JP2022534086A - 新規の網膜色素変性処置 - Google Patents

Abstract

ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部においてｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを改変するための単離または精製されたアンチセンスオリゴマー。本発明の１つの態様では、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部のイントロンの付近または内部の領域に相補的なターゲティング配列を含む１０～５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーを提供する。本発明の別の態様では、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部のエクソンの付近または内部の領域に相補的なターゲティング配列を含む１０～５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーを提供する。

Description

技術分野
本発明は、網膜色素変性の影響を処置、予防、または改善するためのアンチセンスオリゴマーの使用に関する。

背景技術
網膜色素変性（ＲＰ）は、網膜内の桿体光受容細胞の進行性変性によって重度の視力障害を生じる変性眼疾患であり、ほとんどのＲＰは遺伝性である。この網膜ジストロフィーの形態の初期症状は年齢と無関係に出現し；したがって、ＲＰは、早期乳児期から後期成人期までのあらゆる範囲で診断される。ＲＰは、４０００人におよそ１人（全世界で１５０万人超）が罹患する希少疾患である。家族性ＲＰの症例のうち、３０％～４０％が常染色体優性遺伝を示す（Ｈａｒｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２００６）。ＲＰの処置方法は現在のところ存在しない。

ＲＰは、５０を超える遺伝子の変異を原因とする。ＰＲＰＦ３１遺伝子のヘテロ接合体変異により、常染色体優性網膜色素変性（ａｄＲＰ）が生じる。場合によっては、かかる変異は不完全浸透度を示し、ある特定のキャリアは網膜変性を発症する一方で、他のキャリアは全く無症状である。無症候性キャリアは、変異していないＰＲＰＦ３１対立遺伝子の発現が平均より高いことによって疾患から保護されている。

ＰＲＰＦ３１遺伝子の発現は、Ｃｃｒ４－Ｎｏｔデアデニラーゼ複合体によって調節される。Ｃｃｒ４－Ｎｏｔは９つのサブユニットのタンパク質複合体であり、真核細胞における翻訳およびｍＲＮＡ安定性の主要な制御因子である。コアＣＣＲ４－Ｎｏｔ複合体は、酵母においてはＣｃｒ４ｐ、Ｃａｆ１ｐ、５つのＮｏｔタンパク質（ＣＮｏｔ１～ＣＮｏｔ５）、Ｃａｆ４０ｐ、およびＣａｆ１３０ｐからなる。

現在のところ、ＡＡＶ媒介遺伝子置換およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集が、網膜疾患治療として調査されているところである。ＰＲＰＦ３１のコード配列はＡＡＶベクターの能力の範囲内であるが、ＰＲＰＦ３１の未制御または過剰な発現の結果は知られていない。さらに、眼内ウイルスベクター注射の結果としてのセロコンバージョンが報告されているので、ウイルスを媒介する眼科遺伝子治療薬を再投与することができるかどうかは知られていない。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子修正には、各ファミリーのＰＲＰＦ３１変異のために異なる産物が必要である。さらに、遺伝子置換および遺伝子編集アプローチは共に、適切なトランスフェクションを行うためにウイルスベクターを網膜下注射する必要がある。

網膜色素変性のための新規の処置手段または予防手段を提供するか、以前に知られている処置を補完する方法を少なくとも提供する必要がある。

本発明は、網膜色素変性の影響を処置、予防、または改善するための改善された方法または代替法の提供を試みている。

前述の背景技術の考察は、本発明の理解を容易にすることのみを意図している。この考察は、言及したいかなる資料も現在または過去において本出願の優先日の時点での一般的知識の一部であることを認定も承認もするものではない。

発明の要旨
概して、本発明の１つの態様によれば、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部においてｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを改変するための単離または精製されたアンチセンスオリゴマーを提供する。好ましくは、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部において非産生性スプライシングを誘導するための単離または精製されたアンチセンスオリゴマーを提供する。

例えば、本発明の１つの態様では、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部のイントロンの付近または内部の領域に相補的なターゲティング配列を含む１０～５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーを提供する。本発明の別の態様では、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部のエクソンの付近または内部の領域に相補的なターゲティング配列を含む１０～５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーを提供する。

好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーである。好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、改変されたバックボーンを有する。

好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、表１に記載の配列を含む群から選択される。

好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１～７４、より好ましくは、配列番号４、７、９、１１、１４、１６～１８、２７、３０、３４、３５、６４、および６７、さらにより好ましくは、配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４を含むリストから選択される。

アンチセンスオリゴマーは、好ましくは、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部のエクソンのうちの１つまたは複数のスキッピングを誘導するように作用する。例えば、アンチセンスオリゴマーは、エクソン３、８、９、１２、および／または１７のスキッピングを誘導し得る。

本発明のアンチセンスオリゴマーを、選択されたＣＮＯＴ３標的部位に結合することができるアンチセンスオリゴマーであるように選択することができ、ここで、前述の標的部位は、スプライス供与部位、スプライス受容部位、またはエクソンスプライシングエレメントから選択されるｍＲＮＡスプライシング部位である。また、標的部位は、ドナーまたはアクセプターのスプライス部位が標的にされている場合にいくつかの隣接イントロン配列を含み得る。

より具体的には、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１～７４、より好ましくは配列番号４、７、９、１１、１４、１６～１８、２７、３０、３４、３５、６４、および６７、さらにより好ましくは配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４、ならびに／または表１に記載の配列、ならびにその組み合わせもしくはカクテルのうちの任意の１つまたは複数を含む群から選択され得る。これには、スリンジェントなハイブリッド形成条件下でかかる配列とハイブリッド形成することができる配列、その相補配列、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物においてｐｒｅ－ｍＲＮＡプロセシング活性を保有するか調整する改変された塩基、改変されたバックボーン、およびその機能的短縮物または伸長物を含む配列が含まれる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、標的配列と１００％相補的であり得るか、オリゴヌクレオチドと標的配列との間で形成されたヘテロ二重鎖が細胞ヌクレアーゼの作用およびｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る他の分解様式に抵抗するのに十分に安定である限り、例えば、バリアントに順応するためのミスマッチを含み得る。それ故、ある特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間で約または少なくとも約７０％配列相補性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列相補性を有し得る。

また、本発明は、選択された標的に結合してＣＮＯＴ３遺伝子転写物におけるエクソン排除を誘導することができる２またはそれを超えるアンチセンスオリゴマーの組み合わせ（２またはそれを超えるかかるアンチセンスオリゴマーを含む構築物が含まれる）に及ぶ。構築物は、アンチセンスオリゴマーベースの治療のために使用され得る。

本発明は、そのなおさらなる態様によれば、本発明のアンチセンスオリゴマー配列のｃＤＮＡまたはクローン化されたコピー、および本発明のアンチセンスオリゴマー配列を含むベクターに及ぶ。また、本発明は、かかる配列および／またはベクターを含む細胞にさらに及ぶ。

ＣＮＯＴ３遺伝子転写物のスプライシングを操作する方法であって、
ａ）本明細書中に記載のアンチセンスオリゴマーのうちの１つまたは複数を提供し、前記オリゴマー（１つまたは複数）を標的核酸部位に結合させる工程
を含む、方法も提供する。

患者におけるＣＮＯＴ３発現に関する疾患の影響を処置、予防、または改善するための医薬、予防、または治療組成物であって、
ａ）本明細書中に記載の１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーおよび
ｂ）１つまたは複数の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤
を含む、医薬、予防、または治療組成物も提供する。

組成物は、約１ｎＭ～１０００ｎＭの各々の本発明の所望のアンチセンスオリゴマー（１つまたは複数）を含み得る。好ましくは、組成物は、約１０ｎＭ～５００ｎＭ、最も好ましくは１ｎＭと１０ｎＭとの間の各々の本発明のアンチセンスオリゴマー（１つまたは複数）を含み得る。

ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患の影響を処置、予防、または改善する方法であって、
ａ）有効量の本明細書中に記載の１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーまたは１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を患者に投与する工程
を含む、方法も提供する。

ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患の影響を処置、予防、または改善するための医薬の製造のための本明細書中に記載の精製および単離されたアンチセンスオリゴマーの使用も提供する。

患者におけるＣＮＯＴ３発現に関連する疾患の影響を処置、予防、または改善するためのキットであって、本明細書中に記載の少なくとも１つのアンチセンスオリゴマーおよびその組み合わせまたはカクテルを、使用説明書と共に適切な容器に包装された状態で含む、キットも提供する。

好ましくは、患者におけるＣＮＯＴ３発現に関連する疾患は、網膜色素変性である。ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患を有する被験体は、ヒトが含まれる哺乳動物であり得る。

本発明のさらなる態様を、添付の限定されない例および図面を参照して本明細書に記載する。

本発明のさらなる特徴を、以下の本発明のいくつかの非限定的な実施形態の説明においてより詳細に説明する。この説明は、本発明を例証することのみを目的としている。上記の発明の概要、開示、または説明を制限するものと理解されないものとする。以下の添付の図面を参照して説明する：
図１は、ＣＮＯＴ３読み枠の略図である。ＣＮＯＴ３は１８個のエクソンからなり、７５３個のアミノ酸を有するタンパク質をコードする。図１（ａ）インフレームのエクソンを矩形で示し、一方で、コドンに割り込んだジャンクション有するエクソンを山形で示す（青色、赤色）。図１（ｂ）ＣＮＯＴ３タンパク質を表し、上記のエクソンに対応する機能的ドメインおよびアミノ酸の位置を示す。ＮＡＲ：ＮＯＴ係留領域。ＣＳ：連結配列。ＮＯＴボックス：ＴＡＴＡボックス陰性。いずれのエクソン２、３、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、および１６が排除されても、読み取り枠が破壊される。 図２は、２’Ｏ－メチルホスホロチオアートＡＯでのトランスフェクション（５０、２５、および１２．５ｎＭ）の４８時間後のＲＰ１１患者の線維芽細胞由来のＣＮＯＴ３転写産物を示すゲル画像である。既知配列を標的にしない対照ＡＯ（－ｖｅ対照ＡＯ）を、比較のために含めた。 図３は、濃度５０および２５ｎＭで末端イントロン保持を誘導するように設計された２’Ｏ－メチルホスホロチオアートＡＯでのトランスフェクション４８時間後の線維芽細胞由来のＣＮＯＴ３転写産物を示すゲル画像である。 図４Ａは、家系図０２５５である：ＰＲＰＦ３１変異（ｃ．２６７ｄｅｌＡ）を有する１１人のメンバー。図４Ｂは、家系図００８０である：１３人の罹患メンバー（ｃ．１２０５ Ｇ＞Ａ）。矢印＝皮膚線維芽細胞の供与、黒色＝現時点でＣＲＥ自然史研究が行われている患者。 図５Ａ～Ｈは、多能性に再プログラミングされたＣＬＮ３変異を有する患者由来の皮膚線維芽細胞を示す。患者－ｉＰＳＣ（ＣＬＮ３－／－）は、典型的なｉＰＳＣ形態を示し、多能性マーカー（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、およびＳＳＥＡ４が含まれる）を発現した（Ａ）。定量的ＲＴ－ＰＣＲによって６つのｉＰＳＣ系統における多能性遺伝子発現を比較すると、全ての系統について類似の発現パターンが実証された（Ｂ）。患者ｉＰＳＣは、３系列に分化可能であることが実証された。患者ｉＰＳＣ（ＣＬＮ３－ｉＰＳ－ＥＢ）、遺伝子修正された対照ｉＰＳＣ（ＣＬＮ３ＨＤＲ－ｉＰＳ－ＥＢ）、および対照ヒトｉＰＳＣ（ＷＴ－ｉＰＳ－ＥＢ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）は、２週間で胚様体に分化し、次いで、外胚葉系列（ＰＡＸ６、ＯＴＸ１）、中胚葉系列（ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸ２Ａ）、および内胚葉系列（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＦＤＧＦＲ）、ならびに多能性遺伝子（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２）のマーカーの発現について定量的ＲＴ－ＰＣＲによってスクリーニングした（Ｃ）。Ｄ～Ｈ：ｉＰＳＣの網膜分化。網膜オルガノイドは、透明な層状の網膜組織（Ｄ）に囲まれた眼杯様形態を示し、前述の網膜組織は、リカバリンを発現する光受容体の組織化した頂端側の層（Ｅ）および基底側に存在するＳｍｉ３２を発現する網膜神経節細胞（Ｆ）を含んでいた。１７０日目の網膜オルガノイドにおける光受容体外節の電子顕微鏡法（Ｇ）により、発生中の（Ｅ１２０）ヒト網膜（Ｈ）の外節に類似する形態が実証された。 図６は、ＰＳバックボーンに対して２’－Ｏ－メチル化学を使用したＡＯ誘導ＣＮＯＴ３エクソンスキッピングのスクリーニングを示す。ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング中に標的エクソン（１つまたは複数）の排除を媒介してＣＮＯＴ３のノックダウンまたはタンパク質機能の破壊を媒介するために、ＣＮＯＴ３エクソンのスプライスエンハンサーモチーフを標的にするようにＡＯを設計する。皮膚線維芽細胞を、エクソンを標的にするＣＮＯＴ３ ＡＯ（２’ＯＭｅ－ＰＳ化学）で４８時間トランスフェクトした（表示のとおり）。ＲＴ－ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルで分離した。 図６は、ＰＳバックボーンに対して２’－Ｏ－メチル化学を使用したＡＯ誘導ＣＮＯＴ３エクソンスキッピングのスクリーニングを示す。ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング中に標的エクソン（１つまたは複数）の排除を媒介してＣＮＯＴ３のノックダウンまたはタンパク質機能の破壊を媒介するために、ＣＮＯＴ３エクソンのスプライスエンハンサーモチーフを標的にするようにＡＯを設計する。皮膚線維芽細胞を、エクソンを標的にするＣＮＯＴ３ ＡＯ（２’ＯＭｅ－ＰＳ化学）で４８時間トランスフェクトした（表示のとおり）。ＲＴ－ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルで分離した。 図７は、ＰＳバックボーンに対して２’－Ｏ－メチル化学を使用したＡＯ誘導ＣＮＯＴ３エクソンスキッピングのスクリーニングを示す。ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング中に標的エクソン（１つまたは複数）の排除を媒介してＣＮＯＴ３のノックダウンまたはタンパク質機能の破壊を媒介するために、ＣＮＯＴ３エクソンのスプライスエンハンサーモチーフを標的にするようにＡＯを設計する。皮膚線維芽細胞を、エクソンを標的にするＣＮＯＴ３ ＡＯ（２’ＯＭｅ－ＰＳ化学）で４８時間トランスフェクトした（表示のとおり）。ＲＴ－ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルで分離した。 図７は、ＰＳバックボーンに対して２’－Ｏ－メチル化学を使用したＡＯ誘導ＣＮＯＴ３エクソンスキッピングのスクリーニングを示す。ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング中に標的エクソン（１つまたは複数）の排除を媒介してＣＮＯＴ３のノックダウンまたはタンパク質機能の破壊を媒介するために、ＣＮＯＴ３エクソンのスプライスエンハンサーモチーフを標的にするようにＡＯを設計する。皮膚線維芽細胞を、エクソンを標的にするＣＮＯＴ３ ＡＯ（２’ＯＭｅ－ＰＳ化学）で４８時間トランスフェクトした（表示のとおり）。ＲＴ－ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルで分離した。 図８は、ＣＮＯＴ３とＰＲＰＦ３１との間のｍＲＮＡ発現の逆相関を示す。図８（ａ）ＲＰ１１、無症候性、および健常な（ＷＴ）個体由来のｉＰＳＣ由来網膜色素上皮においてＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現に対して正規化したＰＲＰＦ３１およびＣＮＯＴ３のｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。ＲＰ１１および無症候性の被験体は、同一の家系図に由来し、両者はＰＲＰＦ３１ ｃ．１２０５Ｃ＞Ａ（Ｓｅｒ４０２＊）変異のヘテロ接合体である。健常被験体は、無関係の家系に由来する。健常対照におけるＣＮＯＴ３およびＰＲＰＦ３１のｍＲＮＡ発現を、１に設定した（ｎ≧２）。図８（ｂ）ＲＰ１１患者由来の皮膚線維芽細胞を、エクソン４、６、７、または１０を標的にするＣＮＯＴ３ ＡＯ（２’ＯＭｅ－ＰＳ）で４８時間トランスフェクトした。ＰＲＰＦ３１転写物レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して分析し、ＴＢＰ発現に対して正規化した。２５ｎＭの対照ＡＯで処置した細胞におけるＰＲＰＦ３１発現を、１に設定した（ｎ＝１）。図８（ｃ）ＲＰ１１患者由来の皮膚線維芽細胞を、エクソン３、８、９、１６、または１７を標的にするＣＮＯＴ３ ＡＯ（２’ＯＭｅ－ＰＳ化学）で４８時間トランスフェクトした。ＰＲＰＦ３１転写物レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して分析し、ＴＢＰ発現に対して正規化し、２５ｎＭでの偽対照ＡＯで処置した細胞におけるＰＲＰＦ３１発現（１に設定した対照ＰＲＰＦ３１発現）（ｎ＝１）と比較して示す。 図８は、ＣＮＯＴ３とＰＲＰＦ３１との間のｍＲＮＡ発現の逆相関を示す。図８（ａ）ＲＰ１１、無症候性、および健常な（ＷＴ）個体由来のｉＰＳＣ由来網膜色素上皮においてＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現に対して正規化したＰＲＰＦ３１およびＣＮＯＴ３のｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。ＲＰ１１および無症候性の被験体は、同一の家系図に由来し、両者はＰＲＰＦ３１ ｃ．１２０５Ｃ＞Ａ（Ｓｅｒ４０２＊）変異のヘテロ接合体である。健常被験体は、無関係の家系に由来する。健常対照におけるＣＮＯＴ３およびＰＲＰＦ３１のｍＲＮＡ発現を、１に設定した（ｎ≧２）。図８（ｂ）ＲＰ１１患者由来の皮膚線維芽細胞を、エクソン４、６、７、または１０を標的にするＣＮＯＴ３ ＡＯ（２’ＯＭｅ－ＰＳ）で４８時間トランスフェクトした。ＰＲＰＦ３１転写物レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して分析し、ＴＢＰ発現に対して正規化した。２５ｎＭの対照ＡＯで処置した細胞におけるＰＲＰＦ３１発現を、１に設定した（ｎ＝１）。図８（ｃ）ＲＰ１１患者由来の皮膚線維芽細胞を、エクソン３、８、９、１６、または１７を標的にするＣＮＯＴ３ ＡＯ（２’ＯＭｅ－ＰＳ化学）で４８時間トランスフェクトした。ＰＲＰＦ３１転写物レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して分析し、ＴＢＰ発現に対して正規化し、２５ｎＭでの偽対照ＡＯで処置した細胞におけるＰＲＰＦ３１発現（１に設定した対照ＰＲＰＦ３１発現）（ｎ＝１）と比較して示す。 図８は、ＣＮＯＴ３とＰＲＰＦ３１との間のｍＲＮＡ発現の逆相関を示す。図８（ａ）ＲＰ１１、無症候性、および健常な（ＷＴ）個体由来のｉＰＳＣ由来網膜色素上皮においてＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現に対して正規化したＰＲＰＦ３１およびＣＮＯＴ３のｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。ＲＰ１１および無症候性の被験体は、同一の家系図に由来し、両者はＰＲＰＦ３１ ｃ．１２０５Ｃ＞Ａ（Ｓｅｒ４０２＊）変異のヘテロ接合体である。健常被験体は、無関係の家系に由来する。健常対照におけるＣＮＯＴ３およびＰＲＰＦ３１のｍＲＮＡ発現を、１に設定した（ｎ≧２）。図８（ｂ）ＲＰ１１患者由来の皮膚線維芽細胞を、エクソン４、６、７、または１０を標的にするＣＮＯＴ３ ＡＯ（２’ＯＭｅ－ＰＳ）で４８時間トランスフェクトした。ＰＲＰＦ３１転写物レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して分析し、ＴＢＰ発現に対して正規化した。２５ｎＭの対照ＡＯで処置した細胞におけるＰＲＰＦ３１発現を、１に設定した（ｎ＝１）。図８（ｃ）ＲＰ１１患者由来の皮膚線維芽細胞を、エクソン３、８、９、１６、または１７を標的にするＣＮＯＴ３ ＡＯ（２’ＯＭｅ－ＰＳ化学）で４８時間トランスフェクトした。ＰＲＰＦ３１転写物レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して分析し、ＴＢＰ発現に対して正規化し、２５ｎＭでの偽対照ＡＯで処置した細胞におけるＰＲＰＦ３１発現（１に設定した対照ＰＲＰＦ３１発現）（ｎ＝１）と比較して示す。 図９は、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）として合成し、ＲＰ１１ ｉＰＳＣ由来ＲＰＥにトランスフェクトしたＡＳＯ６（配列番号６４、ＣＮＯＴ３＿Ｈ１７Ａ（＋８３＋１０７）、ＣＮＯＴ３エクソン１７を標的にする）の影響を示す。（Ａ）濃度５μＭのＰＭＯ単独または細胞透過性ペプチドタグ化ＰＭＯ（ＰＰＭＯ）で処置した細胞におけるＣＮＯＴ３エクソン１７スキッピング。（Ｂ）ｑＲＴ－ＰＣＲによって判定し、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現に対して正規化したＣＮＯＴ３ノックダウンの結果としてのＰＲＰＦ３１上方制御。無処置対照におけるＰＲＰＦ３１発現を、１に設定した。 図１０は、（Ａ）ＡＳＯ６（配列番号６４、ＣＮＯＴ３＿Ｈ１７Ａ（＋８３＋１０７）、ＣＮＯＴ３エクソン１７を標的にする）でのアンチセンスオリゴマーでの処置または無処置の場合の野生型およびＲＰ１１のＲＰＥにおける繊毛（赤色）および基底小体（緑色）の免疫染色を示す。（Ｂ）１，０００個超の細胞から計数した繊毛を発現するＲＰＥ細胞の百分率。（Ｃ）ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ画像化ソフトウェアを使用した繊毛の長さの測定値。棒グラフは、約３００個の線毛細胞についての平均±ＳＥＭを表す。スケールバー＝１０μｍ。スチューデントｔ検定。^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１０は、（Ａ）ＡＳＯ６（配列番号６４、ＣＮＯＴ３＿Ｈ１７Ａ（＋８３＋１０７）、ＣＮＯＴ３エクソン１７を標的にする）でのアンチセンスオリゴマーでの処置または無処置の場合の野生型およびＲＰ１１のＲＰＥにおける繊毛（赤色）および基底小体（緑色）の免疫染色を示す。（Ｂ）１，０００個超の細胞から計数した繊毛を発現するＲＰＥ細胞の百分率。（Ｃ）ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ画像化ソフトウェアを使用した繊毛の長さの測定値。棒グラフは、約３００個の線毛細胞についての平均±ＳＥＭを表す。スケールバー＝１０μｍ。スチューデントｔ検定。^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１０は、（Ａ）ＡＳＯ６（配列番号６４、ＣＮＯＴ３＿Ｈ１７Ａ（＋８３＋１０７）、ＣＮＯＴ３エクソン１７を標的にする）でのアンチセンスオリゴマーでの処置または無処置の場合の野生型およびＲＰ１１のＲＰＥにおける繊毛（赤色）および基底小体（緑色）の免疫染色を示す。（Ｂ）１，０００個超の細胞から計数した繊毛を発現するＲＰＥ細胞の百分率。（Ｃ）ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ画像化ソフトウェアを使用した繊毛の長さの測定値。棒グラフは、約３００個の線毛細胞についての平均±ＳＥＭを表す。スケールバー＝１０μｍ。スチューデントｔ検定。^＊＊＊ｐ＜０．００１。

発明の説明
発明の詳細な説明
アンチセンスオリゴヌクレオチド
光受容体は、一般的なスプライシング活性の低下に対する脆弱性が高い。スプライシング因子の変異は種々の組織においてスプライシングの欠陥を引き起こし得るが、光受容細胞は、ｍＲＮＡ産生（ロドプシンおよび他の光伝達タンパク質をコードするｍＲＮＡなど）の需要が高いので、大きな影響を受ける。このモデルから、網膜によるｍＲＮＡの産生量が他の組織によるｍＲＮＡの産生レベルを大きく上回ることが推測される。

ＰＲＰＦ３１（ｈＰＲＰ３１としても公知）は、Ｕ４／Ｕ６ ＲＮＡ複合体の組み立ておよび再利用に必要な必須のｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング因子をコードする。いくつかの研究から、ＲＰ１１患者における総ＰＲＰＦ３１ ｍＲＮＡ量の低下、ならびにスプライソソームの組み立ておよびｐｒｅ－ｍＲＮＡプロセシングの遅延が実証された。これは、疾患がハプロ不全機序を介して生じることを示す。他の組織と比較して、網膜は、７倍の主なスプライセオソームの核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を発現する。

ＣＣＲ４－Ｎｏｔ転写複合体サブユニット３（ＣＮＯＴ３、Ｃｃｒ４－Ｎｏｔデアデニラーゼ複合体の５つのＮｏｔタンパク質のうちの１つ）は、転写抑制機序を介してＰＲＰＦ３１変異の浸透度を決定し、そのプロモーターへの直接的な結合によってＰＲＰＦ３１転写を調整する主な変更遺伝子として同定されている。野生型ＰＲＰＦ３１対立遺伝子の発現レベルは、変異ＰＲＰＦ３１対立遺伝子のキャリアが症候性であるかどうかを決定する。無症候性キャリアでは、ＣＮＯＴ３は低レベルで発現され、野生型ＰＲＰＦ３１転写物がより大量に産生されるため、網膜変性の発現が防止される。

ヒトＣＮＯＴ３は、７５３個のアミノ酸を有するタンパク質をコードする１８－エクソン遺伝子である。エクソン２を排除すると、転写物から翻訳開始コドンが除去される。エクソン４、５、６、７、１０、または１７を除去すると、ＣＮＯＴ３の機能的ドメインが破壊され得る。エクソン３、８、９、および１１～１６のいずれかを排除すると、読み取り枠が破壊される。

ＣＮＯＴ３遺伝子は、種々の生理学的過程におけるｍＲＮＡターンオーバーの制御およびｍＲＮＡ分解の制御による細胞周期の進行に極めて重要であるので、ＣＮＯＴ３遺伝子のノックアウトは胎生致死である。しかしながら、ＲＰのリスクが有るか罹患している被験体の眼におけるＣＮＯＴ３のレベルが低下するか、局所的に消失し得る場合、改変されていない遺伝子由来のＰＲＰＦ３１の平均発現量がより多いことによって無症候性キャリアが疾患から保護されるという不完全浸透度モデルを模倣してＰＲＰＦ３１タンパク質量を増加させることができれば、疾患の進行に影響を及ぼす。

したがって、本発明は、ＣＮＯＴ３レベルを低下させ（しかし、除去しないことが好ましい）、それにより正常なＰＲＰＦ３１対立遺伝子由来の転写および翻訳を増加させるために、ＣＮＯＴ３（ＰＲＰＦ３１の負の制御因子）の機能障害タンパク質の非産生性スプライシングを誘導するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

他のアンチセンスオリゴマーに基づいた治療と対照的に、本発明は、ＲＮアーゼＨの動員を介したＲＮＡ分解の増加を誘導せず、ここで、ＲＮアーゼＨは、ＣＮＯＴ３遺伝子のＤＮＡに結合して二重鎖となったＲＮＡに優先的に結合してＲＮＡを分解する。本発明は、複製、転写、転座、および翻訳などの通常の機能を干渉することによってＣＮＯＴ３タンパク質の産生量を調整するために、アンチセンスオリゴマーのＣＮＯＴ３ゲノムＤＮＡへのハイブリッド形成や、アンチセンスオリゴマーのｍＲＮＡへの結合に依存することもない。

むしろ、アンチセンスオリゴマーを、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部におけるｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを改変し、エクソン「スキッピング」および／または末端イントロン保持を誘導するために使用する。このストラテジーは、好ましくは、総タンパク質発現を低下させるか、機能的ドメインを欠くタンパク質を生成し、それにより、タンパク質機能を低下させる。

本発明の第１の態様によれば、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物上の選択された標的に結合して、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部におけるｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを改変することができるアンチセンスオリゴマーを提供する。概して、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部において標的にされたエクソン排除および／または末端イントロン保持を誘導するための単離または精製されたアンチセンスオリゴマーを提供する。

一般集団において、ＰＲＰＦ３１の発現には大きなばらつきがあり、発現レベルは連続分布に従う。発現レベルの任意単位は０．５３から２．４８まで変動し、これは最低発現と最高発現に５倍のばらつきがあることを表す。３０％のＰＲＰＦ３１変異キャリアは無症状であり、これらの個体は、症候性ＰＲＰＦ３１変異を有する個体のほぼ２倍の発現を示す野生型対立遺伝子を有する。したがって、好ましくは、ＣＮＯＴ３発現を調整することにより、症候性ＰＲＰＦ３１変異を有する個体よりＰＲＰＦ３１を少なくとも２倍発現させることが可能である。好ましくは、ＣＮＯＴ３発現を低下させる本発明のＡＯに起因するＰＲＰＦ３１の発現は、症候性ＰＲＰＦ３１変異を有する個体の１．５倍と５倍との間である。例えば、ＰＲＰＦ３１の発現は、２倍と４倍との間であり得る。

「単離された」は、未変性の状態で通常は物質に付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたオリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、天然の状態で隣接する配列から精製されているか除去されているポリヌクレオチドを指し得る（例えば、ゲノム内の断片に隣接する配列から取り除かれたＤＮＡ断片）。用語「単離」は、細胞に関連する場合、細胞（例えば、線維芽細胞、リンパ芽球）の供給元の被験体（例えば、ポリヌクレオチド反復疾患を有する被験体）からの精製を指す。ｍＲＮＡまたはタンパク質の文脈では、「単離」は、供給源（例えば、細胞）からのｍＲＮＡまたはタンパク質の回収を指す。

アンチセンスオリゴマーは、ハイブリッド形成する標的配列「に指向する」または「を標的にする」ということができる。ある特定の実施形態では、標的配列は、プレプロセシングされたｍＲＮＡの３’または５’スプライス部位を含む領域、分岐点、またはスプライシングの制御に関与する他の配列を含む。標的配列は、エクソン内に存在し得るか、イントロン内に存在し得るか、イントロン／エクソンジャンクションにまたがっていてもよい。

ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、標的ＲＮＡ（すなわち、スプライス部位の選択が調整されるＲＮＡ）に対して有効な様式で標的ＲＮＡのある領域（例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）を遮断するのに十分な配列相補性を有する。例示的な実施形態では、ＣＮＯＴ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのかかる遮断は、本来はスプライシングを調整すると考えられるネイティブタンパク質の結合部位をマスキングすることおよび／または標的にされたＲＮＡの構造を変化させることによってスプライシングを調整する働きをする。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、標的ｐｒｅ－ｍＲＮＡ（例えば、ＣＮＯＴ３遺伝子ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）である。

標的ＲＮＡ配列に対して標的ＲＮＡのスプライシングを調整するのに十分な配列相補性を有するアンチセンスオリゴマーは、前述のアンチセンスオリゴマーが、本来は標的にされたＲＮＡのスプライシングを調整し、そして／またはその三次元構造を変化させると考えられるネイティブタンパク質の結合部位のマスキングを誘発するのに十分な配列を有することを意味する。

選択されたアンチセンスオリゴマーは、その配列が標的配列へのハイブリッド形成の際にスプライシングを調整するのに十分に相補的であり、必要に応じて、ＲＮＡとＴｍが４５℃またはそれを超えるヘテロ二重鎖を形成する限り、より短くするか（例えば、約１２塩基）、より長くする（例えば、約５０塩基）ことができ、少数のミスマッチを含むことができる。

好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、表１に記載の配列を含む群から選択される。好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１～７４、より好ましくは配列番号４、７、９、１１、１４、１６～１８、２７、３０、３４、３５、６４、および６７、さらにより好ましくは配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４中の配列を含む群から選択される。

ある特定の実施形態では、標的配列とアンチセンスオリゴマーとの間の相補度は、安定な二重鎖を形成するのに十分である。アンチセンスオリゴマーの標的ＲＮＡ配列との相補性領域は、８～１１塩基の短さであってよいが、１２～１５塩基またはそれを超えることができる（例えば、１０～５０塩基、１０～４０塩基、１２～３０塩基、１２～２５塩基、１５～２５塩基、１２～２０塩基、または１５～２０塩基（これらの範囲の間の全ての整数が含まれる）。約１６～１７塩基のアンチセンスオリゴマーは、一般に、固有の相補配列を有するのに十分な長さである。ある特定の実施形態では、本明細書中に考察されるように、不可欠な結合Ｔｍを得るための最短の相補塩基が必要であり得る。

ある特定の実施形態では、少なくとも最小数の塩基（例えば、１０～１２塩基）が標的配列に相補的である場合、長さが５０塩基のオリゴヌクレオチドは適切であり得る。しかしながら、一般に、細胞への容易なまたは積極的な取り込みのためのオリゴヌクレオチドの長さは約３０塩基未満が最適である。ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）アンチセンスオリゴマーについて、一般に、塩基の長さが１８～２５塩基のときに結合安定性と取り込みとの間で最適なバランスがとれる。約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基からなるアンチセンスオリゴマー（例えば、ＣＰＰＭＯ、ＰＰＭＯ、ＰＭＯ、ＰＭＯ－Ｘ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、２’－ＯＭｅ）が含まれる。

ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、標的配列と１００％相補的であり得るか、オリゴヌクレオチドと標的配列との間で形成されたヘテロ二重鎖が細胞ヌクレアーゼの作用およびｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る他の分解様式に抵抗するのに十分に安定である限り、例えば、バリアントに順応するためのミスマッチを含み得る。それ故、ある特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間で約または少なくとも約７０％配列相補性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列相補性を有し得る。

ミスマッチは、存在する場合、典型的には、ハイブリッド二重鎖の中央よりも末端領域に向かうにつれて不安定性が低下する。許容されるミスマッチ数は、十分に理解された二重鎖安定性の原理にしたがって、オリゴヌクレオチドの長さ、二重鎖内のＧ：Ｃ塩基対の比率、および二重鎖内のミスマッチ（１つまたは複数）の位置に依存する。かかるアンチセンスオリゴマーは必ずしも標的配列と１００％相補的でなくとも、標的ｐｒｅ－ＲＮＡのスプライシングが調整されるように標的配列に安定かつ特異的に結合するのに有効である。

アンチセンスオリゴマーと標的配列との間に形成された二重鎖の安定性は、結合Ｔｍおよび細胞の酵素切断に対する二重鎖の感受性と相関する。相補配列ＲＮＡに関するオリゴヌクレオチドのＴｍを、従来の方法（Ｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８５，ｐｐ．１０７－１０８またはＭｉｙａｄａ Ｃ．Ｇ．ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ Ｒ．Ｂ．，１９８７，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４ ｐｐ．９４－１０７に記載の方法など）によって測定してよい。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、相補配列ＲＮＡに関して、体温より高く、好ましくは、約４５℃または５０℃より高い結合Ｔｍを有し得る。６０～８０℃の範囲またはそれを超えるＴｍも含まれる。

バリアントのさらなる例には、配列番号１～７４のうちのいずれか、より好ましくは配列番号４、７、９、１１、１４、１６～１８、２７、３０、３４、３５、６４、および６７、さらにより好ましくは配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４、または表１に提供した配列の全長に対して約または少なくとも約７０％の配列同一性または相同性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または相同性を有するアンチセンスオリゴマーが含まれる。

より具体的には、選択された標的部位に結合して、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部におけるｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを改変することができるアンチセンスオリゴマーを提供する。アンチセンスオリゴマーは、好ましくは、表１に提供したアンチセンスオリゴマー（すなわち、配列番号１～７４）、より好ましくは配列番号４、７、９、１１、１４、１６～１８、２７、３０、３４、３５、６４、および６７、さらにより好ましくは配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４から選択される。

ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングの改変には、好ましくは、「スキッピング」（すなわち、ｍＲＮＡの１つまたは複数のエクソンまたはイントロンの除去）および／または末端イントロンの保持を誘導する。得られたタンパク質は、親全長ＣＮＯＴ３タンパク質と比較した場合、内部短縮または未成熟の末端化のいずれかに起因してより短い場合があるか、末端イントロンの保持に起因してより長い場合がある。これらのＣＮＯＴ３タンパク質を、非改変ＣＮＯＴ３タンパク質のイソ型と命名する場合がある。

生成されたｍＲＮＡの残存エクソンは、インフレームにあり、元の３’と５’末端との間の領域に内部短縮を有すること以外は、親全長タンパク質に類似する配列を有するより短い配列を産生し得る。別の可能性としては、エクソンスキッピングはフレームシフトを誘導する場合があり、それにより、タンパク質の第１の部分は親全長タンパク質と実質的に同一であるが、タンパク質の第２の部分はフレームシフトに起因して異なる配列（例えば、ナンセンス配列）を有するタンパク質が得られる場合がある。あるいは、エクソンスキッピングは、読み枠の破壊および翻訳が未成熟に終止したことに起因する未成熟に終止したタンパク質の産生を誘導し得る。さらに、アンチセンスオリゴマーは、インフレームで末端イントロンを保持することに起因した人為的に延長したタンパク質を産生し得る。

ＣＮＯＴ３の機能的ドメインには、コイルドコイル、リンカー、ＮＡＲ（Ｎｏｔアンカー領域）、ＣＳ（コネクター配列）、およびＮＯＴボックスが含まれる。エクソン４を排除するとコイルドコイルドメインの一部が除去され、エクソン９が喪失されると読み取り枠が破壊されてｍＲＮＡが分解され、任意のコードされたタンパク質が短縮する。一方で、エクソン１７のスキッピングによってＮＯＴボックスが変化し、複合体形成に影響を及ぼし、それ故、ＣＮＯＴ３機能に影響を及ぼすと予想される。

１つまたは複数のエクソンが除去されると、さらに、ＣＮＯＴ３タンパク質がミスフォールディングし、タンパク質が膜を介して首尾よく輸送される能力が低下し得る。

内部短縮タンパク質（すなわち、１つまたは複数のエクソンによってコードされるアミノ酸を欠くタンパク質）が存在することが好ましい。ＣＮＯＴ３タンパク質がノックアウトされる場合、身体がＣＮＯＴ３タンパク質の総量の低下を相殺しようとするためにＣＮＯＴ３転写を上昇させるという問題が生じ得る。対照的に、転写の上昇を防止するのに内部短縮タンパク質（完全なＣＮＯＴ３タンパク質の特徴のうちの１つまたは複数を欠くことが好ましい）が存在することで十分なはずであるが、機能的ＣＮＯＴ３タンパク質の総量の減少に起因する治療上の利点も得られる。

本発明のアンチセンスオリゴマー誘導エクソンスキッピングは、ＣＮＯＴ３タンパク質の機能を完全に破壊する必要も、実質的に破壊する必要さえもない。好ましくは、エクソンスキッピングプロセスにより、ＣＮＯＴ３タンパク質の機能性が低下するか損なわれる。

アンチセンスオリゴマーを使用した本発明のスキッピングプロセスは、個別のエクソンをスキッピングする場合があるか、２またはそれを超えるエクソンを一度にスキッピングする場合がある。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、選択された標的に結合してＣＮＯＴ３遺伝子転写物におけるエクソン排除を誘導することができる２またはそれを超えるアンチセンスオリゴマーの組み合わせであり得る。組み合わせは、２またはそれを超えるアンチセンスオリゴマーのカクテルおよび／または共に連結した２またはそれを超えるアンチセンスオリゴマーを含む構築物であり得る。

ＣＮＯＴ３遺伝子転写物のスプライシングを操作する方法であって、
ａ）本明細書中に記載のアンチセンスオリゴマーのうちの１つまたは複数を提供し、前記オリゴマー（１つまたは複数）を標的核酸部位に結合させる工程
を含む、方法も提供する。

本発明のさらに別の態様によれば、表１（すなわち、配列番号１～７４からなる群）、より好ましくは配列番号４、７、９、１１、１４、１６～１８、２７、３０、３４、３５、６４、および６７、さらにより好ましくは配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４、ならびにこれらに相補的な配列から選択される核酸配列のＤＮＡ等価物を含むＣＮＯＴ３のスプライス操作のための標的核酸配列を提供する。

コンセンサススプライス部位を完全にマスキングするようにアンチセンスオリゴマーをデザインしても、必ずしも標的にされたエクソンのスプライシングを変化させないかもしれない。さらに、本発明者らは、アンチセンスオリゴマーを設計する場合にアンチセンスオリゴマー自体のサイズまたは長さが常に主因であるわけではないことを発見した。ＩＧＴＡ４エクソン３などのいくつかの標的の場合、２０塩基の短さのアンチセンスオリゴマーは、ある特定の場合には同一のエクソンに指向する他のより長い（例えば、２５塩基）オリゴマーより効率的にいくつかのエクソンスキッピングを誘導することができた。

また、本発明者らは、アンチセンスオリゴマーによって遮断またはマスキングされてスプライシングを再度指示することができるいかなる標準的なモチーフも存在しないようであることを発見した。アンチセンスオリゴマーをデザインし、その個別の有効性を経験的に評価しなければならないことが見出されている。

より具体的には、アンチセンスオリゴマーは、表１に記載のものから選択され得る。配列は、好ましくは、配列番号１～７４、より好ましくは配列番号４、７、９、１１、１４、１６～１８、２７、３０、３４、３５、６４、および６７、さらにより好ましくは配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４、ならびにその組み合わせまたはカクテルのうちのいずれか１つまたは複数のうちのいずれか１つまたは複数からなる群から選択される。これには、ｐｒｅ－ＣＮＯＴ３遺伝子転写物においてｍＲＮＡプロセシング活性を保有するか調整する、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でかかる配列にハイブリッド形成することができる配列、その相補配列、改変された塩基、改変されたバックボーン、およびその機能的短縮物または伸長物を含む配列が含まれる。

オリゴマーとＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、各分子内の十分な数の対応する位置が相互に水素結合することができるヌクレオチドで占められている場合、相互に相補的である。したがって、「特異的にハイブリッド形成可能な」および「相補的な」は、オリゴマーとＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ標的の間に安定かつ特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性または対合を示すために使用される用語である。アンチセンスオリゴマー配列が特異的にハイブリッド形成することができるその標的配列と１００％相補的である必要がないことが当該分野で理解される。化合物の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への結合が標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡ産物の通常の機能に干渉し、かつ相補性の程度が、特異的結合が望まれる条件下で（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療上の処置の場合の生理学的条件下、およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合のアッセイ実施条件下で）アンチセンスオリゴマーの非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分である場合に、アンチセンスオリゴマーは特異的に結合可能である。

選択的ハイブリッド形成は、低、中程度、または高ストリンジェンシー下で可能であるが、高ストリンジェンシー下が好ましい。当業者は、ハイブリッド形成のストリンジェンシーが、塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリッド形成する核酸の間のヌクレオチド塩基のミスマッチ数に加えて、塩濃度、温度、または有機溶媒などの条件に影響を受けることを認識する。ストリンジェントな温度条件には、一般に、３０℃超、典型的には３７℃超、好ましくは４５℃超、好ましくは少なくとも５０℃、典型的には６０℃～８０℃、またはそれを超える温度が含まれる。ストリンジェントな塩条件は、通常は１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満である。しかしながら、任意の単一のパラメーターの基準よりもパラメーターの組み合わせの方がはるかに重要である。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の例は、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））である。したがって、本発明のアンチセンスオリゴマーは、表１に提供した配列（すなわち配列番号１～７４）、より好ましくは配列番号４、７、９、１１、１４、１６～１８、２７、３０、３４、３５、６４、および６７、さらにより好ましくは配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４に選択的にハイブリッド形成するオリゴマーを含み得る。

構造タンパク質内のエクソンの末端のコドンの配置によって常にコドン末端を破壊できるわけではないため、ｍＲＮＡのインフレームでの読み取りを確実にするためにｐｒｅ－ｍＲＮＡから１つを超えるエクソンを欠失させる必要があり得ると認識される。かかる状況において、複数のアンチセンスオリゴマーは、所望のエクソンおよび／またはイントロンの包含を誘導させる異なる領域に各々のアンチセンスオリゴマーを指向させる本発明の方法によって選択される必要があり得る。所与のイオン強度およびｐＨで、Ｔｍは、５０％の標的配列が相補ポリヌクレオチドにハイブリッド形成する温度である。かかるハイブリッド形成は、アンチセンスオリゴマーが標的配列に対して正確な相補性を有する場合だけでなく、「近い」または「実質的な」相補性を有する場合に起こり得る。

典型的には、選択的ハイブリッド形成は、アンチセンスオリゴマーのヌクレオチドと少なくとも約１４ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約５５％同一、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９８％、または９９％同一である場合に生じる。相同性比較のための長さは、記載のように、より長いストレッチにわたる場合があり、ある特定の実施形態では、しばしば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約１２ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２０、しばしば少なくとも約２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド、少なくとも約２５、２６、２７、または２８ヌクレオチド、少なくとも約２９、３０、３１、または３２ヌクレオチド、少なくとも約３６またはそれを超えるヌクレオチドのストレッチにわたる。

したがって、本発明のアンチセンスオリゴマー配列は、好ましくは、本明細書中の配列表に示した配列に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６、８７、８８、８９、または９０％の相同性を有する。より好ましくは、相同性は、少なくとも９１、９２、９３ ９４、または９５％、より好ましくは少なくとも９６、９７、９８％、または９９％である。一般に、アンチセンスオリゴマーの長さが短いほど、選択的にハイブリッド形成させるために必要な相同性は高くなる。それ故に、本発明のアンチセンスオリゴマーが約３０ヌクレオチド未満からなる場合、本明細書中の配列表に記載のアンチセンスオリゴマーと比較して、同一率が７５％超、好ましくは８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５％、９６、９７、９８％、または９９％を超えることが好ましい。ヌクレオチドの相同性比較を、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＢｅｓｔｆｉｔプログラムまたはＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７－３９５）などの配列比較プログラムによって行ってよい。このような方法で、本明細書中に引用した配列と類似するか実質的に異なる長さの配列を、アラインメントにギャップ（かかるギャップは、例えば、ＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって決定される）を挿入することによって比較することができる。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、標的配列と相同性の低い領域、および正確に相同する領域を有し得る。オリゴマーは、その全長にわたって正確な相同性を有する必要はない。例えば、オリゴマーは、標的配列と同一の少なくとも４塩基または５塩基の一続きのストレッチ、好ましくは標的配列と同一の少なくとも６塩基または７塩基の一続きのストレッチ、より好ましくは標的配列と同一の少なくとも８塩基または９塩基の一続きのストレッチを有し得る。オリゴマーは、標的配列と同一の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６塩基のストレッチを有し得る。オリゴマー配列の残りのストレッチは、標的配列と間欠的に同一であってよく；例えば、残りの配列は、同一の塩基を有し、非同一塩基が続き、同一塩基が続き得る。あるいは（または同様に）オリゴマー配列は、完全未満の相同性のストレッチが点在する同一配列（例えば、３、４、５、または６個の塩基）のいくつかのストレッチを有し得る。かかる配列ミスマッチは、好ましくは、スプライススイッチング活性の喪失が全くないか極めて少ない。

用語「調整する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「調整する（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）」には、必要に応じて規定量および／または統計的に有意な量の１つまたは複数の定量可能なパラメーターが「増加する」または「減少する」ことが含まれる。用語「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」もしくは「増加（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」もしくは「増強（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」、または「刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）」もしくは「刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）」は、一般に、１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーまたは組成物が、細胞または被験体において、アンチセンスオリゴマーなしまたは対照化合物のいずれかによって生じる生理学的応答（すなわち、下流効果）と比較して高い応答を生じるか生じさせる能力を指す。用語「減少（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）」または「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」は、一般に、１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーまたは組成物が、細胞または被験体において、アンチセンスオリゴマーなしまたは対照化合物のいずれかによって生じる生理学的応答（すなわち、下流効果）と比較して低い応答を生じるか生じさせる能力を指す。

関連する生理学的応答または細胞応答（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）は当業者に明らかであり、必要とする細胞、組織、または被験体において、ＣＮＯＴ３コードｐｒｅ－ｍＲＮＡ内の特異的エクソンの排除を増加させるか、ＣＮＯＴ３コードｐｒｅ－ｍＲＮＡの量を減少させるか、機能的ＣＮＯＴ３タンパク質の発現を減少させ得る。「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」量または「低下（ｒｅｄｕｃｅｄ）」量は、典型的には、統計的に有意な量であり、アンチセンスオリゴマーが存在しないか（作用因子の不在）または対照化合物を使用した場合の産生量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０分の１、またはそれ未満（例えば、５００、１０００分の１）（その間の１を超える全ての整数および小数点（例えば、１．５、１．６、１．７．１．８が含まれる））の量であり得る。

用語「低下する（ｒｅｄｕｃｅ）」または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」は、一般に、１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーまたは組成物が、診断分野の日常的な技術に従って測定した場合に関連する生理学的応答または細胞応答（本明細書中に記載の疾患または容態の症状など）を「減少させる」能力に関し得る。関連する生理学的応答または細胞応答（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）は、当業者に明らかであり、網膜色素変性などの疾患の症状または病態の緩和が含まれ得る。

応答の「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」は、アンチセンスオリゴマーなしまたは対照組成物によって得られた応答と比較して統計的に有意であり得、減少には、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（その間の全ての整数が含まれる）の減少が含まれ得る。

アンチセンスオリゴマーの長さは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ分子内の意図する位置に選択的に結合することができる限り、変動し得る。かかる配列の長さを、本明細書中に記載の選択手順にしたがって決定することができる。一般に、アンチセンスオリゴマーは、約１０ヌクレオチド長から約５０ヌクレオチド長までである。しかしながら、この範囲内の任意の長さのヌクレオチドを方法で使用してよいと認識される。好ましくは、アンチセンスオリゴマーの長さは、１０と４０との間、１０と３５との間、１５～３０ヌクレオチド長、または２０～３０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２５～３０ヌクレオチド長である。例えば、オリゴマーは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であり得る。

本明細書中で使用される場合、「アンチセンスオリゴマー」は、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合によって核酸塩基がＲＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成して、標的配列内にオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成することが可能な直鎖のヌクレオチド配列またはヌクレオチドアナログ配列を指す。用語「アンチセンスオリゴマー」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」、および「アンチセンス化合物」を、オリゴヌクレオチドを指すために互換的に使用してよい。環状サブユニットは、リボースもしくは別のペントース糖または、ある特定の実施形態では、モルホリノ基（以下のモルホリノオリゴヌクレオチドの説明を参照のこと）に基づき得る。当該分野で公知の数あるアンチセンス作用因子のうちで、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、および２’－Ｏ－メチルオリゴヌクレオチドも意図される。

天然に存在しないアンチセンスオリゴマーまたは「オリゴヌクレオチドアナログ」（（ｉ）改変されたバックボーン構造（例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに見出される標準的なホスホジエステル結合以外のバックボーン）、および／または（ｉｉ）改変された糖部分（例えば、リボース部分またはデオキシリボース部分よりもむしろモルホリノ部分）を有するアンチセンスオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドが含まれる）が含まれる。オリゴヌクレオチドアナログは、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合によって標準的なポリヌクレオチド塩基に水素結合することができる塩基を支持し、ここで、前述のアナログのバックボーンは、オリゴヌクレオチドアナログ分子と標準的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）内の塩基との間で配列特異的にかかる水素結合が可能な塩基を提供する。好ましいアナログは、実質的に不変のリン含有バックボーンを有するアナログである。

アンチセンスオリゴマーの１つの産生方法は、２’ヒドロキシリボース位のメチル化であり、ホスホロチオアートバックボーンを取り込むと、ＲＮＡに見かけ上類似しているが、ヌクレアーゼ分解に対する耐性がはるかに高い分子が産生されるにもかかわらず、当業者は、本発明の目的で使用可能であり得る他の適切なバックボーン形態を承知している。

アンチセンスオリゴマーとの二重鎖形成中のｐｒｅ－ｍＲＮＡの分解を回避するために、方法で使用されるアンチセンスオリゴマーは、内因性ＲＮアーゼＨによる切断を最小にするか防止するように適応され得る。細胞内またはＲＮアーゼＨを含む粗抽出物中のいずれかにおいて非メチル化オリゴマーでＲＮＡを処置するとｐｒｅ－ｍＲＮＡ：アンチセンスオリゴマー二重鎖が分解されるので、この性質は非常に好ましい。かかる分解を迂回するか誘導しないことが可能な任意の形態の改変アンチセンスオリゴマーが本発明で使用され得る。本発明のアンチセンスオリゴマーを、部分不飽和脂肪族炭化水素鎖および１つまたは複数の極性基または荷電基（カルボン酸基、エステル基、またはアルコール基が含まれる）を含むように改変することによってヌクレアーゼ耐性が付与され得る。

ＲＮアーゼＨを活性化しないアンチセンスオリゴマーを、公知の技術（例えば、米国特許第５，１４９，７９７号を参照のこと）にしたがって作製することができる。デオキシリボヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列であり得るかかるアンチセンスオリゴマーは、その１つのメンバーとしてオリゴマーを含む二重鎖分子へのＲＮアーゼＨの結合を立体的に妨害するか防止する任意の構造の改変を簡潔に含み、構造の改変は、二重鎖形成を実質的に妨害も破壊もしない。二重鎖形成に関与するオリゴマー部分はオリゴマー部分へのＲＮアーゼＨ結合に関与する部分と実質的に異なるので、ＲＮアーゼＨを活性化しない多数のアンチセンスオリゴマーが利用可能である。例えば、かかるアンチセンスオリゴマーは、ヌクレオチド間架橋リン酸残基のうちの少なくとも１つまたは全てが改変ホスファート（メチルホスホナート、メチルホスホロチオアート、ホスホロモルホリダート、ホスホロピペラジダート ボラノホスファート、アミド結合、およびホスホルアミダートなど）であるオリゴマーであってよい。例えば、１つおきのヌクレオチド間架橋リン酸残基が記載のように改変されていてよい。別の非限定的な例では、かかるアンチセンスオリゴマーは、ヌクレオチドのうちの少なくとも１つまたは全てが２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ_１～Ｃ_４、直鎖または分岐、飽和または不飽和のアルキル、例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１－プロペニル、２－プロペニル、およびイソプロピルなど）を含む分子である。例えば、１つおきのヌクレオチドが記載のように改変されていてよい。

ＲＮＡと二重鎖形成した場合に細胞ＲＮアーゼＨによって切断されないアンチセンスオリゴマーの一例は、２’－Ｏ－メチル誘導体である。かかる２’－Ｏ－メチル－オリゴリボヌクレオチドは、細胞環境および動物組織において安定であり、ＲＮＡとのその二重鎖のＴｍ値は、そのリボ対応物またはデオキシリボ対応物より高い。あるいは、本発明のヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーは、最後の３’末端ヌクレオチドのうちの少なくとも１つがフッ素化されていてよい。さらに、あるいは、本発明のヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーは、最後の３末端ヌクレオチド塩基のうちの少なくとも２つの間を連結するホスホロチオアート結合を有し、好ましくは、最後の４つの３’末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオアート結合を有する。

別のオリゴヌクレオチド化学を使用してスプライススイッチングを増加さてもよい。例えば、アンチセンスオリゴマーは、以下を含むリストから選択され得る：ホスホルアミダートまたはホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）；ＰＭＯ－Ｘ；ＰＰＭＯ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；ロックド核酸（ＬＮＡ）および誘導体（α－Ｌ－ＬＮＡ、２’－アミノＬＮＡ、４’－メチルＬＮＡ、および４’－Ｏ－メチルＬＮＡが含まれる）；エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）およびその誘導体；ホスホロチオアートオリゴマー；トリシクロ－ＤＮＡオリゴマー（ｔｃＤＮＡ）；トリシクロホスホロチオアートオリゴマー；２’Ｏ－メチル改変オリゴマー（２’－ＯＭｅ）；２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）；２’－フルオロ、２’－フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）；アンロックド核酸（ＵＮＡ）；ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）；２’－アミノ（２’－ＮＨ２）；２’－Ｏ－エチレンアミン、または混合物もしくはギャップマーとしての前述の物質の任意の組み合わせ。送達有効性をさらに改善するために、前述の改変ヌクレオチドは、しばしば、脂肪酸／脂質／コレステロール／アミノ酸／炭水化物／ポリサッカリド／ナノ粒子などを用いて糖部分または核酸塩基部分にコンジュゲートされる。また、これらのコンジュゲートされたヌクレオチド誘導体を使用して、エクソンスキッピングアンチセンスオリゴマーを構築することができる。ヒトＣＮＯＴ３遺伝子転写物のアンチセンスオリゴマー誘導スプライス改変では、一般に、オリゴリボヌクレオチド、ＰＮＡ、ホスホロチオアートバックボーン上の２ＯＭｅまたはＭＯＥ改変塩基のいずれかが使用されている。２ＯＭｅＡＯは、カチオン性リポプレックスとして送達された場合にｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に取り込まれるので、オリゴデザインのために使用されるが、これらの化合物は、ヌクレアーゼ分解に感受性を示し、ｉｎ ｖｉｖｏまたは臨床での適用に理想的とは見なされていない。別の化学を使用して本発明のアンチセンスオリゴマーを生成する場合、本明細書中に提供した配列のウラシル（Ｕ）は、チミン（Ｔ）に置換され得る。

上記のアンチセンスオリゴマーは本発明のアンチセンスオリゴマーの好ましい形態であるが、本発明には、他のオリゴマーアンチセンス分子（下記などのオリゴマー模倣物が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。

本発明で有用な好ましいアンチセンスオリゴマーの具体例には、改変されたバックボーンまたは非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴマーが含まれる。本明細書中で定義するように、改変されたバックボーンを有するオリゴマーには、バックボーン内にリン原子を保持するオリゴマーおよびバックボーン内にリン原子を持たないオリゴマーが含まれる。本明細書の目的のために、当該分野で時折参照されるように、ヌクレオシド間バックボーン内にリン原子を持たない改変オリゴマーを、アンチセンスオリゴマーとみなすこともできる。

他の好ましいオリゴマー模倣物では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方（すなわち、バックボーン）が新規の基と置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリッド形成のために維持される。１つのかかるオリゴマー化合物（優れたハイブリッド形成特性を有することが示されているオリゴマー模倣物）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれている。ＰＮＡ化合物では、オリゴマーの糖バックボーンが、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンに置換されている。核酸塩基は、保持され、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。

別の好ましい化学はホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）オリゴマー化合物であり、これはいかなる公知のヌクレアーゼやプロテアーゼによっても分解されない。これらの化合物は不変であり、ＲＮＡ鎖に結合した場合にＲＮアーゼＨ活性を活性化せず、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後にスプライス改変を維持することが示されている（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７，１８７－１９７）。

また、改変されたオリゴマーは、１つまたは複数の置換された糖部分を含み得る。また、オリゴマーは、核酸塩基（しばしば当該分野で簡潔に「塩基」と呼ばれる）の改変または置換を含み得る。ある特定の核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６、およびＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンが含まれる）が含まれる。５－メチルシトシン置換は、さらにより具体的には２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃増加させることが示されている。

本発明のオリゴマーの別の改変は、オリゴマーの活性、細胞分布、または細胞取り込みを向上させる１つまたは複数の部分またはコンジュゲートのオリゴマーへの化学的連結を含む。かかる部分には、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホナート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、ミリスチル、もしくはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。

細胞取り込みおよび核局在化を強化するために、細胞透過性ペプチドがホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーに付加されている。Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６ ９，１６２４－１６２９に示すように、異なるペプチドタグは、取り込み効率および標的組織特異性に影響を及ぼすことが示されている。

所与の化合物内の全ての位置が一様に改変される必要はなく、実際は、１つを超える前述の改変が、単一の化合物内、またはオリゴマー内の単一のヌクレオシドに取り込まれ得る。また、本発明は、キメラ化合物であるアンチセンスオリゴマーを含む。「キメラ」アンチセンスオリゴマーまたは「キメラ」は、本発明の文脈において、アンチセンスオリゴマー、特に、２またはそれを超える化学的に異なる領域を含み、前述の領域の各々が少なくとも１つのモノマー単位（すなわち、オリゴマー化合物の場合のヌクレオチド）で構成されているオリゴマーである。これらのオリゴマーは、典型的には、オリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーがヌクレアーゼ分解耐性、細胞取り込みを増大するようにオリゴマーが改変された少なくとも１つの領域、および標的核酸に対する結合親和性を増加させるためのさらなる領域を含む。

アンチセンスオリゴマーおよびそのバリアントの活性を、当該分野の日常的技術にしたがってアッセイすることができる。例えば、調査されるＲＮＡおよびタンパク質のスプライス形態および発現レベルは、転写された核酸またはタンパク質のスプライス形態および／または発現を検出するための多種多様の周知の方法のうちのいずれかによって査定され得る。かかる方法の非限定的な例には、ＲＮＡのスプライシングされた形態のＲＴ－ＰＣＲとその後のＰＣＲ産物のサイズ分離、核酸ハイブリッド形成法（例えば、ノーザンブロットおよび／または核酸アレイの使用）；核酸増幅法；タンパク質の免疫学的検出方法；タンパク質精製方法；およびタンパク質の機能または活性のアッセイが含まれる。

ＲＮＡ発現レベルを、細胞、組織、または生物からのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写されたポリヌクレオチド）の調製、およびアッセイされる核酸の相補物またはその断片である基準ポリヌクレオチドとのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡのハイブリッド形成によって査定することができる。ｃＤＮＡを、必要に応じて、相補ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成前に種々のポリメラーゼ連鎖反応またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法のうちのいずれかによって増幅させることができるが、増幅されないことが好ましい。また、１つまたは複数の転写物の発現を、定量的ＰＣＲを使用して検出して、転写物（１つまたは複数）の発現レベルを査定することができる。

本発明は、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物のアンチセンスオリゴマー誘導スプライススイッチング、臨床的に関連するオリゴマー化学、およびＣＮＯＴ３スプライス操作を臨床レベルに仕向けるための送達系を提供する。全長ＣＮＯＴ３ ｍＲＮＡ量の実質的な減少、それによるＣＮＯＴ３遺伝子転写由来のＣＮＯＴ３タンパク質量の実質的な減少は、以下によって達成される：
１）（ｉ）イントロン－エンハンサー標的モチーフ、（ｉｉ）アンチセンスオリゴマーの長さおよびオリゴマーカクテルの開発、（ｉｉｉ）化学の選択、および（ｉｖ）オリゴマー送達を向上させるための細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の付加の実験での査定による、線維芽細胞の細胞株を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏでのオリゴマーの改良；および
２）１つまたは複数のエクソンが喪失したＣＮＯＴ３転写物を生成するための新規のアプローチの詳細な評価。

そのようなものとして、特異的アンチセンスオリゴマーを用いてＣＮＯＴ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのプロセシングを操作することができることを本明細書中で実証している。この方法では、ＣＮＯＴ３タンパク質量を機能的に有意に減少させることができ、それにより、網膜色素変性に関連する重度の病態を軽減することができる。

本発明にしたがって使用されるアンチセンスオリゴマーは、都合の良いことに、周知の固相合成技術によって作成され得る。かかる合成装置は、いくつかの販売者（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）が含まれる）から販売されている。修飾固体支持体上でのオリゴマーの１つの合成方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。

当該分野で公知のかかる合成の任意の他の手段を、追加でまたは代わりに使用してよい。ホスホロチオアートおよびアルキル化誘導体などのオリゴマーを調製するための類似の技術を使用することが周知である。１つのかかる自動化された実施形態では、ジエチル－ホスホルアミダイトを出発物質として使用し、Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９－１８６２に記載のように合成してよい。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、生物起源のアンチセンス組成物や、アンチセンスオリゴマーのｉｎ ｖｉｖｏ合成のためにデザインされた遺伝子ベクター構築物を含まない。また、本発明の分子を、例えば、リポソーム、受容体を標的にする分子などとして他の分子、分子構造物、または化合物の混合物と混合するか、コンジュゲートするか、そうでなければ会合させてもよい。

アンチセンスオリゴマーは、経口、局所、非経口、または他の送達、特に、局所的な眼への送達および注射による眼への送達のために処方され得る。製剤は、送達部位または活性部位での取り込み、分布、および／または吸収を補助するために製剤化され得る。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ＣＮＯＴ３産生の影響が空間的に制限されて全身に及ばないように、眼への局所的な送達または眼内注射もしくは眼内インプラントのために製剤化される。

処置方法
本発明のなおさらなる態様によれば、アンチセンスオリゴマーに基づいた治療で用いるための１つまたは複数の本明細書中に記載のアンチセンスオリゴマーを提供する。好ましくは、治療は、ＣＮＯＴ３発現に関する容態のためのものである。より好ましくは、ＣＮＯＴ３発現に関する容態のための治療は、網膜色素変性のための治療である。

より具体的には、アンチセンスオリゴマーは、表１（すなわち、配列番号１～７４のうちのいずれか１つまたは複数からなる群）、より好ましくは配列番号４、７、９、１１、１４、１６～１８、２７、３０、３４、３５、６４、および６７、さらにより好ましくは配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４、ならびにその組み合わせまたはカクテルから選択され得る。これには、ｐｒｅ－ＣＮＯＴ３遺伝子転写物においてｍＲＮＡプロセシング活性を保有するか調整する、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でかかる配列にハイブリッド形成することができる配列、その相補配列、改変された塩基、改変されたバックボーン、およびその機能的短縮物または伸長物を含む配列が含まれる。

また、本発明は、選択された標的に結合してＣＮＯＴ３遺伝子転写物におけるエクソン排除を誘導することができる２またはそれを超えるアンチセンスオリゴマーの組み合わせに及ぶ。組み合わせは、アンチセンスオリゴマーに基づいた治療で用いるための２またはそれを超えるアンチセンスオリゴマーのカクテル、共に連結した２またはそれを超える２またはそれを超えるアンチセンスオリゴマーを含む構築物であり得る。

したがって、ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患の影響を処置、予防、または改善する方法であって、
ａ）有効量の本明細書中に記載の１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーまたは１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を患者に投与する工程
を含む、方法を提供する。

好ましくは、患者におけるＣＮＯＴ３発現に関連する疾患は、網膜色素変性である。

したがって、本発明は、網膜色素変性の影響を処置、予防、または改善する方法であって、
ａ）有効量の本明細書中に記載の１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーまたは１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を患者に投与する工程
を含む、方法を提供する。

好ましくは、前述の治療を使用して、エクソンスキッピングストラテジーを介して機能的ＣＮＯＴ４タンパク質のレベルを低下させる。ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部においてｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを改変することによって転写物のレベルを低下させることにより、ＣＮＯＴ３レベルを低下させることが好ましい。

好ましくは、ＣＮＯＴ３が低下すると、ＣＮＯＴ３に関する容態または病態（網膜色素変性など）の症状の量、持続時間、または重症度を低下する。

本明細書中で使用される場合、被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の「処置」は、個体または細胞の自然経過を変化させようとする場合に使用される任意のタイプの介入である。処置には、医薬組成物の投与が含まれるが、これらに限定されず、予防的にか、病理学的事象の開始後か、病原体との接触後のいずれかに処置され得る。処置される疾患または容態の進行速度を低下させるか、疾患または容態の発症を遅延させるか、その発症の重症度を軽減するように仕向けることができる「予防的」処置も含まれる。「処置」または「予防」は、疾患もしくは容態またはその関連する症状の完全な根絶、治癒、または防止を必ずしも示さない。

ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患を有する被験体は、ヒトが含まれる哺乳動物であり得る。

また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、代替治療（薬物治療など）と併せて使用されてよい。

したがって、本発明は、ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患または容態の影響を処置、予防、または改善する方法であって、本発明のアンチセンスオリゴマーを、ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患または容態の影響の処置、予防、または改善に関連する別の代替治療と連続的にか同時に投与する、方法を提供する。好ましくは、疾患または容態は、網膜色素変性である。

送達
また、本発明のアンチセンスオリゴマーを、疾患の処置のために利用され得る予防薬または治療薬として使用することができる。したがって、１つの実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と混合された、治療有効量の、ＣＮＯＴ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ内の選択された標的に結合して本明細書中に記載の効率的かつ一貫したエクソンスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーを提供する。

患者におけるＣＮＯＴ３発現に関する疾患の影響を処置、予防、または改善するための医薬、予防、または治療組成物であって、
ａ）本明細書中に記載の１つまたは複数のアンチセンスオリゴマー；および
ｂ）１つまたは複数の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤
を含む、医薬、予防、または治療組成物も提供する。

好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴマーは、全身への影響を回避するために局所眼科経路を介して送達される。投与経路には、硝子体内、前房内、結膜下、テノン嚢下、眼球後、後強膜近傍、または局所（点眼薬、洗眼薬、クリーム剤など）が含まれるが、これらに限定されない。送達方法には、例えば、注射器および薬物送達デバイス（植え込み硝子体送達デバイス（すなわち、ＶＩＴＲＡＳＥＲＴ（登録商標））など）による注射が含まれる。

１つの実施形態では、アンチセンスオリゴマーを、２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。例えば、アンチセンスオリゴマーを、マウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与してよい。

好ましくは、アンチセンスオリゴマーを、硝子体内注射によって、０．０１～１．５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～０．１ｍｇ／ｋｇ体重、０．２～０．８ｍｇ／ｋｇ体重、０．４～０．７ｍｇ／ｋｇ体重、またはより好ましくは０．４～０．６ｍｇ／ｋｇ体重で投与する。アンチセンスオリゴマーを、硝子体内注射によって、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、０．２ｍｇ／ｋｇ体重、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、０．４ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重、０．６ｍｇ／ｋｇ体重、０．７ｍｇ／ｋｇ体重、０．８ｍｇ／ｋｇ体重、０．９ｍｇ／ｋｇ体重、１．０ｍｇ／ｋｇ体重、１．１ｍｇ／ｋｇ体重、１．２ｍｇ／ｋｇ体重、１．３ｍｇ／ｋｇ体重、１．４ｍｇ／ｋｇ体重、１．５ｍｇ／ｋｇ体重で投与してよい。好ましくは、アンチセンスオリゴマーを、硝子体内注射によって、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重で投与する。例えば、アンチセンスオリゴマーを、硝子体内注射によって、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重でマウスに投与してよい。

より好ましくは、アンチセンスオリゴマーを、硝子体内注射によって、０．５～５０ｍｇ／眼、０．５～４０ｍｇ／眼、０．５～３０ｍｇ／眼、２～３０ｍｇ／眼、２～２０ｍｇ／眼、０．５～２０ｍｇ／眼、またはより好ましくは５～２０ｍｇ／眼で投与する。アンチセンスオリゴマーを、硝子体内注射によって、例えば、約０．５ｍｇ／眼、１．０ｍｇ／眼、２．０ｍｇ／眼、３．０ｍｇ／眼、４．０ｍｇ／眼、５．０ｍｇ／眼、６．０ｍｇ／眼、７．０ｍｇ／眼、８．０ｍｇ／眼、９．０ｍｇ／眼、１０．０ｍｇ／眼、１１．０ｍｇ／眼、１２．０ｍｇ／眼、１３．０ｍｇ／眼、１４．０ｍｇ／眼、１５．０ｍｇ／眼、１６．０ｍｇ／眼、１７．０ｍｇ／眼、１８．０ｍｇ／眼、１９．０ｍｇ／眼、２０．０ｍｇ／眼、２１ｍｇ／眼、２２ｍｇ／眼、２３ｍｇ／眼、２４ｍｇ／眼、２５ｍｇ／眼、３０ｍｇ／眼、３５ｍｇ／眼、４０ｍｇ／眼、４５ｍｇ／眼、または５０ｍｇ／眼で投与してよい。好ましくは、アンチセンスオリゴマーを、硝子体内注射によって、約５～２０ｍｇ／眼で投与する。

アンチセンスオリゴマーを、一定間隔で短期間（例えば、２週間またはそれ未満で毎日）投与してよい。しかしながら、多くの場合、オリゴマーを、長期間にわたって間欠的に投与する。投与後または投与と同時に抗生物質を投与するか他の治療上の処置を行ってよい。処置レジメンを、処置を受けている被験体の免疫アッセイ、他の生化学検査、および生理学的試験の結果に基づいて、表示のように（用量、頻度、経路などを）調整してよい。

投薬は処置すべき病状の重症度および応答性に依存し得、一連の処置は、数日間から数カ月間、または治癒するまで、または病状が軽減するまで継続される。あるいは、投薬は、疾患の進行速度に応じて用量設定され得る。ベースラインの進行を確立する。次いで、最初の１回量の投与後の進行速度をモニタリングして、速度の低下をチェックする。好ましくは、投薬後に進行しない。好ましくは、進行速度が不変である場合に限って再投薬が必要である。処置が成功して疾患がさらに進行しないか、さらに視力がいくらか回復することが好ましい。最適な投与計画を、患者の体内の薬物蓄積の測定値から計算することができる。当業者は、最適な投薬量、投与方法、および反復回数を容易に決定することができる。

最適な投薬量は、個別のオリゴマーの相対的効力に応じて変動し得、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルで有効であることが見出されているＥＣ５０に基づいて推定することができる。

一般に、投薬量は、０．０１～１．５ｍｇ／ｋｇ体重であるか、硝子体内注射を介した投与では０．５～５０ｍｇ／眼であり、１日、１週間、１ヶ月、もしくは１年に１回または複数回、またはさらに２～２０年ごとに１回投与され得る。投薬の反復速度は、疾患の進行速度に依存する。当業者は、体液または組織内の薬物の滞留時間および濃度の測定値に基づいて投与の反復回数を容易に見積もることができる。処置が成功した後に、患者は病状の再発を防止するために維持療法を受けることが望ましい場合があり、ここで、オリゴマーは維持量で投与され、用量は、０．０１～１．５ｍｇ／ｋｇ体重であり得るか、硝子体内注射を介した投与では０．５～５０ｍｇ／眼であり得、１日、１週間、１ヶ月、もしくは１年に１回または複数回、またはさらに２～２０年ごとに１回投与され得る。

本発明のアンチセンスオリゴマーを使用した有効なｉｎ ｖｉｖｏ処置レジメンは、期間、用量、頻度、および投与経路、ならびに処置を受ける被験体の容態（すなわち、予防的投与と限局性感染または全身性感染に対応した投与との比較）に応じて変動し得る。したがって、かかるｉｎ ｖｉｖｏ治療は、しばしば、最適な治療結果を得るために、特定のタイプの処置を受けている障害に適切な試験によるモニタリング、および用量または処置レジメンを調整して対応することが必要である。

処置は、例えば、当該分野で公知の疾患の一般的指標によってモニタリングされ得る。ｉｎ ｖｉｖｏ投与された本発明のアンチセンスオリゴマーの有効性は、アンチセンスオリゴマーの投与前、投与中、および投与後に被験体から採取された生物試料（組織、血液、尿など）から決定され得る。かかる試料のアッセイは、（１）当業者に公知の手順（例えば、電気泳動ゲル移動度アッセイ）を使用して、標的配列および非標的配列とのヘテロ二重鎖形成の存在または非存在をモニタリングする工程；（２）標準的な技術（ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、またはウェスタンブロッティングなど）によって判定した場合に、基準となる正常なｍＲＮＡまたはタンパク質と比較して変異ｍＲＮＡの量をモニタリングする工程を含む。

核内オリゴマー送達は、アンチセンスオリゴマーにおける大きな課題である。異なる細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、条件および細胞株が異なる場合に種々の程度でＰＭＯに局在し、本発明者らは、新規のＣＰＰを、ＰＭＯを標的細胞に送達させる能力によって評価している。ＣＰＰまたは「細胞取り込み向上させるペプチド部分」という用語は、互換的に使用され、カチオン性細胞透過性ペプチドを指し、「輸送ペプチド」、「担体ペプチド」、または「ペプチド透過ドメイン」とも呼ばれる。ペプチドは、本明細書中に示すように、約または少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の所与の細胞培養集団の細胞透過を誘導する能力を有し、全身投与した場合にｉｎ ｖｉｖｏで複数の組織内に高分子を移行させることが可能である。ＣＰＰは、当該分野で周知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００１６２１５号（その全体が参考として援用される）に開示されている。

したがって、本発明は、治療医薬組成物の製造のための細胞透過性ペプチドと組み合わせた本発明のアンチセンスオリゴマーを提供する。

賦形剤
本発明のアンチセンスオリゴマーは、薬学的に許容され得る組成物中で送達させることが好ましい。組成物は、約１ｎＭ～１０００ｎＭの各々の本発明の所望のアンチセンスオリゴマー（１つまたは複数）を含み得る。好ましくは、組成物は、約１ｎＭ～５００ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、５０ｎＭ～７５０ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～５０ｎＭ、１ｎＭ～４０ｎＭ、１ｎＭ～３０ｎＭ、１ｎＭ～２０ｎＭ、最も好ましくは１ｎＭと１０ｎＭとの間の本発明の各々の本発明のアンチセンスオリゴマー（１つまたは複数）を含み得る。

組成物は、約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、９５０ｎｍ、または１０００ｎｍの本発明の各々の所望のアンチセンスオリゴマー（１つまたは複数）を含み得る。

本発明は、患者への送達に適切な形態でＣＮＯＴ３発現に関する疾患または病態などの疾患の予防的処置または治療上の処置、症状の予防または改善に役立つように適応させた１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーをさらに提供する。

句「薬学的に許容され得る」は、患者に投与した場合に生理学的に忍容性があり、典型的にはアレルギー反応または類似する有害反応（胃の不調など）を生じない分子実体および組成物を指す。用語「担体」は、化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる薬学的担体は、水および油（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油などの石油、動物、植物に由来するか、合成の油が含まれる）などの滅菌液であり得る。水または生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液を、特に注射液のための担体として使用することが好ましい。適切な薬学的担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，ＰＡ（２０１３）に記載されている。

本発明のより具体的な形態では、治療有効量の１つまたは複数の本発明のアンチセンスオリゴマーを、薬学的に許容され得る希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／またはキャリアと共に含む医薬組成物を提供する。かかる組成物は、種々の緩衝液成分（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ、酢酸、リン酸）、ｐＨ、およびイオン強度の希釈剤および添加物（界面活性剤および溶解補助剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）、および増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）など）を含む。材料は、高分子化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）の粒子調製物またはリポソーム中に取り込まれ得る。ヒアルロン酸（ｈｙｌａｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）も使用され得る。かかる組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの放出速度、およびｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，ＰＡ（２０１３）を参照のこと。組成物は、液体で調製され得るか、乾燥粉末（凍結乾燥形態など）であり得る。

本発明にしたがって提供された医薬組成物は、当該分野で公知の任意の手段によって投与され得ると認識される。投与のための医薬組成物は、注射によるか、経口、局所、または肺もしくは鼻腔経路によって投与される。例えば、アンチセンスオリゴマーは、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下経路での投与によって送達され得る。当業者は、適切な経路を、処置中の被験体の容態に応じて適切に決定し得る。好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、ＣＮＯＴ３産生の影響が空間的に制限されて全身に及ばないように、眼に局所的に送達されるか、眼内注射または眼内インプラントによって送達される。

局所投与のための製剤には、開示のオリゴマーが局所送達剤（脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性物質など）との混合物中に存在する製剤が含まれる。脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰イオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれる。局所投与または他の投与のために、開示のオリゴマーは、リポソーム内にカプセル化され得るか、特にカチオン性リポソームと複合体を形成し得る。あるいは、オリゴマーは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成し得る。脂肪酸およびエステル、その薬学的に許容され得る塩、ならびのその使用は、米国特許第６，２８７，８６０号および／または米国特許出願第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日出願）にさらに記載されている。

ある特定の実施形態では、開示のアンチセンスオリゴマーを、局所的方法または経皮的方法（例えば、例えば乳剤へのアンチセンスオリゴマーの取り込みを介し、かかるアンチセンスオリゴマーは必要に応じてリポソーム内にパッケージングされている）（眼表面への送達が含まれる）によって送達することができる。かかる局所的または経皮的および乳剤／リポソーム媒介の送達方法は、当該分野、例えば、米国特許第６，９６５，０２５号においてアンチセンスオリゴマーの送達に関する記載がある。好ましくは、局所送達は眼への送達である。

また、本明細書中に記載のアンチセンスオリゴマーは、植込み型デバイスを介して送達され得る。かかるデバイスのデザインは、例えば、米国特許第６，９６９，４００号に記載の合成インプラントデザインを用いた当該分野で認識されているプロセスである。好ましくは、インプラントは、アンチセンスオリゴマーの持続送達のために眼に植え込むことができる。

眼投与のための組成物および製剤（眼注射、局所眼送達、および眼インプラントが含まれる）は、滅菌水溶液を含んでよく、滅菌水溶液は、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加物（浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容され得る担体または賦形剤などであるが、これらに限定されない）も含み得る。

治療に有用な量のアンチセンスオリゴマーは、以前に発表された方法によって送達され得る。例えば、アンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーと有効量のブロックコポリマーとの混合物を含む組成物を介して送達され得る。この方法の例は、米国特許出願公開第２００４０２４８８３３号に記載されている。核へのアンチセンスオリゴマーの他の送達方法は、Ｍａｎｎ ＣＪ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，９８（１）４２－４７およびＧｅｂｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２（１５）：１８０１－１８１１に記載されている。発現ベクターによって核酸分子を裸のＤＮＡまたは脂質担体と複合体化したＤＮＡのいずれかとして細胞に導入する方法は、米国特許第６，８０６，０８４号に記載されている。

アンチセンスオリゴマーを、当該分野で認識されている技術（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、リポソーム、コロイドポリマー粒子ならびにウイルスベクターおよび非ウイルスベクターならびに当該分野で公知の他の手段）を使用して細胞に導入することができる。送達方法の選択は、少なくとも処置される細胞および細胞の位置に依存し、この選択は当業者に自明である。例えば、表面上にリポソームを方向づけるための特異的マーカーを有するリポソーム、標的細胞を含む組織内への直接注射、特異的受容体媒介取り込みなどによって局在化させることができる。

コロイド分散系中のアンチセンスオリゴマーを送達させることが望ましい場合がある。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油型乳濁液、ミセル、混合ミセル、およびリポソームまたはリポソーム製剤が含まれる）が含まれる。これらのコロイド分散系を、治療医薬組成物の製造で使用することができる。

リポソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。これらの製剤は、最終的にカチオン性、アニオン性、または中性の電荷特性を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏでの送達方法に有用な特徴を有し得る。巨大な単層小胞が巨大高分子を含む水性緩衝液をかなりの比率でカプセル化することができることが示されている。ＲＮＡおよびＤＮＡを水性の内部にカプセル化することができ、生物学的に活性な形態で細胞に送達させることができる（Ｆｒａｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．６：７７，１９８１）。

リポソームが効率的な遺伝子移入小胞となるために、以下の特徴を示すべきである：（１）目的のアンチセンスオリゴマーの生物学的活性を損なうことなく高効率で前述のアンチセンスオリゴマーをカプセル化すること；（２）非標的細胞と比較して標的細胞に優先的かつ実質的に結合すること；（３）小胞の水性内容物を高い効率で標的細胞質に送達させること；および（４）遺伝情報を正確かつ有効に発現すること（Ｍａｎｎｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２，１９８８）。リポソームの組成物は、通常、リン脂質、特に相転移温度が高いリン脂質の組み合わせ（通常はステロイド、具体的にはコレステロールとの組み合わせ）である。他のリン脂質または他の脂質も使用され得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および２価カチオンの存在に依存する。カチオン性リポソームは正電荷のリポソームであり、負電荷のＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられている。ｐＨ感受性を示すか負電荷のリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するよりもＤＮＡを捕捉すると考えられている。カチオン性および非カチオン性のリポソームの両方は、ＤＮＡを細胞に送達させるために使用されている。

また、リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームが含まれ、この用語は、本明細書中で使用される場合、１つまたは複数の特殊化脂質を含むリポソームを指し、ここで、特殊化脂質は、リポソームに取り込まれた場合に、かかる特殊化脂質を欠くリポソームと比較して循環寿命が向上する。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が１つまたは複数の糖脂質を含むか、１つまたは複数の親水性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分など）で誘導体化されているリポソームである。リポソームおよびその使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。

当該分野で公知のように、アンチセンスオリゴマーは、例えば、リポソーム媒介取り込み、脂質コンジュゲート、ポリリジン媒介取り込み、ナノ粒子媒介取り込み、および受容体媒介エンドサイトシス、ならびにさらなる非エンドサイトシスの送達様式、例えば、微量注入、透過処理（例えば、ストレプトリシン－Ｏ透過処理、アニオン性ペプチド透過処理）、エレクトロポレーション、および当該分野で公知の種々の非侵襲性の非エンドサイトシスの送達方法（Ｄｏｋｋａ ａｎｄ Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４，３５－４９（その全体が参考として援用される）で言及されている）を含む方法を使用して送達され得る。

また、アンチセンスオリゴマーは、医薬組成物を生産するために他の薬学的に許容され得る担体または希釈剤と組み合わされ得る。適切な担体および希釈剤には、等張生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）が含まれる。組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口、または経皮投与のために製剤化され得る。

当業者は任意の特定の動物および条件に最適な投与経路および任意の投薬量を容易に決定することができると考えられるので、記載の投与経路は、指針のみを意図する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で機能的な新規の遺伝子材料を細胞に導入するための複数のアプローチが試みられている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５－１２８０）。これらのアプローチには、発現すべき遺伝子の改変されたレトロウイルスへの組み込み（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）前出；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１（１８），ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ－５０７９Ｓ）；非レトロウイルスベクターへの組み込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６８：１４３－１５５；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１－４３４）；または異種プロモーター－エンハンサーエレメントに連結した導入遺伝子のリポソームを介した送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９），前出；Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８－２８１；Ｎａｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５－１２８８；Ｈａｚｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，４：２０６－２０９；およびＷａｎｇ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４：７８５１－７８５５）；リガンド特異的なカチン系輸送系へのカップリング（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１－１４６２４）、または裸のＤＮＡ、発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），前出）；Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５－１４６８）が含まれる。導入遺伝子を組織に直接注射すると、局在化発現のみが起こる（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）前出）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）前出；Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）前出；Ｎａｂｅｌ（１９９０）前出；ａｎｄ Ｈａｚｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）前出）。Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．のグループ（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）２９８：２７８－２８１ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３９（要約））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内投与後または気管内投与後のいずれかにおけるマウス肺のみでのｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションを報告している。ヒト遺伝子療法の手順についての総説の例は、以下である：Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８－８１３；Ｂａｒｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ；８（５）：３１３－２３；Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｃｌｉｎ Ｒｅｖ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ；３５（３）：１６４－７８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１３（１８）：１３１３－９；Ｓｉｍｏｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ；２（２）：２３７－５４。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトが含まれる動物への投与の際に、生物学的に活性な代謝産物またはその残基を（直接または間接的に）提供することができる任意の薬学的に許容され得る塩、エステル、またはかかるエステルの塩、または任意の他の化合物を含む。したがって、一例として、本開示は、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容され得る塩、かかるプロドラッグの薬学的に許容され得る塩、および他の生物学的等価物にも注目している。

用語「薬学的に許容され得る塩」は、本発明の化合物の生理学的におよび薬学的に許容され得る塩（すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ親化合物に望ましくない毒性効果を付与しない塩）を指す。オリゴマーについて、薬学的に許容され得る塩の好ましい例には、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン（スペルミンおよびスペルミジンなど）のカチオンを用いて形成された塩；（ｂ）無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸など）を用いて形成された酸付加塩；（ｃ）有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、およびポリガラクツロン酸など）を用いて形成された塩；および（ｄ）アニオン性元素（塩素、臭素、およびヨウ素など）から形成された塩が含まれるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物を、局所または全身処置のいずれが望ましいのか、および処置すべき領域に応じて、いくつかの方法で投与することができる。局所経路（眼または筋肉の膜、および直腸送達が含まれる）、肺経路（例えば、散剤またはエアロゾルの吸入またはガス注入（ネブライザーが含まれる）、気管内、鼻腔内、上皮および経皮）、経口経路、または非経口経路を介して投与され得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、眼内、または筋肉内への注射または注入；または頭蓋内（例えば、髄腔内または脳室内）投与が含まれる。少なくとも１つの２’－Ｏ－メトキシエチル改変を有するオリゴマーは、眼内投与に特に有用であると考えられる。好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、眼内経路を介して送達される。

単位投薬形態で都合よく提供され得る本発明の医薬製剤は、医薬品産業で周知の従来技術にしたがって調製され得る。かかる技術は、有効成分を薬学的担体（１つまたは複数）または賦形剤（１つまたは複数）と関連させる工程を含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体または微粉化固体担体またはその両方と均一かつ完全に関連させ、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。

スイススタイル
本発明の別の態様によれば、ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患を調整するか抑制するための医薬の製造における１つまたは複数の本明細書中に記載のアンチセンスオリゴマーの使用を提供する。

また、本発明は、ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患の処置のための医薬を製造するための本明細書中に記載の精製および単離されたアンチセンスオリゴマーの使用を提供する。

ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患の影響を処置、予防、または改善するための医薬の製造のための本明細書中に記載の精製および単離されたアンチセンスオリゴマーの使用も提供する。

好ましくは、ＣＮＯＴ３に関する病態または疾患は、網膜色素変性である。

本発明は、そのなおさらなる態様によれば、本発明のアンチセンスオリゴマー配列のｃＤＮＡまたはクローン化されたコピー、および本発明のアンチセンスオリゴマー配列を含むベクターに及ぶ。また、本発明は、かかる配列および／またはベクターを含む細胞にさらに及ぶ。

キット
患者におけるＣＮＯＴ３発現に関連する疾患の影響を処置、予防、または改善するためのキットであって、本明細書中に記載の少なくとも１つのアンチセンスオリゴマーおよびその組み合わせまたはカクテルを、使用説明書と共に適切な容器に包装された状態で含む、キットも提供する。

好ましい実施形態では、キットは、少なくとも１つの、本明細書中に記載されているか表１に示したアンチセンスオリゴマー（すなわち、配列番号１～７４）、より好ましくは配列番号４、７、９、１１、１４、１６～１８、２７、３０、３４、３５、６４、および６７、さらにより好ましくは配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４、または本明細書中に記載のアンチセンスオリゴマーのカクテルを含む。また、キットは、緩衝液、安定剤などの助剤を含み得る。

したがって、被験体におけるＣＮＯＴ３発現に関連する疾患または容態を処置、予防、または改善するためのキットであって、前述のキットは、少なくとも、本明細書中に記載されているか表１に示したアンチセンスオリゴマーおよびその組み合わせまたはカクテルを、使用説明書と共に適切な容器に包装された状態で含む、キットを提供する。

また、被験体におけるＣＮＯＴ３発現に関連する疾患または容態を処置、予防、または改善するためのキットであって、前述のキットは、少なくとも、配列番号１～７４のうちのいずれか１つまたは複数からなる群から選択されるアンチセンスオリゴマー、より好ましくは配列番号４、７、９、１１、１４、１６～１８、２７、３０、３４、３５、６４、および６７、さらにより好ましくは配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４、およびその組み合わせまたはカクテルを、使用説明書と共に適切な容器に包装された状態で含む、キットを提供する。

好ましくは、疾患または容態は、網膜色素変性である。

キットの内容物を凍結乾燥することができ、キットは、凍結乾燥された構成要素の再構成のための適切な溶媒をさらに含むことができる。キットの各構成要素は、個別の容器に包装される。かかる容器には、医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって承認された形式の通知書を添付することができ、この通知書は、政府機関によるヒトへの投与のための製造、使用、または販売の承認を反映している。

キットの内容物を１つまたは複数の溶液中に提供する場合、溶液は、水溶液、例えば、滅菌水溶液であり得る。ｉｎ ｖｉｖｏでの使用のために、発現構築物は、薬学的に許容され得る注射用組成物に製剤化され得る。この場合、容器手段は、それ自体が吸入器、注射器、ピペット、点眼器、または他の類似の装置であってよく、これらの手段由来の製剤は、肺などの動物の病変部に適用するか、動物に注射するか、さらには、キットの他の構成要素に適用して混合され得る。

１つの実施形態では、本発明のキットは、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物上の選択された標的に結合して、ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部におけるｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを改変することができるアンチセンスオリゴマーを有効量で含む組成物を含む。別の実施形態では、製剤は、測定済み、混合済み、および／または包装済みである。好ましくは、眼内溶液は無菌である。

また、本発明のキットは、利用者遵守が容易なようにデザインされた説明書を含み得る。説明書は、本明細書中で使用される場合、任意のラベル、添付文書などを指し、包装材料の１つまたは複数の表面上に配置され得るか、説明書は、個別のシート上に提供され得るか、前述の組み合わせでもよい。例えば、１つの実施形態では、本発明のキットは、本発明の製剤の投与のための説明書を含む。１つの実施形態では、説明書は、本発明の製剤が網膜色素変性の処置に適切であることを示す。また、かかる説明書は、投薬量に関する説明書、および眼への局所送達または眼内注射を介した投与のための説明書を含み得る。

アンチセンスオリゴマーおよび適切な賦形剤を、従事者または使用者が必要に応じて構成要素を薬学的に許容され得る組成物に製剤化することが可能なように個別に包装することができる。あるいは、アンチセンスオリゴマーおよび適切な賦形剤を共に包装することができ、それにより、従事者または使用者が必要な製剤化を最小限にすることができる。いずれにしても、包装材料は、有効成分の化学的、物理的、および審美的完全性を維持すべきである。

通則
当業者は、本明細書中に記載の発明が具体的に記載した変形形態および修正形態以外の変形形態および修正形態が可能であると認識する。本発明は、全てのかかる変形形態および修正形態を含む。また、本発明は、本明細書中に言及または表示した全ての工程、特徴、製剤、および化合物を個別または集合的に含み、工程または特徴の任意の組み合わせおよび全ての組み合わせまたは任意の２つまたはそれを超える工程または特徴を含む。

本明細書中に引用した各々の書類、参考文献、特許出願、または特許は、その全体が本明細書中で参考として明確に援用され、これは、読み手によってこれらの文書が本明細書の一部であると読み取られ、かつ見なされるべきであることを意味する。本明細書中に引用した各々の書類、参考文献、特許出願、または特許が本明細書中で繰り返されないのは、本明細書を簡潔にすることのみを目的としている。

本明細書中または本明細書中で参考として援用される任意の生成物のための任意の書類中で言及した任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書、およびプロダクトシートは、本明細書中で参考として援用され、本発明の実施において使用され得る。

本発明は、本明細書中に記載のいかなる特定の実施形態によってもその範囲を制限されないものとする。これらの実施形態は、例示のみを意図する。機能的に等価な製品、製剤、および方法は、明確に本明細書中に記載の発明の範囲内にある。

本明細書中に記載の発明は、１つまたは複数の値の範囲（例えば、サイズ、変位量、および場の強度など）を含み得る。値の範囲は、範囲内の全ての値（範囲を定義する値が含まれる）および前述の範囲の近傍にある値（前述の範囲の境界を定義する値に隣接するので、同一または実質的に同一の結果が得られる）を含むと理解される。したがって、そうではないと示されない限り、明細書および特許請求の範囲に記載の数値のパラメーターは近似値であり、本発明によって得ようとされる所望の性質に応じて変動し得る。それ故に、「約８０％」は、「約８０％」を意味し、「８０％」も意味する。最低限でも、各数値パラメーターは、有効数字および通常の丸めを考慮して解釈されるべきである。

本明細書を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」またはそのバリエーション（「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」など）は、言及した整数または整数の群を含むことを意味するが、いかなる他の整数または整数の群も排除しないと理解される。本開示、特に特許請求の範囲および／またはパラグラフにおいて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語が米国特許法中の用語に帰する意味を有することができ；例えば、これらの用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができ；「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法中の用語に帰する意味を有する（例えば、これらの用語は、要素が明確に列挙されなくとも、先行技術で見出されるか、本発明の基本的な特徴または新規の特徴に影響を及ぼす要素を排除する）ことも示す。

本明細書中で使用される選択された用語についての他の定義は、発明の詳細な説明内に見出され、全体で適用され得る。別段の定義がない限り、本明細書中で使用した全ての他の技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されている意味を有する。用語「活性薬剤」は、１つの活性薬剤を意味する場合があるか、２またはそれを超える活性薬剤を含む場合がある。

本明細書中に含まれるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の情報を含む配列識別番号（「配列番号」）は、説明の終わりにまとめられており、Ｐａｔｅｎｔｌｎバージョン３．０プログラムを使用して作成されている。各々のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、配列表において数値表記＜２１０＞に続く配列識別子よって識別される（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２など）。各々のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列についての配列の長さ、タイプ、および供給元となる生物を、それぞれ、数値表記フィールド ＜２１１＞、＜２１２＞、および＜２１３＞に提供した情報によって示す。本明細書中で言及したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、数値表記フィールド＜４００＞に続く配列識別子で提供された情報（例えば、＜４００＞１、＜４００＞２）によって定義される。

アンチセンスオリゴマー命名法は、アンチセンスオリゴマーの相違を区別するために提案および発表された（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｍｅｄ ４，６４４－６５４を参照のこと）。以下に示すように、この命名法により、いくつかのわずかに相違するアンチセンスオリゴマーを試験する場合に具体的に関連付けられ、全ての同一の標的領域が対象とされるようになった：
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）
最初の文字は種を示す（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス）
「＃」は、標的エクソン番号を示す
「Ａ／Ｄ」は、それぞれ、エクソンの最初と最後のアクセプターまたはドナーのスプライス部位を示す
（ｘ ｙ）は、アニーリング座標を表し、ここで、「－」または「＋」は、イントロン配列またはエクソン配列をそれぞれ示す。一例として、Ａ（－６＋１８）は、標的エクソンに先行するイントロンの最後の６塩基および標的エクソンの最初の１８塩基を示す。最も近いスプライス部位はアクセプターであると考えられるので、これらの座標は「Ａ」が先行する。ドナースプライス部位でのアニーリング座標の記載はＤ（＋２－１８）であり得、ここで、最後の２つのエクソン塩基および最初の１８個のイントロン塩基がアンチセンスオリゴマーのアニーリング部位に対応する。全エクソンアニーリング座標は、Ａ（＋６５＋８５）（前述のエクソンの最初から６５番目のヌクレオチドと８５番目のヌクレオチド（両端を含む）の間の部位である）で表される。

以下の実施例は、上記の発明の使用様式をより完全に記載するだけでなく、本発明の種々の態様を実施するための意図する最良の形態を示すのにも役立つ。これらの方法は、本発明の真の範囲を決して制限せず、むしろ、例示を目的として提供していると理解される。

実施例１
ＣＮＯＴ３のフレームシフトを誘導するためのＡＯ媒介エクソンスキッピング
ＣＮＯＴ３のエクソン構造を、図１に示す。スプライススイッチングＡＯを、ＣＮＯＴ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ（図１）においてフレームシフトしているエクソン内のエンハンサー部位を標的にして、ＣＮＯＴ３のエクソンスキッピングを誘導し、その結果として、読み取り枠の喪失およびノックダウンを誘導するようにデザインした。

正常なヒトの線維芽細胞およびＲＰ１１患者由来の線維芽細胞（ＰＲＰＦ３１ｃ．１２０５ Ｃ＞Ａ Ｓｅｒ４０２^＊）を、皮膚生検から採取し、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で培養した。研究室内で２’Ｏ－メチルホスホロチオアートオリゴマーとして合成したアンチセンス配列（表１）を、製造者の説明書にしたがってリポフェクタミン３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したリポプレックスとして、２４ウェルプレート中の線維芽細胞にトランスフェクトした。次いで、変化している標的エクソンの選択で有効であった配列を、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）として合成し、ＰＭＯを以下のようにして線維芽細胞にトランスフェクトした：ｉ）非複合体化の状態、ｉｉ）センスＯＤＮリーシュへのアニーリングしおよびリポフェクタミン３０００を用いた送達（上記の通り）、またはｉｉｉ）製造者の説明書にしたがってＰ２初代細胞４－Ｄ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＸキットＳ（Ｌｏｎｚａ）を使用したヌクレオフェクション。

総ＲＮＡを、ＭａｇＭａｘ ＲＮＡ抽出システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、トランスフェクトした細胞および対照細胞から抽出した。目的の転写物を、まず第一に半定量的ＲＴ－ＰＣＲによって評価し、次いで、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価する。ｃＤＮＡ（ＲＮＡ ３００ｎｇ）を、製造者の説明書に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ逆転写酵素キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて合成した。製造者の説明書に従ってＧＣ緩衝液Ｉを含むＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を使用してＲＴ－ＰＣＲを行った。

細胞をＣＮＯＴ３エクソンスキッピングＡＯでトランスフェクトした後に、ＣＮＯＴ３転写物を評価するために以下の３つの異なるプライマーセットを使用した：
１．エクソン３を標的にするＡＯのために、エクソン２にアニーリングする順方向プライマーを、エクソン６中の逆方向プライマーとペアにした。
２．エクソン８および９を標的にするＡＯのために、エクソン７中の順方向プライマーを、エクソン１１逆方向プライマーとペアにした。
３．エクソン１６および１７を標的にするＡＯのために、エクソン１５中の順方向プライマーを、エクソン１８中の逆方向プライマーとペアにした。

ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、ＣＮＯＴ３エクソンスキッピングＡＯでのトランスフェクション後のＰＲＰＦ３１転写物レベルを定量した。ＰＲＰＦ３１のエクソン２および３ジャンクションにまたがる順方向プライマーを、エクソン３および４ジャンクションにまたがる逆方向プライマーとペアにした（表２）。全てのＣＮＯＴ３ ＡＯ処置細胞の結果を、２つのハウスキーピング遺伝子ＴＢＰおよびＧＡＰＤＨの発現に対して正規化し、抗ＩＳＳ－Ｎ１および偽ＡＯで処置した細胞と比較してＰＲＰＦ３１転写物の変化倍率を計算した。

エクソンスキッピングの誘導に起因すると予測される誘導された（小さい方の）ＣＮＯＴ３転写産物の配列決定により、ＡＯ３６９７およびＡＯ３６９８がエクソン３スキッピングを媒介し、ＡＯ３７０２がエクソン８の部分的スキッピングおよび完全なスキッピングの両方を誘導し、ＡＯ３７０３が用量依存性のエクソン８スキッピングを媒介したことが明らかとなった（データ示さず）。次いで、効率的なＣＮＯＴ３エクソン３、８、または９のスキッピングを媒介したＡＯを、ＲＰ患者の線維芽細胞に４８時間トランスフェクトし、ＣＮＯＴ３転写物をＲＴ－ＰＣＲによって分析した（図２）。ＣＮＯＴ３エクソンスキッピングは、トランスフェクション４８時間後に明らかとなり、全長転写産物レベルがいくらか低下した。エクソン３はＡＯ３６９７によって排除され、エクソン８はＡＯ３７０２およびＡＯ３７０３によってスキッピングされ、エクソン９はＡＯ３７０６によってスキッピングされた。

以前に、本発明者らは、ホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＭＯ）化学が２’Ｏ－メチルＰＳ化学として合成した同一の配列よりもスプライス改変を有効に媒介することを示していた。したがって、ＣＮＯＴ３転写物をノックダウンするのに最も有望なＡＯ配列を、ＰＭＯとして合成し、正常な非複合体化線維芽細胞に、複合体化せずにか、リーシュ／リポプレックスを用いるか、ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、Ｌｏｎｚａ）を介してトランスフェクトする。ＣＮＯＴ３を標的にするＡＯ配列の評価および最適化は進行中である。

ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞は、しばしば、ニューロンの機能および分化のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして使用される。この細胞は、表現型がアドレナリン作動性であるが、ドーパミン作動性マーカーも発現する。線維芽細胞においてＣＮＯＴ３転写物を改変するＡＯを、分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞においてＣＮＯＴ３を下方制御してＰＲＰＦ３１発現（転写物およびタンパク質）を増加させる能力について評価する。

実施例２
ＣＮＯＴ３をノックダウンするためのＡＯ媒介末端イントロン保持
アンチセンス配列を、ＣＮＯＴ３の末端エクソンを標的にしてＣＮＯＴ３の末端イントロン保持およびノックダウンを誘導するようにデザインした。

ＣＮＯＴ３の末端エクソンを標的にする２’Ｏ－メチルＡＯを、ａｄＲＰ１１患者の線維芽細胞に４８時間トランスフェクトした。ＣＮＯＴ３転写物のＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＡＯ３８８７、３８８８、および３８８９（表１）が末端イントロン保持および全長転写産物レベルの低下を用量依存性様式で誘導したことを示した（図３）。

実施例３
ＲＰを有する家族の採用および概説
本発明者らは、ＷＡ在住のＰＲＰＦ３１変異を有する２家族（コーカサス人の１家族および先住民の１家族）の３世代を試験した（図４）。本発明者らは、患者７人から皮膚線維芽細胞を採取し、これらの家族の２４人の罹患個体のうちの１０人において疾患進行のモニタリングを開始した。

実施例４
ＲＰ１１患者由来の誘導多能性幹細胞および対照線維芽細胞の生成ならびにＣＮＯＴ３ノックダウンの結果としての遺伝子発現の査定
誘導多能性幹細胞を、患者線維芽細胞および対照線維芽細胞から生成する。患者線維芽細胞を、ＮＥＯＮ（登録商標）エレクトロポレーションシステムを使用して、再プログラミングエピソーム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））でトランスフェクトする。典型的な再プログラミング実験では、１２～１５個のｉＰＳＣ用コロニーをトランスフェクション３～４週間後に選別し、免疫染色およびＲＴ－ＰＣＲ分析による多能性遺伝子発現の評価のために継代した（図５Ａ～Ｃ）。次いで、３つのクローンを、さらなる試験（ＴａｑＭａｎ Ａｒｒａｙｓ（ヒト幹細胞多能性アレイ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）による遺伝子発現プロファイリングおよびＱｕａｎｔｉＳＮＰ分析（ＡＧＲＦ）を用いた染色体Ｇバンド分析によるバーチャル核型分類が含まれる）のために選択する。

３系列への分化可能性を実証するために、ｉＰＳＣを胚様体として２～４週間培養し、外胚葉、中胚葉、および内胚葉への分化のマーカーの発現、ならびに多能性マーカーの下方制御についてＲＴ－ＰＣＲによって試験する（図５Ｃ）。ｉＰＳＣは、ＣＩＦの公開プロトコール（Ｍｅｌｌｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１２．３０（４）：ｐ．６７３－８６．）を使用して網膜オルガノイドに分化される（図５Ｄ～Ｈ）。

分化細胞を、各分析のために三連でモルホリノ化合物として合成されたリードＣＮＯＴ３ターゲティングＡＯでトランスフェクトする。

ＣＮＯＴ３、ＰＲＰＦ３１、および他のスプライシング因子の転写物を分析する。ＣＮＯＴ３、ＰＲＰＦ３１、ならびに選択したパラスペックルタンパク質およびスプライシング因子を、スプライシング機構およびスプライシング経路の完全性を反映するためのウェスタンブロットおよび免疫蛍光によって査定する。

実施例５
ＡＯの用量依存性試験
ＡＯ配列を、ＣＮＯＴ３伝令ＲＮＡ由来の選択されたエクソンをスキッピングするようにデザインし、効率的なトランスフェクションのためのカチオン性リポソームとの複合体化の後に２‘Ｏ－メチルホスホロチオアートＡＯとして線維芽細胞にトランスフェクトした。標的エクソンをスキッピングすると、２％アガロースゲル上の産物の分離および染色によって同定したところ、伝令ＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ産物が短くなる（図６および７）。

好ましい配列は、用量依存性の標的エクソンのスキッピングを示す。次いで、リード配列を、患者線維芽細胞へのトランスフェクションによる試験のためのホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）として合成した。

ＲＰ１１患者は、健康な集団のおよそ５０％のＰＲＰＦ３１レベルを示す。ＣＮＯＴ３およびＰＲＰＦ３１の伝令ＲＮＡを、ＲＰ１１ファミリーメンバーおよび健常対照群における逆転写および定量的ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって定量した。図８ａは、より高いＣＮＯＴ３発現がヘテロ接合性ＰＲＰＦ３１変異キャリアにおけるＰＲＰＦ３１の低下および臨床転帰に相関することを示す。標的ＣＮＯＴ３エクソンのスキッピングを、ｑＲＴ－ＰＣＲによって査定し（図８ｂ、８ｃ）、ＡＯ処置後のＰＲＰＦ３１発現を、健常なヒトゲノムのいかなる領域も標的にしない対照ＡＯ配列（２５ｎＭの対照ＡＯでのトランスフェクション値を１に設定）で処置した細胞（影響なしと予想される－負の対照）のＰＲＰＦ３１発現と比較して示す。無処置細胞由来のデータを、比較のために含めている。

ＲＰ１１患者は、健康な集団のおよそ５０％のＰＲＰＦ３１レベルを示し、他方では、症候性ＰＲＰＦ３１変異キャリアは健常レベルの少なくとも７０％またはそれを超えるレベルを示す。ＰＲＰＦ３１発現が１．５倍に増加すると（例えば、ＣＮＯＴ３エクソン３または１０のスキッピング（図８ｂ）およびＣＮＯＴ３エクソン９、１６、または１７のスキッピング（図８ｃ））、ＲＰ１１網膜色素上皮におけるスプライシング機能がレスキューされると予想される。

実施例６
アンチセンスオリゴマー媒介ＣＮＯＴ３エクソンスキッピングは、ＲＰ１１患者のｉＰＳＣ誘導網膜色素上皮（ＲＰＥ）におけるＰＲＰＦ３１発現を上方制御し、一次繊毛の長さおよび数をレスキューする
ＡＳＯ６（配列番号６４、ＣＮＯＴ３＿Ｈ１７Ａ（＋８３＋１０７）、ＣＮＯＴ３エクソン１７を標的にする）をホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）として合成し、培養培地中で５ｕＭ ＡＳＯを使用した直接トランスフェクションによってＲＰ１１ ｉＰＳＣ由来ＲＰＥにトランスフェクトした。

免疫細胞化学を、アンチセンスオリゴマーでの処置または無処置の場合の野生型およびＲＰ１１のＲＰＥにおける繊毛および基底小体の免疫染色のために使用した。

繊毛の免疫染色プロトコール
チャンバースライド上のＲＰＥ細胞を、氷冷アセトン－メタノール（１：１）を用いて４分間固定し、次いで風乾した。細胞を、１０％濾過ヤギ血清を含むＰＢＳ中で３０分間ブロッキングした。基底小体染色のために、細胞を、マウス抗ペリセントリン抗体（１：１００）と室温で１時間インキュベートした。一次抗体を、アレキサフルオロ４８８抗マウス（１：４００）を使用して検出した。繊毛染色のために、細胞を、ウサギ抗ＡＲＬ１３Ｂ抗体（１：５００）とインキュベートし、４℃で一晩インキュベートした。第２の一次抗体を、アレキサフルオロ５６８抗ウサギ（１：４００）を使用して室温で１時間検出し、核検出のためのＨｏｅｃｈｓｔ（１：１２５に希釈）を用いて対比染色した。カバーガラスを、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止剤入り培地を使用してスライドガラス上にマウントした。

共焦点顕微鏡による解析および定量化
ＲＰＥの一次繊毛を、共焦点顕微鏡法を使用してＰＲＰＦ３１機能を評価するために査定した。およそ３００個のＲＰＥ細胞／試料の繊毛の長さを、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ画像化ソフトウェアを使用して測定した。

Claims (19)

1. ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部においてｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを改変するための単離または精製されたアンチセンスオリゴマー。
2. ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部において非産生性スプライシングまたは機能障害を誘導する請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
3. 配列番号１～７４を含むリストから選択される請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
4. 前記アンチセンスオリゴマーが、（ｉ）改変されたバックボーン構造；（ｉｉ）改変された糖部分；（ｉｉｉ）ＲＮアーゼＨ耐性；（ｉｖ）オリゴマー模倣化学を含むリストから選択される代替の化学または修飾に供された１つまたは複数のヌクレオチドの位置を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
5. 前記アンチセンスオリゴマーが、（ｉ）部分への化学的コンジュゲート；および／または（ｉｉ）細胞透過性ペプチドでのタグ化によってさらに改変されている、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
6. 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
7. 任意のウラシル（Ｕ）がヌクレオチド配列に存在し、前記ウラシル（Ｕ）がチミン（Ｔ）に置換されている、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
8. 前記ＣＮＯＴ３遺伝子転写物またはその一部のエクソンのうちの１つまたは複数のスキッピングを誘導するように作動する請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
9. ＰＲＰＦ３１タンパク質の発現が、症候性ＰＲＰＦ３１変異を有する被験体におけるＰＲＰＦ３１タンパク質発現の１．５倍と５倍との間になる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
10. ＣＮＯＴ３遺伝子転写物のスプライシングを操作する方法であって、
    ａ）請求項１～８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーのうちの１つまたは複数を提供し、前記オリゴマー（１つまたは複数）を標的核酸部位に結合させる工程
    を含む、方法。
11. 患者におけるＣＮＯＴ３発現に関する疾患の影響を処置、予防、または改善するための医薬組成物、予防組成物、または治療組成物であって、
    ａ）請求項１～８のいずれか１項に記載の１つまたは複数のアンチセンスオリゴマー、および
    ｂ）１つまたは複数の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤
    を含む、医薬組成物、予防組成物、または治療組成物。
12. ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患の影響を処置、予防、または改善する方法であって、
    ａ）有効量の１つまたは複数の請求項１～９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーまたは１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を患者に投与する工程
    を含む、方法。
13. ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患の影響を処置、予防、または改善するための医薬の製造のための請求項１～９のいずれか１項に記載の精製および単離されたアンチセンスオリゴマーの使用。
14. 患者におけるＣＮＯＴ３発現に関連する疾患の影響を処置、予防、または改善するためのキットであって、請求項１～９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアンチセンスオリゴマーおよびその組み合わせまたはカクテルを、使用説明書と共に適切な容器に包装された状態で含む、キット。
15. 前記ＣＮＯＴ３発現に関する疾患が網膜色素変性である、請求項１１に記載の組成物、請求項１０もしくは１２に記載の方法、請求項１３に記載の使用、または請求項１４に記載のキット。
16. 前記ＣＮＯＴ３発現に関連する疾患を有する被験体がヒトである、請求項１１に記載の組成物、請求項１０もしくは１２に記載の方法、請求項１３に記載の使用、または請求項１４に記載のキット。
17. 前記ＰＲＰＦ３１タンパク質の発現が、症候性ＰＲＰＦ３１変異を有する被験体におけるＰＲＰＦ３１タンパク質の発現の１．５と５倍との間になる、請求項１１に記載の組成物、請求項１０もしくは１２に記載の方法、請求項１３に記載の使用、または請求項１４に記載のキット。
18. 配列番号４、７、９、１１、１５、１６～１８、２７、３０、３４、３５、および６４を含むリストから選択される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
19. 配列番号４、７、２７、３０、３４、および６４を含むリストから選択される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。

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