JP2022533011A - 認知障害を処置するためのパルス状ｇｎｒｈ投与 - Google Patents
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Abstract
本発明は、嗅覚機能障害に関連付けられる認知障害を処置するための新規治療方法に関する。ダウン症候群のマウスモデル（ＤＳ－Ｔｓ６５Ｄｎマウス）を使用することにより、本発明者らは、ＧｎＲＨ不全がＤＳにおける認知低下の年齢依存的な獲得に関与すること、及びＤＳにおけるパルス状ＧｎＲＨ処置によって嗅覚及び認知に関連付けられる障害を回復可能にすることを実証した。本発明者らはさらに、ＧｎＲＨ不全が、認知低下が嗅覚機能障害に関連付けられる認知障害の病理学的経路に関与すること、及び、したがって、パルス状ＧｎＲＨ投与を、嗅覚機能障害に関連付けられる認知障害の処置のために使用できることを実証している。したがって、本発明は、認知障害の処置のためのＧｎＲＨの使用に関し、前記ＧｎＲＨは、パルス投与により投与される。本発明はさらにｍｉＲ－２００及び／又はｍｉＲ－１５５に関し、それらは、認知障害の処置における使用のための、ＧｎＲＨ分泌調節に関与することが公知である。
Description
本発明の分野
本発明は、嗅覚機能障害に関連付けられる認知障害を処置するための新規治療方法に関する。本発明は特に、嗅覚機能障害に関連付けられる認知障害の処置のためのゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のパルス投与に関する。
本発明の背景
嗅覚障害及び認知障害の関連性は、いくつかの障害において見出される。嗅覚機能障害は、例えば アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、ダウン症、又は非ダウン症の遅滞（Doty, 2012）において示されており、一般的な病理学的基質がこれらの疾患において含まれうることを示唆する。しかし、この嗅覚障害に関与する機構は依然として不明である。
認知障害は一般的に、記憶障害、ならびに少なくとも１つの他の認知領域、例えば注意、言語、視空間スキル、又は問題解決などの障害を含む。これらの障害によって、患者の日々の機能的活動が大きく損なわれ、一般的に集中的な健康管理が要求される。
今日まで、認知障害のための満足できる標準的な処置はない。
このように、認知障害のための新規治療アプローチについての必要性がある。
ダウン症候群（ＤＳ）は、２１トリソミーとしても公知であり、知的障害の最も一般的な遺伝的形態であり、世界中での出生数１万人当たり１０～１４人の有病率であり、年齢に依存的な複数の併存疾患に関連付けられる（Antonarakis, 2017；Bayen et al., 2018）。ＤＳを伴う患者は実際に、しばしば４０歳の誕生日までに顕在化する加齢の生理学及び状態を加速させているように見える。特に、ＤＳを伴う成人は、２１番染色体上のこの遺伝子の位置の結果として、ＡＰＰによりコードされるアミロイド前駆体タンパク質の過剰発現に部分的に起因するアルツハイマー病（ＡＤ）を発生する非常に高いリスクがある。死後試験によって、ＤＳを伴う成人のほぼ１００%が４０歳までにＡＤの神経病理学的変化を示すことが明らかにされているが（Editorial, 2013；Lott and Head, 2019）、臨床試験によって、ＤＳを伴う４０歳未満の人々では、生涯にわたる知的障害にもかかわらず、認知症の率は全体的に低いことが示されている。しかし、認知症の臨床症状は４０歳以降から迅速に現れる（Ballard et al., 2016）。
ＤＳはしばしば、妊孕性及び嗅覚障害に関連付けられる。不思議なことに、これらの特色はまた、別の障害であるカルマン症候群（ＫＳ）において見出すことができる。ＫＳは、生殖軸及び嗅覚系の両方に影響する遺伝性疾患である。それは、嗅覚プラコードから脳中へのゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）ニューロンの移動の失敗により起こされる低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の形態である。患者は、春機発動期開始及び妊孕性の非存在、ならびに嗅覚の喪失を呈する。
ＤＳ患者は、妊孕性障害及び加速加齢生理を有する。自然な加齢過程は、視床下部－下垂体性腺軸の変化をもたらし、最初にエストロゲンの劇的な低下（Studd et al., 1978）及び男性でのテストステロンの漸減（Deslypere et al., 1987）に導く。女性での低エストロゲン（Manly et al., 2000）及び男性での低テストステロンの両方が、不良な認知能力及びＡＤの増加リスクと一貫して関連付けられてきた（Moffat et al., 2004；Yaffe et al., 2002）。女性での性腺ステロイドの劇的な低下は、閉経期での卵巣予備能の喪失に起因し、それによって、生殖及び種の生存を制御する神経ホルモンであるＧｎＲＨを放出する視床下部ニューロンの活性における著しく永続的な増加が誘発される。この増加は、ＧｎＲＨ分泌に対するエストロゲンの抑制的なネガティブフィードバック効果の欠如に起因し、黄体形成ホルモン（ＬＨ）を含む、下垂体により放出されるゴナドトロピンの循環レベルにおける劇的な増加をもたらす（Studd et al., 1978；Yen and Tsai, 1971）。高齢男性では、テストステロンパルス頻度及び血清レベルの減少は、視床下部－下垂体機能の変化と関連付けられ、それは加齢に伴うＧｎＲＨ分泌の漸減に起因しうる（Deslypere et al., 1987）。同様に、閉経後の高齢女性は、加齢に伴い、生殖軸の視床下部部分のパルス状活性が著しく減少する（Hall et al., 2000）。視床下部のＧｎＲＨ分泌における加齢に関連する低下の存在を示唆するヒトでのこれらの試験と並行して、マウスでの最近の試験によって、全身の加齢におけるＧｎＲＨ神経内分泌系の関与が提唱された（Zhang et al., 2013）。
上の観点において、本発明者らは、後天性ＧｎＲＨ欠損症が、ＤＳにおける認知低下の加齢依存的な獲得において役割を果たすことができるか否かを評価した（Schapiro et al., 1987）。
ＧｎＲＨニューロン及び嗅覚ニューロンの両方が、嗅覚プラコードにおける同じグループの前駆細胞から生じ、ＧｎＲＨニューロンが、さらなる胚発生の間に脳の視床下部中に移動する。この共有された起源によって、ＧｎＲＨ系と嗅覚系の間の関連が強調される。本発明者らは、このように、ＧｎＲＨ欠損症が、嗅覚機能障害に関連付けられる認知障害に関与しうるか否かをさらに評価した。
詳細な説明
ＤＳのマウスモデル（Ｔｓ６５Ｄｎ）を使用し、本発明者らは、認知障害の獲得、しかし、また、嗅覚の低下である無嗅覚症が、ＤＳ（Nijjar and Murphy, 2002）及び認知症（Doty, 2012）の両方の特徴でもあり、出生後発達の間での脳におけるＧｎＲＨ発現の段階的な喪失を伴い、成体期におけるパルス状ＬＨ分泌のパターン変化に関連付けられることを実証した。本発明者らはさらに、海馬及び皮質におけるＧｎＲＨ－Ｒ発現ニューロンの活性を阻害することによって、コントロールの野生型マウスにおいて認知及び嗅覚障害が誘導されることを示した。本発明者らは特に、不妊症を管理するために先天性低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の患者に通常投与されるパルス状ＧｎＲＨ処置（Boehm et al., 2015）によって、ＤＳにおける嗅覚及び認知関連障害が逆転されることを実証した。
本発明者らはさらに、パルス状ＧｎＲＨ処置によって、Ｔｓ６５Ｄｎマウスの皮質におけるＡＤ関連タンパク質、例えばＴａｕＣｔｅｒなどの発現の減少を可能にすることができ、及び、これが、ＡＤ症状の出現の前、即ち、ＡＤの初期段階においてであることを実証した。Ｔｓ６５Ｄｎマウスも、ＡＤの有用なモデルと考えられていることは注目に値するが、ＤＳ患者（ヒト又はマウス）が、２１番染色体上（又はマウスにおける対応する１６番染色体上）に位置付けられるＡＰＰ遺伝子の過剰発現のために、アルツハイマー病（ＡＤ）を発生する非常に高いリスクがあるとの事実に起因する。
本願はこのように、以下を示す：
－ ＧｎＲＨ欠損が、ＤＳにおける認知低下の年齢依存的な獲得に関与する；
－ 視床下部外構造におけるＧｎＲＨ－Ｒ発現ニューロンの阻害によって、認知障害及び嗅覚障害の両方が誘導される；
－ パルス状ＧｎＲＨ処置によって、ＤＳにおける嗅覚及び認知に関連付けられる障害が逆転させることが可能になる；及び
－ ＧｎＲＨ処置によって、ＡＤに関連付けられるタンパク質の発現を低下させることが可能になり、ＡＤは嗅覚機能障害に関連付けられることが公知である（例：Doty, 2012を参照のこと）。
－ ＧｎＲＨ欠損が、ＤＳにおける認知低下の年齢依存的な獲得に関与する；
－ 視床下部外構造におけるＧｎＲＨ－Ｒ発現ニューロンの阻害によって、認知障害及び嗅覚障害の両方が誘導される；
－ パルス状ＧｎＲＨ処置によって、ＤＳにおける嗅覚及び認知に関連付けられる障害が逆転させることが可能になる；及び
－ ＧｎＲＨ処置によって、ＡＤに関連付けられるタンパク質の発現を低下させることが可能になり、ＡＤは嗅覚機能障害に関連付けられることが公知である（例：Doty, 2012を参照のこと）。
上で言及するように、ＤＳ及びＡＤ以外の複数の認知障害（例えばパーキンソン病、認知症、又は非ダウン症の遅滞など）は、随伴性の嗅覚機能障害及び認知低下に関連付けられる。認知低下が嗅覚機能障害に関連付けられる認知障害は、このように、同じ病理学的経路を共有する。
ＧｎＲＨニューロンは、胚発生の間に嗅覚前駆細胞から由来し、本明細書中で実証するように、ＧｎＲＨ発現における欠損によって嗅覚障害及び認知障害が誘導される。
このように、理論により拘束されることなく、本願は、ＧｎＲＨ欠損症が、認知低下が嗅覚障害に関連付けられる認知障害の病理学的経路に関与することを示す。
本願は、このように、ＧｎＲＨ置換処置によって、認知障害における嗅覚障害及び認知障害を逆転させることが可能になることを実証する。
したがって、本発明は、それを必要とする患者における認知障害の処置における使用のためのＧｎＲＨに関し、それにおいて前記ＧｎＲＨはパルス投与により投与される。
本発明は、特に、それを必要とする患者における認知障害の処置における使用のためのＧｎＲＨに関し、それにおいて前記ＧｎＲＨはパルス投与により投与され、及びそれにおいて前記患者は嗅覚機能障害を有する。
本発明はまた、それを必要とする患者における認知障害を処置するための、前記患者へのＧｎＲＨのパルス投与を含む方法に関する。特定の実施形態では、前記患者は嗅覚機能障害を有する。
ＧｎＲＨは、視床下部において位置付けられるＧｎＲＨニューロンからパルス状様式で放出される神経ホルモンである。ＧｎＲＨ発現によって、下垂体前葉からの黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌が制御される。差動的なＧｎＲＨパルス頻度及び振幅によって、ＦＳＨ及びＬＨの分泌パターンが変化する。ＧｎＲＨはデカペプチドである。本発明の文脈において、「ＧｎＲＨ」は、上のＧｎＲＨデカペプチド、及び任意の水溶性のイオン化可能な形態のＧｎＲＨ（遊離塩基、塩、もしくは誘導体、ホモログ、又はそれらの類似体を含む）を指す。特定の実施形態では、「ＧｎＲＨ」は、ゴナドレリン、及び特に以下を指す：
－ FACTREL（登録商標）、HRF（登録商標）、及びLUFORAN（登録商標）として商業的に入手可能なＧｎＲＨ塩酸塩（ＨＣｌ）；又は
－ LUTRELEF（登録商標）、LUTREPULSE（登録商標）、KRYPTOCUR（登録商標）、LHRHFERRING（登録商標）、LUTAMIN（登録商標）、RELISORML（登録商標）、CYSTORELIN（登録商標）、又はRELISORM（登録商標）として商業的に入手可能なＧｎＲＨ酢酸塩／二酢酸塩。
－ FACTREL（登録商標）、HRF（登録商標）、及びLUFORAN（登録商標）として商業的に入手可能なＧｎＲＨ塩酸塩（ＨＣｌ）；又は
－ LUTRELEF（登録商標）、LUTREPULSE（登録商標）、KRYPTOCUR（登録商標）、LHRHFERRING（登録商標）、LUTAMIN（登録商標）、RELISORML（登録商標）、CYSTORELIN（登録商標）、又はRELISORM（登録商標）として商業的に入手可能なＧｎＲＨ酢酸塩／二酢酸塩。
ゴナドレリンは、ヒト視床下部において合成された内因性ＧｎＲＨと同じアミノ酸配列を有し、このように、内因性ＧｎＲＨと同じ薬理学的及び毒物学的プロファイルを有する合成デカペプチドである。
本発明の文脈において、ＧｎＲＨは「パルス」様式で投与される。上記のように、ＧｎＲＨは特定のパルス頻度及び振幅を伴って自然に分泌される。前記の頻度及び振幅は、種、性別、及び年齢に従って変動する。本発明の文脈において、「パルス」投与によって、患者と同じ種及び性別の中年期成人（即ち、ヒトでは２０～３０歳の間）の自然の内因性ＧｎＲＨパルスピーク、即ち、患者と同じ種及び性別の中年期成人において観察されたＧｎＲＨの頻度及び振幅が再現される。パルス状ＧｎＲＨ投与は一般的に、生殖障害、例えば低ゴナドトロピン性性腺機能低下症に起因する、例えば、カルマン症候群（Boehm et al. 2015；又は例えば、Leyendecker et al. 1980；Schoemaker et al. 1981；Reid et al. 1981；Keogh et al. 1981, Hayes et al. 2013；又はアクセッション番号ＮＣＴ００３８３６５６の米国国立医学図書館において参照される進行中の臨床試験を参照のこと）としての、無月経及び不妊症などの処置のために使用される。このように、当業者は、内因性ＧｎＲＨパルスピークに達するために使用される投与の量／頻度を知っている。
典型的には、ヒトの内因性ＧｎＲＨパルスピークは、パルス当たり２５から６００ng/kgまで変動し、６０から１８０分毎のピークを伴う（Hayes et al. 2013を参照のこと）。
典型的には、男性のＧｎＲＨパルスピークは、６０から１８０分毎の１０から４０ng/kgのＧｎＲＨの、特に９０から１５０分毎の２０から３０ng/kgのＧｎＲＨの投与に対応する。男性における典型的なＧｎＲＨパルスピークは、１２０分毎の２５ng/kgのＧｎＲＨである（Boehm et al. 2015を参照のこと）。
典型的には、女性のＧｎＲＨパルスピークは、６０から１２０分毎の５０から１００ng/kgのＧｎＲＨの、特に８０から１１０分毎の６５から８５ng/kgのＧｎＲＨの投与に対応する。女性における典型的なＧｎＲＨパルスピークは、９０分毎の７５ng/kg（即ち、９０分毎の３から１０μg－Boehm et al. 2015又は臨床試験ＮＣＴ００３８３６５６を参照のこと）のＧｎＲＨである。
当業者は、前記パルス状ＧｎＲＨをどのように患者に投与するかを知っている。ＧｎＲＨは、典型的には、経皮、経口、又は非経口投与を介して投与される。本明細書中で使用するように、用語「非経口」は、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、筋肉内投与ならびに注入投与を含む。ＧｎＲＨは、典型的には、医薬的に許容可能な賦形剤と組み合わせて、経皮投与又は非経口投与のために適切な治療用組成物を形成する。
ＧｎＲＨは、典型的には、上記の内因性ＧｎＲＨパルスピークを再現するように、経皮送達システム、例えば特定の間隔でＧｎＲＨボーラスを送達するポンプ（例、携帯型注入ポンプ）などを介して投与される。Ferring Pharmaceuticalsにより産生及び商品化されたLUTREPULSE（登録商標）システムは、そのようなポンプの例である。他の適切なポンプは、例えば、参考文献ＷＯ２００７０４１３８６の下で公開された国際特許出願において又は米国特許第４，７２２，７３４号；第５，０１３，２９３号；第５，３１２，３２５号；第５，３２８，４５４号；第５，３３６，１６８号；及び５，３７２，５７９において開示されている。
あるいは、ＧｎＲＨは、移植されたＧｎＲＨ産生ニューロンを介して投与することができる。この実施形態によれば、ＧｎＲＨ産生ニューロンは、患者の天然ＧｎＲＨニューロンを置換するように患者に移植され、それにより、ＧｎＲＨ不全を治療する。本願の実施例のセクションにおいて実証されるように、ＧｎＲＨ分泌ニューロンの移植に基づく細胞治療によって、パルス状ＧｎＲＨ分泌の回復が可能になり、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおける嗅覚及び認知関連の障害が逆転される。
Lund et al (2013)において説明されているように、ＧｎＲＨ分泌ニューロンをヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から、特にヒト誘導性多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、例えば、健常なドナー線維芽細胞から確立されたｈｉＰＳＣから発生させることが可能である。そのようなＧｎＲＨ分泌ニューロンの産生においては、ヒト胚の破壊は不要である。
本願を通して説明されるように、本発明は、特に嗅覚機能障害に関連付けられる認知障害を処置するためにＧｎＲＨパルス分泌を回復することを目的とする。ＧｎＲＨ発現は、いくつかのｍｉＲＮＡの作用を介して調節される。特に、ｍｉＲＮＡ－２００ファミリーのメンバー及びｍｉＲ－１５５は、Ｚｅｂ１及びＣｅｂｐｂ（ＧｎＲＨプロモーターアクチベーターの２つの重要なリプレッサー）をそれぞれ調節することが公知であり（Messina et al (2016)ならびに参考文献ＷＯ２０１７／１８２５８０の下で開示される国際特許出願を参照のこと）。本発明者らは、このように、ｍｉＲＮＡ－２００ファミリーメンバー（「ｍｉＲ－２００」として言及される）及び／又はｍｉＲ－１５５を過剰発現させることにより、患者におけるパルス状ＧｎＲＨ発現を回復することが可能であることを実証している。本発明者らは、ｍｉＲ－２００の視床下部過剰発現によって、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおける匂いを区別する能力及び新規物体を認識する能力の両方のレスキューがもたらされることを特に実証している。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする患者における認知障害の処置におけるに使用のためのｍｉＲ－２００及び／又はｍｉＲ－１５５に関する。
特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者における認知障害の処置における使用のためのｍｉＲ－２００及び／又はｍｉＲ－１５５に関し、それにおいて患者は嗅覚機能障害を有する。
本発明はまた、治療有効量のｍｉＲ－２００及び／又はｍｉＲ－１５５を前記患者に投与することを含む、それを必要とする患者における認知障害を処置するための方法に関する。特定の実施形態では、前記患者は嗅覚機能障害を有する。
「治療有効量」は、患者に治療的な利益を付与するために、即ち、本発明の場合では、前記患者におけるＧｎＲＨパルス分泌を回復するために必要である最小量の活性薬剤（即ち、ｍｉＲＮＡ）について意図する。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、生物学的過程の重大な調節因子として出現している小さな非コードＲＮＡである。「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、又は「ｍｉＲ」は、約１８から約２５ヌクレオチドの長さの非コードＲＮＡを意味する。これらのｍｉＲは、ｍｉＲＮＡをコードする個々の遺伝子を含む複数の起源から、タンパク質をコードする遺伝子のイントロンから、又は複数の密接に関連するマイクロＲＮＡをしばしばコードするポリシストロン性転写物から由来しうる。
ｍｉＲ－２００ファミリーは、ｍｉＲ－２００ａ（ｍｉＲデータベース中の参考文献ＭＩ００００７３７の下で又はＥｎｓｅｍｂｌデータベース中の参考文献ＥＮＳＧ０００００２０７６０７の下でアクセス可能なヒト配列）、ｍｉＲ－２００ｂ（ｍｉＲデータベース中の参考文献ＭＩ００００３４２の下で又はＥｎｓｅｍｂｌデータベース中の参考文献ＥＮＳＧ０００００２０７７３０の下でアクセス可能なヒト配列）、ｍｉＲ－２００ｃ（ｍｉＲデータベース中の参考文献ＭＩ００００６５０の下で又はＥｎｓｅｍｂｌデータベース中の参考文献ＥＮＳＧ０００００２０７７１３の下でアクセス可能なヒト配列）、ｍｉＲ－１４１（ｍｉＲデータベース中の参考文献ＭＩ００００４５７の下で又はＥｎｓｅｍｂｌデータベース中の参考文献ＥＮＳＧ０００００２０７７０８の下でアクセス可能なヒト配列）、及びｍｉＲ－４２９（ｍｉＲデータベース中の参考文献ＭＩ０００１６４１の下で又はＥｎｓｅｍｂｌデータベース中の参考文献ＥＮＳＧ０００００１９８９７６の下でアクセス可能なヒト配列）を含む。「ｍｉＲ－２００」により、それは、本明細書中で、上に列挙するｍｉＲ２００ファミリーの任意のｍｉＲＮＡとして言及される。
ＭｉＲ－１５５は、ｍｉＲデータベース中の参考文献ＭＩ００００６８１の下で及びＥｎｓｅｍｂｌデータベース中の参考文献ＥＮＳＧ０００００２８３９０４の下で示される配列を有する。
全てのこれらのｍｉＲＮＡは当業者に公知である。それらは、インビボでの細胞の核への核酸の送達のために公知の任意の手順を用いて投与し、それを必要とする患者におけるパルス状ＧｎＲＨ発現を回復させることができる。特に、ｍｉＲ－２００ファミリーメンバー及びｍｉＲ－１５５は、組換え技術を使用して投与することができる。例えば、適切なベクターを宿主細胞中に挿入し、その細胞中で発現させて、上のｍｉＲを発現させてもよい。
本明細書中で使用するように、用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。適切なベクターの１つの型は、ウイルスベクター（例、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））である。
本発明によれば、パルス状ＧｎＲＨ、ｍｉＲ２００、及び／又はｍｉＲ１５５は、認知障害の処置のために投与される。「認知障害」は、任意の公知の認知障害、特に、嗅覚機能障害に関連付けられる認知低下を伴う認知障害でありうる。
「認知障害」は、「神経認知障害」としても言及され、以前に達成された認知機能のレベルからの低下（Sachdev et al. 2014を参照のこと）、即ち、知覚運動機能（視覚知覚、視覚構築推論、知覚－運動協調）、言語（対象の命名、単語の発見、流暢さ、文法及び構文、受容言語）、学習及び記憶（自由想起、手がかり想起、認識記憶、意味的及び自伝的長期記憶、潜在学習）、社会的認知（感情の認識、心の理論、洞察）、複雑な注意（持続的注意、分割的注意、選択的注意、処理速度）及び実行機能（計画、意思決定、作業記憶、フィードバックへの応答、抑制、柔軟性）における低下により特徴付けられる。総説については、米国精神医学会（ＡＰＡ）により発行された精神障害の診断・統計マニュアル（ＤＳＭ－Ｖ‐現場における参照）の第５版によって、神経認知障害の診断のための一般的なフレームワークが提供されている。ＤＳＭ－Ｖは、特に主な認知症候群を記載している。それによって認知障害がせん妄、軽度及び重度神経認知障害の３つのカテゴリーに分類されており、軽度及び重度神経認知障害の特定の病因サブタイプを描写するための基準が定義されている。主な病因のサブタイプはアルツハイマー病；前頭側頭葉変性症、ＨＩＶ感染症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、プリオン病、物質及び／又は薬物使用、外傷性脳損傷、及び血管疾患である。
上で言及するように、いくつかの認知障害は、嗅覚機能障害に関連付けられる認知低下を含む。Doty et al (2012)において開示されているように、そのような認知障害は、例えば、ダウン症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、又は非ダウン症の遅滞である。
特定の態様によれば、本発明による認知障害はダウン症候群である。別の態様によると、認知障害はアルツハイマー病である。さらなる態様によれば、認知障害はパーキンソン病である。
さらに、加齢に関連付けられる認知機能の低下、特により高齢における軽度の認知機能障害は、初期の嗅覚機能障害に関連付けられることが公知である（Wilson et al. 2007を参照のこと）。したがって、さらなる一態様では、本発明による認知障害は、加齢に関連付けられる認知低下である。
嗅覚機能障害は、一般的に認知疾患の初期段階において又は中期段階において現れる。したがって、別の実施形態によれば、認知障害は、初期段階又は中期段階にある。特定の実施形態によれば、認知障害は初期段階にある。
例えば、アルツハイマー病は３つの段階を伴うスペクトルで進行することが公知である－症状を伴わない初期の前臨床段階；軽度認知障害の中期段階；及び認知症の症状により特徴づけられる最終段階。初期段階は、アミロイド蓄積及び他の神経細胞の変化を含む脳変化を含むが、しかし、重大な臨床症状を伴わない。中期段階は、人の年齢及び教育のため通常よりも大きいが、しかし、彼又は彼女の非依存に干渉しない記憶及び／又は他の思考の問題の症状を含む。ＡＤの最終段階は、記憶喪失、単語発見の困難、及び非依存的に機能する人の能力を損なうのに十分に重大な視覚／空間の問題を含む（Sperling et al. 2011を参照のこと）。ＡＤの間に、嗅覚機能障害は、主に無症候性の前臨床段階の間に、さらに「軽度認知障害」に対応する中間段階の間に現れる。したがって、特定の実施形態では、本発明による認知障害は、初期段階のアルツハイマー病である。
嗅覚機能障害はまた、パーキンソン病の初期段階の間に現れる（Ross et al. 2008を参照）。パーキンソン病は、ホーエン・ヤール重症度分類（Ｈｏｅｈｎ ａｎｄ Ｙａｈｒ Ｓｃａｌｅ）として公知の５つの段階に従って進行する。本発明によるパーキンソン病の初期段階は、ステージＩ、ＩＩ及びそれより初期（即ち、「前段階パーキンソン病」）である。したがって、別の特定の実施形態では、本発明による認知障害は、初期段階のパーキンソン病である。
Wilson et al (2007)において示されているように、嗅覚機能障害は加齢に関連付けられる認知低下の間に初期に現れる。このように、さらなる一実施形態によれば、本発明による認知障害は、加齢に関連付けられる認知低下の初期段階である。
また、上で説明したように、ＤＳ患者は生涯にわたる知的障害を示すが、しかし、特に年齢４０歳前後で強い認知低下を、４０歳後に認知症を示す。したがって、ＧｎＲＨ補充治療は、青年期から、又は少なくとも若年成人１８－２０において使用され、患者の認知能力を改善し、認知症の発症を遅延させることができる。したがって、さらなる実施形態では、本発明による認知障害は、「初期段階」ＤＳ、即ち、４０歳又はそれ以上の患者において現れる加齢に関連する認知低下の前である。
本発明による認知障害は、嗅覚機能障害に関連付けられる（ＧｎＲＨ欠損症に関連付けられる認知障害を特異的に標的とするため）。「嗅覚機能障害」は、嗅覚における変化に対応する。前記変化は、「無嗅覚症」とも呼ばれる嗅覚の完全な喪失、又は「嗅覚減退症」もしくは「ミクロスミア」として言及される部分的な嗅覚でありうる。複数の嗅覚テストが、患者の嗅覚機能を評価するためにそれらを使用することに慣れた当業者に利用可能である。嗅覚テストは、精神物理学的テスト、電気生理学的テスト、及び精神生理学的テストに分けることができる（例えば、Doty et al (2007)；Eibenstein et al (2005)及びKobal et al (1994)を参照のこと）。テストの例は、患者に馴染みのある匂い物質を提示することを意味し、患者は次に、オプションのリストから匂いの名前を選ばなければならない。閾値テストも使用することができる。それらは、患者により識別されることができる匂い物質の最も低い濃度を決定することを目的とする。
本発明の文脈では、「患者」は、哺乳動物（例、イヌ、ネコ、ブタ）である。特定の実施形態では、患者はヒトである。
本明細書中で使用するように、用語「処置する」又は「処置」は、そのような用語が適用される障害又は状態を逆転させる、緩和する、その進行を阻害する、又は防止すること、あるいはそのような用語が適用される障害又は状態の１つ又は複数の症状を逆転させる、緩和する、その進行を阻害する、又は防止することに関する。
本発明を、以下の図面及び実施例によりさらに例証する。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして任意の方法で解釈すべきではない。
実施例
実施例１
Ｔｓ６５ｄｎ雄マウスは、性的成熟の遅延、性腺機能低下症、及び不妊症を示す。
性的発達の異常及び不妊症は、ダウン症（ＤＳ）を伴う患者において記載されている（Hsiang et al., 1987）。等しく、Ｔｓ６５ｄｎマウスにおける成体の妊孕性の変化が以前に報告されており、このように、雄は不妊症を示し、雌は低受胎性である（Moore et al., 2010）；しかし、性的成熟は、このマウスモデルにおいて探索されたことはない。本明細書では、Ｔｓ６５ｄｎマウスにおける生殖成熟の表現型の特徴付けを、出生から成体期まで実施した。
Ｔｓ６５ｄｎ雄は、出生後の成熟及び春機発動期移行の間に、野生型同腹仔よりも小さく、有意に低い体重増加を示した。春機発動期の開始での著しい遅延が、野生型同腹仔と比較し、雄Ｔｓ６５ｄｎマウスにおいて観察された。Ｔｓ６５ｄｎ雄は、亀頭包皮分離における遅延を示し、より小さな陰茎及びそれらの精巣は陰嚢中に下降しなかったが、それらの全てが、出生後の性的成熟を追跡するために使用される外部徴候である。亀頭包皮分離時の体重は、Ｔｓ６５Ｄｎと野生型同腹仔の間で同一であったが、遅延した成長が性的成熟における遅延に関与しうることを示唆する。さらに、Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、主要な尿タンパク質の発現の不規則なプロファイルを呈したが、それは、尿中の排泄がテストステロンにより刺激され、マウスにおける性的成熟のマーカーとしても使用される。成体期では、Ｔｓ６５ｄｎ雄は重度の性腺機能低下症を明らかにし、野生型マウスと比較してより低い精巣重量及びより小さな精巣を示した。
ＧｎＲＨパルス状分泌は妊孕性に不可欠であるため（Belchetz et al., 1978）、本発明者らは次に、成体において尾からの連続的な血液サンプリングを実施することにより、ＧｎＲＨ分泌の代理マーカーである黄体形成ホルモン（ＬＨ）の分泌プロファイルを評価した。差はＬＨパルス頻度において見出されなかったが、Ｔｓ６５ｄｎ雄は、野生型同腹仔と比較した場合、有意に低下したＬＨパルスの振幅を示した。ＬＨパルス状態の調節解除は、出生後発達の間でのＧｎＲＨニューロン求心性ネットワークの変化により説明することができるため（Tata et al., 2018）、ＧｎＲＨニューロンへのグルタミン酸作動性及びＧＡＢＡ作動性の並置を分析した。本発明者らは、ＷＴ同腹仔と比較した場合、生後１２日目（Ｐ１２）及びＰ３５の両方で、Ｔｓ６５ｄｎマウスにおけるＧｎＲＨニューロンの細胞体での小胞グルタミン酸トランスポーター２（ｖＧｌｕＴ２）－又はＧＡＢＡトランスポーター（ｖＧａＴ）－免疫反応性点の並置数において任意の差を見出さなかった。性的成熟の間での視床下部－下垂体－性腺（ＨＰＧ）軸の機能をさらに探索するために、ゴナドトロピン、ＬＨ、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、及びテストステロンの循環レベルを小春機発動期（ｍｉｎｉｐｕｂｅｒｔｙ）（Ｐ１２）、即ち、ＨＰＧ軸の最初の出生前活性化に、及び成体において測定した。Ｐ１２では、ＦＳＨレベルではなくＬＨレベルが、野生型同腹仔と比較した場合、Ｔｓ６５ｄｎ雄において有意に上昇していることが見出された。成体雄ＤＳマウスでは、ＬＨレベル及びＦＳＨレベルの両方が有意に増加していることが見出されたのに対し、テストステロンレベルは野生型のものと同等であった。これらの結果は、血漿テストステロンレベルが正常であるが、ＦＳＨ及びＬＨのレベルが有意に上昇していることが見出されている成体ＤＳ雄において報告された所見と一致している（Hsiang et al., 1987）。性腺ステロイドにおける欠乏に応答する視床下部の能力を探るために、本発明者らは次に、両側精巣摘除術の前（コントロール）、ならびに１４及び３０日後にテストステロン及びＬＨの血清レベルを測定した。結果は、精巣摘除術によって野生型マウス及びＴｓ６５Ｄｎマウスの両方においてＬＨ循環レベルが強く増加することを示す（データは示さず）。インタクトな状態と同様に、ＬＨレベルが、野生型同腹仔においてよりもＴｓ６５Ｄｎにおいて精巣摘除後に有意に高いことが見出された。一緒に、これらのデータは、性腺と性腺ステロイドを含む視床下部の間でのコミュニケーション過程がＴｓ６５Ｄｎマウスにおいて不変であるように見えることを示す。
雌における性的成熟の表現型の特徴付けによって、雄と同様に、体重増加が、出生後発達及び春機発動期移行の間で、野生型同腹仔よりもＴｓ６５ｄｎにおいて有意に低いことが示された。Ｔｓ６５ｄｎ雌は、循環エストラジオールレベルにおける増加の指標である、遅延した膣開口を示したが、しかし、差は最初の発情の発生日において見出されず、それは、生殖能力の獲得、即ち、春機発動期と厳密に相関する。膣開口時及び春機発動期開始時の体重は、野生型同腹仔よりもＴｓ６５Ｄｎ雌において低かった。成体Ｔｓ６５ｄｎ雌も、発情間期においてより低い子宮重量を呈した。Ｔｓ６５ｄｎ雌マウスは規則的な発情周期を示したにもかかわらず、それらは、野生型同腹仔と比較した場合、１２０日間にわたり産生されたより少ない同腹仔数及び同腹仔当たりのより少ない仔数を伴う減弱した忍容性を示した。しかし、差は、発情間期中のＴｓ６５ｄｎマウスと野生型雌マウスの間でＬＨ分泌のパターンにおいて、またＦＳＨの循環レベルにおいて検出されなかった。
Ｔｓ６５ｄｎマウスはＧｎＲＨ発現の年齢依存的な喪失を示す。
妥当なＧｎＲＨニューロンネットワーク発生は性的成熟及び正しいＨＰＧ軸機能のために不可欠であるため、本発明者らは次に、Ｔｓ６５ｄｎマウスの脳におけるＧｎＲＨニューロンの分布を評価した。この目的のために、本発明者らは、ＧｎＲＨについての新生仔（Ｐ０）及び成体（Ｐ９０）の脳のホールマウント免疫標識、それに続く溶媒除去器官の３次元イメージング（３ＤＩＳＣＯ）（胚及び出生後脳におけるニューロン接続を同様に試験するために以前に使用されてきた）を実施した（Belle et al., 2017；Casoni et al., 2016）。３Ｄ分析によって、Ｔｓ６５ｄｎマウスとＷＴ同腹仔の間で出生時（Ｐ０）でのＧｎＲＨ細胞体の分布及び数において差はないが、Ｔｓ６５ｄｎマウスは、成体期においてＧｎＲＨ免疫反応性細胞体及び線維の有意な喪失を示した。視床下部のＧｎＲＨペプチド含量は、出生と春機発動期の間に進行性に増加し、乳仔期の間での小春機発動期の開始を伴う過程の加速を伴う（Ｐ７－Ｐ１２）（Messina et al., 2016；Prevot, 2015）。ＧｎＲＨ発現が減少し始める段階を特定するために、本発明者らは次に、Ｔｓ６５ｄｎマウスにおける出生後発達の間での視床下部ＧｎＲＨ免疫反応性を調べた。従来の神経解剖学的分析によって、視床下部のＧｎＲＨ免疫反応性ニューロンの数における喪失が、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおける春機発動期の開始後にだけ生じることが示された。ヒトにおいて行われた最近の試験によって、視床下部中でのそれらの分布に加えて、ＧｎＲＨ細胞体及び線維がいくつかの視床下部外脳領域でも見いだされることが明らかにされている（Casoni et al., 2016）。したがって、３ＤにおけるＧｎＲＨニューロン線維の追跡によって、正中隆起における古典的な向下垂体ＧｎＲＨ投射だけでなく、しかし、また、成体野生型マウスにおける視床下部外領域における多数のＧｎＲＨニューロン投射も強調された。ＧｎＲＨ免疫反応性線維は実際に、内側手綱及び前背側扁桃体まで容易に追跡することができ（Rance et al., 1994）、側脳室の壁に続いている、又は密接な関連においてしばしば見られた。しかし、成体Ｔｓ６５ｄｎマウスでは、ＧｎＲＨ線維は正中隆起において視覚化できたが、野生型において見られたＧｎＲＨ免疫反応性の拡張投射ネットワークは存在しなかった。野生型における視床下部外領域におけるＧｎＲＨ免疫反応性線維の広範な分布は、種の生存を制御するＧｎＲＨニューロンも非生殖過程においても関与し得ることを示唆する。当然の結果として、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおけるこれらの視床下部外ＧｎＲＨ線維の非存在によって、このＧｎＲＨ欠損症が、このＤＳのマウスモデルにおける認知表現型に寄与しうるという興味深い仮説が提起される。
Ｔｓ６５ｄｎマウスは、年齢依存的な嗅覚及び認知機能の喪失を示す。
ＤＳ患者及びＴｓ６５Ｄｎマウスは、精神遅滞（Epstein et al., 1991；Reeves et al., 1995）だけでなく、しかし、また、加齢に関連する嗅覚の障害（Bianchi et al., 2014；Nijjar and Murphy, 2002）を呈している。興味深いことに、匂いを知覚する能力の機能不全は、カルマン症候群を伴う患者におけるＧｎＲＨ欠損症に関連付けられる（Boehm et al., 2015）。嗅覚の手がかりは哺乳行動において重要な役割を果たすため（Risser and Slotnick, 1987）、ＧｎＲＨニューロンの正常な補体及び野生型同腹仔と同等の量の胃中の牛乳を示す（示さず）Ｔｓ６５ｄｎ仔における出生時の嗅覚は、胚発生中の鼻から脳への欠損したＧｎＲＨニューロン移動を伴い、カルマン遺伝子中に変異を保有し、出生時に死亡するマウスとは対照的に、著しく影響されるようには見えなかった（Hanchate et al., 2012）。Ｔｓ６５ｄｎマウスにおいて見られるＧｎＲＨ免疫反応性の喪失が、これらのマウスにおける嗅覚及び認知の低下に関連付けられるか否かを評価するために、本発明者らは、異なる匂いを識別するマウスの能力を評価するための馴化／脱馴化テスト（Breton-Provencher et al., 2009）ならびに春機発動期前（Ｐ３５、ＧｎＲＨ免疫反応性がコントロール同腹仔と同等である場合）マウス及び成体（＞Ｐ６０、Ｔｓ６５ＤｎマウスがＧｎＲＨ免疫反応性における喪失を経験する場合）マウスにおける認識記憶を評価するための新規物体認識テスト（Leger et al., 2013）を実施した（図１ａ）。本発明者らは、野生型同腹仔は、匂いが再導入される場合（馴化）、有意に低下した嗅ぎ動作時間を、及び新規の匂いが呈される場合（脱馴化）、嗅ぎ動作の回復を示すことを見出した；春機発動期前の年齢の雄及び雌の両方のＴｓ６５Ｄｎマウスは、異なる匂いの間で区別することができず（図１ｂ）、これらのマウスにおける明らかな嗅覚欠損症を示している。対照的に、Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、Ｐ３５で両方の性別の野生型同腹仔と比較した場合、それらの環境における新たな物体の導入を等しく認識することができた（図１ｄ）。しかし、テストが、２ヶ月後、即ち、若年成体において実施された場合、嗅覚及び認識記憶の両方がＴｓ６５Ｄｎマウスにおいて障害されていることが見られた（図１ｃ）。これらの結果は、興味深いことに、ＧｎＲＨ発現における脳喪失と並行し、雄及び雌の両方のＴｓ６５Ｄｎマウスにおける加齢に関連する認知低下の発生を示す（図１ｅ）。Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおける認知低下が異常な性腺機能に起因するか否かを決定するために、本発明者らは次に、両側精巣摘除術後３ヶ月に野生型マウス及びＴｓ６５Ｄｎマウスの両方において嗅覚と認識記憶を評価した。精巣摘除動物はインタクトな動物（図１ｃ、ｅ）と同様に行動し（図１ｆ、ｇ）、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおいて見られる嗅覚障害及び認知障害が性腺機能不全又は脳と性腺の間の変化したコミュニケーションに起因する可能性が低いことを示唆している。
ＤＳ患者及びマウスの両方において存在するアミロイド前駆体タンパク質（Ａｐｐ）遺伝子の三重化（Reeves et al., 1995）が、ＤＳにおいて観察される早期発症型アルツハイマー病（ＡＤ）の表現型に関連づけられている。Ｔｓ６５ｄｎマウスにおいて観察された後天性欠損症が、ＤＳにおけるＡＤ病理の発生と平行しているか否かを決定するために、本発明者らは次にＡＰＰ、そのＣ末端フラグメント（ＣＴＦ）及びＴａｕ Ｃ末端（Ｔａｕ－Ｃｔｅｒ）をウエスタンブロットにより分析した。タンパク質分析によって、野生型と比較した場合、中年期（８～１２ヶ月）における海馬（図２ａ）中でのＡＰＰ発現における有意な増加が明らかになったが、しかし、若年成体（３ヶ月）のＴｓ６５ｄｎ雄マウスにおいては明らかにならなかった。対照的に、変化は、Ｔｓ６５ｄｎ雄の海馬中でのＣＴＦ及びＴａｕ－Ｃｔｅｒの発現において見られていない（図２ａ）。皮質では、変化は、野生型同腹仔との比較において、Ｔｓ６５ｄｎ雄におけるＡＤ関連タンパク質の発現において見られなかった（図２ｂ）。雌では、本発明者らは、１２ヶ月齢のＴｓ６５Ｄｎ雌における海馬（図２ｃ）及び皮質（図２ｄ）中でＡＰＰ及びＣＴＦ発現における有意な増加を見出したが、差は、海馬中又は皮質中でのタウ－Ｃｔｅｒ発現において見られない（図２ｄ）。このように、Ｔｓ６５Ｄｎマウスの脳におけるＡＰＰ代謝の年齢依存的な調節不全を示す以前の研究（Choi et al., 2009）と一致して、本発明者らは、両方の性別において、ＡＰＰの発現が若い３ヶ月のＴｓ６５ｄｎマウスにおいて影響されず、しかし、野生型同腹仔と比較した場合、中年期動物において増加することが見られる（図２ａｄ）。全体として、これらのデータは、Ｔｓ６５ｄｎマウスにおける嗅覚及び認知の低下が、ＡＰＰ発現における任意の明白な変化の前に生じることを実証する。
Ｔｓ６５ｄｎマウスは、Ｇｎｒｈ発現を制御するｍｉＲＮＡ遺伝子ネットワークにおける不均衡を示す。
Ｔｓ６５ｄｎマウスにおける出生後成熟の間に観察されたＧｎＲＨ免疫反応性の喪失は、興味深いことに、Ｄｉｃｅｒ（マイクロＲＮＡ生合成のために不可欠なＲＮＡｓｅ－ＩＩＩエンドヌクレアーゼ）がＧｎＲＨニューロン中で選択的にノックアウトされたマウスにおいて見られたものを連想させる（Messina et al., 2016）。後天性ＧｎＲＨ欠損症を伴うこれらのマウスがまた、Ｔｓ６５ｄｎマウスの行動表現型の一部を再現するか否かを決定するために、本発明者らは、成体Ｇｎｒｈ：：Ｃｒｅ；ＤｉｃｅｒｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウスを嗅覚及び認知テストに供した。本発明者らは、ＧｎＲＨ発現の出生後喪失に導く、ＧｎＲＨニューロン中での成熟ｍｉＲＮＡ発現の欠如（Messina et al. 2016）がまた、これらのマウスにおいて匂いを識別し、新たな物体を認識する能力において障害を起こし、このように、Ｔｓ６５ｄｎマウスを表現型コピーする（データは示さず）ことを見出した。
ヒト２１番染色体及びマウス１６番染色体の両方は、その複製がＴｓ６５Ｄｎマウス系統を操作するためにが使用されているが（Reeves et al. 1995）、ＤＳ脳において過剰発現されていることが示されている（Elton et al., 2010）少なくとも５つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－９９ａ、ｌｅｔ－７ｃ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２、ｍｉＲ－１５５、及びｍｉＲ－８０２）を含むことが以前に報告された。これらのｍｉＲＮＡにおけるコピー数の変化の効果によって、このように、特定の標的遺伝子の減少した発現がもたらされ、このように、少なくとも部分的に、これらの個体の認知表現型に寄与しうる（Elton et al., 2010；Kuhn et al., 2010）。興味深いことに、本発明者らは最近、ｍｉＲ－９９ａ、ｌｅｔ－７ｃ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２、及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－８０２ではない）がＧｎＲＨニューロンにより発現されること、ならびにそれらの発現がＰ７とＰ１２の間に、即ち、小春機発動期の発症時に有意に増加することを報告した（Messina et al., 2016）。また、これらのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ１５５を含む）の一部がまた、他のｍｉＲＮＡ種の発現、例えばｍｉＲ－２００ファミリーのメンバーの発現などに影響しうるが、それは、出生後発達の間（成体期を含む）にＧｎＲＨ発現を制御する際に重要な役割を果たす（Messina et al., 2016）。ｍｉＲＮＡ－２００ファミリーのメンバー、及びｍｉＲ－１５５は、Ｚｅｂ１及びＣｅｂｐｂ（ＧｎＲＨプロモーターアクチベーターの２つの重要なリプレッサー）をそれぞれ調節することが公知である（Messina et al., 2016）。ｍｉＲＮＡがＴｓ６５ｄｎマウスにおけるＧｎＲＨ免疫反応性の出生後喪失の基礎となる分子機構において含まれているか否かを調べるために、本発明者らは、成体の野生型及びＴｓ６５Ｄｎ同腹仔の視索前野（ＰＯＡ）（齧歯類におけるＧｎＲＨニューロンの主要な集団を含む）中でのｍｉＲＮＡ及び異なる遺伝子の発現を分析した。予期外に、リアルタイムＰＣＲ分析によって、Ｔｓ６５ｄｎマウスのＰＯＡ中でのｍｉＲ－１５５、ｌｅｔ－７ｃ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２、ｍｉＲ－８０２、及びｍｉＲ－９９ａの任意の過剰発現ではなく、しかし、むしろ、これらの遺伝子の減少した発現が明らかになった（データは示さず）。興味深いことに、データによって、Ｇｎｒｈ発現における著しい減少を伴う成体Ｔｓ６５ｄｎマウスのＰＯＡ中でのＺｅｂ１及びＣｅｂｐｂ ｍＲＮＡ発現レベルの有意な上方調節が示された（図４ｃ）。これはまた、大半のｍｉＲＮＡ－２００ファミリーメンバーの発現の下方調節と関連付けられた（データは示さず）。対照的に、差は、Ｄｉｃｅｒ、Ｎｏｓ１（一酸化窒素シンターゼ１）及びその受容体、ｓＧＣ（可溶性グアニル酸シクラーゼ）の発現において、ならびにいくつかの公知のＧｎｒｈレギュレーター（Ｋｉｓｓ１、キスペプチン受容体（Ｋｉｓｓ１ｒ）、ｏｔｘ２、及びｍｅｉｓ１を含む）の発現において観察されなかった（Messina et al., 2016）。Ｔｓ６５ＤｎマウスのニューロンにおけるＧｎＲＨ発現の出生後喪失に関与する分子機構中へのさらなる洞察を得るために、本発明者らは、Ｇｎｒｈ：：Ｇｆｐ；Ｔｓ６５ｄｎレポーターマウスを構築し、それは異所性Ｇｎｒｈプロモーター下でＧＦＰを発現する。ＧｎＲＨニューロンは、ＧｎＲＨ発現における劇的な下落に先行する発生段階であるＰ１２で、以前に記載されたように（Messina et al., 2016）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により単離した（データは示さず）。Ｇｎｒｈ：：ｇｆｐ；Ｔｓ６５Ｄｎ及びＧｎｒｈ：：ｇｆｐ同腹仔からのＦＡＣＳ単離ＧＦＰ発現ＧｎＲＨニューロンのリアルタイムＰＣＲ分析によって、Ｇｎｒｈ ｍＲＮＡ発現がＰ１２のコントロール同腹仔におけるよりもＧｎｒｈ：：ｇｆｐ；Ｔｓ６５Ｄｎにおいて有意に低いことが明らかになった。これらの変化した発現レベルは、Ｚｅｂ１発現レベルにおける増加に関連付けられ、ＧｎｒｈプロモーターアクチベーターＯｔｘ２及びＫｉｓｓ１ｒをコードする転写物の有意な下方調節を伴った。Ｃｅｂｐｂ及びＤｉｃｅｒ発現は不変のままであった。まとめると、これらのデータは、Ｔｓ６５ｄｎマウスにおけるｍｉＲ２００ファミリーのメンバーの発現の変化が、ｍｉｒ２００／Ｚｅｂ１／Ｋｉｓｓ１Ｒ／Ｏｔｘ２ ｍｉＲＮＡ遺伝子マイクロネットワークを制御するＧｎｒｈプロモーター活性における不均衡を作り出すことにより、出生後発達の間でのＧｎＲＨ発現の段階的な喪失の基礎となるとの考えを裏付ける。
Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおける嗅覚障害及び認知障害の獲得におけるｍｉＲ－２００ファミリーの推定上の役割を決定するために、ｍｉＲ－２００ｂを、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の定位投与を使用し、成体の雄Ｔｓ６５ｄｎマウスの視床下部中で選択的に過剰発現させた。嗅覚能力及び認知能力の両方を、この実験プロトコルに供されたマウスの各々１匹におけるウイルス感染の前後に評価した。３ヶ月の回復期間後、データは、ｍｉＲ－２００ｂの視床下部での過剰発現によって、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおける匂いを区別する能力（図３ａ）及び新規物体を認識する能力（図３ｂ）の両方のレスキューがもたらされることを示し、コントロールＡＡＶを用いて投与されたＴｓ６５Ｄｎマウスは、嗅覚欠損及び記憶欠損のままであった。
ＧｎＲＨ補充治療によって、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおける嗅覚及び認知に関連付けられる障害が逆転する。
本発明者らは次に、成体Ｔｓ６５ｄｎマウスにより示される嗅覚欠損及び認知欠損が、細胞治療及び薬理学的治療を使用したＧｎＲＨ補充によりレスキューすることができるか否かを決定しようと努力した。本発明者らは最初に、宿主組織との機能的接続を確立する、第３脳室（３ｖ）中に移植された新生仔ＰＯＡ移植片の可能性を実証した、性腺機能低下症マウスにおいて妊孕性を回復すると以前に記載された手順を採用した（Charlton et al., 1987）。すなわち、野生型の仔（Ｐ０－Ｐ２）のＰＯＡからの新生仔細胞は、他の場所で記載されているパパイン解離プロトコル（Messina et al., 2016）を使用して酵素的に解離され、成体Ｔｓ６５ｄｎマウスの３ｖ中に定位投与された。なお、嗅覚能力及び認知能力の両方は、投与前に評価された。３ヶ月間の回復期間後、本発明者らは、Ｔｓ６５ｄｎ雄における野生型新生仔視索前組織（ＷＴ－ＰＯＡ）の移植によって、賦形剤溶液を投与されたＴｓ６５Ｄｎマウス（偽群）と比較し、嗅覚障害及び認知障害の両方のレスキューがもたらされることを観察した。本発明者らはまた、これらの動物における短期的な非視空間記憶を評価するためにＹ迷路テストを実施した。本発明者らは、Ｔｓ６５Ｄｎ－Ｓｈａｍマウスとは対照的に、Ｔｓ６５ｄｎ移植動物が、ＷＴ－Ｓｈａｍ同腹仔と同じ時間を新たなアーム中で過ごすことを見出した。さらに、ＷＴ－Ｓｈａｍ及び移植Ｔｓ６５ｄｎの両方が、Ｔｓ６５Ｄｎ－Ｓｈａｍマウスと比較し、最初に新たなアームに入るためにより少ない時間を必要とした。同様の結果が、新生仔ＷＴ－ＰＯＡの移植後に認知を回復した成体Ｔｓ６５ｄｎ雌において観察された。しかし、嗅覚能力のレスキューは、Ｔｓ６５ｄｎ移植雌において観察されなかった。新生仔ＰＯＡ移植によって、Ｔｓ６５ｄｎ雄における妊孕性は回復せず（データは示さず）、高齢Ｔｓ６５ｄｎ雌における発情周期も回復せず（データは示さず）、これらのマウスにおける嗅覚能力及び認知の回復が性腺機能の回復と無関係であることを示している。ウエスタンブロット分析によって、Ｔｓ６５Ｄｎコントロール（偽）と比較し、新生仔ＰＯＡの移植後のＴｓ６５ｄｎ雄の皮質及び海馬中でのＡＰＰ及びＣＴＦ発現における変化がないことを明らかになり（図２ａ－ｄ）、移植片媒介性のレスキューがこれらのＡＤタンパク質における目に見える変化に関連付けられないことを示している。しかし、減少したＴａｕＣｔｅｒの発現が、偽処置Ｔｓ６５Ｄｎマウスと比較した場合、視索前細胞を用いて移植されたＴｓ６５Ｄｎの皮質中で見られた（図２ｂ）。
ＧｎＲＨニューロンがＴｓ６５Ｄｎマウスにおける嗅覚機能及び認知機能のこのＷＴ－ＰＯＡ移植片媒介性レスキューにおいて役割を果たすか否かを決定するために、Ｇｎｒｈ：：ｃｒｅ；ＢｏＮＴＢｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰバイジェニックマウス（ＧｎＲＨニューロンにおける小胞放出がこれらの細胞中でのボツリヌス神経毒Ｂの選択的発現により鈍化されているトランスジェニックマウス系統（ＢｏＮＴＢＧｎｒｈ））からの新生仔細胞を、上に記載するプロトコルに従って、３ｖの成体Ｔｓ６５ｄｎ雄（ＢｏＮＴＢＧｎｒｈ ＰＯＡ）中に投与した。３ヶ月間の回復期間後、嗅覚及び認知のレスキューは、ＢｏＮＴＢＧｎｒｈ－ＰＯＡ細胞を用いて移植されたこれらのＴｓ６５Ｄｎマウスにおいて観察されなかった。興味深いことに、３ヶ月後（即ち、移植後６ヶ月）の急性ＧｎＲＨ腹腔内投与（５０μg/kg体重）によって、偽及びＢｏＮＴＢＧｎｒｈ ＰＯＡ移植Ｔｓ６５ｄｎマウスの両方において嗅覚欠損及び認知欠損がレスキューされることが見られた（データは示さず）。
ＧｎＲＨニューロンは、パルス状様式において神経ホルモンを放出する；パルス状ＧｎＲＨ放出は、脳脊髄液（Van Vugt et al., 1985）及び下垂体門脈血（Clarke and Cummins, 1982）の両方においてインビボでモニターされている。ＣＳＦにおけるその存在のため、ＧｎＲＨの分泌欠損は、生殖機能に対する作用に加えて、齧歯類及びヒトの両方の認知に関与する脳領域中で、拡散性伝達を介して、ＧｎＲＨ受容体を発現するニューロン集団の機能も変化させうる（Granger et al., 2004；Wilson et al., 2006）。上で報告するように、ＧｎＲＨ発現を制御するｍｉＲＮＡ遺伝子マイクロネットワークにおける有意な変化、脳全体のＧｎＲＨ免疫反応性における減少、及びＬＨパルス状態における変化は、ＧｎＲＨ神経機能が成体Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおいて変化していることを強く示唆する。本発明者らは次に、Ｔｓ６５ｄｎマウスにおけるＧｎＲＨパルス状態を回復することによって、これらのマウスにおける認知能力をレスキューすることができる可能性を探索した。これを評価するために、成体Ｔｓ６５ｄｎ雄に浸透圧ポンプを移植し、性腺刺激ホルモン低下性性腺刺激ホルモン低下症を伴う患者の妊孕性を回復させるためにクリニックで使用されるＧｎＲＨペプチドであるLUTRELEF（登録商標）の持続注入（１０分当たり０．００２５μg）（Boehm et al., 2015）；又はプログラム可能なミニポンプを用いて、野生型マウスにおいて報告されたＧｎＲＨ／ＬＨパルス状態を模倣した１５日の間でのパルス状LUTRELEF（登録商標）注入（３時間毎；ピーク持続時間１０分を伴うピーク０．２５μg）（Czieselsky et al., 2016）のいずれかを受けた（図４ａ）。本発明者らは、連続的な血液サンプリングによりＬＨパルス状態を評価した（図４ｂ－ｇ）；Ｔｓ６５Ｄｎ雄におけるLUTRELEF（登録商標）のパルス注入は、賦形剤で処置されたＴｓ６５Ｄｎ雄と比較した場合、ＬＨパルス頻度及びＬＨパルス振幅を有意に増加させることが見出された（図４ｇ）。実際に、ＬＨパルスの振幅は、それらのＷＴ同腹仔において観察されたものと同様のレベルまで増加した（図４ｇ）。対照的に、LUTRELEF（登録商標）持続注入によって、野生型及びＴｓ６５Ｄｎ同腹仔におけるＬＨパルス状態が鈍った（図４ｇ）。LUTRELEF（登録商標）のパルス注入によって、Ｔｓ６５Ｄｎ雄における異なる匂いの間で識別する能力（図４ｈ）及び認知欠損（図４ｉ）の両方がレスキューされることが見られた。LUTRELEF（登録商標）の持続注入は、Ｔｓ６５Ｄｎマウスにおける嗅覚能力及び認知能力に対する効果を有さなかったが、それは、野生型マウスにおいてこれらのタスクに対する著しい悪影響を有するように見えた（図４ｈ、ｉ）。これらのデータによって、ＧｎＲＨが認知に及ぼす有益な効果におけるＧｎＲＨ分泌のパルス状特徴のこれまで疑われていない重要性が実証され、年齢依存的な認知低下を防止し、認知予備能を動員し、このように、神経発達障害（例、ダウン症）及び神経変性障害（例、ダウン症及びアルツハイマー病）を伴う患者における福祉を改善するための新たな処置戦略の開発への道が開かれる。
材料及び方法
動物
全てのマウスを、特定病原体未感染条件下で、１２時間の明／暗サイクルを伴う温度制御された部屋（２１～２２℃）中に収容した。同腹児が生まれた日を０日齢（出生後０日目；Ｐ０）として考えた。動物をＰ２１で離乳させ、食料及び水への自由摂取を提供した。
Ｔｓ６５Ｄｎ（Ｂ６ＥｉＣ３Ｓｎ．ＢＬｉＡ－Ｔｓ（１７１６）６５Ｄｎ／ＤｎＪ；ストック番号００５２５２）マウス（Ahmed et al., 2012；Reeves et al., 1995；Reinholdt et al., 2011）は、１６番染色体の部分的トリソミー、ヒト２１番染色体のオーソロガス領域を保有し、Jackson Laboratories（New Harbour、米国メイン州）から購入した。Ｔｓ６５Ｄｎ系統はＰｄｅ６ｂ遺伝子についての遺伝的背景の野生型（ＷＴ）を有するため、系統を、Ｔｓ６５Ｄｎトリソミー雌をＰｄｅ６ｂ＋（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＥｉＪ×Ｃ３Ｓｎ．ＢＬｉＡ－Ｐｄｅ６ｂ＋／ＤｎＪ）Ｆ１／Ｊ；ストック番号００３６４７）雄と交配することにより維持した。この交配システムによって、ＷＴ動物及びＴｓ６５Ｄｎ動物がもたらされる。ＤｉｃｅｒＬｏｘＰ／ＬｏｘＰ，Ｇｎｒｈ：：Ｃｒｅ（Ｔｇ（Ｇｎｒｈ１：：Ｃｒｅ）１Ｄｌｃ）マウス、Ｇｎｒｈ：：Ｇｆｐマウス、及びＴｇ（ＣＡＧ－ＢｏＮＴ／Ｂ，ＥＧＦＰ）Ｕ７５－５６ｗｐ／Ｊ（ｉＢｏｔ）マウスは、Brian Harfe博士（フロリダ大学、フロリダ州）（Harfe et al., 2005）、Catherine Dulac博士（Howard Hughes Medical Institute、マサチューセッツ州ケンブリッジ）（Yoon et al., 2005）、Daniel J. Spergel博士（イリノイ州、シカゴ大学医学部内分泌学部門）（Spergel et al., 1999）、及びFrank Pfrieger博士（University of Strasbourg）（Slezak et al., 2012）からそれぞれ供与された。マウスの遺伝子型を、補足表Ｓ１中に列挙されているプライマーを使用したＰＣＲにより決定した。動物実験は、リール大学の実験動物の飼育と使用に関する組織倫理委員会により承認された；全ての実験が、２０１０年９月２２日の欧州連合理事会指令（２０１０／６３／ＥＵ）により指定された動物使用のためのガイドラインに従って実施された。使用される動物の性別を、本文及び／又は図面の説明文において指定する。動物の遺伝子型又は／及び処置群を、形態学的又は生理学的な差が無視できないほど明白である場合を除き、試験のために盲検化した。
生理学的測定
春機発動期試験。離乳した雄を、亀頭包皮（ＢＰＳ）分離について毎日チェックし、尿サンプルを離乳からＰ４５まで収集した。
離乳した雌マウスを膣開口部について毎日チェックした。膣開口後、膣スメアを毎日実施し、倒立顕微鏡下で分析し、発情周期の具体的な日を特定した。
妊孕性指数。雌の妊孕性指数を、１２０日間の長期交配の間の雌１匹当たりの同腹児数から算出した。
ホルモンレベル測定。顎下静脈及び体幹から採取された血液を、滅菌マイクロ遠心チューブ中に収集し、遠心分離まで氷上に保った。血漿を、３，０００ｇで１５分間にわたる４℃での血液サンプルの遠心分離後に収集し、使用まで－８０℃で保存した。
ＬＨアッセイ：ＬＨレベルを、以前に記載した高感度ＬＨサンドイッチＥＬＩＳＡ（Steyn et al., 2013）により決定した。９６ウェル高親和性結合マイクロプレート（Corning）を、最終希釈率１：１，０００（０．１M Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９．６中）の５０μLの捕捉抗体（モノクローナル抗体、抗ウシＬＨβサブユニット、５１８Ｂ７；L. Sibley；カリフォルニア大学デービス校）を用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、２００μLのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ－Ｔ ｐＨ ７．４（０．１M ＰＢＳ、０．０５% Ｔｗｅｅｎ ２０（Sigma＃Ｐ９４１６）中の５%（ｗ／ｖ）スキムミルクパウダー）を用いて室温（ＲＴ）で２時間にわたりインキュベートした。標準曲線を、１×ＰＢＳ－Ｔ中の１%（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Sigma、Ａ９４１８）中のマウスＬＨ（参照調製物、ＡＦＰ－５３０６Ａ；国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所の全国ホルモン及び下垂体プログラム（ＮＩＤＤＫ－ＮＨＰＰ））の２倍段階希釈物を使用して作成した。ＬＨスタンダード及び血液サンプルを、最終希釈率１：１０，０００の５０μLの検出抗体（ウサギＬＨ抗血清、ＡＦＰ２４０５８０Ｒｂ；ＮＩＤＤＫ－ＮＨＰＰ）を用いて、ＲＴで１．５時間にわたりインキュベートした。結合基質を含む各々のウェルを、最終希釈率１：１０，０００の５０μLのホースラディッシュペルオキシダーゼ共役抗体（ヤギ抗ウサギ；Vector Laboratories、ＰＩ－１０００）を用いてインキュベートした。１．５時間のインキュベーション後、１００μLの1-Step Ultra TMB-Elisa Substrate Solution（ThermoFisher Scientific、カタログ番号３４０２８）を各々のウェルに加え、室温で１０分間にわたり放置した。反応を、各々のウェルへの５０μLの３M ＨＣｌの添加により停止させ、吸光度を４５０nmで測定した。
テストステロンアッセイ：血漿中テストステロンレベルを、商業的なＥＬＩＳＡ（Demeditec Diagnostics、ＤＥＶ９９１１）（Moore et al., 2015）を製造元の指示に従って使用して測定した。
ＦＳＨアッセイ：ＦＳＨレベルは、以前に詳細に記載されたように（Garcia-Galiano et al., 2012）、国立衛生研究所（A.F. Parlow博士、National Hormone and Peptide Program、カリフォルニア州トーランス）により供給されたラジオイムノアッセイキットを使用して測定した。ホルモン測定を２通りに実施した。ラットＦＳＨ－Ｉ－９を、クロラミンＴ方法により１２５Ｉを用いて標識し、ホルモン濃度を、ＦＳＨ－ＲＰ－２スタンダードの参照調製物を使用して決定した。アッセイ内及び間の変動係数は、ＦＳＨについて６%及び９%未満であった。アッセイの感度はＦＳＨについて２０pg/チューブであった。ホルモン測定の正確性を、公知の濃度の齧歯類血清サンプル（外部コントロールとして使用）の評価により確認した。
パルス状ＬＨ測定
成体マウスを、毎日の取り扱いで馴化した。血液サンプル（５μL）を２時間の間（１０：００から１２：００の間）に１０分間隔で尾から採取し、４５μLの１×ＰＢＳ－Ｔ（０．０５%）中で希釈し、直ちに凍結させ、－８０℃で保存した。ＬＨレベルを次に、前に記載したプロトコルを使用して決定した。パルスを、DynPeak（Vidal et al., 2012）を使用して確認した。
尿収集及びタンパク質分析
ＭＵＰプロファイルの多様性を評価するために、尿を、雄マウスにおける離乳時（Ｐ２１）からＰ４５まで、取り扱い時の自発的排尿、又はマウス膀胱に穏やかな圧力を加えた後での誘発のいずれかに続いて採取した。尿を、収集手順の間に、氷上に保たれたマイクロ遠心チューブ中に収集した。全てのサンプルを最初に－２０℃で凍結し、次に、さらなる処理まで－８０℃に保った。タンパク質分析のために、１μLの尿を１×サンプル緩衝液（Invitrogen）及び１×還元剤（Invitrogen）と混合した。サンプルを、ＮｕＰＡＧＥシステム（Invitrogen）に供給されるプロトコルに従って、５分間にわたり煮沸し、４～１２% ＭＥＳＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル中で、１５０Vで７５分間にわたり電気泳動した。移動後、タンパク質を、ＮｕＰＡＧＥシステム（Invitrogen）のブロットモジュール中の０．２μmニトロセルロースメンブレン（Invitrogen）上に、冷条件において３０Vで９０分間にわたりトランスファーした。メンブレンを次に、ＲＴのブロッキング緩衝液［０．０５% Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）及び５%脱脂粉乳を伴うＴＢＳ］中で１時間にわたりブロックし、ブロッキング緩衝液中で希釈した一次抗体（ウサギポリクローナル抗ＭＵＰ１、１：２００希釈、ｓｃ－６６９７６、Santa Cruz Biotechnology、ＩＮＣ）を用いて４℃で４８時間にわたりインキュベートした。これに続いて、メンブレンを、ブロッキング緩衝液中で希釈した二次抗体（ペルオキシダーゼ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ ＋Ｌ）、１：２０００希釈、ＰＩ－１０００、Vector Laboratories）とのＲＴで１時間にわたるインキュベーション前に、１×ＴＢＳＴを用いて３回洗浄した。二次抗体とのインキュベーション後、メンブレンを、１×ＴＢＳＴを用いて３回洗浄した。免疫反応を、ＥＣＬ検出キット（ＮＥＬ１０１；PerkinElmer、マサチューセッツ州ボストン）を使用して現像し、デスクトップスキャナー（Epson Expression 1680 PRO）を使用してスキャンした。
組織タンパク質抽出及びウエスタンブロット分析
成体Ｔｓ６５ｄｎ及びＷＴマウスからの海馬及び皮質の両方を、４００μL（海馬について）又は８００μL（皮質について）の溶解緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、１０%スクロース及びプロテアーゼ阻害剤（１０mLのComplete；Roche Diagnostics GmbHについて１ペレット）中で超音波処理し、使用まで－８０℃で保存した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Pierce）を使用して決定し、その後に２×ＬＤＳ（Life）を用いて希釈し、還元剤（Life）を添加した。サンプルを１００℃で１０分間にわたり煮沸した。タンパク質を、１×ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動緩衝液を使用し、プレキャスト１２% Criterion XT Bis-Trisポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）上で分離した。その後、タンパク質を０．４μmのニトロセルロースメンブレン（G&E Healthcare）に転写した。低分子量タンパク質、例えばＡＰＰ（ＣＴＦ）のカルボキシ末端フラグメントなどについては、１×Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ泳動緩衝液中の１６．５% Criterion XT Tris-Tricineポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）を使用した。これらを０．２μmのニトロセルロースメンブレン（G&E Healthcare）上に転写した。分子量の推定のために、分子量マーカー（Novex and Magic Marks、Life Technologies）を使用した。メンブレンをブロッキング緩衝液［ＴＮＴ（Ｔｒｉｓ １５mM ｐＨ ８、ＮａＣｌ １４０mM、０．０５% Ｔｗｅｅｎ）及び５%脱脂粉乳又は５%ＢＳＡ］中で、室温でインキュベートし、ブロッキング緩衝液（５%ミルク又はＢＳＡを伴うＴＮＴ）中で希釈した、適した一次抗体（補足表Ｓ２）と４℃で一晩インキュベートした。これに続いて、メンブレンを対応する二次抗体（補足表Ｓ２）とインキュベートした。免疫反応を、化学発光キット（ECLTM、Amersham Bioscience）を使用して現像し、LAS3000イメージングシステム（Fujifilm）を使用して可視化した。結果をＧＡＰＤＨに対して標準化し、定量化を、ImageJソフトウェア（Scion Software）を使用して実施した。
精巣摘除術
成体雄は、イソフルラン麻酔下で陰嚢経路を介した両側性性腺摘出術に供した。
行動試験
馴化／脱馴化テスト。馴化／脱馴化テストを使用し、異なる匂いの間で区別する能力を評価した（Breton-Provencher et al., 2009）。マウスをテストの前に８日間にわたり単一で収容した。この嗅覚テストは、馴化のためのアセトフェノン（００７９０、Sigma）及び脱馴化のためのオクタンタル（０５６０８、Sigma）、又はその逆の提示を含んだ。テストの前に、マウスは、オープンフィールド区域及び空の匂いボックスを３０分間にわたり探索することを可能にした。この馴化期間の後、マウスに、１分間の期間にわたり４つの連続試行にわたり１つの匂いを経時的に提示し、１０分間の試行間隔を維持し、匂いの置換を確実にした。４つの連続試行の後、第２の匂いを１分間の試行の間に提示した。匂い（２０μLの１：１０００希釈物）をろ紙上に投与し、穴を開けたプラスチックボックス中に置き、匂い刺激との直接的な接触を避けた。測定は、マウスが異なる試行の間に物体を嗅ぐのに費やした合計時間を記録することからなった。
新規物体認識テスト。認識記憶を、新規物体認識テストを使用して評価した（Leger et al., 2013）。マウスをテストの前に５日間にわたり単一で収容した。１日目に、２つの同一の物体（Ａ＋Ａ）を、ケージの壁から等距離にあるケージの反対側のオープンフィールドアリーナ内に置いた。各々のマウスを２つの物体内に置き、それらを１５分間にわたり探索することを可能にした。２日目は２つのフェーズ、習熟フェーズ及びテストフェーズからなった。１５分間続いた習熟フェーズ（試行１）の間に、マウスは２つの他の同一物体（Ｂ＋Ｂ）を探索した。このフェーズの後、マウスを、テストフェーズを開始する前に、そのホームケージ中に１時間にわたり戻した。テストフェーズの間に、試行１からの１つの物体及び完全に新しい物体（Ｂ＋Ｃ）をオープンフィールド区域内に置き、マウスはそれらを５分間にわたり探索することが可能であった（試行２）。物体認識スコアを、合計探索時間にわたり新たな物体を探索する（試行２）のに費やされた時間として算出したが、認識メモリ機能を表すために使用する。
Ｙ迷路テスト。自然な自発的探索行動及び視空間短期記憶を、Ｙ迷路を使用してテストした（Bridoux et al., 2013；Dellu et al., 2000）。Ｙ迷路は、３つの白い木製アーム（２４．０cm×６．５cm×１５cm）からなり、床上の４１．０cmの高さまで上昇され、壁上の視覚的な手がかりで囲まれていた。マウスをスタートアーム中に置き、このアームの端に向いており、１つのアームがブロックされている間（新規アーム）、１０分間にわたり迷路を探索することを可能にした。結果的に、マウスは、全ての３つのアームを５分間にわたり探索することを可能にする前に、それらのホームケージ中に１時間にわたり置かれた。マウスの軌跡を、EthoVisionビデオトラッキング装置及びソフトウェア（Noldus Bv、オランダ、ヴァーヘニンゲン）を使用して記録した。新規アーム中で費やされた時間及び新規アーム中に入るまでの潜時をマウス間で比較した。
脳組織解剖
マウスを断頭により安楽死させ、体幹血液をホルモンレベル分析のために収集した。視床下部の視索前野（ＰＯＡ）を、双眼拡大鏡下でWeckerハサミ（フランス、モリア）を使用して解剖し、直ぐにドライアイス中に置き、さらなる処理及びアッセイまで－８０℃で保存した。
ＰＯＡからのＲＮＡ分離及び定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析
ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを、Ambion mirVana（商標）miRNA Isolation Kit（Ambion, Inc；米国カリフォルニア州）を用いて、２２及び２６ゲージ針を通じたフラグメントの連続した粉砕により抽出した。ＲＮＡの品質及び濃度を、分光光度計ND-1000 NANODROP 385（Thermo-scientific）により決定した。遺伝子発現分析のために、ｍＲＮＡを、SuperScript（登録商標）III逆転写酵素（Life Technologies）を使用して逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、エキソン境界特異的TaqMan（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Applied Biosystems）を使用し、Applied Biosystems 7900HT高速リアルタイムＰＣＲシステムで行った（補足表Ｓ３）。
マイクロＲＮＡ発現分析を、TaqMan特異的ＲＴプライマー及びTaqMan miRNA逆転写キット（Applied Biosystems）を使用して実施した。その後、定量的リアルタイムＰＣＲを、製造元の推奨するサイクリング条件を使用し、Applied Biosystems 7900HTサーモサイクラーで、ｍｉＲＮＡ（Applied Biosystems）のための事前に計画されたアッセイ（補足表Ｓ３）を使用して実施した。遺伝子及びｍｉＲＮＡ発現データを、ＳＤＳ２．４．１及びData Assist 3.0.1ソフトウェア（Applied Biosystems）を使用して分析した。
蛍光活性化セルソーティング及び定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析を使用した視床下部ＧｎＲＨニューロンの分離
Ｇｎｒｈ：：Ｇｆｐ及びＧｎｒｈ：：Ｇｆｐ；Ｔｓ６５ｄｎマウスの視索前領域を顕微解剖し、パパイン解離システム（Worthington、ニュージャージー州レイクウッド）を使用して酵素的に解離し、単一細胞懸濁液を得た。ＦＡＣＳを、EPICS ALTRAセルソーターサイトメーターデバイス（BD Bioscience）を使用して実施した。ソート判定は、Ｇｎｒｈ：：Ｇｆｐ動物及びＧｎｒｈ：：Ｇｆｐ；Ｔｓ６５ｄｎ動物からの細胞懸濁液を比較することにより、ＧＦＰ蛍光（励起：４８８nm、５０mW；検出：ＧＦＰバンドパス５３０／３０nm、自家蛍光バンドパス６９５／４０nm）の測定に基づいた（補足図Ｓ５中に示すとおり）。各々の動物について、ＧＦＰ陽性及び陰性細胞を１０μLの抽出緩衝液［０．１%Triton（登録商標）X-100（Sigma-Aldrich）及び０．４U/μLのRNaseOUT（商標）（Life Technologies）］中に直接ソーティングした。
遺伝子発現を分析するために、ＦＡＣＳソーティングＧｎＲＨニューロンから得られたｍＲＮＡを、SuperScript（登録商標）III逆転写酵素（Life Technologies）を使用して逆転写し、線形前増幅工程を、TaqMan（登録商標）PreAmp Master Mix Kitプロトコル（P/N 4366128、Applied Biosystems）を使用して実施した。リアルタイムＰＣＲを、特異的TaqMan（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Applied Biosystems）を使用し、以前に記載されたように、Applied Biosystems 7900HT高速リアルタイム ＰＣＲシステムで行った（補足表Ｓ３）。
ＦＡＣＳソーティングＧｎＲＨニューロンのマイクロＲＮＡ発現分析を、ステムループＲＴ－ＰＣＲベースのTaqMan Rodent MicroRNA Arrays（Applied Biosystems）を使用して実施した。簡単には、ｍｉＲＮＡを、TaqMan miRNA逆転写キット（Applied Biosystems）をステムループメガプレックスプライマープールＡとの組み合わせにおいて使用し、製造元の指示に従って逆転写した。線形前置増幅工程を、TaqMan（登録商標）PreAmp Master Mix Kitプロトコル（P/N 4366128、Applied Biosystems）を使用して実施し、定量的リアルタイムＰＣＲを、Applied Biosystems 7900HTサーモサイクラーでTaqMan低密度アレイ（Applied Biosystems）を使用し、製造元の推奨するサイクリング条件を使用して実施した。遺伝子及びｍｉＲＮＡの発現データを、ＳＤＳ２．４．１及びData Assist 3.0.1ソフトウェア（Applied Biosystems）を使用して分析した。
ドナー組織の調製及び神経移植
ＰＯＡ移植片用の組織ドナーを、ＧｎＲＨを放出するＧｎＲＨニューロン含む生後２日目（Ｐ２）のＷＴマウス（ＷＴ－ＰＯＡ）、及びＧｎＲＨを放出しないＧｎＲＨニューロンを含むＧｎｒｈ：：ｃｒｅ；ＢｏＮＴＢｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰマウス（ＢｏＮＴＢＧｎｒｈ－ＰＯＡ）から得た。
この組織を顕微解剖し、パパイン解離システム（Worthington、ニュージャージー州レイクウッド）を使用して酵素的に解離し、５μLの１×ＨＢＳＳ溶液中の細胞懸濁液を得た。２つの視索前組織をインプラントにより使用した。
成体Ｔｓ６５ｄｎマウスを麻酔（イソフルラン）下で定位固定フレーム（Kopf（登録商標）Instruments、カリフォルニア州）中に置き、穿頭孔を、マウスの脳図譜に従って、正中線でブレグマから－１．７mmに開けた（Paxinos and Franklin, 2004）。２５μLのハミルトンシリンジ（２２ゲージ針）を３ｖ（硬膜に対して５．６mmの深さ）中にゆっくりと挿入し、ＷＴ－ＰＯＡ又はＢｏＮＴＢＧｎｒｈ－ＰＯＡ外植片を含む５μLの異なる溶液を、注入ポンプ（KD Scientific、マサチューセッツ州ホリストン）を使用し、１０分間にわたり投与した。
同じ条件下で、成体６５ｄｎ及びＷＴマウスに５μLの賦形剤（ＨＢＳＳ １×）を用いて投与した（偽群）。
アデノ随伴ウイルスベクター及び定位注入
成体Ｔｓ６５ｄｎ雄の視床下部におけるｍｉＲ－２００ファミリー、特にメンバーｍｉＲ－２００ｂの選択的過剰発現については、ｓｃＡＡＶ９－ＥＦ１ａ－ｍｍｕ－ｍｉＲ－２００ｂ－ｅＧＦＰ（ＡＡＶ－ｍｉＲ２００ｂ、２．１×１０１３ＧＣ/ml）又はｓｃＡＡＶ９－ＥＦ１ａ－ｃｔｒｌ－ｍｉＲ－ｅＧＦＰ（ＡＡＶ－ＧＦＰ、２．２×１０１３ＧＣ/ml）の両側投与（１５０nl又は３００nl合計）を、ＰＯＡ（ＡＰ：＋０．５mm、ＭＬ：±０．１２mm、ＤＶ：－５．３mm）中に５μLハミルトンシリンジを介して２０ｎｌ／分の速度で投与した。針を投与後５分間にわたり平静に放置した。両方のウイルスをベクターバイオラボから得て、投与座標はＰａｘｉｎｏｓマウス脳図譜に基づいた（Paxinos and Franklin, 2004）。
免疫組織化学的分析用の脳の調製
氷上で麻酔された新生仔（Ｐ０）マウス、ならびに５０～１００mg/kgのケタミン－ＨＣｌ及び５～１０mg/kgのキシラジン－ＨＣｌを用いて麻酔された乳仔（Ｐ１２）、春機発動期前（Ｐ３５）、及び成体マウスを、２～１０mlの生理食塩水、それに続く１０～１００mlの４%パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、ｐＨ７．４を用いて経心的に灌流した。脳を収集し、同じ固定液を用いて４℃で２時間にわたり固定し、ＯＣＴ包埋培地（Tissue-Tek）中に包埋し、ドライアイス上で凍結し、凍結切片化まで－８０℃で保存した。
免疫組織化学及び定量化
組織は、他に示さない限り、Ｐ０については１６μmで、ならびにＰ１２、Ｐ３５、及び成体の脳については３５μm（浮遊切片）で凍結切片化した（Leicaクライオスタット）。
ＧｎＲＨタンパク質発現の評価
免疫組織蛍光実験を、以前に報告されたように行った（Hanchate et al., 2012；Messina et al., 2011）。冠状切片を次に０．１Ｍ ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ ０．１Ｍ中のブロッキング溶液（２%ヤギ血清＋０．５% Triton X-100）中で６０分間にわたりインキュベートした。その後、切片を、ブロッキング溶液中の、Erik Hrabovszky博士（ハンガリー科学アカデミー実験医学研究所内分泌神経生物学研究所、ハンガリー、ブダペスト）（Hrabovszky et al., 2011）により産生されたモルモット抗ＧｎＲＨ（１：１００００）中で（Ｐ０脳の場合）；及びウサギ抗ＧｎＲＨ（１：３０００）［G. Tramu教授（国立科学研究センター、ＵＲＡ ３３９、ボルドー大学Ｉ、フランス、タランス）からの寄贈物（Beauvillain and Tramu, 1980）］中で（Ｐ１２、Ｐ３５、及び成体の脳の場合）、４℃で４８時間にわたりインキュベートした。一次抗体中でのインキュベーション後、切片を、０．１M ＰＢＳを用いて各々１０分間にわたり３回リンスし、Alexa fluor 568共役抗モルモット（１：５００）二次抗体又は抗ウサギ（１／５００；Invitrogen Ａ１１０７７）二次抗体とＲＴで９０分間にわたりインキュベートした。切片を次に洗浄し、Hoechst（１：１０，０００；Thermo Fisher Scientific Ｃａｔ＃Ｈ３５６９、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６５１１３３）を用いて３分間にわたり対比染色し、０．１M ＰＢＳを用いて１０分間にわたり３回リンスし、Mowiolカバースリップマウンティング溶液を使用してカバースリップでマウントした。ＧｎＲＨニューロン集団はマウスの脳において非常に限定されているため、全てのニューロンを、２つの一連の脳（Ｐ１２、Ｐ３５、及び成体）又は頭（Ｐ０）の切片のうちの１つにおいて、顕微鏡下で肉眼によりカウントした。画像を、Zeiss Axio Imager Z2 ApoTome顕微鏡（Zeiss、ドイツ）を使用して取得した。
ＧｎＲＨニューロン上のｖＧａＴ又はｖＧｌｕＴ２並置の分析
Ｐ１２及びＰ３５マウスの冠状切片を０．１M ＰＢＳ中で１０分間にわたり３回洗浄し、ブロッキング溶液［１０%正常ロバ血清（ＮＤＳ；Sigma、Ｄ９６６３）を伴う０．１Ｍ ＰＢＳ、０．２５%ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Sigma、Ａ９４１８）、０．３% Triton X-100（Sigma、Ｔ８７８７）］を用いて、ＲＴで９０分間にわたりインキュベートした。切片を次に、ブロッキング溶液中のウサギ抗ＧｎＲＨ（１：６，０００）［G. Tramu教授（国立科学研究センター、ＵＲＡ ３３９、ボルドー大学Ｉ、フランス、タランス）からの寄贈物（Beauvillain and Tramu, 1980）］及びモルモット抗ｖＧａＴ（１：７５０、Synaptic Systems、１３１ ００４）又はｖＧｌｕＴ２（１：７５０、Synaptic Systems、１３５ ４０４）と４℃で７２時間にわたりインキュベートした。一次抗体を用いたインキュベーション後、切片を、０．１M ＰＢＳを用いて１０分間にわたり３回リンスし、０．１M ＰＢＳ中の対応する二次抗体、即ち、Alexa fluor 488共役ロバ抗ウサギ（１：４００；Life Technologies、Molecular Probes、Invitrogen、Ａ２１２０６）及びAlexa fluor 594共役ロバ抗モルモット抗体（１：４００；Jackson Immunoresearch、７０６－５８５－１４８）を用いて、ＲＴで９０分間にわたりインキュベートした。その後、切片を０．１M ＰＢＳ中で１０分間にわたり３回洗浄し、Hoechst（１：１０，０００；Thermo Fisher Scientific、Ｈ３５６９、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６５１１３３）を用いて、３分間にわたりインキュベートし、続いて０．１M ＰＢＳを用いて１０分間にわたり３回洗浄した。最後に、切片を、Mowiolカバースリップマウンティング溶液を使用し、カバースリップとマウントした。画像を、LSM 710ソフトウェア（Zeiss、ドイツ）を備えたLSM 710 Zeiss直立共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して取得した。
アデノ随伴ウイルスベクターの評価
冠状切片を次に、０．１M ＰＢＳを用いて洗浄し、ブロッキング溶液［０．１M ＰＢＳ中の（５%ロバ血清＋０．５% Triton X-100）］を用いて６０分間にわたりインキュベートした。切片を次に、ブロッキング溶液中のニワトリ抗ＧＦＰ（１：５００；Aves Labs、Inc GFP-1020）及びウサギ抗ＧｎＲＨ（１：３０００）［G. Tramu教授（国立科学研究センター、ＵＲＡ ３３９、ボルドー大学Ｉ、フランス、タランス）からの寄贈物（Beauvillain and Tramu, 1980）］を用いて、４℃で４８時間にわたりインキュベートした。これに続いて、切片を、０．１M ＰＢＳを用いて、各々１０分間にわたり３回リンスし、次に二次抗体Alexa fluor 488共役ロバ抗ニワトリ（１：５００；Jackson Immuno Research 703-545-155）及びAlexa 568共役ロバ抗ウサギ（１：５００；Invitrogen Ａ１００４２）を用いて、ＲＴで９０分間にわたりインキュベートした。切片を次に洗浄し、Hoechst（１：１０，０００；Thermo Fisher Scientific Ｃａｔ＃Ｈ３５６９、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６５１１３３）を用いて３分間にわたり対比染色し、０．１M ＰＢＳを用いて１０分間にわたり３回リンスし、Mowiolカバースリップマウンティング溶液を使用してカバースリップとマウントした。画像を、LSM 710ソフトウェア（Zeiss、ドイツ）を備えたLSM 710 Zeiss直立共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して取得した。
ｉＤｉｓｃｏ
ｉＤｉｓｃｏは、蛍光を保ちながら脳組織を透明にする溶剤ベースの透明化方法である（Erturk et al., 2012；Erturk and Bradke, 2013）。
メタノールを用いたサンプル前処理：サンプルをＰＢＳ中で洗浄し（１時間にわたり２回）、続いて０．１M ＰＢＳ中の５０%メタノール（１時間にわたり１回）、８０%メタノール（１時間にわたり１回）、及び１００%メタノール（１時間にわたり２回）中でインキュベートした。次に、サンプルを２０%ＤＭＳＯ／メタノール（２ml ３０% Ｈ２Ｏ２／２ml ＤＭＳＯ／８mlメタノール、氷冷）中の５%Ｈ２Ｏ２中で、４℃で一晩漂白した。これに続いて、サンプルをメタノール（１時間にわたり２回）中、２０%ＤＭＳＯ／メタノール（１時間にわたり２回）中、８０%メタノール（１時間にわたり１回）中、５０%メタノール（１時間にわたり１回）中、ＰＢＳ（１時間にわたり１回）中、及び最後に、染色手順に進む前にＰＢＳ／０．２% TritonX-100（１時間にわたり２回）中で洗浄した。
ホールマウント免疫染色：サンプルを、調整可能なローテーター上で、１０mlのブロッキング溶液（ＰＢＳＧＮａＴ）［０．２%ゼラチン（Sigma）、０．５% Triton X-100（Sigma-Aldrich）、及び０．０１% NaAzide（Casoni et al., 2016）を含む１×ＰＢＳ］中で、３７℃で３晩にわたりインキュベートした。サンプルを、一次抗体を含む１０mlのＰＢＳＧＮａＴに移し（表Ｓ１）、３７℃で７日間にわたり回転中に置いた。これには、ＲＴで、ＰＢＳＧＴ中での３０分間の６回の洗浄、及び４℃で、ＰＢＳＧＴ中での一晩の最後の洗浄が続いた。次に、サンプルを１０ml ＰＢＳＧＮａＴ中で希釈した二次抗体（１：４００、Alexa 568、Alexa 647）と、３７℃で２日間にわたり回転チューブ中でインキュベートした。ＲＴで、０．１M ＰＢＳ中での３０分間にわたる６回の洗浄後、サンプルを透明化するまで暗所において、４℃でＰＢＳ中に保存した。
組織の透明化：全てのインキュベーション工程を、光との接触を避けるためにアルミホイルで覆われた１４rpmのチューブローテーター上で、ドラフト中で、ＲＴで実施した。サンプルを、Ｈ２Ｏ中で希釈されたメタノール（Sigma-Aldrich）の段階的なシリーズ（２０%、４０%、６０%、８０%、及び１００%）中で１時間にわたり脱水させた。これには、１００%ジクロロメタン（ＤＣＭ；Sigma-Aldrich）中での３０～４０分間の脱脂工程が続いた。サンプルを、ジベンジルエーテル（ＤＢＥ；Sigma-Aldrich）中で、ＲＴで２時間にわたり、一定の撹拌上で、暗所において透明化した。最後に、サンプルを新鮮なＤＢＥ中に移し、イメージングまでＲＴで暗所においてガラスチューブ中に保存した。本発明者らは、以下に記載するように、６ヶ月間までにわたり任意の有意な蛍光喪失を伴わずに、サンプルを画像化することができた。
デジタル画像取得
以前に記載された異なる免疫組織蛍光実験を、下で言及する顕微鏡の１つを使用して分析し、Adobe Photoshop（Adobe Systems、カリフォルニア州サンノゼ、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿０１４１９９）を使用して画像を処理した。
蛍光顕微鏡
他に示さない限り、切片を、電動ステージ及びAxioCam MRmカメラ（Zeiss、ドイツ）を備えたZeiss Axio Imager Z2 ApoTome顕微鏡（Zeiss、ドイツ）を使用して分析した。特定のビームスプリッター（ＢＳ）波長、励起（Ｅｘ）波長、及び発光（Ｅｍ）波長を、緑（Alexa 488-BS：４９５nm、Ｅｘ：４５０／４９０nm、Ｅｍ：５００／５５０nm）、赤（Alexa 688-BS：５７０nm、Ｅｘ：５３８／５６２nm、Ｅｍ：５７０／６４０nm）、遠赤色（Alexa 647-BS：６６０nm、Ｅｘ：６２５／６５５nm、Ｅｍ：６６５／７１５nm）、及び核染色（Hoechst-BS：３９５nm、Ｅｘ：３３５／３８３nm、Ｅｍ：４２０／４７０nm）の可視化のために使用した。フォトモンタージュを作成するために、単一平面画像を、AxioVision 4.6システム（Zeiss、ドイツ）のMosaiXモジュール及びZeiss ２０×対物レンズ（開口数ＮＡ＝０．８０）を使用し、各々のフルオロフォアについて経時的に捕捉した。高倍率の顕微鏡写真は、AxioVision 4.6システムのＺスタックモジュールを使用して収集された一連のトリプルApoTome隣接画像から由来する最大強度の投射を表す。全ての画像を、切片内の全ての目に見える染色に対応し、ならびに対応する対物レンズ及び波長についての最適な工程サイズと一致する、定義されたｚフォーカス範囲にわたり段階的な様式で捕捉した。
共焦点イメージング
ＧｎＲＨニューロン上のｖＧａＴ及びｖＧｌｕＴ２の並置の分析からの切片を、LSM710ソフトウェアを備えたLSM710 Zeiss直立共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して画像化した。各々のＧｎＲＨ－ＩＲセルについて、０．２５μm間隔での画像のスタックを、ＧｎＲＨ－ＩＲニューロンの深さ全体にわたって１００倍の対物レンズ及び２×デジタルズームを使用して収集した。１００×対物レンズを使用した画像のＺシリーズスタックを生成し、ｖＧａＴ又はｖＧｌｕＴ２の並置の密度を推定した。接触は、一次ＧｎＲＨ－ＩＲ樹状突起棘及びｖＧａＴ陽性又はｖＧｌｕＴ２陽性末端の間に黒色ピクセルがない場合に定義した。各々の画像について、ＧｎＲＨ－ＩＲニューロンの細胞体及び樹状突起（ＧｎＲＨ一次樹状突起に沿って４５μmまで）に直接対抗するｖＧａＴ又はｖＧｌｕＴ２標識された点の数をカウントし、組み合わせて、各々の細胞についての平均値を提供した。一次ＧｎＲＨ－ＩＲ樹状突起は、細胞体から４５μmを超えて追跡できなかったため、従って、本発明者らは、樹状突起が切片を出るまで、１５μm毎にｖＧａＴ並置の数を決定した。データは、ｖＧａＴ又はｖＧｌｕＴ２並置／μmとして提示する。
ライトシートイメージング
３Ｄイメージングを、以前に記載されているように実施した（Belle et al., 2014）。ImspectorProソフトウェア（LaVision BioTec）を使用した限外顕微鏡（LaVision BioTec）を使用してイメージングを実施した。ライトシートを、レーザー（波長４８８又は５６１nm、Coherent Sapphire Laser、LaVision BioTec）及び２つのシリンドリカルレンズにより生成した。２×対物レンズ（MVPLAPO、オリンパス）を伴う双眼実体顕微鏡（MXV10、オリンパス）を異なる倍率（１．６×、４×、５×、及び６．３×）で使用した。サンプルを、ＤＢＥで満たされた１００%石英（LaVision BioTec）で作製されたイメージングリザーバー中に置き、レーザー光により側面から照射した。PCO Edge SCMOS CCDカメラ（２，５６０×２，１６０ピクセルサイズ、LaVision BioTec）を使用して画像を取得した。各々の画像間のステップサイズを２μmに固定した。
急性ＧｎＲＨ投与
認知能力及び嗅覚能力に対するＧｎＲＨの効果を試験するために、ｉＢｏｔマウス（６５ｄｎ＋ＰＯＡ－ＴＯＸ）からのＰＯＡ外植片を用いて移植された成体雄Ｔｓ６５Ｄｎマウスを、０．０５μg/gのＢＷ、又は賦形剤（ＰＢＳ ｐＨ ７，４）の用量中のＧｎＲＨ－１ペプチド（Genecust）を用いて処置した。
嗅覚識別能力をテストするために、動物は馴化フェーズの２時間前にＧｎＲＨ－１又は賦形剤の単回腹腔内（ｉｐ）投与を受けた。ＮＯＲテストの場合では、１日目に、動物はＧｎＲＨ－１ペプチド又は賦形剤の２回腹腔内投与を受けた。第１の投与を試行の開始前の２時間に、及び第２の投与を第１の投与後の１２時間に与えて、記憶の固定を促した。２日目に、動物は、第１の試行の開始前の２時間に腹腔内投与を受けた。
持続性及びパルス皮下注入
成体マウスに、浸透圧ミニポンプ（１００２、Alzet、ＵＳＡ）を用いて移植し、賦形剤（滅菌０．１M ＰＢＳ）又はLUTRELEF（登録商標）（０．２５μgr/３時間）（Ferring Pharmaceuticals、スイス）の持続注入を受けた；又はプログラム可能なマイクロ注入ポンプ（ＳＭＰ－３００、iPRECIO、日本）を用いて、賦形剤又はLUTRELEF（登録商標）のパルス注入（３時間毎、１０分間の間に０．２５μgのピーク）を受けて、ＷＴマウスにおいて報告されたＧｎＲＨ／ＬＨパルスを模倣し（Czieselsky et al., 2016）、及び残りの時間にわたる低用量（０．００２５μg/１０分）を用いた基礎注入。ポンプは、マウスの背上の皮膚下に置いた。嗅覚欠損及び認知欠損の両方が、これらの動物において以前に確認された。手術の１週間後、マウスを再テストし、それらの嗅覚能力及び認知能力を評価した。手術の２週間後、反復の尾先端血液サンプリングを行い（他の場所に記載）、ＬＨパルスプロファイルを評価した。
サンプルサイズ及び無作為化ステートメント
生理学的及び神経解剖学的試験のための、ならびにｍｉＲＮＡ及び遺伝子発現分析のためのサンプルサイズを、過去の経験及び文献中に提示されているものに基づいて推定した。各々の群からの少なくとも３つの異なる同腹仔からのマウスを性的成熟、妊孕性を試験するために使用し、ＦＡＣＳ、解剖学、及び免疫染色により単離された細胞において定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析を実施するために使用した。無作為化方法は、実験群において被験者を割り当てる、又はデータを収集及び処理するために使用されなかった。
データ及び統計量の提示
全ての統計分析を、Prism 7（GraphPad Software）を使用して実施し、適した場所で正規性（Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ検定）及び分散を評価した。サンプルサイズを、現場における標準的な慣行に従って選んだ。データを、多重比較のために、対応のない／対応のある両側スチューデントのｔ検定、マンホイットニーのＵ検定、又は一元配置分散分析を使用して比較した。テューキーの事後検定を、適している場合に実施した。有意水準をｐ＜０．０５に設定した。データを平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示す。生物学的に非依存的な実験の数、Ｐ値、及び自由度を、本文又は図の説明文のいずれかに示す。
実施例２
ＧｎＲＨ－Ｒ発現ニューロンの急性化学遺伝学的阻害によって、成体コントロールマウスにおける認知能力及び嗅覚能力が損なわれる。
神経解剖学的結果によって、視床下部外のＧｎＲＨ投射が、認知的及び社会的行動を制御する脳領域中で見出されることが実証された。さらに、非生殖過程の調節におけるＧｎＲＨの潜在的な役割はまた、マウス脳の皮質及び海馬においてＧｎＲＨ受容体（ＧｎＲＨ－Ｒ）を発現するＧＦＰ標識ニューロンを特定する本発明者により実施された溶媒透明化（ｉＤＩＳＣＯ）分析の３次元（３Ｄ）イメージングと一致している。
興味深いことに、図５中に示すように、Ｇｎｒｈｒ：：Ｃｒｅマウスの海馬においてＧｎＲＨ受容体ＧｎＲＨ－Ｒを発現するニューロンが、阻害性ＤＲＥＡＤＤウイルスベクター（ＡＡＶ８－ｈＳＹＮ－ＤＩＯ－ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）－ｍＣｈｅｒｒｙ）を用いて感染された場合（図５Ａ）、２００μLのクロザピン－ｎ－オキシド（ＣＮＯ－3mg/kg）の単回投与によって、野生型（ｗｔ）マウスにおける認知能力及び嗅覚能力の両方が劇的に低下した（図５Ｂ及びＣ）。まとめると、これらのデータは、正常な認知機能及び嗅覚機能が、視床下部から遠く離れた標的領域中でのＧｎＲＨ作用に依存すること、及び出生後発達の間でのＴｓ６５Ｄｎマウスにおける視床下部外ＧｎＲＨ線維の後天性欠損が、それらのＤＳ様表現型において重大な役割を果たしうることの興味深い考えをさらに強調する。
参考文献
Claims (13)
- ＧｎＲＨがパルス投与により投与される、それを必要とする患者における認知障害の処置における使用のためのゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）。
- それを必要とする患者における認知障害の処置における使用のためのｍｉＲ－２００及び／又はｍｉＲ－１５５。
- 前記患者が嗅覚機能障害を有する、請求項１に記載の使用のためのＧｎＲＨ、又は請求項２に記載の使用のためのｍｉＲ－２００及び／又はｍｉＲ－１５５。
- 前記認知障害がダウン症候群である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のためのＧｎＲＨ、又は使用のためのｍｉＲ－２００及び／又はｍｉＲ－１５５。
- 前記認知障害がアルツハイマー病である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のためのＧｎＲＨ、又は使用のためのｍｉＲ－２００及び／又はｍｉＲ－１５５。
- 前記認知障害がパーキンソン病である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のためのＧｎＲＨ、又は使用のためのｍｉＲ－２００及び／又はｍｉＲ－１５５。
- 前記認知障害が加齢に関連付けられる認知低下である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のためのＧｎＲＨ、又は使用のためのｍｉＲ－２００及び／又はｍｉＲ－１５５。
- 前記認知障害が初期段階中にある、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のためのＧｎＲＨ、又は使用のためのｍｉＲ－２００及び／又はｍｉＲ－１５５。
- 前記患者が男性である、請求項１及び３から８のいずれか一項に記載の使用のためのＧｎＲＨ。
- 前記パルス投与が１２０分毎の２５ng/kgのＧｎＲＨの投与に対応する、請求項９に記載の使用のためのＧｎＲＨ。
- 前記患者が女性である、請求項１及び３から８のいずれか一項に記載の使用のためのＧｎＲＨ。
- 前記パルス投与が９０分毎の７５ng/kgのＧｎＲＨの投与に対応する、請求項１１に記載の使用のためのＧｎＲＨ。
- 前記ＧｎＲＨがゴナドレリンである、請求項１及び３から１２のいずれか一項に記載の使用のためのＧｎＲＨ。
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