JP2022530031A - ｍｉＲ－１０模倣体およびその標的に関する方法および組成物 - Google Patents

ｍｉＲ－１０模倣体およびその標的に関する方法および組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2022530031A
JP2022530031A JP2021562954A JP2021562954A JP2022530031A JP 2022530031 A JP2022530031 A JP 2022530031A JP 2021562954 A JP2021562954 A JP 2021562954A JP 2021562954 A JP2021562954 A JP 2021562954A JP 2022530031 A JP2022530031 A JP 2022530031A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mir
mimetic
stranded
subject
mice
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021562954A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020219872A5 (ja
Inventor
スンイル ロ
Original Assignee
ネバダ リサーチ アンド イノベイション コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ネバダ リサーチ アンド イノベイション コーポレイション filed Critical ネバダ リサーチ アンド イノベイション コーポレイション
Publication of JP2022530031A publication Critical patent/JP2022530031A/ja
Publication of JPWO2020219872A5 publication Critical patent/JPWO2020219872A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、miR-10a-5p模倣体またはmiR-10b-5p模倣体を含む、胃腸運動障害、肥満、および糖尿病を処置するための方法および組成物に関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第119条（e）の下に、2019年4月24日に出願された米国仮特許出願第62/837,988号および2020年1月22日に出願された米国仮特許出願第62/964,382号に基づく優先権を有し、これらの米国仮特許出願はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所（NIH）によって交付された助成金番号DK091725の下に、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明においてある特定の権利を有する。
発明の背景
世界保健機関からのデータによれば、世界には4億2500万人を超える糖尿病患者がいて、肥満の有症率が増加するにつれて、糖尿病患者の数も急速に増加している。糖尿病患者の90％は肥満でもあるので、肥満と糖尿病は密接に関係している。複雑で不均質な多遺伝子疾患である2型糖尿病（T2D）は、主に40歳を超えた成人で発生するので、成人糖尿病として公知である。T2Dは糖尿病の全診断症例の95％までを占める。残念ながら、今のところ、T2Dを根本的に治す医薬を開発することは困難である。T2Dの原因と誘導機序は今なお把握しがたいからである。興味深いことに、糖尿病患者の約半数は、胃不全麻痺を含む胃腸（GI）合併症も有する。糖尿病の特徴的徴候である異常に高い血中グルコースレベル（高血糖）が胃不全麻痺につながることは公知である。
マイクロRNA（miRNA）は分子プロセスおよび細胞プロセスの重要な調節因子である。miRNAは、細胞の分化、増殖およびアポトーシスを含むさまざまな細胞プロセスの調節に関与することが、いくつかの研究によって示されている。
T2D、肥満、糖尿病性脂肪肝疾患、およびGI合併症を処置しかつ防止するための方法および組成物は、依然として必要とされている。本発明はこの必要性に対処する。
本発明は、miR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体が、インスリン抵抗性糖尿病を含む真性糖尿病、肥満、脂肪肝疾患、心機能および炎症に関連するさまざまな状態および病態を低減するかまたは反転させることができるという予想外の発見に基づく。本発明は、miR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体による処置が、消化管の筋層内で筋肉内のカハール介在細胞における正常機能を回復させ、胃腸運動障害を改善することができるという予想外の発見にも基づく。
したがって、ある特定の局面において、本発明は、その必要のある対象において糖尿病を処置する方法であって、有効量のmiR-10a-5p模倣体を対象に投与し、それによって糖尿病状態を処置する工程を含む、方法を提供する。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体は、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである。
さまざまな態様において、糖尿病は2型糖尿病である。一態様において、miR-10a-5p模倣体は哺乳類のものである。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体はヒトのものである。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体は操作されている。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体は薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む。
別の一局面において、本発明は、有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって対象の体重を低減する工程を含む、対象の体重を低減するための方法を提供する。
別の一局面において、本発明は、対象における血中グルコースを低下させるための方法であって、有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって対象における血中グルコースを低下させる工程を含む、方法を提供する。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって対象におけるインスリン感受性を増加させる工程を含む、インスリン感受性を増加させるための方法を提供する。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象において糖尿病関連脂肪肝疾患を処置する方法であって、対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって糖尿病関連脂肪肝疾患を処置する工程を含む、方法を提供する。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象において糖尿病関連炎症を低減する方法であって、対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって糖尿病関連炎症を低減する工程を含む、方法を提供する。
ある特定の例示的態様において、miR-10a-5p模倣体は、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体は哺乳類のものである。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体はヒトのものである。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体は操作されている。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体は薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって対象における胃腸疾患を処置する工程を含む、胃腸疾患を処置するための方法を提供する。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体は、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体は哺乳類のものである。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体はヒトのものである。
さまざまな態様において、胃腸疾患は、胃不全麻痺、機能性胃腸障害、機能性胃腸運動障害、および偽性腸閉塞からなる群より選択される。
さまざまな態様において、機能性胃腸障害は、過敏性腸症候群、機能性便秘、および特定不能の機能性腸障害からなる群より選択される。
別の一局面において、本発明は、miR-10a-5p模倣体と薬学的に許容される担体またはアジュバントとを含む組成物を提供する。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体は、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである。
さまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体は操作されている。
ある特定の例示的態様において、miR-10a-5p模倣体は、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、またはそれらの組合せを含む核酸配列を含む。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象におけるカハール介在細胞（ICC）増殖を増加させる工程を含む、ICC増殖を増加させるための方法を提供する。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体は、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体は哺乳類のものである。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体はヒトのものである。
さまざまな態様において、対象におけるICC増殖の増加により対象におけるICCの機能が回復する。
さまざまな態様において、ICCは、対象の胃腸管の平滑筋内に位置する。
さまざまな態様において、平滑筋は、対象の胃内、小腸内、または結腸の平滑筋内に位置する。
ある特定の例示的態様において、ICCは、ICC前駆体、ICC-MY、ICC-IM、ICC-DMP、ICC-SM、またはICC-SMPを含む。
さまざまな態様において、対象はヒトである。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象におけるKIT発現を増加させる工程を含む、ICCにおけるKIT発現を増加させるための方法を提供する。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体は、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体は哺乳類のものである。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体はヒトのものである。
さまざまな態様において、対象におけるKIT発現の増加により対象におけるICCの機能が回復する。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象における胃腸疾患を処置する工程を含む、胃腸疾患を処置するための方法を提供する。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体は、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体は哺乳類のものである。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体はヒトのものである。
さまざまな態様において、胃腸疾患は、胃不全麻痺、機能性胃腸障害、機能性胃腸運動障害、および偽性腸閉塞からなる群より選択される。
さまざまな態様において、機能性胃腸障害は、過敏性腸症候群、機能性便秘、および特定不能の機能性腸障害からなる群より選択される。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象の体重を低減する工程を含む、体重を低減するための方法を提供する。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象における血中グルコースを低下させる工程を含む、血中グルコースを低下させるための方法を提供する。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象における膵幹細胞（PSC）増殖または膵前駆細胞（PPC）増殖を増加させる工程を含む、KIT＋ PSC増殖またはKIT＋ PPC増殖を増加させるための方法を提供する。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象におけるインスリン感受性を増加させる工程を含む、インスリン感受性を増加させるための方法を提供する。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象における糖尿病を処置する工程を含む、糖尿病を処置するための方法を提供する。
さまざまな態様において、糖尿病は1型糖尿病または2型糖尿病である。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによってKIT発現を増加させる工程を含むことにより、PSCまたはPPCにおけるKIT発現を増加させるための方法を提供する。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによってINSR、IRS2、およびIRS1の発現を増加させる工程を含む、骨格筋細胞（SkMC）におけるINSR、IRS2、およびIRS1の発現を増加させるための方法を提供する。
別の一局面において、本発明は、その必要のある対象において糖尿病関連炎症を低減するための方法であって、有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって糖尿病関連炎症を低減する工程を含む、方法を提供する。
ある特定の例示的態様において、miR-10b-5p模倣体は、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体は哺乳類のものである。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体はヒトのものである。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体は操作されている。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体は薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む。
別の一局面において、本発明は、miR-10b-5p模倣体と薬学的に許容される担体またはアジュバントとを含む組成物を提供する。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体は、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである。
さまざまな態様において、miR-10b-5p模倣体は操作されている。
本発明の前記局面または他の任意の局面のある特定の例示的態様において、miR-10b-5p模倣体は、SEQ ID NO:6、7、8、9、10、12、13、またはそれらの組合せを含む核酸配列を含む。
本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めば、より良く理解されるであろう。本発明を例示する目的で、図面には現時点で好ましい態様が示されている。しかし本発明は、図面に示される態様の装置および手段そのものに限定されるわけではないと理解すべきである。
図1A～図1Iは、糖尿病KitcopGFP/＋;Lepob/ob雄マウスの空腸および結腸KIT＋ICCにmiR-10a-5pおよびmiR-10b-5pが存在しないことを図解している。図1Aは、KitcopGFP/＋;Lep＋/＋（野生型:WT）マウスと比較した、4週、8週および12週時のKitcopGFP/＋;Lepob/ob（糖尿病）雄マウスの肉眼解剖学的変化を示す。図1Bは、WTマウスと比較した、糖尿病Lep変異体マウスにおける体重の漸進的増加を示す。図1Cは、糖尿病マウスにおける増加した血中グルコースレベルを示す。糖尿病マウスは11～13週の間に大幅な高血糖になる。図1Dは、糖尿病Lep変異体マウスおよびWTマウスの空腸および結腸におけるKITの自動ウェスタンブロットである。図1Eは、糖尿病KitcopGFP/＋;Lepob/obマウス（n＝30）、非糖尿病KitcopGFP/＋;Lepob/＋マウス（n＝20）およびKitcopGFP/＋;Lep＋/＋マウス（n＝20）から単離されプールされた結腸ICCおよび空腸ICC（それぞれCICCおよびJICC）から得られたmiRNA-seqデータ間のピアソン相関分析である。図1Fおよび図1Gは、糖尿病および非糖尿病の空腸ICCおよび結腸ICCにおいて最も動的に調節されるmiRNAのヒートマップである。空腸および結腸のKIT＋ICCをどちらもFACSによって単離し、miRNA-seqによってmiRNA発現プロファイルを得た。miR-10a-5pおよびmiR-10b-5pは、WT JICCとWT CICCのどちらにおいても多量に発現されるが、両糖尿病ICCでは枯渇している。図1Hおよび図1Iは、miRNA-seqによって得られた、図1F（黒い枠で囲む）および図1Gの顕著に発現している10種のmiRNAの発現レベルを示している。 図2A～図2Fは、KIT＋（ICC特異的）mir-10bノックアウトマウスの作製を図解している。図2Aは、タモキシフェン誘導性KitCreERT2/＋;mir-10bLacZ/LacZマウスおよびKitCreERT2/＋;mir-10b-/-マウスのゲノム地図である。mir-10bLacZ-FLP-lox/＋マウスをKitCreERT2/＋マウスまたはROSA26FLP/＋マウスと交配することで、KitCreERT2/＋;mir-10bLacZ/LacZ（タモキシフェンでmir-10b KOを、またオイルでmir-10b WTをもたらす）マウスおよびROSA26FLP/＋;mir-10blox/loxマウスを作製した。ROSA26FLP/＋;mir-10blox/loxマウスをKitCreERT2/＋マウスとさらに交配することで、KitCreERT2/＋;10blox/lox（タモキシフェンでmir-10b KOを、またオイルでmir-10b WTをもたらす）マウスを作製した。図2Bは、雄mir-10b KOマウス（タモキシフェンを注射）およびmir-10b WTマウス（オイルを注射）の肉眼解剖像を示している。図2Cは、mir-10b KOマウスにおけるmiR-10b枯渇の検証を示している。mir-10b KOおよびmir-10b WTの空腸および結腸の平滑筋において、miR-10b-5pの発現レベルを、qPCRによって測定した。図2Dは、Mir10bによって調節される、またはMir10bと関連する、タンパク質のウェスタンブロットを示している。mir-10b KOの空腸および結腸ではKITが減少し、一方、KO組織ではKLF11が増加していた。HOXD3およびHOXD4に目立った変化はなかった。GAPDHをローディング対照として使用した。タンパク質ラダー（L）が分子量（kDa）と共に示されている。図2Eは、mir-10b WTマウスと比較した、mir-10b KOからの胃、空腸および結腸におけるICC（CD117＋CD45-）の低減を示している。図2F～図2Gは、mir-10b KOマウスにおける空腸および/または結腸ICC（KIT＋ANO1＋）の断面、ホールマウントの光学スタックおよび分離画像（ICC-MY、ICC-DMPおよびICC-SMP）を、mir-10b WTマウスと比較して示している。 図3A～図3Fは、雄mir-10bノックアウトマウスが糖尿病を発生することを図解している。図3Aは、対照mir-10b WT雄マウスと比較してmir-10b KO雄マウスの体重が、16週以降、漸進的に増加することを示している。図3Bは、mir-10b KO雄マウスの空腹時血中グルコースレベルも漸進的に増加して、24週後にはマウスが高血糖になることを示している。図3Cは、mir-10b KOマウスおよびWTマウスにおける腹腔内グルコース耐性試験（GTT）を示している。mir-10b KOマウスが示すグルコースのクリアランスは、1ヶ月齢から7ヶ月齢へと加齢するにつれて、徐々に低下する。図3Dは、GTTの曲線下面積（AUC）プロットを示す。6ヶ月齢および7ヶ月齢のmir-10b KOマウスではグルコース不耐性が有意に増加している。図3Eは、mir-10b KOマウスおよびWTマウスにおける腹腔内インスリン耐性試験（ITT）を示している。これらのITTは、mir-10b KOマウスが、1ヶ月齢から7ヶ月齢まで加齢するにつれて、インスリンに対する非感受性を増加させることを示している。図3Fは、ITTのAUCプロットを示している。インスリン抵抗性は、時間の経過と共に過大になるmir-10b WTマウスと比較して、4ヶ月齢のmir-10b KOマウスからは有意に増加している。 図4A～4Fは、雄mir-10bノックアウトマウスが胃腸（GI）通過の遷延を呈することを図解している。図4Aは、1ヶ月齢から7ヶ月齢までのmir-10b KOマウスおよびWTマウスにおいてエバンスブルー法を使って測定された総GI通過時間を示している。図4Bは、GastroSense IVISインビボイメージングシステムを使った、7ヶ月齢のmir-10b KOマウスおよびWTマウスの胃内容排出像を示している。図4Cは、30分時点での胃内容排出のパーセンテージの定量を示している。図4Dは、ビーズ排出法を使って測定した結腸通過時間を示している。図4E～図4Fは、24時間以内の糞粒の頻度および排出量の平均を示している。 図5A～図5Gは、糖尿病におけるmiR-10b-5pの経路解析および標的検証を図解している。図5Aは、Ingenuity Pathway Analysis（IPA）によるmiR-10b-5pと糖尿病に関連するその標的遺伝子の経路解析を示している。図5Bは、NIH3T3細胞およびHEK293細胞中でKLF11およびKITを調節しうる、合成miR-10b-5p模倣体（10b二重鎖模倣体1～3）、一本鎖miR-10b-3p（10b 3p）、一本鎖miR-10b-5p（10b 5p）、アニールしたmiR-10b-3pとmiR-10b-5p（10b 3p＋5p）、およびマウス前駆体miR-10b（mPre-10b）のスクリーニングのためのウェスタンブロット解析を示している。非ターゲティングRNA（スクランブル）および非トランスフェクション対照（NTC）を陰性対照として使用した。タンパク質ラダー（L）が分子量（kDa）と共に示されている。図5Cは、NIH3T3細胞、HEK293細胞におけるmiR-10b-5p標的タンパク質の検証を示している。図5Dは、10b模倣体1、miR-10b-5pアンチセンス（10b阻害物質）、マウスKlf11（siKlf11-1およびsiKlf11-2）およびヒトKLF11（siKLF11-1およびsiKLF11-2）を標的とする2つのsiRNA、スクランブルをトランスフェクトしたNIT-1細胞（mβC）およびPanc10.05細胞（hβC）、ならびにNTCを示している。図5Eは、ルシフェラーゼレポータープラスミドの線図と、ヒトおよびマウスのKLF11（hKLF11 10b TSおよびmKlf11 10b TS）ならびに変異体（mKlf11 10b TSM）のmiR-10b-5p標的部位（10b模倣体結合部位）を示している。図5Fは、ルシフェラーゼレポータープラスミドがトランスフェクトされた安定HEK293細胞における、トランスフェクション後6～48時間にわたる、10b模倣体および10b阻害物質のターゲティング効果を示している。図5Gは、ルシフェラーゼレポータープラスミドがトランスフェクトされた4種の細胞株における10b模倣体および10b阻害物質によるKLF11の標的検証ならびに12時間後の各細胞における10b模倣体および10b阻害物質の用量依存的ターゲティング効果を示している。 図6A～図6Jは、miR-10b模倣体注射による、雄mir-10bノックアウトマウスにおける糖尿病状態および胃不全麻痺のレスキューを図解している。図6Aは、miR-10b-5p模倣体（263ng/g体重）を注射された雄糖尿病mir-10bノックアウト（KO）マウス、注射を行わなかったmir-10b KOマウスおよびWTマウスにおける体重比較を示している。図6Bは、miR-10b-5p模倣体を注射した直後のmir-10b KO雄マウスにおける正常血中グルコースレベルの回復を示している。miR-10b模倣体注射を受けなかったマウス（WTおよび「注射なし」マウス）は、グルコースレベルの減少を示さなかった。正常で安定したグルコースレベルが、注射後、4週にわたって維持された。図6Cは、miR-10b-5p模倣体処置マウスにおいて劇的に改善されたグルコース耐性を示すGTTを示している。図6Dは、miR-10b-5p模倣体処置マウスにおいて有意に改善されたインスリン感受性を示すITTを示している。図6Eは、miR-10b-5p模倣体処置マウスにおける総GI通過時間の段階的回復を示している。図6Fは、miR-10b-5p模倣体処置マウスにおける平均糞排出量の増加を示している。図6Gは、GastroSense IVISインビボイメージングシステムを使った、miR-10b-5p模倣体を注射したmir-10b KOマウス、ならびに注射されていないmir-10b KOマウスおよびWTマウスにおける胃内容排出試験を示している。図6Hは、miR-10b-5p模倣体注射後のmir-10 KOマウスでは、空腸および結腸中のICCが回復することを示している。図6Iは、miR-10b-5p模倣体注射後のmir-10 KOマウスでは、膵臓および結腸におけるKLF11およびKITの発現が反転することを示している。図6Jは、miR-10b-5p模倣体注射後の血液、膵臓、空腸および結腸では、miR-10b-5pの発現が増加したことを示している。 図7A～図7Gは、高脂肪高スクロース食（HFHSD）給餌マウスにおいて、miR-10b-5p模倣体が、糖尿病状態をレスキューし、GI通過時間を遅くすることを図解している。図7Aは、miR-10b-5p模倣体［Thermo Fisher Scientific、アッセイID MC11108（カタログ番号4464070）］（500ng/g体重）またはmiRNA模倣体陰性対照が2回注射されるか、注射なしの、HFHSD誘導性糖尿病雄マウスおよび普通食（normal diet:ND）雄マウスにおける、15週までの体重比較を示している。図7Bは、miR-10b-5p模倣体を注射した直後にHFHSD誘導性糖尿病雄マウスでは正常血中グルコースレベルが回復するが、陰性対照群または注射なし群ではどちらにおいてもそれが起こらないことを示している。処置なしの普通食雄マウスと類似する正常空腹時グルコースレベルが、1回目の注射後、5週にわたって維持され、2回目の注射後はさらに10週にわたって維持された。加えて、miR-10b-5p模倣体を注射した普通食給餌マウスは、陰性対照を注射したマウスおよび何も注射していないマウスと類似する正常グルコースレベルを示した。図7Cは、1回目の注射の2週後および4週後（1-2Wおよび1-4W）ならびに2回目の注射の2週後および4週後（2-2Wおよび2-4W）の、miR-10b-5p模倣体処置HFHSDマウスにおいて有意に改善されたグルコース耐性を示すGTTの結果を取り上げている。図7Dは、miR-10b-5p模倣体処置HFHSDマウスにおいて有意に改善されたインスリン感受性を示すITTの結果を図解している。図7Eは、1回目の注射および2回目の注射の2週後および4週後の、miR-10b-5p模倣体処置HFHSD食マウスにおける総GI通過時間の改善を示している。図7F～図7Gは、1回目の注射および2回目の注射後は、注射後5週にわたり、miR-10b-5p模倣体処置HFHSD給餌群において、糞粒排出量が正常状態まで回復したことを示している。 図8A～図8Gは、miR-10b-5p模倣体で処置された糖尿病マウスにおける、miR-10b、その調節を受けるタンパク質、ICCおよびβ細胞の回復を図解している。図8Aは、普通食（ND）健常マウス、HFHSD糖尿病マウス、および注射後1～4週時点のmiR-10b-5p模倣体HFHSDマウスの、血中miR-10b-5p量を示すグラフである。図8Bは、上記3つのマウス群における6時間の絶食後およびグルコース注射後のインスリンレベルの変化を示すグラフである。図8Cは、ヘモグロビンA1Cレベルを示すグラフである。図8Dは、10b模倣体もしくは陰性対照RNAで処置した、または注射なしの、HFHSD糖尿病マウスおよびND健常マウスにおける、2週時点での、KLF11タンパク質の発現の変化を示している。図8E～図8Fは、NDマウス、HFHSDマウスおよびmiR-10b-5p模倣体注射HFHSDマウスの血液、膵臓、胃、結腸および骨格筋における、1週および3週時点での、KLF11およびKITの発現レベルの比較を示している。図8Gは、前記3つの群の胃、空腸、結腸および膵臓における、3週時点での、ICC（KIT＋）の回復を示す断面およびホールマウントの画像を図解している。 図9A～図9Gは、健常C57マウスにおけるmiR-10b-5p模倣体注射による有害作用の欠如を図解している。図9Aは、一連の濃度のmiR-10b-5p模倣体（263ng/g、132ng/g、66ng/g、33ng/g体重）を2回注射して、10週にわたって観察した、健常C57雄マウスにおける体重比較を示している。図9Bは、血中グルコースレベル比較を示している。図9Cは、1回目の注射の2週後および4週後（1-2週および1-4週）ならびに2回目の注射の2週後および4週後（2-2週および2-4週）の、miR-10b-5p模倣体を注射したマウスにおけるグルコース耐性の用量依存的改善を示すGTTを示している。図9Dは、インスリン感受性の用量依存的改善を示すITTを示している。図9E～9Fは、糞粒の頻度および排出量を示している。図9Gは、総GI通過時間を示している。 図10A～図10Iは、雄KitCre-ERT2/＋;ROSA26DTA/＋マウスにおけるKIT＋細胞のコンディショナルな除去が、糖尿病状態および遅いGI通過につながることを図解している。Kit-tdTom（KitCre-ERT2/＋;ROSA26tdTom/＋）マウスとKit-DTA（KitCre-ERT2/＋;ROSA26DTA/＋）マウスを2ヶ月時にタモキシフェンで処置した。図10Aは、Kit-DTA雄マウスの体重が、10週以降、対照雄マウスと比較して漸進的に増加することを示すグラフである。図10Bは、Kit-DTA雄マウスの血中グルコースレベルも漸進的に増加し、24ヶ月後にはマウスが高血糖になることを示すグラフである。図10Cは、Kit-DTAマウスおよびWTマウスにおける腹腔内グルコース耐性試験（GTT）の結果を示すグラフである。Kit-DTA雄マウスが示すグルコースのクリアランスは、2ヶ月齢および5ヶ月齢において、徐々に低下している。図10Dは、Kit-DTAマウスおよびWTマウスにおける腹腔内インスリン耐性試験（ITT）を示すグラフである。Kit-DTA KOマウスは、2ヶ月時および5ヶ月時に、漸進的なインスリン非感受性を示す。図10Eは、Kit-tdTomマウスと比較した、Kit-DTAマウスにおけるβ細胞の変性を示している。タモキシフェン注射後、7日および5ヶ月の時点で、Kit-tdTomの膵島ではβ（INS＋）細胞中にKIT＋細胞由来（tdTom＋）の細胞が見いだされるが、Kit-DTAではそれが枯渇している。図10Fは、qPCRによって測定されるmiR-10b-5pの発現を示すグラフである。図10Gは、ELISAによる血中のインスリンおよびC-ペプチドの量を示すグラフである。図10Hは、7日後および5ヶ月後のKit-tdTomマウスおよびKit-DTAマウスの膵臓、結腸および血液におけるKLF11およびKITの発現レベルの比較を示している。図10Iは、2ヶ月後および5ヶ月後のKit-DTAマウスにおける総GI通過時間を示すグラフである。 図11A～図11Hは、胃不全麻痺および/またはT2Dを有するヒト患者が、上で得たマウスデータと類似する異常なmiR-10b-5p、KLF11およびKITの発現パターンを有することを図解している。図11Aは、健常対照（healthy control）（HC、n＝15）と比較した、特発性胃不全麻痺（idiopathic gastroparesis）患者（IG、n＝13）および糖尿病性胃不全麻痺（diabetic gastroparesis）患者（DG、n＝2）から収集した血液試料におけるmiR-10b-5pの発現を示している。IG群は、miR-10bの高（IG-H、n＝7）および低（IG-L、n＝6）により、2つの群に分割した。＊＊p＜0.05、＊＊＊p＜0.01。図11Bおよび図11Cは、上記4つの群の血液中のインスリンおよびC-ペプチドを示している。図11Dは、ヘモグロビンA1Cレベルを示している。図11Eは、血液試料および胃試料におけるKLF11およびKITの発現を示している。血清中および洞（antrum）中のKLF11タンパク質レベルもDG群ではHC群より高く、一方、KITレベルはDG群の方が低かった。図11Fは、空腹時血中グルコースレベルを示している。図11Gは、HC、IG-H、IG-LおよびDGの血液から得られたmiRNA-seqデータ間のピアソン相関分析を示している（各群n＝2）。図11Hは、HC、IG-H、IG-LおよびDGにおいて最も動的に調節される70のmiRNAのヒートマップを示している（各群n＝2）。miR-10a-5pおよびmiR-10b-5pのレベルはHCで最も高く、続いてそれぞれIG-H、IG-LおよびDGであった。 miR-10bによる糖尿病状態の調節を図解している。miR-10b-5pは、脂肪細胞、ICC、膵前駆細胞、β細胞および骨格筋細胞における細胞の増殖、分化、インスリン生産およびインスリン感受性を統合する2つの代謝関連転写因子KLF7およびKLF11を介して、キー代謝遺伝子（LEP、ADIPOQ、GLP1R、KIT、INS、INSR、SLC2A2、SLC2A4、IRS1およびIRS2）を調節する。正常グルコース状態では、miR-10bが豊富に発現してKLF7およびKLF11を阻害しているが、高血糖状態下ではこのmiRNAが抑制されてこれらの転写遺伝子の過剰発現を可能にし、それが糖尿病、GI運動障害および肥満につながる。 図13A～図13Bは、この研究において使用したmiR-10a-5pおよびmiR-10b-5pの模倣体および阻害物質の配列比較を図解している。図13Aは、miR-10a-5pおよびmiR-10a-3pをコードするマウスmiR-10a前駆体、合成miR-10a-5p分子（miR-10a-5p模倣体）および合成miR-10a-5pアンチセンス分子（miR-10a-5p阻害物質）の配列と構造を示している。図13Bは、miR-10b-5pおよびmiR-10b-3pをコードするマウスmiR-10b前駆体、合成miR-10b-5p分子（miR-10b-5p模倣体）および合成miR-10b-5pアンチセンス分子（miR-10b-5p阻害物質）の配列と構造を示している。miR-10a-5p模倣体（U）とmiR-10b-5p模倣体（A）の間およびmiR-10a-5p阻害物質（A）とmiR-10b-5p阻害物質（U）の間の単一ヌクレオチド塩基の違いが太字で示されていることに注意されたい。 図14A～図14Bは、高脂肪高スクロース食（HFHSD）または普通食（ND）を給餌されたマウスにおける肥満および糖尿病表現型を、miR-10a-5p模倣体がレスキューすることを図解している。（図14Aおよび図14B）体重および空腹時血中グルコースの比較。雄C57マウスに、実験全体にわたって（4～43週）、HFHSDを給餌し、miR-10a-5p模倣体または陰性対照（スクランブルRNA）を2回注射するか（22週時に1回目の注射および31週時に2回目の注射）、22週時の注射を行わず、その後、注射後（post-injection:PI）21週にわたって監視した。各群n＝3～6。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01（HFHSDにおけるmiR-10a-5p模倣体対注射なし）。 図15A～図15Bは、miR-10a-5p模倣体注射が、HFHSD誘導性肥満糖尿病マウスにおける大幅な体重減少（40％）をもたらすことを図解している。（図15A）同齢のNDマウスと比較した、miR-10a-5p模倣体もしくは陰性対照（スクランブルRNA）を注射した、または注射なしの、HFHSD誘導性肥満糖尿病マウスの肉眼解剖学的変化。（図15B）22週時にmiR-10a-5p模倣体を注射した同じHFHSD誘導性肥満糖尿病マウスの注射前とPI4週時点での肉眼解剖学的変化。 図16A～図16Bは、miR-10a-5p模倣体注射がHFHSD誘導性肥満糖尿病マウスにおけるボディマス指数（BMI）および胴囲を低減することを図解している。図14において、NDを給餌し注射を行わなかった健常マウスと比較した、miR-10a-5p模倣体もしくは陰性対照（スクランブルRNA）を注射した、または注射なしの、HFHSD誘導性肥満糖尿病マウスにおける平均BMIおよび平均胴囲の変化（図16Aおよび図16B）（23週時の1回目の注射後、PI8週時点、および31週時の2回目の注射後、PI1週時点で測定した）。各群n＝6～12。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01。 miR-10a-5p模倣体とmiR-10b-5p模倣体によるインスリンの調節が逆であることを実証している。miR-10a-5p模倣体注射は、HFHSD誘導性糖尿病マウスにおけるインスリンレベルをわずかに減少させてから、ゆっくりと回復させるが、miR-10b-5p模倣体注射は、インスリンレベルを一過性に増加させてから徐々に減少させる。HFHSDまたはNDを給餌し、miR-10a-5p模倣体またはmiR-10b-5p模倣体のどちらかを注射するか、注射を行わなかった雄マウスにおける、4週にわたる、6時間の絶食後のインスリンレベルの変化。各実験の各条件につきn＝6～12。＊＊p＜0.01（HFHSDにおけるmiR-10a-5p模倣体対注射なし）;＃＃p＜0.01（HFHSDにおけるmiR-10b-5p模倣体対注射なし）。 図18A～図18Bは、miR-10a-5p模倣体注射がHFHSD誘導性糖尿病マウスにおけるグルコース耐性を改善することを図解している。（図18A）1回目の注射後のPI4週時の腹腔内（IP）グルコース耐性試験（GTT）。（図18B）GTTの曲線下面積（AUC）プロット。各群につきn＝6～12。＊＊p＜0.01。 図19A～図19Bは、miR-10a-5p模倣体注射がHFHSD誘導性糖尿病マウスにおけるインスリン耐性を改善することを図解している。（図19A）1回目の注射後、4W PI時のIPインスリン耐性試験（ITT）。（図19B）ITTの曲線下面積（AUC）プロット。各群につきn＝6～12。＊＊p＜0.01。 図20A～図20Bは、miR-10a-5p模倣体注射がHFHSD誘導性糖尿病マウスにおける（図20A）GLP-1と（図20B）レプチンを増加させることを図解している。miR-10a-5p模倣体注射は、HFHSD誘導性糖尿病マウスにおける（図20A）GLP-1と（図20B）レプチンを、4週かけて、NDを給餌した健常マウスに近いホルモンレベルまで増加させ、回復させる。各実験の各群につきn＝4。＊＊p＜0.01（HFHSDにおけるmiR-10a-5p模倣体対注射なし）。 図21A～図21Fは、miR-10a-5p模倣体注射がGI機能を改善することを図解している。HFHSDを給餌した雄糖尿病マウスまたはNDを給餌した雄健常マウスにおける、miR-10a-5p模倣体を注射するか、注射なしで、PI4週時点の、（図21A）総GI通過時間、（図21B）糞粒排出量および（図21C）結腸通過時間。（図21D～図21F）図21A～図21Cの個々のマウスにおける総GI通過時間、糞粒排出量および結腸通過時間の変化。各群につきn＝6～18。＊＊p＜0.01。 miR-10a-5p模倣体注射が胃内容排出を改善することを実証する一連の蛍光像である。HFHSDを給餌した雄糖尿病マウスまたはNDを給餌した雄健常マウスにおいて、miR-10a-5p模倣体を注射するか、注射を行わずに、蛍光性GastroSense 750（GS）を経口強制投与し、IVIS Lumina IIIシステムで、60分にわたって胃内容排出を測定した。 図23A～図23Dは、HFHSDを給餌したマウスにおいて、miR-10a-5p模倣体とmiR-10b-5p模倣体がどちらも、肥満および糖尿病表現型からの保護をもたらすことを図解している。雄C57マウスにmiR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体、陰性対照（スクランブルRNA）を2回注射するか（1回目および2回目の注射）、または注射を行わず、次に、HFHSDまたはNDを給餌した。（AおよびB）NDを給餌したマウスにおける体重および空腹時血中グルコース。（CおよびD）HFHSDを給餌したマウスにおける体重および空腹時血中グルコース。各群につきn＝3。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01（miR-10a-5p模倣体対注射なし）;＃p＜0.05および＃＃p＜0.01（miR-10b-5p模倣体対注射なし）。 図24A～図24Dは、miR-10a-5p阻害物質とmiR-10b-5p阻害物質がどちらも、NDを給餌したマウスおよびHFHSDを給餌したマウスにおける肥満および糖尿病表現型の引き金を引き、それを悪化させることを示す一連のグラフである。雄C57マウスに、miR-10a-5p阻害物質、miR-10b-5p阻害物質、miR-10a-5p阻害物質とmiR-10b-5p阻害物質の両方（miR-10a/b-5p阻害物質）、陰性対照（スクランブルRNA）のいずれかを、4週時に1回とその後9週時に1回の2回注射するか（1回目および2回目の注射）、または注射を行わず、次にHFHSDまたはNDを給餌した。（図24Aおよび図24B）NDを給餌したマウスにおける体重および空腹時血中グルコース。（図24Cおよび図24D）HFHSDを給餌したマウスにおける体重および空腹時血中グルコース。各群n＝3。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01（miR-10a-5p阻害物質対注射なし）、＃p＜0.05および＃＃p＜0.01（miR-10b-5p阻害物質対注射なし）、＾p＜0.05および＾＾p＜0.01（miR-10a/b-5p阻害物質対注射なし）。 図25A～図25Bは、NDを給餌した雄健常マウスおよびHFHSDを給餌した雄糖尿病マウスにおいて、9週時の2回目の注射後、PI2週時点で、miR-10a-5p阻害物質は空腹時インスリンレベルを増加させ、一方、miR-10b-5p阻害物質は空腹時インスリンレベルを減少させることを図解している。＊＊p＜0.01。 miR-10a-5p阻害物質、miR-10b-5p阻害物質または陰性対照（スクランブルRNA）のいずれかの2回目の注射後、PI4週時点での、または10週における注射なしの、NDを給餌したマウスにおける胃内容排出像を図解している。GSはGastroSense 750を表す。 miR-10a-5とmiR-10b-5pとが、1回目の注射後、PI4週時点で、NDを給餌したマウスの結腸粘膜、膵臓および白色脂肪細胞における幹細胞または前駆細胞の調節に際して、キータンパク質（LGR5、REG4、PDX1、NEROG3およびPDGFRA）を異なる形で標的とすることを実証する、一連のウェスタンブロットである。このウェスタンブロットではGAPDHを内因性対照として使用した。 図28A～図28Cは、miR-10a-5pとmiR-10b-5pが同じ肥満および糖尿病関連タンパク質を異なる形で標的とすることを図解している。肥満および糖尿病関連タンパク質に対するmiR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体、miR-10a-5p阻害物質およびmiR-10b-5p阻害物質によるターゲティング効果の比較。マウス膵β細胞（NIT-1細胞）またはマウス脂肪細胞（L-M細胞）に、miR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体、miR-10a-5p阻害物質、miR-10b-5p阻害物質もしくは陰性対照（スクランブルRNA）をトランスフェクトするか、またはトランスフェクションを行わなかった。（図28A）NIT-1細胞におけるKLF11、KIT、LEP、GLU4、ADIPOQ、IRS-1、IRS-2およびGAPDH対照のウェスタンブロット。タンパク質マーカー（M）は、対応する分子量（kDa）と共に示されている。（図28B）GAPDHで標準化した、Aにおけるタンパク質の定量。（C）L-M細胞におけるLEP、LEPRおよびGAPDH対照のウェスタンブロット。各群につきn＝3。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01。 miR-10a-5p模倣体がHFHSDを給餌した糖尿病マウスにおける脂肪性、炎症性および線維性の肝表現型をレスキューすることを図解する一連の画像および顕微鏡像である。18週（4～22週）にわたってHFHSDを給餌した雄糖尿病C57マウスまたはNDを給餌した雄健常マウスに、22週時に1回、miR-10a-5p模倣体またはmiR-10a-5p阻害物質を注射するか、注射を行わずに、同じ飼料の給餌を続けた。それらのマウスの肝臓の肉眼像および染色像を示す。PI2週時点でHFHSDマウスおよび/またはNDマウスから肝組織を切離し、H＆E染色、オイルレッドO染色（脂質）、ピクロシリウスレッド染色（線維）およびCD64（マクロファージ）で染色した。 図30A～図30Bは、miR-10a-5p模倣体がHFHSDを給餌した糖尿病マウスにおける肝損傷をレスキューすることを図解している。（図30Aおよび図30B）22週時に1回、miR-10a-5p模倣体を注射するか、注射を行わずに、同じ飼料の給餌を続けた、18週にわたってHFHSDを給餌した雄糖尿病マウスまたはNDを給餌した雄健常マウスにおける、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）に関する血液検査。HFHSDマウスおよび/またはNDマウスのASTおよびALTをPI2週時点で測定した。各群n＝3。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01。 図31A～図31Bは、miR-10a-5p模倣体がHFHSDを給餌した糖尿病マウスにおける高コレステロールをレスキューすることを図解している。（図31Aおよび図31B）22週時に1回、miR-10a-5p模倣体を注射するか、注射を行わずに、同じ飼料の給餌を続けた、18週にわたってHFHSDを給餌した雄糖尿病マウスまたはNDを給餌した雄健常マウスにおける、高密度リポタンパク質（HDL）および低密度リポタンパク質（LDL）/超低密度リポタンパク質（VLDL）コレステロールに関する血液検査。HFHSDマウスおよび/またはNDマウスのHDLおよびLDL/VLDLをPI2週時点で測定した。各群n＝6。＊＊p＜0.01。 図32A～図32Bは、miR-10a-5p模倣体がHFHSDを給餌した糖尿病マウスにおける炎症を低減することを図解している。（図32Aおよび図32B）22週時に1回、miR-10a-5p模倣体を注射するか、注射を行わずに、同じ飼料の給餌を続けた、18週にわたってHFHSDを給餌した雄糖尿病マウスまたはNDを給餌した雄健常マウスにおける、炎症誘発性サイトカインIL-6および抗炎症性サイトカインIL-10に関する血液検査。HFHSDマウスおよび/またはNDマウスのIL-6およびIL-10をPI2週時点で測定した。各群n＝6～8。＊＊p＜0.01。 図33A～図33Dは、miR-10b-5p模倣体がHFHSD誘導性糖尿病マウスにおける心機能を改善することを図解する一連のグラフである。HFHSDを給餌した雄糖尿病マウスおよびNDを給餌した雄健常マウスにおける心機能を、miR-10b-5p模倣体またはmiR-10b-5p阻害物質を注射するか、または注射を行わずに、心エコー法を使って評価した。（図33A）駆出率（EF）。（図33B）短縮率（FS）。（図33C）一回拍出量（SV）。（図33D）心拍数（HR）。HFHSDを給餌した糖尿病マウス（注射なし）は、NDを給餌したマウス（注射なし）と比較して低減したEF、FSおよびSVを示した。NDを給餌したマウスにおけるmiR-10b-5p模倣体の注射は、EFとFSを変化させなかったが、SVを改善した。NDを給餌したマウスにおけるmiR-10b-5p阻害物質の注射はEFとFSおよびSVを低減した。HFHSDを給餌したマウスにおけるmiR-10b-5p模倣体またはmiR-10b-5p阻害物質の注射は、EF、FSおよびSVを有意に変化させなかった。心エコー検査中はすべてのマウスにおいて400～500拍/分の心拍数が維持された。各群n＝3。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01。 図34A～図34Bは、体重および血中グルコースに対するmiR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-103/107阻害物質（RG-125）の薬物効果の比較を図解している。miR-10a-5p模倣体は、HFHSDを給餌したマウスにおける肥満および糖尿病表現型をレスキューする。（図34Aおよび図34B）体重および空腹時血中グルコースの比較。雄C57マウスに、実験全体にわたってHFHSDまたはNDを給餌し、22週時に、miR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体またはmiR-103/107阻害物質のいずれかを注射するか、注射を行わず、その後、PI9週間にわたって監視した。AstraZenecaはRegulus Therapeuticsと協同して、2型糖尿病および非アルコール性脂肪性肝疾患を有する患者における、miR-103/107阻害物質（RG-125）を使った臨床試験の第1相および第2相を完了している。miR-10a-5pおよびmiR-10b-5pは、血中グルコースと体重の低下に、miR-103/107阻害物質よりも著しく改善された永続的効果を有する。各群n＝3～6。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01（miR-10a-5p模倣体対miR-103/7阻害物質）、＃p＜0.05および＃＃p＜0.01（miR-10b-5p模倣体対miR-103/7阻害物質）。 処置後8週にわたってHFHSDを給餌した糖尿病マウス、または対照として、注射なしでNDを給餌した健常マウスにおける、血中グルコース、体重およびGI機能に対するmiR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体、普及している抗糖尿病薬物治療薬およびFDAが承認した消化管運動賦活薬の薬物効果の研究デザインを図解している。miR-10a-5p（500ng/g体重）、miR-10b-5p（500ng/g体重）またはスクランブルRNA（500ng/g体重）を、IP注射によって、1週時に1回と2週時に1回の2回、注射した。メトホルミン（250mg/kg体重）またはシタグリプチン（DPP4阻害物質）（10mg/kg体重）は4週にわたって毎日経口（PO）投与した。リラグルチド（GLP-1受容体アゴニスト）（0.2mg/kg体重）は2週にわたり、皮下注射（SC）注射によって1日2回注射した。インスリン（0.75U/kg体重）は4週にわたり、IP注射によって1日1回注射した。プルカロプリド（5-HT4受容体アゴニスト）（2mg/kg体重）は4週にわたって毎日PO投与した。薬物効果を図36～38に示す。 図36A～図36Bは、miR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体が、（図36A）血中グルコースおよび（図36B）体重の低下に、図35に記載の抗糖尿病薬物治療薬および消化管運動賦活薬よりも良好で長い効果を有することを図解している。各群n＝5。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01（miR-10a-5p模倣体対リラグルチド）、＃p＜0.05および＃＃p＜0.01（スクランブル対リラグルチド）、＾p＜0.05および＾＾p＜0.01（miR-10a-5p模倣体対リラグルチド）。 miR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体が、GI運動の改善に、慢性便秘を処置するために使用される抗糖尿病薬物治療薬よりも良好で長い効果を有することを図解している。処置後2～8週の時点で各群の総GI通過時間を測定した。各群n＝5。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001および＊＊＊＊p＜0.0001。薬物処置の頻度は図35に示されている。 図38A～図38Bは、miR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体が、胃内容排出の改善に、慢性便秘を処置するために使用される抗糖尿病薬物治療薬よりも良好で長い効果を有することを図解している。図38Aは、対照スクランブルRNA HFHSD給餌糖尿病マウスにおける遅延した胃内容排出は、4週時点で、miR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体およびプルカロプリドによって改善されるが、リラグルチドは遅延した胃内容排出を改善しないことを実証する一連の画像である。図38Bは、胃内容排出が、miR-10a-5p模倣体またはmiR-10b-5p模倣体を注射したマウスでは8週時点でも依然として正常だが、プルカロプリド処置マウスでは再び遅延していることを示している。薬物処置の頻度は図35に示されている。 図39A～図39Hは、miR-10b-5p模倣体がHFHSD給餌マウスにおける糖尿病および遅いGI通過を防止することを図解している。図39Aは、10b模倣体または10b阻害物質を注射するか、注射を行わずに、HFHSDまたはNDを給餌した、マウスの肉眼像を示している。図39Bおよび図39Cは、上記PI4週間の、マウスにおける体重および空腹時血中グルコースの変化を示している。図39Dおよび図39EはGTTおよびITTを示している。図39F～図39Hは、マウスにおけるA1C（図9F）、miR-10b-5p（図39G）およびインスリン（図39H）のレベルを示している。図39Iは総GI通過時間を示し、図39Jは総糞粒排出量を示している。
詳細な説明
定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の試験のための実施では、本明細書に記載するものと類似するか等価な任意の方法および材料を使用することができるが、本明細書では好ましい材料および方法を説明する。本発明の説明および特許請求では、以下の術語を使用する。
本明細書において使用する術語には、特定の態様を説明する目的しかなく、限定を意図していないことも、理解すべきである。
冠詞「1つの（a）」および「1つの（an）」は、本明細書では、1つのまたは1つより多い（すなわち少なくとも1つの）その冠詞の文法上の対象を指すために使用される。一例として「ある要素（an element）」とは、1つの要素または1つより多い要素を意味する。
本明細書において使用する「約」は、測定可能な値、例えば量、持続時間などを指す場合には、明示された値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらに好ましくは±1％、より一層好ましくは±0.1％の変動を包含することを意味する。そのような変動は開示される方法を実施するのに適当だからである。
本明細書において使用する「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分な刺激を受けたT細胞の状態を指す。活性化には、誘導されたサイトカイン生産および検出可能なエフェクター機能も付随しうる。「活性化T細胞」という用語は、なかんずく、細胞分裂を起こしているT細胞を指す。
本明細書において使用する「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答に起因する障害と定義される。自己免疫疾患は自己抗原に対する不適当で過剰な反応の結果である。自己免疫疾患の例としては、アジソン病（Addision's disease）、円形脱毛症、強直性脊柱炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（I型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群（Guillain-Barr syndrome）、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎などが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用する「自家」という用語は、後でその物質を再導入することになる個体と同じ個体に由来する任意の材料を指すものとする。
「同種異系」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。
「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
本明細書において使用する「がん」という用語は、異常な細胞の迅速で無制御な成長を特徴とする疾患と定義される。がん細胞は、局所的に広がるか、血流およびリンパ系を介して身体の他の部分に広がりうる。さまざまながんの例として、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵がん、結腸直腸がん、腎がん、肝がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がんなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ある特定の態様において、がんは甲状腺髄様癌である。
「切断」という用語は、共有結合の破壊、例えば核酸分子の骨格中の共有結合の破壊を指す。切断は、限定するわけではないが、ホスホジエステル結合の酵素的加水分解または化学的加水分解などといった、さまざまな方法で開始させることができる。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能である。二本鎖切断は2つの相異なる一本鎖切断事象の結果として起こりうる。DNA切断は平滑端または突出端のいずれかの生成をもたらしうる。ある特定の態様では、切断される二本鎖DNAをターゲティングするために融合ポリペプチドを使用しうる。
本明細書において使用する「保存的配列改変」という用語は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に著しい影響を及ぼすかまたは著しく変化させることのない、アミノ酸改変を指すものとする。そのような保存的改変には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。改変は、例えば部位指定変異導入法やPCR媒介変異導入法などといった当技術分野において公知の標準的技法によって、本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。当技術分野では類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β-分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、抗体のCDR領域内の1つまたは複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えることができ、変化させた抗体を、本明細書記載の機能アッセイを使って、抗原結合能について試験することができる。
「疾患」とは、動物がホメオスタシスを維持できず、その疾患が改善されなければ、その動物の健康が悪化し続けるという、動物の健康状態である。これに対し、動物における「障害」とは、動物はホメオスタシスを維持することはできるが、その動物の健康状態は、その障害がない場合よりも好ましくないという、健康状態である。無処置のまま放置しても、障害は、その動物の健康状態のさらなる低下を、必ずしも引き起こさない。
「有効量」または「治療有効量」は本明細書では相互可換的に使用され、特定の生物学的結果を達成するのにまたは治療上もしくは予防上の利益を与えるのに有効な、本明細書に記載する化合物、製剤、材料または組成物の量を指す。そのような結果としては、当技術分野における適切な任意の手段によって決定される抗腫瘍活性を挙げることができるが、それに限定されるわけではない。
「コードする」とは、生物学的プロセスにおいて、所定のヌクレオチド配列を有するか（すなわちrRNA、tRNAおよびmRNA）または所定のアミノ酸配列を有する他のポリマーおよび高分子の合成のために、テンプレートとして役立つという、遺伝子、cDNAまたはmRNAなどのポリヌクレオチド中の特定ヌクレオチド配列の固有の性質、およびそこからもたらされる生物学的性質を指す。したがって、ある遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的な系においてタンパク質を生産するのであれば、その遺伝子はタンパク質をコードする。コード鎖、すなわちmRNA配列と同一であって通常は配列表に掲載されているヌクレオチド配列と、遺伝子またはcDNAの転写にテンプレートとして使用される非コード鎖は、どちらも、タンパク質またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードしているということができる。
本明細書において使用する「操作された」、「遺伝子操作された（genetically engineered）」、「組換え」）、「非自然（non-naturally occurring）」および「非天然（non-natural）」という用語は、人間が意図的にマニピュレートした合成ポリヌクレオチドおよび合成ポリペプチドを指すために、相互可換的に使用される。
本明細書において使用する「内因性」とは、ある生物、細胞、組織もしくは系の内部に由来するか、またはある生物、細胞、組織もしくは系の内部で生産される、任意の物質を指す。
本明細書において使用する「外因性」という用語は、ある生物、細胞、組織もしくは系の外部から導入されるか、ある生物、細胞、組織もしくは系の外部で生産される任意の物質を指す。
本明細書において使用する「RNA干渉」またはRNAiという用語は、合成低分子干渉RNA（small interfering RNA）（siRNA）が、またはマイクロRNA（miRNA）、短鎖干渉RNA（short interfering RNA）（siRNA）もしくは短鎖ヘアピンRNA（shRNA）などといったRNA分子の発現が、相補的mRNA分子の配列特異的な分解または翻訳抑制を引き起こすプロセスである。したがってRNAiは転写後遺伝子サイレンシングの一形態である。
本明細書において使用する「miRNA模倣体」という用語は、内因性miRNAに類似するかまたはその機能を模倣することができる内因性miRNAの二本鎖合成版を指す。合成miRNA模倣体は、内因性の対応物よりも（例えば分解に対する耐性の向上などによって）大きなまたは小さな活性を有するように、（例えば化学的に）修飾することができる。これに対し、「miRNA阻害物質」または「アンチmiR」は、内因性標的miRNAに結合して、それらがそれぞれのmRNA標的を調節するのを妨げる、合成一本鎖RNA分子を指す。
本明細書において使用する「増大する」という用語は、T細胞の数が増加する場合のように、数が増加することを指す。一態様において、エクスビボで増大されるT細胞は、培養中に元々存在していた数と比較して、数が増加する。別の一態様において、エクスビボで増大されるT細胞は、培養中の他の細胞タイプと比較して、数が増加する。本明細書において使用する「エクスビボ」という用語は、生きている生物（例えばヒト）から取り出し、その生物の外で（例えば培養ディッシュ、試験管またはバイオリアクター中で）増殖させた細胞を指す。
本明細書において使用する「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の、そのプロモーターによって駆動される、転写および/または翻訳と定義される。
「発現ベクター」とは、発現させようとするヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは発現にとって十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって供給されるか、またはインビトロ発現系中に供給されうる。発現ベクターには、例えば組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば裸のプラスミドまたはリポソームに含まれているプラスミド）およびウイルス（例えばセンダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）など、当技術分野において公知のものはすべて包含される。
本明細書において使用する「相同」とは、2つのポリマー分子、例えば2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子などといった2つの核酸分子、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を指す。2つの分子の両方で、あるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められている場合、例えば2つのDNA分子のそれぞれにおけるある位置がアデニンで占められているなら、それらはその位置において相同である。2つの配列間の相同性は、一致位置または相同位置の数の直接的関数である。例えば2つの配列中の位置の半分（例えば長さ10サブユニットのポリマー中の5つの位置）が相同であるなら、それら2つの配列は50％相同であり、位置の90％（例えば10中の9）が一致するか相同であるなら、それら2つの配列は90％相同である。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、キメラ免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えばFv、Fab、Fab'、F（ab'）2または抗体の他の抗原結合性部分配列）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（CDR）からの残基が、所望の特異性、アフィニティーおよび容量を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のCDRからの残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらにまた、「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体にもインポートされるCDR配列またはフレームワーク配列にも見いだされない残基を含むことができる。これらの改変は抗体の性能をさらに精密化し最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域のすべてまたは実質上すべてが非ヒト免疫グロブリンに対応し、FR領域のすべてまたは実質上すべてがヒト免疫グロブリン配列のそれである、少なくとも1つの、典型的には2つの、可変ドメインの実質上すべてを含むと考えられる。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含むと考えられる。さらなる詳細については、Jones et al.,Nature,321:522-525,1986、Reichmann et al.,Nature,332:323-329,1988、Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992を参照されたい。
「完全ヒト」とは、分子全体がヒト由来であるか、ヒト型の抗体と同一なアミノ酸配列からなる、抗体などの免疫グロブリンを指す。
本明細書において使用する「同一性」とは、2つのポリマー分子間の、特に2つのアミノ酸分子間、例えば2つのポリペプチド分子間の、サブユニット配列同一性を指す。2つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する場合、例えば2つのポリペプチド分子のそれぞれにおけるある位置がアルギニンで占められているなら、それらはその位置において同一である。同一性、または2つのアミノ酸配列がアラインメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する程度は、パーセンテージとして表されることが多い。2つのアミノ酸配列間の同一性は、一致位置または同一位置の数の直接的関数である。例えば2つの配列中の位置の半分（例えば長さ10アミノ酸のポリマー中の5つの位置）が同一であるなら、それら2つの配列は50％同一であり、位置の90％（例えば10個中の9個）が一致するか同一なら、それら2つのアミノ酸配列は90％同一である。
「単離された」とは、自然状態から変更されまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物中に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、その自然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在するか、または例えば宿主細胞などの非ネイティブ環境に存在することができる。
本明細書において使用する「改変された」という用語は、本発明の分子または細胞の、変化した状態または構造を意味する。分子は、さまざまな方法で、例えば化学的、構造的および機能的に改変されうる。細胞は核酸の導入によって改変されうる。
本明細書において使用する「調整する」という用語は、ある処置または化合物の非存在下での対照における応答のレベルと比較した、および/または無処置である点を除けば同一である対象における応答のレベルと比較した、対照における応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、ネイティブのシグナルまたは応答に摂動を加えおよび/または影響を及ぼし、それによって、対象、好ましくはヒトにおける有益な治療応答を媒介することを包含する。
本発明では、よく見られる核酸塩基について、以下の略号を使用する。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
別段の明示がある場合を除き、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重物であって同じアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列をすべて包含する。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部のバージョンではイントロンを含有しうるという限りにおいて、イントロンも包含しうる。
「機能的に連結される」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結であり、後者の発現をもたらすものを指す。例えば、第1核酸配列が第2核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、第1核酸配列は第2核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすのであれば、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたDNA配列は連続しており、2つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合には、同じ読み枠にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）もしくは胸骨内注射、または注入技法が含まれる。
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらにまた、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書において使用される核酸とポリヌクレオチドは相互可換である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それを単量体型「ヌクレオチド」に加水分解することができるという一般知識を有している。単量体型ヌクレオチドはヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書において使用するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において利用可能な任意の手段によって、例えば限定するわけではないが、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCR（商標）などを使った組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングによって得られる、および合成手段によって得られる、すべての核酸配列が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用する「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は相互可換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに接合された2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を包含する。本明細書において使用する場合、この用語は、当技術分野においてペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーなどともよく呼ばれる短い鎖と、当技術分野において一般にタンパク質と呼ばれて多くのタイプが存在する長い鎖を、どちらも包含する。「ポリペプチド」は、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変されたポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質などを包含する。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組合せを包含する。
本明細書において使用する「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識され、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要な、DNA配列と定義される。
本明細書において使用する「プロモーター/調節配列」という用語は、そのプロモーター/調節配列に機能的に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。ある場合、この配列はコアプロモーター配列であることができ、また別の場合、この配列はエンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要な他の調節要素も含みうる。プロモーター/調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現させるものでありうる。
「構成的」プロモーターは、ある遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、ある細胞におけるその遺伝子産物の生産を、その細胞の大半のまたはすべての生理条件下で引き起こすヌクレオチド配列である。
「誘導性」プロモーターは、ある遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、ある細胞におけるその遺伝子産物の生産を、実質上、そのプロモーターに対応する誘導物質がその細胞内に存在する場合にのみ、引き起こすヌクレオチド配列である。
「組織特異的」プロモーターは、ある遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、ある細胞におけるその遺伝子産物の生産を、実質上、その細胞が該プロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ、引き起こすヌクレオチド配列である。
「シグナル伝達経路」とは、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達に役割を果たすさまざまなシグナル伝達分子の間の生化学的関係性をいう。「細胞表面受容体」という語句には、シグナルを受取り、細胞の形質膜越しにシグナルを伝達する能力を有する分子および分子の複合体が包含される。
抗体に関して本明細書において使用する「特異的に結合」という用語は、特異的抗原を認識するが、試料中の他の分子は実質的に認識も結合もしない抗体を意味する。例えば、ある種からの抗原に特異的に結合する抗体は、1つまたは複数の種からのその抗原にも結合しうる。しかし、そのような異種間反応性、それ自体によって、特異的であるという抗体の分類が変更されることはない。別の例において、ある抗原に特異的に結合する抗体は、その抗原の異なるアレル型にも結合しうる。しかし、そのような交差反応性、それ自体によって、特異的であるという抗体の分類が変更されることはない。場合によっては、抗体、タンパク質またはペプチドと第2の化学種との相互作用に関して、その相互作用が化学種上の特定構造（例えば抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味するために、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を使用することができる。例えば抗体は、タンパク質一般ではなく、特異的なタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的であるとすると、標識された「A」を含む反応において、エピトープAを含有する分子（または遊離の非標識A）の存在は、抗体に結合される標識されたAの量を低減すると考えられる。
「対象」という用語は、生きている生物であり、その体内での免疫応答を引き出すことができるもの（例えば哺乳動物）を包含するものとする。ここで使用する「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物でありうる。非ヒト哺乳動物としては、例えば家畜およびペット、例えばヒツジ類、ウシ類、ブタ類、イヌ類、ネコ類およびネズミ類の哺乳動物が挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。
「標的部位」または「標的配列」とは、核酸のうち、結合が起こるのに十分な条件下で結合分子が特異的に結合しうる部分を規定する、ゲノム核酸配列をいう。
本明細書において使用する「治療」という用語は、処置および/または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。
本明細書において使用する「トランスフェクトされる」または「形質転換される」または「形質導入される」という用語は、外因性核酸が宿主細胞中に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクト」細胞または「形質転換」細胞または「形質導入」細胞とは、外因性核酸によるトランスフェクションまたは形質転換または形質導入を受けた細胞をいう。細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
「導入遺伝子」という用語は、動物、特に哺乳動物、より具体的には生きている動物の哺乳動物細胞のゲノムに、人為的に導入された、または人為的に導入されようとしている、遺伝物質を指す。
「トランスジェニック動物」という用語は、非ヒト動物、通常は哺乳動物であり、非内因性（すなわち異種）核酸配列が、その細胞の一部分に染色体外要素として存在するか、その生殖系列DNAに安定に（すなわちその動物細胞の大半またはすべてのゲノム配列に）組み込まれている動物、例えばトランスジェニックマウスを指す。異種核酸は、例えば宿主動物の胚または胚性幹細胞の遺伝子操作（gene manipulation）によって、そのようなトランスジェニック動物の生殖系列に導入される。
「ノックアウトマウス」という用語は、既存の遺伝子が不活化（すなわち「ノックアウト」）されているマウスを指す。いくつかの態様において、遺伝子は相同組換えによって不活化される。いくつかの態様において、遺伝子は人工的核酸配列による置き換えまたは途絶によって不活化される。
疾患を「処置する」とは、この用語を本明細書において使用する場合には、対象が経験する疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。
本明細書において使用する「転写制御下」または「機能的に連結された」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始とポリヌクレオチドの発現を制御するために、そのポリヌクレオチドに対して正しい位置と配向にあることを意味する。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、その単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物である。限定するわけではないが、例えば線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスなど、当技術分野では数多くのベクターが公知である。したがって「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを包含する。この用語は、例えばポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸の移入を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物を包含するとも解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
範囲:本開示の全体を通して、本発明のさまざまな局面は、範囲形式で表される場合がある。範囲形式での説明は、単に便宜上および簡潔な表現のためであり、本発明の範囲に対する確固たる限定であると解釈してはならないと、理解すべきである。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内の考えうる部分的範囲および個々の数値を具体的に開示しているとみなすべきである。例えば、1～6などの範囲の説明は、1～3、1～4、1～5、2～4、2～6、3～6などの部分的範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6などを、具体的に開示しているとみなすべきである。これは範囲の幅とは無関係に適用される。
説明
ICC内でのmir-10b欠損の効果を調べるために、ICC特異的miR-10bノックアウト（KO）マウス系統を作製した。驚いたことに、健常成体マウスのICC内でmiRNA遺伝子をコンディショナルに欠失させると、マウスは胃不全麻痺を発生し、徐々に過体重かつ高血糖になった。これらはいずれも2型糖尿病（T2D）の特徴である。ここでは、新しいマウスモデルにおいて、GI管での蠕動運動活性の障害が肥満とT2Dの両方につながることが発見された。糖尿病患者における最も一般的な病的GI異常は、蠕動運動活性を調節するGIペースメーカー細胞であるICCの枯渇である。
胃不全麻痺誘導性糖尿病（gastroparesis-induced diabetes）というこの新しい発見は予想外であり、糖尿病状態がICC変性と胃不全麻痺を引き起こすという現在広まっている見解とは相容れない。理論に束縛されることは望まないが、miR-10b欠損が媒介するICC変性は、単なる一症状ではなく、実際には、肥満およびT2D様症状の原因になると考えられる。
本発明はさらに、miR-10a-5p模倣体と、それが調節する遺伝子、例えばクルッペル様因子11（KLF11）、レプチン（LEP）、アディポネクチン（ADIPOQ）、インスリン依存性グルコース輸送体4型（GLU4/GLUT4）およびチロシン-プロテインキナーゼ（KIT）は、体脂肪および体重の低減、グルコースホメオスタシスおよびインスリン感受性の回復、ならびに胃腸（GI）機能の改善をもたらすことができるという予想外の発見に基づく。
最近の研究により、糖尿病および胃腸運動障害の処置では、miR-10b-5p模倣体とその標的を使用できることが確認されている。その後の研究により、糖尿病マウスにおけるグルコースホメオスタシスおよびインスリン感受性の回復とGI機能の改善に関して類似する効果を有する別のmiRNA、miR-10a-5p模倣体が同定された。miR-10a-5pとmiR-10b-5pの違いは配列の真ん中にある単一ヌクレオチド塩基だけである。しかし、肥満糖尿病マウスへのmiR-10a-5p模倣体の注射は、血中グルコースを低下させ、GI機能を改善することに加えて、体脂肪および体重を激減させる。さらにまた、これら2つのmiRNAは、どちらも血中グルコースを低下させるものの、インスリンレベルの調節の仕方は対照的である。miR-10a-5p模倣体がインスリンレベルを減少させるのに対して、miR-10b-5p模倣体はインスリン生産を増加させる。miRNA模倣体データと合致して、miR-10a-5p阻害物質およびmiR-10b-5p阻害物質は、インスリンレベルに反対で逆の効果を有する。これらの観察結果は、インスリン生産を増加させることによって血中グルコースを低下させるmiR-10b-5p模倣体とは異なり、miR-10a-5p模倣体は、インスリンを増加させずにインスリン感受性を改善することによって血中グルコースを低下させる能力を有することを示唆している。miR-10a-5p模倣体によるインスリン感受性の改善は、インスリン依存性グルコース輸送体GLUT4をアップレギュレートすることによって達成されうる。miR-10a-5pによる処置は、主に脂肪細胞によって生産されるホルモンであるレプチンの発現も増加させ、空腹感を阻害することによってエネルギーバランスを調節し、脂肪細胞における脂肪貯蔵を低減する。理論に束縛されることは望まないが、miR-10a-5p模倣体は肥満2型糖尿病とGI運動障害を有する患者の処置に理想的であり、miR-10b-5p模倣体は、1型糖尿病、非肥満2型糖尿病およびGI運動障害の患者の処置に理想的である。
糖尿病および関連状態
一局面において、本開示の発明は、その必要のある対象において糖尿病を処置する方法であって、その対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体またはmiR-10b-5p模倣体を投与する工程を含む、方法を提供する。糖尿病または真性糖尿病とは、ホルモンであるインスリンの生産、分泌または機能における欠陥の結果として、グルコースまたは糖の使用を適正に調節できないことに広く関連する疾患群をいう。インスリン機能の異常は、炭水化物、脂質およびタンパク質の代謝異常につながる。糖尿病は大きく2タイプに分けられる。1型、すなわちインスリン依存性真性糖尿病は、膵臓中のインスリン産生β細胞の破壊をもたらす自己免疫反応に起因し、これは結果としてインスリンの全身性の欠乏をもたらす。この疾患の処置は、主として、血中グルコースレベルを定期的に監視し、1日に数回、インスリンを注射することからなる。インスリン投薬量の管理に失敗すると、重篤な低血糖と、脳および他の機能の、生命にかかわる損傷とが起こりうる。
2型、すなわちインスリン非依存性真性糖尿病（T2DM）は、典型的には成人に発生し、インスリンの作用に対する抵抗性を生じる脂肪組織（adipose fat tissue）、筋肉および肝臓などといったグルコース応答組織と関連する、より複雑な疾患である。T2DMの初期段階では、膵島細胞が過剰量のインスリンを分泌することによって補償する。介入がなければ、β膵島細胞の機能障害が起こり、それが代償不全および慢性高血糖につながる。加えて、T2DMは、本来ならインスリン感受性である細胞が正常に応答できない末梢インスリン抵抗性を伴う場合もある。1型糖尿病は若年期に現われる急性疾患であることが多いのに対して、2型糖尿病は、遺伝的特徴や生活様式を含む数多くの要因の結果として、中年期以降に徐々に発生しうる。T2DMの処置によく使用される薬物治療には以下の数種類がある。1）インスリン分泌を直接刺激するが、低血糖を引き起こすリスクがある、インスリン放出作用物質;2）グルコース誘発インスリン分泌を強化するが、食事のたびに前もって服用しなければならない、食事性インスリン放出薬（diet insulin releaser）;3）消化によるグルコースの産生を低減する、メトホルミンを含むビグアナイド類;4）グルコース代謝遺伝子の発現を調整することによってインスリンに対する末梢応答を改善するが、体重増加、浮腫および肝毒性などの副作用を有する、チアゾリジンジオン誘導体ロジグリタゾンおよびピオグリタゾンなどのインスリン抵抗性改善薬;5）末期T2DMでは必要となることが多いインスリン注射。
2型糖尿病の代謝的性質およびこの状態に起因する異常に高い血糖は、しばしば、広範な体組織に影響を及ぼす症状および障害の発生につながる。糖尿病は、肥満、脂肪肝疾患、高脂質血症、脂肪肝疾患、ならびに胃不全麻痺および便秘を含むGI運動障害の発生率の上昇と関連付けられている。
T2DM関連インスリン抵抗性は、一般に、アテローム性動脈硬化、肥満、高脂質血症および本態性高血圧と関連する。この異常状態群は「代謝」またはインスリン抵抗性を構成する。加えて、インスリン抵抗性は脂肪肝疾患に関連し、これは、慢性炎症または非アルコール性肝炎、線維症および肝硬変につながりうる。非アルコール性脂肪性肝疾患は肝臓におけるトリアシルグリセロールの蓄積から始まり、肝細胞の5％超における細胞質脂質滴の存在または健常個体の95パーセンタイルを超えるTAGレベルと定義される。T2DMと脂肪肝疾患はどちらも互いの有害な帰結と関連する。2型糖尿病は、脂肪肝疾患患者における進行性肝疾患および肝臓関連死のリスク因子であるのに対し、脂肪肝疾患は、2型糖尿病を有する個体における心血管リスクおよび死亡のマーカーでありうる。肝細胞傷害と炎症を特徴とするNAFLDの組織亜型である非アルコール性脂肪性肝炎は、T2DMを有する患者のおよそ10％に存在し、肝硬変の発生および肝臓関連死のリスクの増加と関連している。
上部胃腸管の、一般的だが重篤な慢性障害である糖尿病性胃不全麻痺は、物理的閉塞が存在しない状況下での胃内容排出の遅延の存在によって定義され、悪心、嘔吐、早期満腹感、腹部膨満および腹痛などの症状と関連する。現在、糖尿病性胃不全麻痺のための唯一のFDA承認薬はメトクロプラミドであり、これは、ドーパミンD2受容体アンタゴニストおよび弱い5-HT4アゴニスト活性を有する5-HT3受容体アンタゴニストであり、12週以下の処置期間で、急性および反復性の糖尿病性胃内容うっ滞に関連する症状の緩和に適応を有する。しかしメトクロプラミド処置には、突然の筋れん縮およびうつ病/気分変動などといった重大な副作用が付随する。
miRNAによる遺伝子発現調節
一局面において、本発明は、糖尿病および糖尿病に関係する状態を処置するためにmiR-10a-5pおよびmiR-10b-5pのmiRNA模倣体を使用する方法を提供する。
miRNAは、典型的には20～22ヌクレオチド長の小さなノンコーディングRNA分子である。miRNAは、遺伝子の発現と機能のキー調節因子として作用し、これは、転写後のRNAと相互作用して、その安定性と後続の翻訳を調整することにより、遺伝子発現を修飾するように作用する。miRNAを含むncRNAの生物学的役割の理解は急速に進歩しつつある。数多くの進化学的研究により、ノンコーディングRNAはタンパク質コードRNAより4倍近く多く発現し得るということが明らかになっている。
内因性miRNAは、100～1000ヌクレオチド（nt）の一次miRNA（pri-RNA）として、RNAポリメラーゼIIによって転写される。miRNAは5'キャッピングおよび3'ポリ（A）テーリングによって修飾されうる。pri-miRNAのmiRNAコード部分はヘアピンを形成し、それが、dsRNA特異的リボヌクレアーゼであるドローシャおよびその補因子であるディジョージ症候群染色体領域（DiGeorge syndrome critical region）8（DGCR8）によって切断されることで、約60～70nt長のpre-miRNAを形成する。pre-miRNAはダイサーおよびトランス活性化因子RNA結合タンパク質TRBPによってさらにプロセシングされて、2つの成熟miRNA（5'鎖および3'鎖miRNA）を含有するmiRNA二重鎖を与える。各成熟miRNAは約22～23nt長である。
成熟miRNAとその標的との間の相補性の程度に依存して、いくつかのmRNAサイレンシング機序が生じうる。成熟miRNAの位置2から位置7までの先頭塩基は「シード」配列と呼ばれ、標的mRNAとのペアリング特異性の大半をもたらす。場合により、シード配列とそのコグネイト標的との間のペアリングが完全であれば、コグネイトmRNAの切断と分解を媒介には十分である。しかし、哺乳動物およびウイルスのmRNA標的の場合、より典型的には、切断は、シードおよび他の領域におけるミスマッチを含むペアリングによって損なわれ、翻訳阻害は、翻訳機構の結合との物理的干渉によって起こる。miRNAがコグネイトmRNAを標的とするのに必要なシード配列の相補鎖長（complementary length）は短いので、各miRNAには、何百もの転写産物を標的とし、それらを調整する可能性がある。さらにまた、逆にmRNA分子は数多くの相異なるmiRNAによる作用を受けることにもなりうる。大半のmiRNAは標的タンパク質レベルをせいぜい2分の1に減少させるだけだが、これは有意な生理学的効果を発揮するのに十分であることが多い。したがって内因性miRNA経路は、特異的な機能的経路を調整すると共に、数多くの遺伝子の発現を同時に微調整するための、極めて効率のよい系である。miRNAは、哺乳動物におけるすべてのタンパク質コード遺伝子のおよそ30％の活性を制御していると予測され、胚発生から造血細胞発生に及ぶ正常な生理学的プロセスにおいて、ならびに心血管疾患、がんおよび免疫障害などの疾患において、重要な役割を果たしている。最近の研究で、miR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体は、糖尿病ならびに胃不全麻痺、脂肪肝疾患および肥満などといった他の状態をうまく処置しうることが実証された。
miRNA模倣体
本開示のある特定の態様において、本発明は、内因性のmiR-10b-5p miRNAおよびmiR-10a-5p miRNAによって調節されるヒト遺伝子を標的とするいくつかのmiRNA模倣体を提供する。miRNA模倣体は、非天然二本鎖miRNA様RNAフラグメントを利用する遺伝子サイレンシングの戦略である。これらのフラグメントの5'端は、標的遺伝子にユニークな3'UTR中のコグネイト配列に対して部分的に相補的な配列を有する。このRNAフラグメントは、発現されるか細胞中に導入されると、内因性miRNAの機能を模倣して標的遺伝子に特異的に結合し、それが、遺伝子の転写後抑制を、典型的には転写の阻害によってもたらす。したがってmiRNA模倣体は、特異的遺伝子に影響を及ぼすように、正確にターゲティングされうる。本発明のさまざまな態様において、miR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体は、限定するわけではないがKLF11、KIT、ロイペプチン、GLU/GLUT4、アディポネクチン、LGR5、REG4、PDX1、NEUROG3、PDGFA、LEP、LEPRおよびIRS21（miR-10a-5p）ならびにKLF7、KLF11、KIT、INSR、IRS2、およびIRS1（miR-10b-5p）を含むいくつかの標的遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる。
miR-10a-5p模倣体
本発明のいくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体の模倣体は、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである。
いくつかのmiR-10a-5p模倣体およびmiR-10a-5p模倣体阻害物質の配列および/または供給源を以下に列挙する。
10a-5p模倣体1:10a二重鎖RNA
センス:
Figure 2022530031000001
アンチセンス:
Figure 2022530031000002
miR-10b-5p:10a-5p一本鎖RNA（miR-10a-5p）
Figure 2022530031000003
10a阻害物質:10a-3p一本鎖RNA（miR-10a-5p阻害物質）
Figure 2022530031000004
成熟配列に下線を引いたヒトmir-10a遺伝子（ステム-ループ）
アクセッション:MI0000266
ID:hsa-mir-10a
Figure 2022530031000005
成熟配列mmu-miR-10a-5p（miR-10a模倣体）
アクセッション:MIMAT0000253
ID:hsa-miR-10a
Figure 2022530031000006
成熟配列に下線を引いたマウスmir-10a遺伝子（ステム-ループ）
アクセッション:MI0000685
ID:mmu-mir-10a
Figure 2022530031000007
成熟配列mmu-miR-10a-5p（miR-10a模倣体）
アクセッション:MIMAT0000648
ID:mmu-miR-10a
Figure 2022530031000008
miR-10b-5p模倣体
いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである。
いくつかのmiR-10b-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体阻害物質の配列および/または供給源を以下に列挙する。
10b模倣体1［図5B～図5C］（MC11108、Thermo Fisher Scientific）:10b二重鎖RNA
センス:
Figure 2022530031000009
アンチセンス:
Figure 2022530031000010
10b模倣体2［図5C］（C-310431-07-0005、Dharmacon）:10b二重鎖RNA
10b模倣体3［図5C］（219600、QIAGEN）:10b RNA二重鎖
miR-10b-5p（IDT）:10b-5p一本鎖RNA（miR-10b-5p）
Figure 2022530031000011
アニールしたmiR-10b-3pとmiR-10b-5p（IDT）:miR-10b-5p/3pによる10b二重鎖RNA
センス:
Figure 2022530031000012
アンチセンス:
Figure 2022530031000013
10b模倣体7（IDT）:10b前駆体RNA
Figure 2022530031000014
miRNA模倣体は商業的に入手することができる。ヒトmiR-10b-5p模倣体（has-miR-10b-5p）はThermo Fisher Scientificから商業的に入手することができる（製品名mirVana（登録商標）miRNA模倣体;製品ID MC11108）。
成熟miR-10b配列は、
Figure 2022530031000015
である。
成熟配列に下線を引いたヒトmir-10b遺伝子（ステム-ループ）
アクセッション番号:MI0000267
ID:hsa-mir-10b
＞hsa-mir-10b MI0000267
Figure 2022530031000016
成熟配列hsa-miR-10b-5p（miR-10b模倣体）
アクセッション:MIMAT0000254
ID:hsa-miR-10b
＞hsa-miR-10b-5p MIMAT0000254
Figure 2022530031000017
成熟配列に下線を引いたマウスmir-10b遺伝子（ステム-ループ）
アクセッション:MI0000221
ID:mmu-mir-10b
＞mmu-mir-10b MI0000221
Figure 2022530031000018
成熟配列mmu-miR-10b-5p（miR-10b模倣体）
アクセッション:MIMAT0000208
ID:mmu-miR-10b
＞mmu-miR-10b-5p MIMAT0000208
Figure 2022530031000019
陰性対照または阻害物質:
陰性対照＃1（4464058、Thermo Fisher Scientific）:非ターゲティング二重鎖RNA
10b阻害物質（Thermo Fisher Scientific）:10b-5p阻害物質RNA（miR-10b-5pのアンチセンス）
Figure 2022530031000020
miR-10b-3p（IDT）:10b-3p一本鎖RNA（miR-10b-5p阻害物質）
Figure 2022530031000021
処置の方法
その必要のある対象において糖尿病を処置する方法であって、有効量のmiR-10a-5p模倣体を対象に投与し、それによって糖尿病状態を処置する工程を含む、方法が提供される。いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体は、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである。
いくつかの態様において、糖尿病は2型糖尿病である。いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体は哺乳類のものである。いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体はヒトのものである。いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体は操作されている。いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体は薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む。
有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって対象の体重を低減する工程を含む、対象の体重を低減するための方法も提供される。いくつかの態様において、miR-10a-5pによる処置はレプチンのアップレギュレーションをもたらし、それによって空腹感を減少させると共に脂肪貯蔵を低減し、それにより、体重減少をもたらす。
有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって対象における血中グルコースを低下させる工程を含む、対象における血中グルコースを低下させるための方法も提供される。
その必要のある対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって対象におけるインスリン感受性を増加させる工程を含む、インスリン感受性を増加させるための方法も提供される。
前記方法のいずれか1つのいくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体は、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである。さらなる態様において、miR-10a-5p模倣体は哺乳類のものである。さらなる態様において、miR-10a-5p模倣体はヒトのものである。さらなる態様において、miR-10a-5p模倣体は操作されている。さらなる態様において、miR-10a-5p模倣体は薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む。
その必要のある対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって対象における胃腸疾患を処置する工程を含む、胃腸疾患を処置するための方法も提供される。いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体は、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである。いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は哺乳類のものである。いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体はヒトのものである。
いくつかの態様において、胃腸疾患は、胃不全麻痺、機能性胃腸障害、機能性胃腸運動障害、および偽性腸閉塞からなる群より選択される。さらなる態様において、機能性胃腸障害は、過敏性腸症候群、機能性便秘、および特定不能の機能性腸障害からなる群より選択される。
その必要のある対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって対象におけるインスリン感受性を増加させる工程を含む、インスリン感受性を増加させるための方法も提供される。いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体の投与は、インスリン依存性グルコース輸送体4（GLU4/GLUT4）の発現の増加をもたらす。さらなる態様において、miR-10a-5p模倣体の投与は、対象における血中グルコースレベルの減少をもたらす。
前記方法のいずれか1つのいくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体は、KLF11、KIT、ロイペプチン、GLU4/GLUT4、アディポネクチンおよびIRS2ならびにそれらの組合せからなる群より選択される遺伝子を標的とする。
miR-10a-5p模倣体と薬学的に許容される担体またはアジュバントとを含む組成物も提供される。いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体と薬学的に許容される担体またはアジュバントとを含む組成物が提供される。いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体は、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである。いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体は操作されている。
その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象におけるカハール介在細胞（ICC）増殖を増加させる工程を含む、ICC増殖を増加させるための方法が提供される。いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである。さらなる態様において、miR-10b-5p模倣体は哺乳類のものである。さらなる態様において、miR-10b-5p模倣体はヒトのものである。
いくつかの態様において、対象におけるICC増殖の増加により対象におけるICCの機能が回復する。さらなる態様において、ICCは、対象の胃腸管の平滑筋内に位置する。さらなる態様において、平滑筋は、対象の胃内、小腸内、または結腸の平滑筋内に位置する。
いくつかの態様において、ICCは、ICC前駆体、ICC-MY、ICC-IM、ICC-DMP、ICC-SM、またはICC-SMPを含む。
いくつかの態様において、対象はヒトである。
その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象におけるKIT発現を増加させる工程を含む、ICCにおけるKIT発現を増加させるための方法が提供される。いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである。さらなる態様において、miR-10b-5p模倣体は哺乳類のものである。さらなる態様において、miR-10b-5p模倣体はヒトのものである。
いくつかの態様において、対象におけるKIT発現の増加により対象におけるICCの機能が回復する。
いくつかの態様において、対象へのmiR-10-b-5p模倣体の投与は、KLF7およびKLF11の発現の減少をもたらす。
いくつかの態様において、胃腸疾患ではICCが表現型的に不活化され、非機能的になる。
その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象における胃腸疾患を処置する工程を含む、胃腸疾患を処置するための方法も提供される。いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである。さらなる態様において、miR-10b-5p模倣体は哺乳類のものである。さらなる態様において、miR-10b-5p模倣体はヒトのものである。
いくつかの態様において、胃腸疾患は、胃不全麻痺、機能性胃腸障害、機能性胃腸運動障害、および偽性腸閉塞からなる群より選択される。さらなる態様において、機能性胃腸障害は、過敏性腸症候群、機能性便秘、および特定不能の機能性腸障害からなる群より選択される。
その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象の体重を低減する工程を含む、体重を低減するための方法が提供される。
その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象における血中グルコースを低下させる工程を含む、血中グルコースを低下させるための方法も提供される。
その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象における膵幹細胞（PSC）増殖または膵前駆細胞（PPC）増殖を増加させる工程を含む、KIT＋ PSC増殖またはKIT＋ PPC増殖を増加させるための方法も提供される。いくつかの態様において、PSC増殖またはPPC増殖は、対象において、対照と比較して増加する。
その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象におけるインスリン感受性を増加させる工程を含む、インスリン感受性を増加させるための方法も提供される。いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体の投与は、対象における骨格筋細胞（SkMC）へのグルコース取込みの増加をもたらす。さらなる態様において、miR-10b-5p模倣体の投与は、対象における血中グルコースレベルの減少をもたらす。一部の糖尿病対象では、対象のSkMCにインスリン抵抗性が認められる場合がある。
その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象におけるインスリン遺伝子発現を増加させる工程を含む、インスリン遺伝子発現を増加させるための方法も提供される。いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体の投与は、β細胞の機能の回復をもたらし、それにより、対照と比較して、β細胞から産生されるインスリンの量を増加させる。いくつかの態様において、対象へのmiR-10-b-5p模倣体の投与は、KLF7およびKLF11の発現の減少をもたらす。いくつかの態様において、KLF11の発現の減少は、β細胞におけるNEUROG3およびINSの発現の増加をもたらす。
一部の無処置糖尿病対象では、対象のβ細胞においてインスリンが生産されないか、低レベルにしか生産されない。無処置糖尿病対象では、膵島細胞中に位置するβ細胞が低減している。膵島細胞は対象の膵臓中に位置する。
その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって対象における糖尿病を処置する工程を含む、糖尿病を処置するための方法も提供される。いくつかの態様において、糖尿病は1型糖尿病または2型糖尿病である。いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体の投与は、対象における骨格筋細胞（SkMC）へのグルコース取込みの増加をもたらす。さらなる態様において、miR-10b-5p模倣体の投与は、対象における血中グルコースレベルの減少をもたらす。
その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによってKIT発現を増加させる工程を含むことにより、PSCまたはPPCにおけるKIT発現を増加させるための方法が提供される。いくつかの態様において、対象へのmiR-10-b-5p模倣体の投与は、KLF11の発現の減少をもたらす。
その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによってINSR、IRS2、およびIRS1の発現を増加させる工程を含む、骨格筋細胞（SkMC）におけるINSR、IRS2、およびIRS1の発現を増加させるための方法も提供される。いくつかの態様において、対象へのmiR-10-b-5p模倣体の投与は、KLF11の発現の減少をもたらす。いくつかの態様において、KLF11の発現の減少は、INSR、IRS2、およびIRS1の発現の増加をもたらす。
前記方法のいずれか1つのいくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである。さらなる態様において、miR-10b-5p模倣体は哺乳類のものである。さらなる態様において、miR-10b-5p模倣体はヒトのものである。
前記方法のいずれか1つのいくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は操作されている。
前記方法のいずれか1つのいくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は注射によって投与される。いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、点鼻投与、埋植による投与、腔内（intracavitary）注入もしくは膀胱内（intravesical）注入による投与、眼内投与、動脈内投与、病巣内投与、経皮投与、または粘膜への適用によって投与されうる。
前記方法のいずれか1つのいくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む。
miR-10b-5p模倣体は糖尿病（1型または2型）のための他の適切な処置と組み合わせて対象に投与されうると想定される。いくつかの態様において、それら他の処置は、インスリン、インスリン抵抗性改善薬（チアゾリジンジオン）、メトホルミン、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）受容体アゴニスト（エクセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、リラグルチド、リキシセナチド）、ジペプチジルペプチダーゼ-4（DPP4）阻害物質（シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチン、リナグリプチン）、ナトリウム-グルコース輸送体-2（SGLT2）阻害物質（ダパグリフロジン、エンパグリフロジン）およびスルホニル尿素（グリメピリド）である。
miR-10b-5p模倣体は胃腸障害のための他の適切な処置と組み合わせて対象に投与されうると想定される。いくつかの態様において、それら他の処置は、腸管運動促進薬、5-HT4受容体アゴニスト（プルカロプリド、テガセロッドおよびベルセトラグ）、グレリンアゴニスト（レラモレリン）、ドーパミン受容体アンタゴニストおよび5-HT4アゴニスト（メトクロプラミドおよびドンペリドン）、モチリン受容体アゴニスト（マクロライド系抗生物質:エリスロマイシンおよびアジスロマイシン）］、制吐剤（アプレピタント、プロメタジン、プロクロルペラジンおよびオンダンセトロン）および分泌に作用する薬剤（ルビプロストンおよびテナパノール）である。
いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は、SEQ ID NO:6、7、8、9、10、12、13、またはそれらの組合せを含む核酸配列を含む。
前記局面または態様のいずれか一つにおいて、miR-10b-5p模倣体は、化学修飾されていてもまたは無修飾であってもよい。
薬学的組成物
miR-10a-5p模倣体またはmiR-10b-5p模倣体と薬学的に許容される担体またはアジュバントとを含む組成物が提供される。いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体またはmiR-10a-5p模倣体は、miR-10a-5p二重鎖もしくはmiR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5pもしくは化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5pもしくは無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5pもしくは一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pもしくは一本鎖無修飾miR-10b-5pである。さらなる態様において、miR-10a-5p模倣体またはmiR-10b-5p模倣体は哺乳類のものである。さらなる態様において、miR-10a-5p模倣体またはmiR-10b-5p模倣体はヒトのものである。
前記組成物のいずれか1つのいくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体またはmiR-10b-5p模倣体は操作されている。
いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体は、SEQ ID NO:1、2、4、5、またはそれらの組合せを含む核酸配列を含む。
いくつかの態様において、miR-10b-5p模倣体は、SEQ ID NO:6、7、8、9、10、12、13、またはそれらの組合せを含む核酸配列を含む。
いくつかの態様において、miR-10a-5p模倣体またはmiR-10b-5p模倣体は、化学修飾されていてもまたは無修飾であってもよい。
本発明の薬学的組成物は、1つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、または賦形剤と組み合わされた、本明細書記載のmiR-10a-5p模倣体またはmiR-10b-5p模倣体を含みうる。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの糖質、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤、EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、および保存剤を含みうる。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。
本発明の薬学的組成物は、処置（または防止）されるべき疾患にとって適当な方法で投与されうる。適当な投薬量は臨床治験によって決定されうるが、投与の量および頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプおよび重症度などといった因子によって決定されると考えられる。
本発明の薬学的組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤など、固形物または液状物の形態で投与されうる。本発明の薬学的組成物は、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、点鼻投与、埋植による投与、腔内注入もしくは膀胱内注入による投与、眼内投与、動脈内投与、病巣内投与、経皮投与、または粘膜への適用によって投与されうる。いくつかの態様において、組成物は鼻、喉または気管支に、例えば吸入によって適用されうる。
患者に施行されるべき上記の処置の投薬量は、処置される状態および処置のレシピエントの厳密な性質によって変動し、体重、状態の重症度、過去のまたは現在の治療的介入などといった身体的および生理学的因子ならびに投与経路によって決定されうる。ヒト投与のための投薬量のスケーリングは、当技術分野において受け入れられている慣行に従って行うことができる。例えばmiR模倣体の用量は、一般的には、成人患者の場合で1～約100mgの範囲にあり、通常は1～12ヶ月の期間にわたって毎月投与されると考えられる。好ましい1ヶ月量は1ヶ月あたり1～10mgであるが、場合により、1ヶ月あたり10mgを超えるさらに大きな用量を使用しうる。
ヒト投薬量は、まず、マウスで使用された化合物の量から推定することによって決定することができる。当業者にはわかるように、ヒトに関する投薬量を動物モデルと比較して修正することは、当技術分野では日常的な手順である。ある特定の態様において、投薬量は、1回の投与につき、約1マイクログラム/kg/体重、5マイクログラム/kg/体重、10マイクログラム/kg/体重、50マイクログラム/kg/体重、100マイクログラム/kg/体重、200マイクログラム/kg/体重、350マイクログラム/kg/体重、500マイクログラム/kg/体重、1ミリグラム/kg/体重、5ミリグラム/kg/体重、10ミリグラム/kg/体重、50ミリグラム/kg/体重、100ミリグラム/kg/体重、200ミリグラム/kg/体重、350ミリグラム/kg/体重、または500ミリグラム/kg/体重～1000mg/kg/体重またはそれ以上、およびそこから導き出せる任意の範囲の有効量を含みうることが想定される。別の態様において、有効量は、約0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または約100mg/Kg体重でありうる。別の態様において、有効量は化合物約1マイクログラム～化合物約100mgの範囲にありうることが想定される。別の態様において、有効量は、1回の投与につき、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20mgでありうる。別の一態様において、有効量は、1日あたり約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95mg未満を含む。例示的一態様において、有効量は1日あたり約50mg未満を含む。もちろん、1回の投薬量または1日あたりの投薬量は、そのような処置プロトコールにおいて日常的に行われているように、初回の臨床試験の結果と個々の対象の必要に応じて、上向きにも下向きにも調節されうる。投薬の変更を正当化する条件と状況は当業者にはわかると考えられる。
有効量とみなされる量の厳密な決定は、各対象に個別の因子、例えば対象の背格好、年齢、性別、体重、および個々の対象の状態に基づく。当業者であれば、本開示と当技術分野における知識から、投薬量を容易に確かめることができる。
任意で、本発明の方法は、組織修復を誘発するか、細胞死を低減するか、または他の所望の生物学的応答を誘導する組成物の投薬量、その中の構成要素の濃度、および組成物投与のタイミングを同定するための、適切な動物モデルへの本発明組成物の投与を提供する。そのような決定は、甚だしい実験を必要とせず、日常的作業であり、甚だしい実験なしで確かめることができる。
生物学的に活性な作用物質は、選択されたpHに緩衝化しうる滅菌液状調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、乳液、分散液または粘稠な組成物などとして、対象に都合よく提供することができる。本発明の細胞および作用物質は、液状の製剤または粘稠な製剤として提供されうる。いくつかの応用には、液状製剤が望ましい。液状製剤は、投与、とりわけ注射による投与に好都合だからである。組織と長く接触していることが望まれる場合は、粘稠な組成物が好ましいと考えられる。そのような組成物は適当な粘性範囲内で製剤化される。液状の組成物または粘稠な組成物は、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる担体を含むことができる。
滅菌注射用溶液剤は、タランパネルおよび/またはペランパネルを、必要量の適当な溶媒に、所望に応じたさまざまな量の他の成分と共に懸濁することによって調製される。そのような組成物は、適切な担体、希釈剤または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどと混合されていてよい。組成物は凍結乾燥することもできる。組成物は、投与の経路および所望の製剤に応じて、例えば湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えばメチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化添加物または増粘添加剤、保存剤、香料、着色料などといった補助物質を含有することができる。参照により本明細書に組み入れられる「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE」第17版、1985などの標準的教科書を参考にすることで、甚だしい実験を行わずに、適切な調製物を調製しうる。
抗微生物保存剤、酸化防止剤、キレート剤および緩衝剤など、組成物の安定性および無菌性を向上させるさまざまな添加剤を加えることができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗細菌作用物質および抗真菌作用物質、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確保することができる。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって生じさせることができる。ただし本発明によれば、使用される媒体、希釈剤または添加剤はいずれも、細胞またはその調整培地中に存在する作用物質と適合する必要があると考えられる。
前記組成物は等張性であることができる。すなわち組成物は血液および涙液と同じ浸透圧を有することができる。本発明組成物の望ましい等張性は、塩化ナトリウムを使用するか、他の薬学的に許容される作用物質、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機溶質を使用して達成しうる。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝液には特に好ましい。
所望であれば、メチルセルロースなどの薬学的に許容される増粘剤を使って、前記組成物の粘度を選択したレベルに維持することができる。他の適切な増粘剤には、例えばキサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどがある。適切な担体および他の添加剤の選択は、厳密な投与経路および特定剤形、例えば液状剤形の性質（例えば組成物が溶液、懸濁液、ゲルまたは他の液状形態、例えば持効性剤形または液体充填剤形のどれに製剤化されるか）に依存すると考えられる。組成物の構成要素が化学的に不活性であるように選択されるべきであることは、当業者にはわかると考えられる。
本発明において有用であり得る方法および組成物が実施例において説明される特定の製剤に限定されないことは理解すべきである。細胞を作製しかつ使用する方法、増大、および培養の方法、ならびに本発明の治療方法を当業者に完全に開示し説明するために、以下に実施例を提案するが、これらの実施例は、本発明者らが自分達の発明であるとみなしているものの範囲を限定しようとするものではない。
本発明の実施には、別段の表示がある場合を除き、十分に当業者の認識範囲内である分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法が使用される。そのような技法は「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」第4版（Sambrook、2012）;「Oligonucleotide Synthesis」（Gait、1984）;「Culture of Animal Cells」（Freshney、2010）;「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」（Weir、1997）;「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」（Miller and Calos、1987）;「Short Protocols in Molecular Biology」（Ausubel、2002）;「Polymerase Chain Reaction:Principles,Applications and Troubleshooting」（Babar、2011）;「Current Protocols in Immunology」（Coligan、2002）などの文献に詳述されている。これらの技法は本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に応用可能であり、したがって本発明をなし実施する際に考慮しうる。特定態様にとって特に有用な技法については以下のセクションで議論する。
実験例
以下に実験例を挙げて、本発明を、さらに詳しく説明する。これらの実施例は、別段の明示がある場合を除き、例示のために提供されるに過ぎず、限定を意図していない。したがって本発明は、決して、以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として自明になるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
さらなる説明がなくても、当業者であれば、上記の説明と以下の具体例とを使って、本発明の化合物を作り、利用し、請求項の方法を実施することができると考えられる。それゆえに、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指し示すものであり、決して本開示の他の部分を限定していると解釈してはならない。
実施例1 - 高血糖Kit copGFP/＋ ;Lep ob/ob 雄マウスの空腸および結腸KIT ＋ ICCでは高度に発現したmiR-10b-5pが存在しない
肥満雌自然発生レプチン遺伝子変異体マウスLepob/ob（2型糖尿病モデル）（The Jackson Laboratory）をICC-copGFP雄マウスKitcopGFP/＋（Ro、2010）と交配することで、KitcopGFP/＋;Lepob/obマウスを作製した（Ro、2010）。4週、8週および12週時点で糖尿病雄KitcopGFP/＋;Lepob/obマウスと健常対照雄KitcopGFP/＋;Lep＋/＋マウスを屠殺して比較した（図1A）。レプチン変異体雄に含まれる体脂肪は健常対象よりはるかに多かった。レプチン変異体マウスの体重増加は生後4週時点で野生型（WT）の同胞より速く、その体重は、18週時点でも引き続き、対照の2倍であった（図1B）。空腹時血中グルコースレベルは、変異体では健常対照と比べてはるかに高く、11週後には歴然とした高血糖レベル（250mg/dL超）に達した（図1C）。しかしグルコースは14週後には正常レベルまで低減した。一時的高血糖（糖尿病）状態の間は、KIT発現を失うために、小腸および結腸におけるcopGFP＋ICCの数が低減することが、以前に報告されている（Ro、2010）。糖尿病copGFP＋ICCを、12～13週時に、3匹の雄糖尿病マウスの結腸および空腸から、週齢と性別が一致する健常非糖尿病対照と共に、それぞれFACSによって単離した。単離された空腸copGFP＋ICC（JICC）および結腸copGFP＋ICC（CICC）をプールしてそれぞれ1つの試料とし、それを低分子RNA単離とそれに続くmiRNAシーケンシングに使用した。糖尿病ホモ接合Lep変異体と非糖尿病WT Lepの結腸および空腸ICC内でのグローバルmiRNA発現パターンは大きく異なり（ピアソン相関係数:CICCの場合は0.55、JICCの場合は0.68）、一方、Lepヘテロ接合ICCは、ホモ接合変異体との類似性も（ピアソン相関係数:CICCの場合は0.75、JICCの場合は0.81）、WTマウスとの類似性も（ピアソン相関係数:CICCの場合は0.63、JICCの場合は0.61）示す（図1E）。驚いたことに、結腸および空腸のICCは、Lepヘテロ接合変異体遺伝子型内およびホモ接合変異体遺伝子型内では、著しく類似したmiRNA発現プロファイルを示す（ピアソン相関係数:それぞれ0.98および0.99）（図1E）。miR-10a-5p、miR-143-3pおよびmiR-10b-5pは、WT ICCでは最も高度に発現するmiRNAであるが、Lepヘテロ接合変異体およびホモ接合変異体のICCでは、それらの発現が大幅に減少していた。これら3つのmiRNAのうち、miR-10b-5pは糖尿病依存性の低減を呈した。糖尿病Lepホモ接合変異体ICCではさらなる低減が観察されたからである（図1Fおよび図1G）。これらから、糖尿病ICCではmiR-10b-5pが選択的に枯渇することの決定が容易になった。miRNAのシーケンシングとアノテーションにより、miR-10a-5pとmiR-10b-5pは、健常WT JICCおよびCICCでは最も高度に発現しているが、糖尿病JICCおよびCICCでは劇的に枯渇することが示された（図1F～図1G）。これらの結果を図1A～図1Gに示す。
実施例2 - KIT ＋ ICC特異的mir-10bノックアウトマウスの作製
Mir10b遺伝子はHoxd4の第5イントロン内に位置しており、これは、2番染色体上で、Hoxd3のイントロン1とも重なっている（図2A）。フロックス（floxed）Mir10b同腹仔（mir-10bLacZ-FLP-lox/＋）をクライオアーカイブ（The Jackson Laboratory）から回収した。mir-10bLacZ-FLP-lox/＋マウスをKitCreERT2/＋マウスまたはROSA26FLP/＋マウスと交配することで、KitCreERT2/＋;mir-10bLacZ/LacZマウスおよびROSA26FLP/＋;mir-10blox/loxマウスを作製した（図2A）。ROSA26FLP/＋;mir-10blox/loxマウスをさらにKitCreERT2/＋マウスと交配することで、KitCreERT2/＋;mir-10blox/loxマウスを作製した。KitCreERT2/＋;mir-10bLacZ/LacZマウスおよびKitCreERT2/＋;mir-10blox/loxマウスをタモキシフェンで処置することで、ICC中のmir10bを欠失させた。5日連続してタモキシフェンを注射した両系統は、mir-10b KO（KitCreERT2/＋;mir-10b-/-）をもたらした。タモキシフェンおよびオイルの注射後6ヶ月における雄mir-10b KOマウスおよび雄mir-10b WTマウスを図2Bに示す。mir-10b KOマウスはWT対照よりも重く、より多くの腹部脂肪を含んでいた。mir-10b KOマウスにおけるmir-10b欠失をqPCRによって確認した（図2C）。mir-10b KO空腸およびmir-10b KO結腸の平滑筋ではmiR-10b-5pの発現が大幅に減少していた。KO空腸およびKO結腸の平滑筋では、KITタンパク質の発現も減少していた（図2D）。miR-10b-5pはKLF11を標的とすることがTargetScanで予測されている。KO組織ではKLF11が増加していたことから、miR-10b-5pはKLF11を標的とすることが示唆される。加えて、HOXD3およびHOXD4の発現は、KO組織でも変化しなかったことから、これら2つのオーバーラップ遺伝子のイントロン領域中にコードされているMir10bの欠失は、これら2つの遺伝子の発現を妨害しなかったことが示唆される。フローサイトメトリーにおけるCD117＋（KIT抗体）およびCD45-（造血細胞マーカー）選択によって分析されるICCは、mir-10b KO小腸およびmir-10b KO結腸では有意に減少していた（図2E）。空腸および結腸におけるICCの喪失は免疫組織化学によって確認された（図2F）。KO組織では、ICCのサブタイプである空腸のICC DMPおよび結腸のICC SMPが最も低減しているようであった。結果を図2A～図2Fに示す。
実施例3 - 雄mir-10bノックアウトマウスは糖尿病を発生する
雄mir-10b KOマウスは中等度の肥満になり、2型糖尿病を発生したが、雌マウスはそうならなかった（図3A～図3F）。mir-10b KO雄マウスの体重は、タモキシフェン注射後、16週（4ヶ月）以降に漸進的に増加し、30週（6ヶ月半）では、対照雄mir-10b WTマウスと比較して、有意に重くなった（40.5g対32.7g）（図3A）。雄mir-10b KOマウスの血中グルコースレベルも漸進的に増加し、24週（6ヶ月）後にはマウスは高血糖（200mg/dL超）になった（図3B）。mir-10b KOマウスにおける腹腔内グルコース耐性試験（GTT）により、1～7ヶ月齢のWT対照マウスは負荷されたグルコースを2時間以内に排除できたが、mir-10b KOマウスは、1ヶ月から7ヶ月にかけて、グルコース負荷に対する応答が漸進的に損なわれることが確認された（図3C）。6～7ヶ月時のmir-10b KOマウスにはグルコース不耐性の有意な増加がある（図3D）。加えて、mir-10b KOマウスでは、1ヶ月から7ヶ月にかけて、インスリン感受性が漸進的に低下した（図3E）。4ヶ月後のmir-10b KOマウスでは、mir-10b WTマウスと比較して、インスリン抵抗性の有意な増加がある（図3F）。結果を図3A～図3Fに示す。
実施例4 - 雄mir-10bノックアウトマウスは胃腸（GI）通過の遷延を呈する
mir-10b KOマウスは胃不全麻痺および便秘も発生する。KOマウスは、1ヶ月齢で早くも始まる総GI通過の遷延を示し、それは3ヶ月齢まで漸進的に遅延した後、安定化して便秘になる（図4A）。3ヶ月齢において、通過時間は2倍超遅延した（125分対270分）。遅延した総GI通過は、遅い胃内容排出と遅い結腸通過に起因した。IVISインビボイメージングは、7ヶ月齢のmir-10b KOマウスにおける胃内容排出が、WT対照と比較して明確に遅延していることを示した（図4B）。KOマウスにおける胃内容排出時間は、3ヶ月齢ではほとんど2倍遅く、7ヶ月齢ではさらに遅かった（図4C）。KOマウスにおける結腸通過も、3倍超と、さらに遅延した（図4D）。さらにまた、KOマウスにおける平均糞粒頻度および平均排出量も、有意に低下した（図4E～図4F）。これらのデータはすべて、mir-10b KOマウスが大きく低減したGI運動を呈したことを、一貫して示唆している。さらに重要なことに、mir-10b KOマウスでは、グルコース耐性異常およびインスリン耐性異常より先に運動障害が起きている。結果を図4A～図4Fに示す。
実施例5 - 糖尿病におけるmiR-10b-5pの経路解析および標的検証
Ingenuity Pathway Analysis（IPA）ソフトウェアにより、miR-10b-5pと糖尿病に関連するその標的遺伝子を解析した。この解析により、KLF4、KLF7およびKLF11を含めて、糖尿病に関連付けられる数多くのmiR-10b-5p標的が同定された（図5A）。KLF11は転写抑制因子であり、INSとの相互作用に基づくさらなる研究には、これを選択した。KLF11はインスリン（INS）プロモーター中のGCボックスとCACCCボックスの両方に結合して（Niu 2007;Neve 2005）、標的遺伝子の転写活性化を抑制する（Niu 2007）。相互作用遺伝子（INSR、IRS1、IRS2、KIT、NEUROG3、SLC2A4およびGLP1R）はGCリッチなCpGアイランドを含有することから、これらの遺伝子が潜在的なKLF11標的であることが示唆される。前駆体（pre-miR-10b）からは、2つの成熟miRNA、miR-10b-5pおよびmiR-10b-3pが生成する。この前駆体はマウスとヒトのどちらでも高度に保存されており、成熟miRNAは同じである（Kozomara 2019）。miRNA標的スクリーニングのために、化学合成された6つの形態のmiR-10b-5p模倣体（10b模倣体1、Thermo Fisher Scientificの二重鎖RNA;2、Dharmaconの二重鎖RNA;3、QIAGENの二重鎖RNA;4、IDTの一本鎖miR-10b-5p RNA;5、IDTのアニールしたmiR-10b-3pとmiR-10b-5p RNA;6、IDTの前駆体miR-10b RNA）を、マウスNIT3T3細胞およびヒトHEK293において、アンチセンスmiR-10b-5p（Thermo Fisher Scientificの一本鎖10b阻害物質、IDTの一本鎖miR-10b-3p）、2つのマウスKlf11 siRNA（siKlf11-1、siKlf11-2）およびヒトKLF11 siRNA（siKLF11-1およびsiKLF11-2）（Thermo Fisher Scientific）と共に試験した。miR-10b-5pおよびmiR-10b-3pをコードするマウスのpre-miR-10b、10b模倣体および10b阻害物質を図13Bに示す。10b模倣体および10b阻害物質をトランスフェクトしたNIH3T3細胞およびHEK293細胞における標的遺伝子に対する効果を図5Cに示す。ウェスタンブロットは、トランスフェクトされたNIH3T3細胞およびHEK293細胞において、miR-10b-5pがKlf11を効率よく標的とすることを示している（図5C）。二重鎖RNA miR-10b模倣体1はKLF11タンパク質の翻訳を最も効率よく抑制し、pre-miR-10bがそれに続いた。他の2つのmiR-10b模倣体（2および3）、一本鎖miR-10b-5p RNA、およびアニールしたmiR-10b-3p RNAとmiR-10b-5p RNAは、模倣体1よりはタンパク質の抑制がはるかに弱いか、何らの抑制も誘発しなかった。これに対し、阻害物質miR-10b-3p RNAはKLF11を激増させたことから、この阻害物質は内因性miR-10b-5pに効率よく結合し、そのレベルをノックダウンすることが示唆される。加えて、KIT発現は共存するKLF11の量によって負に調節されたことから、KLF11は、NIH3T3細胞およびHEK293細胞におけるKIT発現を抑制することが示唆される。さらなるターゲティング実験にはmiR-10b模倣体1を選択して使用した。KLF11によって抑制される糖尿病遺伝子を、4つのヒト細胞株（NIH3T3;HEK293;マウスβ細胞NIT-1;ヒトβ細胞Panc10.05）で、10b模倣体、10b阻害物質、2つのマウスsiKLF11および2つのヒトsiKLF11を使って評価した。KLF11は、NIH3T3およびHEK293ではKIT、IRS1およびIRS2を負に調節し（図5D）、マウスおよびヒトのβ細胞株ではKIT、IRS1、IRS2、INSおよびISNRを負に調節した（図5E）。10b模倣体と2つのsiKLF11-1およびsiKLF11-2はどちらもKLF11発現を減少させた。10b阻害物質を導入すると4つの細胞株のすべてでKLF11レベルが増加したことから、miR-10b-5p（模倣体）-KLF11による糖尿病遺伝子の調節経路が確認された。10b模倣体-KLF11のさらなる標的検証のために、マウスKlf11 3'UTR中のmiR-10b-5p標的部位（mKlf11 10b TS）およびヒトKLF11 3'UTR中のmiR-10b-5p標的部位（hKLF11 10b TS）を、レポーター遺伝子プラスミド中のルシフェラーゼ遺伝子の最後に挿入した（図5F）。mKlf11 10b TS 変異体（mKlf11 10b TSM:シード配列中に4つの変異）およびスクランブル配列を含有する2つのレポーター遺伝子プラスミドも構築し、陰性対照として使用した（図5F）。マウスとヒトのKLF11 10b TS配列は高度に保存されている（図5F）。これらレポーター遺伝子プラスミドのそれぞれで形質転換された4つの安定細胞株（NIH3T3、HEK293、マウスおよびヒトのβ細胞株）を作製した。6つの一連の量の10b模倣体および10b阻害物質（1～200pmol）をトランスフェクトしたNIH3T3-mKlf11 10b TSは、6、12、24および48時間後に、ルシフェラーゼ活性の用量依存的な低減および誘導を示したが、最大の低減および誘導は12時間時点であった（図5G）。10b模倣体/阻害物質をトランスフェクトしたNIH3T3-mKlf11 10b TSMではルシフェラーゼ活性の低減や誘導がなかった（図5G）。次に、mKlf11/hKLF11 10b TS、mKlf11/hKLF11 10b TSMおよび/またはスクランブルを有する4つの細胞株に、一連のさまざまな濃度で10b模倣体および10b阻害物質をトランスフェクトした。mKlf11/hKLF11 10b TSを有する4つの細胞株はすべて、10b模倣体によるルシフェラーゼの用量依存的阻害および10b阻害物質による酵素の誘導を示した（図5H）。しかしmKlf11/hKLF11 10b TSMおよび/またはスクランブルを有する細胞には、10b模倣体および10b阻害物質による有意な効果がなかった。総合すると、これらのインビトロ実験により、糖尿病遺伝子の発現を抑制するマウスKLF11とヒトKLF11の両方を、miR-10b-5pが負に調節することが実証された。結果を図5A～図5Hに示す。
実施例6 - miR-10b模倣体注射によるmir-10bノックアウト雄マウスにおける糖尿病および胃不全麻痺のレスキュー
10b模倣体のインビボ効果を試験するために、10b模倣体（263ng/g）をインビボjetPEIと共に、腹腔内注射によって、mir-10b KO 糖尿病マウスに送達した。3つの群（mir-10 KOマウスにおける10b模倣体注射群および注射なし群ならびにWTマウス群）における体重を、注射後、10週にわたって比較した。10b模倣体を注射したマウスは4週かけて体重が少し減少したのに対して、注射なしのKOマウスは体重が徐々に増加した（図6A）。さらに重要なことに、10b模倣体を注射したマウスでは、空腹時グルコースレベルが1週時点で直ちに正常レベル（約100mg/dL）まで低下し、10週までそれが維持された（図6B）。GTTおよびITTは、模倣体を注射したマウスではグルコース耐性およびインスリン抵抗性がWTマウスと同等にまたはそれをわずかに上回るほど改善されたことを示した（図6C～図6D）。さらにまた、模倣体を注射したマウスではGI機能が徐々に改善されて回復した。糞排出量は1週時点および2週時点では徐々に増加し、2週以降はそれが安定した（図6E）。総GI通過時間も2週時点および4週時点で減少し、その後、WTマウスと同等になった（図6F）。さらにまた、10b模倣体を注射した10b KO糖尿病マウスでは、胃内容排出時間が著しく改善され、完全に回復してWTマウスと同等になった（図6G）。10b KOマウスでは空腸および結腸中のICCが失われたが、miR-10b-5p模倣体注射後は、mir-10 KOマウスにおいてそれらが回復した（図6H）。10b KOマウスの膵臓および結腸ではKITタンパク質発現の回復も確認された。さらにまた、10b模倣体注射後のmiR-10b-5pの増加が、血中、膵臓、空腸および結腸において確認された（図6J）。結果を図6A～図6Jに示す。
実施例7 - miR-10b-5p模倣体は高脂肪高スクロース食（HFHSD）マウスにおける糖尿病および遅いGI通過をレスキューする
次に、10b模倣体がHFHSD誘導性糖尿病マウスをレスキューできるかどうかを試験するための実験を計画した。KitcopGFP/＋マウスにHFHS食または普通食のどちらかを4ヶ月間給餌した。普通食マウス（29gおよび約107mg/dL）と比べて、HFHS食マウス（約43g）は体重が大幅に増え、血中グルコースも増加した（約200mg/dL）。両方のマウス群に、10b模倣体（500ng/g）および陰性対照RNA（500ng/g）をインビボjetPEIと共に2回腹腔内注射するか（1回目の注射の後、5週の間隔をおいて2回目の注射）、または注射を行わなかった。HFHSDマウスおよび普通食マウスの3つの群（10b模倣体注射、陰性対照RNA注射および注射なし）において、体重、血中グルコースレベルおよびGI機能を、2回の注射後、15週にわたって比較した。HFHSDマウスのうち、1回目および2回目の10b模倣体注射を受けたマウスは、11週にわたって体重が増加しなかったが、HFHSDマウスを給餌した陰性対照注射マウスと何も注射していないマウスは体重が徐々に増加した（図7A）。普通食マウスの3群も徐々に体重が増加したが、その増加はHFHSD給餌マウスよりもはるかに遅かった。10b模倣体を注射したHFHS食マウスは、10b模倣体を注射した10b KOマウスで見られたように、1週時点で、空腹時グルコースレベルが直ちに著しく低下して正常レベル（90mg/dL）になった（図7B）。しかし、グルコースレベルは漸進的に反発し、5週時には前糖尿病レベル（150mg/dL）に達した。2回目の注射後はグルコースレベルが正常レベルまで下落して、10週にわたって100～140mg/dLを維持した。普通食マウスの3群はグルコースを正常レベルに維持した。GTTおよびITTは、模倣体を注射したHFHSDマウスではグルコース耐性およびインスリン抵抗性が普通食マウスと同等にまたはそれを上回るほど改善された（とりわけ2回目の注射後）ことを示した（図7C～図7D）。加えて、模倣体を注射したHFHSD群におけるGI機能は、1回目および2回目の注射群では2週時点および4週時点で、漸進的に改善し、回復した（図7E）。2回目の注射の4週後は、GI通過時間が普通食マウスの場合とほとんど同等であった。1回目の模倣体注射をしたHFHSDマウスでは平均糞粒頻度および糞排出量が1～4週は徐々に増加し、5週時点で減少した（図7F）。しかし、2回目の注射により、5週目の頻度および排出量は大きく改善され、正常食マウスと同等になった。結果を図7A～図7Fに示す。
実施例8 - 10b模倣体で処置された糖尿病マウスにおけるmiR-10b、その調節タンパク質、ICC、およびβ細胞の回復
HFHSD糖尿病マウスの血液におけるmiR-10b-5pの低減はqPCRによって確認された（図8A）。糖尿病マウスでは普通食健常対照と比較してmiRNAが劇的に低減した。10b模倣体注射により、miRNAは1週時点で63％前後回復し、2～4週時点では徐々に低下した。驚いたことに、miRNAのレベルは、6時間の絶食とそれに続くグルコース負荷後のマウスにおける血中インスリンのレベルと対をなしていた（図8B）。加えて、10b模倣体を注射したマウスでは1週時点で健常対照マウスよりインスリンが高かった。ヘモグロビンA1CのパーセントはインスリンおよびCペプチドデータの逆であった（図8C）。10b模倣体注射はA1C％を減少させ、それは1～4週時点でゆっくりリバウンドした。10b模倣体を注射したマウスの血液、膵臓、胃および結腸におけるKLF11タンパク質変化をウェスタンブロッティングで調べた（図8D）。KLF11は、何も注射していないHFHSD給餌マウスでは著しく増加し、一方、普通食給餌マウスでは、はるかに低いレベルで発現した。HFHSDマウスへの10b模倣体注射は、注射後1週時点および3週時点で、組織中のKLF11を効率よく枯渇させた（図8D）。加えて、KITは、HFHSDの組織では減少し、10b模倣体により1週時点で増加し、3週時点ではさらに増加した（図8D）。そのうえ、HFHSDではICCが失われたが、10b模倣体注射をした胃、空腸、結腸および膵では容易に検出された（図8E）。結果を図8A～図8Gに示す。
実施例9 - HFHSDマウスにおける糖尿病および遅いGI通過に対するmiR-10b-5p模倣体の防止効果
miR-10b-5pがHFHSDを給餌したマウスにおける糖尿病および胃不全麻痺の発症を防止できるかどうかを決定するために、miR-10b-5p模倣体またはmiR-10b-5p阻害物質を、HFHSDまたはNDを給餌した健常C57マウスに毎月注射した。HFHSDを給餌した非注射対照マウスの体重が急速に増加したのに対し、ND給餌対照マウスの体重は、それより遅い速度で増加した。（図39Aおよび図39B）miR-10b-5p模倣体を注射したHFHSD給餌マウスは、ND給餌対照マウスに似て、体重が5ヶ月にわたってゆっくり増加し、一方、miR-10b-5p阻害物質を注射したマウスは、HFHSD給餌群でもND給餌群でも、体重が急速に増加した。（図39C～図39E）miR-10b-5p阻害物質を注射したマウスでは血中グルコースレベルが大幅に増加し、HFHSD給餌マウスでは糖尿病レベル（＞180mg/dL）に、またND給餌マウスでは前糖尿病レベル（121～179mg/dL）に達したのに対し、miR-10b-5p模倣体を注射したマウスは、5ヶ月間にわたって健常血中グルコースレベルを維持した。（図39G）miR-10b-5p模倣体を毎月注射することによって血中のmiR-10b-5pレベルが回復し維持されたのに対し、miR-10b-5p阻害物質注射後はレベルが急速に低下した。（図9H）これと合致して、インスリンおよびC-ペプチドのレベルも、miR-10b-5p模倣体またはmiR-10b-5p阻害物質を注射したマウスにおけるmiR-10b-5pのレベルと、類似するパターンに従った。（図39Iおよび図39J）どちらの飼料を給餌しても、miR-10b-5p阻害物質を注射したマウスでは、GI機能が大きく損なわれ、一方、miR-10b-5p模倣体注射はHFHSD給餌マウスを運動障害から保護した。マウスにおけるmiR-10b-5p模倣体とmiR-10b-5p阻害物質による拮抗的ターゲティング効果から、miR-10b-5pは糖尿病および遅いGI通過の発生を調節できることが確認される。さらにまた、miR-10b-5p模倣体注射によるmiR-10b-5pの回復は、HFHSD給餌マウスにおけるこれらの病的状態の発症を防止する。
実施例10 - Kit Cre-ERT2/＋ ;Rosa26 DTA/＋ 雄マウスにおけるKIT ＋ 細胞のコンディショナルな除去は糖尿病および遅いGI通過につながる
マウスにおけるKIT＋細胞の機能の喪失を調べるために、それぞれタモキシフェン注射により、KitCre-ERT2/＋;Rosa26DTA/＋（Kit-DTA）ではDTAで細胞をコンディショナルに除去し、KitCre-ERT2/＋;Rosa26tdTom/＋（Kit-tdTom）では細胞をtdTomatoで標識した。Kit-DTAマウスは、4週以降、WT対照より速く体重が増加した（図10A）。血中グルコースは、タモキシフェン注射後、6週以降は顕著に増加し、24週時点で高血糖レベルになった（図10B）。GTTおよびITTは、Kit-DTAマウスにおけるグルコース耐性およびインスリン感受性が2ヶ月時点および5ヶ月時点で徐々に損なわれていることを示した（図10C～図10D）。タモキシフェン注射後、7日（7D）以降、Kit-tdTomマウスの膵臓には多数のKIT＋細胞が同定された（図10E）。7日時点では多くのKIT＋細胞（tdTom）が膵島中のβ細胞（INS＋）であるように見えたが、5ヶ月時点ではKIT＋であるβ細胞は少ないようであった。これは、β細胞はKIT＋細胞に由来したが、5ヶ月時点では、KIT＋前駆体から派生したβ細胞の大半が失われて、新たに派生したβ細胞で置き換えられたことを示唆している。またこれは、5ヶ月まで保存されるKIT＋前駆体由来細胞が少ないことも示唆している。一方、Kit-DTAマウスは、7日時点および5ヶ月時点でKIT＋細胞を失っていた。5ヶ月時点でKit-DTAマウスの膵臓における膵島の数とサイズは類似していたが、β細胞はサイズが小さく、変性していた。5日時点および5ヶ月時点のKit-DTAマウスの血中では、Kit-tdTomマウスと比較して、miR-10bが顕著に低減した（図10F）。miR-10bの低減と合致して、インスリンとC-ペプチドはどちらも、5日目はわずかに、また5ヶ月時点では顕著に、低減した（図10G）。また、7日時点および5ヶ月時点のKit-DTAマウスの血液、膵臓および結腸では、KLF11が増加し、一方、KITは相応に低減した（図10H）。さらにまた、2ヶ月時点および5ヶ月時点のKit-DTAマウスでは、総GI通過時間が大きく遅延した（図10I）。結果を図10A～図10Iに示す。
実施例11 - T2Dおよび胃不全麻痺を有するヒト患者におけるmiR-10b-5p、KLF11、およびKITの発現
次に、糖尿病および特発性胃不全麻痺を有するヒト患者からの試料を調べることで、糖尿病マウスモデルに見られたmiR-10b-5p、KLF11およびKITの異常な発現パターンがヒト患者試料において類似しているかどうかを見た。確立されたガイドラインと異常な胃内容排出シンチグラフィとに基づいて胃不全麻痺と診断された15人の成人被験者（18～65歳）と15人の対照被験者を、遺伝子発現解析に使用した。試料は、miR-10b-5p発現レベルに基づいて、4つの相異なる群、すなわち健常対照試料に対応する高発現群（HC）、特発性胃不全麻痺（IG）試料に対応し、高発現群と低発現群とに分割された中間発現群（IG-HおよびIG-L）、および糖尿病性胃不全麻痺試料に対応する低発現群（DG）に分割することができた（図11A）。マウスからのデータと合致して、インスリンとC-ペプチドのレベルはヒト試料中のmiR-10b-5p発現と相関するパターンを示した（図11Bおよび図11C）。IG-L群ではmiR-10b-5p、インスリンおよびC-ペプチドのレベルがHC群と比べて有意に低かったことから、IG-L群は前糖尿病段階であることが示唆される。IG-H群とIG-H群のA1Cレベルは正常範囲（＞5.7）のHC群と類似していたことから（図11D）、A1Cでは前糖尿病状態をHC群と区別できないことが示唆された。血清中および洞中のKLF11タンパク質レベルもDG群ではHC群より高く、一方、KITレベルはDG群の方が低かった（図11E）。マウスで見られた結果と合致して、T2Dおよび/または胃不全麻痺を有するヒト患者からの試料は、miR-10b-5pの減少、KLF11の増加、KITの減少を示した。HC、IG-H、IG-LおよびDGの2つの個別血液試料からのmiRNAのディープシーケンシングにより、差次的に発現されるmiRNAが同定された。上位70の最も動的に調節されるmiRNAの発現パターンは、HCとIG-Hの間およびIG-LとDGの間のクラスタリングを示す（図11Fおよび図11G）。miR-10a-5レベルとmiR-10b-5pレベルはHCで最も高く、それに続いてそれぞれIG-H、IG-LおよびDGであった（図11G）。総合すると、HCヒト患者試料およびDGヒト患者試料におけるmiR-10b-5p、KLF11およびKITの発現レベルは、本研究で得られたマウスデータと非常に似ている。加えて、IG-HおよびIG-LにおけるmiR-10b-5p、インスリンおよびC-ペプチドの発現レベルから、これらの群は糖尿病へと進行中の前糖尿病状態にあることが示唆される。
実施例12 - miR-10b調節の糖尿病モデル
理論に束縛されることは望まないが、このトランスジェニック動物研究およびヒト研究から得られたデータによれば、miR-10bは糖尿病、GI運動および肥満を調節するようである（図12）。miR-10b-5pは、2つの代謝転写因子KLF7とKLF11を標的とし、抑制する。これらの転写因子は、脂肪細胞、ICC、膵前駆細胞、β細胞および骨格筋細胞における細胞の増殖、分化、インスリン生産およびインスリン感受性を指図する代謝遺伝子（LEP、ADIPOQ、GLP1R、KIT、INS、INSR、SLC2A2、SLC2A4、IRS1およびIRS2）の発現を負に調節する。miR-10bは正常グルコースレベル条件下では高度に発現し、それがKLF7およびKLF11を抑制し、それによって代謝遺伝子の高発現を可能にする。しかし、高グルコース状態では、miR-10bがサイレンシングされ、それにより、前記2つの転写因子がエスケープして過剰発現状態になることを可能にし、それが、代謝遺伝子の発現をダウンレギュレートし、糖尿病、GI運動障害および肥満の発生につながる。
実施例13: miR-10a-5p模倣体は肥満および糖尿病表現型をレスキューする
図13Aは、miR-10a-5pおよびmiR-10a-3pをコードするマウスmiR-10a前駆体、合成miR-10a-5p分子（miR-10a-5p模倣体）および合成miR-10a-5pアンチセンス分子（miR-10a-5p阻害物質）の配列と構造を示している。図13Bは、miR-10b-5pおよびmiR-10b-3pをコードするマウスmiR-10b前駆体、合成miR-10b-5p分子（miR-10b-5p模倣体）および合成miR-10b-5pアンチセンス分子（miR-10b-5p阻害物質）の配列と構造を示している。miR-10a-5p模倣体（U）とmiR-10b-5p模倣体（A）の間およびmiR-10a-5p阻害物質（A）とmiR-10b-5p阻害物質（U）の間の単一ヌクレオチド塩基の違いが太字で示されていることに注意されたい。次に、以降の研究ではこれらのコンストラクトを使用した。miR-10a-5p模倣体は、高脂肪高スクロース食（HFHSD）または普通食（ND）を給餌されたマウスにおける肥満および糖尿病表現型をレスキューする。（図14Aおよび図14B）体重および空腹時血中グルコースの比較。雄C57マウスに、実験全体にわたって（4～43週）、HFHSDを給餌し、miR-10a-5p模倣体または陰性対照（スクランブルRNA）を2回注射するか（22週時に1回目の注射および31週時に2回目の注射）、22週時の注射を行わず、その後、注射後（PI）21週にわたって監視した。各群n＝3～6。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01（HFHSDにおけるmiR-10a-5p模倣体対注射なし）。
実施例14: miR-10a-5p模倣体注射は大幅な体重減少をもたらしかつBMIおよび胴囲を低減する
雄C57マウスに研究全体にわたってHFHSDを給餌し、以前の研究と同様にして、miR-10a-5p模倣体または陰性対照を2回注射することで処置するか、注射を行わなかった。図15Aは、図14に示す、miR-10a-5p模倣体もしくは陰性対照（スクランブルRNA）を注射した、または注射なしの、HFHSD誘導性肥満糖尿病マウスの肉眼解剖学的変化を示している（43Wにおける、1回目の注射後、12W PI時のマウス）。（図15B）22週でmiR-10a-5p模倣体を注射した同じHFHSD誘導性肥満糖尿病マウスの、注射前およびPI4週時点の、肉眼解剖学的変化。平均BMIおよび平均胴囲の変化（図15Aおよび図15B）も評価した。各群につきn＝3。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01。図14において、NDを給餌し注射を行わなかった健常マウスと比較した、miR-10a-5p模倣体もしくは陰性対照（スクランブルRNA）を注射した、または注射なしの、HFHSD誘導性肥満糖尿病マウスにおける平均BMIおよび平均胴囲の変化（図16Aおよび図16B）（23週時の1回目の注射後、PI8週時点、および31週時の2回目の注射後、PI1週時点で測定した）。各群n＝6～12。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01。全体として、この研究は、10a模倣体を投与された糖尿病マウスにおける40％の体重減少とグルコース耐性およびインスリン耐性の改善を実証した。
実施例15: miR-10a-5p模倣体注射によりHFHSD誘導性糖尿病マウスにおけるインスリンレベルが回復する
miR-10b-5p模倣体注射がインスリンレベルを増加させるので、インスリンレベルに対するmiR-10a-5pの効果を調べた。HFHSDまたは普通食（ND）を給餌し、miR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体または陰性対照（スクランブルRNA）のいずれかを注射するか、注射を行わなかった雄マウスにおいて、6時間の絶食後に、インスリンレベルの変化を評価した（31Wにおける2回目の注射後、2W PIで測定）。（図17）各実験の各条件につきn＝6～12。次に、追跡研究により、miR-10b-5pまたはmiR-10a-5pのどちらかの注射後、4週にわたって、インスリンの変化を評価した。miR-10a-5p模倣体とmiR-10b-5p模倣体とではインスリンが逆に調節されることが観察された（図17）。miR-10a-5p模倣体注射は、HFHSD誘導性糖尿病マウスにおけるインスリンレベルをわずかに減少させてから、ゆっくりと回復させるが、miR-10b-5p模倣体注射は、インスリンレベルを一過性に増加させてから徐々に減少させる。HFHSDまたはNDを給餌し、miR-10a-5p模倣体またはmiR-10b-5p模倣体のどちらかを注射するか、注射を行わなかった雄マウスにおける、4週にわたる、6時間の絶食後のインスリンレベルの変化。各実験の各条件につきn＝6～12。＊＊p＜0.01（HFHSDにおけるmiR-10a-5p模倣体対注射なし）;＃＃p＜0.01（HFHSDにおけるmiR-10b-5p模倣体対注射なし）。次に、HFHSD誘導性糖尿病マウスのグルコース耐性およびインスリン耐性を改善するmiR-10a-5p模倣体の能力を評価した。（図18A）miR-10a-5b模倣体注射の4週後または注射なしでの腹腔内（IP）グルコース耐性試験（GTT）。（図18B）GTTの曲線下面積（AUC）プロット。各群につきn＝6～12。＊＊p＜0.01。同様の研究でインスリン耐性を評価した。（図19A）miR-10a-5p模倣体の1回目の注射の4週後のIPインスリン耐性試験（ITT）。（図19B）ITTの曲線下面積（AUC）プロット。各群につきn＝6～12。＊＊p＜0.01。インスリン関連代謝調節ホルモンGLP-1およびレプチンに対するmiR-10a-5p処置の効果。miR-10a-5p模倣体注射は、HFHSD誘導性糖尿病マウスにおける（図20A）GLP-1と（図20B）レプチンを増加させることがわかった。miR-10a-5p模倣体注射は、HFHSD誘導性糖尿病マウスにおける（図20A）GLP-1と（図20B）レプチンを、4週かけて、NDを給餌した健常マウスに近いホルモンレベルまで増加させ、回復させる。これらのホルモンはどちらも、そのシグナリングの増加が体重を低減することが公知である。各実験の各群につきn＝4。＊＊p＜0.01（HFHSDにおけるmiR-10a-5p模倣体対注射なし）。総合すると、これらの結果から、miR-10a-5p模倣体処置マウスにおけるインスリンレベルは非糖尿病マウスと類似するレベルまで大幅に回復することが実証された。また、理論に束縛されることは望まないが、これらの結果から、miR-10a-5p模倣体による糖尿病性肥満の処置は、この状態の複数の症状を反転させうることが示唆された。
実施例16: miR-10a-5p模倣体注射はGI機能を改善する
HFHSDを給餌した雄C57BL/6マウスを、miR-10a-5p模倣体もしくはスクランブル陰性対照による処置後に、または注射なしで、GI機能について評価した。（図21A～図21C）総GI通過時間、糞粒排出量および結腸通過時間を評価した（図21Aおよび図21B、23Wにおける1回目の注射後、8W PIで測定;図21C、31Wにおける2回目の注射後、2W PIで測定）。追跡研究により、HFHSDを給餌した雄糖尿病マウスまたはNDを給餌した健常マウスにおける、miR-10a-5p模倣体を注射するか、注射なしで、PI4週時点での、総GI通過時間（図21A）、糞粒排出量（図21B）および結腸通過時間（図21C）を評価した。（図21D～図21F）図21A～図21Cの個々のマウスにおける総GI通過時間、糞粒排出量および結腸通過時間の変化。各群につきn＝6～18。＊＊p＜0.01。胃機能の追加尺度として、HFHSDを給餌した雄糖尿病マウスまたはNDを給餌した雄健常マウスにおいて、miR-10a-5p模倣体を注射して、または注射なしで、胃内容排出速度を測定した。蛍光性GastroSense 750（GS）を混合した食品を蛍光強制投与によって胃に適用してから、強制投与の0分後および60分後にIVIS Lumina IIIシステムで撮像した（図22）。これらのデータにより、10a模倣体による処置はGI通過時間を低減し、糞粒排出量を増加させ、胃内容排出を増加させ、結腸通過時間を大幅に低減できることが実証された。全体として、これらの観察結果から、miR-10a-5p模倣体による処置は糖尿病性肥満の改善をもたらすだけでなく、GI機能も改善することが示唆された。
実施例17: miR-10a-5p模倣体とmiR-10b-5p模倣体はどちらも肥満および糖尿病表現型からの保護をもたらす
miR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体による処置が、既存の状態を処置することに加えて、肥満と糖尿病の発生を防止することもできるかどうかを見るために、雄C57BL/6マウスにHFHSD食を給餌してから、miR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体または陰性対照（スクランブルRNA）を2回注射するか（1回目および2回目の注射）、注射を行わずに、HFHSDまたはNDを給餌した。（図23Aおよび図23B）NDを給餌したマウスにおける体重および空腹時血中グルコース。（図23Cおよび図23D）HFHSDを給餌したマウスにおける体重および空腹時血中グルコース。各群につきn＝3。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01（miR-10a-5p模倣体対注射なし）;＃p＜0.05および＃＃p＜0.01（miR-10b-5p模倣体対注射なし）。これらのデータは、両模倣体による事前処置が、対照と比べて、肥満の発症を有意に低減し、低い血中グルコースレベルを維持できることを示した。普通食を給餌されたマウスでは、miR-10b-5p処置だけが体重増加の有意な遅延をもたらした。ただし、これに伴う血中グルコースレベルの差はなかった。ND給餌マウスのさらなる研究により、NDを給餌したマウスへのmiR-10a-5p模倣体および/またはmiR-10b-5p模倣体の注射は、9Wにおける2回目の注射後、2W PIでの空腹時グルコースレベルを変化させないことが明らかになった。各群につきn＝3（図23B）。
実施例18: miR-10a-5p阻害物質およびmiR-10b-5p阻害物質による処置はマウスにおける肥満および糖尿病表現型の引き金を引きかつそれらを悪化させる
miR-10a-5p模倣体処置およびmiR-10b-5p模倣体処置がマウスにおける肥満および糖尿病表現型を低減し防止できることが観察されたので、次に、miR-10a-5pおよびmiR-10b-5pの配列に基づく阻害物質による処置が、（図23に示す）反対の効果を有しうるかどうかを見るための研究を行った。雄C57BL/6マウスにNDまたはHSHSDを給餌してから、4Wおよび9Wにおいて、miR-10a-5p阻害物質、miR-10b-5p阻害物質、miR-10a-5p阻害物質とmiR-10b-5p阻害物質の両方（miR-10a/b-5p阻害物質）、または陰性対照（スクランブルRNA）のいずれかを2回注射するか（1回目および2回目の注射）、注射を行わず、次に、HFHSDまたは普通食（ND）を給餌した。（図24Aおよび図24B）NDを給餌したマウスにおける体重および空腹時血中グルコース。（図24Cおよび図24D）HFHSDを給餌したマウスにおける体重および空腹時血中グルコース。各群n＝3。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01（miR-10a-5p阻害物質対注射なし）、＃p＜0.05および＃＃p＜0.01（miR-10b-5p阻害物質対注射なし）、＾p＜0.05および＾＾p＜0.01（miR-10a/b-5p阻害物質対注射なし）。次に、空腹時インスリンレベルに対する阻害物質の効果を評価した。NDを給餌した雄健常マウス（図25A）およびHFHSDを給餌した雄糖尿病マウス（図25B）において、9週時の2回目の注射後、PI2週時点で、miR-10a-5p阻害物質は空腹時インスリンレベルを増加させ、一方、miR-10b-5p阻害物質は空腹時インスリンレベルを減少させる。＊＊p＜0.01。加えて、阻害物質で処置されたマウスにおいて、胃内容排出を観察した。（図26）miR-10a-5p阻害物質、miR-10b-5p阻害物質または陰性対照（スクランブルRNA）のいずれかの2回目の注射後、PI4週時点での、または10週における注射なしの、NDを給餌したマウスにおける画像。GSはGastroSense 750を表す。全体として、これらのデータにより、どちらのタイプの飼料を給餌されたマウスでも、糖尿病の発症および体重増加の加速が実証された。miR-10a-5p阻害物質およびmiR-10b-5p阻害物質による処置はマウスにおける肥満および糖尿病表現型の引き金を引き、それを悪化させる。
実施例19: miR-10a-5pおよびmiR-10b-5pの遺伝子標的
次に、標的遺伝子発現に対するmiR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体の効果を調べるために、一連の研究を企てた。（図27）観察結果は、miR-10a-5pとmiR-10b-5pとが、1回目の注射後、PI4週時点で、NDを給餌したマウスの結腸粘膜、膵臓および白色脂肪細胞における幹細胞または前駆細胞の調節に際して、キータンパク質（LGR5、REG4、PDX1、NEROG3およびPDGFRA）を異なる形で標的とすることを示した。このウェスタンブロットではGAPDHを内因性対照として使用した。以降の研究により、miR-10a-5pとmiR-10b-5pとは同じ肥満および糖尿病関連タンパク質を異なる形で標的とすることが実証された。肥満および糖尿病関連タンパク質に対するmiR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体、miR-10a-5p阻害物質およびmiR-10b-5p阻害物質によるターゲティング効果の比較。マウス膵β細胞（NIT-1細胞）またはマウス脂肪細胞（L-M細胞）に、miR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体、miR-10a-5p阻害物質、miR-10b-5p阻害物質もしくは陰性対照（スクランブルRNA）をトランスフェクトするか、またはトランスフェクションを行わなかった。（図28A）NIT-1細胞におけるKLF11、KIT、LEP、GLU4、ADIPOQ、IRS-1、IRS-2およびGAPDH対照のウェスタンブロット。タンパク質マーカー（M）は、対応する分子量（kDa）と共に示されている。（図28B）GAPDHで標準化した、Aにおけるタンパク質の定量。（図28C）L-M細胞におけるLEP、LEPRおよびGAPDH対照のウェスタンブロット。各群につきn＝3。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01。
実施例20: miR-10a-5pは糖尿病関連非アルコール性脂肪性肝疾患をレスキューする
非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）は、2型真性糖尿病患者では非常によく見られ、付随する肥満およびインスリン抵抗性と相関関係にある。上記実施例のHFHSマウスモデルを使って、miR-10a-5p模倣体による処置がHFHSDを給餌した糖尿病マウスにおける脂肪性、炎症性および線維性の肝表現型を防止しうるかまたは反転させうるかどうかを決定するための一連の研究を企てた。（図29）18週（4～22週）にわたってHFHSDを給餌した雄糖尿病C57BL/6マウスまたはNDを給餌した雄健常マウスに、22週時に1回、miR-10a-5p模倣体またはmiR-10a-5p阻害物質を注射するか、注射を行わずに、同じ飼料の給餌を続けた。それらのマウスの肝臓の肉眼像および染色像を示す。PI2週時点でHFHSDマウスおよび/またはNDマウスから肝組織を切離し、H＆E染色、オイルレッドO染色（脂質）、ピクロシリウスレッド染色（線維）およびCD64（マクロファージ）で染色した。処置マウスと無処置マウスにおける肝損傷関連マーカーのレベルを評価する類似の研究を行った。（図30Aおよび図30B）22週時に1回、miR-10a-5p模倣体を注射するか、注射を行わずに、同じ飼料の給餌を続けた、18週にわたってHFHSDを給餌した雄糖尿病マウスまたはNDを給餌した雄健常マウスにおける、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）に関する血液検査。HFHSDマウスおよび/またはNDマウスのASTおよびALTをPI2週時点で測定した。各群n＝3。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01。
実施例21: miR-10a-5p処置は糖尿病マウスにおいて高コレステロールをレスキューしかつ炎症を低減する
インスリンおよびグルコースの調節不全、GI機能の異常および脂肪肝疾患の発生に加えて、糖尿病は、高レベルの「悪玉」LDLコレステロールと関連することが知られている。miR-10a-5p模倣体による処置はHFHSDを給餌した糖尿病マウスにおける高コレステロールをレスキューすることが見いだされた。（図31Aおよび図31B）22週時に1回、miR-10a-5p模倣体を注射するか、注射を行わずに、同じ飼料の給餌を続けた、18週にわたってHFHSDを給餌した雄糖尿病マウスまたはNDを給餌した雄健常マウスにおける、高密度リポタンパク質（HDL）および低密度リポタンパク質（LDL）/超低密度リポタンパク質（VLDL）コレステロールに関する血液検査。HFHSDマウスおよび/またはNDマウスのHDLおよびLDL/VLDLをPI2週時点で測定した。各群n＝6。＊＊p＜0.01。2型糖尿病を有する患者では炎症関連サイトカインのレベルがしばしば高いことも、研究によって見いだされている。特に、これらの患者は、炎症誘発性サイトカインIL-6のレベルが高く、抗炎症性サイトカインIL-10のレベルは低い傾向にある。miR-10a-5p模倣体によるHFHSDマウスの処置はHFHSDを給餌した糖尿病マウスにおける炎症を低減することが見いだされた。（図32Aおよび図32B）22週時に1回、miR-10a-5p模倣体を注射するか、注射を行わずに、同じ飼料の給餌を続けた、18週にわたってHFHSDを給餌した雄糖尿病マウスまたはNDを給餌した雄健常マウスにおける、炎症誘発性サイトカインIL-6および抗炎症性サイトカインIL-10に関する血液検査。HFHSDマウスおよび/またはNDマウスのIL-6およびIL-10をPI2週時点で測定した。各群n＝6～8。＊＊p＜0.01。
実施例22: miR-10b-5pで処置された糖尿病マウスにおける心機能の改善
異常な心機能と糖尿病は密接に関連する。糖尿病を有する患者は心疾患および心不全を発生するリスクが上昇している。同様に、心不全を有する患者はしばしば合併症として糖尿病を発生する。miR-10b-5p模倣体による処置が心機能を改善するかどうかを決定するために、HFHSD誘導性糖尿病マウスで一連の研究を行った。HFHSDを給餌した雄糖尿病マウスおよびNDを給餌した雄健常マウスにおける心機能を、miR-10b-5p模倣体またはmiR-10b-5p阻害物質を注射するか、または注射を行わずに、心エコー法を使って評価した。（図33A）駆出率（EF）。（図33B）短縮率（FS）。（図33C）一回拍出量（SV）。（図33D）心拍数（HR）。HFHSを給餌した糖尿病マウス（注射なし）は、NDを給餌したマウス（注射なし）と比較して低減したEF、FSおよびSVを示した。NDを給餌したマウスにおけるmiR-10b-5p模倣体の注射は、EFとFSを変化させなかったが、SVを改善した。NDを給餌したマウスにおけるmiR-10b-5p阻害物質の注射はEFとFSおよびSVを低減した。HFHSDを給餌したマウスにおけるmiR-10b-5p模倣体またはmiR-10b-5p阻害物質の注射は、EF、FSおよびSVを有意に変化させなかった。心エコー検査中はすべてのマウスにおいて400～500拍/分の心拍数が維持された。各群n＝3。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01。
実施例23: miR-10a-5p処置およびmiR-10b-5p処置と確立された糖尿病薬との比較
糖尿病および糖尿病関連疾患は比較的よく見られるので、この疾患の諸局面に対抗するために設計された薬物は、いくつか開発されている。それら確立された化学治療薬と比較したmiR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体の相対効力は、臨床的有用性の目安になると考えられる。そこで、体重および血中グルコースに対するmiR-10a-5p、miR-10b-5pおよび治験薬miR-103/107阻害物質（RG-125）の薬物効果を比較する一連の研究を企てた。miR-10a-5p模倣体は、HFHSDを給餌したマウスにおける肥満および糖尿病表現型をレスキューする。（図34Aおよび図34B）体重および空腹時血中グルコースの比較。雄C57BL/6マウスに、実験全体にわたってHFHSDまたはNDを給餌し、22週時に、miR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体またはmiR-103/107阻害物質のいずれかを注射するか、注射を行わず、その後、PI9週間にわたって監視した。AstraZenecaはRegulus Therapeuticsと協同して、2型糖尿病および非アルコール性脂肪性肝疾患を有する患者における、miR-103/107阻害物質（RG-125）を使った臨床試験の第1相および第2相を完了している。miR-10a-5pおよびmiR-10b-5pは、血中グルコースと体重の低下に、miR-103/107阻害物質よりも著しく改善された永続的効果を有する。各群n＝3～6。＊p＜0.05および＊＊p＜0.01（miR-10a-5p模倣体対miR-103/7阻害物質）、＃p＜0.05および＃＃p＜0.01（miR-10b-5p模倣体対miR-103/7阻害物質）。
図35は、処置後8週にわたってHFHSDを給餌した糖尿病マウス、または対照として、注射なしでNDを給餌した健常マウスにおける、血中グルコース、体重およびGI機能に対するmiR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体の薬物効果を、普及している抗糖尿病薬物治療薬およびFDAが承認した消化管運動賦活薬と比較する研究デザインを図解している。miR-10a-5p（500ng/g体重）、miR-10b-5p（500ng/g体重）またはスクランブルRNA（500ng/g体重）を、IP注射によって、1週時に1回と2週時に1回の2回、注射した。メトホルミン（250mg/kg体重）またはシタグリプチン（DPP4阻害物質）（10mg/kg体重）は4週にわたって毎日経口（PO）投与した。リラグルチド（GLP-1受容体アゴニスト）（0.2mg/kg体重）は2週にわたり、皮下注射（SC）注射によって1日2回注射した。インスリン（0.75U/kg体重）は4週にわたり、IP注射によって1日1回注射した。プルカロプリド（5-HT4受容体アゴニスト）（2mg/kg体重）は4週にわたって毎日PO投与した。薬物効果を図36～図38に示す。miR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体による処置は、（図36A）血中グルコースおよび（図36B）体重の低下に、図35に記載の抗糖尿病薬物治療薬および消化管運動賦活薬よりも良好で長い効果を有した。各群n＝5。同様に、miR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体は、GI運動の改善にも、抗糖尿病薬物治療薬および慢性便秘を処置するために使用されるプルカロプリドよりも良好で長い効果を有する（図37～図38）。処置後、2週、4週、6週および8週の時点で、各群の総GI通過時間を測定した（図37）。各群n＝5。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001および＊＊＊＊p＜0.0001。薬物処置の頻度は図35に示されている。miR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体およびプルカロプリドは総GI通過を改善したが、4つの抗糖尿病薬物治療薬はそうではなかった（図37）。ただし、8週間の持続的効果を有するmiR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体と比べて、プルカロプリドは、処置中のGI通過に、4週間の一時的な効果を有した。最後に、対照スクランブルRNA HFHSD給餌糖尿病マウスにおける遅延した胃内容排出は、4週時点で、miR-10a-5p模倣体、miR-10b-5p模倣体およびプルカロプリドによって改善されたが、リラグルチドは遅延した胃内容排出を改善しなかった（図38A～図38B）。miR-10a-5p模倣体およびmiR-10b-5p模倣体を注射したマウスでは8週時に正常な胃内容排出速度が維持されていたが、プルカロプリド処置マウスでは遅延したことから、両miRNAは、胃内容排出の改善において、プルカロプリドよりもはるかに持続的な効果を有したことが示唆される。薬物処置の頻度は図35に示されている。全体として、これらのデータは、miR-10a-5p模倣体および/またはmiR-10b-5p模倣体による糖尿病の処置が、確立された薬物治療薬と等価かそれより良好な臨床アウトカムを与えることができ、有望な治験薬にありうることを実証している。
他の態様:
本明細書における可変部の任意の定義における要素の一覧の記載は、列挙された要素の任意の単一要素または組合せ（または副組合せ）としての当該可変部の定義を含む。本明細書における態様の記載は、任意の単一態様または他の任意の態様もしくはその一部分との組合せとしての当該態様を包含する。
本明細書において言及した特許、特許出願、および刊行物の開示はいずれも皆、ここに、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。具体的態様を参照して本発明を開示したが、他の当業者が、本発明の真の要旨および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変形を工夫しうることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および等価な変形をすべて包含すると解釈されるべきものとする。

Claims (65)

  1. その必要のある対象において糖尿病を処置する方法であって、有効量のmiR-10a-5p模倣体を該対象に投与し、それによって糖尿病状態を処置する工程を含む、該方法。
  2. 前記miR-10a-5p模倣体が、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである、請求項1記載の方法。
  3. 前記糖尿病が2型糖尿病である、請求項1記載の方法。
  4. 前記miR-10a-5p模倣体が哺乳動物のものである、請求項1記載の方法。
  5. 前記miR-10a-5p模倣体がヒトのものである、請求項1記載の方法。
  6. 前記miR-10a-5p模倣体が操作されている、請求項1記載の方法。
  7. 前記miR-10a-5p模倣体が、薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む、請求項1記載の方法。
  8. 有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって対象の体重を低減する工程を含む、該対象の体重を低減する方法。
  9. 有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって対象における血中グルコースを低下させる工程を含む、該対象における血中グルコースを低下させる方法。
  10. その必要のある対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって該対象におけるインスリン感受性を増加させる工程を含む、インスリン感受性を増加させるための方法。
  11. その必要のある対象において糖尿病関連脂肪肝疾患を処置する方法であって、該対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって該糖尿病関連脂肪肝疾患を処置する工程を含む、該方法。
  12. その必要のある対象において糖尿病関連炎症を低減する方法であって、該対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって該糖尿病関連炎症を低減する工程を含む、該方法。
  13. 前記miR-10a-5p模倣体が、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである、請求項8～12のいずれか一項記載の方法。
  14. 前記miR-10a-5p模倣体が哺乳動物のものである、請求項13記載の方法。
  15. 前記miR-10a-5p模倣体がヒトのものである、請求項14記載の方法。
  16. 前記miR-10a-5p模倣体が操作されている、請求項15記載の方法。
  17. 前記miR-10a-5p模倣体が、薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む、請求項13記載の方法。
  18. その必要のある対象に有効量のmiR-10a-5p模倣体を投与し、それによって該対象における胃腸疾患を処置する工程を含む、胃腸疾患を処置する方法。
  19. 前記miR-10a-5p模倣体が、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである、請求項18記載の方法。
  20. 前記miR-10a-5p模倣体が哺乳動物のものである、請求項19記載の方法。
  21. 前記miR-10a-5p模倣体がヒトのものである、請求項20記載の方法。
  22. 前記胃腸疾患が、胃不全麻痺、機能性胃腸障害、機能性胃腸運動障害、および偽性腸閉塞からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
  23. 前記機能性胃腸障害が、過敏性腸症候群、機能性便秘、および特定不能の機能性腸障害からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
  24. miR-10a-5p模倣体と薬学的に許容される担体またはアジュバントとを含む組成物。
  25. 前記miR-10a-5p模倣体が、miR-10a-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10a-5p、無修飾二本鎖miR-10a-5p、一本鎖化学修飾miR-10a-5p、または一本鎖無修飾miR-10a-5pである、請求項24記載の組成物。
  26. 前記miR-10a-5p模倣体が操作されている、請求項24記載の組成物。
  27. 前記miR-10a-5p模倣体が、SEQ ID NO:1、2、4、5、またはそれらの組合せを含む核酸配列を含む、請求項1～23のいずれか一項記載の方法または請求項24～26のいずれか一項記載の組成物。
  28. その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって該対象におけるカハール介在細胞（ICC）増殖を増加させる工程を含む、ICC増殖を増加させるための方法。
  29. 前記miR-10b-5p模倣体が、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである、請求項28記載の方法。
  30. 前記miR-10b-5p模倣体が哺乳動物のものである、請求項29記載の方法。
  31. 前記miR-10b-5p模倣体がヒトのものである、請求項30記載の方法。
  32. 前記対象におけるICC増殖の増加により該対象におけるICCの機能が回復する、請求項28記載の方法。
  33. 前記ICCが前記対象の胃腸管の平滑筋内に位置する、請求項28記載の方法。
  34. 前記平滑筋が、前記対象の胃内、小腸内、または結腸の平滑筋内に位置する、請求項33記載の方法。
  35. 前記ICCが、ICC前駆体、ICC-MY、ICC-IM、ICC-DMP、ICC-SM、またはICC-SMPを含む、請求項34記載の方法。
  36. 前記対象がヒトである、請求項28記載の方法。
  37. その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって該対象におけるKIT発現を増加させる工程を含む、ICCにおけるKIT発現を増加させるための方法。
  38. 前記miR-10b-5p模倣体が、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである、請求項37記載の方法。
  39. 前記miR-10b-5p模倣体が哺乳動物のものである、請求項38記載の方法。
  40. 前記miR-10b-5p模倣体がヒトのものである、請求項39記載の方法。
  41. 前記対象におけるKIT発現の増加により該対象における前記ICCの機能が回復する、請求項37記載の方法。
  42. その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって該対象における胃腸疾患を処置する工程を含む、胃腸疾患を処置するための方法。
  43. 前記miR-10b-5p模倣体が、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである、請求項42記載の方法。
  44. 前記miR-10b-5p模倣体が哺乳動物のものである、請求項43記載の方法。
  45. 前記miR-10b-5p模倣体がヒトのものである、請求項44記載の方法。
  46. 前記胃腸疾患が、胃不全麻痺、機能性胃腸障害、機能性胃腸運動障害、および偽性腸閉塞からなる群より選択される、請求項43記載の方法。
  47. 前記機能性胃腸障害が、過敏性腸症候群、機能性便秘、および特定不能の機能性腸障害からなる群より選択される、請求項46記載の方法。
  48. その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって該対象の体重を低減する工程を含む、体重を低減するための方法。
  49. その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって該対象における血中グルコースを低下させる工程を含む、血中グルコースを低下させるための方法。
  50. その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって該対象における膵幹細胞（PSC）増殖または膵前駆細胞（PPC）増殖を増加させる工程を含む、KIT＋ PSC増殖またはKIT＋ PPC増殖を増加させるための方法。
  51. その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって該対象におけるインスリン感受性を増加させる工程を含む、インスリン感受性を増加させるための方法。
  52. その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって該対象における糖尿病を処置する工程を含む、糖尿病を処置するための方法。
  53. 前記糖尿病が1型または2型糖尿病である、請求項51記載の方法。
  54. その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによってKIT発現を増加させる工程を含むことにより、PSCまたはPPCにおけるKIT発現を増加させるための方法。
  55. その必要のある対象に有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによってINSR、IRS2、およびIRS1の発現を増加させる工程を含む、骨格筋細胞（SkMC）におけるINSR、IRS2、およびIRS1の発現を増加させるための方法。
  56. その必要のある対象において糖尿病関連炎症を低減するための方法であって、有効量のmiR-10b-5p模倣体を投与し、それによって該糖尿病関連炎症を低減する工程を含む、該方法。
  57. 前記miR-10b-5p模倣体が、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである、請求項48～56のいずれか一項記載の方法。
  58. 前記miR-10b-5p模倣体が哺乳動物のものである、請求項57記載の方法。
  59. 前記miR-10b-5p模倣体がヒトのものである、請求項58記載の方法。
  60. 前記miR-10b-5p模倣体が操作されている、請求項57記載の方法。
  61. 前記miR-10b-5p模倣体が、薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む、請求項57記載の方法。
  62. miR-10b-5p模倣体と薬学的に許容される担体またはアジュバントとを含む組成物。
  63. 前記miR-10b-5p模倣体が、miR-10b-5p二重鎖、化学修飾二本鎖miR-10b-5p、無修飾二本鎖miR-10b-5p、一本鎖化学修飾miR-10b-5p、または一本鎖無修飾miR-10b-5pである、請求項62記載の組成物。
  64. 前記miR-10b-5p模倣体が操作されている、請求項62記載の組成物。
  65. 前記miR-10b-5p模倣体が、SEQ ID NO:6、7、8、9、10、12、13、またはそれらの組合せを含む核酸配列を含む、請求項28～61のいずれか一項記載の方法または請求項62～64のいずれか一項記載の組成物。
JP2021562954A 2019-04-24 2020-04-24 ｍｉＲ－１０模倣体およびその標的に関する方法および組成物 Pending JP2022530031A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962837988P 2019-04-24 2019-04-24
US62/837,988 2019-04-24
US202062964382P 2020-01-22 2020-01-22
US62/964,382 2020-01-22
PCT/US2020/029807 WO2020219872A1 (en) 2019-04-24 2020-04-24 METHODS AND COMPOSITIONS OF MiR-10 MIMICS AND TARGETS THEREOF

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022530031A true JP2022530031A (ja) 2022-06-27
JPWO2020219872A5 JPWO2020219872A5 (ja) 2023-04-26

Family

ID=72941232

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021562954A Pending JP2022530031A (ja) 2019-04-24 2020-04-24 ｍｉＲ－１０模倣体およびその標的に関する方法および組成物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220211742A1 (ja)
EP (1) EP3959317A4 (ja)
JP (1) JP2022530031A (ja)
KR (1) KR20220004989A (ja)
CN (1) CN113950528A (ja)
AU (1) AU2020263502A1 (ja)
BR (1) BR112021021310A2 (ja)
CA (1) CA3137897A1 (ja)
MX (1) MX2021013004A (ja)
WO (1) WO2020219872A1 (ja)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201302468D0 (en) * 2013-02-12 2013-03-27 Reneuron Ltd Stem cell product
US20150216892A1 (en) * 2012-08-03 2015-08-06 Aptamir Therapeutics, Inc. Cell-specific delivery of mirna modulators for the treatment of obesity and related disorders
AU2014351482B2 (en) * 2013-11-22 2020-08-20 Mina Therapeutics Limited C/EBP alpha short activating RNA compositions and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
US20220211742A1 (en) 2022-07-07
CN113950528A (zh) 2022-01-18
CA3137897A1 (en) 2020-10-29
KR20220004989A (ko) 2022-01-12
BR112021021310A2 (pt) 2021-12-14
WO2020219872A1 (en) 2020-10-29
EP3959317A4 (en) 2023-10-18
MX2021013004A (es) 2022-03-04
EP3959317A1 (en) 2022-03-02
AU2020263502A1 (en) 2021-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11464873B2 (en) RNA-modulating agents
WO2006056885A2 (en) Igf-1 isoforms
EA033653B1 (ru) Антисмысловые олигонуклеотиды для лечения врожденного амавроза лебера
CA2443923A1 (en) Gene therapy with chimeric oligonucleotides delivered by a method comprising a step of iontophoresis
US20090023670A1 (en) Regulation of Transgene Expression by RNA Interference
US20220211742A1 (en) METHODS AND COMPOSITIONS OF MiR-10 MIMICS AND TARGETS THEREOF
KR101652957B1 (ko) ATF3 유전자 발현을 억제하는 신규 siRNA 및 이의 용도
US20130028957A1 (en) Pharmaceutical composition for treating cancer
US11053499B2 (en) Oligonucleotide sequences targeting transcription factor TSC22D4 for the treatment of insulin resistance
US20210290595A1 (en) Gfi1 inhibitors for the treatment of hyperglycemia
US20220049254A1 (en) KLF11 siRNA For Treatment Of Diabetes And Obesity
EP3944861A1 (en) Long non-coding rna as therapeutic target in cardiac disorders and cardiac regeneration
US9012426B2 (en) Pharmaceutical anti-angiogenic composition including a MicroRNA-382 inhibitor
CN114788866B (zh) Mafg作为胆固醇稳态调控靶点的应用及其调控剂
US20220340903A1 (en) Targeting rlim to modulate body weight and obesity
US20230287427A1 (en) Inhibition of lncExACT1 to Treat Heart Disease
CN116392500A (zh) microRNA及其在诊断和治疗中的用途
WO2012039137A2 (en) A nucleic acid having an anti-metabolic syndrome effect
WO2023220732A1 (en) Methods and systems for correcting mutations in prph2
US20160122762A1 (en) Methods of treating atherosclerosis

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220415

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230418

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230418

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20230707

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240502