JP2022517406A - 標識ポリペプチド - Google Patents

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Abstract

標識ポリペプチド本発明は、標識ポリペプチドを調製する方法であって、以下を含む方法に関する:a.以下を含むポリペプチドを提供すること:i.ソルターゼアクセプタ部位又はソルターゼドナー部位、ii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体、iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)、及びiv.トランスロケーションドメイン、b.前記ポリペプチドを以下とインキュベートすること:ソルターゼ、及びソルターゼドナー部位又はソルターゼアクセプタ部位それぞれ及び結合した検出可能な標識を含む標識基質、ここで、前記ソルターゼは、前記標識基質の前記ソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸と前記ソルターゼドナー部位のアミノ酸との間の結合、又は前記標識基質の前記ソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸と前記ポリペプチドの前記ソルターゼドナー部位のアミノ酸との結合、を触媒し、これにより前記ポリペプチドを標識する、及びc.標識ポリペプチドを取得すること。本発明は、更に、標識するためのポリペプチド、標識ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、及び前記ポリペプチドを使用及び製造する方法に関する。【選択図】図1

Description

本発明は、標識ポリペプチド及びこれを調製及び使用する方法に関する。
クロストリジウム属の細菌は、非常に強力且つ特異的なタンパク質毒素を産生し、これらは、送達されたニューロン及び他の細胞を害する可能性がある。このようなクロストリジウム毒素の例には、C.tetani(TeNT)及びC.botulinum(BoNT)血清型A乃至G及びX(WO2018/009903A2を参照)により産生される神経毒、並びにC.baratii及びC.butyricumにより産生されるものが含まれる。
クロストリジウム神経毒には、公知の最も強力な毒素の幾つかが含まれる。一例として、ボツリヌス神経毒は、血清型に応じて、マウスに対する半致死量(LD50)値が0.5乃至5ng/kgの範囲となる。破傷風毒素及びボツリヌス毒素は、共に、罹患ニューロンの機能、具体的には神経伝達物質の放出を阻害することにより作用する。ボツリヌス毒素が神経筋接合部で作用し、末梢神経系におけるコリン作用性伝達を阻害する一方、破傷風毒素は、中枢神経系において作用する。
クロストリジウム神経毒は、クロストリジウム属において一本鎖ポリペプチドとして発現する。各クロストリジウム神経毒は、活性化ループと呼ばれる露出領域により重鎖(N末端トランスロケーションドメイン及びC末端受容体結合ドメインを含む)から分離された触媒軽鎖を有する。タンパク質の成熟中に、活性化ループのタンパク分解性切断により、クロストリジウム神経毒の軽鎖と重鎖とが分離され、ジスルフィド架橋により結び付き、完全に活性な二本鎖毒素が生成される。
当該技術分野では、再標的化クロストリジウム神経毒も知られており、これは、標的化部分(TM)として知られる外因性リガンドを含むように修飾し得る。TMは、所望の標的細胞に対する結合特異性をもたらすように選択され、再標的化プロセスの一環として、クロストリジウム毒素の天然結合部分(例えば、HCドメイン、又はHCCドメイン)は、除去し得る。再標的化手法は、例えば、EP-B-0689459、WO1994/021300、EP-B-0939818、US6,461,617、US7,192,596、WO1998/007864、EP-B-0826051、US5,989,545、US6,395,513、US6,962,703、WO1996/033273、EP-B-0996468、US7,052,702、WO1999/017806、EP-B-1107794、US6,632,440、WO2000/010598、WO2001/21213、WO2006/059093、WO2000/62814、WO2000/04926、WO1993/15766、WO2000/61192、及びWO1999/58571に記載されており、これらは全て出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とする。
他のバリエーションは、クロストリジウム神経毒又は同等/類似の機能を有するポリペプチドの無細胞毒性プロテアーゼ、トランスロケーション又は結合ドメインの1つ以上から調製されたポリペプチドを含む。
クロストリジウム神経毒(又は本明細書に記載の他のポリペプチド)によるSNAREタンパク質の結合、トランスロケーション、及びタンパク分解性切断は、理解が不十分なままである。したがって、特にリアルタイム及び/又は生細胞において、これらの各段階の視覚化を可能にするアッセイの必要性が残っている。このようなアッセイは、クロストリジウム神経毒治療薬の開発及び特性評価、特に新しいBoNT治療薬、ハイブリッド毒素、及び再標的化クロストリジウム神経毒(及びその多様体(variant)の特性評価を容易にする。
更に、クロストリジウム神経毒及び他のこうしたポリペプチドを視覚化するために従来の方法で使用される抗体(例えば、蛍光抗体)は、不十分であり、特異性及び/又は感度が限定されている。また、このような従来の方法は、通常、細胞構造に有害な影響を与える可能性がある細胞の固定に依存しており、特に動物におけるインビボ等の複雑な生物システムにおいて、ライブ/リアルタイムイメージングに適していない。したがって、改善された/代替の技術が必要である。
本発明は、上述した問題の1つ以上を克服する。
本発明者らは、驚くべきことに、ソルターゼを使用して、検出可能な標識を本発明のポリペプチド(無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体;標的細胞上の結合部位に結合する標的化部分(TM);及びトランスロケーションドメインを含む)に、標識ポリペプチドの効力を低下させることなくコンジュゲートできることを発見した。換言すれば、標識ポリペプチドは、同等の非標識ポリペプチドと比較した祭に、同様の(又は改善された)細胞結合、トランスロケーション、及びSNAREタンパク質切断を示す。代替手法(例えば、非部位特異的標識及びSNAP標識)を用いて標識したポリペプチドが効力の低下を示したことを考えると、これは完全に予想外であった。
また、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位を含む本発明のポリペプチドは、容易に精製及び発現可能であり、これも、GFPタグ付けが、発現/精製の難しさに関連していることを考えると驚くべきことであり、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位の組み込みがポリペプチドの構造又は折り畳みに悪影響を及ぼさなかったことを示している。
加えて、ソルターゼの使用を含む方法は、二重標識ポリペプチドの生成を可能にし、これにより更に、クロストリジウム神経毒(及び再標的化クロストリジウム神経毒)の輸送の最も理解されていない側面の1つである、細胞エンドソーム内で発生するトランスロケーションイベントの視覚化が可能となった。有利なことに、本発明は、ライブイメージング顕微鏡を用いたトランスロケーションの視覚化を可能にし、幾つかの細胞モデル及び組織におけるトランスロケーション機構の理解に大きく貢献するであろう。
本発明の標識ポリペプチドは、前記ポリペプチドの作用機序のライブ及び/又はリアルタイムモニタリングのための新しい道を開き、細胞構造に有害な影響を与える固定剤製品の必要性を排除する。したがって、本発明は、エクスビボ組織調製物(例えば、脳スライス)、組織病理学的サンプル、及び動物におけるインビボ等、より複雑な生物システムにおける毒素の視覚化を可能にし、従来の手法のように不死化細胞株及びニューロン等の単純な細胞システムに限定されない。したがって、本発明のポリペプチドは、(例えば)投与部位から離れたポリペプチドの分散を測定するために使用し得る。
一態様において、本発明は、標識ポリペプチドを調製する方法であって、以下を含む方法を提供する:
a.以下を含むポリペプチドを提供すること:
i.ソルターゼアクセプタ又はドナー部位、
ii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体、
iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)、及び
iv.トランスロケーションドメイン、
b.ポリペプチドを以下とインキュベートすること:
ソルターゼ、及び
ソルターゼドナー又はアクセプタ部位及び結合した検出可能な標識を含む標識基質、
ここで、ソルターゼは、ソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸とソルターゼドナー部位のアミノ酸との間の結合を触媒することにより、ポリペプチドを標識する、及び
c.標識ポリペプチドを取得すること。
本発明の方法がソルターゼアクセプタ部位を含むポリペプチドの使用を含む場合、(例えば、bで言及される)結合した検出可能な標識を含む標識基質は、ソルターゼドナー部位を含む。同様に、本発明の方法がソルターゼドナー部位を含むポリペプチドの使用を含む場合、(例えば、bにおいて言及される)結合した検出可能な標識を含む標識基質は、ソルターゼアクセプタ部位を含む。
したがって、本発明は、ソルターゼアクセプタ部位及び対応するソルターゼドナー部位の使用に関し、ソルターゼは、ソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸とソルターゼドナー部位のアミノ酸とのコンジュゲートを触媒することができる。したがって、本発明で使用するための対応するソルターゼアクセプタ及びドナー部位は、ソルターゼによる結合が可能となるように選択される。
したがって、一実施形態において、本発明の方法は、以下を含む:
a.以下を含むポリペプチドを提供すること:
i.ソルターゼアクセプタ部位、
ii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体、
iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)、及び
iv.トランスロケーションドメイン、
b.ポリペプチドを以下とインキュベートすること:
ソルターゼ、及び
ソルターゼドナー部位及び結合した検出可能な標識を含む標識基質、
ここで、ソルターゼは、ソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸とソルターゼドナー部位のアミノ酸との間の結合を触媒することにより、ポリペプチドを標識する、及び
c.標識ポリペプチドを取得すること。
別の実施形態において、本発明の方法は、以下を含む:
a.以下を含むポリペプチドを提供すること:
i.ソルターゼドナー部位、
ii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体、
iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)、及び
iv.トランスロケーションドメイン、
b.ポリペプチドを以下とインキュベートすること:
ソルターゼ、及び
ソルターゼアクセプタ部位及び結合した検出可能な標識を含む標識基質、
ここで、ソルターゼは、ソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸とソルターゼドナー部位のアミノ酸との間の結合を触媒することにより、ポリペプチドを標識する、及び
c.標識ポリペプチドを取得すること。
また、本発明は、本発明の方法により得られる標識ポリペプチドを提供する。
一実施形態において、検出可能な標識は、無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、標的部分(TM)と、トランスロケーションドメインと、を含むポリペプチドのソルターゼアクセプタ又はドナー部位において又はその近くでコンジュゲートされる。
一実施形態において、検出可能な標識は、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位においてコンジュゲートされ、例えば、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位のアミノ酸に直接コンジュゲートされる。或いは、検出可能な標識は、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位のC末端側、例えば、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位に対して、1乃至50個、例えば1乃至25又は1乃至10個のアミノ酸だけC末端側で、コンジュゲートされ得る。
別の実施形態において、検出可能な標識は、例えば、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位のN末端側、例えば、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位に対して、1乃至50個、例えば1乃至25又は1乃至10個のアミノ酸だけN末端側で、コンジュゲートされる。
本明細書で使用される「取得可能」という用語は、「取得された」という用語も包含する。一実施形態において、「取得可能」という用語は、取得されたことを意味する。
関連する態様において、ソルターゼを用いて標識するためのポリペプチドが提供され、ポリペプチドは、
i.ソルターゼアクセプタ又はドナー部位と、
ii.標的細胞内の開口放出融合機構(exocytic fusion apparatus)のタンパク質を切断することが可能な無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
iv.無細胞毒性プロテアーゼを、エンドソーム内からエンドソーム膜を越えて標的細胞のサイトゾルにトランスロケートさせることが可能なトランスロケーションドメインと、を含み、
ポリペプチドがソルターゼドナー部位を含む場合、ソルターゼドナー部位は、ポリペプチドのN末端に位置し、ソルターゼドナー部位がGn又はAnを含む場合、nは、少なくとも2であり、
ドナー部位のN末端残基は、ポリペプチドのN末端残基であり、又は
ポリペプチドは、ソルターゼドナー部位に対してN末端側にある1つ以上のアミノ酸残基と、切断時にソルターゼドナー部位のN末端を露出させる切断可能部位とを含む。
一実施形態において、ソルターゼを用いて標識するためのポリペプチドは、
i.ソルターゼドナー部位と、
ii.標的細胞内の開口放出融合機構のタンパク質を切断することが可能な無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
iv.無細胞毒性プロテアーゼを、エンドソーム内からエンドソーム膜を越えて標的細胞のサイトゾルにトランスロケートさせることが可能なトランスロケーションドメインと、を含み、
ソルターゼドナー部位は、ポリペプチドのN末端に位置し、ソルターゼドナー部位がGn又はAnを含む場合、nは、少なくとも2であり、
ドナー部位のN末端残基は、ポリペプチドのN末端残基である。
一実施形態において、ソルターゼを用いて標識するためのポリペプチドは、
i.ソルターゼドナー部位と、
ii.標的細胞内の開口放出融合機構のタンパク質を切断することが可能な無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
iv.無細胞毒性プロテアーゼを、エンドソーム内からエンドソーム膜を越えて標的細胞のサイトゾルにトランスロケートさせることが可能なトランスロケーションドメインと、を含み、
ソルターゼドナー部位は、ポリペプチドのN末端に位置し、ソルターゼドナー部位がGn又はAnを含む場合、nは、少なくとも2であり、
ポリペプチドは、ソルターゼドナー部位に対してN末端となる1つ以上のアミノ酸残基と、切断時にソルターゼドナー部位のN末端を露出させる切断可能部位とを含む。
一実施形態において、ソルターゼを用いて標識するためのポリペプチドは、
i.ソルターゼアクセプタ部位と、
ii.標的細胞内の開口放出融合機構のタンパク質を切断することが可能な無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
iv.無細胞毒性プロテアーゼを、エンドソーム内からエンドソーム膜を越えて標的細胞のサイトゾルにトランスロケートさせることが可能なトランスロケーションドメインと、を含む。
ポリペプチドは、本発明の方法において適切に使用される。
本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ部位を含み得る。或いは、前記ポリペプチドは、ソルターゼドナー部位を含み得る。
好適な実施形態において、前記ポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ部位及びソルターゼドナー部位を含む。
本発明のポリペプチドは、配列番号2に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号2に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号2として示したポリペプチドを含む(より好ましくは、これからなる)。
本発明のポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号4として示したポリペプチドを含む(より好ましくは、これからなる)。
本発明のポリペプチドは、配列番号40に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号40に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号40として示したポリペプチドを含む(より好ましくは、これからなる)。
ポリペプチドは、本発明の核酸によりコードされ得る。
本発明は、更に、標識ポリペプチドであって、
i.ポリペプチドに結合した検出可能な標識と、
ii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
iv.トランスロケーションドメインと、を含むポリペプチドを提供する。
本発明は、更に、標識ポリペプチドであって、
i.ポリペプチドに結合した検出可能な標識と、
ii.L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(配列番号59)(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(配列番号60)(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN(配列番号61)、YPRTG(配列番号:62)、IPQTG(配列番号63)、VPDTG(配列番号64)、LPXTGS(配列番号65)(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG(配列番号46)、XPETG(配列番号ID番号47)、LGATG(配列番号48)、IPNTG(配列番号49)、IPETG(配列番号50)、NSKTA(配列番号51)、NPQTG(配列番号52)、NAKTN(配列番号53)、NPQSS(配列番号54)、LPXTX(配列番号55)(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(配列番号56)(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(配列番号57)(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(配列番号58)(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS(配列番号66)、LAXT(配列番号67)、MPXT(配列番号68)、MPXTG(配列番号69)、LAXS(配列番号ID番号:70)、NPXT(配列番号71)、NPXTG(排列番号72)、NAXT(配列番号73)、NAXTG(配列番号74)、NAXS(配列番号75)、NAXSG(配列番号76)、LPXP(配列番号77)、LPXPG(配列番号78)(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn(配列番号111)、又はLPAXGn(配列番号106)(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)を含むアミノ酸配列と、
iii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
iv.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
v.トランスロケーションドメインと、を含むポリペプチドを提供する。
本発明は、更に、標識ポリペプチドであって、
i.ポリペプチドに結合した検出可能な標識と、
ii.L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)を含むアミノ酸配列と、
iii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
iv.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
v.トランスロケーションドメインと、を含むポリペプチドを提供する。
一実施形態において、標識ポリペプチドは、
i.ポリペプチドに結合した検出可能な標識と、
ii.L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、を含むアミノ酸配列と、
iii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
iv.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
v.トランスロケーションドメインと、を含む。
一実施形態において、標識ポリペプチドは、
i.ポリペプチドに結合した検出可能な標識と、
ii.L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)を含むアミノ酸配列と、
iii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
iv.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
v.トランスロケーションドメインと、を含む。
一実施形態において、本発明の標識ポリペプチドは、同等の非標識ポリペプチドと比較して、同様の細胞結合、トランスロケーション、及びSNAREタンパク質切断を示す。別の実施形態において、標識ポリペプチドは、同等の非標識ポリペプチドと比較して、改善された細胞結合、トランスロケーション、及び/又はSNAREタンパク質切断を示す。特に好適な実施形態において、標識ポリペプチドは、同等の非標識ポリペプチドと比較して、改善された細胞結合、トランスロケーション、及びSNAREタンパク質切断を示す。細胞結合、トランスロケーション、及び/又はSNAREタンパク質切断は、当該技術分野において公知の及び/又は本明細書に記載の任意の手法を用いて決定することができる。一実施形態において、細胞結合、トランスロケーション、及び/又はSNAREタンパク質切断は、細胞に基づく又はインビボのアッセイを用いて決定することができる。適切なアッセイには、当該技術分野において日常的に行われている、指外転スコア(Digital Abduction Score)(DAS)、後根神経節(DRG)アッセイ、脊髄ニューロン(SCN)アッセイ、及びマウス横隔神経半横隔膜(PNHD)アッセイが含まれ得る。適切なアッセイは、出典を明記することにより本願明細書の一部とした、Donald et al (2018), Pharmacol Res Perspect, e00446, 1-14に記載されているものにしてよい。好ましくは、適切なアッセイは、出典を明記することにより本願明細書の一部としたFonfria, E., S. Donald and V. A. Cadd (2016), "Botulinum neurotoxin A and an engineered derivate targeted secretion inhibitor (TSI) A enter cells via different vesicular compartments." J Recept Signal Transduct Res 36(1): 79-88に記載のSNAP25切断アッセイである。
一実施形態において、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)を含むアミノ酸配列において又はその近くでコンジュゲートされる。一実施形態において、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGSを含むアミノ酸配列において又はその近くでコンジュゲートされる。
一実施形態において、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)を含むアミノ酸配列は、ポリペプチドのTMのC末端側に位置し得る。一実施形態において、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGSは、ポリペプチドのTMのC末端側に位置し得る。別の実施形態において、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)を含むアミノ酸配列は、ポリペプチドの無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体のN末端側に位置し得る。別の実施形態において、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGSは、ポリペプチドの無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体のN末端側に位置し得る。
一実施形態において、標識ポリペプチドは、2つ以上の検出可能な標識を含み、好ましくは、標識ポリペプチドは、2つの検出可能な標識を含む。好適な実施形態において、検出可能な標識は異なり、例えば、異なる色のフルオロフォアである。
第1及び第2(又は更に多く)の検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2、(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)を含むアミノ酸配列において又はその近くでコンジュゲートされ、第1及び第2(又は更に多く)の検出可能な標識は、標識ポリペプチド上の異なる部位においてコンジュゲートされる。第1及び第2(又は更に多く)の検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGSを含むアミノ酸配列において又はその近くでコンジュゲートされてよく、第1及び第2(又は更に多く)の検出可能な標識は、標識ポリペプチド上の異なる部位においてコンジュゲートされる。例えば、第1の検出可能な標識は、無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体のN末端側に位置するアミノ酸配列にコンジュゲートされ、第2の検出可能な標識は、TMのC末端側に位置するアミノ酸配列にコンジュゲートされてよい(又は逆も同様)。好ましくは、第1及び第2(又は更に多く)の検出可能な標識がコンジュゲートされているアミノ酸配列は、配列が異なる。
一実施形態において、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2、(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)においてコンジュゲートされる。或いは、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2、(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)のC末端側、例えば、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2、(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)に対して、1乃至50個、例えば1乃至25又は1乃至10個のアミノ酸だけC末端側にコンジュゲートされ得る。
一実施形態において、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGSにおいてコンジュゲートされる。或いは、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGSのC末端側例えば、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGSに対して、1乃至50個、例えば1乃至25又は1乃至10個のアミノ酸だけC末端側で、コンジュゲートされ得る。
別の実施形態において、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2、(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)のN末端側、例えば、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gnに対して、1乃至50個、例えば1乃至25又は1乃至10個のアミノ酸だけN末端側にコンジュゲートされる。
別の実施形態において、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGSのN末端側、例えば、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gnに対して、1乃至50個、例えば1乃至25又は1乃至10個のアミノ酸だけN末端側にコンジュゲートされる。
アミノ酸配列がL(A/P/S)X(T/S/A/C)Anを含み、Xが任意のアミノ酸であり、nが少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10となり得る実施形態において、このようなアミノ酸配列は、LPXTAn(配列番号102)を含み得る。好ましくは、nは、1乃至10、より好ましくは1乃至4である。このような実施形態において、結合した検出可能な標識及びL(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)含むアミノ酸配列は、ソルターゼ(例えば、Streptococcus pyogenes由来)によるポリペプチドの標識が成功していることを示す。
特に好適な実施形態において、アミノ酸配列は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gnを含み、Xは、任意のアミノ酸、n、少なくとも1である。このようなアミノ酸配列は、LPXSGn(配列番号103)、LAXTGn(配列番号104)、LPXTGn(配列番号105)、LPXCGn(配列番号107)、LAXSGn(配列番号108)、LPXAGn(配列番号109)、又はLSXTGn(配列番号110)を含み得る。好ましくは、アミノ酸配列は、LPXSGn、LAXTGn、LPXTGn、又はLAXSGnを含み得る。
一実施形態において、アミノ酸配列は、LRXTGnを含み、Xは、任意のアミノ酸であり、nは、少なくとも1である。
一実施形態において、アミノ酸配列は、LPAXGnを含み、Xは、任意のアミノ酸であり、nは、少なくとも1である。
結合した検出可能な標識及びL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)を含むアミノ酸配列は、ソルターゼによるポリペプチドの標識が成功していることを示す。一実施形態において、nは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10となり得る。好ましくは、nは、1乃至10、より好ましくは1乃至4である。
一実施形態において、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gnにおいて又はその近くでコンジュゲートされる。
一実施形態において、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gnにおいて、そのGアミノ酸残基等でコンジュゲートされる。或いは、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)GnのC末端側、例えば、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gnに対して、1乃至50個、例えば1乃至25又は1乃至10個のアミノ酸だけC末端側で、コンジュゲートされ得る。
別の実施形態において、検出可能な標識は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)GnのN末端側、例えば、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gnに対して、1乃至50個、例えば1乃至25又は1乃至10個のアミノ酸だけN末端側で、コンジュゲートされる。
一実施形態において、検出可能な標識は、アミノ酸配列LPXSGnにおいて又はその近くでコンジュゲートされ、nは、少なくとも1、例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10である。好ましくは、nは、1乃至10であり、より好ましくは1乃至5である。検出可能な標識は、好ましくは、LPXSGnのC末端側で、例えば、LPXSGnのC末端側のリジン残基に対してコンジュゲートされる。Xは、E等の任意のアミノ酸である。
一実施形態において、検出可能な標識は、アミノ酸配列LAXTGnにおいて又はその近くでコンジュゲートされ、nは少なくとも1、例えば少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10である。好ましくは、nは、1乃至10であり、より好ましくは1乃至4である。検出可能な標識は、好ましくは、LAXTGnのN末端側で、例えばLAXTGnのN末端側のヒスチジン残基に対してコンジュゲートされる。Xは、E等の任意のアミノ酸である。
一実施形態において、第1の検出可能な標識は、アミノ酸配列LPXSGn(nは少なくとも1、例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10、好ましくは、nは1乃至10、より好ましくは1乃至5)において又はその近くでコンジュゲートされ、第2の検出可能な標識は、アミノ酸配列LAXTGn(nは少なくとも1、例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10、好ましくは、nは1乃至10、より好ましくは1乃至4)において又はその近くでコンジュゲートされる。第1の検出可能な標識は、好ましくは、LPXSGnのC末端側で、例えば、LPXSGnのC末端側のリジン残基に対してコンジュゲートされ、第2の検出可能な標識は、好ましくは、LAXTGnのN末端側で、例えば、LAXTGnのN末端側のヒスチジン残基に対してコンジュゲートされる。Xは、E等の任意のアミノ酸である。一実施形態において、第1の検出可能な標識は、ポリペプチドのTMのC末端側に位置し、第2の検出可能な標識は、ポリペプチドの無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体(好ましくは無細胞毒性プロテアーゼ)のN末端側に位置する。
本発明の標識ポリペプチドは、配列番号26に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態において、本発明の標識ポリペプチドは、配列番号26に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明の標識ポリペプチドは、配列番号26として示したポリペプチドを含む(より好ましくは、これからなる)。
本明細書に記載のソルターゼは、ソルターゼA、ソルターゼB、ソルターゼC、又はソルターゼDであり得る。ソルターゼの生物学的特性の概要は、共に出典を明記することにより本願明細書の一部とした、Mazmanian, S. K., G. Liu, H. Ton-That and O. Schneewind (1999). "Staphylococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall." Science 285(5428): 760-763及びPaterson, G. K. and T. J. Mitchell (2004). "The biology of Gram-positive sortase enzymes." Trends Microbiol 12(2): 89-95に記載されている。
本発明には、ソルターゼ多様体も含まれる。ソルターゼ多様体は、代替のソルターゼ部位(例えば、アクセプタ部位)を認識するように変更された特異性を適切に有する。ソルターゼ多様体は、それぞれ出典を明記することにより本願明細書の一部とした、Dorr, B. M., H. O. Ham, C. An, E. L. Chaikof and D. R. Liu (2014). "Reprogramming the specificity of sortase enzymes." Proc Natl Acad Sci U S A 111(37): 13343-13348, Chen, I., B. M. Dorr and D. R. Liu (2011). "A general strategy for the evolution of bond-forming enzymes using yeast display." Proc Natl Acad Sci U S A 108(28): 11399-11404, Dorr, B. M., H. O. Ham, C. An, E. L. Chaikof and D. R. Liu (2014). "Reprogramming the specificity of sortase enzymes." Proc Natl Acad Sci U S A 111(37): 13343-13348, and Chen, L., J. Cohen, X. Song, A. Zhao, Z. Ye, C. J. Feulner, P. Doonan, W. Somers, L. Lin and P. R. Chen (2016). "Improved variants of SrtA for site-specific conjugation on antibodies and proteins with high efficiency." Sci Rep 6: 31899 に記載されている。特注のソルターゼ多様体は、前記参考文献に記載の方法論を使用して生成し得る。当業者は、本発明において前記多様体を使用する場合、ソルターゼ多様体により認識される適切なソルターゼドナー及び/又はアクセプタ部位を選択するであろう。当業者は、更に、前記ソルターゼドナー及び/又はアクセプタ部位が本明細書に提示されたものと異なり得ることを認識するであろう。
一実施形態において、ソルターゼ多様体は、進化した黄色ブドウ球菌ソルターゼAを含み得る。進化したソルターゼAは、本明細書に記載の配列番号31の配列に関連する1つ以上の突然変異を含み得る。例えば、進化したソルターゼAは、配列番号31の配列に関連する以下の突然変異のうちの1つ以上を含み得る:P86L、P94S、P94R、N98S、A104T、E106G、A118T、F122S、F122Y、D124G、N127S、K134R、F154R、D160N、D165A、K173E、G174S、K177E、I182V、K190E、K196T、又はこれらの組み合わせ。一部の実施形態では、これらの突然変異のうち、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、又は全19種を含む進化したソルターゼが提供される。前述したアミノ酸置換は、それぞれの親の野生型ソルターゼが結合しないアクセプタ及び/又はドナー部位を効率的に使用する進化したソルターゼを提供し得る。例えば、一部の実施形態において、進化したソルターゼは、配列LPXTGを有するソルターゼアクセプタ部位と、N末端ポリグリシンモチーフを有するドナー部位とを利用する。一部の実施形態において、進化したソルターゼは、親ソルターゼにより使用されるアクセプタ及び/又はドナー部位とは(それぞれ)異なるアクセプタ及び/又はドナー部位、例えば、LPXS、LAXT、LAXTG(配列番号116)、MPXT、MPXTG、LAXS、LAXSG(配列番号120)、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG、又はLPXTA(配列番号114)モチーフを含むソルターゼアクセプタ部位、を利用する。
好ましくは、ソルターゼは、ソルターゼA又はその多様体である。ソルターゼAは、タンパク質の(好ましくはC末端)L(A/P/S)X(T/S/A/C)(G/A)モチーフを認識して(T/S/A/C)とG/Aとの間を切断し、その後、アシル成分を(好ましくはN末端)(オリゴ)グリシン(モチーフはL(A/P/S)X(T/S/A/C)G)又は(オリゴ)アラニン(モチーフはL(A/P/S)X(T/S/A/C)A)を含む求核試薬に移送する。一実施形態において、ソルターゼAは、化膿連鎖球菌(例えば、配列番号37)から得られるものであってよく、前記ソルターゼは、(とりわけ)配列LPXTAを有するソルターゼアクセプタ部位を認識し、このような場合、好ましくは、ソルターゼアクセプタ部位は、Anであり、nは、少なくとも1である。化膿連鎖球菌ソルターゼの使用は、出典を明記することにより本願明細書の一部としたAntos et al (2009), J Am Chem Soc, 131, 10800-10801に記載されている。
好ましくは、ソルターゼAは、黄色ブドウ球菌又はその多様体から入手可能なものとなり得る。
一実施形態において、ソルターゼアクセプタ部位は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)(G/A)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)を含み得る(又は、これらからなり得る)。例えば、ソルターゼアクセプタ部位は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)G、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)を含み得る(又は、これらからなり得る)。
一実施形態において、ソルターゼアクセプタ部位は、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTG(配列番号123)、又はLPAXG(配列番号118)(Xは任意のアミノ酸)を含み得る(又は、これらからなり得る)。
ソルターゼアクセプタ部位X1PX2X3Gは、ソルターゼAにより認識され得る。ソルターゼアクセプタ部位がX1PX2X3Gを含む(又は、これからなる)一部の実施形態において、X2は、Asp、Glu、Ala、Gln、Lys、又はMetとなり得る。一部の実施形態において、前記ソルターゼアクセプタ部位は、LPX1TG(X1は任意のアミノ酸)を含む(又は、これからなる)。別の実施形態において、ソルターゼアクセプタ部位は、LPKTG、LPATG、LPNTG、LPETG、LPNAG、LPNTA、LGATG、IPNTG、又はIPETGを含む(又は、これらからなる)。
ソルターゼアクセプタ部位NPX1TX2は、ソルターゼBにより認識され得る。一部の実施形態において、ソルターゼアクセプタ部位は、NPQTN、NPKTG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、又はNPQSSを含む(又は、これらからなる)。
ソルターゼアクセプタ部位LPXTXは、ソルターゼCにより認識され得る。
一実施形態において、ソルターゼアクセプタ部位は、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTG、又はLPAXG(Xは任意のアミノ酸)を含まない(又は、これらからならない)。
ソルターゼAが使用される実施形態において、ソルターゼ部位(例えば、アクセプタ又はドナー部位)は、ソルターゼA部位である。
好適な実施形態において、本明細書に記載のソルターゼアクセプタ部位は、ソルターゼA部位であり得る。ソルターゼAコンセンサスアクセプタ部位は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)(G/A)であってよく、Xは、E等の任意のアミノ酸である。しかしながら、ソルターゼAコンセンサスアクセプタ部位は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gであることが好ましい。
一実施形態において、ソルターゼAアクセプタ部位は、LPXSG(配列番号115)、LAXTG、LPXTG(配列番号117)、LPAXG、LPXCG(配列番号119)、LAXSG、LPXAG(配列番号121)、LSXTG(配列番号122)、LRXTG、及びLPXTAを含むか、又はこれらから選択される。好ましくは、ソルターゼAアクセプタ部位は、LPXSG、LAXTG、LPXTG、及びLAXSG、より好ましくはLPXSG又はLAXTGから選択され得る。例えば、ソルターゼAアクセプタ部位は、本明細書に例示したように、LPESG(配列番号112)又はLAETG(配列番号113)であり得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載のソルターゼアクセプタ部位の後には、1乃至50個、1乃至10個、又は好ましくは1乃至5個(例えば2個)のアミノ酸残基等、1つ以上のC末端アミノ酸残基が続く。一部の実施形態において、ソルターゼアクセプタ部位の後には、1つ以上の酸性アミノ酸残基が続く。酸性アミノ酸残基は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり得る。
ソルターゼドナー部位は、Gn(nは少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10)を含み得る(又は、これからなり得る)。一実施形態において、nは、少なくとも2である。好ましくは、nは、2乃至10、例として2乃至5である。より好ましくは、nは、4である。このようなドナー部位は、好ましくはソルターゼA部位であり、好ましくはソルターゼAアクセプタ部位L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gと共に使用するためのものとなり得る。
一部の実施形態において、ソルターゼドナー部位は、GnKであってよく、nは、少なくとも1である(例えば、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、一実施形態において、nは、少なくとも2であり、好ましくは、nは、2乃至10、例として2乃至5)。
一実施形態において、本発明で使用するソルターゼアクセプタ部位は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)G(Xは任意のアミノ酸)を含み(又は、これからなり)、本発明で使用するソルターゼドナー部位は、Gn(nは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10)を含む(又は、これからなる)。
ソルターゼドナー部位は、An(nは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10)を含み得る(又はからなる)。一実施形態において、nは、少なくとも2である。好ましくは、nは、2乃至10、例として2乃至5である。より好ましくは、nは、4である。このようなドナー部位は、好ましくはソルターゼA部位であり、好ましくはソルターゼAアクセプタ部位L(A/P/S)X(T/S/A/C)Aと共に使用するためのものとなり得る。
一実施形態において、本発明で使用するソルターゼアクセプタ部位は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)A(Xは任意のアミノ酸)を含み(又は、これからなり)、本発明で使用するソルターゼドナー部位は、An(nは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10)を含む(又は、これからなる)。
ソルターゼアクセプタ又はドナー部位に関連して、Xは、例えば、標準アミノ酸:アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、メチオニン、トリプトファン、システイン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、及びフェニルアラニンから選択される任意のアミノ酸であり得る。一部の実施形態において、Xは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得る。
次のような非ソルターゼAアクセプタ部位が採用されている場合:
黄色ブドウ球菌ソルターゼB部位:NPQTN、
肺炎連鎖球菌ソルターゼB部位:YPRTG、IPQTG、又はVPDTG、
化膿連鎖球菌ソルターゼB部位:LPXTGS、
肺炎連鎖球菌ソルターゼC部位:YPRTG、IPQTG、又はVPDTG、及び
肺炎連鎖球菌ソルターゼD部位:YPRTG、IPQTG、又はVPDTG、
当業者は、当該技術分野での教示に基づいて、前記非ソルターゼAアクセプタ部位と共に使用する適切なドナー部位を選択するであろう。
ソルターゼBは、配列番号32又は34に対して少なくとも70%の配列同一性を有する触媒活性ポリペプチドであり得る。一実施形態において、ソルターゼBは、配列番号32又は34に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有する触媒活性ポリペプチドであり得る。好ましくは、ソルターゼBは、配列番号32又は34を含む(より好ましくは、これからなる)触媒活性であり得る。
ソルターゼCは、配列番号35に対して少なくとも70%の配列同一性を有する触媒活性ポリペプチドであり得る。一実施形態において、ソルターゼCは、配列番号35に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有する触媒活性ポリペプチドであり得る。好ましくは、ソルターゼCは、配列番号35を含む(より好ましくは、これからなる)触媒活性であり得る。
ソルターゼDは、配列番号36に対して少なくとも70%の配列同一性を有する触媒活性ポリペプチドであり得る。一実施形態において、ソルターゼDは、配列番号36に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有する触媒活性ポリペプチドであり得る。好ましくは、ソルターゼDは、配列番号36を含む(より好ましくは、これからなる)触媒活性であり得る。
ソルターゼアクセプタ部位は、好ましくは、ポリペプチドのC末端に位置する。ソルターゼドナー部位は、好ましくは、ポリペプチドのN末端に位置する。
これに関連して使用される「C末端に位置する」という用語は、アクセプタ部位のC末端残基が、ポリペプチドのC末端残基に対して、最大50個のアミノ酸残基までN末端側に位置すること、例えば、アクセプタ部位のC末端残基が、ポリペプチドのC末端残基に対して、1乃至50個、好ましくは10乃至40個のアミノ酸残基だけN末端側に位置することを意味し得る。特に好適な実施形態において、アクセプタ部位のC末端残基は、ポリペプチドのC末端残基であり得る。
ポリペプチドのソルターゼアクセプタ部位に対してC末端側に1つ以上の残基が存在する実施形態において、前記1つ以上の残基は、本明細書に記載の標識方法においてポリペプチドを使用する前に除去することが好ましい。
これに関連して使用される「N末端に位置する」という用語は、ドナー部位のC末端残基が、ポリペプチドのN末端残基に対して、最大50個のアミノ酸残基までC末端側に位置すること、例えば、ドナー部位のN末端残基が、ポリペプチドのN末端残基に対して、1乃至50個、好ましくは1乃至25個のアミノ酸残基だけC末端側に位置することを意味し得る。特に好適な実施形態において、ドナー部位のN末端残基は、ポリペプチドのN末端残基であり得る。
ポリペプチドのソルターゼドナー部位に対してN末端側に1つ以上の残基が存在する実施形態において、前記1つ以上の残基は、本明細書に記載の標識方法においてポリペプチドを使用する前に除去することが好ましい。
一実施形態において、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位は、ポリペプチドのTMのC末端側に位置する。一実施形態において、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位は、無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体のN末端側に位置する。
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも2つのソルターゼアクセプタ部位、少なくとも2つのソルターゼドナー部位、又は少なくとも1つのソルターゼアクセプタ部位及び少なくとも1つのソルターゼドナー部位を含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、1つのソルターゼアクセプタ部位及び1つのソルターゼドナー部位を含む。本発明の方法で標識された場合、本明細書に記載の少なくとも2つ(好ましくは2つ)の部位を含むポリペプチドは、少なくとも2つ(好ましくは2つ)の検出可能な標識を含む。このようなポリペプチドの場合、少なくとも2つの部位は、好ましくは異なり、例えば、1つの部位は、ドナー部位であり、1つは、アクセプタ部位であってよく、又は少なくとも2つの部位が同じである場合(例えば、両方ともドナー部位又は両方ともアクセプタ部位)、部位は、異なるアミノ酸配列を有することが好ましい。これにより、異なるアクセプタ部位を認識するソルターゼ等、様々なソルターゼを用いて標識付けを媒介可能となる。
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのTMのC末端側に位置するソルターゼアクセプタ部位と、無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体(好ましくは無細胞毒性プロテアーゼ)のN末端側に位置するソルターゼドナー部位とを含む。
一実施形態において、ポリペプチドを標識する方法は、2段階の標識プロセスを含む。一実施形態において、ステップの1つは、ポリペプチド又は標識基質の第1のソルターゼアクセプタ部位を認識するソルターゼの使用を含み、第2のステップは、ポリペプチド又は標識基質の異なるアクセプタ部位を認識する異なるソルターゼの使用を含む。当業者は、3つ以上(more than two)の異なるソルターゼアクセプタ部位が使用される場合、この方法は、3つ以上の標識ステップ及び3つ以上の異なるソルターゼの使用を含んでよく、各ソルターゼは、異なるソルターゼアクセプタ部位の1つを認識することを理解するであろう。
好ましくは、ポリペプチドは、LPXSGを含む(又は、これからなる)アクセプタ部位と、Gn(nは、2乃至5)を含む(又は、これからなる)ドナー部位とを含む。特に好適な実施形態において、ポリペプチドは、LPESGを含む(又は、これからなる)アクセプタ部位と、G3を含む(又は、これからなる)ドナー部位とを含む。
一実施形態において、本発明の方法は、以下を含む:
a.ソルターゼアクセプタ部位及びソルターゼドナー部位を含むポリペプチドを提供すること、
b.ポリペプチドを以下とインキュベートすること:
ソルターゼアクセプタ部位を認識する第1のソルターゼ、及び
ソルターゼドナー部位及び結合した検出可能な標識を含む第1の標識基質、
ここで、第1のソルターゼは、ソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸とソルターゼドナー部位のアミノ酸との間の結合を触媒することにより、ポリペプチドを標識する、
c.ポリペプチドを以下と更にインキュベートすること:
ポリペプチドのソルターゼアクセプタ部位とは異なるソルターゼアクセプタ部位及び結合した検出可能な標識を含む第2の標識基質、及び
異なるソルターゼアクセプタ部位を認識する(好ましくはポリペプチドのソルターゼアクセプタ部位を認識しない)第2のソルターゼ、
ここで、第2のソルターゼは、異なるソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸とソルターゼドナー部位のアミノ酸との間の結合を触媒することにより、ポリペプチドを更に標識する、及び
d.標識ポリペプチドを取得すること。
当業者は、上述した方法のステップb及びcの順序を任意の順序で実行可能であることを理解するであろう。
別の実施形態において、本発明の方法は、以下を含む。
a.第1のソルターゼアクセプタ部位及び第2のソルターゼアクセプタ部位を含むポリペプチドを提供すること、ここで、第1及び第2のソルターゼアクセプタ部位は異なる:
b.ポリペプチドを以下とインキュベートすること:
第1のソルターゼアクセプタ部位を認識する(好ましくは第2のソルターゼアクセプタ部位を認識しない)第1のソルターゼ、及び
ソルターゼドナー部位及び結合した検出可能な標識を含む標識基質、
ここで、第1のソルターゼは、第1のソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸とソルターゼドナー部位のアミノ酸との間のコンジュゲートを触媒することにより、ポリペプチドを標識する、
c.ポリペプチドを以下と更にインキュベートすること:
第2のソルターゼアクセプタ部位を認識する(好ましくは第1のソルターゼアクセプタ部位を認識しない)第2のソルターゼ、及び
ソルターゼドナー部位及び結合した検出可能な標識を含む標識基質、
ここで、第2のソルターゼは、第2のソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸とソルターゼドナー部位のアミノ酸との間のコンジュゲートを触媒することにより、ポリペプチドを更に標識する、及び
d.標識ポリペプチドを取得すること。
当業者は、上述した方法のステップb及びcの順序を任意の順序で実行可能であることを理解するであろう。
ステップcにおいて、標識基質は、好ましくは、ステップbの標識基質とは異なる検出可能な標識、例えば、異なる色のフルオロフォア、を含む。
別の実施形態において、本発明の方法は、以下を含む:
a.第1のソルターゼドナー部位及び第2のソルターゼドナー部位を含むポリペプチドを提供すること、
b.ポリペプチドを以下とインキュベートすること:
第1のソルターゼアクセプタ部位及び結合した検出可能な標識を含む第1の標識基質、及び
第1のソルターゼアクセプタ部位を認識する(好ましくは第2のソルターゼアクセプタ部位を認識しない)第1のソルターゼ、
ここで、第1のソルターゼは、第1のソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸と第1又は第2のソルターゼドナー部位のアミノ酸との間の結合を触媒することにより、ポリペプチドを標識する、
c.ポリペプチドを以下と更にインキュベートすること:
第2のソルターゼアクセプタ部位及び結合した検出可能な標識を含み、第2のソルターゼアクセプタ部位が第1のソルターゼアクセプタ部位とは異なる第2の標識基質、及び
第2のソルターゼアクセプタ部位を認識する(第1のソルターゼアクセプタ部位を認識しない)第2のソルターゼ、
ここで、第2のソルターゼは、第2のソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸と第1又は第2のソルターゼドナー部位のアミノ酸との間の結合を触媒することにより、ポリペプチドを更に標識する、及び
d.標識ポリペプチドを取得すること。
当業者は、上述した方法のステップb及びcの順序を任意の順序で実行可能であることを理解するであろう。
ステップcにおいて、標識基質は、好ましくは、ステップbの標識基質とは異なる検出可能な標識、例えば、異なる色のフルオロフォア、を含む。
好適な実施形態において、本発明の方法は以下を含む:
a.LPXSG(Xは任意のアミノ酸)を含むソルターゼアクセプタ部位とGn(nは2乃至5)を含むソルターゼドナー部位とを含むポリペプチドを提供すること、
b.ポリペプチドを以下とインキュベートすること:
LPXSGを含むソルターゼアクセプタ部位を認識する(好ましくはLAXTGを含むソルターゼアクセプタ部位を認識しない)第1のソルターゼ、及び
Gn(nは2乃至10(好ましくは2乃至5))を含むソルターゼドナー部位及び結合した検出可能な標識を含む第1の標識基質、
ここで、第1のソルターゼは、ポリペプチドのソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸と第1の標識基質のソルターゼドナー部位のアミノ酸との間の結合を触媒することにより、ポリペプチドを標識する、
c.ポリペプチドを以下とインキュベートすること:
LAXTG(Xは任意のアミノ酸)を含むソルターゼアクセプタ部位及び結合した検出可能な標識を含む第2の標識基質、及び
LAXTGを含むソルターゼアクセプタ部位を認識する(好ましくはLPXSGを含むソルターゼアクセプタ部位を認識しない)第2のソルターゼ、
ここで、第2のソルターゼは、第2の標識基質のソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸とポリペプチドのソルターゼドナー部位のアミノ酸との間の結合を触媒することにより、ポリペプチドを標識する、及び
d.標識ポリペプチドを取得すること。
当業者は、上述した方法のステップb及びcの順序を任意の順序で実行可能であることを理解するであろう。
第1及び第2の標識基質に結合した検出可能な標識は、好ましくは異なり、例えば、異なる色のフルオロフォアである。
当業者は、ポリペプチドに3つ以上(more than two)の検出可能な標識を追加することが意図される場合、ポリペプチドが3つ以上の部位(例えば、ドナー又はアクセプタ部位)を含むことが可能であり、方法を反復的に実施可能であることを理解するであろう。
「ソルターゼアクセプタ部位を認識しない」という用語(又はその変形)は、前記部位を認識するソルターゼのポリペプチドとの活性と比較して、対象のソルターゼアクセプタ部位を含むポリペプチドとのソルダーゼの活性(例えば、切断又は結合)が低いことを意味し得る。一実施形態において、「ソルターゼアクセプタ部位を認識しない」という用語は、前記部位を認識するソルターゼのポリペプチドとの活性と比較して、対象のソルターゼアクセプタ部位を含むポリペプチドとの活性(例えば、切断又は結合)を、ソルダーゼが実質的に有しないか、又は有しないことを意味し得る。一実施形態において、「ソルターゼアクセプタ部位を認識しない」という用語(又はその変形)は、対象のソルターゼアクセプタ部位を含むポリペプチドとのソルターゼの活性(例えば、切断又は結合)が、ソルターゼにより認識されるソルターゼアクセプタ部位を含むポリペプチドとの前記ソルターゼの活性と比較して、低いことを意味し得る。一実施形態において、「ソルターゼアクセプタ部位を認識しない」という用語は、対象のソルターゼアクセプタ部位を含むポリペプチドとの活性(例えば、切断又は結合)を、ソルダーゼが、ソルターゼにより認識されるソルターゼアクセプタ部位を含むポリペプチドとの前記ソルターゼの活性と比較して、実質的に有しないか、又は有しないことを意味し得る。ソルターゼにより認識されるソルターゼアクセプタ部位は、前記ソルターゼにより認識されることが当該技術分野において公知である部位であり得る。
本発明の方法のインキュベーションステップは、ソルターゼを用いてポリペプチドの標識を成功させることを可能にする任意の条件下で実施することができる。このような条件は、当業者が日常的な手法/最適化を用いて決定することができる。
本明細書に記載した方法のインキュベーションステップにおいて使用するためのポリペプチド、ソルターゼ、及び標識基質の量は、当業者が日常的な手法を用いて決定することができる。一実施形態において、方法は、ポリペプチド及びソルターゼに対する過剰の標識基質の使用と、任意にポリペプチドに対する過剰のソルターゼの使用とを含む。一実施形態において、方法は、ポリペプチド対ソルターゼ対標識基質の重量比1:2:20の使用を含む。別の実施形態において、方法は、ポリペプチド対ソルターゼ対標識基質のモル比1:2:20の使用を含む。
本明細書に記載の方法のインキュベーションステップの反応条件も、当業者が日常的な手法を用いて決定することができる。例えば、反応は、少なくとも2、4、6、8、10又は12時間に亘り実施し得る。好ましくは、反応は、少なくとも10時間に亘り実施し得る。反応は、1乃至40℃、例として1乃至37℃で実施し得る。一実施形態において、反応は、1乃至10℃、好ましくは3乃至5℃、例えば約4℃で実施し得る。反応時間は、使用する温度に応じて調整してよく、例えば、温度が低いほど、長いインキュベーション時間が必要となり得る。
本発明の方法のインキュベーションステップの後、任意の遊離標識基質及び/又はソルターゼ及び/又は非標識ポリペプチドを、標識ポリペプチドから分離し得る。一実施形態において、分離は、ソルターゼ又は標識ポリペプチド上のタグ、好ましくは標識ポリペプチド上のタグ(例えば、Hisタグ)により達成される。タグは、標識ポリペプチド上に存在し得るが、非標識ポリペプチド上には存在し得ず、例えば、タグは、標識ポリペプチドに結合した標識基質上に存在する。
一実施形態において、分離ステップは、ポリペプチドが2つ以上の部位を含み、方法が2つ以上のインキュベーション/標識ステップを含む場合に利用し得る。分離ステップは、各インキュベーション/標識ステップの後に利用し得る。
一実施形態において、本発明の方法は、(例えば、本明細書に詳述される)第1のインキュベーション及び第2のインキュベーションを含み、第1のインキュベーション後、第1のタグを使用して、標識ポリペプチドを非標識ポリペプチドから分離する。好ましくは、第1のタグは、標識ポリペプチドには存在しないが、非標識ポリペプチド上に存在し、非標識ポリペプチドは、免疫除去により取り除くことができる。第1のタグは、Strepタグにし得る。一実施形態において、第2のインキュベーション後、第2のタグを使用して、二重標識ポリペプチドを任意の単一標識(又は非標識)ポリペプチドから分離する。好ましくは、第2のタグは、二重標識ポリペプチド上に存在するが、単一標識(又は非標識)ポリペプチドには存在せず、二重標識ポリペプチドは、免疫アフィニティークロマトグラフィにより分離することができる。第2のタグは、Hisタグにし得る。
ソルターゼを用いて標識するポリペプチドがソルターゼドナー部位を含む実施形態において、前記部位のN末端は、例えば、それに対してN末端側の1つ以上のアミノ酸残基により保護し得る。利点として、これにより、ソルターゼアクセプタ部位を更に含むポリペプチドの環状化を防止し得る。前記1つ以上のアミノ酸は、TEV切断部位等、切断可能な部位を介して除去することにより、前記ソルターゼドナー部位のN末端を露出させ得る。したがって、本発明の方法は、ソルターゼドナーのN末端を、例えば、それに対してN末端側にある1つ以上のアミノ酸を除去することにより脱保護するステップを含み得る。脱保護ステップは、第1及び第2のインキュベーションステップ間に実施し得る。
本発明のポリペプチドが切断可能部位(例えば、ソルターゼドナー部位のN末端の切断可能部位)を含む一実施形態において、前記切断可能部位は、任意の切断可能部位にし得る。一実施形態において、切断可能部位は、クロストリジウム神経毒に対して非天然(即ち、外因性)である部位にし得る。一部の実施形態において、切断可能部位は、関連するプロテアーゼにより多様体を切断可能であるという条件で、プロテアーゼ認識部位又はその多様体である。切断可能な部位は、エンテロキナーゼ、第Xa因子、タバコエッチ病ウイルス(TEV)、トロンビン、PreScission、ADAM17、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ(HAT)、エラスターゼ、フューリン、グランザイム、又はカスパーゼ2、3、4、7、9、又は10により切断される部位であり得る。切断可能部位は、配列番号84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、又は100の何れか1つに対して、少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態において、切断可能部位は、配列番号84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、又は100の何れか1つに対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。別の実施形態において、切断可能部位は、配列番号84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、又は100の何れか1つとして示したポリペプチド配列を有する非クロストリジウム切断可能部位を含む(好ましくは、これからなる)。好ましくは、切断可能部位は、配列番号87として示したTEV切断部位を含む(より好ましくは、これからなる)。
本発明で使用するソルターゼは、配列番号14に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態において、本発明で使用するソルターゼは、配列番号14に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。好ましくは、本発明で使用するソルターゼは、配列番号14として示したポリペプチド配列を含み得る(より好ましくは、これからなる)。
本発明で使用するソルターゼは、配列番号13に対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ得る。一実施形態において、本発明で使用するソルターゼは、配列番号13に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ得る。好ましくは、本発明で使用するソルターゼは、配列番号13として示した核酸配列を含む(より好ましくは、これからなる)核酸配列によりコードされ得る。
本発明で使用するソルターゼは、配列番号16に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態において、本発明で使用するソルターゼは、配列番号16に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。好ましくは、本発明で使用するソルターゼは、配列番号16として示したポリペプチド配列を含み得る(より好ましくは、これからなる)。
本発明で使用するソルターゼは、配列番号15に対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ得る。一実施形態において、本発明で使用するソルターゼは、配列番号15に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ得る。好ましくは、本発明で使用するソルターゼは、配列番号15として示した核酸配列を含む(より好ましくは、これからなる)核酸配列によりコードされ得る。
ソルターゼAは、配列番号31、33、又は37に対して少なくとも70%の配列同一性を有する触媒活性ポリペプチドであり得る。一実施形態において、ソルターゼAは、配列番号31、33、又は37に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有する触媒活性ポリペプチドであり得る。好ましくは、ソルターゼAは、配列番号31、33、又は37を含む(より好ましくは、これからなる)触媒活性であり得る。
本発明は、少なくとも2つのソルターゼ(より好ましくは2つ)の使用を含んでよく、例えば、前記ソルダーゼは、それぞれ配列番号14及び16に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一実施形態において、本発明は、少なくとも2つのソルターゼの使用を含んでよく、前記ソルターゼは、それぞれ配列番号14及び16に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。好ましくは、本発明は、少なくとも2つのソルターゼの使用を含んでよく、前記ソルターゼは、それぞれ配列番号14及び16を有するポリペプチドを含む(より好ましくは、これからなる)。
ソルターゼの使用を含む方法で使用するための標識基質は、ソルターゼ基質であり、ソルターゼドナー又はアクセプタ部位及び結合した検出可能な標識を含む。標識基質がソルターゼアクセプタ部位を含むポリペプチドを標識するためのものであるとされる場合、標識基質は、ソルターゼドナー部位を含み、逆も同様となる。標識基質は、ペプチド又はポリペプチド、好ましくはペプチドであり得る。
標識基質は、本明細書に記載のソルターゼドナー又はアクセプタ部位の何れかを含み得る。標識基質は、更に、その精製又は標識ポリペプチドからの分離を助けるために、精製タグ(例えば、Hisタグ)等、1つ以上のタグを含み得る。
一実施形態において、標識基質は、ソルターゼドナー部位を含む。ソルターゼドナー部位を含む標識基質の例は、配列番号29により提供される。したがって、一実施形態において、配列番号29に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む標識基質が提供される。標識基質は、配列番号29に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、標識基質は、配列番号29として示したポリペプチド配列を含む(より好ましくは、これからなる)。
一実施形態において、標識基質は、ソルターゼアクセプタ部位を含む。ソルターゼアクセプタ部位を含む標識基質の例は、配列番号30により提供される。したがって、一実施形態において、配列番号30に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む標識基質が提供される。標識基質は、配列番号30に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、標識基質は、配列番号30として示したポリペプチド配列を含む(より好ましくは、これからなる)。
ソルターゼアクセプタ部位は、好ましくは、標識基質のC末端に位置する。ソルターゼドナー部位は、好ましくは、標識基質のN末端に位置する。
本発明のポリペプチドは、好ましくは、2本の鎖がジスルフィド結合により共に結合されている二本鎖ポリペプチドとして使用するためのものである。このような実施形態において、ポリペプチドは、2本のポリペプチド鎖の一方又は両方のN末端に位置するソルターゼドナー部位を含み得る。例えば、二本鎖ポリペプチドは、無細胞毒性プロテアーゼ(又はそのタンパク分解性に不活性な変異体)のN末端側にあるソルターゼドナー部位及び/又はそのトランスロケーションドメインを含み得る。ソルターゼドナー部位がポリペプチドのトランスロケーションドメインのN末端側にある実施形態において、ソルターゼドナー部位は、ポリペプチドが(例えば、タンパク質分解活性化により)二本鎖形態に変換された後でのみ、本発明の方法において利用可能となる。
これに関連して使用される「C末端に位置する」という用語は、アクセプタ部位のC末端残基が、標識基質のC末端残基に対して、最大50個のアミノ酸残基までN末端側に位置すること、例えば、アクセプタ部位のC末端残基が、標識基質のC末端残基に対して、1乃至50個、好ましくは10乃至40個のアミノ酸残基だけN末端側に位置することを意味し得る。特に好適な実施形態において、アクセプタ部位のC末端残基は、標識基質のC末端残基であり得る。
標識基質のソルターゼアクセプタ部位に対してC末端側に1つ以上の残基が存在する実施形態において、前記1つ以上の残基は、本明細書に記載の標識方法において標識基質を使用する前に除去することが好ましい。
これに関連して使用される「N末端に位置する」という用語は、ドナー部位のC末端残基が、標識基質のN末端残基に対して、最大50個のアミノ酸残基までC末端側に位置すること、例えば、ドナー部位のN末端残基が、標識基質のN末端残基に対して、1乃至50個、好ましくは1乃至25個のアミノ酸残基だけC末端側に位置することを意味し得る。特に好適な実施形態において、ドナー部位のN末端残基は、標識基質のN末端残基であり得る。
標識基質のソルターゼドナー部位に対してN末端側に1つ以上の残基が存在する実施形態において、前記1つ以上の残基は、本明細書に記載の標識方法において標識基質を使用する前に除去することが好ましい。
原理実証データにより、本発明者らは、本発明のポリペプチドの効力(例えば、結合、トランスロケーション、及び/又は触媒活性)に悪影響を与えることなく、ソルターゼ媒介標識と同様の任意の標識手法を本発明において使用し得ることを実証している。したがって、本発明は、標識ポリペプチドを本発明のポリペプチドにコンジュゲートさせることが可能な代替酵素の使用を包含する。これらは、ソルターゼの代わりに、又はソルターゼに追加して(好ましくは、例えば、追加の部位で標識する際に追加して)、使用し得る。本発明においても有用となり得る酵素は、代替のトランスペプチダーゼ又はリガーゼを含み得る。したがって、ソルターゼに関して本明細書に記載の実施形態は、代替のトランスペプチダーゼ又はリガーゼに適用し得る。
一実施形態において、本発明は、植物種Clitoria ternateaから得られるリガーゼであり、出典を明記することにより本願明細書の一部としたNguyen, G. K., Y. Cao, W. Wang, C. F. Liu and J. P. Tam (2015). "Site-Specific N-Terminal Labeling of Peptides and Proteins using Butelase 1 and Thiodepsipeptide." Angew Chem Int Ed Engl 54(52): 15694-15698及びNguyen et al (2016), Nature Protocols, 11, 10, 1977-1988, which are incorporated herein by referenceにおいて説明されるブテラーゼ1(又はその多様体)等のリガーゼの使用を含み得る。本発明がソルターゼに代わるトランスペプチダーゼ又はリガーゼの使用を含む場合、標識基質は、それぞれ、前記トランスペプチダーゼ又はリガーゼの基質となる。
ブテラーゼ1が利用される実施形態において、ポリペプチドは、ブテラーゼ1アクセプタ又はドナー部位を含み、ブテラーゼ1ドナー又はアクセプタ部位及び結合した検出可能な標識を含む標識基質が利用される。ソルターゼの使用を含む方法と同様に、ポリペプチドがブテラーゼアクセプタ部位を含む場合、結合した検出可能な標識を含む標識基質は、ブテラーゼドナー部位を含む(逆も同様)。このような実施形態において、標識基質は、ブテラーゼ(例えば、ブテラーゼ1)の基質である。
ブテラーゼは、C末端のAsn/Asp-His-Valコンセンサス配列のAsn/AspとHisとの間を切断し、N末端アミノ酸配列Xaa-(Ile/Leu/Val/Cys)を含むポリペプチドを連結することが可能であり、ここで、Xaaは、Asn/Asp-Xaa-(Ile/Leu/Val/Cys)間の結合を形成するプロリン以外の任意のアミノ酸である。一実施形態において、ブテラーゼアクセプタ部位は、Asn/Asp-His-Valを含む(又は、これからなる)。一実施形態において、ブテラーゼドナー部位は、Xaa-(Ile/Leu/Val/Cys)を含み(又は、これからなり)、ここで、Xaaは、プロリン以外の任意のアミノ酸である。
ブテラーゼ部位に関連して、Xaaは、(例えば)標準アミノ酸:アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、メチオニン、トリプトファン、システイン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニンから選択され得る。
したがって、標識ポリペプチドを調製する方法が提供され、方法は、以下を含む:
a.以下を含むポリペプチドを提供すること:
i.ブテラーゼアクセプタ部位、
ii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体、
iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)、及び
iv.トランスロケーションドメイン、
b.ポリペプチドを以下とインキュベートすること:
ブテラーゼ(例えば、ブテラーゼ1)、及び
ブテラーゼドナー又はアクセプタ部位及び結合した検出可能な標識を含む標識基質、
ここで、ブテラーゼは、ブテラーゼアクセプタ部位のアミノ酸とブテラーゼドナー部位のアミノ酸との間の結合を触媒することにより、ポリペプチドを標識する、及び
c.標識ポリペプチドを取得すること。
他の態様において、本発明は、ブテラーゼにより標識するためのポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、
ブテラーゼアクセプタ又はドナーサイトと、
標的細胞内の開口放出融合機構のタンパク質を切断することが可能な無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
無細胞毒性プロテアーゼを、エンドソーム内からエンドソーム膜を越えて標的細胞のサイトゾルにトランスロケートさせることが可能なトランスロケーションドメインと、を含み、
ポリペプチドがブテラーゼドナー部位を含む場合、ブテラーゼドナー部位は、ポリペプチドのN末端に位置し、
ドナー部位のN末端残基は、ポリペプチドのN末端残基であり、又は
ポリペプチドは、ブテラーゼドナー部位に対してN末端側にある1つ以上のアミノ酸残基と、切断時にブテラーゼドナー部位のN末端を露出させる切断可能部位とを含む。
本発明は、更に、標識ポリペプチドであって、
i.ポリペプチドに結合した検出可能な標識と、
ii.Asn/Asp-Xaa-(Ile/Leu/Val/Cys)(Xaaはプロリン以外の任意のアミノ酸)を含むアミノ酸配列と、
iii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
iv.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
v.トランスロケーションドメインと、を含むポリペプチドを提供する。
したがって、標識ポリペプチドは、Asn/Asp-Xaa-(Ile/Leu/Val/Cys)(Xaaはプロリン以外の任意のアミノ酸)を含む(又は、これからなる)アミノ酸配列において又はその近くで結合した検出可能な標識を含み得る。
一実施形態において、ブテラーゼ1等、トランスペプチダーゼ又はリガーゼをソルターゼと組み合わせて使用して、2つ以上の標識を有するポリペプチドを取得する。したがって、一実施形態において、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の少なくとも1つのソルターゼアクセプタ又はドナー部位、及び少なくとも1つのブテラーゼ(例えば、ブテラーゼ1)アクセプタ又はドナー部位を含み得る。
ブテラーゼ1は、配列番号27又は28(好ましくは配列番号28)に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む触媒活性ポリペプチドであり得る。一実施形態において、ブテラーゼ1は、配列番号27又は28(好ましくは配列番号28)に対して少なくとも80%、90%、又は95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、ブテラーゼ1は、配列番号27又は28(好ましくは配列番号28)として示したポリペプチド配列を含み得る(より好ましくは、これからなる)。
他のリガーゼには、PATG(配列番号41)、PCY1(配列番号42)、POPB(配列番号43)又はブテラーゼ同族列OaAEP1b(配列番号44及び45)が含まれ得る(Harris et al (2015), Nat Commun, 6, 10199)。前記リガーゼがシグナルペプチド又は他のN末端リーダ配列を有する場合、前記シグナルペプチド又はリーダ配列は、好ましくは、本発明で使用する前に除去される。
POPB及びその使用のための適切な方法は、当該技術分野において教示されている。例えば、出典を明記することにより本願明細書の一部としたLuo H (2014), Chemistry and Biology 21: 1610-1617に記載されている。
したがって、本発明で使用するリガーゼは、配列番号41乃至44の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態において、リガーゼは、配列番号41乃至44の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、又は95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、リガーゼは、配列番号41乃至44の何れか1つとして示したポリペプチド配列を含み得る(より好ましくは、これからなる)。
本発明は、当業者に公知の任意の適切な検出可能な標識の使用を包含する。検出可能な標識は、標識の光学的特性により視覚的に検出できる標識にし得る。このような標識は、蛍光手法、例えば、蛍光顕微鏡を用いて検出することができる。したがって、特に好適な実施形態において、検出可能な標識は、フルオロフォアである。好ましくは、検出可能な標識は、特に、HiLyte蛍光色素(AnaSpecから市販)、AlexaFluor(Thermo Fisherから市販)、Atto(Sigma-Aldrichから市販)、Quantum Dots(Sigma-Aldrichから市販)、Janelia Fluor色素(Janelia(米国)から入手可能)等の蛍光色素である(又はこれらを含む)。好適な実施形態において、検出可能な標識は、多糖及び/又はポリアルコール及び/又は細菌又はウイルスポリマ(例えば、多糖又はポリペプチド)を含まない。
一態様において、本発明は、更に、本発明のポリペプチドをアッセイする方法であって、
a.標的細胞を本発明の標識ポリペプチドと接触させることと、
b.検出可能なラベルを検出することと、を含む方法を提供する
このような方法は、インビトロ又はインビボで(例えば、哺乳動物、例として非ヒト哺乳動物、例えばマウスにおいて)実施され得る。好ましくは、方法は、インビトロで実施される。インビボで実施される場合、方法は、エクスビボ分析のために組織サンプルを除去することを含み得る。
本発明の方法は、好ましくは生細胞/組織を使用して、好ましくはリアルタイムで実施される。前記方法は、本発明のポリペプチドの結合、移送、及びトランスロケーションを可能にする利点を有する。
方法は、パルスチェイス実験にしてよく、又はパルスステップ(例えば、標識ポリペプチドの使用を含む)及びチェイスステップ(例えば、標識ポリペプチドの使用を含まず、非標識ポリペプチドの使用を任意に含む)を含み得る。
検出可能な標識を検出することにより、ポリペプチド又はその一部の検出が可能になる。例えば、ポリペプチドが、無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体に結合した第1の検出可能な標識とトランスロケーションドメイン又はTMに結合した第2の検出可能な標識とを含む場合、この方法は、前記検出可能な標識の両方の検出を含み得る。
本発明の方法は、2つ以上の検出可能な標識の共局在化の存在又は非存在を検出することを含み得る。検出は、当業者に公知の任意の手法(例えば、FRET及び関連する手法)を使用して達成することができる。一実施形態において、本発明の方法は、2つ以上の検出可能な標識の共局在の変化を、例えば経時的に検出することを含む。ポリペプチドが、無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体に結合した第1の検出可能な標識、及びトランスロケーションドメイン又はTMに結合した第2の検出可能な標識を含む実施形態において、第1及び第2の検出可能な標識の共局在の減少を(例えば、経時的に)検出することにより、エンドソームからの無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体のトランスロケーションの測定が可能となり得る。このような共局在の変化が生じるのに要する時間は、トランスロケーション率を決定するために使用し得る。共局在の変化がない(例えば、実質的に変化しない)ことを検出することにより、トランスロケーションが起こらなかったことを示し得る。
この方法は、細胞のサイトゾルにおける第1の検出可能な標識及び/又は細胞のエンドソームにおける第2の検出可能な標識の存在を検出することを含んでよく、これは、更に、トランスロケーションのアッセイを提供し得る。同様に、エンドソームにおいて第1及び第2の検出可能な標識(共局在)を検出することにより、ポリペプチドが正常にエンドサイトーシスされたことを示すものとし得る。
一部の実施形態において、本発明の方法は、検出可能な標識の量を、例えばセル内の特定の場所において、及び/又は特定の時間経過に亘って、定量化することを含み得る。このような定量化は、細胞内の特定の位置で(例えば、経時的に)検出可能な標識の強度を検出することにより決定し得る。代わりに又は追加として、定量化は、細胞内に存在する前記検出可能な標識を含む凝集体の数又はサイズを決定することにより実行し得る。
一実施形態において、本発明の方法は、以下を含む:
i)標的細胞を、エンドソーム放出能力を評価すべき本発明の標識ポリペプチドと接触させ、ここで、前記標的細胞は、前記細胞の細胞膜外面に存在する結合部位を含む細胞膜を含むこと、
ii)標識ポリペプチドを前記標的細胞とインキュベートすることにより、
a)標識ポリペプチドを標的細胞上に存在する結合部位と結合させ、これとの結合複合体を形成させ、これにより、前記結合複合体がエンドサイトーシスにより標的細胞に入るのを可能にすること、
b)前記細胞内に標識ポリペプチドを含む1つ以上のエンドソームを形成させること、及び
c)前記標識ポリペプチドを、1つ以上のエンドソームのエンドソーム膜を通過することにより、標的細胞のサイトゾルに入れること、
iii)標的細胞上に存在する結合部位に結合していない過剰な標識ポリペプチドを除去すること、
iv)所定の期間の後、1つ以上のエンドソームに存在する標識ポリペプチドの量を検出するか、又は前記標的細胞のサイトゾルに存在する標識ポリペプチドの量を検出すること、
v)ステップiv)において検出された標識ポリペプチドの量を、1つ以上のエンドソームに存在する標識ポリペプチドの量、又はステップiv)の前にサイトゾルに存在する標識ポリペプチドの量を表す対照値と比較すること、
vi)1つ以上のエンドソーム内に存在する標識ポリペプチドの量の相対的変化を決定することにより、又は前記標的細胞のサイトゾルに存在する標識ポリペプチドの量の相対的変化を決定することにより、標識ポリペプチドのエンドソーム放出値を計算すること。
標的細胞は、哺乳動物細胞等の真核細胞、例えば、本明細書に記載の標的細胞であり得る。
インキュベーションステップii)は、任意の所定期間、例えば、5分乃至5日の期間に亘り進行し得る。一般的な期間は、1乃至12時間、たとえば2乃至10時間、4乃至8時間、又は6乃至8時間となる。この期間中、標的細胞(即ち、細胞膜の外面)は、標識ポリペプチド(一般に、過剰な標識ポリペプチド)に曝露させ、その結果、標識ポリペプチドが細胞内エンドソームにほぼ同じ割合で出入りする「定常状態」が達成されるようにし得る。この時点は、ステップiii及び/又はiv)を実行するのに最適な時点を表す。
ステップiii)は、標的細胞の外部の標識ポリペプチドの供給源を減少又は除去することにより、細胞に入る標識ポリペプチドの量を減少させる(又は実質的に防止する)ことを含み得る。標的細胞に入る標識ポリペプチドの量の前記減少は、次に、エンドソームに入る標識ポリペプチドの量の変化をもたらし、これは、次に、エンドソームを出る及び/又は標的細胞のサイトゾルに入る標識ポリペプチドの量(又は速度)の変化をもたらす。エンドソーム構造を離れる標識ポリペプチドの量(又は速度)は、一実施形態においてアッセイの基礎を提供するものとなり得、エンドソーム構造を離れる標識ポリペプチドの前記量(又は速度)は、エンドソームに存在する標識ポリペプチドの量の変化、及び/又はサイトゾルに存在する標識ポリペプチドの量の変化により測定し得る。エンドソームに存在する標識ポリペプチドの量を測定する場合、一般に、存在する標識ポリペプチドの量の減少が観察される。サイトゾルに存在する標識ポリペプチドの量を測定する場合、サイトゾル内に存在する標識ポリペプチドの量の増加又は減少が観察され得る。一例として、サイトゾル内の標識ポリペプチドの量の増加は、標識ポリペプチドの定常状態のエンドソーム輸送が確立する前にステップiii)が開始される際に観察され得る。或いは、サイトゾル内の標識ポリペプチドの量の現象は、標的細胞からの標識ポリペプチドの細胞分泌の速度が、エンドソームからサイトゾルへの標識ポリペプチドのエンドソーム輸送の速度を超える場合に観察され得る。
アッセイで使用される標的細胞は、表面に固定化し得る。細胞の固定化は、アッセイ前のステップとして実行してよく(即ち、事前固定化)、又はアッセイプロトコルの一部として実行してもよい。したがって、一実施形態において、アッセイの細胞は、事前に固定化される。標的細胞の固定化は、任意の従来の手段により実行し得る。一例として、細胞を高密度でアッセイプレートに播種し、アッセイを実施する前に付着させる。或いは、細胞をアッセイプレートに播種し、使用前に数日間培養して、コンフルエントな単層とする。細胞の付着は、ポリ-D-リジンをコーティングしたプレート等、従来のコーティングを用いることにより強化し得る。
一実施形態において、標的細胞の固定化は、ステップiii)の前又は最中に実施してよく、これにより、遊離(例えば、非結合又は外因性)標識ポリペプチドから前記細胞を分離するための簡単な手段が提供される。または、固定化は、ステップiii)の後、例えば、検出ステップiv)を容易にするために実行し得る。
ステップiii)は、過剰な(例えば、非結合又は外因性)標識ポリペプチドから標的細胞を分離する濾過ステップ又はアフィニティリガンドステップを含み得る。ステップiii)は、例えば従来の緩衝液を使用して、過剰な(例えば、非結合又は外因性)標識ポリペプチドを標的細胞から洗い流す洗浄ステップを含み得る。過剰な標識ポリペプチドとは、標的細胞の外部でアッセイ培地に存在し、標的細胞の表面に存在する結合部位にまだ結合していない標識ポリペプチドを意味するものである。
ステップiv)での標識ポリペプチドの検出は、一般に、ステップiii)の直後に実行される。一例として、ステップiv)の一般的な時間枠は、ステップiii)に続く5分乃至5時間となる。一実施形態において、ステップiv)は、ステップiii)に続く15乃至240分、又は30乃至180分、又は45乃至150分に実行される。検出ステップiv)は、幾つかの時点で、例えば10分、15分、又は30分間隔で繰り返してよく、これにより、エンドソーム放出の速度を計算することができる。
検出ステップiv)は、任意の従来の手段により実行し得る。標識ポリペプチドの検出は、前記標識ポリペプチドの細胞内局在に基づくものにし得る。
比較ステップv)は、ステップiv)を検出する前にエンドソーム及び/又はサイトゾル内に存在する標識ポリペプチドの量を表す対照値の使用を採用している。対照値は、一般に、検出ステップiv)において標識ポリペプチドの量を決定するのと同じ手段/方法により決定される。対照値は、一般に、ステップiii)の最中又は前にエンドソーム及び/又はサイトゾル内に存在する標識ポリペプチドの量を表す。一例として、対照値は、ステップii)の最中又は終了時にエンドソーム及び/又はサイトゾル内に存在する標識ポリペプチドの量を表してよく、一実施形態において、対照値は、「定常状態」のトランスロケーション速度が確立された時、即ち、標識ポリペプチドがほぼ同じ速度で細胞内エンドソームに出入りする時に、エンドソーム及び/又はサイトゾル内に存在する標識ポリペプチドの量を表す。
上述した実施形態において、標識ポリペプチドという用語は、無細胞毒性プロテアーゼドメイン、トランスロケーションドメイン、又はTM(例えば、トランスロケーションドメイン及びTM)等、その一部も包含し得る。方法は、更に、ポリペプチドの1つの部分上の標識及びポリペプチドの第2の部分上の標識等、2つ以上の標識を検出することを含み得る。
一実施形態において、本発明の方法は、更に、開口放出融合機構のタンパク質(例えば、SNAREタンパク質)の切断をアッセイすることを含み得る。
検出可能な標識は、当業者に公知の任意の適切な手法を使用して検出し得る。一実施形態では、顕微鏡法を使用して、検出可能な標識を検出する。検出可能な標識を検出するための手法は、任意の適切な光、共焦点(好ましくは3Dライブ共焦点顕微鏡法)、超解像、又は単一分子イメージング手法(例えば、光学顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、超解像顕微鏡法、又は単一分子画像化)を含み得る。STED、PALM、STORM、及びTIRF等の顕微鏡を本発明の方法において採用し得る。このような顕微鏡手法は、十分に確立されており、高解像度である。
「タンパク分解性に不活性な変異体」という用語は、その非変異型と比較した場合に、標的細胞における開口放出融合機構のタンパク質の切断の有意な減少を示す無細胞毒性プロテアーゼ変異体を包含するものである。好ましくは、タンパク分解性に不活性な変異体は、タンパク分解性に不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含む。一実施形態において、タンパク分解性に不活性な変異体は、配列番号38又は40のL鎖を含み得る。
一実施形態において、「タンパク分解性に不活性な変異体」は、実質的に無細胞毒性プロテアーゼ活性を示さず、好ましくは無細胞毒性プロテアーゼ活性を示さない。「実質的に無細胞毒性プロテアーゼ活性がない」という用語は、タンパク分解性に不活性な変異体が、その非変異(即ち、タンパク質分解活性)型の無細胞毒性プロテアーゼ活性の5%未満、例えば2%未満、1%未満、又は好ましくは0.1%未満であることを意味する。無細胞毒性プロテアーゼ活性は、試験無細胞毒性プロテアーゼ変異体をSNAREタンパク質と共にインキュベートし、その非変異(即ち、タンパク質分解活性)型により同じ条件下で切断されたSNAREタンパク質の量と比較した場合に、試験無細胞毒性プロテアーゼにより切断されたSNAREタンパク質の量を比較することにより、インビトロで決定することができる。SDS-PAGEやウエスタンブロッティング等、日常的な手法を使用して、切断されたSNAREタンパク質の量を定量化することができる。適切なインビトロアッセイは、出典を明記することにより本願明細書の一部としたWO2019/145577A1に記載されている。代わりに又は追加として、本明細書に記載の細胞に基づくアッセイを使用し得る。
一実施形態において、タンパク分解性に不活性な変異体は、前記プロテアーゼ活性を不活性化する1つ以上の変異を有し得る。例えば、無細胞毒性プロテアーゼのタンパク分解性に不活性な変異体は、His223、Glu224、His227、Glu262、及び/又はTyr366等、活性部位残基の変異を含むBoNT/A L鎖を含み得る。位置番号付けは、配列番号17のアミノ酸位置に対応し、ポリペプチドを配列番号17と整列させることにより決定することができる。
本発明のポリペプチドは、好ましくは、クロストリジウム神経毒(例えば、ボツリヌス神経毒)に関連する1つ以上の活性を有する。換言すれば、本発明のポリペプチドは、活性神経毒であり得る。例えば、本発明のポリペプチドは、標的細胞内の開口放出融合機構のタンパク質を切断し得、標的細胞上の結合部位に結合可能であり得、及び/又はトランスロケーション活性を有し得る。好ましくは、本発明のポリペプチドは、標的細胞において開口放出融合機構のタンパク質を切断し得、標的細胞上の結合部位に結合可能であり得、トランスロケーション活性を有し得る。したがって、好ましくは、ポリペプチドは、解毒処理を受けない(及び受けていない)。例えば、ポリペプチドは、化学的に不活性化及び/又は熱的に不活性化されなくてよい(及びされていなくてよい)。一実施形態において、ポリペプチドは、架橋剤と接触させず(及び接触させておらず)、より好ましくは、ポリペプチドは、ホルムアルデヒドと接触させない(及び接触させていない)。
本明細書に記載のポリペプチドは、好ましくは、標的細胞において開口放出融合機構のタンパク質を切断することが可能な無細胞毒性プロテアーゼを含む。
本発明のポリペプチドの標的部分(TM)は、好ましくは、標的細胞上の結合部位に結合することが可能であり、その結合部位は、エンドサイトーシスを経て、標的細胞内のエンドソームに組み込むことができる。
トランスロケーションドメインは、好ましくは、無細胞毒性プロテアーゼをエンドソーム内から、エンドソーム膜を越えて、標的細胞のサイトゾルにトランスロケートさせることができる。
好適な実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドの無細胞毒性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒L鎖を含む。より好ましくは、クロストリジウム神経毒L鎖は、ボツリヌス神経毒L鎖である。
好適な実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドのトランスロケーションドメインは、クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインを含む。より好ましくは、クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインは、ボツリヌス神経毒トランスロケーションドメインである。
一実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒の機能HCドメインを欠いている。
別の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒結合ドメイン(HCドメイン)TMを含む。より好ましくは、クロストリジウム神経毒結合ドメイン(HCドメイン)TMは、ボツリヌス神経毒結合ドメイン(HCドメイン)TMである。
したがって、好適な実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒L鎖、クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメイン、及び非クロストリジウムTMを含む。
同様に好適な別の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒L鎖及びクロストリジウム神経毒H鎖(クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメイン[HN]及びHCドメインを有する)を含む。このような実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒である。
より好ましくは、本明細書に記載のポリペプチドは、ボツリヌス神経毒L鎖、ボツリヌス神経毒トランスロケーションドメイン、及び非クロストリジウムTMを含む。
同様に好適な代替の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、ボツリヌス神経毒L鎖及びボツリヌス神経毒H鎖(ボツリヌス神経毒トランスロケーションドメイン[HN]及びHCドメインを有する)を含む。このような実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、ボツリヌス神経毒である。
好ましくは、ポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を更に含むボツリヌス神経毒(BoNT)である。BoNTは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、又はBoNT/Xから選択される1つ以上であり得る。無細胞毒性プロテアーゼのタンパク分解性に不活性な変異体を含むその多様体も含まれる。
好ましくは、ポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を更に含むボツリヌス神経毒(BoNT)である。BoNTは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、又はBoNT/Xから選択される1つ以上であり得る。無細胞毒性プロテアーゼのタンパク分解性に不活性な変異体を含むその多様体も含まれる。
又は、ポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を更に含む破傷風神経毒素(TeNT)であり得る。無細胞毒性プロテアーゼのタンパク分解性に不活性な変異体を含むその多様体も含まれる。
又は、ポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を更に含む破傷風神経毒素(TeNT)であり得る。無細胞毒性プロテアーゼのタンパク分解性に不活性な変異体を含むその多様体も含まれる。
BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、及びTeNTの代表的なポリペプチド配列は、本明細書において、それぞれ配列番号17乃至25として記載されている。前記ポリペプチド配列は、本発明で使用するソルターゼアクセプタ又はドナー部位を含むように修飾することができる。
本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号17乃至25の何れかに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドであり得る。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号17乃至25の何れかに対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドであり得る。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号17乃至25の何れかを含む(より好ましくは、これからなる)ポリペプチドを含むポリペプチドであり得る。
本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号17乃至25の何れかに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドであり得る。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号17乃至25の何れかに対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドであり得る。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号17乃至25の何れかを含む(より好ましくは、これからなる)ポリペプチドを含むポリペプチドであり得る。
又は、本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号38に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドであり得る。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号38に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドであり得る。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号38を含む(より好ましくは、これからなる)ポリペプチドを含むポリペプチドであり得る。
又は、本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号38に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドであり得る。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号38に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドであり得る。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ソルターゼアクセプタ及び/又はドナー部位及び/又はそれに結合した検出可能な標識、並びにL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)(より好ましくは、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1))を含むアミノ酸配列を含み、更に配列番号38を含む(より好ましくは、これからなる)ポリペプチドを含むポリペプチドであり得る。
本明細書に記載のポリペプチド(又はそれをコードするヌクレオチド配列)は、Hisタグ又はStrepタグ等の1つ以上のタグ(例えば、精製タグ)を含み得る。本発明は、更に、例えばその使用前にタグが除去されたポリペプチド配列(及びそれをコードするヌクレオチド配列)を包含するものである。ポリペプチドは、タグの除去を容易にするために、TEV切断部位等、1つ以上の切断部位を更に含み得る。
本発明は、多くの異なる種類のクロストリジウム神経毒への適用に適している。したがって、本発明に関連して、「クロストリジウム神経毒」という用語は、C.botulinum(ボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、F、G、H、及びX)、C.tetani(破傷風神経毒)、C.butyricum(ボツリヌス神経毒血清型F)、及びC. baratii(ボツリヌス神経毒血清型F)により産生される毒素と、上記の何れかに由来する修飾クロストリジウム神経毒又は誘導体を含む。「クロストリジウム神経毒」という用語は、ボツリヌス神経毒血清型Hも含む。好ましくは、クロストリジウム神経毒は、BoNT/C1ではない。
ボツリヌス神経毒(BoNT)は、ボツリヌス菌により、多数のアクセサリータンパク質と複合体を形成したBoNT自体からなる大きなタンパク質複合体の形で産生される。現在、ボツリヌス神経毒には9種類のクラス、即ち、ボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、F、G、H、及びXが存在し、全て、同様の構造と作用機序を共有している。異なるBoNT血清型は、特定の中和抗血清による不活性化に基づいて区別可能であり、このような血清型による分類は、アミノ酸レベルでの配列同一性パーセンテージと相関する。特定の血清型のBoNTタンパク質は、アミノ酸の配列同一性パーセンテージに基づいて、異なるサブタイプに更に分類される。
BoNTは、消化管で吸収され、全身循環に入った後、コリン作動性神経終末のシナプス前膜に結合し、神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を防ぐ。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、及びBoNT/Gは、シナプトブレビン/小胞結合膜タンパク質(VAMP)を切断し、BoNT/C1、BoNT/A、及びBoNT/Eは、25kDaのシナプトソーム関連タンパク質(SNAP-25)を切断し、BoNT/C1は、シンタキシンを切断する。BoNT/Xは、SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、Ykt6、及びシンタキシン1を切断することが分かっている。
破傷風毒素は、C.tetaniにより単一の血清型で産生される。C.butyricumは、BoNT/Eを産生し、C.baratiiは、BoNT/Fを産生する。
「クロストリジウム神経毒」という用語は、限定ではないが、以下に記載されるものを含め、修飾クロストリジウム神経毒及びその誘導体も包含するものである。修飾クロストリジウム神経毒又は誘導体は、天然(未修飾)型のクロストリジウム神経毒と比較して修飾された1つ以上のアミノ酸を含み得るか、又は天然(未修飾)型のクロストリジウム神経毒に存在しない1つ以上の挿入アミノ酸を含み得る。一例として、修飾クロストリジウム神経毒は、天然(未修飾)クロストリジウム神経毒配列に対して、1つ以上のドメインに修飾アミノ酸配列を有し得る。このような修飾は、クロストリジウム神経毒の機能的側面、例えば生物学的活性又は持続性を修飾し得る。したがって、一実施形態において、本発明のポリペプチドは、修飾クロストリジウム神経毒、又は修飾クロストリジウム神経毒誘導体、又はクロストリジウム神経毒誘導体である。
修飾クロストリジウム神経毒は、重鎖(修飾HCドメイン等)のアミノ酸配列に1つ以上の修飾を有してよく、前記修飾重鎖は、天然(未修飾)クロストリジウム神経毒より高い又は低い親和性で標的神経細胞に結合する。HCドメインにおけるこうした修飾は、標的神経細胞のガングリオシド受容体及び/又はタンパク質受容体との結合を変化させる、HCドメインのガングリオシド結合部位又はタンパク質(SV2又はシナプトタグミン)結合部位における残基の修飾を含むことができる。こうした修飾クロストリジウム神経毒の例は、共に出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたWO2006/027207及びWO2006/114308に記載されている。
修飾クロストリジウム神経毒は、軽鎖のアミノ酸配列における1つ以上の修飾、例えば修飾L鎖のSNAREタンパク質特異性を変更又は修飾し得る基質結合又は触媒ドメインにおける修飾を有し得る。こうした修飾クロストリジウム神経毒の例は、共に出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたWO2010/120766及びUS2011/0318385に記載されている。
修飾クロストリジウム神経毒は、修飾クロストリジウム神経毒の生物学的活性及び/又は生物学的持続性を増加又は減少させる1つ以上の修飾を含み得る。例えば、修飾クロストリジウム神経毒は、ロイシン又はチロシンに基づくモチーフであって、修飾クロストリジウム神経毒の生物学的活性及び/又は生物学的持続性を増加又は減少させるモチーフを含み得る。適切なロイシンに基づくモチーフには、xDxxxLL(配列番号79)、xExxxLL(配列番号80)、xExxxIL(配列番号81)、及びxExxxLM(配列番号82)(xは任意のアミノ酸)が含まれる。適切なチロシンに基づくモチーフには、Y-x-x-Hy(配列番号83)(Hyは疎水性アミノ酸である)が含まれる。ロイシン及びチロシンに基づくモチーフを含む修飾クロストリジウム神経毒の例は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたWO2002/08268に記載されている。
「クロストリジウム神経毒」という用語は、ハイブリッド及びキメラクロストリジウム神経毒を包含するものである。ハイブリッドクロストリジウム神経毒は、1つのクロストリジウム神経毒又はそのサブタイプ由来の軽鎖の少なくとも一部と、別のクロストリジウム神経毒又はクロストリジウム神経毒サブタイプ由来の重鎖の少なくとも一部とを含む。一実施形態において、ハイブリッドクロストリジウム神経毒は、1つのクロストリジウム神経毒サブタイプ由来の軽鎖の軽鎖全体と、別のクロストリジウム神経毒サブタイプ由来の重鎖とを含み得る。別の実施形態において、キメラクロストリジウム神経毒は、1つのクロストリジウム神経毒サブタイプの重鎖の一部(例えば、結合ドメイン)を、別のクロストリジウム神経毒サブタイプに由来する重鎖の別の部分と共に含み得る。同様に又は代わりに、治療要素は、異なるクロストリジウム神経毒由来の軽鎖部分を含み得る。このようなハイブリッド又はキメラクロストリジウム神経毒は、例えば、特定のクロストリジウム神経毒サブタイプに対して免疫耐性を有する患者、特定のクロストリジウム神経毒重鎖結合ドメインに対する受容体の濃度が平均より低い可能性のある患者、又は膜又は小胞毒素基質(例えば、SNAP-25、VAMP、及びシンタキシン)のプロテアーゼ耐性多様体を有する可能性のある患者に対して、このようなクロストリジウム神経毒の治療効果を送達する手段として有用となる。ハイブリッド及びキメラクロストリジウム神経毒は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたUS8,071,110に記載されている。したがって、一実施形態において、本発明の操作されたクロストリジウム神経毒は、操作されたハイブリッドクロストリジウム神経毒、又は操作されたキメラクロストリジウム神経毒である。
「クロストリジウム神経毒」という用語は、更に、BoNT/Xに最も近い配列同一性を有するエンテロコッカスコード化毒素、W89-W90でVAMP2を切断するBoNT/Woと呼ばれるWeissella oryzaeコード化毒素(NCBI Ref Seq:WP_027699549.1)、VAMP2及びSNAP25を切断するEnterococcus faeciumコード化毒素(GenBank:OTO22244.1)、Chryseobacterium piperoコード化毒素(NCBI Ref.Seq:WP_034687872.1)等、非クロストリジウム微生物により発現される新たに発見されたボツリヌス神経毒タンパク質ファミリメンバを包含するものである。
本発明のポリペプチドの「生物活性」成分は、無細胞毒性プロテアーゼにより提供される。この明確なプロテアーゼグループは、SNAREタンパク質(例えば、SNAP-25、VAMP、シンタキシン)として公知の細胞内輸送タンパク質をタンパク分解性に切断することにより作用する(Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology” (4th edition) John Wiley & Sons, Inc.参照)。頭字語SNAREは、Soluble NSF Attachment Receptorという用語に由来し、NSFは、N-エチルマレイミド感受性因子を意味する。SNAREタンパク質は、細胞内小胞形成に不可欠であり、そのため細胞からの小胞輸送を介した分子の分泌に不可欠となる。したがって、所望の標的細胞に送達されると、無細胞毒性プロテアーゼは、標的細胞からの細胞分泌を阻害することができる。
無細胞毒性プロテアーゼは、細胞を殺さない分子の個別のクラスであり、代わりに、タンパク質合成以外の細胞プロセスを阻害することにより作用する。無細胞毒性プロテアーゼは、様々な植物並びにクロストリジウム属の種及びナイセリア属の種等の様々な微生物により、より大きな毒素分子の一部として生成される。
クロストリジウム神経毒は、無細胞毒性毒素分子の主要なグループを表し、ジスルフィド結合により結合された2本のポリペプチド鎖を含む。この2本の鎖は、分子量が略100kDaの重鎖(H鎖)及び分子量が略50kDaの軽鎖(L鎖)と呼ばれる。L鎖は、プロテアーゼ機能を有し、エキソサイトーシスプロセスに関与する小胞及び/又は原形質膜関連(SNARE)タンパク質(例えば、シナプトブレビン、シンタキシン、又はSNAP-25)に対して高い基質特異性を示す。これらの基質は、神経分泌機構の重要な構成要素である。
N.gonorrhoeae種由来のものが最も重要であるナイセリア属の種、及び/又はS.pneumoniae種由来のものが最も重要であるストレプトコッカス属の種は、機能的に類似した無細胞毒性毒素分子を産生する。このような無細胞毒性プロテアーゼの例は、IgAプロテアーゼである(出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたWO99/58571を参照)。したがって、本発明の無細胞毒性プロテアーゼは、好ましくは、クロストリジウム神経毒プロテアーゼ又はIgAプロテアーゼである。
次に、本発明の標的部分(TM)成分に戻ると、この成分は、本発明のポリペプチドを標的細胞に結合する。
したがって、本発明のTMは、標的細胞上の受容体に結合する。一例として、本発明のTMは、感覚又は運動ニューロン上の受容体等、ニューロン細胞上の受容体に結合し得る。或いは、本発明のTMは、EGF受容体に結合し得る。一実施形態において、標的細胞は、運動又は感覚ニューロン等のニューロン細胞である。別の実施形態において、標的細胞は、EGF受容体を発現する細胞である。しかしながら、当業者は、標的細胞上の前記ペプチドの結合部位(例えば、細胞表面受容体)の存在に基づいて、選択した標的細胞を標的とするためのペプチドTMを選択することができる。
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、以下のペプチドのうち1つ以上を含むTMを含み得る:成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)ペプチド、ソマトスタチンペプチド、コルチスタチンペプチド、グレリンペプチド、ボンベシンペプチド、ウロテンシンペプチド、メラニン濃縮ホルモンペプチド、KISS-1ペプチド、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)ペプチド、又はプロラクチン放出ペプチド。前記TM及びそれを含むポリペプチドは、出典を明記することにより本願明細書の一部としたWO2009/150469に記載されている。
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、以下のペプチドのうち1つ以上を含むTMを含み得る:レプチンペプチド、インスリン様成長因子(IGF)ペプチド、形質転換成長因子(TGF)ペプチド、VIP-グルカゴン-GRF-セクレチンスーパーファミリーペプチド、PACAPペプチド、血管作用性腸ペプチド(VIP)、オレキシンペプチド、インターロイキンペプチド、神経成長因子(NGF)ペプチド、血管内皮成長因子(VEGF)ペプチド、甲状腺ホルモンペプチド、エストロゲンペプチド、ErbBペプチド、表皮成長因子(EGF)ペプチド、EGF及びTGF-αキメラペプチド、アンフィレグリンペプチド、ベータセルリンペプチド、エピゲンペプチド、エピレグリンペプチド、ヘパリン結合EGF(HB-EGF)ペプチド、ボンベシンペプチド、ウロテンシンペプチド、メラニン濃縮ホルモン(MCH)ペプチド、キスペプチン-10ペプチド、キスペプチン-54ペプチド、コルチコトロピン放出ホルモンペプチド、ウロコルチン1ペプチド、又はウロコルチン2ペプチド。前記TM及びそれを含むポリペプチドは、出典を明記することにより本願明細書の一部としたWO2009/150470に記載されている。
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、以下のうちの1つ以上を含むTMを含み得る:甲状腺刺激ホルモン(TSH)、TSH受容体抗体、膵島特異的モノシアロガングリオシドGM2-1に対する抗体、インスリン、インスリン様成長因子、及び両方の受容体に対する抗体、TSH放出ホルモン(プロチレリン)及びその受容体に対する抗体、 FSH/LH放出ホルモン(ゴナドレリン)及びその受容体に対する抗体、コルチコトロピン放出ホルモン(CRH)及びその受容体に対する抗体、並びにACTH及びその受容体に対する抗体。前記TM及びそれを含むポリペプチドは、出典を明記することにより本願明細書の一部としたWO01/21213に記載されている。
本発明のポリペプチドは、3つの主成分として、無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体、TM、及びトランスロケーションドメインを含み得る。このような融合タンパク質の調製に関連する一般的な技術は、再標的化毒素技術と呼ばれることが多い。例として、以下を参照する:WO94/21300、WO96/33273、WO98/07864、WO00/10598、WO01/21213、WO06/059093、WO00/62814、WO00/04926、WO93/15766、WO00/61192、及びWO99/58571。これらの公報は全て、出典を明記することにより本願明細書の一部とする。
より詳細には、本発明のTM成分は、本発明のプロテアーゼ成分又はトランスロケーション成分の何れかに融合され得る。前記融合は、共有結合、例えば、直接共有結合又はスペーサ/リンカ分子を介したものの何れかによるものであることが好ましい。プロテアーゼ成分及びトランスロケーション成分は、好ましくは、共有結合を介して、例えば、直接共有結合又はスペーサ/リンカ分子を介したものの何れかにより共に連結される。適切なスペーサ/連結分子は、当該技術分野において周知であり、一般に5乃至40個、好ましくは10乃至30個のアミノ酸残基の長さのアミノ酸に基づく配列を含む。
使用時、ポリペプチドは、プロテアーゼ成分及びトランスロケーション成分が、好ましくはジスルフィド結合を介して共に連結された二本鎖構造を有する。
したがって、本発明のポリペプチド及び標識ポリペプチドは、一本鎖形態又は二本鎖形態、好ましくは二本鎖形態であり得る。
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の従来の化学的コンジュゲート手法により調製し得る。一例として、Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press、及びWong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press、Nagy et al., PNAS 95 p1794-99 (1998)が挙げられる。合成TMを本発明のポリペプチドに結合させる更に詳細な方法は、例えば、EP0257742に記載される。上述したコンジュゲートの出版物は、出典を明記することにより本願明細書の一部とする。
或いは、ポリペプチドは、単一ポリペプチド融合タンパク質の組換え調製により調製し得る(例えば、WO98/07864参照)。この手法は、天然のクロストリジウム神経毒(即ち、ホロトキシン)が調製される生体内バクテリア機構に基づいており、次の「簡略化された」構造配置を有する融合タンパク質が生じる。
NH2-[プロテアーゼ成分]-[トランスロケーション成分]-[TM]-COOH
WO98/07864によれば、TMは、融合タンパク質のC末端側に配置される。融合タンパク質は、その後、プロテアーゼ成分とトランスロケーション成分との間の部位において切断するプロテアーゼによる処理により活性化される。これにより2本鎖タンパク質が生成され、トランスロケーション成分及びTMを含む他の単一ポリペプチド鎖に(ジスルフィド架橋を介して)共有結合した単一ポリペプチド鎖として、プロテアーゼ成分が含まれる。
或いは、WO06/059093によれば、融合タンパク質のTM成分は、直線状の融合タンパク質配列の中央側で、プロテアーゼ切断部位とトランスロケーション成分との間に位置する。これにより、TMがトランスロケーションドメインに結合された状態(即ち、天然のクロストリジウムホロトキシンにより生じる状態)が確保されるが、この場合、2つの成分は天然のホロトキシンに対して順序が逆になる。その後のプロテアーゼ切断部位での切断により、TMのN末端部分が露出され、2本鎖ポリペプチド融合タンパク質が提供される。
上述したプロテアーゼ切断配列は、部位特異的突然変異誘発等の従来の手段により、DNAにおいて導入し得る(及び/又は任意の本来の切断配列を除去し得る)。切断配列の存在を確認するためのスクリーニングは、手作業で、或いはコンピュータソフトウェア(例えば、DNASTAR、Inc.のMapDrawプログラム)を用いて実行し得る。任意のプロテアーゼ部位を利用してよいが(即ち、クロストリジウム又は非クロストリジウム)、以下が好適となる。
エンテロキナーゼ (DDDDK↓、配列番号84)
第Xa因子 (IEGR↓/IDGR↓、配列番号85及び86)
TEV(タバコエッチ病ウイルス) (ENLYFQ↓G、配列番号87)
トロンビン (LVPR↓GS、配列番号88)
PreScission (LEVLFQ↓GP、配列番号89)。
付加的なプロテアーゼ切断部位には、無細胞毒性プロテアーゼ、例えばクロストリジウム神経毒により切断される認識配列が含まれる。これらには、クロストリジウム神経毒等の無細胞毒性プロテアーゼにより切断されるSNARE(例えば、SNAP-25、シンタキシン、VAMP)タンパク質認識部位が含まれる。特定の例は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたUS2007/0166332に記載されている。
更に、プロテアーゼ切断部位という用語には、自己切断配列であるインテインが含まれる。自己スプライシング反応は、例えば、存在する還元剤の濃度を変化させることで制御可能となる。上述した「活性化」切断部位は、本発明のポリペプチドに導入するべき「破壊的」切断部位(後述)としても利用し得る。
好適な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、N末端及び/又はC末端に位置する1つ以上の精製タグを含み得る。任意の精製タグを利用し得るが、以下が好適となる。
Hisタグ(例えば、6×ヒスチジン)(SEQ ID NO:7)、好ましくはC末端及び/又はN末端タグとして
MBPタグ(マルトース結合タンパク質)、好ましくはN末端タグとして
GSTタグ(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、好ましくはN末端タグとして
His-MBPタグ、好ましくはN末端タグとして
GST-MBPタグ、好ましくはN末端タグとして
チオレドキシンタグ、好ましくはN末端タグとして
CBDタグ(キチン結合ドメイン)、好ましくはN末端タグとして
1つ以上のペプチドスペーサ/リンカ分子が、融合タンパク質に含まれ得る。例えば、ペプチドスペーサは、精製タグと融合タンパク質分子の残りの部分との間において利用し得る。
一態様において、本発明は、ソルターゼを用いて標識するためのポリペプチドを製造する方法を提供し、方法は、以下を含む:
a.以下を含むポリペプチドをコードする核酸配列を提供すること:
i.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体、
ii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)、及び
iii.トランスロケーションドメイン、及び
b.ソルターゼアクセプタ又はドナー部位を前記核酸に導入することにより、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位を含むポリペプチドをコードする修飾核酸を生成すること。
ソルターゼアクセプタ又はドナー部位の導入は、当業者に公知の任意の修飾/方法、例えば、結果として生じるポリペプチド内のアミノ酸残基をコードする配列の置換、挿入又は欠失により、達成することができる。一例として、修飾は、標準的な分子クローニング手法を用いる核酸配列の修飾、例えば、所望のアミノ酸をコードするDNA(オリゴヌクレオチド)の短鎖を使用して、ポリメラーゼ酵素により本来のコード配列を置き換える部位特異的変異誘発により、又は様々な酵素(例えば、リガーゼ及び制限エンドヌクレアーゼ)により遺伝子の一部を挿入/欠失させることにより、導入し得る。或いは、修飾遺伝子配列は、化学的に合成することができる。
好ましくは、方法は、修飾核酸を宿主細胞において発現させることを更に含む。より好ましくは、方法は、宿主細胞において修飾核酸を発現させること、及び発現されたポリペプチドを取得することを更に含む。ポリペプチドは、本明細書に記載の方法を使用して活性化し得る。
本発明は、本発明の方法により得られるポリペプチドにも及ぶ。
「標識ポリペプチドを取得する」又は「発現されたポリペプチドを取得する」の文脈で使用される「取得する」という用語は、ポリペプチドを単離することを意味し得る。単離は、当業者に公知のクロマトグラフィ法又はイムノアフィニティ法等の任意の精製方法により達成することができる。
製造方法で使用するための核酸は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸であり得る。例えば、このような核酸は、配列番号6、8、17乃至25、又は38の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチドをコードし得る。一実施形態において、核酸は、配列番号6、8、17乃至25、又は38の何れか1つに対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードし得る。好ましくは、核酸は、配列番号6、8、17乃至25、又は38の何れか1つを含む(より好ましくは、これからなる)ポリペプチドをコードし得る。
製造方法で使用するための核酸は、配列番号5又は7の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸であり得る。一実施形態において、核酸は、配列番号5又は7の何れか1つに対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸であり得る。好ましくは、核酸は、配列番号5又は7を含み得る(より好ましくは、これからなる)。
したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸(例えば、DNA)配列(例えば、修飾核酸)を提供する。前記核酸は、複製起点、核酸組み込み部位、プロモータ、ターミネータ、及びリボソーム結合部位のうちの1つ以上を任意に含み得るプラスミド等のベクタの形態で含まれ得る。
本発明の核酸(例えば、修飾核酸)は、配列番号1、3、又は39に対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸配列を含み得る。一実施形態において、本発明の核酸は、配列番号1、3、又は39に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有する核酸配列を含み得る。好ましくは、本発明の核酸は、配列番号1、3、又は39として示した核酸配列を含む(より好ましくは、これからなる)。
本発明の核酸(例えば、修飾核酸)は、配列番号2、4、又は40に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするものであり得る。一実施形態において、本発明の核酸は、配列番号2、4、又は40に対して少なくとも80%又は90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするものであり得る。好ましくは、本発明の核酸は、配列番号2、4、又は40を含む(より好ましくは、これからなる)ポリペプチドをコードするものであり得る。
本発明は、更に、本発明の核酸又はベクタを含む宿主細胞を包含する。
本発明は、更に、宿主細胞において、特に大腸菌において、又はバキュロウイルス発現系を介して、上述した核酸配列を発現させる方法を含む。
本発明は、更に、本発明のポリペプチドを活性化する方法を含み、前記方法は、無細胞毒性プロテアーゼ成分とトランスロケーション成分との間に位置する認識部位(FXa部位等の切断部位)でポリペプチドを切断プロテアーゼ(例えば、FXa)と接触させ、これにより、ポリペプチドを、無細胞毒性プロテアーゼ及びトランスロケーション成分がジスルフィド結合により結合されている二本鎖ポリペプチドに変換することを含む。好適な実施形態において、認識部位は、天然に存在するクロストリジウム神経毒及び/又は天然に存在するIgAプロテアーゼに生じるものではない。
本発明のポリペプチドは、非標的領域への分散に関連する望ましくない副作用を低減又は防止するために更に修飾し得る。この実施形態によれば、ポリペプチドは、破壊的切断部位を含む。破壊的切断部位は、「活性化」部位(即ち、二本鎖形成)とは異なり、無細胞毒性プロテアーゼではなく、第2のプロテアーゼにより切断可能となる。更に、第2のプロテアーゼにより、このように破壊的切断部位で切断されると、ポリペプチドは効力が低下する(例えば、目的の標的細胞との結合能力の低下、トランスロケーション活性の低下、及び/又は無細胞毒性プロテアーゼ活性の低下)。完全を期すために、本発明の「破壊的」切断部位の何れかは、本発明のポリペプチド内の「活性化」部位として別個に利用し得る。
したがって、この実施形態によれば、本発明は、オフサイト位置で制御可能に不活性化及び/又は破壊することが可能なポリペプチドを提供する。
好適な実施形態において、破壊的切断部位は、循環プロテアーゼ(例えば、血清プロテアーゼ又は血液凝固カスケードのプロテアーゼ等の細胞外プロテアーゼ)、組織関連プロテアーゼ(例えば、筋肉のMMP等のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP))、及び細胞内プロテアーゼ(好ましくは、標的細胞に存在しないプロテアーゼ)から選択される第2のプロテアーゼ(即ち、破壊的プロテアーゼ)により認識及び切断される。
したがって、使用時、本発明のポリペプチドが、その目的の標的細胞から分散して離れ、及び/又は非標的細胞により取り込まれた場合、ポリペプチドは、(第2のプロテアーゼによる)破壊的切断部位の切断により不活性化される。
一実施形態において、破壊的切断部位は、オフサイト細胞型内に存在する第2のプロテアーゼにより認識及び切断される。この実施形態において、オフサイト細胞及び標的細胞は、好ましくは異なる細胞型である。代わりに(又は追加として)、破壊的切断部位は、オフサイトの位置(例えば、標的細胞の遠位)に存在する第2のプロテアーゼにより認識及び切断される。したがって、破壊的切断が細胞外で起こる場合、標的細胞及びオフサイト細胞は、同じ細胞型でも異なる細胞型でもよい。これに関して、標的細胞及びオフサイト細胞は、それぞれ、本発明の同じポリペプチドが結合する受容体を有し得る。
本発明の破壊的切断部位は、ポリペプチドがオフサイト位置にある場合、ポリペプチドの不活性化/破壊をもたらす。これに関して、破壊的切断部位での切断は、(同じ破壊的切断部位を欠く、又は同じ破壊的部位を有するが切断されていない形態の同一のポリペプチドと比較して)ポリペプチドの効力を最小限に抑える。一例として、効力の低下には、(哺乳動物細胞受容体への)結合の低下、及び/又は(哺乳動物細胞のエンドソーム膜をサイトゾルの方向で越える)トランスロケーションの低下、及び/又はSNAREタンパク質切断の低下が含まれる。
本発明に関連して破壊的切断部位を選択する場合、破壊的切断部位は、製造プロセスの一部として、本発明のポリペプチドの翻訳後修飾のために別個に使用され得る任意のプロテアーゼの基質ではないことが好ましい。これに関して、本発明の無細胞毒性プロテアーゼは、一般に、(本発明の破壊的切断部位とは構造的に異なる別個の「活性化」プロテアーゼ切断部位を介して)プロテアーゼ活性化イベントを利用する。活性化切断部位の目的は、無細胞毒性プロテアーゼと本発明のポリペプチドのトランスロケーション又は結合成分との間のペプチド結合を切断し、これにより、前記2つの成分がジスルフィド結合を介して連結された「活性化」二本鎖ポリペプチドを提供することである。
したがって、本発明のポリペプチドの破壊的切断部位が「活性化」切断部位及びその後のジスルフィド結合形成に悪影響を及ぼさない状態を確保するのを助けるために、前者は、好ましくは、「活性化」切断部位から、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、より好ましくは少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80の(連続する)アミノ酸残基だけ離れた位置で、本発明のポリペプチドに導入される。
破壊的切断部位及び活性化切断部位は、好ましくは、ポリペプチドの天然成分に関して外因性である(即ち、操作されている/人工的である)。換言すれば、前記切断部位は、好ましくは、ポリペプチドの対応する天然成分本来のものではない。一例として、BoNT/A L鎖又はH鎖(それぞれ)に基づくプロテアーゼ又はトランスロケーション成分は、切断部位を含むように本発明により操作し得る。しかしながら、前記切断部位は、対応するBoNT天然L鎖又はH鎖には存在しない。同様に、ポリペプチドの標的部分成分がプロテアーゼ切断部位を含むように操作される場合、前記切断部位は、対応する標的部分の対応する天然配列には存在しない。
本発明の好適な実施形態において、破壊的切断部位及び「活性化」切断部位は、同じプロテアーゼにより切断されない。一実施形態において、2種類の切断部位は、それぞれの認識配列内の少なくとも1つ、より好ましくは少なくとも2つ、特に好ましくは少なくとも3つ、最も好ましくは少なくとも4つの許容アミノ酸が異なるという点で互いに異なる。
一例として、クロストリジウムL鎖とHN成分との間に第Xa因子「活性化」部位を含むポリペプチドキメラの場合、L鎖及び/又はHN及び/又はTM成分内で他の場所に挿入し得る、第Xa因子部位以外の部位である破壊的切断部位を利用することが好ましい。このシナリオでは、ポリペプチドは、L鎖とHN成分との間の代替「活性化」部位(例えば、エンテロキナーゼ切断部位)に対応するように修飾してよく、その場合、別個の第Xa因子切断部位は、破壊的切断部位としてポリペプチド内に他の場所で組み込み得る。或いは、L鎖とHN成分との間の既存の第Xa因子「活性化」部位を保持し、破壊的切断部位としてトロンビン切断部位等の代替切断部位を組み込み得る。
切断部位を含めるために、本発明の構成要素の何れかの一次配列内で適切な部位を特定する際には、挿入すべき提案された切断部位と厳密に一致する一次配列を選択することが好ましい。これにより、ポリペプチドに導入される構造変化が最小限となる。一例として、切断部位は、一般に、少なくとも3個の連続するアミノ酸残基を含む。したがって、好適な実施形態において、新しい切断部位を導入するために必要なアミノ酸残基の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つを(正しい位置に)既に保有している切断部位が選択される。一例として、一実施形態において、カスパーゼ3切断部位(DMQD)を導入し得る。これに関して、例えば、Dxxx、xMxx、xxQx、xxxD、DMxx、DxQx、DxxD、xMQx、xMxD、xxQD、DMQx、xMQD、DxQD、及びDMxDから選択される一次配列を既に含む好適な挿入位置が特定される。
同様に、表面露出領域に切断部位を導入することが好ましい。表面露出領域内では、既存のループ領域が好ましい。
本発明の好適な実施形態において、破壊的切断部位は、BoNT/Aの一次アミノ酸配列に基づく以下の位置の1つ以上に導入される。挿入位置は、(便宜上)BoNT/Aを参照して特定されるが、代替のプロテアーゼドメイン及び/又はトランスロケーションドメインの一次アミノ酸配列は、前記BoNT/A位置と容易に整列させ得る。
プロテアーゼ成分には、以下の位置のうち1つ以上が好ましい:27-31、56-63、73-75、78-81、99-105、120-124、137-144、161-165、169-173、187-194、202-214、237-241、243-250、300-304、323-335、375-382、391-400、及び413-423。上記の番号付けは、好ましくは、本発明のプロテアーゼ成分のN末端から開始される。
好適な実施形態において、破壊的切断部位は、プロテアーゼ成分のN末端から8アミノ酸残基を超える、好ましくは10アミノ酸残基を超える、より好ましくは25アミノ酸残基を超える、特に好ましくは50アミノ酸残基を超える位置に置かれる。同様に、好適な実施形態において、破壊的切断部位は、プロテアーゼ成分のC末端から20アミノ酸残基を超える、好ましくは30アミノ酸残基を超える、より好ましくは40アミノ酸残基を超える、特に好ましくは50アミノ酸残基を超える位置に置かれる。
トランスロケーション成分には、以下の位置のうち1つ以上が好ましい:474-479、483-495、507-543、557-567、576-580、618-631、643-650、669-677、751-767、823-834、845-859。上記の番号付けは、好ましくは、本発明のトランスロケーションドメイン成分のN末端に対して449の開始位置、及びトランスロケーションドメイン成分のC末端に対して871の終了位置を認める。
好適な実施形態において、破壊的切断部位は、トランスロケーション成分のN末端から10アミノ酸残基を超える、好ましくは25アミノ酸残基を超える、より好ましくは40アミノ酸残基を超える、特に好ましくは50アミノ酸残基を超える位置に置かれる。同様に、好適な実施形態において、破壊的切断部位は、トランスロケーション成分のC末端から10アミノ酸残基を超える、好ましくは25アミノ酸残基を超える、より好ましくは40アミノ酸残基を超える、特に好ましくは50アミノ酸残基を超える位置に置かれる。
好適な実施形態において、破壊的切断部位は、TM成分のN末端から10アミノ酸残基を超える、好ましくは25アミノ酸残基を超える、より好ましくは40アミノ酸残基を超える、特に好ましくは50アミノ酸残基を超える位置に置かれる。同様に、好適な実施形態において、破壊的切断部位は、TM成分のC末端から10アミノ酸残基を超える、好ましくは25アミノ酸残基を超える、より好ましくは40アミノ酸残基を超える、特に好ましくは50アミノ酸残基を超える位置に置かれる。
本発明のポリペプチドは、1つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ以上)の破壊的プロテアーゼ切断部位を含み得る。2つ以上の破壊的切断部位が含まれる場合、各切断部位は、同じであっても異なっていてもよい。これに関して、2つ以上の破壊的切断部位を使用すると、オフサイトの不活性化が改善される。同様に、2つ以上の異なる破壊的切断部位を使用すると、設計の柔軟性が追加される。
破壊的切断部位は、ポリペプチドの以下の成分の何れかにおいて操作し得る:無細胞毒性プロテアーゼ成分、トランスロケーション成分、標的部分、又はスペーサペプチド(存在する場合)。これに関して、破壊的切断部位は、ポリペプチドの効力に対する悪影響が確実に最小限となる(例えば、標的化/結合領域及び/又はトランスロケーションドメイン、及び/又は無細胞毒性プロテアーゼドメインに対する影響が最小となる)一方で、ポリペプチドがその標的部位/標的細胞から離れて不安定となる状態を確保するように選択される。
好適な破壊的切断部位(及び対応する第2のプロテアーゼ)を下の表に列挙する。記載の切断部位は、純粋に例示的なものであり、本発明に限定することを意図したものではない。
Figure 2022517406000002
Figure 2022517406000003
マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)は、本発明に関連して、破壊的プロテアーゼの好適なグループである。このグループ内では、ADAM17(EC 3.4.24.86、TACEとしても知られている)が好ましく、様々な膜アンカー型細胞表面タンパク質を切断して細胞外ドメインを「脱落」させる。追加の好適なMMPには、アダマリシン、セラリシン、及びアスタシンが含まれる。
好適な破壊的プロテアーゼの別のグループは、トロンビン、凝固因子VIIa、凝固因子IXa、凝固因子Xa、凝固因子XIa、凝固因子XIIa、カリクレイン、プロテインC、及びMBP関連セリンプロテアーゼ等の哺乳動物の血中プロテアーゼである。
本発明の一実施形態において、前記破壊的切断部位は、少なくとも3又は4、好ましくは5又は6、より好ましくは6又は7、特に好ましくは少なくとも8つの連続するアミノ酸残基を有する認識配列を含む。これに関して、(連続するアミノ酸残基に関して)認識配列が長いほど、意図しない第2のプロテアーゼを介して破壊部位の非特異的切断が起こる可能性は低くなる。
本発明の破壊的切断部位は、プロテアーゼ成分及び/又は標的部分及び/又はトランスロケーション成分及び/又はスペーサペプチドに導入されることが好ましい。これらの4つの成分のうち、プロテアーゼ成分が好ましい。したがって、ポリペプチドは、無細胞毒性プロテアーゼ及び/又は結合及び/又はトランスロケーション成分の直接破壊により急速に不活性化され得る。
本発明のポリペプチドは、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、アジュバント、噴射剤、及び/又は塩から選択される少なくとも1つの成分と共に、ポリペプチドを含む医薬組成物の一部として処方し得る。
本発明のポリペプチドは、経口、非経口、持続注入、インプラント、吸入、又は局所投与用に処方され得る。注射に適した組成物は、溶液、懸濁液、又は乳液、或いは使用前に適切な溶媒に溶解又は懸濁させる乾燥粉末の形態にし得る。
局所送達手段は、エアロゾル又は他の噴霧器(例えば、ネブライザ)を含み得る。これに関して、ポリペプチドのエアロゾル処方により、肺及び/又は他の鼻及び/又は気管支又は気道の通路への送達が可能となる。
好適な投与経路は、全身(例えば、静脈内)、腹腔鏡、及び/又は局所注射(例えば、腫瘍への直接の経蝶形骨洞注射)から選択される。
注射用製剤の場合、投与部位でのポリペプチドの保持を助けるため、又は投与部位からのポリペプチドの除去を減らすために、医薬活性物質を任意に含める。このような医薬活性物質の一例は、アドレナリン等の血管収縮剤である。このような製剤は、投与後のポリペプチドの滞留時間を増加させ、したがって、その効果を増加及び/又は増強させるという利点をもたらす。
本発明のポリペプチドを投与するための投与量範囲は、所望の治療効果を生み出すものとなる。必要な投与量範囲は、ポリペプチド又は組成物の正確な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度、又は重症度、存在する場合は禁忌、及び主治医の判断に依存することは理解されよう。これらの投与量レベルの変動は、最適化のための標準的な経験的ルーチンを使用して調整することができる。
適切な1日投与量(患者の体重1kg当たり)は、0.0001乃至1mg/kg、好ましくは0.0001乃至0.5mg/kg、より好ましくは0.002乃至0.5mg/kg、特に好ましくは0.004乃至0.5mg/kgの範囲である。単位投与量は、1マイクログラム未満乃至30mgで変化する可能性があるが、一般的には、投与当たり0.01乃至1mgの範囲であり、これを毎日、又は好ましくは、毎週若しくは6ヶ月に一回等、より少ない頻度で、投与し得る。
特に好適な投与計画は、1X用量として2.5ngのポリペプチドに基づくものとなる。これに関して、好適な投与量は、1X乃至100X(即ち、2.5乃至250ng)の範囲となる。
流体投与形態は、一般に、ポリペプチドとパイロジェンフリー無菌溶媒とを使用して調製される。ポリペプチドは、溶媒と、用いる濃度とに応じて、溶媒に溶解又は懸濁させることができる。溶液の調製では、ポリペプチドを溶媒に溶解することが可能であり、溶液は、必要な場合には、塩化ナトリウムを加えて等張にし、無菌操作により細菌濾過器を介して濾過し滅菌した後、適切な滅菌バイアル又はアンプルに充填して密封する。或いは、溶液の安定性が十分である場合、密封容器内の溶液をオートクレーブにより滅菌し得る。緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤又は殺菌剤、懸濁化剤又は乳化剤、及び/又は局部麻酔剤等の添加剤を、溶媒に溶解し得るという利点を有する。
使用前に適切な溶媒に溶解又は懸濁させる乾燥粉末は、事前に滅菌した材料を、無菌区域内で無菌操作により滅菌容器に充填することで調製し得る。或いは、材料は、無菌区域内で無菌操作により適切な容器内へ溶解させてもよい。その後、製品を凍結乾燥させ、容器を無菌状態で密封する。
筋肉内、皮下、又は皮内注射に適した非経口懸濁液は、実質的に同一の方法で調製されるが、但し、滅菌成分は、溶解させる代わりに滅菌溶媒中に懸濁させ、滅菌は、濾過により行うことはできない。成分は、無菌状態で単離してよく、或いは、単離後に、例えばガンマ線照射により滅菌してもよい。
懸濁剤、例えばポリビニルピロリドンを組成物(群)に含め、成分の均一な分布を促進することが有利となる。
標的部分(TM)とは、結合部位と機能的に相互作用して、本発明のポリペプチドと標的細胞(一般には哺乳動物細胞、特にヒト細胞)の表面との間に物理的関連を引き起こす任意の化学構造を意味する。TMという用語は、標的細胞上の結合部位に結合することが可能な任意の分子(即ち、天然に存在する分子、又はその化学的/物理的に修飾された多様体)を包含し、その結合部位は、好ましくは、インターナリゼーション(例えば、エンドソーム形成)が可能であり、これは受容体媒介エンドサイトーシスとも呼ばれる。TMは、エンドソーム膜トランスロケーション機能を有する場合があり、この場合、別個のTM及びトランスロケーションドメイン成分が、本発明の薬剤中に存在する必要はない。前述の説明全体を通して、特異的TMが説明されている。前記TMへの言及は、単なる例示であり、本発明は、標的細胞上の、好ましくはインターナリゼーションが可能な結合部位への基本的な結合(即ち、標的化)能力を有する、その全ての多様体及び誘導体を包含する。
本発明のTMは、当該の標的細胞に結合する(好ましくは特異的に結合する)。「特異的に結合する」という用語は、好ましくは、所定のTMが、106M-1以上、好ましくは107M-1以上、又は108M-1以上、又は109M-1以上の結合親和性(Ka)で標的細胞に結合することを意味する。本発明のTM(遊離形態である場合、即ち、任意のプロテアーゼ及び/又はトランスロケーション成分から分離されている場合)は、好ましくは、0.05乃至18nMの領域で当該の標的受容体に対する結合親和性(IC50)を示す。
本発明のTMは、好ましくは、コムギ胚芽凝集素(WGA)ではない。
本明細書におけるTMへの言及は、当該の標的細胞に結合する能力を保持する、そのフラグメント及び多様体を包含する。一例として、多様体は、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも97%、又は少なくとも99%のアミノ酸配列相同性を基準TMに対して有し得、後者は、本出願に記載されている任意のTM配列となる。したがって、多様体は、アミノ酸の1つ以上の類似体(例えば、非天然アミノ酸)、又は置換された連結を含み得る。また、一例として、フラグメントという用語は、TMに関して使用される場合、基準TMの少なくとも5個、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも20個、最も好ましくは少なくとも25個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。フラグメントという用語は、上述した変異体にも関連している。したがって、一例として、本発明のフラグメントは、少なくとも7、10、14、17、20、25、28、29、又は30個のアミノ酸を有するペプチド配列を含み得、ペプチド配列は、基準ペプチドの(連続する)アミノ酸の対応するペプチド配列に対して少なくとも80%の配列相同性を有する。
TMは、TMが標的細胞に結合することができる限り、より長いアミノ酸配列、例えば、少なくとも30又は35個のアミノ酸残基、又は少なくとも40又は45個のアミノ酸残基を含み得る。
TMが選択した標的細胞に結合することを確認するのは日常的な作業である。例えば、標的細胞を代表する組織又は細胞が、過剰な非標識TMの存在下で標識(例えば、トリチウム化)TMに曝露される単純な放射性変位実験を使用し得る。このような実験では、非特異的及び特異的結合の相対的な割合を評価し得、これにより、TMが標的細胞に結合することの確認が可能となる。任意に、アッセイは、1つ以上の結合アンタゴニストを含んでよく、アッセイは、TM結合の喪失を観察することを更に含み得る。この種の実験の例は、Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311, In Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Pressにおいて見ることができる。
一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒の機能HCドメインが欠如している。したがって、前記ポリペプチドは、Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82に記載されているように、結合アッセイにおいて(クロストリジウムHC成分を介して)ラットシナプトソーム膜に結合することができない。好適な実施形態において、ポリペプチドは、好ましくは、クロストリジウム神経毒ホロトキシンの最後の50個のC末端アミノ酸が欠如している。別の実施形態において、ポリペプチドは、好ましくは、クロストリジウム神経毒ホロトキシンの最後の100、好ましくは最後の150、より好ましくは最後の200、特に好ましくは最後の250、最も好ましくは最後の300個のC末端アミノ酸残基が欠如している。或いは、突然変異誘発によりHC結合活性を無効化又は低減してよく、一例として、便宜上BoNT/Aを参照すると、ガングリオシド結合ポケットにおける1個又は2個のアミノ酸残基突然変異(W1266がL及びY1267がF)の修飾により、HC領域は、その受容体結合機能を失う。類似の突然変異は、非血清型Aクロストリジウムペプチド成分、例えば、突然変異を有するボツリヌスB(W1262がL及びY1263がF)又はボツリヌスE(W1224がL及びY1225がF)に基づく構築物に対して行われてもよい。活性部位に対する他の突然変異により、例えば、A型ボツリヌス毒素におけるY1267S及び他のクロストリジウム神経毒における対応する保存性の高い残基等で、Hc受容体結合活性が同様に除去される。この突然変異及び他の突然変異の詳細は、出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部としたRummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51:631-634)に記載されている。
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒の機能HCドメインが欠如しており、機能的に同等のTMも欠如している。したがって、前記ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒の天然の結合機能を欠いており、Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82に記載されているように、結合アッセイにおいて(クロストリジウムHC成分を介して、又は任意の機能的に同等のTMを介して)ラットシナプトソーム膜に結合することができない。
天然クロストリジウム神経毒のHCペプチドは、略400乃至440個のアミノ酸残基を含み、それぞれ略25kDaの2つの機能的に別個のドメイン、即ち、N末端領域(一般にHCNペプチド又はドメインと呼ばれる)及びC末端領域(一般にHCCペプチド又はドメインと呼ばれる)から成る。この事実は、それぞれ出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とした以下の出版物により確認されている:Umland TC (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792; Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204、Halpern J (1993) J. Biol. Chem. 268: 15, pp. 11188-11192、Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364; Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898-902、Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25: 90、Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 1751-1759; and Rummel A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643。更に、C末端領域(HCC)は、C末端の160乃至200個のアミノ酸残基により構成され、クロストリジウム神経毒の、その自然細胞受容体、即ち、神経筋接合部の神経終末に対する結合に関与することが十分に立証されており、この事実も上記の出版物でも確認されている。したがって、本明細書の全体を通して、天然のクロストリジウム神経毒が結合する細胞表面受容体に対して重鎖が結合できないように機能的重鎖HCペプチド(又はドメイン)が欠如したクロストリジウム重鎖への言及は、単にクロストリジウム重鎖に機能的HCCペプチドが欠如していることを意味する。換言すれば、HCCペプチド領域は、一部又は全体が除去、又は他の形で(例えば、従来の化学処理又はタンパク質分解処理により)修飾され、神経筋接合部の神経終末に対するその天然の結合能力が不活性化されている。
したがって、一実施形態において、本発明のクロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒のC末端ペプチド部分(HCC)が欠如しており、したがって、天然のクロストリジウム神経毒のHC結合機能が欠如している。一例として、一実施形態において、C末端伸長クロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒重鎖のC末端の40個のアミノ酸残基、又はC末端の60個のアミノ酸残基、又はC末端の80個のアミノ酸残基、又はC末端の100個のアミノ酸残基、又はC末端の120個のアミノ酸残基、又はC末端の140個のアミノ酸残基、又はC末端の150個のアミノ酸残基、又はC末端の160個のアミノ酸残基が欠如している。他の実施形態において、本発明のクロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒のC末端ペプチド部分(HCC)全体が欠如しているため、天然クロストリジウム神経毒のHC結合機能が欠如している。一例として、一実施形態において、クロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒重鎖のC末端の165個のアミノ酸残基、又はC末端の170個のアミノ酸残基、又はC末端の175個のアミノ酸残基、又はC末端の180個のアミノ酸残基、又はC末端の185個のアミノ酸残基、又はC末端の190個のアミノ酸残基、又はC末端の195個のアミノ酸残基が欠如している。他の例として、本発明のクロストリジウムHNペプチドには、以下から成る群から選択されたクロストリジウムHCC基準配列が欠如している
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(Y1111-L1296)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(Y1098-E1291)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(Y1112-E1291)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(Y1099-E1276)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(Y1086-K1252)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(Y1106-E1274)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(Y1106-E1297)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(Y1128-D1315)。
上記の基準配列は、目安と考えるべきであり、下位血清型により僅かな変動が生じ得る。
本発明のプロテアーゼは、真核細胞内のエキソサイトーシス融合器官の1つ以上のタンパク質を切断可能な全ての無細胞毒性プロテアーゼを包含する。
本発明のプロテアーゼは、好ましくは細菌プロテアーゼ(又はそのフラグメント)である。より好ましくは、細菌プロテアーゼは、クロストリジウム又はナイセリア/ストレプトコッカス属から選択される(例えば、クロストリジウムL鎖、又は好ましくはN.gonorrhoeae又はS.pneumoniae由来のナイセリアIgAプロテアーゼ)。
本発明は、更に、多様体無細胞毒性プロテアーゼ(即ち、天然に存在するプロテアーゼ分子の多様体)を、その多様体プロテアーゼが必要なプロテアーゼ活性を依然として示す限りは含む。一例として、多様体は、基準プロテアーゼ配列との少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95、又は少なくとも98%のアミノ酸配列相同性を有し得る。したがって、多様体という用語は、エンドペプチダーゼ活性が増進(又は減少)した無細胞毒性プロテアーゼを含み、これについては、特に、BoNT/A変異体Q161A、E54A、及びK165LのKcat/Kmの増加が挙げられ、出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部としたAhmed, S.A. (2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8を参照されたい。フラグメントという用語は、プロテアーゼに関して用いる場合、一般には、基準プロテアーゼの少なくとも150個、好ましくは少なくとも200個、より好ましくは少なくとも250個、最も好ましくは少なくとも300個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。TM「フラグメント」成分(上述)と同様に、本発明のプロテアーゼ「フラグメント」は、基準配列に基づく多様体プロテアーゼのフラグメントを包含する。
本発明のプロテアーゼは、好ましくはセリン又はメタロプロテアーゼ活性(例えば、エンドペプチダーゼ活性)を示す。プロテアーゼは、好ましくはSNAREタンパク質(例えば、SNAP-25、シナプトブレビン/VAMP、又はシンタキシン)に対して特異的である。
特に、神経毒のプロテアーゼドメイン、例えば、細菌神経毒のプロテアーゼドメインが挙げられる。したがって、本発明には、天然に存在する神経毒ドメインと、前記天然に存在する神経毒を組換えにより調製したものとの使用が含まれる。
神経毒の例は、クロストリジウムにより生成されるものであり、クロストリジウム神経毒という用語は、C.tetani(TeNT)、及びC.botulinum(BoNT) 血清型A-Gにより生産される神経毒と、C.baratii及びC.butyricumにより生産される近縁のBoNT様神経毒とを包含する。上述した略語は、本明細書全体を通して使用する。例えば、BoNT/Aという命名法は、神経毒の供給源をBoNT(血清型A)として示す。対応する命名法は、他のBoNT血清型にも当てはまる。
BoNTは、知られている最も強力な毒素であり、マウスに対する半数致死量(LD50)の値は、血清型に応じて0.5乃至5ng/kgの範囲となる。BoNTは、胃腸管に吸収され、全身循環に入った後、コリン作動性神経終末のシナプス前膜に結合し、その神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を妨げる。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、及びBoNT/Gは、シナプトブレビン/小胞関連膜タンパク質(VAMP)を切断し、BoNT/C、BoNT/A、及びBoNT/Eは、25kDaのシナプトソーム関連タンパク質(SNAP-25)を切断し、BoNT/Cは、シンタキシンを切断する。
BoNTは、約150kDaの2本鎖タンパク質である共通の構造を有し、約50kDaの軽鎖(L鎖)と単一ジスルフィド結合により共有結合した約100kDaの重鎖(H鎖)からなる。H鎖は、それぞれ約50kDaの2つのドメインからなる。C末端ドメイン(HC)は、高親和性ニューロン結合に必要であり、N末端ドメイン(HN)は、膜トランスロケーションに関与することが示唆されている。L鎖は、基質SNAREタンパク質の切断に関与する亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。
L鎖フラグメントという用語は、神経毒のL鎖の成分を意味し、このフラグメントは、メタロプロテアーゼ活性を示し、細胞のエキソサイトーシスに関与する小胞及び/又は形質膜関連タンパク質をタンパク分解性に切断することが可能である。
適切なプロテアーゼ(基準)配列の例は以下を含む:
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(1-448)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(1-440)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(1-441)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(1-445)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(1-422)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(1-439)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(1-441)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(1-457)
IgAプロテアーゼ-アミノ酸残基(1-959)*
* 出典を明記することにより本願明細書の一部とするPohlner, J. et al. (1987). Nature 325, pp. 458-462。
最近同定されたBoNT/Xでは、L鎖は、そのアミノ酸1乃至439に対応すると報告されており、L鎖の境界は、略25個のアミノ酸だけ異なる可能性がある(例えば、1乃至414又は1乃至464)。
上記の基準配列は、目安と考えるべきであり、下位血清型により僅かな変動が生じ得る。一例として、US2007/0166332(出典を明記することにより本願明細書の一部とする)では、僅かに異なるクロストリジウム配列を引用している。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(M1-K448)
ボツリヌスB型神経-毒アミノ酸残基(M1-K441)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(M1-K449)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(M1-R445)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(M1-R422)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(M1-K439)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(M1-K446)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(M1-A457)
軽鎖を含む様々なクロストリジウム毒素フラグメントは、これらの軽鎖フラグメントが神経伝達物質放出器官のコア成分を特異的に標的にすることが可能であり、これによりクロストリジウム毒素が基質をタンパク分解性に切断する全体的な細胞機構の達成に関与できる場合、本発明の態様において有用となり得る。クロストリジウム毒素の軽鎖は、略420乃至460アミノ酸長を有し、酵素ドメインを含む。研究により、酵素ドメインの酵素活性には、クロストリジウム毒素軽鎖の全長を必要としないことが分かっている。非限定的な例として、BoNT/A軽鎖の最初の8個のアミノ酸は、酵素活性に必要ではない。他の非限定的な例として、TeNT軽鎖の最初の8個のアミノ酸は、酵素活性に必要ではない。同様に、軽鎖のカルボキシル末端は、活性に必要ではない。非限定的な例として、BoNT/A軽鎖の最後の32個のアミノ酸(残基417乃至448)は、酵素活性に必要ではない。他の非限定的な例として、TeNT軽鎖の最後の31個のアミノ酸(残基427乃至457)は、酵素活性に必要ではない。したがって、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも350個のアミノ酸、少なくとも375個のアミノ酸、少なくとも400個のアミノ酸、少なくとも425個のアミノ酸、及び少なくとも450個のアミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含むことができる。この実施形態の他の態様は、例えば多くとも350個のアミノ酸、多くとも375個のアミノ酸、多くとも400個のアミノ酸、多くとも425個のアミノ酸、及び多くとも450個のアミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含むことができる。
本発明の無細胞毒性プロテアーゼ成分は、好ましくは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、又はBoNT/X血清型L鎖(又はそのフラグメント若しくは多様体)。
本発明のポリペプチド、特にそのプロテアーゼ成分は、PEG化してよく、これは、安定性、例えば、プロテアーゼ成分の作用の持続期間の増加に役立ち得る。PEG化は、プロテアーゼがBoNT/A、B、又はC1プロテアーゼを含む場合、特に好ましい。一例として、プロテアーゼのN末端は、同一又は異なるものにしてよい1個以上のアミノ酸(例えば、システイン)残基により伸長し得る。1つ以上の前記アミノ酸残基は、それ自体に結合された(例えば、共有結合された)PEG分子を有し得る。この手法の例は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたWO2007/104567に記載されている。
トランスロケーションドメインは、プロテアーゼ活性の機能発現が標的細胞のサイトゾル内で生じるように、プロテアーゼの標的細胞内へのトランスロケーションを可能にする分子である。任意の分子(例えば、タンパク質又はペプチド)が本発明の必要なトランスロケーション機能を有するかは、従来の多数のアッセイの何れか1つにより確認し得る。
例えば、Shone C. (1987)は、試験分子により負荷を与えたリポソームを利用するインビトロアッセイを説明している。必要なトランスロケーション機能の存在は、容易に観測し得るK+及び/又は標識NADのリポソームからの放出により確認される[Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180参照]。
他の例は、Blaustein R. (1987) により、平面リン脂質二分子膜を利用する単純なインビトロアッセイが記載されている。試験分子により膜に負荷を与え、前記膜を介したコンダクタンスの増加により必要なトランスロケーション機能を確認する[Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115-120を参照]。
膜融合の評価を可能にし、これにより本発明での使用に適したトランスロケーションドメインの同定を可能にする他の方法は、Methods in Enzymology Vol 220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993に記載されている。
本発明は、更に、好ましくは、必要なトランスロケーション活性を多様体トランスロケーションドメインが依然として示す限り、その多様体トランスロケーションドメインを含む。一例として、多様体は、基準トランスロケーションドメインに対して、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、又は少なくとも98%のアミノ酸配列相同性を有し得る。フラグメントという用語は、トランスロケーションドメインに関して用いる場合、基準トランスロケーションドメインの少なくとも20個、好ましくは少なくとも40個、より好ましくは少なくとも80個、最も好ましくは少なくとも100個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。クロストリジウムトランスロケーションドメインの場合、フラグメントは、好ましくは、基準トランスロケーションドメイン(例えば、HNドメイン)の少なくとも100個、好ましくは少なくとも150個、より好ましくは少なくとも200個、最も好ましくは少なくとも250個のアミノ酸残基を有する。TM「フラグメント」成分(上述)と同様に、本発明のトランスロケーション「フラグメント」は、基準配列に基づく多様体トランスロケーションドメインのフラグメントを包含する。
トランスロケーションドメインは、好ましくは、低pHの条件下で脂質膜にイオン透過性の孔を形成することができる。こうしたエンドソーム膜内での孔形成可能なタンパク質分子の部分のみを用いることが好ましいことが分かっている。
トランスロケーションドメインは、微生物タンパク質源、特に細菌又はウイルスタンパク質源から取得し得る。そのため、一実施形態において、トランスロケーションドメインは、細菌毒素又はウイルスタンパク質等、酵素のトランスロケーションドメインである。
細菌毒素分子の特定のドメインが、こうした孔を形成可能であることは、十分に立証されている。ウイルスにより発現される膜融合タンパク質の特定のトランスロケーションドメインが、こうした孔を形成可能であることも知られている。このようなドメインは、本発明において利用し得る。
トランスロケーションドメインは、HNドメイン(又はその機能成分)等、クロストリジウムを起源とするものにし得る。HNは、H鎖のアミノ末端側の半分と略同等のクロストリジウム神経毒のH鎖の一部若しくはフラグメント、又は完全なH鎖における、そのフラグメントに対応するドメインを意味する。H鎖は、H鎖のHC成分の天然結合機能が欠如していてもよい。一部の実施形態において、HC機能は、HCアミノ酸配列を(DNA合成レベル又はヌクレアーゼ若しくはプロテアーゼ処理による合成後のレベルで)欠失させることにより除去し得る。或いは、一部の実施形態において、HC機能は、化学的又は生物学的処理により不活性化し得る。したがって、一部の実施形態において、H鎖は、天然のクロストリジウム神経毒(即ち、ホロトキシン)が結合する標的細胞上の結合部位に結合することができない。
適切な(基準)トランスロケーションドメインの例は以下を含む。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(449-871)
ボツリヌス菌B型神経毒-アミノ酸残基(441-858)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(442-866)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(446-862)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(423-845)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(440-864)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(442-863)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(458-879)
上述した基準配列は、目安と考えるべきであり、下位血清型により僅かな変動が生じ得る。一例として、US2007/0166332(出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部とする)では、僅かに異なるクロストリジウム配列を引用している。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(A449-K871)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(A442-S858)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(T450-N866)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(D446-N862)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(K423-K845)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(A440-K864)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(S447-S863)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(S458-V879)
本発明に関連して、トランスロケーションドメインを含む様々なクロストリジウム毒素HN領域は、これらの活性フラグメントが無細胞毒性プロテアーゼ(例えば、クロストリジウムL鎖)の細胞内小胞から標的細胞の細胞質への放出を促進して、クロストリジウム毒素が基質をタンパク分解性に切断する全体的な細胞機構の達成に関与できる場合、本発明の態様において有用となり得る。クロストリジウム毒素の重鎖からのHN領域は、略410乃至430アミノ酸長を有し、トランスロケーションドメインを含む。研究により、トランスロケーションドメインのトランスロケーション活性には、クロストリジウム毒素重鎖のHN領域の全長を必要としないことが分かっている。したがって、本実施形態の態様は、例えば、少なくとも350個のアミノ酸、少なくとも375個のアミノ酸、少なくとも400個のアミノ酸、及び少なくとも425個のアミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム毒素HN領域を含むことができる。本実施形態の他の態様は、例えば、多くとも350個のアミノ酸、多くとも375個のアミノ酸、多くとも400個のアミノ酸、及び多くとも425個のアミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム毒素HN領域を含むことができる。
Clostridium botulinum及びC.tetaniにおける毒素生成の遺伝学的基礎に関する詳細については、The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press内のHenderson et al (1997)を参照されたい。
HNという用語は、天然に存在する神経毒HN部分を含むと共に、天然に存在しないアミノ酸配列及び/又は合成アミノ酸残基を有する修飾HN部分を、その修飾HN部分が上述したトランスロケーション機能を依然として示す限り包含する。
或いは、トランスロケーションドメインは、非クロストリジウム起源のものとし得る。非クロストリジウム(基準)トランスロケーションドメイン起源の例には、限定では無いが、ジフテリア毒素のトランスロケーションドメイン[O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206、Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532、及びLondon, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51]、シュードモナス外毒素A型のトランスロケーションドメイン[Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559]、炭疽毒素のトランスロケーションドメイン[Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442]、トランスロケーション機能の様々な融合性又は疎水性ペプチド[Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924、及び Wagner et al (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938]、及び両親媒性ペプチド[Murata et al (1992) Biochem., 31, pp.1986-1992]が含まれる。トランスロケーションドメインは、天然に存在するタンパク質内に存在するトランスロケーションドメインをそのまま反映してよく、或いは、トランスロケーションドメインのトランスロケーション能力を破壊しない限りアミノ酸の変化を含み得る。
本発明での使用に適したウイルス(基準)トランスロケーションドメインの特定の例は、ウイルス発現膜融合タンパク質の特定のトランスロケーションドメインを含む。例えば、Wagner et al. (1992) およびMurata et al. (1992)は、インフルエンザウイルスヘムアグルチニンのN末端領域に由来する多数の融合性及び親水性ペプチドのトランスロケーション(即ち、膜融合および小胞形成)機能を記載している。所望のトランスロケーション活性を有することが知られている他のウイルス発現膜融合タンパク質は、セムリキ森林ウイルス(SFV)の融合性ペプチドのトランスロケーションドメイン、水疱性口内炎ウイルス(VSV)グリコプロテインGのトランスロケーションドメイン、SERウイルスFタンパク質のトランスロケーションドメイン、及び泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質のトランスロケーションドメインである。ウイルスによりコードされたスパイクタンパク質、例えば、SFVのE1タンパク質及びVSVのGタンパク質のGタンパク質は、本発明に関連して特定の用途を有する。
表(下記)に列挙した(基準)トランスロケーションドメインの使用は、それらの配列多様体の使用を含む。多様体は、好ましくは、その多様体が必要なトランスロケーション機能を保有する場合、1つ以上の保存的な核酸置換及び/又は核酸欠失若しくは挿入を含み得る。多様体は、その多様体が必要なトランスロケーション機能を保有する限り、1つ以上のアミノ酸置換及び/又はアミノ酸欠失若しくは挿入を含み得る。
Figure 2022517406000004
クロストリジウム神経毒HCドメイン基準配列の例は以下を含む:
BoNT/A - N872-L1296
BoNT/B - E859-E1291
BoNT/C1 - N867-E1291
BoNT/D - S863-E1276
BoNT/E - R846-K1252
BoNT/F - K865-E1274
BoNT/G - N864-E1297
TeNT - I880-D1315
最近同定されたBoNT/Xの場合、HCドメインは、そのアミノ酸893乃至1306に対応すると報告されており、ドメインの境界は、略25個のアミノ酸だけ変化する可能性がある(例:868乃至1306又は918乃至1306)。
本発明のポリペプチドは、更に、トランスロケーション促進ドメインを含み得る。前記ドメインは、標的細胞のサイトゾルへの無細胞毒性プロテアーゼの送達を促進し、例えば、それぞれ出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部としたWO08/008803及びWO08/008805に記載されている。
一例として、適切なトランスロケーション促進ドメインは、エンベロープウイルス融合性ペプチドドメインを含み、例えば、適切な融合性ペプチドドメインは、インフルエンザウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、23アミノ酸のA型インフルエンザウイルス融合性ペプチドドメイン)、アルファウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、26アミノ酸のセムリキ森林ウイルス融合性ペプチドドメイン)、ベシクロウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、21アミノ酸の水泡性口内炎ウイルス融合性ペプチドドメイン)、レスピロウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、25アミノ酸のセンダイウイルス融合性ペプチドドメイン)、モルビリウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、25アミノ酸のイヌジステンパウイルス融合性ペプチドドメイン)、アブラウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、25アミノ酸のニューカッスル病ウイルス融合性ペプチドドメイン)、ヘニパウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、25アミノ酸のヘンドラウイルス融合性ペプチドドメイン)、メタニューモウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、25アミノ酸のヒトメタニューモウイルス融合性ペプチドドメイン)、若しくはサル泡沫状ウイルス融合性ペプチドドメイン等のスプマウイルス融合性ペプチドドメイン、又はそのフラグメント若しくは多様体を含む。
他の例として、トランスロケーション促進ドメインは、クロストリジウム毒素HCNドメイン又はそのフラグメント若しくは多様体を含み得る。更に詳しくは、クロストリジウム毒素HCNトランスロケーション促進ドメインは、少なくとも200個のアミノ酸、少なくとも225個のアミノ酸、少なくとも250個のアミノ酸、少なくとも275個のアミノ酸の長さを有し得る。これに関連して、クロストリジウム毒素HCNトランスロケーション促進ドメインは、好ましくは、多くとも200個のアミノ酸、多くとも225個のアミノ酸、多くとも250個のアミノ酸、又は多くとも275個のアミノ酸の長さを有する。具体的な(基準)例は以下を含む。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(872-1110)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(859-1097)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(867-1111)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(863-1098)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(846-1085)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(865-1105)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(864-1105)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(880-1127)
上述した配列位置は、血清型/サブタイプに応じて僅かに変化する場合があり、適切な(基準)クロストリジウム毒素HCNドメインの他の例は以下を含む。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(874-1110)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(861-1097)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(869-1111)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(865-1098)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(848-1085)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(867-1105)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(866-1105)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(882-1127)
上述した促進ドメインは、何れも本発明での使用に適した上述のトランスロケーションドメインペプチドの何れかと組み合わせてよい。したがって、一例として、非クロストリジウム促進ドメインは、非クロストリジウムトランスロケーションドメインペプチド又はクロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせてよい。或いは、クロストリジウム毒素HCNトランスロケーション促進ドメインは、非クロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせてよい。或いは、クロストリジウム毒素HCN促進ドメインは、クロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせてよく、その例は以下を含む:
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(449-1110)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(442-1097)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(450-1111)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(446-1098)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(423-1085)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(440-1105)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(447-1105)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(458-1127)
本発明の様々な方法に関連する実施形態は、他の方法、ポリペプチド、例えば、標識に適したポリペプチド又は標識ポリペプチド、核酸に等しく適用されるものであり、逆も同様となる。
配列相同性
同一性パーセントは、限定では無く、グローバル法、ローカル法、及び、例えばセグメントアプローチ法等のハイブリッド法を含む様々な配列アラインメント方法の何れかを用いて決定することができる。同一性パーセントを決定するためのプロトコルは、当業者の範囲内の日常の手順である。グローバル法は、配列を分子の最初から最後まで整列させ、個々の残基対のスコアを合計すると共に、ギャップペナルティを与えることにより、最善のアラインメントを決定する。非限定的な方法には、例えば、CLUSTAL W(例えば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)参照)及び反復改良(例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996)参照)が含まれる。ローカル法は、入力配列の全てが共有する1つ以上の保存モチーフを同定することにより配列を整列させる。非限定的な方法には、例えば、Match-box(例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)参照)、ギブスサンプリング(例えば、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131 ) Science 208-214 (1993)参照)、Align-M(例えば、Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)参照)が含まれる。
したがって、配列同一性パーセントは、従来の方法により決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992を参照されたい。簡単に言うと、ギャップ開始ペナルティとして10、ギャップ伸長ペナルティとして1、及び以下に示すようなHenikoff and Henikoff(前掲)の「blosum62」スコア行列(アミノ酸を標準の1文字コードで示す)を用いてアラインメントスコアを最適化するように2つのアミノ酸配列を整列させる。2つ以上の核酸又はアミノ酸配列間の「配列同一性パーセント」は、配列が共有する同一位置数の関数である。したがって、同一性パーセントは、同一のヌクレオチド/アミノ酸の数をヌクレオチド/アミノ酸の合計数で除算したものに100を乗算して計算し得る。配列同一性パーセントの計算は、ギャップ数と、2つ以上の配列のアラインメントを最適化するために導入する必要がある各ギャップの長さとを考慮して行ってもよい。2つ以上の配列間の配列比較及び同一性パーセントの決定は、当業者によく知られているBLAST等の特定の数学アルゴリズムを用いて実施することができる。
Figure 2022517406000005
次に同一性パーセントを以下のように計算する。
完全一致の合計数
-------------------------------- x 100
[長い配列の長さ+2配列を整列させる
ために長い配列に導入したギャップ数]
実質的に相同なポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有することを特徴とする。こうした変化は、好ましくは軽微な性質のものであり、即ち、保存的アミノ酸置換(下記参照)及びポリペプチドの折り畳み又は活性に著しく影響しない他の置換、一般には1乃至約30個のアミノ酸の僅かな欠失、及びアミノ末端メチオニン残基、約20乃至25残基までの小さなリンカペプチド、若しくはアフィニティタグ等の僅かなアミノ又はカルボキシル末端伸長である。
保存的アミノ酸置換
塩基性:
アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性:
グルタミン酸
アスパラギン酸
極性:
グルタミン
アスパラギン
疎水性:
ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族:
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小型:
グリシン
アラニン
セリン
トレオニン
メチオニン
20種類の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸(例えば4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリジン、2-アミノイソ酪酸、イソバリン、及びα-メチルセリン)により、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基を置換し得る。限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、及び非天然アミノ酸により、ポリペプチドアミノ酸残基を置換し得る。本発明のポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸残基を含むことができる。
天然に存在しないアミノ酸は、限定では無く、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノ-プロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-トレオニン、メチル-トレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ-システイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、及び4-フルオロフェニルアラニンを含む。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むために、当該技術分野において幾つかの方法が知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサtRNAを用いてナンセンス変異を抑制したインビトロ系を利用することができる。アミノ酸及びアミノアシル化tRNAを合成するための方法は、当該技術分野において公知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、E.coli S30抽出物と、市販の酵素及び他の試薬とを含む無細胞系において実施される。タンパク質は、クロマトグラフィにより精製する。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991、 Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991、 Chung et al., Science 259:806-9, 1993、及びChung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993を参照されたい。第2の方法において、翻訳は、アフリカツメガエル卵母細胞において、変異mRNA及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサtRNAのマイクロインジェクションにより実施される(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996)。第3の方法では、大腸菌細胞を、置換対象の天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)が存在せず、所望の天然に存在しないアミノ酸(群)(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、又は4-フルオロフェニルアラニン)が存在する状態で培養する。天然に存在しないアミノ酸は、自然状態での対応物の代わりにポリペプチドに取り込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994を参照されたい。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学修飾により、天然に存在しない種に変換することができる。化学修飾は、部位特異的突然変異誘発と組み合わせて、置換の範囲を更に拡大することができる(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。
限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び非天然アミノ酸により、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基を置換し得る。
本発明のポリペプチド内の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発等、当該技術分野において公知の手順により同定することができる(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989)。生物学的相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性標識のような手法により決定されるような構造の物理解析により、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と組み合わせて決定することもできる。例えば、de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992を参照されたい。必須アミノ酸の同定は、本発明のポリペプチドの関連成分(例えば、トランスロケーション又はプロテアーゼ成分)との相同性の解析から推測することもできる。
多重アミノ酸置換を、Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)により開示されるもの等、公知の突然変異誘発及びスクリーニング方法を用いて実施及び試験することができる。簡単に言うと、これらの執筆者は、ポリペプチド内の2つ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、その後、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して、各位置で許容される置換の範囲を決定する方法を開示している。使用可能な他の方法には、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991、Ladnerらの米国特許第5,223,409号、HuseのWIPO公開番号WO92/06204)と、領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988)とが含まれる
多重アミノ酸置換を、Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)により開示されるもの等、公知の突然変異誘発及びスクリーニング方法を用いて実施及び試験することができる。簡単に言うと、これらの執筆者は、ポリペプチド内の2つ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、その後、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して、各位置で許容される置換の範囲を決定する方法を開示している。使用可能な他の方法には、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991、Ladnerらの米国特許第5,223,409号、HuseのWIPO公開番号WO92/06204)と、領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988)とが含まれる。
特に定義されない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は、本明細書が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、当業者にとって、本開示で用いられる多くの用語の一般的な辞書となる。
本開示は、本明細書に開示した方法及び材料の例により限定されず、本明細書に記載したものと類似する又は等価の任意の方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験に用いることができる。数値範囲は、範囲を定める数を含む。特に指示の無い限り、任意の核酸配列は、5’から3’の方向で左から右に書かれており、アミノ酸配列は、それぞれアミノからカルボキシへの方向で左から右に書かれている。
本明細書に記載の見出しは、本開示の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。
本明細書において、アミノ酸は、アミノ酸の名前、3文字の略語、又は1文字の略語を用いて示す。本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語及び/又は「タンパク質」という用語と同義である。場合により、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。場合により、「アミノ酸配列」という用語は「酵素」という用語と同義である。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書において相互に交換可能に用いられる。本開示及び特許請求の範囲では、アミノ酸残基の従来の1文字及び3文字のコードが使用される場合がある。アミノ酸の3文字コードは、生化学的命名法に関するIUPAC-IUB共同委員会(JCBN)に準拠して定義されたものである。また、遺伝暗号の縮重のため、ポリペプチドは、複数のヌクレオチド配列によりコードされ得ると理解される。
用語の他の定義は、明細書全体を通して現れる場合がある。実施形態の例をより詳細に説明する前に、本開示は、説明された特定の実施形態に限定されず、それ自体が変化し得ることを理解されたい。また、本開示の範囲は、添付特許請求の範囲によりのみ定義されるため、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図しないことも理解されたい。
値の範囲が提示された場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値も、文脈上明らかに別の意味を示す場合を除き下限の単位の10分の1まで、具体的に開示されると理解される。記載範囲内の任意の記載値又は介在値と、記載範囲内の他の任意の記載値又は介在値との間の、より小さな範囲は、本開示に含まれる。こうしたより小さな範囲の上限及び下限は、独立して範囲内に包含又は除外してよく、より小さな範囲に上限及び下限の一方又は両方が含まれる場合又は何れも含まれない場合の各範囲も、記載範囲内で具体的に除外された任意の限界に応じて本開示に含まれる。記載範囲が限界の一方又は両方を含む場合、含まれた限界の一方又は両方を除外した範囲も、本開示に含まれる。
本明細書及び付記特許請求の範囲での使用において、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈上明らかに別の意味を示す場合を除き、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ポリペプチド(a polypeptide)」への言及は、複数のそのような候補薬剤を含み、「ポリペプチド(the polypeptide)」への言及は、1つ以上のポリペプチド及び当業者に公知のその等価物への言及等を含む。
本明細書にて論じた公表文献は、本出願の出願日より前の開示内容のみのために提示している。本明細書の如何なる部分も、このような公表文献が本明細書の付記特許請求の範囲の先行技術を構成することを認めるものと解釈するべきではない。
次に、本発明の実施形態を、単なる例として、以下の図及び実施例を参照して説明する。
図1は、リガンド結合ポリペプチドの二重標識戦略の概略図を示す。タンパク質は、C末端にSrtA認識部位を含み、これにStrepタグが続く。N末端において、タンパク質は、TEV切断部位により保護された一続きのグリシンを含む。選択したフルオロフォアに結合した一続きのグリシンを含むペプチドと、SrtA認識部位及び6Hisタグ(HT)を含む第2のペプチドも生成された。2つの異なるSrtA酵素により、N末端及びC末端で異なる色のフルオロフォアの部位特異的標識が可能となる。 図2は、非標識、単一標識、及び二重標識ポリペプチドのSNAP-25切断アッセイを示す。A.3、10、30、100、300、及び1000nMの非標識EGFリガンド結合ポリペプチド、TxRed標識EGFポリペプチド、SNAP594標識EGFリガンド結合ポリペプチド、単一SrtA媒介標識EGFリガンド結合ポリペプチド、及び二重SrtA標識EGFリガンド結合ポリペプチドによる皮質ニューロンのSNAP-25切断。対照として、リガンドを含まない(非リガンド結合)ポリペプチドを全ての濃度で使用した。ポリペプチドへの曝露は、24時間に亘り実施した。B.3、10、30、100、300、及び1000nMの非標識ノシセプチンリガンド結合ポリペプチド及び二重SrtA媒介標識ノシセプチンポリペプチドによる皮質ニューロンのSNAP-25切断。対照として、リガンドを含まない(非リガンド結合)ポリペプチドを全ての濃度で使用した。ポリペプチドへの曝露は、24時間に亘り実施した。 図3は、二重標識EGFリガンド結合ポリペプチドのライブ共焦点イメージングを示す。A.N末端においてHF555、C末端においてHF488により標識されたEGFリガンド結合ポリペプチドで処理したA549細胞の共焦点ライブイメージング記録のスナップショット。画像(右)は、タンパク質添加後0.5分から様々な間隔で撮影した、大きな画像(左)に示した囲み領域のスナップショットである。このポリペプチドに特徴的な凝集体の形成は、3分以降に見ることができる。B.N末端においてHF555、C末端においてHF488により標識されたEGFリガンド結合ポリペプチドで処理したA549細胞の共焦点ライブイメージング記録のスナップショット。画像(右)は、タンパク質添加後30分から様々な間隔で撮影した、大きな画像(左)に示した囲み領域のスナップショットである。凝集体の消失は、45分以降に見られる。 図4は、BoNT/A(0)と呼ばれる、BoNT/A1のタンパク分解性に不活性な二重標識全長変異体の概略図を示す。ソルターゼドナー及びアクセプタ部位及びプロトコルは、図1のものと同じである。 図5は、蛍光(左)とクーマシー染色(右)を用いて画像化したタンパク分解性に不活性化された二重標識BoNT/A(BoNT/A(0))のSDS-PAGE分析を示す。レーン1及び4は、タンパク質ラダーを示し、レーン2及び5は、非還元二重標識BoNT/A(0)を示し、レーン3及び6は還元二重標識(L鎖下部及びH鎖上部)BoNT/A(0)を示す。 図6は、5秒間隔で記録された単一標識BoNT/A(0)のタイムラプス単一分子TIRF顕微鏡画像を示す。白い矢印は、時間の経過とともに移動する単一分子を秒単位で示す。
配列表
最初のMetアミノ酸残基又は対応する最初のコドンが以下の配列番号の何れかに示される場合、当該残基/コドンは、任意選択となり得る。説明に記載の配列とST.25配列表の配列に違いがある場合は、説明のシーケンスが優先される。
配列番号1-二重標識SrtA部位を有するEGFリガンド結合(EGFTM)ポリペプチドのヌクレオチド配列
配列番号2-二重標識SrtA部位を有するEGFリガンド結合(EGFTM)ポリペプチドのポリペプチド配列
配列番号3-二重標識SrtA部位を有するノシセプチンリガンド結合(ノシセプチンTM)ポリペプチドのヌクレオチド配列
配列番号4-二重標識SrtA部位を有するノシセプチンリガンド結合(ノシセプチンTM)ポリペプチドのポリペプチド配列
配列番号5-EGFリガンド結合(EGFTM)ポリペプチドのヌクレオチド配列
配列番号6-EGFリガンド結合(EGFTM)ポリペプチドのポリペプチド配列
配列番号7-ノシセプチンリガンド結合(ノシセプチンTM)ポリペプチドのヌクレオチド配列
配列番号8-ノシセプチンリガンド結合(ノシセプチンTM)ポリペプチドのポリペプチド配列
配列番号9-GFPタグ付きEGFリガンド結合ポリペプチドのヌクレオチド配列
配列番号10-GFPタグ付きEGFリガンド結合ポリペプチドのポリペプチド配列
配列番号11-SNAPタグ付きEGFリガンド結合ポリペプチドのヌクレオチド配列
配列番号12-SNAPタグ付きEGFリガンド結合ポリペプチドのポリペプチド配列
配列番号13-ソルターゼAのヌクレオチド配列(LPESG標的)
配列番号14-ソルターゼAのポリペプチド配列(LPESG標的)
配列番号15-ソルターゼAのヌクレオチド配列(LAETG標的)
配列番号16-ソルターゼAのポリペプチド配列(LAETG標的)
配列番号17-BoNT/A-UniProt P10845
配列番号18-BoNT/B-UniProt P10844
配列番号19-BoNT/C-UniProt P18640
配列番号20-BoNT/D-UniProt P19321
配列番号21-BoNT/E-UniProt Q00496
配列番号22-BoNT/F-UniProt A7GBG3
配列番号23-BoNT/G-UniProt Q60393
配列番号24-BoNT/Xのポリペプチド配列
配列番号25-TeNT- UniProt P04958
配列番号26-標識EGFTMポリペプチドのポリペプチド配列
配列番号27-チョウマメブテラーゼ1のポリペプチド配列(シグナルペプチドあり)
配列番号28-チョウマメブテラーゼ1のポリペプチド配列(シグナルペプチドなし)
配列番号29-結合した検出可能な標識及びソルターゼドナー部位を有するペプチド
配列番号30-結合した検出可能な標識及びソルターゼアクセプタ部位を有するペプチド
配列番号31-黄色ブドウ球菌ソルターゼAのポリペプチド配列
配列番号32-黄色ブドウ球菌ソルターゼBのポリペプチド配列
配列番号33-肺炎連鎖球菌ソルターゼAのポリペプチド配列
配列番号34-肺炎連鎖球菌ソルターゼBのポリペプチド配列
配列番号35-肺炎連鎖球菌ソルターゼCのポリペプチド配列
配列番号36-肺炎連鎖球菌ソルターゼDのポリペプチド配列
配列番号37-化膿連鎖球菌ソルターゼAのポリペプチド配列
配列番号38-タンパク分解性に不活性な変異体BoNT/A(0)のポリペプチド配列
配列番号39-二重標識SrtA部位を有する全長のタンパク分解性に不活性な変異体BoNT/A(0)のヌクレオチド配列
配列番号40-二重標識SrtA部位を有する全長のタンパク分解性に不活性な変異体BoNT/A(0)のポリペプチド配列
配列番号41-Prochloron didemni PATGのポリペプチド配列
配列番号42-Saponaria vaccaria PCY1のポリペプチド配列
配列番号43-Galerina marginata POPBのポリペプチド配列
配列番号44-Oldenlandia affinisブテラーゼホモログOaAEP1bのポリペプチド配列(シグナルペプチドあり)
配列番号45-Oldenlandia affinisブテラーゼホモログOaAEP1bのポリペプチド配列(シグナルペプチドなし)
配列番号1-二重標識SrtA部位を有するEGFリガンド結合ポリペプチドのヌクレオチド配列
TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCAAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATgggatccatgGAGAACCTGTATTTTCAGGGCGGCGGTGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCcctttcgttaacaaacagttcaactataaagacccagttaacggtgttgacattgcttacatcaaaatcccgaacgctggccagatgcagccggtaaaggcattcaaaatccacaacaaaatctgggttatcccggaacgtgatacctttactaacccggaagaaggtgacctgaacccgccaccggaagcgaaacaggtgccggtatcttactatgactccacctacctgtctaccgataacgaaaaggacaactacctgaaaggtgttactaaactgttcgagcgtatttactccaccgacctgggccgtatgctgctgactagcatcgttcgcggtatcccgttctggggcggttctaccatcgataccgaactgaaagtaatcgacactaactgcatcaacgttattcagccggacggttcctatcgttccgaagaactgaacctggtgatcatcggcccgtctgctgatatcatccagttcgagtgtaagagctttggtcacgaagttctgaacctcacccgtaacggctacggttccactcagtacatccgtttctctccggacttcaccttcggttttgaagaatccctggaagtagacacgaacccactgctgggcgctggtaaattcgcaactgatcctgcggttaccctggctcacgaactgattcatgcaggccaccgcctgtacggtatcgccatcaatccgaaccgtgtcttcaaagttaacaccaacgcgtattacgagatgtccggtctggaagttagcttcgaagaactgcgtacttttggcggtcacgacgctaaattcatcgactctctgcaagaaaacgagttccgtctgtactactataacaagttcaaagatatcgcatccaccctgaacaaagcgaaatccatcgt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配列番号2-二重標識SrtA部位を有するEGFリガンド結合ポリペプチドのポリペプチド配列
MENLYFQGGGGSGGSGGSPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSALDNSDPKCPLSHEGYCLNDGVCMYIGTLDRYACNCVVGYVGERCQYRDLKLAELRGLEAGGSGGGSGLPESGGGSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK
配列番号3-二重標識SrtA部位を有するノシセプチンリガンド結合(ノシセプチンTM)ポリペプチドのヌクレオチド配列
TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCAAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATatgGAGAACCTGTATTTTCAGGGCGGCGGTGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCAGCATGcctTTTGTGAACAAACAGTTCAACTATAAGGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTGGATGGCATTATTACCAGCAAAACCAAATCCGATGATGACGATAAATTCGGTGGTTTTACCGGTGCACGTAAAAGCGCACGTAAACGTAAAAATCAGGCACTGGCAGGCGGTGGTGGTAGCGGTGGCGGTGGTTCAGGTGGTGGTGGCTCAGCACTGGTTCTGCAGTGTATTAAAGTTAATAACTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAGGATAATTTCACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTCGATAATGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCACTGACCAATAGCGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTTAACAAAGCAACCGAAGCAGCCATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTTTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATTACCATCATCATCCCGTATATCGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTGAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATCGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTGTACAAGTATATCGTGACCAATTGGCTGGCAAAAGTTAACACCCAGATTGACCTGATTCGCAAGAAGATGAAAGAAGCACTGGAAAACCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATTAACTATCAGTACAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAGAATAACATCAACTTCAACATCGATGATCTGAGCAGCAAGCTGAATGAAAGCATCAACAAAGCCATGATCAACATTAACAAATTTCTGAATCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGTCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCCCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGTCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTGAACAACACCCTGAGTACCGATATTCCTTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGTCTGCTGAGTACCCTGGATGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCCTGCCCGAAAGCGGTGGCGGATCTGCTTGGTCTCACCCGCAGTTCGAAAAAGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGCTTGGTCTCACCCGCAGTTCGAAAAAtaatgaAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT
配列番号4-二重標識SrtA部位を有するノシセプチンリガンド結合ポリペプチドのポリペプチド配列
MENLYFQGGGGSGGSGGSGSMPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKFGGFTGARKSARKRKNQALAGGGGSGGGGSGGGGSALVLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLDGGSGGGSGLPESGGGSAWSHPQFEKGGG
配列番号5-EGFリガンド結合ポリペプチドのヌクレオチド配列
TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCAAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATgggatccatggagttcgttaacaaacagttcaactataaagacccagttaacggtgttgacattgcttacatcaaaatcccgaacgctggccagatgcagccggtaaaggcattcaaaatccacaacaaaatctgggttatcccggaacgtgatacctttactaacccggaagaaggtgacctgaacccgccaccggaagcgaaacaggtgccggtatcttactatgactccacctacctgtctaccgataacgaaaaggacaactacctgaaaggtgttactaaactgttcgagcgtatttactccaccgacctgggccgtatgctgctgactagcatcgttcgcggtatcccgttctggggcggttctaccatcgataccgaactgaaagtaatcgacactaactgcatcaacgttattcagccggacggttcctatcgttccgaagaactgaacctggtgatcatcggcccgtctgctgatatcatccagttcgagtgtaagagctttggtcacgaagttctgaacctcacccgtaacggctacggttccactcagtacatccgtttctctccggacttcaccttcggttttgaagaatccctggaagtagacacgaacccactgctgggcgctggtaaattcgcaactgatcctgcggttaccctggctcacgaactgattcatgcaggccaccgcctgtacggtatcgccatcaatccgaaccgtgtcttcaaagttaacaccaacgcgtattacgagatgtccggtctggaagttagcttcgaagaactgcgtacttttggcggtcacgacgctaaattcatcgactctctgcaagaaaacgagttccgtctgtactactataacaagttcaaagatatcgcatccaccctgaacaaagcgaaatccatcgtgggtaccactgcttctctccagtacatgaagaacgtttttaaagaaaaata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配列番号6-EGFリガンド結合ポリペプチドのポリペプチド配列
MEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSALDNSDPKCPLSHEGYCLNDGVCMYIGTLDRYACNCVVGYVGERCQYRDLKLAELRGLEAHHHHHHHHHH
配列番号7-ノシセプチンリガンド結合ポリペプチドのヌクレオチド配列
TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCAAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGCAGCATGGAATTTGTGAACAAACAGTTCAACTATAAGGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATA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配列番号8-ノシセプチンリガンド結合ポリペプチドのポリペプチド配列
MGSMEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKFGGFTGARKSARKRKNQALAGGGGSGGGGSGGGGSALVLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLDHHHHHH
配列番号9-GFPタグ付きEGFリガンド結合ポリペプチドのヌクレオチド配列
TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCAAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATgATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCACGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCggatccatggagttcgttaacaaacagttcaactataaagacccagttaacggtgttgacattgcttacatcaaaatcccgaacgctggccagatgcagccggtaaaggcattcaaaatccacaacaaaatctgggttatcccggaacgtgatacctttactaacccggaagaaggtgacctgaacccgccaccggaagcgaaacaggtgccggtatcttactatgactccacctacctgtctaccgataacgaaaaggacaactacctgaaaggtgttactaaactgttcgagcgtatttactccaccgacctgggccgtatgctgctgactagcatcgttcgcggtatcccgttctggggcggttctaccatcgataccgaactgaaagtaatcgacactaactgcatcaacgttattcagccggacggttcctatcgttccgaagaactgaacctggtgatcatcggcccgtctgctgatatcatccagttcgagtgtaagagctttggtcacgaagttctgaacctcacccgtaacggctacggttccactcagtacatccgtttctctccggacttcaccttcggttttgaagaatccctggaagtagacacgaacccactgctgggcgctggtaaattcgcaactgatcctgcggttaccctggctcacgaactgattcatgcaggccaccgcctgtacggtatcgccatcaatccgaaccgtgtcttcaaagttaacaccaacgcgtattacgagatgtccggtctggaagttagcttcgaagaactgcgtacttttggcggtcacgacgctaaattcatcgactctctgcaagaaaacgagttccgtctgtactactataacaagttcaaagatatcgcatccaccctgaacaaagcgaaatccatcgtgggtaccactgcttctctccagtacatgaagaacgtttttaaagaaaaatacctgctcagcgaagacacctccggcaaattctctgtagacaagttgaaattcgataaactttacaaaatgctgactgaaatttacaccgaagacaacttcgttaagttctttaaagttctgaaccgcaaaacctatctgaacttcgacaaggcagtattcaaaatcaacatcgtgccgaaagttaactacactatctacgatggtttcaacctgcgtaacaccaacctggctgctaattttaacggccagaacacggaaatcaacaacatgaacttcacaaaactgaaaaacttcactggtctgttcgagttttacaagctgctgtgcgtcgacggcatcattacctccaaaactaaatctctgatagaaggtagaaacaaagcgctgaacctgcagtgtatcaaggttaacaactgggatttattcttcagcccgagtgaagacaacttcaccaacgacctgaacaaaggtgaagaaatcacctcagatactaacatcgaagcagccgaagaaaacatctcgctggacctgatccagcagtactacctgacctttaatttcgacaacgagccggaaaacatttctatcgaaaacctgagctctgatatcatcggccagctggaactgatgccgaacatcgaacgtttcccaaacggtaaaaagtacgagctggacaaatataccatgttccactacctgcgcgcgcaggaatttgaacacggcaaatcccgtatcgcactgactaactccgttaacgaagctctgctcaacccgtcccgtgtatacaccttcttctctagcgactacgtgaaaaaggtcaacaaagcgactgaagctgcaatgttcttgggttgggttgaacagcttgtttatgattttaccgacgagacgtccgaagtatctactaccgacaaaattgcggatatcactatcatcatcccgtacatcggtccggctctgaacattggcaacatgctgtacaaagacgacttcgttggcgcactgatcttctccggtgcggtgatcctgctggagttcatcccggaaatcgccatcccggtactgggcacctttgctctggtttcttacattgcaaacaaggttctgactgtacaaaccatcgacaacgcgctgagcaaacgtaacgaaaaatgggatgaagtttacaaatatatcgtgaccaactggctggctaaggttaatactcagatcgacctcatccgcaaaaaaatgaaagaagcactggaaaaccaggcggaagctaccaaggcaatcattaactaccagtacaaccagtacaccgaggaagaaaaaaacaacatcaacttcaacatcgacgatctgtcctctaaactgaacgaatccatcaacaaagctatgatcaacatcaacaagttcctgaaccagtgctctgtaagctatctgatgaactccatgatcccgtacggtgttaaacgtctggaggacttcgatgcgtctctgaaagacgccctgctgaaatacatttacgacaaccgtggcactctgatcggtcaggttgatcgtctgaaggacaaagtgaacaataccttatcgaccgacatcccttttcagctcagtaaatatgtcgataaccaacgccttttgtccactctagaaggcggTGGCGGTAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGTAGCGCACTAGacAACAGCGACCCTAAATGCCCACTaAGTCATGAAGGATACTGCCTTAATGATGGTGTTTGTATGTACATAGGAACATTGGACCGTTATGCTTGCAATTGTGTAGTGGGCTATGTCGGGGAAAGGTGTCAATATCGAGATCTCAAGCTGGCAGAGTTAAGAgggctagaagcaCACCATCATCACcaccatcaccatcaccattaatgaAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT
配列番号10-GFPタグ付きEGFリガンド結合ポリペプチドのポリペプチド配列
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKGGSGGGSGGGSMEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSALDNSDPKCPLSHEGYCLNDGVCMYIGTLDRYACNCVVGYVGERCQYRDLKLAELRGLEAHHHHHHHHHH
配列番号11-SNAPタグ付きEGFリガンド結合ポリペプチドのヌクレオチド配列
TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCAAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATgATGGACAAAGACTGCGAAATGAAGCGCACCACCCTGGATAGCCCTCTGGGCAAGCTGGAACTGTCTGGGTGCGAACAGGGCCTGCACCGTATCATCTTCCTGGGCAAAGGAACATCTGCCGCCGACGCCGTGGAAGTGCCTGCCCCAGCCGCCGTGCTGGGCGGACCAGAGCCACTGATGCAGGCCACCGCCTGGCTCAACGCCTACTTTCACCAGCCTGAGGCCATCGAGGAGTTCCCTGTGCCAGCCCTGCACCACCCAGTGTTCCAGCAGGAGAGCTTTACCCGCCAGGTGCTGTGGAAACTGCTGAAAGTGGTGAAGTTCGGAGAGGTCATCAGCTACAGCCACCTGGCCGCCCTGGCCGGCAATCCCGCCGCCACCGCCGCCGTGAAAACCGCCCTGAGCGGAAATCCCGTGCCCATTCTGATCCCCTGCCACCGGGTGGTGCAGGGCGACCTGGACGTGGGGGGCTACGAGGGCGGGCTCGCCGTGAAAGAGTGGCTGCTGGCCCACGAGGGCCACAGACTGGGCAAGCCTGGGCTGGGTGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCggatccatggagttcgttaacaaacagttcaactataaagacccagttaacggtgttgacattgcttacatcaaaatcccgaacgctggccagatgcagccggtaaaggcattcaaaatccacaacaaaatctgggttatcccggaacgtgatacctttactaacccggaagaaggtgacctgaacccgccaccggaagcgaaacaggtgccggtatcttactatgactccacctacctgtctaccgataacgaaaaggacaactacctgaaaggtgttactaaactgttcgagcgtatttactccaccgacctgggccgtatgctgctgactagcatcgttcgcggtatcccgttctggggcggttctaccatcgataccgaactgaaagtaat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配列番号12-SNAPタグ付きEGFリガンド結合ポリペプチドのポリペプチド配列
MDKDCEMKRTTLDSPLGKLELSGCEQGLHRIIFLGKGTSAADAVEVPAPAAVLGGPEPLMQATAWLNAYFHQPEAIEEFPVPALHHPVFQQESFTRQVLWKLLKVVKFGEVISYSHLAALAGNPAATAAVKTALSGNPVPILIPCHRVVQGDLDVGGYEGGLAVKEWLLAHEGHRLGKPGLGGGSGGGSGGGSMEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSALDNSDPKCPLSHEGYCLNDGVCMYIGTLDRYACNCVVGYVGERCQYRDLKLAELRGLEAHHHHHHHHHH
配列番号13-ソルターゼAのヌクレオチド配列(LPESG標的)
TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCAAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATCATATGCAGGCAAAACCGCAGATTCCGAAAGATAAAAGCAAAGTGGCAGGCTATATTGAAATTCCGGATGCCGATATTAAAGAACCGGTTTATCCGGGTCCTGCAACACGTGAACAGCTGGATCGTGGTGTTTGTTTTGTTGAAGAAAATGAGAGCCTGGATGATCAGAACATTAGCATTACCGGTCATACCGCAATTGATCGTCCGAATTATCAGTTTACCAATCTGCGTGCAGCCAAACCGGGTAGCATGGTTTATCTGAAAGTTGGTAATGAAACCCGCATCTACAAAATGACCAGCATTCGTAATGTTAAACCGACCGCAGTTGGTGTTCTGGATGAACAAAAAGGTAAAGATAAACAGCTGACCCTGGTTACCTGTGATGATTATAACTTTGAAACCGGTGTTTGGGAAACGCGCAAAATCTTTGTTGCAACCGAAGTTAAACATCACCATCACCACCATCATCATCACCATTAAAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT
配列番号14-ソルターゼAのポリペプチド配列(LPESG標的)
MQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATREQLDRGVCFVEENESLDDQNISITGHTAIDRPNYQFTNLRAAKPGSMVYLKVGNETRIYKMTSIRNVKPTAVGVLDEQKGKDKQLTLVTCDDYNFETGVWETRKIFVATEVKHHHHHHHHHH
配列番号15-ソルターゼAのヌクレオチド配列(LAETG標的)
TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCAAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCAGGCAAAACCGCAGATTCCGAAAGATAAAAGCAAAGTGGCAGGCTATATTGAAATTCCGGATGCCGATATTAAAGAACCGGTTTATCCGGGTCCTGCAACACGTGAACAGCTGAATCGTGGTGTTTGTTTTCACGATGAAAATGAGAGCCTGGATGATCAGAATATTAGCATTGCAGGCCATACCTTTATTGATCGTCCGAATTATCAGTTCACCAATCTGAAAGCAGCAAAACCGGGTAGCATGGTTTATTTCAAAGTTGGTAATGAAACCCGCATCTACAAAATGACCAGCATTCGTAAAGTTCATCCGAATGCAGTTGGTGTTCTGGATGAACAAGAAGGCAAAGATAAACAGCTGACCCTGGTTACCTGTGATGATTATAACGAAGAAACCGGTGTTTGGGAAAGCCGTAAAATCTTTGTTGCAACCGAAGTGAAACATCATCACCACCATCACCATCATCATCACTAAAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT
配列番号16-ソルターゼAのポリペプチド配列(LAETG標的)
MQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATREQLNRGVCFHDENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKPGSMVYFKVGNETRIYKMTSIRKVHPNAVGVLDEQEGKDKQLTLVTCDDYNEETGVWESRKIFVATEVKHHHHHHHHHH
配列番号17-BoNT/A-UniProt P10845
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNVGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLN
PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGG
STIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGY
GSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPN
RVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKA
KSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKV
LNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFT
GLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEE
ITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNG
KKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEA
AMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSG
AVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAK
VNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKA
MININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDK
VNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINI
GSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNN
EYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTIT
NNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELN
EKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR
GSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA
GVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
配列番号18-BoNT/B-UniProt P10844
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
配列番号19-BoNT/C-UniProt P18640
MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
配列番号20-BoNT/D-UniProt P19321
MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE
配列番号21-BoNT/E-UniProt Q00496
MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHRFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNCMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLRTKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKIINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTFEDNRGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
配列番号22-BoNT/F-UniProt A7GBG3
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN
配列番号23-BoNT/G-UniProt Q60393
MPVNIKXFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE
配列番号24-BoNT/Xのポリペプチド配列
MKLEINKFNYNDPIDGINVITMRPPRHSDKINKGKGPFKAFQVIKNIWIVPERYNFTNNT
NDLNIPSEPIMEADAIYNPNYLNTPSEKDEFLQGVIKVLERIKSKPEGEKLLELISSSIP
LPLVSNGALTLSDNETIAYQENNNIVSNLQANLVIYGPGPDIANNATYGLYSTPISNGEG
TLSEVSFSPFYLKPFDESYGNYRSLVNIVNKFVKREFAPDPASTLMHELVHVTHNLYGIS
NRNFYYNFDTGKIETSRQQNSLIFEELLTFGGIDSKAISSLIIKKIIETAKNNYTTLISE
RLNTVTVENDLLKYIKNKIPVQGRLGNFKLDTAEFEKKLNTILFVLNESNLAQRFSILVR
KHYLKERPIDPIYVNILDDNSYSTLEGFNISSQGSNDFQGQLLESSYFEKIESNALRAFI
KICPRNGLLYNAIYRNSKNYLNNIDLEDKKTTSKTNVSYPCSLLNGCIEVENKDLFLISN
KDSLNDINLSEEKIKPETTVFFKDKLPPQDITLSNYDFTEANSIPSISQQNILERNEELY
EPIRNSLFEIKTIYVDKLTTFHFLEAQNIDESIDSSKIRVELTDSVDEALSNPNKVYSPF
KNMSNTINSIETGITSTYIFYQWLRSIVKDFSDETGKIDVIDKSSDTLAIVPYIGPLLNI
GNDIRHGDFVGAIELAGITALLEYVPEFTIPILVGLEVIGGELAREQVEAIVNNALDKRD
QKWAEVYNITKAQWWGTIHLQINTRLAHTYKALSRQANAIKMNMEFQLANYKGNIDDKAK
IKNAISETEILLNKSVEQAMKNTEKFMIKLSNSYLTKEMIPKVQDNLKNFDLETKKTLDK
FIKEKEDILGTNLSSSLRRKVSIRLNKNIAFDINDIPFSEFDDLINQYKNEIEDYEVLNL
GAEDGKIKDLSGTTSDINIGSDIELADGRENKAIKIKGSENSTIKIAMNKYLRFSATDNF
SISFWIKHPKPTNLLNNGIEYTLVENFNQRGWKISIQDSKLIWYLRDHNNSIKIVTPDYI
AFNGWNLITITNNRSKGSIVYVNGSKIEEKDISSIWNTEVDDPIIFRLKNNRDTQAFTLL
DQFSIYRKELNQNEVVKLYNYYFNSNYIRDIWGNPLQYNKKYYLQTQDKPGKGLIREYWS
SFGYDYVILSDSKTITFPNNIRYGALYNGSKVLIKNSKKLDGLVRNKDFIQLEIDGYNMG
ISADRFNEDTNYIGTTYGTTHDLTTDFEIIQRQEKYRNYCQLKTPYNIFHKSGLMSTETS
KPTFHDYRDWVYSSAWYFQNYENLNLRKHTKTNWYFIPKDEGWDED
配列番号25-TeNT- UniProt P04958
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND
配列番号26-標識EGF TMポリペプチドのポリペプチド配列
*HHHHHHLAETGGSGGSGGSEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSALDNSDPKCPLSHEGYCLNDGVCMYIGTLDRYACNCVVGYVGERCQYRDLKLAELRGLEAGGSGGGSGLPESGK†
* = HiLyte555; † = HiLyte488
配列番号27-チョウマメブテラーゼ1のポリペプチド配列(シグナルペプチドあり)
MKNPLAILFLIATVVAVVSGIRDDFLRLPSQASKFFQADDNVEGTRWAVLVAGSKGYVNYRHQADVCHAYQILKKGGLKDENIIVFMYDDIAYNESNPHPGVIINHPYGSDVYKGVPKDYVGEDINPPNFYAVLLANKSALTGTGSGKVLDSGPNDHVFIYYTDHGGAGVLGMPSKPYIAASDLNDVLKKKHASGTYKSIVFYVESCESGSMFDGLLPEDHNIYVMGASDTGESSWVTYCPLQHPSPPPEYDVCVGDLFSVAWLEDCDVHNLQTETFQQQYEVVKNKTIVALIEDGTHVVQYGDVGLSKQTLFVYMGTDPANDNNTFTDKNSLGTPRKAVSQRDADLIHYWEKYRRAPEGSSRKAEAKKQLREVMAHRMHIDNSVKHIGKLLFGIEKGHKMLNNVRPAGLPVVDDWDCFKTLIRTFETHCGSLSEYGMKHMRSFANLCNAGIRKEQMAEASAQACVSIPDNPWSSLHAGFSV
配列番号28-チョウマメブテラーゼ1のポリペプチド配列(シグナルペプチドなし)
IRDDFLRLPSQASKFFQADDNVEGTRWAVLVAGSKGYVNYRHQADVCHAYQILKKGGLKDENIIVFMYDDIAYNESNPHPGVIINHPYGSDVYKGVPKDYVGEDINPPNFYAVLLANKSALTGTGSGKVLDSGPNDHVFIYYTDHGGAGVLGMPSKPYIAASDLNDVLKKKHASGTYKSIVFYVESCESGSMFDGLLPEDHNIYVMGASDTGESSWVTYCPLQHPSPPPEYDVCVGDLFSVAWLEDCDVHNLQTETFQQQYEVVKNKTIVALIEDGTHVVQYGDVGLSKQTLFVYMGTDPANDNNTFTDKNSLGTPRKAVSQRDADLIHYWEKYRRAPEGSSRKAEAKKQLREVMAHRMHIDNSVKHIGKLLFGIEKGHKMLNNVRPAGLPVVDDWDCFKTLIRTFETHCGSLSEYGMKHMRSFANLCNAGIRKEQMAEASAQACVSIPDNPWSSLHAGFSV
配列番号29-結合した検出可能な標識及びソルターゼドナー部位を有するペプチド
GGGGK†
† = HiLyte488
配列番号30-結合した検出可能な標識及びソルターゼアクセプタ部位を有するペプチド
*HHHHHHLAETGGG
* = HiLyte555
配列番号31-黄色ブドウ球菌ソルターゼAのポリペプチド配列
MKKWTNRLMTIAGVVLILVAAYLFAKPHIDNYLHDKDKDEKIEQYDKNVKEQASKDKKQQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVK
配列番号32-黄色ブドウ球菌ソルターゼBのポリペプチド配列
MRMKRFLTIVQILLVVIIIIFGYKIVQTYIEDKQERANYEKLQQKFQMLMSKHQEHVRPQFESLEKINKDIVGWIKLSGTSLNYPVLQGKTNHDYLNLDFEREHRRKGSIFMDFRNELKNLNHNTILYGHHVGDNTMFDVLEDYLKQSFYEKHKIIEFDNKYGKYQLQVFSAYKTTTKDNYIRTDFENDQDYQQFLDETKRKSVINSDVNVTVKDRIMTLSTCEDAYSETTKRIVVVAKIIKVS
配列番号33-肺炎連鎖球菌ソルターゼAのポリペプチド配列
MEKLYIHLKNLRKVAVVMLLVFTTFYLLLMFLNQSDNQEIAKNIEKFNDSVIVAKTDNTKADIKEIEKNIEKVRKIEGGNVERVNQLTSENEKVKENIDLNIEEEIIENSYKSLETTDNFEKLGIIEIPKIDLNLSIFKGKPFVNTKNRQDTMLYGAVTNKKNQKMGRENYVLASHIISNSNLLFTSINQLEKGDVITLKDSEYSYQYTVYNNFIVSKDETWILNDIKDYSILTLYTCYDDSTKLPENRVVIRAVLTDIN
配列番号34-肺炎連鎖球菌ソルターゼBのポリペプチド配列
MAKTKKQKRNNLLLGVVFFIGXAVMAYPLVSRLYYRVESNQQIADFDKEKATLDEADIDERMKLAQAFNDSLNNVVSGDPWSEEMKKKGRAEYARMLEIHERMGHVEIPAIDVDLPVYAGTAEEVLQQGAGHLEGTSLPIGGNSTHAVITAHTGLPTAKMFTDLTKLKVGDKFYVHNIKEVMAYQVDQVKVIEPTNFDDLLIVPGHDYVTLLTCTPYMINTHRLLVRGHRIPYVAEVEEEFIAANKLSHLYRYLFYVAVGLIVILLWIIRRLRKKKRQSERALKALKEATKEVKVEDE
wherein X is Met or Ile.
配列番号35-肺炎連鎖球菌ソルターゼCのポリペプチド配列
MDNSRRSRKKGTKKKKHPLILLLIFLVGFAVAIYPLVSRYYYRIESNEVIKEFDETVSQMDKAELEERWRLAQAFNATLKPSEILDPFTEQEKKKGVSEYANMLKVHERIGYVEIPAIDQEIPMYVGTSEDILQKGAGLLEGASLPVGGKNTHTVITAHRGLPTAELFSQLDKMKKGDIFYLHVLDQVLAYQVDQIVTVEPNDFEPVLIQHGEDYATLLTCTPYMINSHRLLVRGKRIPYTAPIAERNRAVRERGQFWLWLLLGAMAVILLLLYRVYRNRRIVKGLEKQLEGRHVKD
配列番号36-肺炎連鎖球菌ソルターゼDのポリペプチド配列
MSRTKLRALLGYLLMLVACLIPIYCFGQMVLQSLGQVKGHATFVKSMTTEMYQEQQNHSLAYNQRLASQNRIVDPFLAEGYEVNYQVSDDPDAVYGYLSIPSLEIMEPVYLGADYHHLGMGLAHVDGTPLPMDGTGIRSVIAGHRAEPSHVFFRHLDQLKVGDALYYDNGQEIVEYQMMDTEIILPSEWEKLESVSSKNIMTLITCDPIPTFNKRLLVNFERVAVYQKSDPQTAAVARVAFTKEGQSVSRVATSQWLYRGLVVLAFLGILFVLWKLARLLRGK
配列番号37-化膿連鎖球菌ソルターゼAのポリペプチド配列
MVKKQKRRKIKSMSWARKLLIAVLLILGLALLFNKPIRNTLIARNSNKYQVTKVSKKQIKKNKEAKSTFDFQAVEPVSTESVLQAQMAAQQLPVIGGIAIPELGINLPIFKGLGNTELIYGAGTMKEEQVMGGENNYSLASHHIFGITGSSQMLFSPLERAQNGMSIYLTDKEKIYEYIIKDVFTVAPERVDVIDDTAGLKEVTLVTCTDIEATERIIVKGELKTEYDFDKAPADVLKAFNHSYNQVST
配列番号38-タンパク分解性に不活性な変異体BoNT/A(0)のポリペプチド配列
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
配列番号39-二重標識SrtA部位を有する全長のタンパク分解性に不活性な変異体BoNT/A(0)のヌクレオチド配列
ATGGAGAACCTGTATTTTCAGGGCGGCGGTGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCCCGTTTGTGAACAAGCAGTTCAACTATAAAGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAAAGCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACACCAGCTGATTTATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCCATTAATCCGAATCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCCTATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGAGTTTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTTCGTGGCATTATTACCAGCAAAACCAAAAGTCTGGATAAAGGCTACAATAAAGCCCTGAATGATCTGTGCATTAAGGTGAATAATTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAGGATAATTTCACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTCGATAATGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCACTGACCAATAGCGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTTAACAAAGCAACCGAAGCAGCCATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTTTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATTACCATCATCATCCCGTATATCGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATTTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTGAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATCGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTGTACAAGTATATCGTGACCAATTGGCTGGCAAAAGTTAACACCCAGATTGACCTGATTCGCAAGAAGATGAAAGAAGCACTGGAAAATCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATCAACTATCAGTATAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAAAATAACATCAACTTCAACATCGACGATCTGTCCAGCAAACTGAACGAAAGCATCAACAAAGCCATGATTAACATTAACAAATTTCTGAACCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGTCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCCCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGTCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTGAACAACACCCTGAGTACCGATATTCCTTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGTCTGCTGTCAACCTTTACCGAATACATTAAGAACATCATCAACACCAGCATTCTGAACCTGCGTTATGAAAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCCAGCAAAATCAATATAGGCAGCAAGGTTAACTTCGACCCGATTGACAAAAATCAGATACAGCTGTTTAATCTGGAAAGCAGCAAAATTGAGGTGATCCTGAAAAACGCCATTGTGTATAATAGCATGTACGAGAATTTCTCGACCAGCTTTTGGATTCGTATCCCGAAATACTTTAATAGCATCAGCCTGAACAACGAGTACACCATTATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGCTGGAAAGTTAGCCTGAATTATGGCGAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCCAAGAAATCAAACAGCGTGTGGTTTTCAAATACAGCCAGATGATTAATATCAGCGACTATATCAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAATAATCGCCTGAATAACAGCAAGATCTATATTAACGGTCGTCTGATTGACCAGAAACCGATTAGTAATCTGGGTAATATTCATGCGAGCAACAACATCATGTTTAAACTGGATGGTTGTCGTGATACCCATCGTTATATTTGGATCAAGTACTTCAACCTGTTCGATAAAGAGTTGAACGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTATGATAACCAGAGCAACAGCGGTATTCTGAAGGATTTTTGGGGAGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAATCTGTACGACCCGAATAAATACGTGGATGTGAATAATGTTGGCATCCGTGGTTATATGTACCTGAAAGGTCCGCGTGGTAGCGTTATGACCACAAACATTTATCTGAATAGCAGCCTGTATCGCGGAACCAAATTCATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAGGATAATATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTACATTAACGTTGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGTGCCCTGGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTGATGAAAAGCAAAAATGATCAGGGCATCACCAACAAGTGCAAAATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAACGATATTGGTTTTATTGGCTTCCACCAGTTCAACAATATTGCGAAACTGGTTGCAAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGAACGTAGCAGTCGTACCCTGGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCTGTGGATGATGGTTGGGGTGAACGTCCGCTGGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCCTGCCCGAAAGCGGTGGCGGATCTGCTTGGTCTCACCCGCAGTTCGAAAAAGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGCTTGGTCTCACCCGCAGTTCGAAAAATAATGA
配列番号40-二重標識SrtA部位を有する全長のタンパク分解性に不活性な変異体BoNT/A(0)のポリペプチド配列
MENLYFQGGGGSGGSGGSPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLGGSGGGSGLPESGGGSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK
配列番号41-Prochloron didemni PATGのポリペプチド配列
MFSIMITIDYPFTVSLNRDIQVTSTEDYYTLQVTESDPSAWLTFATTPAMDMAFDHLKAGTTTESLVQTLAELGGPAAREQFALTLQQLDERGWLSYAVLPLAEAIPMVESAELNLPGNPHWMETGVTLSRFAYQHPYEGTMVLESPLSKFRVKLLDWRASALLAQLAQPQTLGTIAPPPYLGPETAYQFLNLLWATGFLASDHEPVSLQLWDFHNLLFHSRSRLGRHDYPGTDLNVDNWSDFPVVKPPMSDRIVPLPRPNLEALMSNDATLTEAIETRKSVREYDDDNPITIEQLGELLYRAARVTKLLSPEERFGKLWQQNKPVFEEAGVDEGEFSHRPYPGGGAMYELEIYPVVRLCQGLSQGVYHYDPLNHQLEQIVESKDDIFAVSGSPLASKLGPHVLLVITARFGRLFRLYRSVAYALVLKHVGVLQQNLYLVATNMGLAPCAGGAGDSDAFAQVTGIDYVEESAVGEFILGSLASEVESDVVEGEDEIESAGVSASEVESSATKQKVALHPHDLDERIPGLADLHNQTLGDPQITIVIIDGDPDYTLSCFEGAEVSKVFPYWHEPAEPITPEDYAAFQSIRDQGLKGKEKEEALEAVIPDTKDRIVLNDHACHVTSTIVGQEHSPVFGIAPNCRVINMPQDAVIRGNYDDVMSPLNLARAIDLALELGANIIHCAFCRPTQTSEGEEILVQAIKKCQDNNVLIVSPTGNNSNESWCLPAVLPGTLAVGAAKVDGTPCHFSNWGGNNTKEGILAPGEEILGAQPCTEEPVRLTGTSMAAPVMTGISALLMSLQVQQGKPVDAEAVRTALLKTAIPCDPEVVEEPERCLRGFVNIPGAMKVLFGQPSVTVSFAGGQATRTEHPGYATVAPASIPEPMAERATPAVQAATATEMVIAPSTEPANPATVEASTAFSGNVYALGTIGYDFGDEARRDTFKERMADPYDARQMVDYLDRNPDEARSLIWTLNLEGDVIYALDPKGPFATNVYEIFLQMLAGQLEPETSADFIERLSVPARRTTRTVELFSGEVMPVVNVRDPRGMYGWNVNALVDAALATVEYEEADEDSLRQGLTAFLNRVYHDLHNLGQTSRDRALNFTVTNTFQAASTFAQAIASGRQLDTIEVNKSPYCRLNSDCWDVLLTFYDPEHGRRSRRVFRFTLDVVYVLPVTVGSIKSWSLPGKGTVSK
配列番号42-Saponaria vaccaria PCY1のポリペプチド配列
MATSGFSKPLHYPPVRRDETVVDDYFGVKVADPYRWLEDPNSEETKEFVDNQEKLANSVLEECELIDKFKQKIIDFVNFPRCGVPFRRANKYFHFYNSGLQAQNVFQMQDDLDGKPEVLYDPNLREGGRSGLSLYSVSEDAKYFAFGIHSGLTEWVTIKILKTEDRSYLPDTLEWVKFSPAIWTHDNKGFFYCPYPPLKEGEDHMTRSAVNQEARYHFLGTDQSEDILLWRDLENPAHHLKCQITDDGKYFLLYILDGCDDANKVYCLDLTKLPNGLESFRGREDSAPFMKLIDSFDASY
TAIANDGSVFTFQTNKDAPRKKLVRVDLNNPSVWTDLVPESKKDLLESAHAVNENQLILRYLSDVKHVLEIRDLESGALQHRLPIDIGSVDGITARRRDSVVFFKFTSILTPGIVYQCDLKNDPTQLKIFRESVVPDFDRSEFEVKQVFVPSKDGTKIPIFIAARKGISLDGSHPCEMHGYGGFGINMMPTFSASRIVFLKHLGGVFCLANIRGGGEYGEEWHKAGFRDKKQNVFDDFISAAEYLISSGYTKARRVAIEGGSNGGLLVAACINQRPDLFGCAEANCGVMDMLRFHKFTLG
YLWTGDYGCSDKEEEFKWLIKYSPIHNVRRPWEQPGNEETQYPATMILTADHDDRVVPLHSFKLLATMQHVLCTSLEDSPQKNPIIARIQRKAAHYGRATMTQIAEVADRYGFMAKALEAPWID
配列番号43-Galerina marginata POPBのポリペプチド配列
MSSVTWAPGNYPSTRRSDHVDTYQSASKGEVPVPDPYQWLEESTDEVDKWTTAQADLAQSYLDQNADIQKLAEKFRASRNYAKFSAPTLLDDGHWYWFYNRGLQSQSVLYRSKEPALPDFSKGDDNVGDVFFDPNVLAADGSAGMVLCKFSPDGKFFAYAVSHLGGDYSTIYVRSTSSPLSQASVAQGVDGRLSDEVKWFKFSTIIWTKDSKGFLYQRYPARERHEGTRSDRNAMMCYHKVGTTQEEDIIVYQDNEHPEWIYGADTSEDGKYLYLYQFKDTSKKNLLWVAELDEDGVKSGIHWRKVVNEYAADYNIITNHGSLVYIKTNLNAPQYKVITIDLSKDEPEIRDFIPEEKDAKLAQVNCANEEYFVAIYKRNVKDEIYLYSKAGVQLTRLAPDFVGAASIANRQKQTHFFLTLSGFNTPGTIARYDFTAPETQRFSILRTTKVNELDPDDFESTQVWYESKDGTKIPMFIVRHKSTKFDGTAAAIQYGYGGFATSADPFFSPIILTFLQTYGAIFAVPSIRGGGEFGEEWHKGGRRETKVNTFDDFIAAAQFLVKNKYAAPGKVAINGASNGGLLVMGSIVRAPEGTFGAAVPEGGVADLLKFHKFTGGQAWISEYGNPSIPEEFDYIYPLSPVHNVRTDKVMPATLITVNIGDGRVVPMHSFKFIATLQHNVPQNPHPLLIKIDKSWLGHGMGKPTDKNVKDAADKWGFIARALGLELKTVE
配列番号44-Oldenlandia affinisブテラーゼホモログOaAEP1bのポリペプチド配列(シグナルペプチドあり)
MVRYLAGAVLLLVVLSVAAAVSGARDGDYLHLPSEVSRFFRPQETNDDHGEDSVGTRWAVLIAGSKGYANYRHQAGVCHAYQILKRGGLKDENIVVFMYDDIAYNESNPRPGVIINSPHGSDVYAGVPKDYTGEEVNAKNFLAAILGNKS AITGGSGKVVDSGPNDHIFIYYTDHGAAGVIGMPSKPYLYADELNDALKKKHASGTYKSLVFYLEACESGSMFEGILPEDLNIYALTSTNTTESSWCYYCPAQENPPPPEYNVCLGDLFSVAWLEDSDVQNSWYETLNQQYHHVDKRISH
ASHATQYGNLKLGEEGLFVYMGSNPANDNYTSLDGNALTPSSIVVNQRDADLLHLWEKFRKAPEGSARKEVAQTQIFKAMSHRVHIDSSIKLIGKLLFGIEKCTEILNAVRPAGQPLVDDWACLRSLVGTFETHCGSLSEYGMRHTRTIA NICNAGISEEQMAEAASQACASIP
配列番号45-Oldenlandia affinisブテラーゼホモログOaAEP1bのポリペプチド配列(シグナルペプチドなし)
ARDGDYLHLPSEVSRFFRPQETNDDHGEDSVGTRWAVLIAGSKGYANYRHQAGVCHAYQILKRGGLKDENIVVFMYDDIAYNESNPRPGVIINSPHGSDVYAGVPKDYTGEEVNAKNFLAAILGNKSAITGGSGKVVDSGPNDHIFIYYTDHGAAGVIGMPSKPYLYADELNDALKKKHASGTYKSLVFYLEACESGSMFEGILPEDLNIYALTSTNTTESSWCYYCPAQENPPPPEYNVCLGDLFSVAWLEDSDVQNSWYETLNQQYHHVDKRISHASHATQYGNLKLGEEGLFVYMGSNPANDNYTSLDGNALTPSSIVVNQRDADLLHLWEKFRKAPEGSARKEVAQTQIFKAMSHRVHIDSSIKLIGKLLFGIEKCTEILNAVRPAGQPLVDDWACLRSLVGTFETHCGSLSEYGMRHTRTIANICNAGISEEQMAEAASQACASIP
実施例1
Texas Red、eGFP、SNAP、及びSrtA媒介単一及び二重標識EGFリガンド結合ポリペプチドの設計
ポリペプチドを標識するために幾つかの戦略を試みた。目的は、構造的特徴及び細胞への輸送及びSNAREタンパク質を効果的に且つ非標識バージョンと同様の方法で切断する能力に影響を及ぼさないポリペプチドの標識バージョンを得ることであった。
EGFリガンド結合ポリペプチドの4つの異なる標識戦略(Fonfria, E., S. Donald and V. A. Cadd (2016). "Botulinum neurotoxin A and an engineered derivate targeted secretion inhibitor (TSI) A enter cells via different vesicular compartments." J Recept Signal Transduct Res 36(1): 79-88)を試みた。クローニング後、必要な場合、ポリペプチドは、以前に公開されたように、標準的な手順を使用して組換え発現及び精製した(Masuyer, G., M. Beard, V. A. Cadd, J. A. Chaddock and K. R. Acharya (2011). "Structure and activity of a functional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B." J Struct Biol 174(1): 52-57、Somm, E., N. Bonnet, A. Martinez, P. M. Marks, V. A. Cadd, M. Elliott, A. Toulotte, S. L. Ferrari, R. Rizzoli, P. S. Huppi, E. Harper, S. Melmed, R. Jones and M. L. Aubert (2012). "A botulinum toxin-derived targeted secretion inhibitor downregulates the GH/IGF1 axis." J Clin Invest 122(9): 3295-3306)。簡単に説明すると、ポリペプチドは、大腸菌コンピテントバクテリアにおいて組換え発現させた。発現したポリペプチドは、アフィニティカラム、その後、陰イオン交換クロマトグラフィ、二本鎖複合体を生成する酵素活性化、最後に疎水性相互作用を用いた研磨ステップにより精製した。
1. 上記のように精製した未修飾のEGFリガンド結合ポリペプチドは、Texas Red -X Protein Labeling Kit(Thermo Fisher Scientific)を使用して、製造元のプロトコルに従って標識した。タンパク質の標識の成功は、共焦点顕微鏡とライブイメージングにより確認した。標識に使用したポリペプチドのヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号5及び6として示している。
2. EGFリガンド結合ポリペプチドは、標準的なクローニング手順により、N末端において、増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)でタグ付けした。ヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号9及び10として示している。タンパク質の発現及び精製を上に示したように実施した。発現後、eGFPタグ付きEGFリガンド結合ポリペプチドの精製の試みは失敗した。
3. EGFリガンド結合ポリペプチドは、標準的なクローニング手順により、N末端において、SNAPタグ基質(New England Biolabs)でタグ付けした。ヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号11及び12として示している。このタンパク質の発現と精製は、成功した。SNAPタグ付きEGFリガンド結合ポリペプチドの標識は、SNAP-Surface594蛍光基質(New England Biolabs)を使用して、製造元のプロトコルに従って実行した。タンパク質の標識の成功は、共焦点顕微鏡とライブイメージングにより確認した。
4. 部位特異的標識のための非天然アミノ酸を含むポリペプチドを生成する試みもなされた。しかしながら、これらの試みは、発現及び/又は精製の困難であるため失敗した。
5. EGFリガンド結合ポリペプチド(即ち、EGF TMを有するポリペプチド)は、2つの異なるソルターゼA(SrtA)認識部位により、1つはN末端、1つはC末端においてタグ付けした。SrtAの使用により、同じタンパク質上に異なる色の2つのフルオロフォアを結合させることが可能となった。ポリペプチドは、図1に示すように構築した。SrtAの2つの変異バージョン(Dorr, B. M., H. O. Ham, C. An, E. L. Chaikof and D. R. Liu (2014). "Reprogramming the specificity of sortase enzymes." Proc Natl Acad Sci U S A 111(37): 13343-13348)を選択した(配列番号14及び16)。これらは、それぞれの認識部位に100%特異的であることが明らかとなっている。EGFリガンド結合ポリペプチドは、C末端において、第1のSrtAのLPESG認識部位、続いてタンパク質の最初の親和性媒介精製を可能にする二重StrepTag認識部位(IBA-lifesciences)でクローニングした。ヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号1及び2として示されている。これとは別に、選択したフルオロフォアにコンジュゲートした一続きのグリシン残基を含むペプチドを取得した(Eurogentec)。このペプチドの配列は、GGGGK(HF488)(配列番号29)となった。SrtA媒介反応中に、LPESG部位のグリシンが、SrtA(配列番号14)により切断され、蛍光ペプチド上に存在する一続きのグリシンがSrtAにより認識され、ポリペプチドとペプチドとの間の結合を媒介するために使用された。これにより、蛍光による単一標識のEGFリガンド結合ポリペプチドが生成された。標識ポリペプチドは、もはやStrepTagを有しておらず、逆親和性媒介精製ステップを用いて、ポリペプチドの標識部分が選択されたという事実に留意されたい。EGFリガンド結合ポリペプチドを二重標識するために、一続きの3個のグリシン残基が、開始コドン及びタバコエッチ病ウイルス(TEV)切断認識部位に続くポリペプチドのN末端部位においてクローニングした。TEV部位は、上述した最初のC末端SrtA反応中に一続きのグリシン残基をタンパク質の環状化から保護するために導入した。これとは別に、選択したフルオロフォアにコンジュゲートしたLAETG認識部位を含むペプチドを取得した(Eurogentec)。このペプチドの配列は、HiLyteFluorTM 555-HHHHHHLAETGGG(配列番号30)となった。加えて、SrtA反応後のタンパク質精製を容易にするために、6His-Tag(6HT)をLAETG部位の前に位置づけした(配列番号16)。SrtA反応は、C末端部位と同様に実施し、最終的な二重標識EGFリガンド結合タンパク質は、Hisアフィニティ精製ステップを用いて精製した。タンパク質の単一及び二重標識の成功は、SDS-PAGEゲル電気泳動、共焦点顕微鏡、及びライブイメージングにより確認した。
C末端Hisタグを有するソルターゼA(SrtA)タンパク質は、コンピテント大腸菌において発現させ、アフィニティキャプチャカラムを用いて精製した。
ポリペプチド及び蛍光ペプチドのソルターゼの結合は、それぞれ1対2対20当量のポリペプチド対SrtA対蛍光ペプチドの比率を用いて4℃で一晩行った。
本実施例では、EGFリガンド結合ポリペプチドは、C末端トランスロケーションリガンド部分で、HiLyte555フルオロフォアと、N末端軽鎖部分でHiLyte488フルオロフォアと、結合された。SrtA認識部位及びSrtAの2つの多様体を含むポリペプチドの発現は、成功した。有利なことに、2つの異なる色のフルオロフォアにより標識可能なポリペプチドを生成することにより、タンパク質の軽鎖(無細胞毒性プロテアーゼを含む)及びトランスロケーションリガンド部分の両方の輸送機構を視覚化することができた。
実施例2
SrtA媒介二重標識ノシセプチンリガンド結合ポリペプチドの設計
ノシセプチンリガンドTMを有するポリペプチド(ノシセプチンリガンド結合ポリペプチド)は、EGFリガンド結合ポリペプチドに使用した戦略を用いて、二重蛍光標識のために生成した。このポリペプチドの二重標識に使用した設計、精製、及び蛍光ペプチドは、EGFリガンド結合ポリペプチドの場合と全く同じとした。ポリペプチドの二重標識の成功は、SDS-PAGEゲル電気泳動、共焦点顕微鏡、及びライブイメージングにより確認した。ソルターゼ部位を含むポリペプチドのヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号3及び4として示している。
SNAP25切断アッセイを使用した標識タンパク質の検証
リガンド結合ポリペプチドの標識が、それぞれの受容体への結合、細胞への輸送、及びトランスロケーションの能力に影響を及ぼさないことを確定するために、SNAP25切断アッセイを実施して、非標識バージョンと比較した標識ポリペプチドの相対的効力を決定した。同様の効力プロファイルは、標識ポリペプチドが非標識バージョンと同様に輸送されることを示唆することになる。SNAP25切断アッセイは、以前の記述の通りに実行した(Fonfria, E., S. Donald and V. A. Cadd (2016). "Botulinum neurotoxin A and an engineered derivate targeted secretion inhibitor (TSI) A enter cells via different vesicular compartments." J Recept Signal Transduct Res 36(1): 79-88)。簡単に説明すると、皮質ニューロンを3乃至1000nMの各標識及び非標識タンパク質で24時間処理した。処理後、0.1Mジチオスレイトール及び250単位/mlベンゾナーゼ(Sigma)を添加したNuPAGE溶解バッファ(Thermo Fischer Scientific)において細胞を回収した。溶解物をSDS-PAGEで分離し、SNAP-25(Sigma)に対する一次抗体を用いてウエスタンブロッティングを施した。これらの抗体は、SNAP25の切断及び非切断部分の両方の認識を可能にする。相対的な効力は、切断されたSNAP25と切断されていないSNAP25との比率により決定した(図2)。図2Aは、EGFリガンド結合ポリペプチドの用量反応効力を示している。非標識ポリペプチドと比較して、テキサスレッド及びSNAP594標識バージョンは、非リガンド結合対照ポリペプチドと同様の値で効力の強い低下を示した。対照的に、SrtA媒介単一及び二重標識ポリペプチドは、非標識バージョンと同様の効力を示し、この標識戦略がタンパク質構成及びその細胞輸送機構に影響を与えないことを実証した。同様に、ノシセプチンリガンド結合ポリペプチドの二重標識は、非標識対照ポリペプチドと比較して、皮質ニューロンにおけるその効力に影響しなかった(図2B)。
要約すると、Texas Red色素及びSNAPタグ、部位特異的バージョンを使用した非部位特異的標識等の直接的なタグ付け手法を最初に試行した。しかしながら、これらの標識戦略は成功したが、標識されていない対応物と比較して、ポリペプチドの効力に影響することが明らかとなり、テキサスレッド又はSNAPタグの場合、幾つかの蛍光分子の添加が標識ポリペプチドの輸送特性に影響したことが示唆された。eGFPタグ付きEGFリガンド結合ポリペプチドを生成する試みは、タグ付きタンパク質が発現せず失敗した。全く対照的に、SNAP25切断アッセイでは、EGFリガンド結合及びノシセプチンリガンド結合ポリペプチドへの2つのフルオロフォアの添加が、それらの効力に影響しなかったことが確認され、標識ポリペプチドの作用機構が、それらの非標識対応物と類似していることが示唆された。SNAP及びTexasRedの標識が効力に悪影響を及ぼしたことを考えると、これは驚くべきことだった。
実施例3
不死化細胞株における二重標識EGFリガンド結合ポリペプチドの可視化
二重標識SrtA媒介手法は、本発明のポリペプチドの標識のための最適な戦略として選択された。哺乳類細胞において標識ポリペプチドを視覚化するために、3Dライブ共焦点顕微鏡法を実施した。ヒト肺腺癌肺細胞(A549)を50nMの二重標識EGFリガンド結合ポリペプチドにより処理し、AiryScan(Zeiss)を備えたZeiss880共焦点顕微鏡を用いて経時的に連続して画像化した。これらの実験では、EGFリガンド結合ポリペプチドは、N末端をHiLyte555フルオロフォア(AnaSpec)、C末端をHiLyte488フルオロフォア(AnaSpec)により標識した。図3は、A549細胞でのインターナリゼーション中にEGFリガンド結合ポリペプチドにより形成された2色の凝集体のスナップショット画像を示している。図3Aから、細胞へのポリペプチド添加の3分後に凝集体が現れ、そのサイズ及び量が経時的に増加したことが分かる。図3Bには、蛍光凝集体の消失が経時的に示され、ポリペプチド添加の65分後に完全に消失する。
二重標識EGFリガンド結合ポリペプチドを用いて実行されたライブイメージングにより、標識手法と、標識ポリペプチドの生のインターナリゼーション及び輸送を監視する能力が明確に検証された。
ソルターゼ標識が有利であり、効力に影響を与えないことを実証されたことから、BoNT血清型(及び誘導体)を含む他のクロストリジウム神経毒にこれを応用することができる。
実施例4
SrtA媒介二重標識BoNT/Aポリペプチドの設計
タンパク分解性に不活性な全長変異体BoNT/A(0)(配列番号38)を修飾し、ソルターゼを使用した二重蛍光標識を可能にした(図4を参照)。二重標識ポリペプチド配列は、配列番号40として示しており、一方、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号39として示している。配列番号40の二重標識に使用した設計、精製及び蛍光ペプチドは、実施例1のEGFリガンド結合ポリペプチドの場合と同じとした。ポリペプチドの二重標識の成功は、SDS-PAGEにより確認した(図5)。より詳細には、クーマシー染色を用いることで、ポリペプチドのL鎖及びH鎖ドメインを表す両方のバンドを視覚化することができ、一方、ゲルをUV光に曝露することで、L鎖及びH鎖両方の標識の成功が(蛍光により)実証された。
実施例5
一次皮質ニューロンにおける単一標識BoNT/A(0)ポリペプチドの可視化
一次神経細胞において標識BoNT/A(0)ポリペプチドを視覚化するために、これにより処理したニューロンにおいて、単一分子ライブTIRF顕微鏡検査を実施した。一次皮質ニューロンは、1nMの単一標識BoNT/A(0)ポリペプチドにより処理し、特注の単一分子TIRF顕微鏡を用いて経時的に連続して画像化した。これらの実験では、BoNT/A(0)ポリペプチドは、N末端をHiLyte555又はHiLyte488フルオロフォア(AnaSpec)により標識した。図6は、一次皮質ニューロンに輸送中のBoNT/A(0)の単色分子のタイムラプス画像を示す。図6から、単一のBoNT/A(0)分子(白い矢印)が、選択したニューロン領域内を急速に移動することが分かる。単一標識BoNT/A(0)ポリペプチドの単一分子ライブTIRFイメージングは、ニューロンへのBoNT/A(0)単一分子の輸送を特殊な高解像度顕微鏡手法により視覚化できることを明確に示している。
BoNT/A(0)の単一標識を一次ニューロンの単一分子レベルで視覚化できることが実証されたことから、無細胞毒性プロテアーゼ活性を有するものを含め、他のクロストリジウム神経毒血清型及び誘導体に、この方法を応用可能することができる。
上記明細書において言及した全ての文書は、出典を明記することにより本願明細書の一部とする。本発明の記載された方法及びシステムの様々な変形及び変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかとなろう。本発明を、特定の好適な実施形態に関連して説明してきたが、請求項に係る発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、生化学及び生命工学又は関連分野の当業者には明らかである、記載された本発明を実施するための形態の様々な変形は、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。
[図1]
Fluorescent Dye: 蛍光色素
Spacer: スペーサ
Ligand: リガンド
Purification: 精製
[図2]
EGF-liganded Polypeptide: EGFリガンド結合ポリペプチド
%SNAP25 Cleavage: SNAP25切断百分率
Polypeptide: ポリペプチド
Unlabelled: 非標識
single labelled SrtA-mediated: 単一標識SrtA媒介
dual labelled SrtA-mediated: 二重標識SrtA媒介
unliganded: 非リガンド結合
Nociceptin-liganded Polypeptide: ノシセプチンリガンド結合ポリペプチド
[図4]
Fluorescent Dye: 蛍光色素
Purification: 精製
[図5]
Fluorescence: 蛍光
Coomassie: クーマシー

Claims (65)

  1. 標識ポリペプチドを調製する方法であって、以下を含む方法:
    a.以下を含むポリペプチドを提供すること:
    i.ソルターゼアクセプタ部位又はソルターゼドナー部位、
    ii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体、
    iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)、及び
    iv.トランスロケーションドメイン、
    b.前記ポリペプチドを以下とインキュベートすること:
    ソルターゼ、及び
    ソルターゼドナー部位又はソルターゼアクセプタ部位それぞれ及び結合した検出可能な標識を含む標識基質、
    ここで、前記ソルターゼは、前記標識基質の前記ソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸と前記ソルターゼドナー部位のアミノ酸との間の結合、又は
    前記標識基質の前記ソルターゼアクセプタ部位のアミノ酸と前記ポリペプチドの前記ソルターゼドナー部位のアミノ酸との結合、を触媒し、
    これにより前記ポリペプチドを標識する、及び
    c.標識ポリペプチドを取得すること。
  2. ソルターゼを用いて標識するためのポリペプチドであって、
    i.ソルターゼアクセプタ又はドナー部位と、
    ii.標的細胞内の開口放出融合機構のタンパク質を切断することが可能な無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
    iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
    iv.前記無細胞毒性プロテアーゼを、エンドソーム内からエンドソーム膜を越えて前記標的細胞のサイトゾルにトランスロケートさせることが可能なトランスロケーションドメインと、を含み、
    前記ポリペプチドがソルターゼドナー部位を含む場合、前記ソルターゼドナー部位は、前記ポリペプチドのN末端に位置し、前記ソルターゼドナー部位がGn又はAnを含む場合、nは、少なくとも2であり、
    前記ドナー部位のN末端残基は、前記ポリペプチドのN末端残基であり、又は
    前記ポリペプチドは、前記ソルターゼドナー部位に対してN末端側にある1つ以上のアミノ酸残基と、切断時に前記ソルターゼドナー部位のN末端を露出させる切断可能部位とを含む、ポリペプチド。
  3. 前記ソルターゼアクセプタ又はドナー部位は、前記TMのC末端側に位置するか、又は前記ソルターゼアクセプタ又はドナー部位は、前記無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体のN末端側に位置する、請求項1記載の方法又は請求項2記載のポリペプチド。
  4. 前記ソルターゼアクセプタ部位は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)(G/A)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)を含み(又は、これらからなり)、前記ソルターゼドナー部位は、Gn又はAn(nは少なくとも1)を含む、先行請求項の何れかに記載の方法又はポリペプチド。
  5. 前記ソルターゼアクセプタ部位は、L(A/P/S)X(T/S/A/C)G(Xは任意のアミノ酸)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、又はLPXTGS(Xは任意のアミノ酸)を含み(又は、これらからなり)、前記ソルターゼドナー部位は、Gn(nは少なくとも1)を含む、先行請求項の何れかに記載の方法又はポリペプチド。
  6. 前記ソルターゼは、ソルターゼA(SrtA)である、先行請求項の何れかに記載の方法又はポリペプチド。
  7. 前記ポリペプチドは、少なくとも2つのソルターゼアクセプタ部位、少なくとも2つのソルターゼドナー部位、又は少なくとも1つのソルターゼアクセプタ部位及び少なくとも1つのソルターゼドナー部位を含む、先行請求項の何れかに記載の方法又はポリペプチド。
  8. 前記少なくとも2つの部位は異なり、好ましくは前記少なくとも2つの部位は異なるアミノ酸配列を有する、請求項7記載の方法又はポリペプチド。
  9. 第1のソルターゼアクセプタ又はドナー部位は、前記TMのC末端側に位置し、第2のソルターゼアクセプタ又はドナー部位は、前記無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体のN末端側に位置し、又は
    第1のソルターゼアクセプタ又はドナー部位は、前記無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体のN末端側に位置し、第2のソルターゼアクセプタ又はドナー部位は、前記TMのC末端側に位置する、請求項7又は8記載の方法又はポリペプチド。
  10. 前記ポリペプチドは、配列番号2、4、又は40に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、先行請求項の何れかに記載の方法又はポリペプチド。
  11. 前記ポリペプチドは、配列番号2、4、又は40に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、先行請求項の何れかに記載の方法又はポリペプチド。
  12. 前記ポリペプチドは、配列番号2、4、又は40に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、先行請求項の何れかに記載の方法又はポリペプチド。
  13. 前記ポリペプチドは、配列番号2、4、又は40として示したポリペプチド配列を含む(好ましくは、これからなる)、先行請求項の何れかに記載の方法又はポリペプチド。
  14. 標識ポリペプチドであって、
    i.前記ポリペプチドに結合した検出可能な標識と、
    ii.L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG(Xは任意のアミノ酸)、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、を含むアミノ酸配列と、
    iii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
    iv.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
    v.トランスロケーションドメインと、を含むポリペプチド。
  15. L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX、NPX1TX2、X1PX2X3G、LPEX1G、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)を含む前記アミノ酸配列は、前記TMのC末端側に位置し、又はL(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX、NPX1TX2、X1PX2X3G、LPEX1G、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG、LRXTGn、又はLPAXGn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)を含む前記アミノ酸配列は、前記無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体のN末端側に位置する、請求項14記載の標識ポリペプチド。
  16. 更に、ポリペプチドに結合した他の検出可能な標識と、L(A/P/S)X(T/S/A/C)Gn(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、L(A/P/S)X(T/S/A/C)An(Xは任意のアミノ酸、nは少なくとも1)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG、LPXTGS(Xは任意のアミノ酸)、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX、NPX1TX2、X1PX2X3G、LPEX1G、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG、LRXTGn、又はLPAXGnを含む他のアミノ酸配列を含む、請求項14又は15記載の標識ポリペプチド。
  17. 前記(第1の)アミノ酸配列は、前記他の(第2の)アミノ酸配列とは異なる、請求項16記載の標識ポリペプチド。
  18. 前記(第1の)アミノ酸配列は、前記TMのC末端側に位置し、前記他の(第2の)アミノ酸配列は、前記無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体のN末端側に位置し、又は
    前記(第1の)アミノ酸配列は、前記無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体のN末端側に位置し、前記他の(第2の)アミノ酸配列は、前記TMのC末端側に位置する、請求項16又は17記載の標識ポリペプチド。
  19. 前記ポリペプチドは、配列番号2、4、26、又は40に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項14乃至18の何れかに記載の標識ポリペプチド。
  20. 前記ポリペプチドは、配列番号2、4、26、又は40に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項14乃至19の何れかに記載の標識ポリペプチド。
  21. 前記ポリペプチドは、配列番号2、4、26、又は40に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項14乃至20の何れかに記載の標識ポリペプチド。
  22. 前記ポリペプチドは、配列番号26として示したポリペプチド配列を含む(好ましくは、これからなる)、請求項14乃至21の何れかに記載の標識ポリペプチド。
  23. 前記無細胞毒性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒L鎖を含む、先行請求項の何れかに記載の方法、ポリペプチド、又は標識ポリペプチド。
  24. 前記トランスロケーションドメインは、クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインを含む、先行請求項の何れかに記載の方法、ポリペプチド、又は標識ポリペプチド。
  25. 前記ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒の機能HCドメインが欠如している、先行請求項の何れかに記載の方法、ポリペプチド、又は標識ポリペプチド。
  26. 前記TMは、クロストリジウム神経毒HCペプチドである、請求項1乃至24の何れかに記載の方法、ポリペプチド、又は標識ポリペプチド。
  27. 前記ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒である、請求項1乃至24又は26の何れかに記載の方法、ポリペプチド、又は標識ポリペプチド。
  28. 前記ポリペプチドは、ボツリヌス神経毒(BoNT)である、請求項1乃至24又は26乃至27の何れかに記載の方法、ポリペプチド又は標識ポリペプチド。
  29. 前記ポリペプチドは、ボツリヌス神経毒L鎖又はそのタンパク分解性に不活性な変異体を含む、先行請求項の何れかに記載の方法、ポリペプチド、又は標識ポリペプチド。
  30. 前記ポリペプチドは、ボツリヌス神経毒H鎖を含む、請求項1乃至24又は26乃至29の何れかに記載の方法、ポリペプチド、又は標識ポリペプチド。
  31. 前記ポリペプチドは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、又はTeNTから選択される、請求項1乃至24又は26乃至30の何れかに記載の方法、ポリペプチド、又は標識ポリペプチド。
  32. 請求項1又は3乃至13又は23乃至31の何れかに記載の方法により得られる標識ポリペプチド。
  33. 同等の非標識ポリペプチドと比較した場合、前記標識ポリペプチドは、効力の低下を示さない、請求項1又は3乃至32の何れかに記載の方法又は標識ポリペプチド。
  34. 前記標識ポリペプチドは、同等の非標識ポリペプチドと比較した場合、同様の細胞結合、トランスロケーション、及びSNAREタンパク質切断を示す、請求項1又は3乃至33の何れかに記載の方法又は標識ポリペプチド。
  35. 前記標識ポリペプチドは、同等の非標識ポリペプチドと比較した場合、細胞結合、トランスロケーション、及び/又はSNAREタンパク質切断の改善を示す、請求項1又は3乃至34の何れかに記載の方法又は標識ポリペプチド。
  36. 前記標識ポリペプチドは、同等の非標識ポリペプチドと比較した場合、細胞結合、トランスロケーション、及びSNAREタンパク質切断の改善を示す、請求項1又は3乃至35の何れかに記載の方法又は標識ポリペプチド。
  37. ポリペプチドをアッセイする方法であって、
    a.請求項14乃至36の何れかに記載の標識ポリペプチドに標的細胞を接触させることと、
    b.前記検出可能な標識を検出することと、を含む方法:
  38. 請求項2乃至13又は23乃至31の何れかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
  39. 前記核酸は、配列番号1、3、又は39に対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項38記載の核酸。
  40. 前記核酸は、配列番号1、3、又は39に対して少なくとも80%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項38又は39記載の核酸。
  41. 前記核酸は、配列番号1、3、又は39に対して少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項38乃至40の何れかに記載の核酸。
  42. 前記核酸は、配列番号1、3、又は39として示した核酸配列を含む(好ましくは、これからなる)、請求項38乃至41の何れかに記載の核酸。
  43. ソルターゼを用いて標識するためのポリペプチドを製造する方法であって、以下を含む方法:
    a.以下を含むポリペプチドをコードする核酸配列を提供すること:
    i.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体、
    ii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)、及び
    iii.トランスロケーションドメイン、
    b.ソルターゼアクセプタ又はドナー部位を前記核酸に導入することにより、ソルターゼアクセプタ又はドナー部位を含むポリペプチドをコードする修飾核酸を生成すること、及び
    c.任意に、前記修飾核酸を宿主細胞において発現させること、及び
    d.任意に、塩基発現されたポリペプチドを取得すること。
  44. ステップaの前記核酸は、配列番号5又は7に対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項43記載の方法。
  45. ステップaの前記核酸は、配列番号5又は7に対して少なくとも80%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項43又は44記載の方法。
  46. ステップaの前記核酸は、配列番号5又は7に対して少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項43乃至45の何れかに記載の方法。
  47. ステップaの前記核酸は、配列番号5又は7として示した核酸配列を含む(好ましくは、これからなる)、請求項43乃至46の何れかに記載の方法。
  48. 前記修飾核酸は、配列番号1、3、又は39に対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項43乃至47の何れかに記載の方法。
  49. 前記修飾核酸は、配列番号1、3、又は39に対して少なくとも80%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項43乃至48の何れかに記載の方法。
  50. 前記修飾核酸は、配列番号1、3、又は39に対して少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項43乃至49の何れかに記載の方法。
  51. 前記修飾核酸は、配列番号1、3、又は39として示した核酸配列を含む(好ましくは、これからなる)、請求項43乃至50の何れかに記載の方法。
  52. 前記修飾核酸は、配列番号2、4、26、又は40に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを発現する、請求項43乃至51の何れかに記載の方法。
  53. 前記修飾核酸は、配列番号2、4、26、又は40に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを発現する、請求項43乃至52の何れかに記載の方法。
  54. 前記修飾核酸は、配列番号2、4、26、又は40に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを発現する、請求項43乃至53の何れかに記載の方法。
  55. 前記修飾核酸は、配列番号2、4、26、又は40として示したポリペプチド配列を含む(好ましくは、これからなる)ポリペプチドを発現する、請求項43乃至54の何れかに記載の方法。
  56. 標識ポリペプチドを調製する方法であって、以下を含む方法:
    a.以下を含むポリペプチドを提供すること:
    i.トランスペプチダーゼ若しくはリガーゼアクセプタ部位又はトランスペプチダーゼ若しくはリガーゼドナー部位、
    ii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体、
    iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)、及び
    iv.トランスロケーションドメイン、
    b.前記ポリペプチドを以下とインキュベートすること:
    トランスペプチダーゼ又はリガーゼ、及び
    トランスペプチダーゼ若しくはリガーゼドナー部位又はトランスペプチダーゼ若しくはリガーゼアクセプタ部位それぞれ及び結合した検出可能な標識を含む標識基質、
    ここで、前記トランスペプチダーゼ又はリガーゼは、前記標識基質の前記トランスペプチダーゼ又はリガーゼアクセプタ部位のアミノ酸と前記トランスペプチダーゼ又はリガーゼドナー部位のアミノ酸との間の結合、又は
    前記標識基質の前記トランスペプチダーゼ又はリガーゼアクセプタ部位のアミノ酸と前記ポリペプチドの前記トランスペプチダーゼ又はリガーゼドナー部位のアミノ酸との結合、を触媒し、
    これにより前記ポリペプチドを標識する、及び
    c.標識ポリペプチドを取得すること。
  57. 前記リガーゼは、ブテラーゼ、PATG、PCY1、又はPOPBである、請求項56記載の方法。
  58. 前記リガーゼは、ブテラーゼ、好ましくはブテラーゼ1である、請求項56又は57記載の方法。
  59. ブテラーゼを用いて標識するためのポリペプチドであって、
    i.ブテラーゼアクセプタ又はドナー部位と、
    ii.標的細胞内の開口放出融合機構のタンパク質を切断することが可能な無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
    iii.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
    iv.前記無細胞毒性プロテアーゼを、エンドソーム内からエンドソーム膜を越えて前記標的細胞のサイトゾルにトランスロケートさせることが可能なトランスロケーションドメインと、を含み、
    前記ポリペプチドがブテラーゼドナー部位を含む場合、前記ブテラーゼドナー部位は、前記ポリペプチドのN末端に位置し、、
    前記ドナー部位のN末端残基は、前記ポリペプチドのN末端残基であり、又は
    前記ポリペプチドは、前記ブテラーゼドナー部位に対してN末端側にある1つ以上のアミノ酸残基と、切断時に前記ブテラーゼドナー部位のN末端を露出させる切断可能部位とを含む、ポリペプチド。
  60. 標識ポリペプチドであって、
    i.前記ポリペプチドに結合した検出可能な標識と、
    ii.Asn/Asp-Xaa-(Ile/Leu/Val/Cys)(Xaaはプロリン以外の任意のアミノ酸)を含むアミノ酸配列と、
    iii.無細胞毒性プロテアーゼ又はそのタンパク分解性に不活性な変異体と、
    iv.標的細胞上の結合部位に結合可能な標的部分(TM)と、
    v.トランスロケーションドメインと、を含むポリペプチド。
  61. 前記検出可能な標識は、フルオロフォアである、請求項1乃至37又は43乃至60の何れかに記載の方法、ポリペプチド、又は標識ポリペプチド。
  62. 前記フルオロフォアは、HiLyte、AlexaFluor、Atto、Quantum Dots、及びJanelia Fluorから選択される、請求項61記載の方法、ポリペプチド、又は標識ポリペプチド。
  63. 前記標識ポリペプチドは、2つ以上の検出可能な標識を含む、請求項1、3乃至37、43乃至58、又は60乃至62の何れかに記載の方法又は標識ポリペプチド。
  64. 前記2つ以上の検出可能な標識は、異なるフルオロフォアである、請求項63記載の方法又は標識ポリペプチド。
  65. 前記ソルターゼアクセプタ部位は、NPKTG、XPETG、LGATG、IPNTG、IPETG、NSKTA、NPQTG、NAKTN、NPQSS、LPXTX(Xは任意のアミノ酸)、NPX1TX2(X1はLys又はGln、X2はAsn、Asp、又はGly)、X1PX2X3G(X1はLeu、Ile、Val、又はMet、X2は任意のアミノ酸、X3はSer、Thr、又はAla)、LPEX1G(X1はAla、Cys、又はSer)、LPXS、LAXT、MPXT、MPXTG、LAXS、NPXT、NPXTG、NAXT、NAXTG、NAXS、NAXSG、LPXP、LPXPG、LRXTG、又はLPAXG(Xは任意のアミノ酸)を含む(又は、これらからなる)、請求項1乃至13、23乃至31、33乃至36、43乃至55、又は61乃至64の何れかに記載の方法又はポリペプチド。
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