JP2022521766A - 次世代シーケンシングのための組成物および方法 - Google Patents

次世代シーケンシングのための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【解決手段】本明細書には、ユニバーサル・ポリヌクレオチド・アダプタを使用する次世代シーケンシングのための組成物と方法が提供される。さらに、ロックド核酸または架橋核酸を使用するユニバーサルアダプタが提供される。また、ユニバーサルアダプタの伸長のために長さを短くしたバーコード化プライマーが提供される。さらに本明細書にはユニバーサルアダプタブロッカーが提供される。【選択図】図１Ａ

Description

相互参照
本出願は、２０１９年２月２５日出願の米国仮特許出願第６２／８１０，３２１号、２０１９年１０月１４日出願の米国仮特許出願第６２／９１４，９０４号、および２０１９年１０月２５日出願の米国仮特許出願第６２／９２６，３３６号に基づく利益を主張するものであり、これら出願はすべてその全体を参照することで本明細書に引用される。
高忠実度かつ低コストでの非常に効率的な化学的遺伝子合成には、バイオテクノロジー、医療、および基礎的な生物学的研究において中心的な役割がある。デノボ遺伝子合成は、基礎的な生物学的研究およびバイオテクノロジー用途に対して強力なツールである。小規模での比較的短いフラグメントの合成の様々な方法が知られているが、これらの技法には、スケーラビリティ、自動化、速度、精度、およびコストの点でしばしば問題がある。
参照による引用
本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により引用されるように具体的かつ個々に指示されるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に引用される。
本明細書には、次世代シーケンシングのための組成物と方法が提供される。
本明細書にはポリヌクレオチドが提供され、該ポリヌクレオチドは、第１の末端アダプター領域、第１の非相補的領域、および第１のヨーク領域（ｙｏｋｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含む第１の鎖と、第２の末端アダプター領域、第２の非相補的領域、および第２のヨーク領域を含む第２の鎖とを含み、前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域は相補的であり、前記第１の非相補的領域と前記第２の非相補的領域は相補的ではなく、前記第１のヨーク領域または前記第２のヨーク領域は少なくとも１つの核酸塩基アナログを含む。本明細書ではさらに、前記核酸塩基アナログが、前記第１ヨーク領域を前記第２のヨーク領域に結合するＴｍを増加させる、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記核酸塩基アナログがロックド核酸（ＬＮＡ）または架橋核酸（ＢＮＡ）である、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、相補的な前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域が、長さ１５未満の塩基である、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、相補的な前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域が、長さ１０未満の塩基である、ポリヌクレオチドが提供される。相補的な前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域が、長さ６未満の塩基である、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記アダプターがバーコードまたはインデックス配列を含まない、ポリヌクレオチドが提供される。
本明細書にはポリヌクレオチドが提供され、該ポリヌクレオチドは、二重試料核酸（ｄｕｐｌｅｘ ｓａｍｐｌｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）と、前記二重試料核酸の５’末端にライゲートされる第１のポリヌクレオチドと、前記二重試料核酸の３’末端にライゲートされる第２のポリヌクレオチドとを含み、前記第１のポリヌクレオチドまたは前記第２のポリヌクレオチドは、第１の末端アダプター領域、第１の非相補的領域、および第１のヨーク領域を含む第１の鎖と、第２の末端アダプター領域、第２の非相補的領域、および第２のヨーク領域を含む第２の鎖とを含み、前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域は相補的であり、前記第１の非相補的領域と前記第２の非相補的領域は相補的ではなく、前記第１のヨーク領域または前記第２のヨーク領域は少なくとも１つの核酸塩基アナログを含む。本明細書ではさらに、前記二重試料核酸がＤＮＡである、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記二重試料核酸がゲノムＤＮＡである、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記ゲノムＤＮＡがヒト由来のものである、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記第１ポリヌクレオチドまたは前記第２のポリヌクレオチドが少なくとも１つのバーコードを含む、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのバーコードが、少なくとも長さ８の塩基である、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのバーコードが、少なくとも長さ１２の塩基である、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのバーコードが、少なくとも長さ１６の塩基である、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのバーコードが、少なくとも長さ８～１２の塩基である、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記第１のポリヌクレオチドが第１のバーコードと第２のバーコードを含み、前記第２のポリヌクレオチドが第３のバーコードと第４のバーコードを含む、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記第１のバーコードと前記第３のバーコードが同じポリヌクレオチドを有し、前記第２のバーコードと前記第４のバーコードが同じ配列を有する、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、ポリヌクレオチドの各バーコードが固有の配列を含む、ポリヌクレオチドが提供される。
本明細書には、試料核酸を標識する方法が提供され、該方法は、（１）アダプターでライゲートされた試料核酸を生成するために少なくとも１つのポリヌクレオチドを少なくとも１つの試料核酸にライゲートする工程であって、前記ポリヌクレオチドは、第１のプライマー結合領域、第１の非相補的領域、および第１のヨーク領域を含む第１の鎖と、第２のプライマー結合領域、第２の非相補的領域、および第２のヨーク領域を含む第２の鎖とを含み、前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域は相補的であり、前記第１の非相補的領域と前記第２の非相補的領域は相補的でない、工程と、（２）少なくとも１つのアダプターでライゲートされた試料核酸を第１のプライマーおよびポリメラーゼと接触させる工程であって、前記第１のプライマーは、第３のプライマー結合部位と、第４のプライマー結合部位と、少なくとも１つのバーコードとを含み、前記第３のプライマー結合部位は、少なくとも１つのポリヌクレオチドアダプターの長さ未満に対して相補的であり、前記第１のプライマー結合部位に相補的である、工程と、（３）少なくとも１つのアダプターでライゲートされた増幅試料核酸を生成するために前記ポリヌクレオチドを伸長させる工程であって、前記アダプターでライゲートされた増幅試料核酸は少なくとも１つのバーコードを含む、工程とを含む。本明細書ではさらに、前記プライマーが長さ３０未満の塩基である、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記プライマーが長さ２０未満の塩基である、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記ポリヌクレオチドがバーコードを含まない、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記プライマーが１つのバーコードを含む、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのバーコードがインデックス配列を含む、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのバーコードが、少なくとも長さ８の塩基である、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのバーコードが、少なくとも長さ１２の塩基である、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのバーコードが、少なくとも長さ１６の塩基である、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのバーコードが、少なくとも長さ８～１２の塩基である、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、前記インデックス配列が、同じソース由来の試料核酸のライブラリによくみられるものである、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのバーコードが固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、方法が提供される。本明細書ではさらに、２つのポリヌクレオチドが核酸をサンプリングするためにライゲートされる、方法が提供される。本明細書ではさらに、第１ポリヌクレオチドが前記試料核酸の５’末端に、前記第２のポリヌクレオチドが前記試料核酸の３’末端にライゲートされる、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記方法が、（４）少なくとも１つのアダプターでライゲートされた試料核酸を第２のプライマーおよびポリメラーゼと接触させる工程であって、前記第２のプライマーは、第５のプライマー結合部位と、第６のプライマー結合部位と、少なくとも１つのバーコードとを含み、前記第６のプライマー結合部位は、少なくとも１つのポリヌクレオチドの長さ未満に対して相補的であり、前記第２のプライマー結合部位に相補的である、工程と、（５）少なくとも１つのアダプターでライゲートされた増幅試料核酸を生成するために前記ポリヌクレオチドを伸長させる工程であって、前記アダプターでライゲートされた増幅試料核酸は少なくとも１つのバーコードを含む、工程とをさらに含む、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記アダプターでライゲートされた試料核酸を配列決定する工程をさらに含む、方法が提供される。
本明細書に組成物が提供され、該組成物は、アダプターでライゲートされた試料核酸の１つ以上の領域に結合するよう構成される少なくとも３つのポリヌクレオチドブロッカーであって、前記アダプターでライゲートされた試料核酸は、第１の非相補的領域、第１のインデックス領域、第２の非相補的領域、第１のヨーク領域、第３の非相補的領域、第２のインデックス領域、第４の非相補的領域、および第２のヨーク領域を含み、前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域は相補的であり、前記第１の非相補的領域と前記第２の非相補的領域は相補的でない、ポリヌクレオチドブロッカーと、前記第１のヨーク領域および前記第２のヨーク領域に隣接するゲノムインサートとを含み、少なくとも１つのポリヌクレオチドブロッカーは、前記第１のヨーク領域または前記第２のヨーク領域に相補的ではなく、かつ、前記ポリヌクレオチドブロッカーと前記アダプターでライゲートされた試料核酸との結合を増大させるように構成される少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む。本明細書ではさらに、少なくとも２つのポリヌクレオチドブロッカーが、前記第１のヨーク領域または前記第２のヨーク領域に相補的ではなく、かつ、それぞれ、前記ポリヌクレオチドブロッカーと前記アダプターでライゲートされた試料核酸との結合を増大させるように構成される少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む、組成物が提供される。本明細書ではさらに、少なくとも１つのインデックス領域がバーコードまたは固有の分子識別子を含む、組成物が提供される。本明細書ではさらに、少なくとも１つのインデックス領域が長さ５～１５の塩基である、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記ポリヌクレオチドブロッカーの少なくとも１つが少なくとも１つのユニバーサル塩基を含む、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのユニバーサル塩基が５－ニトロインドールまたは２－デオキシイノシンである、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも１つのユニバーサル塩基が、少なくとも１つのインデックス配列と重なるように構成される、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記少なくとも２つのユニバーサル塩基が、少なくとも２つのインデックス配列と重なるように構成される、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記ポリヌクレオチドブロッカーの少なくとも２つが少なくとも１つのユニバーサル塩基を含み、前記少なくとも１つのユニバーサル塩基はそれぞれ、少なくとも１つのインデックス配列と重なる、組成物が提供される。本明細書ではさらに、重なりが長さ２～１０の塩基である、組成物が提供される。本明細書ではさらに、４つ以下のポリヌクレオチドブロッカーを含む、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記ポリヌクレオチドブロッカーが１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）または１つ以上の架橋核酸（ＢＮＡ）を含む、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記ポリヌクレオチドブロッカーが少なくとも５つのヌクレオチドアナログを含む、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記ポリヌクレオチドブロッカーが少なくとも１０のヌクレオチドアナログを含む、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記ポリヌクレオチドブロッカーのＴｍが少なくとも７８℃である、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記ポリヌクレオチドブロッカーのＴｍが少なくとも８０℃である、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記ポリヌクレオチドブロッカーのＴｍが少なくとも８２℃である、組成物が提供される。本明細書ではさらに、前記ポリヌクレオチドブロッカーのＴｍが８０～９０℃である、組成物が提供される。
本明細書には核酸ハイブリダイゼーションのための方法が提供され、該方法は、複数のゲノムインサートを含む、アダプターでライゲートされた試料核酸ライブラリを提供する工程と、前記アダプターでライゲートされた試料核酸ライブラリを、本明細書で提供される組成物の存在下で少なくとも５０００のポリヌクレオチドプローブを含むプローブライブラリと接触させる工程と、プローブの少なくとも一部を前記ゲノムインサートにハイブリダイズする工程とを含む。前記試料核酸ライブラリが少なくとも１００万の固有ゲノムインサートを含む、請求項５４に記載の方法。本明細書ではさらに、前記ゲノムインサートの少なくとも一部がヒトＤＮＡを含む、方法が提供される。本明細書ではさらに、濃縮された試料核酸ライブラリを生成する工程をさらに含む、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記濃縮された試料核酸ライブラリを配列決定する工程をさらに含む、方法が提供される。本明細書ではさらに、前記試料核酸ライブラリが、次世代シーケンシングのために構成されるアダプターを含む、方法が提供される。
ユニバーサルアダプターまたは「太くて短い（ｓｔｕｂｂｙ）」アダプターを表す。 試料核酸の末端にライゲートされる２つのユニバーサルアダプターを表す。 ユニバーサルアダプターを伸長させるのに使用されるバーコード化プライマーを表す。 試料ポリヌクレオチドの末端にライゲートされる２つのユニバーサルアダプター（伸長／バーコード追加後）を表す。 バーコード化され、アダプターでライゲートされた試料ポリヌクレオチドを生成するためにユニバーサルアダプターに結合する、バーコード化プライマーを表す。 バーコード化され、アダプターでライゲートされた試料ポリヌクレオチドを生成するためにユニバーサルアダプターに結合する、バーコード化プライマーを表す。 シーケンシング前にバーコード化アダプターをライゲートし、かつプローブライブラリにより試料ポリヌクレオチドを濃縮するための概略図を表す。 シーケンシング前にユニバーサルアダプターをライゲートし、該アダプターにバーコードを付し、プローブライブラリにより試料ポリヌクレオチドを濃縮するための概略図を表す。 標準のバーコード化Ｙアダプターまたはユニバーサルアダプターに対する、アダプターでライゲートされた試料ポリヌクレオチドの濃度を表す。 全ゲノムシーケンシング中の標準のバーコード化ＹアダプターまたはユニバーサルアダプターのＡＴドロップアウト率（ＡＴ ｄｒｏｐｏｕｔ ｒａｔｅｓ）を表す。 様々な試料インデックス番号に対し特定されるリード数を表す。前記試料指数はユニバーサルアダプターに追加される。 バーコードを伴う従来のＹアダプター、ユニバーサルアダプター（ＰＣＲにより追加されるバーコードを伴う）、ＵＭＩを伴う従来のＹアダプター、およびＵＭＩを伴うユニバーサルアダプターを使用して生成されるライブラリに対する、ＨＳライブラリのサイズを表す。 バーコードを伴う従来のＹアダプター、ユニバーサルアダプター（ＰＣＲにより追加されるバーコードを伴う）、ＵＭＩを伴う従来のＹアダプター、およびＵＭＩを伴うユニバーサルアダプターを使用して生成されるライブラリに対する、３０倍のリード深さでの標的塩基の割合を表す。 プローブによる試料ポリヌクレオチドのキャプチャーと濃縮を表す。 クラスター増幅からのポリヌクレオチドライブラリ生成の概略図を表す。 標的化と濃縮を行うための一対のポリヌクレオチドを表す。このポリヌクレオチドは、相補的標的結合（インサート）配列のほか、プライマー結合部位を含む。 標的化と濃縮を行うための一対のポリヌクレオチドを表す。このポリヌクレオチドは、相補的標的結合（インサート）配列、プライマー結合部位、および非標的配列を含む。 より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を表す。この標的配列は前記ポリヌクレオチド結合領域よりも短く、前記ポリヌクレオチド結合領域（またはインサート配列）は標的配列に対してオフセットされ、隣接する配列の一部にも結合する。 より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を表す。この標的配列の長さは前記ポリヌクレオチド結合領域以下であり、前記ポリヌクレオチド結合領域は前記標的配列の中心に位置し、隣接する配列の一部にも結合する。 より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を表す。この標的配列は前記ポリヌクレオチド結合領域よりもわずかに長く、前記ポリヌクレオチド結合領域は、両側で緩衝液領域により標的配列の中心に位置する。 より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を表す。この標的配列は前記ポリヌクレオチド結合領域よりも長く、２つのポリヌクレオチドの結合領域は前記標的配列に及ぶように重なっている。 より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を表す。この標的配列は前記ポリヌクレオチド結合領域よりも長く、２つのポリヌクレオチドの結合領域は前記標的配列に及ぶように重なっている。 より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を表す。この標的配列は前記ポリヌクレオチド結合領域よりも長く、２つのポリヌクレオチドの結合領域は前記標的配列に及ぶように重なっておらず、間隙（４０５）が残る。 より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を表す。この標的配列は前記ポリヌクレオチド結合領域よりも長く、３つのポリヌクレオチドの結合領域は前記標的配列に及ぶように重なっている。 本明細書に開示されるような遺伝子合成の典型的なプロセスワークフローを実証する工程の略図を提示する。 コンピュータシステムを示す。 コンピュータシステムの構造を図示するブロック図である。 複数のコンピュータシステム、複数の携帯電話、個人用携帯情報端末、およびネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）を組み込むように構成されるネットワークを実証する図である。 共有仮想アドレスメモリ空間を用いるマルチプロセッサ・コンピュータ・システムのブロック図である。 ２５６個のクラスターを有するプレートの画像である。各クラスターには、座から伸長するポリヌクレオチドを伴う１２１個の座がある。 ２４０個のクラスターの２９，０４０個の固有のポリヌクレオチド合成からの、プレート全体にわたるポリヌクレオチド表現（ポリヌクレオチド頻度対存在量、測定した吸収度として）のプロットである。各クラスターには１２１個のポリヌクレオチドがある。 対照クラスターがボックスにより特定されている、個々のクラスター全体にわたるポリヌクレオチド頻度対存在吸収度（測定した吸収度として）の測定のプロットである。 ４個それぞれのクラスター全体にわたるポリヌクレオチド頻度対存在量（測定した吸収度として）の測定のプロットである。 ２４０個のクラスターの２９，０４０個の固有のポリヌクレオチド合成からの、プレート全体にわたる頻度対エラー率のプロットである。各クラスターには１２１個のポリヌクレオチドがある。 対照クラスターがボックスにより特定されている、個々のクラスター全体にわたるポリヌクレオチドエラー率対頻度の測定のプロットである。 ４個のクラスター全体にわたるポリヌクレオチド頻度対エラー率の測定のプロットである。 ポリヌクレオチド数対ポリヌクレオチド１つ当たりの割合から測定されるＧＣ含有量のプロットである。 シーケンシングライブラリを生成するために、試料の断片化、末端修復、Ａテーリング（Ａ－ｔａｉｌｉｎｇ）、ユニバーサルアダプターのライゲーション、およびＰＣＲ増幅によるアダプターへのバーコード付加の概略図を表す。追加の工程として随意に、濃縮、さらなる増幅、および／またはシーケンシングが挙げられる（図示せず）。 １０サイクルのＰＣＲにより増幅される完全長の標準Ｙアダプター、および８サイクルのＰＣＲにより増幅されるユニバーサルアダプターに対するライゲーション産物の濃度（ｎｇ／ｕＬ）のプロットである。ユニバーサルアダプターにより、少数のＰＣＲサイクルでより高収量のライゲーション産物が得られる。 ライゲーション産物の濃度（蛍光により測定）ｖｓライゲーション産物のサイズ（ｂｐ）のプロットを示す。両グラフの矢印は、ゲノムポリヌクレオチドインサートを含まないアダプター二量体に相当するピークを示す。ユニバーサルアダプター（右のグラフ）により、完全長の標準Ｙアダプター（左のグラフ）より少数のアダプター二量体が得られる。 １０ｂｐの二重インデックス配列または８ｂｐの二重インデックス配列（９６－ｐｌｅｘ）を含むユニバーサルプライマーによる最終増幅に関する、未調整の相対的シーケンシングパフォーマンスに対する数のプロットである。相対的シーケンシングパフォーマンスは、各デザインでの完全なインデックスリードの合計数を標準化することで算出した。１０ｂｐの二重インデックスプライマーは、より厳格な相対的パフォーマンス、およびより均一なシーケンシング表現を示した。 １０ｂｐの二重インデックス配列または８ｂｐの二重インデックス配列（９６－ｐｌｅｘ）を含むユニバーサルプライマーによる最終増幅に関する、平均の中心的相対的シーケンシングパフォーマンスに対する数のプロットである。相対的シーケンシングパフォーマンスは、各デザインでの完全なインデックスリードの合計数を標準化し、最上部のパフォーマーに対して標準化することで算出した。結果、各集団の分布は、直接の比較のためにそれらの算出平均に集中した。１０ｂｐの二重インデックスプライマーは、より厳格な相対的パフォーマンス、およびより均一なシーケンシング表現を示した。 １０ｂｐの二重インデックス配列または８ｂｐの二重インデックス配列（９６－ｐｌｅｘ）を含むユニバーサルプライマーによる最終増幅に関する、相対的バーコードパフォーマンス対各バーコード配列のプロットである。 ユニバーサルアダプターから生成され、かつ単一プールとして配列決定される、一組の１，１５２のＵＤＩプライマーペアの初期スクリーニングのプロットである。 ユニバーサルアダプターから生成され、かつ単一プールとして配列決定される、一組の３８４のＵＤＩプライマーペアのプロットである。 ユニバーサルアダプターから生成され、かつ独立して配列決定される、９６のＵＤＩプライマーペアの個々のプールのプロットである。 ユニバーサルアダプターから生成され、かつ独立して配列決定される、９６のＵＤＩプライマーペアの個々のプールのプロットである。 ユニバーサルアダプターから生成され、かつ独立して配列決定される、９６のＵＤＩプライマーペアの個々のプールのプロットである。 ユニバーサルアダプターから生成され、かつ独立して配列決定される、９６のＵＤＩプライマーペアの個々のプールのプロットである。 均一なカバレッジ（上のパネル）と不均一なカバレッジ（下のパネル）のプロットを表す。 様々な対照薬パネル（対照薬Ａ１、対照薬Ａ２、および対照薬Ｄ）およびライブラリ４Ａのｆｏｌｄ ８０ ｂａｓｅ ｐｅｎａｌｔｙのグラフである。 オンターゲット率、ニアターゲット率、およびオフターゲット率の概略図を表す。 様々な対照薬パネル（対照薬Ａ１、対照薬Ａ２、および対照薬Ｄ）およびライブラリ４Ａのオンターゲット率のグラフである。 様々な対照薬パネル（対照薬Ａ１、対照薬Ａ２、および対照薬Ｄ）およびライブラリ４Ａの重複率のグラフを表す。図２８ＥはＨＳライブラリサイズを表す。 様々な対照薬パネル（対照薬Ａ１、対照薬Ａ２、および対照薬Ｄ）およびライブラリ４Ａの重複率のグラフを表す。図２８Ｆは、複製としてマーキングされるリードにあるためフィルタ処理された位置合わせ済み塩基の画分の割合を表す。 様々な対照薬パネル（対照薬Ａ１、対照薬Ａ２、および対照薬Ｄ）およびライブラリ４Ａの深度カバレッジのグラフである。 内容物のカスタムパネルへの添加または濃縮の第１の概略図である。 内容物のカスタムパネルへの添加または濃縮の第２の概略図である。 補足プローブを伴うパネルと伴わないパネルとを比較する、均一性（８０倍）のグラフである。 補足プローブを伴うパネルと伴わないパネルとを比較する、重複率のグラフである。 補足プローブを伴うパネルと伴わないパネルとを比較する、率に対する割合（ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｎ ｒａｔｅ）のグラフである。 補足プローブを伴うパネルと伴わないパネルとを比較する、標的カバレッジの割合のグラフである。 補足プローブを伴うパネルと伴わないパネル、および対照薬濃縮キットを比較する、８０－ｆｏｌｄ ｂａｓｅ ｐｅｎａｌｔｙのグラフである。 パネルの調整可能な標的カバレッジのグラフを表す。 ＲｅｆＳｅｑデザインの概略図である。 エクソームパネル単独、またはＲｅｆＳｅｑパネルを加えたエクソームパネルのカバレッジにおける標的塩基の割合としての、深度カバレッジのグラフを表す。図３１Ｂは第１の実験を表す。 エクソームパネル単独、またはＲｅｆＳｅｑパネルを加えたエクソームパネルのカバレッジにおける標的塩基の割合としての、深度カバレッジのグラフを表す。図３１Ｃは第２の実験を表す。 標準エクソームパネルｖｓシングルプレックスと８－ｐｌｅｘ実験両方のＲｅｆＳｅｑパネルと組み合わせたエクソームパネルに関する、様々な濃縮／キャプチャーシーケンシング基準のグラフを表す。図３１Ｄは、エクソームパネル単独、またはＲｅｆＳｅｑパネルを加えたエクソームパネルに関する、オフターゲット割合としての特異性のグラフを示す。 標準エクソームパネルｖｓシングルプレックスと８－ｐｌｅｘ実験両方のＲｅｆＳｅｑパネルと組み合わせたエクソームパネルに関する、様々な濃縮／キャプチャーシーケンシング基準のグラフを表す。図３１Ｅは、エクソームパネル単独、またはＲｅｆＳｅｑパネルを加えたエクソームパネルに関する、均一性のグラフを示す。 標準エクソームパネルｖｓシングルプレックスと８－ｐｌｅｘ実験両方のＲｅｆＳｅｑパネルと組み合わせたエクソームパネルに関する、様々な濃縮／キャプチャーシーケンシング基準のグラフを表す。図３１Ｆは、エクソームパネル単独、またはＲｅｆＳｅｑパネルを加えたエクソームパネルに関する、ライブラリサイズのグラフを示す。 標準エクソームパネルｖｓシングルプレックスと８－ｐｌｅｘ実験両方のＲｅｆＳｅｑパネルと組み合わせたエクソームパネルに関する、様々な濃縮／キャプチャーシーケンシング基準のグラフを表す。図３１Ｇは、エクソームパネル単独、またはＲｅｆＳｅｑパネルを加えたエクソームパネルに関する、重複率のグラフを示す。 標準エクソームパネルｖｓシングルプレックスと８－ｐｌｅｘ実験両方のＲｅｆＳｅｑパネルと組み合わせたエクソームパネルに関する、様々な濃縮／キャプチャーシーケンシング基準のグラフを表す。図３１Ｈは、エクソームパネル単独、またはＲｅｆＳｅｑパネルを加えたエクソームパネルに関する、カバレッジ率のグラフを示す。 ３０倍カバレッジを達成する各カスタムパネルにおけるリードの割合のグラフである。 各カスタムパネルに関する３０倍超の標的塩基の画分のグラフである。 各カスタムパネルの均一性（８０倍）のグラフである。 高速濃縮ワークフローの概略図である。 高速ハイブリダイゼーションと洗浄ワークフロー、およびハイブリダイゼーションと洗浄ワークフローを使用した、カバレッジでの標的塩基の割合としてのパフォーマンスを表す。 ナノボールシーケンシングを使用した、標的上の塩基の割合のグラフである。 ナノボールシーケンシングを使用した均一性のグラフである。 ナノボールシーケンシングを使用した重複率のグラフである。 ３０倍以上のカバレッジでの標的塩基のグラフである。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３５Ａ－３５Ｅの説明文を図３５Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３５Ａは、単一分子を伴う（「Ｊ」と「Ｌ」）インデックスの内部にあるすべてのアダプター領域に結合する一組のブロッカー（「Ｄ」、「Ｊ」、「Ｌ」、および「Ｅ」）の結合構成を表す。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３５Ａ－３５Ｅの説明文を図３５Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３５Ｂは、複数のブロッカーを伴うインデックスの内部にあるアダプター領域に結合する、一組のブロッカー（「Ｄ」、「Ｍ」、「Ｎ」、「Ｑ」、および「Ｅ」）の結合構成を表す。アダプターのＹステムアニーリング部分は単一のブロッカーメンバー「Ｎ」と結合することに留意されたい。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３５Ａ－３５Ｅの説明文を図３５Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３５Ｃは、複数のブロッカーを伴うインデックスの内部にあるアダプター領域に結合する、一組のブロッカー（「Ｄ」、「Ｍ」、「Ｐ」、「Ｑ」、および「Ｅ」）の代替的な結合構成を表す。アダプターのＹステムアニーリング部分は単一のブロッカーメンバー「Ｐ」と結合することに留意されたい。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３５Ａ－３５Ｅの説明文を図３５Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３５Ｄは、複数のブロッカーを伴うインデックスの内部にあるアダプター領域に結合する、一組のブロッカー（「Ｒ」、「Ｎ」、および「Ｓ）の結合構成を表す。この場合、外部アダプター配列とインデックスすなわちアダプターインデックスとの結合、および内部アダプター配列とインデックスとの結合は、両側で１つの固有の分子と相互に作用する。アダプターのＹステムアニーリング部分は単一のブロッカーメンバー「Ｎ」と結合することに留意されたい。単一のアダプターインデックス長さのみが、このような結合構成によりアドレス可能であることに留意されたい。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３５Ａ－３５Ｅの説明文を図３５Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３５Ｅは、複数のブロッカーを伴うインデックスの内部のアダプター領域に結合する、一組のブロッカーの代替的な結合構成を表す。この場合、外部アダプター配列とインデックスすなわちアダプターインデックスとの結合、および内部アダプター配列とインデックスとの結合は、両側で１つの固有の分子と相互に作用する。アダプターのＹステムアニーリング部分は単一のブロッカーメンバー「Ｐ」と結合することに留意されたい。単一のアダプターインデックス長さのみが、このような結合構成によりアドレス可能であることに留意されたい。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３６Ａ－３６Ｄの説明文を図３６Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３６Ａは、所望の構成で結合するブロッカーすべてを表す。これは、標的濃縮のワークフローの最適なパフォーマンスを生じさせる所望の集団である。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３６Ａ－３６Ｄの説明文を図３６Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３６Ｂは、所望の構成で結合する外部ブロッカーを表す。これは望ましくない集団である。内部ブロッカーは、望まれない他の分子上にアダプター配列を含む他の分子を動員することができる未結合領域に、望ましくない構成で結合する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３６Ａ－３６Ｄの説明文を図３６Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３６Ｃは、溶液中で互いに結合するブロッカーを表す。これは望ましくない集団である。ブロッカーは互いに結合するが、これらの指定のアダプター領域に結合することはできない。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３６Ａ－３６Ｄの説明文を図３６Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３６Ｄは、溶液中で遊離するブロッカーを表す。これは、標的濃縮ワークフローのパフォーマンスに対する効果が最小である中性集団である。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３７Ａ－３７Ｇの説明文を図３７Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３７Ａは、（１）二重インデックスアダプターに対してデザインされる一組のブロッカーを表し、その場合、（２）全ブロッカーは一本鎖に結合し、（３）外部領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長せず、（４）内部アダプター領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長しない。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３７Ａ－３７Ｇの説明文を図３７Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３７Ｂは、（１）二重インデックスアダプターに対してデザインされる一組のブロッカーを表し、その場合、（２）全ブロッカーは一本鎖に結合し、（３）外部領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長し、（４）内部アダプター領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長しない。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３７Ａ－３７Ｇの説明文を図３７Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３７Ｃは、（１）二重インデックスアダプターに対してデザインされる一組のブロッカーを表し、その場合、（２）全ブロッカーは一本鎖に結合し、（３）外部領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長せず、（４）内部アダプター領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３７Ａ－３７Ｇの説明文を図３７Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３７Ｄは、（１）二重インデックスアダプターに対してデザインされる一組のブロッカーを表し、その場合、（２）全ブロッカーは一本鎖に結合し、（３）外部領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長し、（４）内部アダプター領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３７Ａ－３７Ｇの説明文を図３７Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３７Ｅは、（１）二重インデックスアダプターに対してデザインされる一組のブロッカーを表し、その場合、（２）ブロッカーは両方の鎖に結合し、（３）外部領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長し、（４）内部アダプター領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３７Ａ－３７Ｇの説明文を図３７Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３７Ｆは、（１）単一インデックスアダプターに対してデザインされる一組のブロッカーを表し、その場合、（２）全ブロッカーは一本鎖に結合し、（３）外部領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックス（存在する場合）をカバーするように伸長し、（４）内部アダプター領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックス（存在する場合）をカバーするように伸長する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３７Ａ－３７Ｇの説明文を図３７Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図３７Ｇは、（１）二重インデックスアダプターに対してデザインされる一組のブロッカーを表し、その場合、（２）全ブロッカーは一本鎖に結合し、（３）外部領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長し、（４）内部アダプター領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーはアダプターインデックスをカバーするように伸長し、（５）内部アダプター領域をインデックスに結合するようデザインされるブロッカーは、固有の分子識別子（または、定義された、もしくは未定義の他のポリヌクレオチド配列）をカバーするように伸長する。 様々な数のインデックス塩基をカバーする複数組のブロッカーの、オフベイトのパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆｆ ｂａｉｔ）に応じたパフォーマンスのグラフを表す。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３９Ａ－３９Ｃの説明文を図３９Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。ここで、両側から３つのアダプターインデックス塩基をカバーするようデザインされる２つのブロッカーに対する異なる結合モードが、アダプターに対する異なる結合モードで示される。図３９Ａは６ｂｐのアダプターインデックス長さを表し、合計６個のインデックス塩基がオーバーハングにカバーされ、合計０個のインデックス塩基が曝露され、結果曝露されたインデックス塩基の合計割合は０％である。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３９Ａ－３９Ｃの説明文を図３９Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。ここで、両側から３つのアダプターインデックス塩基をカバーするようデザインされる２つのブロッカーに対する異なる結合モードが、アダプターに対する異なる結合モードで示される。図３９Ｂは８ｂｐのアダプターインデックス長さを表し、合計６個のインデックス塩基がオーバーハングにカバーされ、合計２個のインデックス塩基が曝露され、結果曝露されたインデックス塩基の合計割合は２５％である。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図３９Ａ－３９Ｃの説明文を図３９Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。ここで、両側から３つのアダプターインデックス塩基をカバーするようデザインされる２つのブロッカーに対する異なる結合モードが、アダプターに対する異なる結合モードで示される。図３９Ｃは１０ｂｐのアダプターインデックス長さを表し、合計６個のインデックス塩基がオーバーハングにカバーされ、合計４個のインデックス塩基が曝露され、結果曝露されたインデックス塩基の合計割合は４０％である。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ａは、（１）二重インデックスシステムのためのブロッカーを表し、該二重インデックスシステムは（２）一本鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部への結合に対し修飾はなく、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ｂは、（１）二重インデックスシステムのためのブロッカーを表し、該二重インデックスシステムは（２）両方の鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部への結合に対し修飾はなく、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ｃは、（１）単一のインデックスシステムのためのブロッカーを表し、該単一のインデックスシステムは（２）一本鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部への結合に対し修飾はなく、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ｄは、（１）二重インデックスシステムのためのブロッカーを表し、該二重インデックスシステムは（２）一本鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部への結合に対し修飾はなく、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在し、（５）固有の分子識別子をカバーするように伸長が存在する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ｅは、（１）二重インデックスシステムのためのブロッカーを表し、該二重インデックスシステムは（２）一本鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部への結合親和性を低減するために修飾が行われ、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ｆは、（１）二重インデックスシステムのためのブロッカーを表し、該二重インデックスシステムは（２）両方の鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部への結合親和性を低減するために修飾が行われ、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ｇは、（１）単一のインデックスシステムのためのブロッカーを表し、該単一のインデックスシステムは（２）一本鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部への結合親和性を低減するために修飾が行われ、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ｈは、（１）二重インデックスシステムのためのブロッカーを表し、該二重インデックスシステムは（２）一本鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部への結合親和性を低減するために修飾が行われ、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在し、（５）固有の分子識別子をカバーするように伸長が存在する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ｉは、（１）二重インデックスシステムのためのブロッカーを表し、該二重インデックスシステムは（２）一本鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部に結合する単一の員が存在し、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ｊは、（１）二重インデックスシステムのためのブロッカーを表し、該二重インデックスシステムは（２）両方の鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部に結合する単一の員が存在し、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ｋは、（１）単一のインデックスシステムのためのブロッカーを表し、該単一のインデックスシステムは（２）一本鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部に結合する単一の員が存在し、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在する。 ポリメラーゼ連鎖増幅後の次世代シーケンシングライブラリの１分子の一本鎖を太い棒で表すものであり、「上」と「下」の鎖の５’と３’の末端には方向を示すラベルが付けられている。図４０Ａ－４０Ｌの説明文を図４０Ａに表す。様々な化学修飾および／またはデザイン特徴を伴うブロッカーは細いブロッカーで表される。５’末端と３’末端には方向を示すラベルがつけられ、これらが結合するように設計されるアダプター領域の最も近くに位置決めされる。図４０Ｌは、（１）二重インデックスシステムのためのブロッカーを表し、該二重インデックスシステムは（２）一本鎖に結合するようデザインされ、（３）アダプターのＹステムアニーリング部に結合する単一の員が存在し、（４）アダプターインデックスをカバーするように伸長が存在し、（５）固有の分子識別子をカバーするように伸長が存在する。 非メチル化試料（上部）とメチル化試料（下部）のワークフローを表す。 標準のメチル化パネルの３つの異なるサイズに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４２Ａは、３０倍カバレッジでの塩基のパーセントのグラフを表す。 標準のメチル化パネルの３つの異なるサイズに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４２Ｂは、ｆｏｌｄ－８０ ｂａｓｅ ｐｅｎａｌｔｙのグラフを表す。 標準のメチル化パネルの３つの異なるサイズに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４２Ｃは、オフベイトのパーセントのグラフを表す。 標準のメチル化パネルの３つの異なるサイズに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４２Ｄは、重複率のグラフを表す。 ストリンジェンシーが高い、中程度、または低い、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４３Ａは、３０倍カバレッジでの塩基のパーセントのグラフを表す。 ストリンジェンシーが高い、中程度、または低い、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４３Ｂは、ｆｏｌｄ－８０ ｂａｓｅ ｐｅｎａｌｔｙのグラフを表す。 ストリンジェンシーが高い、中程度、または低い、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４３Ｃは、オフベイトのパーセントのグラフを表す。 ストリンジェンシーが高い、中程度、または低い、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４３Ｄは、重複率のグラフを表す。 ０、２５、５０、７５、および１００％のメチル化の最終比率に配合される、低メチル化および過剰メチル化細胞株から生成されるｇＤＮＡライブラリから標的をキャプチャーするために厳密に使用される媒体の、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４４Ａは、３０倍カバレッジでの塩基のパーセントのグラフを表す。 ０、２５、５０、７５、および１００％のメチル化の最終比率に配合される、低メチル化および過剰メチル化細胞株から生成されるｇＤＮＡライブラリから標的をキャプチャーするために厳密に使用される媒体の、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４４Ｂは、ｆｏｌｄ－８０ ｂａｓｅ ｐｅｎａｌｔｙのグラフを表す。 ０、２５、５０、７５、および１００％のメチル化の最終比率に配合される、低メチル化および過剰メチル化細胞株から生成されるｇＤＮＡライブラリから標的をキャプチャーするために厳密に使用される媒体の、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４４Ｃは、オフベイトのパーセントのグラフを表す。 ０、２５、５０、７５、および１００％のメチル化の最終比率に配合される、低メチル化および過剰メチル化細胞株から生成されるｇＤＮＡライブラリから標的をキャプチャーするために厳密に使用される媒体の、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４４Ｄは、重複率のグラフを表す。 臨床的に関連するサイクリンＤ２座における標的と個々ＣｐＧ部位に沿った様々なＤＮＡメチル化レベルの検出を表す。この座は、特定の癌（例えば乳癌）のメチル化状態を変化させると知られている。図４５Ａは、４，２６８ｋｂ～４，２７６ｋｂのゲノム座でのメチル化を表す。 臨床的に関連するサイクリンＤ２座における標的と個々のＣｐＧ部位に沿った様々なＤＮＡメチル化レベルの検出を表す。この座は、特定の癌（例えば乳癌）のメチル化状態を変化させると知られている。図４５Ｂは、４，２７５．２ｋｂ～４，２７６．４ｋｂのゲノム座でのメチル化を表す。 バイサルファイト変換法または酵素変換法を使用して標的をキャプチャーするために厳密に使用される媒体の、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４６Ａは、３０倍カバレッジでの塩基のパーセントのグラフを表す。 バイサルファイト変換法または酵素変換法を使用して標的をキャプチャーするために厳密に使用される媒体の、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４６Ｂは、ｆｏｌｄ－８０ ｂａｓｅ ｐｅｎａｌｔｙのグラフを表す。 バイサルファイト変換法または酵素変換法を使用して標的をキャプチャーするために厳密に使用される媒体の、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４６Ｃは、オフベイトのパーセントのグラフを表す。 バイサルファイト変換法または酵素変換法を使用して標的をキャプチャーするために厳密に使用される媒体の、最適化された１Ｍｂメチル化パネルに関するシーケンシング基準のグラフを表す。図４６Ｄは、重複率のグラフを表す。 変換率のボックスグラフを表す。非ＣｐＧ部位で変換されるシトシンの画分は、バイサルファイト変換法と酵素変換法の両方で９９．５％超であったと測定される。
本明細書には、ポリヌクレオチドアダプターとハイブリダイゼーションブロッカーを含む、次世代シーケンシングのための組成物と方法が記載される。従来のアダプターは、試料のインデックス／起源に関連する情報を含むバーコード領域、または固有の分子識別子を含むことが多い。このようなバーコードは核酸をサンプルするために直接ライゲートされる。しかし場合により、バーコード化アダプターを産生する際に高純度で顕著な合成オーバーヘッドが求められるため、次世代シーケンシング用途におけるパフォーマンスは制限されてしまう。代替的に、バーコードを含まないトランケート型「ユニバーサル」（または太くて短い）アダプターが核酸をサンプリングするためにライゲートされ、バーコードのライブラリはシーケンシング前の後期段階で加えられる。このようなユニバーサルアダプターは、いくつかの例では、安価で製造することができ、従来のバーコード化アダプターよりも高度なライゲーション効率をもたらす。いくつかの例では、ライゲーション効率が高度になることで、増幅のためのＰＣＲ回路は少なくなり、その結果、ＰＣＲにより誘導された増幅誤差が低下する。いくつかの例では、ユニバーサルアダプターに加えられるバーコードライブラリは、より多くのバーコード、または一般的なバーコード化アダプターよりも長いバーコードを含む。加えて、ユニバーサルアダプターは、広範囲の異なるシーケンシングプラットフォームに適合可能である。本明細書では、核酸塩基アナログを含むユニバーサルアダプターが提供される。本明細書ではさらに、前記プライマーのユニバーサルアダプター結合領域の長さがユニバーサルアダプターの長さ未満である、バーコード化プライマーが提供される。本明細書には、濃縮効率基準を増大させるために不要なアダプター間相互作用を防ぐ、ハイブリダイゼーションブロッカーが記載される。本明細書ではさらに、様々なアダプター結合構成を伴うハイブリダイゼーションブロッカーが記載される。本明細書ではさらに、メチル化修飾をゲノムＤＮＡに同定する方法が記載される。
定義
本開示の全体にわたり、数的な特徴が範囲表示形式で提示される。範囲表示形式での記載は利便性と簡潔さのみを目的とするものであり、任意の実施形態の範囲に対する確固たる限定として解釈するべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、前後関係から明らかでない限り、可能な下位範囲すべて、ならびに下限値の単位の１０分の１までその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと考慮する必要がある。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの下位範囲と、その範囲内の個々の数値、例えば１．１、２、２．３、５、５．９を具体的に開示したものと考慮する必要がある。このことは範囲の広さに関係なく適用される。このような介入する範囲の上限と下限は、より小さな範囲内に独立して含まれてもよく、更に、定められた範囲内の任意の具体的に除外された限度に従って本発明内に包含される。定められた範囲が上限と下限の１つ又はその両方を含む場合、このような含まれた上限と下限の何れか又は両方を除く範囲も、文脈が明らかに他に指示しない限り、本発明内に包含される。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみの説明を目的とするものであり、任意の実施形態を制限することを意図していない。本明細書では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、前後関係から明らかでない限り、同様に複数形を含むことを意図している。本明細書では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、明示された特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を特定するが、１以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在あるいは追加を妨げるものではないことが、さらに理解される。本明細書では、用語「および／または」は、関連する列記された項目の１つ以上のあらゆる組み合わせを含む。
別段の定めのない限り、または前後関係から明らかでない限り、本明細書では、数または数の範囲に関連する用語「約」とは、明示された数およびその数の＋／－１０％、または、ある範囲で列記された値に対して列記された下限値の１０％未満および列記された上限値の１０％超を意味する。
本明細書で使用されているように、用語「あらかじめ選択された配列（ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「あらかじめ定められた配列（ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「あらかじめ定められた配列（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、交換可能に使用される。用語は、ポリマー配列がポリマーの合成またはアセンブリの前に知られており、選択されていることを意味する。特に、本発明の様々な態様は、主に、核酸分子の合成またはアセンブリの前に既知であり選択される、核酸分子の調製、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列に関して、本明細書に記載されている。
核酸という用語は、二本鎖または三本鎖の核酸のほか、一本鎖の分子を包含する。二本鎖または三本鎖の核酸では、核酸の鎖は同一の広がりを持つ必要はない（二本鎖核酸は両方の鎖の全長に沿った二本鎖である必要はない）。他に明示されない限り、核酸配列は、提供されたときに５’～３’の方向に列記される。本明細書に記載の方法は、単離された核酸の生成を提供する。本明細書に記載の方法はさらに、単離かつ精製された核酸の生成を提供する。提供される場合、ポリヌクレオチドの長さは塩基の数として記載され、ｎｔ（ヌクレオチド）、ｂｐ（塩基）、ｋｂ（キロベース）、ｍｂ（メガベース）、またはＧｂ（ギガベース）のように省略される。
本明細書には、合成（デノボ合成または化学合成された）ポリヌクレオチドの産生のための方法と組成物が提供される。オリゴ核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴ、およびポリヌクレオチドという用語は、全体にわたり同義であると定められる。本明細書に記載の合成ポリヌクレオチドのライブラリは、１つ以上の遺伝子または遺伝子フラグメントをまとめてコードする複数のポリヌクレオチドを含む場合がある。いくつかの例では、前記ポリヌクレオチドライブラリは、コード配列または非コード配列を含む。いくつかの例では、前記ポリヌクレオチドライブラリは複数のｃＤＮＡ配列をコードする。ｃＤＮＡ配列の基となる参照遺伝子配列はイントロンを含む場合があり、一方でｃＤＮＡ配列はイントロンを除外している。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、生物体からの遺伝子または遺伝子フラグメントをコードする場合がある。例示的な生物体として、原核生物（例えば細菌）および真核生物（例えばマウス、ウサギ、ヒト、および非ヒト霊長類）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの例では、前記ポリヌクレオチドライブラリは１つ以上のポリヌクレオチドを含む。この１つ以上のポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドは複数のエクソンに対する配列をコードする。本明細書に記載のライブラリ内の各ポリヌクレオチドは、異なる配列、すなわち非同一配列をコードする場合がある。いくつかの例では、本明細書に記載のライブラリ内の各ポリヌクレオチドは、該ライブラリ内の他のポリヌクレオチドの配列に相補的な少なくとも１つの部分を含む。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列は、別段の定めのない限り、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む場合がある。本明細書に記載のポリヌクレオチドライブラリは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、または１，０００，０００より多くのポリヌクレオチドを含む場合がある。本明細書に記載のポリヌクレオチドライブラリは、多くとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、または１，０００，０００より多くのポリヌクレオチドを有する場合がある。本明細書に記載のポリヌクレオチドライブラリは、１０～５００、２０～１０００、５０～２０００、１００～５０００、５００～１０，０００、１，０００～５，０００、１０，０００～５０，０００、１００，０００～５００，０００、または５０，０００～１，０００，０００のポリヌクレオチドを含む場合がある。本明細書に記載のポリヌクレオチドライブラリは、約３７０，０００、４００，０００、５００，０００以上の異なるポリヌクレオチドを含む場合がある。
ユニバーサルアダプター
図１Ａに表されるように、いくつかの例では、本明細書に開示されるユニバーサルアダプターは、第１の鎖（１０１ａ）と第２の鎖（１０１ｂ）を含む、ユニバーサル・ポリヌクレオチド・アダプター（１００）を含む場合がある。いくつかの例では、第１の鎖（１０１ａ）は、第１のプライマー結合領域（１０２ａ）、第１の非相補的領域（１０３ａ）、および第１のヨーク領域（１０４ａ）を含む。いくつかの例では、第２の鎖（１０１ｂ）は、第２のプライマー結合領域（１０２ｂ）、第２の非相補的領域（１０３ｂ）、および第２のヨーク領域（１０４ｂ）を含む。いくつかの例では、プライマー結合領域（例えば１０２ａ／１０２ｂ）は、ポリヌクレオチドアダプター（１００）のＰＣＲ増幅を可能にする。いくつかの例では、プライマー結合領域（例えば１０２ａ／１０２ｂ）は、ポリヌクレオチドアダプター（１００）のＰＣＲ増幅、およびポリヌクレオチドアダプターへの１つ以上のバーコードの同時追加を可能にする。いくつかの例では、第１のヨーク領域（１０４ａ）は第２のヨーク領域（１０４ｂ）に相補的である。いくつかの例では、第１の非相補的領域（１０３ａ）は第２の非相補的領域（１０３ｂ）に相補的ではない。いくつかの例では、ユニバーサルアダプター（１００）は、Ｙ字状、または二叉状のアダプターである。いくつかの例では、１つ以上のヨーク領域は、第１のヨーク領域と第２のヨーク領域との間のＴｍを上昇させる核酸塩基アナログを含む。本明細書に記載されるようなプライマー結合領域は、ポリヌクレオチドの末端アダプター領域の形態を呈していてもよい。いくつかの例では、ユニバーサルアダプターは１つのインデックス配列を含む。いくつかの例では、ユニバーサルアダプターは１つの固有の分子識別子を含む。
ユニバーサル（ポリヌクレオチド）アダプター（１００）は、一般的なバーコード化アダプター（例えば完全長の「Ｙアダプター」）に比べて短くされてもよい。例えば、ユニバーサルアダプター鎖（１０１ａ）または（１０１ｂ）は、長さ２０～４５の塩基である。いくつかの例では、ユニバーサルアダプター鎖は、長さ２５～４０の塩基である。いくつかの例では、ユニバーサルアダプター鎖は、長さ３０～３５の塩基である。いくつかの例では、ユニバーサルアダプター鎖は、長さ５０以下の塩基、長さ４５以下の塩基、長さ４０以下の塩基、長さ３５以下の塩基、長さ３０以下の塩基、または長さ２５以下の塩基である。いくつかの例では、ユニバーサルアダプター鎖は、長さ約２５、２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０の塩基である。いくつかの例では、ユニバーサルアダプター鎖は、長さ約６０の塩基対である。いくつかの例では、ユニバーサルアダプター鎖は、長さ２５～４０の塩基対である。いくつかの例では、ユニバーサルアダプター鎖は、長さ２５～４０の塩基対である。いくつかの例では、ユニバーサルアダプター鎖は、長さ２５～４０の塩基対である。
ユニバーサルアダプターは、試料ポリヌクレオチドでのライゲーションを容易にするために修飾することができる。例えば、５’末端がリン酸化される。いくつかの例では、ユニバーサルアダプターは、ホスホロチオエート結合など１つ以上の非天然核酸塩基結合を含む。例えば、ユニバーサルアダプターは、３’末端塩基間にホスホロチオエート、および３’末端塩基に隣接する塩基を含む。いくつかの例では、試料ポリヌクレオチドは、ヒト、細菌、植物、動物、真菌、もしくはウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡなど、様々なソースの核酸を含む。図１Ｂに表されるように、アダプターでライゲートされた試料ポリヌクレオチド（１１０）は、いくつかの例では、試料ポリヌクレオチド（１０５ａ）／（１０５ｂ）の５’末端と３’末端の両方にライゲートされるアダプター（１００）を伴う試料ポリヌクレオチド（例えば試料核酸）（１０５ａ／１０５ｂ）を含む。二本鎖試料ポリヌクレオチドは、第１の鎖（フォワード）（１０５ａ）および第２の鎖（リバース）（１０５ｂ）の療法を含む。
ユニバーサルアダプターは、あらゆる数の異なる核酸塩基（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、核酸塩基アナログ、または非核酸塩基リンカーもしくはスペーサーを含有する場合がある。例えばアダプターは、アダプターの２つの鎖間のハイブリダイゼーション（Ｔｍ）を増強させる１つ以上の核酸塩基アナログまたは他の基を含む。いくつかの例では、核酸塩基アナログは、アダプターのヨーク領域に存在する。核酸塩基アナログおよび他の基として、ロックド核酸（ＬＮＡ）、二環式核酸（ＢＮＡ）、Ｃ５修飾ピリミジン塩基、２’－Ｏ－メチル置換ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ゼノ核酸（ＸＮＡ）、モルホリノバックボーン修飾塩基、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）、スペルミン、Ｇ－クランプ、またはアントラキノン（Ｕａｑ）キャップが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの例では、アダプターは、表１から選択される１つ以上の核酸塩基アナログを含む。
Figure 2022521766000002
ユニバーサルアダプターは、所望のハイブリダイゼーションＴｍに応じて、あらゆる数の核酸塩基アナログ（ＬＮＡまたはＢＮＡなど）を含む場合がある。例えば、アダプターは１～２０の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、アダプターは１～８の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、アダプターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または少なくとも１２の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、アダプターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、核酸塩基アナログの数は、アダプター中の塩基の合計数の割合として表される。例えば、アダプターは少なくとも１％、２％、５％、１０％、１２％、１８％、２４％、３０％、または３０％超の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のアダプター（例えばユニバーサルアダプター）は、メチル化シトシンなどのメチル化核酸塩基を含む。
バーコード化プライマー
ポリヌクレオチドプライマーは、図１Ｃに表されるように、バーコード（またはインデックス）などの規定の配列を含む。バーコードは、例えばバーコード、アダプターでライゲートされた試料ポリヌクレオチド（図１Ｄ、１０８）を生成するために、ＰＣＲとバーコード化プライマー（１１３ａ）または（１１３ｂ）を使用して、ユニバーサルアダプターに付けることができる。図１Ｃと１Ｄに表されるユニバーサルプライマー結合部位（１０７ａ）または（１０７ｂ）などのプライマー結合部位は、バーコード・プライマー・ライブラリのすべての員、または員の部分集団を同時に増幅することを促す。いくつかの例では、プライマー結合部位（１０７ａ）または（１０７ｂ）は、次世代シーケンシング中にフローセルまたは他の固体担体に結合する領域を含む。いくつかの例では、バーコード化プライマーは、Ｐ５（５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’）またはＰ７（５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ－３’）配列を含む。いくつかの例では、プライマー結合部位（１１２ａ）または（１１２ｂ）は、ユニバーサルアダプター配列（１０２ａ）または（１０２ｂ）に結合するように構成され、バーコード化アダプターの増幅と生成を促進する。いくつかの例では、バーコード化プライマーは長さ６０以下の塩基である。いくつかの例では、バーコード化プライマーは長さ５５以下の塩基である。いくつかの例では、バーコード化プライマーは長さ５０～６０の塩基である。いくつかの例では、バーコード化プライマーは長さ約６０の塩基である。いくつかの例では、本明細書に記載のバーコードは、メチル化シトシンなどのメチル化核酸塩基を含む。
図１Ｃと１Ｄに表されるように、バーコード化プライマーは１つ以上のバーコード（１０６ａ）または（１０６ｂ）を含む。いくつかの例では、このバーコードはＰＣＲ反応によりユニバーサルアダプターに加えられる。バーコードは、該バーコードが関連付けられるポリヌクレオチドの一部特徴が同定されるのを可能にする核酸配列である。いくつかの例では、バーコードはインデックス配列を含む。いくつかの例では、インデックス配列は、試料、または配列決定されるべき核酸の固有ソースの同定を可能にする。シーケンシング後、バーコード（またはバーコード領域）は、コード領域または試料ソースに関連する特徴を同定するための指標を提供する。バーコードは、十分な程度の同定を可能にするのに適切な長さ、例えば長さが少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、またはそれより多くの塩基でデザインすることができる。約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのバーコードなどの複数のバーコードは、同じ分子に対して使用され、場合により非バーコード配列により分離されてもよい。いくつかの例では、複数のバーコード中の各バーコードは、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの位置など、少なくとも３つの塩基位置にある複数のバーコードにおける１つおきのバーコードとは異なる。バーコードの使用により、シーケンシング（マルチプレックス）などの下流の用途のために複数のライブラリのプールと同時処理が可能となる。いくつかの例では、少なくとも４、８、１６、３２、４８、６４、１２８、または５１２より多くのライブラリが使用される。バーコード化プライマーまたはアダプターは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含む場合がある。このようなＵＭＩは、いくつかの例では独自に試料中の核酸すべてにタグを付ける。いくつかの例では、試料中で少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９５％より多くの核酸が、ＵＭＩでタグ付けされる。いくつかの例では、試料中で少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、または少なくとも９９％の核酸が、固有のバーコードまたはＵＭＩでタグ付けされる。バーコード化プライマーは、いくつかの例では、インデックス配列と１つ以上のＵＭＩを含む。ＵＭＩにより、バイアスを導入可能な下流の試料処理（例えばＰＣＲまたは濃縮の工程）の前に、初期試料濃度または化学量論の内部測定が可能となる。いくつかの例では、ＵＭＩは１つ以上のバーコード配列を含む。いくつかの例では、アダプターでライゲートされた試料ポリヌクレオチドの各鎖（フォワードｖｓリバース）は、１つ以上の固有のバーコードを持つ。このようなバーコードは随意に、独自に試料ポリヌクレオチドの各鎖にタグを付けるために使用される。いくつかの例では、バーコード化プライマーは、インデックスバーコードおよびＵＭＩバーコードを含む。いくつかの例では、少なくとも２つのバーコード化プライマーによる増幅後、結果として生じるアンプリコンは、２つのインデックス配列および２つのＵＭＩを含む。いくつかの例では、少なくとも１つのバーコード化プライマーによる増幅後、結果として生じるアンプリコンは、２つのインデックスバーコードおよび１つのＵＭＩバーコードを含む。いくつかの例では、ユニバーサルアダプター－試料ポリヌクレオチドの複製における各鎖は、ＵＭＩまたはインデックスバーコードなどの固有のバーコードでタグを付けられる。
図１Ｅと１Ｆに表されるように、ライブラリ中のバーコード化プライマーは、ユニバーサルアダプター上のプライマー結合領域（１０２ａ）／（１０２ｂ）に相補的な領域（１１２ａ）／（１１２ｂ）を含む。例えば、ユニバーサルアダプター結合領域（１１２ａ）は、ユニバーサルアダプターのプライマー領域（１０２ａ）に相補的であり、ユニバーサルアダプター結合領域（１１２ｂ）は、ユニバーサルアダプターのプライマー領域（１０２ｂ）に相補的である。このような構成により、（図１Ｅと１Ｆに表されるように）ＰＣＲ中にユニバーサルアダプターの伸長が容易になり、バーコード化プライマーが付けられる。いくつかの例では、プライマーとプライマー結合領域との間のＴｍは、４０～６５℃である。いくつかの例では、プライマーとプライマー結合領域との間のＴｍは、４２～６３℃である。いくつかの例では、プライマーとプライマー結合領域との間のＴｍは、５０～６０℃である。いくつかの例では、プライマーとプライマー結合領域との間のＴｍは、５３～６２℃である。いくつかの例では、プライマーとプライマー結合領域との間のＴｍは、５４～５８℃である。いくつかの例では、プライマーとプライマー結合領域との間のＴｍは、４０～５７℃である。いくつかの例では、プライマーとプライマー結合領域との間のＴｍは、４０～５０℃である。いくつかの例では、プライマーとプライマー結合領域との間のＴｍは、約４０、４５、４７、５０、５２、５３、５５、５７、５９、６１、または６２℃である。
ハイブリダイゼーションブロッカー
ブロッカーは、あらゆる数の異なる核酸塩基（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、核酸塩基アナログ（非標準）、または非核酸塩基リンカーもしくはスペーサーを含有する場合がある。いくつかの例では、ブロッカーはユニバーサルブロッカーを含む。いくつかの例では、このようなブロッカーは「セット」として記載される場合がある。いくつかの例では、ユニバーサルブロッカーは、アダプターの少なくとも１つに存在する１つ以上のバーコードに依存しないアダプター間相互作用を妨げる。例えばブロッカーは、ブロッカーとアダプターとの間のハイブリダイゼーション（Ｔｍ）を増強させる１つ以上の核酸塩基アナログまたは他の基を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、ブロッカーとアダプター（例えば「ユニバーサル」塩基）との間のハイブリダイゼーション（Ｔｍ）を減少させる、１つ以上の核酸塩基を含む。いくつかの例では、本明細書に記載のブロッカーは、ブロッカーとアダプターとの間のハイブリダイゼーション（Ｔｍ）を増加させる１つ以上の核酸塩基と、ブロッカーとアダプターとの間のハイブリダイゼーション（Ｔｍ）を減少させる１つ以上の核酸塩基の両方を含む。
本明細書には、標的配列（例えばアダプター）への結合を増強する１つ以上の領域と、標的配列（例えばアダプター）への結合を減少させる１つ以上の領域とを含む、ハイブリダイゼーションブロッカーが記載される。いくつかの例では、各領域は、標的濃縮への適用中に、与えられた所望のレベルのオフベイト活性を調整される。いくつかの例では、各領域は、標的配列に対する分子の全体的な親和性を増加または減少させるため、一種類または複数種の化学的修飾／部分により改質することができる。いくつかの例では、ブロッカーセットの個々の員すべての融解温度は、（例えば、ＬＮＡおよび／またはＢＮＡなどの部分の追加により）特定温度より上に維持される。いくつかの例では、与えられた一組のブロッカーは、インデックス長さ、インデックス配列、および、どのくらいのアダプターインデックスがハイブリダイゼーションに存在するかに関係なく、オフベイトパフォーマンスを改善する。
ブロッカーは、標的シーケンシングに対する親和性を増大および／または減少させるアダプターなどの部分を含む場合がある。いくつかの例では、このような特定領域は、特定の標的配列に対する親和性を回避または増大するために特定の融解温度へと熱力学的に調整することができる。いくつかの例では、このような修飾の組み合わせは、特異的かつ固有のアダプター配列に対するブロッカー分子の親和性の増大、および反復アダプター配列（例えばアダプターのＹステムアニーリング部分）に対するブロッカー分子の親和性の減少を助けるようにデザインされる。いくつかの例では、ブロッカーは、アダプターのＹステム領域へのブロッカーの結合を減少させる部分を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、アダプターのＹステム領域へのブロッカーの結合を減少させる部分、およびアダプターの非Ｙステム領域へのブロッカーの結合を増大させる部分を含む。
ブロッカー（例えばユニバーサルブロッカー）とアダプターは、ハイブリダイゼーション中に多数の異なる集団を形成する場合がある。いくつかの例では、ブロッカーのＹステムアニーリング領域における親和性を減少させるＤＮＡの修飾の数が増えると、集団「Ａ」と「Ｄ」が優勢となり、いずれかが所望の効果（Ａ、図３６Ａ）または最小効果（Ｄ、図３６Ｄ）を持つ。いくつかの例では、ブロッカーのＹステムアニーリング領域における親和性を減少させるＤＮＡの修飾の数が減ると、集団「Ｂ」と「Ｃ」が優勢となり、他のアダプターへのデイジーチェーニング（ｄａｉｓｙ－ｃｈａｉｎｉｎｇ）またはアニーリングが生じるおそれのある望まれない効果を持つか（Ｂ、図３６Ｂ）、または適切に機能できないブロッカーを隔絶する（Ｃ、図３６Ｃ）。
単一インデックスアダプターまたは二重インデックスアダプター両方のデザイン上のインデックスは、アダプターインデックス塩基をカバーするために、特異的にデザインされたＤＮＡ修飾により伸長されているユニバーサルブロッカーにより部分的または完全にカバーされる場合がある。いくつかの例では、このような修飾は、インデックスへのアニーリングを減少させるユニバーサル塩基などの部分を含む。いくつかの例では、二重インデックスアダプターのインデックスは、１つ以上のブロッカーにより部分的にカバーされる（または重複される）。いくつかの例では、二重インデックスアダプターのインデックスは、１つ以上のブロッカーにより完全にカバーされる。いくつかの例では、単一インデックスアダプターのインデックスは、１つ以上のブロッカーにより部分的にカバーされる。いくつかの例では、単一インデックスアダプターのインデックスは、１つ以上のブロッカーにより完全にカバーされる。いくつかの例では、ブロッカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２０より多くの塩基によりインデックス配列を重複させる。いくつかの例では、ブロッカーは、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２５より多くの塩基によりインデックス配列を重複させる。いくつかの例では、ブロッカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または３０の塩基によりインデックス配列を重複させる。いくつかの例では、ブロッカーは、１～５、１～３、２～５、２～８、２～１０、３～６、３～１０、４～１０、４～１５、１～４、または５～７の塩基によりインデックス配列を重複させる。いくつかの例では、インデックス配列に重複するブロッカーの領域は、少なくとも１つの２－デオキシイノシンまたは５－ニトロインドールの核酸塩基を含む。
１または２つのブロッカーは、アダプター上に存在するインデックス配列に重なる場合がある。いくつかの例では、１または２つのブロッカーは、インデックス配列の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２０より多くの塩基との重複と組み合わせられる。いくつかの例では、１または２つのブロッカーは、インデックス配列の多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２０より多くの塩基との重複と組み合わせられる。いくつかの例では、１または２つのブロッカーは、インデックス配列の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２０より多くの塩基との重複と組み合わせられる。いくつかの例では、１または２つのブロッカーは、インデックス配列の１～５、１～３、２～５、２～８、２～１０、３～６、３～１０、４～１０、４～１５、１～４、または５～７の塩基より多くの塩基との重複と組み合わせられる。いくつかの例では、インデックス配列に重複するブロッカーの領域は、少なくとも１つの２－デオキシイノシンまたは５－ニトロインドールの核酸塩基を含む。
第１の構成では、アダプター・インデックス・オーバーハングの長さは変動する場合がある。片側からデザインされると、アダプター・インデックス・オーバーハングは、インデックスの一方の側から０～ｎ個のアダプターインデックスをカバーするように改質される場合がある（図３７Ｂ～３７Ｆ）。これにより、単一（図３７Ｆ）および二重（図３７Ｂと３７Ｃ）のインデックス・アダプター・システムに対してこのようなアダプターブロッカーをデザインすることができる。
第２の構成では、アダプターインデックス塩基は両側からカバーされる（図３７Ｄと３７Ｅ）。アダプターインデックス塩基が両側からカバーされると、各ブロッカーのカバー領域の長さは、ブロッカーの単一ペアが一定範囲のアダプターインデックス長さと相互に作用しながら、依然としてインデックス塩基の総数の顕著な部分をカバーするように、選択される場合がある。一例として、アダプターインデックスをカバーする３ｂｐのオーバーハングでデザインされている２つのブロッカーを呈する。６ｂｐ、８ｂｐ、または１０ｂｐのアダプターインデックス長さの観点では、これらブロッカーは、ハイブリダイゼーション中にそれぞれ０ｂｐ、２ｂｐ、または４ｂｐを残すことになる（図３９Ａ～３９Ｃ）。
第３の構成では、修飾された核酸塩基は、インデックスアダプター塩基をカバーするように選択される。現在市販で入手可能なこれら修飾の例として、縮退性塩基（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｂａｓｅ）（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇの混合塩基）、２’－デオキシイノシン、５－ニトロインドールが挙げられる。
第４の構成では、アダプター・インデックス・オーバーハングを伴うブロッカーは、次世代シーケンシングライブラリのセンス（「上部」）鎖またはアンチセンス（「下部」）鎖のいずれかに結合する。
第５の構成では、ブロッカーはさらに、規定の長さと組成を持つ標準アダプターインデックス塩基に加えて、他のポリヌクレオチド配列（例えば、ライゲーションを容易にするために先の生化学工程で、または、規定のアダプター配列、シーケンシング後の生物情報割当て（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）のための固有の分子識別子などを導入するための他の方法で追加される、ポリ－Ａテール）をカバーするように伸長される（図３７Ｇ）。このような種類の配列はアダプターの複数の位置に配置することができ、この場合には、最も広く利用された事例（ゲノムインサートの隣に固有の分子インデックス）が提示される。固有の分子識別子（例えばアダプターインデックス塩基の隣）に対する他の位置は、同様の手法により処理することもできる。
第６の構成では、先の構成はすべて、特定条件下での標的濃縮中にオフベイトパフォーマンスに対する標的パフォーマンス基準を満たすために、様々な組み合わせで利用される。いくつかの例では、ブロッカーは、図３５Ａに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３５Ｂに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３５Ｃに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３５Ｄに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３５Ｅに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３７Ａに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３７Ｂに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３７Ｃに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３７Ｄに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３７Ｅに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３７Ｆに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３７Ｇに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３９Ａに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３９Ｂに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図３９Ｃに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ａに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ｂに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ｃに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ｄに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ｅに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ｆに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ｇに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ｈに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ｉに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ｊに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ｋに示される構成を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、図４０Ｌに示される構成を含む。
ブロッカーは、核酸塩基アナログなどの部分を含む場合がある。核酸塩基アナログおよび他の基として、ロックド核酸（ＬＮＡ）、二環式核酸（ＢＮＡ）、Ｃ５修飾ピリミジン塩基、２’－Ｏ－メチル置換ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、イノシン、２’－デオキシイノシン、３－ニトロピロール、５－ニトロインドール、ゼノ核酸（ＸＮＡ）、モルホリノバックボーン修飾塩基、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）、スペルミン、Ｇ－クランプ、またはアントラキノン（Ｕａｑ）キャップが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの例では、核酸塩基アナログはユニバーサル塩基を含み、ここで核酸塩基は、同族の核酸塩基に結合するために低いＴｍを持つ。いくつかの例では、ユニバーサル塩基は５－ニトロインドールまたは２’－デオキシイノシンを含む。ある例では、ブロッカーは、２つのポリヌクレオチド鎖を接続するスペーサー要素を含む。いくつかの例では、ブロッカーは、表１から選択される１つ以上の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、このような核酸塩基アナログはブロッカーのＴｍを調節するために加えられる。ブロッカーは、所望のハイブリダイゼーションＴｍに応じて、あらゆる数の核酸塩基アナログ（ＬＮＡまたはＢＮＡなど）を含む場合がある。例えば、ブロッカーは２０～４０の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、ブロッカーは８～１６の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、ブロッカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または少なくとも１２の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、ブロッカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、核酸塩基アナログの数は、ブロッカー中の塩基の合計数の割合として表される。例えば、ブロッカーは少なくとも１％、２％、５％、１０％、１２％、１８％、２４％、３０％、または３０％超の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、核酸塩基アナログを含むブロッカーは、各核酸塩基アナログに対して約２℃～約８℃の範囲でＴｍを上昇させる。いくつかの例では、Ｔｍは、各核酸塩基アナログに対して少なくともまたは約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１２℃、１４℃、または１６℃まで上昇される。いくつかの例では、このようなブロッカーは、アダプターの上部または「センス」鎖に結合するよう構成される。いくつかの例ではブロッカーは、アダプターの下部または「アンチセンス」鎖に結合するよう構成される。いくつかの例では、一組のブロッカーは、アダプターの上部鎖と下部鎖の両方に結合するよう構成される配列を含む。いくつかの例では、追加のブロッカーは、アダプター配列の補体、リバース、フォワード、またはリバース補体に対して構成される。いくつかの例では、上部鎖（上部に結合する）または下部鎖（あるいは両方）を標的とする一組のブロッカーがデザインかつ試験され、続いて、上部ブロッカーを下部ブロッカーに、または下部ブロッカーを上部ブロッカーに置き換えるなどの最適化が行われる。いくつかの例では、ブロッカーは、アダプター上でインデックスまたはバーコードの塩基と完全または部分的に重複するように構成される。いくつかの例では、一組のブロッカーは、アダプターインデックス配列と重複する少なくとも１つのブロッカーを含む。いくつかの例では、一組のブロッカーは、アダプターインデックス配列と重複する少なくとも１つのブロッカー、およびアダプターインデックス配列と重複しない少なくとも１つのブロッカーを含む。いくつかの例では、一組のブロッカーは、ヨーク領域配列と重複しない少なくとも１つのブロッカーを含む。いくつかの例では、一組のブロッカーは、ヨーク領域配列と重複しない少なくとも１つのブロッカー、およびヨーク領域配列と重複する少なくとも１つのブロッカーを含む。いくつかの例では、一組のブロッカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多くのブロッカーを含む。
ブロッカーは、アダプターまたはハイブリダイゼーションＴｍのサイズに応じて任意の長さであってもよい。例えば、ブロッカーは長さ２０～５０の塩基である。いくつかの例では、ブロッカーは、長さ２５～４５の塩基、３０～４０の塩基、２０～４０の塩基、または３０～５０の塩基である。いくつかの例では、ブロッカーは長さ２５～３０の塩基である。いくつかの例では、ブロッカーは、長さが少なくとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５の塩基である。いくつかの例では、ブロッカーは、長さが多くとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５の塩基である。いくつかの例では、ブロッカーは、長さが約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５の塩基である。いくつかの例では、ブロッカーは長さ約５０の塩基である。いくつかの例では、アダプターでタグを付けられたゲノムライブラリフラグメントを標的とする一組のブロッカーは、長さが１より大きなブロッカーを含む。いくつかの例では、２つのブロッカーがリンカーに繋ぎ止められる。様々なリンカーが当該技術分野で周知であり、いくつかの例では、アルキル基、ポリエーテル基、アミン基、アミド基、または他の化学基を含む。いくつかの例では、リンカーは個別のリンカーユニットを含む。このユニットは、リン酸塩、チオリン酸塩、アミドなどの骨格、またはその他の骨格を介して一体的に接続される（またはブロッカーポリヌクレオチドに付けられる）。典型的な構成では、リンカーは、それぞれアダプター配列の５’末端を標的とする第１のブロッカーと、アダプター配列の３’末端を標的とする第２のブロッカーとの間にあるインデックス領域にまたがる。いくつかの例では、下流増幅を妨げるためにキャッピング基がブロッカーの５’または３’末端に加えられる。キャッピング基は多種多様に、ポリエーテル、多価アルコール、アルカン、または増幅を妨げる他のハイブリダイズ不能な基を含む。いくつかの例では、このような基は、リン酸塩、チオリン酸塩、アミド、または他の骨格を介して接続される。いくつかの例では、１つ以上のブロッカーが使用される。いくつかの例では、少なくとも４つの非同一ブロッカーが使用される。いくつかの例では、第１のブロッカーはアダプター配列の第１の３’末端にまたがり、第２のブロッカーはアダプター配列の第１の５’末端にまたがり、第３のブロッカーはアダプター配列の第２の３’末端にまたがり、第４のブロッカーはアダプター配列の第２の５’末端にまたがる。いくつかの例では、第１のブロッカーは、長さが少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５の塩基である。いくつかの例では、第２のブロッカーは、長さが少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５の塩基である。いくつかの例では、第３のブロッカーは、長さが少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５の塩基である。いくつかの例では、第４のブロッカーは、長さが少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５の塩基である。いくつかの例では、第１のブロッカー、第２のブロッカー、第３のブロッカー、または第４のブロッカーは、核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、前記核酸塩基アナログはＬＮＡである。
ブロッカーのデザインは、アダプター配列への所望のハイブリダイゼーションＴｍにより影響を受ける場合がある。いくつかの例では、非標準核酸（例えばロックド核酸、架橋核酸、または他の非標準核酸もしくはアナログ）は、ブロッカーのＴｍを増大または減少させるためにブロッカーへと挿入される。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは、非標準アミノ酸を含むポリヌクレオチドのＴｍを算出するのに特異的なツールを使用して算出される。いくつかの例では、ＴｍはＥｘｉｑｏｎ（商標）オンライン予測ツールを使用して算出される。いくつかの例では、本明細書に記載のブロッカーのＴｍは、インシリコで算出される。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍはインシリコで算出され、かつ実験上のインビトロ条件と相関される。理論に縛られるものではないが、実験で求められたＴｍはさらに。塩濃度、温度、添加剤の存在、またはその他の因子などの実験パラメータにより影響を受ける場合がある。いくつかの例では、本明細書に記載のＴｍはインシリコで求められたＴｍであり、これを使用してブロッカーパフォーマンスがデザインまたは最適化される。いくつかの例では、Ｔｍ値は、融解曲線解析実験から予測、評価、または決定される。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは７０℃～９９℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは７５℃～９０℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは少なくとも８５℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは、少なくとも７０、７２、７５、７７、８０、８２、８５、８８、９０、または９２℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは、約７０、７２、７５、７７、８０、８２、８５、８８、９０、９２、または９５℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは７８℃～９０℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは７９℃～９０℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは８０℃～９０℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは８１℃～９０℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは８２℃～９０℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは８３℃～９０℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは８４℃～９０℃である。いくつかの例では、一組のブロッカーの平均Ｔｍは７８℃～９０℃である。いくつかの例では、一組のブロッカーの平均Ｔｍは８０℃～９０℃である。いくつかの例では、一組のブロッカーの平均Ｔｍは少なくとも８０℃である。いくつかの例では、一組のブロッカーの平均Ｔｍは少なくとも８１℃である。いくつかの例では、一組のブロッカーの平均Ｔｍは少なくとも８２℃である。いくつかの例では、一組のブロッカーの平均Ｔｍは少なくとも８３℃である。いくつかの例では、一組のブロッカーの平均Ｔｍは少なくとも８４℃である。いくつかの例では、一組のブロッカーの平均Ｔｍは少なくとも８６℃である。いくつかの例では、ブロッカーのＴｍは、高速のハイブリダイゼーション緩衝液および／またはハイブリダイゼーション促進剤の使用など、本明細書に記載の他の成分の結果として修飾される。
ブロッカーとアダプター標的とのモル比は、ハイブリダイゼーション中のオフベイト（続いてオフターゲット）率に影響を及ぼす場合がある。ブロッカーの標的アダプターへの結合が効率的になるほど、必要なブロッカーは少なくなる。いくつかの例では、本明細書に記載のブロッカーは、２０：１（ブロッカー：標的）未満のモル比で、２０％以下のオフターゲットリードのシーケンシング結果を達成する。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、１０：１（ブロッカー：標的）未満のモル比で達成される。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、５：１（ブロッカー：標的）未満のモル比で達成される。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、２：１（ブロッカー：標的）未満のモル比で達成される。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、１．５：１（ブロッカー：標的）未満のモル比で達成される。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、１．２：１（ブロッカー：標的）未満のモル比で達成される。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、１．０５：１（ブロッカー：標的）未満のモル比で達成される。
ユニバーサルブロッカーは、サイズが変動したパネルライブラリと共に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、このパネルライブラリは、少なくともまたは約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、１．０、２．０、４．０、８．０、１０．０、１２．０、１４．０、１６．０、１８．０、２０．０、２２．０、２４．０、２６．０、２８．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０メガベース（Ｍｂ）、または６０．０Ｍｂを超えるものを含む。
本明細書に記載されるようなブロッカーは、オンターゲットパフォーマンスを改善する場合がある。いくつかの実施形態では、オンターゲットパフォーマンスは、少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％より多く改善する。いくつかの実施形態では、オンターゲットパフォーマンスは、様々なインデックスデザインで少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％より多く改善する。いくつかの実施形態では、オンターゲットパフォーマンスは、様々なパネルサイズで少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％より多く改善する。
シーケンシング方法
本明細書には、シーケンシングの効率と精度を改善する方法が記載される。このような方法は、核酸塩基アナログを含むユニバーサルプライマーの使用、および、核酸をサンプリングするためにライゲーション後のバーコード化アダプターの生成を含む。いくつかの例では、試料が断片化され、フラグメント端部が修復され、１つ以上のアデニンがフラグメント重複部位（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｕｐｌｅｘ）の一本の鎖に加えられ、ユニバーサルアダプターがライゲートされ、フラグメントのライブラリがバーコード化プライマーにより増幅されることで、バーコード化核酸ライブラリが生成される（図２２）。いくつかの例では、さらなる工程として、濃縮／キャプチャー、追加のＰＣＲ増幅、および／または核酸ライブラリのシーケンシングが挙げられる。
典型的なシーケンシングのワークフローの第１の工程では（図２）、試料核酸を含む試料（２０８）が機械剪断または酵素剪断により断片化され、フラグメント（２０９）のライブラリが形成される。インデクシングしたアダプター（２１５）を断片化試料核酸にライゲートすると、アダプターでライゲートされた試料核酸ライブラリ（２１０）が形成される。次いでこのライブラリは随意に増幅される。その後、ライブラリ（２１０）は随意に標的結合ポリヌクレオチド（２１７）でハイブリダイズされ、標的結合ポリヌクレオチド（２１７）は試料核酸（２１１）にハイブリダイズし、試料核酸（２１７）とアダプター（２１５）との間でのハイブリダイゼーションを妨げる遮断ポリヌクレオチド（２１６）でハイブリダイズされる。試料核酸の標的結合ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションペア（２１２）／（２１８）のキャプチャー、および標的結合ポリヌクレオチド（２１７）の除去により、試料核酸（２１３）の単離／濃縮が可能となり、その後随意に増幅され、配列決定される（２１４）。
典型的なシーケンシングのワークフローの第１の工程では（図３）、試料核酸を含む試料（２０８）が機械剪断または酵素剪断により断片化され、フラグメント（２０９）のライブラリが形成される。ユニバーサルアダプター（２２０）を断片化試料核酸にライゲートすると、アダプターでライゲートされた試料核酸ライブラリ（２２１）が形成される。次いで、このライブラリをバーコード化プライマーライブラリ（２２２）（簡潔さのために１つのプライマーのみを示す）で増幅すると、バーコード化アダプターの試料ポリヌクレオチドライブラリ（２２３）が生成される。その後、ライブラリ（２２３）は随意に標的結合ポリヌクレオチド（２１７）でハイブリダイズされ、標的結合ポリヌクレオチド（２１７）は、プローブポリヌクレオチド（２１７）とアダプター（２２０）との間でのハイブリダイゼーションを妨げる遮断ポリヌクレオチド（２１６）とともに、試料核酸にハイブリダイズする。試料ポリヌクレオチドの標的結合ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションペア（２１２）／（２１８）のキャプチャー、および標的結合ポリヌクレオチド（２１７）の除去により、試料核酸（２１３）の単離／濃縮が可能となり、その後随意に増幅され、配列決定される（２１４）。ユニバーサルアダプターおよびバーコード化プライマーの様々な組み合わせを使用してもよい。いくつかの例では、バーコード化プライマーは少なくとも１つのバーコードを含む。いくつかの例では、異なる種類のバーコードが、アダプター、バーコード、またはその両方を使用して試料核酸に加えられる。例えばユニバーサルアダプターはインデックスバーコードを含み、ライゲーション後、追加のインデックスバーコードを含むバーコード化プライマーにより増幅される。いくつかの例では、ユニバーサルアダプターは固有の分子識別子バーコードを含み、ライゲーション後、インデックスバーコードを含むバーコード化プライマーにより増幅される。
バーコード化プライマーは、ＰＣＲを使用してユニバーサルアダプターでライゲートされた試料ポリヌクレオチドを増幅し、シーケンシングのためにポリ核酸を生成するために使用されてもよい。いくつかの例では、このようなライブラリは増幅後にバーコードを含む。いくつかの例では、バーコード化プライマーでの増幅の結果、標準のＹアダプターでライゲートされた試料ポリヌクレオチドライブラリの増幅に比べて多くの増幅収量が得られる。いくつかの例では、ユニバーサルアダプターでライゲートされた試料ポリヌクレオチドライブラリを増幅するために、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のＰＣＲサイクルが使用される。いくつかの例では、ユニバーサルアダプターでライゲートされた試料ポリヌクレオチドライブラリを増幅するために、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のＰＣＲサイクルが使用される。いくつかの例では、ユニバーサルアダプターでライゲートされた試料ポリヌクレオチドライブラリを増幅するために、２～１２、３～１０、４～９、５～８、６～１０、または８～１２のＰＣＲサイクルが使用される。いくつかの例では、このようなライブラリはより少数のＰＣＲベースの誤差を含む。理論に縛られるものではないが、増幅中のＰＣＲサイクルが減少すると、アンプリコン生成物に生じる誤差は少数となる。増幅後、このようなバーコード化アンプリコンライブラリは、いくつかの例では濃縮され、キャプチャー、追加の増幅反応、および／またはシーケンシングにかけられる。いくつかの例では、本明細書に記載のユニバーサルアダプターを使用して生成されるアンプリコン生成物は、標準の完全長Ｙアダプターの増幅から生成されるアンプリコン生成物よりも誤差が約３０％、１５％、１０％、７％、５％、３％、２％、１．５％、１％、０．５％、０．１％、または０．０５％少ない。
本明細書には、ゲノムフラグメントにライゲートされるアダプターへのキャプチャープローブのオフターゲット結合、またはアダプター間ハイブリダイゼーションを防ぐためにユニバーサルブロッカーが使用される方法が、記載される。オフターゲットハイブリダイゼーションを防ぐために使用されるアダプターブロッカーは、アダプターの一部または全体を標的とする場合がある。いくつかの例では、固有のインデックス配列を含むアダプターの一部に相補的である特異的なブロッカーが、使用される。アダプターでタグを付けられたゲノムライブラリが多くの異なるインデックスを含む場合、インデックス配列を標的としないか、またはインデックス配列に強くハイブリダイズしないブロッカーをデザインすることが有益な場合がある。例えば、「ユニバーサル」ブロッカーは、インデックス配列を含まない（インデックスに依存しない）アダプターの一部を標的とし、これにより、利用される様々なインデックス配列の数に関係なく最小数のブロッカーの使用が可能となる。いくつかの例では、多くとも８つのユニバーサルブロッカーが使用される。いくつかの例では、４つのユニバーサルブロッカーが使用される。いくつかの例では、３つのユニバーサルブロッカーが使用される。いくつかの例では、２つのユニバーサルブロッカーが使用される。いくつかの例では、１つのユニバーサルブロッカーが使用される。典型的な構成では、４つのユニバーサルブロッカーは、少なくとも４、８、１６、３２、６４、９６、または１２８の異なるインデックス配列を含むアダプターと共に使用される。いくつかの例では、異なるインデックス配列は、少なくともまたは約４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２０より多くの塩基対（ｂｐ）を含む。いくつかの例では、ユニバーサルブロッカーは、バーコード配列に結合するよう構成されない。いくつかの例では、ユニバーサルブロッカーは、バーコード配列に部分的に結合する。いくつかの例では、バーコード配列に部分的に結合するユニバーサルブロッカーはさらに、アダプターに結合するＴｍを増大させるもの（例えばＬＮＡまたはＢＮＡ）など、ヌクレオチドアナログを含む。
メチル化シーケンシングとキャプチャー
メチル化シーケンシングは、脱アミノ化で最高点に達する一連の事象を介して非メチル化シトシンのウラシルへの変換を生じさせる一方で、メチル化シトシンを無傷のままにする、酵素的または化学的な方法を必要とする（図４１）。増幅中にウラシルは相補鎖上でアデニンと対になり、これにより非メチル化シトシンの本来の位置にチミンが含まれる。図４１では、異なる位置にそれぞれ非メチル化シトシンを有する同一の配列が存在する。最終生成物は非対称的であり、変換後に２つの異なる二本鎖ＤＮＡ分子をもたらす（上の列、図４１）。メチル化ＤＮＡに対し同じプロセスを行うと、さらに複数組の配列が得られる（下の列、図４１）。
標的の濃縮は、事前または事後のキャプチャー変換により処理することができる。事後のキャプチャー変換は左側の本来の試料ＤＮＡを標的とし、事前のキャプチャーは右側の変換された配列の４つの鎖を標的とする（図４１）。事後のキャプチャー転換でのプローブデザインに対する困難は少ないが、ＰＣＲ増幅がメチル化パターンを保存せずキャプチャー前に実行できないため、大量の開始ＤＮＡ材料が必要となるのが多い。そのため、事前のキャプチャー転換は多くの場合、無細胞ＤＮＡなどの低入力で感受性のある用途に対する選択の方法である。
本明細書に記載の方法は、シトシンのウラシルへの変換を促すための、酵素または重亜硫酸塩によるライブラリの処理を含む場合がある。いくつかの例では、本明細書に記載のアダプター（例えばユニバーサルアダプター）は、メチル化シトシンなどのメチル化核酸塩基を含む。
増幅反応のための小ポリヌクレオチド集団のデノボ合成
表面、例えば、プレートからポリヌクレオチドを合成する方法が本明細書に記載される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド伸長のための座のクラスター上で合成され、放出され、その後、増幅反応、例えば、ＰＣＲに供される。クラスターからのポリヌクレオチドの合成の例示的なワークフローが図８に示される。シリコンプレート（８０１）は、複数のクラスター（８０３）を含む。各クラスター内には、複数の座（８２１）が存在する。ポリヌクレオチドは、クラスター（８０３）からプレート（８０１）上でデノボ合成される（８０７）。ポリヌクレオチドは切断され（８１１）、プレートから除去されることで（８１３）、放出されたポリヌクレオチドの集団（８１５）を形成する。放出されたポリヌクレオチドの集団（８１５）は、その後、増幅され（８１７）、増幅されたポリヌクレオチドのライブラリ（８１９）を形成する。
本明細書で提供される方法は、クラスター上で合成されたポリヌクレオチドの増幅が、そのようなクラスター化された配置を有していない構造体の表面全体にわたるポリヌクレオチドの増幅と比較して、ポリヌクレオチドの表現に対する強化された制御を提供する。いくつかの例では、ポリヌクレオチド伸長のための座のクラスター化された配置を有する表面から合成されたポリヌクレオチドの増幅は、大きなポリヌクレオチド集団の反復合成に起因する表現に対する負の影響を克服するために提供される。大きなポリヌクレオチド集団の反復合成に起因する表現に対する例示的な負の影響としては、限定されないが、高／低ＧＣ含有量、反復配列、後方の（ｔｒａｉｌｉｎｇ）アデニン、二次構造、標的配列結合に対する親和性、またはポリヌクレオチド配列中の修飾されたヌクレオチドに起因する、増幅バイアスが挙げられる。
クラスター化された配置なしでプレート全体にわたってポリヌクレオチドを増幅するのとは対照的なクラスター増幅は、平均の周りのよりタイトな分布をもたらし得る。例えば、１０万のリードがランダムにサンプリングされる場合、配列ごとに平均８つのリードにより、平均から約１．５倍の分布を有するライブラリが生成される。場合によっては、単一クラスター増幅により、平均から最大で約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、または約２．０倍がもたらされる。場合によっては、単一クラスター増幅により、平均から少なくとも約１．０倍、１．２倍、１．３倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または２．０倍がもたらされる。
プレート全体にわたる増幅と比較して、本明細書に記載されるクラスター増幅方法は、等価な配列表現に必要とされるシーケンシングがより少ないポリヌクレオチドライブラリをもたらし得る。いくつかの例では、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％少ないシーケンシングが必要とされる。いくつかの例では、最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、または最大９５％少ないシーケンシングが必要とされる。プレート全体にわたる増幅と比較して、クラスター増幅後に、３０％少ないシーケンシングが必要とされることもある。いくつかの例では、ポリヌクレオチドのシーケンシングは、次世代シーケンシングなどのハイスループットシーケンシングによって検証される。シーケンシングライブラリのシーケンシングは、限定されないが、単一分子のリアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、ポロニーシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、可逆的なターミネーターシーケンシング、陽子検出シーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ナノポアシーケンシング、電子シーケンシング、パイロシーケンシング、マクサム－ギルバートシーケンシング、連鎖停止反応（例えば、サンガー）シーケンシング、＋Ｓシーケンシング、あるいは合成によるシーケンシングを含む任意の適切なシーケンシング技術を用いて実施されてもよい。単一のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが同定されたか、または「読み取られた」回数は、シーケンシング深度またはリード深度として定義される。場合によっては、リード深度は、フォールドカバレッジ、例えば、５５倍（または５５×）カバレッジと呼ばれ、随意に、塩基のパーセンテージを記載する。
いくつかの例では、プレート全体にわたる増幅と比較して、クラスター化された配置からの増幅は、より少ないドロップアウト、または増幅産物のシーケンシング後に検出されない配列をもたらす。ドロップアウトは、ＡＴおよび／またはＧＣであり得る。いくつかの例では、ドロップアウトの数は、ポリヌクレオチド集団の最大約１％、２％、３％、４％、または５％である。場合によっては、ドロップアウトの数はゼロである。
本明細書に記載されるクラスターは、ポリヌクレオチド合成のための離散的で非重複の座の集合体を含む。クラスターは、約５０～１０００、７５～９００、１００～８００、１２５～７００、１５０～６００、２００～５００、または３００～４００の座を含み得る。いくつかの例では、各クラスターは１２１の座を含む。いくつかの例では、各クラスターは、約５０～５００、約５０～２００、約１００～１５０の座を含む。いくつかの例では、各クラスターは、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、５００、１０００、またはそれ以上の座を含む。いくつかの例では、単一のプレートは、１００、５００、１００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、５０００００、７０００００、１００００００、またはそれ以上の座を含む。座は、スポット、ウェル、マイクロウェル、チャネル、またはポストであり得る。いくつかの例では、各クラスターは、同一の配列を有するポリヌクレオチドの伸長を支持する別の特徴の少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれ以上の冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を有する。
配列含量（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ）の化学量論を制御したポリヌクレオチドライブラリの生成
いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは、所望のポリヌクレオチド配列の指定された分布で合成される。いくつかの例では、特定の所望の配列を濃縮するためにポリヌクレオチドライブラリを調節すると、結果として、下流の用途の結果（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｕｔｃｏｍｅｓ）が改善される。
１つ以上の特定の配列は、下流の用途におけるそれらの評価に基づいて選択され得る。いくつかの例では、評価は、増幅、濃縮、または検出のための標的配列に対する結合親和性、安定性、融解温度、生物学的活性、より大きな断片へと集合する能力、またはポリヌクレオチドの他の特性である。いくつかの例では、評価は、経験的なものであるか、または先行実験および／またはコンピュータアルゴリズムから予測される。例示的な用途には、平均的なリード深度よりも小さいリード深度を有するゲノム標的の領域に対応するプローブライブラリ中の配列を増加させることが含まれる。
ポリヌクレオチドライブラリ中の選択された配列は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％であり得るか、または９５％を超える場合がある。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリ中の選択された配列は、配列の最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または最大１００％である。場合によっては、選択された配列は、配列の約５～９５％、約１０～９０％、約３０～８０％、約４０～７５％、または約５０～７０％の範囲である。
ポリヌクレオチドライブラリは、それぞれの選択された配列の頻度で調節することができる。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは、より多くの選択された配列に有利である。例えば、選択された配列のポリヌクレオチド頻度の増加が約４０％～約９０％の範囲にあるライブラリが設計される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは、選択された配列の数が少ないものを含む。例えば、ライブラリは、選択された配列のポリヌクレオチド頻度の増加が約１０％～約６０％の範囲にあるように設計される。ライブラリは、選択された配列のより高い頻度およびより低い頻度に有利であるように設計され得る。いくつかの例では、ライブラリは、均一な配列表現を好む。例えば、ポリヌクレオチドの頻度は、選択された配列の頻度に関して、約１０％～約９０％の範囲で均一である。いくつかの例では、ライブラリは、配列の約１０％～約９５％の範囲の選択された配列頻度を有するポリヌクレオチドを含む。
場合によっては、指定された選択された配列頻度を有するポリヌクレオチドライブラリの生成は、異なる選択された配列頻度含量を有する少なくとも２つのポリヌクレオチドライブラリを組み合わせることによって行われる。いくつかの実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、または１０を超えるポリヌクレオチドライブラリが、指定された選択された配列頻度を有するポリヌクレオチドの集団を生成するために組み合わせられる。場合によっては、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、または１０以下のポリヌクレオチドライブラリが、指定された選択された配列頻度を有する非同一ポリヌクレオチドの集団を生成するために組み合わされる。
いくつかの例では、選択された配列頻度は、１つのクラスターあたりより少ないまたはより多くのポリヌクレオチドを合成することによって調整される。例えば、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または１０００を超える非同一ポリヌクレオチドが単一のクラスター上で合成される。場合によっては、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００以下の非同一ポリヌクレオチドは、単一のクラスター上では合成されない。いくつかの例では、５０～５００の非同一ポリヌクレオチドが単一のクラスター上で合成される。いくつかの例では、１００～２００の非同一ポリヌクレオチドが単一のクラスター上で合成される。いくつかの例では、約１００、約１２０、約１２５、約１３０、約１５０、約１７５、または約２００の非同一ポリヌクレオチドが単一のクラスター上で合成される。
場合によっては、選択された配列頻度は、様々な長さの非同一ポリヌクレオチドを合成することによって調節される。例えば、非同一ポリヌクレオチドの各々の長さは、少なくともまたは少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、２０００のヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。合成された非同一ポリヌクレオチドの長さは、最大で、または最大で約２０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０のヌクレオチド、またはそれ以下である。非同一ポリヌクレオチドの各々の長さは、１０～２０００、１０～５００、９～４００、１１～３００、１２～２００、１３～１５０、１４～１００、１５～５０、１６～４５、１７～４０、１８～３５、および１９～２５の範囲であり得る。
ポリヌクレオチドプローブ構造
ポリヌクレオチドプローブのライブラリは、試料ポリヌクレオチドのより大きな集団において特定の標的配列を濃縮するために使用することができる。いくつかの例では、ポリヌクレオチドプローブはそれぞれ、１つ以上の標的配列に相補的な標的結合配列、１つ以上の非標的結合配列、および１つ以上のプライマー結合部位、例えば、ユニバーサルプライマー結合部位を含む。相補的であるか、または、少なくとも部分的に相補的である標的結合配列は、いくつかの例では、標的配列に結合（ハイブリダイズ）する。ユニバーサルプライマー結合部位などのプライマー結合部位は、プローブライブラリの全メンバー、またはメンバーのサブ集団の同時増幅を容易にする。いくつかの例では、プローブまたはアダプターはさらに、バーコード配列またはインデックス配列を構成する。バーコードは、バーコードが関連付けられるポリヌクレオチドのいくつかの特徴を識別することを可能にする核酸配列である。シーケンシング後、バーコード領域は、コード領域または試料ソースに関連付けられる特徴を識別するための指標を提供する。バーコードは、十分な程度の識別を可能にするために、適切な長さ、例えば、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、またはそれ以上の塩基長で設計することができる。複数のバーコード、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のバーコードが、非バーコード配列によって随意に分離された同一の分子上で使用されてもよい。いくつかの例では、複数のバーコードの各バーコードは、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の位置などの、複数の少なくとも３つの塩基位置の他のすべてのバーコードとは異なる。バーコードを使用すると、シーケンシング（マルチプレックス）などの下流の用途のために、複数のライブラリをプールして同時に処理することが可能になる。いくつかの例では、少なくとも４、８、１６、３２、４８、６４、１２８、５１２、１０２４、２０００、５０００、または５０００を超えるバーコード付きライブラリが使用される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、低分子、ペプチド、抗原、金属、またはタンパク質などの１つ以上の分子（または、親和性）タグにライゲートされて、対象の標的配列をその後キャプチャーするためのプローブを形成する。いくつかの例では、ポリヌクレオチドの一部のみが分子タグにライゲートされる。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションが可能な相補的な標的結合配列を有する２つのプローブは、二本鎖プローブ対を形成する。ポリヌクレオチドプローブまたはアダプターは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含んでいてもよい。ＵＭＩにより、バイアスを導入する可能性がある下流の試料処理（例えば、ＰＣＲまたは濃縮の工程）の前に、初期の試料濃度または化学量論の内部測定が可能になる。いくつかの例では、ＵＭＩは、１つ以上のバーコード配列を含む。
本明細書に記載されるプローブは、ゲノム中の配列である標的配列に相補的であってもよい。本明細書に記載されるプローブは、ゲノム中のエクソーム配列である標的配列に相補的であってもよい。本明細書に記載されるプローブは、ゲノム中のイントロン配列である標的配列に相補的であってもよい。いくつかの例では、プローブは、（試料核酸の）標的配列に相補的な標的結合配列と、標的に相補的ではない少なくとも１つの非標的結合配列とを含む。いくつかの例では、プローブの標的結合配列は、約１２０ヌクレオチド長、または少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１１０、１２０、１２５、１４０、１５０、１６０、１７５、２００、３００、４００、５００、または５００を超えるヌクレオチド長である。いくつかの例では、標的結合配列は、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または５００以下のヌクレオチド長である。プローブの標的結合配列は、いくつかの例では、約１２０ヌクレオチド長、または約１０、１５、２０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、８５、８７、９０、９５、９７、１００、１０５、１１０、１１５、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、４００、または約５００ヌクレオチド長である。標的結合配列は、いくつかの例では、約２０～約４００ヌクレオチド長、または約３０～約１７５、約４０～約１６０、約５０～約１５０、約７５～約１３０、約９０～約１２０、または約１００～約１４０ヌクレオチド長である。プローブの非標的結合配列は、いくつかの例では、少なくとも約２０ヌクレオチド長、または少なくとも約１、約５、約１０、約１５、約１７、約２０、約２３、約２５、約５０、約７５、約１００、約１１０、約１２０、約１２５、約１４０、約１５０、約１６０、約１７５、または約１７５を超えるヌクレオチド長である。非標的結合配列はしばしば、約５以下、１０、約１５以下、約２０以下、約２５以下、約５０以下、約７５以下、約１００以下、約１２５以下、約１５０以下、約１７５以下、または約２００以下のヌクレオチド長である。プローブの非標的結合配列はしばしば、約２０ヌクレオチドの長さ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、または約２００ヌクレオチドの長さである。 いくつかの例では、非標的結合配列は、約１～約２５０ヌクレオチド長、または約２０～約２００ヌクレオチド長、約１０～約１００ヌクレオチド長、約１０～約５０ヌクレオチド長、約３０～約１００ヌクレオチド長、約５～約４０ヌクレオチド長、または約１５～約３５ヌクレオチド長である。非標的結合配列はしばしば、標的配列に相補的ではない配列を含み、および／またはプライマーと結合するために使用されない配列を含む。いくつかの例では、非標的結合配列は、単一ヌクレオチド、例えば、ポリアデニンまたはポリチミジンの繰り返しを含む。プローブはしばしば、非標的結合配列をまったく含まないか、または少なくとも１つの非標的結合配列を含む。いくつかの例では、プローブは１つまたは２つの非標的結合配列を含む。非標的結合配列は、プローブ中の１つ以上の標的結合配列に隣接することもある。例えば、非標的結合配列は、プローブの５’末端または３’末端に位置する。いくつかの例では、非標的結合配列は、分子タグまたはスペーサーに結合する。
いくつかの例では、非標的結合配列はプライマー結合部位であり得る。プライマー結合部位はそれぞれ、しばしば、少なくとも約２０ヌクレオチド長、または少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１４、少なくとも約１６、少なくとも約１８、少なくとも約２０、少なくとも約２２、少なくとも約２４、少なくとも約２６、少なくとも約２８、少なくとも約３０、少なくとも約３２、少なくとも約３４、少なくとも約３６、少なくとも約３８、または少なくとも約４０ヌクレオチド長である。いくつかの例では、各プライマー結合部位は、約１０以下、約１２以下、約１４以下、約１６以下、約１８以下、約２０以下、約２２以下、約２４以下、約２６以下、約２８以下、約３０以下、約３２以下、約３４以下、約３６以下、約３８以下、または約４０以下のヌクレオチド長である。いくつかの例では、各プライマー結合部位は、約１０～約５０ヌクレオチド長、または約１５～約４０ヌクレオチド長、約２０～約３０ヌクレオチド長、約１０～約４０ヌクレオチド長、約１０～約３０ヌクレオチド長、約３０～約５０ヌクレオチド長、または約２０～約６０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも２つのプライマー結合部位を含む。いくつかの例では、プライマー結合部位は、ユニバーサルプライマー結合部位であってもよく、ここで、すべてのプローブは、これらの部位で同一のプライマー結合配列を含む。いくつかの例では、特定の配列およびその逆相補体（例えば、ゲノムＤＮＡの領域）を標的とする一対のポリヌクレオチドプローブは、第１の標的結合配列（９０１）、第２の標的結合配列（９０２）、第１の非標的結合配列（９０３）、および第２の非標的結合配列（９０４）を含む、図９Ａの（９００）で表される。例えば、特定の配列（例えば、ゲノムＤＮＡの領域）に相補的な一対のポリヌクレオチドプローブ。
いくつかの例では、第１の標的結合配列（９０１）は、第２の標的結合配列（９０２）の逆相補体である。いくつかの例では、両方の標的結合配列は、増幅の前に化学的に合成される。代替的な配置では、特定の配列およびその逆相補体（例えば、ゲノムＤＮＡの領域）を標的とする一対のポリヌクレオチドプローブは、第１の標的結合配列（９０１）、第２の標的結合配列（９０２）、第１の非標的結合配列（９０３）、第２の非標的結合配列（９０４）、第３の非標的結合配列（９０６）、および第４の非標的結合配列（９０７）を含む、図９Ｂの（９０５）で表される。いくつかの例では、第１の標的結合配列（９０１）は、第２の標的結合配列（９０２）の逆相補体である。いくつかの例では、１つ以上の非標的結合配列は、ポリアデニンまたはポリチミジンを含む。
いくつかの例では、一対の両方のプローブは、少なくとも１つの分子タグで標識される。いくつかの例では、増幅中に（分子タグを含むプライマーを介して）分子タグをプローブに導入するためにＰＣＲが使用される。いくつかの例では、分子タグは、１以上のビオチン、葉酸、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン、または本明細書に一致する他の分子タグを含む。いくつかの例では、プローブは５’末端で標識される。いくつかの例では、プローブは３’末端で標識される。いくつかの例では、５’末端と３’末端の両方が分子タグで標識される。いくつかの例では、一対の第１のプローブの５’末端は、少なくとも１つの分子タグで標識され、一対の第２のプローブの３’末端は、少なくとも１つの分子タグで標識される。いくつかの例では、１つ以上の分子タグとプローブの核酸との間にスペーサーが存在する。いくつかの例では、スペーサーは、アルキル、ポリオール、またはポリアミノ鎖、ペプチド、またはポリヌクレオチドを含む場合がある。いくつかの例では、プローブ－標的核酸複合体をキャプチャーするために使用される固体支持体は、ビーズまたは表面である。いくつかの例では、固体支持体は、ガラス、プラスチック、または分子タグを結合するキャプチャー部分を含むことができる他の材料を含む。いくつかの例では、ビーズは磁気ビーズである。例えば、ビオチンで標識されたプローブは、ストレプトアビジンを含む磁気ビーズでキャプチャーされる。プローブを核酸のライブラリと接触させて、標的配列へのプローブの結合を可能にする。いくつかの例では、標的核酸に結合した１つ以上のアダプター配列へのプローブの結合を防止するために、ブロッキングポリ核酸が加えられる。いくつかの例では、ブロッキングポリ核酸は、１つ以上の核酸アナログを含む。いくつかの例では、ブロッキングポリ核酸は、１つ以上の位置でチミンで置換されたウラシルを有する。
本明細書に記載されるプローブは、１つ以上の標的核酸配列に結合する相補的な標的結合配列を含み得る。いくつかの例では、標的配列は任意のＤＮＡまたはＲＮＡの核酸配列である。いくつかの例では、標的配列はプローブインサート（ｐｒｏｂｅ ｉｎｓｅｒｔ）よりも長いことがある。いくつかの例では、標的配列はプローブインサートよりも短いことがある。いくつかの例では、標的配列はプローブインサートと同じ長さであり得る。例えば、標的配列の長さは、少なくともまたは少なくとも約２、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、５，０００、１２，０００、２０，０００ヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。標的配列の長さは、最大で、または最大で約２０，０００、１２，０００、５，０００、２，０００、１，０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、２ヌクレオチド、またはそれ以下であり得る。標的配列の長さは、２～２０，０００、３～１２，０００、５～５，０００、１０～２，０００、１０～１，０００、１０～５００、９～４００、１１～３００、１２～２００、１３～１５０、１４～１００、１５～５０、１６～４５、１７～４０、１８～３５、１９～２５の範囲であり得る。プローブ配列は、特定の遺伝子、疾患、調節経路、または本明細書と一致する他の生物学的機能に関連する配列を標的とすることができる。
いくつかの例では、単一のプローブインサート（１００３）は、より大きなポリ核酸（１０００）中の１つ以上の標的配列（１００２）（図１０Ａ～１０Ｇ）に相補的である。例示的な標的配列はエクソンである。いくつかの例では、１つ以上のプローブは、単一の標的配列を標的とする（図１０Ａ～１０Ｇ）。いくつかの例では、単一のプローブは、１つを超える標的配列を標的とすることができる。いくつかの例では、プローブの標的結合配列は、標的配列（１００２）と隣接配列（１００１）の両方を標的とする（図１０Ａおよび１０Ｂ）。いくつかの例では、第１のプローブは、標的配列の第１の領域と第２の領域を標的とし、第２のプローブは、標的配列の第２の領域と第３の領域を標的とする（図１０Ｄおよび図１０Ｅ）。いくつかの例では、複数のプローブは単一の標的配列を標的とし、ここで、複数のプローブの標的結合配列は、標的配列の領域に対する相補性に関して重複する１つ以上の配列を含む（図１０Ｇ）。いくつかの例では、いくつかの実施形態では、プローブインサートは、標的配列の領域に対する相補性に関して重複していない。いくつかの例では、少なくとも２、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、５０００、１２０００、２００００、または２００００を超えるプローブが単一の標的配列を標的とする。いくつかの例では、単一の標的配列を対象とする４つ以下のプローブが重複するか、または単一の標的配列を対象とする３つ以下、２つ以下、１つ以下のプローブが重複するか、または単一の標的配列を対象とするいかなるプローブも重複しない。いくつかの例では、１つ以上のプローブは、標的配列中のすべての塩基を標的とするわけではなく、１つ以上のギャップを残す（図１０Ｃと図１０Ｆ）。いくつかの例では、ギャップは、標的配列（１００５）の中央付近にある（図１０Ｆ）。いくつかの例では、ギャップ（１００４）は、標的配列の５’末端または３’末端にある（図１０Ｃ）。いくつかの例では、ギャップは６ヌクレオチド長である。いくつかの例では、ギャップは、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、２０以下、３０以下、４０以下、または５０以下のヌクレオチド長である。いくつかの例では、ギャップは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または少なくとも５０ヌクレオチド長である。いくつかの例では、ギャップの長さは、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、１～１０、２～３０、２～２０、２～１０、３～５０、３～２５、３～１０、または３～８ヌクレオチド長の範囲内である。いくつかの例では、配列を標的とするプローブのセットは、相補的な配列にハイブリダイズしたときに、そのセット中のプローブ間に重複する領域を含まない。いくつかの例では、配列を標的とするプローブのセットは、相補的な配列にハイブリダイズしたときに、そのセット中のプローブ間にはギャップがない。プローブは、標的配列への均一な結合を最大化するように設計されてもよい。いくつかの例では、プローブは、高または低ＧＣ含有量、二次構造、反復配列／回文配列、またはプローブが標的に結合するのを妨げる可能性のある他の配列特徴の標的結合配列を最小限に抑えるように設計される。いくつかの例では、単一のプローブは、複数の標的配列を標的とすることができる。
本明細書に記載されるプローブライブラリは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、または１，０００，０００を超えるプローブを含んでいてもよい。プローブライブラリは、１０以下、２０以下、５０以下、１００以下、２００以下、５００以下、１，０００以下、２，０００以下、５，０００以下、１０，０００以下、２０，０００以下、５０，０００以下、１００，０００以下、２００，０００以下、５００，０００以下、または１，０００，０００，０００以下のプローブを含み得る。プローブライブラリは、１０～５００、２０～１０００、５０～２０００、１００～５０００、５００～１０，０００、１，０００～５，０００、１０，０００～５０，０００、１００，０００～５００，０００、または５０，０００～１，０００，０００のプローブを含み得る。プローブライブラリは、約３７０，０００；４００，０００；５００，０００、またはそれ以上の様々なプローブを含み得る。
次世代シーケンシングの適用
ポリヌクレオチドライブラリの下流の適用は、次世代シーケンシングを含み得る。例えば、制御された化学量論のポリヌクレオチドプローブライブラリによる標的配列の濃縮は、より効率的なシーケンシングをもたらす。標的をキャプチャーするか、または標的にハイブリダイズするためのポリヌクレオチドライブラリのパフォーマンスは、効率、正確さ、および精度を説明する多くの異なる測定基準によって定義されてもよい。例えば、Ｐｉｃａｒｄ測定基準は、ＨＳライブラリサイズ（リードペアから計算された、標的領域に対応するライブラリ中の固有の分子の数）、平均の標的カバレッジ（特定のカバレッジレベルに達する塩基の割合）、カバレッジ深度（所与のヌクレオチドを含むリードの数）、フォールドエンリッチメント（ｆｏｌｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（総試料に対してマッピングする標的／リードに対して一意にマッピングする配列リードに、総サンプルの長さ／標的の長さをかけたもの）、オフベイト塩基パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆｆ－ｂａｉｔ ｂａｓｅｓ）（プローブ／ベイトの塩基に対応しない塩基のパーセント）、オフターゲットパーセント（対象の塩基に対応しない塩基のパーセント）、標的上の使用可能な塩基、ＡＴあるいはＧＣのドロップアウト率、ｆｏｌｄ－８０ ｂａｓｅ ｐｅｎａｌｔｙ（０ではない標的の８０パーセントを平均カバレッジレベルに上げるのに必要なフォールドオーバーカバレッジ（ｆｏｌｄ ｏｖｅｒ－ｃｏｖｅｒａｇｅ））、パーセントゼロカバレッジ標的、ＰＦリード（クオリティーフィルター（ｑｕａｌｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したリードの数）、選択された塩基のパーセント（オンベイト塩基（ｏｎ－ｂａｉｔ ｂａｓｅｓ）とニアベイト塩基（ｎｅａｒ－ｂａｉｔ ｂａｓｅｓ）の総数を、位置合わせされた塩基の総数で割ったもの）、重複パーセント、または明細書と一致する他の変数などの変数を含む。
リード深度（シーケンシング深度、またはサンプリング）は、配列に対して配列決定された核酸断片（「リード」）が得られる総回数を表す。理論的なリード深度は、理想的なゲノム全体にリードが完全に分布されていると仮定して、同じヌクレオチドが読み取られる期待回数として定義される。リード深度は、カバレッジ率（または、カバレッジ幅）の関数として表される。例えば、完全に分布された１００万塩基のゲノムの１，０００万のリードは、理論的には配列の１００％の１０倍のリード深度をもたらす。実際には、標的配列の割合について所望のリード深度を得るためには、より多くのリード（より高い理論的なリード深度、またはオーバーサンプリング）が必要となることがある。制御された化学量論的プローブライブラリを用いて標的配列を濃縮すると、下流のシーケンシングの効率が向上する。なぜなら、標的配列の所望の％に対して許容可能なリード数を有する結果を得るために、より少ない総リード数が必要となるためである。例えば、いくつかの例では、標的配列の５５倍の理論的なリード深度は、配列の少なくとも９０％の少なくとも３０倍のカバレッジをもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５倍以下の理論的なリード深度は、配列の少なくとも８０％の少なくとも３０倍のリード深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５倍以下の理論的なリード深度は、配列の少なくとも９５％の少なくとも３０倍のリード深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５倍以下の理論的なリード深度は、配列の少なくとも９８％の少なくとも１０倍のリード深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５倍の理論的なリード深度は、配列の少なくとも９８％の少なくとも２０倍のリード深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５倍以下の理論的なリード深度は、配列の少なくとも９８％の少なくとも５倍のリード深度をもたらす。標的とのハイブリダイゼーション中にプローブの濃縮を増加させると、リード深度が増加し得る。いくつかの例では、プローブの濃度を少なくとも１．５倍、２．０倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、または５倍以上増加させる。いくつかの例では、プローブの濃度を増加させると、リード深度の少なくとも１０００％の増加、または２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、５００％、７５０％、１０００％、または１０００％を超える増加がもたらされる。いくつかの例では、プローブの濃度を３倍増加させると、リード深度は１００００％増加する。
オンターゲット率は、所望の標的配列に一致するシーケンシングリードの割合を表す。いくつかの例では、制御された化学量論的ポリヌクレオチドプローブライブラリは、少なくとも３０％、または少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または少なくとも９０％のオンターゲット率をもたらす。ターゲット核酸との接触中にポリヌクレオチドプローブの濃度を増加させると、オンターゲット率が増加する。いくつかの例では、プローブの濃度が、少なくとも１．５倍、２．０倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、または５倍以上増加される。いくつかの実施形態では、プローブ濃度が増加すると、オンターゲット結合が少なくとも２０％増加するか、または１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、または少なくとも５００％増加する。いくつかの例では、プローブの濃度が３倍増加すると、オンターゲット率が２０％増加する。
カバレッジ均一性は、場合によっては、標的配列同一性の関数としてのリード深度として計算される。より高いカバレッジ均一性により、所望のリード深度を得るために必要とされるシーケンシングリードの数がより少なくなる。例えば、標的配列の特性は、リード深度、例えば、高または低ＧＣまたはＡＴ含有量、反復配列、後方の（ｔｒａｉｌｉｎｇ）アデニン、二次構造、標的配列結合に対する親和性（増幅、濃縮、または検出のための）、安定性、融解温度、生物活性、より大きな断片へと集合する能力、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む配列、またはポリヌクレオチドの他の任意の特性に影響を与える可能性がある。制御された化学量論ポリヌクレオチドプローブライブラリを用いて標的配列を濃縮すると、シーケンシング後により高いカバレッジ均一性が得られる。いくつかの例では、配列の９５％は、平均ライブラリリード深度の約１倍以内、または平均ライブラリリード深度の約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７、１、１．２、１．５、１．７、または約２倍以内であるリード深度を有する。いくつかの例では、配列の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が、平均の１倍以内であるリード深度を有する。
ポリヌクレオチドプローブライブラリを用いた標的核酸の濃縮
本明細書に記載されるプローブライブラリは、様々な下流の適用のために、試料ポリヌクレオチドの集団中に存在する標的ポリヌクレオチドを濃縮するために使用され得る。あるいくつかの例では、試料が１つ以上のソースから得られ、試料ポリヌクレオチドの集団が単離される。試料は、唾液、血液、組織、皮膚、または完全に合成されたソースなどの生物学的ソースから（非限定的な例として）得られる。試料から得られた複数のポリヌクレオチドは、断片化され、末端修復され、およびアデニル化されて、二本鎖試料核酸断片を形成する。いくつかの例では、末端修復は、適切な緩衝液中でのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ酵素、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの１つ以上の酵素による処理によって達成される。アダプターへのライゲーションを容易にするためのヌクレオチドオーバーハングが、いくつかの例では、３’～５’エキソマイナスクレノウ断片（ｅｘｏ ｍｉｎｕｓ ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）およびｄＡＴＰとともに加えられる。
アダプター（ユニバーサルアダプターなど）は、試料ポリヌクレオチド断片の両端に、Ｔ４リガーゼなどのリガーゼを用いてライゲートして、アダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖のライブラリを生成することができ、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリは、ユニバーサルプライマーなどのプライマーを用いて増幅される。いくつかの例では、アダプターは、１つ以上のプライマー結合部位、１つ以上の移植領域、および１つ以上のインデックス（または、バーコード）領域を含むＹ字型アダプターである。いくつかの例では、１つ以上のインデックス領域は、アダプターの各鎖に存在する。いくつかの例では、移植領域は、フローセル表面に相補的であり、試料ライブラリの次世代シーケンシングを容易にする。いくつかの例では、Ｙ字型アダプターは、部分的に相補的な配列を含む。いくつかの例では、Ｙ字型アダプターは、二本鎖アダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖のオーバーハングアデニンにハイブリダイズする単一のチミジンオーバーハングを含む。Ｙ字型アダプターは、切断に抵抗性のある修飾核酸を含み得る。例えば、ホスホロチオエートバックボーンは、オーバーハングチミジンをアダプターの３’末端に取り付けるために使用される。ユニバーサルプライマーが使用される場合、バーコード化プライマーをアダプターに加えるために、ライブラリの増幅が実施される。いくつかの例では、濃縮ワークフローが図７に示される。二本鎖のアダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖（７０１）のライブラリ（７００）がハイブリッド対（７０４）と接触して、ポリヌクレオチドプローブ（７０２）が形成される。そのような対は、ハイブリダイズされていない断片から分離され（７０５）、プローブ（７０６）から単離され、濃縮されたライブラリ（７０７）が生成される。
次に、二本鎖試料核酸断片のライブラリを、アダプターブロッカー（ａｄａｐｔｅｒ ｂｌｏｃｋｅｒｓ）の存在下で変性させる。アダプターブロッカーは、アダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖上に（標的配列の代わりに）存在するアダプター配列へのプローブのオフターゲットハイブリダイゼーションを最小限に抑え、および／またはアダプターの分子間ハイブリダイゼーション（すなわち、「デイジーチェーニング（ｄａｉｓｙ ｃｈａｉｎｉｎｇ）」）を防ぐ。変性は、いくつかの例では、９６℃で、または約８５℃、約８７℃、約９０℃、約９２℃、約９５℃、約９７℃、約９８℃、または約９９℃で実施される。ポリヌクレオチド標的化ライブラリ（プローブライブラリ）は、いくつかの例では、９６℃で、または約８５℃、約８７℃、約９０℃、約９２℃、約９５℃、約９７℃、約９８℃、または約９９℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で変性される。変性されたアダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリおよびハイブリダイゼーション溶液は、プローブがそれらの相補的な標的配列とハイブリダイズすることを可能にするために、適切な時間および適切な温度でインキュベートされる。いくつかの例では、適切なハイブリダイゼーション温度は、約４５～８０℃、または少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８℃５、または少なくとも９０℃である。いくつかの例では、ハイブリダイゼーション温度は７０℃である。いくつかの例では、好適なハイブリダイゼーション時間は、１６時間、または少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１４時間、少なくとも１６時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも２２時間、または２２時間以上、または約１２～２０時間である。その後、結合緩衝液を、ハイブリダイズされたアダプタータグ付きポリヌクレオチドプローブに加え、キャプチャー部分を含む固体支持体を使用して、ハイブリダイズされたアダプタータグ付きポリヌクレオチドプローブを選択的に結合する。固体支持体を緩衝液で洗浄して未結合のポリヌクレオチドを除去した後、溶出緩衝液を添加して、濃縮されたタグ付きポリヌクレオチド断片を固体支持体から放出する。いくつかの例では、固体支持体を、２回洗浄するか、または１回、２回、３回、４回、５回、あるいは６回洗浄する。アダプタータグ付きポリヌクレオチド断片の濃縮されたライブラリを増幅し、その濃縮されたライブラリを配列決定する。
複数の核酸（すなわち、ゲノム配列）を試料から得て、断片化し、随意に末端修復し、アデニル化してもよい。アダプターをポリヌクレオチド断片の両端にライゲートしてアダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖のライブラリを生成し、そのアダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリを増幅する。その後、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリを、アダプターブロッカーの存在下で、高温、好ましくは９６℃で変性させる。ポリヌクレオチド標的化ライブラリ（プローブライブラリ）を、高温、好ましくは約９０～９９℃でハイブリダイゼーション溶液中で変性させ、約４５～８０℃で約１０～２４時間、ハイブリダイゼーション溶液中で変性させたタグ付きポリヌクレオチドライブラリと組み合わせる。その後、結合緩衝液を、ハイブリダイズされたタグ付きポリヌクレオチドプローブに添加し、キャプチャー部分を含む固体支持体を用いて、ハイブリダイズされたアダプタータグ付きポリヌクレオチドプローブを選択的に結合する。固体支持体を緩衝液で１回以上、好ましくは約２回および約５回洗浄して未結合のポリヌクレオチドを除去した後、溶出緩衝液を添加して、濃縮されたアダプタータグ付きポリヌクレオチド断片を固体支持体から放出する。アダプタータグ付きポリヌクレオチド断片の濃縮されたライブラリを増幅し、その後、ライブラリを配列決定する。インキュベーション時間、温度、反応量／濃度、洗浄回数、または本明細書に一致する他の変数などの代替的な変数も、本方法において採用される。
例のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドの検出または定量化分析は、シーケンシングによって達成され得る。サブユニットまたは合成されたオリゴヌクレオチド全体は、当該技術分野で既知のいずれかの適切な方法、例えば、本明細書に記載されるシーケンシング方法を含むＩｌｌｕｍｉｎａの合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、ＰａｃＢｉｏナノポアシーケンシング、またはＢＧＩ／ＭＧＩナノボールシーケンシングによる、すべてのオリゴヌクレオチドの完全なシーケンシングによって検出することができる。
シーケンシングは、当該技術分野で周知の古典的なサンガーシーケンシング方法を介して達成され得る。シーケンシングはまた、ハイスループットシステムを使用して達成されてもよく、そのシステムのいくつかは、成長する鎖に組み込まれた直後または組み込まれる際に、配列決定されたヌクレオチドの検出、すなわち、読み取られた時間または実質的にリアルタイムでの配列の検出を可能にする。場合によっては、ハイスループットシーケンシングは、１時間につき少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、または少なくとも５００，０００の配列リードを生成し；各リードは、１リード当たり、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、または少なくとも１５０塩基対である。
いくつかの例では、ハイスループットシーケンシングは、ＨｉＳｅｑ ２５００、ＨｉＳｅｑ １５００、ＨｉＳｅｑ ２０００、ＨｉＳｅｑ １０００、ｉＳｅｑ １００、Ｍｉｎｉ Ｓｅｑ、ＭｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０、ＮｅｘｔＳｅｑ ２０００、ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０、またはＮｏｖａＳｅｑ ６０００を使用するものなど、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩＸ、ＭｉＳｅｑ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、またはＨｉＳｅｑ ｓｙｓｔｅｍｓによって利用可能な技術の使用を含む。これらの機械は、合成化学による可逆的なターミネーターベースのシーケンシングを使用する。これらの機械は、１３～４４時間で、６０００Ｇｂまたはそれより多くのリードを生成することができる。３日、２日、１日、またはそれより少ない時間内でのランのために、より小さなシステムが利用されてもよい。シーケンシングの結果を得るのにかかる時間を最小限にするために、短い合成サイクルが使用されてもよい。
いくつかの例では、ハイスループットシーケンシングは、ＡＢＩ Ｓｏｌｉｄ Ｓｙｓｔｅｍにより利用可能な技術の使用を含む。この遺伝子解析プラットフォームは、ビーズに連結した、クローン的に増幅されたＤＮＡ断片の超並列シーケンシングを可能にする。シーケンシングの方法論は、色素で標識されたオリゴヌクレオチドとの連続的なライゲーションに基づく。
次世代シーケンシングは、（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）の技術を使用する）イオン半導体シーケンシングを含み得る。イオン半導体シーケンシングは、ヌクレオチドがＤＮＡの鎖へ組み込まれる時にイオンが放出され得るという事実を利用することができる。イオン半導体シーケンシング定を行なうために、微細加工されたウェルの高密度アレイを形成することができる。各ウェルは、単一のＤＮＡ鋳型を保持することができる。ウェルの下にはイオン感受性の層がある場合があり、イオン感受性の層の下にはイオンセンサーがある場合がある。ヌクレオチドがＤＮＡに加えられると、Ｈ＋が放出され、ｐＨの変化として測定され得る。Ｈ＋イオンは電圧に変換され、半導体センサーによって記録され得る。アレイチップは、１つのヌクレオチドで連続して満たされる（ｆｌｏｏｄｅｄ）場合がある。走査、光、またはカメラは必要としない。場合によっては、核酸を配列決定するためにＩＯＮＰＲＯＴＯＮ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒが使用される。場合によっては、ＩＯＮＰＧＭ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒが使用される。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）は、２時間で１０００万の読み取りを行うことができる。
［０５４５］
いくつかの実施形態では、ハイスループットシーケンシングは、合成による単一分子シーケンシング（Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＭＳＳ）の方法など、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）によって利用可能な技術の使用を含む。ＳＭＳＳは、最大２４時間でヒトゲノム全体のシーケンシングを可能にするのでユニークである。最終的に、ＳＭＳＳは、ＭＷ技術のように、ハイブリダイゼーション前に前増幅工程を必要としないため、強力である。実際、ＳＭＳＳは増幅を必要としない。ＳＭＳＳは、米国特許出願公開第２００６００２４７１ Ｉ号；第２００６００２４６７８号；第２００６００１２７９３号；第２００６００１２７８４号；および第２００５０１００９３２号に部分的に記載されている。
［０５４６］
いくつかの実施形態では、ハイスループットシーケンシングは、器具内のＣＣＤカメラによって記録される、シーケンシング反応によって生成された化学発光シグナルを送信するファイバオプティックプレートを含む、Ｐｉｃｏ Ｔｉｔｅｒ Ｐｌａｔｅ装置など、４５４ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．）から利用可能な技術の使用を包含している。このファイバーオプティクスを使用すると、４．５時間で最低限２０００万の塩基対の検出が可能になる。
［０５４７］
ビーズ増幅とそれに続くファイバーオプティクス検出を使用するための方法は、Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．“Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ ｒｅａｃｔｏｒｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３９５９；ならびに、米国特許出願公開第２００２００１２９３０号；第２００３００５８６２９号；第２００３０１００１０２号；第２００３０１４８３４４号；第２００４０２４８１６１号；第２００５００７９５１０号；第２００５０１２４０２２号；および、第２００６００７８９０９号に記載されている。
いくつかの例では、ハイスループットシーケンシングは、Ｃｌｏｎａｌ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ，Ｉｎｃ．）、または可逆的ターミネーター化学を利用する、合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）を使用して行なわれる。これらの技術は、米国特許第６，９６９，４８８号；第６，８９７，０２３号；第６，８３３，２４６号；第６，７８７，３０８号；および、米国特許出願公開第２００４０１０６１３０号；第２００３００６４３９８号；第２００３００２２２０７号；および、Ｃｏｎｓｔａｎｓ，Ａ．，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ２００３，１７（１３）：３６に記載されている。オリゴヌクレオチドのハイスループットシーケンシングは、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｌｃｙｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどによって市販されているものなど、当該技術分野で既知の任意の適切な配列方法を使用して、達成され得る。他のハイスループットシーケンシングシステムには、Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００１；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４ Ｍａｒｃｈ ２０００；および、Ｍ．Ｊ，Ｌｅｖｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：６８２－６８６，Ｊａｎｕａｒｙ ２００３；ならびに、米国特許出願公開第２００３００４４７８１号および第２００６／００７８９３７号に開示されるものが含まれる。全体として、このようなシステムは、オリゴヌクレオチドの分子上で測定された重合反応を介して、塩基の時間的付加によって複数の塩基を有する標的オリゴヌクレオチド分子を配列決定すること、すなわち、配列決定される鋳型オリゴヌクレオチド分子上の核酸重合酵素の活性をリアルタイムで追跡することを含む。その後、塩基付加の配列における各工程での核酸重合酵素の触媒活性によって、標的オリゴヌクレオチドの成長している相補鎖にどの塩基が組み入れられているかを同定することにより、配列が推定され得る。標的オリゴヌクレオチド分子複合体上のポリメラーゼが、標的オリゴヌクレオチド分子に沿って移動し、かつ活性部位でオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するのに適切な位置で提供される。複数の標識型のヌクレオチドアナログが活性部位のすぐ近くに提供され、各識別可能型のヌクレオチドアナログが、標的オリゴヌクレオチド配列中の異なるヌクレオチドに対して相補的である。成長しているオリゴヌクレオチド鎖は、ポリメラーゼを使用して、活性部位でオリゴヌクレオチド鎖にヌクレオチドアナログを付加することによって伸長し、ここで、付加されたヌクレオチドアナログは、活性部位の標的オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに相補的である。重合工程の結果としてオリゴヌクレオチドプライマーに付加されたヌクレオチドアナログが、同定される。標識されたヌクレオチドアナログを提供する工程、成長しているオリゴヌクレオチド鎖を重合する工程、および付加されたヌクレオチドアナログを同定する工程が繰り返され、その結果、オリゴヌクレオチド鎖がさらに伸長し、標的オリゴヌクレオチドの配列が測定される。
次世代シーケンシング技術は、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるリアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術を含む場合がある。ＳＭＲＴにおいて、４つのＤＮＡ塩基の各々が、４つの異なる蛍光色素の１つに結合される場合がある。これらの色素はホスホ結合され得る。単一のＤＮＡポリメラーゼは、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）の底部にある鋳型の一本鎖ＤＮＡの単一分子で固定され得る。ＺＭＷは、（マイクロ秒で）ＺＭＷ内およびＺＭＷ外で急速に拡散することができる蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対する、ＤＮＡポリメラーゼによる単一のヌクレオチドの組み込みの観察を可能にする、閉じ込め構造であってもよい。成長している鎖にヌクレオチドを組み込むには、数ミリ秒かかる場合がある。この間に、蛍光標識を励起して蛍光シグナルを生成し、蛍光タグを切断することができる。ＺＭＷは下から照らすことができる。励起ビームからの減衰光は、各ＺＭＷの下部２０～３０ｎｍを透過することができる。２０ゼプトリットル（１０”リットル）の検出限界を持つ顕微鏡が作成され得る。小さな検出量により、バックグラウンドノイズの減少を１０００倍改善することができる。色素の対応する蛍光を検出すると、どの塩基が組み込まれたのかを示すことができる。このプロセスは繰り返され得る。
場合によっては、次世代シーケンシングは、ナノポアシーケンシングである（例えば、Ｓｏｎｉ Ｇ Ｖ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ Ａ．（２００７）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３：１９９６－２００１を参照）。ナノポアは、直径約１ナノメートルほどの小さな穴であり得る。導電性流体にナノポアを浸漬すること、およびそれにわたって電位を印加することで、ナノポアを介したイオンの伝導により、僅かな電流を結果としてもたらすことができる。流れる電流の量はナノポアの大きさに敏感であり得る。ＤＮＡ分子がナノポアを通ると、ＤＮＡ分子上のヌクレオチドはそれぞれ、異なる程度にナノポアを塞ぐことができる。ゆえに、ＤＮＡ分子がナノポアを通る際のナノポアを通る電流の変化は、ＤＮＡ配列の読み取りを表すことができる。ナノポアシーケンシング技術は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのもの、例えば、ＧｒｉｄＩＯＮ ｓｙｓｔｅｍであってもよい。単一のナノポアは、マイクロウェルの上部にわたる高分子膜に挿入され得る。マイクロウェルはそれぞれ、個別に感知するための電極を有し得る。マイクロウェルは、１つのチップ当たり１００，０００以上（例えば、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、または１，０００，０００より多い）のマイクロウェルを備えた、アレイチップへと組み立てられ得る。機器（または、ノード）がチップを解析するために使用されてもよい。データはリアルタイムで解析され得る。１つ以上の機器が一度に操作されてもよい。ナノポアは、タンパク質ナノポア、例えば、タンパク質アルファ溶血素、七量体タンパク質ポアであってもよい。ナノポアは、ソリッドステートナノポアで出来ており、例えば、合成膜（例えば、ＳｉＮｘまたはＳｉＯ２）内に形成されるナノメートルサイズの穴であり得る。ナノポアは、ハイブリッドポア（例えば、ソリッドステート膜へのタンパク質ポアの統合）であってもよい。ナノポアは、統合されたセンサー（例えば、トンネリング電極検出器、容量性検出器、またはグラフェンベースのナノギャップ、またはエッジ状態検出器（ｅｄｇｅ ｓｔａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ）（例えば、Ｇａｒａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．６７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９３７９を参照）を備えたナノポアであってもよい。ナノポアは、特定の型の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）を解析するために官能化されてもよい。ナノポアシーケンシングは「鎖シーケンシング」を含むことができ、鎖シーケンシングでは、完全なＤＮＡポリマーをタンパク質ナノポアに通過させ、ＤＮＡがそのタンパク質ナノポアを移動する際にリアルタイムで配列決定することができる。酵素は二本鎖ＤＮＡの鎖を分離し、ナノポアを介して鎖を与えることができる。ＤＮＡは一方の末端でヘアピンを有することができ、システムは両方の鎖を読み取ることができる。場合によっては、ナノポアシーケンシングは、「エキソヌクレアーゼシーケンシング」であり、エキソヌクレアーゼシーケンシングでは、個々のヌクレオチドを前進型エキソヌクレアーゼによってＤＮＡ鎖から切断することができ、ヌクレオチドはタンパク質ナノポアを通過することができる。ヌクレオチドは、ポア内の分子（例えば、シクロデキストラン）に一過的に結合することができる。電流の特徴的な断絶を利用して、塩基を同定することができる。
ＧＥＮＩＡのナノポアシーケンシング技術が使用されてもよい。操作したタンパク質ポアを、脂質二重層の膜に包埋することができる。「能動的制御」技術を使用して、効果的なナノポア－膜アセンブリを可能にし、チャネルを介したＤＮＡの運動を制御することができる。場合によっては、ナノポアシーケンシング技術は、ＮＡＢｓｙｓからのものである。ゲノムＤＮＡは、平均長約１００ｋｂの鎖に断片化され得る。１００ｋｂの断片を一本鎖にし、その後、６ｍｅｒのプローブでハイブリダイズさせることができる。プローブを有するゲノム断片は、ナノポアを通り抜けることができ、電流対時間のトレースを作り出すことができる。電流トレースにより、各ゲノム断片上のプローブ位置を提供することができる。ゲノム断片を並べて、ゲノムに対するプローブマップを作成することができる。このプロセスは、プローブのライブラリに対して並列して行うことができる。各プローブに対するゲノム長のプローブマップを生成することができる。エラーは、「ｍｏｖｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ｍｗＳＢＨ）」と名付けられたプロセスを用いて修正することができる。場合によっては、ナノポアシーケンシング技術は、ＩＢＭ／Ｒｏｃｈｅからのものである。電子ビームを使用して、マイクロチップにナノポアサイズの開口部を作ることができる。電界を使用して、ＤＮＡを、ナノポアを介して引き寄せるか、またはナノポアに通すことができる。ナノポアにおけるＤＮＡトランジスタ装置は、金属と誘電体が交互になったナノメートルサイズの層を含むことができる。ＤＮＡ骨格における別個の電荷を、電界によってＤＮＡナノポアの内部に閉じ込めることができる。ゲート電圧をオフおよびオンにすると、ＤＮＡ配列を読み取ることができる。
次世代シーケンシングは、（例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（例えば、Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：７８－８１を参照）によって実施されるような）ＤＮＡナノボールシーケンシングを含み得る。ＤＮＡを単離し、断片化し、サイズ選択することができる。例えば、ＤＮＡは、約５００ｂｐの平均長に（例えば、超音波処理によって）断片化することができる。アダプター（Ａｄｌ）を、断片の末端に結合することができる。シーケンシング反応のためのアンカーにハイブリダイズするために、アダプターを使用することができる。各末端に結合したアダプターを持つＤＮＡをＰＣＲ増幅することができる。相補的一本鎖末端が互いに結合して環状ＤＮＡを形成するように、アダプター配列を改変することができる。ＤＮＡをメチル化して、その後の工程で使用されるＩＩＳ型制限酵素による切断からそのＤＮＡを保護することができる。アダプター（例えば、右アダプター）は制限認識部位を有することができ、制限認識部位は非メチル化されたままであってもよい。アダプター中のメチル化されていない制限認識部位は、制限酵素（例えば、Ａｃｕｌ）によって認識されることができ、ＤＮＡは、Ａｃｕｌによって右アダプターの右側１３ｂｐで切断されて、線状二本鎖ＤＮＡを形成することができる。第２ラウンドの右アダプターと左アダプター（Ａｄ２）を、線状ＤＮＡのいずれかの末端にライゲートすることができ、両方のアダプターが結合しているＤＮＡはすべて、（例えば、ＰＣＲによって）ＰＣＲ増幅することができる。Ａｄ２配列は、それらが互いに結合して環状ＤＮＡを形成できるように改変され得る。ＤＮＡはメチル化することができるが、制限酵素認識部位は、左Ａｄ１アダプター上でメチル化されないままであってもよい。制限酵素（例えば、Ａｃｕｌ）を適用することができ、ＤＮＡは、Ａｄ１の左側１３ｂｐで切断され、線状ＤＮＡ断片を形成することができる。第３ラウンドの右アダプターと左アダプター（Ａｄ３）を、線状ＤＮＡの右側面および左側面にライゲートすることができ、結果として生じる断片をＰＣＲ増幅することができる。アダプターは、互いに結合して環状ＤＮＡを形成することができるように改変され得る。ＩＩＩ型制限酵素（例えば、ＥｃｏＰ１５）を加えてもよく；ＥｃｏＰ１５は、Ａｄ３の左側２６ｂｐと、Ａｄ２の右側２６ｂｐでＤＮＡを切断することができる。この切断により、ＤＮＡの大きなセグメントが取り除かれ、ＤＮＡを再び線状化することができる。第４ラウンドの右アダプターと左のアダプター（Ａｄ４）をＤＮＡにライゲートすることができ、ＤＮＡを（例えば、ＰＣＲによって）増幅して、それらが互いに結合して完成した環状ＤＮＡ鋳型を形成するように改変することができる。
（例えば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用する）ローリングサークル複製を使用して、ＤＮＡの小さな断片を増幅することができる。４つのアダプター配列は、ハイブリダイズできるパリンドローム配列を含有することができ、一本鎖は、それ自体の上へと折りたたまれて、平均で直径およそ２００～３００ナノメートルであり得るＤＮＡナノボール（ＤＮＢ（商標））を形成することができる。ＤＮＡナノボールは、マイクロアレイ（シーケンシングフローセル）に付着させることができる（例えば、吸着によって）。フローセルは、二酸化ケイ素、チタン、およびヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）、ならびにフォトレジスト材料でコーティングされたシリコンウェーハであってもよい。シーケンシングは、ＤＮＡに蛍光プローブをライゲートすることにより連鎖しないシーケンシングによって、実施することができる。問い合わせられた（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ）位置の蛍光の色は、高解像度カメラによって可視化することができる。アダプター配列間のヌクレオチド配列の同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチドの集団は、アダプターライゲーション前に濃縮されてもよい。一実施例では、ポリヌクレオチドの集団を試料から得て、断片化し、随意に末端修復し、高温、好ましくは９０～９９℃で変性させる。ポリヌクレオチド標的化ライブラリ（プローブライブラリ）を、高温、好ましくは約９０～９９℃でハイブリダイゼーション溶液中で変性させ、約４５～８０℃で約１０～２４時間、ハイブリダイゼーション溶液中で変性させたタグ付きポリヌクレオチドライブラリと組み合わせる。その後、結合緩衝液を、ハイブリダイズされたタグ付きポリヌクレオチドプローブに添加し、キャプチャー部分を含む固体支持体を用いて、ハイブリダイズされたアダプタータグ付きポリヌクレオチドプローブを選択的に結合させる。固体支持体を緩衝液で１回以上、好ましくは約２回および約５回洗浄して未結合のポリヌクレオチドを除去した後、溶出緩衝液を添加して、濃縮されたアダプタータグ付きポリヌクレオチド断片を固体支持体から放出する。その後、濃縮されたポリヌクレオチド断片をポリアデニル化し、アダプターをポリヌクレオチド断片の両端にライゲートしてアダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖のライブラリを生成し、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリを増幅する。次いで、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリを配列決定する。
望ましくない断片にハイブリダイズすることによって、複数のポリヌクレオチドから望ましくない配列をフィルタリングするために、ポリヌクレオチド標的化ライブラリを使用してもよい。例えば、複数のポリヌクレオチドを試料から得て、断片化し、随意に末端修復し、アデニル化する。アダプターをポリヌクレオチド断片の両端にライゲートしてアダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖のライブラリを生成し、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリを増幅する。代替的に、試料ポリヌクレオチドの濃縮後に、アデニル化とアダプターのライゲーション工程がその代りに実施される。その後、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリを、アダプターブロッカーの存在下で、高温、好ましくは９０～９９℃で変性させる。望ましくない非標的配列を除去するように設計されたポリヌクレオチドフィルタリングライブラリ（プローブライブラリ）を、高温、好ましくは約９０～９９℃でハイブリダイゼーション溶液中で変性させ、約４５～８０℃で約１０～２４時間、ハイブリダイゼーション溶液中で変性させたタグ付きポリヌクレオチドライブラリと組み合わせる。その後、結合緩衝液を、ハイブリダイズされたタグ付きポリヌクレオチドプローブに添加し、キャプチャー部分を含む固体支持体を用いて、ハイブリダイズされたアダプタータグ付きポリヌクレオチドプローブを選択的に結合させる。固体支持体を緩衝液で１回以上、好ましくは約１回および約５回洗浄して、未結合アダプタータグ付きポリヌクレオチド断片を溶出させる。未結合アダプタータグ付きポリヌクレオチド断片の濃縮されたライブラリを増幅し、その後、増幅されたライブラリを配列決定する。
高並列デノボ核酸合成
革新的な合成プラットフォームを作成するための、シリコン上のナノウェル内でのポリヌクレオチド合成から遺伝子アセンブリまでのエンド・ツー・エンドプロセスの小型化、並列化、および垂直統合を利用するプラットフォームアプローチが、本明細書で提供される。本明細書に記載される装置には９６ウェルのプレートと同じフットプリントが設けられ、シリコン合成プラットフォームは、従来の合成方法と比較してスループットを１００～１，０００倍増加させることができ、１回の高並列化されたランで最大でおよそ１，０００，０００のポリヌクレオチドを産生する。いくつかの例では、本明細書に記載される単一のシリコンプレートは、約６，１００の非同一ポリヌクレオチドの合成を提供する。いくつかの例では、非同一ポリヌクレオチドの各々は、クラスター内に位置する。クラスターは、５０～５００の非同一ポリヌクレオチドを含む場合がある。
本明細書に記載される方法は、少なくとも１つのあらかじめ定められた参照核酸配列のあらかじめ定められた変異体をそれぞれコードするポリヌクレオチドのライブラリの合成を提供する。場合によっては、あらかじめ決められた参照配列はタンパク質をコードする核酸配列であり、変異体ライブラリは、合成された核酸によってコードされたその後のタンパク質中の単一の残基の複数の異なる変異体が標準的な翻訳プロセスによって生成されるように、少なくとも１つのコドンの変異をコードする配列を含む。核酸配列中の合成された特異的な変化は、ヌクレオチド変化を、重複または平滑端のポリヌクレオチドプライマーに組み入れることによって導入することができる。代替的に、ポリヌクレオチドの集団は、長い核酸（例えば、遺伝子）およびその変異体をまとめてコードすることもある。この配置では、ポリヌクレオチドの集団をハイブリダイズして標準的な分子生物学技術に供することで、長い核酸（例えば、遺伝子）およびその変異体を形成することができる。長い核酸（例えば、遺伝子）およびその変異体が細胞中で発現される場合、異なるタンパク質ライブラリが生成される。同様に、ＲＮＡ配列（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）またはＤＮＡ配列（例えば、エンハンサー、プロモーター、ＵＴＲ、およびターミネーター領域）をコードする変異体ライブラリの合成のための方法が本明細書で提供される。さらに、本明細書に記載される方法を用いて合成されたライブラリから選択された変異体の下流の適用も本明細書で提供される。下流の適用としては、向上した生物学的に関連する機能、例えば、生化学的な親和性、酵素活性、細胞活性の変化を持つとともに、病状の処置または予防を目的とする変異体核酸あるいはタンパク質配列の同定が挙げられる。
基板
複数のクラスターを含む基板が本明細書で提供され、ここで、クラスターはそれぞれ、ポリヌクレオチドの結合および合成を支持する複数の座を含む。本明細書で使用される場合、「座」という用語は、表面から伸長する単一のあらかじめ定められた配列をコードするポリヌクレオチドを支持する構造上の別個の領域を指す。いくつかの例では、座は、二次元表面、例えば、実質的に平らな表面上にある。いくつかの例では、座は、表面上の別個の隆起部位または沈降部位、例えば、ウェル、マイクロウェル、チャネル、またはポストを指す。いくつかの例では、座の表面は、ポリヌクレオチド合成のための少なくとも１つのヌクレオチド、または、好ましくは、ポリヌクレオチドの集団の合成のための同一のヌクレオチドの集団に結合する、活発に官能化される物質を含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチドとは、同じ核酸配列をコードするポリヌクレオチドの集団を指す。いくつかの例では、装置の表面は、基板の１つまたは複数の表面を包含する。
共通の支持体上のアドレス可能な位置で異なるあらかじめ決められた配列を有する複数のポリヌクレオチドの合成を支持する表面を含み得る構造が、本明細書で提供される。いくつかの例では、装置は、２，０００；５，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；１０，０００，０００を超える、またはそれ以上の非同一ポリヌクレオチドの合成のための支持を提供する。いくつかの例では、装置は、別の配列をコードする、２，０００；５，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；１０，０００，０００を超える、またはそれ以上のポリヌクレオチドの合成のための支持体を提供する。いくつかの例では、ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、同一の配列を有しているか、または同一の配列で合成されるように構成される。
約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００塩基長であるポリヌクレオチドを製造し、成長させるための方法および装置が、本明細書で提供される。いくつかの例では、形成されるポリヌクレオチドの長さは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２２５塩基長である。ポリヌクレオチドは、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００塩基長であり得る。ポリヌクレオチドは、１０～２２５塩基長、１２～１００塩基長、２０～１５０塩基長、２０～１３０塩基長、または３０～１００塩基長であり得る。
いくつかの例では、ポリヌクレオチドは基板の別個の座で合成され、ここで、各座はポリヌクレオチドの集団の合成を支持する。いくつかの例では、各座は、別の座上で成長したポリヌクレオチドの集団とは異なる配列を有するポリヌクレオチドの集団の合成を支持する。いくつかの例では、装置の座は複数のクラスター内に位置する。いくつかの例では、装置は、少なくとも１０、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、またはそれ以上のクラスターを含む。いくつかの例では、装置は、２，０００；５，０００；１０，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，１００，０００；１，２００，０００；１，３００，０００；１，４００，０００；１，５００，０００；１，６００，０００；１，７００，０００；１，８００，０００；１，９００，０００；２，０００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；または、１０，０００，０００を超える、あるいはそれ以上の別々の座を含む。いくつかの例では、装置は、約１０，０００の別個の座を含む。単一のクラスター内の座の量は、異なる例では変動する。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、またはそれ以上の座を含む。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約５０～５００の座を含む。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約１００～２００の座を含む。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約１００～１５０の座を含む。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約１０９、１２１、１３０、または１３７の座を含む。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約１９、２０、６１、６４、またはそれ以上の座を含む。
装置上で合成された別個のポリヌクレオチドの数は、基板中の利用可能な別個の座の数に依存し得る。いくつかの例では、装置のクラスター内の座の密度は、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１０の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約２５の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約５０座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約６５の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約７５の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１００の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１３０の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１５０の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１７５の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約２００の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約３００の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約４００の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約５００の座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１，０００の座、またはそれ以上である。いくつかの例では、装置は、１ｍｍ２当たり約１０～約５００の座、１ｍｍ２当たり約２５～約４００の座、１ｍｍ２当たり約５０～約５００の座、１ｍｍ２当たり約１００～約５００の座、１ｍｍ２当たり約１５０～約５００の座、１ｍｍ２当たり約１０～約２５０の座、１ｍｍ２当たり約５０～約２５０の座、１ｍｍ２当たり約１０～約２００の座、１ｍｍ２当たり約５０～約２００の座を含む。いくつかの例では、クラスター内の２つの隣接する座の中心からの距離は、約１０μｍ～約５００μｍ、約１０μｍ～約２００μｍ、または約１０μｍ～約１００μｍである。いくつかの例では、隣接する座の２つの中心からの距離は、約１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、または１００μｍより長い。いくつかの例では、２つの隣接する座の中心からの距離は、約２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、または１０μｍ未満である。いくつかの例では、各座の幅は、約０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、または１００μｍである。いくつかの例では、各座の幅は、約０．５μｍ～１００μｍ、約０．５μｍか～５０μｍ、約１０μｍ～７５μｍ、または約０．５μｍ～５０μｍである。
いくつかの例では、装置内のクラスターの密度は、１００ｍｍ２当たり少なくともまたは約１のクラスター、１０ｍｍ２当たり少なくともまたは約１のクラスター、５ｍｍ２当たり少なくともまたは約１のクラスター、４ｍｍ２当たり少なくともまたは約１のクラスター、３ｍｍ２当たり少なくともまたは約１のクラスター、２ｍｍ２当たり少なくともまたは約１のクラスター、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１のクラスター、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約２のクラスター、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約３のクラスター、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約４のクラスター、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約５のクラスター、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１０のクラスター、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約５０のクラスター、またはそれ以上である。いくつかの例では、装置は、１０ｍｍ２当たり約１のクラスター～１ｍｍ２当たり約１０のクラスターを含む。いくつかの例では、２つの隣接するクラスターの中心からの距離は、約５０μｍ未満、約１００μｍ未満、約２００μｍ未満、約５００μｍ未満、約１０００μｍ未満、約２０００μｍ未満、または約５０００μｍ未満である。いくつかの例では、２つの隣接するクラスターの中心からの距離は、約５０μｍ～約１００μｍ、約５０μｍ～約２００μｍ、約５０μｍ～約３００μｍ、約５０μｍ～約５００μｍ、および約１００μｍ～約２０００μｍである。いくつかの例では、２つの隣接するクラスターの中心からの距離は、約０．０５ｍｍ～約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約５ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約４ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約３ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約２ｍｍ、約０．１ｍｍ～１０ｍｍ、約０．２ｍｍ～１０ｍｍ、約０．３ｍｍ～約１０ｍｍ、約０．４ｍｍ～約１０ｍｍ、約０．５ｍｍ～１０ｍｍ、約０．５ｍｍ～約５ｍｍ、または約０．５ｍｍ～約２ｍｍである。いくつかの例では、各クラスターは、約０．５～２ｍｍ、約０．５～１ｍｍ、または約１～２ｍｍの一次元に沿った直径または幅を有する。いくつかの例では、各クラスターは、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、または約２ｍｍの一次元に沿った直径または幅を有する。いくつかの例では、各クラスターは、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．１５、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、または約２ｍｍの一次元に沿った内径または幅を有する。
装置は、ほぼ標準９６ウェルプレートのサイズであり、例えば、約１００～２００ｍｍ×約５０～１５０ｍｍである。いくつかの例では、装置の直径は、約１０００ｍｍ以下、約５００ｍｍ以下 約４５０ｍｍ以下、約４００ｍｍ以下、約３００ｍｍ以下、約２５０ｎｍ以下、約２００ｍｍ以下、約１５０ｍｍ以下、約１００ｍｍ以下、または約５０ｍｍ以下である。いくつかの例では、装置の直径は、約２５ｍｍ～１０００ｍｍ、約２５ｍｍ～約８００ｍｍ、約２５ｍｍ～約６００ｍｍ、約２５ｍｍ～約５００ｍｍ、約２５ｍｍ～約４００ｍｍ、約２５ｍｍ～約３００ｍｍ、または約２５ｍｍ～約２００である。装置のサイズの非限定的な例としては、約３００ｍｍ、約２００ｍｍ、約１５０ｍｍ、約１３０ｍｍ、約１００ｍｍ、約７６ｍｍ、約５１ｍｍ、約２５ｍｍが挙げられる。いくつかの例では、装置は、少なくとも約１００ｍｍ２；２００ｍｍ２；５００ｍｍ２；１，０００ｍｍ２；２，０００ｍｍ２；５，０００ｍｍ２；１０，０００ｍｍ２；１２，０００ｍｍ２；１５，０００ｍｍ２；２０，０００ｍｍ２；３０，０００ｍｍ２；４０，０００ｍｍ２；５０，０００ｍｍ２、またはそれ以上の平面の表面積を有する。いくつかの例では、装置の厚さは、約５０ｍｍ～約２０００ｍｍ、約５０ｍｍ～約１０００ｍｍ、約１００ｍｍ～約１０００ｍｍ、約２００ｍｍ～約１０００ｍｍ、または約２５０ｍｍ～約１０００ｍｍである。装置の厚さの非限定的な例としては、２７５ｍｍ、３７５ｍｍ、５２５ｍｍ、６２５ｍｍ、６７５ｍｍ、７２５ｍｍ、７７５ｍｍ、および９２５ｍｍが挙げられる。いくつかの例では、装置の厚さは、直径によって変わり、基板の組成に左右される。例えば、シリコン以外の材料を含む装置は、同じ直径のシリコン装置とは異なる厚さを有している。装置の厚さは、使用される材料の機械強度によって決定され、取り扱い中に割れることなく、それ自体の重量を支えるのに十分な厚さでなければならない。いくつかの例では、構造は、本明細書に記載される複数の装置を含む。
表面材料
表面を含む装置が本明細書で提供され、ここで、表面は、あらかじめ決められた位置での、および結果として生じる低いエラー率、低いドロップアウト率、高い収率、ならびに高いオリゴ表現でのポリヌクレオチド合成を支持するために改質される。いくつかの例では、本明細書で提供されるポリヌクレオチド合成のための装置の表面は、デノボポリヌクレオチド合成反応を支持するために、修飾可能な様々な物質から作られる。場合によっては、装置は十分に導電性であり、例えば、装置のすべてまたは一部にわたって、均一な電場を形成することができる。本明細書に記載される装置は可撓性材料を含むこともある。典型的な可撓性材料としては、限定されないが、修飾ナイロン、非修飾ナイロン、ニトロセルロース、およびポリプロピレンなどが挙げられる。本明細書に記載される装置は剛性材料を含むこともある。典型的な剛性材料としては、限定されないが、ガラス、石英ガラス（ｆｕｓｅ ｓｉｌｉｃａ）、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、プラスチック（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびそれらの混合物）、ならびに金属（例えば、金、白金）が挙げられる。本明細書で開示される装置は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロース系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ガラス、またはそれらの任意の組み合わせを含む材料から作られてもよい。場合によっては、本明細書で開示される装置は、本明細書に列挙される材料または当該技術分野において知られている他の適切な材料の組み合わせで製造される。
本明細書に記載される典型的な材料の引っ張り強度のリストは、以下の通りである：ナイロン（７０ＭＰａ）、ニトロセルロース（１．５ＭＰａ）、ポリプロピレン（４０ＭＰａ）、シリコン（２６８ＭＰａ）、ポリスチレン（４０ＭＰａ）、アガロース（１～１０ＭＰａ）、ポリアクリルアミド（１～１０ＭＰａ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（３．９～１０．８ＭＰａ）。本明細書に記載される固体支持体は、１～３００、１～４０、１～１０、１～５、または３～１１ＭＰａの引っ張り強度を有する場合がある。本明細書に記載される固体支持体は、約１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、２７０、あるいはそれ以上のＭＰａの引っ張り強度を有する場合がある。いくつかの例では、本明細書に記載される装置は、テープまたはフレキシブルシートなどの連続的なループまたはリールに格納され得る可撓性材料の形態を取るポリヌクレオチド合成のための固体支持体を含む。
ヤング率は、荷重下での弾性（復元可能）変形に対する材料の耐性を測定する。本明細書に記載される典型的な材料の剛性のヤング率のリストは以下の通りである：ナイロン（３ＧＰａ）、ニトロセルロース（１．５ＧＰａ）、ポリプロピレン（２ＧＰａ）、シリコン（１５０ＧＰａ）、ポリスチレン（３ＧＰａ）、アガロース（１～１０ＧＰａ）、ポリアクリルアミド（１～１０ＧＰａ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（１～１０ＧＰａ）。本明細書に記載される固体支持体は、１～５００、１～４０、１～１０、１～５、または３～１１ＧＰａのヤング率を有する場合がある。本明細書に記載される固体支持体は、約１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００ＧＰａ、またはそれ以上のヤング率を有する場合がある。軟性と剛性の関係は互いに逆であることから、可撓性材料は低ヤング率を有し、荷重下でその形状を大きく変化させる。
場合によっては、本明細書で開示される装置は二酸化ケイ素の基部と酸化ケイ素の表層を含む。代替的に、装置は酸化ケイ素の基部を有することもある。本明細書で提供されるデバイスの表面は、テクスチャード加工されることもあり、ポリヌクレオチド合成のための全体的な表面積の増加をもたらす。本明細書で開示される装置は、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のシリコンを含んでいてもよい。本明細書で開示される装置はシリコン・オン・インシュレーター（ＳＯＩ）ウェーハから作られてもよい。
表面のアーキテクチャ
隆起した特徴および／または沈降した特徴を含む装置が本明細書で提供される。そのような特徴を有する１つの利点は、ポリヌクレオチド合成を支持する表面積の増加である。いくつかの例では、隆起した特徴および／または陥没した特徴を有する装置は、三次元基板と呼ばれる。いくつかの例では、三次元装置は１つ以上のチャネルを含む。いくつかの例では、１つ以上の座はチャネルを含む。いくつかの例では、チャネルは、ポリヌクレオチドシンセサイザーなどの堆積装置による試薬の堆積に利用可能である。いくつかの例では、試薬および／または流体は、１つ以上のチャネルと流体連通するより大きなウェルに集まる。例えば、装置は、クラスターを有する複数の座に対応する複数のチャネルを含み、複数のチャネルは、クラスターの１つのウェルと流体連通している。いくつかの方法では、ポリヌクレオチドのライブラリは、クラスターの複数の座において合成される。
いくつかの例では、構造は、表面上でのポリヌクレオチド合成のための制御された流れおよび物質移動経路を可能にするように構成される。いくつかの例では、装置の構成により、ポリヌクレオチド合成中の物質移動経路、化学暴露時間、および／または洗浄効果の制御および均一な分布が可能になる。いくつかの例では、装置の構成は、成長しているポリヌクレオチドによって排除される体積が、ポリヌクレオチドの成長に利用可能なまたは適切な、初期に利用可能な体積の５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％、またはそれ以下を超えて占めることがないように、例えば、成長しているポリヌクレオチドに十分な体積を提供することによって、奏効率（ｓｗｅｅｐ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を高めることができる。いくつかの例では、三次元構造は、化学暴露の急速な交換を可能にするために流体の流れの管理を可能にする。
１ｆＭ、５ｆＭ、１０ｆＭ、２５ｆＭ、５０ｆＭ、７５ｆＭ、１００ｆＭ、２００ｆＭ、３００ｆＭ、４００ｆＭ、５００ｆＭ、６００ｆＭ、７００ｆＭ、８００ｆＭ、９００ｆＭ、１ｐＭ、５ｐＭ、１０ｐＭ、２５ｐＭ、５０ｐＭ、７５ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、３００ｐＭ、４００ｐＭ、５００ｐＭ、６００ｐＭ、７００ｐＭ、８００ｐＭ、９００ｐＭ、またはそれ以上の量のＤＮＡを合成する方法が、本明細書で提供される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリは、遺伝子の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の長さに及ぶことがある。遺伝子は、最大約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％まで変化し得る。
同一でないポリヌクレオチドはまとめて、遺伝子の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％に対する配列をコードし得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、遺伝子の５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列をコードし得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、遺伝子の８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列をコードし得る。
いくつかの例では、物理的構造によって隔離が達成される。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成のための能動領域および受動領域を発生させる表面の差次的な官能化によって、隔離が達成される。差次的な官能基化はまた、装置表面にわたって疎水性を変え、それによって、堆積した試薬の水滴（ｂｅａｄｉｎｇ）または湿りを引き起こす水接触角の効果を作り出すことによって達成される。より大きな構造を利用することで、飛散（ｓｐｌａｓｈｉｎｇ）や、隣接するスポットの試薬での別々のポリヌクレオチド合成位置の相互汚染を減らすことができる。いくつかの例では、ポリヌクレオチドシンセサイザーなどの装置が、別々のポリヌクレオチド合成位置に試薬を堆積させるために使用される。三次元の特徴を有する基板は、低いエラー率（例えば、約１：５００未満、約１：１０００未満、約１：１５００未満、約１：２，０００未満、約１：３，０００未満、約１：５，０００未満、または約１：１０，０００未満）で、多数のポリヌクレオチド（例えば、約１０，０００を超える）を合成することができる。いくつかの例では、装置は、１ｍｍ２当たり約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、または５００、またはそれを超える特徴の密度で特徴を含む。
装置のあるウェルは、基板の他のウェルと同じまたは異なる幅、高さ、および／または体積を有してもよい。装置のあるチャネルは、基板の他のチャネルと同じまたは異なる幅、高さ、および／または体積を有してもよい。いくつかの例では、クラスターの幅は、約０．０５ｍｍ～約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約５ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約４ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約３ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約２ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約１ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約０．５ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約０．１ｍｍ、約０．１ｍｍ～１０ｍｍ、約０．２ｍｍ～１０ｍｍ、約０．３ｍｍ～約１０ｍｍ、約０．４ｍｍ～約１０ｍｍ、約０．５ｍｍ～１０ｍｍ、約０．５ｍｍ～約５ｍｍ、または約０．５ ｍｍ～約２ｍｍである。いくつかの例では、クラスターを含むウェルの幅は、約０．０５ｍｍ～約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約５ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約４ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約３ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約２ｍｍの、約０．０５ｍｍ～約１ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約０．５ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約０．１ｍｍ、約０．１ｍｍ～１０ｍｍ、約０．２ｍｍ～１０ｍｍ、約０．３ｍｍ～約１０ｍｍ、約０．４ｍｍ～約１０ｍｍ、約０．５ｍｍ～１０ｍｍ、約０．５ｍｍ～約５ｍｍ、または約０．５ｍｍ～約２ｍｍである。いくつかの例では、クラスターの幅は、５ｍｍ未満、４ｍｍ未満、３ｍｍ未満、２ｍｍ未満、１ｍｍ未満、０．５ｍｍ未満、０．１ｍｍ未満、０．０９ｍｍ未満、０．０８ｍｍ未満、０．０７ｍｍ未満、０．０６ｍｍ未満、または０．０５ｍｍ未満であるか、あるいは、約５ｍｍ、約４ｍｍ、約３ｍｍ、約２ｍｍ、約１ｍｍ、約０．５ｍｍ、約０．１ｍｍ、約０．０９ｍｍ、約０．０８ｍｍ、約０．０７ｍｍ、約０．０６ｍｍ、または約０．０５ｍｍである。いくつかの例では、クラスターの幅は約１．０～１．３ｍｍである。いくつかの例では、クラスターの幅は約１．１５０ｍｍである。いくつかの例では、ウェルの幅は、５ｍｍ未満、４ｍｍ未満、３ｍｍ未満、２ｍｍ未満、１ｍｍ未満、０．５ｍｍ未満、０．１ｍｍ未満、０．０９ｍｍ未満、０．０８ｍｍ未満、０．０７ｍｍ未満、０．０６ｍｍ未満、または０．０５ｍｍ未満であるか、あるいは、約５ｍｍ、約４ｍｍ、約３ｍｍ、約２ｍｍ、約１ｍｍ、約０．５ｍｍ、約０．１ｍｍ、約０．０９ｍｍ、約０．０８ｍｍ、約０．０７ｍｍ、約０．０６ｍｍ、または約０．０５ｍｍである。いくつかの例では、ウェルの幅は、約１．０～１．３ｍｍである。いくつかの例では、ウェルの幅は約１．１５０ｍｍである。いくつかの例では、クラスターの幅は約０．０８ｍｍである。いくつかの例では、ウェルの幅は約０．０８ｍｍである。クラスターの幅は、二次元または三次元の基板内のクラスターを指すことがある。
いくつかの例では、ウェルの高さは、約２０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約１０００μｍ、約１００μｍ～約１０００μｍ、約２００μｍ～約１０００μｍ、約３００μｍ～約１０００μｍ、約４００μｍ～約１０００μｍ、または約５００μｍ～約１０００μｍである。いくつかの例では、ウェルの高さは、約１０００μｍ未満、約９００μｍ未満、約８００μｍ未満、約７００μｍ未満、または約６００μｍ未満である。
いくつかの例では、装置は、クラスター内の複数の座に対応する複数のチャネルを含み、ここで、チャネルの高さまたは深さは、約５μｍ～約５００μｍ、約５μｍ～約４００μｍ、約５μｍ～約３００μｍ、約５μｍ～約２００μｍ、約５μｍ～約１００μｍ、約５μｍ～約５０μｍ、または約１０μｍ～約５０μｍである。いくつかの例では、チャネルの高さは、１００μｍ未満、８０μｍ未満、６０μｍ未満、４０μｍ未満または２０μｍ未満である。
いくつかの例では、チャネル、座（例えば、実質的に平面の基板における）、またはチャネルと座の両方の直径（例えば、座がチャネルに対応する三次元構造装置における）は、約１μｍ～約１０００μｍ、約１μｍ～約５００μｍ、約１μｍ～約２００μｍ、約１μｍ～約１００μｍ、約５μｍ～約１００μｍ、または約１０μｍ～約１００μｍ、例えば、約９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、あるいは１０μｍである。いくつかの例では、チャネル、座、またはチャネルと座の両方の直径は、約１００μｍ、９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、または１０μｍ未満である。いくつかの例では、２つの隣接チャネル、座、またはチャネルと座の中心からの距離は、約１μｍ～約５００μｍ、約１μｍ～約２００μｍ、約１μｍ～約１００μｍ、約５μｍ～約２００μｍ、約５μｍ～約１００μｍ、約５μｍ～約５０μｍ、または約５μｍ～約３０μｍ、例えば、約２０μｍである。
表面改質
様々な例では、装置表面あるいは装置表面の選択された部位または領域の１つ以上の化学的性質および／または物理的性質を変更するための加法または減法による表面の化学的および／または物理的な変更のために、表面改質が利用される。例えば、表面改質としては、限定されないが、（１）表面の湿潤性を変更すること、（２）表面を官能化すること、つまり、表面官能基を提供、修飾、または置換すること、（３）表面を脱官能基化すること、つまり、表面官能基を除去すること、（４）そうでなければ、例えば、エッチングによって、表面の化学組成を変更すること、（５）表面粗さを増大または低減すること、（６）表面上にコーティング、例えば、表面の湿潤性とは異なる湿潤性を示すコーティングを提供すること、および／または（７）表面上に粒子を堆積させることが挙げられる。
いくつかの例では、表面上の化学層（接着促進剤と呼ばれる）を追加することで、基板の表面上の座の構造化したパターン化が容易になる。接着促進の適用のための典型的な表面としては、限定されないが、ガラス、シリコン、二酸化ケイ素、および窒化ケイ素が挙げられる。いくつかの例では、接着促進剤は、高い表面エネルギーを有する化学物質である。いくつかの例では、第２の化学層が基板の表面上に堆積される。いくつかの例では、第２の化学層は、低い表面エネルギーを有する。いくつかの例では、表面上にコーティングされた化学層の表面エネルギーは、表面上の液滴の局在化を支持する。選択されるパターン化の配置に応じて、座の近接性および／および座での流体接触の領域は変更可能である。
いくつかの例では、例えば、ポリヌクレオチド合成のために、核酸または他の部分が堆積する装置表面または分解された座は、滑らかであるか、実質的に平面であり（例えば、二次元）、あるいは隆起した特徴または陥没した特徴（例えば、三次元の特徴）などの不規則性を有している。いくつかの例では、装置表面は、化合物の１つ以上の異なる層で改質される。対象のそのような改変層としては、限定されないが、金属、金属酸化物、ポリマー、小さな有機分子などの無機層および有機層が挙げられる。非限定的なポリマー層としては、ペプチド、タンパク質、核酸またはそれらの模倣物（例えば、ペプチド核酸など）、多糖類、リン脂質、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンアミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、および本明細書に記載されるか、そうでなければ当該技術分野で知られている他の適切な化合物が挙げられる。いくつかの例では、ポリマーはヘテロポリマーである。いくつかの例では、ポリマーはホモポリマーである。いくつかの例では、ポリマーは官能性部分を含むか、またはコンジュゲートされる。
いくつかの例では、装置の分解された座は、表面エネルギーを増大および／または低減させる１つ以上の部分で官能基化される。いくつかの例では、ある部分は化学的に不活性である。いくつかの例では、ある部分は、望ましい化学反応、例えば、ポリヌクレオチド合成反応における１つ以上のプロセスを支援するように構成される。表面の表面エネルギー、すなわち、疎水性は、表面上に付着するヌクレオチドの親和性を決定するための因子である。いくつかの例では、装置の官能基化のための方法は、（ａ）二酸化ケイ素を含む表面を有する装置を提供する工程と；（ｂ）本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野で知られている適切なシラン化剤、例えば、有機官能性アルコキシシラン分子を使用して、表面をシラン処理する工程とを含む。
いくつかの例では、有機官能性アルコキシシラン分子は、ジメチルクロロ－オクトデシル－シラン、メチルジクロロ－オクトデシル－シラン、トリクロロ－オクトデシル－シラン、トリメチル－オクトデシル－シラン、トリエチル－オクトデシル－シラン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの例では、装置の表面は、ポリエチレン／ポリプロピレン（ガンマ線照射またはクロム酸酸化、およびヒドロキシアルキル表面への還元によって官能基化された）、高度に架橋されたポリスチレン－ジビニルベンゼン（クロロメチル化によって誘導体化され、ベンジルアミン官能面にアミノ化された）、ナイロン（末端のアミノヘキシル基は直接反応性である）で官能基化されるか、または還元されたポリテトラフルオロエチレンでエッチングされる。他の方法および官能化剤は米国特許第５，４７４，７９６号に記載され、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの例では、装置の表面は、典型的に装置の表面上に存在する反応性の親水性部分を介して、装置の表面にシランを結合させるのに有効な反応条件下で、シランの混合物を含有している誘導体化組成物と接触させることによって官能基化される。シラン処理は一般に、有機官能性アルコキシシラン分子による自己組織化を介して表面を覆う。
当該技術分野において現在知られているように、例えば、表面エネルギーを低下または増大させるのための様々なシロキサン官能化試薬がさらに使用されてもよい。有機官能性アルコキシシランは、それらの有機官能に従って分類され得る。
本明細書には、ヌクレオシドに結合することができる薬剤のパターン化を含み得る装置が提供される。いくつかの例では、装置は活性薬剤でコーティングされてもよい。いくつかの例では、装置は、受動剤（ｐａｓｓｉｖｅ ａｇｅｎｔ）でコーティングされてもよい。本明細書に記載されるコーティング材料に含まれる例示的な活性薬剤としては、限定されることなく、Ｎ－（３－トリエトキシシリルプロピル）－４－ヒドロキシブチルアミド（ＨＡＰＳ）、１１－アセトキシウンデシルトリエトキシシラン、ｎ－デシルトリエトキシシラン、（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン、３－グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰＳ）、３－ヨード－プロピルトリメトキシシラン、ブチル－アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｒ）－トリメトキシシラン、二量体の二級アミノアルキルシロキサン、、（３－アミノプロピル）－ジエトキシ－メチルシラン、（３－アミノプロピル）－ジメチル－エトキシシラン、および（３－アミノプロピル）－トリメトキシシラン、（３－グリシドキシプロピル）－ジメチル－エトキシシラン、グリシドキシ－トリメトキシシラン、（３－メルカプトプロピル）－トリメトキシシラン、３－４エポキシシクロヘキシル－エチルトリメトキシシラン、および（３－メルカプトプロピル）－メチル－ジメトキシシラン、アリルトリクロロクロロシラン、７－オクト－１－エニルトリクロロクロロシラン、あるいはビス（３－トリメトキシシリルプロピルアミンが挙げられる。
本明細書に記載されるコーティング材料に含まれる典型的な受動剤としては、限定されないが、ペルフルオロオクチルトリクロロシラン；トリデカフルオロ－１，１，２，２－テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン；１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－フルオロオクチルトリエトキシシラン（ＦＯＳ）；トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフロオロオクチル）シラン；ｔｅｒｔ－ブチル－［５－フルオロ－４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）インドール－１－イル］－ジメチル－シラン；ＣＹＴＯＰ（商標）；フロリナート（商標）；ペルフロオロオクチルトリクロロシラン（ＰＦＯＴＣＳ）；ペルフロオロオクチルジメチルクロロシラン（ＰＦＯＤＣＳ）；ペルフロオロデシルトリエトキシシラン（ＰＦＤＴＥＳ）；ペンタフルオロフェニル－ジメチルプロピルクロロ－シラン（ＰＦＰＴＥＳ）；ペルフロオロオクチルトリエトキシシラン；ペルフロオロオクチルトリメトキシシラン；オクチルクロロシラン；ジメチルクロロ－オクトデシル－シラン；メチルジクロロ－オクトデシル－シラン；トリクロロ－オクトデシル－シラン；トリメチル－オクトデシル－シラン；トリエチル－オクトデシル－シラン；または、オクタデシルトリクロロシランが挙げられる。
いくつかの例では、官能基化剤は、オクタデシルトリクロロシランなどの炭化水素シランを含む。いくつかの例では、官能基化剤は、１１－アセトキシウンデシルトリエトキシシラン、ｎ－デシルトリエトキシシラン、（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン、グリシジルオキシプロピル／トリメトキシシラン、およびＮ－（３－トリエトキシシリルプロピル）－４－ヒドロキシブチルアミドを含む。
ポリヌクレオチド合成
ポリヌクレオチド合成のための本開示の方法は、ホスホラミダイト化学を含むプロセスを含み得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成は、塩基をホスホラミダイトと結合させることを含む。ポリヌクレオチド合成は、カップリング条件下でホスホラミダイトの堆積によって塩基をカップリングすることを含んでいてもよく、ここで、同じ塩基が、随意に、１回より多くホスホラミダイトとともに堆積される、すなわち、二重カップリングが行われる。ポリヌクレオチド合成は、未反応の部位のキャッピングを含んでもよい。いくつかの例では、キャッピングは任意である。ポリヌクレオチド合成はまた、酸化または酸化工程を含んでもよい。ポリヌクレオチド合成は、脱ブロック化、脱トリチル化、および硫化を含んでもよい。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成は、酸化または硫化のいずれかを含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成反応中の１つの工程または各工程間で、装置は、例えば、テトラゾールまたはアセトニトリルを使用して洗浄される。ホスホラミダイト合成方法における任意の１つの工程の時間枠は、約２分、１分、５０秒、４０秒、３０秒、２０秒、および１０秒未満であり得る。
ホスホラミダイト方法を使用するポリヌクレオチド合成は、後に、成長しているポリヌクレオチド鎖にホスホラミダイト構築ブロック（例えば、ヌクレオシドホスホラミダイト）を加えて、亜リン酸塩トリエステル結合の形成することを含んでもよい。ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成は、３’から５’の方向に進む。ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成は、１つの合成サイクル当たり、成長している核酸鎖への１つのヌクレオチドの制御された付加を可能にする。いくつかの例では、各合成サイクルはカップリング工程を含む。ホスホラミダイトカップリングは、活性化されたヌクレオシドホスホラミダイトと、例えば、リンカーを介して基板に結合されたヌクレオシドとの間の亜リン酸塩トリエステル結合の形成を含む。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、起動された装置に提供される。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）とともに装置に提供される。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、基板に結合されたヌクレオシドよりも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍、またはそれ以上の過剰量で、装置に提供される。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトの付加は、無水環境において、例えば、無水アセトニトリルにおいて実行される。ヌクレオシドホスホラミダイトの付加に続いて、装置は随意に洗浄される。いくつかの例では、カップリング工程は、随意に、基板へのヌクレオシドホスホラミダイトの添加の間に洗浄工程を伴って、さらに１回以上繰り返される。いくつかの例では、本明細書で使用されるポリヌクレオチド合成方法は、１、２、３、またはそれ以上の連続するカップリング工程を含む。カップリング前に、多くの場合では、装置に結合されたヌクレオシドは、保護基の除去によって脱保護され、ここで、その保護基は重合を防ぐように機能する。一般的な保護基は、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）である。
カップリング後、ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成方法は、キャッピング工程を随意に含む。キャッピング工程では、成長しているポリヌクレオチドがキャッピング剤で処置される。キャッピング工程は、さらなる鎖伸長からのカップリング後に未反応の基板に結合した５’－ＯＨ基をブロックするのに有用であり、内部塩基欠失（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｂａｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）を伴うポリヌクレオチドの形成を防ぐ。さらに、１Ｈ－テトラゾールで活性化されたホスホラミダイトは、わずかにグアノシンのＯ６位置と反応する可能性がある。理論に縛られることなく、Ｉ２／水で酸化すると、この副産物は、恐らくＯ６－Ｎ７遊走を介して、脱プリン化を受けることもある。脱プリン部位は、ポリヌクレオチドの最終的な脱保護の間に切断されることになり、したがって、完全長の産物の収率を低下させる場合がある。Ｏ６修飾は、Ｉ２／水での酸化前に、キャッピング試薬による処理によって除去され得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成中にキャッピング工程を含めることにより、キャッピングなしの合成と比較して、エラー率が低下する。一例として、キャッピング工程は、基板に結合したポリヌクレオチドを、無水酢酸と１－メチルイミダゾールとの混合物で処理することを含む。キャッピング工程に続いて、装置は随意に洗浄される。
いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトの付加後に、および随意にキャッピングと１以上の洗浄工程後に、装置に結合した成長している核酸が酸化される。酸化工程には、亜リン酸塩トリエステルを、天然に存在するリン酸ジエステルのヌクレオシド間の結合の保護された前駆体である、四配位リン酸塩トリエステルに酸化することが含まれる。いくつかの例では、成長しているポリヌクレオチドの酸化は、随意に弱塩基（例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン）の存在下で、ヨウ素および水での処理によって達成される。酸化は、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドまたは（１Ｓ）－（＋）－（１０－カンファースルホニル）－オキサジリジン（ＣＳＯ）を使用して、無水条件下で実行され得る。いくつかの方法では、キャッピング工程は、酸化に続いて実行される。持続する可能性のある酸化からの残留水が、続くカップリングを阻害することができるため、第２のキャッピング工程により装置の乾燥が可能になる。酸化後に、装置および成長しているポリヌクレオチドは、随意に洗浄される。いくつかの例では、酸化の工程は、ポリヌクレオチドホスホロチオエートを得るための硫化工程に置き換えられ、任意のキャッピング工程が硫化後に実行され得る。限定されないが、３－（ジメチルアミノメチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン、ＤＤＴＴ、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬としても知られている）、およびＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’－テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）を含む多くの試薬が、効率的な硫黄移動を行うことができる。
その後のヌクレオシドの取り込みのサイクルがカップリングを介して生じるためには、装置に結合した成長しているポリヌクレオチドの保護された５’末端を除去し、一次ヒドロキシル基が次のヌクレオシドホスホラミダイトと反応するようにする。いくつかの例では、保護基はＤＭＴであり、脱ブロック化がジクロロメタン中のトリクロロ酢酸による生じる。長時間にわたって、または、推奨された酸の溶液よりも強力な脱トリチル化を行うことで、固体支持体に結合したポリヌクレオチドの脱プリン化が増大し、ゆえに、所望の完全長の産物の収率を低下させることがある。本明細書に記載される本開示の方法および組成物は、望ましくない脱プリン化反応を制限する制御された脱ブロック化条件を提供する。いくつかの例では、装置に結合したポリヌクレオチドは、脱ブロック化後に洗浄される。いくつかの例では、脱ブロック化後の効率的な洗浄は、低いエラー率を有する合成されたポリヌクレオチドに寄与する。
ポリヌクレオチドの合成のための方法は、典型的には以下の工程の一連の繰り返し（ｉｔｅｒａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む：活性化された表面、リンカー、または以前に脱保護された単量体のいずれかと結合するために、保護された単量体を活発に官能化された表面（例えば、座）に適用すること；後に適用される保護された単量体と反応するように、適用された単量体を脱保護すること；および、結合のために別の保護された単量体を適用すること。１以上の中間工程は、酸化または硫化を含む。いくつかの例では、１つ以上の洗浄工程は、工程の１つまたはすべてに先行するか、または工程の１つまたはすべての後に続く。
ホスホラミダイトベースのポリヌクレオチド合成のための方法は、一連の化学的な工程を含む。いくつかの例では、合成方法の１つ以上の工程は、試薬のサイクリングを含み、ここで、方法の１つ以上の工程は、工程に有用な試薬を装置に適用すること含む。例えば、試薬は、一連の液体堆積および真空乾燥の工程によって循環させられる。ウェル、マイクロウェル、チャネルなどの三次元の特徴を含む基板の場合、試薬は、随意にウェルおよび／またはチャネルを介して装置の１つ以上の領域を通過する。
本明細書に記載される方法およびシステムは、ポリヌクレオチドの合成のためのポリヌクレオチド合成装置に関する。合成は並行して行われ得る。例えば、少なくともまたは少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１００００、５００００、７５０００、１０００００、またはそれ以上のポリヌクレオチドが並行して合成可能である。並行して合成され得るポリヌクレオチドの総数は、２～１０００００、３～５００００、４～１００００、５～１０００、６～９００、７～８５０、８～８００、９～７５０、１０～７００、１１～６５０、１２～６００、１３～５５０、１４～５００、１５～４５０、１６～４００、１７～３５０、１８～３００、１９～２５０、２０～２００、２１～１５０、２２～１００、２３～５０、２４～４５、２５～４０、３０～３５の間であってもよい。当業者は、並行して合成されたポリヌクレオチドの総数が、これらの値のいずれかによって制約される任意の範囲内（例えば、２５～１００）にある得ることを認識する。並行して合成されたポリヌクレオチドの総数は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。装置内で合成されたポリヌクレオチドの総モル質量またはポリヌクレオチドの各々のモル質量は、少なくともまたは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２５０００、５００００、７５０００、１０００００ピコモル、またはそれ以上であり得る。装置内のポリヌクレオチドの各々の長さまたはポリヌクレオチドの平均長は、少なくともまたは少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００のヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。装置内のポリヌクレオチドの各々の長さまたはポリヌクレオチドの平均長は、最大でまたはおよそ最大で約５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０のヌクレオチド、またはそれ以下であり得る。装置内のポリヌクレオチドの各々の長さまたはポリヌクレオチドの平均長は、１０～５００、９～４００、１１～３００、１２～２００、１３～１５０、１４～１００、１５～５０、１６～４５、１７～４０、１８～３５、１９～２５の間であり得る。当業者は、装置内のポリヌクレオチドの各々の長さまたはポリヌクレオチドの平均長が、これらの値のいずれかによって制約される任意の範囲内（例えば、１００～３００）にあり得ることを認識する。装置内のポリヌクレオチドの各々の長さまたはポリヌクレオチドの平均長は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。
本明細書で提供される表面上でのポリヌクレオチド合成の方法は、高速での合成を可能にする。一例として、１時間につき少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５ ５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００のヌクレオチド、またはそれ以上が合成される。ヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウリジンの構築ブロック、またはそれらのアナログ／修飾されたバージョンを含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチドのライブラリは基板上で並行して合成される。例えば、約または少なくとも約１００；１，０００；１０，０００；３０，０００；７５，０００；１００，０００；１，０００，０００；２，０００，０００；３，０００，０００；４，０００，０００；または５，０００，０００の分解された座を含む装置は、少なくとも同じ数の別個のポリヌクレオチドの合成を支援することができ、ここで、別個の配列をコードするポリヌクレオチドは分解された座で合成される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドのライブラリは、約３か月、２か月、１か月、３週、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、２４時間未満、またはそれ以下で、本明細書に記載される低いエラー率で、装置上で合成される。いくつかの例では、本明細書に記載される基板および方法を用いて低いエラー率で合成されるポリヌクレオチドライブラリから組み立てられる大きな核酸は、約３か月、２か月、１か月、３週、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、２４時間未満、またはそれ以下で調製される
いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、複数のコドン部位にて異なる変異体ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのライブラリの生成をもたらす。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、１つの部位、２つの部位、３つの部位、４つの部位、５つの部位、６つの部位、７つの部位、８つの部位、９つの部位、１０の部位、１１の部位、１２の部位、１３の部位、１４の部位、１５の部位、１６の部位、１７の部位、１８の部位、１９の部位、２０の部位、３０の部位、４０の部位、５０の部位、またはそれ以上の部位の変異体コドン部位を有してもよい。
いくつかの例では、変異体コドン部位の１以上の部位は隣接することがある。変異体コドン部位の１以上の部位は隣接せず、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコドンにより分離されてもよい。
いくつかの例では、ポリヌクレオチドは変異体コドン部位の複数の部位を含むことがあり、ここで、すべての変異体コドン部位は互いに隣接して、変異体コドン部位のストレッチを形成する。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは変異体コドン部位の複数の部位を含み得、ここで、いかなる変異体コドン部位も互いに隣接していない。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは変異体コドン部位の複数の部位を含んでもよく、ここで、変異体コドン部位のいくつかは互いに隣接して、変異体コドン部位のストレッチを形成し、変異体コドン部位の一部は互いに隣接していない。
図面を参照すると、図１１は、より短いポリヌクレオチドからの核酸（例えば、遺伝子）の合成のための例示的なプロセスのワークフローを示す。ワークフローは通常、以下の段階：（１）一本鎖ポリヌクレオチドライブラリのデノボ合成、（２）より大きな断片を形成するためのポリヌクレオチドの結合、（３）エラー補正、（４）品質管理、および（５）輸送に分けられる。デノボ合成の前に、意図した核酸配列または核酸配列の群が、あらかじめ選択される。例えば、遺伝子の群が生成のためにあらかじめ選択される。
いったん、生成される大きなポリヌクレオチドが選択されると、ポリヌクレオチドのあらかじめ決められたライブラリがデノボ合成のために設計される。高密度のポリヌクレオチドアレイを生成するための様々な適切な方法が知られている。ワークフローの例では、装置の表層（１１０１）が提供される。この例では、表面の化学的性質（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、ポリヌクレオチド合成プロセスを改善するために変えられる。低表面エネルギーの領域が液体を弾くように生成され、一方で高表面エネルギーの領域は液体を引き付けるために生成される。表面自体は平坦な表面の形態であってもよく、または、表面積を増加させる突起またはマイクロウェルなどの形状の変形を含んでもよい。ワークフローの例では、全体として参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ／２０１５／０２１０８０で開示されるように、選択された高表面エネルギー分子は、ＤＮＡの化学的性質を支援する二重の機能を果たす。
ポリヌクレオチドアレイのインサイツ調製物は固体支持体上で生成され、並行して複数のオリゴマーを伸長させるために単一のヌクレオチド伸長プロセスを利用する。ポリヌクレオチドシンセサイザーなどの材料堆積装置は、段階的な手法で試薬を放出するように設計され、複数のポリヌクレオチドが並行して一度に１つの残基を伸長させ、それによりあらかじめ決められた核酸配列を持つオリゴマーを生成する（１１０２）。いくつかの例では、ポリヌクレオチドはこの段階で表面から切断される。切断は、例えば、アンモニアまたはメチルアミンによる気相切断（ｇａｓ ｃｌｅａｖａｇｅ）を含む。
生成されたポリヌクレオチドライブラリは反応チャンバに配される。この例示的なワークフローでは、反応チャンバ（「ナノリアクター」とも呼ばれる）は、シリコンでコーティングされたウェルであり、ＰＣＲ試薬を含み、ポリヌクレオチドライブラリ上に下げられる（１１０３）a。ポリヌクレオチドの密閉（１１０４）の前または後に、試薬を加えて、基板からポリヌクレオチドを放出させる。例示的なワークフローでは、ポリヌクレオチドは、ナノリアクターの密閉後に放出される（１１０５）。いったん放出されると、一本鎖ポリヌクレオチドの断片は、ＤＮＡの完全長範囲の配列に及ぶようにハイブリダイズする。合成されたポリヌクレオチドがそれぞれ、集団中の少なくとも１つの他のポリヌクレオチドと重なる小さな部分を持つように設計されるため、部分的なハイブリダイゼーション（１１０５）が可能である。
ハイブリダイゼーション後、ＰＣＲ反応が始まる。ポリメラーゼサイクル中、ポリヌクレオチドは相補的断片にアニーリングされ、ギャップはポリメラーゼにより充填される。各サイクルは、どのポリヌクレオチドが互いに見出されるかに依存して、様々な断片の長さをランダムに増加させる。断片間の相補性は、完全な大きなスパンの二本鎖ＤＮＡの形成を可能にする（１１０６）。
ＰＣＲが完了した後、ナノリアクターは装置から分離され（１１０７）、ＰＣＲのためのプライマーを有する装置との相互作用のために配置される（１１０８）。密閉後、ナノリアクターはＰＣＲにかけられ（１１０９）、より大きな核酸が増幅される。ＰＣＲ（１１１０）の後、ナノチャンバが開放され（１１１１）、エラー補正試薬が加えられ（１１１２）、チャンバは密閉され（１１１３）、エラー補正反応が生じて、二本鎖ＰＣＲ増幅産物からの相補性が乏しいミスマッチ塩基対および／または鎖を取り除く（１１１４）。ナノリアクターが開放および分離される（１１１５）。エラー補正された産物は次に、ＰＣＲおよび分子バーコーディングなどの付加的なプロセシング工程にさらされ、その後、包装されて（１１２２）輸送される（１１２３）。
いくつかの例では、品質管理措置が取られる。エラー補正の後、品質管理工程は、例えば、エラー補正した生成物の増幅のためのシーケンシングプライマーを有するウェーハとの相互作用（１１１６）、エラー補正した増幅産物を含むチャンバにウェーハを密閉すること（１１１７）、および、追加の回の増幅を行うこと（１１１８）を含む。ナノリアクターは開放され（１１１９）、産物はプールされ（１１２０）、配列決定される（１１２１）。許容可能な品質管理の決定がなされた後、包装された産物（１１２２）は輸送を承認される（１１２３）。
いくつかの例では、図１１のものなどのワークフローによって生成される核酸は、本明細書に開示される重複プライマーを使用した突然変異誘発にさらされる。いくつかの例では、プライマーのライブラリは、固体支持体上でのインサイツの調製により生成され、並行して複数のオリゴマーを伸長させるための単一のヌクレオチド伸長プロセスを利用する。ポリヌクレオチドシンセサイザーなどの堆積装置は、段階的な手法で試薬を放出するように設計され、複数のポリヌクレオチドが並行して、一度に１つの残基を伸長させ、それによりあらかじめ決められた核酸配列を有するオリゴマーを生成する（１１０２）。
低いエラー率を有する大きなポリヌクレオチドライブラリ
提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドの平均エラー率は、１０００中で１未満、１２５０中で１未満、１５００中で１未満、２０００中で１未満で、３０００中で１未満であるか、またはしばしばそれよりも低い。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドの平均エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１２５０、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満であるか、またはそれよりも低い。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドの平均エラー率は、１／１０００未満である。
いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドの総エラー率は、あらかじめ定められた配列と比較して、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１２５０、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満であるか、またはそれよりも低い。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドに対する総エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、または１／１０００未満である。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドの総エラー率は、１／１０００未満である。
いくつかの例では、エラー補正酵素は、使用することができる提供された方法およびシステムを使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドに使用されてもよい。いくつかの例では、エラー補正を伴うポリヌクレオチドの総エラー率は、あらかじめ定められた配列と比較して、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満、またはそれ以下であってもよい。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドのエラー補正を伴う総エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、または１／１０００未満であってもよい。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリ内で合成されたポリヌクレオチドのエラー補正を伴う総エラー率は、１／１０００未満であってもよい。
エラー率は、遺伝子変異体のライブラリの産生のための遺伝子合成の値を制限することがある。１／３００のエラー率では、１５００の塩基対遺伝子におけるクローンの約０．７％が正しくなる。ポリヌクレオチド合成からのエラーのほとんどが、フレームシフト突然変異をもたらすことになるため、こうしたライブラリ中のクローンの９９％以上が、完全長タンパク質を生成しない。エラー率を７５％低下させることで、正確なクローンの画分を４０倍増加させることになる。本開示の方法および組成物は、合成の質の改善と、超並列および時間効率の良い方法で可能になるエラー補正方法の適用性の両方のおかげで、一般に観察される遺伝子合成方法よりも低いエラー率での大きなポリヌクレオチドと遺伝子のライブラリの迅速なデノボ合成を可能にする。したがって、ライブラリは、ライブラリ全体にわたって、またはライブラリの８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上にわたって、塩基の挿入、欠失、置換、あるいは１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１２５０、１／１５００、１／２０００、１／２５００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１００００、１／１２０００、１／１５０００、１／２００００、１／２５０００、１／３００００、１／４００００、１／５００００、１／６００００、１／７００００、１／８００００、１／９００００、１／１０００００、１／１２５０００、１／１５００００、１／２０００００、１／３０００００、１／４０００００、１／５０００００、１／６０００００、１／７０００００、１／８０００００、１／９０００００、１／１００００００未満、またはそれ以下である合計のエラー率で合成され得る。本開示の方法および組成物はさらに、あらかじめ決められた／あらかじめ選択された配列と比較して、エラーのない配列に関連するライブラリの少なくともサブセットでは、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上に関連付けられる低いエラー率での大きな合成オリゴヌクレオチドおよび遺伝子のライブラリに関する。いくつかの例では、ライブラリ内の単離した量でのポリヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上は、同じ配列を有している。いくつかの例では、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、またはそれ以上の類似性または同一性に関連する、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上は、同じ配列を有している。いくつかの例では、ポリヌクレオチドまたは遺伝子上の指定された座に関連するエラー率は、最適化される。したがって、大きなライブラリの一部としての１つ以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子の所定の座または複数の選択された座はそれぞれ、１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１２５０、１／１５００、１／２０００、１／２５００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１００００、１／１２０００、１／１５０００、１／２００００、１／２５０００、１／３００００、１／４００００、１／５００００、１／６００００、１／７００００、１／８００００、１／９００００、１／１０００００、１／１２５０００、１／１５００００、１／２０００００、１／３０００００、１／４０００００、１／５０００００、１／６０００００、１／７０００００、１／８０００００、１／９０００００、１／１００００００未満、またはそれより低いエラー率を有してもよい。様々な事例では、そのようなエラーを最適化した座は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、３００００、５００００、７５０００、１０００００、５０００００、１００００００、２００００００、３００００００、またはそれ以上の座を含んでもよい。エラーを最適化した座は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、３００００、７５０００、１０００００、５０００００、１００００００、２００００００、３００００００、またはそれ以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子に分布されてもよい。
エラー率は、エラー補正を伴ってまたは伴わずに達成され得る。エラー率は、ライブラリ全体にわたって、またはライブラリの８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上にわたって達成され得る。
コンピュータシステム
本明細書に記載されるシステムのいずれかがコンピュータに操作可能に接続され、局所的にまたは遠隔的にコンピュータを介して自動化されてもよい。様々な例では、本開示の方法およびシステムはさらに、コンピュータシステム上にソフトウェアプログラム、およびその使用を含んでもよい。したがって、材料堆積装置の動作、分配行為、および減圧作動を編成および同期するなど、機能の分配／減圧／再充填の同期のためのコンピュータ制御は、本開示の範囲内である。コンピュータシステムは、ユーザーに指定された塩基配列と材料堆積装置の位置との間に干渉するようにプログラムされ、基板の指定された領域に正しい試薬を送達する。
図１２で例証されるコンピュータシステム（１２００）は、媒体（１２１１）、および／または固定された媒体（１２１２）を有するサーバー（１２０９）に随意に接続可能されたネットワークポート（１２０５）からの命令を読み取ることができる論理的な装置として理解されてもよい。図１２に示されるものなどのシステムは、ＣＰＵ（１２０１）、ディスクドライブ（１２０３）、キーボード（１２１５）および／またはマウス（１２１６）などの随意の入力装置、および随意のモニター（１２０７）を含んでもよい。データ通信は指示された通信媒体を介して局所位置または遠隔位置のサーバーまで達成され得る。通信媒体は、データを送信および／または受信する任意の手段を含むことができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続であってもよい。そのような接続は、ワールド・ワイド・ウェブ上での通信を提供することができる。本開示に関するデータは、図１２に例示されるように当事者（１２２２）による受領および／または検討のためにそのようなネットワークまたは接続によって伝達され得ることが想定される。
図１３は、本開示の例と関連して使用可能なコンピュータシステム（１３００）の第１の例のアーキテクチャを示すブロック図である。図１３に表されるように、例示的なコンピュータシステムは、命令を処理するためのプロセッサ（１３０２）を含んでもよい。プロセッサの非限定的な例は、以下を含む：Ｉｎｔｅｌ Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサ、ＡＭＤ Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサ、Ｓａｍｓｕｎｇ ３２－ｂｉｔ ＲＩＳＣ ＡＲＭ １１７６ＪＺ（Ｆ）－Ｓ ｖ１．０（商標）プロセッサ、ＡＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ－Ａ８ Ｓａｍｓｕｎｇ Ｓ５ＰＣ１００（商標）プロセッサ、ＡＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ－Ａ８ Ａｐｐｌｅ Ａ４（商標）プロセッサ、Ｍａｒｖｅｌｌ ＰＸＡ ９３０（商標）プロセッサ、または機能的に同等なプロセッサ。実行の複数のスレッドが並列処理に使用可能である。いくつかの例では、複数のプロセッサ、または複数のコアを持つプロセッサも、単一のコンピュータシステム中であろうと、クラスターの中であろうと、または、複数のコンピュータ、携帯電話、および／または個人用携帯情報端末装置を含むネットワーク上のシステムにわたって分布されていても、使用可能である。
図１３に示されるように、高速キャッシュ（１３０４）は、プロセッサ（１３０２）に接続するか、または組み込まれることで、プロセッサ（１３０２）により近年使用されてきたまたは頻繁に使用されている命令またはデータのための高速メモリを提供することができる。プロセッサ（１３０２）は、プロセッサバス（１３０８）によりノースブリッジ（１３０６）に接続される。ノースブリッジ（１３０６）は、メモリバス（１３１２）によりランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（１３１０）に接続され、プロセッサ（１３０２）によりＲＡＭ（１３１０）へのアクセスを管理する。ノースブリッジ（１３０６）は、チップセットバス（１３１６）によりサウスブリッジ（１３１４）にも接続される。サウスブリッジ（１３１４）は次に、周辺バス（１３１８）に接続される。周辺バスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ－Ｘ、ＰＣＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ、または他の周辺バスであってもよい。ノースブリッジおよびサウスブリッジはしばしば、プロセッサチップセットと称され、周辺バス（１３１８）上でプロセッサと、ＲＡＭと、周辺コンポーネントとの間のデータ転送を管理する。いくつかの代替的なアーキテクチャでは、ノースブリッジの機能性は、別のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサに組み込まれることができる。いくつかの例では、システム（１３００）は、周辺バス（１３１８）に取り付けられたアクセラレータカード（１３２２）を含むことができる。アクセラレータは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または特定の処理を促進するための他のハードウェアを含んでもよい。例えば、アクセラレータは、適応データの再構成のために、または拡張された設定処理に使用される代数式を評価するために使用され得る。
ソフトウェアとデータは、外部記憶装置（１３２４）に記憶され、プロセッサにより使用されるＲＡＭ（１３１０）および／またはキャッシュ（１３０４）へとロードすることができる。システム（１３００）は、システムリソースの管理のためのオペレーティングシステムを含み；オペレーティングシステムの非限定的な例は、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、および他の機能的に同等なＯＳ、同様に、本開示の例に従ってデータの記憶と最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で実行するアプリケーションソフトウェアを含む。この例では、システム（１３００）はさらに、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）などの外部記憶装置、および分散並列処理に使用することができる他のコンピュータシステムにネットワークインターフェースを提供するために、周辺バスに接続されるネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）（１３２０）および（１３２１）を含む。
図１４は、複数のコンピュータシステム（１４０２ａ）および（１４０２ｂ）、複数の携帯電話および個人用携帯情報端末（１４０２ｃ）、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１４０４ａ）および（１４０４ｂ）を備えたネットワーク（１４００）を示す略図である。例では、システム（１４０２ａ）、（１４０２ｂ）、および（１４０２ｃ）は、データ記憶を管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１４０４ａ）および（１４０４ｂ）に記憶されたデータに対するデータアクセスを最適化することができる。数学モデルはこのデータに対して使用可能であり、コンピュータシステム（１４０２ａ）および（１４０２ｂ）、ならびに携帯電話および個人用携帯情報端末システム（１４０２ｃ）にわたって分散並列処理を使用して評価可能である。コンピュータシステム（１４０２ａ）および（１４０２ｂ）、ならびに携帯電話および個人用携帯情報端末システム（１４０２ｃ）は、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１４０４ａ）および（１４０４ｂ）に記憶されたデータの適応データ再構築に対して並列処理を提供することもできる。図１４は一例のみを示しており、様々な他のコンピュータのアーキテクチャおよびシステムは、本開示の様々な例と共に使用され得る。例えば、ブレードサーバーは並列処理を提供するために使用することができる。プロセッサブレードは、並列処理を提供するためにバックプレーンを介して接続可能である。ストレージも、バックプレーンに接続することができるか、または別のネットワークインターフェースを介してネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続可能である。いくつかの例では、プロセッサは、別のメモリ空間を維持し、ネットワークインターフェース、バックプレーン、または他のプロセッサによる並列処理のための他のコネクターを通じてデータを伝達することができる。他の例では、プロセッサのいくつかまたはすべてが、共有仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。
図１５は、例に従って共有仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサコンピュータシステム（１５００）のブロック図である。上記システムは、共有メモリサブシステム（１５０４）にアクセス可能な複数のプロセッサ（１５０２ａ－ｆ）を含む。上記システムは、メモリサブシステム（１５０４）に複数のプログラマブルハードウェアメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）（１５０６ａ－ｆ）を組み込む。各ＭＡＰ（１５０６ａ－ｆ）は、メモリ（１５０８ａ－ｆ）および１以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（１５１０ａ－ｆ）を含んでもよい。ＭＡＰは設定可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズムまたはアルゴリズムの一部は、各プロセッサと密接に協働して処理を行うためにＦＰＧＡ（１５１０ａ－ｆ）に提供可能である。例えば、ＭＡＰは、データモデルに関する代数式を評価し、かつ例における適応データの再構築を行うために使用することができる。この例では、各ＭＡＰは、このような目的のためのプロセッサすべてにより世界中からアクセス可能である。１つの構成では、各ＭＡＰは、関連するメモリ（１５０８ａ－ｆ）にアクセスするためにダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、それにより、各マイクロプロセッサ（１５０２ａ－ｆ）から独立して、かつこれらから非同期的に、タスクを実行することができる。この構成では、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン処理（ｐｉｐｅｌｉｎｉｎｇ）および並列実行のために別のＭＡＰに直接結果を供給することができる。
上記のコンピュータのアーキテクチャおよびシステムは単なる例に過ぎず、様々な他のコンピュータ、携帯電話、および、個人用携帯情報端末のアーキテクチャおよびシステムは、一般的なプロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡ、および他のプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、および他の処理要素と論理素子の任意の組み合わせを使用するシステムを含む例と共に使用することができる。いくつかの例では、コンピュータシステムのすべてまたは一部は、ソフトウェアまたはハードウェアに実装することができる。様々なデータ記憶媒体が、例えば、ランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、および他のローカルまたは分散データ記憶装置およびシステムを含む例と共に使用することができる。
例では、コンピュータシステムは、上記のまたは他のコンピュータのアーキテクチャおよびシステムのいずれかで実行されるソフトウェアモジュールを使用して実施することができる。他の例では、システムの機能は、ファームウェア、図１５で言及されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または他の処理要素および論理素子において、部分的または完全に実装することができる。例えば、セットプロセッサおよびオプティマイザは、図１３に示されるアクセラレータカード（１３２２）などのハードウェアアクセラレータカードの使用を介してハードウェアアクセラレーションで実施することができる。
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられ、いかなる方法でも本発明を制限するようには意図されていない。本明細書に記載される方法とともに、本実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであり、および、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。請求項の範囲によって定義される本発明の精神内に包含されるその変化および他の使用が、当業者に想定される。
実施例１：基板表面の官能化
ポリヌクレオチドのライブラリの付着および合成を助けるために、基板を官能化した。基板表面をまず、２０分間、９０％のＨ２ＳＯ４および１０％のＨ２Ｏ２を含むピラニア溶液を使用して湿式洗浄した。基板を、ＤＩ水を含む様々なビーカー中ですすぎ、５分間ＤＩ水のグーズネック形状の蛇口下で保持して、Ｎ２で乾燥させた。基板をその後、ＮＨ４ＯＨ（１：１００；３ｍＬ：３００ｍＬ）に５分間浸し、ハンドガン（ｈａｎｄｇｕｎ）を使用してＤＩ水ですすぎ、ＤＩ水を含む３つの連続するビーカーの中でそれぞれ１分間浸し、その後、ハンドガンを使用してＤＩ水で再びすすいだ。その後、基板表面をＯ２にさらすことにより基板をプラズマ洗浄した。ＳＡＭＣＯ ＰＣ－３００機器を使用して、下流モードで１分間、２５０ワットでＯ２をプラズマエッチングした。
以下のパラメータ：０．５から１トル、６０分、７０℃、１３５℃の気化器を有するＹＥＳ－１２２４Ｐ気相蒸着オーブンシステムを使用して、汚れを落とした基板表面をＮ－（３－トリエトキシシリルプロピル）－４－ヒドロキシブチルアミドを含む溶液で能動的に官能化した。Ｂｒｅｗｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００Ｘスピンコータを使用して、基板表面をレジストコートした（ｒｅｓｉｓｔ ｃｏａｔｅｄ）。ＳＰＲ（商標）３６１２フォトレジストを、４０秒間２５００ｒｐｍで基板上でスピンコートした。Ｂｒｅｗｅｒホットプレート上で、９０℃で３０分間、基板をプリベイクした。Ｋａｒｌ Ｓｕｓｓ ＭＡ６マスクアライナー機器を使用して、基板をフォトリソグラフィーに曝露した。基板を２．２秒間曝露し、ＭＳＦ ２６Ａの中で１分間、現像させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。残りの現像剤（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）をハンドガンですすぎ、基板を５分間水に浸した。基板をオーブン中で１００℃にて３０分間ベイクし、その後、Ｎｉｋｏｎ Ｌ２００を使用してリソグラフィーの欠損について目視検査を行った。デスカム処理を使用してＳＡＭＣＯ ＰＣ－３００機器を用いて残りのレジストを取り除き、１分間２５０ワットでＯ２プラズマエッチングした。
基板表面を、１０μＬの軽油と混合したペルフルオロオクチルトリクロロシランの１００μＬ溶液で受動的に官能化した。基板をチャンバに入れ、１０分間ポンプでくみ出し、その後、バルブを閉じてポンプを止め、１０分間放置した。チャンバを通気した。最大パワー（Ｃｒｅｓｔシステム上で９）での超音波処理によって７０℃で５００ｍＬのＮＭＰ中で５分間に２回の浸漬を行うことにより、基板をレジスト剥離した。その後、最大パワーでの超音波処理により室温で５００ｍＬのイソプロパノール中に５分間、基板を浸した。基板を、３００ｍＬの２００プルーフエタノール（２００ ｐｒｏｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ）に漬けて、Ｎ２で送風乾燥した。官能化した表面を活性化させて、ポリゴヌクレオチド合成のための支持体として機能させた。
実施例２：ポリヌクレオチド合成装置上での５０ｍｅｒの配列の合成
二次元ポリヌクレオチド合成装置をフローセルに組み入れ、フローセル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ「ＡＢＩ３９４ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ」）に接続させた。Ｎ－（３－トリエトキシシリルプロピル）－４－ヒドロキシブチルアミド（Ｇｅｌｅｓｔ）でポリヌクレオチド合成装置を均一に機能化し、これを使用し、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成方法を用いて５０ｂｐの例示的なポリヌクレオチド（「５０ｂｐ（５０－ｍｅｒ）のポリヌクレオチド」）を合成した。
５０ｍｅｒの配列は、配列番号：１に記載されている通りであった。５’ＡＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＧＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号：１）、ここで、＃は、チミジン－スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ－２２４４）を表し、これは、脱保護中に表面からのポリゴヌクレオチドの放出を可能にする切断可能なリンカーである。
表２のプロトコルおよびＡＢＩシンセサイザーに従い、標準ＤＮＡ合成化学（カップリング、キャッピング、酸化、および脱ブロック化）を使用して合成を行った。
Figure 2022521766000003
Figure 2022521766000004
Figure 2022521766000005
ホスホラミダイト／活性化因子の組み合わせを、フローセルを介するバルク試薬の送達と同様に送達した。環境が時間全体にわたって試薬により「湿った」ままであるときには、いかなる乾燥工程も行わなかった。
フローリストリクターをＡＢＩ ３９４シンセサイザーから取り除き、より速い流れを可能した。フローリストリクターなしで、アミダイト（ＡＣＮ中で０．１Ｍ）、活性化因子（ＡＣＮ中で０．２５Ｍのベンゾイルチオテトラゾール（「ＢＴＴ」；ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈの３０－３０７０－ｘｘ））、およびＯｘ（２０％のピリジン、１０％の水、および７０％のＴＨＦ中の０．０２ＭのＩ２）の流量は、およそ～１００ｕＬ／秒、アセトニトリル（「ＡＣＮ」）およびキャッピング試薬（ＣａｐＡとＣａｐＢの１：１の混合物、ここで、ＣａｐＡはＴＨＦ／ピリジン中の無水酢酸であり、ＣａｐＢはＴＨＦ中の１６％の１－メチルイミダゾール（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ））についてはおよそ～２００ｕＬ／秒、および、Ｄｅｂｌｏｃｋ（トルエン中の３％のジクロロ酢酸）についてはおよそ～３００ｕＬ／秒（フローリストリクターですべての試薬に対して～５０ｕＬ／秒と比較して）であった。酸化剤（Ｏｘｉｄｉｚｅｒ）を完全に押し出す時間を観察し、化学フロー時間のタイミングを適宜調整し、余分なＡＣＮ洗浄を異なる化学物質間に導入した。ポリヌクレオチド合成後、７５ｐｓｉで一晩、ガス状のアンモニア中でチップを脱保護した。表面に水を５滴加えて、ポリヌクレオチドを回収した。その後、回収したポリヌクレオチドを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒの小さなＲＮＡチップ上で分析した（データは示されていない）。
実施例３：ポリヌクレオチド合成装置上での１００ｍｅｒの配列の合成
５０ｍｅｒの配列の合成について実施例２に記載されるのと同じプロセスを、１００ｍｅｒのポリヌクレオチド（「１００ｍｅｒのポリヌクレオチド」；５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＴＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’、ここで、＃はチミジン－スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ－２２４４）；配列番号：２を表す）の、２つの異なるシリコンチップ上での合成に使用し、第１のシリコンチップはＮ－（３－トリエトキシシリルプロピル）－４－ヒドロキシブチルアミドで均一に官能化され、第２のシリコンチップは１１－アセトキシウンデシルトリエトキシシランとｎ－デシルトリエトキシシランの５／９５の混合物で官能化され、表面から抽出されたポリヌクレオチドを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ機器で分析した（データは示されていない）。
以下の熱サイクルプログラムを使用して、５０ｕＬのＰＣＲ混合物（２５ｕＬのＮＥＢ Ｑ５ マスターミックス、２．５ｕＬの１０ｕＭフォワードプライマー、２．５ｕＬの１０ｕＭリバースプライマー、表面から抽出した１ｕＬのポリヌクレオチド、および最大５０ｕＬの水）中で、フォワードプライマー（５’ＡＴＧＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ３’；配列番号：３）およびリバースプライマー（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧ３’；配列番号：４）を使用して、２つのチップからの１０の試料すべてをさらに増幅した：
９８Ｃ、３０秒；
９８Ｃ、１０秒；６３Ｃ、１０秒；７２Ｃ、１０秒；１２のサイクルを繰り返す
７２Ｃ、２分
ＰＣＲ生成物をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上でも実行して（データは示されていない）、１００ｍｅｒの位置での鋭いピークを実証した。次に、ＰＣＲ増幅試料をクローン化し、サンガーシーケンシングを行った。表３は、チップ１からのスポット１－５から得た試料、およびチップ２からのスポット６－１０から得た試料に対するサンガーシーケンシングから生じる結果を要約する。
Figure 2022521766000006
ゆえに、高品質および高均一性の合成ポリヌクレオチドを、異なる界面化学的性質を持つ２つのチップ上で繰り返した。配列決定された１００ｍｅｒの２６２のうち２３３に対応している全体の８９％が、エラーのない完全な配列であった。
最後に、表４は、スポット１－１０からのポリヌクレオチド試料から得た配列に対するエラー特徴を要約している。
Figure 2022521766000007
実施例４：２９，０４０の固有のポリヌクレオチドの並列アセンブリ
図１６に示すように、各々、平坦なシリコンプレート（１６０１）上に１２１の座を含む２５６のクラスター（１６０５）を含む構造体を製造した。クラスターの拡大図が、１２１の座を有する（１６１０）で示されている。２５６のクラスターの２４０からの座は、特徴的な配列を有するポリヌクレオチドの合成のための取り付けおよび支持を提供した。ポリヌクレオチドの合成は、実施例３からの一般的な方法を用いて、ホスホラミダイト化学によって行われた。２５６のクラスターのうち１６からの座は対照クラスターであった。合成された２９，０４０の固有のポリヌクレオチド（２４０×１２１）の包括的な分布を、図１７Ａに示す。ポリヌクレオチドライブラリは、高い均一性で合成された。配列の９０％は、平均の４倍以内のシグナルに存在し、１００％の表現を可能にした。分布は、図１７Ｂに示すように、各クラスターについて測定された。４つの代表的なクラスター中で合成された固有のポリヌクレオチドの分布を、図１８に示す。包括的なレベルでは、実行中のすべてのポリヌクレオチドが存在し、９９％のポリヌクレオチドは、合成の均一性を示す平均の２倍以内の存在量を有していた。クラスターごとのレベルでもこの同じ観察結果は一致していた。
各ポリヌクレオチドのエラー率は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ遺伝子シーケンサーを用いて決定された。２９，０４０の固有のポリヌクレオチドに対するエラー率の分布を図１９Ａに示し、５００塩基に約１個の割合で平均し、８００塩基に１個の割合の低いエラー率のものもある。分布は、図１９Ｂに示すように、各クラスターについて測定された。４つの代表的なクラスターにおける固有のポリヌクレオチドのエラー率分布を、図２０に示す。２９，０４０の固有のポリヌクレオチドのライブラリは、２０時間未満で合成された。
２９，０４０の固有のポリヌクレオチドのすべてでのＧＣパーセンテージ対ポリヌクレオチド表現の分析は、ＧＣ含量にかかわらず、合成が均一であることを示した（図２１）。
実施例５：試料の調製と、ポリヌクレオチド標的化ライブラリによる濃縮
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料から得て、断片化緩衝液で酵素的に断片化し、末端を修復し、３’アデニル化した。二重インデックスアダプター（１６の固有のバーコードの組み合わせ）をゲノムＤＮＡ断片の両末端にライゲートして、アダプタータグ付きｇＤＮＡ鎖のライブラリを作製し、アダプタータグ付きＤＮＡライブラリを高忠実度ポリメラーゼで増幅した。その後、ｇＤＮＡライブラリを、ユニバーサルアダプターブロッカーの存在下で、９６℃で一本鎖に変性させた。ポリヌクレオチド標的化ライブラリ（プローブライブラリ）を９６℃のハイブリダイゼーション溶液で変性させ、７０℃で１６時間、ハイブリダイゼーション溶液中で、変性したタグ付きｇＤＮＡライブラリと組み合わせた。その後、ハイブリダイズしたタグ付きｇＤＮＡ－プローブに結合緩衝液を加え、ストレプトアビジンからなる磁気ビーズを用いてビオチン化したプローブをキャプチャーした。磁石を使ってビーズを溶液から分離させ、ビーズを緩衝液で３回洗浄して、結合していないアダプター、ｇＤＮＡ、アダプターブロッカーを除去した後、溶出緩衝液を添加して、濃縮されたタグ付きｇＤＮＡ断片をビーズから放出した。タグ付きｇＤＮＡ断片の濃縮されたライブラリを高忠実度ポリメラーゼで増幅して、クラスター生成に十分な収量を得た後、ＮＧＳ機器を用いてライブラリを配列決定した。
実施例６：エクソーム標的化ポリヌクレオチドプローブライブラリを用いたゲノムＤＮＡキャプチャー
ヒトエクソームを標的とする少なくとも５０万の非同一ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド標的化ライブラリを、実施例３の一般的な方法を用いるホスホラミダイト化学、および、実施例５の一般的な方法を用いて制御された化学量論によって、設計して構造体上で合成することで、ライブラリ４を生成した。その後、このポリヌクレオチドをビオチンで標識し、溶解させて、エクソームプローブライブラリ溶液を形成した。実施例１６の一般的な方法を用いて、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料から乾燥したインデックス化ライブラリプールを得た。
エクソームプローブライブラリ溶液、ハイブリダイゼーション溶液、遮断薬ミックスＡ、および遮断薬ミックスＢを、２秒間パルスボルテックスすることにより混合した。ハイブリダイゼーション溶液を６５℃で１０分間、または沈殿物がすべて溶解するまで加熱し、その後、ベンチトップでさらに５分間室温に戻した。２０μＬのハイブリダイゼーション溶液と４μＬのエクソームプローブライブラリ溶液を薄肉のＰＣＲ ０．２ｍＬストリップチューブに添加し、ピペッティングで静かに混合した。組み合わせたハイブリダイゼーション溶液／エクソームプローブ溶液を１０５℃の蓋付きサーマルサイクラーで２分間９５℃に加熱し、すぐに氷上で少なくとも１０分間冷却した。次いで、溶液をベンチトップ上で５分間室温まで冷却した。ハイブリダイゼーション溶液／エクソームプローブライブラリ溶液が冷却されている間に、各ゲノムＤＮＡ試料に９μｌまで水を加え、薄肉のＰＣＲ ０．２ｍＬストリップチューブ内の乾燥インデックス化ライブラリプールに遮断薬ミックスＡを５μｌ、遮断薬ミックスＢを２μｌ添加した。その後、溶液をピペッティングで静かに混合した。プールされたライブラリ／遮断薬チューブを１０５℃の蓋付きサーマルサイクラーで９５℃で５分間加熱し、その後、次の工程に進む前にベンチトップで５分以下、室温に戻した。ハイブリダイゼーションミックス／プローブ溶液をピペッティングで混合し、全２４μＬのプールされたライブラリ／遮断薬チューブに添加した。キャプチャー反応ウェル全体を、気泡を発生させないように、静かなピペッティングによって混合した。試料チューブは、チューブがしっかりと密封されていることを確認するためにパルススピンされた。キャプチャー／ハイブリダイゼーション反応は、８５℃の蓋の温度で、ＰＣＲサーモサイクラーで１６時間、７０℃で加熱された。
結合緩衝液、洗浄緩衝液１、および洗浄緩衝液２を、沈殿物がすべて溶液に溶解するまで、４８℃で加熱した。７００μＬの洗浄緩衝液２を１回キャプチャーするたびにアリコートし、４８℃に予熱した。ストレプトアビジン結合ビーズおよびＤＮＡ精製ビーズを室温で少なくとも３０分間平衡化した。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘなどのポリメラーゼ、および増幅プライマーを氷上で解凍した。いったん試薬を解凍して、試薬を２秒間パルスボルテックスで混合した。キャプチャー反応あたり５００μＬの８０％エタノールを調製した。ストレプトアビジン結合ビーズを室温で予備平衡化し、均質化するまでボルテックスした。１００μＬのストレプトアビジン結合ビーズを、１回のキャプチャー反応ごとに、清潔な１．５ｍＬマイクロチューブに添加した。２００μＬの結合緩衝液を各チューブに添加し、各チューブをホモジナイズするまで、ピペッティングで混合した。チューブを磁石スタンドに置いた。ストレプトアビジン結合ビーズを１分以内にペレット化した。チューブを取り出し、ビーズペレットを乱さないように注意しながら、透明な上清を捨てた。チューブを磁石スタンドから取り出し、洗浄をさらに２回繰り返した。３回目の洗浄後、チューブを除去し、透明な上清を捨てた。結合緩衝液の最後の２００μＬを添加し、ビーズを均質になるまでボルテックスで再懸濁した。
ハイブリダイゼーション反応完了後、サーマルサイクラーの蓋を開け、キャプチャー反応の全量を、洗浄したストレプトアビジン結合ビーズに速やかに移した（３６－４０μＬ）。この混合物を、キャプチャー反応／ストレプトアビジン結合ビーズ溶液のホモジナイズしたまま維持するのに十分な速度で、シェーカー、ロッカー、またはローテーター上で室温で３０分間混合した。キャプチャー反応／ストレプトアビジン結合ビーズ溶液は、すべての溶液がチューブの底にあることを確認するために、ミキサーとパルススピンから取り除かれた。試料を磁気スタンドに置き、ストレプトアビジン結合ビーズをペレット化して、１分以内に透明な上清を残した。この透明な上清を除去して廃棄した。チューブを磁気スタンドから取り出し、２００μＬの洗浄緩衝液を室温で添加し、その後、ホモジナイズするまでピペッティングにより混合した。すべての溶液がチューブの底にあることを確認するために、チューブをパルススピンした。サーマルサイクラーを以下の条件でプログラムした（表５）。
加熱した蓋の温度を１０５℃に設定した。
Figure 2022521766000008
増幅プライマー（２．５μＬ）とＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（２５μＬ）などのポリメラーゼを、水／ストレプトアビジン結合ビーズスラリーを入れたチューブに添加し、チューブをピペッティングで混合した。その後、チューブを２つの反応に分割した。チューブをパルススピンしてサーマルサイクラーに移し、表５のサイクリングプログラムを開始した。サーマルサイクラープログラムが完了すると、試料をブロックから取り出し、すぐに精製に供した。室温で予備平衡化したＤＮＡ精製ビーズをホモジナイズするまでボルテックスした。９０μＬ（１．８倍）のホモジナイズされたＤＮＡ精製ビーズをチューブに添加し、ボルテックスによりよく混合した。チューブを室温で５分間インキュベートし、磁石スタンドに置いた。ＤＮＡ精製ビーズをペレット化して、１分以内に透明な上清を残した。透明な上清を廃棄して、チューブを磁石スタンドに残した。ＤＮＡ精製ビーズのペレットを２００μＬの新しく調製した８０％エタノールで洗浄し、１分間インキュベートし、その後、除去して、エタノールを廃棄した。洗浄は、チューブを磁石スタンド上に置いたまま、１回繰り返し、合計２回の洗浄を行った。残されたすべてのエタノールを除去し、ＤＮＡ精製ビーズペレットを乱さないように注意しながら、１０μＬのピペットで廃棄した。ＤＮＡ精製ビーズペレットを磁石スタンド上で５－１０分間、またはペレットが乾燥するまで、風乾させた。チューブを磁石スタンドから取り出し、３２μＬの水を加え、ホモジナイズするまでピペッティングで混合し、室温で２分間インキュベートした。チューブを３分間、またはビーズが完全にペレット化されるまで、磁気スタンド上に置いた。３０μＬの透明な上清を回収し、ＤＮＡ精製ビーズのペレットを乱さないように注意しながら、清潔な薄肉のＰＣＲ ０．２ｍＬストリップチューブに移した。平均断片長は、分析装置で１５０ｂｐ－１０００ｂｐの範囲設定を使用して、約３７５ｂｐ－約４２５ｂｐの間であった。理想的には、最終濃度値は少なくとも約１５ｎｇ／μＬである。各キャプチャーは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて定量化され、検証された。
対照薬エクソームキャプチャーキット（対照薬キットＤ）と比較した、ＮＧＳ測定基準の概要を表６、表７に示す。ライブラリ４は、対照薬キットＤよりも高い割合でエクソン標的に対応するプローブ（ベイト）を有している。このおかげで、ライブラリ４を用いて標的配列の同等の品質およびカバレッジを得るためのシーケンシングが少なくて済む。
Figure 2022521766000009
Figure 2022521766000010
キットＤとライブラリ４の両方についての重複する標的領域の比較（９６倍のカバレッジに正規化された総リード）を表８に示す。ライブラリ４はハイブリダイゼーションあたり８試料として処理され、キットＤはハイブリダイゼーションあたり２試料として処理された。さらに、両方のライブラリについて、重複領域からの一塩基多型およびインフレーム欠失コールを、“Ｇｅｎｏｍｅ ｉｎ ａ Ｂｏｔｔｌｅ”ＮＡ１２８７８参照データから同定された高信頼度領域に対して比較した（表９）。ライブラリ４は、ＳＮＰおよびインデルの同定においてキットＤと同等またはそれ以上のパフォーマンス（インデルの精度がより高い）を示した。「インデル」との用語は、本明細書で使用されるように、あらかじめ決められた配列とは異なる挿入および欠失を含むエラーの一種を指す。
Figure 2022521766000011
Figure 2022521766000012
精度は、真の陽性コール対合計（真および偽）の陽性コールの比を表す。感度は、真の陽性コール対合計の真の値（真の陽性と偽の陰性）の比を表す。
実施例７．ユニバーサルアダプターを用いるライブラリ調製
二重インデックスアダプターをユニバーサルアダプターに交換する変更を行って、実施例５または６の一般的な方法を用いて核酸サンプルを調製した。ユニバーサルアダプターをライゲートした後、アダプターライゲートされた試料核酸ライブラリの増幅は、バーコード化プライマーライブラリで行われ、バーコード化アダプターライゲートされた試料核酸ライブラリを生成した。その後、このライブラリを直接配列決定した。ユニバーサルアダプターを使用することで、標準的な二重インデックスＹアダプターと比較して、増幅後のライブラリ核酸濃度が増加した（図４Ａ）。さらに、ユニバーサルアダプターを用いて調製されたライブラリは、標準的な二重インデックスＹアダプターに比べてＡＴのドロップアウトが少なく（図４Ｂ）、すべてのインデックス配列を均一に表現することができた。（図５）
実施例８．ユニバーサルアダプターを用いるライブラリ調製および濃縮
二重インデックスアダプターをユニバーサルアダプターに交換する変更を行って、実施例５または６の一般的な方法を用いて核酸サンプルを調製した。ユニバーサルアダプターをライゲートした後、アダプターライゲートされた試料核酸ライブラリの増幅は、バーコード化プライマーライブラリで行われ、バーコード化アダプターライゲートされた試料核酸ライブラリを生成した。その後、このライブラリは、類似する濃縮、精製およびシーケンシングの工程に晒された。ユニバーサルアダプターの使用は、同等の、またはより優れたシーケンシング結果をもたらした（図６Ａおよび図６Ｂ）。
実施例９．修飾塩基を含むユニバーサルアダプターを用いるライブラリ調製
ユニバーサルアダプターが少なくとも１つのロックド核酸または架橋核酸を含むという変更を行った実施例８の一般的な方法を用いて、核酸サンプルを調製する。ユニバーサルアダプターをライゲートした後、アダプターライゲートされた試料核酸ライブラリの増幅が、バーコード化プライマーライブラリで行われ、バーコード化アダプターライゲートされた試料核酸ライブラリを生成する。その後、このライブラリは、類似する濃縮、精製およびシーケンシングの工程に晒される。
実施例１０．短いバーコード化プライマーを有するユニバーサルアダプターを用いるライブラリ調製
バーコード化プライマーの各々がユニバーサルアダプターの全長よりも短い長さに結合するという変更を行った実施例８の一般的な方法を用いて、核酸サンプルを調製する。
実施例１１．核酸塩基アナログ含有ユニバーサルアダプターを用いるライブラリ調製および短いバーコード化プライマーを用いる増幅
二重インデックスアダプターが、１つ以上の核酸塩基アナログ（例えば、ロックド核酸または架橋核酸）を含むユニバーサルアダプターと取り替えられるという変更を行った実施例８の一般的な方法を用いて、核酸サンプルを調製する。ユニバーサルアダプターをライゲートした後、アダプターライゲートされた試料核酸ライブラリの増幅が、バーコード化プライマーライブラリで行われ、バーコード化アダプターライゲートされた試料核酸ライブラリを生成する。バーコードの各々はユニバーサルアダプターの全長よりも短い長さに結合する。その後、このライブラリは、類似する濃縮、精製およびシーケンシングの工程に晒される。
実施例１２．ユニバーサルアダプターと標準的な二重インデックスアダプターを用いて調製されたシーケンシングライブラリの比較
１０ｂｐの二重インデックスを含むユニバーサルアダプターが利用された（８つのＰＣＲサイクル、Ｎ＝１２）という変更を行った実施例８の一般的な方法を用いて、核酸サンプルをゲノムＤＮＡ（５０ｎｇのＮＡ１２８７８）から調製した。比較のために、標準的な完全長のＹアダプターも、同じゲノムＤＮＡ試料（１０のＰＣＲサイクル、Ｎ＝１２）について試験した。ユニバーサルアダプターを利用するプロトコルは、増幅後の高い全収率（図２３）と、低いアダプター二量体形成（図２４）をもたらした。
実施例１３．１０ｂｐのＵＤＩユニバーサルアダプターと８ｂｐのコンビナトリアルデュアルプライマーを用いて調製されたシーケンシングライブラリの比較。
１０ｂｐのインデックス配列（Ｎ＝９６）または８ｂｐのインデックス配列（Ｎ＝９６）のいずれかを含むユニバーサルプライマーが、ライブラリの最終増幅工程に使用されたという実施例８の一般的な方法を用いて、核酸サンプルをゲノムＤＮＡ（ＮＡ１２８７８）から調製した。相対的なシーケンシングパフォーマンスは、各デザインの完全なインデックスリードの合計数を正規化して、トップのパフォーマーに正規化することで、算出され、結果として得られた各集団の分布は、直接比較するために、算出された平均値を中心とした。１０ｂｐのユニバーサルプライマーを用いた実験は、より厳格な相対的なパフォーマンスと、より均一なシーケンシング表現を示し（図２５Ａおよび２５Ｂ）、９６の固有のインデックスすべてにおいて相対的なパフォーマンスが高かった（図２６）。
実施例１４．固有の二重インデックスライブラリのスクリーニングおよび評価
実施例１３の一般的な手順に従って、固有の二重インデックス配列を含む１，１５２のライブラリを構築し、均等なシーケンシングパフォーマンスを得るために反復的にスクリーニングした（図２７Ａ）。ライブラリは、酵素による断片化を用いて生成され、ヒトゲノム材料をインサートとして含んでいた。個々のライブラリを質量によってプールし、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ ｖ２キットを用いて配列決定して、２×１０ｂｐのインデックスリードを生成した。インデックスリード個々の対（許可されたミスマッチは１回）の合計数を測定し、平均値に対する各対の相対的なパフォーマンスを算出した。その結果、単一の大きなプール（図２７Ｂ）としても、または、４×９６メンバーの個々のセット（図２７Ｃ－２７Ｆ）としても、±２５％の平均値に対するシーケンシングパフォーマンスをもたらした３８４のＵＤＩ配列が同定された。
実施例１５：様々なエクソーム標的化ポリヌクレオチドプローブライブラリを用いたゲノムＤＮＡキャプチャー
ヒトエクソームを標的とする少なくとも５０万の非同一ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド標的化ライブラリを、実施例３の一般的な方法を用いるホスホラミダイト化学、および、実施例５の一般的な方法を用いて制御された化学量論によって、設計して構造体上で合成することで、ライブラリ４Ａを生成した。その後、このポリヌクレオチドをビオチンで標識し、溶解して、エクソームプローブライブラリ溶液を形成した。実施例５の一般的な方法を用いて、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料から乾燥したインデックス化ライブラリプールを得た。
様々なプローブライブラリを用いるＤＮＡキャプチャーは、実施例６に記載される方法を用いて行われた。簡潔に説明すると、エクソームプローブライブラリ溶液、ハイブリダイゼーション溶液、遮断薬ミックスＡ、および遮断薬ミックスＢを混合し、ハイブリダイゼーションミックス／プローブ溶液を調製した。ハイブリダイゼーション反応を行った後、キャプチャー反応を行った。その後、溶液を増幅させて、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を行った。
ライブラリ４Ａは、実施例６に記載された対照薬キットＤを含む様々な対照薬エクソームキャプチャーキットと比較された。ＮＧＳ測定基準の概要は、ライブラリ４Ａを用いる様々な対照薬エクソームキャプチャーキットの表１０に示される。
Figure 2022521766000013
様々なライブラリを、均一性、特異性、および重複率について評価した。図２８Ｂに見られるように、ライブラリ４Ａは、対照薬キットと比較して、標的の濃縮効率（ｆｏｌｄ－８０ ｂａｓｅ ｐｅｎａｌｔｙによって測定される）を３５－６０％増加させた。図２８Ｃ－２８Ｄに見られるように、ライブラリ４Ａは、特異性およびオンターゲット率を増加させた。オンターゲット率は、オンターゲット塩基をアラインメントされたＰＦ塩基で割った値として測定された。ライブラリ４Ａは、図２８Ｅ－２８Ｆに見られるように、重複率によって示されるように、改善されたオリゴヌクレオチド合成、最適化された二本鎖プローブ、および互換性のある緩衝液とワークフローを示した。
様々なライブラリを、カバレッジの深度と最大シーケンシング出力についても評価した。図２９に見られるように、ライブラリ４Ａを使用する１５０倍の総合的な生のシーケンシングでは、３０倍で９５％の標的塩基がカバーされた。表１１は、ライブラリ４Ａが最大配列出力を最大化したことを示している。
Figure 2022521766000014
実施例１６．柔軟かつモジュール式のカスタムパネル
内容物は添加または増強可能である。図３０Ａ－図３０Ｂを参照。パネルに内容物を加えることで、カバーされる標的の数が増える。パネルに内容物を増強することは、特定の領域のカバレッジを意味する。
ＲｅｆＳｅｑデータベースに由来する３Ｍｂのさらなる標的領域が追加された。このパネルを作成することで、カバレッジが増加し、パフォーマンスは低下しなかった。カバレッジは、ＲｅｆＳｅｑ、ＣＣＤＳ、およびＧＥＮＣＯＤＥのデータベースの９９％以上に改善した。さらに、カスタムパネルは高い均一性とオンターゲット率、および低い重複率を示した（すべての結果は１５０倍のシーケンシングに基づく）。
表１２に見られるようなデータベースのカバレッジは、本明細書に記載されるようなカスタムパネルを使用して増加した。データは、２０１８年５月現在（ＵＣＳＣゲノムブラウザ）の一次ヒトゲノムアセンブリ（代替染色体は除外された）に注釈をつけたデータベースにおけるタンパク質コード領域へのパネル内容物の重複を比較した。対照薬Ａ１、対照薬Ａ２、および対照薬Ｄは、市販の対照薬パネルである。比較は、ＢＥＤｔｏｏｌｓスイートおよび括弧内に示されたゲノムバージョンを用いて行われた。３Ｍｂの内容物を追加することで、ＲｅｆＳｅｑとＧＥＮＣＯＤＥのデータベースのカバレッジを９９％以上に向上させた。
Figure 2022521766000015
図３０Ｃ－３０Ｅは、パネル１とパネル１＋補足プローブ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｂｅｓ）ｏｎ Ｆｏｌｄ（図３０Ｃ）、重複率（図３０Ｄ）、およびオンターゲットパーセント（図３０Ｅ）のデータを示す。図３０Ｆと図３０Ｇは、標的カバレッジ（図３０Ｆ）とｆｏｌｄ－８０ ｂａｓｅ ｐｅｎａｌｔｙ（図３０Ｇ）の比較データを示す。
図３０Ｈは、本明細書に記載されるライブラリの調整可能な標的カバレッジを示す。図３０Ｈの上部パネルに見られるように、３４．９の平均カバレッジがあり、２０倍以上で標的塩基の９１％が観察された。図３０Ｈの下部パネルに見られるように、６７．５の平均カバレッジがあり、２０倍以上で標的塩基の９７％が観察された。
実施例１７．ＲｅｆＳｅｑデザイン
ＲｅｆＳｅｑパネルデザインはｈｇ３８で設計され、ＣＣＤＳ２１、ＲｅｆＳｅｑ全コード領域、およびＧＥＮＣＯＤＥ ｖ２８塩基コード配列の組み合わせを含んでいた。ＲｅｆＳｅｑ単独（Ｅｘｏｍｅ）のサイズは３．５Ｍｂであり、Ｃｏｒｅ Ｅｘｏｍｅ＋ＲｅｆＳｅｑの組み合わせ（Ｅｘｏｍｅ＋ＲｅｆＳｅｑ）は３６．５Ｍｂであった。実験は、５０ｎｇのｇＤＮＡ（ＮＡ１２８７８）を１プレックスおよび８プレックスとして３回繰り返してランし、７６ｂｐリードの１５０倍のシーケンシングで評価した。標的ファイルは３６．５Ｍｂであった。図３１Ａを参照する。
ＲｅｆＳｅｑパネルデザインを、カバレッジの深度、特異性、均一性、ライブラリの複雑さ、重複率、およびカバレッジ率について評価した。図３１Ｂ－３１Ｃはカバレッジの深度を示す。２０倍で９５％を超える標的塩基が観察された。３０倍で９０％を超える標的塩基が観察された。図３１Ｄは、ＲｅｆＳｅｑパネルの特異性を示す。オフターゲットパーセントは０．２未満であった。図３１Ｅは、ＲｅｆＳｅｑパネルの均一性を示す。ｆｏｌｄ８０は１．５未満であった。図３１Ｆは、ライブラリの複雑さを示す。ライブラリサイズは３億２，０００万より大きかった。図３１Ｇは、ＲｅｆＳｅｑパネルの重複率を示す。重複率は４％未満であった。図３１ＨはＲｅｆＳｅｑパネルのカバレッジ率を示す。カバレッジ率は０．９－１．１の間であった。図３１Ｈで見られるように、カバレッジ比は１．１未満であった。
実施例１８．一連のパネルサイズおよび標的領域でのカスタムパネルデザイン
実施例６の一般的な方法を用いて、シーケンシングデータを取得した。ライブラリの詳細が表１３で見られる。簡潔に説明すると、製造業者の推奨事項に従って、シングルプレックスプールあたり５００ｎｇのｇＤＮＡ（ＮＡ１２８７８；Ｃｏｒｉｅｌｌ）を使用して、本明細書で設計された複数の標的濃縮パネルを使用して、ハイブリッドキャプチャーを実施した。２ｘ７６ペアエンドのリードを生成するために、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ ｖ２キットを用いてシーケンシングを行った。データを標的サイズの１５０倍にダウンサンプリングし、２０のマッピング品質、Ｎ＝２のＰｉｃａｒｄ測定基準を用いて解析した。パネルは、均一性の改善および低い重複率と同様に、高い割合のオンターゲットリードをもたらした。図３２Ａ－３２Ｂは、３０倍のカバレッジを達成した各パネルのリードの割合を示し、図３２Ｃは均一性（ｆｏｌｄ－８０）を示している。
Figure 2022521766000016
実施例１９．濃縮ワークフロー
濃縮ワークフロータイムラインが図３３Ａに見られる。実施例６の一般的な方法を用いて、シーケンシングデータを取得した。簡潔に説明すると、ゲノムＤＮＡ（ＮＡ１２８７８、Ｃｏｒｒｉｅｌｌ）をハイブリダイズし、エクソームパネルまたはカスタムパネルを用いてキャプチャーした。２つの異なるプローブライブラリ（エクソームプローブまたはカスタムパネル）を核酸試料にハイブリダイゼーションする間、「高速」ハイブリダイゼーション緩衝液を液体ポリマーとともに使用し、キャプチャー／ハイブリダイゼーション反応を、８５℃の蓋の温度にて、ＰＣＲサーモサイクラー中で様々な時間に渡って６５℃で加熱した。シーケンシング後に、デフォルト値を有するＰｉｃａｒｄ ＨＳ＿Ｍｅｔｒｉｃツール（Ｐｃｔ＿Ｔａｒｇｅｔ＿Ｂａｓｅｓ＿３０Ｘ）をシーケンシング分析に使用した。いずれのパネルについても、高速ハイブリダイゼーション溶液中での１５分間のハイブリダイゼーションは、図３３Ｂに見られるように、１６時間の標準ハイブリダイゼーションと同等のパフォーマンスをもたらし、ハイブリダイゼーション時間の増加は、従来のハイブリダイゼーション緩衝液を使用した標準プロトコルよりもパフォーマンスを向上させた。
実施例２０．ナノボールシーケンシングを用いる標的濃縮
標的濃縮パネルは、ナノボールシーケンシングを用いて配列決定された。簡潔に説明すると、ナノボールシーケンシングは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を用いて、ゲノムＤＮＡの断片をＤＮＡナノボールに増幅する。ＤＮＡナノボールをフローセルに吸着させ、各位置での蛍光を測定し、塩基を同定するために使用する。
２つの異なる挿入サイズのライブラリを作製し、ナノボールシーケンシングを用いて配列決定した。環状化アダプターは、ナノボールシーケンシングに適合した。ライブラリを、オンターゲット率、特異性、重複率、カバレッジについて評価した。図３４Ａ～３４Ｄに見られるように、環状化アダプターを用いた場合、オンターゲット率の割合が４０％から７５％に増加し（図３４Ａ）、ｆｏｌｄ８０が約１．４５で均一性が非常に高く（図３４Ｂ）、重複率が約３％で低く（図３４Ｃ）、３０倍のカバレッジ以上で標的塩基が約９２％であることが観察された（図３４Ｄ）。
実施例２１．アダプターのステム領域に結合するブロッカー
異なる市販されているアダプター系は、異なるステム（Ｙステム、ヨーク）長および溶融温度（表１４）を含み、例えば、標準的なデュアルバーコードアダプター系Ｔ；トランスポザーゼアダプター系Ｎ；およびナノボールベースのシーケンシングに設計されたアダプター系Ｂなどがある。
Figure 2022521766000017
実施例１９の一般的な手順に従って、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含むブロッキング核酸を、濃縮／キャプチャーの間にＮアダプター系と共に使用し、観察された「オフベイト」の割合（任意のベイト領域、ＯＦＦ＿ＢＡＩＴ＿ＢＡＳＥＳ／ＰＦ＿ＢＡＳＥＳ＿ＡＬＩＧＮＥＤから離れてマッピングされたＰＦ＿ＢＡＳＥＳ＿ＡＬＩＧＮＥＤの割合）の関数としてのＮＧＳパフォーマンスを測定した。一般に、アダプターステム領域にアニーリングするロックド核酸の数を増やすと、オフベイトパフォーマンスが悪くなった（表１５）。
Figure 2022521766000018
理論に拘束されることなく、いくつかの例におけるパフォーマンスの低下は、望ましくないハイブリダイゼーション種集団Ｂ－Ｄ（図３６Ｂ－３６Ｄ）の増加、および所望の種集団Ａ（図３６Ａ）の減少によって引き起こされる可能性がある。表１６を参照されたい。
Figure 2022521766000019
実施例２２．プッシュプル式のユニバーサルブロッカー
ユニバーサルブロッカーは、標的配列との結合親和性を増加させる領域と低下させる領域の両方を持つように設計されることで、親和性の全体的な正味の増加と標的濃縮中のオフベイトパフォーマンスの向上をもたらすことができる。このようなデザインは、以下のような利点をもたらす：１）各領域は、標的濃縮適用の際のオフベイト活性の任意の所望のレベルに合わせて、理論的または経験的に調整することができる；２）各領域は、標的配列に対する分子の全体的な親和性を増加または減少させることができる、単一タイプの化学修飾または複数タイプの化学修飾のいずれかで変更することができる；３）他の修飾（例：ＬＮＡおよびＢＮＡ）で最適なパフォーマンスを得るためには、ブロッカーセットの個々のメンバーすべての融解温度を特定の温度以上に保たなければならない；４）任意のブロッカーのセットは、インデックスの長さとは無関係に、インデックスの配列とは無関係に、ハイブリダイゼーションにおけるアダプターインデックスの数とは無関係に、オフベイトのパフォーマンスを向上させる。
ユニバーサルブロッカーのＹステムアダプターアニーリング部分に対処する一つのアプローチは、ＤＮＡ改変を完全に取り除き、およびこの問題のある領域に標準的なＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴの塩基のみを持つブロッカーを設計することである。また、任意の領域に対する結合親和性を減少させるさらなるＤＮＡ修飾を追加する可能性もある。これが、結合親和性を増加させるためのＤＮＡ改変を導入された領域を伴う場合、所定の標的領域に対する親和性を増加させた領域と減少させた領域の両方を有するように設計されたブロッカーオリゴを作成することができる。化学合成時に導入可能な市販の修飾の例は、２’－デオキシイノシンである。
いくつかのデザインは、アダプターバーコードをカバーするために、これらのタイプの部分のストレッチ（長さ６～１０ｂｐ）を利用しているが、融解温度（Ｔｍ）を下げるために、配列全体にまばらに利用することもできる。以下に、ランダムな１８ｂｐの配列を、異なる数の２’－デオキシイノシン部分を含まない場合と含む場合で示しており、Ｔｍを所望の標的に調整できることを実証している（表１７）。このような配列を、Ｔｍを増加させる部分を含む配列と連結すると、様々な熱力学的特性を持つハイブリッド分子を生成することができる。このようなハイブリッド分子では、特定の領域を特定の融解温度に熱力学的に調整することで、特定の標的配列に対する親和性を回避または増加させることができる。このような修飾の組み合わせは、特定の固有のアダプター配列に対するブロッカー分子の親和性を増加させ、繰り返されたアダプター配列（例えば、アダプターのＹステムアニーリング部分）に対するブロッカー分子の親和性を減少させるのに役立つように設計されている。理論に束縛されることなく、このようなデザインは、標的濃縮ワークフロー中のハイブリダイゼーションの文脈において、望ましい集団に対する結合を増加させ、望ましくない集団に対する結合を減少させることができる。
固有の領域において親和性を増加させる部分の数を一定に保ち、アダプターのＹステム部分に結合する領域における親和性を減少させる部分の数を増やした例が表１７に提示されている。
Figure 2022521766000020
ブロッカーのＹステムアニーリング領域における親和性を減少させるＤＮＡ修飾の数を増やすと、「Ａ」および「Ｄ」の集団が支配的になり、いずれかが所望の効果（Ａ、図３６Ａ）または最小の効果（Ｄ、図３６Ｄ）を有する（表１８）。ブロッカーのＹステムアニーリング領域において親和性を減少させるＤＮＡ修飾の数が減少すると、集団「Ｂ」および「Ｃ」が支配的になり、デイジーチェーンまたは他のアダプターへのアニーリングが発生する望ましくない効果を（「Ｂ」、図３６Ｂ）有し、あるいはそれらが適切に機能しない場合にはブロッカーを隔絶（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）する（「Ｃ」、図３６Ｃ）。
Figure 2022521766000021
実施例２３．ユニバーサル塩基でインデックスをカバーするユニバーサルアダプター
単一または二重のインデックスアダプターデザインの両方のインデックスは、アダプターインデックス塩基をカバーするために特別に設計されたＤＮＡ修飾で拡張されたユニバーサルブロッカーによって部分的または完全にカバーされる。このようなデザインは、以下のような潜在的な利点を提供する：１）インデックスのいずれかの側から様々な長さのバーコードを部分的または完全にカバーするように調整される；２）他の修飾（例えば、ＬＮＡおよび／またはＢＮＡ）で最適なパフォーマンスを得るために、ブロッカーセットの個々のメンバーすべての融解温度を特定の温度以上に保つ；および、３）インデックスの長さが定義された最小の長さ以上であれば、配列とは関係なく、および、ハイブリダイゼーションにおいていくつのアダプターインデックスが存在するかとは関係なく、所定のブロッカーセットはオフベイトのパフォーマンスを向上させる。
ブロッカーは、アダプターインデックスの一部ではない領域に結合するように設計されている（図３７Ａ）。その結果、このデザインのすべてのインデックス塩基は完全に露出したままとなる（すなわち、図３７Ａの’１｜２｜３｜．．．．．．｜（ｎ－１）｜ｎ’）。このデザインは、インデックス塩基をカバーするためにブロッカーを拡張する様々な部位でも拡張される。このような方法でインデックス塩基をカバーすることは、二重インデックスシステムの個々のインデックスが２’－デオキシイノシン部分の３ｂｐまたは５ｂｐのストレッチのいずれかによって片側からカバーされる場合に、標的濃縮の間にオフベイトパフォーマンスを高めることが実証されている（図３７Ｂ）。 そのような様式でインデックス塩基をカバーすることは、二重インデックス系の個別のインデックスが２’－デオキシイノシン部分（図３７Ｂ）の３ｂｐあるいは５ｂｐのストレッチによって単一の側からカバーされる場合に、標的の濃縮中にオフベイトパフォーマンスを増強するとを実証されている。追加のデザインは図３７Ｃ－３７Ｇを含む。
実施例１９の基本手順に従って、３３．１ｍｂのエクソームパネルは２時間のハイブリダイゼーション時間のキャプチャーに使用され、ＮＧＳ測定基準が得られた。ａ）パーセントオフベイト（ＰＣＴ＿ＯＦＦ＿ＢＡＩＴ）、（ｂ）均一性（ＦＯＬＤ＿８０＿ＢＡＳＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹ）、および（ｃ）カバレッジの深度（ＰＣＴ＿ＴＡＲＧＥＴ＿ＢＡＳＥＳ＿３０）について改善が観察された（図３８、表１９）。このような変更は、次世代シーケンシングマシン（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮＧＳ ＮｏｖａＳｅｑプラットフォーム）に載せることができる試料数に大きな影響を与える可能性がある。
Figure 2022521766000022
実施例２４．標的とされたメチル化シーケンシングのためのエクソーム濃縮
材料および方法。ＮＡ１２８７８（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）およびＥｐｉＳｃｏｐｅ（登録商標）の低メチル化および高メチル化ｇＤＮＡ対照（それぞれ５％未満および９５％を超えるメチル化ＨＣＴ１１６ ＤＫＯ ｇＤＮＡ）から得られたゲノムＤＮＡ試料を機械的にせん断し、～３００ｂｐのサイズにした（Ｃｏｖａｒｉｓ（登録商標）ＭＥ２２０上）。せん断された低メチル化および高メチル化の対照を混ぜることによって、様々なシミュレートされたメチル化レベルの試料を調製した。入力された５００ｎｇのｇＤＮＡをＳｗｉｆｔ Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔに入れ、バイサルファイト処理（Ｚｙｍｏ ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｍａｇ－Ｂｉｎｄ ＲｘｎＰｕｒｅ Ｐｌｕｓ ＳＰＲＩ Ｂｅａｄｓ、およびＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｕｒａｃｉｌ＋ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと組み合わせた。入力された２００ｎｇのｇＤＮＡをＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ Ｋｉｔに投入した。せん断された試料とライブラリは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ７５００とＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｑｕｂｉｔ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｋｉｔｓで検証された。
実施例１９の一般的なプロトコルに従って、高速ハイブリダイゼーション緩衝液が、様々な標的サイズ（０．０５、１．０、１．５、および３．０Ｍｂ）の範囲をカバーする４つのメチル化パネルを用いる４時間のハイブリダイゼーションに使用された。各シングルプレックスキャプチャーに２００ｎｇのライブラリを使用し、その後、ｖ２．５ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ Ｋｉｔを備えたＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０で２ｘ１５１ｂｐシーケンシングを行った。アラインメントおよびメチル化解析は、試料あたり２５０倍の生のカバレッジになるようにサンプリングした後に、Ｂｉｓｍａｒｋ １９．１およびＰｉｃａｒｄ ＨｓＭｅｔｒｉｃｓを用いて行われた。
結果。キャプチャー前の変換により、高感度のエピジェネティックな適用が可能になるが、重要な課題は変換後のゲノムの複雑さが減少することに由来する。非メチル化パネルと比較すると、これにより、一般的にオフターゲットが著しく高くなり（５０～６０％を超えるレベル）、ベイトのシーケンシングカバレッジが低下し、キャプチャーの均一性が大幅に減少する（ｆｏｌｄ－８０ ｂａｓｅ ｐｅｎａｌｔｙ値は２．５を超える）。広範囲の異なるメチル化標的をカバーするパネルのうち３つから得られた結果を、図４２Ａ－４２Ｄに示す。評価されたパネルは、オフターゲット値が２７％と低いことを示した。０．０５Ｍｂのパネルは、他の３つのパネルと比較して高いオフターゲットを示した。理論に束縛されることなく、これは、標的サイズが非常に小さいことに起因していると考えられる。キャプチャー均一性は２．５倍以上のｆｏｌｄ８０であり、１．７５と１．５という低い値に達した。重複率は、試験した４つのパネルすべてにおいて非常に低く、キャプチャー工程が効率的で、ワークフロー全体を通して高い試料複雑性を維持することができることを示している。全体として、２５０倍の生のシーケンシングカバレッジでは、最小のパネルであっても、２０倍で８４％を超え、３０倍で７０％を超える塩基の生のカバレッジが達成された。
適応パネルデザイン最適化アルゴリズムは、キャプチャー実験からの経験データを用いて特定のプローブの特徴を学習して、パフォーマンスを定量的に調整することができる。この方法は、高いオフターゲット率を抑制することが優先事項となるメチル化パネルに特に有効である。さらに、３０，０００を超えるメチル化標的について収集されたデータを用いて、情報量の多い配列の特徴を導き出し、３段階のストリンジェンシーで最適化されたデフォルトパネルデザインを開発した。１Ｍｂパネルは、低、中、および高のストリンジェンシーを有するデフォルトパネルの例として使用されたが、これは、オフターゲット率の制御を増加させる一方で、他の主要な測定基準ではわずかな変化しかもたらさない（図４３Ａ－４３Ｄ）。
可能なメチル化レベルの範囲にわたる適合性を評価するために、中程度のストリンジェンシーの１Ｍｂパネルのキャプチャーを、それぞれ０、２５、５０、７５、および１００％のメチル化の最終比率に混合された低メチル化および高メチル化の細胞株から生成されたｇＤＮＡライブラリを用いて行った。図４４Ａ－４４Ｄは、主要なキャプチャー測定基準を強調しており、バーは平均値を示し、標準誤差はメチル化度の異なる試料間のキャプチャーパフォーマンスのばらつきを表している。測定基準は、メチル化レベルの変化に対してほとんど～まったく反応しないことから、低メチル化および高メチル化のＤＮＡを含む幅広いメチル化状態に対するシステムの適合性を実証している。
プロモーターおよびその他の制御要素のメチル化レベルの変化は、癌の早期発見に利用可能な最も感度の高いマーカーの一つとして注目されている。標的メチル化シーケンシングは、様々なレベルのＤＮＡメチル化を検出および定量化することができる。低メチル化ＤＮＡと高メチル化ＤＮＡは異なる比率で混合され、１Ｍｂパネルでのキャプチャーに使用された。図４５Ａおよび４５Ｂは、特定の癌（例えば、乳癌）においてメチル化状態を変化させることが知られている、臨床的に関連するサイクリンＤ２座の標的および個々のＣｐＧ部位に沿った、異なるＤＮＡメチル化レベルの検出を強調している。メチル化されたシトシンを検出することは、非メチル化シトシンのチミンへの変換を含むが、メチル化されたシトシンは変換から保護される。従来、変換は化学的なバイサルファイト方法を介して生じた。この分野では、非メチル化シトシンの酵素変換を含む他の方法が採用される割合が増加している。それぞれの変換方法には、変換反応条件に対する酵素の潜在的な感度の大きさ、またはバイサルファイトによるＤＮＡの文脈に偏った分解などの長所と短所がある。
本明細書のパネル合成によるメチル化シーケンシングは、酵素的アプローチおよびバイサルファイトアプローチの両方に適合した（図４６Ａ－４６Ｄ）。非ＣｐＧ部位で変換されたシトシンの割合として測定された変換率は、両方の方法で９９．５％を超えていた（図４７）。全体的なキャプチャー測定基準は、両方のライブラリ調製法でも比較的に同じ順序であったが、均一性およびオフターゲットなどの特定の測定基準は、バイサルファイト方法では減少した。理論に束縛されることなく、均一性の低下は、少なくとも部分的には、バイサルファイトベースのライブラリ調製法によって導入された固有のＧＣバイアスに起因すると考えられる（データは示されていない）。
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないことが当業者に明らかであろう。当業者であれば、多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく思いつくだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明の実施に際して利用され得ることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法、および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。

Claims (59)

  1. ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、
    第１の末端アダプタ領域、第１の非相補的領域、および第１のヨーク領域を含む第１の鎖と、
    第２の末端アダプタ領域、第２の非相補的領域、および第２のヨーク領域を含む第２の鎖と
    を含み、
    前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域は相補的であり、前記第１の非相補的領域と前記第２の非相補的領域は相補的ではなく、前記第１のヨーク領域または前記第２のヨーク領域は少なくとも１つの核酸塩基アナログを含む、ポリヌクレオチド。
  2. 前記核酸塩基アナログは、前記第１のヨーク領域を前記第２のヨーク領域に結合するＴｍを増加させる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記核酸塩基アナログはロックド核酸（ＬＮＡ）または架橋核酸（ＢＮＡ）である、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 相補的な前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域は、それぞれ長さ１５未満の塩基である、請求項１から３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
  5. 相補的な前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域は、それぞれ長さ１０未満の塩基である、請求項１から３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
  6. 相補的な前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域は、それぞれ長さ６未満の塩基である、請求項１から３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記ポリヌクレオチドはバーコードまたはインデックス配列を含まない、請求項１から６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
  8. ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、
    二重試料核酸と、
    前記二重試料核酸の５’末端にライゲートされる第１のポリヌクレオチドと、
    前記二重試料核酸の３’末端にライゲートされる第２のポリヌクレオチドと
    を含み、
    前記第１のポリヌクレオチドまたは前記第２のポリヌクレオチドは、
    第１の末端アダプタ領域、第１の非相補的領域、および第１のヨーク領域を含む第１の鎖と、
    第２の末端アダプタ領域、第２の非相補的領域、および第２のヨーク領域を含む第２の鎖と
    を含み、
    前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域は相補的であり、前記第１の非相補的領域と前記第２の非相補的領域は相補的ではなく、前記第１のヨーク領域または前記第２のヨーク領域は少なくとも１つの核酸塩基アナログを含む、ポリヌクレオチド。
  9. 前記二重試料核酸はＤＮＡである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記二重試料核酸はゲノムＤＮＡである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記ゲノムＤＮＡはヒト由来のものである、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記第１のポリヌクレオチドまたは前記第２のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのバーコードを含む、請求項８から１１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記少なくとも１つのバーコードは、少なくとも長さ８の塩基である、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記少なくとも１つのバーコードは、少なくとも長さ１２の塩基である、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記少なくとも１つのバーコードは、少なくとも長さ１６の塩基である、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記少なくとも１つのバーコードは、長さ８～１２の塩基である、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記第１のポリヌクレオチドは第１のバーコードと第２のバーコードを含み、前記第２のポリヌクレオチドは第３のバーコードと第４のバーコードを含む、請求項１２から１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
  18. 前記第１のバーコードと前記第３のバーコードが同じ配列を有し、前記第２のバーコードと前記第４のバーコードが同じ配列を有する、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  19. 前記ポリヌクレオチドにおける各バーコードは固有の配列を含む、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  20. 試料核酸を標識する方法であって、該方法は、
    （１）アダプタでライゲートされた試料核酸を生成するために少なくとも１つのポリヌクレオチドを少なくとも１つの試料核酸にライゲートする工程であって、前記ポリヌクレオチドは、第１のプライマー結合領域、第１の非相補的領域、および第１のヨーク領域を含む第１の鎖と、第２のプライマー結合領域、第２の非相補的領域、および第２のヨーク領域を含む第２の鎖とを含み、前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域は相補的であり、前記第１の非相補的領域と前記第２の非相補的領域は相補的でない、工程と、
    （２）少なくとも１つのアダプタでライゲートされた試料核酸を第１のプライマーおよびポリメラーゼと接触させる工程であって、前記第１のプライマーは、第３のプライマー結合領域と、第４のプライマー結合領域と、少なくとも１つのバーコードとを含み、前記第３のプライマー結合領域は、少なくとも１つのポリヌクレオチドの長さ未満に対して相補的であり、前記第１のプライマー結合領域に相補的である、工程と、
    （３）少なくとも１つのアダプタでライゲートされた増幅試料核酸を生成するために前記アダプタでライゲートされた試料核酸を伸長させる工程であって、前記アダプタでライゲートされた増幅試料核酸は少なくとも１つのバーコードを含む、工程と
    を含む、方法。
  21. 前記第１のプライマーと前記第２のプライマーは、それぞれ長さ３０未満の塩基である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記プライマーは長さ２０未満の塩基である、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記ポリヌクレオチドはバーコードを含まない、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記プライマーは１つのバーコードを含む、請求項２０から２３のいずれか１つに記載の方法。
  25. 前記少なくとも１つのバーコードがインデックス配列を含む、請求項２０から２４のいずれか１つに記載の方法。
  26. 前記少なくとも１つのバーコードは、少なくとも長さ８の塩基である、請求項２０から２５のいずれか１つに記載の方法。
  27. 前記少なくとも１つのバーコードは、少なくとも長さ１２の塩基である、請求項２０から２５のいずれか１つに記載の方法。
  28. 前記少なくとも１つのバーコードは、少なくとも長さ１６の塩基である、請求項２０から２５のいずれか１つに記載の方法。
  29. 前記少なくとも１つのバーコードは、長さ８～１２の塩基である、請求項２０から２５のいずれか１つに記載の方法。
  30. 前記インデックス配列は、同じソース由来の試料核酸のライブラリによくみられるものである、請求項２５から２９のいずれか１つに記載の方法。
  31. 前記少なくとも１つのバーコードは固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項２４から３０のいずれか１つに記載の方法。
  32. ２つのポリヌクレオチドが前記少なくとも１つの試料核酸にライゲートされる、請求項２０から３１のいずれか１つに記載の方法。
  33. 第１のポリヌクレオチドが前記試料核酸の５’末端に、第２のポリヌクレオチドが前記試料核酸の３’末端にライゲートされる、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記方法が、
    （４）少なくとも１つのアダプタでライゲートされた試料核酸を第２のプライマーおよびポリメラーゼと接触させる工程であって、前記第２のプライマーは、
    第５のプライマー結合領域と、
    第６のプライマー結合領域と、
    少なくとも１つのバーコードと
    を含み、前記第６のプライマー結合領域は、少なくとも１つのポリヌクレオチドの長さ未満に対して相補的であり、前記第５のプライマー結合領域は前記第２のプライマー結合領域に相補的である、工程と、
    （５）少なくとも１つのアダプタでライゲートされた増幅試料核酸を生成するために前記ポリヌクレオチドを伸長させる工程であって、前記アダプタでライゲートされた増幅試料核酸は少なくとも１つのバーコードを含む、工程と
    をさらに含む、請求項２０から３３のいずれか１つに記載の方法。
  35. 前記アダプタでライゲートされた試料核酸を配列決定する工程をさらに含む、請求項２０から３４のいずれか１つに記載の方法。
  36. 組成物であって、該組成物は、
    アダプタでライゲートされた試料核酸の１つ以上の領域に結合するよう構成される少なくとも３つのポリヌクレオチドブロッカーであって、前記アダプタでライゲートされた試料核酸は、
    ｉ）第１の非相補的領域、第１のインデックス領域、第２の非相補的領域、第１のヨーク領域、および
    ｉｉ）第３の非相補的領域、第２のインデックス領域、第４の非相補的領域、および第２のヨーク領域
    を含み、前記第１のヨーク領域と前記第２のヨーク領域は相補的であり、前記第１の非相補的領域と前記第２の非相補的領域は相補的でなく、
    前記アダプタでライゲートされた試料核酸はさらに、
    ｉｉｉ）前記第１のヨーク領域および前記第２のヨーク領域に隣接するゲノムインサート
    を含み、少なくとも１つのポリヌクレオチドブロッカーは、前記第１のヨーク領域または前記第２のヨーク領域に相補的ではなく、かつ、前記ポリヌクレオチドブロッカーと前記アダプタでライゲートされた試料核酸との結合を増大させるように構成される少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む、組成物。
  37. 少なくとも２つのポリヌクレオチドブロッカーが、前記第１のヨーク領域または前記第２のヨーク領域に相補的ではなく、かつ、それぞれ、前記ポリヌクレオチドブロッカーと前記アダプタでライゲートされた試料核酸との結合を増大させるように構成される少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む、請求項３６に記載の組成物。
  38. 少なくとも１つのインデックス領域はバーコードまたは固有の分子識別子を含む、請求項３６に記載の組成物。
  39. 少なくとも１つのインデックス領域は長さ５～１５の塩基である、請求項３６に記載の組成物。
  40. 前記ポリヌクレオチドブロッカーの少なくとも１つは、少なくとも１つのユニバーサル塩基を含む、請求項３６に記載の組成物。
  41. 前記少なくとも１つのユニバーサル塩基は、５－ニトロインドールまたは２－デオキシイノシンである、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記少なくとも１つのユニバーサル塩基は、少なくとも１つのインデックス配列と重なるように構成される、請求項４０に記載の組成物。
  43. 少なくとも２つのユニバーサル塩基は、少なくとも２つのインデックス配列と重なるように構成される、請求項４０に記載の組成物。
  44. 前記ポリヌクレオチドブロッカーの少なくとも２つが少なくとも１つのユニバーサル塩基を含み、前記少なくとも１つのユニバーサル塩基はそれぞれ、少なくとも１つのインデックス配列と重なる、請求項４０に記載の組成物。
  45. 重なりは長さ２～１０の塩基である、請求項４２または４３に記載の組成物。
  46. 前記組成物は４つ以下のポリヌクレオチドブロッカーを含む、請求項３６に記載の組成物。
  47. 前記ポリヌクレオチドブロッカーは、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）または１つ以上の架橋核酸（ＢＮＡ）を含む、請求項３６から４６のいずれか１つに記載の組成物。
  48. 前記ポリヌクレオチドブロッカーは、少なくとも５つのヌクレオチドアナログを含む、請求項３６から４６のいずれか１つに記載の組成物。
  49. 前記ポリヌクレオチドブロッカーは、少なくとも１０のヌクレオチドアナログを含む、請求項３６から４６のいずれか１つに記載の組成物。
  50. 前記ポリヌクレオチドブロッカーのＴｍは少なくとも７８℃である、請求項３６から４６のいずれか１つに記載の組成物。
  51. 前記ポリヌクレオチドブロッカーのＴｍは少なくとも８０℃である、請求項３６から４６のいずれか１つに記載の組成物。
  52. 前記ポリヌクレオチドブロッカーのＴｍは少なくとも８２℃である、請求項３６から４６のいずれか１つに記載の組成物。
  53. 前記ポリヌクレオチドブロッカーのＴｍは８０～９０℃である、請求項３６から４６のいずれか１つに記載の組成物。
  54. 核酸ハイブリダイゼーションのための方法であって、
    複数のゲノムインサートを含む、アダプタでライゲートされた試料核酸ライブラリを提供する工程と、
    前記アダプタでライゲートされた試料核酸ライブラリを、請求項３６から５３のいずれか１つに記載の組成物の存在下で少なくとも５０００のポリヌクレオチドプローブを含むプローブライブラリと接触させる工程と、
    プローブの少なくとも一部を前記ゲノムインサートにハイブリダイズする工程と
    を含む、方法。
  55. 前記試料核酸ライブラリが少なくとも１００万の固有ゲノムインサートを含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ゲノムインサートの少なくとも一部はヒトＤＮＡを含む、請求項５４に記載の方法。
  57. 濃縮された試料核酸ライブラリを生成する工程をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
  58. 前記濃縮された試料核酸ライブラリを配列決定する工程をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記試料核酸ライブラリは、次世代シーケンシングのために構成されるアダプタを含む、請求項５４から５８のいずれか１つに記載の方法。
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