の空間的立体配座を示す。環状ペプチドに対して選択的であり、またミスフォールドしたオリゴマータウに選択的に結合することが予測される前述の化合物を使用して、さらなる抗体を産生することができる。同様に、例えば、ＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、および／または本明細書に記載の他の関連エピトープ配列を含む環状化合物を使用して、ミスフォールドしたオリゴマータウに関連してアクセス可能なこれらの残基におけるエピトープに選択的に結合する抗体を産生することができる。
したがって、化合物、特に本明細書に記載の環状化合物を使用して、それらが含むタウのエピトープに選択的に結合する、および／または本明細書に記載の１つ以上の異なる特徴を含むタウのこれらの残基の特定の立体配座を認識する抗体を産生することができる。
したがって、一態様は、タウ上のエピトープ、ＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、またはＫＬＤＦＫ（配列番号１）を含むかまたはそれらからなるエピトープ、その関連エピトープ、例えばその一部、任意選択で前述のいずれかの立体配座エピトープに選択的に結合する抗体を含む。実施形態では、エピトープがＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、またはＫＬＤＦＫ（配列番号１）からなる場合、それは立体配座エピトープである。
実施形態では、抗体は、立体配座選択的抗体である。実施形態では、抗体は、立体配座選択的ＫＬＤＦＫ（配列番号１）またはその一部に結合する抗体であり、例えば、ＫＬＤＦ（配列番号２）またはＬＤＦＫ（配列番号３）結合抗体である。
実施形態では、抗体は、単離される。
実施形態では、抗体は、モノマータウに特異的に結合しない。選択的結合は、本明細書に記載のように、例えば、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴測定を使用して測定することができる。
したがって、さらなる態様は、ミスフォールドしたオリゴマータウに存在するエピトープ（例えば、立体配座エピトープ）に選択的に結合する抗体であり、エピトープは、配列ＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、もしくはＫＬＤＦＫ（配列番号１）、またはそれらの一部を含むか、またはそれらからなる。
別の実施形態では、エピトープは立体配座エピトープであり、アミノ酸配列ＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、またはＫＬＤＦＫ（配列番号１）からなる。実施形態では、抗体は、環状ペプチド中のＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、またはＫＬＤＦＫ（配列番号１）に選択的に結合し、任意選択で、リンカーは、ＧＧＣＧ（配列番号１８６；１，２リンカー）、ＧＣＧＧ（配列番号４３；２，１リンカー）、ＧＣＧ（１，１リンカー）、ＧＣＧＧＧ（配列番号４４；３，１リンカー）、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号４５；３，２リンカー）、ＧＧＧＣＧ（配列番号４６；１，３リンカー）、ＧＧＧＧＣＧＧ（配列番号６５；２，４リンカー）またはＧＣＧＧＧＧ（配列番号４７；４，１リンカー）または本明細書に記載の他の任意のリンカーのいずれかから選択される。例えば、エピトープＫＬＤＦ（配列番号２）と組み合わされたリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号４５）は、例えばシクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧＧ）（配列番号１６）を生成するであろう。
一実施形態では、抗体は、対応する線状ペプチドと比較して環状化合物に選択的に結合する。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３１）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号４）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３９）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧＧ）（配列番号５）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧＧＧＧ）（配列番号３４）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３５）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＫＬＤＦＧ）（配列番号７）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１５）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１９）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧＧ）（配列番号１６）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＧＬＤＦＫＧ）（配列番号５２）である。実施形態では、環状化合物はシクロ（ＣＧＬＤＦＫＧＧ）（配列番号４９）である。
実施形態では、抗体は、（例えば、モノマー構造アンサンブルと比較した環状化合物中のエピトープの）本明細書に記載の少なくとも１つの代替立体配座特徴を含む本明細書に記載のエピトープペプチドを含む環状化合物に選択的に結合する。例えば、特定のエピトープ立体配座に結合する抗体は、立体配座特異的抗体と呼ばれることがある。立体配座特異的／選択的抗体は、特定のミスフォールドしたオリゴマータウ種を区別して認識することができ、モノマー種と比較して、１つの種または種の群に対してより高い親和性を有し得る。
実施形態では、抗体は、ＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、もしくはＫＬＤＦＫ（配列番号１）またはそれらの一部を含む環状化合物に、任意選択でシクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３５）またはモノマータウに対する表２、４および／もしくは７に記載されている他の環状ペプチド配列に関連して選択的に結合する。例えば、実施形態では、抗体は、環状立体配座でＫＬＤＦＫ（配列番号１）に選択的に結合し、例えば任意選択で本明細書に記載の方法を使用してＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴によって測定されるように、モノマーアンサンブルにおけるＫＬＤＦＫ（配列番号１）と比較して、環状立体配座におけるＫＬＤＦＫ（配列番号１）に対して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍またはそれ以上の選択性（例えば結合親和性）を有する。
実施形態では、抗体は、モノマーアンサンブルに対してエピトープを、または天然のモノマータウに対してタウの種、例えばミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドを含む環状化合物に選択的に結合する。実施形態では、選択性は、タウのモノマーアンサンブルから選択されたタウの種よりも、環状化合物および／またはミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドに対して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍またはそれ以上選択的である。
実施形態では、抗体は、本明細書に記載の環状ペプチドを含む免疫原で免疫することによって生成された。実施形態では、環状ペプチド（または線状ペプチド）は、表２、４または７に記載の化合物から選択され、任意選択で、環状化合物は、シクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３１；リンカー２，１を有する）、シクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号４；リンカー１，１を有する）、シクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３９；リンカー４，１を有する）、シクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧＧ）（配列番号５；リンカー１，２を有する）、シクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧＧＧＧ）（配列番号３４；３，２リンカーを有する）、シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３５；リンカー３，１を有する）、シクロ（ＣＧＫＬＤＦＧ）（配列番号７；リンカー１，１を有する）、シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１５；リンカー３，１を有する）、シクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１９；リンカー４，１を有する）、シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧＧ）（配列番号１６；リンカー３，２を有する）、シクロ（ＣＧＧＬＤＦＫＧ）（配列番号５２；リンカー２，１を有する）またはシクロ（ＣＧＬＤＦＫＧＧ）（配列番号４９；リンカー１、２を有する）から選択される。
実施形態では、抗体は、表１０に記載のクローンの可変領域を有する抗体、および／または表１１に記載のＣＤＲ配列（例えば、ＣＤＲ配列のセット）を有する抗体から選択される。
実施形態では、本明細書に記載の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、当該ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
Figure 2022534406000004
実施形態では、本明細書に記載の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、当該ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
Figure 2022534406000005
実施形態では、本明細書に記載の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、当該ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
Figure 2022534406000006
実施形態では、本明細書に記載の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、当該ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
Figure 2022534406000007
実施形態では、本明細書に記載の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、当該ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
Figure 2022534406000008
実施形態では、本明細書に記載の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、当該ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
Figure 2022534406000009
実施形態では、本明細書に記載の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、当該ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
Figure 2022534406000010
実施形態では、本明細書に記載の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、当該ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含む。

Figure 2022534406000011
実施形態では、本明細書に記載の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、当該ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
Figure 2022534406000012
実施形態では、本明細書に記載の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、当該ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
Figure 2022534406000013
実施形態では、本明細書に記載の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７５および７６；配列番号７７および７８；配列番号７９および８０；配列番号８１および８２；配列番号８３および８４；配列番号８５および８６；配列番号８７および８８；配列番号８９および９０；配列番号９１および９２；もしくは配列番号９３および９４を含み；または、配列番号７５および７６；配列番号７７および７８；配列番号７９および８０；配列番号８１および８２；配列番号８３および８４；配列番号８５および８６；配列番号８７および８８；配列番号８９および９０；配列番号９１および９２；もしくは配列番号９３および９４の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ配列は表１０で下線が引かれている通りである。
モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）は、本明細書に記載の免疫原により免疫付与された対象から採取され、標準的な体細胞融合手順によって骨髄腫細胞と融合され、したがって、本明細書に記載の方法を含んで、これらの細胞を不死化しハイブリドーマ細胞を生じることができる。そのような技法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５）によって最初に開発されたハイブリドーマ技法）、ならびにヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３））、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１：１４０－６７（１９８６））、および組み合わせ抗体ライブラリーのスクリーニング（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５（１９８９））は、当該技術分野で周知である。ハイブリドーマ細胞を、所望のエピトープに選択的に反応的な抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を、単離することができる。
特定の抗原または分子に対して反応性のある特定の抗体または抗体断片はまた、細胞表面成分を有する細菌で発現される免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることによって生成され得る。例えば、完全なＦａｂ断片、ＶＨ領域およびＦＶ領域は、ファージ発現ライブラリーを使用して細菌中で発現させることができる（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１：５４４－５４６（１９８９）、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１（１９８９）、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照）。
ＣＤＲを含む抗体配列は、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマから得られた免疫グロブリン転写物の配列分析によって決定することができる。
さらに、本明細書に記載のエピトープに特異的な抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって容易に単離される。例えば、抗体ファージライブラリーは、疾患特異的エピトープに特異的な抗体断片を同定するために、本開示の疾患特異的エピトープを使用することによって任意にスクリーニングされる。同定された抗体断片を任意に使用して、本開示の異なる実施形態で有用である様々な組換え抗体を産生する。抗体ファージディスプレイライブラリーは、例えば、Ｘｏｍａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を通じて市販されている。抗体ファージライブラリーをスクリーニングするための方法は、当該技術分野で周知である。
一実施形態では、抗体は単鎖抗体である。一実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。さらに別の実施形態では、抗体は単鎖ヒト化抗体である。
本明細書に記載の抗体および例えば検出可能な標識を含む免疫複合体も提供される。そのような抗体は、例えば、インビボで病原性種を検出するために、または血液もしくはその画分もしくはＣＳＦ等の試料中の病原性タウを検出するために使用することができる。例えば、そのような抗体は、病原性タウのレベルを決定することによって、臨床試験における薬効および／または標的の関与を決定するために使用することができる。
ＩＶ．核酸および細胞
さらなる態様は、本明細書に記載の抗体または部分をコードする配列を含む単離された核酸である。例えば、単離された核酸は、表１１に示されるようなＣＤＲ（例えばそこに示されるようなセット）を含む重鎖または軽鎖可変領域をコードする配列を含む。
実施形態では、核酸は、本明細書に記載の抗体またはその一部（例えば、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン等）をコードする配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２もしくは９４のいずれか１つの軽鎖可変ドメインをコードする配列、または配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２もしくは９４のいずれかに１つ対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。実施形態では、軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、配列番号１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２もしくは１７４のいずれか１つの配列、または配列番号１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２もしくは１７４のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１もしくは９３のいずれか１つの重鎖可変ドメインをコードする配列、または配列番号７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１もしくは９３のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。実施形態では、軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、配列番号１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９もしくは１７３のいずれか１つの配列、または配列番号１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９もしくは１７３のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。
重鎖または軽鎖のいずれかをコードする配列を含むそのような核酸は、例えば、単鎖抗体を生成するために使用することができる。
他の実施形態では、核酸は単鎖抗体をコードする。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２もしくは９４のいずれか１つの軽鎖可変ドメインをコードする配列、または配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２もしくは９４のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、および配列番号７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１もしくは９３のいずれか１つの重鎖可変ドメインをコードする配列、または配列番号７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１もしくは９３のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含み、前述のコードされた抗体は、本明細書に記載のオリゴマータウおよび／または環状化合物に結合する。一実施形態では、核酸は、表１０に記載されている抗体の重鎖および軽鎖可変配列をコードする配列、および／または表１１に記載されているＣＤＲ配列を有する配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号１５５および１５６；配列番号１５７および１５８；配列番号１５９および１６０；配列番号１６１および１６２；配列番号１６３および１６４；配列番号１６５および１６６；配列番号１６７および１６８；配列番号１６９および１７０；配列番号：１７１および１７２；もしくは配列番号１７３および１７４の配列、または配列番号１５５および１５６；配列番号１５７および１５８；配列番号１５９および１６０；配列番号１６１および１６２；配列番号１６３および１６４；配列番号１６５および１６６；配列番号１６７および１６８；配列番号１６９および１７０；配列番号：１７１および１７２；もしくは配列番号１７３および１７４に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含み、コードされた抗体は、本明細書に記載のオリゴマータウおよび／または環状化合物に結合する。
表１２に記載されているのは、表１０に記載されている可変ドメインをコードする核酸配列である。実施形態では、核酸は、可変ドメインをコードする配列をコードする核酸を含み、これもまた提供される。
実施形態では、抗体またはその一部をコードする配列を含む核酸は、分泌シグナルペプチドをコードする配列をさらに含む。分泌シグナルペプチドは、天然の分泌シグナルペプチドまたは非天然のシグナル分泌シグナルペプチドであり得る。
一実施形態では、核酸は、分泌シグナルペプチドをコードする配列を含む。例えば、分泌シグナルペプチドは、天然の重鎖シグナルペプチドまたは天然の軽鎖シグナルペプチドであり得る。例示的な重鎖シグナル配列は、ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱ（配列番号１７５）、ＭＥＬＧＬＳＷＩＦＬＬＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号１７６）、ＭＥＬＧＬＲＷＶＦＬＶＡＩＬＥＧＶＱＣ（配列番号１７７）、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号１７８）、ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号１７９）、ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳ（配列番号１８０）、ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号１８１）、ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号１８２）またはＭＤＬＬＨＫＮＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号１８３）を含む／包含する。例示的な軽鎖シグナル配列は、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＳＧＡＲＣ（配列番号１８４）またはＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１８５）が含まれる。
核酸はまた、検出可能なタグ、例えば、一般的に使用される精製タグまたはＨＡ、ＦＬＡＧ、またはＭＹＣ等の検出タグをコードする配列を含み得る。
配列は、コドン最適化され得る、例えば、ヒト細胞における発現のために最適化されたコドンであり得る。
別の態様は、本明細書に記載の核酸を含む発現カセットまたはベクターである。発現カセットは、例えば、抗体をコードする核酸、任意選択で単鎖抗体、および核酸に作動可能に連結されているプロモーター等の調節配列を含むことができる。実施形態では、ベクターは単離されたベクターである。
ベクターは、任意のベクター、好適には本明細書に記載の単鎖抗体を生成するのに適した発現ベクターであり得る。実施形態では、ベクターは、例えば、単鎖抗体（例えば、イントラボディー）を発現するのに好適である。
核酸分子は、タンパク質の発現を確実にする適切な発現ベクターに既知の方法で組み込まれ得る。
可能な発現ベクターは、限定されないが、コスミド、プラズミド、または修飾ウイルス（例えば、レンチウイルスベクターを含む、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む。
一実施形態では、ベクターは、神経細胞を形質導入することができるアデノ随伴ウイルスである（例えば、ＡＡＶ血清型９）。
ベクターは、好適な調節配列を含み得る。
好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫の遺伝子を含む様々な供給源に由来し得る。そのような調節配列の例には、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が含まれる。さらに、トランスフェクト／感染／形質導入される宿主細胞および用いられるベクターに応じて、複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性をもたらす配列等の他の配列が、発現ベクターに組み込まれ得る。実施形態では、調節配列は、神経組織および／または細胞における発現を指示または増加させる。実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。組換え発現ベクターはまた、本明細書に記載の抗体を発現するためのベクターで形質転換、感染、またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含み得る。組換え発現ベクターはまた、例えば、本明細書に記載のタグまたは標識を含む、検出を補助し得る、融合部分または検出可能な標識（例えば、抗体「融合タンパク質」を作製するため）等をコードする他の発現カセットを含み得る。
核酸またはベクターを使用して、本明細書に記載の抗体またはその一部を生成するか、または前述の抗体または結合フラグメント（任意選択で抗体は単鎖抗体である）を細胞内に、例えば細胞内発現の場合には対象の細胞内に、または対象に送達することができる。
ウイルスベクター、「裸の」ＤＮＡ、脂質または他のナノ粒子中のＤＮＡ、アジュバント支援ＤＮＡ、遺伝子銃等を含む、細胞を形質導入するための幅広いアプローチが使用され得る。例えば、レンチウイルスベクター等のレトロウイルスベクターも、細胞を形質導入するために使用され得る。本発明の態様を実施するのに有用な他のベクター系は、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベースのベクターを含む。
別の態様では、本明細書に記載の抗体を発現する細胞も提供される。実施形態では、細胞は、本明細書に記載の抗体を発現するか、または本明細書に開示されるベクターを含む、単離されたおよび／または組換え細胞である。実施形態では、細胞は、ハイブリドーマ等の融合細胞である。実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞等の哺乳動物細胞である。実施形態では、細胞は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎｉ、またはＳ２等の昆虫細胞である。
Ｖ．組成物
さらなる態様は、本明細書に記載の環状化合物、免疫原、免疫複合体、核酸、ベクターまたは抗体を含む組成物である。
実施形態では、組成物は、希釈剤を含む。
抗体またはそれらの断片および／または細胞を含む、ポリペプチドに好適な希釈剤には、限定されないが、生理食塩水、ｐＨ緩衝液、ならびにグリセロール溶液、またはポリペプチドおよび／もしくは細胞を凍結させるのに好適な他の溶液が含まれる。
核酸またはベクターに対して好適な希釈剤は、水、生理食塩水、またはエタノールを含むがこれらに限定されない。
組成物は、核酸および／またはベクターの送達を補助するためのリポソーム、ナノ粒子、またはナノソーム等の脂質粒子を含むことができる。
実施形態では、組成物は、本明細書に記載の核酸またはベクターを含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体またはその一部、および希釈剤を含む。実施形態では、組成物は、無菌組成物である。
組成物は、髄腔内、実質内または脳室内投与用に配合することができる。
実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を含む。実施形態では、組成物は、本明細書に記載の方法のためのものである。
組成物は、本明細書に記載の１つ以上の抗体、免疫複合体、環状化合物、免疫原、細胞、核酸またはベクターを含むことができる。例えば、組成物は、本明細書に記載の２、３、４、またはそれ以上の抗体または結合フラグメント；本明細書に記載の２、３、４、またはそれ以上の免疫複合体；本明細書に記載の２、３、４、またはそれ以上の環状化合物；本明細書に記載の２、３、４、またはそれ以上の免疫原；本明細書に記載の２、３、４、またはそれ以上の細胞；本明細書に記載の２、３、４、またはそれ以上の核酸、または本明細書に記載の２、３、４、またはそれ以上のベクターを含むことができる。
例えば、環状化合物、免疫原、またはそれらのいずれかの組み合わせ（例えば、複数の環状化合物、免疫原またはそれらの混合物を含む）を含む組成物は、免疫原性であり、抗体、例えばオリゴマータウに選択的な抗体の生成を誘導する。したがって、一態様は、環状化合物、免疫原、またはそれらのいずれかの組み合わせ、例えば２、３、４、もしくはそれ以上の環状化合物；２、３、４もしくはそれ以上の免疫原；またはそれらのいずれかの混合物を含む免疫原性組成物を提供する。
本明細書に記載の化合物または免疫原を含む実施形態では、組成物は、アジュバントを含む。
例えば、使用できるアジュバントには、内因性アジュバント（リポ多糖等）が含まれ、通常、ワクチンとして使用される死滅または弱毒化した細菌の成分である。外因性アジュバントは、典型的には、抗原に非共有結合し、宿主の免疫応答を増強するように配合される免疫調節剤である。水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、およびリン酸アルミニウム（総称して一般的にミョウバンと称される）は、アジュバントとして日常的に使用されている。広範囲の外因性アジュバントは、免疫原に対する強力な免疫応答を引き起こし得る。これらは、Ｓｔｉｍｕｌｏｎｓ（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）等のサポニン、または膜タンパク質抗原免疫刺激複合体に複合体化された、ＩＳＣＯＭおよび免疫賦活性複合体およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ等のそこから生成された粒子、鉱油を含むプルロニックポリマー、死滅マイコバクテリアまたは鉱油、完全フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）等の細菌生成物、ならびに脂質Ａ、およびリポソームを含む。
実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムである。別の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。粘膜付着性を有するアジュバントは、ポリマー、例えばカルボポールもしくはアクリル酸（ポリアクリル酸等）を含むもの、例えばＣａｒｂｉｇｅｎ（商標）アジュバント；水中油型アジュバント、例えばＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）アジュバント；ナノ粒子；またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
水中油型乳剤は、スクアレン、落花生油、ＭＦ５９（ＷＯ９０／１４３８７）、ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、ならびにＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（Ｐｈｉｂｒｏ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｒｐ，Ｔｅａｎｅｃｋ，ＮＪ）を含む。水中油型エマルジョンは、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミル－Ｌ－アラニン－２－（１′－２′ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－イソグル－Ｌ－Ａｌａ－ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ－ＤＰＰ）セラミド（ＴＭ））、または他の細菌細胞壁成分等の免疫刺激剤とともに使用され得る。
アジュバントは、単一の組成物として免疫原とともに投与することができる。あるいは、アジュバントは、免疫原の投与の前、同時、および／または後に投与され得る。
実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体および希釈剤を含む。実施形態では、組成物は、無菌組成物である。
本明細書で使用される化合物という用語は、例えば、ペプチド、免疫原、抗体、免疫複合体等を指すことができる。
別の態様は、本明細書に記載の抗体およびタウ（例えば、ミスフォールドしたタウオリゴマーまたは可溶性フィブリル）を含む抗体複合体を含む。複合体は、溶液中であり得る。
ＶＩ．キット
さらなる態様は、滅菌バイアル等のバイアルまたは他のハウジングに含まれる、本明細書に記載のｉ）抗体および／もしくはその結合断片、または該抗体を含む免疫複合体、ｉｉ）核酸、ｉｉｉ）環状および／もしくは線状のペプチドもしくは免疫原、ｉｖ）組成物、あるいはｖ）組換え細胞、ならびに任意選択的に、基準剤および／またはそれらの使用のための命令を含む、キットに関する。
ＶＩＩ．方法
本明細書に記載の化合物、免疫原、核酸、ベクター、抗体、免疫複合体、および抗体を作製するための方法が含まれる。
特に、ＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）または関連するエピトープの立体配座エピトープに対して抗体を選択的にする方法が提供される。この方法は、現在の抗体を作製するための実施例に記載されている１つ以上のステップを含み得る。例えば、この方法は、本明細書に記載の環状化合物もしくは免疫原を対象に投与すること、Ｂ細胞を単離すること、ハイブリドーマ細胞株を調製すること、またはＢ細胞をクローニングすること；ならびに免疫原もしくはオリゴマータウのタウペプチドに対する特異性について細胞株によって生成された抗体を試験すること、例えば、線状化合物に対して環状化合物に提示されるタウペプチドに優先的に結合する抗体を同定すること、および／または非オリゴマータウ（例えばモノマータウ）に対してオリゴマータウのタウペプチドに優先的に結合する抗体を同定することを含み得る。いくつかの実施形態において、抗体配列が決定され、抗体またはそのフラグメントが合成される。
本明細書に記載の環状化合物および選択された好適な特性を有する抗体を使用して、抗体ライブラリーをスクリーニングすることもできる。好適な特性は、本明細書に記載の抗体特性のうちの１つ以上を含む。
さらなる態様は、試験試料がミスフォールドしたオリゴマータウを含むかどうかを検出する方法を提供する。
実施形態では、この方法は、
ａ．試験試料を、抗体：ミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチド複合体を産生することを許容する条件下で、本明細書に記載の抗体または免疫複合体と接触させることと、
ｂ．任意の複合体の存在を検出することと、を含み、
検出可能な複合体の存在は、試験試料がミスフォールドしたタウポリペプチドを含み得ることを示している。
別の実施形態では、この方法は、
ａ．抗体－抗原複合体を産生することを許容する条件下で、該対象の試験試料を本明細書に記載の抗体または免疫複合体と接触させることと、
ｂ．試験試料中の抗体－抗原複合体の量を定量化することと、
ｃ．試験試料中の抗体－抗原複合体の量を対照と比較することと、を含み、
対照と比較して試験試料中の抗体－抗原複合体を検出することは、試料がミスフォールドしたオリゴマータウを含むことを示す。
実施形態では、試験試料は生体試料である。実施形態では、試験試料は、脳組織もしくはその抽出物、唾液、血液、および／または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。実施形態では、試験試料は、ヒト対象から得られる。
いくつかの実施形態では、試験試料は、タウ遺伝子に遺伝子変異を含む対象に由来する。
別の実施形態では、試験試料は、タウオパチーを患っている、または患っている疑いのある対象に由来する。例えば、タウオパチーは、アルツハイマー病（ＡＤ）、ピック病、前頭側頭型認知症または前頭側頭葉変性症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、原発性加齢性タウオパチー、慢性外傷性脳症、亜急性硬化性汎脳炎、前頭側頭型認知症、および染色体１７に関連するパーキンソン病を含む。
フローサイトメトリー、ドットブロット、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、または免疫沈降、続いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ免疫細胞化学または他の検出プラットフォーム（例えば、ＳＩＭＯＡ、ＭＳＤ等）のイムノアッセイを含む、本明細書に記載の抗体を使用して、ミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドが試験試料中に存在するかどうかを決定するために、多くの方法を使用することができる。
実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴を使用して、立体配座特異的結合を評価することができる。
本明細書に記載の標識抗体または免疫複合体を対象に投与して、ミスフォールドしたタウの位置を検出することもできる。測定は、例えば、免疫蛍光抗体法またはＰＥＴトレーサーによるものであってもよい。
この方法はまた、共局在染色、例えばパンタウ染色を含み得る。
さらなる態様は、対象に化合物、免疫原、核酸もしくはベクター、または本明細書に記載の前述のいずれかを含む組成物を投与することを含む、対象において免疫応答を誘導する方法を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、投与された化合物または免疫原に特異的に結合する細胞および／または抗体を単離することを含む。単離された抗体は、実施例に記載される１つ以上のアッセイを使用して試験することができる。
実施例に記載されているように、細胞内タウ凝集体のタウＰＦＦ誘導性形成を阻害または低減する抗体の能力は、細胞蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）アッセイを使用して決定された。Ｈｏｌｍｅｓ，ＢＢらによって報告されているように、ＦＲＥＴアッセイにおけるプロテオパチータウ播種活性は、マウスモデルにおける「タウオパチーの早期かつ安定なマーカー」である。したがって、本明細書で観察されるように、抗体による播種の阻害は、タウの病因を阻害すると予測される。
したがって、さらなる態様は、細胞または組織を、本明細書に開示されるミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドおよび／または可溶性フィブリル、抗体、環状化合物、免疫原、免疫複合体、核酸もしくはベクターを含む細胞または組織と接触させるか、あるいはそれらを細胞または組織に投与することを含む、タウ凝集／凝集体および／または増殖を低減または阻害する方法を含む。
実施形態では、細胞または組織はインビトロである。別の実施形態では、細胞または組織はインビボである。例えば、細胞または組織は、対象、任意選択でヒト対象内にある。例えば、細胞は脳細胞である。例えば、組織は脳組織抽出物および／または脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
本明細書に開示される別の態様は、タウオパチーの治療を必要とする対象におけるタウオパチーを治療する方法であって、本明細書に開示される抗体、環状化合物、免疫原、免疫複合体、核酸もしくはベクター、または前述の抗体、環状化合物、免疫原、免疫複合体、核酸もしくはベクターを含む組成物の有効量を対象に投与することを含む方法に関する。抗体、環状化合物、免疫原、免疫複合体、核酸またはベクターは、例えば髄腔内、実質内もしくは脳室内投与経路を介して、または末梢的に、例えば静脈内、筋肉内、皮内もしくは皮下投与経路を介してＣＮＳに投与され得る。例えば、ベクター化抗体は、ＣＮＳまたは末梢に送達され得る。
実施形態では、タウオパチーは、アルツハイマー病（ＡＤ）、ピック病、前頭側頭型認知症もしくは前頭側頭葉変性症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、原発性加齢性タウオパチー、慢性外傷性脳症、亜急性硬化性汎脳炎、前頭側頭型認知症または染色体１７に関連したパーキンソン病である。
実施形態では、対象は、ヒト対象である。
核酸またはベクターは、例えば、本明細書に記載の組成物に、例えば、薬学的に許容される担体、希釈剤および／もしくは賦形剤と組み合わせて含まれてもよく、ならびに／または、例えば核酸および／もしくはベクターの送達を補助するためのナノ粒子もしくはナノソームに配合されてもよい。
本明細書に記載の組成物、抗体、免疫複合体、核酸および／またはベクターは、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、脳室内、髄腔内、眼窩内、眼科、脊髄内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、または経口投与によって投与することができる。
他の実施形態は、本明細書に記載の組成物、抗体、免疫複合体、核酸および／またはベクターと、血液脳関門を通過する輸送を促進することが知られている生物学的に活性な分子との同時投与を企図している。
特定の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０１２，０６１号「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」に記載されているように、血液脳関門の透過性を一時的に増加させることを目的とするもの等の、血液脳関門を越えて本明細書に記載の組成物、抗体、免疫複合体、核酸および／またはベクターを投与するための方法も企図される。
また、本明細書で企図されるのは、本明細書に記載の１つ以上の抗体の発現のための本明細書に記載の核酸またはベクターの、それを必要とする対象におけるウイルス送達である。一態様は、または任意選択で別のタウオパチー治療と組み合わせて、本明細書に記載の本開示の有効量のベクター化抗体、または前述のベクター化抗体を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象を治療する方法を含む。一実施形態では、ベクター化抗体は、そこに記載されている抗体をコードする核酸を含むウイルスベクターである。一実施形態では、この方法は、それを必要とする対象におけるイントラボディの細胞内発現のためのものである。
例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ９）等のウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター等を使用することができる。非ウイルスベクターもまた使用され得る。ある特定の実施形態では、核酸、ベクターまたは組成物は、脳室内または髄腔内に注射され得る。他の実施形態では、核酸、ベクターまたは組成物は、例えば、分泌された単鎖抗体の持続的生成のためのデポーを使用して、静脈内または皮下または筋肉内に投与され得る。
本明細書に開示される抗体、環状化合物、免疫原、免疫複合体、核酸またはベクターは、タウオパチーに対する併用治療の一部として、それを必要とする対象に投与され得る。実施形態では、治療の方法は、追加の治療とともに本明細書に開示される有効量の抗体を対象に投与することを含む。
実施形態では、追加の治療は、追加の抗体、抗うつ薬（例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤）、抗精神病薬、レボドパ、ドーパミンアゴニスト、および／またはそれらの混合物である。例えば、追加の抗体は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／０７９８３３号、同第２０１７／０７９８３４号、同第２０１７／０７９８３１号、同第２０１７／０７９８３２号、または同第２０１７／０７９８３５号に記載されているように、アミロイドベータに結合する抗体である。
上記の開示は、一般に、本出願を説明している。以下の具体例を参照することによって、より完全な理解を得ることができる。これらの例は、単に説明を目的として説明されており、本出願の範囲を制限することを意図しない。状況が示唆または便宜をもたらす可能性があるため、形態の変化および同等物の代替が企図される。本明細書では特定の用語が用いられているが、そのような用語は、説明的な意味で意図されており、限定を目的とするものではない。
以下の非限定的な実施例は、本開示の例示である。
実施例１
タンパク質（またはペプチド凝集体）に全体座標バイアスを課して、タンパク質（またはペプチド凝集体）をミスフォールドするように強制し、次いで部分的に構造化されていないタンパク質（またはペプチド凝集体）の最も可能性の高いアンフォールドした領域を予測する分子動力学ベースのシミュレーションを使用して、ミスフォールドしたオリゴマータウに選択的または優先的に表示されるエピトープを同定した。バイアスシミュレーションを実施し、各残基に対応する溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）の変化を測定した（検討中のタンパク質の初期フィブリル構造の変化と比較して）。ＳＡＳＡは、Ｈ２Ｏにアクセス可能な表面積を表す。ＳＡＳＡの正の変化（検討中のタンパク質の初期構造の変化と比較して）は、関連する残基インデックスの領域でのアンフォールディングを示しているとみなすことができる。候補エピトープを同定するために、ＳＡＳＡに加えて、他の２つの方法を使用した。これらは、カットオフ長内の非水素原子によって定義されるフィブリル接触の喪失、および構造的アンサンブルの平均に関する偏差の程度を測定する二乗平均平方根変動（ＲＭＳＦ）であり、ここで、いくつかのアミノ酸のＲＭＳＦの増加は、それらのアミノ酸の動力学の増加を示す。
ＮＭＲでしばしば使用されるＬｉｐａｒｉ－Ｓｚａｂｏ Ｓ２オーダーパラメータ［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８２，１０４（１７），ｐｐ ４５４６－４５５９，ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊａ００３８１ａ００９］は、エピトープを同定するためのＲＭＳＦの代替オーダーパラメータとして使用され得る。
方法を、タウフィブリル（ＰＤＢエントリー５Ｏ３Ｌ）に適用した。
タウフィブリルの１０鎖の構造が決定され、ＰＤＢエントリー５Ｏ３Ｌとしてタンパク質データバンクに記載されている。ＰＤＢ ５Ｏ３Ｌ構造、その一部、またはＮ末端とＣ末端の両方で例えば１０アミノ酸によって拡張された各鎖の全配列をコンピュータで平衡化して、平衡アンサンブルを得ることができ、これは、本明細書では「構造化フィブリル」または「タウの非偏向フィブリル構造」、「タウのフィブリルアンサンブル」、「タウの平衡フィブリルアンサンブル」または「タウフィブリル構造アンサンブル」」と様々に呼ばれるタウのフィブリル構造におけるエピトープのフィブリル立体配座のすべての測定に使用された。
モノマーアンサンブルは、例えば、最初に、ＰＤＢフィブリル（５Ｏ３Ｌ）からの鎖のうちの１つを開始構造としてとることによって得ることができる。タウは大きなタンパク質であるため、タウを含む部分を評価した。ヒトタウの残基２９６～３８８が評価に使用された。
次いで、ピボットアルゴリズムを２０回実施して、構成に大きな立体配座変化を引き起こし、そのようにして新しいランダム化された構成を生成する。次いで、ピボットアルゴリズムを再びこの構成で２０回実行して、別のランダム化された構成を生成し、以下同様にして、分子動力学（ＭＤ）シミュレーションの初期構成として使用される複数の異なる展開構造を生成する。次いで、これらの初期構造のそれぞれについて、３ｎｓの平衡化シミュレーションを行う。これらのシミュレーションの一部では、１ｎｓごとにスナップショットを収集した。他のシミュレーションでは、シミュレーションの最後にスナップショット構成を収集した。これらのＭＤシミュレーションの相関時間は一般に１ｎｓ未満であることがわかったため、平衡アンサンブルを生成するには、上記方法の両方が許容される。スナップショットのすべてを蓄積して、７１６６構成（ＫＬＤＦＫ（配列番号１）およびＬＤＦＫ（配列番号３））または５５００構成（ＫＬＤＦ配列番号２）のモノマーアンサンブルを生成した。
シミュレーションは、共に参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／０７９８３６号に記載の集合座標法、ならびにＫ．Ｖａｎｏｍｍｅｓｌａｅｇｈｅ，Ｅ．Ｈａｔｃｈｅｒ，Ｃ．Ａｃｈａｒｙａ，Ｓ．Ｋｕｎｄｕ，Ｓ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓｈｉｍ，Ｅ．Ｄａｒｉａｎ，Ｏ．Ｇｕｖｅｎｃｈ，Ｐ．Ｌｏｐｅｓ，Ｉ．Ｖｏｒｏｂｙｏｖ，ａｎｄ Ａ．Ｄ．Ｍａｃｋｅｒｅｌｌ．Ｃｈａｒｍｍ ｇｅｎｅｒａｌ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ：Ａ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣＨＡＲＭＭ ａｌｌ－ａｔｏｍ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（４）：６７１－６９０，２０１０；およびＰ．Ｂｊｅｌｋｍａｒ，Ｐ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｃｕｅｎｄｅｔ，Ｂ．Ｈｅｓｓ，ａｎｄ Ｅ．Ｌｉｎｄａｈｌ．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＨＡＲＭＭ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ ｉｎ ＧＲＯＭＡＣＳ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｆｒｏｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｍａｐｓ，ｖｉｒｔｕａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ，ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏ．Ｃｏｍｐ．，６：４５９－４６６，２０１０に記載のＣＨＡＲＭＭ力場を用いて、溶媒としてＴＩＰ３Ｐ水を用いて初期フィブリル構造に対し行った。集合座標法は、元の接触の６０％で部分的に無秩序なフィブリル構造を誘発するために、フィブリル構造にグローバルバイアスを適用する。接触は、ＷＯ２０１７／０７９８３６で説明されているように、カットオフ距離内の非水素原子によって定義される。
部分的に無秩序なフィブリル構造は、１００ｎｓの間元の接触の６０％を有するように維持される。これは、国際特許公開第２０１７／０７９８３６に号記載のように、１０回繰り返される。これらのシミュレーションの最後の４９ｎｓは、スナップショット立体配座を得るために使用される。スナップショットが取得される合計シミュレーション時間は約４９０ｎｓである。４２００のスナップショットが均一にサンプリングされ、応力または偏向フィブリルアンサンブルが生成される。
ＰＤＢ５Ｏ３Ｌ構造の表現を図１に示す。図１Ａは、ＰＤＢ ５Ｏ３Ｌに示されるような１０本の鎖を含むタウの概略図であり、図１Ａは、フィブリル構造を部分的に無秩序にするための集合座標偏向後の１０本の鎖を含むタウの概略図である。
ＰＤＢ ５Ｏ３Ｌの構造から開始して３０ｎｓのＭＤシミュレーションを実行した。このシミュレーションから、３０１０のスナップショットが均一にサンプリングされ、フィブリルアンサンブルが得られる。
分析により、応力フィブリルで優先的にアクセス可能であると予測されるエピトープ配列が特定された。
エピトープ予測
応力フィブリルの１０本の鎖すべてを分析したところ、集合座標法に従って展開しやすいいくつかの領域が特定された。
アミノ酸ストレッチ３４４～３４６、３４１～３４９、３４２～３５０、３４４～３４６、３４３～３４６、３４４～３４７、３４５～３４７、３４３～３５２、および３４５～３４７は、偏向圧力下で展開しやすい領域、およびミスフォールドしたオリゴマータウでアクセス可能な候補領域として特定された。評価された基準は、溶媒アクセス可能表面積（ＳＡＳＡ）であったが、ＳＡＳＡは、例えば抗体結合に対してよりアクセス可能であり、タンパク質に埋もれる可能性が低い領域を特定する。
アミノ酸ストレッチ３３７～３４６、３４３～３５０、３４１～３４６、３４２～３４５、３４１～３４５、３４６～３４８、および３４３～３４５は、バイアス圧力下で展開しやすい領域、およびミスフォールドしたオリゴマータウでアクセス可能な候補領域として特定された。評価された基準は、フィブリル接触の数であり、フィブリル接触の喪失は、展開しやすい領域を特定する。
エピトープＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、およびＫＬＤＦＫ（配列番号１）は、集合座標アプローチを使用して、ＰＤＢ構造５Ｏ３Ｌから予測されるエピトープとして出現する。
上で示されたように、タウの残基３３７～３５２内の配列は、ＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳ（配列番号２３）に対応する偏向条件下で優先的に曝露されることが特定された。追加のエピトープは、例えば、任意の４つ以上のアミノ酸ストレッチ、ＥＫＬＤＦＫＤＲ（配列番号２４）、ＫＬＤＦＫＤＲ（配列番号２５）、またはＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶ（配列番号２６）を含む、配列番号２３によって提供される。図２Ａに示されるように、ΔＳＡＳＡ、Δ接触、およびΔＲＭＳＦが一緒に考慮される場合、配列ＫＬＤＦＫ（配列番号１）の残基が最も高い予測強度を有する。より低い閾値を使用して、エピトープはまた、Ｎ末端もしくはＤＲＶ上のＳＥもしくはその一部、あるいはＣ末端上のその一部を含むことができる。
ＫＬＤＦ（配列番号２）は、ＰＤＢ ５Ｏ３Ｌのアミノ酸３４３～３４６に存在し、ＬＤＦＫ（配列番号３）は、アミノ酸３４４～３４７に存在し、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）は、アミノ酸３４３～３４７に存在する。
予測されるエピトープ配列（例えば、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）、ＫＬＤＦ（配列番号２）およびＬＤＦＫ（配列番号３））のＮ－末端およびＣ末端のいずれかの側に１～４つのグリシンを加えることにより、１６の異なる環状ペプチド配列を生成した。コンストラクトをタンパク質（例えばＫＬＨまたはＢＳＡ）につなぐためにシステイン残基が含まれていた。可能な環状ペプチド配列は、シクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号４）、シクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧＧ）（配列番号５）、およびシクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号６）等を含むが、これらに限定されない。これらの１６の配列のそれぞれでＭＤシミュレーションが３００ｎｓ（ＫＬＤＦ（配列番号２）足場では６００ｎｓ）で実行され、２５００のスナップショット立体配座（ＫＬＤＦＫ（配列番号１）もしくはＬＤＦＫ（配列番号３））または６０００環状ペプチドスナップショット立体配座（ＫＬＤＦ（配列番号２））が生成された。
アミノ酸足場（例えばリンカーを含む）にエピトープを含む異なる環状化合物を、本明細書および実施例２に記載のようにエピトープを提示するためのそれらの適合性について評価し、さらなる分析に使用した。
環状ペプチドアンサンブルのエピトープ立体配座と、フィブリルアンサンブルまたはモノマーアンサンブルのいずれかにおけるその立体配座との間の非類似性は、ジェンセン－シャノン距離（ＪＳＤ）を使用することによって定量化することができる。この距離は、アンサンブルの任意の２つの対間の効果的分離を提供し、これは、２つのガウスアンサンブル間の効果的な分離としてリキャストすることができる。そのアンサンブルがタウモノマーのそれとは異なるエピトープＫＬＤＦ（配列番号２）（例えばシクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１９））、および同様にＬＤＦＫ（配列番号３）およびＫＬＤＦＫ（配列番号１）の環状ペプチド足場、ならびに偏向または応力フィブリルにも類似している足場が望ましい。これらの２つの基準、モノマーアンサンブルに対する大きなＪＳＤおよび応力フィブリルアンサンブルに対する小さなＪＳＤを使用して、様々な足場を評価した。
図３Ａ、Ｂ、およびＣは、エピトープＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）、およびＫＬＤＦＫ（配列番号１）の１６の環状ペプチド足場のＪＳＤの散布図を示す。ＸＸのＪＳＤは、２つの１次元ガウス分布間の７．８標準偏差（ＸＸσ）の有効距離に対応する。
実施例２
環状立体配座で同定されたエピトープを提示するために使用できる足場を評価した。
以下の表２は、エピトープを、エピトープおよびシステイン残基に対する可変数のグリシンアミノ酸Ｎ末端およびＣ末端に隣接させることによって得られた、ＫＬＤＦ（配列番号２）のいくつかの環状エピトープ足場を示す。適合性は、環状ペプチドのアンサンブルとタウモノマーの平衡アンサンブルの間、および環状ペプチドのアンサンブルと応力（すなわち偏向）フィブリルの平衡アンサンブルとの間のジェンセン－シャノン（ＪＳＤ）を測定することによって評価される。応力／偏向フィブリルとの類似性が望まれる一方で、モノマーアンサンブルとの非類似性もまた、インビボ機能への干渉を回避するために望まれる。これらの基準に基づいて好適であると予測される環状ペプチド足場を表２に示す。
図３Ａは、ＫＬＤＦ（配列番号２）の１６の環状エピトープ足場に対するこのデータの散布図を示している。
Figure 2022534406000014
Figure 2022534406000015
エピトープＫＬＤＦＫ（配列番号１）およびＬＤＦＫ（配列番号３）に対しても同様の分析を行った。好適な足場を表４に提供する。
Figure 2022534406000016
図３Ｂおよび３Ｃは、それぞれ、ＬＤＦＫ（配列番号３）およびＫＬＤＦＫ（配列番号１）の１６の環状エピトープ足場に対するこのデータの散布図を示している。
Figure 2022534406000017
Figure 2022534406000018
実施例３
予測されるエピトープを含む環状化合物の構築
予測されるエピトープ配列を含む化合物は、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）、ＫＬＤＦ（配列番号２）、またはＬＤＦＫ（配列番号３）等の本明細書に記載のエピトープおよびリンカー配列を含むまたはそれからなる線状ペプチドを作製することによって調製し、環化してシクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧＧ）（配列番号２８）またはシクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧＧＧＧ）（配列番号３４）等の環状化合物を作製することができる。例えば、環状化合物は、線状ペプチドを頭から尾まで環化することによって作製することができる。
例えば、ＫＬＤＦ（配列番号２）またはＬＤＦＫ（配列番号３）等のエピトープ配列を含むペプチドは、好ましくは１、２、３、または４つのアミノ酸、例えばグリシンならびに／またはエピトープ配列に対してＣ末端および／もしくはＮ末端のＰＥＧ単位含むリンカーを用いて合成またはそれにコンジュゲートすることができる。システイン残基または他の官能化可能な残基もまた、リンカーの一部として加えることができる。リンカーがアミノ酸配列で構成されている場合、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成等の既知の方法を単独で、または他の方法と組み合わせて使用して合成することができる。ＰＥＧ分子は、例えば、Ｈａｍｌｅｙ ２０１４［Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１４，１５（５），ｐｐ １５４３－１５５９，ＤＯＩ：１０．１０２１／ｂｍ５００２４６ｗ］およびＲｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ ２０１２［Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６４，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１２，Ｐａｇｅｓ １１６－１２７、Ｍ．Ｊ．ＲｏｂｅｒｔｓＭ．Ｄ．ＢｅｎｔｌｅｙＪ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２５］（各々が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるカップリング化学を使用して、Ｎ末端にアミン基に結合され得る。化合物は、１）ペプチド結合を形成する（例えば、骨格を環化する）ためのペプチド＋リンカーのアミノ末端およびカルボキシ末端、２）ペプチド＋リンカーに側鎖を有するアミノまたはカルボキシ末端、または３）ペプチド＋リンカーの２つの側鎖を共有結合することによって環化することができる。
環状化合物の結合は、すべて通常のペプチド結合（ホモデティック環状ペプチド）であり得るか、またはエステル、エーテル、アミド、もしくはジスルフィド結合（ヘテロデティック環状ペプチド）等の他のタイプの結合を含み得る。
ペプチドは、Ｎ末端もしくはＣ末端で、または例えばシステインおよびホモシステインを含むペプチドの内部で、チオールまたはメルカプタン含有残基の酸化によって環化することができる。例えば、ペプチドに隣接する２つのシステイン残基が酸化されて、ジスルフィド結合を形成し得る。用いることができる酸化試薬には、例えば、酸素（空気）、ジメチルスルホキシド、酸化型グルタチオン、シスチン、塩化銅（ＩＩ）、フェリシアン化カリウム、酢酸トリフルオロタリウム（ＩＩＩ）、または当業者に既知であり得、当業者に既知であるような方法で使用され得る他の酸化試薬が含まれる。
環状ペプチド合成に関連する方法および組成物は、米国特許公開第２００９／０２１５１７２号に記載されている。米国特許公開第２０１０／０２４０８６５号、米国特許公開第２０１０／０１３７５５９号、および米国特許第７，５６９，５４１号は、環化の様々な方法を記載している。他の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／９２４６６号、およびＡｎｄｒｅｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３５：９１－１６９に記載されている。これらの参考文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
前述のように、リンカーは、リンカーに隣接および／または挿入された１つ以上のシステイン残基を含むことができる。ペプチドは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加された非天然システイン残基間にジスルフィド結合を作成することによって、環状立体配座に構造化することができる。
環状ペプチドは、担体、任意にＢＳＡ部分、またはＫＬＨ等の免疫原性増強剤に連結することができる。
本明細書に記載のエピトープ配列を含む線状および環状ペプチドを調製することができる。実施例を表７に提供する。
Figure 2022534406000019
ペプチド合成は、ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ、ＵＳＡ）によって行われる。２－クロロトリチル塩化物樹脂上での標準的な従来のＦｍｏｃに基づく固相ペプチド合成、続いて、樹脂による開裂によって、ペプチドを合成する。エレクトロスプレーＭＳによってペプチド配列を確認し、ＨＰＬＣによって純度を評価して、少なくとも９５％の純度を確認する。環化は、頭－尾（Ｃ－Ｇ）アミド結合を介して実施され得る。非環化線状ペプチドもまた、ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって製造されている。
免疫原の構築
次いで、環状化合物は、例えば、マレイミドベースのカップリング（ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）を介してＫＬＨ（免疫付与用）またはＢＳＡ（スクリーニング用）にコンジュゲートされ得る。
実施例４
環状ペプチド（４，１）シクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１９）、（３，２）シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧＧ）（配列番号１６）および（３，１）シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１５）は、実施例３に記載されるようにＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ、ＵＳＡ）によって調製され、ＫＬＨまたはＢＳＡにコンジュゲートされ、実施例５に記載されるように抗体を生成するために使用された。
実施例５
抗体の生成および選択
連結されたペプチドを、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（本明細書でＩＰＡとして称されるＩｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＬＴＤ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）によって承認されたプロトコルに従って、マウスモノクローナル抗体の産生に使用した。
免疫
簡単に説明すると、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ケベック）を、ＩＰＡのＲａｐｉｄ Ｐｒｉｍｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ手順を使用してＫＬＨコンジュゲート環状ペプチドで免疫した。マウスをＬａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓの換気ラックシステムに収容した。１９日目にすべてのマウスを安楽死させ、ハイブリドーマ細胞株を生成するためにリンパ球を採取した。
融合／ハイブリドーマの開発
リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ １５００）の存在下で、または電気融合を介して、マウスＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させた。融合細胞を、ＨＡＴ選択を使用して培養した。この方法は、半固体のメチルセルロースベースのＨＡＴ選択培地を使用して、ハイブリドーマの選択およびクローニングを１つのステップに組み合わせる。単一細胞由来のハイブリドーマは成長して、半固体培地上でモノクロ－ナルコロニーを形成する。融合イベント後約１０日間、結果として生じたハイブリドーマクローンは、９６ウェルの組織培養プレートに移され、中間ログ成長に到達する（５日間）まで培地を含有するＨＴ中に成長し得る。
ハイブリドーマ分析
ハイブリドーマからの組織培養上清を、抗原（環状ペプチド－ＢＳＡおよび線状ペプチド－ＢＳＡ）のスクリーニング時に間接ＥＬＩＳＡによって試験し、ヤギ抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ二次を使用してＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の両方について調べ、ＴＭＢ基質を用いて発色させた。
陽性培養物を、分泌を確認するために抗原をスクリーニングする際に、無関係な抗原（ヒトトランスフェリン等）上で再試験した。クローンを抗体捕捉ＥＬＩＳＡによってアイソタイプ化して、ＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであるかどうかを決定し、同じエピトープを含む他の環状ペプチド－ＢＳＡコンジュゲート上で間接ＥＬＩＳＡによって試験して、交差反応性を評価した。
アイソタイプ化
ハイブリドーマ抗体は、抗体捕捉実験を使用してアイソタイプ化され得る。捕捉プレートを、１００ｕＬ／ウェルの炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）において、１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）抗体で４℃で一晩コーティングした。１００μｇ／ｍＬで、主な抗体（ハイブリドーマ上清）を加える。二次抗体を、１：５，０００ヤギ抗マウスＩｇＧγ－ＨＲＰまたは１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＭμ－ＨＲＰで、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルで、３７℃で１時間振とうしながら添加した。すべての洗浄ステップを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３０分間行う。暗所で成長させ、等しい体積１ＭのＨＣｌで止めた、基質ＴＭＢを、５０ｕＬ／ウェルで加える。
結果
（４，１）シクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１９）、（３，２）シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧＧ）（配列番号１６）および（３，１）シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号ＩＤ ＮＯ：１５）での免疫により得られた抗体は、ＥＬＩＳＡにより、対応する線状ペプチドに対して、環状ペプチドに選択的に結合した。以下の表８に示されるように、分析された抗体の大部分は環状ペプチドと反応性であり、試験された条件下で対応する線状ペプチドとわずかな、または低い反応性を示した。ほとんどの抗体は、他の環状ペプチドの一方または両方の環状ペプチドと反応した。クローンのサブセットは、それが産生された環状ペプチドとのみ反応した。（ＯＤ＝光学密度）
Figure 2022534406000020
実施例６
抗ミスフォールドオリゴマータウ抗体の特性決定
抗体は、表面プラズモン共鳴を使用して、ミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドならびにモノマータウポリペプチドに結合するそれらの能力について試験した。表面プラズモン共鳴測定は、分子親和性スクリーニングシステム（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。タウモノマー（Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）またはタウオリゴマー（ＳｙｎＡｇｉｎｇ、Ｖａｎｄｏｅｕｖｒｅ－ｌｅｓ－Ｎａｎｃｙ、Ｆｒａｎｃｅ）を高アミン容量センサーチップに固定化し、ハイブリドーマ上清（５０％希釈）を固定化表面に１０μｌ／分で４分間注入し、続いて５分間の解離段階を設けた。マウスＩｇＧ１を陰性対照として使用し、パンタウ反応性抗体を陽性対照として使用した。精製された抗体には逆方向を使用した。ｍＡｂをセンサーチップ（８０００～１２０００ＲＵ）の表面に共有結合的に固定化し、タウモノマーまたはオリゴマーの段階希釈液を表面に注入した。
図４は、固定化されたタウオリゴマーに対するハイブリドーマクローン上清の結合応答（ＲＵ－応答単位）を示す。
図５は、固定化されたタウモノマーに対するハイブリドーマクローン上清の結合応答（ＲＵ－応答単位）を示す。
図６は、各ハイブリドーマクローンのタウオリゴマーおよびモノマーへの結合応答を重ね合わせたものである。
図７は、各ハイブリドーマクローンのタウオリゴマー／タウモノマーに対する結合応答の比を示す。結果は、３つの環状ペプチド足場すべてが、モノマーに対してタウオリゴマーに優先的に結合する複数の抗体クローンを生じさせたことを示している（非選択的パンタウ抗体で得られた１．４の比よりも大きいモノマー結合に対するオリゴマー結合の比）。
以下の表９は、２９のハイブリドーマクローン上清を列挙しており、各ハイブリドーマクローンのタウオリゴマーおよびモノマーに対するそれらの結合応答を示している。
Figure 2022534406000021
図８Ａ－Ｈは、表面に注入された様々な濃度のタウモノマーまたはオリゴマーに対する固定化精製ｍＡｂ（センサーチップ上で約８，０００～１２，０００ＲＵ）の結合応答を示す。図８ＩはＩｇＧ対照を示し、図８Ｊは別の抗タウ抗体、ゴスラネマブまたはＢＩＩＢ０９２を示す。解離段階での注入停止後３０秒で測定された結合応答（ＲＵ）が示されている。
実施例７
生体試料の表面プラズモン共鳴分析
均質化：ヒト神経組織試料を、新鮮な氷冷ＴＢＳ（５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（両方ともＳｉｇｍａ製）およびＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌａｖａｌ ＱＣ Ｃａｎａｄａ製のＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテルで補足された）に浸漬し、組織の最終濃度が１０％（ｗ／ｖ）になるようにした。組織を、機械的プローブホモジナイザーを使用してこの緩衝液中で均質化した（３×３０秒のパルスで間に３０秒の休止があり、すべて氷上で実施される）。次いで、ＴＢＳ均質化した試料を、超遠心分離にかけた（１００，０００ｘｇで９０分間）。上清を収集し、等分して－８０℃で保存した。ＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して決定した。
表面プラズモン共鳴分析：ＡＤ患者からの神経組織試料を分析した。試験抗体、正の対照抗体およびＩｇＧアイソタイプ対照を、センサーチップのフローセルに高密度（約１０，０００ＲＵ）（およそ８，０００～１２，０００ＲＵ）で固定した。希釈した試料（２００μｇタンパク質／ｍｌ）を表面におよそ３００～９００秒間連続して注入した後、緩衝液中で１５０秒間解離させ、表面を再生した。
結果：クローン８Ｇ７（試験ｍＡｂ）、市販のパンタウ抗体（陽性対照）およびマウスＩｇＧ１（陰性対照）の３つの個々のＡＤ脳からの抽出物に対する代表的な結合応答を図９に示す。図１０は、個々のＡＤ脳からの可溶性抽出物（パネルＡ）または３つのＡＤ脳からの可溶性抽出物のプール（パネルＢ）に対する選択されたｍＡｂの結合応答を示している。解離段階での注入停止後３０秒で測定された結合応答（ＢＲＵ）が示されている。
実施例８
ＡＤ脳の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色および免疫蛍光
ＡＤ患者の脳前頭葉の凍結切片を、４～１０μｇ／ｍｌの濃度の試験抗体または対照抗体に曝露する。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＥＣＬ、１：１０００希釈）またはウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ａｂｃａｍ、１：５０００希釈）の添加によって検出する。次いで、ジアミノベジジン（ＤＡＢ）色原体試薬であるＨＲＰ酵素基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を切片に添加して、茶色をもたらす。細胞および細胞核を視覚化するために、切片をヘマトキシリンで対比染色した（青紫色の染色）。免疫蛍光法では、結合した抗体の検出は、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５６８複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、１：１０００の作業濃度でＤＡＰＩ対比染色を用いて実施され得る。
実施例９
タウペプチドを使用した予備形成フィブリルの播種活性の複製および抗体によるプロテオパチータウ播種の阻害
可溶性タウフィブリルに結合する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
タウオリゴマー対モノマーへのより大きな結合を示すハイブリドーマ上清を有する選択された抗体クローン（図６を参照）を精製し、ＳＰＲによって可溶性タウフィブリル（ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）への結合についてアッセイした。可溶性タウフィブリルをセンサーチップのフローセル（約１２００ＲＵ）に固定化し、抗体（１ｕＭ）を表面に約３分間注入し、続いて約５分間解離させた。図１１に示されるように、いくつかの抗体は、可溶性タウフィブリルと交差反応した。
細胞内タウ凝集体を誘導する可溶性の予備形成タウフィブリル（ＰＦＦ）の能力の阻害
タウＰＦＦによるプロテオパチー播種を阻害する抗体の能力を、Ｈｏｌｍｅｓ，ＢＢ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｐａｔｈｉｃ ｔａｕ ｓｅｅｄｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｔａｕｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１１１（４１）：Ｅ４３７６－８５，２０１４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により説明されるように、細胞蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）アッセイを使用して試験した。簡単に説明すると、タウＲＤ Ｐ３０１Ｓ ＦＲＥＴバイオセンサー細胞（ＡＴＣＣ）をタウＰＦＦ（ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑのＴａｕ４４１（２Ｎ４Ｒ）Ｐ３０１Ｓ突然変異体）およびリポフェクタミンに曝露して、播種を誘導した。バイオセンサー細胞は、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）に融合したタウタンパク質および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）に融合したタウタンパク質を安定して発現する。凝集が生じると、これら２つの蛍光標識の近接性により異なる波長で発光が生じ（別個のタンパク質に対して５２６ｎｍ対４７６ｎｍ）、フローサイトメトリーによりシグナルが検出され得る。バイオセンサー細胞を０．６ｕｇ／ｍｌ ＰＦＦ＋リポフェクタミンに曝露し、約２０分後に試験抗体（４００ｎＭ）を添加した。４８時間後に、フローサイトメトリーによるＦＲＥＴ検出を行った。結果は図１２に示され、抗体なしで培養された細胞（１００％播種対照）のＦＲＥＴシグナルのパーセンテージとして表されている。このアッセイでは、タウ抗体の大部分が播種を阻害し、ＦＲＥＴによって検出される細胞内タウ凝集体のレベルが低下した。Ｈｏｌｍｅｓ，ＢＢらによって報告されているように、このアッセイにおけるプロテオパチータウ播種活性は、マウスモデルにおける「タウオパチーの早期かつ安定なマーカー」である。したがって、本明細書で観察されるように、抗体による播種の阻害は、タウの病因を阻害すると予想される。
実施例１０
ＡＤ脳抽出物の播種活性の阻害
ｍＡｂはＡＤ脳播種による凝集の誘導を阻害する
ＡＤ脳ホモジネートの播種活性を阻害するタウｍＡｂの能力を、タウＲＤ Ｐ３０１ＳＦＲＥＴバイオセンサー細胞を使用したＦＲＥＴアッセイで評価した。脳ホモジネート（１０％ｗｔ／ｖｏｌホモジナイズ脳組織からの２０，０００×ｇ上清）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬を使用してバイオセンサー細胞に形質導入し、４８時間後にフローサイトメトリーによってＦＲＥＴシグナルを測定した。
抗体によるＡＤ脳播種の直接阻害を試験する研究では、脳ホモジネート＋／－ｍＡｂ（０．８μＭ）をバイオセンサー細胞に形質導入した。結果は、正規化された統合ＦＲＥＴ密度（ＦＲＥＴ陽性細胞のパーセントにそれらのＦＲＥＴ陽性細胞の蛍光強度中央値を掛けたものとして定義され、ＩｇＧで処理された細胞に対して正規化された）として表され、図１３に示される。予想通り、健康な脳ホモジネートは播種活性を欠いていたが、ＡＤ脳はタウ凝集を誘発してＦＲＥＴシグナルを生成した。試験した３つの抗体（９Ｄ１２、９Ｅ４、８Ｅ１１）は、ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、ＡＤ脳ホモジネートの播種活性を阻害した。
ＡＤ脳抽出物のｍＡｂによる前処理は播種活性を低減する
ＡＤ脳播種に結合して枯渇させる抗体の能力を試験する免疫枯渇研究では、脳ホモジネートをｍＡｂコーティングされた磁気ビーズ（各タウ抗体または対照ＩｇＧの６μｇと共にインキュベートした０．７５ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓタンパク質Ｇ）で３０分間前処理し、ビーズおよび結合したタウ種を除去した後に残った物質をバイオセンサー細胞に形質導入した。結果は、正規化された統合ＦＲＥＴ密度として表される。図１４に示すように、ＡＤ脳ホモジネートを試験した３つの抗体（９Ｄ１２、９Ｅ４、８Ｅ１１）に前曝露すると、ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して播種活性が低下した。
実施例１１
抗体配列決定
配列決定のために１０個のｍＡｂクローンを選択した。配列決定は、Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）によって行った。１０個のハイブリドーマのそれぞれからＲＮＡを抽出してｃＤＮＡにした。ＩｇＧ、ＩｇＫ、およびＩｇＬの可変領域を、５‘ＲＡＣＥ戦略で増幅した。ハイブリドーマ可変領域アンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ次世代シーケンサーによって配列決定した。各ハイブリドーマの読み取りの少なくとも５％を占める抗体配列のみを考慮した。すべてのハイブリドーマは、５％の閾値について検出された１つの優性配列のみを有していた。すべてのハイブリドーマ軽鎖はカッパとして同定された。同定された抗体およびＣＤＲの配列を、以下の表１０および１１に要約する。
Figure 2022534406000022
Figure 2022534406000023
Figure 2022534406000024
Figure 2022534406000025
配列決定データは、配列決定された１０個のハイブリドーマクローンに対して、固有の重鎖ペアリングと軽鎖ペアリングが生成されたことを示している。次のクローンは同じ軽鎖を共有していることが分かった：１２Ｄ１１．１（３，１環状ペプチドに対して産生）および１０．Ｂ１０．１（３，２環状ペプチドに対して産生）；ならびに９Ｅ４．１および１０Ｃ９．１（両方とも３，２環状ペプチドに産生）。
異なる抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を以下に示す。
Figure 2022534406000026
本出願は、現在好ましい例であると考えられるものを参照して説明されているが、本出願は、開示された例に限定されないことを理解されたい。逆に、本出願は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる様々な修正および同等の配置を網羅することを意図している。
すべての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願の各々が、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、例えば、表または他の場所で提供される受託番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含む、本明細書で提供される各受託番号に関連する配列は、参照によりその全体が組み込まれる。
特許請求の範囲は、好ましい実施形態および実施例によって限定されるべきではなく、全体としての説明と一致する最も広い解釈を与えられるべきである。

Claims (51)

  1. ＫＬＤＦＫ（配列番号１）、任意選択でＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）またはＫＬＤＦＫ（配列番号４）の少なくとも４つの残基を含むタウペプチド；およびリンカーを含む環状化合物であって、前記リンカーが、ペプチドＮ末端残基およびＣ末端残基に共有結合している、環状化合物。
  2. 前記タウペプチドが、ＫＬＤＦ（配列番号２）、ＬＤＦＫ（配列番号３）および／またはＫＬＤＦＫ（配列番号１）から選択される、請求項１に記載の環状化合物。
  3. 前記タウペプチドが、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）であるかまたはそれを含む、請求項１に記載の環状化合物。
  4. 前記タウペプチドが、ＫＬＤＦ（配列番号２）および／またはＬＤＦＫ（配列番号３）から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の環状化合物。
  5. 前記リンカーが、１～８個のアミノ酸および／もしくは１つ以上の官能化可能な部分を含むか、またはそれらからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の環状化合物。
  6. リンカーアミノ酸が、アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）から選択され、かつ／または前記官能化可能な部分が、システイン（Ｃ）である、請求項５に記載の環状化合物。
  7. 前記リンカーが、ＧＧＣＧ（配列番号１８６、１，２リンカー）、ＧＣＧＧ（配列番号４３、２，１）、－ＧＣＧ（１，１リンカー）、ＧＣＧＧＧ（配列番号４４；３，１リンカー）、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号４５；３，２リンカー）、ＧＧＧＣＧ（配列番号４６；１，３リンカー）、ＧＧＧＧＣＧＧ（配列番号：６５；２，４リンカー）またはＧＣＧＧＧＧ（配列番号４７；４，１リンカー）を含む、またはそれらからなる、請求項１から６のいずれか一項に記載の環状化合物。
  8. 前記リンカーが、１つ以上のＰＥＧ分子を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の環状化合物。
  9. 環状化合物が、表２または４に記載の環状化合物から選択され、であり、任意選択で、環状化合物が、シクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３１；リンカー２，１を有する）、シクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧ）（リンカー１，１を有する配列番号２７）、シクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３９；リンカー４，１を有する）、シクロ（ＣＧＫＬＤＦＫＧＧ）（配列番号２８；リンカー１，２を有する）、シクロ（ＣＧＧＫＬＤＦＫＧＧＧＧ）（配列番号３４；３，２リンカーを有する）、シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＫＧ）（配列番号３５；リンカー３，１を有する）、シクロ（ＣＧＫＬＤＦＧ）（配列番号７；リンカー１，１を有する）、シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１５；リンカー３，１を有する）、シクロ（ＣＧＧＧＧＫＬＤＦＧ）（配列番号１９；リンカー４，１を有する）、シクロ（ＣＧＧＧＫＬＤＦＧＧ）（リンカー３，２を有する配列番号１６）、シクロ（ＣＧＧＬＤＦＫＧ）（配列番号５２；リンカー２，１を有する）またはシクロ（ＣＧＬＤＦＫＧＧ）（配列番号４９；リンカー１，２を有する）から選択される、請求項１に記載の環状化合物
  10. 任意選択で、請求項１～９のいずれか一項に記載の環状化合物を含む、免疫原。
  11. 前記化合物、任意選択で、環状化合物が、担体タンパク質もしくは免疫原性増強剤に結合し、かつ／または多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）である、請求項１０に記載の免疫原。
  12. 前記担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であるか、または前記免疫原性増強剤が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項１１に記載の免疫原。
  13. 請求項１から９のいずれか一項に記載の化合物または請求項１０から１２のいずれか一項に記載の免疫原および任意選択で希釈剤を含む組成物。
  14. アジュバントを含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記アジュバントが、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである、請求項１４に記載の組成物。
  16. 対応する線状化合物および／もしくはタウモノマーと比較して、請求項１から９のいずれか一項に記載の環状化合物中の前記タウペプチドのエピトープに選択的に結合する、ならびに／または請求項１０から１５のいずれか一項に記載の免疫原もしくは組成物を使用して産生される抗体。
  17. ミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドおよび／または可溶性フィブリルの配座エピトープに結合し、また配座選択的抗体である、請求項１６に記載の抗体。
  18. 前記タウペプチドが、ＫＬＤＦ（配列番号２）またはＬＤＦＫ（配列番号３）を含むか、またはそれからなる、請求項１７に記載の抗体。
  19. 前記タウペプチドおよび／またはエピトープが、ＫＬＤＦＫ（配列番号１）を含むか、またはそれからなる、請求項１７に記載の抗体。
  20. 対応する線形化合物と比較して、前記環状化合物に対して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、または少なくとも４倍選択的である、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の抗体。
  21. モノマータウポリペプチドおよび／または微小管結合タウポリペプチドと比較して、ミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドおよび／または可溶性フィブリルに選択的に結合する、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の抗体。
  22. モノマータウポリペプチドおよび／または微小管結合タウポリペプチドと比較して、ミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドおよび／または可溶性フィブリルに対して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、または少なくとも４倍選択的である、請求項２１に記載の抗体。
  23. 軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、前記軽鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が、以下の配列を含む、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体。
    Figure 2022534406000027
    Figure 2022534406000028
  24. ｉ）配列番号７５に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号７６に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号９５～９７に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、および／あるいは、配列番号７６に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号７６に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号９８～１００に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の抗体。
  25. ｉ）配列番号７７に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号７７に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１０１～１０３に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、および／あるいは、配列番号７８に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号７８に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１０４～１０６に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の抗体。
  26. ｉ）配列番号７９に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号７９に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１０７～１０９に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、および／あるいは、配列番号８０に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８０に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１１０～１１２に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の抗体。
  27. ｉ）配列番号８１に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１１３～１１５に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、および／あるいは、配列番号８２に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１１６～１１８に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の抗体。
  28. ｉ）配列番号８３に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８３に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１１９～１２１に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、および／あるいは、配列番号８４に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８４に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１２２～１２４に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の抗体。
  29. ｉ）配列番号８５に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８５に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１２５～１２７に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、および／あるいは、配列番号８６に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８６に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１２８～１３０に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の抗体。
  30. ｉ）配列番号８７に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８７に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１３１～１３３に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、および／あるいは、配列番号８８に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８８に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１３４～１３６に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の抗体。
  31. ｉ）配列番号８９に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８９に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１３７～１３９に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、および／あるいは、配列番号９０に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９０に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１４０～１４２に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の抗体。
  32. ｉ）配列番号９１に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１４３～１４５に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、および／あるいは、配列番号９２に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１４６～１４８に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の抗体。
  33. ｉ）配列番号９３に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９３に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１４９～１５１に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、および／あるいは、配列番号９４に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号９４に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が配列番号１５２～１５４に記載の通りであるアミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的に置換されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の抗体。
  34. 請求項１６～３３のいずれか一項に記載の抗体および検出可能な標識を含む、免疫複合体。
  35. 請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗体、抗体重鎖可変ドメイン、または抗体軽鎖可変ドメインをコードする核酸。
  36. 前記核酸がｉ）重鎖可変ドメインをコードし、重鎖可変ドメインをコードする前記核酸が、配列番号１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、もしくは１７３のいずれか１つの配列、または配列番号１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、もしくは１７３のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む；ｉｉ）軽鎖可変ドメインをコードし、軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸が、配列番号１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、もしくは１７４のいずれか１つの配列、または配列番号１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、もしくは１７４のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む；あるいはｉｉｉ）重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードし、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸が、それぞれ、配列番号１５５および１５６；配列番号１５７および１５８；配列番号１５９および１６０；配列番号１６１および１６２；配列番号１６３および１６４；配列番号１６５および１６６；配列番号１６７および１６８；配列番号１６９および１７０；配列番号１７１および１７２；もしくは配列番号１７３および１７４の配列、または配列番号１５５および１５６；配列番号１５７および１５８；配列番号１５９および１６０；配列番号１６１および１６２；配列番号１６３および１６４；配列番号１６５および１６６；配列番号１６７および１６８；配列番号１６９および１７０；配列番号：１７１および１７２；もしくは配列番号１７３および１７４に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３５に記載の核酸。
  37. 請求項３５または３６に記載の核酸を含む、ベクター。
  38. ウイルスベクター、任意選択でアデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター、またはレトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターである、請求項３７に記載のベクター。
  39. 請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗体、または請求項３５もしくは３６に記載の核酸を発現する、あるいは請求項３７または３８に記載のベクターを含む細胞。
  40. 哺乳動物細胞、任意選択でＣＨＯ細胞もしくはＨＥＫ－２９３細胞、または昆虫細胞、任意選択でＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎｉ細胞もしくはＳ２細胞から選択される、請求項３９に記載の細胞。
  41. 請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗体、請求項３４の免疫複合体、請求項３５もしくは３６に記載の核酸、請求項３７もしくは３８に記載のベクター、または請求項３９もしくは４０に記載の細胞および任意選択で希釈剤を含む組成物。
  42. 請求項１から９のいずれか一項に記載の化合物、請求項１０から１２のいずれか１つの免疫原、請求項１６から３３のいずれか１つに記載の抗体、請求項３４の免疫複合体、請求項３５もしくは３６に記載の核酸、請求項３７もしくは３８に記載のベクター、または請求項３９もしくは４０に記載の細胞を含むキット。
  43. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の環状化合物の免疫原形態もしくは免疫原、または前記環状化合物の前記免疫原形態もしくは前記免疫原を含む組成物を対象に投与し、投与された前記環状化合物または免疫原中のタウペプチドに選択的な抗体および／または抗体を発現する細胞を単離すること、任意選択で抗体を試験して、モノマータウポリペプチドおよび／または微小管結合タウポリペプチドに対する対応する線状ペプチドおよび／またはミスフォールドしたオリゴマータウおよび／または可溶性フィブリルと比較して前記環状化合物に選択的に結合するかどうかを確認することを含む、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の抗体を作製する方法。
  44. 試験試料がミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドを含むかどうかを決定する方法であって、
    ａ．抗体：ミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチド複合体および／または抗体：可溶性フィブリル複合体を形成することを許容する条件下で、前記試験試料を、請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗体または請求項３４に記載の免疫複合体と接触させることと、
    ｂ．任意の複合体の存在を検出することと、を含み、
    検出可能な複合体の前記存在が、前記試料がミスフォールドしたタウポリペプチドを含み得ることを示している、方法。
  45. 試験試料が、脳組織抽出物および／または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 試験試料がヒト試料である、請求項４４または４５に記載の方法。
  47. 前記複合体を検出することが、前記複合体をｐａｎタウ抗体と接触させることを含む、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. ミスフォールドしたオリゴマータウポリペプチドおよび／または可溶性フィブリルを発現する細胞または組織を、請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗体、請求項３４の免疫複合体、請求項３５もしくは３６に記載の核酸、または請求項３７もしくは３８に記載のベクターと接触させることを含む、タウ凝集／凝集体および／または増殖を低減または阻害する方法。
  49. 細胞または組織が対象においてインビボである、請求項４８に記載の方法。
  50. タウオパチーの治療を必要とする対象におけるタウオパチーを治療する方法であって、請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗体、あるいは前記抗体、請求項３４の免疫複合体、請求項３５もしくは３６の核酸、または請求項３７もしくは３８のベクターを含む組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
  51. 前記タウオパチーが、アルツハイマー病（ＡＤ）、ピック病、前頭側頭型認知症もしくは前頭側頭葉変性症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、原発性加齢性タウオパチー、慢性外傷性脳症、亜急性硬化性汎脳炎、前頭側頭型認知症または染色体１７に関連したパーキンソン病から選択される、請求項５０に記載の方法。
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