JP2022531832A - 凍結された標本におけるミトコンドリア呼吸計測 - Google Patents
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Abstract
ミトコンドリア呼吸計測は、健康な組織におけるミトコンドリア機能性、ならびにミトコンドリア病または2型糖尿病、肥満、およびがんなどのミトコンドリア機能に関連する疾患を研究するために使用される。しかしながら、生きているまたは新たに単離された生体標本の分析を必要とする従来の技術の限界により、エネルギー代謝の研究に対する障壁は高い。本明細書に開示される発明は、以前に凍結された生体標本における細胞エネルギー生産能力を評価するための新しい技術を提供する。【選択図】図3
Description
連邦政府が後援する研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所により付与されたDK099618の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所により付与されたDK099618の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
本開示は、細胞エネルギー代謝を観察するための方法および材料に関する。
ミトコンドリア呼吸障害は、代謝性疾患、加齢関連疾患、および心血管疾患において重要な役割を果たす(Liesa et al.,2009、Wallace,2011)。しかしながら、ミトコンドリア呼吸計測分析では、現在、患者から採取してから1時間以内に生体組織試料を処理および測定することが必要である。この必要性により、呼吸計測分析は、標準的な臨床診療および臨床研究ではほぼ実行不可能である。例えば、UCLAで実施された研究では、現在の手法を使用して合計46人の患者の試料を収集および分析するのに4年を要した(Vergnes et al.,2016)。この制限により、科学の進歩が大幅に停滞し、科学的発見を患者ケアの改善に転換する可能性が事実上排除された。
これを考慮すると、当技術分野では、細胞エネルギー代謝を観察する改善された方法、具体的には、1回以上の凍結融解サイクルに供された生体試料において細胞エネルギー代謝を観察する能力が必要である。
本発明者らは、以前に凍結された生体標本における細胞エネルギー生産能力を評価するための新しい技術を設計したが、これは、これまで科学界では不可能と考えられていた。この技術は、新たに単離された組織を必要とする従来の呼吸計測手法の根本的な制限を克服し、劇的に少ない生体材料の使用を可能にする簡素化された試料調製を提供する。さらに、この技術は、凍結された組織において以前可能であった唯一のミトコンドリアアッセイである、個々の複雑な酵素活性アッセイと比較して、感度において1,000~1,000,000倍の増加を提供する。本発明は、細胞エネルギー生産システムの特性の理解における画期的な進歩に続いて設計された。簡単に言えば、細胞エネルギーの大部分は、ミトコンドリア酸化的リン酸化(OXPHOS)によって生産され、これは、栄養素の還元エネルギーを利用してATP生合成を強化するプロセスである。OXPHOSは、特殊な電子伝達タンパク質複合体によるミトコンドリア内膜での電子の連続的な移動を伴う。複合体Iは、電子をNADHから受け取り、複合体IIは、電子をスクシネートから受け取る。複合体IおよびIIからの電子は、その後、補酵素Q、複合体III、シトクロムc、および複合体IVを通って流れ、そこでは、酸素が、電子を受容するプロセスで消費される(NichollsおよびFerguson)。したがって、酸素消費速度、つまり呼吸は、ミトコンドリアの電子フラックスを密接に反映する。
これに関連して、本発明者らは、電子伝達複合体が、分離した酵素として機能するのではなく、呼吸活性のある超複合体に集合することを発見した(Acin-Perez et al.,2008)。さらに、本発明者らは、ミトコンドリアのエネルギー生成システムの他の成分とは異なり、超複合体が複数の凍結融解サイクルに対して独自に耐性があることを実証した。これらの発見に基づいて、本発明者らは、凍結された生体標本における細胞呼吸の観察を可能にする基質および阻害剤の特定の組み合わせを設計した。本発明の実用的な実施形態では、本発明者らは、アッセイされる試料と組み合わされる一連の異なる配合物であって、複合体I、複合体II、および複合体IVの基質および阻害剤を含有する配合物を利用する単純な呼吸計測アッセイを開発した。本明細書に提示される実用的な例に示されるように、本発明によって、以前に凍結された試料における電子フラックスの測定が初めて可能になる。
本明細書に開示される発明は、多数の実施形態を有する。本発明の一実施形態は、以前に凍結された生体試料(例えば、複数の凍結融解サイクルに供されたもの)において細胞エネルギー代謝のアッセイを実行するための方法である。この方法は、生体試料を、複合体Iの基質を含む第1の溶液、複合体Iの阻害剤と組み合わせた複合体IIの基質を含む第2の溶液、複合体IIの阻害剤を含む第3の溶液、シトクロムc還元系を含む第4の溶液、および複合体IVの阻害剤を含む第5の溶液、と組み合わせるステップを含む。典型的には、これらの方法は、例えば、細胞外フラックスアナライザーデバイスにおいて、細胞エネルギー代謝をアッセイすることをさらに含む(例えば、試料の酸素消費速度を観察することによって)。
これらの方法の実施形態では、複合体Iの基質は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)ならびに/または電子を複合体Iに供与し、かつ/もしくはキノンを還元する別の基質であり得る。これらの方法の実施形態では、複合体IIの基質は、スクシネートならびに/または電子を複合体IIに供与し、かつ/もしくはキノンを還元する別の基質であり得、複合体Iの阻害剤は、ロテノンおよび/または複合体Iを阻害する別の化合物を含む。これらの方法の実施形態では、複合体IIIの阻害剤は、アンチマイシンA、ミキソチアゾール、または複合体IIIを阻害する別の化合物であり得る。これらの方法の実施形態では、シトクロムc還元系は、N,N,N’,N’-テトラメチル-p-フェニレンジアミン(TMPD)/アスコルベートならびに/または電子を複合体IVに供与し、かつ/もしくはシトクロムcを還元する別の化合物であり得る。これらの方法の実施形態では、複合体IVの阻害剤は、アジド、シアン化物、または複合体IVを阻害する別の化合物であり得る。本発明のある特定の実施形態は、溶液のうちの1つ以上を、シトクロムc、アラメチシン、カルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン、ピルベート、マレエート、および/またはN-アセチルシステインのうちの少なくとも1つで補充することによって、細胞エネルギー代謝を促進することをさらに含む。
本発明の別の実施形態は、以前に凍結された生体試料において細胞エネルギー代謝のアッセイを実行するためのシステムである。このシステムは、典型的には、複合体Iの基質を含む第1の容器、複合体Iの阻害剤と組み合わせた複合体IIの基質を含む第2の容器、複合体IIの阻害剤を含む第3の容器、シトクロムc還元系を含む第4の容器、および複合体IVの阻害剤を含む第5の容器、を含む。本発明のある特定の実施形態では、システムは、シトクロムc、アラメチシン、カルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン、ピルベート、マレエート、および/またはN-アセチルシステインのうちの少なくとも1つを含む容器を含む。本発明のある特定の実施形態では、システムは、pHを緩衝し、カルシウムをキレート化し、かつ270~300mOsm/Lを維持する配合物を有する溶液を含む。任意選択的に、このシステムの容器は、キット内に配置される。
試料調製は、標準的な手順を使用して実行される。一実施形態では、試料の均質化と組み合わせた酵素消化が用いられる。一実施形態では、酵素の選択は、組織および動物起源に依存する。ある特定の実施形態では、コラゲナーゼが使用される。ある特定の実施形態では、トリプシンが使用される。ある特定の実施形態では、コラゲナーゼIV型、トリプシンコラゲナーゼII型、またはナガーゼが使用される。一実施形態では、試料は、筋肉である。一実施形態では、筋肉は、哺乳動物の筋肉である。試料が筋肉である、ある特定の実施形態では、コラゲナーゼIV型、トリプシンコラゲナーゼII型、またはナガーゼが使用される。試料が筋肉である一実施形態では、コラゲナーゼは、均質化と組み合わせて使用される。試料が筋肉である一実施形態では、コラゲナーゼII型は、均質化と組み合わせて使用される。試料が筋肉である一実施形態では、トリプシンコラゲナーゼII型は、均質化と組み合わせて使用される。ゼブラフィッシュでは、コラゲナーゼIV型が使用される。一実施形態では、コラゲナーゼは、呼吸計測の前に融解された試料の調製中に均質化緩衝剤に添加される。いくつかの実施形態では、これらの調製ステップは、それ以外の場合の試料から得られる呼吸数の約70%の低減を回避する。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例が、本発明のいくつかの実施形態を示しているが、限定ではなく例示として与えられていることを理解されたい。本発明の範囲内の多くの変更および修正は、その趣旨から逸脱することなく行ってもよく、本発明は、そのようなすべての修正を含む。
実施形態の説明において、本明細書の一部を形成し、本発明が実施され得る特定の実施形態を例示として示す添付の図面を参照してもよい。本発明の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用してもよく、構造変更を行ってもよいことを理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法、および他の科学用語または専門用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするため、および/またはすぐに参照できるように本明細書で定義され、そのような定義を本明細書に含めることは、当技術分野で一般的に理解されているものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。
本明細書に記載または参照される技術および手順の態様の多くは、当業者によって十分に理解され、一般に用いられる。以下は、本発明のいくつかの例示的な実施形態を提供する。
発明の態様および要素
簡単に言えば、タンパク質のミトコンドリア呼吸鎖複合体は、酸化的リン酸化に関与する。酸化的リン酸化は、酸素および単糖を使用して細胞の主要なエネルギー源であるアデノシン三リン酸(ATP)を形成する重要な細胞プロセスである。各々いくつかのタンパク質で構成される5つのタンパク質複合体が、このプロセスに関与する。複合体は、複合体I、複合体II、複合体III、複合体IV、および複合体Vと呼ばれる。本発明者らは、電子伝達複合体が、分離した酵素として機能するのではなく、呼吸活性のある超複合体に集合することを発見した(例えばAcin-Perez et al.,2008参照)。さらに、本発明者らは、ミトコンドリアのエネルギー生成システムの他の成分とは異なり、超複合体が複数の凍結融解サイクルに対して独自に耐性があることを実証した。これらの発見に基づいて、本発明者らは、凍結された生体標本における細胞呼吸の観察を可能にする基質および阻害剤の特定の組み合わせを設計した。本発明の実用的な実施形態では、本発明者らは、アッセイされる試料と組み合わされる一連の異なる配合物であって、複合体I、複合体II、および複合体IVの基質および阻害剤を含有する配合物を利用する単純な呼吸計測アッセイを開発した。
簡単に言えば、タンパク質のミトコンドリア呼吸鎖複合体は、酸化的リン酸化に関与する。酸化的リン酸化は、酸素および単糖を使用して細胞の主要なエネルギー源であるアデノシン三リン酸(ATP)を形成する重要な細胞プロセスである。各々いくつかのタンパク質で構成される5つのタンパク質複合体が、このプロセスに関与する。複合体は、複合体I、複合体II、複合体III、複合体IV、および複合体Vと呼ばれる。本発明者らは、電子伝達複合体が、分離した酵素として機能するのではなく、呼吸活性のある超複合体に集合することを発見した(例えばAcin-Perez et al.,2008参照)。さらに、本発明者らは、ミトコンドリアのエネルギー生成システムの他の成分とは異なり、超複合体が複数の凍結融解サイクルに対して独自に耐性があることを実証した。これらの発見に基づいて、本発明者らは、凍結された生体標本における細胞呼吸の観察を可能にする基質および阻害剤の特定の組み合わせを設計した。本発明の実用的な実施形態では、本発明者らは、アッセイされる試料と組み合わされる一連の異なる配合物であって、複合体I、複合体II、および複合体IVの基質および阻害剤を含有する配合物を利用する単純な呼吸計測アッセイを開発した。
例示的アッセイプロトコル
本発明の実施形態で有用な機器
以下に論じるように、本発明の実施形態は、ベンダーの指示に従って、Seahorse XF96細胞外フラックスアナライザーを使用して、酸素消費速度(OCR)アッセイによるミトコンドリア脱共役活性を観察した。
本発明の実施形態で有用な機器
以下に論じるように、本発明の実施形態は、ベンダーの指示に従って、Seahorse XF96細胞外フラックスアナライザーを使用して、酸素消費速度(OCR)アッセイによるミトコンドリア脱共役活性を観察した。
実用的な例ではSeahorse XF96細胞外フラックスアナライザーを使用するが、本発明の実施形態による分析を実行するのに好適な分析ツールには、例えば、Seahorse Bioscience XFp細胞外フラックスアナライザー、Seahorse Bioscience XFe24細胞外フラックスアナライザー、Seahorse Bioscience XFe96細胞外フラックスアナライザー、Seahorse Bioscience XF24細胞外フラックスアナライザー、Seahorse Bioscience XF24-3細胞外フラックスアナライザー、またはSeahorse Bioscience XF96細胞外フラックスアナライザーが含まれる。これらの装置の各々は、技術者がマルチウェルプレートのウェル内の細胞試料の代謝の可能性を決定することを可能にする。装置は、典型的には、(i)マルチウェルプレートを支持するように適合されたステージと、(ii)マルチウェルプレートのウェル内の細胞試料に関連する細胞成分を感知するように適合されたセンサーと、(iii)流体をウェルに導入するように適合された分配システムと、を含む。装置の構成要素は、例えば、米国特許第7,276,351号および第8,658,349号に記載されており、これらは両方とも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
試料調製
試料を氷上で融解する。XF96センサーカートリッジの装填に進む。
試料を氷上で融解する。XF96センサーカートリッジの装填に進む。
XF96センサーカートリッジの装填
XF96センサーカートリッジの注入ポートを、アッセイ中に自動的に注入される溶液で装填する。条件には、複合体Iの基質であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)、複合体IIの基質であるスクシネート、複合体Iの阻害剤であるロテノン、複合体IIIの阻害剤であるアンチマイシンA、シトクロムc還元系であるN,N,N’,N’-テトラメチル-p-フェニレンジアミン(TMPD)/アスコルベート、および複合体IVの阻害剤であるアジドの注入が含まれる(Divakaruni et al.,2014、Salabei et al.,2014)。これらの条件によって、複合体I、複合体II、および複合体IVによるミトコンドリアの呼吸容量の決定が可能になる。以下の表は、溶液が注入される順序、注入体積、および濃度、ならびに組織調製が曝露されるウェル内の化合物の最終濃度について要約する。
XF96センサーカートリッジの注入ポートを、アッセイ中に自動的に注入される溶液で装填する。条件には、複合体Iの基質であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)、複合体IIの基質であるスクシネート、複合体Iの阻害剤であるロテノン、複合体IIIの阻害剤であるアンチマイシンA、シトクロムc還元系であるN,N,N’,N’-テトラメチル-p-フェニレンジアミン(TMPD)/アスコルベート、および複合体IVの阻害剤であるアジドの注入が含まれる(Divakaruni et al.,2014、Salabei et al.,2014)。これらの条件によって、複合体I、複合体II、および複合体IVによるミトコンドリアの呼吸容量の決定が可能になる。以下の表は、溶液が注入される順序、注入体積、および濃度、ならびに組織調製が曝露されるウェル内の化合物の最終濃度について要約する。
ポートAのNADH注入は、最大呼吸に達しない場合に、1~100μMの化学脱共役剤のカルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)、0.5~50mMのピルベート、および0.5~50mMのマレエートである、追加の試薬で補充される。ポートAのスクシネート注入は、最大呼吸に達しない場合に、1~100μMのFCCPおよび0.1~50mMの抗酸化N-アセチルシステインである、追加の試薬で補充される。ポートが装填されたら、較正のためにカートリッジをXF96アナライザーに置く。XF96細胞培養マイクロプレートの装填に進む。
XF96細胞培養マイクロプレートの装填
すべての手順を4°Cで実行する。すべての備品、溶液、および消耗品を事前に冷却する。
1.試料を20μLのMAS緩衝剤中に再懸濁する。各条件の5つのテクニカルレプリケートを装填する。少なくとも4つの空のウェルを残して、背景信号を決定する。
2.ミトコンドリア粒子をプレートの底に付着させるために、プレートキャリア回転バケットを使用して、装填されたプレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離する。急速な減速によってプレートの底のミコンドリアの均一な分布が妨げられるため、遠心分離機のブレーキを使用しない。
3.遠心分離後、ウェル当たり130uLのMASアッセイ緩衝剤を添加することによって、ウェルの全体積を150uLに調整する。MAS単独で最大呼吸に達しない場合に、MAS緩衝剤を、1~200μg/mLのシトクロムcおよび1~500μg/mLのアラメチシンで補充する。プレートの底へのミトコンドリアの付着の妨げを回避するために、製造者の指示に従って、ウェルチャンバの上部に対して45°の角度に向けられたマルチチャネルピペットを使用して、MASを添加する。
4.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートする。
5.プレートをXF96に挿入し、アッセイプロトコルを開始する。すべての注入の前後に酸素消費速度(OCR)を測定する。混合、待機、および測定の時間は、1~7分および1~5回の繰り返しの間で変動し得る。
すべての手順を4°Cで実行する。すべての備品、溶液、および消耗品を事前に冷却する。
1.試料を20μLのMAS緩衝剤中に再懸濁する。各条件の5つのテクニカルレプリケートを装填する。少なくとも4つの空のウェルを残して、背景信号を決定する。
2.ミトコンドリア粒子をプレートの底に付着させるために、プレートキャリア回転バケットを使用して、装填されたプレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離する。急速な減速によってプレートの底のミコンドリアの均一な分布が妨げられるため、遠心分離機のブレーキを使用しない。
3.遠心分離後、ウェル当たり130uLのMASアッセイ緩衝剤を添加することによって、ウェルの全体積を150uLに調整する。MAS単独で最大呼吸に達しない場合に、MAS緩衝剤を、1~200μg/mLのシトクロムcおよび1~500μg/mLのアラメチシンで補充する。プレートの底へのミトコンドリアの付着の妨げを回避するために、製造者の指示に従って、ウェルチャンバの上部に対して45°の角度に向けられたマルチチャネルピペットを使用して、MASを添加する。
4.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートする。
5.プレートをXF96に挿入し、アッセイプロトコルを開始する。すべての注入の前後に酸素消費速度(OCR)を測定する。混合、待機、および測定の時間は、1~7分および1~5回の繰り返しの間で変動し得る。
データ分析
測定機器から酸素消費速度(OCR)をエクスポートする。
測定機器から酸素消費速度(OCR)をエクスポートする。
Microsoft Excelで、以下の計算を個々のウェル毎に実行する。
A.複合体I:AのNADH注入後の最大OCR値から、BのアンチマイシンA注入後の最小OCR値を差し引く。
B.複合体II:Aのスクシネート注入後の最大OCR値から、BのアンチマイシンA注入後の最小OCR値を差し引く。
C.複合体IV:Dのアジド注入後の最大OCR値から、CのTMPD注入後の最小OCR値を差し引く。
A.複合体I:AのNADH注入後の最大OCR値から、BのアンチマイシンA注入後の最小OCR値を差し引く。
B.複合体II:Aのスクシネート注入後の最大OCR値から、BのアンチマイシンA注入後の最小OCR値を差し引く。
C.複合体IV:Dのアジド注入後の最大OCR値から、CのTMPD注入後の最小OCR値を差し引く。
溶液調製
すべての溶液を最高純度の脱イオン水または超高純度のジメチルスルホキシド(DMSO)で調製する。すべての水溶液のpHを、水酸化カリウム(KOH)および塩酸(HCl)を使用して7.2に調整する。
すべての溶液を最高純度の脱イオン水または超高純度のジメチルスルホキシド(DMSO)で調製する。すべての水溶液のpHを、水酸化カリウム(KOH)および塩酸(HCl)を使用して7.2に調整する。
-20℃で保存されたストック溶液
MAS緩衝剤:水(またはpHを緩衝し、カルシウムをキレート化し、かつ270~300mOsm/Lを維持し得る任意の溶液)中における、70mMのスクロース、220mMのマンニトール、5mMのKH2P04、5mMのMgCl2、1mMのEGTA、0.1%の脂肪酸を含まないBSA、および2mMのHEPES。
シトクロムc:MAS中10mg/mL。
アラメチシン:エタノール中20mg/mL。
ピルベート:MAS中0.5M。
マレエート:MAS中0.5M。
スクシネート:MAS中0.5M。
ロテノン:DMSO中40mM。
アンチマイシン:DMSO中20mM。
N-アセチルシステイン:MAS中1M。
アジド:MAS中0.5M。
MAS緩衝剤:水(またはpHを緩衝し、カルシウムをキレート化し、かつ270~300mOsm/Lを維持し得る任意の溶液)中における、70mMのスクロース、220mMのマンニトール、5mMのKH2P04、5mMのMgCl2、1mMのEGTA、0.1%の脂肪酸を含まないBSA、および2mMのHEPES。
シトクロムc:MAS中10mg/mL。
アラメチシン:エタノール中20mg/mL。
ピルベート:MAS中0.5M。
マレエート:MAS中0.5M。
スクシネート:MAS中0.5M。
ロテノン:DMSO中40mM。
アンチマイシン:DMSO中20mM。
N-アセチルシステイン:MAS中1M。
アジド:MAS中0.5M。
アッセイ当日に調製する溶液
アッセイ緩衝剤:MAS中の、1~200μg/mLのアラメチシンおよび1~500μg/mLのシトクロムc。
アッセイ緩衝剤:MAS中の、1~200μg/mLのアラメチシンおよび1~500μg/mLのシトクロムc。
NADH+ピルベート+マレエート+FCCP(10倍濃度):MAS中の、1~100mMのNADH(粉末から新たに調製)、5~500mMのピルベート、5~500mMのマレエート、10~1,000μMのFCCP。
スクシネート+ロテノン(10倍濃度):MAS中の、5~500mMのスクシネートおよび10~50μMのロテノン。
アンチマイシンA+ロテノン(10倍濃度):MAS中の、50~1,000μMのアンチマイシンAおよび50~1,000μMのロテノン。
TMPD+アスコルベート(10倍濃度):MAS中の、5~50mMのTMPD(粉末から新たに調製)および10~50mMのアスコルベート(粉末から新たに調製)。
本発明の実施形態で使用され得る代替の溶液および機器
試料凍結:液体窒素、-80℃の冷凍庫、-20℃の冷凍庫、または任意の他の凍結装置を使用して、処理の前または後に、試料を凍結することができる。
試料凍結:液体窒素、-80℃の冷凍庫、-20℃の冷凍庫、または任意の他の凍結装置を使用して、処理の前または後に、試料を凍結することができる。
MAS緩衝剤:代替品には、電子伝達酵素活性を維持する任意の溶液が含まれる。これは、純水、浸透圧を増加させ、pHを緩衝し、かつ/またはカルシウムをキレート化する試薬で補充された水であり得る。いくつかの一般に使用される緩衝剤には、以下が含まれる。
1.水中の、250Mのスクロース、5~10mMのHEPES、1~2mMのEDTA、0.1~2.0%のBSA。
2.水中の、200mMのマンニトール、70mMのスクロース、5~10mMのHEPES、1~2mMのEDTA、0.1~2.0%のBSA。
3.水中の、115mMのKCl、10mMのKH2P04、2mMのMgCl、5mMのHEPES、1mMのEGTA、0.1~2.0%のBSA。
4.水中の、250mMのスクロース、50mMのトリス-HCl(pH8.0)、0.2mMのEDTA、0.1~2.0%のBSA。
5.10mMのトリス-HCl(pH7.4)、25mMのスクロース、75mMのソルビトール、100mMのKCl、10mMのK2HPO4、0.05mMのEDTA、5mMのMgCl2、1mg/mlのBSA。
1.水中の、250Mのスクロース、5~10mMのHEPES、1~2mMのEDTA、0.1~2.0%のBSA。
2.水中の、200mMのマンニトール、70mMのスクロース、5~10mMのHEPES、1~2mMのEDTA、0.1~2.0%のBSA。
3.水中の、115mMのKCl、10mMのKH2P04、2mMのMgCl、5mMのHEPES、1mMのEGTA、0.1~2.0%のBSA。
4.水中の、250mMのスクロース、50mMのトリス-HCl(pH8.0)、0.2mMのEDTA、0.1~2.0%のBSA。
5.10mMのトリス-HCl(pH7.4)、25mMのスクロース、75mMのソルビトール、100mMのKCl、10mMのK2HPO4、0.05mMのEDTA、5mMのMgCl2、1mg/mlのBSA。
NADH:代替品には、電子を複合体Iに供与し、かつ/またはキノンを還元する任意の基質が含まれる。
FCCP:代替品には、CCCP、DNP、BAM-15、および脂肪酸種などの任意のイオノフォアが含まれる。
アラメチシン:代替品には、ジギトニン、サポニン、またはパーフリンゴリジンなどの任意の膜透過性試薬が含まれる。
スクシネート:代替品には、電子を複合体IIに供与し、かつ/またはキノンを還元する任意の基質が含まれる。
TMPDおよびアスコルベート:代替品には、電子を複合体IVに供与し、かつ/またはシトクロムcを還元する任意の基質が含まれる。
ロテノン:代替品には、複合体Iを阻害する任意の化合物、例えば、ビグアニド、スティグマテリン、ピエリシジン、ロリニアスタチン、ムシジン、カプサイシン、CoQ2(Fato et al.,2009)、ブラタシン(Miyoshi et al.,1998)、ADPリボース(Zharova and Vinogradov,1997)、アセトゲニン(Nakamaru-Ogis et al.,2010)、農薬、殺虫剤が含まれる。
アンチマイシンA:代替品には、ミキソチアゾールなどの複合体IIIを阻害する任意の化合物が含まれる。
アジド:代替品には、シアン化物などの複合体IVを阻害する任意の化合物が含まれる。
N-アセチルシステイン:代替品には、任意のROS捕捉剤が含まれる。
いくつかの注入は、同時に実行することができる。例えば、NADHおよびスクシネートを一緒に注入して、統合された複合体I+複合体IIの活性を評価することができる。次に、TMPD/アスコルビン酸を、ロテノン/アンチマイシンと同時に注入して、複合体IVの活性を評価することができる。また、注入せずに調製物を基質で事前にインキュベートすることが可能である。
酸素測定機器:
1.ポーラグラフ酸素電極(クラーク電極)機器
a.Agilent Seahorse XFe96、XFe24、XFpアナライザー(Rogers et al.,2011)
b.Oroboros機器02k-FluoRespirometer
c.Hansatech機器Oxygraph
2.プローブの内因性タンパク質の酸素感受性蛍光、発光、比色、吸光度
a.Agilent Luxcel Biosciences MitoXpress Xtra
b.NADH 340nm吸光度、NADH 450nm蛍光、およびシトクロムb 566nm吸光度(Quinlan et al.,2013,2014)
3.分光光度法によるミトコンドリア複合体の測定(Birch-Machin and Turnbull,2001)ならびにゲル内活性アッセイ(Jha et al.,2016)
4.プロトンポンピングセンサー
1.ポーラグラフ酸素電極(クラーク電極)機器
a.Agilent Seahorse XFe96、XFe24、XFpアナライザー(Rogers et al.,2011)
b.Oroboros機器02k-FluoRespirometer
c.Hansatech機器Oxygraph
2.プローブの内因性タンパク質の酸素感受性蛍光、発光、比色、吸光度
a.Agilent Luxcel Biosciences MitoXpress Xtra
b.NADH 340nm吸光度、NADH 450nm蛍光、およびシトクロムb 566nm吸光度(Quinlan et al.,2013,2014)
3.分光光度法によるミトコンドリア複合体の測定(Birch-Machin and Turnbull,2001)ならびにゲル内活性アッセイ(Jha et al.,2016)
4.プロトンポンピングセンサー
実施例1(20171201):マウスの褐色脂肪組織から単離された、凍結されたミトコンドリアにおける呼吸計測。
1.以前詳述されているように(Mahdaviani et al.,2017)、ミトコンドリアをC57/Bl6Jマウスの褐色脂肪組織から新たに単離した。
2.10回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり3μgのタンパク質を装填した。
3.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
4.遠心分離後、ウェル当たり130uLのMASを添加した。
5.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。
6.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
7.ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのピルベート+50mMのマレエートをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
8結果を図1に提示する。
1.以前詳述されているように(Mahdaviani et al.,2017)、ミトコンドリアをC57/Bl6Jマウスの褐色脂肪組織から新たに単離した。
2.10回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり3μgのタンパク質を装填した。
3.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
4.遠心分離後、ウェル当たり130uLのMASを添加した。
5.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。
6.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
7.ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのピルベート+50mMのマレエートをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
8結果を図1に提示する。
実施例2(20171207):以前に凍結されたマウスの心臓から単離された、凍結されたミトコンドリアにおける呼吸計測。
1.以前詳述されているように(Liesa et al.,2011)、ミトコンドリアをC57/Bl6Jマウスの以前に凍結された心臓から単離した。
2.最終ミトコンドリアペレットを、氷冷単離緩衝剤中に再懸濁した。ミトコンドリアタンパク質を、BCAアッセイ(Pierce)で測定した。
3.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり2μgのタンパク質を装填した。
4.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
5.遠心分離後、ウェル当たり130uLのMASを添加した。
6.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
7.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
8結果を図2に提示する。
1.以前詳述されているように(Liesa et al.,2011)、ミトコンドリアをC57/Bl6Jマウスの以前に凍結された心臓から単離した。
2.最終ミトコンドリアペレットを、氷冷単離緩衝剤中に再懸濁した。ミトコンドリアタンパク質を、BCAアッセイ(Pierce)で測定した。
3.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり2μgのタンパク質を装填した。
4.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
5.遠心分離後、ウェル当たり130uLのMASを添加した。
6.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
7.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
8結果を図2に提示する。
実施例3(20180112):シトクロムcは、凍結されたマウスの肝臓ホモジネートにおける呼吸計測を増強する。
1.ガラス/テフロンダウンスホモジナイザーを使用して、MAS中で以前に凍結されたマウスの肝臓組織からホモジネートを調製した。調製物を1,000xgで5分間、4℃で遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。
2.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり15μgのタンパク質を装填した。
3.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
4.遠心分離後、ウェル当たり130uLのMASまたは100μg/mLのシトクロムcで補充されたMASを添加した。
5.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、MAS中に10mMのNADHを含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
6.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
7.結果を図3に提示する。
この手法は、凍結されたマウスの心臓(4ug)、WAT(15ug)、およびBAT(4ug)からのホモジネートについて検証された。
1.ガラス/テフロンダウンスホモジナイザーを使用して、MAS中で以前に凍結されたマウスの肝臓組織からホモジネートを調製した。調製物を1,000xgで5分間、4℃で遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。
2.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり15μgのタンパク質を装填した。
3.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
4.遠心分離後、ウェル当たり130uLのMASまたは100μg/mLのシトクロムcで補充されたMASを添加した。
5.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、MAS中に10mMのNADHを含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
6.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
7.結果を図3に提示する。
この手法は、凍結されたマウスの心臓(4ug)、WAT(15ug)、およびBAT(4ug)からのホモジネートについて検証された。
実施例4(20180318):褐色細胞腫患者の凍結された組織から調製された組織ホモジネートにおけるヒトの脂肪組織褐変の決定。
1.脂肪組織を、健康な対照と、褐色細胞腫、脂肪組織の生体エネルギー能力を増加させるホルモン障害のある患者とから収集した。
2.ガラス/ガラスダウンスホモジナイザーを使用して、500mgの白色脂肪組織を2.5mLのMAS中で均質化した。調製物を1,000xgで5分間、4℃で遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。
3.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり15μgのタンパク質を装填した。
4.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
5.遠心分離後、ウェル当たり、100μg/mLのシトクロムcで補充された130uLのMASを添加した。
6.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
7.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
8結果を図4に提示する。
1.脂肪組織を、健康な対照と、褐色細胞腫、脂肪組織の生体エネルギー能力を増加させるホルモン障害のある患者とから収集した。
2.ガラス/ガラスダウンスホモジナイザーを使用して、500mgの白色脂肪組織を2.5mLのMAS中で均質化した。調製物を1,000xgで5分間、4℃で遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。
3.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり15μgのタンパク質を装填した。
4.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
5.遠心分離後、ウェル当たり、100μg/mLのシトクロムcで補充された130uLのMASを添加した。
6.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
7.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
8結果を図4に提示する。
実施例5(20180223):スクシネート駆動呼吸が複合体IIに特異的であることの検証。
1.特定の複合体II阻害剤である3-ニトロプロピオン酸(3-NPA)を使用して、アッセイの特異性を確認した。
2.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり4μgの凍結された単離肝臓ミトコンドリアタンパク質を装填した。
3.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
4.遠心分離後、ウェル当たり130μLのMASまたは示された濃度の3-NPAで補充されたMASを添加した。
5.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
6.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
7.結果を図5に提示する。
1.特定の複合体II阻害剤である3-ニトロプロピオン酸(3-NPA)を使用して、アッセイの特異性を確認した。
2.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり4μgの凍結された単離肝臓ミトコンドリアタンパク質を装填した。
3.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
4.遠心分離後、ウェル当たり130μLのMASまたは示された濃度の3-NPAで補充されたMASを添加した。
5.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
6.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
7.結果を図5に提示する。
実施例6(20180223):TMPD駆動呼吸が複合体IVに特異的であることの検証。
1.特定の複合体IV阻害剤であるシアン化カリウム(KCN)を使用して、アッセイの特異性を確認した。
2.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり4μgの凍結された単離肝臓ミトコンドリアタンパク質を装填した。
3.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
4.遠心分離後、ウェル当たり130μLのMASまたは示された濃度のKCNで補充されたMASを添加した。
5.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
6.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
7.結果を図6に提示する。
1.特定の複合体IV阻害剤であるシアン化カリウム(KCN)を使用して、アッセイの特異性を確認した。
2.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり4μgの凍結された単離肝臓ミトコンドリアタンパク質を装填した。
3.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
4.遠心分離後、ウェル当たり130μLのMASまたは示された濃度のKCNで補充されたMASを添加した。
5.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
6.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
7.結果を図6に提示する。
実施例7(20180228):凍結されたミトコンドリアを使用したミトコンドリア薬物毒性の決定。
1.メトホルミンおよびフェンホルミンを、マウスの心臓から単離された、凍結された肝臓ミトコンドリアを使用してアッセイした。フェンホルミンは、乳酸アシドーシスを引き起こす複合体Iの毒性のために市場から撤退したビグアニドである。
2.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり4μgのタンパク質を装填した。
3.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
4.遠心分離後、ウェル当たり130μLのMASまたは示された濃度の阻害剤で補充されたMASを添加した。
5.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHを含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
6.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
7.結果を図7に提示する。
1.メトホルミンおよびフェンホルミンを、マウスの心臓から単離された、凍結された肝臓ミトコンドリアを使用してアッセイした。フェンホルミンは、乳酸アシドーシスを引き起こす複合体Iの毒性のために市場から撤退したビグアニドである。
2.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり4μgのタンパク質を装填した。
3.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
4.遠心分離後、ウェル当たり130μLのMASまたは示された濃度の阻害剤で補充されたMASを添加した。
5.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHを含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
6.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した。
7.結果を図7に提示する。
実施例8(20180214):アラメチシンは、凍結された培養ヒト骨髄神経芽細胞腫細胞株における呼吸を増強する。
1.SH-SY5Y細胞を、ATCCの指示に従って培養した。
2.細胞が80%の集密度に達したら、細胞をトリプシン処理し、カウントし、スピンダウンし、PBS中で洗浄し、凍結した。
3.細胞を氷上で融解し、MAS中に再懸濁した。
4.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり80,000個の細胞を装填した。
5.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
6.遠心分離後、ウェル当たり130uLのMASまたはMAS単独または10μg/mLのアラメチシンおよび100μg/mLのシトクロムcで補充されたMASを添加した。
7.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
8Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した
9.結果を図8に提示する。
1.SH-SY5Y細胞を、ATCCの指示に従って培養した。
2.細胞が80%の集密度に達したら、細胞をトリプシン処理し、カウントし、スピンダウンし、PBS中で洗浄し、凍結した。
3.細胞を氷上で融解し、MAS中に再懸濁した。
4.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり80,000個の細胞を装填した。
5.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
6.遠心分離後、ウェル当たり130uLのMASまたはMAS単独または10μg/mLのアラメチシンおよび100μg/mLのシトクロムcで補充されたMASを添加した。
7.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
8Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した
9.結果を図8に提示する。
実施例9(20180329):凍結されたヒトの頬粘膜細胞における呼吸計測。
1.内側の頬に綿棒を45秒間押し付けて、ヒトの頬粘膜細胞を採取した。被験者当たり4本の綿棒を使用した。各綿棒を1mlのPBSを含有する個々のエッペンドルフチューブにクリップし、3,000xgで10分間遠心分離した。各被験者からの細胞ペレットをPBS中に再懸濁し、1本の最終エッペンドルフチューブに一緒にプールしてカウントした。
2.細胞を氷上で融解し、MAS中に再懸濁した
3.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり80,000個の細胞を装填した。
4.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
5.遠心分離後、ウェル当たり、10μg/mLのアラメチシンおよび100μg/mLのシトクロムcで補充された130uLのMASを添加した。
6.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
7.結果を図9に提示する。
1.内側の頬に綿棒を45秒間押し付けて、ヒトの頬粘膜細胞を採取した。被験者当たり4本の綿棒を使用した。各綿棒を1mlのPBSを含有する個々のエッペンドルフチューブにクリップし、3,000xgで10分間遠心分離した。各被験者からの細胞ペレットをPBS中に再懸濁し、1本の最終エッペンドルフチューブに一緒にプールしてカウントした。
2.細胞を氷上で融解し、MAS中に再懸濁した
3.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり80,000個の細胞を装填した。
4.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
5.遠心分離後、ウェル当たり、10μg/mLのアラメチシンおよび100μg/mLのシトクロムcで補充された130uLのMASを添加した。
6.プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
7.結果を図9に提示する。
実施例10(20180314):マウスの骨髄からの凍結された未分化免疫細胞対分化免疫細胞を使用した燃料選好の検証。
1.マウスの骨髄前駆体をマウスの大腿骨から洗い流し、細胞を1,000xgで5分間遠心分離し、赤血球を溶解した。
2.前駆体を10cmの皿にプレーティングし、マクロファージコロニー刺激因子MCSFの存在下で7日間増殖させて、分化したマクロファージを得た。
3.前駆体および分化したマクロファージからの細胞ペレットを-80℃で凍結した。
4.細胞を氷上で融解し、MAS中に再懸濁した。
5.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり80,000個の細胞を装填した。
6.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
7.遠心分離後、ウェル当たり、10μg/mLのアラメチシンおよび100μg/mLのシトクロムcで補充された130uLのMASを添加した。
8プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
9.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した
10.結果を図10に提示する。
1.マウスの骨髄前駆体をマウスの大腿骨から洗い流し、細胞を1,000xgで5分間遠心分離し、赤血球を溶解した。
2.前駆体を10cmの皿にプレーティングし、マクロファージコロニー刺激因子MCSFの存在下で7日間増殖させて、分化したマクロファージを得た。
3.前駆体および分化したマクロファージからの細胞ペレットを-80℃で凍結した。
4.細胞を氷上で融解し、MAS中に再懸濁した。
5.5回のテクニカルレプリケートにおいて20μLのMAS中のXF96細胞マイクロプレートのウェル当たり80,000個の細胞を装填した。
6.プレートキャリア回転バケットを使用して、プレートを2,000xgで5分間、4℃で遠心分離した。
7.遠心分離後、ウェル当たり、10μg/mLのアラメチシンおよび100μg/mLのシトクロムcで補充された130uLのMASを添加した。
8プレートを非CO2インキュベーターにおいて37°Cで5分間インキュベートし、次いで、XF96アナライザーに挿入した。ポートAの注入は、10mMのNADHまたは50mMのスクシネート+20μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートBの注入は、50μMのアンチマイシンおよび50μMのロテノンをMAS中に含有していた。ポートCの注入は、5mMのTMPDおよび10mMのアスコルベートをMAS中に含有していた。ポートDの注入は、0.5MのアジドをMAS中に含有していた。
9.Seahorseアッセイプロトコルを、2分間の待機、0.3~2分間の混合、および4分間の測定の間隔ならびにすべての注入後1~2回の繰り返しで実行した
10.結果を図10に提示する。
参照文献
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本明細書に記載のすべての刊行物(例えば、上記のもの、Wang et al.,Journal of Biomolecular Screening 2015,Vol.20(3)422-429および米国特許公開第20160281049号および第20170334869号)は、それに関して刊行物が引用される方法および/または材料を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用されている刊行物は、本出願の出願日より前の開示について引用されている。本明細書におけるいかなるものも、本発明者が発明のより早い優先日またはより前の日付のために刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、実際の発行日は表示されている日付と異なる場合があり、独立した検証が必要である。
結論:
これで、本発明の例示的な実施形態の説明は終了する。本発明の1つ以上の実施形態の前述の説明は、例示および説明の目的で提示されている。包括的であること、または本発明を開示された正確な形態に限定することを意図するものではない。上記の教示に照らして、多くの修正および変形が可能である。
これで、本発明の例示的な実施形態の説明は終了する。本発明の1つ以上の実施形態の前述の説明は、例示および説明の目的で提示されている。包括的であること、または本発明を開示された正確な形態に限定することを意図するものではない。上記の教示に照らして、多くの修正および変形が可能である。
Claims (26)
- 以前に凍結された生体試料における細胞エネルギー代謝のアッセイを実行するための方法であって、前記生体試料を、
複合体Iの基質を含む第1の溶液、
複合体Iの阻害剤と組み合わせた複合体IIの基質を含む第2の溶液、
複合体IIIの阻害剤を含む第3の溶液、
シトクロムc還元系を含む第4の溶液、および
複合体IVの阻害剤を含む第5の溶液、と組み合わせるステップを含む、方法。 - 前記複合体Iの基質が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)ならびに/または電子を複合体Iに供与し、かつ/もしくはキノンを還元する別の基質を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複合体IIの基質が、スクシネート、ならびに/または電子を複合体IIに供与し、かつ/もしくはキノンを還元する別の基質を含み、かつ/あるいは
前記複合体Iの阻害剤が、ロテノンおよび/または複合体Iを阻害する別の化合物を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記複合体IIIの阻害剤が、アンチマイシンA、ミキソチアゾール、または複合体IIIを阻害する別の化合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記シトクロムc還元系が、N,N,N’,N’-テトラメチル-p-フェニレンジアミン(TMPD)/アスコルベートならびに/または電子を複合体IVに供与し、かつ/もしくはシトクロムcを還元する別の化合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複合体IVの阻害剤が、アジド、シアン化物、または複合体IVを阻害する別の化合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料の酸素消費速度を観察することによって細胞エネルギー代謝をアッセイすることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記溶液のうちの1つ以上を、
シトクロムc、
アラメチシン、
カルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン、
ピルベート、
マレエート、および/または
N-アセチルシステイン、のうちの少なくとも1つで補充することによって、細胞エネルギー代謝を促進することをさらに含む、請求項7に記載の方法。 - 前記生体試料が、複数の凍結融解サイクルに供されている、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞エネルギー代謝のアッセイが、細胞外フラックスアナライザーデバイスで実行される、請求項7に記載の方法。
- 以前に凍結された生体試料において細胞エネルギー代謝のアッセイを実行するためのシステムであって、
複合体Iの基質を含む第1の容器、
複合体Iの阻害剤と組み合わせた複合体IIの基質を含む第2の容器、
複合体IIIの阻害剤を含む第3の容器、
シトクロムc還元系を含む第4の容器、および
複合体IVの阻害剤を含む第5の容器、を含む、システム。 - シトクロムc、
アラメチシン、
カルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン、
ピルベート、
マレエート、および/または
N-アセチルシステイン、のうちの少なくとも1つを含む容器をさらに含む、請求項11に記載のシステム。 - pHを緩衝し、カルシウムをキレート化し、かつ270~300mOsm/Lを維持する配合物を有する溶液をさらに含む、請求項11に記載のシステム。
- 前記容器が、キット内に配置されている、請求項11に記載のシステム。
- センサーカートリッジをさらに含む、請求項11に記載のシステム。
- 前記試料が、筋肉、肝臓、心臓、頬粘膜細胞、脂肪組織、ミトコンドリア、または骨髄である、請求項1に記載の方法。
- 組み合わせる前に、前記試料が、均質化に供される、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が、酵素消化にも供される、請求項17に記載の方法。
- 前記酵素消化が、コラゲナーゼを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記酵素消化が、コラゲナーゼII型、コラゲナーゼIV型、トリプシンコラゲナーゼII型、またはナガーゼを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記試料が、筋肉である、請求項19に記載の方法。
- コラゲナーゼII型が使用される、請求項21に記載の方法。
- コラゲナーゼIV型が使用される、請求項21に記載の方法。
- 前記試料を消化するための酵素を含む容器をさらに含む、請求項11に記載のシステム。
- 前記酵素が、コラゲナーゼである、請求項24に記載のシステム。
- 前記酵素が、コラゲナーゼII型、コラゲナーゼIV型、トリプシンコラゲナーゼII型、またはナガーゼから選択される、請求項24記載のシステム。
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