JP2022531841A - ハンチントン病を予防又は処置するためのｐ１６ＩＮＫ４ａ阻害剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、ハンチントン病の予防及び／又は処置での使用のための、ｐ１６ＩＮＫ４ａ阻害剤、医薬組成物の組成に関し、前記阻害剤は、核酸又はペプチド、低分子化合物分子又は市販の薬物である。【選択図】

Description

本発明は、ＮＩＨにより授与されたＧｒａｎｔ Ｎｏ．ＲＯ１ＮＳ１００５２９のもとアメリカ合衆国政府の支援を受けてなされた。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。

本発明はハンチントン病の処置に関する。

Ｕ．Ｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによれば、ハンチントン病は、運動制御不能、情動問題及び思考力の欠如（認知）を引き起こす進行性の脳障害である。

この障害の最も一般的形態である成人発症ハンチントン病は通常、３０代又は４０代で発症する。初期の徴候及び症候は、易刺激性、うつ、小さな不随意運動、協調不良、及び新しい情報の学習又は決断を行う上での困難を含み得る。多くのハンチントン病患者は、舞踏病として知られる不随意の筋肉反射又は攣縮運動を発する。疾患が進行するにつれて、これらの動作がより顕著になる。罹患者は、歩行、発話及び嚥下に困難を有し得る。この障害がある者では、性格の変化、思考力及び判断能力の低下も起こる。成人発症型のハンチントン病の者は通常、徴候及び症候開始後、約１５～２０年生存する。

若年型として知られるあまり一般的ではない形態のハンチントン病は、小児又は思春期に始まる。これは、運動の問題及び精神的及び情動的変化も含む。若年型のさらなる徴候としては、動作緩慢、不器用、頻繁な転倒、固縮、発語不明瞭及び流涎が挙げられる。思考力及び判断能力が損なわれるために学業成績が低下する。この状態の小児の３０パーセント～５０パーセントで痙攣が起こる。若年性ハンチントン病は、成人発症型よりも速く進行する傾向があり；罹患者の生存期間は通常、徴候及び症状の出現後１０～１５年である。

ＨＤがアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、プリオン病及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ）などの神経変性疾患（ＮＤ）であるという事実、及びＮＤの多くが共通の特性及び分子機序を共有するという事実にもかかわらず、ＨＤと細胞老化との間には何の関連も示されていない。

細胞老化は、様々なストレス要因と反応して細胞において永久的な増殖停止を強要する過程である。これは歴史的に、加齢及び加齢性障害などの複雑な生物学的過程に寄与するものとみなされてきた。細胞老化は、細胞が細胞成分を修復しようと試みること（細胞修復）、特に細胞周期停止又は細胞周期への再進入を含み得るＤＮＡ損傷を修復するという細胞の試みと関連づけられる。細胞老化は、長引くがうまくいかない又は準最適な細胞修復からの結果であり得る。細胞修復と細胞老化との間の関連性は、星状細胞、乏突起膠細胞及びミクログリアなどの脳の分裂細胞を含むがそれらだけではない分裂細胞、並びにニューロンなどの脳の有糸分裂後細胞を含むがそれらだけではない有糸分裂後細胞に適用される。有糸分裂後細胞において、細胞老化は、「細胞老化様状態」又は「老化応答」と呼ばれることが多い。両ケースで、細胞老化特性は、外部ストレス要因に対する細胞脆弱性並びに炎症性サイトカインなどの周囲細胞に対して有害である分子の分泌を含み得る。細胞周期停止の主要な調節因子はｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}であり、これは主要な誘導因子及び細胞老化の重要なマーカーでもある。

本発明は、ＨＤの予防又は処置におけるｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の役割の偶然の発見からの結果である。

本発明は、ハンチントン病（ＨＤ）の予防及び／又は処置での使用のためのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤に取り組む。

本発明の特定の態様では、前記阻害剤は、核酸、ペプチド、低分子化合物分子又は市販の薬物である。

本発明のさらなる態様では、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、非コードＲＮＡ、デオキシリボサイム（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｙｍｅ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム ＤＮＡｚｙｍｅ、修飾若しくは合成ＤＮＡ又はＲＮＡ変性耐性ポリヌクレオシドアミド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、他の核酸塩基含有ポリマー、アプタマー又はポリヌクレオチド標的遺伝子編集又は何らかのそれらの組み合わせなど、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を干渉するＲＮＡをコードする核酸である。

本発明のさらなる態様では、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤は、リガンド、キナーゼの阻害剤、低分子化合物分子、例えばＰＰＡＲγアンタゴニストなど又はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アンタゴニスト低分子ＳＩＲＴ１活性化因子、ＦＯＸＯ因子の活性を刺激可能な化合物、ＡＭＰＫ活性化因子などを含む群の間で選択されるペプチドである。

本発明のさらなる態様では、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤はリガンドであり、このリガンドは、抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、アプタマー又はＶＨＨドメインである。

別の態様によれば、本発明は、ＨＤの処置又は予防での使用のための組成物に取り組み、この組成物は、上記のような少なくとも１つのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤を含む。

本発明のさらなる態様では、本組成物は、医薬組成物であり、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。

本発明のさらなる態様では、本組成物は、細胞特異的な標的化のためのペプチドをコードする核酸配列を含有し、及び／又は細胞特異的な発現を可能にする核酸を含有する。

本発明のさらなる態様では、本組成物は、ＨＤを処置するための１つ以上の活性薬剤及び／又はその活性薬剤の副作用を処置するための１つ以上の活性薬剤をさらに含む。

またさらなる態様では、本発明は、上記のような使用のための少なくとも１つのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤を含む薬剤に取り組む。

特定の態様では、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤又は先行する請求項の何れか１つに記載の使用のための組成物は、治療的有効量で対象に投与される。

本発明のｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤のさらなる態様では、本組成物又は薬剤は治療的有効量で対象に投与される。

本発明のさらなる態様では、対象は、ＨＤと診断されている、ＨＤに対する遺伝的素因を呈する、又は罹患している。

本発明のより好ましい態様では、対象はＨＤと診断される。

定義
「ｐ１６^ＩＮＫ４」は、本明細書中で使用される場合、ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤のＩｎｋ４ファミリーの主要なメンバーである。これはＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ遺伝子座内で染色体９ｐ２１に位置するＣＤＫＮ２Ａ遺伝子によりコードされ、この遺伝子は、異なるプロモーターを伴う２つの異なるタンパク質：ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}及びｐ１９^ＡＲＦをコードする。これは、Ｓ期を阻害することによって、細胞周期進行の調節に寄与する。細胞周期調節におけるｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}の作用に加えて、このタンパク質は、アポトーシス、細胞浸潤及び血管形成などの他の過程にも関与している。

「ｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤」は、本明細書中で使用される場合、対象に投与された場合にｐ１６^ＩＮＫ４の正常な生理学的活性の部分的又は完全な低下につながる、何らかの分子、化合物又は物質を指す。ｐ１６^ＩＮＫ４の正常な生理学的活性は、これらのＣＤＫ阻害剤の生理学的活性を意味する。

「ハンチントン病」は、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃにより定義されるように、及び本明細書中で使用される場合、ハンチントン遺伝子におけるＣＡＧリピート延長又はＨＤ臨床的表現型模写を生じさせる、及び神経細胞、ニューロン及び脳の他の細胞の進行性の崩壊（細胞機能不全とそれに続く可能性がある細胞変性）を引き起こし得る他の遺伝学的原因が関連する遺伝性疾患を指す。ハンチントン病は、人間の機能的能力に大きな影響があり、通常、その結果、運動、思考（認知）及び精神医学的障害を引き起こす。

「発現」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子の発現を指す。遺伝子の発現は、例えば免疫組織化学、マルチプレックス法（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光結合免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの方法により、タンパク質レベルで決定され得る。或いは、遺伝子の発現は、例えばＲＴ－ＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ（ｑＰＣＲは定量的ＰＣＲを意味する）、ハイブリッド形成技術、例えばノーザンブロット、マイクロアレイの使用及び、ＲＴ－ＰＣＲにより得られるアンプリコンのハイブリッド形成を含むが限定されないそれらの組み合わせ、シーケンシング、例えば次世代ＤＮＡシーケンシング（ＮＧＳ）又はＲＮＡ－ｓｅｑ（「全トランスクリプトームショットガンシーケンシング」とも呼ばれる）などの方法によってｍＲＮＡレベルで決定され得る。

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」及び「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ及びＲＮＡにおける（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）一連のヌクレオチド塩基を指し、２個以上のヌクレオチドの何らかの鎖を意味する。ポリヌクレオチドは、キメラ混合物又は誘導体又はその修飾型、１本鎖又は２本鎖であり得る。

「過剰発現」は、本明細書中で使用される場合、「参照発現レベル」と比較した場合に試料中での遺伝子発現がより高いことを指す。参照発現レベルは、対象の大きな群（一般的には１０名を超える、好ましくは少なくとも５０名以上の対象）の中での、癌細胞の同様の集団において観察される典型的な発現レベルであり得る。参照発現レベルは、同じ対象における起源の同じ組織の、又は対象の大きな群由来の健常細胞での発現のレベルも指し得る。参照発現レベルは、異なる時点での対象の癌細胞における発現レベルも指す。当業者は、遺伝子発現レベルの比較を可能にする技術に精通している。

「受容体アンタゴニスト」は、本明細書中で使用される場合、受容体に結合し、それによりその活性化リガンド（即ち受容体アゴニスト）の結合時に観察される正常な生理学的活性を妨げる、あらゆる分子、化合物又は物質を指す。受容体アンタゴニストは、例えば受容体へのアゴニストの結合と競合し得る。

「予防（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、重篤な症状の発症前に、即ちハンチントン病の症状が出る前又はその前駆期に、処置を開始することを意味する。予防は、標的とされる病的状態の発症年齢を遅らせることを意味する。

「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患の進行を停止させるか又は遅らせるために、症状を示すＨＤ過程の何れかの時点で処置を開始することを意味する。このように、「処置する（ｔｒｅａｔ）」は、標的とされる病的状態又は障害を鈍化させる（和らげる）ことを意味する。

「治療的有効量」は、本明細書中で使用される場合、（１）標的とされる状態又は障害の発症を遅延させるか又は予防する；（２）標的とされる状態又は障害の１つ以上の症状の進行、増悪又は悪化を鈍化又は停止させる；（３）標的とされる状態又は障害の症状の寛解を引き起こす；（４）標的とされる状態又は障害の重症度又は発生率を低下させる；及び／又は（５）標的とされる状態又は障害を治癒させることを目的とする（しかし対象に対して顕著な負の又は有害な副作用を引き起こさない）、本発明による阻害剤又は組成物のレベル又は量を指す。本発明による阻害剤又は組成物の治療的有効量は、予防的又は予防作用のために標的とされる状態又は障害の発症前に投与され得る。或いは又はさらに、本発明による阻害剤又は組成物の治療的有効量は、治療作用のために、標的とされる状態又は障害の発症後に投与され得る。

「対象」は、本明細書中で使用される場合、温血動物、好ましくはヒトを指す。いくつかの実施形態では、対象は男性又は女性の対象である。いくつかの実施形態では、対象は、成人（例えば１８歳（ヒト年齢）を超える対象又は小児（例えば１８歳未満の対象、より具体的には１５歳未満及びより具体的には１０歳（ヒト年齢）未満である。いくつかの実施形態では、対象は、「患者」、即ち医療ケアを受けるために待機中であるか又は医療ケアを受けている、又は、本発明の方法による医学的手順の目的であった／目的である／目的となろう、又は疾患の発症に対して監視される対象であり得る。

ハンチントン病対象は、３０代又は４０代に徴候及び症状を発する。しかし、疾患は、生涯の中でより早く又は遅く現れ得る。疾患が２０歳前に発症する場合、その状態は「若年性ハンチントン病」と呼ばれる。疾患が早期に発現する結果、一連の症状が幾分異なり、疾患進行がより速いことが多くなる。薬物療法は、ハンチントン病の症状の管理を助けるために利用可能であるが、処置は、脳における細胞機能不全及び変性と関連する身体的、精神的及び行動の減退を予防し得ない。

本発明は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤又はＨＤを予防及び／又は処置するための活性薬剤として前記ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤を含む組成物を利用することによって、この要求に対処する。

本発明は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤又はＨＤを予防及び／又は処置するための活性薬剤として前記ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤を含む組成物を利用する。

第一の実施形態によれば、本発明は、ハンチントン病の予防及び／又は処置での使用のためのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤に関する。

ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}は、細胞周期の調節に関与するタンパク質である。ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}はＣＤＫ阻害剤のＩｎｋ４ファミリーの主なメンバーである。これは、ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ遺伝子座内の染色体９ｐ２１上に位置する遺伝子によりコードされる。ｐ１６は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の阻害剤である。ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}の発現は、殆どのマウス組織において及びヒト皮膚及び腎臓組織において加齢とともに顕著に上昇し、これにより、加齢及び老化におけるこの腫瘍抑制因子の重要性が示唆される。さらに、酸化ストレス、ＤＮＡ損傷及びクロマチン構造変化に応答したｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}過剰発現が老化線維芽細胞において報告されている。それにもかかわらず、老化の引き金となるシグナルは現在、完全に理解されておらず、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}は老化における主要な因子の１つであると思われるものの、この過程での各因子の正確な役割を確認するためにより多くの情報が必要とされている。

特定の態様では、本発明による使用のためのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤は、核酸、ポリペプチド又は低分子化合物分子である。

本発明のより具体的な態様では、本発明による使用のためのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、非コードＲＮＡ、デオキシリボサイム（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｙｍｅ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムＤＮＡｚｙｍｅ、修飾若しくは合成ＤＮＡ又はＲＮＡ変性耐性ポリヌクレオシドアミド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、他の核酸塩基含有ポリマー又はアプタマーなどのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を妨害するＲＮＡをコードする核酸配列である。

本発明の核酸分子又は配列は、ＤＮＡ及びＲＮＡにおける（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）一連のヌクレオチド塩基を指し、２個以上のヌクレオチドの何らかの鎖を意味する。ポリヌクレオチドはキメラ混合物又は誘導体又はその修飾型、１本鎖又は２本鎖であり得る。

オリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性、そのハイブリッド形成パラメーターなどを改善するために塩基部分、糖部分又はリン酸骨格で修飾され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、チオ－グアニン及び２，６－ジアミノプリンを含むが限定されない群から選択される修飾塩基部分を含み得る。

ヌクレオチド配列は一般的に、タンパク質及び酵素を作製するために細胞機構により使用される情報を含め、遺伝情報を保有する。これらの用語は、２本鎖又は１本鎖ゲノム及び相補的ＤＮＡ、ＲＮＡ、何らかの合成及び遺伝子改変ポリヌクレオチド及びセンス及びアンチセンス両方のポリヌクレオチドを含む。これは、１本鎖及び２本鎖分子、即ちＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ及びＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、並びにアミノ酸骨格に対する複合化塩基により形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）を含む。これは炭水化物又は脂質を含有する核酸も含む。

代表的なＤＮＡとしては、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ又はｃｐＤＮＡ）、マイクロサテライトＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ又はｍＤＮＡ）、キネトプラストＤＮＡ（ｋＤＮＡ）、プロウイルス、溶原菌、反復性ＤＮＡ、サテライトＤＮＡ及びウイルス性ＤＮＡが挙げられるが限定されない。

代表的なＲＮＡとしては、１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ又は短いヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、コードＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡ又はｌｎｃＲＮＡ）、サテライトＲＮＡ、ウイルス性サテライトＲＮＡ、シグナル認識粒子ＲＮＡ、低分子量細胞質ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ポリイノシン酸、リボザイム、フレキシザイム、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、スプライスリーダーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ及びウイルス性サテライトＲＮＡが挙げられるが限定されない。

本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の標準的方法により、例えば自動ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているものなど）の使用によって合成され得る。アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを細胞に送達するために多くの方法が開発されており、例えばアンチセンス分子を組織部位に直接注入し得るか、又は所望の細胞を標的とするために設計される、修飾されたアンチセンス分子（ペプチドに連結されるアンチセンス又は受容体に特異的に結合する抗体又は標的細胞表面上で発現される抗原）を全身投与し得る。或いは、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ及びインビボ転写によって、ＲＮＡ分子が作製され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多岐にわたるベクターに組み込まれ得る。或いは、使用されるプロモーターに依存して構成的又は誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡコンストラクトを細胞株に安定に導入し得る。しかし、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することは困難であることが多い。従って、好ましいアプローチは、強力なプロモーターの制御下にアンチセンスオリゴヌクレオチドが置かれる組み換えＤＮＡコンストラクトを利用する。患者において標的細胞に遺伝子移入するためにこのようなコンストラクトを使用することにより、内因性標的遺伝子転写産物との相補的塩基対が形成され、それにより標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を防ぐのに十分な量の１本鎖ＲＮＡの転写が起こる。例えば、細胞により取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を支配するように、ベクターをインビボで導入し得る。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを作製するために転写され得る限り、エピソーム性のままであり得るか又は染色体に組み込まれ得る。このようなベクターは、当技術分野の標準的な組み換えＤＮＡ技術の方法により構築され得る。ベクターは、哺乳動物細胞での複製及び発現のために使用される、プラスミド、ウイルス又は当技術分野で公知の他のものであり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物の、好ましくはヒトの細胞で作用させるための、当技術分野で公知の何れかのプロモーターによるものであり得る。このようなプロモーターは、誘導性又は構成的であり得る。組織部位に直接導入され得る組み換えＤＮＡコンストラクトを調製するために、何れかのタイプのプラスミド、コスミド、酵母人工染色体又はウイルスベクターを使用し得る。

ポリヌクレオチドは、天然の調節（発現制御）配列に隣接し得るか、又は、プロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及び他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、反応エレメント、抑制因子、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’－及び３’－非コード領域などを含め、異種配列を付随し得る。

特定の態様では、本発明によるｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}阻害剤は、薬物投与時のｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}陽性老化細胞の誘導排除のための、特異的なコンストラクトＩＮＫ－ＡＴＴＡＣである。ＩＮＫ－ＡＴＴＡＣトランスジェニックコンストラクトを次のように作製した。ａＰ２－ＡＴＴＡＣトランスジェニックコンストラクトからＦＫＢＰ－Ｃａｓｐ８断片をサブクローニングし（Ｐａｖａｎｉ ＵＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２００５；１１：７９７－８０３）、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入した。マウスｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}プロモーターの２，６１７－ｂｐセグメントをＢＡＣ ＤＮＡからＰＣＲで増幅させて、ａＰ２プロモーターを置き換えた。ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ断片をＡＴＴＡＣの３’に挿入した。このコントラクト（ｃｏｎｔｒｕｃｔ）はＢａｋｅｒ Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｎｏｖ ２；４７９（７３７２）：２３２－２３６に記載されている。

核酸はまた、当技術分野で公知の多くの手段によって修飾され得る。このような修飾の非限定例としては、メチル化、「ｃａｐｓ」、類似体での天然ヌクレオチドの１つ以上の置換及びヌクレオチド間修飾、例えば無電荷の連結（例えばメチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバマートなど）及び電荷結合（例えばホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）があるものが挙げられる。ポリヌクレオチドは１つ以上のさらなる共有結合部分、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－１－リジンなど）、干渉物質（例えばアクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば金属、放射活性金属、鉄、酸化金属など）及びアルキル化剤を含有し得る。ポリヌクレオチドは、メチル又はエチルホスホトリエステル又はアルキルホスホロアミダート結合の形成により誘導体化され得る。さらに、本明細書中のポリヌクレオチドはまた、直接又は間接的の何れかで、検出可能なシグナルを提供可能な標識で修飾され得る。代表的な標識としては、放射性同位元素、蛍光分子、同位体（例えば放射活性同位体）、ビオチンなどが挙げられる。

「アプタマー」は、本明細書中で使用される場合、分子認識の点で抗体に対する代替物に相当する分子のクラスを指す。アプタマーは、高い親和性及び特異性で実質的にあらゆるクラスの標的分子を認識する能力があるオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、ランダム配列ライブラリのＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）を通じて単離され得る。ランダム配列ライブラリは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成により入手可能である。このライブラリでは、各メンバーは、ユニークな配列の、最終的に化学修飾される直鎖オリゴマーである。このクラスの分子の可能な修飾、使用及び長所は、Ｊａｙａｓｅｎａ（１９９９．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．４５（９）：１６２８－５０）により概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法によりコンビナトリアルライブラリから選択される、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）チオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質により提示される、立体構造的に束縛される抗体可変領域からなる。

アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含む「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、それへの結合により５－ＨＴＲ１_ＤｍＲＮＡの翻訳を直接的に阻止するために作用し、従ってタンパク質翻訳を防ぐか又はｍＲＮＡ分解を増加させ、従って、細胞において、５－ＨＴＲ１_Ｄレベル、及び続いて５－ＨＴＲ１_Ｄ活性を低下させる。例えば、少なくとも約１５塩基であり、５－ＨＴＲ１_ＤをコードするｍＲＮＡ転写産物配列のユニークな領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば従来からのホスホジエステル技術により合成され、例えば静脈内注射又は点滴により投与され得る。

配列が当技術分野で周知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用するための方法（例えば米国特許第５，９８１，７３２号明細書、同第６，０４６，３２１号明細書、同第６，１０７，０９１号明細書、同第６，３６５，３５４号明細書、同第６，４１０，３２３号明細書、同第６，５６６，１３１号明細書及び同第６，５６６，１３５号明細書を参照）。

「リボザイム」は、ＲＮＡの特異的な切断を触媒可能な酵素性ＲＮＡ分子を指す。リボザイム作用の機序は、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的なハイブリッド形成、それに続くヌクレオチド鎖切断を含む。５－ＨＴＲ１_Ｄ ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効率的に触媒する改変ヘアピン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、それにより本発明の範囲内で有用である。何らかの潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位は、リボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることによって最初に同定され、これは一般的に次の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを含む。同定したら、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する約１５～２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、不適切なオリゴヌクレオチド配列を与え得る二次構造など、予想される構造特性について評価し得る。候補標的の適切性はまた、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対するそれらの接近性を試験することにより評価され得る。

公知の方法によってアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムの両方を調製し得る。これらは、例えば固相ホスホロアマダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍａｄｉｔｅ）化学合成など、化学合成のための技術を含むが限定されない。或いは、ａｓＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ又はインビボ転写により作製され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多岐にわたるベクターに組み込まれ得る。本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な修飾は、細胞内安定性及び半減期を向上させる手段として導入され得る。可能な修飾としては、分子の５’及び／又は３’末端へのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加又はオリゴヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオアート又は２’－Ｏ－メチルの使用が挙げられるが限定されない。

「ＲＮＡｉ」は、本明細書中で使用される場合、ｐ１６^ＩＮＫ４転写産物に標的化される、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；並びに、細胞内部に存在することにより標的５－ｐ１６^ＩＮＫ４転写産物に対して標的化されるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが産生されるＲＮＡｉベクターが挙げられるが限定されない。このようなｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡは、標的である５－ｐ１６^ＩＮＫ４転写産物の領域に相補的であるＲＮＡの部分を含む。

ＲＮＡ干渉は、多段階工程であり、一般に、標的とされるｐ１６^ＩＮＫ４遺伝子の配列に相同である２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により活性化される。生物の細胞への長鎖ｄｓＲＮＡの導入は、相同遺伝子転写産物の配列特異的な分解につながる。長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、ダイサーとして知られる内因性リボヌクレアーゼの作用により低分子（例えば２１～２３ヌクレオチド）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）へと代謝される。干渉ＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるタンパク質複合体に結合するが、これはヘリカーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性を含有する。ヘリカーゼ活性は、ＲＮＡ分子の２本鎖を解きほぐし、アンチセンス鎖が標的ｐ１６^ＩＮＫ４ＲＮＡ分子に結合できるようにする。エンドヌクレアーゼ活性は、アンチセンス鎖が結合される部位で５－ＨＴＲ１_Ｄ ＲＮＡを加水分解する。従って、ＲＮＡｉは、１本鎖（ｓｓＲＮＡ）ＲＮＡ分子が標的ｐ１６^ＩＮＫ４ＲＮＡ分子に結合し、ｐ１６^ＩＮＫ４ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼを動員するので、アンチセンス作用機序である。

適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡコードベクターを選択するための方法は、配列が既知である遺伝子について、当技術分野で周知である（例えばＴｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．１３（２４）：３１９１－７；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｎａｔｕｒｅ．４１１（６８３６）：４９４－８；Ｈａｎｎｏｎ，２００２．Ｎａｔｕｒｅ．４１８（６８９４）：２４４－５１；ＭｃＭａｎｕｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，２００２．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．３（１０）：７３７－４７；ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２．ＲＮＡ．８（６）：８４２－５０；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９６（５５６７）：５５０－３；米国特許第６，５７３，０９９号明細書及び同第６，５０６，５５９号明細書；及び国際公開第１９９９０３２６１９号パンフレット、同第２００１０３６６４６号パンフレット及び同第２００１０６８８３６号パンフレット）を参照。

さらなる態様では、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤は、ペプチド性リガンド、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}のアンタゴニスト又は、その活性を低下させるｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}タンパク質に直接的若しくはアロステリックに結合可能である低分子の化合物分子、又は定義されるか若しくは未定義の機序を通じてｐ１６^{ＩＮＫ４ａ} ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の発現レベルを低下させ、またその活性を低下させることが可能である低分子の化合物分子を含む群の間で選択される化学物質である。

さらなる態様では、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤はリガンドであり、このリガンドは、抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー又はＶＨＨドメインである。

「抗体」は、本明細書中で使用される場合、抗体が所望の生物学的活性を示す限り、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、単ドメイン抗体、ナノボディー、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片など）、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、多特異性抗体（少なくとも２つのインタクトな抗体から作製される二特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質及び抗原認識部位を含むあらゆる他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれα（アルファ）、δ（デルタ）、ε（イプシロン）、γ（ガンマ）及びμ（ミュー）と呼ばれるその重鎖定常ドメインの同一性に基づき、免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの主要クラス又はそのサブクラス（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）の何れかであり得る。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なるよく知られるサブユニット構造及び三次元立体構造を有する。抗体は裸であってもよいし、又は毒素、放射性同位元素若しくは本明細書中で挙げられる他の具体的な分子の何れかなどの他の分子と複合化されていてもよい。

「モノクローナル抗体」は、単一の抗原性決定基又はエピトープに対する特異性が高い認識及び結合に関与する均一な抗体集団を指す。これは、一般的に異なる抗原性決定基に対する異なる抗体を含む「ポリクローナル抗体」とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクト及び全長モノクローナル抗体の両方、並びに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、１本鎖（ｓｃＦｖ）突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質及び抗原認識部位を含むあらゆる他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現及びトランスジェニック動物を含むが限定されないあらゆる多くの方法で作製されるこのような抗体を指す。「ヒト化抗体」という用語は、最小の非ヒト（例えばマウス）配列を含有するように改変されている非ヒト（例えばマウス）免疫グロブリン由来の抗体を指す。一般的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（例えばマウス、ラット、ウサギ又はハムスター）のＣＤＲからの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンである。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＷ）残基は、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種由来の抗体において対応する残基で置き換えられる。ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性及び／又は能力を洗練し最適化するために、Ｆｖフレームワーク領域中及び／又は置き換えられた非ヒト残基内の何れかでさらなる残基の置換によりさらに修飾され得る。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有する少なくとも１つ及び一般的には２つ又は３つの可変ドメインの実質的に全てを含み、一方で、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのもの、も含み得る。

またさらなる態様では、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（ＰＰＡＲ－γ）アンタゴニストなど又はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アンタゴニスト、ＡＭＰＫ活性化因子、ＳＩＲＴ１活性化因子又はそれらの組み合わせなどの低分子の化合物分子である。

レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アンタゴニストは、次の非限定リストの間で選択され得る：ＵＶＩ３００３、しかしＰＰＡＲガンマアンタゴニストとの組み合わせ、ＨＸ５３１、ＰＡ４５２、ＮＥｔ－３ＩＢ、β－Ａｐｏ－１３－カロテノン、ＬＧ１００７５４、ＡＧＮ１９８５３９３、Ｒｏ２６－５４０５、ＬＧ１０１５０６、ＰＡ４５１、ＰＡ４５２、ＢＩ－１００３、ＢＩ－１００５、ＳＲ１１１７９、ＵＶ１３００３、ＨＸ５３１、ダンスロン、レイン、ベータ－アポ－１３－カロテン、Ｒ－エトドラク、スンディラク（Ｓｕｎｄｉｌａｃ）スルフィド、Ｋ－８００３、Ｋ－８００８、トリプトライド、ＴＲＣ４、ＮＳＣ－６４３５８、フラバスタチン（Ｆｌｖａｓｔａｔｉｎ）、９－シスレチノイン酸、ＰＡ０２４、ＣＤ３２５４、ＬＧ１００７５４、ＵＶＩ３００３、ＨＸ５３１及び“Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ”，Ｍａｓａｋｉ Ｗａｔａｎａｂｅ ａｎｄ Ｈｉｒｏｋｉ Ｋａｋｕｔａ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１８，１９，２３５４に記載の全ての構成成分、ジアゼピニル安息香酸骨格に基づくＲＸＲアンタゴニスト、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）－７－［２－ブトキシ－３，５－ビス（１，１－ジメチルエチル）－フェニル］－３－メチル－２，４，６－オクタトリエン酸、（２Ｅ，４Ｅ，）－（１ＲＳ，２ＲＳ）－５－［２－（３，５－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－２－ブトキシ－フェニル）－シクロプロピル］－３－メチル－ペンタ－２，４－ジエン酸、（２Ｅ，４Ｅ_））－（１ＲＳ，２ＲＳ）－５－［２－（３，５－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－２－エトキシ－フェニル）－シクロプロピル］－３－メチル－ペンタ－２，４－ジエン酸、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）－７－［３_Ｊ５－ビス（１，１－ジメチルエチル）－２－エトキシ－フェニル］－３－メチル－２，４，６－オクタトリエン酸エチルエステル、（２Ｅ，４Ｅ）－３－メチル－５－［２－（２，６，６－トリメチル－シクロへキシ－１－エニルエチニル）－シクロヘプト－１－エニル］－ペンタ－２，４－ジエン酸、（２Ｅ，４Ｅ）－３－メチル－５－［（１ＲＳ，２ＲＳ）－２－（５，５，８₎８－テトラメチル－３－プロポキシ－５，６，７，８－テトラヒドロナフタレン－２－イル）－シクロプロピル］－ペンタ－２，４－ジエン酸、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）－３－メチル－７－（５，５_Ｊ８_Ｊ８－テトラメチル－３－プロポキシ－５，６，７，８－テトラヒドロ－ナフタレン－２－イル）－オクタ－２，４，６－トリエン、又は

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又はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ；ＮＲ１Ｃ１－３）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲｓ；ＮＲ１Ｈ２－３）又はファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ；ＮＲ１Ｈ４）。

次の非限定リスト中でＰＰＡＲ－ガンマ又はＰＰＡＲ－アルファアンタゴニスト、特に脳関門を通過し得るもの（特許データベースをスクリーニング）を選択し得る：ビスフェノールＡジグリシジルエーテル（ＢＡＤＧＥ）、ＧＷ９６６２、イソラムネチン、Ｔ００７０９０７、ＲＵＯ２－クロロ－５－ニトロベンズアニリド、３－［［［２－メトキシ－４－（フェニルアミノ）フェニル］アミノ］スルホニル］－２－チオフェンカルボン酸メチルエステル、Ｎ－（（２Ｓ）－２－（（（１Ｚ）－１－メチル－３－オキソ－３－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）プロプ－１－エニル）アミノ）－３－（４－（２－（５－メチル－２－フェニル－１，３－オキサゾール－４イル）エトキシ）フェニル）プロピル）プロペンアミド、２－クロロ－５－ニトロ－Ｎ－４－ピリジニル－ベンズアミド、ＡＺ６１０２、ＦＨ５３５、フェノフィブリン酸、ＧＳＫ０６６０、ＧＳＫ３７８７。
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低分子ＳＩＲＴ１活性化因子は、次の非限定リストにおいて選択され得る：ニコチンアミド（ＮＡＭ）、カルバ－ＮＡＤ＋、チオアセチル－リジンペプチド及びアセチル化－リジン－ＡＤＰリボース複合物、テノビンス（ｔｅｎｏｖｉｎｓ）、ＭＣ２１４１、ＥＸ－５２７、レスベラトロール、全レスベラトロール類似体、ケルセチン及びケルセチン誘導体、フィセチン、アルキルレゾルシノール、ＳＲＴ１４６０、ＳＲＴ１７２０、ＳＲＴ２１８３及び（脳浸透性）ＳＲＴ３０２５、ＳＴＡＣ－５、ブテイン、ＳＴＡＣ－９、ＳＴＡＣ－１０。

ＡＭＰＫ活性化因子は、次の非限定リストにおいて選択され得る：メトホルミン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、レスベラトロール、ケルセチン、ゲニステイン、エピガロカテキン没食子酸、ベルベリン、クルクミン、ジンセンシド（ｇｉｎｓｅｎｓｉｄｅ）Ｒｂ１、アルファ－リポ酸、クリプトタンシノン、ＡＩＣＡＲ、チエノピリドン、ベンズイミダゾール、サリシクレート（ｓａｌｉｃｙｃｌａｔｅ）、国際公開２０１００３６６１３号パンフレットからのｅｘ２２９、Ａｂｂｏｔｔ Ａ７６９６６２化合物及びＡＩＣＡＲ（５－アミノ－４－イミダゾールカルボキサミドリボシド）、９９１［国際公開２０１００３６６１３号パンフレットからのｅｘ２２９としても知られる）、クチベーター（ｃｔｉｖａｔｏｒ）－３，２－［２－（４－（トリフルオロメチル）フェニルアミノ）チアゾール－４－イル］酢酸、ＣＮＸ－０１２－５７０、ＭＫ－８７２２、

又は

ＦＯＸＯ補助因子（例えばβ－カテニン）又は上流調節因子（例えばＡＭＰＫ、ＳＩＲＴ１）だけでないものを介してＦＯＸＯ因子の活性を刺激する化合物はまた、本発明の化合物の一部でもあり、それらは、非限定的な次のリストから選択され得る：レスベラトロール（Ｐａｒｋｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００５ Ａｐｒ；３７（４）：３４９－５０．Ｅｐｕｂ ２００５ Ｍａｒ ２７．）及び３β－メトキシ－プレグネノロン（ＭＡＰ４３４３）、１７β－エストラジオール（１７βＥ２）、塩化リチウム、イソクエルシトリン（レスベラトロールファーマコフォアを伴うフラボノイド）及びレスベラトロールファーマコフォアを伴う１１種類のフラボノイド類（化合物Ａ～Ｋ）（Ｆａｒｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７ Ｊｕｎ ２１；７（１）：４０１４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１７－０４２５６は以下で示す：

特定の態様では、本発明によるｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}阻害剤は、標的化遺伝子編集のためのポリヌクレオチドである。本発明で企図される遺伝子編集方法の例としては、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に基づく編集システム、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート－Ｃａｓ９ ５ＣＲＩＲ－Ｃａｓ９）、自己不活型ＫａｍｉＣａｓ９システム、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｎｏｖ ２；４７９（７３７２）：２３２－２３６）などが挙げられるが限定されない。

さらなる態様では、本発明はさらに、ＨＤの予防及び／又は処置での使用のための本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤を含む組成物に関する。

本発明はさらに、ＨＤの予防及び／又は処置での使用のための、本発明による少なくとも１つのｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物にも関する。

本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、無毒性固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、封入材料又はあらゆるタイプの処方補助剤を指す。本発明の組成物で使用され得る薬学的に許容可能な賦形剤としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなど、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えばプロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、シリカ、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂が挙げられるが限定されない。

本発明による医薬組成物は、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ＢＨＴ、ソルビン酸カリウム又はロスマリヌス・オフィシナリス（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）抽出物を含むが限定されない抗酸化剤をさらに含み得る。

本発明による医薬組成物は、糖、果実又はお茶の香味料を含むが限定されない香味剤をさらに含み得る。

本発明による医薬組成物は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成されるもの）を含むが限定されない薬学的に許容可能な塩をさらに含み得、この酸付加塩は、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は三価鉄の水酸化物などの無機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基由来でもあり得る。

賦形剤は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物及び植物油、例えばオレイン酸などを含有する溶媒又は分散媒でもあり得る。例えば、レシチン（即ちダイズレシチン又は脱脂ダイズレシチン）などのコーティングの使用によって、分散の場合は求められる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、適正な流動性が維持され得る。

様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって微生物の作用の予防をもたらし得る。

多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。

本発明による医薬組成物の吸収延長のために、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含むが限定されない、吸収を遅らせる物質を添加し得る。

別の態様では、本発明の組成物は、細胞特異的な標的化のためのペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含有し、及び／又は細胞特異的発現を可能にする核酸を含有する。

別の態様では、本発明の組成物又は医薬組成物は、ＨＤを処置するための１つ以上の活性薬剤及び／又は前記活性薬剤の副作用を処置するための１つ以上の薬剤をさらに含む。

本発明はさらに、ＨＤの予防及び／又は処置での使用のための、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤を含む薬剤に関する。

本発明の一実施形態では、ｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、ｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤を含む、組成物、医薬組成物又は（ｏｒ）が、治療的有効量で使用される。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、当業者により決定される用量で投与され、各対象に個々に適合するものである。

本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤の総１日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で担当医師により決定されることが理解されよう。何れかの特定対象に対する具体的な治療的有効量は、処置されている状態及び状態の重症度；使用される具体的な組成物、対象の、年齢、体重、総体的健康状態、性別及び食事；投与時間、投与経路、処置の持続時間；本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤と組み合わせて若しくは同時に使用される薬物；及び医学の技術分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるものより低いレベルで治療用化合物の投与を開始すること及び所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは十分に当技術分野の技術の範囲内であるが；反対に、定常状態血漿濃度により素早く到達させるための方法を初期量で開始し、次に排出過程の影響を的確に代償するために計算される維持用量で続けることは、等しく有用であり得る。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤の治療的有効量は、少なくとも１日１回、少なくとも１日２回、少なくとも１日３回投与されるものである。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤の治療的有効量は、２、３、４、５、６日ごとに投与されるものである。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤の治療的有効量は、週２回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、１カ月に１回投与されるものである。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤の治療的有効量は、毎月、２カ月ごと、３カ月ごと、４カ月ごと、５カ月ごと、６カ月ごと、１年に１回投与されるものである。

一実施形態では、本発明による５ｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤の治療的有効量は、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、１年間という期間又は、例えば数年間又は対象が死亡するまでなど、より長期間にわたり投与されるものである。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、全身的又は局所的に投与されるものである。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、経口、口腔、注射により、経皮的投与により、非経口で、腹腔内に、内視鏡により、局所的に、経皮で、経粘膜で、鼻腔に、吸入噴霧により、直腸に、膣に、気管内に又は埋め込みリザーバーを介して、投与されるものである。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、経口投与されるものである。

経口投与に適応した処方物の例としては、固形形態、液体形態及びゲルが挙げられるが限定されない。

経口投与に適応した固形形態の例としては、丸剤、錠剤、カプセル、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、ドラジェ、顆粒剤、カプレット、圧縮錠剤、カシェ、ウエハ、糖衣コーティングした丸剤、糖衣コーティングした錠剤又は崩壊（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）／若しくは崩壊（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）錠、粉末、経口投与前の液体中の溶液又は懸濁液に適切な固形形態、及び発泡性錠剤が挙げられるが限定されない。

経口投与に適応した液体形態の例としては、溶液、懸濁液、飲用溶液、エリキシル、密封バイアル、薬、水薬、シロップ剤、濃縮溶液及びスプレーが挙げられるが限定されない。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、注射、好ましくは全身注射されるものである。

全身注射に適応した処方物の例としては、液体溶液又は懸濁液、注射前の液体中の溶液に又は懸濁液に適切な固形形態が挙げられるが限定されない。

全身注射の例としては、静脈内、頭蓋内、リンパ内、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、膀胱内、肝内、病巣内、空洞内、点滴技術及び灌流が挙げられるが限定されない。

別の実施形態では、注射されるとき、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は滅菌状態である。滅菌組成物、医薬組成物、薬剤又は栄養補助食品組成物を得るための方法としては、ＧＭＰ合成（ＧＭＰは「製造管理及び品質管理に関する基準（Ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ）」を意味する）が挙げられるが限定されない。

送達系
一実施形態では、本発明による組成物、医薬組成物又は薬剤は、中枢神経系への薬剤の送達を促進する送達系と合わせて使用され得る。例えば、様々な血液脳関門（ＢＢＢ）透過性促進剤を使用して、治療剤に対する血液脳関門の透過性を一過性に及び可逆的に上昇させ得る。このようなＢＢＢ透過性促進剤としては、ロイコトリエン、ブラジキニンアゴニスト、ヒスタミン、タイトジャンクション破壊剤（例えばゾヌリン、ｚｏｔ）、高張液（例えばマンニトール）、細胞骨格収縮剤及び短鎖アルキルグリセロール（例えば１－Ｏ－ペンチルグリセロール）が挙げられるが限定されない。経口、舌下、非経口、埋め込み、鼻腔及び吸入経路は、中枢神経系への活性薬剤の送達を提供し得る。いくつかの実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、末梢神経系への影響を最小限に抑えて中枢神経系に対して投与され得る。

別の実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、エクソソーム、ナノ粒子又はポリマー性ナノ粒子薬物送達系の形態で送達される。

持続放出
一実施形態では、本発明による少なくとも１つのｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、即時放出形態で投与されるものである。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、混合放出形態で投与されるものである。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、腸溶コーティング形態で投与されるものである。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、持続放出形態で投与されるものである。

一実施形態では、本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤は、有効成分の放出を制御する送達系を含む。

一実施形態では、対象は動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、さらにより好ましくはヒトである。

一実施形態では、対象は男性である。一実施形態では、対象は男性又は女性である。

一実施形態では、対象は成人である。

一実施形態では、対象は小児である。

一実施形態では、対象は１０代である。

一実施形態では、対象は１０、１５、１８又は２０歳である。一実施形態では、対象は３０歳を超える。一実施形態では、対象は４０歳を超える。

一実施形態では、対象は５０歳を超える。一実施形態では、対象は５５歳を超える。一実施形態では、対象は６０歳を超える。

一実施形態では、対象は、ＨＤと診断されている／診断された、ＨＤに対する遺伝的素因を呈する／呈した、又はＨＤに罹患している、好ましくはＨＤと診断されている。一実施形態では、対象は既にＨＤ処置を受けた。

予防及び処置
本発明はさらに、ＨＤの予防及び／又は処置を必要とする対象におけるＨＤの予防及び／又は処置での使用のための、ｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物又は薬剤に関する。これは、ＨＤの予防及び／又は処置を必要とする対象に本発明によるｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、組成物、医薬組成物、薬剤又はワクチン組成物を投与することによって、ＨＤを予防及び／又は処置する方法にも関する。

処置を必要とする者としては、障害が既にある者並びに障害を有する傾向がある者又は障害が予防されるべきである者が含まれる。対象又は哺乳動物は、本発明による阻害剤又は組成物の治療量を投与した後に、患者が次の観察可能な及び／又は測定可能な変化の１つ以上：特異的な疾患又は状態と関連する症状の１つ以上に関する寛解、死亡率及び罹患率の低下及びクオリティーオブライフ問題の改善を示す場合、「処置」は成功している。処置の成功及び疾患の改善を評価するためのパラメーターは、例えばＵｎｉｔｅｄ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ（ＵＨＤＲＳ）及び例えばＨｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｂａｔｔｅｒｙ（ＨＤ－ＣＡＢ）などであるが限定されない開発されている他のスケールなどであるがそれらだけではない医師が熟知している通常の手順によって、容易に測定可能である。

本発明はさらに、ｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤、前記ｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤を含む、組成物、医薬組成物又は薬剤の投与を含む、ＨＤの予防又は処置を必要とする対象においてＨＤを予防又は処置する方法に関する。

本発明は、ｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤の投与を含む、ニューロン及び／又はＮＳＣの死滅率の低下を必要とするＨＤ対象においてニューロン及び／又はＮＳＣの死滅率を低下させる方法にも関する。

本発明は、ｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤の投与を含む、慢性及び／又は非適応性の老化応答からＨＤニューロン及び／又はＨＤ ＮＳＣを保護するための方法にも関する。

本発明はさらに、ｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤の投与を含む、ＤＮＡ損傷修復の持続軽減を必要とするＨＤ対象においてＤＮＡ損傷修復の持続を軽減するための方法に関する。

本発明は、ｐ１６^ＩＮＫ４阻害剤の投与を含む、ＨＤニューロンにおいて正常な活性を回復させるための方法にも関する。

本発明による阻害剤又は組成物の治療量を受けた後、患者が早い時期に徴候及び症状を示さないか又は疾患進行が遅くなる場合、予防は成功である。

図１は、ヒトＨＤ及び正常－ＨＴＴ ＮＳＣにおける遺伝子調節レベルのＦＯＸＯ３－ＥＴＳ２、ＥＴＳ２－ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}及びＥＴＳ１－ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}相互作用の特徴に関する。 ｓｉＲＮＡ処置を含む実験において、非標的対照（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡで処理した細胞に対してｍＲＮＡレベルを正規化する。他の実験では、Ｃ１１６細胞又は増殖因子（ＧＦ）欠乏がない細胞に対してｍＲＮＡレベルを正規化する。ｎｓ、有意性なし。 （Ａ）ＧＦ欠乏に供されるＨＤ ＮＳＣにおけるＦＯＸＯ３低下によって、ＥＴＳ２ ｍＲＮＡレベルが上昇し、基底状態でも正常ＨＴＴ細胞でも影響は観察されない（左パネル：^＊Ｐ＜０．０５）。ＥＴＳ２ ｍＲＮＡレベルはＨＤ ＮＳＣにおいて低下する（中央パネル：^＊＊Ｐ＜０．０１）。ＧＦ欠乏によって、Ｃ１１６ ＮＳＣではＥＴＳ２ ｍＲＮＡレベルは変化せず、ＨＤ ＮＳＣではＥＴＳ２ ｍＲＮＡレベルが低下する（右パネル：^＊Ｐ＜０．０５）。 （Ｂ）基底状態のＨＤ ＮＳＣで及びストレスを受けた細胞ではＥＴＳ２低下によってｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}ｍＲＮＡレベルが低下し、正常ＨＴＴ細胞では影響が検出されない（左パネル：^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１）。ＨＤ ＮＳＣにおいてｐ１６^{ＩＮＫ４ａ} ｍＲＮＡレベルが上昇する（中央左パネル：^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。ＧＦ欠乏によって、Ｃ１１６ ＮＳＣではｐ１６^{ＩＮＫ４ａ} ｍＲＮＡレベルは変化せず、ＨＤ ＮＳＣではｐ１６^{ＩＮＫ４ａ} ｍＲＮＡレベルが低下する（中央右パネル：^＊Ｐ＜０．０５）。ＧＦ欠乏に供されたＨＤ ＮＳＣにおいて、ＦＯＸＯ３ノックダウンによってｐ１６^{ＩＮＫ４ａ} ｍＲＮＡレベルが上昇する傾向がある（右パネル：Ｐ＝０．０７３６で有意ではない）。 （Ｃ）基底状態のＣ１１６ ＮＳＣにおいて及び基底及びストレスの両状態のＨＤ ＮＳＣにおいて、ＥＴＳ１低下によってｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}ｍＲＮＡレベルが低下する（左パネル：^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１）。Ｃ１１６ ＮＳＣと比較してＨＤにおいてＥＴＳ１ ｍＲＮＡレベルは変化しない（中央パネル）。ＧＦ欠乏によって、Ｃ１１６ ＮＳＣではＥＴＳ１ ｍＲＮＡレベルが変化せず、ＨＤ ＮＳＣではＥＴＳ１ ｍＲＮＡレベルが低下する（右パネル：^＊Ｐ＜０．０５）。 （Ｄ）ＥＴＳ２－ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}経路におけるＦＯＸＯ３標的再プログラミングの効果に対する作業モデル。 図２は、ヒトＨＤプレパターン化ＮＳＣにおいて、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}のレベル上昇を説明し、ＳＡ－β－ｇａｌ活性上昇を特徴とする老化表現型を示す。 （Ａ）ＨＤプレパターン化ＮＳＣにおいてｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}ｍＲＮＡレベルが上昇する。データは平均±ＳＤ（^＊＊Ｐ＜０．０１）、Ｎ＝３である。 （Ｂ）ＨＤ ＮＳＣにおける中程度ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}上昇に対する代表的画像。全パネルのスケールバー：１００μｍ。 （Ｃ）Ｎ＝５３２ Ｃ１１６ ＮＳＣ及びＮ＝１０００ ＨＤ ＮＳＣに対する核ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}ピクセル強度の定量。データは平均±ＳＤ（^＊＊Ｐ＜０．０１）である。 （Ｄ）ＨＤ ＮＳＣにおけるＳＡ－β－ｇａｌ活性の発現上昇に対する代表的画像。全パネルのスケールバー：２００μｍ。 （Ｅ）Ｎ＝５４７個のＣ１１６ ＮＳＣ及びＮ＝６４５個のＨＤ ＮＳＣに対するＳＡ－β－ｇａｌ活性の定量。データは平均±ＳＤ（^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）である。 （Ｆ）パネルＥで示されるデータに対するＳＡ－β－ｇａｌシグナルの度数分布。 図３は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}のレベル上昇及びＳＡ－β－ｇａｌ活性上昇も他の非アイソジェニックなＨＤ ＮＳＣ株の特徴であることを示す。 （Ａ）対照ＮＳＣにおけるＲＴ－ＰＣＲ分析により決定される場合のｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}ｍＲＮＡレベル（青いバー；ＭＮ０８ｉ－３３１１４．Ｂ及びＮＤ４２２４１）及びＨＤ ＮＳＣ（赤いバー；ＮＤ４１６５６－ＣＡＧ５７及びＮＤ４２２２２－ＣＡＧ１０９）。データは平均±ＳＤ（Ｎ＝３）である。^＊＊＊Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡ；テューキー多重比較検定）。 （Ｂ）免疫蛍光分析は、ＨＤ ＮＳＣにおけるｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}のロバストな上昇を明らかにする。全パネルでのスケールバー：１００μｍ。 （Ｃ）対照ＮＳＣ（ＭＮ０８ｉ－３３１１４．Ｂ及びＮＤ４２２４１）と比較した、ＨＤ ＮＳＣ（ＮＤ４１６５６－ＣＡＧ ５７；ＮＤ４２２２２－ＣＡＧ１０９）におけるＳＡ－β－ｇａｌ活性の発現上昇を示す代表的画像。１０Ｘ拡大率。全パネルでのスケールバー：２００μｍ。 図４は、ヒトＨＤ ＭＳＮにおいてｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}発現が上昇することを示す。 （Ａ）規定の促進培地（Ｓｙｎａｐｔｏｊｕｉｃｅ ｍｅｄｉｕｍ）を使用してＮＳＣから調製されるヒトＭＳＮの代表的画像。 （Ｂ）Ｃ１１６及びＨＤ ＭＳＮにおけるｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}、ＦＯＸＯ３及びＲｙｋのＲＴ－ＰＣＲ分析から、ＨＤ ＭＳＮにおける、ＦＯＸＯ３ ｍＲＮＡレベルの中程度の上昇並びにｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}及びＲｙｋ ｍＲＮＡレベルのロバストな上昇が明らかになる。データは平均±ＳＤ（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１）である。Ｎ＝３。 （Ｃ）免疫蛍光分析から、ＨＤ ＭＳＮにおけるｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の劇的な上昇が明らかになる。全パネルのスケールバー：１００μｍ。 （Ｄ）Ｎ＝５９６ Ｃ１１６ ＮＳＣ及びＮ＝６０９ ＨＤ ＮＳＣに対する核ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}ピクセル強度の定量。データは平均±ＳＤ（^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）である。 （Ｅ）パネルＤで示されるデータに対する核ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}シグナルの度数分布。 図５は、ＦＯＸＯ３及びｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}がヒトＨＤ神経幹細胞の脆弱性を逆に調整することを示す。 細胞増殖アッセイにおいて、二元配置ＡＮＯＶＡを使用して有意性を検定した。細胞脆弱性アッセイにおいて、スチューデントのｔ検定を使用して有意性を検定した。ｎｓ：有意性なし。 （Ａ）ヒトＨＤ ＮＳＣは細胞増殖速度の低下を示す。データは平均±ＳＥＭである。 （Ｂ）ＦＯＸＯ３低下により、Ｃ１１６ ＮＳＣの増殖は変化しない（左パネル）。ＦＯＸＯ３低下は、ヒトＨＤ ＮＳＣの増殖を強く減弱させ（右パネル）、ＨＴＴ ｍＲＮＡレベルでは変化は検出されない（図６Ｃ、左パネル参照）。データは平均±ＳＥＭである。 （Ｃ）ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の低下により、Ｃ１１６（左パネル）及びＨＤ（右パネル）ＮＳＣの増殖が僅かに上昇する。ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の低下により、ＨＤ ＮＳＣにおいてＨＴＴ ｍＲＮＡレベルは変化しない（図６Ｃ、右パネル参照）。データは平均±ＳＥＭである。 （Ｄ）ＦＯＸＯ３の低下により、ヒト ＨＤ ＮＳＣの死滅率が上昇し、Ｃ１１６ ＮＳＣでは影響は検出されない（左パネル：^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１）。ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の低下により、ヒトＨＤ ＮＳＣの死滅率が低下し、Ｃ１１６ ＮＳＣでは影響は検出されない（右パネル：^＊Ｐ＜０．０５）。 図６は、ｓｉＲＮＡでの処理時の遺伝子標的発現レベル及びＦＯＸＯ３の低下又はｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の低下時のＨＴＴ発現レベルを示す。データは平均±ＳＤである。（Ａ）ｓｉＲＮＡ処理ＨＤ及び正常ＨＴＴ ＮＳＣにより、ＦＯＸＯ３ ｍＲＮＡレベルが低下する。ＮＴＣ ｓｉＲＮＡと比較して^＊＊Ｐ＜０．０１及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１。図５に関連。（Ｂ）ｓｉＲＮＡ処理ＨＤ及び正常ＨＴＴ ＮＳＣにより、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ} ｍＲＮＡレベルが低下する。非特異的な対照ｓｉＲＮＡ処理と比較して^＊＊＊Ｐ＜０．００１。図５に関連。（Ｃ）ＨＤ ＮＳＣにおいてＦＯＸＯ３又はｐ１６^{ＩＮＫ４ａ} ｓｉＲＮＡ処理により、ＨＴＴ ｍＲＮＡレベルは変化しない。ｎｓ、有意性なし。 図７は、ＨＤ ＮＳＣ及びＭＳＮにおいて評価される老化の適切なマーカーを示す。 （Ａ）Ｃ１１６ ＮＳＣと比較して、ＨＤにおいてｐ２１^ＣＩＰ１ ｍＲＮＡレベルが低下する（^＊＊Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）Ｃ１１６ ＮＳＣと比較して、ＨＤにおいてｐ２７^ＫＩＰ１ｍＲＮＡレベルは変化しない。ｎｓ、有意性なし。（Ｃ）Ｃ１１６ ＮＳＣと比較して、ＨＤにおいてＭＭＰ－３ｍＲＮＡレベルが上昇する（^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｄ）免疫蛍光分析から、Ｃ１１６ ＭＳＮと比較して、ＨＤ ＭＳＮの核からのＨＭＧＢ１の欠乏が明らかになる。全パネルのスケールバー：１００μｍ。（Ｅ）Ｎ＝４３７ Ｃ１１６ ＮＳＣ及びＮ＝４９１ ＨＤ ＮＳＣに対する核ＨＭＧＢ１ ピクセル強度の定量。データは平均±ＳＤ（^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）である。 図８は、非標的ｓｈＲＮＡ（ＣＴＲ）又はｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に対するｓｈＲＮＡ（ｐ１６）を安定して発現するＨＤ及び対照（Ｃ１１６）ＮＳＣにおける酸化ストレスに応答したＤＮＡ損傷修復（ＤＤＲ）機構のマーカーであるγＨ２ＡＸの発現を示す。非標的ｓｈＲＮＡ（ＣＴＲ）又はｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に対するｓｈＲＮＡ（ｐ１６）を安定して発現するＨＤ及び対照（Ｃ１１６）ＮＳＣの何れも４００ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２で１時間処理するか又は未処理のままにする（酸化ストレスは軸の下で示される）。次に、処理した細胞Ｃ１１６及びＨＤを洗浄し、２４時間にわたり培養に戻す。次にγＨ２ＡＸに対する免疫蛍光のために全細胞を処理した。次に核γＨ２ＡＸの斑点を数え、プロットした。ボールド体の数字は、未処理細胞に対する核γＨ２ＡＸ斑点の倍率変化を示す。統計のためにＴ検定を使用した。^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ．ｓ．：有意性なし。データは全部で４５～８７個の細胞に対する平均±ＳＤである。 図９は、非標的ｓｈＲＮＡ（ＣＬＴＲ）、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈｐ１６）又はｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}及びｐ１４^ＡＲＦの両方の発現を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＣＤＫＮ２ａ）を安定して発現するＨＤ及び対照（Ｃ１１１６）ＮＳＣから分化したＭＳＮにおけるＦＯＳＢ（ｑＰＣＲ）の発現を示す。未処理（ＵＴ、黒いバー）試料を除き、指定のｓｈＲＮＡを安定して発現するＮＳＣから分化したＭＳＮに５μＭエトポシド（Ｅｔｏｐ．）を１時間適用した。次に、細胞を洗浄し、指定の回復時間、培養に戻した（点線バー、指定されるように左から右へ回復時間が長くなる：左から右へ：０時間、０．５時間、１時間、３時間）。次に全試料をＲＴ－ｑＰＣＲ用に処理し、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴの発現に対してＦＯＳＢ発現を正規化した。データは平均±ＳＤである。

実施例
本発明を次の実施例によりさらに例示する。

実施例１：材料及び方法
細胞培養
発明者らは、ＨＤ患者（女性、２０歳：７２Ｑ／１９Ｑ）由来のヒトｉＰＳＣ及びそのＣＡＧ修正対応物（２１Ｑ／１９Ｑ：Ｃ１１６）を使用した［Ａｎ ＭＣｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１２；１１（２）：２５３－６３］。これらの細胞を記載のようにＮＳＣに分化させた［Ｒｉｎｇ ＫＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｉａｔａｌ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｈｔｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５；５（６）：１０２３－３８］。簡潔に述べると、ＲｅＬｅｓＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でｉＰＳＣを継代し、ｂＦＧＦを含まないＥＳ培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、２．４８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１Ｘ ＮＥＡＡ、１５．４ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０μＭ β－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び４ｎｇ／ｍｌ塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、１００－１８Ｂ）を補給したＥｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ：ＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ））中で低吸着ペトリ皿（０，１％アガロースでコーティング）にて細胞塊を培養した。２日ごとにＥＳ培地の２５％をＥＢ分化培地（２０％ＦＢＳ、１Ｘ非必須アミノ酸、５０μＭ β－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ）により置き換えた。第８日に、培地の１００％が胚様体（ＥＢ）培地となった。第１０日に、神経誘導培地（１Ｘ Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ／Ｆ１２）及び２５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ中でポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン（それぞれｐＯ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ４９５７及びＬ２０２０）コーティングした皿にＥＢを付着させた。培地を２日ごとに交換した。１０～１２日後に、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｎｅｕｒａｌ Ｒｏｓｅｔｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してロゼットを採取し、完全神経増殖培地（ＮＰＭ）（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ、１Ｘ Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、２５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ白血病阻害因子（ＬＩＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００－０５）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中でｐＯ／Ｌコーティングプレート上に播種した。ＮＳＣマーカーであるネスチンに対する（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１：２００）及びＳＯＸ１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１：５０）に対する抗体及びｉＰＳＣマーカーＯＣＴ３／４に対する抗体（Ｐｉｅｒｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１：５００）を使用して、免疫蛍光によってＮＳＣへの分化のレベルを試験した。全実験にわたるＮＳＣへの分化のレベルは少なくとも９８％であった。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）により行われるマルチカラーＦＩＳＨ分析を使用して実験を行う前にゲノムの完全性に対してｉＰＳＣ株を検証した。プレパターン化アクチビンＡ ＮＳＣを作製するために、第１０日にＥＢ段階開始後、上のプロトコールを使用して作製したＮＳＣを一貫して２５ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）中で維持した。

前述のＮＳＣ（実施例５、図９）からＭＳＮを作製するために、以前に記載のように細胞培養３週間にわたり低分子のカクテルを使用した［Ｔｅｌｅｚｈｋｉｎ Ｖｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｒｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ｅｘｉｔ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＢＡＡ，ＣＲＥＢ，ａｎｄ ＧＳＫ３β ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１６ Ａｐｒ １；３１０（７）：Ｃ５２０－４１．］。β３－チューブリンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１：５００）及びＧＡＢＡに対する抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１：５００）を用いた免疫蛍光を使用してＭＳＮの分化を評価した。平均で、発明者らの分化集団において細胞の＞８０％がＭＳＮ（β３－チューブリン及びＧＡＢＡを発現）であった。

非アイソジェニックなＨＤ及び対照ｉＰＳＣ株ＮＤ４１６５６（ＣＡＧ５７）、ＮＤ４２２２２（ＣＡＧ１０９）、ＮＤ４２２４１は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから、ＭＮ０８ｉ－３３１１４．Ｂ株はＷｉＣｅｌｌから入手した。マニュアルの指示通り、ＰＳＣ神経誘導培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＮＳＣ株を作製した。簡潔に述べると、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼを使用して、ｍＴｅＳＲ中で培養したｉＰＳＣを回収した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：６０希釈、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした６０ｍｍ皿にコロニーを移し、７日間にわたり１μＭ ＬＤＮ－１９３１８９及び１０μＭ ＳＢ４３１５４２を補給したＰＳＣ神経誘導培地中で培養して、神経上皮運命を誘導した。次に、これらの細胞を回収し、２５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補給した神経増殖培地（ＰＳＣ神経誘導培地及びＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（１：１）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭ Ｌ－グルタミン）中で増やした。

遺伝子発現分析
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してトータルＲＮＡを細胞から単離し、製造者の説明書キット（Ａｍｂｉｏｎ）に従いＤＮＡフリーＤＮＡ除去キットを使用してＤＮａｓｅ処理した。製造者の説明書に従い、ＲｅｖｅｒｔＡＩＤ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ１６２２）を使用して、等量のトータルＲＮＡ（１μｇ）を逆転写した。ファーストストランドｃＤＮＡを希釈し、リアルタイム定量的ＰＣＲ分析で鋳型として使用した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＧｏＴａｑ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａ６００２）を使用するｑＲＴ－ＰＣＲを行った。次のプライマーを使用して３つ組でｑＲＴ ＰＣＲ実験を行った：ＦＯＸＯ３：フォワード：５’－ＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＧＡＡ－３’（配列番号１）、リバース：５’－ＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＡＡＧＴＴ－３’（配列番号２）；Ｒｙｋ：フォワード：５’－ＣＣＡＣＴＴＣＴＡＣＧＣＧＴＧＴＧＴＴＴ－３’（配列番号３）、リバース：５’－ＧＣＣＣＴＴＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣ－３’（（配列番号３６）；ｐ１６^ＩＮＫ４：フォワード：５’－ＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧ－３’（配列番号４）、リバース：５’－ＧＣＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧ－３’（配列番号５）；ｐ１４^ＡＲＦ：フォワード：５’－ＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＡＣＴＧ－３’（配列番号６）、リバース：５’－ＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＡ－３’（配列番号７）；ＣＤＫＮ２ＡＩＰ：フォワード：５’－ＧＴＧＴＡＴＡＧＧＧＴＣＧＧＣＣＡＴＣＡＡ－３’（配列番号８）、リバース：５’－ＣＣＴＧＣＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＴＧＡＧＡＧ－３’（配列番号９）；ＳＥＲＴＡＤ１：フォワード：５’－ＣＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＴ－３’（配列番号１０）、リバース：５’－ＡＧＴＧＴＴＣＡＣＧＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡ－３’（配列番号１１）；ＥＴＳ２：フォワード：５’－ＣＴＧＧＧＣＡＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＣＣＣ－３’（配列番号１２）、リバース：５’－ＣＣＡＧＡＣＴＧＡＡＣＴＣＡＴＴＧＧＴＧＧ－３’（配列番号１３）；ＥＴＳ１フォワード：５’－ＧＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＣＧＴＧＧＴＡＡＡ－３’（配列番号１４）、リバース：５’－ＣＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧ－３’（配列番号１５）；ｐ２１^ＣＩＰ１：フォワード：５’－ＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧ－３’（配列番号１６）、リバース５’－ＣＣＧＣＣＡＴＴＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣＡＧ－３’（配列番号１７）；ｐ２７^ＫＩＰ１：フォワード：５’－ＴＡＡＴＴＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴ－３’（配列番号１８）、リバース：５’－ＴＧＣＡＧＧＴＣＧＣＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣ－３’（配列番号１９）；ＨＲＰＴ：フォワード：５’－ＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＡＧＧ－３’（配列番号２０）リバース：５’－ＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＣＡ－３’（配列番号２１）；ＡＣＴＢ：フォワード：５‘－ＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡ－３’（配列番号２２）、リバース：５’－ＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＴＡＧ－３’（配列番号２３）；ＦＯＳＢ：フォワード：５’－ＴＧＡＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＣＣＡＡＧＡＣＣＣ－３’（配列番号３４）、リバース：５’－ＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＣＡＴＣＡ－３’（配列番号３５）。９５℃で１０分間、この後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒及び７２℃で３０秒を４０サイクルでＱＲＴ－ＰＣＲを行った。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ）及びアドバンスト相対定量（ａｄｖａｎｃｅｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を使用して、データを分析した。３回の測定に対する平均サイクル閾値（Ｃｔ）の値により遺伝子発現を定量した。２－ΔΔＣｔ式に従い、２つのハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ及びＡＣＴＢ）に対して標的遺伝子発現を正規化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６を使用して統計分析（二元配置ＡＮＯＶＡ及びｔ検定）を行った。

アクチビンＡ及びＭＳＮの生化学分析のために、ＩＳＯＬＡＴＥ ＩＩ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して、トータルＲＮＡをＮＳＣ及びＭＳＮから単離した。ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して２０μｌの総反応体積で１μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。１０μｌの総体積で２Ｘ ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ Ｐｒｏｂｅ Ｎｏ－ＲＯＸキット（Ｂｉｏｌｉｎｅ）及び１μｌ ｃＤＮＡ／反応を使用して、３８４ウェル方式でＲＴ－ＰＣＲ反応を組み立てた。Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０機器上でＲＴ－ＰＣＲを行った。定量のために、二次微分最大値法（ｓｅｃｏｎｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｍｅｔｈｏｄ）を使用することにより、各増幅の閾値サイクル、Ｃｔを決定した。２^{－ΔΔＣｔ}法を使用して、ハウスキーピング遺伝子ｂ－アクチンに対して正規化された各遺伝子の相対発現レベルを決定した。使用したプライマーは次の通りであった：ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}：フォワード：５’－ＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣ－３’（配列番号２４）、リバース：５’－ＣＧＴＡＡＣＴＡＴＴＣＧＧＴＧＣＧＴＴＧ－３’（配列番号２５）、プローブ６７及びフォワード：５’－ＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＧＡＡＴＡ－３’（配列番号２６）、リバース：５’－ＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣＴ－３’（配列番号２７）、プローブＦＡＭ；ＦＯＸＯ３：フォワード：５’－ＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡ－３’（配列番号２８）、リバース：５’－ＣＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴＴＧ－３’（配列番号２９）、プローブ１１；ＭＭＰ３：フォワード５’－ＧＣＴＧＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＣＴＣＴＴＴＴＧＣＡＧＴ－３’（配列番号３０）、リバース：５’－ＣＡＴＡＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＡ－３’（配列番号３１）、プローブ８５。

ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}、γＨ２ＡＸ及びＨＭＧＢ１の免疫蛍光分析及び定量
８ウェルＮｕｎｃ Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において播種したＮＳＣ（及びＭＳＮに分化させたもの）を４％パラホルムアルデヒドで室温（ＲＴ）にて１５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ中で１５分間、ＲＴにて０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で細胞を透過処理し、次にＰＢＳで２回洗浄した。ＲＴで３０分間、ＰＢＳ中５％ロバ血清及び１％ＢＳＡを使用して、ブロッキング処理を行った。細胞をＰＢＳで洗浄し、一次抗体とともに４℃にて一晩温置し、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光二次抗体とともに暗所でＲＴにて２時間温置した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともにＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅを使用してカバースリップを載せた。スライドをＲＴにて暗所で２４時間硬化させ、Ｐｌａｎ Ａｐｏλ２０Ｘ／０．７５対物レンズを使用してＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｕ顕微鏡上でイメージングを行った。次のものに対する一次抗体、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}（Ａｂｃａｍ、ａｂ１０８３４９）、ＨＭＧＢ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ１８２５６）及びネスチン（ＳＣＢＴ、ｓｃ－２３９２７）を１：１００希釈で使用した。γＨ２ＡＸに対する一次抗体（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０５－６３６）を１：１０００希釈で使用した。二次Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。Ｇｅｎ５ソフトウェアを使用して画像分析を行った。ＴＩＦＦ画像をモノクロ画像に変換し、ＤＡＰＩ染色核を使用して一細胞分析を行い、関心のある領域を定めた。

老化関連β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）染色
２５ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＡＦ－１２０－１４Ｅ）を添加して、上記のようにＮＳＣを培養した。老化染色キット（＃９８６０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＮＳＣを染色した。ＤＡＰＩで核を染色し、上記のようにカバースリップを載せた。Ｌｉｏｎｈｅａｒｔ ＦＸ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ及び１０Ｘ Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒｉｔｅ ＷＤ １０ ＮＡ ０．３対物レンズを使用して画像を捕捉した。Ｇｅｎ５ソフトウェアを使用して画像解析を行った。ＴＩＦＦ画像をモノクロ画像に変換し、ＤＡＰＩ染色核を使用して一細胞分析を行い、関心のある領域を定め、平均ＳＡ－β－ｇａｌ強度／細胞を定量した。

ＭＳＮへのヒトＮＳＣの分化
６０ｍｍ皿又は６ウェルプレートを１００μｇ／ｍｌポリ－Ｄ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ６４０７）でコーティングし、次にＭａｔｒｉｇｅｌ（１：６０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした。ＮＳＣを播種し、ＮＰＭ中で培養した。コンフルエント時に、１週間にわたりＳｙｎａｐｔｏｊｕｉｃｅ Ａ培地でＮＳＣを処理し、続いてＳｙｎａｐｔｏｊｕｉｃｅ Ｂ培地により３７℃で１０日間処理した［７１］。２５ｎｇ／ｍｌアクチビンＡをＳｙｎａｐｔｏｊｕｉｃｅ Ａ及びＳｙｎａｐｔｏｊｕｉｃｅ Ｂ培地の両方に添加した。２日ごとに半量の培地交換を行った。次のものに対する抗体を使用した免疫蛍光によって、得られたＭＳＮの特徴を評価した：β－ＩＩＩ－チューブリン（ＳＣＢＴ、ｓｃ－８０００５）、ＤＡＲＰＰ－３２（ＳＣＢＴ、ｓｃ－１１３６５）、カルビンディンＤ－２８Ｋ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ９８４８）、ＧＡＢＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ２０５２）、ＭＡＰ２（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ５６２２）。ＭＳＮはこれらのマーカーに対して陽性標識された。ＤＡＲＰＰ－３２発現もＲＴ－ＰＣＲにより判定した。

ヒト神経幹細胞の遺伝子移入
ＦＯＸＯ３ ｓｉＲＮＡ（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ＋ＳＭＡＲＴプール、Ｌ－００３００７－００－００２０）、ＥＴＳ１ ｓｉＲＮＡ（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ＋ＳＭＡＲＴプール、Ｌ－００３８８７－００－０００５）、ＥＴＳ２ ｓｉＲＮＡ（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ＋ＳＭＡＲＴプール、Ｌ－００３８８８－００－０００５）及び陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ＋非標的対照プール、Ｄ－００１８１０－１０－２０）はＤｈａｒｍａｃｏｎ（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から入手した。以前に検証したＣＤＫＮ２ＡのｓｉＲＮＡ標的エクソン１は、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ} ｓｉＲＮＡ－１（配列番号３２：５’－ＡＡＣＧＣＡＣＣＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＧＴ－３’）［Ｋａｎ ＣＹ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ１６（ＩＮＫ４ａ）ｄｕｒｉｎｇ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０１２；３１（４６）：４８１５－２７ｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ１６（ＩＮＫ４ａ）ｄｕｒｉｎｇ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０１２；３１（４６）：４８１５－２７］及びｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ} ｓｉＲＮＡ－２（配列番号３３：５’－ＣＵＧＣＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＧＡＡＵＡ－３’）［Ｌｅｊｅｕｎｅ ＦＸ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡｉ ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２０１２；１３：９１．Ｅｐｕｂ ２０１２／０３／１５］及び非特異的対照４７％ＣＧ ｓｉＲＮＡはＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから入手した。製造者の指針に従い、Ｎｅｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １００μｌキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＭＫ１００９６）を使用してヒトＮＳＣに対して遺伝子移入を行った。簡潔に述べると、Ｓｔｅｍｐｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１１０５０１）を用いて細胞を回収し、ＤＰＢＳで洗浄し、緩衝液Ｒ中で細胞２ｘ１０^７個／ｍｌで再懸濁した。細胞２ｘ１０^６個を２５０ｎＭ ｓｉＲＮＡと混合した。エレクトロポレーションのために使用した条件は、パルス電圧１４００Ｖ、パルス幅２０ｍｓ及び２パルスであった。２ｍＬの抗生物質なしの予め温めた増殖培地を用いて６ウェルマトリゲルコーティングプレートに細胞を播種し、３７℃で温置した。遺伝子移入４８時間後に、トータルＲＮＡ抽出前に６時間にわたり、ｂＦＧＦ及びＬＩＦなしの培地に完全ＮＰＭを置き換えた。

細胞増殖アッセイ
遺伝子型ごとに６ウェルずつ、細胞０．５～１ｘ１０^５個／ウェルで２４ウェルプレートにヒトＮＳＣを播種した。３７℃及び５％ＣＯ_２で１、２、３、４及び５日後、製造者のプロトコールに従い、１０％ｖ／ｖ ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＤＡＬ１０２５）を含有する５００μＬ新鮮培地で培地を置き換えた。次に、プレートを３７℃で３時間温置した。読み取りのために、各ウェルからの１００μｌを９６ウェルプレートに移した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ５００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｉｏｓ）を使用して、蛍光（５５０及び５９５ｎｍの励起及び発光波長）を測定した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）の１００％還元型、（即ち１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた１０％ｖ／ｖＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）を含有する培地）を陽性対照として使用した。１０％ｖ／ｖＡｌａｍａｒＢｌｕｅを含有する培地があり細胞がないウェルを陰性対照として使用した。第Ｘ日の試料のＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）蛍光シグナル－陰性対照のシグナルとして、各遺伝子型及び各日に対する相対蛍光強度を計算した。Ｐｒｉｓｍ ｖ６を使用して統計分析（二元配置ＡＮＯＶＡ）を行った。

細胞脆弱性アッセイ
細胞遺伝子移入４８時間後に行った場合、ヒトＮＳＣを２４時間の増殖因子欠乏に供し（上記のようなエレクトロポレーションによる）、その後、製造者の説明書に従い、ＡｐｏＬｉｖｅ－Ｇｌｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ６４１０）を使用して細胞生存能及びカスパーゼ－３／７活性を検出した。簡潔に述べると、１０μｌの試薬（ＧＦ－ＡＦＣ基質）を各ウェルに添加し、プレート振盪器で３０秒間穏やかに混合した。３７℃で３０分間の温置後、プレートリーダーＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ（３６０ｎｍでＥｘ、４９０ｎｍでＥｍ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して蛍光を測定した。次に、５０μｌのカスパーゼ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬を各ウェルに添加し、３０秒間穏やかに混合した。次にこれらのプレートを室温で３０分間温置し、プレートリーダーＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して各試料の発光を測定した。点あたり５回の反復を使用してカスパーゼ－３／７アッセイを行い、データは、カスパーゼ－３／７活性（ＲＬＵ）を細胞生存能（ＲＦＵ）で除したものとして表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６を使用して統計分析（スチューデントｔ検定）を行った。

統計
スチューデントのｔ検定、テューキーの多重比較検定により多重検定に対して補正した一元配置ＡＮＯＶＡ又は二元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計を行った。少なくとも３回全実験を反復した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。

実施例２：プレパターン化ＨＤ ＮＳＣは、線条体ニューロンにおいて細胞老化特性を示す。
ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}がストレス応答における細胞老化の重要なエフェクターであると仮定すると［Ｂａｋｅｒ ＤＪ，Ｃｈｉｌｄｓ ＢＧ，Ｄｕｒｉｋ Ｍ，Ｗｉｊｅｒｓ ＭＥ，Ｓｉｅｂｅｎ ＣＪ，Ｚｈｏｎｇ Ｊ］、発明者らの結果（図１Ａ～Ｄ）から、ＦＯＸＯ３標的再プログラミングの１つの結果が、一連のニューロン分化においてＨＤ ＮＳＣにより獲得される細胞老化特性に対抗することであるという可能性が生じる。従って発明者らは、アクチビンＡ背腹側プレパターン化Ｃ１１６及びＨＤ細胞においてｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}発現をアッセイした（図２）。アクチビンＡがヒトｉＰＳＣの線条体突起ニューロン分化を効率的に指揮することが報告されているので、この目的で、発明者らはアクチビンＡ誘導性背腹側プレパターン化を使用した［Ｂｉｓｗａｓ ＳＣ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｉｙｉｒｈｉａｒｏ Ｇ，Ｗｉｌｌｅｔｔ ＲＴ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｙ，Ｃｒｅｇａｎ ＳＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｒｔａｄ１ ｐｌａｙｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎ ｄｅａｔｈ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１０；３０（１１）：３９７３－８２］。Ｃ１１６プレパターン化ＮＳＣと比較して、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}ｍＲＮＡレベルがＨＤで上昇した（図２Ａ）。対応して、ＩＣＣにより測定した場合、Ｃ１１６ ＮＳＣと比較して、プレパターン化ＨＤにおいてｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}陽性細胞のレベルがより高かった（図２Ｂ及び２Ｃ）。さらに、広く使用される推定上の老化マーカーである老化関連β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）活性は、ＨＤにおいて、Ｃ１１６ ＮＳＣと比較してより高かった（図２Ｄ、２Ｅ及び２Ｆ）。次に、発明者らは、さらなる非アイソジェニックなＨＤ ｉＰＳＣ（即ちＮＤ４１６５６及びＮＤ４２２２２）及び対照ｉＰＳＣ（即ちＭＩＮ０８ｉ－３３１１４．Ｂ及びＮＤ４２２４１）株由来のＮＳＣにおいて細胞老化について試験した。アイソジェニックなＮＳＣモデルでの発明者らの以前の知見と一致して、発明者らは、非アイソジェニックなＨＤ ＮＳＣ株において、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}発現のロバストな上昇（図３Ａ及び３Ｂ）及びＳＡ－γ－ガラクトシダーゼ活性上昇（図３Ｃ）を報告する。これらの結果は、ＨＤ ＮＳＣにおける細胞老化がＨＤ突然変異の存在に直接起因し、アイソジェニックなＨＤ ＮＳＣにより示される老化表現型がクローン依存性（ｃｌｏｎａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ）の結果であるという可能性を排除し得ることを実証する。

発明者らは、ＨＤ ＮＳＣ由来のＨＤ ＭＳＮにおいてｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}レベルが変化したか否かも試験した（図４Ａ）。ＨＤ ＭＳＮにおいてｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}ｍＲＮＡレベルが上昇し、これはまたＦＯＸＯ３及びＲｙｋ ｍＲＮＡレベルでも当てはまった（図４Ｂ）。ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}ｍＲＮＡレベルの上昇（～５倍；図４Ａ）は、ヒトＨＤ ＮＳＣでの上昇（～１．７倍；図２Ａ）よりも規模が大きく、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}免疫染色の向上を付随した（図４Ｃ～Ｅ）。発明者らは、ｐ５３応答性ＣＤＫ阻害剤ｐ２１^ＣＩＰ１をコードするＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫ阻害剤ｐ２７^ＫＩＰ１をコードするＣＤＫＮ１Ｂ、ＡＫＴ－ＦＯＸＯ経路のメンバーをコードする遺伝子及びマトリクスメタロプロテイナーゼをコードするＭＭＰ３のｍＲＮＡレベル上昇を含む細胞老化の他のマーカーについても試験した（図７）。基底条件下で、Ｃ１１６ ＮＳＣと比較して、ＨＤ ＮＳＣにおいて、ｐ２１^ＣＩＰ１ｍＲＮＡレベルが低下し（図７Ａ）、ｐ２７^ＫＩＰ１ｍＲＮＡレベルは変化せず（図７Ｂ）、ＭＭＰ－３ ｍＲＮＡレベルは上昇した（図７Ｃ）。従って、ＨＤ ＮＳＣは、細胞老化のいくつかのマーカー（ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}、ＭＭＰ－３、ＳＡ－βｇａｌ）のレベル上昇を示す。さらに、ヒトＨＤ ＭＳＮは、核ＨＭＧＢ１のレベル低下を示し、これは老化細胞において細胞外スペースに再局在し［Ｌｉ Ｊ，Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＫ４－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐ３４（ＳＥＩ－１）ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐ３４（ＳＥＩ－１）ａｎｄ ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５；４４（４０）：１３２４６－５６］；核ＨＭＧＢ１のこの低下はヒトＨＤ ＮＳＣでは観察されなかった（図７Ｄ及び７Ｅ）。まとめると、これらの結果から、線条体ニューロンへのＮＳＣの分化には、ＨＤにおける次第に顕著になる細胞老化の特性が付随することが示唆される。

実施例３：ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}は、ヒトＨＤ ＮＳＣにおいてストレス脆弱性に影響する。
ＦＯＸＯ因子は、いくつかの組織において幹細胞ホメオスタシスの重要な調節因子であり［Ｏｈｔａｎｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｏｐｐｏｓｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｅｔｓ ａｎｄ Ｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｐ１６ＩＮＫ４ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４０９（６８２３）：１０６７－７０，Ａｒｂｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｄｉｒｅｃｔｓ ｓｔｒｉａｔａｌ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２０１５；１４２（７）：１３７５－８６ ａｎｉｃｚｅｋ ＪＲ，Ｋｅｌｌｙ Ｃ，Ｎｏａｋｅｓ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｄｉｒｅｃｔｓ ｓｔｒｉａｔａｌ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２０１５；１４２（７）：１３７５－８６］、以前の試験から、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}が、造血幹細胞プールの維持を調節するためのＦＯＸＯ因子に対して下流で作用し得ることが示唆された。［Ｏｈｔａｎｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｏｐｐｏｓｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｅｔｓ ａｎｄ Ｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｐ１６ＩＮＫ４ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４０９（６８２３）：１０６７－７０］］。発明者らの結果（図１）から、ストレスをかけられたヒトＨＤ ＮＳＣにおいてＥＴＳ２を抑圧することによりＦＯＸＯ３活性がｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}上昇に対抗し得ることが示唆される。さらに、ヒトＨＤ ＮＳＣは細胞老化マーカーのレベル上昇を示し、これはニューロンに分化するときにさらに上昇し（図２～４）、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}は幹細胞において加齢表現型を促進すると考えられる［Ｄａｖａｌｏｓ ＡＲ，ｅｔ ａｌ．ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ａｌａｒｍｉｎ ＨＭＧＢ１ ｉｓ ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１３；２０１（４）：６１３－２９］。従って、ＨＤ ＮＳＣにおけるＦＯＸＯ３活性は、ＨＤにおける神経幹細胞プールのホメオスタシスにおいてｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の効果に対抗し得る。従って、発明者らは、培養における細胞倍増時間及び血清欠乏後のカスパーゼ－３／７活性化のレベルにより測定した場合の細胞脆弱性におけるＦＯＸＯ３又はｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の抑制の効果を試験した。

ヒトＨＤ ＮＳＣは、Ｃ１１６ ＮＳＣと比較してよりゆっくりと分裂した（図５Ａ）。ＦＯＸＯ３の低下（図６Ａ）は、ヒトＨＤ ＮＳＣの増殖を遅らせ（図５Ｂ、左パネル）、ＨＴＴ発現で変化は検出されず（図６Ｃ、左パネル）、Ｃ１１６ ＮＳＣでは増殖低下の傾向があった（有意性なし）（図５Ｂ、右パネル）。これらの知見から、ＦＯＸＯ３がヒトＨＤ ＮＳＣの増殖を促進することが示唆される。ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}低下（図６Ｂ）により、ＨＤ（図５Ｃ、左パネル）及びＣ１１６（図５Ｃ、右パネル）ＮＳＣの両方の増殖が僅かに上昇し、ＨＴＴ発現の変化はなく（図６Ｃ、右パネル）、これにより、ＨＴＴ遺伝子型にかかわらず、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}がヒトＮＳＣの増殖を正常に抑制することが示唆される。ＦＯＸＯ３－ＥＴＳ２－ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}経路における発明者らのデータを考慮すると（図１Ｄ）、これらの結果から、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}がＨＤにおけるＮＳＣプールのダイナミクスに顕著に影響を与えないことが示唆される。

細胞脆弱性アッセイにおいて、ＦＯＸＯ３発現低下（図６Ａ）は、ＨＤ ＮＳＣの死滅率を強く増強し、Ｃ１１６細胞における影響はなく（図５Ｄ、左パネル）、これにより、ＦＯＸＯ３がヒトＨＤ ＮＳＣの生存を促進することが示唆される。対照的に、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}発現低下（図６Ｂ）は、ＨＤ ＮＳＣの死滅率を低下させ、Ｃ１１６細胞において影響は検出されず（図５Ｄ、右パネル）、これにより、ヒトＨＤ ＮＳＣにおけるｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}上昇が有害であることが示唆される。ＦＯＸＯ３－ＥＴＳ２－ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}経路における発明者らのデータを考慮すると、これらの結果から、ＦＯＸＯ３活性がＨＤにおける神経幹細胞プールの脆弱性及び生存におけるｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の有害効果に対抗することが示唆される。

実施例４：ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の慢性的な遺伝子阻害は、ＨＤ７２Ｑ ＮＳＣにおいてＤＮＡ損傷修復（ＤＤＲ）機構の持続を低下させる。

急性酸化ストレス（４００ｍＭ Ｈ２Ｏ２、１時間）後、ＤＮＡ２本鎖破壊（ＤＳＢ）を認識するＤＤＲ機構のマーカーであるγＨ２ＡＸのレベルは、Ｃ１１６細胞と比較してＨＤ７２Ｑ／１９Ｑ ＮＳＣにおいて持続的により高い（図８）。

さらに、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の慢性的な遺伝子抑制により、急性酸化ストレスから回復するＨＤ細胞におけるγＨ２ＡＸ核斑点の持続性が低下する（図８）。ＤＤＲの持続性は、病的現象であり得る（ＤＮＡ瘢痕をマークし得る）（ＤＮＡ－ＳＣＡＲＳ：損傷誘導性の老化成長抑制及び炎症性サイトカイン分泌を持続する明瞭な核構造）ことが記載されており、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害によって、このヒトＮＳＣの状況において病原性が緩和されることが示唆される（Ｒｏｄｉｅｒ Ｆ，Ｍｕｎｏｚ ＤＰ，Ｔｅａｃｈｅｎｏｒ Ｒ，Ｃｈｕ Ｖ，Ｌｅ Ｏ，Ｂｈａｕｍｉｋ Ｄ，Ｃｏｐｐｅ ＪＰ，Ｃａｍｐｅａｕ Ｅ，Ｂｅａｕｓｅｊｏｕｒ ＣＭ，Ｋｉｍ ＳＨ，Ｄａｖａｌｏｓ ＡＲ，Ｃａｍｐｉｓｉ Ｊ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２０１１ Ｊａｎ １；１２４（Ｐｔ１）：６８－８１）。

実施例５．ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の慢性的な遺伝子抑制は、インビトロでＨＤ ＭＳＮの活動亢進を低下させる。
ＨＤニューロン活動亢進（興奮毒性につながる）は、異なるモデルにおいて記載されている（Ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｓｔｒａｄａ Ｓａｎｃｈｅｚ ＡＭ１，Ｍｅｊｉａ－Ｔｏｉｂｅｒ Ｊ，Ｍａｓｓｉｅｕ Ｌ．Ａｒｃｈ Ｍｅｄ Ｒｅｓ．２００８ Ａｐｒ；３９（３）：２６５－７６；Ａｒｎｏｕｘ Ｉ，Ｗｉｌｌａｍ Ｍ，Ｇｒｉｅｓｃｈｅ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅｓ ｅａｒｌｙ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｌｉｆｅ．２０１８；７：ｅ３８７４４．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１８ Ｓｅｐ ４．ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．３８７４４）。ここで、発明者らは、この現象を試験するためにｉＰＳＣ由来のＭＳＮを使用した。さらに、発明者らは、ＤＳＢを生成させるトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるエトポシドを使用してニューロン活動をＤＮＡ損傷修復能と連結させた。ＤＳＢは、クロマチンを開き、それが転写機構に近づけるようにすると考えられており、従って特異的なゲノム部位での転写を活性化する。ＤＳＢ修復能は、これらのゲノム部位での正常な転写低下につなげられる。

エトポシドは、それらのプロモーターにおいてトポイソメラーゼＩＩの存在により転写活性化が開始されるので、いくつかの遺伝子（初期応答遺伝子など）としてインビトロでニューロンを活性化することが示されている（Ａｃｔｉｖｉｔｙ－Ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ Ｂｒｅａｋｓ Ｇｏｖｅｒｎ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｅａｒｌｙ－Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅｓ．Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ Ｒ，Ｇａｏ Ｆ，Ｐｆｅｎｎｉｎｇ ＡＲ，Ｐａｎ Ｌ，Ｙａｍａｋａｗａ Ｓ，Ｓｅｏ Ｊ，Ｒｕｅｄａ Ｒ，Ｐｈａｎ ＴＸ，Ｙａｍａｋａｗａ Ｈ，Ｐａｏ ＰＣ，Ｓｔｏｔｔ ＲＴ，Ｇｊｏｎｅｓｋａ Ｅ，Ｎｏｔｔ Ａ，Ｃｈｏ Ｓ，Ｋｅｌｌｉｓ Ｍ，Ｔｓａｉ ＬＨ．Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｊｕｎ １８；１６１（７）：１５９２－６０５）。ニューロン活動のレポーターとして、発明者らは、初期応答遺伝子であるＦＯＳＢの発現を監視した。

ｓｈＲＮＡを使用したｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害は、ＨＤと対照（Ｃ１１６）ＭＳＮとの間の差異を縮小させ、これは、ｓｈｐ１６（及びｓｈＣＤＫＮ２Ａ）で処理したＨＤ細胞がそれらのエトポシド応答及びまた基底（未処理）状態でのそれらのＦＯＳＢレベルを正常化し得ることを示す（図９）。

まとめると、これらのデータは、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害が、慢性及び非適応性の老化応答からヒトＨＤ ＮＳＣを保護するだけでなく、ヒトＨＤ中型有棘ニューロンにおいて正常な活性を回復させることも可能であるモデルを実証する。

Claims (12)

1. ハンチントン病（ＨＤ）の予防及び／又は処置での使用のための、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤。
2. 核酸又はペプチド、低分子化合物分子又は市販の薬物である、請求項１に記載の使用のためのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤。
3. 前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、非コードＲＮＡ、デオキシリボサイム（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｙｍｅ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムＤＮＡｚｙｍｅ、修飾又は合成ＤＮＡ又はＲＮＡ変性耐性ポリヌクレオシドアミド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、他の核酸塩基含有ポリマー、アプタマー又はポリヌクレオチド標的遺伝子編集又は何らかのそれらの組み合わせなど、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を妨害するＲＮＡをコードする、請求項２に記載の使用のためのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤。
4. 前記ペプチドが、リガンド、キナーゼの阻害剤、低分子化合物分子、例えばＰＰＡＲγアンタゴニストなど、又はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アンタゴニスト、低分子ＳＩＲＴ１活性化因子、ＦＯＸＯ因子の活性を刺激可能な化合物、ＡＭＰＫ活性化因子などを含む群の間で選択される、請求項２に記載のｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤。
5. 前記リガンドが、抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、アプタマー又はＶＨＨドメインである、請求項４に記載のｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤。
6. 請求項１～５の何れか１項に記載の少なくとも１つのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤を含む、ＨＤの処置又は予防での使用のための組成物。
7. 医薬組成物であり、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項６に記載の使用のための組成物。
8. さらに、細胞特異的な標的化のためのペプチドをコードする核酸配列を含有し、及び／又は細胞特異的発現を可能にする核酸を含有する、請求項６又は７の何れか１項に記載の組成物。
9. ＨＤを処置するための１つ以上の活性薬剤及び／又は前記活性薬剤の副作用を処置するための１つ以上の活性薬剤をさらに含む、請求項６～８に記載の使用のための組成物。
10. 治療的有効量で前記対象に投与される、請求項１～９の何れか１項に記載の使用のための少なくとも１つのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤を含む薬剤又は請求項１～９の何れか１項に記載の使用のための組成物。
11. 前記対象がＨＤと診断されている、ＨＤに対する遺伝的素因を呈する、又はＨＤに罹患している、請求項１～１０の何れか１項に記載の使用のためのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤、組成物又は薬剤。
12. 前記対象がＨＤと診断されている、請求項１１に記載の使用のためのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}阻害剤、組成物又は薬剤。

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