JP2022532403A - 残存疾患を検出するための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
疾患（例えば、がん）のレベル、例えば、罹患組織（例えば、がん組織）に関係する個体からの試料中の核酸分子（例えば、無細胞ＤＮＡ）の割合を測定するための方法、デバイスおよびシステムが、本明細書に記載される。個体における疾患の存在、再発、進行または退縮を測定するための方法、デバイスおよびシステムも記載される。ある特定の方法は、個体に関連する核酸シークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が、罹患組織に由来する率を示すシグナルと、シークエンシング偽陽性エラー率を示すバックグラウンド指数、または選択された遺伝子座にわたってのサンプリング分散を示すノイズ指数とを、比較するステップを含む。
Description
関連出願への相互参照
本願は、２０１９年５月１７日に出願した米国特許仮出願第６２／８４９，４１４号および２０２０年２月７日に出願した米国特許仮出願第６２／９７１，５３０号に基づく優先権の利益を主張しており、前記仮出願の各々の内容は、それら全体が参照により本明細書に援用される。
本願は、２０１９年５月１７日に出願した米国特許仮出願第６２／８４９，４１４号および２０２０年２月７日に出願した米国特許仮出願第６２／９７１，５３０号に基づく優先権の利益を主張しており、前記仮出願の各々の内容は、それら全体が参照により本明細書に援用される。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１６５２７２０００１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２０年５月１４日、サイズ：１ＫＢ）。
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発明の分野
核酸シークエンシングデータを使用して、がんなどの疾患に関連する試料中の核酸分子の割合を測定するための方法、システムおよびデバイスが、本明細書に記載される。がんなどの疾患の存在、再発、進行または退縮のレベルを測定するための方法、システムおよびデバイスも記載される。
核酸シークエンシングデータを使用して、がんなどの疾患に関連する試料中の核酸分子の割合を測定するための方法、システムおよびデバイスが、本明細書に記載される。がんなどの疾患の存在、再発、進行または退縮のレベルを測定するための方法、システムおよびデバイスも記載される。
背景
がん処置前、がん処置中およびがん処置後の残存疾患の検出および定量は、患者におけるがん処置またはがん寛解の有効性をモニターするために使用され得る。標的核酸シークエンシング法は、無病組織とがん性組織との相違（すなわちバリアント）を決定するためにこれまで使用されてきた。標的シークエンシング法は、多くの場合、がんゲノムもしくはエクソーム内の公知ドライバー遺伝子もしくは公知突然変異ホットスポットにおける突然変異を探すか、またはディープシークエンシング法を利用して特定の標的遺伝子座における正確なバリアントコールを確保する。
がん処置前、がん処置中およびがん処置後の残存疾患の検出および定量は、患者におけるがん処置またはがん寛解の有効性をモニターするために使用され得る。標的核酸シークエンシング法は、無病組織とがん性組織との相違（すなわちバリアント）を決定するためにこれまで使用されてきた。標的シークエンシング法は、多くの場合、がんゲノムもしくはエクソーム内の公知ドライバー遺伝子もしくは公知突然変異ホットスポットにおける突然変異を探すか、またはディープシークエンシング法を利用して特定の標的遺伝子座における正確なバリアントコールを確保する。
個体における腫瘍が起源である無細胞ＤＮＡ（「ｃｆＤＮＡ」）（「循環腫瘍ＤＮＡ」または「ｃｔＤＮＡ」とも呼ばれる）の量は、疾患の重症度と相関し得る。大部分の進行した疾患状態を除くと、罹患組織が起源であるＤＮＡは、試料中のほんの一部に過ぎず、ＤＮＡの圧倒的多数は、個体における非罹患組織に由来する。このことが、罹患組織が起源であるｃｆＤＮＡの量の正確な測定を特に困難にする。現行の手法は、比較的まれながん特異的バリアントを標的とする超高感度スキーム、例えば、カスタムｑＰＣＲまたはカスタム濃縮を必要とすることが多い。
発明の簡単な要旨
個体の疾患（例えば、がん）のレベルを測定するための方法、システムおよびデバイス、ならびに個体における疾患の存在、再発、進行または退縮を測定する方法が、本明細書に記載される。
個体の疾患（例えば、がん）のレベルを測定するための方法、システムおよびデバイス、ならびに個体における疾患の存在、再発、進行または退縮を測定する方法が、本明細書に記載される。
一部の実施形態では、個体における疾患のレベルを測定する方法は、個体に関連する核酸シークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示すシグナルと、選択された遺伝子座にわたってのシークエンシング偽陽性エラー率を示すバックグラウンド指数とを、比較するステップ；およびシグナルとバックグラウンド指数の比較に基づいて個体における疾患のレベルを決定するステップを含む。
一部の実施形態では、個体における疾患の再発を測定する方法は、個体に関連する核酸シークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示すシグナルと、選択された遺伝子座にわたってのシークエンシング偽陽性エラー率を示すバックグラウンド指数とを、比較するステップ；およびシグナルとバックグラウンド指数の比較に基づいて個体における疾患のレベルを決定するステップを含む。
一部の実施形態では、個体における疾患の進行または退縮を測定する方法は、個体に関連する核酸シークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示すシグナルと、選択された遺伝子座にわたってのシークエンシング偽陽性エラー率を示すバックグラウンド指数とを、比較するステップ；およびシグナルとバックグラウンド指数の比較に基づいて個体における疾患のレベルを決定するステップ；および疾患の測定レベルを、個体におけるその疾患の以前に測定されたレベルと比較するステップを含む。一部の実施形態では、疾患の進行または退縮は、疾患の測定レベルの統計的に有意な変化に基づく。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、疾患のレベルは、個体からの試料中の疾患に関連する核酸分子の割合である。上記方法のいずれかの一部の実施形態では、比較するステップは、バックグラウンド指数をシグナルから減算することを含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、疾患のレベルの測定についての誤差を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、誤差は、疾患のレベルについての信頼区間である。一部の実施形態では、誤差は、選択された遺伝子座で検出された個々の小ヌクレオチドバリアントリードの総数に比例する。一部の実施形態では、疾患のレベルは、個体からの試料中の疾患に関連する核酸分子の割合であり、割合および誤差は、
（式中、Ｆは、割合であり、Ｎｔｏｔａｌは、選択された遺伝子座で検出された個々の小ヌクレオチドバリアントリードの総数であり、Ｎｖａｒは、選択された遺伝子座の数であり、Ｄは、平均シークエンシング深度である）により定義される。
一部の実施形態では、個体における疾患を検出する方法は、個体に関連する核酸シークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示すシグナルと、選択された遺伝子座にわたってのサンプリング分散を示すノイズ指数とを、比較するステップ；およびシグナルとバックグラウンド指数の比較に基づいて個体が疾患を有するかどうかを決定するステップを含む。一部の実施形態では、シグナルは、所定の閾値を超えてノイズ指数を上回った場合、個体は、疾患の再発または疾患の残存レベルを有すると決定される。一部の実施形態では、シグナルは、ｋ倍またはそれより大きくノイズ指数を上回った場合、個体は、疾患の再発または疾患の残存レベルを有すると決定され、ｋが約１．５である。一部の実施形態では、ｋが約３．０である。一部の実施形態では、ｋが約５．０である。一部の実施形態では、ｋが約１０である。一部の実施形態では、方法は、疾患の再発を検出するステップを含む。
一部の実施形態では、個体における疾患の再発、進行または退縮を検出する方法は、（ａ）個体の罹患組織に起因する試料中の核酸分子の割合、Ｆ、を示す値がゼロより大きい可能性であって、ゼロより大きいＦが個体の疾患の存在を示す、可能性、および（ｂ）個体の罹患組織に起因する試料中の核酸分子の割合、Ｆ、を示す値の統計的に有意な変化の少なくとも一方を測定するステップを含み、統計的に有意な変化が、以前に測定された割合、Ｆｐｒｉｏｒ、に対する変化であり、Ｆの統計的に有意な変化が、個体の疾患の進行または退縮を示し、割合Ｆが、無細胞核酸シークエンシングデータにおいて検出された一塩基バリアント（ＳＮＶ）の総数、Ｎｔｏｔａｌ、であって、ＳＮＶが個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルから選択される、Ｎｔｏｔａｌと、ＳＮＶパネルから選択されたＳＮＶの数、Ｎｖａｒ、であって、平均シークエンシング深度、Ｄ、により調整され、さらに、選択されたＳＮＶにわたってシークエンシング偽陽性エラー率、Ｅ、により調整された、Ｎｖａｒとを比較することにより決定される。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するステップは、罹患組織の試料に由来する核酸分子をシークエンシングして、疾患関連ＳＮＶのセットを決定すること、および疾患関連ＳＮＶのセットを、生殖細胞系列バリアントおよび非がん関連体細胞バリアントを除去するようにフィルター処理することを含む。一部の実施形態では、罹患組織の試料は、個体から得られた腫瘍生検試料である。一部の実施形態では、生殖細胞系列バリアントもしくは体細胞バリアント、または両方は、個体から得られた非罹患組織の試料に由来する核酸分子をシークエンシングすることにより決定される。一部の実施形態では、非罹患組織の試料は、白血球を含む。一部の実施形態では、非罹患組織の試料は、バフィーコートである。一部の実施形態では、方法は、罹患関連ＳＮＶのセットを、１つのシークエンシングリードによってしか支持されないＳＮＶを除去するようにフィルター処理するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、罹患関連ＳＮＶのセットを、相補的シークエンシングリードにより支持されないＳＮＶを除去するようにフィルター処理するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、罹患関連ＳＮＶのセットを、個体の一般集団に所定の閾値よりも高い対立遺伝子頻度で存在するＳＮＶを除去するようにフィルター処理するステップをさらに含む。一部の実施形態では、所定の閾値は、約０．０１である。一部の実施形態では、方法は、低複雑性ゲノム領域（すなわち、ホモポリマー領域、またはショートタンデムリピート（ＳＴＲ））内のＳＮＶをフィルター処理するステップをさらに含む。一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、個体から得られた流体試料からの核酸分子を、複数のフロー位置を含むフローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングすることにより得られ、フロー位置は、ヌクレオチドフローに対応し；個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するステップは、疾患関連ＳＮＶのセットを、核酸シークエンシングデータおよび参照シークエンシングデータは、フローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングされたときに、２カ所より多くのフロー位置において参照配列に関連する参照シークエンシングデータと異なる核酸シークエンシングデータを生じさせる結果となるＳＮＶのみを含むように、フィルター処理することをさらに含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、個体から得られた流体試料からの核酸分子を、複数のフロー位置を含むフローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングすることにより得られ、フロー位置は、ヌクレオチドフローに対応し；方法は、罹患組織の試料に由来する核酸分子をシークエンシングして疾患関連ＳＮＶのセットを決定することを含む個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するステップをさらに含み；個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するステップは、疾患関連ＳＮＶのセットを、核酸シークエンシングデータおよび参照シークエンシングデータは、フローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングされたときに、２カ所より多くのフロー位置において参照配列に関連する参照シークエンシングデータと異なる核酸シークエンシングデータを生じさせる結果となるＳＮＶのみを含むように、フィルター処理することをさらに含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、核酸分子は、無細胞核酸分子である。一部の実施形態では、核酸分子は、ＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子である。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、個体から得られた流体試料中の核酸分子から導出される。一部の実施形態では、流体試料は、血液試料、血漿試料、唾液試料、尿試料、または糞便試料である。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、疾患はがんである。一部の実施形態では、がんは、転移性がんである。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、核酸分子をシークエンシングしてシークエンシングデータを得るステップをさらに含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、所定のヌクレオチドシークエンシングサイクル順序に従って核酸分子をシークエンシングすることにより得られる。一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、異なる所定のヌクレオチドシークエンシングサイクルに従って核酸分子を再シークエンシングすることによりさらに得られ、異なる所定のヌクレオチドシークエンシングサイクルは、シークエンシング遺伝子座のサブセットにおいて第１の所定のヌクレオチドシークエンシングサイクル順序と比較して異なる偽陽性バリアント率を生じさせる結果となる。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、シークエンシングデータは、非標的シークエンシングデータである。一部の実施形態では、シークエンシングデータは、非標的全ゲノムから得られる。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、シークエンシングデータの平均シークエンシング深度は、少なくとも０．０１である。一部の実施形態では、シークエンシンデータの平均シークエンシング深度は、約１００未満である。一部の実施形態では、シークエンシンデータの平均シークエンシング深度は、約１０未満である。一部の実施形態では、シークエンシンデータの平均シークエンシング深度は、約１未満である。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルは、パッセンジャー突然変異および／またはドライバー突然変異を含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルは、一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子座を含む。一部の実施形態では、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルは、インデル遺伝子座を含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルからの選択された遺伝子座は、約３００またはそれより多くの遺伝子座を含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、疾患関連ＳＮＶパネルから選択される遺伝子座は、個々の遺伝子座の偽陽性率に基づいて選択される。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、疾患関連ＳＮＶパネルから選択される遺伝子座は、疾患の選択されたサブクローンに関連する固有のＳＮＶに基づく。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、疾患関連ＳＮＶパネルは、罹患組織に関連するシークエンシングデータを非罹患組織に関連するシークエンシングデータと比較することにより決定される。一部の実施形態では、方法は、罹患組織に由来する核酸分子をシークエンシングして罹患組織に関連するシークエンシングデータを得るステップをさらに含む。一部の実施形態では、非罹患組織に由来する核酸分子をシークエンシングして非罹患組織に関連するシークエンシングデータを得るステップをさらに含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、核酸分子の表面ベースのシークエンシングを使用して得られ、核酸分子は、表面への核酸分子の付着前に増幅されない。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、固有分子識別子（ＵＭＩ）を使用せずに得られる。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、試料識別バーコードを使用せずに得られる。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、シークエンシング偽陽性エラー率は、対照遺伝子座のパネルを使用して測定される。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、シークエンシングデータは、プールされた試料中の複数の個体から得られた核酸分子をシークエンシングすることにより得られる。一部の実施形態では、選択された遺伝子座は、複数の個体のうち各個体に固有のものである。一部の実施形態では、選択された遺伝子座の中の少なくとも１つの遺伝子座は、複数の個体における少なくとも２名の個体間で共通している。一部の実施形態では、シークエンシング深度は、個体ごとに決定され、各個体についてのシグナルは、その個体に関連するシークエンシング深度に基づいて調整される。
発明の詳細な説明
本明細書に記載される方法、デバイスおよびシステムは、個体における疾患のレベルの検出および／または測定に関係する。疾患のレベルを、罹患組織（例えば、がん組織）に起因する試料中の核酸分子（例えば、無細胞ＤＮＡ）の割合と関連付けることができる。例えば、選択された遺伝子座での罹患組織に起因する核酸分子における小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）リードの検出率を示すシグナルを測定すること、およびこのシグナルと、シークエンシング偽陽性エラー率を示すバックグラウンド指数、または遺伝子座にわたってのサンプリング分散を示すノイズ指数とを比較することにより、疾患を検出することができ、またはそのレベルを測定することができる。罹患組織に関連している試料中の核酸分子の検出された割合により、個体における疾患のレベルの情報が得られる。個体における疾患のレベルを検出することにより、すでに存在する疾患（または寛解期にあるとそれまで考えられていた疾患）の再発を決定することができ、病状の進行または退縮を決定することもできる。
本明細書に記載される方法、デバイスおよびシステムは、個体における疾患のレベルの検出および／または測定に関係する。疾患のレベルを、罹患組織（例えば、がん組織）に起因する試料中の核酸分子（例えば、無細胞ＤＮＡ）の割合と関連付けることができる。例えば、選択された遺伝子座での罹患組織に起因する核酸分子における小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）リードの検出率を示すシグナルを測定すること、およびこのシグナルと、シークエンシング偽陽性エラー率を示すバックグラウンド指数、または遺伝子座にわたってのサンプリング分散を示すノイズ指数とを比較することにより、疾患を検出することができ、またはそのレベルを測定することができる。罹患組織に関連している試料中の核酸分子の検出された割合により、個体における疾患のレベルの情報が得られる。個体における疾患のレベルを検出することにより、すでに存在する疾患（または寛解期にあるとそれまで考えられていた疾患）の再発を決定することができ、病状の進行または退縮を決定することもできる。
ある特定の罹患組織、特にがんは、個体の正常な健常ゲノムと比較して、罹患ゲノム全体にわたって何千もの（または何万もの、何十万もの、またはそれを超える）突然変異を含み得る。これらの突然変異は、成長優位性（例えば、増殖もしくは生存）をがんにもたらす、ドライバー突然変異であることもあり、またはゲノムのコードもしくは非コード領域全体にわたって見出すことができるが、いずれの成長優位性ももたらすと考えられないパッセンジャー突然変異であることもある。一部のケースでは、パッセンジャー突然変異は、がん性になる前にがん性になる細胞内に蓄積し、健常組織でさえも、ある特定の突然変異率を有する。患者における任意の所与の疾患についての幅広い突然変異は、患者に、およびさらには特定の罹患組織クローンまたはサブクローンに固有のものであり、したがって、罹患組織に固有の遺伝子シグネチャーをもたらす。同じ患者の罹患組織のゲノム（またはその一部分）と非罹患組織のゲノム（または対応するゲノム）を比較することにより、罹患組織についての個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルを確立することができる。必要に応じて、そのパネルから遺伝子座のサブセットを解析のために選択することができ、この選択は、例えば、所与の遺伝子座における、例えば他の遺伝子座より低い偽陽性エラー率に基づき得る。ＳＮＶパネルは、パッセンジャー突然変異および／またはドライバー突然変異を含み得る。
核酸分子の罹患割合または患者における疾患のレベルを測定する際に偽陽性エラー率および／またはサンプリング分散を考慮することにより、全体的なシークエンシング深度を低減することができ、それによってかなりの時間およびコストが節約できる。偽陽性エラーは、化学的損傷、誤った塩基組込み、またはシークエンシング中の蛍光リードエラーに起因して生じることがあり、ＳＮＶが所与の遺伝子座に存在すると間違って示すことがある。サンプリング分散は、偽陽性エラーと真陽性コールの両方を含む、検出ＳＮＶリードの数に関連している。特定の遺伝子座における潜在的偽エラーを防ぐために、他の疾患検出方法は、所与の遺伝子座における複数の独立したＳＮＶコールを必要することが多く、そのようなコールは、試料中の罹患核酸の割合に逆比例する深度でその遺伝子座をシークエンシングすることよってしか得ることができない。一部のケースでは、他の方法は、ある遺伝子座におけるコンセンサス配列を複数のシークエンシングリードから決定するステップを含む。他の方法により用いられるディープシークエンシングは、一般に、ゲノムの特定の遺伝子座または狭いサブセットを標的とする必要がある（例えば、突然変異ホットスポットまたは全エクソームシークエンシング）。加えて、他のシークエンシング法は、同じ核酸分子の複数のコピーを独立してシークエンシングするためにライブラリー調製中に核酸分子の増幅を必要とすることが多い。この増幅プロセスには、さらなる偽エラーを導入するリスクがある。
任意の特定の遺伝子座における偽陽性エラーを顧慮せずに、本明細書に記載の方法は、解析に選択される遺伝子座にわたっての偽陽性エラー率および／またはサンプリング分散を使用して、罹患核酸分子の割合または疾患のレベルを測定する。遺伝子座が選択されてしまえば、いずれの特定の遺伝子座における偽陽性も測定に有意な影響を与えない。したがって、解析に選択される遺伝子座を、特定の遺伝子座各々における偽陽性エラー率を使用して選択することができるが、所与の遺伝子座におけるシークエンシングから生じ得るいずれの特定のエラーの影響も考慮されない。
定義
定義
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明白な指示がない限り、複数形の言及対象を含む。
本明細書での「約」ある値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に関する変動を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
用語「平均」は、本明細書で使用される場合、平均値もしくは中央値、または平均値もしくは中央値を概算するために使用される任意の値のいずれかを指す。
「変動」または「分散」は、本明細書で使用される場合、分布の幅を定義する任意の統計メトリックを指し、標準偏差、分散、または四分位範囲であり得るが、これらに限定されない。
用語「個体」、「患者」および「対象」は、同義語として使用され、ヒトを含む動物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「組織」は、任意の細胞物質を指し、循環細胞または非循環細胞を含み得る。
本明細書に記載される本発明の態様および変形形態が、態様および変形形態「からなること」および／または「から本質的になること」を含むことは理解されよう。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間に介在する各々の値、およびその述べられている範囲内の、任意の他の述べられているまたは介在する値が、本開示の範囲内に包含されることは、理解されるはずである。述べられている範囲が上限値または下限値を含む場合、これらの含まれる限界値のどちらかを含まない範囲もまた、本開示に含まれる。
本明細書で使用される節の見出しは、単に構成のためのものであり、記載される主題を限定するものと解釈すべきでない。この説明は、当業者による本発明の実施および使用を可能にするために提供され、特許出願およびその要件に関連して提供される。記載される実施形態の様々な修飾形態が当業者には容易に分かることになり、本明細書における一般原理を他の実施形態に応用することができる。したがって、本発明は、示される実施形態に限定されるように意図されたものではなく、本発明には、本明細書に記載される原理および特徴に対応する最も広い範囲が与えられる。
図１～８Ｄは、様々な例によるプロセスを示す。これらの例示的プロセスを、例えば、ソフトウェアプラットフォームを実装している１つまたは複数の電子デバイスを使用して遂行することができる。一部の例では、例示的プロセスの１つまたは複数は、クライアント－サーバーシステムを使用して遂行され、示されているプロセスのブロックは、サーバーデバイスとクライアントデバイスの間でいかようにも分割され得る。他の例では、例示的プロセスのブロックは、サーバーデバイスと複数のクライアントデバイスの間で分割される。したがって、例示的プロセスの部分は、クライアント－サーバーシステムの特定のデバイスにより遂行されるように本明細書に記載されているが、そのプロセスがそのように限定されないことは理解されるであろう。他の例では、例示的プロセスの１つまたは複数は、クライアントデバイス（例えば、ユーザーデバイス）をもっぱら使用して行なわれるか、または１つもしくは複数のクライアントデバイスをもっぱら使用して行なわれる。これらの例示的プロセスでは、一部のブロックは、必要に応じて組み合わせられ、一部のブロックの順序は、必要に応じて変更され、一部のブロックは、必要に応じて割愛される。一部の例では、追加のステップが例示的プロセスと組み合わせて遂行され得る。したがって、例証される（および下記でより詳細に説明される）ような操作は、本質的に例示的なものであり、したがって、限定と見なすべきではない。
本明細書で言及されるすべての公表文献、特許および特許出願の開示は、これにより各々その全体が参照により本明細書に取り込まれる。参照により取り込まれるいずれかの参考文献が本開示と矛盾する場合には、本開示が優先されるものとする。
個別化遺伝子座パネル
個別化遺伝子座パネル
個体におけるある特定の疾患、例えばがんは、その疾患のシグネチャーを与える突然変異型核酸配列を生じさせることができる。罹患組織に関連する核酸分子の配列（すなわち、罹患ゲノム）を、同じ個体からの非罹患組織に関連する核酸分子の配列（すなわち、健常または非罹患ゲノム）と比較することができる。罹患ゲノム（またはその一部分）と非罹患ゲノム（またはその一部分）との差が罹患組織のバリアントを決定する。ゲノム（またはゲノムの部分）間の小ヌクレオチドバリアント（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）または小さいインデル（一般に長さ１～５塩基））の一部またはすべてを使用して、その個体の疾患に固有の個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを確立することができる。ＳＮＶ遺伝子座パネルは、ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏであり、例えば、オリゴヌクレオチドプライマーのセットでは具現化されない。したがって、個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルは、罹患組織からの関連する核酸配列と健常（すなわち、非罹患）組織からの関連する核酸配列との差に基づいて構築される。一部の実施形態では、罹患組織および／または健常組織に関連するシークエンシングデータが標的シークエンシングデータである。一部の実施形態では、罹患組織および／または健常組織に関連するシークエンシングデータは、非標的（例えば、ゲノムワイドまたは全ゲノム）シークエンシングデータである。
一部の実施形態では、ＳＮＶ遺伝子座パネルは、罹患（例えば、がん性）組織に関連するＳＮＶからの生殖細胞系列バリアントおよび／または非疾患（例えば、非がん）関連体細胞バリアントのフィルター処理により生成される。例えば、罹患組織をシークエンシングして、疾患組織に関連する複数のバリアントを決定することができる。得られたシークエンシングリードを、例えば、参照ゲノムと比較することができ、シークエンシングリードと参照ゲノムとの差に基づいてバリアントを選択することができる。同定されたバリアントは、罹患組織に固有であるバリアントばかりでなく、健常組織に見られるバリアント（例えば、白血球または他の健常組織に見られるバリアント）も含み得る。例えば、白血球に見られるバリアントは、同じ対象からのマッチするバフィーコート試料をシークエンシングすることおよびシークエンシングデータを参照ゲノムと比較することにより得ることができる。これらのバリアントは、がん性バリアントを含むことがあるが、多数のバリアントは、加齢に伴うクローン性造血に起因し得る。一部の実施形態では、バフィーコート／白血球シークエンシングにより同定されたバリアントは、非がん関連体細胞バリアントの近似的代表集団として処理される。したがって、生殖細胞系列バリアントおよび／または非疾患関連体細胞バリアント（参照ゲノムに対して）を、健常組織をシークエンシングすることおよびシークエンシングリードを参照ゲノムと比較することにより決定することができる。次いで、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルが生成されると、罹患組織に関連するＳＮＶを、生殖細胞系列バリアントおよび／または体細胞バリアントを除去するようにフィルター処理することができる。
一部の実施形態では、罹患組織に関連する配列データおよび／または健常組織に関連する配列データは、事前に（つまり、流体試料中の核酸分子のシークエンシングおよび／または解析の前に）決定される。例えば、個体から得られた任意の健常組織を使用して、健常ゲノム（またはその一部分）の配列を決定することができる。健常組織は、例えば、流体試料から（例えば、流体試料中の無細胞核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ）もしくは健常血液細胞から）、口腔内スワブから、健常組織の生検から、または任意の他の好適な方法から得ることができる。一部の実施形態では、健常組織は、白血球、例えば、バフィーコートから得られた白血球を含む。一部の実施形態では、健常組織は、非罹患組織を含む。例えば、腫瘍生検試料（例えば、固形腫瘍生検試料、例えばｎ ＦＦＰＥ組織試料）は、健常（すなわち、非罹患）組織と罹患組織の両方を含み得る。一部の実施形態では、健常組織は、健常ｃｆＤＮＡ試料を含み、例えば、個体は、血漿および／または白血球含有試料などの血液試料の全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）解析を含む通例の健康診断を受け得る。そのようなデータを個体の健康記録に保存することができる。個体が、その後、がんなどの病的状態を発症したとき、以前に得られたシークエンシングデータを使用してその個体についての健康のベースラインを確立することができる。逆に、処置（例えば、外科的処置）を受けた、病的状態（例えば、肝臓がんまたは乳がん）があることが分かっている個体について、健常組織は、病的状態をもはや検出することができない処置後に適切に採取された１つまたは複数の採取試料を含み得る。そのような健常組織は、疾患が個体において再燃したかどうかを評定するためにその後の試料が比較されるベースライン試料として、使用することができる。核酸シークエンシングライブラリーを健常組織から調製し、シークエンシングして健常組織のゲノム（またはその一部分）に起因するシークエンシングデータを得ることができる。少量の疾患組織が健常組織とともに抽出されることがあるが、罹患組織は、一般に、健常組織のシークエンシングデータを得るために無視され得る微量成分であろう。
罹患組織に関連する核酸分子（例えば、ゲノムまたはその一部分）の配列データは、罹患組織、例えば、切除、生検または別様に試料採取され得る原発性または続発性がん、の組織試料を得ること、および得られた組織中の核酸分子をシークエンシングすることにより、決定され得る。一部の実施形態では、複数の試料が罹患組織から得られ、これにより、罹患組織内のモザイク現象（例えば、罹患組織の異なるクローンまたはサブクローン）が捕捉され得る。一部の実施形態では、罹患組織に関連するシークエンシングデータは、流体試料から（例えば、流体試料中の無細胞核酸分子（例えばｃｆＤＮＡ）または健常血液細胞から）得られる核酸分子をシークエンシングすることにより得られる。流体試料も健常組織に関連する核酸分子を含み得るが、健常組織に関連するシークエンシングデータは、一般に、かなり高度な深度カウントを有することになり、罹患組織に関連するシークエンシングデータの決定上、無視され得る。罹患組織は、例えば、疾患の処置（例えば、がんの処置のための化学療法）の開始前に試料採取されることもあり、または疾患の処置の開始後に採取されることもある。
個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルは、非罹患組織からの核酸分子と比較される罹患組織からの核酸分子のバリアント（バリアントおよび突然変異変化の遺伝子座を含む）を含む。ある特定のバリアントは、健常および／もしくは罹病組織のシークエンシングデータに対する制限のため検出されなかった可能性があり、またはシークエンシングすることが技術的に困難であるゲノムの領域、例えば、低複雑度領域もしくは縮重がマッピングされる領域、において生じる可能性があるので、パネルは、健常組織と罹患組織との核酸の相違のすべてを１つの相違も欠けることなく含むことはできない。一部の実施形態では、個別化パネルは、ドライバー突然変異、パッセンジャー突然変異、またはドライバー突然変異とパッセンジャー突然変異の両方を含む。一部の実施形態では、遺伝子座パネルは、ゲノムのコード領域、ゲノムの非コード領域、または両方における突然変異を含む。個別化パネルにおけるバリアントの数は、罹患組織のタイプ、または疾患の重症度を含む、罹患組織に依存する。一部の実施形態では、個別化パネルは、２つまたはそれより多くの、５つまたはそれより多くの、１０またはそれより多くの、２５またはそれより多くの、５０またはそれより多くの、１００またはそれより多くの、２００またはそれより多くの、３００またはそれより多くの、５００またはそれより多くの、１０００またはそれより多くの、２５００またはそれより多くの、５０００またはそれより多くの、１０，０００またはそれより多くの、２５，０００またはそれより多くの、５０，０００またはそれより多くの、１００，０００またはそれより多くの、２５０，０００またはそれより多くの、５００，０００またはそれより多くの、１，０００，０００またはそれより多くの、５，０００，０００またはそれより多くの遺伝子座を含む。一部の実施形態では、バリアント遺伝子座は、２つまたはそれより多くの（例えば、３つもしくはそれより多くの、４つもしくはそれより多くの、または５つもしくはそれより多くの）冗長バリアントコールがいずれかの所与の遺伝子座で行なわれた場合にのみ、個別化遺伝子座パネルに含まれる。冗長バリアントコールの遺伝子座のスクリーニングは、パネルに導入される偽陽性バリアント遺伝子座の数を制限する。一部のケースでは、パネルは、高信頼度で決定されるコンセンサス核酸シークエンシングにより罹患組織と非罹患組織とで異なることが検証されたバリアントのみを含む。
本明細書に記載される方法のために個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルのすべてを解析する必要があるとは限らない。一部の実施形態では、個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネル内の遺伝子座の一部分が解析に選択される。ある特定の遺伝子座またはバリアントは、他の遺伝子座またはバリアントよりも偽陽性エラーを起こしやすいことがある。加えて、ある特定のシークエンシング方法論は、他の方法論よりも偽陽性エラーを起こしやすいことがある。一部の実施形態では、遺伝子座は、その遺伝子座における偽陽性エラー率に基づいて個別化遺伝子座パネルから選択される。例えば、遺伝子座は、その遺伝子座における偽陽性エラー率が約１％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．２５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０２５％もしくはそれ未満、約０．０１％もしくはそれ未満、約０．００５％もしくはそれ未満、約０．００２５％もしくはそれ未満、または約０．０００１％もしくはそれ未満である場合、選択され得る。単に例として、特定のシークエンシング方法論は、特定の突然変異（例えば、Ｇ→Ａ）突然変異の検出について他の突然変異タイプ（例えば、Ｇ→Ｃ）よりも低いシークエンシング偽陽性エラー率を有することができ、より低い偽陽性エラー率を有するバリアントを選択することができる。一部の実施形態では、選択される遺伝子は、２つもしくはそれより多くの、５つもしくはそれより多くの、１０もしくはそれより多くの、２５もしくはそれより多くの、５０もしくはそれより多くの、１００もしくはそれより多くの、２００もしくはそれより多くの、３００もしくはそれより多くの、５００もしくはそれより多くの、１０００もしくはそれより多くの、２５００もしくはそれより多くの、５０００もしくはそれより多くの、１０，０００もしくはそれより多くの、２５，０００もしくはそれより多くの、５０，０００もしくはそれより多くの、１００，０００もしくはそれより多くの、２５０，０００もしくはそれより多くの、または５００，０００もしくはそれより多くの遺伝子座を含む。一部の実施形態では、個別化遺伝子座パネルにおけるすべての遺伝子座が選択される。
罹患組織に関連するＳＮＶからの生殖細胞系列および非疾患関連体細胞バリアントのフィルター処理は、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルから遺伝子座を選択するために（または疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するために）使用され得る１つの技法である。血液中に存在するｃｆＤＮＡは、がん性および非がん性細胞を含む、いくつかの細胞源から生じ得る。造血幹細胞は、血液細胞のクローン集団の拡大をもたらすことができる、クローン性造血関連体細胞バリアントを含み得る。これらのクローン造血関連体細胞バリアントは、非悪性であることが多く、これらの体細胞バリアントにより駆動されるクローン拡大は、未確定の潜在能を持つクローン造血（ＣＨＩＰ）と呼ばれ得る。Ｓｔｅｅｎｓｍａ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｏｎａｌ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｏｆ ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ， Ｂｌｏｏｄ， ｖｏｌ．， １２６， ｐｐ． ９－１６ （２０１５）を参照されたい。いくつかの研究により、７０歳より高齢の高齢者集団の少なくとも１０％は、突然変異した造血幹細胞のオリゴクローナル拡大に起因してＣＨＩＰを保有することが示された。Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｇｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｌｏｎａｌ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ｖｏｌ． ３７１， ｎｏ． ２６， ｐｐ． ２４８８－２４９８ （２０１４）を参照されたい。したがって、これらの非疾患関連体細胞バリアントは、それらが疾患に関連していないとしても、ｃｆＤＮＡにおいて有意に表されることがある。米国特許出願公開第２０１９／０３８５７００Ａ１号、米国特許出願公開第２０１９／０３５５４３８Ａ１号、米国特許出願公開第２０２０／００１３４８４Ａ１号を参照されたく、これらの参考特許文献の各々の内容は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。ＳＮＶ遺伝子座パネルからのこれらの非疾患関連体細胞バリアントの除去は、バックグラウンドエラー率を有意に低減することができる。クローン造血関連体細胞バリアントなどの、非疾患関連体細胞バリアントを、例えば、白血球、例えばバフィーコート中の白血球、に由来する核酸分子をシークエンシングすることにより、同定することができる。
一部の実施形態では、ＳＮＶ遺伝子座パネルは、生殖細胞系列および非疾患関連体細胞バリアント（すなわち、疾患と無関係の体細胞バリアント）を除去するようにフィルター処理された罹患組織に関連するＳＮＶを含む。例えば、これらの非疾患関連体細胞バリアントを、健常組織（例えば、バフィーコートのような、白血球を含有する試料）に由来する核酸分子をシークエンシングすることにより決定することができる。白血球（例えば、バフィーコートからの）から得られる核酸分子をシークエンシングすることにより検出される生殖細胞系列および非疾患関連体細胞バリアントの除去は、疾患のレベルが、ｃｆＤＮＡをシークエンシングすることにより測定される場合、特に有用であり得る。ｃｆＤＮＡが解析のためにシークエンシングされると、腫瘍から生じる疾患関連バリアントと非疾患関連体細胞バリアントおよび生殖細胞系列バリアントの両方が検出される。解析からの生殖細胞系列および非疾患関連体細胞バリアントの除去は、ｃｔＤＮＡへの誤った帰属を低減することができる。したがって、非疾患関連体細胞バリアントを除去することにより、偽陽性エラー率（つまり、罹患組織に誤って起因すると考えられるＳＮＶ）を低減することができる。
他の技法を、加えてまたは代替的に、疾患関連ＳＮＶパネルから遺伝子座を選択するためにまたは疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するために、使用することができる。例えば、一部の実施形態では、疾患関連バリアントが、罹患組織に由来する核酸分子をシークエンシングしたときに得られた２つまたはそれより多くの（例えば、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの）シークエンシングリードにより支持された場合にのみ、遺伝子座を疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルから選択することができる（または疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを、ＳＮＶを含むように生成することができる）。罹患組織に関連するバリアントを支持するために２つまたはそれより多くのシークエンシングリードを必要とすることにより、偽陽性の可能性を（例えば、罹患組織を解析する際のシークエンシングエラーまたは他のエラーによりコールされるバリアントの数を制限することにより）低下させることができる。したがって、罹患組織に由来する核酸分子をシークエンシングすることにより得られるシークエンシングデータにより確実に支持されないＳＮＶを除去することにより、偽陽性エラー率（つまり、罹患組織に誤って起因すると考えられるＳＮＶ）を低減することができる。
一部の実施形態では、多く見られるバリアント対立遺伝子、例えば所定の頻度閾値より頻度が高いバリアントを一般集団から排除することにより、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネル内の遺伝子座を選択することができる（またはそのように排除することにより、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成することができる）。多く見られるバリアントは、生殖細胞系列突然変異であって罹患組織に固有のものでない可能性が高く、したがって、それらを排除してエラーを低減することができる。一部の実施形態では、所定の頻度閾値は、約０．００５あり（もしくはそれより大きく）、約０．０１であるかもしくはそれより大きく、約０．０２であるかもしくはそれより大きく、または約０．０５であるかもしくはそれより大きい。したがって、一般集団に多く見られる、それ故、生殖細胞系列の分散に起因する可能性が高いＳＮＶを除去することにより、偽陽性エラー率（つまり、罹患組織に誤って起因すると考えられるＳＮＶ）を低減することができる。
一部の実施形態では、所定の閾値より高いまたは統計的閾値より高い対立遺伝子頻度を有する核酸シークエンシングデータにおいて検出されるバリアントを排除することにより、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネル内の遺伝子座を選択することができる（またはそのように排除することにより、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成することができる）。罹患組織に由来するｃｆＤＮＡは、一般にｃｆＤＮＡの微量画分であり、高い対立遺伝子頻度を有するバリアントは、疾患と無関係の生殖細胞系列および／または体細胞バリアント（例えば、非疾患関連体細胞バリアント、または異なる状態もしくは疾患に関係する体細胞バリアント）に起因する可能性が高く、疾患のレベルを測定するための解析から排除され得る。対立遺伝子頻度のヒストグラムをプロットすると、罹患組織またはシークエンシングノイズに一般に起因する、より低い対立遺伝子頻度クラスターと、生殖細胞系列および／または体細胞バリアントに一般に起因する、より高い対立遺伝子頻度クラスターとが、一般に得られることになる。一部の実施形態では、より低い対立遺伝子頻度クラスターとより高い対立遺伝子頻度クラスターを区別するために統計パラメーターが決定され、より高い対立遺伝子頻度クラスターに関連するバリアントが排除され得る。一部の実施形態では、より高い対立遺伝子頻度クラスターにおけるバリアントを排除するために所定の閾値が使用される。所定の閾値は、例えば、約０．２であるかもしくはそれより高い、約０．２５であるかもしくはそれより高い、または約０．３であるかもしくはそれより高いことがある。
一部の実施形態では、ホモポリマー領域（同じ塩基タイプを有する、連続するヌクレオチドのストレッチ）内のバリアントを排除することにより疾患関連ＳＮＶパネル内の遺伝子座を選択することができる（そのようなバリアントを排除することにより疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成することができる）。一部の実施形態では、ホモポリマー領域は、同じ塩基タイプを有する連続した３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのヌクレオチドを含有する。ホモポリマー領域内のバリアントは、偽陽性バリアントであることが疑われ、罹患組織を正確に反映しないことがある。したがって、ホモポリマー領域に含まれるＳＮＶを除去することにより、偽陽性エラー率（つまり、罹患組織に誤って起因すると考えられるＳＮＶ）を低減することができる。
一部の実施形態では、疾患組織に由来する核酸分子の中から相補鎖により支持されないバリアントを排除することにより疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネル内の遺伝子座を選択することができる（そのようなバリアントを排除することにより疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成することができる）。例えば、バリアントが、第１鎖に関連するシークエンシングリードでコールされるが、相補的バリアントが、第１鎖に相補的な第２鎖でコールされない場合には、シークエンシングエラーまたは他のアーチファクトを仮定することができ、バリアントをさらなる解析から排除することができる。したがって、罹患組織に由来する核酸分子をシークエンシングすることにより得られるシークエンシングデータにより確実に支持されないＳＮＶを除去することにより、偽陽性エラー率（つまり、罹患組織に誤って起因すると考えられるＳＮＶ）を低減することができる。
一部の実施形態では、サイクルシフト（例えば、フローサイクル順序に基づいて参照と比較して１つもしくは複数のフローサイクルによるフローグラムシグナルシフト）を誘導するおよび／またはシークエンシングデータにおいて新しいゼロもしくは新しい非ゼロシグナルを生じさせるバリアントのみを含めることにより疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネル内の遺伝子座を選択することができる（そのようなバリアントのみを含めることにより疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成することができる）。例えば、米国特許出願第１６／８６４，９８１号および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３１１４７を参照されたく、これらの参考特許文献の各々の内容は、それら全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。サイクルシフト事象は、真陽性事象（本明細書中でさらに説明されるような）の非存在下で存在する可能性が低いので、一部の実施形態では、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルからの遺伝子座は、その遺伝子座におけるバリアントがサイクルシフト事象をもたらす場合に選択され得る。したがって、強いシグナルをもたらすＳＮＶのみを含めることにより、偽陽性エラー率（つまり、罹患組織に誤って起因すると考えられるＳＮＶ）を低減することができる。
本明細書に記載される方法を使用して、同じ個体における罹患組織の異なるクローンまたは異なるサブクローンを同時に解析することができる。罹患組織の異なるクローン（例えば、独立したがんクローン）は、一般に、固有のまたはほぼ固有のバリアントシグネチャーを有する。罹患組織のサブクローンは、いくつかの重複するバリアントを有することがあるが、一般に、バリアントの固有のまたはほぼ固有のサブセットを選択するのに十分な数の固有のバリアントを有する。一部の実施形態では、シークエンシングされた遺伝子座は、いくつかの疾患サブクローンに関連するバリアント遺伝子座の論理和集合から選択され、解析により、すべての疾患サブクローンを含む試料の画分が検出され、各サブクローンからの疾患の画分も検出される。一部の実施形態では、所与のクローンまたはサブクローンについての解析に選択されるシークエンシングされた遺伝子座は、バリアントの重複を回避するように選択される（つまり、２つまたはそれより多くのクローンまたはサブクローンにより共有されるいずれのバリアントも選択されない）。したがって、別々のクローンもしくはサブクローンについての疾患のレベル、または別々のクローンもしくはサブクローンに関連する核酸分子の割合を、個体からの同じ試料を使用して決定することができる。一部の実施形態では、クローンまたはサブクローンの１つまたは複数には１つまたは複数のがん処置が無効であり、方法を使用して、リフラクタークローンまたはサブクローンの進行または退縮をモニターすることができる。
患者試料およびシークエンシング
患者試料およびシークエンシング
流体試料は、個体から試料を得るための比較的非侵襲的の方法である。そのような流体試料は、例えば、血液、血漿、唾液、糞便または尿試料を含み得る。加えて、残存疾患、悪性疾患、または原発性もしくは固形罹患組織のない（または有意な原発性もしくは固形罹患組織のない）他の疾患について、流体試料により、罹患組織に関連する核酸分子を腫瘍生検なしに得ることが可能になる。したがって、方法は、罹患組織の位置が不明であるかまたは固形罹患組織が小さ過ぎて試料採取できない場合、特に有用であり得る。
がんなどの疾患を有する個体から採取される流体試料は、がん組織に由来する核酸分子および非罹患組織に由来する核酸分子を含む、無細胞ＤＮＡ（または「ｃｆＤＮＡ」）を一般に有する。シークエンシングデータが得られる核酸試料は、ｃｆＤＮＡであり得るが、ｃｆＤＮＡである必要はない。例えば、流体試料は、シークエンシングデータを得ることができる他の核酸を提供することができる。例えば、疾患が、血液疾患（例えば、血液がん）である場合、血液細胞を血液試料から得ることができ、血液細胞からの核酸分子をシークエンシングしてシークエンシングデータを得ることができる。一部の実施形態では、核酸分子は、流体試料から得られる無細胞ＲＮＡ分子である。
任意の好適なシークエンシング法を使用して核酸分子をシークエンシングして、核酸分子からシークエンシングデータを得ることができる。例示的なシークエンシング法としては、ハイスループットシークエンシング、次世代シークエンシング、合成によるシークエンシング、フローシークエンシング、大規模並行シーケンシング、ショットガンシークエンシング、単一分子シークエンシング、ナノポアシークエンシング、パイロシークエンシング、半導体シークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、デジタル遺伝子発現、合成による単一分子シークエンシング（ＳＭＳＳ）、クローン単一分子アレイ、ライゲーションによるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ）、およびマキシム・ギルバートシークエンシングを挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ハイスループットシーケンサー、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ３０００、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ４０００、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑＸ、Ｒｏｃｈｅ ４５４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ、またはその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，２６７，７９０号に記載されているような公開シークエンシングプラットフォームを使用して、核酸分子をシークエンシングすることができる。他のシークエンシング法およびシークエンシングシステムも当技術分野において公知である。一部の実施形態では、核酸分子は、合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）方法を使用してシークエンシングされる。一部の実施形態では、核酸分子は、「自然な合成によるシークエンシング」または「非終結型の合成によるシークエンシング」方法（その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７２，４７３号を参照されたい）を使用してシークエンシングされる。
選択されたシークエンシング法は、均一に、あるいは特定のバリアントタイプに適用されるように、偽陽性エラー率に影響を及ぼすことができる。上記で論じられたように、一部の実施形態では、個別化遺伝子座パネルからの解析に選択される遺伝子座を、所与のバリアントについての偽陽性エラー率に基づいて選択することができる。一部の実施形態では、核酸分子は、２つまたはそれより多くの異なるシークエンシング法を使用してシークエンシングされる。異なるバリアントについての異なる偽陽性エラー率を有する２つまたはそれより多くの異なるシークエンシング法を使用することにより、偽陽性エラー率を異なるシークエンシング法に適用してより多数のバリアントを選択することができる。例えば、ある特定のシークエンシング法は、所定のヌクレオチドシークエンシングサイクル（例えば、ＣＴＡＧ、ＡＴＣＧ、ＴＣＡＧなど）に頼り、バリアントタイプのシークエンシングエラー率は、サイクルの順序に依存し得る。したがって、一部の実施形態では、シークエンシングデータは、核酸分子を第１の所定のヌクレオチドシークエンシングサイクルに従ってシークエンシングすること、およびその核酸分子を異なる所定のヌクレオチドシークエンシングサイクル順序に従って再シークエンシングすることにより、得られる。一部の実施形態では、シークエンシングデータは、２つ、３つ、４つまたはそれより多くの異なるヌクレオチドシークエンシングサイクル順序を使用して得られる。
一部の実施形態では、シークエンシングデータは、非標的シークエンシングデータである。ある特定のシークエンシング方法論は、シークエンシングの幅を制限するために、および／または特定の領域を濃縮するために、ゲノムの特定の領域または遺伝子座の標的化に頼る。一般的な標的化方法としては、ハイブリダイゼーション標的化（例えば、標識またはビーズに結合された核酸プローブの使用が、標的シークエンシング用の試料中の核酸分子の領域を選択的に標的にするように使用される）、プライマーを利用した標的化（例えば、増幅（例えば、ＰＣＲ）によって標的核酸領域を増幅するために核酸プライマーを使用する）、アレイを利用した捕捉、および溶液中捕捉法が、挙げられる。標的領域は、例えば、以前に同定されたバリアント、がん増殖の公知ドライバーであるゲノム内の遺伝子、またはゲノム内の突然変異ホットスポットであり得る。しかし、標的シークエンシングは、本明細書に記載される方法により使用され得る罹患組織ゲノム全体にわたる情報のかなりの部分を無視する。
方法は、必要に応じて、全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）によって得られたシークエンシングデータを使用して遂行される。全ゲノムシークエンシングを利用することによって、より多数のバリアント遺伝子座を検出して解析に使用することができる。検出されるシグナルは、解析される遺伝子座の数が増加するにつれてノイズよりも速い速度で増加し、全ゲノムを利用することによって、より大量のデータをより単純な調製で解析することができる。したがって、一部の実施形態では、ゲノムのいずれの領域も標的とされない。一部の実施形態では、シークエンシングデータは、非標的全ゲノムシークエンシングから得られる。
本明細書に記載される方法は、幅広いシークエンシングデータ（例えば、非標的または全ゲノムシークエンシングデータ）とともに使用することができるので、平均シークエンシング深度は、標的濃縮方法ほど高度である必要がない。例えば、一部の実施形態では、シークエンシングデータの平均シークエンシング深度は、約１００もしくはそれ未満、約５０もしくはそれ未満、約２５もしくはそれ未満、約１０もしくはそれ未満、約５もしくはそれ未満、約１もしくはそれ未満、約０．５もしくはそれ未満、約０．２５もしくはそれ未満、約０．１もしくはそれ未満、約０．０５もしくはそれ未満、約０．０２５もしくはそれ未満、または約０．０１もしくはそれ未満である。一部の実施形態では、平均シークエンシング深度は、約０．０１～約１０００であるか、これらの間の任意の深度である。
一部の実施形態では、シークエンシングデータは、シークエンシングコロニー（シークエンシングクラスターとも呼ばれる）を確立する前に核酸分子を増幅することなく得られる。シークエンシングコロニーを生成するための方法としては、ブリッジ増幅またはエマルジョンＰＣＲが挙げられる。ショットガンシークエンシング、およびコンセンサス配列のコーリングに頼る方法は、一般に、固有分子識別子（ＵＭＩ）を使用して核酸分子を標識し、その核酸分子を増幅させて、独立してシークエンシングされる同じ核酸分子の非常に多数のコピーを生成する。次いで、増幅された核酸分子を表面に結合させ、ブリッジ増幅させて、独立してシークエンシングされるシークエンシングクラスターを生成し得る。次いで、ＵＭＩを使用して、独立してシークエンシングされた核酸分子を関連付けることができる。しかし、増幅プロセスは、例えばＤＮＡポリメラーゼの限られた忠実度に起因して、核酸分子にエラーを導入し得る。上記で論じられたように、ここに提供される方法は、コンセンサス配列をコールせずに遂行することができ、したがって、この初期増幅プロセスは必要とされず、このプロセスを回避して偽陽性エラー率を低減することができる。一部の実施形態では、核酸分子は、シークエンシングデータを得るためのコロニーを生成するための増幅の前に増幅されない。一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、固有分子識別子（ＵＭＩ）を使用せずに得られる。
プールされたシークエンシングデータ、および個体に関連するシークエンシングデータを使用して、試料のプール内の個体試料の割合を決定することができる。個体のゲノムは、固有のバリアントシグネチャーを有し、このシグネチャーを使用して、その個体に起因する核酸分子の割合を決定することができる。したがって、複数の個体からの試料をプールすることができ、個体に関連するプールされた試料中の核酸分子の部分を、試料識別バーコードを使用せずに決定することができる。
一部の実施形態では、個体は、疾患を有するか、または以前に疾患を有した。一部の実施形態において、疾患はがんである。本明細書に記載される方法により包含される例示的ながんとしては、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、腺癌（例えば、前立腺、小腸、子宮内膜、頸管、大腸、肺、膵臓、食道、直腸、子宮、胃、乳腺および卵巣）、Ｂ細胞リンパ腫、乳がん、癌腫、子宮頸がん、慢性骨髄性白血病、結腸がん、食道がん、神経膠芽腫、神経膠腫、血液がん、ホジキンリンパ腫、白血病、リンパ腫、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、肝臓がん、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、多発性骨髄腫、新生物悪性病変、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓腺癌、前立腺がん（例えば、ホルモン抵抗性前立腺腺癌）、腎がん（例えば、明細胞癌）、扁平上皮癌（例えば、頸管、眼瞼、結膜、膣、肺、口腔、皮膚、膀胱、舌、喉頭、および食道）、頭頸部扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、および甲状腺がんが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、がんには１つまたは複数の処置が無効である。一部の実施形態では、がんは、寛解期にあるか、または寛解期にあると思われている。
フローシークエンシング法およびサイクルシフト検出
フローシークエンシング法およびサイクルシフト検出
核酸分子をシークエンシングする例示的方法は、フローシークエンシング法を使用して核酸分子をシークエンシングしてシークエンシングデータを生成するステップを含み得る。フローシークエンシング法は、例えばエラー率が低い遺伝子座またはバリアントの選択により、疾患関連ＳＮＶパネル内のバリアント遺伝子座の信頼度の高い選択を可能にし得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書中でさらに説明されるように、サイクルシフト（すなわち、フローサイクル順序に基づいて参照と比較して１フルサイクル（例えば、４カ所のフロー位置）によるフローグラムシグナルシフト）を誘導するおよび／またはシークエンシングデータにおいて新しいゼロもしくは新しい非ゼロシグナルを生じさせるバリアントのみを含めることにより、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネル内の遺伝子座を選択することができる（そのようなバリアントのみを含めることにより疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成することができる）。
フローシークエンシング法は、任意の所与のフロー位置において単一のタイプのヌクレオチドが伸長プライマーに到達できる所定のフローサイクルに従って鋳型ポリヌクレオチド分子に結合されたプライマーを伸長するステップを含むことができる。一部の実施形態では、特定のタイプのヌクレオチドの少なくとも一部は、標識を含み、標識されたヌクレオチドが伸長プライマーに取り込まれると、この標識が検出可能なシグナルをもたらす。そのようなヌクレオチドが伸長されたプライマーに取り込まれることにより得られる配列は、鋳型ポリヌクレオチド分子の配列の逆相補配列であるはずである。一部の実施形態では、例えば、シークエンシングデータは、標識されたヌクレオチドを使用してプライマーを伸長するステップ、および伸長プライマーに取り込まれた標識されたヌクレオチドの存在または非存在を検出するステップを含むフローシークエンシング法を使用して生成される。フローシークエンシング法は、「自然な合成によるシークエンシング」または「非終結型の合成によるシークエンシング」方法と呼ばれることもある。例示的な方法は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる米国特許第８，７７２，４７３号に記載されている。以下の説明は、フローシークエンシング法に関して提供されるが、シークエンシングされる領域のすべてまたは一部分をシークエンシングするために他のシークエンシング法が使用され得ることは、理解されよう。例えば、本明細書で論じられるシークエンシングデータを、パイロシークエンシング法を使用して生成することができる。
フローシークエンシングは、ポリヌクレオチドとハイブリダイズされたプライマーを伸長するためのヌクレオチドの使用を含む。所与の塩基タイプのヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕなど）をハイブリダイズされた鋳型と混合して、相補的塩基が鋳型鎖内に存在する場合には、プライマーを伸長することができる。ヌクレオチドは、例えば、非終結ヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドであるとき、１つより多くの連続する相補的塩基が鋳型鎖内に存在する場合には、１つより多くの連続する塩基を伸長プライマー鎖に取り込むことができる。非終結ヌクレオチドは、３’可逆的ターミネーターを有するヌクレオチドと対照をなし、一般に、連続ヌクレオチドが結合される前にブロッキング基は除去される。相補的塩基が鋳型鎖内に存在しない場合、鋳型鎖内の次の塩基と相補的であるヌクレオチドが導入されるまで、プライマー伸長は停止する。ヌクレオチドの少なくとも一部分に標識することができ、その結果、取り込みを検出することができる。最も一般的には、単一のヌクレオチドタイプのみが一度に導入される（すなわち、個々に付加される）が、ある特定の実施形態では、２つまたは３つの異なるタイプのヌクレオチドが同時に導入されることもある。この方法論は、あらゆる単一塩基の伸長後、ターミネーターが反転されて次に続く塩基の取り込みが可能になるまで、プライマー伸長が停止される、可逆的ターミネーターを使用するシークエンシング法と対比され得る。
プライマー伸長の過程でヌクレオチドをフロー順序で導入することができ、この過程をフローサイクルにさらに分けることができる。フローサイクルは、反復されるヌクレオチドフロー順序であり、任意の長さのものであり得る。ヌクレオチドが段階的に付加され、これにより、付加されたヌクレオチドを鋳型鎖内に存在する相補的塩基のシークエンシングプライマーの末端に取り込むことが可能になる。単に例として、フローサイクルのフロー順序は、Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｃであることもあり、またはフローサイクル順序は、Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇであることもある。代替順序を当業者は容易に企図することができる。フローサイクル順序は、いずれの長さのものであってもよいが、４つの固有の塩基タイプ（任意の順序でＡ、Ｔ、ＣおよびＧ）を含有するフローサイクルが最も一般的である。一部の実施形態では、フローサイクルは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くの別々のヌクレオチドフローをフローサイクル順序で含む。単に例として、フローサイクル順序は、Ｔ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｃ－Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｃ－Ｔ－Ａ－Ｇであり得、これら１６の別々に提供されるヌクレオチドが数サイクルにわたってこのフローサイクル順序で提供される。異なるヌクレオチドの導入と導入の間に、例えば洗浄液でシークエンシングプラットフォームを洗浄することにより、取り込まれていないヌクレオチドを除去することができる。
ポリメラーゼを使用して、１つまたは複数のヌクレオチドをプライマーの末端に鋳型依存的に取り込むことによりシークエンシングプライマーを伸長させることができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼは、天然に存在するポリメラーゼであることもあり、または合成（例えば、突然変異型）ポリメラーゼであることもある。ポリメラーゼをプライマー伸長の最初のステップで付加させることができるが、補足ポリメラーゼを、必要に応じて、シークエンシング中に、例えば、ヌクレオチドの段階的付加を用いて、またはいくつかのフローサイクル後に、付加させることができる。例示的なポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、熱安定性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変ポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ３．０ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ Φ２９（ファイ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、およびＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼが、挙げられる。
導入されるヌクレオチドは、鋳型鎖の配列を決定する場合、標識ヌクレオチドを含むことができ、取り込まれた標識核酸の存在または非存在を検出して配列を決定することができる。標識は、例えば、光学活性標識（例えば、蛍光標識）または放射性標識であることがあり、標識により放出または変更されたシグナルを、検出器を使用して検出することができる。鋳型ポリヌクレオチドとハイブリダイズされたプライマーに取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することができ、このことによって配列の決定が（例えば、フローグラムを生成することにより）可能になる。一部の実施形態では、標識ヌクレオチドは、蛍光部分、発光部分、または他の光出射部分で標識される。一部の実施形態では、標識は、リンカーを介してヌクレオチドに結合される。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、光化学的または化学的切断反応によって、切断可能である。例えば、標識を、検出後かつ連続ヌクレオチドの取り込み前に切断することができる。一部の実施形態では、標識（またはリンカー）は、ヌクレオチド塩基に結合されるか、または新生ＤＮＡ鎖の延長に干渉しないヌクレオチド上の別の部位に結合される。一部の実施形態では、リンカーは、ジスルフィドまたはＰＥＧ含有部分を含む。
一部の実施形態では、導入されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドのみを含み、一部の実施形態では、ヌクレオチドは、標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドの混合物を含む。例えば、一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約９０％もしくはそれ未満、約８０％もしくはそれ未満、約７０％もしくはそれ未満、約６０％もしくはそれ未満、約５０％もしくはそれ未満、約４０％もしくはそれ未満、約３０％もしくはそれ未満、約２０％もしくはそれ未満、約１０％もしくはそれ未満、約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２．５％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１．５％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．２５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０２５％もしくはそれ未満、または約０．０１％もしくはそれ未満である。一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約１００％であり、約９５％であるかもしくはそれより多く、約９０％であるかもしくはそれより多く、約８０％であるかもしくはそれより多く、約７０％であるかもしくはそれより多く、約６０％であるかもしくはそれより多く、約５０％であるかもしくはそれより多く、約４０％であるかもしくはそれより多く、約３０％であるかもしくはそれより多く、約２０％であるかもしくはそれより多く、約１０％であるかもしくはそれより多く、約５％であるかもしくはそれより多く、約４％であるかもしくはそれより多く、約３％であるかもしくはそれより多く、約２．５％であるかもしくはそれより多く、約２％であるかもしくはそれより多く、約１．５％であるかもしくはそれより多く、約１％であるかもしくはそれより多く、約０．５％であるかもしくはそれより多く、約０．２５％であるかもしくはそれより多く、約０．１％であるかもしくはそれより多く、約０．０５％であるかもしくはそれより多く、約０．０２５％であるかもしくはそれより多く、または約０．０１％であるかまたはそれより多い。一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約０．０１％～約１００％、例えば、約０．０１％～約０．０２５％、約０．０２５％～約０．０５％、約０．０５％～約０．１％、約０．１％～約０．２５％、約０．２５％～約０．５％、約０．５％～約１％、約１％～約１．５％、約１．５％～約２％、約２％～約２．５％、約２．５％～約３％、約３％～約４％、約４％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、約９０％～１００％未満、または約９０％～約１００％である。
シークエンシングデータを生成する前に、ポリヌクレオチドは、ハイブリダイズされた鋳型を生成するためにシークエンシングプライマーとハイブリダイズされる。ポリヌクレオチドをシークエンシングライブラリー調製中にアダプターにライゲーションすることができる。アダプターは、シークエンシングプライマーとハイブリダイズするハイブリダイゼーション配列を含むことができる。例えば、アダプターのハイブリダイゼーション配列は、複数の異なるポリヌクレオチドにわたって一様な配列であることがあり、シークエンシングプライマーは、一様なシークエンシングプライマーであることがある。これは、シークエンシングライブラリー内の異なるポリヌクレオチドの多重シークエンシングを可能にする。
ポリヌクレオチドをシークエンシングのために表面（例えば、固体支持体）に結合させることができる。ポリヌクレオチドを（例えば、ブリッジ増幅または他の増幅技法により）増幅させて、ポリヌクレオチドシークエンシングコロニーを生成することができる。クラスター内の増幅されたポリヌクレオチドは、実質的に同一または相補的である（増幅プロセス中に多少のエラーが導入されることがあり、その結果、ポリヌクレオチドの一部分は、元のポリヌクレオチドと必ずしも同一でないことがある）。コロニー形成により、検出器が標識ヌクレオチド取り込みをコロニーごとに正確に検出することができるようなシグナル増幅が可能になる。一部のケースでは、コロニーは、エマルジョンＰＣＲを使用してビーズ上に形成され、ビーズがシークエンシング面全体に分配される。シークエンシングのためのシステムおよび方法の例は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる米国特許出願第１０，３４４，３２８号において見つけることができる。
ポリヌクレオチドとハイブリダイズされたプライマーは、フロー順序に従って別々のヌクレオチドフロー（これらは、フローサイクル順序に従って周期的であり得る）を使用して核酸分子を通して伸長され、ヌクレオチドの取り込みを上記の通り検出することができ、それによって、核酸分子についてのシークエンシングデータセットを生成することができる。
フローシークエンシングを使用するプライマー伸長は、長さが数百またはさらには数千ほどもの塩基のロングレンジシークエンシングを可能にする。フローステップまたはサイクルの数を増加または減少させて、所望のシークエンシング長を得ることができる。プライマーの伸長は、１つまたは複数の異なる塩基タイプを有するヌクレオチドを使用するプライマーの段階的伸長のための１つまたは複数のフローステップを含むことができる。一部の実施形態では、プライマー伸長は、１～約１０００ステップの間のフローステップ、例えば、１～約１０ステップの間のフローステップ、約１０～約２０ステップの間のフローステップ、約２０～約５０ステップの間のフローステップ、約５０～約１００ステップの間のフローステップ、約１００～約２５０ステップの間のフローステップ、約２５０～約５００ステップの間のフローステップ、または約５００～約１０００ステップの間のフローステップを含む。フローステップを同一のまたは異なるフローサイクルに分割することができる。プライマーに取り込まれる塩基の数は、シークエンシングされる領域の配列、およびプライマーを伸長するために使用されるフロー順序に依存する。一部の実施形態では、シークエンシングされる領域は、長さ約１塩基～約４０００塩基、例えば、長さ約１塩基～約１０塩基、長さ約１０塩基～約２０塩基、長さ約２０塩基～約５０塩基、長さ約５０塩基～約１００塩基、長さ約１００塩基～約２５０塩基、長さ約２５０塩基～約５００塩基、長さ約５００塩基～約１０００塩基、長さ約１０００塩基～約２０００塩基、または長さ約２０００塩基～約４０００塩基である。
シークエンシングデータを、取り込まれたヌクレオチドの検出およびヌクレオチド導入の順序に基づいて生成することができる。以下の伸長される配列（すなわち、対応する鋳型配列の各逆相補配列）：ＣＴＧ、ＣＡＧ、ＣＣＧ、ＣＧＴ、およびＣＡＴ（先行する配列も後続の配列もシークエンシング法に供されないと仮定して）、ならびにＴ－Ａ－Ｃ－Ｇの反復フローサイクル（つまり、反復サイクル中のＴ、Ａ、ＣおよびＧヌクレオチドの逐次的付加）を例にとる。所与のフロー位置における特定のタイプのヌクレオチドは、相補的塩基が鋳型ポリヌクレオチド中に存在する場合にのみプライマーに取り込まれることになる。結果として生じる例示的なフローグラムが表１に示され、この表中の１は、導入されたヌクレオチドが取り込まれること示し、０は、導入されたヌクレオチドが取り込まれないことを示す。フローグラムを使用して、鋳型鎖の配列を導出することができる。例えば、本明細書で論じられるシークエンシングデータ（例えば、フローグラム）は、伸長されたプライマー鎖およびその逆相補鎖を表し、この逆相補鎖は、鋳型鎖の配列を表すために容易に決定され得る。表１中のアスタリスク（＊）は、伸長されたシークエンシング鎖（例えば、より長い鋳型鎖）に追加のヌクレオチドが取り込まれた場合にシグナルがシークエンシングデータ中に存在し得ることを示す。
フローグラムは、バイナリであることもあり、ノンバイナリであることもある。バイナリフローグラムは、取り込まれたヌクレオチドの存在（１）または非存在（０）を検出する。ノンバイナリフローグラムは、各々の段階的導入から取り込まれたヌクレオチドの数をより定量的に決定することができる。例えば、ＣＣＧの伸長された配列は、同じＣフローの中の（例えば、フロー位置３における）伸長プライマー内への２つのＣ塩基の取り込みを含むことになり、標識された塩基により放出されるシグナルは、単一塩基取り込みに相当する強度レベルより高い強度を有することになる。このことが表１に示されている。ノンバイナリフローグラムはまた、塩基の存在または非存在を示し、所与のフロー位置における各伸長プライマーに取り込まれる可能性が高い塩基の数を含む追加情報を提供することができる。値が整数である必要はない。一部のケースでは、値は、所与のフロー位置に取り込まれる塩基の数の不確実性および／または確率を反映していることもある。
一部の実施形態では、シークエンシングデータセットは、各フロー位置に取り込まれているシークエンシングされた核酸分子中の塩基の数を示す塩基カウントを表すフローシグナルを含む。例えば、表１に示されているように、Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇフローサイクル順序を使用してＣＴＧ配列で伸長されたプライマーは、位置３に１の値を有し、これは、その位置における１の塩基カウントを示す（この１塩基は、シークエンシングされた鋳型鎖内のＧと相補的であるＣである）。また表１において、Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇフローサイクル順序を使用してＣＣＧ配列で伸長されたプライマーは、位置３に２の値を有し、これは、このフロー位置にある間の伸長プライマーのその位置における２の塩基カウントを示す。ここで、２塩基は、伸長プライマー配列内のＣＣＧ配列の最初のＣ－Ｃ配列を指し、この配列は、鋳型鎖内のＧ－Ｇ配列と相補的である。
シークエンシングデータセット内のフローシグナルは、各フロー位置における１または複数の塩基カウントについての尤度または信頼区間を示す１つまたは複数の統計パラメーターを含み得る。一部の実施形態では、フローシグナルは、シークエンシング中にシークエンシングプライマーに取り込まれる１つまたは複数の塩基の蛍光シグナルなどの、シークエンシングプロセス中に検出されるアナログシグナルから決定される。一部のケースでは、アナログシグナルを処理して統計パラメーターを生成することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に取り込まれる公開国際特許出願ＷＯ２０１９０８４１５８Ａ１に記載されているように、機械学習アルゴリズムを使用してアナログシークエンシングシグナルのコンテキスト効果について補正することができる。ゼロまたはそれを超える整数の塩基がいずれかの所与のフロー位置に取り込まれるが、所与のアナログシグナルは、そのアナログシグナルと完全にマッチしないことがある。したがって、検出されたシグナルを考えれば、フロー位置に取り込まれる塩基の数の尤度を示す統計パラメーターを決定することができる。単に例として、表１のＣＣＧ配列について、フローシグナルがフロー位置３に取り込まれた２塩基を示す尤度は、０．９９９であり得、フローシグナルがフロー位置３に取り込まれた１塩基を示す尤度は、０．００１であり得る。フローシグナルが、各フロー位置における複数の塩基カウントについての尤度を示す統計パラメーターを含む場合、シークエンシングデータセットを疎行列としてフォーマットすることができる。単に例として、Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇの反復フローサイクル順序を使用してＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１）（すなわち、シークエンシングは逆相補鎖を読み取る）の配列で伸長されたプライマーは、図８Ａに示されているシークエンシングデータセットを生じさせる結果となり得る。統計パラメーターまたは尤度値は、例えば、シークエンシング中のアナログシグナルの検出中に存在するノイズまたは他のアーチファクトによって、異なり得る。一部の実施形態では、統計パラメーターまたは尤度が所定の閾値よりも下であった場合、実質的にゼロである所定の非ゼロ値（すなわち、何らかの非常に小さい値または無視できる値）にパラメーターを設定して、真のゼロ値を用いると計算誤差が生じるか、または可能性の低さのレベル同士、例えば、非常に可能性の低いレベル（０．０００１）とあり得ないレベル（０）とが十分に区別されなくなる可能性がある、本明細書でさらに論じられる統計解析を補助することができる。
所与の配列についてのシークエンシングデータセットの尤度を示す値を、配列アラインメントなしにシークエンシングデータセットから決定することができる。例えば、データが得られる可能性の最も高い配列を、図８Ｂに（図８Ａに示されているのと同じデータを使用して）星印により示されているように、各フロー位置において最高尤度を有する塩基カウントを選択することにより決定することができる。したがって、プライマー伸長の配列を、各フロー位置において可能性の最も高い塩基カウントに従って決定することができる：ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１）。このことから、逆相補配列（すなわち、鋳型鎖）を容易に決定することができる。さらに、ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１）配列（または逆相補配列）が得られる、このシークエンシングデータセットの尤度を、各フロー位置における選択尤度の積として決定することができる。
核酸分子に関連するシークエンシングデータセットを１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、６もしくはそれより多くの）可能性のある候補配列と比較する。シークエンシングデータセットと候補配列との（下記で論じられるような、マッチスコアに基づく）近似マッチは、そのシークエンシングデータセットが、近似マッチする候補配列と同じ配列を有する核酸分子から生じた可能性が高いことを示す。一部の実施形態では、シークエンシングされた核酸分子の配列を、参照配列に（例えば、バローズ・ホイーラーアラインメント（ＢＷＡ）アルゴリズムまたは他の好適なアラインメントアルゴリズムを使用して）マッピングして、その配列についての遺伝子座（または１つもしくは複数の遺伝子座）を決定することができる。フロー空間におけるシークエンシングデータセットを塩基空間に（またはフロー順序が既知である場合には、その逆に）容易に変換することができ、マッピングをフロー空間または塩基空間において行なうことができる。マッピングされた配列に対応する遺伝子座（単数）［または遺伝子座（複数）］を、本明細書に記載される解析方法のための候補配列（またはハプロタイプ配列）として動作することができる１つまたは複数のバリアント配列と、関連付けることができる。本明細書に記載される方法の１つの利点は、一部のケースではアラインメントアルゴリズムを使用するシークエンシングされた核酸分子の配列と各候補配列との一般に計算コストの高いアラインメントを必要としない点である。その代わりに、フロー空間におけるシークエンシングデータを使用して候補配列の各々についてマッチスコアを決定することができ、この操作のほうが、計算効率が良い。
マッチスコアは、シークエンシングデータセットがいかに良く候補配列を支持するかを示す。例えば、シークエンシングデータセットが候補配列にマッチする尤度を示すマッチスコアは、各フロー位置における統計パラメーター（例えば、尤度）であって、候補配列についての予想シークエンシングデータが得られたそのフロー位置における塩基カウントに対応する統計パラメーターを選択することにより、決定することができる。選択された統計パラメーターの積によりマッチスコアを得ることができる。例えば、伸長されたプライマーについて図８Ａに示されているシークエンシングデータセット、およびＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号２）の候補プライマー伸長配列を仮定する。図８Ｃ（図８Ａにおける同じシークエンシングデータセットを示す）は、候補配列（塗りつぶした丸印）についてのトレースを示す。比較として、ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１）配列のトレース（図８Ｂを参照されたい）が、図８Ｃに白抜きの丸印を使用して示されている。シークエンシングデータが第１の候補配列ＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号２）に対応する尤度を示すマッチスコアと、シークエンシングデータが第２の候補配列ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１）にマッチする尤度を示すマッチスコアとには、たとえこれらの配列が単一塩基変動分しか変わらなかったとしても、大きな差がある。図８Ｃで見られるように、トレース間の差は、フロー位置１２に見られ、少なくとも９フロー位置（およびシークエンシングデータがさらなるフロー位置にわたって伸長する場合にはより長い可能性がある）にわたって伝播する。１または複数のフローサイクルにわたって継続するこの伝播は、「サイクルシフト」と呼ばれることがあり、シークエンシングデータセットが候補配列にマッチする場合、一般に、非常に可能性の低い事象である。
ＳＮＶは、ＳＮＶを有する核酸分子に関連するシークエンシングデータが、参照配列（すなわち、ＳＮＶを有さないことを除いて、核酸分子と同じ配列を有する配列）に関連する参照配列シークエンシングデータと比較して、核酸シークエンシングデータおよび参照シークエンシングデータがフローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングされたときに１または複数フローサイクルシフトした場合、サイクルシフトを誘導する。つまり、シークエンシングデータと参照シークエンシングデータは、１または複数のフローサイクルにわたって異なる。参照シークエンシングデータは、参照核酸分子をシークエンシングすることにより得られる必要はないが、参照配列に基づいてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成され得る。
ＳＮＶを誘導する例示的サイクルシフトは、図８Ｃにより説明される。図８Ｃに示されている第２の候補配列が、ＳＮＶ含有核酸分子に関連する（および図の上部のフローグラムに示されているシークエンシングデータに関連する）配列リード逆相補配列ＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１）であり、第１の候補配列が、参照配列のシークエンシングリード逆相補配列ＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号２）であると、仮定する。Ａ→Ｇ ＳＮＰ（両方の配列の塩基位置８における）は、参照シークエンシングデータと比較してＳＮＶ含有核酸分子に関連するシークエンシングデータの１サイクル左方向シフトにより観察され得る、サイクルシフトを誘導する。例えば、塩基位置９におけるＴ塩基は、ＳＮＶ含有核酸分子に関連するシークエンシングデータによるとフロー位置１３に、および参照シークエンシングデータによると位置１７にシークエンシングされる。同様に、塩基位置１０および１１におけるＣＧ塩基は、ＳＮＶ含有核酸分子に関連するシークエンシングデータによるとフロー位置１５および１６に、ならびに参照シークエンシングデータによると位置１９および２０にシークエンシングされる。
サイクルシフト事象は、真陽性事象の非存在下で存在する可能性が低いので、一部の実施形態では、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルからの遺伝子座は、その遺伝子座におけるバリアントがサイクルシフト事象をもたらす場合にのみ選択され得る。
短い遺伝的バリアントがサイクルシフトを誘導する感度は、ＳＮＶを有する核酸分子をシークエンシングするために使用されるフローサイクル順序に依存し得る。図８Ｃで説明される例は、Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇフローサイクル順序を含むが、他のフローサイクル順序を使用して他のバリアントにおいてサイクルシフトを誘導することができる。任意のフロー順序を使用して、シークエンシングデータにおける新しいゼロシグナルまたは新しい非ゼロシグナルの生成により、ＳＮＶがサイクルシフト事象を誘導する可能性を観察することができる。したがって、たとえ選択されたフロー順序がサイクルシフト事象を誘導しなかったとしても、異なるフローサイクル順序を使用してＳＮＶがサイクルシフト事象を誘導することができる。一部の実施形態では、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルからの遺伝子座は、核酸シークエンシングデータおよび参照シークエンシングデータが、フローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングされたときに、その遺伝子座におけるバリアントが、新しいゼロシグナルまたは新しい非ゼロシグナルを有するシークエンシングデータの点で異なるシークエンシングデータおよび参照シークエンシングデータを生じさせる結果となった場合にのみ、選択される。シグナル変化は、一部の実施形態では、連続していることがある。一部の実施形態では、疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルからの遺伝子座は、核酸シークエンシングデータおよび参照シークエンシングデータが、フローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングされたときに、その遺伝子座におけるバリアントが、２カ所またはそれより多くのフロー位置（これらは、連続していることがある）で異なるシークエンシングデータおよび参照シークエンシングデータを生じさせる結果となった場合にのみ、選択される。
核酸分子は、異なるフローサイクル順序を使用してシークエンシングされるため、シークエンシングデータセットは異なる。図８Ｄは、異なるフローサイクル順序（Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｔ）（Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇフローサイクルを使用して得られた、図８Ｃと比較して）を使用して決定されたＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＡ（配列番号１）の逆相補配列を有するＳＮＶ含有核酸分子についての例示的シークエンシングデータセットを示す。参照シークエンシングデータがＳＮＶ含有核酸分子についてのシークエンシングデータ上にマッピングされている。ＳＮＶは、位置１７において新しいゼロシグナル、および位置１８において新しい非ゼロシグナルを生じさせる。したがって、たとえＴ－Ａ－Ｃ－Ｇフローサイクルがサイクルシフトを誘導した（図８Ｃを参照されたい）としても、Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｔフローサイクルは、ＳＮＶが同じであるにもかかわらず、誘導しない。それでもやはり、新しいゼロおよび新しい非ゼロシグナルは、異なるサイクル順序を使用するとＳＮＶがサイクルシフトを誘導する可能性があることを示す。
バリアントシグナル、偽陽性エラー、およびノイズ
バリアントシグナル、偽陽性エラー、およびノイズ
個体から得られた流体試料中の核酸分子は、個体に関連するシークエンシングデータを得るためにシークエンシングされる。シークエンシングデータは、非罹患組織に関連するシークエンシングデータ、および罹患組織に関連するシークエンシングデータを含む。しかし、シークエンシング中に生じる偽陽性エラーの存在のため、非罹患組織に関連するシークエンシングデータと罹患組織に関連するシークエンシングデータのすべての差を罹患組織のゲノムの突然変異に起因すると考えることができるとは限らない。つまり、シークエンシングデータにおける個別化遺伝子座パネルから選択された遺伝子座において検出される個々の小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）リードの総数、Ｎｔｏｔａｌ、は、罹患組織に起因する個別化遺伝子座パネルからの選択位置での検出ＳＮＶリードの数、Ｎｄｅｔ、と、偽陽性エラー（すなわち、バックグラウンド）に起因する個別化遺伝子座パネルから選択された位置の中からの検出ＳＮＶリードの数、Ｎｂｋｇ、の和である。つまり、
Ｎｔｏｔａｌ＝Ｎｄｅｔ＋Ｎｂｋｇ。
Ｎｔｏｔａｌ＝Ｎｄｅｔ＋Ｎｂｋｇ。
罹患組織に起因する選択遺伝子座の中からの検出ＳＮＶリードの数、Ｎｄｅｔ、は、個別化遺伝子座パネルから選択された遺伝子座の数、Ｎｖａｒ、平均シークエンシング深度、Ｄ、および罹患組織に由来する流体試料中の核酸分子の割合、Ｆ、に比例する。一部の実施形態では、Ｎｄｅｔは、割合、Ｆ、と一次の関係を有する。一部の実施形態では、
Ｎｄｅｔ＝ＮｖａｒＤＦ。
同様に、偽陽性エラーに起因する選択遺伝子座の中からの検出ＳＮＶリードの数、Ｎｂｋｇ、は、個別化遺伝子座パネルから選択された遺伝子座の数、Ｎｖａｒ、平均シークエンシング深度、Ｄ、および選択遺伝子座にわたってのエラー率、Ｅ、に比例する。一部の実施形態では、Ｎｂｋｇは、エラー率、Ｅ、と一次の関係を有する。つまり、一部の実施形態では、
Ｎｂｋｇ＝ＮｖａｒＤＥ。
したがって、Ｎｔｏｔａｌを、一部の実施形態では、概略的に、次のように決定することができる：
Ｎｔｏｔａｌ＝ＮｖａｒＤ（Ｆ＋Ｅ）。
Ｎｄｅｔ＝ＮｖａｒＤＦ。
同様に、偽陽性エラーに起因する選択遺伝子座の中からの検出ＳＮＶリードの数、Ｎｂｋｇ、は、個別化遺伝子座パネルから選択された遺伝子座の数、Ｎｖａｒ、平均シークエンシング深度、Ｄ、および選択遺伝子座にわたってのエラー率、Ｅ、に比例する。一部の実施形態では、Ｎｂｋｇは、エラー率、Ｅ、と一次の関係を有する。つまり、一部の実施形態では、
Ｎｂｋｇ＝ＮｖａｒＤＥ。
したがって、Ｎｔｏｔａｌを、一部の実施形態では、概略的に、次のように決定することができる：
Ｎｔｏｔａｌ＝ＮｖａｒＤ（Ｆ＋Ｅ）。
偽陽性エラーに起因する選択遺伝子座の中からの検出ＳＮＶリードの数、Ｎｂｋｇ、は、エラー率Ｅに比例するため、偽陽性エラーを生じさせる可能性がより高い遺伝子座を除外することによりエラー率Ｅを低減することができる。偽陽性エラーがより低い遺伝子座を選択するための例示的方法は、本明細書中でさらに説明される。
個体における疾患に関連する試料中の核酸分子の割合は、Ｎｄｅｔを使用して決定することができる。一部の実施形態では、
Ｎｄｅｔが、例えば偽陽性エラーの存在に起因して、直接測定されない場合、個体における疾患に関連する試料中の核酸分子の割合は、個別化遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率（例えば、
）を示すシグナルと選択された遺伝子座にわたってのシークエンシング偽陽性エラー率を示すバックグラウンド指数とを比較することにより、決定することができる。一部の実施形態では、Ｆは、Ｎｔｏｔａｌとの一次の関係で、例えば、
との一次の関係で、決定される。一部の実施形態では、割合は、次のように決定される：
罹患組織に起因する個別化遺伝子座パネルから選択されたＳＮＶの中からの選択ＳＮＶの数についてのシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）は、偽陽性エラーの数についておよび真の検出についてポアソンサンプリングノイズを仮定することにより決定することができる。したがって、Ｎｔｏｔａｌのサンプリングノイズ（すなわち、
）を、
と仮定することができる。したがって、罹患組織に起因する選択遺伝子座の中からの検出ＳＮＶについてのシグナル対ノイズ非（ＳＮＲ）は、一部の実施形態では、次のように決定することができる：
一部の実施形態では、偽陽性エラー率、Ｅ、は、選択遺伝子座、例えば、個別化遺伝子座パネル以外のまたは個別化遺伝子座パネルから選択された遺伝子座以外のゲノムの残余、から独立して決定される。
決定された割合、Ｆ、に関する誤差も、サンプリングノイズに基づいて決定することができる。例えば、一部の実施形態では、Ｆに関する誤差は、
である。または、一部の実施形態では、
したがって、一部の実施形態では、割合は、誤差を伴う公称値と考えられ、この誤差を割合の信頼区画と定義することができる。
個体における疾患のレベルを罹患組織に由来する試料中の核酸分子の割合、Ｆ、と相関させることができる。したがって、疾患の存在またはレベルは、例えばこの割合を決定することにより、測定することができる。疾患再発、進行または退縮を、個体における疾患のレベルを複数の時点で測定することにより、決定することができる。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの測定割合の信頼区画が比較され、これを使用して、測定割合間の統計的有意差を決定する（例えば、疾患の進行または退縮を測定する）ことができる。
一部の実施形態では、疾患の存在または再発を検出するために、シグナル対ノイズ比が使用される。より高いＳＮＲは、疾患が存在するまたは再発した可能性の増加を示す。
一部の実施形態では、被験個体に関連する核酸シークエンシングデータを含むプールされた核酸シークエンシングデータを得るために、異なる個体からの複数の試料が一緒にプールされる。所与の個体の罹患組織に関連する核酸分子は、固有のまたはほぼ固有のバリアントシグネチャーを有し、これにより、多くの検出バリアントリードを個体に割り当てることが可能になる。一部の実施形態では、解析に選択されるシークエンシングされた遺伝子座は、バリアントの重複を回避するように選択される（つまり、２名またはそれより多くの個体により共有されるいずれのバリアントも選択されない）。他の実施形態では、２名またはそれより多くの個体に共通するバリアントのバリアントリードは、例えば、バリアントを共有する個体についてのバリアントリードを計数することにより、あるいはバリアントを共有する個体にわたって（例えば、個体に由来する核酸分子の相対量に基づいて）または配列プール全体に対する試料もしくは疾患の割合の最尤解析によってバリアントリードカウントに重み付けすることにより、解析に含められる。個体のプール中の個体における疾患に関連する核酸分子の測定割合（すなわち、プールされた核酸シークエンシングデータを使用する）が試料のプール中の核酸分子の割合として最初に決定されることになり、プール中の試料の割合に基づいて調整され得る。単なる例として、試料のプール中の個体の罹患組織に由来する核酸分子の測定割合が０．５％であり、その個体からの試料がプール中の核酸分子の５％に相当する場合には、その個体からの試料中の罹患組織に由来する核酸分子の割合は１０％である。
偽陽性エラー率、Ｅ、の正確な決定は、割合、Ｆ、およびシグナル対ノイズ比、ＳＮＲ、のより正確な決定をもたらす。一部の実施形態では、偽陽性エラー率は、実験によって決定される。一部の実施形態では、偽陽性エラー率は、１名または複数の他の個体からのシークエンシングデータを使用して決定される。一部の実施形態では、偽陽性エラー率は、同じ個体からの、例えば個別化遺伝子座パネル外の領域における、シークエンシングデータを使用して決定される。一部の実施形態では、偽陽性エラー率は、割合、シグナル対ノイズ比または疾患レベルを決定するために使用された個体に関連するシークエンシングデータから本質的に決定される。例えば、一部の実施形態では、対照遺伝子座のセットが、偽陽性エラー率を決定するために選択され得る。対照遺伝子座には、バリアントが高度に存在する可能性が低い遺伝子座、例えば、ゲノムの高度に保存される領域内の遺伝子座が選択され得る。例えば、対照遺伝子座は、真のバリアントが細胞死を生じさせる結果となる、必須遺伝子のコード領域内にあることがある。したがって、対照遺伝子座における真のバリアントは、高度に存在することになる可能性が低いため、いずれの検出バリアントも偽陽性エラーに起因すると考えることができる。対照遺伝子座において検出されるＳＮＶ塩基リードの総数、Ｎｔｏｔａｌ，ｃｏｎ、対照遺伝子座の総数、Ｎｃｏｎ、および平均シークエンシング深度、Ｄ、を使用して、偽陽性エラー率を決定することができる。つまり、一部の実施形態では、
図１は、個体における疾患（例えば、がん）のレベル、例えば、個体からの試料中の疾患に関連する核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ分子）の割合を測定する、例示的な方法１００を示す。試料は、流体試料、例えば、血液試料、血漿試料、唾液試料、尿試料または糞便試料であり得る。ステップ１０５で、個体に関連する核酸シークエンシングデータは、シグナルをバックグラウンド指数と比較するために使用される。必要に応じて、核酸シークエンシングデータは、非標的および／または非濃縮核酸シークエンシングデータ（例えば、全ゲノムシークエンシングデータ）である。一部の実施形態では、シークエンシングデータのシークエンシング深度は、約１００未満、約１０未満、または約１未満である。一部の実施形態では、シークエンシンデータのシークエンシング深度は、少なくとも０．０１である。シグナルは、個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示す。必要に応じて、疾患関連ＳＮＶパネルから選択された遺伝子座が、個々の遺伝子座の偽陽性率に基づいて選択される。一部の実施形態では、シグナルは、
またはＮｄｅｔである。一部の実施形態では、シグナルの大きさは、選択された遺伝子座の数、および核酸シークエンシングデータに関連する平均シークエンシング深度に、少なくとも依存する。バックグラウンド指数は、選択された遺伝子座にわたってのシークエンシング偽陽性エラー率を示す。ステップ１１０で、個体における疾患のレベル（例えば、疾患に関連する試料中の核酸分子の割合）が、シグナルとバックグラウンド指数の比較に基づいて決定される。例えば、割合を、次の式に基づいて決定することができる：
図２は、個体における疾患（例えば、がん）のレベル、例えば、個体からの試料中の疾患に関連する核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ分子）の割合を測定する、別の例示的な方法２００を示す。試料は、流体試料、例えば、血液試料、血漿試料、唾液試料、尿試料または糞便試料であり得る。ステップ２０５で、罹患組織に関連するシークエンシングデータ、および非罹患組織に関連するシークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルが構築される。個別化遺伝子座パネルは、罹患組織に関連するシークエンシングデータと非罹患組織に関連するシークエンシングデータとの差に基づく。ステップ２１０で、遺伝子座は、個別化遺伝子座パネルから選択される。一部の実施形態では、個別化遺伝子座パネル内のすべての遺伝子座が選択され、一部の実施形態では、個別化遺伝子座パネル内の遺伝子座のサブセットが選択される。遺伝子座は、個別化遺伝子座パネルから、例えば個々の遺伝子座の偽陽性率に基づいて、選択され得る。ステップ２１５で、個体からの試料に関連するシークエンシングデータが得られる。シークエンシングデータは、例えば、試料中の核酸分子をシークエンシングすることにより、または記録からのシークエンシングデータを受信することにより、得ることができる。必要に応じて、核酸シークエンシングデータは、非標的および／または非濃縮核酸シークエンシングデータ（例えば、全ゲノムシークエンシングデータ）である。一部の実施形態では、シークエンシングデータのシークエンシング深度は、約１００未満、約１０未満、または約１未満である。一部の実施形態では、シークエンシンデータのシークエンシング深度は、少なくとも０．０１である。ステップ２２０で、個体に関連する核酸シークエンシングデータは、シグナルをバックグラウンド指数と比較するために使用される。シグナルは、個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示す。一部の実施形態では、シグナルは、
またはＮｄｅｔである。一部の実施形態では、シグナルの大きさは、選択された遺伝子座の数、および核酸シークエンシングデータに関連する平均シークエンシング深度に、少なくとも依存する。バックグラウンド指数は、選択された遺伝子座にわたってのシークエンシング偽陽性エラー率を示す。ステップ２２５で、個体における疾患のレベル（例えば、個体からの試料中の疾患に関連する核酸分子の割合）が、シグナルとバックグラウンド指数の比較に基づいて決定される。例えば、割合を、次の式に基づいて決定することができる：
疾患の存在、レベル、再発、進行または退縮を検出するための方法
本明細書に記載される方法は、疾患の存在（例えば、再発）の検出、疾患のレベルの測定、または疾患の進行もしくは退縮の測定もしくは検出に有用であり得る。本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、個体は、以前に疾患の処置を受けたことがある。一部の実施形態では、疾患は、完全寛解または部分寛解などの、寛解期にあると思われている。疾患の、例えば化学療法またはがんの切除による、処置後、疾患は、例えば、すべての罹患組織の不完全な除去または死滅に起因して、再発することがある。がんは、例えば、個体体内の異なる位置で転移および移動することがあり、または小さ過ぎて公知のイメージング方法（例えば、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャンなど）により検出できないこともある。疾患が再発または進行した場合に個体を再処置することができるように、疾患の再発、退縮または進行についての個体のモニタリングを定期的に行なうことができるだろう。
がんなどの疾患の存在または残存レベルは、例えば、個体に関連する核酸シークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示すシグナルと、選択された遺伝子座にわたってのサンプリング分散を示すノイズ指数とを、比較すること；およびシグナルとバックグラウンド指数の比較に基づいて個体が疾患を有するのかを決定することにより、検出することができる。一部の実施形態では、シグナル対ノイズ比は、例えば、本明細書中で説明されるように決定される。
検出シグナルの統計的有意性は、シグナルを統計ノイズ（例えば、真の検出の数および偽陽性エラーの数に少なくとも基づき得る、サンプリング分散）を比較することにより、決定され得る。シグナルが統計ノイズよりも大きい場合、例えば、約１．５より大きい、約２、約３、約５、約８、約１０またはそれより大きいシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）の場合、疾患を陽性検出することができる。逆に、一部の実施形態では、より低いＳＮＲ、例えば、約１．５未満、約１．４未満、約１．３未満、約１．２未満、または約１．１未満のＳＮＲは、疾患の非検出を示す。
図３は、個体における疾患または疾患（例えば、がん）の再発を検出する例示的方法３００を示す。ステップ３０５で、個体に関連する核酸シークエンシングデータは、シグナルをノイズ指数と比較するために使用される。核のシークエンシングデータは、個体から得られた流体試料中の核酸分子に由来し得る。例えば、一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、個体からの流体試料（例えば、血液試料、血漿試料、唾液試料、尿試料、または糞便試料）中の無細胞ＤＮＡに由来する。必要に応じて、核酸シークエンシングデータは、非標的および／または非濃縮核酸シークエンシングデータ（例えば、全ゲノムシークエンシングデータ）である。一部の実施形態では、シークエンシングデータのシークエンシング深度は、約１００未満、約１０未満、または約１未満である。一部の実施形態では、シークエンシンデータのシークエンシング深度は、少なくとも０．０１である。シグナルは、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示す。必要に応じて、疾患関連ＳＮＶパネルから選択される遺伝子座は、個々の遺伝子座の偽陽性率に基づいて選択される。ノイズ指数は、選択された遺伝子座にわたってのシークエンシングサンプリングノイズを示す。ステップ３１０で、疾患が個体に存在するかどうかに関する決定が、シグナルとノイズ指数の比較に基づいてなされる。例えば、一部の実施形態では、ノイズ指数より上の統計的に有意なシグナルは、個体が疾患を有することを示す。
図４は、個体における疾患（例えば、がん）の存在または再発についての例示的方法４００を示す。ステップ４０５で、罹患組織に関連するシークエンシングデータ、および非罹患組織に関連するシークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルが構築される。個別化遺伝子座パネルは、罹患組織に関連するシークエンシングデータと非罹患組織に関連するシークエンシングデータとの差に基づく。ステップ４１０で、遺伝子座は、個別化遺伝子座パネルから選択される。一部の実施形態では、個別化遺伝子座パネル内のすべての遺伝子座が選択され、一部の実施形態では、個別化遺伝子座パネル内の遺伝子座のサブセットが選択される。遺伝子座は、個別化遺伝子座パネルから、例えば個々の遺伝子座の偽陽性率に基づいて、選択され得る。ステップ４１５で、個体からの試料に関連する核酸シークエンシングデータが得られる。シークエンシングデータは、例えば、試料中の核酸分子をシークエンシングすることにより、または記録からの試料についてのシークエンシングデータを受信することにより、得ることができる。試料は、個体から取得された流体試料であり得る。例えば、一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、個体からの流体試料（例えば、血液試料、血漿試料、唾液試料、尿試料、または糞便試料）中の無細胞ＤＮＡに由来する。必要に応じて、核酸シークエンシングデータは、非標的および／または非濃縮核酸シークエンシングデータ（例えば、全ゲノムシークエンシングデータ）である。一部の実施形態では、シークエンシングデータのシークエンシング深度は、約１００未満、約１０未満、または約１未満である。一部の実施形態では、シークエンシンデータのシークエンシング深度は、少なくとも０．０１である。ステップ４２０で、個体に関連する核酸シークエンシングデータは、シグナルをノイズ指数と比較するために使用される。シグナルは、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示す。ノイズ指数は、選択された遺伝子座にわたってのサンプリングノイズを示す。疾患が個体に存在するかどうかに関して決定するステップ４２５で、シグナルとノイズ指数の比較に基づいて決定される。例えば、一部の実施形態では、ノイズ指数より上の統計的に有意なシグナルは、個体が疾患を有することを示す。
がんなどの疾患の存在または残存を、例えば個体における疾患のレベルを測定することにより、検出することもできる。必要に応じて、疾患のレベルは、罹患組織に起因する個体からの試料中の核酸分子の割合により示される。罹患組織に起因する、個体から得られる流体試料中の核酸分子、例えばｃｆＤＮＡ、の割合は、その個体における疾患の重症度またはレベルと相関している。したがって、罹患組織に起因する核酸分子の割合を、疾患の残存レベルまたは再発のマーカーとして使用することができる。例えば、個体に関連する核酸シークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示すシグナルと、選択された遺伝子座にわたってのシークエンシング偽陽性エラー率を示すバックグラウンド指数とを、比較すること；およびシグナルとバックグラウンド指数の比較に基づいて個体における疾患のレベルを決定することにより、レベルを測定することができる。
レベルについての信頼区画などの、疾患の測定レベルについての誤差（例えば、測定割合についての誤差）が、必要に応じて決定される。一部の実施形態では、誤差は、選択された遺伝子座で検出された個々の小ヌクレオチドバリアントリードの総数に比例する。測定レベルについての誤差を使用して、例えば、測定レベルが統計的に有意であるかどうかを決定することができる。例えば、一部の実施形態では、割合についての信頼区画の下限がゼロより上である場合、測定レベルは、疾患の存在または再発を示す。この誤差を使用して、測定割合が所定の値より高い可能性を測定することもできる。一部の実施形態では、非罹患組織に起因する核酸分子と比較して罹患組織に起因する核酸分子の測定割合が、所定の閾値よりも高い（例えば、０であるかもしくはそれより高い、約０．１％であるかもしくはそれより高い、約０．２％であるかもしくはそれより高い、約０．５％であるかもしくはそれより高い、約１％であるかもしくはそれより高い、約１．５％であるかもしくはそれより高い、約２％であるかもしくはそれより高い、約２．５％であるかもしくはそれより高い、約３％であるかもしくはそれより高い、約４％であるかもしくはそれより高い、約５％であるかもしくはそれより高い、約６％であるかもしくはそれより高い、約７％であるかもしくはそれより高い、約８％であるかもしくはそれより高い、約９％であるかもしくはそれより高い、または約１０％であるかもしくはそれより高い）可能性が測定され、所定の閾値よりも高い割合は、個体における疾患の存在または再発を示す。
疾患の進行または退縮は、２つまたはそれより多く時点で疾患のレベル（例えば、罹患組織に起因する個体の試料中の核酸分子の割合、または個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が選択された遺伝子座にわたってのシークエンシング偽陽性エラー率を示すバックグラウンド指数と比較して疾患組織に由来する率を示すシグナル）を測定することにより、決定および／またはモニターすることができる。したがって、測定割合が過去の割合、Ｆｐｒｉｏｒ、と比較され得る。これらの時点は、例えば、疾患の処置の開始する前の第１の時点、および疾患の処置を開始した後の第２の時点を含み得る。一部の実施形態では、割合またはシグナルの増加（バックグラウンド指数と比較して）は、疾患の進行を示し、割合の低下またはシグナルの減少（バックグラウンド指数と比較して）は、疾患の退縮を示す。一部の実施形態では、割合またはシグナルの統計的に有意な増加（バックグラウンド指数と比較して）は、疾患の進行を示し、割合の統計的に有意な低下またはシグナルの統計的に有意な減少（バックグラウンド指数と比較して）は、疾患の退縮を示す。２つまたはそれより多くの時点についてのレベルの決定誤差（例えば、信頼区画）を使用して、測定レベルの変化が統計的に有意であるかどうかを決定することができる。
図５は、個体における疾患（例えば、がん）の再発、進行または退縮をモニターする例示的方法５００を示す。ステップ５０５で、個体に関連する核酸シークエンシングデータは、シグナルをバックグラウンド指数と比較するために使用される。核のシークエンシングデータは、個体から得られた流体試料中の核酸分子に由来し得る。例えば、一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、個体からの流体試料（例えば、血液試料、血漿試料、唾液試料、尿試料、または糞便試料）中の無細胞ＤＮＡに由来する。必要に応じて、核酸シークエンシングデータは、非標的および／または非濃縮核酸シークエンシングデータ（例えば、全ゲノムシークエンシングデータ）である。一部の実施形態では、シークエンシングデータのシークエンシング深度は、約１００未満、約１０未満、または約１未満である。一部の実施形態では、シークエンシンデータのシークエンシング深度は、少なくとも０．０１である。シグナルは、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示す。必要に応じて、疾患関連ＳＮＶパネルから選択される遺伝子座は、個々の遺伝子座の偽陽性率に基づいて選択される。バックグラウンド指数は、選択された遺伝子座にわたってのシークエンシング偽陽性エラー率分散を示す。ステップ５１０で、個体における疾患のレベルが、シグナルとバックグラウンド指数の比較に基づいて決定される。例えば、一部の実施形態では、バックグラウンド指数より上の統計的に有意なシグナルは、個体が疾患を有することを示す。ステップ５１５で、個体の疾患のレベルが、個体における疾患の以前のレベルと比較される。疾患の以前に測定されたレベルと比較して疾患の測定レベルの統計的に有意な変化は、疾患が再発、進行または退縮したことを示す。例えば、疾患の以前に測定されたレベルと比較して疾患の測定レベルの統計的に有意な増加は、疾患が進行したことを示す。疾患の以前に測定されたレベルと比較して疾患の測定レベルの統計的に有意な減少は、疾患が退縮したことを示す。
図６は、個体における疾患（例えば、がん）の再発、進行または退縮をモニターする別の例示的方法６００を示す。ステップ６０５で、罹患組織に関連するシークエンシングデータ、および非罹患組織に関連するシークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルが構築される。個別化遺伝子座パネルは、罹患組織に関連するシークエンシングデータと非罹患組織に関連するシークエンシングデータとの差に基づく。ステップ６１０で、遺伝子座は、個別化遺伝子座パネルから選択される。一部の実施形態では、個別化遺伝子座パネル内のすべての遺伝子座が選択され、一部の実施形態では、個別化遺伝子座パネル内の遺伝子座のサブセットが選択される。遺伝子座は、個別化遺伝子座パネルから、例えば個々の遺伝子座の偽陽性率に基づいて、選択され得る。ステップ６１５で、個体からの試料に関連する核酸シークエンシングデータが得られる。シークエンシングデータは、例えば、試料中の核酸分子をシークエンシングすることにより、または記録からの試料についてのシークエンシングデータを受信することにより、得ることができる。試料は、個体から得られた流体試料であり得る。例えば、一部の実施形態では、核酸シークエンシングデータは、個体からの流体試料（例えば、血液試料、血漿試料、唾液試料、尿試料、または糞便試料）中の無細胞ＤＮＡに由来する。必要に応じて、核酸シークエンシングデータは、非標的および／または非濃縮核酸シークエンシングデータ（例えば、全ゲノムシークエンシングデータ）である。一部の実施形態では、シークエンシングデータのシークエンシング深度は、約１００未満、約１０未満、または約１未満である。一部の実施形態では、シークエンシンデータのシークエンシング深度は、少なくとも０．０１である。ステップ６２０で、個体に関連する核酸シークエンシングデータは、シグナルをバックグラウンド指数と比較するために使用される。シグナルは、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示す。バックグラウンド指数は、選択された遺伝子座にわたってのシークエンシング偽陽性エラー率分散を示す。ステップ６２５で、個体における疾患のレベルが、シグナルとバックグラウンド指数の比較に基づいて決定される。例えば、一部の実施形態では、バックグラウンド指数より上の統計的に有意なシグナルは、個体が疾患を有することを示す。ステップ６３０で、個体の疾患のレベルが、個体における疾患の以前のレベルと比較される。疾患の以前に測定されたレベルと比較して疾患の測定レベルの統計的に有意な変化は、疾患が再発、進行または退縮したことを示す。例えば、疾患の以前に測定されたレベルと比較して疾患の測定レベルの統計的に有意な増加は、疾患が進行したことを示す。疾患の以前に測定されたレベルと比較して疾患の測定レベルの統計的に有意な減少は、疾患が退縮したことを示す。
必要に応じて、疾患の測定割合、測定レベル、進行、退縮および／または再発が、記録、例えば、電子診療記録（ＥＭＲ）または患者ファイルに記録される。本明細書に記載される方法のいずれかについての一部の実施形態では、個体は、疾患の測定割合、測定レベル、進行、退縮および／または再発を知らされる。本明細書に記載される方法のいずれかについての一部の実施形態では、個体は、疾患、疾患の再発、または疾患の進行があると診断される。本明細書に記載される方法のいずれかについての一部の実施形態では、個体は、疾患について処置される。
システムおよびレポート
システムおよびレポート
図１～６に関連して説明されたものを含む、上記で説明された操作は、図７に描かれている構成要素により、必要に応じて実行される。どのようにすれば他のプロセス、例えば、上記で説明された操作のすべてまたは一部の組合せまたは部分的組合せを図７に描かれている構成要素に基づいて実行することができるのかは、当業者には明らかであろう。どのようにすれば本明細書に記載される方法、技法、システムおよびデバイスを互いに、全体として、または部分的に組み合わせることができるのかもまた、それらの方法、技法、システムおよび／またはデバイスが、図７に描かれている構成要素により実行されるか否か、および／または提供されるか否かを問わず、当業者には明らかであろう。
図７は、一実施形態に従ってコンピュータデバイスの例を説明する。デバイス７００は、ネットワークに接続されたホストコンピュータであることがある。デバイス４００は、クライアントコンピュータまたはサーバーであることもある。図７に示されているように、デバイス７００は、任意の好適なタイプのマイクロプロセッサーベースのデバイス、例えば、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、サーバー、またはハンドヘルドコンピュータデバイス（携帯用電子デバイス）、例えば電話機もしくはタブレットであり得る。デバイスは、例えば、プロセッサー７１０、入力デバイス７２０、出力デバイス７３０、記憶装置７４０、および通信デバイス７６０のうちの１つまたは複数を含み得る。入力デバイス７２０および出力デバイス７３０は、一般に、上記のものに対応することができ、コンピュータと接続可能または一体型のどちらかであり得る。
入力デバイス７２０は、入力を行なう任意の好適なデバイス、例えば、タッチスクリーン、キーボードもしくはキーパッド、マウス、または音声認識デバイスであり得る。出力デバイス７３０は、出力を行なう任意の好適なデバイス、例えば、タッチパネル、触覚デバイス、またはスピーカーであり得る。
記憶装置７４０は、ＲＡＭ、キャッシュメモリー、ハードドライブまたは脱着式保存ディスクを含む、電子、磁気または光メモリーなどの、記憶域を提供する任意の好適なデバイスであり得る。通信デバイス７６０は、ネットワークを用いてシグナルを送信および受信することができる任意の好適なデバイス、例えば、ネットワークインターフェースチップまたはデバイスを含み得る。コンピュータの構成要素を、任意の好適な方法で、例えば物理的バスを介してまたは無線で、接続することができる。
記憶装置７４０に記憶され、プロセッサー７１０により実行され得る、ソフトウェア７５０は、例えば、本開示の機能性を具現化する（例えば、上記のデバイスで具現化されるような）プログラミングを含むことができる。
上記のものなどの命令実行システム、装置もしくはデバイスで使用するための、またはそれと接続している、任意の非一過性コンピュータ可読記憶媒体であって、ソフトウェアに関連する命令を命令実行システム、装置またはデバイスから取り出し、命令を実行することができる可読記憶媒体の中に、ソフトウェア７５０を記憶および／またはトランスポートすることもできる。本開示に関して、コンピュータ可読記憶媒体は、命令実行システム、装置もしくはデバイスで使用するための、またはそれと接続している、プログラミングを収容または記憶することができる任意の媒体、例えば、記憶装置７４０であり得る。
上記のものなどの命令実行システム、装置もしくはデバイスで使用するための、またはそれと接続している、任意のトランスポート媒体であって、ソフトウェアに関連する命令を命令実行システム、装置またはデバイスから取り出し、命令を実行することができるトランスポート媒体の中に、ソフトウェア７５０を伝播することもできる。本開示に関して、トランスポート媒体は、命令実行システム、装置もしくはデバイスで使用するための、またはそれと接続している、プログラミングを伝える、伝播するまたはトランスポートすることができる、任意の媒体であり得る。トランスポート可読媒体としては、電子、磁気、光、電磁または赤外有線もしくは無線伝播媒体を挙げることができるが、これらに限定されない。
デバイス７００をネットワークに接続することができ、これは任意の好適なタイプの相互接続通信システムであり得る。ネットワークは、任意の好適な通信プロトコルを実行することができ、ネットワークを任意の好適なセキュリティープロトコルにより保護することができる。ネットワークは、ネットワークシグナルの通信および受信を実行することができる任意の好適な構成のネットワークリンク、例えば、無線ネットワーク接続、Ｔ１もしくはＴ３ライン、ケーブルネットワーク、ＤＳＬ、または電話線を含むことができる。
デバイス７００は、ネットワークでの操作に好適な任意の操作システムを実装することができる。ソフトウェア７５０を任意の好適なプログラミング言語、例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）またはＰｙｔｈｏｎで書くことができる。様々な実施形態では、本開示の機能性を具現化するアプリケーションソフトウェアを、例えば、異なる配置で、例えばクライアント／サーバー構成で、またはウェブベースのアプリケーションもしくはウェブサービスのようなウェブブラウザによって、展開することができる。
本明細書に記載される方法は、解析方法を使用して決定された情報を報告するステップ、および／または解析方法を使用して決定された情報を含むレポートを生成するステップを、必要に応じてさらに含む。例えば、一部の実施形態では、方法は、個体における疾患のレベルに関する＿＿を含有するレポートを報告または生成するステップをさらに含む。報告される情報またはレポートの中の情報は、例えば、疾患（例えば、がん）に起因する個体から得られた試料中のｃｆＤＮＡの割合、または疾患（例えば、がん）の検出可能な量の存在もしくは非存在に関連し得る。受信者、例えば、臨床医、対象または研究者に、レポートを配布することができ、または情報を報告することができる。
本願の例示的実施形態として提供する以下の非限定的実施例を参照することにより、本願をよりよく理解することができる。以下の実施例を、実施形態をより十分に説明するために提示するが、いかなる点においても本願の広い範囲を限定するものと解釈すべきでない。本願のある特定の実施形態を本明細書で示し、説明したが、このような実施形態を単なる例として提供することは明らかであろう。本発明の趣旨および範囲から逸脱しない非常に多くの変形形態、変更形態および置換形態に当業者なら想到するであろう。本明細書に記載する実施形態の様々な代替形態を、本明細書に記載する方法を実施する際に利用することができることは、理解されるはずである。
（実施例１）
（実施例１）
個体から採取したがん組織生検から採取したＤＮＡを全ゲノムシークエンシングによりシークエンシングして、がん組織に関連するシークエンシングデータを得る。血液試料を個体から採取し、全血からのＤＮＡをシークエンシングして、健常組織に関連するシークエンシングデータを得る。がん組織に関連するシークエンシングデータと健常組織に関連するシークエンシングデータを比較し、差を個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルに収載する。個別化遺伝子座パネル内のバリアントをバリアントの偽陽性エラー率に基づいてフィルター処理し、偽陽性エラー率が最も低いバリアントを解析に選択する。Ｎｖａｒ遺伝子座の総数を選択する。
無細胞ＤＮＡを個体からの流体試料から採取し、非標的および非濃縮全ゲノムシークエンシングを使用してｃｆＤＮＡをシークエンシングして、Ｄの平均シークエンシング深度でのシークエンシングデータを得る。このシークエンシング法は、Ｅのシークエンシング偽陽性エラー率をもたらす。個別化遺伝子座パネルからのバリアントコールを伴うシークエンシングリードの数、Ｎｔｏｔａｌ、を測定し、疾患に関連する流体試料中の核酸分子の割合（Ｆｐｒｉｏｒ）を、その割合の誤差とともに決定する。
個体は、がんの処置を受ける。処置後、個体からのその後の流体試料から無細胞ＤＮＡを採取し、非標的および非濃縮全ゲノムシークエンシングを使用してｃｆＤＮＡをシークエンシングして、Ｄの平均シークエンシング深度（これは、以前の試料のものと同じまたは異なる深度である）でのシークエンシングデータを得る。このシークエンシング法は、Ｅのシークエンシング偽陽性エラー率（これは、以前の試料のものと同じまたは異なる）をもたらす。個別化遺伝子座パネルからのバリアントコールを伴うシークエンシングリードの数、Ｎｔｏｔａｌ、を測定し、疾患に関連する流体試料中の核酸分子の割合（Ｆｐｒｅｓｅｎｔ）を、その割合の誤差とともに決定する。
より最近の試料に関連する割合（Ｆｐｒｅｓｅｎｔ）を過去の試料に関連する割合（Ｆｐｒｉｏｒ）と比較して、がんの進行または退縮をモニターする。割合の統計的に有意な増加は、疾患が進行したことを示し、割合の統計的に有意な低下は、疾患が退縮したことを示す。
（実施例２）
（実施例２）
個体から採取したがん組織生検から採取したＤＮＡを全ゲノムシークエンシングによりシークエンシングして、がん組織に関連するシークエンシングデータを得る。血液試料を個体から採取し、全血からのＤＮＡをシークエンシングして、健常組織に関連するシークエンシングデータを得る。がん組織に関連するシークエンシングデータと健常組織に関連するシークエンシングデータを比較し、差を個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルに収載する。個別化遺伝子座パネル内のバリアントをバリアントの偽陽性エラー率に基づいてフィルター処理し、偽陽性エラー率が最も低いバリアントを解析に選択する。Ｎｖａｒ遺伝子座の総数を選択する。
個体は、がんの処置を受ける。処置後、個体からのその後の流体試料から無細胞ＤＮＡを採取し、非標的および非濃縮全ゲノムシークエンシングを使用してｃｆＤＮＡをシークエンシングして、Ｄの平均シークエンシング深度（これは、以前の試料のものと同じまたは異なる深度である）でのシークエンシングデータを得る。このシークエンシング法は、Ｅのシークエンシング偽陽性エラー率（これは、以前の試料のものと同じまたは異なる）をもたらす。個別化遺伝子座パネルからのバリアントコールを伴うシークエンシングリードの数、Ｎｔｏｔａｌ、を測定し、疾患に関連する流体試料中の核酸分子のシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）を決定する。設定閾値（ｋ）より上のＳＮＲ比は、個体が疾患の残存量を有することを示す。
（実施例３）
（実施例３）
がん試料をＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＡＢＳ）バイオバンクから購入した。このバイオバンクにおける正常および罹患ヒト組織の生物検体は、商用研究のために適切なインフォームドコンセントを得て厳格な法令順守要件のもとで収集された。生物検体は、がんのドナーからのバフィーコートおよび血漿（ｃｆＤＮＡ）にマッチした腫瘍生検材料（アーカイブＦＦＰＥ）を含む。この研究は、これらの試料の遺伝子シグネチャーを評価した。
試料。結腸がんの転移性腺癌を有する４０歳女性である患者１についてのＦＦＰＥ、バフィーコートおよび血漿試料を入手した。ＦＦＰＥ試料は、約８０％のがん細胞と、約１０～２０％の線維芽細胞および浸潤単核細胞および壊死組織（死滅組織）とを含んでいた。
転移性黒色腫がんを有する６９歳男性である患者２についての血漿試料を入手した。患者２からの血漿試料を対照として使用して、シークエンシングエラー率を決定した。血漿試料は、採血中の赤血球および白血球を示す、赤みを帯びた色であった。溶解した血液細胞に起因して、がんｃｆＤＮＡ（すなわち、ｃｔＤＮＡ）に対してバックグラウンド非腫瘍ｃｆＤＮＡが予想よりも高度になることがある。
核酸抽出およびライブラリー調製。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔまたはＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔを使用して、１００μＬのバフィーコート（患者１）から核酸分子を抽出した。両方のキットからの抽出ｇＤＮＡを併せ、１０００ｎｇの抽出ｇＤＮＡを、Ｒｏｃｈｅ ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ Ｋｉｔを使用するライブラリー構築に使用した。
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔとキシレンまたはＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ＦＦＰＥ組織（患者１）の３０μｍ薄片から核酸分子を抽出した。スライドに対してキシレンを用いてＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用してＦＦＰＥ試料から抽出した１７３ｎｇのｇＤＮＡを、第１のＦＦＰＥに基づくライブラリーのライブラリー構築に使用し、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して（スライドに対してキシレンを用いずに）ＦＦＰＥ試料から抽出した４４６ｎｇのｇＤＮＡを、第２のＦＦＰＥに基づくライブラリーのライブラリー構築に使用した。Ｒｏｃｈｅ ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ Ｋｉｔを使用してライブラリーを構築し、その後、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘキットによる７サイクルのＰＣＲを行なった。
ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｅｌｌ Ｆｒｅｅ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して４ｍＬの血漿（患者１または患者２）から核酸分子を抽出した。患者１血漿試料からの１００ｎｇのｃｆＤＮＡおよび患者２血漿試料からの２５ｎｇのｃｆＤＮＡを、Ｒｏｃｈｅ ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ Ｋｉｔを使用するライブラリー構築に使用し、その後、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘキットによる７サイクルのＰＣＲを行なった。
アダプターにライゲーションされたライブラリーの正確な定量を、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して行なった。
全ゲノムシークエンシング。Ｕｌｔｉｍａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓの機器およびプロトコル（Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇフローサイクル）を使用して３０～１５０倍のカバレッジで試料ごとにエマルジョンＰＣＲおよびシークエンシングを行なった。
バイオインフォマティクス解析。９１７，３１９，８６８生リード（ライブラリー１、カバレッジ中央値で平均長２２８塩基）を、バフィーコート（患者１）試料ライブラリーについて得た。２，１３６，８２２，０００生リード（ライブラリー２、平均長１８３塩基）を、ｃｆＤＮＡ（血漿、患者１）試料ライブラリーについて得た。５５３，２９８，７６０生リード（ライブラリー３）および１，７６８，７８６，８５１生リード（ライブラリー４）（１８６塩基の平均長）を、２つの異なるＦＦＰＥに基づくシークエンシングライブラリーについて得た。
２１１，８７８６，０００生リード（平均長１８７塩基）を、ｃｆＤＮＡ（血漿、患者２）試料ライブラリー（ライブラリー５）について得た。
ＢＷＡ（バージョン０．７．１５－ｒ１１４０）を使用して生リードを参照ゲノム（ｈｇ３８）とアラインメントし、バフィーコートおよびＦＦＰＥリードについてＰｉｃａｒｄ Ｔｏｏｌ（バージョン２．１５．０、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、またはｃｆＤＮＡリードについてＳＡＭ Ｔｏｏｌｓ ｒｍｄｕｐプログラムを使用して、デュプリケートにマークを付けた。アラインメントおよびデュプリケートの除去後、ゲノムのカバレッジ中央値は、ライブラリー１～５について、それぞれ、４５倍、８４倍、８倍、１８倍および５６倍であった。
ＧＡＴＫ４パッケージからのＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒプログラム（Ｕｌｔｉｍａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓの機器およびプロトコルにより生成されたシークエンシングデータを処理するために改良されたもの）を使用して、ＦＦＰＥリード中のｈｇ３８参照ゲノムに関するバリアントを別々にコールした。４，６９４，１９８バリアントが、第１のＦＦＰＥに基づくライブラリー（ライブラリー３）からコールされ、６，７０２，４２１バリアントが、第２のＦＦＰＥに基づくライブラリー（ライブラリー４）からコールされた。試料処理の分散を説明するための７，６８２，８０８の固有のバリアント（すなわち、「ベースラインバリアント」）のリストのために２つのＦＦＰＥ試料からのベースラインバリアントを併せ、各ベースラインバリアントについて、試料の各々におけるベースラインバリアントを支持するリードの数を表にした。次いで、ベースラインバリアントを、生殖細胞系列バリアント、試料調製に起因するＤＮＡ損傷から生じるバリアント、およびシークエンシングエラーから生じるバリアントを除去するようにフィルター処理した。先ず、ベースラインバリアントを、２つまたはそれより多くのシークエンシングリードにより支持されるＳＮＰバリアントのみを含むようにフィルター処理し、その結果、４，１７９，２０３の固有のバリアントを得た。次いで、これらのバリアントを、人口データベース（ｇｎｏｍＡＤ ｖ３、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手可能）から対立遺伝子頻度が０．０１より大きいバリアント（生殖細胞系列突然変異である可能性が高いと考えられる）を除去するようにフィルター処理し、その結果、１，２９２，１３５の固有のバリアントを得た。次いで、これらのバリアントを、ホモポリマー領域内の８塩基のまたはそれより長いバリアントを除去するようにフィルター処理し、その結果、１，１７６，１７９の固有のバリアントを得た。次いで、これらのバリアントを、相補鎖内の支持されないバリアント（シークエンシングエラーである疑いがある）を除去するようにフィルター処理し、その結果、５０５，５００の固有のバリアントを得た。次いで、これらのバリアントを、バフィーコート試料からのリードにより検出されたバリアント（生殖細胞系列および／または非がん性体細胞突然変異と推測された）を除去するようにフィルター処理し、その結果、６７，６６０の固有のバリアントを得た。６７，６６０の固有のバリアントのパネルから、両方のＦＦＰＥ試料ライブラリーに存在するバリアントであって、サイクルシフト（すなわち、フローサイクル順序に基づいて参照と比較して１フルサイクル（例えば、４つのフロー位置）またはそれを超えるフローグラムシグナルシフト）を誘導すると予想される１７，０７３のバリアントを、さらなる解析に選択した。比較として、両方のＦＦＰＥ試料ライブラリーに存在するバリアントであって、異なるフロー順序の場合にサイクルシフトを誘導すると予想される（すなわち、新しいゼロまたは新しい非ゼロフローグラムシグナルを含有する）１７，５０９のバリアントを解析し、サイクルシフトを含むことができない（すなわち、新しいゼロフローグラムシグナルも新しい非ゼロフローグラムシグナルも含有しない）５，７４８のバリアントも解析した。
患者１データを使用してバイオインフォマティクス解析を行ない、患者２からのｃｆＤＮＡを使用して、選択されたバリアントの同じセットに対するシークエンシングエラー率を推定した。その結果、患者１におけるがんに関連するｃｆＤＮＡの推定割合、
を４．６５％であると決定し、バックグラウンドレベルを、サイクルシフト誘導バリアントを解析して約０．３５％であると決定した。表２を参照されたい。誤差補正割合、Ｆ’＝Ｆ－Ｅは、したがって、約４．３％である。
可能性のあるサイクルシフトバリアントを解析して、患者１におけるがんに関連するｃｆＤＮＡの推定割合を４．３４％であると決定し、バックグラウンドレベルを約０．４４％と決定し、かくて３．９％の誤差補正割合を得た。表３を参照されたい。
サイクルシフトも可能性のあるサイクルシフトも誘導しなかったバリアントを解析して、患者１におけるがんに関連するｃｆＤＮＡの推定割合を３．９２％であると決定し、バックグラウンドレベルを約０．５５％と決定し、かくて３．３７％の誤差補正割合を得た。表４を参照されたい。
（実施例４）
ＤＮＡ試料ＮＡ１２８７８（コリエル医学研究所（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から入手可能な試料）のゲノムを、４フローサイクル（Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇ）に従って非終結蛍光標識ヌクレオチドを使用してシークエンシングした。シークエンシング実行により、平均長が１７６塩基である４１５，９００，００２のリードが生成された。３９９，８０４，９２５リードをｈｇ３８参照ゲノムと（ＢＷＡ、バージョン０．７．１７－ｒ１１８８で）アラインメントした。
アラインメント後、参照ゲノムと完全にアラインしたリード（１７８，６３４，６２５リード）、または参照ゲノムとの単一ミスマッチを有し、２０のもしくはそれを超えるマッピング品質スコアでアラインしたリード（２７，２６５，６６１リード）を選択した。つまり、１９３，９０４，６３９は、例えば、インデル、複数のミスマッチ、または参照ゲノムとの誤っている（アーチファクトの）可能性のあるアラインメントを有するため、さらなる解析に含めなかった。したがって、２７，２６５，６６１リードは、真の陽性ＮＡ１２８７８ ＳＮＰはもちろん、シークエンシングエラーから生じるあらゆる偽陽性ＳＮＰも含むと推定した。２７，２６５，６６１リードのこのプールから、真の陽性ＮＡ１２８７８ ＳＮＰバリアントの効果を低下させる１回より多くミスマッチ遺伝子座に及んだシークエンシングリードを除去し、その結果、深度１のミスマッチを有する合計３，４１３，７００リードを得た。
残りの３，４１３，７００リード各々は、（１）フローグラムフローシグナルがフローサイクル順序に基づいて参照に対して１フルサイクル（例えば、４フロー位置）シフトした場合、サイクルシフトを誘導すると予想されるミスマッチ、（２）異なるフローサイクルを使用した場合、サイクルシフトを誘導し得る（例えば、それが、フローグラムで新しいゼロもしくは新しい非ゼロシグナルを生成する）可能性のあるミスマッチ、または（３）フローサイクル順序に関係なくサイクルシフトを誘導することができないであろうミスマッチを含んだ。３，４１３，７００ミスマッチのうち、１，１８４，９５４（３４％）は、サイクルシフトを誘導したが、１，５４６，５８８（４３％）は、異なるフロー順序でサイクルシフト（すなわち、「可能性のあるサイクルシフト」）を誘導することがあった。比較して、ランダムミスマッチの理論的予想は、名目上、サイクルシフト４２％および可能性のあるサイクルシフトミスマッチ４６％を示唆した。全体的に見て、サイクルシフトを誘導するミスマッチ率は、３．７×１０－５事象／塩基であり、可能性のあるサイクルシフトを誘導するミスマッチ率は、４．８×１０－５事象／塩基であった。表５は、サイクルシフトを誘導する１０の最高頻度単一ミスマッチ、および発生率の相対パーセンテージを示す。
次いで、３つの異なるクラス（すなわち、サイクルシフトを誘導する、サイクルシフトを誘導する可能性がある、またはサイクルシフトを誘導しないおよび誘導することができない）の各々におけるミスマッチに基づくバリアントコーリングの性能を評価した。ＢＷＡを用いてリードを参照ゲノムとアラインメントし、ＧＡＴＫ（バージョン４）のＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒツールを使用してバリアントコーリングを遂行した。得られたミスマッチコールを、１０塩基より長いホモポリマー内のバリアントコール、または１０塩基もしくはそれを超える長さを有するホモポリマーに隣接する１０塩基以内のバリアントコールを捨てることにより、フィルター処理した。
ミスマッチコールを、ｇｅｎｏｍｅ－ｉｎ－ｔｈｅ ｂｏｔｔｌｅ（ＧＩＡＢ）プロジェクトによって同じＮＡ１２８７８について生成されたコールと比較して、ミスマッチのクラスごとに精度＃ＴＰ／（＃ＦＰ＋＃ＦＮ＋＃ＴＰ）を決定した。シークエンシングデータを、示した平均ゲノム深度にランダムにダウンサンプリングした。サイクルシフトを誘導するミスマッチ、およびサイクルシフトを誘導する可能性のあるミスマッチは、表６で実証されるように、サイクルシフトを誘導しないミスマッチよりも高い精度を有した。
Claims (70)
- 個体における疾患のレベルを測定する方法であって、
前記個体に関連する核酸シークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示すシグナルと、前記選択された遺伝子座にわたってのシークエンシング偽陽性エラー率を示すバックグラウンド指数とを、比較するステップ；および
前記シグナルと前記バックグラウンド指数の前記比較に基づいて前記個体における疾患の前記レベルを決定するステップ
を含む方法。 - 前記疾患の前記レベルが、前記個体からの試料中の前記疾患に関連する核酸分子の割合である、請求項１に記載の方法。
- 比較するステップが、前記バックグラウンド指数を前記シグナルから減算することを含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記疾患の前記レベルの測定についての誤差を決定するステップをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記誤差が、前記疾患の前記レベルについての信頼区間である、請求項４に記載の方法。
- 前記誤差が、前記選択された遺伝子座で検出された個々の小ヌクレオチドバリアントリードの総数に比例する、請求項４または５に記載の方法。
- 前記疾患の前記レベルが、前記個体からの試料中の前記疾患に関連する核酸分子の割合であり、前記割合および誤差が、
Ｆは、割合であり、
Ｎｔｏｔａｌは、前記選択された遺伝子座で検出された個々の小ヌクレオチドバリアントリードの総数であり、
Ｎｖａｒは、選択された遺伝子座の数であり、
Ｄは、平均シークエンシング深度であり、
Ｅは、前記選択された遺伝子座にわたっての偽陽性エラー率である）
により定義される、請求項６に記載の方法。 - 前記疾患の再発を測定するステップを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患の測定レベルを前記疾患の以前に測定されたレベルと比較することにより、前記疾患の進行または退縮を測定するステップを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患の進行または退縮が、前記疾患の前記測定レベルの統計的に有意な変化に基づく、請求項９に記載の方法。
- 個体における疾患を検出する方法であって、
前記個体に関連する核酸シークエンシングデータを使用して、個別化疾患関連小ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）遺伝子座パネルから選択されたシークエンシングされた遺伝子座が罹患組織に由来する率を示すシグナルと、選択された遺伝子座にわたってのサンプリング分散を示すノイズ指数とを、比較するステップ；および
前記シグナルと前記ノイズ指数の前記比較に基づいて前記個体が前記疾患を有するかどうかを決定するステップ
を含む方法。 - 前記シグナルが、所定の閾値を超えて前記ノイズ指数を上回った場合、前記個体が、疾患の再発または前記疾患の残存レベルを有すると決定される、請求項１１に記載の方法。
- 前記シグナルが、ｋ倍またはそれより大きく前記ノイズ指数を上回った場合、前記個体が、疾患の再発または前記疾患の残存レベルを有すると決定され、ｋが約１．５である、請求項１１に記載の方法。
- 前記シグナルが、ｋ倍またはそれより大きく前記ノイズ指数を上回った場合、前記個体が、疾患の再発または前記疾患の残存レベルを有すると決定され、ｋが約３．０である、請求項１１に記載の方法。
- 前記シグナルが、ｋ倍またはそれより大きく前記ノイズ指数を上回った場合、前記個体が、疾患の再発または前記疾患の残存レベルを有すると決定され、ｋが約５．０である、請求項１１に記載の方法。
- 前記シグナルが、ｋ倍またはそれより大きく前記ノイズ指数を上回った場合、前記個体が、疾患の再発または前記疾患の残存レベルを有すると決定され、ｋが約１０である、請求項１１に記載の方法。
- 前記疾患の再発を検出するステップを含む、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シグナルの大きさが、選択された遺伝子座の数、および前記核酸シークエンシングデータに関連する平均シークエンシング深度に、少なくとも依存する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
- 個体における疾患の存在、進行または退縮を検出する方法であって、
（ａ）前記個体の罹患組織に起因する試料中の核酸分子の割合、Ｆ、を示す値がゼロより大きい可能性であって、ゼロより大きいＦが前記個体の前記疾患の存在を示す、可能性、および
（ｂ）前記個体の罹患組織に起因する試料中の核酸分子の割合、Ｆ、を示す値の統計的に有意な変化
の少なくとも一方を測定するステップを含み、
前記統計的に有意な変化が、以前に測定された割合、Ｆｐｒｉｏｒ、に対する変化であり、Ｆの統計的に有意な変化が、前記個体の前記疾患の進行または退縮を示し、
前記割合Ｆが、無細胞核酸シークエンシングデータにおいて検出された一塩基バリアント（ＳＮＶ）の総数、Ｎｔｏｔａｌ、であって、前記ＳＮＶが個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルから選択される、Ｎｔｏｔａｌと、前記ＳＮＶパネルから選択されたＳＮＶの数、Ｎｖａｒ、であって、平均シークエンシング深度、Ｄ、により調整され、さらに、前記選択されたＳＮＶにわたってシークエンシング偽陽性エラー率、Ｅ、により調整された、Ｎｖａｒとを比較することにより決定される、方法。 - 前記個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するステップをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するステップが、
前記罹患組織の試料に由来する核酸分子をシークエンシングして、疾患関連ＳＮＶのセットを決定すること、および
疾患関連ＳＮＶの前記セットを、生殖細胞系列バリアントおよび非疾患関連体細胞バリアントを除去するようにフィルター処理すること
を含む、請求項２０に記載の方法。 - 前記罹患組織の前記試料が、前記個体から得られた腫瘍生検試料である、請求項２１に記載の方法。
- 前記生殖細胞系列バリアントもしくは前記非疾患関連体細胞バリアント、または両方が、前記個体から得られた非罹患組織の試料に由来する核酸分子をシークエンシングすることにより決定される、請求項２１または２２に記載の方法。
- 非罹患組織の前記試料が、白血球を含む、請求項２３に記載の方法。
- 非罹患組織の前記試料が、バフィーコートである、請求項２４に記載の方法。
- 罹患関連ＳＮＶのセットを、１つのシークエンシングリードによってしか支持されないＳＮＶを除去するようにフィルター処理するステップをさらに含む、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
- 罹患関連ＳＮＶの前記セットを、相補的シークエンシングリードにより支持されないＳＮＶを除去するようにフィルター処理するステップをさらに含む、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
- 罹患関連ＳＮＶの前記セットを、個体の一般集団に所定の閾値よりも高い対立遺伝子頻度で存在するＳＮＶを除去するようにフィルター処理するステップをさらに含む、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記所定の閾値が、約０．０１である、請求項２８に記載の方法。
- ホモポリマー領域内のＳＮＶをフィルター処理するステップ、またはショートタンデムリピート内のＳＮＶをフィルター処理するステップをさらに含む、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸シークエンシングデータが、前記個体から得られた流体試料からの核酸分子を、複数のフロー位置を含むフローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングすることにより得られ、前記フロー位置が、前記ヌクレオチドフローに対応し；
前記個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するステップが、疾患関連ＳＮＶの前記セットを、前記核酸シークエンシングデータおよび前記参照シークエンシングデータが、前記フローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングされたときに、２カ所またはそれより多くのフロー位置において参照配列に関連する参照シークエンシングデータと異なる核酸シークエンシングデータを生じさせる結果となるＳＮＶのみを含むように、フィルター処理することをさらに含む、
請求項２１から３０のいずれか一項に記載の方法。 - 前記核酸シークエンシングデータが、前記個体から得られた流体試料からの核酸分子を、複数のフロー位置を含むフローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングすることにより得られ、前記フロー位置が、前記ヌクレオチドフローに対応し；
前記方法が、
前記罹患組織の試料に由来する核酸分子をシークエンシングして、疾患関連ＳＮＶのセットを決定すること
を含む、前記個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するステップをさらに含み、
前記個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するステップが、疾患関連ＳＮＶの前記セットを、前記核酸シークエンシングデータおよび前記参照シークエンシングデータが、前記フローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングされたときに、２カ所またはそれより多くのフロー位置において参照配列に関連する参照シークエンシングデータと異なる核酸シークエンシングデータを生じさせる結果となるＳＮＶのみを含むように、フィルター処理することをさらに含む、
請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。 - 前記個別化疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルを生成するステップが、疾患関連ＳＮＶの前記セットを、前記核酸シークエンシングデータおよび前記参照シークエンシングデータが、前記フローサイクル順序に従って別々のヌクレオチドフローで提供される非終結ヌクレオチドを使用してシークエンシングされたときに、１または複数のフローサイクルにわたって参照配列に関連する参照シークエンシングデータと異なる核酸シークエンシングデータを生じさせる結果となるＳＮＶのみを含むように、フィルター処理することを含む、請求項３１または３２に記載の方法。
- 前記核酸分子が、無細胞核酸分子である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、ＤＮＡ分子である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、ＲＮＡ分子である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸シークエンシングデータが、前記個体から得られた流体試料中の核酸分子から導出される、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記流体試料が、血液試料、血漿試料、唾液試料、尿試料、または糞便試料である、請求項３７に記載の方法。
- 前記疾患ががんである、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記がんが、転移性がんである、請求項３９に記載の方法。
- 核酸分子をシークエンシングして前記シークエンシングデータを得るステップをさらに含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸シークエンシングデータが、所定のヌクレオチドシークエンシングサイクル順序に従って核酸分子をシークエンシングすることにより得られる、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸シークエンシングデータが、異なる所定のヌクレオチドシークエンシングサイクルに従って前記核酸分子を再シークエンシングすることによりさらに得られ、前記異なる所定のヌクレオチドシークエンシングサイクルが、シークエンシング遺伝子座のサブセットにおいて第１の所定のヌクレオチドシークエンシングサイクル順序と比較して異なる偽陽性バリアント率を生じさせる結果となる、請求項４２に記載の方法。
- 前記シークエンシングデータが、非標的シークエンシングデータである、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シークエンシングデータが、非標的全ゲノムから得られる、請求項４４に記載の方法。
- 前記シークエンシングデータの平均シークエンシング深度が、少なくとも０．０１である、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シークエンシンデータの前記平均シークエンシング深度が、約１００未満である、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シークエンシンデータの前記平均シークエンシング深度が、約１０未満である、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シークエンシンデータの前記平均シークエンシング深度が、約１未満である、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルが、パッセンジャー突然変異を含む、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルが、ドライバー突然変異を含む、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルが、一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子座を含む、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルが、インデル遺伝子座を含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患関連ＳＮＶ遺伝子座パネルからの前記選択された遺伝子座が、約３００またはそれより多くの遺伝子座を含む、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患関連ＳＮＶパネルから選択される前記遺伝子座が、前記個々の遺伝子座の偽陽性率に基づいて選択される、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患関連ＳＮＶパネルから選択される前記遺伝子座が、前記疾患の選択されたサブクローンに関連する固有のＳＮＶに基づく、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患関連ＳＮＶパネルが、前記罹患組織に関連するシークエンシングデータを非罹患組織に関連するシークエンシングデータと比較することにより決定される、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記罹患組織に由来する核酸分子をシークエンシングして前記罹患組織に関連するシークエンシングデータを得るステップを含む、請求項５７に記載の方法。
- 前記非罹患組織に由来する核酸分子をシークエンシングして前記非罹患組織に関連するシークエンシングデータを得るステップを含む、請求項５７または５８に記載の方法。
- 前記核酸シークエンシングデータが、前記核酸分子の表面ベースのシークエンシングを使用して得られ、前記核酸分子が、表面への前記核酸分子の付着前に増幅されない、請求項１から５９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸シークエンシングデータが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を使用せずに得られる、請求項１から６０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸シークエンシングデータが、試料識別バーコードを使用せずに得られる、請求項１から６１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シークエンシング偽陽性エラー率が、対照遺伝子座のパネルを使用して測定される、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シークエンシングデータが、プールされた試料中の複数の個体から得られた核酸分子をシークエンシングすることにより得られる、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された遺伝子座が、前記複数の個体のうち各個体に固有のものである、請求項６４に記載の方法。
- 前記選択された遺伝子座の中の少なくとも１つの遺伝子座が、前記複数の個体における少なくとも２名の個体間で共通している、請求項６５に記載の方法。
- シークエンシング深度が、個体ごとに決定され、各個体についてのシグナルが、その個体に関連するシークエンシング深度に基づいて調整される、請求項６４から６６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体における疾患の存在、非存在またはレベルを示すレポートを生成するステップを含む、請求項１から６７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポートを患者にまたは前記患者の医療担当者に提供するステップを含む、請求項６８に記載の方法またはシステム。
- １または複数台のプロセッサーと、
請求項１から６９のいずれか一項に記載の方法を実行するための命令を含む１つまたは複数のプログラムを記憶する非一過性コンピュータ可読媒体と
を含むシステム。
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