JP2022526716A - 耐酸化性を有する修飾グルカゴン分子および製剤、ならびにそれらを使用する方法およびキット - Google Patents

Abstract

実質的に中性のｐＨで保存されたときにグルカゴン分子が酸化に耐性を持つようになる、修飾グルカゴン分子ならびに緩衝液および／または賦形剤溶液が提供される。このような修飾グルカゴン分子は、２７位に置換を含み、天然メチオニンが、メチオニン模擬アナログ、ノルロイシン、または前述のもののうちのいずれかの異性体で置き換えられている。任意選択により、修飾グルカゴン分子はさらにリン酸化されて、実質的に中性のｐＨでの溶解性およびフィブリル化に対する耐性の向上をもたらし得る。そのような分子を医薬組成物で使用する方法および治療キットも提供される。【選択図】図６Ｂ

Description

優先権
本出願は、２０１９年３月１５日に出願されたＴｏｐｐ ｅｔ ａｌ．の米国仮特許出願第６２／８１８，８２６号の優先権利益に関するものであり、その利益を主張する。本出願は、さらに、２０１８年１月１７日に出願され、かつ現在、米国特許第１０，３０８，７０１号として特許となっている、Ｔｏｐｐ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願第１５／７４５，４８３号に関するものであるが、その優先権を主張するものではなく、該米国特許出願は、３７１の国内段階出願であり、かつ２０１６年７月２２日に出願されたＴｏｐｐ ｅｔ ａｌ．の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３４９５号に対する優先権を主張し、該国際特許出願は、２０１５年７月２２日に出願されたＴｏｐｐ ｅｔ ａｌ．の６２／１９５，５３７に関するものであり、かつこれに対する優先権を主張している（「関連する開示」と総称する）。前述の出願の内容は、参照によりそれらの全体が本開示に組み込まれる。

政府支援に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所中小企業技術革新制度により授与されたＲ４４ＤＫ１２１５９４－０１下の政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。

糖尿病は、膵臓が十分なインスリンを産生しない場合または身体が産生されるインスリンを有効に使用することができない場合に生じる慢性疾患である。インスリンは、血糖を調節するホルモンである。１型糖尿病は、インスリン産生の欠損を特徴とし、インスリンを毎日投与することが必要である。１型糖尿病の原因は現在不明であり、現在の知識では予防できないが、状態を管理することができる。２型糖尿病は、身体がインスリンを有効に使用していないことに起因する。２型糖尿病は、世界中の糖尿病患者の大部分を占めている。

推定３，０００万人の米国人が１型または２型糖尿病を患っており、米国では毎年１５０万の症例が新たに診断される。これらの個人は、血糖が健全なレベルに維持されるように、食事、運動、医薬品、血糖モニタリングを含む厳格なルーチンを維持しなければならない。この厳密なレジメンに従わない場合、糖尿病患者は、重度から中等度の低血糖症を発症し得る。軽度から中等度の低血糖症の症状には、頭痛、かすみ目、めまい、発汗、脱力感、および混乱が含まれ、これらの場合、血糖値は、通常、炭水化物の摂取によって回復することができる。しかしながら、重度の低血糖（１型糖尿病患者の４０％および２型糖尿病患者の２０％で少なくとも年に１回発生する）では、症状は、発作および意識不明を経験し、個人をさらに一層衰弱させる。

重度の低血糖症では、貯蔵されたグリコーゲンを血流に放出されるグルコースへと変換するホルモンであるグルカゴンの筋肉内または皮下注射を個人に行わなければならない。グルカゴンは血糖値の回復に有効であるが、低血糖事象は、投与が遅延するかまたは不適切に行われた場合、昏睡または死亡を引き起こし得る。これらの症例は、次いで、大きな経済的影響をもたらす。重度の低血糖症状を治療するために、毎年１億２０００万ドルの救急外来受診および数十億ドルの入院費用が支出されている。これらの費用は、糖尿病を有する患者の人口の増加により、ただ増加することが予想されている。

グルカゴンは、生命を脅かす低血糖症の治療における重要な治療薬として長い間使用されてきた。グルカゴンは、膵ａ細胞によって分泌される２９残基のペプチドホルモンであり、グルコース代謝において重要な役割を果たす。グルカゴンは、市販のキットに入って糖尿病の個人によって携帯され、典型的には、投与直前に希塩酸水溶液に可溶化することが意図されている凍結乾燥粉末として提供される。

グルカゴンの重大な問題は、分子が中性ｐＨで水への溶解性が悪く、酸性ｐＨで可溶化しなければならないことである。しかしながら、グルカゴンは、酸性溶液中でも安定ではなく、不溶性のアミロイドβフィブリルを不可逆的に形成する。グルカゴンアミロイドフィブリルの形成は、薬物の効力を損ない、毒性効果を生じる可能性があり、溶液粘度を増加して、これが注入ポンプまたは注射ペンを使用して製剤を送達することを困難にしている。

したがって、これらの溶解性および安定性の問題のために、市販のキットは、グルカゴンが投与直前に再構成され、かつ任意の余剰溶液が投与直後に廃棄され得るように、凍結乾燥粉末として製剤化されたグルカゴンおよび溶媒が予め充填されたシリンジから構成される。

個人が重度の低血糖を経験する場合、それは高ストレスの緊急的状況である。したがって、緊急キットを使用する従来の手法は、非常にストレスの強い条件下で第三者がいくつかの工程手順を経て、グルカゴンを成功裏に再構成し、用量を投与することを必要とする。第三者の不安は、キットの非使用または投与の誤りにつながる可能性があり、キットの使用の３０％以上で誤りが発生する。従来の製剤に関する針の曝露および投与の誤りの不都合さおよびリスクにより、低血糖症の治療に安全性および有効性があるにもかかわらず、グルカゴンの利用は十分なものになっていない。さらに、個人がその大きさのために携帯するのが面倒と感じるため、必要なときにキットがしばしば利用可能でなく、低血糖症救助のためには緊急治療室への依存度が高まる。従来のキットの利用が十分でないことおよびそのようなキットの使用での誤りの割合により、グルカゴン救出戦略の改善の必要性が浮き彫りになっている。実際、重度の低血糖症の事象を経験している個人の転帰を改善し、全医療費を削減するために、より広範囲での効果的な使用を促進する、簡単で使いやすく、かつ費用対効果の高い解決策が必要とされている。

さらに、グルカゴンの溶解性および安定性の問題は、クローズドループ人工膵臓デバイスの開発を妨げている。そのようなデバイスは、血糖の変動に応答してインスリンおよびグルカゴンを自動的に投与することができ、糖尿病患者の生活の質を著しく改善することができる。血糖の変動に応答して調節可能な量のグルカゴン溶液を即座に投与することを必要とする人工膵臓に、凍結乾燥グルカゴン製剤を使用することは現実的ではない。したがって、糖尿病患者の治療における人工膵臓デバイスの潜在的な利益を実現するために、安定しかつ安全なグルカゴン代替物が必要である。

本開示は、実質的に中性のｐＨで水溶液に可溶性であり、かつ耐酸化性である、修飾グルカゴン分子および製剤を提供する。グルカゴンに対する従来の溶解性および安定性の問題は、部分的には、グルカゴンフィブリル化によりアミロイドβフィブリルが形成されるために生じる。アミロイドβフィブリルは、βスパイン（β－ｓｐｉｎｅ）として知られる長いβシートであり、これは、その側鎖の絡み合いによって隣り合って相互作用し、立体ジッパーを形成する。本開示の態様は、互いに相互作用して立体ジッパーを形成するグルカゴン分子の特定のアミノ酸残基を修飾することに基づく。それらのアミノ酸をその相互作用を妨げる様式で修飾することにより、フィブリル形成を阻害し、したがって、分子の溶解性を促進する。さらに、特定の実施形態では、耐酸化性を促進するために、天然グルカゴンまたはホスホグルカゴンは、抗酸化製剤中に保存されるか、またはグルカゴンおよび／もしくはホスホグルカゴンが、メチオニン残基を置き換えるように修飾される。安定した溶液としてグルカゴンを製剤化することは、現在の用途のための利用を促進するだけでなく、人工膵臓デバイスなどによりグルカゴンの治療利益を拡げるための大きなステップでもある。

本開示の少なくとも１つの例示的な実施形態では、分子が、実質的に中性のｐＨで可溶性であり、および／または（長期にわたり）耐酸化性であるように修飾された、配列番号１（天然グルカゴン）を含むペプチドが提供される。例示的な修飾は、１つ以上のアミノ酸が、アミロイドフィブリルの形成を防止するために可逆的にリン酸化され、さらに、その２７位のメチオニンが、長期にわたり酸化を低減するために置換されているものである。２７位は、耐酸化性メチオニン模擬アナログ（ｍｅｍｅｔｉｃ ａｎａｌｏｇ）またはその異性体で置換され得る。少なくとも１つの実施形態では、メチオニン模擬アナログは、ノルロイシンもしくはその異性体、またはメトキシニンもしくはその異性体を含む。少なくとも１つの例示的な実施形態では、ペプチドは、配列番号２を含み、Ｘは、ノルロイシンもしくはその異性体、またはメトキシニンもしくはその異性体を含む。

ペプチドが１つ以上のアミノ酸でリン酸化される場合、そのようなアミノ酸は、Ｈｉｓ^１、Ｓｅｒ^２、Ｔｈｒ^５、Ｔｈｒ^７、Ｓｅｒ^８、Ｔｙｒ^１０、Ｓｅｒ^１１、Ｔｙｒ^１３、Ｓｅｒ^１６、Ｔｈｒ^２９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

医薬組成物も提供される。少なくとも一実施形態では、本開示の医薬組成物は、修飾ペプチドが、（ａ）２７位のアミノ酸が、耐酸化性メチオニン模擬アナログまたはその異性体で置換されるように修飾されるか、（ｂ）修飾ペプチドのアミノ酸のうちの１つ以上が、（例えば、限定されないが、上記のアミノ酸残基において）リン酸化されるように修飾されるか、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方であるように修飾された、配列番号１を含む、修飾ペプチドまたはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体と、を含む。

特定の実施形態では、そのような医薬組成物は、抗酸化剤をさらに含み得る。そのような抗酸化剤は、アスコルビン酸、システイン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、メチオニン、および／または前述の抗酸化剤のうちのいずれかの異性体を含み得る。少なくとも１つの例示的な実施形態では、医薬組成物は、１～５ｍＭのＥＤＴＡが中に懸濁されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．５ｍＭ～５０ｍＭのＬ－メチオニンが中に懸濁されたＰＢＳ、中に１～５ｍＭのＥＤＴＡが中に懸濁されたヒスチジン緩衝液、または０．５ｍＭ～５０ｍＭのＬ－メチオニンが中に懸濁されたヒスチジン緩衝液を含む。

さらに他の実施形態では、組成物は、プロドラッグを含み得る。例えば、限定されないが、プロドラッグにおいて、各リン酸基は、プロドラッグの投与時に化学的または酵素的に切断される。

医薬組成物は、実質的に中性のｐＨの水溶液を含み得る。さらに、またはあるいは、医薬組成物は、１ｍｇ／ｍＬ以上～５０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の修飾ペプチドを含み得る。

本開示の修飾ペプチドおよび製剤を使用して状態を治療する方法も提供される。少なくとも１つの実施形態では、本方法は、状態（例えば、胃腸運動または糖尿病状態）を治療するのに有効な量の修飾グルカゴンを含む安定な製剤を対象に投与することによって、状態またはその合併症を治療することを含む。ここで、グルカゴンは、（ａ）２７位のアミノ酸が、耐酸化性メチオニン模擬アナログまたはその異性体で置換されるように修飾されるか、（ｂ）グルカゴンの１つ以上のアミノ酸が、リン酸化されるように修飾されるか、（ｃ）または（ａ）および（ｂ）の両方であるように修飾される。修飾グルカゴンは、配列番号２を含み得、Ｘは、ノルロイシンもしくはその異性体、またはメトキシニンもしくはその異性体である。さらに、またはあるいは、安定な製剤は、本明細書で参照される特定の製剤のいずれかを使用して、アスコルビン酸、システイン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ、メチオニン、または前述のうちのいずれかの異性体からなる群から選択される１つ以上の抗酸化剤をさらに含む。

追加の方法は、対象にインスリンを投与することを提供する。少なくとも１つの実施形態では、修飾グルカゴンの安定な製剤およびインスリンは、対象の血糖値をモニタリングし、必要に応じて２つの薬物を独立して投与するデバイスによって異なる時間に投与される。

本開示の安定な製剤を含むような状態を治療するためのキットも提供される。少なくとも１つの例示的な実施形態では、安定な製剤は、実質的に中性のｐＨの水溶液である。そのようなキットは、バイアル、カートリッジ、自動注射デバイス、ポンプ、または経鼻スプレーデバイスをさらに含み得、これらの全ては、安定な製剤を含み得る（すなわち、予め混合されている／予め充填されている）。例えば、限定されないが、キットは、シリンジを含み得、シリンジは、安定な製剤で予め充填され、安定な製剤は、抗酸化剤をさらに含む。さらに、安定な製剤は、治療有効量の修飾ペプチドを含み得る。

開示される実施形態および本明細書に含まれる他の特徴、利点、および態様、ならびにそれらを達成するための事項は、本開示の様々な例示的な実施形態の以下の詳細な説明に照らして明らかになるであろう。そのような詳細な説明は、添付の図面と併せて考えるとよりよく理解されるであろう。

サブパートＡは、高度に疎水性のコアを有する天然グルカゴンフィブリルの立体ジッパー領域のエネルギー的に有利な構造の例を示し、サブパートＢは、疎水性コアの中央に荷電した基が配置され、したがって立体ジッパー形成を妨げる、Ｓｅｒ^８（疎水性コア内に埋設された残基）上にリン酸エステルを有するグルカゴン分子のモデルを示す。 容易にリン酸化可能な側鎖として同定された１０個のアミノ酸に下線が引かれた天然グルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列を示す。 リン－Ｓｅｒ８－グルカゴンアナログの１ヶ月間の安定性試料中の相対的なＭｅｔ^２７酸化パーセントのグラフ表示を示し、Ｍｅｔ^２７酸化は、質量スペクトルにおける非酸化種に対する酸化種のピーク高さを測定することによって定量化される； 天然グルカゴンまたはホスホグルカゴンのいずれかの投与に応答するラットでの血糖測定値のグラフ表示を示す（各試験群についてｎ＝８）； 図５Ａは、ホスホ－Ｔｈｒ^５－グルカゴンを表す（０～１２週目のＣＤスペクトル結果） 図５Ｂは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液中のホスホ－Ｔｈｒ^５－グルカゴンを示す（０～１２週目のＣＤスペクトル結果） 図５Ｃは、ホスホ－Ｔｈｒ^７－グルカゴンを示す（０～１２週目のＣＤスペクトル結果） 図５Ｄは、ＥＤＴＡ溶液中のホスホ－Ｔｈｒ^７－グルカゴンを示す（０～１２週目のＣＤスペクトル結果） 図５Ｅは、ホスホ－Ｓｅｒ^８－グルカゴンを示す（０～１２週目のＣＤスペクトル結果） 図５Ｆは、ＥＤＴＡ溶液中のホスホ－Ｓｅｒ^８－グルカゴンを示す（０～１２週目のＣＤスペクトル結果） 図５Ｇは、Ｎｌｅ^２７がＭｅｔ^２７に置換されたホスホ－Ｔｈｒ^５－グルカゴンを示す（０～１２週目のＣＤスペクトル結果） 図５Ｈは、Ｎｌｅ^２７がＭｅｔ^２７に置換されたホスホ－Ｔｈｒ^７－グルカゴンを示す（０～１２週目のＣＤスペクトル結果） 図５Ｉは、Ｎｌｅ^２７がＭｅｔ^２７に置換されたホスホ－Ｓｅｒ^８－グルカゴンを示す（０～１２週目のＣＤスペクトル結果） 図５Ａ～図５Ｉの試料の質量分析結果を示し、これは、１２週目までにメチオニン置換および耐酸化性試験試料において酸化または分解が起こらなかったかまたは最小限であったことを裏付ける。 図５Ａ～図５Ｉの試料の質量分析結果を示し、これは、１２週目までにメチオニン置換および耐酸化性試験試料において酸化または分解が起こらなかったかまたは最小限であったことを裏付ける。

本開示は、様々な修正および代替的な形態について許容され、それらの例示的な実施形態は、図面に例示され、本明細書で詳細に説明されている。

配列表の簡単な説明
配列番号１は、天然グルカゴンのアミノ酸配列：ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴであり、
配列番号２は、メチオニン置換グルカゴンの人工アミノ酸配列：
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＸＮＴであり、Ｘは、限定されないが、ノルロイシンもしくはその異性体、またはメトキシニンもしくはその異性体を含む、メチオニンの模擬アナログである：

前述に加えて、上記の配列は、本明細書と共に提出されるファイル中にコードされるコンピュータ読み取り可能な形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。コンピュータ読み取り可能な形式で記録された情報は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１（ｆ）に従った、上記で提供された書面による配列表と同一である。

本開示の原理の理解を容易にする目的のために、図面および明細書に示される実施形態を参照し、特定の言語を使用してそれらを説明する。それでもなお、これらの実施形態の説明により、範囲を限定することが意図されていないことが理解されるであろう。むしろ、本開示は、添付の特許請求の範囲によって定義される本出願の真意および範囲内に含まれ得る代替物、修正物、および同等物を包含することが意図される。前述のように、１つ以上の好ましい実施形態において、この技術を例示および説明し得るが、本発明の組成物、システム、および方法は、多くの異なる構成、形態、材料、および付属物を含み得る。

以下の説明では、本開示の完全な理解を提供するために、多くの特定の詳細を記載する。特定の例は、これらの特定の詳細の一部または全てなしに実施され得、本開示は、特定の生物学的システムに限定されるものではなく、当然ながら変化し得ることが理解されるべきである。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、関連技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似するまたは同等の任意の方法および材料を本出願の主題の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を本明細書に記載する。さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が特に明示しない限り、複数の指示対象を含む。さらに、特に明記しない限り、「約」という用語は、パーセントに関してはプラスまたはマイナス１０％の値の範囲を指し、単位の値に関してはプラスまたはマイナス１．０単位の値の範囲を指し、例えば、約１．０は、０．９～１．１の値の範囲を指す。

「対象」または「患者」は、該用語を本明細書で使用する場合、哺乳動物である。これらの用語は、好ましくはヒトを指すが、マウス、ネコ、イヌ、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、またはヒツジなどの非ヒト哺乳動物も指すことができ、雄、雌、成人、および小児を含む。

本明細書で使用する場合、「糖尿病状態」という語句は、限定されないが、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、前糖尿病、低血糖、およびメタボリックシンドロームを含む。

「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、本明細書で使用する場合、治癒的および／または予防的治療を含む。より具体的には、治癒的治療は、症状の緩和、改善および／または排除、低減および／または安定化（例えば、より進行した段階への進行がないこと）、ならびに特定の障害の症状の進行の遅延のうちのいずれかを指す。予防的治療とは、以下：発症を止めること、発症のリスクを低減すること、発症率を低減すること、発症を遅延させること、発症を低減すること、および特定の障害の症状の発症までの時間を延長することのうちのいずれかを指す。

本明細書で使用する場合、「治療有効用量」、「治療有効量」、および「有効量」という語句は、（特段明示しない限り）１回または治療サイクル（例えば、限定されないが、糖尿病状態に関連する効果の軽減または予防）の過程にわたって投与されたときに、対象の健康、福祉、または死亡に影響を及ぼす化合物の量を意味する。本明細書に記載される疾患、状態、または障害（糖尿病状態を含むが、これらに限定されない）を治療するために対象に投与されるペプチド薬物または他の化合物の適切な投与量または量は、治療される状態の種類および重症度、疾患病状の進行度、組成物の製剤化、患者の応答、処方医師または医療提供者の判断、ならびに治療される患者または対象の特徴（例えば、全身の健康、年齢、性別、体重、および薬物に対する認容性）を含むいくつかの因子によって変化するであろう。治療有効量はまた、治療剤の任意の毒性または有害効果が治療上有益な効果よりも上回る量である。

さらに、糖尿病状態または他の疾患もしくは障害を治療するための本明細書に記載のペプチド薬物の投与用量は、当業者によって実施される用量および予定レジメンに従う。本方法で使用される全ての薬理剤の適切な用量に関する一般的な指針は、上記のＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１１版，２００６およびＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ），例えば、第７１版（２０１７）またはオンラインで利用可能なもの（ＰＤＲ．ｎｅｔ），ＰＤＲ Ｎｅｔｗｏｒｋ，ＬＬＣで提供されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

有効量または用量を決定することは、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。一般に、これらの用量を送達する製剤は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のペプチドまたはペプチドアナログ（ペプチドアナログが明示的に除外されない限り、「ペプチド」と総称する）を含み得、各ペプチドは、製剤中に約０．１ｍｇ／ｍＬからペプチドの溶解の限界までの濃度で存在する。この濃度は、好ましくは、約１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬ、例えば、約１ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬである。

「医薬組成物」という用語は、本明細書に記載の化合物、ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクル、例えば、保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味剤、香料剤、抗菌剤、抗真菌剤、滑沢剤、および分散剤を含む少なくとも１つの成分（投与様式および剤形の性質に応じて）を含む組成物を意味する。

「薬学的に許容される」という用語およびそれらの文法的変形は、組成物、担体、希釈剤、試薬などを指す場合に互換的に使用され、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、および／または吐き気、めまい、胃の不調などの望ましくない生理学的効果を生ずることなく、合理的な利益／リスク比に見合って、材料を哺乳動物にまたは哺乳動物上に投与することができることを表す。

本明細書で使用される「ホスホグルカゴン」という用語は、関連する開示および本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸側鎖でリン酸化されているグルカゴン分子誘導体を指す。

本明細書で使用される「プロドラッグ」という用語は、例えば血液中の加水分解により、インビボで急速に形質変換されて親化合物（ここでは、天然グルカゴン）を生成する化合物を指す。加水分解、代謝切断、または他の反応によってインビボで急速に変換され得る官能基は、プロドラッグの誘導体化因子（すなわち、「プロ部分（ｐｒｏｍｏｉｅｔｙ））として使用することができる。プロ部分には、限定されないが、アルカノイル（アセチル、プロピオニル、ブチリルなど）、非置換および置換アロイル（ベンゾイルおよび置換ベンゾイルなど）、アルコオキシカルボニル（エトキシカルボニルなど）、トリアルキルシリル（トリメチルシリルおよびトリエチルシリルなど）、ジカルボン酸を用いて形成されたモノエステル（スクシニルなど）、リン酸エステル、硫酸エステルなどの基が含まれる。本開示による有用な化合物の代謝的に切断可能な基はインビボで切断されやすいため、そのような基を有する化合物はプロドラッグとして作用する。代謝的に切断可能な基を有する化合物は、代謝的に切断可能な基の存在により、親化合物に付与される溶解性および／または吸収率の向上の結果として、改善された生物学的利用能または他の望ましい特性を示し得るという利点を有する。「真のプロドラッグ」は、その誘導体化形態では薬理学的に不活性であり、プロ部分が除去されたときにのみその活性を得る。しかしながら、本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」という用語は、そのような化合物がその誘導体化形態で活性を示すかどうかにかかわらず、インビボで化学的または酵素的に切断され得るプロモーション部分で誘導体化された化合物を指す。したがって、「プロドラッグ」という用語は、「真のプロドラッグ」、およびその誘導体化形態において活性を示す切断可能なプロ部分を有する誘導体の両方を包含する。

本明細書で使用される「中性ｐＨ」は、約ｐＨ７を指す。「実質的に中性のｐＨ」は、正確にはｐＨ７ではなくてもよいが、４～９の範囲のｐＨも含み、それらの間の任意の値を含むｐＨである。実質的に中性のｐＨは、約７．４の生理的中性ｐＨを含む。

本明細書で使用する場合、「化学的安定性」という語句は、治療剤に関して、製剤が特定の条件下で保存されるときに、酸化または加水分解などの化学経路によって生成される、許容可能な割合の分解生成物が形成されることを意味する。いくつかの実施形態では、化学的に安定な製剤は、製品の意図される保存条件での長期間の保存後に形成される、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の分解生成物を有する。

本明細書で使用する場合、「物理的安定性」という用語は、治療剤に関して、許容可能な割合の凝集体（例えば、二量体、三量体、およびより大きな形態）および他の物理的分解物（例えば、沈殿物）が形成されることを意味する。いくつかの実施形態では、物理的に安定な製剤は、製品の意図される保存条件での長期間の保存の後に形成される、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の凝集体または他の物理的分解生成物を有する。

本明細書で使用する場合、「安定な製剤」という用語は、製剤が、製品の意図された保存条件での長期間の保存後に、許容限度内で活性医薬成分（例えば、ホスホグルカゴンおよび／またはメチオニン置換グルカゴン）の化学的および物理的安定性を維持することを意味する。いくつかの実施形態では、安定な製剤は、２年間にわたって１０％未満の分解を有するか、または２年間にわたって５％未満の分解を有する。

「単離された」という用語は、材料が元の環境、例えば、それが天然に存在する場合には自然環境から取り出されることを意味する。例えば、生体内に存在する天然ポリペプチドは単離されないが、天然系内の共存材料の一部または全てから分離された同じポリペプチドは単離される。

「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とせず、代わりに、相対的な定義として意図される。

本開示の本発明の概念は、一般に、従来の技術を用いて保存された天然グルカゴンおよび前述のホスホグルカゴン誘導体と比較して、可溶化グルカゴンの安定性を向上する方法、組成物、および修飾ペプチドに関する。これらの本発明の戦略は、グルカゴンの酸化を最小限に抑えて、そのような向上された安定性を達成する。そのような方法、組成物、および修飾ペプチドは、出発点としての天然グルカゴンと共に利用され、または例示的な実施形態では、関連する開示に記載されるホスホグルカゴン技術と併せて適用され、安定性の向上だけでなく、中性ｐＨでの溶解性の向上も達成し得る。

天然グルカゴン（配列番号１）は、３以下のｐＨおよび１０以上のｐＨで可溶性であることが見出されている。任意の特定の理論または作用機序に拘束されるものではないが、実質的に中性のｐＨでの天然グルカゴンに関する溶解性および安定性の問題は、そのほぼ中性の等電点（ＰＩ）ならびにグルカゴンのフィブリル化およびアミロイドβフィブリルの形成に起因すると考えられる。アミロイドβフィブリルは、βスパインとして既知である長いβシートであり、これは、その側鎖の絡み合いによって隣り合って相互作用し、「立体ジッパー」を形成する。

関連する開示に詳細に記載されているように、特定のアミノ酸側鎖へのリン酸の付加によって、天然グルカゴンにより形成される立体ジッパーを壊すことにより、天然グルカゴンと比較して、修飾グルカゴン分子の溶解性および安定性が改善されることが決定されている。中性ｐＨでは、リン酸化により、負電荷（－２）がジッパー形成側鎖に導入され、電荷反発によってグルカゴンの自己会合およびフィブリル化が阻害され、したがって、中性ｐＨでの溶解性が増加する。

図１のサブパートＡおよびＢは、グルカゴン分子の疎水性コアに埋包された残基（本実施例ではＳｅｒ^８）がどのようにリン酸化され得るかを示す。リン酸化は、疎水性コアの中央に荷電した基を配置し、それによって立体ジッパーの形成が妨げられる。計算モデルにより、Ｔｈｒ^５またはＳｅｒ^８でのリン酸化がＳｅｒ^２よりも有効であることが示唆されるが、その理由は、それらの部位は、それと反対側の立体ジッパーの中央に電荷を配置しているからである。したがって、特定のアミノ酸残基のリン酸化は、実質的に中性のｐＨ（すなわち、約４～９の間のｐＨ）で可溶性かつ安定である修飾グルカゴンを生じさせる。

さらに、リン酸基が血清条件に近いホスファターゼ酵素濃度で容易に酵素的に除去され、遊離天然グルカゴン生じさせることも決定された。言い換えれば、注射した際に、リン酸部分は、全身に天然に存在するホスファターゼ酵素によって切断され、天然グルカゴンを再生し、グリコーゲンからグルコースへの変換を促進して、血糖値を回復させる。

これは本質的に、小分子薬物（例えば、ホスフェニトイン）の溶解性を改善するために長期使用するプロドラッグ手法であり、ここではグルカゴンフィブリル化を阻害することに適用される。上述のように、リン酸化はまた、等電点（ＰＩ）をシフトすることによって、中性ｐＨでのグルカゴンの溶解性を増加させる。グルカゴンの理論的ＰＩは７付近であるため、分子は、本質的に荷電しておらず、中性水溶液中で溶解性が非常に低い。単一のリン酸基を付加することにより、正味電荷が２減少し、中性ｐＨでの溶解性が増加する。

リン酸化プロセスは、当該技術分野で周知であり、既知の技術を使用して達成することができる。一実施形態では、標的アミノ酸のリン酸化は、ＡＴＰがホスホリルのドナーとして機能するプロセスにおけるキナーゼおよびホスファターゼ酵素を含む可逆的酵素プロセスとして達成することができる。全体的な反応は、以下のように表すことができる：
リン酸化：Ｅ＋ＡＴＰ→→Ｅ－Ｐ＋ＡＤＰ
さらに、ホスホグルカゴンは、試薬として１つ以上のリン酸化アミノ酸を使用する固相合成手順または他の既知のペプチド合成手順によって調製され得る。

これらのアミノ酸への誘導体化に限定するものではないは、天然グルカゴン上には、容易にリン酸化可能なアミノ酸側鎖が１０個（すなわち、Ｈｉｓ^１、Ｓｅｒ^２、Ｔｈｒ^５、Ｔｈｒ^７、Ｓｅｒ^８、Ｔｙｒ^１０、Ｓｅｒ^１１、Ｔｙｒ^１３、Ｓｅｒ^１６、Ｔｈｒ^２９）存在する（図２を参照）。１０個の残基のうち、２個は鎖末端にあり（Ｈｉｓ^１およびＴｈｒ^２９）、フィブリル形成に関与する可能性が低い。それにもかかわらず、これらの容易にリン酸化可能な部位に１～３個のリン酸基を担持する、１０個の１つリン酸化された、４５個の２つリン酸化された、および１２０個の３つリン酸化された可能なグルカゴンプロドラッグが存在し、合計１７５個の異なる分子である。最大１０部位のリン酸化が可能であり、容易にリン酸化可能な側鎖に基づく異なるホスホグルカゴン誘導体の数は、１０２３に増加する。これらのホスホグルカゴン誘導体は、天然グルカゴン誘導体よりも高い溶解性および安定性を有することが示されている。さらに、これらの化合物はインビボで有効である。実際、本明細書および関連する開示に提供されるデータは、本発明のホスホグルカゴンが、対象への投与後に容易に脱リン酸化されて、その結果、それらが天然グルカゴンに戻ることを示している。さらに、それらのインビボでの性能は、天然グルカゴンに匹敵する。

天然グルカゴン（配列番号１）、したがって、前述のホスホグルカゴンは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によって酸化されやすいアミノ酸であるメチオニン残基を２７位に含む。酸化は、タンパク質のミスフォールディングを生じ得、これは、グルカゴンの安定性に悪影響を及ぼし、および／またはその生物学的機能を損ない、その免疫原性に重大な影響を及ぼし得る。ホスホグルカゴンに関する好ましい予備的研究にもかかわらず、ホスホグルカゴンアナログは、保護されていない製剤中での３０日間の保存後に、Ｍｅｔ^２７がメチオニンスルホキシドおよび（より低い程度で）メチオニンスルホンに酸化されることを示している。製剤の貯蔵寿命を延長し、ホスホグルカゴンおよび／または天然グルカゴンを他の用途（例えば、人工膵臓での使用）へと変更可能にするには、現在の製剤の安定性をさらに延長する必要がある。本明細書で提示する場合、これは、リン酸化グルカゴンもしくは天然グルカゴンのいずれかのメチオニン残基の修飾、および／または抗酸化剤が豊富な新規な製剤の使用によって達成することができる。

安定性の懸念に対処するために、本開示の少なくとも１つの例示的な実施形態では、分子の化学的安定性を向上させるために２７位（メチオニンまたはＭｅｔ^２７）にアミノ酸置換を含むグルカゴン分子（配列番号２）が提供される。例えば、Ｍｅｔ^２７は、酸化安定性メチオニン模擬アナログまたはその異性体で置換され得る。

本開示の特定の実施形態では、ノルロイシン（Ｎｌｅ^２７）、メトキシニン（Ｍｏｘ^２７）（ホモセリンメチルエーテルとも呼ばれる）、またはＮｌｅもしくはＭｏｘの異性体は、Ｍｅｔ^２７に代えて置換され得る。ノルロイシンは、いくつかの点でメチオニンに類似しているが、異なる側鎖を有するために、より酸化されにくい。Ｍｅｔ→Ｎｌｅ変換は、アミノ酸側鎖の長さを保持し、これは、疎水性相互作用に重要であるが、その水素結合特性には重要ではない。同様に、Ｍｅｔ→Ｍｏｘ置換は、Ｍｅｔの電子特性についてよく似ている。重要なことに、そのような修飾グルカゴン分子は、本開示の天然グルカゴンおよび／または非置換ホスホグルカゴン誘導体と比較して酸化を低減し、したがって、得られた製剤および／または医薬組成物の貯蔵寿命が延長されることが示されている。さらに、得られるグルカゴン誘導体では、天然グルカゴンの生物活性が保存される。

特定の置換が記載される一方、修飾グルカゴンの生物活性が有意に保存されている限り、任意の好適な耐酸化性アミノ酸が使用され得ることを理解されたい。特に使用中の医療用途においては、修飾ペプチドは、該修飾ペプチドが天然グルカゴンと同一または実質的に同様の特徴を示すように、できるだけ天然グルカゴンに近いことが望ましい。小さな変化は、タンパク質の物理的および化学的特性の有意な変化を誘発し得、これは、得られるペプチドの半減期および免疫原性に大きな影響を及ぼし得る。例えば、天然グルカゴンは、筋肉内投与では約２０～２６分、経鼻粉末の投与では約３０～４５分、皮下自動注射器または予め充填された用量では約２８～３５分の半減期を有する。同様に、任意のグルカゴン誘導体は、少なくとも天然グルカゴンよりも（または理想的には）抗原性が低いものである必要がある。グルカゴン分子の２７位のみを修飾することにより、本明細書における修飾ペプチドの例示的な実施形態は、天然グルカゴンに匹敵する半減期および抗原性を示す一方、著しい耐酸化性を付与し、得られる生成物の貯蔵寿命を延ばす。したがって、本開示の修飾ペプチドは、天然グルカゴンの実行可能な代用物であり、その貯蔵寿命を著しく向上する長期間にわたる安定性を維持することも可能である。

本明細書の修飾グルカゴンペプチドは、（上述および関連する開示に記載されるように）実質的に中性のｐＨで可溶性であるグルカゴン分子を生じさせるための立体ジッパー形成に関与する１つ以上のアミノ酸側鎖のリン酸化を任意選択で含み得る。そのような実施形態では、グルカゴンのＭｅｔ^２７は、上述のように置換されてもまたは置換されなくてもよいが、メチオニンが置換されていない場合、耐酸化性を提供するために新規な耐酸化性製剤を使用し得る。そのような実施形態は、それらが、メチオニンＭｅｔ^２７をメチオニンＮｌｅ^２７、Ｍｏｘ^２７、または任意の他の適切な酸化安定性アミノ酸もしくはその異性体で置換することから生じ得る潜在的な毒性（もしある場合）を回避するという点で、特に有益であり得る。より具体的には、特定の実施形態では、グルカゴンペプチドおよび／またはホスホグルカゴンペプチド（以下にさらに詳細に記載される）は、１つ以上の抗酸化剤を含む緩衝液または賦形剤中に懸濁され得る。適用において、抗酸化剤は、競合阻害剤と同様に作用し、抗酸化剤が最初に酸化することによってグルカゴンのメチオニンを酸化から保護するような濃度で製剤内に存在する。換言すれば、抗酸化剤は、製剤内でＲＯＳと反応することによって、溶液内のＲＯＳ濃度を低減または排除する脱酸素剤であり得る。

製剤に利用される抗酸化剤は、限定されないが、アスコルビン酸（例えば、Ｌ－（＋）－アスコルビン酸）、システイン（例えば、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン）、ポリソルベート２０および／または８０、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、メチオニン（例えば、Ｌ－メチオニン）を含む、実質的に中性のｐＨで有効な生物学的製剤および医療用製剤に適切な任意の抗酸化剤を含み得る。抗酸化剤の濃度は、必要に応じて、使用される正確な抗酸化剤および／または抗酸化剤の組み合わせに従って調整し得、例えば、限定されないが、約０．５ｍＭ～１００ｍＭ（その中の任意の値を含む）を含み得る。少なくとも１つの例示的な実施形態では、抗酸化剤の濃度は、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、または約２０ｍＭを含む。

少なくとも１つの実施形態では、製剤は、約１～５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで調製されるホスホグルカゴンペプチド（約１ｍｇ／ＭＬ）を含む。代替の実施形態では、製剤は、約０．５ｍＭ～５０ｍＭのＬ－メチオニンを含むＰＢＳ、約１～５ｍＭのＥＤＴＡを含むヒスチジン緩衝液、または約０．５ｍＭ～５０ｍＭのＬ－メチオニンを含むヒスチジン緩衝液で調製されるホスホグルカゴンペプチド（約１ｍｇ／ＭＬ）を含み得る。

本明細書における特有のペプチドおよび製剤は、従来の手法のいくつかの利点を提供する。多くの従来の技術は、緊急救助用途にはおそらく許容されるが、長期的で一貫した計量注入（例えば、人工膵臓）には理想的ではない、無機溶媒を使用する。さらに、従来の用途が有機溶媒を利用する場合には天然グルカゴンが用いられており、上記の問題が、溶解性および長期にわたる安定性に関して生じる。本ペプチドおよび関連する製剤、組成物、および方法は、従来の手法で経験される全ての障害を克服し、糖尿病状態の治療に有効な使いやすく安全な代替を提供する。

本開示の新規のペプチドならびに／または緩衝液および賦形剤を含む製剤は、皮下、皮内、鼻腔内、筋肉内、または静脈内（例えば、注射または注入による）投与用であり得る。いくつかの実施形態では、この製剤は、皮下投与される。さらに、本開示の製剤は、任意の好適なデバイスを使用して、注射または注入によって投与される。例えば、本開示の製剤は、シリンジ、ペン注射デバイス、鼻スプレー送達デバイス、自動注射デバイス、またはポンプデバイス中に入れられ得る。いくつかの実施形態では、注射デバイスは、低血糖の緊急治療のための単回用量シリンジまたはペンデバイスである。他の実施形態では、注射デバイスは、複数回用量注射ポンプデバイスまたは複数回用量自動注射デバイスである。製剤は、自動注射器またはスプレーデバイスなどの注射デバイスの作動時に、ペプチド薬物を送達するために、製剤が針から容易に流出することができるような様式でデバイス内に提供される。好適なペン／自動注射デバイスは、限定されないが、Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＳＨＬ Ｇｒｏｕｐ）、ＹｐｓｏＭｅｄ Ａｇなどによって製造されるペン／スプレー／自動注射デバイスを含む。好適なポンプデバイスは、限定されないが、Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｌｓｙｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ ＭｉｎｉＭｅｄ，Ｉｎｃ．などによって製造されるポンプデバイスを含む。

いくつかの実施形態では、本開示の新規のペプチドならびに／または緩衝液および賦形剤を含む製剤は、バイアル、カートリッジ、または予め充填されたシリンジで投与するように準備して提供される。

本開示の化合物が医薬としてヒトおよび他の哺乳動物に投与される場合、それらは、それ自体で与えることができ、または例えば、約０．１～９９．５％（より好ましくは、約０．５～９０％）の活性成分、すなわち少なくとも新規の耐酸化性製剤が使用される場合には天然グルカゴン、ならびに／または本明細書に記載のメチオニン置換グルカゴンペプチドおよび／もしくは他のグルカゴン誘導体のうちの１つを、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物として与えることができる。さらに、そのような医薬品は、さらなる耐酸化性が望まれる耐酸化性製剤も含み得る。

一般に、本開示の医薬化合物の好適な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である化合物量である。そのような有効用量は、一般的に、治療有効用量に関する上述の要因に依存する。必要に応じて、活性化合物の有効な１日用量は、１日を通して適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６、またはそれ以上の分割用量（ｓｕｂ－ｄｏｓｅ）として、任意選択で単位投与形態で投与し得る。

さらに、血糖（ＢＧ）濃度の自動制御は、糖尿病状態のために長い間求められてきた目標であった。従来、クローズドループ制御システムは、対象の血糖濃度を測定し、増加した血糖値の検出に応答して、必要に応じてインスリンを皮下送達する。従来の技術では高濃度で生物学的に許容される溶液中にグルカゴンを保存することができないため、必要に応じてインスリンおよびグルカゴンの両方を送達することができる実行可能なバイホルモンクローズドループシステムは、現在まで利用可能ではなかった。しかしながら、本開示のペプチド、組成物、および方法により達成されたグルカゴンの溶解性および安定性の進歩に鑑みると、そのようなバイホルモン（ｂｉ－ｈｏｒｍｏｎａｌ）クローズドループシステム（すなわち、人工膵臓）は現在、実現可能である。実際、本明細書に記載の新規な製剤を使用して、ホスホグルカゴンは、そのようなバイホルモンクローズドループシステムによって必要に応じて自動的に投与され得るように、実質的に中性のｐＨの水溶液中で高濃度で保存され得る。例えば、少なくとも１つの実施形態では、医薬組成物は、修飾ペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含み得る。

他の態様では、本開示は、本明細書に記載の修飾グルカゴン化合物の安定な製剤を含むキットを提供する。例えば、少なくとも１つの例示的な実施形態では、本開示の化合物は、バイアル中に、実質的に中性のｐＨ（すなわち、ｐＨ４～９（９を含む））の水溶液中で保存される。水溶液は、ヒトおよび他の哺乳動物と生体適合性である。いくつかの実施形態では、キットは、ペン注射デバイス、自動注射デバイス、ポンプ、または経鼻スプレーデバイスの一部であるシリンジを含む。少なくとも１つの実施形態では、シリンジは、安定な製剤で予め充填される。

そのようなキットは、説明書をさらに含み得る。例えば、そのような説明書は、それを必要とする対象（例えば、急性低血糖または別の糖尿病状態を経験している対象）を治療するための安定な製剤の投与を指示し得る。

本発明のペプチドおよび製剤を使用して状態を治療するための方法も提供される。少なくとも１つの実施形態では、状態を治療するのに有効な量の修飾グルカゴン分子を含む安定な製剤を対象に投与することによって、状態またはその合併症を治療するための方法が提供される。修飾ペプチドは、置換メチオニンを含むグルカゴン（例えば、耐酸化性メチオニン模擬アナログに変換される）を含む、本明細書に記載されるグルカゴン誘導体のうちのいずれかを含み得る。別の実施形態では、修飾ペプチドは、単に、ホスホグルカゴンを含み得る。さらに、少なくとも１つの例示的な実施形態では、修飾ペプチドは、置換メチオニンを含み得、また１つ以上のアミノ酸でリン酸化され得る。しかしながら、おそらくグルカゴンは全く修飾されなくてもよく、代わりに、本開示の利益は、抗酸化剤が豊富な溶液に懸濁された天然グルカゴンを含む製剤により達成され得ることにも留意されたい。

本方法の少なくとも１つの実施形態では、安定な形成は、上述のように、１つ以上の抗酸化剤をさらに含み得、そのような抗酸化剤を含ませることは、修飾ペプチドの酸化を防止することによって、修飾ペプチドの安定性を向上する。

さらに、方法がバイホルモンクローズドループシステム（すなわち、人工膵臓）と関連して使用される場合、方法は、対象にインスリンを投与することをさらに含み得る。そのような実施形態では、修飾グルカゴンの安定な製剤およびインスリンは、血液中の検出された血糖値に応答して、システムにより異なる時間に投与される。例えば、システムが確立されたベースラインと比較して増加した血糖値を検出する場合、システムはインスリンを自動的に投与する。逆に、システムが、確立されたベースラインと比較して血糖値の低下を検出した場合、システムは、修飾グルカゴンの安定な製剤を自動的に投与する。そのような投与のタイミングおよびその濃度は、当業者により、定義されたアルゴリズムに従って、容易に決定することができることが理解されるであろう。このようにして、糖尿病状態の二方向性管理を達成することができる。そのような治療は、従来のグルカゴンが高濃度で、水溶液中で、および／または実質的に中性のｐＨで保存することができないため、現在までに達成することができていない。

最後に、本開示の修飾グルカゴン、製剤、およびキットの他の医療用途も実現される。例えば、グルカゴンは、胃の画像化様式を受ける（すなわち、領域が動くことにより、不鮮明な画像をもたらし得る）対象において、胃腸運動を遅らせるまたは停止させるためにしばしば使用される。本明細書で論じられるペプチドおよび製剤の利益はまた、水性および実質的に中性のｐＨに一定期間保存された１つ以上の用量のグルカゴンを用いることが有益であり得る、この用途または任意の他の用途に関して有用であり得る。

本明細書の記載のペプチド、医薬組成物、および方法の様々な実施形態を非常に詳細に説明したが、実施形態は非限定的な例として提供されるにすぎない。本明細書に記載の実施形態の多くの変形および修正は、本開示に照らして当業者に明らかであろう。したがって、本開示の範囲から逸脱することなく、種々の変更および修正が行われ得、それらの要素に代えて等価物が置換され得ることが当業者には理解されるであろう。実際、本開示は、網羅的であるまたは非常に限定的であることを意図するものではない。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって定義される。

さらに、代表的な実施形態を説明する際に、本開示は、特定順序の工程として方法および／またはプロセスを提供し得る。しかしながら、方法またはプロセスが本明細書に示される工程の特定の順序に依存しない限り、方法またはプロセスは、記載される工程の特定の順序に限定されるべきではない。当業者であれば理解するであろうように、他の一連の工程が可能であり得る。したがって、本明細書に開示される工程の特定の順序は、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。さらに、方法および／またはプロセスに関する特許請求の範囲は、記載された順序でのそれらの工程の順序に限定されるべきではなく、当業者は、その順序が変化してもよく、依然として本開示の真意および範囲内に留まっていることを容易に理解することができる。

したがって、本説明および添付の特許請求の範囲は、本開示に基づく当業者に明らかな全ての修正および変更を包含することが意図される。

ホスホグルカゴン試験
予備的研究では、１つリン酸化されたグルカゴンアナログを、確立された固相合成技術を使用してカスタム合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、それぞれ、Ｓｅｒ^２、Ｔｈｒ^５、Ｔｈｒ^７、Ｓｅｒ^８、Ｔｙｒ^１０、Ｓｅｒ^１１、Ｔｙｒ^１３、およびＳｅｒ^１６のうちの１つでリン酸化した。次いで、アナログを、以下および関連する開示に記載される溶解性および安定性について評価した。以下のリン酸化の例は、１～２つのリン酸基を含むホスホグルカゴン誘導体に焦点を当てているが（これは本明細書に記載される手法を実証するように機能する）、本開示は、１つまたは２つのリン酸基のみを含むホスホグルカゴン誘導体に限定されず、代わりに、より高いレベルの誘導体化も含むことを理解されたい。

実施例１
ホスホグルカゴンの溶解性。
低血糖救出のための理想的なグルカゴンは、中性ｐＨの水溶液に十分な溶解性を有する。天然ヒトグルカゴンおよびそのホスホグルカゴンアナログのおよその溶解性は、完全な溶解が得られるまで（目視観察によって確認される）、既知量のペプチドに５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）または５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）を滴加することにより、室温で測定した。

より具体的には、濁度測定のために、１００μＬの濾過した安定試料を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し（３つ組）、最終体積を５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を含んで最大２００μＬとし、凝集指数を計算するために４０５ｎｍおよび２８０ｎｍのＵＶ吸光度を使用した。濁度は、濁度を初期値の５０％増加させるために必要な日数として報告される。蛍光測定のために、グルカゴンおよびホスホグルカゴン溶液を３．２ｍＭのＨＣＬ、０．９％のＮａＣｌ（ｗ／ｖ）（ｐＨ２．５）または５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）のいずれかで１ｍｇ／ｍＬで調製し、試料を遠心分離して濾過し、９６ウェル黒色平底マイクロタイタープレートに３つ組で配置し、５０μＭのチオフラビン－Ｔ（ＴｈＴ）最終濃度と共にインキュベートした。ＴｈＴの蛍光強度を決定するために、励起波長および発光波長をそれぞれ４４０ｎｍおよび４８２ｎｍに設定した。Ｔｒｐ－２５からの蛍光発光（自家蛍光、ＩＦ）の変化を決定するために、励起波長および発光波長をそれぞれ２９５ｎｍおよび３５５ｎｍに設定した。全ての蛍光読み取りを１５分間隔で２４時間行い、視覚化のために、１００，０００を超える（オーバーフロー）蛍光シグナルを１００，０００に設定した。ＴｈＴおよびＩＦの結果は、最初の読み取りと比較してシグナルを５０％減少させるために必要な時間として報告される。

既知量のペプチドを完全に溶解するために必要な緩衝液の体積を使用して、ペプチド濃度をｍｇ／ｍＬで計算した（表１）。救出用のグルカゴンの標準用量は、１ｍｇであり、１ｍＬの溶液中で送達される。したがって、１ｍｇ／ｍＬが、これらの研究の標的溶度として機能した。

表１．ホスホグルカゴンアナログの溶解性および安定性測定の概要。ａ室温におけるｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸ナトリウム（ＰＢ）中の溶解性。ｂ５０ｍＭ、ｐＨ７．４で行った。ＰＢ＝リン酸緩衝液。ＮＳ＝溶解性ではない。ＮＤ＝３５日間の研究期間中に検出なし。
溶解性研究により、多くのホスホグルカゴンアナログが、中性のｐＨで高い溶解性（＞１ｍｇ／ｍＬ）を示すが、予想されるように、天然グルカゴンは、このｐＨでは本質的に不溶性であることが示された。

実施例２
ホスホグルカゴンの安定性
ホスホグルカゴンの医学的影響および商業的利用可能性は、中性ｐＨでの溶解性に加えて、溶液中でのその安定性に依存する。物理的安定性、構造的安定性、および化学的安定性の評価を含む安定性研究のために、ホスホ－Ｔｈｒ^５－グルカゴン、ホスホ－Ｔｈｒ^７－グルカゴン、およびホスホ－Ｓｅｒ８－グルカゴンを選択したが、その理由は、それらがホスホグルカゴンアナログの最大の溶解性を有するためである。安定性研究のために、ホスホグルカゴン溶液試料を５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中で１ｍｇ／ｍＬで調製し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．１μｍフィルターで濾過して、任意の不溶性材料を除去した。試料を３００μｌとして２ｍＬのバイアルに等分し、窒素ガス下で密封し、暗所で室温で３５日間保存した。バイアルを一定の間隔で取り出して、濁度測定を使用して物理的安定性をモニタリングし、遠紫外円偏光二色性（ＣＤ）分光法および蛍光測定により構造的安定性をモニタリングし、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により化学的安定性をモニタリングした。

より具体的には、安定性試料を０．１％ギ酸（ＦＡ）中に希釈し、約６０ｐｍｏｌのホスホグルカゴンをペプチドマイクロトラップ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏｔｒａｐ）に注入した。１５％のアセトニトリル、８５％の水、および０．１％のＦＡを用いて、試料を２分間脱塩した。ＥＳＩ－ＬＣ／ＭＳ系（１２００シリーズＬＣ、６５２０Ｑ－ＴＯＦ）を使用して、１００～１７００のｍ／ｚ範囲にわたって質量スペクトルを得た。生データを処理し、データ解析ソフトウェア（ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して質量を分析した。質量スペクトルにおける非酸化種に対する酸化種のピークの高さを測定することにより、Ｍｅｔ^２７酸化を定量化した。

表１に示すように、３つ全てのホスホグルカゴンアナログは、３５日間の試験期間中、ホスホＴｈｒ^５およびホスホＳｅｒ^８－グルカゴンが検出可能なフィブリル化を伴わずに、優れた安定性を示した。ＣＤ分光法により、ホスホグルカゴンの構造は、安定性研究の１日目から３５日目まで事実上変化しないことが示された。ホスホグルカゴンの物理的および構造的安定性は良好であったが、ＬＣ／ＭＳ分析により、検出可能なレベルのメチオニン（Ｍｅｔ^２７）酸化が明らかとなった（図３参照）。以下に記載される本開示の実施形態は、酸化反応を最小限に抑え、および／またはメチオニン残基を置き換えるようにホスホグルカゴン配列を修飾することによる本発明の製剤戦略を使用して、この不純物に対処する。

実施例３
ホスホグルカゴンの脱リン酸化
グルカゴンのリン酸化がホスファターゼ酵素への曝露によって戻るかどうかを評価するために、ホスホ－Ｔｈｒ^５－グルカゴンおよびホスホ－Ｓｅｒ^８－グルカゴンを用いて脱リン酸化の動態を調べた。本研究のために、遊離リン酸塩がＢＩＯＭＯＬ緑色試薬と反応して、色の変化（黄色から緑色）を生じ、この変化は、遊離リン酸塩濃度に直接比例する、比色ホスファターゼアッセイ（ＢＩＯＭＯＬ）を行った。具体的には、２ｎｍｏｌのアナログを、最終体積を５０μＬとする、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４）中の０．００９単位のウシアルカリホスファターゼと別々にインキュベートした。反応は、３７℃で、５～４８０分間にわたり、９６ウェル結晶透明マイクロタイタープレートで行った。反応物を１００μＬのＢＩＯＭＯＬ緑色試薬（マラカイト緑色）を添加することによってクエンチし、６２０ｎｍで読み取った。既知のリン酸濃度を有する試料を使用して、リン酸塩標準曲線を得た。

表２．脱リン酸化研究の概要．
結果は、脱リン酸化が容易に起こることを裏付けている。実際、表２に示されるように、約１．５時間以内に、約半分のホスホグルカゴンが脱リン酸化されていた。

実施例４
ホスホグルカゴンのインビボ活性
リン酸化がグルカゴンの薬理活性を阻害しないまたは妨げないことを実証するために、代表的なホスホグルカゴンがラットの血糖値を上昇させる能力を、天然グルカゴンによって生じる上昇と比較した。

ホスホグルカゴンアナログを５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で透析した。その後、約７．１ｎｍｏｌ／ｋｇの天然グルカゴンまたはホスホグルカゴンのいずれかを、１６時間絶食させた雄Ｗｉｓｔａｒラットに皮下注射した。総血糖値を一定の間隔（５～１２０分）で採血することによって測定し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｌｉｔｅ（登録商標）血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ）を使用して試験した。

図４は、天然グルカゴンまたはホスホグルカゴンの投与に応答してラットで採取した血糖測定値を示す。重要なことに、ホスホグルカゴンは、天然グルカゴンと比較して同様のレベルに空腹時血糖を増加させ、その増加は同等の速度で生じた。したがって、このデータは、本開示の本発明ホスホグルカゴンが天然グルカゴンに匹敵する性能をインビボで示すことを裏付けている。

したがって、関連する開示において上記に提示されるホスホグルカゴンデータは、低血糖救出方法論および関連するキットのために、安定した溶液製剤中でホスホグルカゴンを使用することの実現可能性を示している。具体的には、そのようなデータは、（１）中性ｐＨ（＞１ｍｇ／ｍＬ）での適切な溶解性を提供し、（２）インビトロでのフィブリル化を阻害し、および（３）天然グルカゴンによってもたらされる血糖上昇と同等のラットでの血糖上昇をもたらす、グルカゴン上のいくつかのリン酸化部位を確立する。

酸化安定性の研究
次いで、前述のホスホグルカゴンデータを背景として、グルカゴンおよび／またはホスホグルカゴン製剤の両方の貯蔵寿命を延ばすことを目的として、メチオニン酸化による安定性の問題に対処した。予備的な取り組みで同定された４つのホスホグルカゴン候補を、以下の２つの別々の手法を使用して、それらの酸化安定性を改善した：（１）Ｍｅｔ^２７をノルロイシン（Ｎｌｅ^２７）で置き換えるようにホスホグルカゴン配列を修飾すること、ならびに（２）非修飾ホスホグルカゴンにおける酸化を最小限に抑えるように製剤戦略を評価すること。次いで、得られた製剤およびＮｌｅ^２７修飾ホスホグルカゴンを、インビトロ安定性およびインビボ機能性について評価し、ホスホグルカゴンを、安定性および機能性に関する所定のメトリックへのアドヒアランスに従ってランク付けした。

実施例５
製剤化および構造修飾により、ホスホグルカゴンおよび天然グルカゴン安定性を最適化する
リン酸化にもかかわらず、本明細書で同定されるホスホグルカゴンアナログは、保護されていない製剤中での３０日間の保存後に、Ｍｅｔ^２７がメチオニンスルホキシドおよび（より低い程度で）メチオニンスルホンに酸化をされることを示している。製剤の貯蔵寿命を延長し、ホスホグルカゴンおよび／または天然グルカゴンを他の用途（例えば、人工膵臓での使用）へと変更可能にするには、現在の製剤の安定性を延長しなければならない。所望の向上された安定性は、製剤の変更（すなわち、特定の緩衝液および／または賦形剤の添加）および／またはグルカゴンアミノ酸鎖のメチオニン残基の修飾によって達成された。

Ｍｅｔ^２７をノルロイシンで置換することにより、向上された安定性が達成されることを示すために、３つのリードホスホグルカゴン（ホスホ－Ｔｈｒ^５－グルカゴン、ホスホ－Ｔｈｒ^７－グルカゴン、およびホスホ－Ｓｅｒ^８－グルカゴン）を、メチオニンについてノルロイシン置換あり（すなわち、Ｍｅｔ^２７→Ｎｌｅ^２７）または置換なしの両方で合成した。全てのペプチドを、確立された固相合成技術を使用してＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってカスタム合成し、その後、２つの緩衝液（ヒスチジンおよび１×ＰＢＳ）中で１ｍｇ／ｍＬの濃度に製剤化した。Ｎｌｅアナログの溶解性を評価し、天然グルカゴンを対照として使用して、前述の技術を使用して任意のフィブリル化をモニタリングした。

Ｍｅｔ^２７をＮｌｅ^２７へと修飾する研究と並行して、酸化することが既知であるホスホグルカゴン（例えば、ホスホ－Ｓｅｒ^８－グルカゴン、図３を参照されたい）を使用して、いくつかの緩衝液および賦形剤をＭｅｔ^２７の酸化を阻害する能力について評価した。具体的には、上記で同定した３つのホスホグルカゴンの各々の試料を、以下の緩衝液：１～５ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬの溶液中で調製した。上記のホスホグルカゴン研究で記載されるように、溶解性およびフィブリル化（暗所で室温で３０日間）を評価した。次いで、ホスホ－Ｓｅｒ^８－グルカゴンの酸化を阻害することに成功した緩衝液を、他のリードホスホグルカゴンに関して評価した。

図５Ａ～図５Ｉは、そのような研究の結果を示す。Ｍｅｔ^２７置換および緩衝液／賦形剤研究の両方において（図５Ｂ、図５Ｄ、および図５Ｆ～図５Ｉ）、ホスホグルカゴン誘導体は、以前の繰り返しおよび従来技術と比較して、中性ｐＨで所望の改善された安定性を達成することができた。実際、３０℃で３ヶ月後、１０％未満の酸化が試料中に観察され、フィブリル化は検出されなかったか、または無視できるほどしか検出されなかった。さらに、中性ｐＨで約１ｇ／ｍＬ以上の溶解性が試験試料中で達成された。

実施例６
メチオニン置換グルカゴンアナログの安定性およびインビボ活性
中性ｐＨで約１ｍｇ／ｍＬ以上の溶解性を示し、３０日間にわたってほとんどまたは全く酸化またはフィブリル化がなかった天然グルカゴンおよび実施例５の上位の製剤を、３ヶ月間の安定性およびインビボ活性について評価した。

上述のメチオニン置換ペプチドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、各々が、ノルロイシンをメチオニンに置換した修飾グルカゴンおよび／またはホスホグルカゴン誘導体を含む。具体的には、上記で同定した１つのグルカゴンおよび８つのホスホグルカゴン製剤を調製し、バイアルに等分し、３ヶ月間３０℃に置いて安定性を評価した。安定性分析のために各製剤の３つのバイアルを毎週取り出し、自家蛍光を使用してフィブリル化の程度をモニタリングし、ＴｈＴ蛍光および濁度（ＵＶ）測定を行い（予備試験と同様）、全てグルカゴン対照と比較した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、親ピークの損失として、フィブリル化もモニタリングした。

酸化生成物の検出のために、ＥＳＩ ＬＣ／ＭＳを使用して、メチオニンスルホキシド（＋１６）および／またはメチオニンスルホン（＋３２）を同定した。酸化の程度を、ペプチド種の総面積の一部としてのＥＩＣ上の酸化生成物の相対面積として定量化した。次いで、時点と製剤戦略との間の安定性の差をＡＮＯＶＡを使用して決定し、続いて、多重比較のための検定（ダンカンの検定）を行った。

試験された試料のうち、メチオニン置換されていないか、または抗酸化剤溶液中の３つのホスホグルカゴンのみが、著しい酸化を示した（図６Ａの矢印で示される）。残りのメチオニン置換試料、およびメチオニン置換されていないが抗酸化剤溶液内にある試料は、３０℃で３ヶ月間保存したときに約１０％未満の酸化を示し、この期間中、フィブリル化がないことまたは無視できるほどのフィブリル化を示した（図６Ａおよび図６Ｂを参照されたい）。

次いで、様々な製剤（製剤の変更およびノルロイシン置換製剤の両方を含む）について安定性評価を行った。一方または他方の手法に関して天然グルカゴンと比較して観察される測定可能な差異に加えて、これらの手法の組み合わせは、得られた製剤において有意に向上された安定性を達成したことにも留意されたい。

実施例７
ラットを使用して修飾ホスホグルカゴンの薬力学的特性および機能性を決定する
次いで、実施例６のホスホグルカゴン製剤（例えば、ホスホ－Ｔｈｒ^５－グルカゴン＋ＥＤＴＡ；ホスホ－Ｔｈｒ^５－グルカゴン＋Ｍｅｔ^２７置換；ホスホ－Ｔｈｒ^７－グルカゴン＋ＥＤＴＡ；ホスホ－Ｔｈｒ^７－グルカゴン＋Ｍｅｔ^２７置換；ホスホ－Ｓｅｒ^８－グルカゴン＋ＥＤＴＡ；ホスホ－Ｓｅｒ^８－グルカゴン＋Ｍｅｔ^２７置換）をインビボで評価して、ペプチドが十分なインビボ生物学的活性を示すこと（すなわち、それが、作用の迅速な開始および短い作用持続時間で、天然グルカゴンと同様の速度で血糖を増加させること）を検証した。ホスホグルカゴン研究に関する予備結果項目に記載の方法を用いて、これをラットで評価した。ホスホグルカゴン製剤、天然グルカゴン、およびビヒクル対照ごとに、８匹のＷｉｓｔａｒラット（４匹の雄および４匹の雌；１６時間絶食）を使用し、全ての処置を筋肉内注射によって送達した。ピーク血糖値到達時間（ｔ_ｍａｘ）、ピーク血糖値（Ｃ_ｍａｘ）、および作用持続時間（例えば、ベースライン血糖の約＋／－１０％に戻るまでの時間）を各製剤について決定し、前述の研究に記載されるように比較した。

修飾メチオニンを含むホスホグルカゴン試料は、（驚くことではないが）メチオニン置換を有しないホスホグルカゴンと同様に、天然グルカゴン（速度および程度）と同様に血糖を増加させることを同定した（以前のホスホグルカゴン研究を参照）。具体的には、ラットでの約７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＭ投与後のインビボ応答の定量的基準は、（ｉ）約１５分以下で少なくとも４０ｍｇ／ｄＬの血糖上昇があること、および（ｉｉ）約２時間以下でベースライン血糖値の＋／－１０％に戻ることである。

実施例８
血漿中のホスホグルカゴンを検出ならびに定量化するための分析方法の開発ならびに検証
ホスホグルカゴン検出方法の信頼性を示し、最終的にＰＫ研究を裏付けるために、血漿中の修飾メチオニンを有するホスホグルカゴンを検出および定量化するための方法を開発し、再現性およびバイアスは、全ての測定基準について２０％未満のＣＶであるようにした。そのような方法の開発は、本明細書に記載のホスホグルカゴンを投与したラットから収集した血漿を使用して、その後に検証されたＬＣ－ＭＳ手法に焦点を当てた。

多重ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイを使用し、公開された方法に従って、ホスホグルカゴンプロドラッグ候補ならびに対応する脱リン酸化グルカゴンおよびグルカゴンアナログを測定した。有機溶媒を用いたタンパク質沈殿およびイオン交換固定相を用いた固相抽出（ＳＰＥ）により、所定の最適タンパク質沈殿および固相抽出条件下で、ペプチド分析物を血漿から単離した。様々な抽出溶媒および固相抽出条件をスクリーニングすることにより、グルカゴンを単離するための正確な戦略を決定した。さらに、グルカゴンは多くの電荷状態で存在する可能性が高いため、各アナログの測定に使用するための最適な電荷状態を評価し、信号強度および安定性に基づいてランク付けした。

分析物の回収は溶媒スクリーニングにより最適化され、アッセイ性能に関する任意の問題は内部標準によって容易に修正された。分析物の直接分析は、高分解能質量分析を使用して行い、アッセイは、血漿中で５０００～５０ｎｇ／ｍＬの動的範囲を有するように設計されており、これは、Ｃ_ｍａｘおよび定常状態レベルの両方を決定するのに十分である。このＬＣ－ＭＳ方法の理想的な実施形態は、血漿マトリックス中のホスホグルカゴンについて５０ｎｍ／ｍＬの検出限界を有し、これは、ペプチドの５半減期を含む範囲を考慮に入れる。

この分析手法を検証するために、１つの非リン酸化グルカゴン対照と共に、４つのホスホグルカゴン候補を評価のために選択した。全ての試料を５０ｎｇ／ｍＬ～５０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でラット血漿中に添加し（ｓｐｉｋｅｄ）、固相抽出によって抽出し、次いで、ＬＣ－ＭＳによって分析した。再現性、ペプチド安定性、線形性、定量化の下限、および干渉について、アッセイを評価した。再現性を複数日にわたる複数回の注入によって決定し、日の間のＣＶ、日内のＣＶ、および総ＣＶを決定した。

ペプチドの安定性のために、３つ組の試料のバイアスおよびＣＶを外挿値と比較し、定量化の下限をノイズの３倍以上に設定した。臨床的に関連する潜在的な干渉物を追加することにより、干渉を決定した。添加の希釈（干渉溶液に応じて５％～５０％希釈）を考慮した場合の３つ組の添加試料のＣＶおよびバイアスも、予想値と比較した。試料の安定性に関連する任意の問題は、プロテアーゼ阻害剤の使用および低温試料処理技術によって対処した。

実施例９
ホスホグルカゴン製剤の長期安定性試験
次いで、実施例８からの修飾メチオニンを含む以下の４つの修飾ホスホグルカゴンを調製し、長期安定性試験のために等分した。各誘導体の試料を４℃、２５℃、および４０℃で１８ヶ月間保存し、各試料の６つの複製物を、毎月、保存から取り出し、上記実施例６に記載されるプロトコルに従って安定性を評価した。時点と製剤戦略との間の安定性測定の差異をＡＮＯＶＡを使用して評価し、続いて、多重比較のための検定（ダンカンの検定）を行った。

この研究の成功の指標は、４０℃で保存した場合に１０％未満の酸化を示し、４℃で保存した場合に２％未満の酸化を示す製剤を、両方とも１８ヶ月の期間にわたって同定することであった。さらに、この期間中はフィブリル化が検出されてはならない。代替の保存バイアルおよび変更した保存条件も、本発明の製剤の安定性に影響を及ぼす可能性に関して考慮した。

実施例１０
ホスホグルカゴン製剤のＰＫ／ＰＤ特性の評価
ラットにおいて修飾メチオニンを含む４つのリードホスホグルカゴンの動態を評価するために、４つの修飾ホスホグルカゴンの各々のＰＫ／ＰＤ特性を、鼻腔内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）送達（ＩＮについて２つ、ＩＭについて２つ）の両方により、インビボで評価した。最も安定した可溶性の２つの候補をＩＮ剤として評価し、他の２つの候補をＩＭ投与について評価した。天然グルカゴンのＩＭ送達は、十分に特性評価され、ＩＭ候補のためのベンチマークとして機能することができるが、ＩＮは十分に特性評価されていないので、ＰＤ特性を十分に規定するために、ＩＮ研究について追加の用量を評価した。

投与前に、絶食した（１６時間）Ｗｉｓｔａｒラットを頸静脈カテーテルを介してカテーテル留置し、投与後に様々な時点での血液試料の収集を可とした。各ラットは、適切な経路（ＩＭまたはＩＮ；４匹の雄および４匹の雌／群）により、単回用量の各修飾ホスホグルカゴンを受けた。ビヒクルまたは天然グルカゴン（７．１ｎｍｏｌ／ｋｇ）を受けた群は、対照として機能した。ＩＭにより送達された修飾ホスホグルカゴンの場合、約２．５、５．０、７．１、または１０ｎｍｏｌ／ｋｇの修飾ホスホグルカゴンを覚醒ラットに筋肉内注射した。同様に、６つの濃度のＩＮを評価し、約５．０、７．１、１０、１５、２０、および４０ｎｍｏｌ／ｋｇの修飾ホスホグルカゴンを、麻酔下で（３Ｌ／分のＯ２流速での３％のイソフルラン）、ＩＮ群のラットの左鼻孔にピペットにより送達し、全用量の送達を確実にした。より小さな量の薬物の送達を可能にするために、より大きな用量範囲をＩＮ群で評価した。ＩＮ投与後、動物を垂直位置で最低３０秒保持して、投与溶液が鼻腔を通って流れることを可能にした。

定義された試験指標を満たす各送達経路（ＩＭおよびＩＮ）の上位のホスホグルカゴン製剤をフラグ付けし、以下に記載される予備的安全性および免疫原性プロファイル試験へと進んだ。一定間隔（５～１２０分）で採血することによって総血糖値を測定し、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ ＬＩＴＥ（血糖測定器、Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して試験した。投与前および投与後の１０時点（ベースライン、８０分まで１０分ごと、次いで１２０分）で血液試料を収集した。

特定の試料は、１）血糖の上昇の程度、２）ピークの血糖値に到達するために必要な時間、および３）ベースライン（トラフ（ｔｒｏｕｇｈ））レベルに到達するための時間に関して、天然グルカゴンと同様のプロファイルを有した。インビボで、アッセイを含むさらなる研究のために、最低有効用量を受けた群由来の血漿試料中の修飾ホスホグルカゴンおよび脱リン酸化プロドラッグの濃度（血糖測定によって決定される）をフラグ付けした。ダンカンの検定を用いたＡＮＯＶＡを使用して、ベースラインまたは空腹時血糖値に対する時点における差の有意性も決定した。

実施例１１
毒性研究
次いで、投与部位における毒性を評価するために、各経路について実施例１０で同定した上位の修飾ホスホグルカゴンを評価した。主に、ＩＮおよびＩＭ投与後における選択された各修飾ホスホグルカゴンの局所炎症反応を決定するため、ＩＭ処置のために、高度に修飾されたホスホグルカゴンの各々の実施例１０で使用されたものの約２倍の有効濃度を、麻酔下で（３Ｌ／分Ｏ２流速で３％イソフルランを吸入）、雄および雌のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（６回の注射／動物；３匹の雄および３匹の雌）に皮下（ＳＣ）注射した。具体的には、各ラットに、剃毛した背部にグリッド（幅２平方×高さ３平方）を描き、各グリッドの正方形に単回のＳＣ注射を投与した。さらに、高度に修飾されたホスホグルカゴンの各々の実施例１０で使用したものの約１０倍の有効濃度を、２匹の雄および２匹の雌のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの左鼻孔に麻酔下で（３Ｌ／分Ｏ２流速で３％のイソフルランを吸入）送達した。ＩＮ投与後、動物を垂直位置に最低３０秒保持して、投与溶液が鼻腔を通って流れることを可能にした。ビヒクルを受けた群は、対照としてのみ機能した。

投与の４時間後、ＩＮ処置を受けた動物を麻酔し、１倍ＰＢＳを用いて鼻洗浄を行った。洗浄物を遠心分離し、ペレットを再懸濁し、サイトスピンカラムに適用して、細胞計数および示差分析のために試料を濃縮した。さらに、組織学のために鼻甲介を収集した。

ＳＣ処置を受けた動物を安楽死させ、背部の皮膚を除去し、脂肪およびファシアを取り除き、背部に存在する任意の刺激の評価を可能にした。観察される赤みおよび炎症のレベルに基づいて、０が反応なしであり、３が最大反応である、０～３の範囲の主観的スコアを作成した。組織学のために、皮膚試料も処理した。組織学的および主観的スコア付けは盲検とした。

候補は、重度の組織部位炎症反応（すなわち、３未満のスコア）をもたらさなかった。ＩＮ投与は、ＩＭ送達と比較して望ましくない反応をもたらす可能性がより高い。しかしながら、重度の組織部位炎症反応を誘発しなかった候補は、１）それが、インビボで天然グルカゴンへと急速に脱リン酸化されたこと、２）修飾ホスホグルカゴンが、天然グルカゴンと同様の安全性プロファイルをもたらす僅かな修飾を有していること、および３）製剤が、徐放または複数回投与のために設計されていないことから、そうではない可能性が高い。

実施例１２
抗薬物抗体および免疫原性試験
各経路について実施例１０で同定された上位の修飾ホスホグルカゴンをまた、免疫原性に関して評価し、すなわち、薬物活性を妨げ得る抗体の産生を評価した。実施例１１の急性毒性の組織学的決定からの血漿試料を将来の分析のために保持した。炎症の組織学的徴候が同定された場合、プロテインＡ／Ｇを使用して、対応する血漿試料から免疫グロブリンを濃縮した。濃縮したら、グルカゴン検出抗体を添加し、サンドイッチＥＬＩＳＡを提供した。陽性シグナルは、修飾ホスホグルカゴンの投与から生じる天然グルカゴンに対する抗薬物抗体および中和抗体の存在を示唆する。検出抗体の前に添加される既知濃度の抗グルカゴン抗体は、陽性対照およびアッセイ検証として機能し、ノイズレベルの３倍のシグナルを使用して、定量化の下限を決定した。

Claims (26)

1. ２７位のアミノ酸が、耐酸化性メチオニン模擬アナログ（ｍｅｍｅｔｉｃ ａｎａｌｏｇ）またはその異性体で置換されるように修飾された、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド。
2. 前記メチオニン模擬アナログが、ノルロイシンもしくはその異性体、またはメトキシニンもしくはその異性体を含む、請求項１に記載のペプチド。
3. 配列番号２を含み、Ｘが、ノルロイシンもしくはその異性体、またはメトキシニンもしくはその異性体を含む、請求項２に記載のペプチド。
4. １つ以上のリン酸化アミノ酸をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
5. 前記１つ以上のリン酸化アミノ酸が、Ｈｉｓ^１、Ｓｅｒ^２、Ｔｈｒ^５、Ｔｈｒ^７、Ｓｅｒ^８、Ｔｙｒ^１０、Ｓｅｒ^１１、Ｔｙｒ^１３、Ｓｅｒ^１６、Ｔｈｒ^２９、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載のペプチド。
6. 修飾ペプチドまたはその薬学的に許容される塩であって、前記修飾ペプチドが、（ａ）２７位のアミノ酸が、耐酸化性メチオニン模擬アナログまたはその異性体で置換されるように修飾されるか、（ｂ）前記修飾ペプチドのアミノ酸のうちの１つ以上がリン酸化されるように修飾されるか、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方であるように修飾された、配列番号１のアミノ酸配列を含む、修飾ペプチドまたはその薬学的に許容される塩と、
   薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
7. 前記修飾ペプチドが、１つ以上のリン酸化アミノ酸を含み、前記医薬組成物が、抗酸化剤をさらに含む、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 前記１つ以上のリン酸化アミノ酸が、Ｈｉｓ^１、Ｓｅｒ^２、Ｔｈｒ^５、Ｔｈｒ^７、Ｓｅｒ^８、Ｔｙｒ^１０、Ｓｅｒ^１１、Ｔｙｒ^１３、Ｓｅｒ^１６、Ｔｈｒ^２９、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
9. 前記組成物が、プロドラッグである、請求項７に記載の医薬組成物。
10. 各リン酸基が、前記プロドラッグの投与時に化学的または酵素的に切断される、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記抗酸化剤が、アスコルビン酸、システイン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、メチオニン、および前述の抗酸化剤のいずれかの異性体からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
12. 前記医薬組成物が、１～５ｍＭのＥＤＴＡが中に懸濁されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．５ｍＭ～５０ｍＭのＬ－メチオニンが中に懸濁されたＰＢＳ、１～５ｍＭのＥＤＴＡが中に懸濁されたヒスチジン緩衝液、または０．５ｍＭ～５０ｍＭのＬ－メチオニンが中に懸濁されたヒスチジン緩衝液を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 実質的に中性のｐＨの水溶液を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
14. １ｍｇ／ｍＬ以上～５０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の前記修飾ペプチドを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
15. 状態を治療する方法であって、
    前記状態を治療するのに有効な量の修飾グルカゴンを含む安定な製剤を対象に投与することによって、状態またはその合併症を治療することを含み、
    前記グルカゴンが、（ａ）２７位のアミノ酸が、耐酸化性メチオニン模擬アナログまたはその異性体で置換されるように修飾されているか、（ｂ）前記グルカゴンの１つ以上のアミノ酸がリン酸化されるように修飾されているか、（ｃ）または（ａ）および（ｂ）の両方であるように修飾されている、方法。
16. 前記修飾グルカゴンが、配列番号２を含み、Ｘが、ノルロイシンもしくはその異性体、またはメトキシニンもしくはその異性体である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記安定な製剤が、アスコルビン酸、システイン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、メチオニン、または前述のもののいずれかの異性体からなる群から選択される１つ以上の抗酸化剤をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
18. 前記安定な製剤が、１～５ｍＭのＥＤＴＡが中に懸濁されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．５ｍＭ～５０ｍＭのＬ－メチオニンが中に懸濁されたＰＢＳ、１～５ｍＭのＥＤＴＡが中に懸濁されたヒスチジン緩衝液、または０．５ｍＭ～５０ｍＭのＬ－メチオニンが中に懸濁されたヒスチジン緩衝液を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記修飾グルカゴンのアミノ酸のうちの少なくとも１つ以上が、リン酸化され、前記１つ以上のリン酸化アミノ酸が、Ｈｉｓ^１、Ｓｅｒ^２、Ｔｈｒ^５、Ｔｈｒ^７、Ｓｅｒ^８、Ｔｙｒ^１０、Ｓｅｒ^１１、Ｔｙｒ^１３、Ｓｅｒ^１６、Ｔｈｒ^２９、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
20. 前記対象にインスリンを投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
21. 前記修飾グルカゴンの安定な製剤およびインスリンが、前記対象の血糖値をモニタリングし、必要に応じて２つの薬物を独立して投与するデバイスにより、異なる時間に投与される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記状態が、糖尿病状態または胃腸運動を含む、請求項１５に記載の方法。
23. 状態を治療するためのキットであって、
    請求項６に記載の医薬組成物の安定な製剤を含み、前記安定な製剤が、実質的に中性のｐＨの水溶液である、キット。
24. バイアル、カートリッジ、自動注射デバイス、ポンプ、または経鼻スプレーデバイスをさらに含む、請求項２３に記載のキット。
25. シリンジをさらに含み、前記シリンジが、前記安定な製剤で予め充填されており、前記安定な製剤が、抗酸化剤をさらに含む、請求項２３に記載のキット。
26. 前記安定な製剤が、治療有効量の前記修飾ペプチドを含む、請求項２３に記載のキット。

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