JP2022513098A - 体重減少及び／又は食物摂取量低減に使用するためのｇｄｆ１５類似体及び方法 - Google Patents

体重減少及び／又は食物摂取量低減に使用するためのｇｄｆ１５類似体及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、半減期延長タンパク質、リンカー、及びＧＤＦ１５アゴニストとして機能するＧＤＦ１５タンパク質を含む融合タンパク質に関する。これらのＧＤＦ１５アゴニストは、肥満の治療、体重の減少、食物摂取量の減少、又は食欲の減少に有用となり得る。

Description

本発明は、ＧＤＦ１５融合タンパク質に関する。詳細には、本発明は、半減期延長タンパク質、リンカー、及びＧＤＦ１５タンパク質を含む融合タンパク質、融合タンパク質をコードする核酸及び発現ベクター、その組換え細胞、並びに融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。融合タンパク質を使用して体重を減少させる、及び／又は食物摂取量を低減する方法が提供される。
ＧＤＦ１５は、ＴＧＦβファミリーのメンバーであり、２５ｋＤａのホモダイマーとして血漿中を循環する分泌タンパク質である。ＧＤＦ１５の血漿中濃度は多くの個人で１５０～１１５０ｐｇ／ｍｌの範囲である（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｃｈｅｘｉａ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｍｕｓｃｌｅ．２０１２，３：２３９－２４３）。ＧＤＦ１５の高い血漿中濃度は、がんにおける食欲不振及び悪液質による体重減少、また腎不全及び心不全における体重減少と関連している。臨床試験では、ＧＤＦ１５レベルは、肥満の非糖尿病対象者におけるインスリン抵抗性の独立予測因子とされていた（Ｋｅｍｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏ．２０１２，１６７：６７１－６７８）。双子における研究により、双子のペアにおけるＧＤＦ１５のレベルの差がそのペアのＢＭＩの差に相関していることが示され、ＧＤＦ１５がエネルギーホメオスタシスの長期的な調節因子として機能していることを示唆している（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５，１０（７）：ｅ０１３３３６２）。
多くの報告で、ＧＤＦ１５タンパク質による処理によりマウスモデルにおいて耐糖能及びインスリン感受性の改善が示されている。ＧＤＦ１５を過剰発現するトランスジェニックマウスの２つの独立した系統で、体重及び体脂肪量が減少し、耐糖能が改善された（Ｊｏｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００７，１３：１３３３－１３４０；Ｍａｃｉａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２，７：ｅ３４８６８；Ｃｈｒｙｓｏｖｅｒｇｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓｉｔｙ．２０１４，３８：１５５５－１５６４）。ＧＤＦ１５マウスにおいて全身のエネルギー消費量及び酸化的代謝量の増加が報告されている（Ｃｈｒｙｓｏｖｅｒｇｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４、同上）。これらは、褐色脂肪組織における熱発生遺伝子の発現の増加、及び白色脂肪組織における脂肪分解遺伝子の増加を伴う。ＧＤＦ１５遺伝子を欠損したマウスでは、体重及び体脂肪量が増加した（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３，８（２）：ｅ５５１７４）。ＧＤＦ１５のＦｃ融合タンパク質は、肥満カニクイザルモデルにおいて週１回、６週にわたって投与した場合に体重を減少させ、耐糖能及びインスリン感受性を改善することが示されている（国際公開第２０１３／１１３００８号）。
体重に対するＧＤＦ１５の効果は、食物摂取量の低減及びおそらくはエネルギー消費量の増加を介して示されると考えられている。ＧＤＦ１５は、体重依存性及びおそらくは非依存性の機序によって血糖コントロールを改善している可能性がある。
これらの観察を考え合わせると、ＧＤＦ１５のレベルを増加させることは代謝性疾患の治療法として有用であり得る。代謝性疾患、障害、又は状態を治療若しくは予防するために使用することができるＧＤＦ１５を用いた組成物が当該技術分野で求められている。
現在の肥満治療としては、食事介入及び行動介入、薬物療法、並びに肥満手術が挙げられる。食事及び身体活動の増加を含む生活習慣の介入は、あらゆる体重減少の取り組みの基礎をなすものであり、短期間（３～６ヶ月）で体重減少を達成するうえで有効となり得る。しかしながら、多くの場合、生活習慣の介入により達成される体重減少は長期間は持続されず、長期にわたって大幅な体重減少を持続することができるのは個人のわずかに５～１０％に過ぎない。（Ｆｉｓｈｅｒ ＢＬ ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ Ｐ．，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．２００２ １８４：９ Ｓ－１６ Ｓ，Ｒｕｅｄａ－Ｃｌａｕｓｓｅｎ ＣＦ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．２０１５ ３５：４７５－５１６）。生活習慣の変化が大幅な体重減少を達成するうえで効果的でない場合、薬物療法は第二選択療法として推奨される。長期にわたる体重管理のために米国及びＥＵで認可されている薬物としては、オルリスタット（消化管リパーゼ阻害剤）、ナルトレキソン／ブプロピオン（オピオイドアンタゴニストとドーパミン／ノルエピネフリン再取り込み阻害剤との組み合わせ）、及びリラグルチド（グルカゴン様ペプチド－１受容体アゴニスト）が挙げられ、米国内では、ロルカセリン（選択的５－ＨＴ２Ｃ受容体アゴニスト）及びフェンテルミン／トピラマート（交感神経刺激アミンと抗てんかんとの組み合わせ）も入手可能である。更に、フェンテルミン、並びに他のいくつかの食欲抑制剤（ジエチルプロピオン、ベンズフェタミン、及びフェンジメトラジンを含む）は、短期使用（最大１２週間）用として米国内で登録されている。行動介入と組み合わせて、これらの薬理剤は、様々な効果を有し、初期体重の２％～１０％の範囲の更なる体重減少をもたらす。更に、薬理剤の使用は、胃腸作用（すなわち、悪心、嘔吐、膨満、下痢）、神経精神作用（すなわち、認知障害、睡眠障害）、及び心拍数の上昇（特定の薬物に応じて）を含む副作用によって制限され得る。利用可能な薬理学的アプローチのこれらの固有の制限（限定的な効果、安全性プロファイル、及び３０～６５％の範囲のノンレスポンダーの割合）のため、心血管疾患、２型糖尿病、及び高血圧などの肥満関連の併存疾患の改善も可能な、肥満に対してより効果的で忍容性が高く、かつ安全な薬理学的療法に対する明らかに満たされていない医療上のニーズが依然、存在する。肥満手術（胃バンディング術、スリーブ状胃切除術、及びＲｏｕｘ－ｅｎ－Ｙ胃バイパス）により、１０年後の体重減少が約１５％～３０％の範囲で、医学療法よりも持続的な体重減少がもたらされ、著しい健康状態の改善をもたらすことが可能であり、重度の肥満、術中（例えば、静脈血栓塞栓症）及び術後（例えば、悪心、ダンピング症候群、脂溶性ビタミン吸収不良）合併症を有する患者において、死亡率を低減することができる。更に、多くの医療保険制度におけるコスト及び外科的能力の両方の制限を考慮すると、肥満手術は、適格患者のごく一部にしか対応できない（Ｒｕｅｄａ－Ｃｌａｕｓｓｅｎ ＣＦ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．２０１５；３５：４７５－５１６）。したがって、高血圧症、脂質異常症、及び２型糖尿病などの肥満関連の併存疾患にもプラスの影響を及ぼし得る、より効果的かつ忍容性の高い長期的な体重管理療法が必要とされている。
本発明は、食物摂取量の減少及び体重減少の達成のための新規な作用機序を示すＧＤＦ１５アゴニストであるＦＰ２を提供することにより、この必要性を満たすものである。非臨床的な薬理学的及び安全性試験において、ＦＰ２は、臨床開発への移行の候補として適格な好ましい薬理学的効果及び有望な安全特性を示すことが示されている。
一態様では、本発明は、対象の体重を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、当該融合タンパク質が約０．８ｍｇ～約９０ｍｇの範囲の用量で投与され、対象の体重が約８０ｋｇ以上である、方法を提供する。本発明の一態様では、対象は過体重である。本発明の一態様では、対象は、約２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する。本発明の一態様では、対象は、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する。本発明の一態様では、融合タンパク質は、約０．８ｍｇ、約２．５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１５ｍｇ、約３０ｍｇ、約６０ｍｇ、及び約９０ｍｇからなる群から選択される用量で投与される。本発明の一態様では、融合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１．０８ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。本発明の一態様では、融合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１８ｍｇ／ｋｇ、約０．３６ｍｇ／ｋｇ、約０．７２ｍｇ／ｋｇ、及び約１．０８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。
本発明の一態様では、融合タンパク質は皮下注射により投与される。
本発明の一態様では、融合タンパク質は、対象に週１回投与される。
一態様では、本発明は、対象の食物摂取量を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、当該融合タンパク質が約０．８ｍｇ～約９０ｍｇの範囲の用量で投与され、対象の体重が８０ｋｇ以上である、方法を提供する。本発明の一態様では、対象は過体重である。本発明の一態様では、対象は、２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する。本発明の一態様では、対象は、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する。本発明の一態様では、融合タンパク質は、約０．８ｍｇ、約２．５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１５ｍｇ、約３０ｍｇ、約６０ｍｇ、及び約９０ｍｇからなる群から選択される用量で投与される。本発明の一態様では、融合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１．０８ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。本発明の一態様では、融合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１８ｍｇ／ｋｇ、約０．３６ｍｇ／ｋｇ、約０．７２ｍｇ／ｋｇ、及び約１．０８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。
本発明の一態様では、融合タンパク質は皮下注射により投与される。
本発明の一態様では、融合タンパク質は、対象に週１回投与される。
本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。
上述の「課題を解決するための手段」及び以降の「発明を実施するための形態」は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施形態そのものに限定されない点は理解される必要がある。
図面は、以下のとおりである。
第１のシステイン残基と第２のシステイン残基とのジスルフィドペアリング（Ｃ１～Ｃ２）がタンパク質のＮ末端にループを形成しているＧＤＦ１５の結晶構造を示す。 第１のシステイン残基と第２のシステイン残基とのジスルフィドペアリング（Ｃ１～Ｃ２）がタンパク質のＮ末端にループを形成しているＧＤＦ１５の結晶構造を示す。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの食物摂取量に対する本発明の実施形態に基づく融合タンパク質（例えば、融合タンパク質ＦＰ１（配列番号６０）及び６ｘＨｉｓ－ＦＰ１（Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグが結合された配列番号２６））の皮下投与の効果を示し、投与２４時間後の累積食物摂取量が示されている。各棒内に示される値は、溶媒（ＰＢＳ）群±ＳＥＭと比較した低下率（％）である。全ての群で各群Ｎ＝８匹の動物（ＦＰ１の１６ｎｍｏｌ／ｋｇ群のＮ＝９を除く）。＊溶媒と比較してｐ＜０．０５；ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。 Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの食物摂取量に対するＦＰ１及び６ｘＨｉｓ－ＦＰ１（Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグが結合された配列番号２６）の皮下投与の効果を示し、投与４８時間後の累積食物摂取量が示されている。各棒内に示される値は、溶媒（ＰＢＳ）群±ＳＥＭと比較した低下率（％）である。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較してｐ＜０．０５；ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。 ＦＰ１による処理の間の食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）の体重の変化を示す。矢印は、初回投与（０日目）後の皮下投与の時間（日）を示す。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較したＦＰ１の１ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；＃溶媒と比較したＦＰ１の１０ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；ｐ値は、二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。 ３日ごと（ｑ３ｄ）に１４日間ＦＰ１を投与した後の経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）の間のＤＩＯマウスの血糖値を示し、各値は曲線下面積として表されている。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較したＦＰ１の１ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。 ３日ごと（ｑ３ｄ）に１４日間ＦＰ１を投与した後の経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）の間のＤＩＯマウスの血糖値を示し、各値は曲線下面積として表されている。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較したＦＰ１の１ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。 ＦＰ１による処理の間のＤＩＯマウスの摂食血糖値を示す。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較してｐ＜０．０５；ｐ値は、二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。 ＦＰ１による１４日間の処理の後のＤＩＯマウスにおけるインスリン抵抗性の４時間絶食ホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ－ＩＲ）を示す。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較してｐ＜０．０５；ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。 ３日ごと（ｑｄ３）のＦＰ１による処理の間のｏｂ／ｏｂマウスの体重変化を示す。矢印は、初回投与（０日目）後の皮下投与の時間（日）を示す。各群Ｎ＝９匹の動物。＊溶媒と比較したＦＰ１の１０ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；＃溶媒と比較したＦＰ１の１ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；ｐ値は、二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。 ＦＰ１による処理の間のｏｂ／ｏｂマウスの血糖値を示す。矢印は、初回投与（０日目）後の皮下投与の時間（日）を示す。各群Ｎ＝９匹の動物。＊溶媒と比較したＦＰ１の１０ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；＃溶媒と比較したＦＰ１の１ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；ｐ値は、二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける２ｍｇ／ｋｇの静脈内（ＩＶ）及び皮下（ＳＣ）投与後のＦＰ１の血清薬物濃度－時間プロファイルの平均（±標準偏差、ＳＤ）を示す。 Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける２ｍｇ／ｋｇのＩＶ及びＳＣ投与後のＦＰ１の血清薬物濃度－時間プロファイルの平均（±ＳＤ）を示す。 イムノアッセイにより測定した、カニクイザルにおける１ｍｇ／ｋｇのＩＶ及びＳＣ投与後のＦＰ１の血清薬物濃度－時間プロファイルの平均（±ＳＤ）を示す。 免疫親和性（ＩＡ）捕捉ＬＣＭＳ分析により測定した、カニクイザルにおける単回ＩＶ投与後の経時的な完全な二量体としてのＦＰ１の血清濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。 免疫親和性捕捉ＬＣＭＳ分析により測定した、カニクイザルにおける単回ＳＣ投与後の経時的な完全な二量体としてのＦＰ１の血清濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。 イムノアッセイにより測定した、２人のヒト被験者（Ｓｕｂ）から得た血漿中でのｅｘ ｖｉｖｏインキュベーションの０、４、２４、及び４８時間後の開始濃度の割合（％）として表したＦＰ１の濃度を示す。 完全マス免疫親和性捕捉ＬＣＭＳ分析により測定した、２人のヒト被験者（Ｓｕｂ）から得た血漿中でのｅｘ ｖｉｖｏインキュベーションの０、４、２４、及び４８時間後の完全な二量体としての時間０の割合（％）として表した平均のＦＰ１の濃度を示す。 ＧＤＦ１５の異なるＮ末端欠失変異体の投与の前後の痩身Ｃ５７ＢＬ６Ｎ雄性マウスにおける急性食物摂取量を示す。（欠失のない野生型融合体（Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグが結合された配列番号２６）に対して、配列番号９２、１１１、及び１１２）。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較してｐ＜０．０５；ｐ値は、二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの食物摂取量に対するＦＰ２の単回投与の効果を示す。詳細には、投与後２４時間の累積食物摂取量を示す。各棒内に示される値は、ＰＢＳ群（平均±ＳＥＭ）と比較した低下率（％）である。全ての群で各群Ｎ＝８匹の動物（６ｘＨｉｓ－ＦＰ１のＮ＝６を除く）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｐ値は、二元配置ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定を用いて計算した。 ＦＰ２の単回用量の投与後２４時間にＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットで測定された累積食物摂取量を示す。各棒内に示される値は、ＰＢＳ群（平均±ＳＥＭ）と比較した低下率（％）である。各群Ｎ＝８匹の動物。＊＊ｐ＜０．０１、ｐ値は、二元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。 ＤＩＯマウスのＦＰ２によるｑ３ｄ処理の間の体重の変化率（％）を示す。矢印は、ＦＰ２の皮下注射の時点を示す。各群Ｎ＝６匹の動物。＊ｐ，０．０５、ｐ値は、二元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて溶媒と比較。 ＤＩＯマウスにおける１４日間のＦＰ２のｑ３ｄ投与後のＯＧＴＴの間の血糖値の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物を用いた。 ＤＩＯマウスにおける１４日間のＦＰ２のｑ３ｄ投与後のＯＧＴＴの間の血糖値の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物を用いた。 ＤＩＯマウスにおける８日間のＦＰ２のｑ３ｄ投与後のＯＧＴＴの間の血漿インスリン値を示す。＊ｐ＜０．０５、溶媒に対するＦＰ２（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）；ＦＰ２（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）；及びロシグリタゾン。＃ｐ＜０．０５、二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いてロシグリタゾン（１０ｍｇ／ｋｇ）と比較。 ＤＩＯマウスにおける８日間のＦＰ２のｑ３ｄ投与後のＯＧＴＴの間の血漿インスリン値のＡＵＣを示す。＊ｐ＜０．０５、溶媒と比較、＃ｐ＜０．０５、ロシグリタゾンと比較。 ＤＩＯマウスにおける８日間のＦＰ２のｑ３ｄ投与後の摂食血糖値を示す。＊ｐ＜０．０５、二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物を用い、溶媒と比較。 ＤＩＯマウスで１４日間のＦＰ２によるｑ３ｄ処理後、１４日目に５時間絶食させた後の絶食ＨＯＭＡ－ＩＲを示す。＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物について、溶媒と比較。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける２ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）及び２ｍｇ／ｋｇ皮下（ＳＣ）投与後のＦＰ２の血清濃度を示す。各値は、平均±ＳＤを表す（各時点につきｎ＝５の試料）。 Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける２ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）及び２ｍｇ／ｋｇ皮下（ＳＣ）投与後のＦＰ２の血清濃度を示す。各時点につき、ｎ＝５試料。 イムノアッセイにより分析したカニクイザルにおけるＦＰ２の血漿中濃度を示す。各値は、２２日目（５２８時間）のＩＶのｎ＝２を除き、ｎ＝３の平均±ＳＤを示す。ＩＶ＝静脈内、ＳＣ＝皮下。 ＬＣＭＳにより分析したカニクイザルにおける完全な二量体としてのＦＰ２の血漿中濃度を示す。各値は、１６８時間の皮下投与（ＳＣ）のｎ＝２、１２０時間及び４３２時間のＳＣのｎ＝１、並びに１６８時間及び４３２時間の静脈内（ＩＶ）のｎ＝１を除き、ｎ＝３の平均±ＳＥＭを示す。 イムノアッセイにより測定したヒト血漿中での４８時間のＦＰ２のｅｘ ｖｉｖｏ安定性（正規化した回復率（％））を示す。 完全ＬＣ／ＭＳにより測定したヒト血漿中での４８時間のＦＰ２のｅｘ ｖｉｖｏ安定性（正規化した回復率（％））を示す。 カニクイザルにおけるＦＰ１の単回投与の前後の１日食物摂取量（ｇ）を示す。＊溶媒と比較したＦＰ１の１０ｍｇ／ｋｇではｐ＜０．０５とした。 カニクイザルにおけるＦＰ１の単回投与の前後の体重の変化率（％）を示す。＊溶媒と比較したＦＰ１の１０ｍｇ／ｋｇではｐ＜０．０５とした。＊ｐ＜０．０５、二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物で溶媒と比較した３ｍｇ／ｋｇの場合。 カニクイザルにおけるＦＰ２の単回投与の前後の１日食物摂取量（ｇ）を示す。＊ｐ＜０．０５、二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物で溶媒と比較した場合。 カニクイザルにおけるＦＰ２の単回投与の前後の体重の変化率（％）を示す。＊ｐ＜０．０５、溶媒と比較した１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２の場合、＃ｐ＜０．０５、溶媒と比較した３ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２の場合、＆ｐ＜０．０５、溶媒と比較した１ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２の場合（二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物で）。 ベースラインからの低下率（％）として正規化された、投与前の週の間の平均１日食物摂取量として計算した、ＦＰ２の１２週間の週１回皮下投与の長期における自然発生的に肥満のカニクイザルの食物摂取量を示す。データは平均±ＳＥＭを示し、グラフの下に動物の数Ｎを示す。エラーバーは、Ｎ＝２における±範囲とした。 ＦＰ２の１２週間の週１回皮下投与の長期における自然発生的に肥満のカニクイザルの体重（ベースラインからの変化率（％））を示す。データは平均±ＳＥＭを示し、グラフの下に動物の数Ｎを示す。エラーバーは、Ｎ＝２における±範囲とした。 ＦＰ２の１２週間の週１回皮下投与の長期における自然発生的に肥満のカニクイザルにおけるイムノアッセイにより測定されたＦＰ２の血清濃度（ｎＭ）を示す。データは平均±ＳＥＭを示し、グラフの下に検出可能な曝露を有する動物の数Ｎを示す。エラーバーは、Ｎ＝２における±範囲とした。 試験の模式的概要を示す。ＤＧ－投与群。
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを認めるものではない。
別の定義がなされない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に全般的に理解されるものと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によってあたかもその全体が本明細書に記載されているものと同様にして組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
本発明は、（ａ）半減期延長タンパク質、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）ＧＤＦ１５タンパク質を含み、Ｎ末端からＣ末端に（ａ）－（ｂ）－（ｃ）の順序で配列された融合タンパク質に関する。
半減期延長タンパク質、リンカー及びＧＤＦ１５タンパク質を含む、本発明の実施形態に基づく融合タンパク質は、ＧＤＦ１５タンパク質の半減期を増大させるため、本発明の融合タンパク質は、代謝性疾患、障害又は状態を治療及び予防するための治療薬としての適性を示す代謝効果を示すことが見出された。このような効果としては、これらに限定されるものではないが、融合タンパク質を投与した動物の体重の減少、耐糖能の向上、インスリン感受性の改善が挙げられる。
本明細書で使用するところの「融合タンパク質」なる用語は、それぞれの部分が異なるタンパク質に由来する、互いに共有結合された２つ以上の部分を有するタンパク質を指す。
本発明の実施形態に基づく融合タンパク質は、任意のＧＤＦ１５タンパク質を含むことができる。本明細書で使用するところの「ＧＤＦ１５タンパク質」なる用語は、天然に存在する野生型増殖分化因子１５タンパク質、又はその機能的変異体を指す。ＧＤＦ１５タンパク質は、ヒト、又はマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ、若しくは霊長類などの他の適当な哺乳動物のような任意の哺乳動物に由来するものとすることができる。特定の実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質は、ヒトＧＤＦ１５タンパク質又はその機能的変異体である。好ましい実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質は、成熟ＧＤＦ１５タンパク質又はその機能的変異体である。
本明細書で使用するところの「成熟ＧＤＦ１５タンパク質」とは、ＲＸＸＲのフーリン様切断部位での細胞内切断後に完全長タンパク質から放出されるＧＤＦ１５のプレプロタンパク質の部分を指す。成熟ＧＤＦ１５タンパク質は、ジスルフィド結合により連結されたホモ二量体として分泌される。本発明の一実施形態では、成熟ＧＤＦ１５タンパク質（ＧＤＦ１５（１９７～３０８）（配列番号６）と略記される）は、完全長ヒトＧＤＦ１５タンパク質のアミノ酸１９７～３０８を含む。
本明細書で使用するところの「機能的変異体」とは、親タンパク質と実質的な、又は相当の配列同一性を有し、親タンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを保持している親タンパク質の変異体を指す。親タンパク質の機能的変異体は、本開示を考慮することで当該技術分野では周知の手段により調製することができる。機能的変異体は、親タンパク質のアミノ酸配列に対する１つ以上の改変を含むことができる。かかる改変は、例えば、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を変化させ、最適ｐＨを変化させることなどによってポリペプチドの物理化学特性を変化させることができる。かかる改変は、親タンパク質の生物学的活性の全てを喪失又は消失させないものであれば、親タンパク質の生物学的活性を変化させることもできる。かかる改変は、１つ以上のアミノ酸の欠失又は挿入であってもよい。
本発明の他の実施形態によれば、親タンパク質の機能的変異体は、親タンパク質に対する１つ以上のアミノ酸の欠失及び／又は挿入を含む。例えば、成熟ＧＤＦ１５タンパク質の機能的変異体は、成熟ＧＤＦ１５タンパク質に対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、又はそれ以上のアミノ酸の欠失及び／又は挿入、好ましくは、成熟ＧＤＦ１５タンパク質のＮ末端の１～３０個のアミノ酸の欠失を含むことができる。
本発明の実施形態によれば、本発明の融合タンパク質は、ＧＤＦ１５（１９７～３０８）（配列番号６）などの成熟ＧＤＦ１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、又は、ＧＤＦ１５（２００～３０８）（配列番号７）、ＧＤＦ１５（２０１～３０８）（配列番号８）、ＧＤＦ１５（２０２～３０８）（配列番号９）、ＧＤＦ１５（２０３～３０８）（配列番号１０）、又はＧＤＦ１５（２１１～３０８）（配列番号１１）などの、Ｎ末端が切り詰められた成熟ＧＤＦ１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＧＤＦ１５タンパク質を含む。ＧＤＦ１５タンパク質は、食物摂取、血糖値、インスリン抵抗性、及び体重などに対するその効果など、ＧＤＦ１５タンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを維持する限り、配列番号６、７、８、９、１０又は１１に対する置換、挿入、及び欠失の少なくとも１つを有することができる。
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号６、７、８、９、１０、又は１１のアミノ酸配列を含むがこれらに限定されない、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５タンパク質を含む。
任意の適当な半減期延長タンパク質を本発明の実施形態に基づく融合タンパク質に使用することができる。本明細書で使用するところの「半減期延長タンパク質」なる用語は、半減期延長タンパク質が融合されたタンパク質の半減期を延長することが知られている任意のタンパク質又はそのフラグメントであってよい。かかる半減期延長タンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、イムノグロブリン（Ｉｇ）の定常フラグメントドメイン（Ｆｃ）、又はトランスフェリン（Ｔｆ）が挙げられる。本発明の実施形態では、半減期延長タンパク質は、ＨＳＡ又はその機能的変異体を含む。本発明の特定の実施形態では、半減期延長タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明の好ましい実施形態では、半減期延長タンパク質は、ＨＳＡの３４位のシステイン残基がセリン又はアラニンに置換されたＨＳＡ又はその機能的変異体を含む。
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１～３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する半減期延長タンパク質を含む。
任意の適当なリンカーを、本発明の実施形態に基づく融合タンパク質に使用することができる。本明細書で使用するところの「リンカー」なる用語は、ペプチドリンカーを含む連結部分を指す。リンカーは、適正なフォールディングを確実とし、立体障害を最小化し、融合タンパク質内のそれぞれの機能的要素の構造に大きく干渉しないことが好ましい。本発明の特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、２～１２０個のアミノ酸を含む。例えば、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、又は１２０個のアミノ酸を含む。
本発明の実施形態では、リンカーは、融合タンパク質要素の柔軟性を増大させる。本発明の特定の実施形態では、リンカーは、ＧＳ－（ＧＧＧＧＳ）ｎ又はＡＳ－（ＧＧＧＧＳ）ｎ－ＧＴを含むがこれらに限定されない、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ただし、ｎは２～２０、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である）を含む柔軟性リンカーとすることができる。
本発明の他の実施形態では、リンカーは構造化されたものである。本発明の特定の実施形態では、リンカーは、ＡＳ－（ＡＰ）ｎ－ＧＴ又はＡＳ－（ＥＡＡＡＫ）ｎ－ＧＴを含むがこれらに限定されない、配列（ＡＰ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ただし、ｎは２～２０、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である）を含む構造化リンカーとすることができる。本発明の他の実施形態では、リンカーは、配列（ＧＧＧＧＡ）ｎ、（ＰＧＧＧＳ）ｎ、（ＡＧＧＧＳ）ｎ又はＧＧＳ－（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ）ｎ－ＧＧＳ（ｎは２～２０である）を含む。
本発明の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５、２５～３０、３６～３７、４０、４８、５５～５６、５９～６０又は６４～７５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５、２５～３０、３６～３７、４０、４８、５５～５６、５９～６０及び６４～７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のより特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５、２５～３０、４０、５５～５６、５５～５６、５９～６０、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の更なるより特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９２、配列番号６０、又は配列番号２６のアミノ酸配列を含む。融合タンパク質は、タンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に、ポリヒスチジンタグ、抗原性エピトープ、又は結合ドメインなどの、精製を容易にするタグなどの小さい延長部分を有してもよい。
本明細書に開示される融合タンパク質は、これらに限定されるものではないが、食物摂取量に対する効果、経口耐糖能試験、血糖値の測定、インスリン抵抗性の分析、体重変化、薬物動態分析、毒物動態分析、完全長の融合タンパク質のレベル及び安定性のイムノアッセイ及び質量分析、並びにヒト血漿中でのｅｘ ｖｉｖｏ安定性分析を含むＧＤＦ１５の生物学的活性について特性評価又は評価を行うことができる。
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする単離核酸分子も提供する。本発明の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号５、２５～３０、３６～３７、４０、４８、５５～５６、５９～６０、６４～７５又は９２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号５、２５～３１、３６～３７、４０、４８、５５～５６、５９～６０、６４～７５、及び９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。より特定の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号５、２５～３０、４０、５５～５６、５９～６０、７０、及び９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。より特定の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号７６～９１、９５、及び１１０のヌクレオチド配列を含む。
本発明の他の実施形態によれば、融合タンパク質をコードする核酸分子は、発現ベクター内に存在させることができる。発現ベクターとしては、これらに限定されるものではないが、組換えタンパク質を発現させるためのベクター、及びウイルスベクターなどの、対象の体内に核酸を送達させて対象の組織で発現させるためのベクターなどが挙げられる。本発明との使用に適したウイルスベクターの例としては、これらに限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。ベクターは非ウイルスベクターであってもよい。非ウイルスベクターの例としては、これらに限定されるものではないが、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられる。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、又は複製起点を含むことができる。
本発明の他の実施形態によれば、融合タンパク質をコードする核酸分子は、ヒト胎児由来腎細胞（ＨＥＫ）又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの所望の宿主細胞からの組換えによる発現を向上させるため、本開示を考慮して当該技術分野では周知の技術を用いてコドン最適化することができる。
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞も提供する。宿主細胞としては、これらに限定されるものではないが、組換えタンパク質を発現させるための宿主細胞、及び対象の体内に核酸を送達させて対象の組織で発現させるための宿主細胞などが挙げられる。本発明との使用に適した宿主細胞の例としては、これらに限定されるものではないが、ＨＥＫ又はＣＨＯ細胞が挙げられる。
別の全般的な態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質を得る方法に関する。全般的な態様では、かかる方法は、（１）融合タンパク質が生成する条件下で、融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養することと、（２）宿主細胞により産生された融合タンパク質を回収することと、を含む。融合タンパク質は、更に当該技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞中で発現させられ、これらに限定されるものではないが、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、及び透析を含む１以上の標準的な精製方法の組み合わせを用いて宿主細胞から精製される。好ましくは、融合タンパク質は、プロテアーゼを含まないように精製される。
本発明は、本発明の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を更に提供する。本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む組成物は、融合タンパク質を発現させるために核酸分子を細胞内に導入するための送達媒介物を含むことができる。核酸送達媒介物の例としては、リポソーム、天然ポリマー及び合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー、リポ蛋白質、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子、及び細菌、バキュロウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルスウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、並びに各種の真核宿主での発現について記載されている当該技術分野で通常用いられている他の組換え用媒介物が挙げられる。
本発明は、本発明の医薬組成物を含むキットにも関する。かかるキットは、本発明の乾燥融合タンパク質を有する第１の容器と、対象への投与に先立って乾燥融合タンパク質と混合される水溶液を有する第２の容器とを含むか、又は本発明の液体医薬組成物が入った単一の容器を含むことができる。かかるキットは、本発明の医薬組成物の単回投与単位又は複数回投与単位を含むことができる。かかるキットは、１以上の予め充填された注射器（例えば、液体注射器及びリオシリンジ（lyosyringe））を含んでもよい。キットはその使用説明書を含んでもよい。かかる使用説明書は、キット内で与えられる材料の使用及び性質について記載したものでよく、治療される正確な代謝性疾患に適合したものとすることができる。
本発明は、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチなどの代謝性疾患、障害又は状態を治療又は予防するための本明細書に記載される医薬組成物の使用にも関する。本発明の実施形態によれば、治療を要する対象の代謝性疾患、障害、又は状態を治療又は防止する方法は、対象に治療上又は予防上の有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物又は融合タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物を含む、本明細書に記載される医薬組成物のいずれのものも、本発明の方法で使用することができる。
本明細書では、対象の体重を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、当該融合タンパク質が約０．８ｍｇ～約９０ｍｇの範囲の用量で投与され、対象の体重が８０ｋｇ以上である、方法が提供される。
特定の実施形態によれば、対象は過体重である。本発明の特定の実施形態では、対象は２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有し、また、特定の実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する。
特定の実施形態によれば、融合タンパク質は、約０．８ｍｇ、約２．５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１５ｍｇ、約３０ｍｇ、約６０ｍｇ、及び約９０ｍｇからなる群から選択される用量で投与される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、約０．８ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約２．５ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約７．５ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約１５ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約３０ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約６０ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約９０ｍｇの用量で投与される。
特定の実施形態によれば、融合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１．０８ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。特定のかかる実施形態では、融合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１８ｍｇ／ｋｇ、約０．３６ｍｇ／ｋｇ、約０．７２ｍｇ／ｋｇ、及び約１．０８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約０．０９ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約０．１８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約０．３６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約０．７２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約１．０８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
本発明の特定の実施形態によれば、融合タンパク質は皮下注射によって投与される。
本発明の特定の実施形態によれば、融合タンパク質は、対象に週１回投与される。
本明細書では、対象の食物摂取量を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、当該組成物が約０．８ｍｇ～約９０ｍｇの範囲の用量で投与され、対象の体重が８０ｋｇ以上である、方法が提供される。
特定の実施形態によれば、対象は過体重である。本発明の特定の実施形態では、対象は２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有し、また、特定の実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する。
特定の実施形態によれば、融合タンパク質は、約０．８ｍｇ、約２．５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１５ｍｇ、約３０ｍｇ、約６０ｍｇ、及び約９０ｍｇからなる群から選択される用量で投与される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、約０．８ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約２．５ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約７．５ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約１５ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約３０ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約６０ｍｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約９０ｍｇの用量で投与される。
特定の実施形態によれば、融合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１．０８ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。特定のかかる実施形態では、融合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１８ｍｇ／ｋｇ、約０．３６ｍｇ／ｋｇ、約０．７２ｍｇ／ｋｇ、及び約１．０８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約０．０９ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約０．１８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約０．３６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約０．７２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、約１．０８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
本発明の特定の実施形態によれば、融合タンパク質は皮下注射によって投与される。
本発明の特定の実施形態によれば、融合タンパク質は、対象に週１回投与される。
数値範囲、カットオフ、又は特定の値に言及するときに用いる場合、「約」という用語は、引用した値が、記載値から最大１０％変動し得ることを示すために用いる。したがって、「約」という用語は、規定値からの±１０％以下の変動、±５％以下の変動、±１％以下の変動、±０．５％以下の変動、±５％以下の変動、又は±０．１％以下の変動を包含するために用いられる。
本明細書で使用するところの「対象」とは、本発明の実施形態による方法によって治療される、又は治療された任意の動物、詳細には哺乳動物、最も詳細にはヒトを意味する。本明細書で使用するとき、用語「哺乳動物」とは、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル又は類人猿などの非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、より詳細にはヒトが挙げられる。
本明細書で使用するとき、「過体重」とは、過剰な体重を指す。対象の年齢、身長、性別、及び健康状態などの様々なパラメータを使用して、対象が、基準となる健康な個体と比較して過体重であるかどうかを判定する。例えば、キログラムで表される対象の体重を、メートルで表される対象の身長の２乗で割ることによって計算される対象のボディマス指数（ＢＭＩ）を評価することによって、対象は過体重又は肥満とみなされ得る。１８．５～２４．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する成人は、正常体重を有するとみなされ、２５～２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する成人は、過体重（前肥満）とみなされ得、３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する成人は肥満であるとみなされ得る。食欲増進は、過剰な体重に寄与することがよくある。
「代謝性疾患、障害又は状態」とは、異常代謝に関連するあらゆる障害を指す。本発明の方法に従って治療することができる代謝性疾患、障害又は状態の例としては、これらに限定されるものではないが、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、過体重である、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチが挙げられる。
本明細書で使用するところの「治療する」、「治療される」、及び「治療」なる用語は、対象に組成物を投与して対象で所望の治療的又は臨床的転帰を得ることを指す。一実施形態では、「治療する」、「治療される」、及び「治療」なる用語は、本発明の医薬組成物を投与することにより、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチなどの代謝性疾患の進行又は進展を低減、緩和又は遅延させることを指す。
本発明の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、筋肉内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸内）、鼻腔内又は腹腔内の投与経路などの、本開示を考慮することで当業者には周知の任意の方法によって対象に投与することができる。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、静脈内注射又は皮下注射によって対象に投与される。
本明細書で使用するとき、「週１回」の投与は、１日の中で行われる。好ましくは、「週１回」の投与は、単回の注射などの単回のステップで行われる。
特定の実施形態では、本発明は、対象の体重を減少させる方法で使用するための配列番号９２を含む配列を有する、臨床的に安全性が証明され、かつ臨床的に有効性が証明されたＧＤＦ１５融合タンパク質の用量を提供し、当該臨床的に安全性が証明され、かつ臨床的に有効性が証明された用量は、体重８０ｋｇ以上の対象に０．８ｍｇ～９０ｍｇの範囲の用量で投与される単回皮下（ＳＣ）注射である。
特定の実施形態では、本発明は、対象の食物摂取量を減少させる方法で使用するための配列番号９２を含む配列を有する、臨床的に安全性が証明され、かつ臨床的に有効性が証明されたＧＤＦ１５融合タンパク質の用量を提供し、当該臨床的に安全性が証明され、かつ臨床的に有効性が証明された用量は、体重８０ｋｇ以上の対象に０．８ｍｇ～９０ｍｇの範囲の用量で投与される単回皮下（ＳＣ）注射である。
本明細書で定義される本発明によれば、「臨床的に安全性が証明された」という用語は、配列番号９２を含む配列を有するＧＤＦ１５融合タンパク質の用量又はそれによる治療に関して好ましいリスク：ベネフィット比を指し、有害なバイタルサイン（心拍数、収縮期及び拡張期血圧、体温）、有害な標準的臨床検査（血液学、臨床化学、尿検査、脂質、凝固）、アレルギー反応／過敏症、有害な局所注射部位反応、又は有害なＥＫＧを含む有害事象の頻度が比較的低いか若しくは低下しており、かつ／又は重症度が低いか若しくは低下している。
本明細書で定義される本発明によれば、「臨床的に有効性が証明された」又は「臨床的に効果が証明された」という用語は、配列番号９２を含む配列を有するＧＤＦ１５融合タンパク質の用量、投与レジメン、又はそれによる治療に関して、食物摂取量の減少、食欲評価の低下、質問票を使用して評価される食品嗜好性の低下、又は体重の減少を指す。
本明細書で使用するとき、体重の減少は、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、又はこれらの値の間の任意の数値の減少である。
本明細書で使用するとき、食物摂取量の減少は、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、又はこれらの値の間の任意の数値の減少である。食物摂取量は、各食物品目の消費されたグラム数、及びその栄養含量に基づいて推定されるカロリーを測定することによって測定することができる。
本明細書で使用するとき、特に断りがない限り、用語「臨床的に証明された」（独立して、又は用語「安全性」及び／又は「有効性」を修飾するために使用される）は、臨床試験によって証明されており、臨床試験が、米国食品医薬品局、ＥＭＥＡ、又は対応する国家規制機関の基準を満たしていることを意味するものとする。例えば、臨床試験は、薬物の効果を臨床的に証明するために使用される、適切なサイズのランダム化二重盲検試験であってもよい。いくつかの実施形態では、「臨床的に証明された」とは、第Ｉ相臨床試験のための米国食品医薬品局、ＥＭＥＡ、又は対応する国立規制機関の基準を満たした臨床試験によって証明されていることを示す。
実施形態
１．対象の体重を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、当該融合タンパク質が０．８ｍｇ～９０ｍｇの範囲の用量で投与され、対象の体重が８０ｋｇ以上である、方法。
２．対象が過体重である、実施形態１に記載の方法。
３．対象が、２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する、実施形態２に記載の方法。
４．対象が、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する、実施形態３に記載の方法。
５．融合タンパク質が、０．８ｍｇ、２．５ｍｇ、７．５ｍｇ、１５ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、及び９０ｍｇからなる群から選択される用量で投与される、実施形態１に記載の方法。
６．融合タンパク質が、０．８ｍｇの用量で投与される、実施形態５に記載の方法。
７．融合タンパク質が、２．５ｍｇの用量で投与される、実施形態５に記載の方法。
８．融合タンパク質が、７．５ｍｇの用量で投与される、実施形態５に記載の方法。
９．融合タンパク質が、１５ｍｇの用量で投与される、実施形態５に記載の方法。
１０．融合タンパク質が、３０ｍｇの用量で投与される、実施形態５に記載の方法。
１１．融合タンパク質が、６０ｍｇの用量で投与される、実施形態５に記載の方法。
１２．融合タンパク質が、９０ｍｇの用量で投与される、実施形態５に記載の方法。
１３．融合タンパク質が、皮下注射により投与される、実施形態１に記載の方法。
１４．対象の体重を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、当該融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１．０８ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される、方法。
１５．当該融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．３６ｍｇ／ｋｇ、０．７２ｍｇ／ｋｇ、及び１．０８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される、実施形態１４に記載の方法。
１６．融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５に記載の方法。
１７．融合タンパク質が、０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５に記載の方法。
１８．融合タンパク質が、０．０９ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５に記載の方法。
１９．融合タンパク質が、０．１８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５に記載の方法。
２０．融合タンパク質が、０．３６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５に記載の方法。
２１．融合タンパク質が、０．７２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５に記載の方法。
２２．融合タンパク質が、１．０８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５に記載の方法。
２３．融合タンパク質が、皮下注射により投与される、実施形態１４に記載の方法。
２４．組成物が対象に週１回投与される、実施形態１４に記載の方法。
２５．組成物が対象に週１回投与される、実施形態１に記載の方法。
１Ａ．対象の食物摂取量を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、当該融合タンパク質が０．８ｍｇ～９０ｍｇの範囲の用量で投与され、対象の体重が８０ｋｇ以上である、方法。
２Ａ．対象が過体重である、実施形態１Ａに記載の方法。
３Ａ．対象が、２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する、実施形態２Ａに記載の方法。
４Ａ．対象が、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する、実施形態３Ａに記載の方法。
５Ａ．融合タンパク質が、０．８ｍｇ、２．５ｍｇ、７．５ｍｇ、１５ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、及び９０ｍｇからなる群から選択される用量で投与される、実施形態１Ａに記載の方法。
６Ａ．融合タンパク質が、０．８ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ａに記載の方法。
７Ａ．融合タンパク質が、２．５ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ａに記載の方法。
８Ａ．融合タンパク質が、７．５ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ａに記載の方法。
９Ａ．融合タンパク質が、１５ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ａに記載の方法。
１０Ａ．融合タンパク質が、３０ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ａに記載の方法。
１１Ａ．融合タンパク質が、６０ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ａに記載の方法。
１２Ａ．融合タンパク質が、９０ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ａに記載の方法。
１３Ａ．融合タンパク質が、皮下注射により投与される、実施形態１Ａに記載の方法。
１４Ａ．対象の食物摂取量を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、当該融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１．０８ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される、方法。
１５Ａ．当該融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．３６ｍｇ／ｋｇ、０．７２ｍｇ／ｋｇ、及び１．０８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される、実施形態１４Ａに記載の方法。
１６Ａ．融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ａに記載の方法。
１７Ａ．融合タンパク質が、０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ａに記載の方法。
１８Ａ．融合タンパク質が、０．０９ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ａに記載の方法。
１９Ａ．融合タンパク質が、０．１８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ａに記載の方法。
２０Ａ．融合タンパク質が、０．３６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ａに記載の方法。
２１Ａ．融合タンパク質が、０．７２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ａに記載の方法。
２２Ａ．融合タンパク質が、１．０８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ａに記載の方法。
２３Ａ．融合タンパク質が、皮下注射により投与される、実施形態１５Ａに記載の方法。
２４Ａ．組成物が対象に週１回投与される、実施形態１４Ａに記載の方法。
２５Ａ．組成物が対象に週１回投与される、実施形態１Ａに記載の方法。
１Ｂ．対象の体重を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を対象に週１回投与することを含み、当該融合タンパク質が０．８ｍｇ～９０ｍｇの範囲の用量で投与され、対象の体重が８０ｋｇ以上である、方法。
２Ｂ．対象が過体重である、実施形態１Ｂに記載の方法。
３Ｂ．対象が、２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する、実施形態２Ｂに記載の方法。
４Ｂ．対象が、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する、実施形態３Ｂに記載の方法。
５Ｂ．融合タンパク質が、０．８ｍｇ、２．５ｍｇ、７．５ｍｇ、１５ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、及び９０ｍｇからなる群から選択される用量で投与される、実施形態１Ｂに記載の方法。
６Ｂ．融合タンパク質が、０．８ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｂに記載の方法。
７Ｂ．融合タンパク質が、２．５ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｂに記載の方法。
８Ｂ．融合タンパク質が、７．５ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｂに記載の方法。
９Ｂ．融合タンパク質が、１５ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｂに記載の方法。
１０Ｂ．融合タンパク質が、３０ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｂに記載の方法。
１１Ｂ．融合タンパク質が、６０ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｂに記載の方法。
１２Ｂ．融合タンパク質が、９０ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｂに記載の方法。
１３Ｂ．融合タンパク質が、皮下注射により投与される、実施形態１Ｂに記載の方法。
１４Ｂ．対象の体重を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を対象に週１回投与することを含み、当該融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１．０８ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される、方法。
１５Ｂ．当該融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．３６ｍｇ／ｋｇ、０．７２ｍｇ／ｋｇ、及び１．０８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される、実施形態１４Ｂに記載の方法。
１６Ｂ．融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ｂに記載の方法。
１７Ｂ．融合タンパク質が、０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ｂに記載の方法。
１８Ｂ．融合タンパク質が、０．０９ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ｂに記載の方法。
１９Ｂ．融合タンパク質が、０．１８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ｂに記載の方法。
２０Ｂ．融合タンパク質が、０．３６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ｂに記載の方法。
２１Ｂ．融合タンパク質が、０．７２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ｂに記載の方法。
２２Ｂ．融合タンパク質が、１．０８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ｂに記載の方法。
２３Ｂ．融合タンパク質が、皮下注射により投与される、実施形態２２Ｂに記載の方法。
１Ｃ．対象の食物摂取量を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を対象に週１回投与することを含み、当該融合タンパク質が０．８ｍｇ～９０ｍｇの範囲の用量で投与され、対象の体重が８０ｋｇ以上である、方法。
２Ｃ．対象が過体重である、実施形態１Ｃに記載の方法。
３Ｃ．対象が、２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する、実施形態２Ｃに記載の方法。
４Ｃ．対象が、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する、実施形態３Ｃに記載の方法。
５Ｃ．融合タンパク質が、０．８ｍｇ、２．５ｍｇ、７．５ｍｇ、１５ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、及び９０ｍｇからなる群から選択される用量で投与される、実施形態１Ｃに記載の方法。
６Ｃ．融合タンパク質が、０．８ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｃに記載の方法。
７Ｃ．融合タンパク質が、２．５ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｃに記載の方法。
８Ｃ．融合タンパク質が、７．５ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｃに記載の方法。
９Ｃ．融合タンパク質が、１５ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｃに記載の方法。
１０Ｃ．融合タンパク質が、３０ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｃに記載の方法。
１１Ｃ．融合タンパク質が、６０ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｃに記載の方法。
１２Ｃ．融合タンパク質が、９０ｍｇの用量で投与される、実施形態５Ｃに記載の方法。
１３Ｃ．融合タンパク質が、皮下注射により投与される、実施形態１Ｃに記載の方法。
１４Ｃ．対象の食物摂取量を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を対象に週１回投与することを含み、当該融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１．０８ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される、方法。
１５Ｃ．当該融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．３６ｍｇ／ｋｇ、０．７２ｍｇ／ｋｇ、及び１．０８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される、実施形態１４Ｃに記載の方法。
１６Ｃ．融合タンパク質が、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ｃに記載の方法。
１７Ｃ．融合タンパク質が、０．０３ｍｇの用量で投与される、実施形態１５Ｃに記載の方法。
１８Ｃ．融合タンパク質が、０．０９ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ｃに記載の方法。
１９Ｃ．融合タンパク質が、０．１８ｍｇの用量で投与される、実施形態１５Ｃに記載の方法。
２０Ｃ．融合タンパク質が、０．３６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ｃに記載の方法。
２１Ｃ．融合タンパク質が、０．７２ｍｇの用量で投与される、実施形態１５Ｃに記載の方法。
２２Ｃ．融合タンパク質が、１．０８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５Ｃに記載の方法。
２３Ｃ．融合タンパク質が、皮下注射により投与される、実施形態２２Ｃに記載の方法。
以下の本発明の実施例は、本発明の本質を更に説明するためのものである。当業者であれば、上記の説明及び以下の例示的な実施例を利用することで、本発明を製造及び使用し、特許請求される方法を実施することが可能であるものと考えられる。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項によって定められる点を理解されたい。
実施例１：ＧＤＦ１５を含む融合分子の設計（ＧＤＦ１５の短縮化の影響）
他のＴＧＦβファミリーのメンバーと同様、ＧＤＦ１５は、小胞体内で二量体を形成し、フーリン様に切断されて分泌型の成熟ＧＤＦ１５（アミノ酸１９７～３０８）を生じるプレプロタンパク質として合成される。分泌型の成熟ＧＤＦ１５ホモ二量体は約２５ｋＤａであり、各単量体は最大で４つの分子内ジスルフィド結合を形成することができ、１つの分子間ジスルフィド結合によってホモ二量体の構成要素同士が連結されている。
本発明ではＧＤＦ１５の結晶構造を決定し、これを図１Ａ及び図１Ｂに示す。この結晶構造は、成熟ＧＤＦ１５のＣ末端が二量体の界面に埋め込まれているのに対して、Ｎ末端は露出していることを示している。この露出した末端は、ＧＤＦ１５のＮ末端に対する半減期延長タンパク質などの融合タンパク質の連結を可能とする。
この結晶構造は、ＧＤＦ１５のシステイン残基の新規なジスルフィドのペアリングパターンも示している。ＴＧＦβ１がＣ１～Ｃ３及びＣ２～Ｃ７のペアリング（すなわち、その１番目と３番目のシステイン残基間のペアリングと、その２番目と７番目のシステイン残基間のペアリング）を有しているのに対して、ＧＤＦ１５はＣ１～Ｃ２及びＣ３～Ｃ７のペアリングを有している（図１Ａ及び図１Ｂを参照）。この固有のジスルフィドペアリングは、タンパク質のＮ末端に、他のジスルフィド結合を含むシステインノットから離れて位置するＣ１～Ｃ２ペアリングによって形成されたループを生じる。この構造により、ＧＤＦ１５のＮ末端が二量体の形成又は全体のタンパク質のフォールディングにとって重要ではない可能性があり、ＧＤＦ１５及びそのＮ末端融合タンパク質は、Ｃ１及びＣ２、Ｃ１～Ｃ２ループ内の残基、又は更にはＣ２のＣ末端側の残基を欠失させるＮ末端欠失によっても影響を受けない可能性が予測される。
実施例２：ＧＤＦ１５を含む融合分子の設計（リンカーの影響）
ＨＳＡ分子とＧＤＦ１５分子との間の異なるリンカーについて評価した。配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを含む可撓性リンカーと、配列（ＡＰ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎを含む構造化リンカー（ただし、ｎは２～２０である）の両方を評価した。
異なるリンカーを含む融合タンパク質を、それらの生物物理特性、痩身マウスの食物摂取の効果に対するそれらの影響、それらのマウスでの薬物動態（ＰＫ）値、及びヒト血液中でのそれらのｅｘ ｖｉｖｏ安定性について比較した。試験したリンカー変異体の結果を表１に示す。（ＥＡＡＡＫ）８リンカーを含む、配列番号３１を含む分子は、ＨＰＬＣにより凝集を示した。表１の残りの７種類のリンカー変異体は、凝集を示さなかった。
Figure 2022513098000002
 ＊精製目的でＮ末端に６ｘＨｉｓタグを結合した
これらの変異体においても、マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ試験により、また、ヒトの全血及び血漿試料中でのｅｘ ｖｉｖｏ安定性試験により、リンカーの安定性を評価した。２つの検出の形態を用いてこれらの試験からの結果を分析した。抗ＧＤＦ１５捕捉抗体と抗ＨＳＡ検出抗体のペアを用いたイムノアッセイを用いて、リンカーの両側の両分子の存在を測定することにより、リンカーがどの程度、完全であるかを評価した。分子全体の完全性の大まかな状態を、ＨＳＡ及びＧＤＦ１５からの異なる代理ペプチド配列を用いて液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分析した。イムノアッセイは、全てのリンカー変異体について安定したＰＫプロファイルを示し、いずれのリンカー変異体についても血漿中の試料濃度のスパイクの消失は４８時間にわたって認められなかった。ＬＣ－ＭＳの結果はイムノアッセイと一致し、ＨＳＡ及びＧＤＦ１５分子の異なる部分からの代理ペプチドが完全であることを示した。代理ペプチドを用いてＬＣ－ＭＳにより分析したリンカー変異体のＰＫプロファイルは、異なるリンカー変異体で同様の傾向を示し、いずれのリンカー変異体も７日目において検出可能なレベルを示した。表１の全ての変異体は、配列番号３１を除き、所望の生物物理特性及びＰＫ値を示した。
各リンカー変異体を、痩身マウスで食物摂取試験を行うことによりそれらのｉｎ ｖｉｖｏ活性について評価した。表２は、食物摂取量の減少における融合タンパク質の効果に対するリンカー変異体の影響を示す。効果に対するリンカーの明らかな影響が認められた。柔軟な（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーでは、リンカーの長さを２個～４個～８個に増やすことで融合タンパク質の効果が大幅に増大した。より固い（ＡＰ）ｎリンカーでは、この傾向はそれほど顕著ではなく、融合タンパク質内のＧＤＦ１５分子の自由度がその効果に重要な役割を果たしていることを示唆している。
Figure 2022513098000003
 ＊精製目的でＮ末端に６ｘＨｉｓタグを結合した
実施例３：ＧＤＦ１５を含む融合分子の設計（ＨＳＡ突然変異の影響）
半減期延長タンパク質としてのヒト血清アルブミンを、ＧＤＦ１５のＮ末端にリンカーによって融合させた組換えタンパク質を設計した。この設計によれば、ＧＤＦ１５の二量体化のための界面が不安定化しないため、天然の分子間鎖ジスルフィド結合が形成され、融合されたＨＳＡタンパク質がそれぞれのＧＤＦ１５アームから伸びたＧＤＦ１５ホモ二量体が得られる。このアプローチによれば、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５ホモ二量体を作製するうえで１個の遺伝子しか必要としない。
天然のヒト血清アルブミンタンパク質は、１７個のジスルフィド結合を形成する３５個のシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）残基を含んでおり、Ｃｙｓ－３４残基が分子中で唯一の遊離システインである。この遊離Ｃｙｓ－３４は、複数の活性酸素種（ＲＯＳ）及び活性窒素種（ＲＮＳ）を捕捉することにより、フリーラジカルスカベンジャーとして機能することが示されている。そこでこの遊離Ｃｙｓを変異させて酸化による不均一性が生じるリスクを最小とした。
ＨＳＡの３４位の遊離システインをセリン又はアラニンに変異させ、これらのＨＳＡ（Ｃ３４Ｓ）又はＨＳＡ（Ｃ３４Ａ）変異を有するＧＤＦ１５融合分子を分析した。これらの分子はいずれも、（ｉ）イオン交換クロマトグラフィー、（ｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び（ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィー、の３段階の精製方法を用いて精製した。これらの分子が最初に作製された時点では、ＨＰＬＣ分析はどちらの分子も純粋であり、凝集がないことを示した（表３）。
しかしながら、作製の２週後、ＨＳＡ（Ｃ３４Ｓ）変異を有する融合タンパク質（配列番号４８を含む）は、ＨＰＬＣにより凝集を示したのに対して、ＨＳＡ（Ｃ３４Ａ）変異を有するタンパク質（配列番号４０）は、４週後でも凝集がないままであった。
Figure 2022513098000004
実施例４：ＧＤＦ１５のプロテアーゼ切断傾向
本発明者らはＧＤＦ１５のアミノ酸位置１９８のアルギニン残基（Ｒ１９８）がＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合分子内でプロテアーゼ分解を受けやすいことを観察した。このような分解によって不均一な集団が生じ、治療組成物としては望ましくない。このような切断は、プロテアーゼ阻害剤カクテルによって防止することができる。各精製方法をプロテアーゼの除去について調べた。表４に、ＨＰＬＣにより測定される、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合タンパク質の精製について試験した２種類のＨＳＡアフィニティーカラムを示す。精製の時点で、いずれの方法によって精製されたＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合タンパク質も純度１００％であり、完全であった。低濃度（２～５ｍｇ／ｍｌ）では、いずれの方法により精製されたタンパク質も４週間の試験期間全体にわたって完全に保たれた。しかしながら、高濃度（４０～５０ｍｇ／ｍｌ）では、抗体に基づいたＨＳＡ樹脂（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ社）のみがプロテアーゼを含まないタンパク質を生じ、これは４週間の試験期間全体にわたって完全に保たれた。ＨＳＡ－リガンドに基づいた樹脂（Ａｌｂｕｐｕｒｅ社）により得られたタンパク質は、初期には完全であったが、高濃度で保存した場合、時間とともに分解した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ）及びＥＤＴＡの添加により、Ａｌｂｕｐｕｒｅ社の樹脂を用いて精製された高濃度のＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合タンパク質の分解は完全に停止した。したがって、精製法は、安定した治療組成物を生成するうえで重要な役割を担っている。これに相当する分解は、ｉｎ ｖｉｖｏでもｅｘ ｖｉｖｏでも観察されず、治療組成物がいったんプロテアーゼを含まないものとして調製されると、融合タンパク質の分解はｉｎ ｖｉｖｏでは問題とならないことを示している。したがって、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ社の樹脂を用いた方法のように、製造時に潜在的なプロテアーゼを効果的に除去することができる精製法は、均質で完全かつ安定したＧＤＦ１５治療薬を効果的に製造するうえで不可欠である。
Figure 2022513098000005
実施例５：ＧＤＦ１５のＮ末端欠失変異体
図１Ａ及び図１Ｂに示されるＧＤＦ１５結晶構造によれば、欠失変異体に関与するＧＤＦ１５のＮ末端は、二量体形成及び全体のタンパク質フォールディングにとって重要ではないことが予測される。この結晶構造によれば、このようなＮ末端欠失はいずれの潜在的な受容体相互作用にも影響しないことも予測される。ＧＤＦ１５のＮ末端の様々な欠失を含むＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ活性について試験した。
ＧＤＦ１５のプロテアーゼ切断部位（Ｒ１９８）を除去したＧＤＦ１５のＮ末端欠失変異体を設計した。Ｒ１９８残基の直後には残基Ｎ１９９～Ｇ２００の潜在的脱アミノ化部位があるが、基質の脱アミノ化は治療組成物ではやはり好ましくない。ＧＤＦ１５のＮ末端欠失は、タンパク分解切断部位及び脱アミノ化部位の両方を除去することができる。ＨＳＡとの融合タンパク質に組み込まれた、得られたＧＤＦ１５欠失変異体は、ＧＤＦ１５（２０１～３０８；配列番号８）、ＧＤＦ１５（２０２～３０８；配列番号９）、及びＧＤＦ１５（２１１～３０８；配列番号１１）を含んでいた。マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ試験により、ＧＤＦ１５のＮ末端欠失変異体は食物摂取量を低減させるうえで依然活性を有していることが示された（図１７）。試験の結果より、これらのＧＤＦ１５のＮ末端欠失変異体は、適正に発現され、適切な二量体を形成し、ｉｎ ｖｉｖｏで活性であることが確認された。
実施例６：ＧＤＦ１５の不活性突然変異体
表５は、ＧＤＦ１５のｉｎ ｖｉｖｏ活性を消失させ、ＧＤＦ１５の機能的エピトープを同定するために作製したＧＤＦ１５の１２種類の突然変異体を示している。これらの突然変異体には、５種類の１重突然変異体、２種類の２重突然変異体、及び５種類の３重突然変異体が含まれる。これらの突然変異を含むＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合タンパク質をそれらの生物物理特性及び活性について特性評価を行った（表５）。１２種類の突然変異体のうち、１つは発現がみられず、４つは時間とともに凝集体を形成し、これらの変異がタンパク質フォールディング及び生物物理特性を妨げることを示した。残りの７種類の突然変異体のうち、４つはＧＤＦ１５の１重突然変異を有するものであり、これらの変異体を、マウスで野生型と比較した食物摂取量の低下について試験した。３つの１重突然変異体（Ｉ８９Ｒ、Ｉ８９Ｗ及びＷ３２Ａ）はｉｎ ｖｉｖｏ活性を失ったが、残りの変異体（Ｑ６０Ｗ）は野生型と同様の活性を示した。これらの結果は、Ｉ８９Ｒ、Ｉ８９Ｗ及びＷ３２Ａ変異が、ＧＤＦ１５の受容体／共受容体との相互作用を妨げることを示し、ＧＤＦ１５の機能性エピトープが残基Ｉ８９及びＷ３２の周辺にあることを示唆するものであった。突然変異の番号付けは、融合タンパク質中に存在する成熟ＧＤＦ１５に基づいている。例えば、「１」は成熟ＧＤＦ１５（配列番号６）の１番目のアミノ酸を指し、「８９」は成熟ＧＤＦ１５タンパク質の８９番目のアミノ酸を指す。
Figure 2022513098000006
 ＊精製目的でＮ末端に６ｘＨｉｓタグを結合した
実施例７：発現及び精製方法
発現
２０ｍｌよりも多く発現させるため、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地中で増殖させたＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞を用いて発現を行った。細胞を８％ＣＯ２下で１２５ＲＰＭで振盪しながら３７℃で増殖させた。Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現キットを使用して細胞を１ｍｌ当たり２．５×１０６個でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞１Ｌにつき、１ｍｇの全ＤＮＡを２５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈し、２．６ｍｌのＥｘｐｉ２９３（商標）試薬を２５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈し、室温で５分間インキュベートした。希釈したＤＮＡと希釈したＥｘｐｉ２９３試薬を加え合わせ、室温で２０分間インキュベートした。次に、このＤＮＡ複合体を細胞に加えた。細胞を振盪インキュベーターに一晩入れた。トランスフェクションの翌日、５ｍｌのキットのＥｎｈａｎｃｅｒ１を５０ｍｌのキットのＥｎｈａｎｃｅｒ２に希釈し、２つのＥｎｈａｎｃｅｒの全量を細胞に加えた。トランスフェクトした細胞をインキュベーター内に再び４日間戻してから収穫した。細胞を６０００ｇで３０分間遠心分離して濃縮した後、精製工程に先立って０．２μｍのフィルターで濾過した。
発現をＣＨＯ細胞でも行った。プラスミドを精製し、特性評価を行った。トランスフェクションに先立ち、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５のコーディング領域を含むプラスミドＤＮＡ２００μｇの１つのアリコートをＡｃｌ Ｉによる制限酵素消化によって直鎖化した。この制限エンドヌクレアーゼによる消化によって、アンピシリン耐性遺伝子が確実に除去される。２つの１５μｇの直鎖化ＤＮＡアリコートを、ＢＴＸ ＥＣＭ ８３０Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌマニピュレータ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、マサチューセッツ州ホリストン）を使用して２つの１×１０７細胞（トランスフェクションプールＡ及びＢとした）にトランスフェクトした。細胞を、電極ギャップ４ｍｍのキュベット中、１５ミリ秒のパルス長及び５秒のパルス間隔で２５０Ｖで３回電気穿孔した。トランスフェクトした細胞を振盪フラスク内のＭＡＣＨ－１＋Ｌ－グルタミンに移し、１日間インキュベートした。トランスフェクションプールＡ及びトランスフェクションプールＢを遠心し、ＭＡＣＨ－１＋ＭＳＸ中に再懸濁し、振盪フラスコに移して６日間インキュベートした。トランスフェクションプールＡ及びトランスフェクションプールＢからのトランスフェクトしたＨＳＡ融合タンパク質産生細胞をプールし、電気穿孔から８日目にメチルセルロースに播種した。
精製
ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ樹脂及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いた２段階精製を用いた。一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３（商標）細胞からの細胞上清を、樹脂１ｍｌ当たりタンパク質１０ｍｇの適当な容量で、予め平衡化した（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＨＳＡ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より販売されるＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトアルブミンアフィニティーマトリクス）にロードした。ローディング後、未結合タンパク質をカラム容量（ＣＶ）の１０倍量のＰＢＳ（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄することによって除去した。カラムに結合したＨＳＡ－ＧＤＦ１５を１０ＣＶの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）中の２Ｍ ＭｇＣｌ２で溶出した。ピーク画分をプールし、濾過（０．２μ）し、４℃のＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析した。透析後、タンパク質を再び濾過し（０．２μ）、適当な容量にまで濃縮した後、２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードした。高い純度でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）から溶出したタンパク質画分（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定したもの）をプールした。タンパク質の濃度は、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＴＭ分光光度計で２８０ｎｍの吸光度で測定した。精製したタンパク質の質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び分析用サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ、Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ社）によって評価した。内毒素レベルをＬＡＬアッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）－Ｔ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ社）を用いて測定した。
Ａｌｂｕｐｕｒｅ樹脂及びＳＥＣを用いた２段階精製を用いた。ＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合タンパク質を、ＨＳＡに選択的に結合するように固定化した合成トリアジンリガンドを用いたＡｌｂｕＰｕｒｅ樹脂（ＰｒｏＭｅｔｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて室温で精製した。発現用上清をＡｌｂｕＰｕｒｅ樹脂に流した。次いで、樹脂を最初に４ＣＶのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で、次に４ＣＶの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファで洗浄した。カラムに結合したＨＳＡ－ＧＤＦ１５を１００ｍＭのオクタン酸Ｎａを含む４ＣＶのＰＢＳバッファ（ｐＨ７．２）で溶出した。タンパク質を含む画分を、カットオフ値が分子量３０，０００ｋＤａのスピンコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ社）を使用して１０ｍＬの容量にまで濃縮してから、ＰＢＳバッファ（ｐＨ７．２）で平衡化した２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ｐｇカラム（ＧＥ）に流した。ＨＳＡ－ＧＤＦ１５二量体を含むＳＥＣ画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより同定し、分析用にプールした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥ－ＨＰＬＣによりタンパク質の純度を評価した。
実施例８～１４、及び実施例１９では、配列番号６０のアミノ酸配列を有する本発明の例示的な融合タンパク質の特性評価を行っている。この融合タンパク質は、グリシン及びセリン残基からなるアミノ酸４２個のリンカーＧＳ－（ＧＧＧＧＳ）８を介した、ＨＳＡの成熟ヒトＧＤＦ１５との融合体のホモ二量体として存在する完全な組換えタンパク質である。この融合タンパク質の予測される分子量は、１６２，６９６Ｄａであり、ＨＳＡの３４位の１個の天然遊離システインがセリンに変異している。この特定のＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合タンパク質を、簡潔にするために、以下の実施例では単に「ＦＰ１」と呼ぶものとする。ＡＳ－（ＧＧＧＧＳ）ｘ８－ＧＴリンカーを含むＦＰ１の６ｘＨｉｓタグ付加変異体（６ｘＨｉｓ－ＦＰ１、配列番号２６）を、以下の実施例の一部で比較のために使用した。
実施例８：Ｃ５７Ｂ１／６マウスの食物摂取量に対するＦＰ１の効果
この試験の目的は、Ｃ５７Ｂ１／６マウスの食物摂取の阻害に対するＦＰ１の用量応答性の効果を実証することであった。
雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＢｉｏＤＡＱケージ内で最低７２時間、環境順応させた。その後、マウスを食物摂取量に基づいて１群８匹ずつの６群に事前の２４時間にグループ分けした。午後４：００～５：００の間に、動物の体重を測定し、溶媒又はＦＰ１を含む組成物を皮下注射により投与した。各ケージについて、食物摂取量の変化をＢｉｏＤＡＱシステムにより、注射後４８時間にわたって継続的に記録した。この試験では、６ｘＨｉｓ－ＦＰ１を比較に用いた。
結果（図２及び表６）を、所定の時間間隔での累積食物摂取量の平均として表した。結果は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへのＦＰ１の皮下投与が、試験した全ての用量及び時点において食物摂取を溶媒処理した動物に対して有意に阻害したことを示した。６ｘＨｉｓ－ＦＰ１は、８ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で食物摂取を低減させた。
Figure 2022513098000007
 データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５；＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１；＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．００１；＊＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０００１
一元配置ＡＮＯＶＡ：テューキーの多重比較検定；ｎ＝８／群
実施例９：Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの食物摂取量に対するＦＰ１の効果
この試験の目的は、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの食物摂取の阻害に対するＦＰ１の用量応答性の効果を実証することであった。
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットをＢｉｏＤＡＱケージ内で最低７２時間、環境順応させた。その後、ラットを食物摂取量に基づいて１群８匹ずつの６群に事前の２４時間にグループ分けした。午後４：００～５：００の間に、動物の体重を測定し、溶媒又は融合タンパク質を含む組成物を皮下注射により投与した。各ケージについて、食物摂取量の変化をＢｉｏＤＡＱシステムにより、注射後４８時間にわたって継続的に記録した。この試験では、６ｘＨｉｓ－ＦＰ１を比較に用いた。
結果を図３及び図７に示す。ＦＰ１の皮下投与は、溶媒処理動物と比較して２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で食物摂取を阻害した。阻害率は、投与２４及び４８時間後で、試験した最高用量（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）でのみ有意差に達した。ＦＰ１は、用量８ｎｍｏｌ／ｋｇで食物摂取を低下させ、その効果は２４及び４８時間で有意であった。
Figure 2022513098000008
 データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５；＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１
一元配置ＡＮＯＶＡ：テューキーの多重比較検定；ｎ＝８／群
実施例１０：食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおけるグルコースホメオスタシス及び体重に対するＦＰ１の効果
この試験の目的は、ＤＩＯＣ５７Ｂｌ／６マウスに処理を行った２週間全体を通じて食物摂取量、体重、及びグルコースホメオスタシスに対するＦＰ１の効果を評価することであった。
雄性ＤＩＯマウスの体重を測定し、ＦＰ１を０、３、６、９、及び１２日目の３日ごと（ｑ３ｄ）に２ｍＬ／ｋｇを皮下投与した。溶媒処理群及びロシグリタゾン処理群に同様のレジメンでＰＢＳを投与した。対照のロシグリタゾンは、０．０１５％で食餌中で自由に与えた。マウス及び食餌重量を毎日記録した。血糖値測定器（Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｌｉｆｅｓｃａｎ、カリフォルニア州ミルピタス）を用いて血糖値を測定した。体脂肪量及び除脂肪量を、Ｂｒｕｋｅｒ Ｍｉｎｉ－Ｓｐｅｃ ＬＦ１１０を使用し、時間領域ＮＭＲ（ＴＤ－ＮＭＲ）により覚醒状態のマウスで定量した。経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）において、マウスを４時間絶食させた。２ｇ／ｋｇのグルコースを１０ｍＬ／ｋｇで強制経口投与した０、３０、６０、９０、及び１２０分後に尾を切って血糖値を測定した。グルコース投与の０、３０、及び９０分後にインスリンを測定した。
試験の終了時にマウスをＣＯ２吸入により安楽死させ、最終血液試料を採取した。血清を濡れた氷の入った９６穴プレートに入れた後、－８０℃で保存した。肝臓を摘出し、肝臓切片の合計質量に対する脂肪含量を、製造者の指示に従ってＢｒｕｋｅｒ ＭｉｎｉＳｐｅｃ ｍｑ６０でＴＤ－ＮＭＲを用いて評価した。
インスリン抵抗性の絶食ホメオスタシスモデル（ＨＯＭＡ－ＩＲ）を、絶食血糖値（ｍｇ／ｄＬ）とインスリン値（ｍＵ／Ｌ）との積を４０５の因数で割ることによって計算した。
ＤＩＯマウスを１ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ１によりｑ３ｄで処理することにより、体重（表８）及び食物摂取量（表９）が低下した。低下量は、下記に述べる特定の時点でのみ有意差に達した。
ＦＰ１は、ＤＩＯマウスで１（２～１４日目）及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（１～１４日目）の用量で体重を減少させた（表８及び図４）。食物摂取量の有意な低下は、１ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で試験の１及び２日目に、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で１、８、及び９日目に認められた（表９）。
Figure 2022513098000009
Figure 2022513098000010
試験１４日目に実施したＯＧＴＴにおいて、ＦＰ１は、試験した３つの用量全てで、時点０以降の全ての時点において溶媒処理動物と比較して血糖値を有意に低下させた（表１０）。これを、曲線下面積（ＡＵＣ）及びΔＡＵＣとして更に定量したところ、試験した３つの用量全てで溶媒と比較して有意に低かった（表１０及び図５Ａ及び図５Ｂ）。
Figure 2022513098000011
摂食血糖値を、試験開始（０日目）、７日目、及び１３日目に測定した（表１１、及び図６）。ＦＰ１は、試験の１３日目に１ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で血糖値を統計的に有意に低下させた。
Figure 2022513098000012
 データは平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝８／群
＊溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
ＯＧＴＴの間の血漿インスリン値は、ＦＰ１では、３０分において０．１ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で対応する溶媒群よりも有意に高く、同じ時点で１及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で低かった（表１２）。全ＡＵＣにより測定されるＯＧＴＴの間のインスリン変動は、０．１ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ１の用量では溶媒群よりも高く（表１２）、１及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量ではより低かった。いずれの場合も、最低用量においてのみ有意差に達した。９０分の時点で１及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ１で処理したマウスはより低いインスリン値を示したが、この効果は統計的有意差を示さなかった。インスリン感受性の指標として用いたＨＯＭＡ－ＩＲは、試験の１４日目に測定した。この時点で、ＦＰ１は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇでＨＯＭＡ－ＩＲを低下させ、インスリン感受性を改善した（表１３及び図７）。
Figure 2022513098000013
 データは平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝８／群
＊溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
Figure 2022513098000014
 データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
ｎ＝８／群
＊溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
１３日目までに達成された体重減少の大きさは、いずれの用量でも絶対体脂肪量又は体脂肪率（％）の測定可能な変化を生じなかった（表１４）。１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量では、絶対除脂肪量に有意な減少が認められた。この減少は、除脂肪率（％）として表した場合には認められなかった。試験の１５日目に最終的な剖検を行って肝重量を測定した（表１５）。ＦＰ１は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で絶対肝重量及び体重の割合（％）としての肝重量を減少させた。１ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で減少が認められたが、これはどちらのパラメータでも有意差には達しなかった。肝脂肪を生検でＮＭＲにより測定した（表１６）。ＦＰ１融合タンパク質は、１及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、肝生検重量の割合（％）として表される肝脂肪含有率を減少させた。この低下はより高い用量で有意であった。
Figure 2022513098000015
 データは平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝８／群
＊溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
Figure 2022513098000016
 データは平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝８／群
＊溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
Figure 2022513098000017
 データは平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝８／群
＊溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
実施例１１：ｏｂ／ｏｂマウスにおける血糖値及び体重に対するＦＰ１の効果
この試験の目的は、肥満で高血糖症のレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおける８日間の処理にわたって体重及び血糖値に対するＦＰ１の効果を評価することにあった。
雄性ｏｂ／ｏｂマウスの体重を測定し、ＦＰ１を０、３、及び６日目の３日ごと（ｑ３ｄ）に２ｍＬ／ｋｇを皮下投与した。マウス及び食餌重量を毎日記録した。血糖値測定器を使用して血糖値を毎日測定した。試験の終了時にマウスを安楽死させ、最終血液試料を採取した。
ＦＰ１は、１ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて溶媒処理マウスに対して、２日目～８日目までに有意に体重を減少させた（開始体重の割合（％）として表される）。ＦＰ１は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて溶媒処理マウスに対して１日目～８日目までに体重を減少させた（開始体重の割合（％）として表される）（表１７及び図８）。
Figure 2022513098000018
 データは平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝８／群
＊溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
ＦＰ１は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて試験の１日目及び２日目、並びに４日目～８日目までに溶媒処理マウスに対して摂食血糖値を減少させた。１ｎｍｏｌ／ｋｇで血糖値の低下が観察されたが、この効果は有意差に達しなかった（表１８及び図９）。
Figure 2022513098000019
実施例１２：複数種における薬物動態
マウスにおける薬物動態
ＦＰ１を、雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ＰＢＳ（ｐＨ７）中、２ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内及び皮下投与した。両方の投与経路後に、血液試料を採取し、血清を処理して、薬物濃度を７日間にわたって測定した。ＦＰ１の濃度を、イムノアッセイ法により測定した。血清中の薬物濃度／時間プロファイルを表１９及び２０にまとめて示し、図１０に示す。
Figure 2022513098000020
Figure 2022513098000021
薬物動態学分析により、皮下及び静脈内投与後のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいてそれぞれ、１．６７及び１．５７日のＦＰ１の最終半減期が示された（表２１）。ＦＰ１は、皮下投与後に約７１％の平均バイオアベイラビリティーを示した。
Figure 2022513098000022
 注：＊Ｔｍａｘ（中央値）
ラットにおける薬物動態
ＦＰ１を、雌性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、ＰＢＳ（ｐＨ７）中、２ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内及び皮下投与した。両方の投与経路後に、血液試料を採取し、血清を処理して、薬物濃度を７日間にわたって測定した。ＦＰ１の濃度を、イムノアッセイ法により測定した。血清中の薬物濃度／時間プロファイルを表２２及び２３にまとめて示し、図１１に示す。
Figure 2022513098000023
Figure 2022513098000024
 ＊繰り返しの分析により結果を確認した
薬物動態学分析により、皮下及び静脈内投与後のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいてそれぞれ、１．３４及び１．５１日のＦＰ１の最終半減期が示された（表２４）。ＦＰ１は、皮下投与後に約２３％の平均バイオアベイラビリティーを示した。
Figure 2022513098000025
 注：＊Ｔｍａｘ（中央値）
サルにおける薬物動態
ＦＰ１を、ナイーブな雄性カニクイザル（Macaca fascicularis）に、ＰＢＳ（ｐＨ７）中、１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内及び皮下投与した。両方の投与経路後に、血液試料を採取し、血清を処理し、イムノアッセイバイオアナリシスを用いて、薬物濃度を２１日間にわたって測定した。血清中の薬物濃度／時間プロファイルを表２５及び２６にまとめて示し、図１２に示す。
Figure 2022513098000026
Figure 2022513098000027
薬物動態学分析により、皮下及び静脈内投与後のカニクイザルにおいてそれぞれ、８．５及び９．２日のＦＰ１の最終半減期が示され、皮下投与後の平均バイオアベイラビリティーは約８８％であった（表２７）。
Figure 2022513098000028
 注：＊Ｔｍａｘ（中央値）
免疫親和性捕捉ＬＣＭＳ分析を用いて、静脈内及び皮下投与後のカニクイザルの血清中に存在する完全な二量体の濃度を定量した（表２８及び２９、並びに図１３及び１４）。この方法により測定された濃度は、イムノアッセイ（ＩＡ）により測定された濃度と同様であり、ＦＰ１が完全な二量体として循環しており、カニクイザルでは検出可能な代謝不安定性はないことを示している。
Figure 2022513098000029
Figure 2022513098000030
静脈内及び皮下投与後のカニクイザル血清中の被検質の濃度も免疫親和性捕捉トリプシン消化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって測定した（表３０及び３１）。ＦＰ１内のＨＳＡ領域のＮ末端近く、ＧＤＦ１５のＮ末端近く、及びＧＤＦ１５のＣ末端近くにそれぞれ位置するトリプシン消化ペプチド、すなわち、ＡＬＶ（ＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫ）、ＡＳＬ（ＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲ）、及びＴＤＴ（ＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫ）を選択した。これらのペプチドをＦＰ１の代理ペプチドとして観察した。代理ペプチドの全ての濃度は互いと、また、イムノアッセイにより測定された濃度と同程度であり、ＦＰ１内のＧＤＦ１５配列が完全に保たれ、ｉｎ ｖｉｖｏで完全なＨＳＡ配列に連結されていることが示された。
Figure 2022513098000031
Figure 2022513098000032
ヒト血漿安定性アッセイ
この研究の目的は、ヒト血漿中のＦＰ１のｅｘ ｖｉｖｏ安定性を分析することにあった。新鮮な非凍結ヒト血漿を、遠心分離により２名の被験者（男性１人、女性１人）のヘパリン添加血から調製した。ＦＰ１を、静かに混合しながらこの基質中で、０、４、２４及び４８時間、３７℃でインキュベートした。ＦＰ１の濃度を、イムノアッセイ法により測定した。開始濃度（０時間）からの平均の差（％）は、－４．１～－１２．９の範囲であり、経時的な増加はみられず、ＦＰ１がｅｘ ｖｉｖｏのヒト血漿中で４８時間まで安定であることが示された（表３２及び図１５）。
Figure 2022513098000033
免疫親和性捕捉ＬＣＭＳを用いて、ヒト血漿中でのインキュベーション後に存在する完全な二量体の濃度を定量した。この方法で測定された濃度は経時的（０、４、２４、及び４８時間）に安定であり、ＦＰ１が、ｅｘ ｖｉｖｏのヒト血漿中で最大４８時間、完全な二量体に保たれることが示された（表３３及び図１６）。
Figure 2022513098000034
実施例１５～１９では、配列番号９２のアミノ酸配列（配列番号９５（コドン最適化１）及び配列番号１１０（コドン最適化２）のヌクレオチド配列によりコードされる）を有する、実施例５で述べた本発明の例示的な融合タンパク質の特性評価を行う。この融合タンパク質は、グリシン及びセリン残基からなるアミノ酸４２個のリンカーＧＳ－（ＧＧＧＧＳ）８を介した、ＨＳＡ（Ｃ３４Ｓ）の成熟ヒトＧＤＦ１５の欠失変異体（２０１～３０８、配列番号８）との融合体のホモ二量体として存在する完全な組換えタンパク質である。ＨＳＡの３４位の１個の天然の遊離システインがセリンに変異している。この特定のＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合タンパク質を、簡潔にするために、以下の実施例では「ＦＰ２」と呼ぶものとする。
配列番号９２：
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ
実施例１３：ＦＰ２のｉｎ ｖｉｔｒｏアゴニスト効力
ＦＰ２のｉｎ ｖｉｔｒｏのアゴニスト効力を、ヒトＧＤＦ１５受容体（ＧＦＲＡＬ）を安定的に過剰発現するＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞を用いた細胞ベースのｐＡＫＴアッセイを用いて評価した。ＧＦＲＡＬ活性を、ヒトＧＦＲＡＬを過剰発現させるために安定的にトランスフェクトされたＳＫ－Ｎ－ＡＳヒト神経芽腫細胞（ＡＴＣＣ）中のリン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）レベルを測定することによって決定した。様々な濃度の試験物を有するＧＦＲＡＬ発現細胞を処理した後のＡＫＴのリン酸化を、製造元の指示に従ってＰｈｏｓｐｈｏ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）Ａｓｓａｙキット（Ｃｉｓｂｉｏ，Ｂｅｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して測定した。得られたデータを使用して、Ｐｒｉｓｍ統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いＥＣ５０値を計算した。ＦＰ２は、２．９０８±０．２３９ｎＭ（Ｎ＝３）の半数効果濃度（ＥＣ５０）でｐＡＫＴを活性化した。天然のＧＤＦ１５はアッセイの対照として機能し、０．１５３±０．００８ｎＭ（Ｎ＝３）のＥＣ５０でアゴニスト活性を示した。
実施例１４：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの食物摂取量に対するＦＰ２の効果
ＦＰ２を、単回投与後に雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの食物摂取量を低下させる性質について評価した。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ニューヨーク州ハドソン）より入手した雄性Ｃ５７Ｂｌ／６Ｎマウス（１０～１２週齢）を試験で使用した。マウスは、１２時間の明暗サイクル（午前６時／午後６時）を行った調温室内で１匹ずつ収容し、水及び食餌を自由に取らせた。雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスはＢｉｏＤＡＱケージ内で最低７２時間、環境順応させた。その後、マウスを食物摂取量に基づいて１群８匹ずつの６群に最後の２４時間にグループ分けした。午後４：００～５：００の間に、動物の体重を測定し、溶媒又は化合物を皮下注射により投与した。各ケージについて、食物摂取量の変化を、ＢｉｏＤＡＱシステムにより、化合物の投与後４８時間にわたって継続的に記録した。この試験では、６ｘＨｉｓ－ＦＰ１を比較に用いた。
ＦＰ２は、試験した全ての用量レベルにおいて投与１２、２４、及び４８時間後に食物摂取量を低減させる有意な効果を示した（表３４）。マウスで全ての時点及び全ての用量レベルにおいてＰＢＳに対して食物摂取量の変化率（％）の低下がみられた（表３５）。
Figure 2022513098000035
 データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
それぞれ、＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５
＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１
＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．００１
＊＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０００１
使用した統計分析法は、ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定である。
６ｘＨｉｓ－ＦＰ１の８ｎｍｏｌ／ｋｇ投与群（ｎ＝６）を除き、ｎ＝８／群とした。
Figure 2022513098000036
 ＦＰ２の食欲抑制効果を、それぞれのＰＢＳコントロールと比較した食物摂取量の相対低下率として表す。
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
それぞれ、＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５
＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１
＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．００１
＊＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０００１
使用した統計分析法は、ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定である。
６ｘＨｉｓ－ＦＰ１の８ｎｍｏｌ／ｋｇ投与群（ｎ＝６）を除き、ｎ＝８／群とした。
実施例１５：Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの食物摂取量に対するＦＰ２の効果
ＦＰ２を、単回投与後に雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの食物摂取量及び体重増加を低下させる能力について評価した。動物は、体重２００～２２５ｇのものをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より得、配送の１週間以内に使用した。動物は、１２時間の明暗サイクルを行った調温室内で、Ａｌｐｈａドライ床材及び濃縮用プラスチックチューブの入ったケージに１匹ずつ収容した。ラットには自由に水を摂取させ、試験用のげっ歯類の食餌；Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ＰｉｃｏＬａｂ（登録商標）Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ２０，５Ｋ７５＊（Ｐｕｒｉｎａ Ｍｉｌｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ｖｉａ ＡＳＡＰ Ｑｕａｋｅｒｔｏｗｎ，ＰＡから供給された）を与えた。投与に先立って各ラットについて動物の体重を測定し、記録した。
動物はＢｉｏＤＡＱケージ内で最低７２時間、環境順応させた。その後、ラットを食物摂取量に基づいて１群８匹ずつの６群に最後の２４時間にグループ分けした。午後４：００～５：００の間に、動物の体重を測定し、溶媒又は化合物を皮下注射により投与した。各ケージについて、食物摂取量の変化を、ＢｉｏＤＡＱシステムにより、化合物の投与後４８時間にわたって継続的に記録した。この試験では、６ＸＨｉｓ－ＦＰ１を比較に用いた。
ＦＰ２の単回投与後に食物摂取量の用量依存的な低下について試験した。０．３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量では、食物摂取量に有意差は認められなかった。１ｎｍｏｌ／ｋｇでは、食物摂取量を低下させる有意な効果が１２時間で認められたが、２４又は４８時間では認められなかった。３及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは、食物摂取量の有意な低下が全ての時点で認められた（表３６、図１９）。全ての時点及び全ての用量レベルにおいてＰＢＳに対して食物摂取量の変化率（％）の低下がみられた（表３７）。
Figure 2022513098000037
 データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
それぞれ、＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５
＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１
＊＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．００１
使用した統計分析法は、ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定である。
ｎ＝８／群
Figure 2022513098000038
 ＦＰ２の食欲抑制効果を、それぞれのＰＢＳコントロールと比較した食物摂取量の相対低下率として表す。
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
それぞれ、＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５
＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１
＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．００１
使用した統計分析法は、ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定である。
ｎ＝８／群
実施例１６：食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの食物摂取量、体重、及びグルコースホメオスタシスに対するＦＰ２の効果
ＦＰ２を、８日間にわたって雄性ＤＩＯ Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに反復投与し、食物摂取量及び体重を低下させ、グルコースホメオスタシスを改善する能力について評価した。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ニューヨーク州ハドソン）より入手した雄性ＤＩＯ Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（２１週齢、高脂肪食を１５週間与えたもの）を試験で使用した。マウスは、１２時間の明暗サイクル（午前６時／午後６時）を行った調温室内で１匹ずつ収容し、水を自由摂取させ、研究用食事Ｄ１２４９２（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ社、ニュージャージー州ニューブランズウィック）を与えた。マウスを１週間以上マウス飼育室で環境順応させてから試験に供した。試験のエンドポイントは、食物摂取量、体重、体組成、及び血糖エンドポイント（ＯＧＴＴ、血糖値）の測定値とした。投与の１日前に動物の体重を測定し、体重（ＢＷ）別にグループ分けした。皮下注射によりマウスに投与した。ＦＰ２を投与した動物には、この化合物を０日目、３日目、及び６日目、９日目、及び１２日目に投与した。溶媒群及びロシグリタゾン群には、滅菌ＰＢＳをこれらの日に同様に投与した。ロシグリタゾンは、０．０１５重量／重量％で食餌中で自由に与えた。体重及び食物摂取量を、１５日間にわたり毎日記録した。血糖値を０、７、及び１３日目に測定した。経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を１４日目に実施した。ＯＧＴＴの間、インスリン値を選択された時点に測定した。１５日目にマウスをＣＯ２で安楽死させ、曝露用の最終血液試料を心臓穿刺により採取した。各投与群３匹のマウスで合計１５匹のマウスで別々のＰＫアームを行った。
ＤＩＯマウスにおけるＦＰ２に対する曝露－反応（Ｅ－Ｒ）分析
薬力学（ＰＤ）（効果）アームの大半の動物が、おそらくは免疫原性のために、薬物動態（ＰＫ）試料を得た最後の試験日には検出不能な薬物濃度を有していた。したがって、ＰＤアームからの個々のＰＫの代わりに、ＰＫアームからの平均ＰＫプロファイルを使用して、対応する用量レベルでＰＤアームのベースラインからの体重変化率（％）について曝露－反応（それぞれ、３、６及び９日目）を実施した。この方法では、ＰＫアームが薬物曝露に関してＰＤアームと同様の挙動を示すと仮定している。
Ｅｍａｘモデル（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６、反応に対するアゴニストの対数値）を用いて曝露量を反応データと相関させた（対数値を薬物濃度に変換した）。Ｈｉｌｌ Ｓｌｏｐｅは１に設定した。ＥＣ５０値に対してＥＣ１０を当てはめたモデルは、Ｅｍａｘ推定値が異なった（Ｅｍａｘ＝それぞれ、－４．２６％、－８．１８％及び－９．８５％）にもかかわらず、３、６及び９日目で２倍以内であった。９日目に、一部の動物が、潜在的なＡＤＡの形成のために薬物曝露の消失をやはり示したため、９日目のデータに基づいたＥ－Ｒパラメータは解釈に注意を要する。
食物摂取量、体重、グルコースホメオスタシス、及び肝脂肪含有率に対する２週間のＦＰ２の曝露の効果を、食餌誘発性肥満雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスで評価した。０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群の１．７～３．３ｎＭのＦＰ２、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群の７．１～１４ｎＭ、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群の２０．８～４１．６ｎＭ、及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群の２８．５～１１２．９ｎＭのＦＰ２のトラフ曝露値を、試験のＰＫアームで９日目まで維持した（ｎ＝２又は３、表４９）。９日目以降、ｑ３ｄ投与を継続したにもかかわらず、循環値の減少が大半の動物で認められた（表４９）。この加速したクリアランスと一致して、試験のＰＤアームの動物の大半が１５日目に検出不能なＦＰ２の循環値を有していた（表５０）。
ｑ３ｄのＦＰ２によるＤＩＯマウスの処理は、溶媒処理（表４３及び図２３）と比較して、食物摂取量（表３８）、体重（表３９、４０及び図２０）、及び摂食血糖値を低下させた。食物摂取量の有意な低下が、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇでは２日目、５日目、及び８日目で、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは１日目～７日目を通じて、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは１日目、２日目、４日目～６日目、及び８日目に、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは１日目、３日目～６日目、８日目、及び９日目でみられた。体重変化率（％）は、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇでは５日目～１３日目で、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは３日目～１３日目で、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは４日目から１３日目で有意であった。体重の変化（ｇ）は、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇでは８日目から、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは６日目から、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは７日目から、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは５日目から有意であった。摂食血糖値の減少は、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルの動物では７日目で有意であり、３．０及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルの動物では１３日目で有意であった。
ｑ３ｄのＦＰ２で処理したＤＩＯマウスは、経口グルコースチャレンジにおいて溶媒処理群と比較して１４日目に耐糖能の改善がみられた（表４１、図２１Ａ及び２１Ｂ）。血糖値は、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ群では３０分で、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ群では６０分及び１２０分で、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇ群では１２０分で、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇ群では３０、９０、及び１２０分で有意に低かった。全曲線下面積は、全ての投与群で有意であった。グルコースチャレンジにおけるインスリン値は、０．３及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇ群で３０分で有意に低かった（表４２、図２２Ａ及び２２Ｂ）。更に、溶媒処理動物と比較して、１４日間の１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２によるｑ３ｄ処理後のＤＩＯマウスで絶食ＨＯＭＡ－ＩＲ計算値に有意な低下がみられ、インスリン感受性の改善を示した（表４４及び図２４）。
試験開始前の－１日目及び１３日目にＭＲＩにより体組成を測定した（表４７及び表４８）。１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２で処理したＤＩＯマウスが１３日目に体脂肪量の有意な低下を示したのに対して、いずれの処理群でも除脂肪量の変化はみられなかった。１３日目に、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群は、溶媒処理群と比較して除脂肪率（％）の有意な増加及び体脂肪率（％）の有意な低下を示した。－１日目～１３日目の変化は除脂肪量について０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群で有意であり、除脂肪率（％）について１．０、３．０、及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群で有意であった。－１日目～１３日目の変化は、溶媒と比較して全ての処理群で体脂肪量及び除脂肪率（％）について有意であった。
溶媒処理動物と、ｑ３ｄのＦＰ２で１５日間処理したマウスとの間で内因性マウスＧＤＦ１５の血清レベルに有意差はみられなかった（表４６）。
結論：これらの結果は、高い薬物曝露が概して、３、６、及び９日目に試験した投与群全てにおいて、集団レベルでベースラインからのより大きな体重変化率（％）を伴うことを示している。
２週にわたるＦＰ２への曝露は、ＤＩＯマウスで食物摂取量の低下、体重減少、血糖値の減少、耐糖能及びインスリン感受性の改善につながった。ｑ３ｄの１．０、３．０、及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇで複数の日数にわたって食物摂取量の有意な減少が得られた。試験開始の３日～５日後から体重が有意に減少した。１３日目の摂食血糖値は３．０及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２のｑ３ｄ投与後に有意に減少した。絶食ＨＯＭＡ－ＩＲの有意な減少により示されるインスリン感受性は、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２のｑ３ｄ投与の１４日後に得られた。１３日目に、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２でｑ３ｄ処理されたＤＩＯマウスにおいて、除脂肪率（％）の有意な増大及び体脂肪率（％）の有意な減少が認められた。
Figure 2022513098000039
 各値は、ｎ＝７の場合（＾により示される）を除き、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ、テューキーの多重比較検定である。
Figure 2022513098000040
 各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ、テューキーの多重比較検定である。
Figure 2022513098000041
 各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ、テューキーの多重比較検定である。
Figure 2022513098000042
 各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、血糖値については、二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ、テューキーの多重比較検定、
ＡＵＣについては、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
Figure 2022513098000043
 各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、インスリン値については、二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ、テューキーの多重比較検定、
ＡＵＣについては、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
Figure 2022513098000044
 各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ、テューキーの多重比較検定である。
Figure 2022513098000045
 各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
Figure 2022513098000046
 各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
Figure 2022513098000047
 各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
Figure 2022513098000048
 各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
Figure 2022513098000049
 各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
Figure 2022513098000050
 データは、各動物における濃度として表す。
＜ＬＯＱ＝定量限界未満；ＬＯＱは０．４９４ｎＭである。
＊＊３、６、９及び１２日目の値は、次の投与の直前の値である。
Figure 2022513098000051
 データは、各動物における濃度として表す。
＜ＬＯＱ＝定量限界未満；ＬＯＱは０．４９４ｎＭである。
実施例１７：ＦＰ２の複数種における薬物動態及び免疫応答
マウスにおける薬物動態
ＦＰ２を雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに皮下投与した場合の薬物動態特性を評価した。ＦＰ２を雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｓａｇｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ミズーリ州セントルイス）にＰＢＳ（ｐＨ７．３～７．５）中、２．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、皮下（各時点につきｎ＝５の試料）及び静脈内（各時点につきｎ＝５の試料）投与した。最後の時点の試料の採取は、最終瀉血により行った。血液試料を採取し、血清を処理し、薬物濃度を１６８時間まで測定した。ＦＰ２の濃度は、イムノアッセイ法により測定した。血漿中の薬物濃度プロファイルを表５１及び５２にまとめて示し、図２５に示す。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＦＰ２の薬物動態分析により、静脈内及び皮下投与後の最終半減期は、それぞれ約１．５１日及び約１．７６日であり、皮下投与後の平均バイオアベイラビリティーは約６１％であることが示された。
Figure 2022513098000052
Figure 2022513098000053
Figure 2022513098000054
ラットにおける薬物動態
ＦＰ２をＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（Ｓａｇｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ミズーリ州セントルイス）にＰＢＳ（ｐＨ７．３～７．５）中、２．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、皮下（各時点につきｎ＝５の試料）及び静脈内（各時点につきｎ＝５の試料）投与した。最後の時点の試料の採取は、最終瀉血により行った。血液試料を採取し、血清を処理し、薬物濃度を１６８時間まで測定した。ＦＰ２の濃度は、イムノアッセイ法により測定した。血漿中の薬物濃度プロファイルを表５４及び５５にまとめて示し、図２６に示す。これらのデータから計算した薬物動態パラメータを表５６にまとめて示す。
Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットにおけるＦＰ２の薬物動態分析により、静脈内及び皮下投与後の最終半減期は、それぞれ約１．４６日及び約１．３７日であり、皮下投与後の平均バイオアベイラビリティーは約２８％であることが示された。
Figure 2022513098000055
Figure 2022513098000056
Figure 2022513098000057
サルにおける薬物動態
ＦＰ２を、３匹の雄のカニクイザルにそれぞれＰＢＳ（ｐＨ７．０～７．６）中、１ｍｇ／ｋｇで皮下に、１ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した。血液試料を採取し、血漿を処理し、薬物濃度を２１日目まで測定した。
ＦＰ２の薬物動態（ＰＫ）を、カニクイザルに単回静脈内（ＩＶ）（１．０ｍｇ／ｋｇ）及び皮下（ＳＣ）（１．０ｍｇ／ｋｇ）投与した後に特性評価した。ＳＣ投与後の血漿中の薬物濃度－時間プロファイルを、イムノアッセイ及びＬＣＭＳ分析について表５７及び５８にそれぞれ示し、ＩＶ投与後の血漿中の薬物濃度－時間プロファイルをイムノアッセイ及びＬＣＭＳ分析について表５９及び６０にそれぞれ示す。イムノアッセイのデータを図２７にグラフで示し、ＬＣＭＳのデータを図２８に示す。
イムノアッセイ分析の結果を用いると、平均ＮＣＡに基づいたＦＰ２の最終半減期（ｔ１／２）は、ＩＶ及びＳＣ投与後にそれぞれ約７．０５日及び約８．５１日であった。ＩＶ及びＳＣ投与後の平均ＰＫパラメータを表６１に示す。イムノアッセイ生体分析の結果を用いると、平均の非コンパートメントモデルで推定したＦＰ２の最終半減期（ｔ１／２）は、ＩＶ及びＳＣ投与後にそれぞれ約７．０５日及び約８．５１日であった。ＦＰ２の平均バイオアベイラビリティー（Ｆ％）は、ＳＣ投与後のカニクイザルでＡＵＣ０～最終に基づいて約９８．５％と推定され、ＡＵＣ０～無限に基づいて約１０９．２％と推定された。
Figure 2022513098000058
 Ｎ／Ａ＝適用できず
Figure 2022513098000059
 －＝最初の測定が失敗し、繰り返し分析を行うための試料が充分ではなかった
＃＝チューブのラベリングに誤りがあったため、分析から試料を除外した
Ｎ／Ａ＝適用できず
Figure 2022513098000060
 Ｎ／Ａ＝適用できず
Figure 2022513098000061
 －＝最初の測定が失敗し、繰り返し分析を行うための試料が充分ではなかった
Ｎ／Ａ＝適用できず
＃＝チューブのラベリングに誤りがあったため、分析から試料を除外した
Figure 2022513098000062
 ＰＫパラメータは、イムノアッセイのＰＫデータのＮＣＡに基づいた平均値である。
＊Ｔｍａｘ（中央値）
ヒト血漿安定性アッセイ
ＦＰ２のｅｘ ｖｉｖｏ安定性を、新鮮なヘパリン添加血漿中、３７℃で４８時間まで調べた。新鮮な非凍結ヒト血漿を、遠心分離により２名の被験者（男性１人、女性１人）のヘパリン添加血から調製した。ＦＰ２を、静かに混合しながらこの基質中で、０、４、２４及び４８時間、３７℃でインキュベートした。ＦＰ２の濃度を、イムノアッセイ法により測定した。独立した免疫親和性捕捉の後にＬＣＭＳを行って、アッセイ条件下でこの基質中に存在する完全な二量体の濃度を定量した。
イムノアッセイ法では、開始濃度からの回復率は１０４．８～９４．１の範囲であり、経時的な減少はみられず、ＦＰ２がｅｘ ｖｉｖｏのヒト血漿中で４８時間まで安定であることが示された（図２９及び表６２）。ＬＣＭＳ法では、濃度は経時的に安定しており、ＦＰ２がｅｘ ｖｉｖｏのヒト血漿中で４８時間まで完全な二量体に保たれることが示された（図３０及び表６３）。
Figure 2022513098000063
Figure 2022513098000064
実施例１８：カニクイザルにおける単回投与ＦＰ１及びＦＰ２の効果
ナイーブなカニクイザルへの単回投与後の食物摂取量及び体重に対するＦＰ１及びＦＰ２の影響を評価した。
ＦＰ１は、ナイーブなカニクイザルのコホートに１、３及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの３つの用量レベルで皮下投与した。溶媒処理群も含めた。動物は盲検で処理した。試験は、２週間のベースライン食物摂取量測定及びデータ収集、化合物の単回投与後の４週間のデータ収集の合計６週間で行った。血漿薬物曝露量を投与の１、７、１４、２１、及び２８日目に測定した。
単回投与のＦＰ１によるカニクイザルの処理は、溶媒処理と比較して食物摂取量及び体重を減少させた（図３１～３２）。１日食物摂取量の有意な低下が、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで４、５、６、及び８～１２日目にみられた（図３１）。１日食物摂取量の週平均値は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで投与後２週目の間、有意に低下した。３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは、投与後２週目の投与の前に平均の週食物摂取量から有意な低下率（％）を示し、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは、投与後１及び２週目の投与の前に平均の週食物摂取量から有意な低下率（％）を示した。０日目からの体重変化率（％）の有意な低下が、３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで２８日目に、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは１４、２１、及び２８日目にみられた（図３２）。
ＦＰ２は、ナイーブなカニクイザルのコホートに１、３及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの３つの用量レベルで皮下投与した。溶媒処理群も含めた。動物は盲検で処理した。試験は、５週間のベースライン食物摂取量測定及びデータ収集、１週間の処理、及び５週間の休薬期データ収集の合計１１週間で行った。血漿薬物曝露量を投与の１、７、１４、２１、２８、３５、及び４２日目に測定した。
単回投与のＦＰ２によるカニクイザルの処理は、溶媒処理と比較して食物摂取量及び体重を減少させた（図３３～３４）。１日食物摂取量の有意な低下が、３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで３、５～８、１０及び１２日目に、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで３～３８日目、及び４０日目にみられた（図３３）。１日食物摂取量の週平均値は、３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで投与後１週目に有意に低下し、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで１～６週目に有意に低下した。３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは、投与後２週目に、週平均の１日食物摂取量に投与の前の週から有意な低下率（％）がみられ、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは、投与後１及び６週目に、週平均の１日食物摂取量に投与の前の週から有意な低下率（％）がみられた。０日目からの体重変化率（％）の有意な低下が、１ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは２１～４２日目に、３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは１４～４２日目に、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは７～４２日目にみられた（図３３）。
実施例１９：カニクイザルにおける複数回投与のＦＰ２の効果
ＦＰ２の効果を、０．３、１、及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの３つの投与レベルで、ナイーブな自発的に過体重のカニクイザルのコホート（年齢８～２０才、体重８．０～１１．９ｋｇ）への週１回の皮下注射により評価した。摂餌量を毎日測定し、体重を毎週測定し、動物の一般状態を毎日評価した。週１２回のＦＰ２による過体重カニクイザルの処置は、溶媒処置と比較して食物摂取量（図３５）及び体重（図３６）を低減した。循環ＦＰ２濃度をイムノアッセイにより測定した（図３７）。おそらくは抗薬物抗体（ＡＤＡ）の生成によるものと思われる、ＦＰ２への曝露の喪失が後の時点で一部の動物において観察された。図は、曝露の喪失（同じ動物についての前の測定からのトラフ血清薬物濃度の４０％以上の減少として定義される）前の点まで収集されたデータを示す。試験の全体を通じて、治療に関連する毒性影響は認められなかった。
実施例２０：リンカーの熱安定性
ＨＳＡとＧＤＦ１５とを連結する異なるリンカーの熱安定性を調べた。フラグメント化及び凝集する性質を評価するため、異なるリンカーを有するＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合タンパク質を１０ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＥＤＴＡ及びメチオニンを加えた後、試料を４０℃以下で１４日間インキュベートした。次いで試料を１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）で評価した。完全なタンパク質並びに凝集体及びフラグメントの割合（％）をこれらのタンパク質について定量した。表６４は、ＡＰの繰り返しからなるリンカーを有するＨＳＡ－ＧＤＦ１５タンパク質が熱ストレス下でフラグメント化に対して最も安定的であることを示している。
これらのリンカーがＧＤＦ１５とその受容体との相互作用に影響するか否かを評価するため、ＧＦＲＡＬ－ＦＣ融合タンパク質をプレートにコートし、抗ＧＤＦ１５又は抗ＨＳＡによる検出を行うイムノアッセイを、ＧＤＦ１５（Ｊａｎｓｓｅｎ社）及びＨＳＡ（Ｋｅｒａｆａｓｔ，Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州ボストン）に対するモノクローナル抗体を使用して行った。このアッセイにより、表６６に示されるこれらのリンカーはいずれも受容体に同様の結合性を有することが示された。
Figure 2022513098000065
実施例２１：臨床試験のプロトコル
過体重である以外は健康な被験者に皮下投与されたＦＰ２の安全性、忍容性、薬物動態（絶対バイオアベイラビリティーを含む）、及び免疫原性を調べるための二重盲検、プラセボ対照、ランダム化、単回用量漸増投与試験
プロトコル６４７３９０９０ＥＤＩ１００１；第１相
ＥｕｄｒａＣＴ番号：２０１８－０００３２４－３４
Figure 2022513098000066
Figure 2022513098000067
Figure 2022513098000068
Figure 2022513098000069
Figure 2022513098000070
Figure 2022513098000071
Figure 2022513098000072
Figure 2022513098000073
 ａ－第１部は二重盲検であり、最大７つの投与群からなる。
第２部は、非盲検であり、単回投与群からなる。
ｂ－スクリーニング－手順は、１日目の試験薬の投与の４週間（２８日）前以内に行われる必要がある。
ｃ－インフォームドコンセント－任意の試験関連手順を開始する前に得る必要がある。
ｄ－組み入れ／除外基準－適格性基準をサポートする文書の利用可能性の最低基準は、「セクション４被験者集団の適格性」に記載されており、投与前のベースライン評価の検証後に確認される。
ｅ－得られる臨床検査のリストについては、「実施例２１セクション９．６．２臨床検査」を参照されたい。被験者は、血液を採取する前に少なくとも１０時間絶食する必要がある（すなわち、食物又は（水を除く）飲料を摂らない）。１日目のランダム化及び投与の前に検証するための結果が与えられるものとして、ベースラインの臨床検査は、－２日目又は－１日目に得られてもよい。
ｆ－全て女性の被験者のみで得られる。
ｇ－ランダム化は、－２日目及び－１日目の全ての評価が行われ、検討、検証されて、被験者が全ての組み込み基準を満たし、排除基準を満たさないこと（例えば、検査結果、ＥＣＧなど）が確認された後、１日目に実施される。
ｈ－第１部用量漸増／皮下（ＳＣ）投与：被験者にＦＰ２又はプラセボ（最大容量２ｍＬ）を単回投与する。第２部：被験者に３０分間にわたってＩＶ注入（一定速度）にてＦＰ２を単回投与する（一定速度）。第１部及び第２部の全ての被験者は、投与前～投与後３時間まで一晩（少なくとも１０時間）絶食する必要がある。第１部の時間０は、ＳＣによる試験薬の注射時間であり、第２部の時間０は、試験薬のＩＶ注入の開始時間である。
ｉ－バイタルサインは、仰臥位での５分間の休息後に測定する必要があり、安静時心拍数（ＨＲ）及び血圧（ＢＰ）が含まれる必要がある。血液サンプリング又はバイタルサイン測定がＥＣＧ記録と同じ時点でスケジュールされた場合、各処置は、バイタルサイン、ＥＣＧ、ＰＫ、安全のための採血叉は探索的バイオマーカー分析の順序で行われる必要がある。測定値は、完全に自動化された血圧計で測定される。全ての時点で単一の血圧及び時間を測定し、記録する。
ｊ－連続的第ＩＩ誘導ＥＣＧモニタリングは、第２部でのみ行われ、１日目のＩＶ注入開始の３０分前から開始され、注入終了の２時間後まで行う必要がある。治験責任医師の裁量により、心臓モニタリングの継続時間を延長することができる。
ｋ－１２誘導ＥＣＧ：スクリーニングＥＣＧを除き、全てのＥＣＧは３回測定する。被験者には、気を散らすもの（例えば、テレビ、携帯電話）を避け、静かな状況で仰臥位で少なくとも５分間休息する必要があり、会話又は手足を動かすことは控えてもらう。３回のＥＣＧは、各時点で２分以内に個別に得る必要がある。ＥＣＧがＰＫ試料と同じ試験の時点で行われる場合、ＥＣＧの直後にＰＫ試料を採取する必要がある。
－１日目の１２誘導ＥＣＧは、１日目にスケジュールされた１２誘導ＥＣＧ（すなわち、投与前、投与の１、２、４、８、１２、及び２４時間後）に時間を一致させる必要がある（同時）。
ｍ－体重:朝食前並びに－１、２、３、４日及び５日目の排尿後、及び１日目の排尿後、投与前に得る。体重は、２回測定する必要がある。被験者は、靴を履かず、ガウンを着用した状態で、較正された秤で計量する必要がある。
ｎ－投与前の手順は、試験薬投与の３０分前以内に得る必要がある。
ｏ－２４時間の食物摂取評価及びＶＡＳ質問票のタイミングの詳細な説明については、「実施例２１セクション９．３、薬力学的評価」、「食事及びＶＡＳ質問票の時間及び事象のスケジュール」を参照されたい。
ｐ－Ａｔスクリーニング、血清妊娠検査は、全ての女性に必要である。尿妊娠検査は、他の全ての時点で得ることができる。
ｑ－試料採取手順及びプロセスの説明書きについては、ラボマニュアルを参照のこと。
ｒ－薬物動態評価：全てのＰＫ採血は、スケジュールされた時点のできるだけ近くで行われる必要がある。ＥＣＧが同じ時点で行われる場合、ＰＫ検体は、ＥＣＧの終了直後に採取する必要がある。第２部（ＩＶ注入）では、全ての採取時点は、注入の終了時に対するものである。薬物動態試料採取のタイミングは、前の用量からの予備ＰＫデータによって示される場合、変更されてもよい（ただし、追加の試料は採取されない）。
ｓ－時点０．５（＝ｔ０（注入終了時）は、第２部におけるＩＶ投与にのみ適用可能である。
ｔ－薬理ゲノミクス（ＤＮＡ）試料は、指定の時点で採取する必要があるが、必要であれば、プロトコルから逸脱することなく、後の時点で採取されてもよい。
ｕ－有害事象及び併用薬は、インフォームドコンセントの署名後から開始して試験終了時の来院における最終試験手順まで記録する。更に、有害事象について、試験全体を通じて（無指示の質問を用いて）指定の時点でクエリがなされる。
ｖ－局所注射部位反応の毒性の報告に関するガイドラインについては、「実施例２１セクション９．６．８局所注射部位反応」の表７０を参照のこと。
ｗ－アレルギー反応及び／又は過敏反応の管理に関するガイドラインについては、「実施例２１セクション９．６．７アレルギー反応／一般的な過敏症」を参照のこと。
Figure 2022513098000074
 ａ－ 時刻は、必要に応じて±１５分間調整することができる。
ｂ－ 時間０は、－１、２、３、４及び５日目の朝食の開始時、並びに１日目の投与後の最初の食事の開始時を指す。
ｃ－ 全ての被験者に全ての日で同時（±１５分）に食事が与えられる必要がある。食事のタイミングは、－１日目のＥＣＧ測定と重複しないように決められており、ＥＣＧが午前７時前、及びその後、０８００、０９００、１１００、１５００、及び１９００（１日目の投与が０７００に行われる場合）、又は１０００、１１００、１３００、１７００、及び２１００（１日目の投与が０９００に行われる場合）に行われるものと仮定して計算されている。
ｄ－ 朝食、昼食、軽食及び夕食は、－１日目と３日目で同じで、他の日に投与される食事とは異なっている必要がある。
ｅ－ －１日目及び３日目に、他の被験者に影響されないよう、食事を取る際に被験者同士は互いから視覚的に隔離する必要がある。
ｆ－ －１日目及び３日目には、各食事は３０分以内に食べ終わる必要があり、被験者は、食事が３０分前に終了した場合には試験官に報告する必要がある。食事の開始及び終了時間は記録する必要がある。
ｇ－ －１日目及び３日目には、各食事の各品目を消費の前後に計量する必要があり、その後のカロリー計算を行うために消費量を記録する必要がある。
ｈ－ 「食欲評価に関するＶＡＳ質問票」は、各食事の前及び終了時、－１日目及び３日目の毎時間、並びに１、２、４日目及び５日目の３時間毎に与えられる必要がある。「食欲評価に関するＶＡＳ質問票」に関する詳細については、「実施例２１セクション９．３、薬力学的評価」を参照のこと。
ｉ－ １日目には、「食欲評価に関するＶＡＳ質問票」は、その日の最初の食事（投与３時間後）から開始して与えられる必要がある。
ｊ－ 「食品嗜好性に関するＶＡＳ質問票」は、食物を一口食べた後に被験者によって記入する必要がある。「食品嗜好性に関するＶＡＳ質問票」に関する詳細については、「実施例２１セクション９．３、薬力学的評価」を参照のこと。
Figure 2022513098000075
 ａ－外来患者来院：来院は、試験手順の前に被験者を少なくとも１０時間（一晩）絶食させ、午前中に行われる必要がある。スケジュールされた時点（すなわち、各来院の特定の日）で外来患者来院を行うためのあらゆる無理のない試みが行われる必要があるが、±１日間以内のウインドウが第４週目（２８日目）まで許容され、±３日間のウインドウが、第１２週目（８４日目）まで残りの外来患者来院について許容される。全ての後続の来院は、以前のスケジュール変更された来院の日付ではなく、第１の試験薬投与（１日目）の日付に対してスケジュールされる必要がある。
ｂ－バイタルサインは、仰臥位での５分間の休息後に測定する必要があり、鼓膜温度、安静時心拍数（ＨＲ）及び血圧が含まれる必要がある。血液サンプリング又はバイタルサイン測定がＥＣＧ記録と同じ時点でスケジュールされた場合、各処置は、バイタルサイン、ＥＣＧ、採血の順序で行われる必要がある。測定値は、完全に自動化された血圧計で測定される。全ての時点で単一の血圧及び時間を測定し、記録する。
ｃ－１２誘導ＥＣＧ：全てのＥＣＧは３回測定される。被験者には、気を散らすもの（例えば、テレビ、携帯電話）を避け、静かな状況で仰臥位で少なくとも５分間休息する必要があり、会話又は手足を動かすことは控えてもらう。３回のＥＣＧは、各時点で２分以内に個別に得る必要がある。ＥＣＧがＰＫ試料と同じ試験の時点で行われる場合、ＥＣＧの直後にＰＫ試料を採取する必要がある。
ｄ－得られる臨床検査のリストについては、「プロトコルセクション９．６．２臨床検査」を参照されたい。被験者は、血液が採取される前に少なくとも１０時間絶食する必要がある（すなわち、食物又は（水を除く）飲料を摂らない）。
ｅ－試料採取手順及びプロセスの説明書きについては、ラボマニュアルを参照のこと。
ｆ－薬物動態評価：全てのＰＫ採血は、スケジュールされた時点のできるだけ近くで行われる必要がある。ＥＣＧが同じ時点で行われる場合、ＰＫ検体は、ＥＣＧの終了直後に採取する必要がある。第２部（ＩＶ注入）では、全ての採取時点は、注入の終了時に対するものである。薬物動態試料採取のタイミングは、前の用量からの予備ＰＫデータによって示される場合、変更されてもよい（ただし、追加の試料は採取されない）。
ｇ－有害事象及び併用薬は、インフォームドコンセントの署名後から開始して試験終了時の来院における最終試験手順まで記録する。更に、有害事象について、試験全体を通じて（無指示の質問を用いて）指定の時点でクエリがなされる。
ｈ－試験終了時の来院は、８４日目の外来患者来院の７～１０日後に行われる必要がある。早期に試験を中止する被験者については、試験終了時の評価は、試験薬投与後にできるだけ早く行われる必要がある。
１．序論
増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、ヒト血漿中に２５ｋＤａの二量体として存在する循環タンパク質因子である。公開されているデータ及び内部のデータは、主としてエネルギーに影響を及ぼすエネルギー収支の調節（すなわち、食物摂取）におけるその役割を支持している。
ＦＰ２の皮下（ＳＣ）投与は、げっ歯類及び非ヒト霊長類における食物摂取量の減少及びその後の体重（ＢＷ）減少をもたらす。更に、ＦＰ２によるＳＣ処置は、おそらくは体重減少に起因して、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおけるグルコースホメオスタシスの改善をもたらし、インスリン抵抗性を改善する。ＦＰ２は、主として中枢神経系（ＣＮＳ）の最後野で発現される、近年同定されたＧＤＦ１５受容体であるＧＤＮＦファミリー受容体α様（ＧＦＲＡＬ）に結合することによってその作用を示す５，１７，２４，１５。ＦＰ２は食物摂取量を減少させ、その結果、肥満の被験者の体重減少をもたらし、肥満関連の併存疾患の改善につながるものと仮定される。
１．１背景
１．１．１．非臨床試験
薬理学プロファイル
ＦＰ２のｉｎ ｖｉｔｒｏのアゴニスト効力を、ヒトＧＦＲＡＬ受容体を安定的に過剰発現するＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞を用いた細胞ベースのｐＡＫＴアッセイを用いて評価した。ＦＰ２は、２．９０８±０．２３９ｎＭ（Ｎ＝３）の半数効果濃度（ＥＣ５０）でｐＡＫＴを活性化した（実施例１４を参照）。天然のＧＤＦ１５はアッセイの対照として機能し、０．１５３±０．００８ｎＭ（Ｎ＝３）のＥＣ５０でアゴニスト活性を示した。
ＦＰ２を、複数種において食物摂取量を低減するその能力について評価した。ＦＰ２の単回ＳＣ投与は、雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（実施例１４を参照）及びＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（実施例１５を参照）における食物摂取を強く阻害した。ナイーブな自発的に過体重のカニクイザルへのＦＰ２の単回ＳＣ投与は、溶媒処置動物と比較して投与後４週間までに食物摂取量の低減及びその結果として有意な体重減少をもたらした（実施例１８）。
２週間にわたる３日毎のＦＰ２の反復投与は、ＤＩＯマウスにおける食物摂取量及び体重を減少させ、恒常性モデル評価（インスリン抵抗性）により測定される耐糖能及びインスリン感受性を改善した（実施例１６を参照）。１２週間にわたるナイーブな自発的に過体重のカニクイザルのコホートへのＦＰ２の週１回の投与により、溶媒処置と比較して、食物摂取量及び体重が有意に低下した（実施例１９を参照）。おそらくは抗薬物抗体（ＡＤＡ）の生成により、一部の動物において後の時点での曝露の喪失が観察された。試験の全体を通じて、治療に関連する毒性影響は認められなかった。
安全性の薬理学
安全性の薬理学的エンドポイント（心血管［ＣＶ］、呼吸器系及び中枢神経系［ＣＮＳ］機能）を、医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）のＳ６（Ｒ１）ガイドラインに従って、カニクイザル（試験番号８３７２５９３）及びＳＤラット（試験番号８３７１０９８）における医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）の４週間反復投与毒性試験の一環として評価した。更に、スタンドアローンＣＶ安全薬理学試験（試験番号Ｔ－２０１７－０４４）をテレメトリ装置を装着したカニクイザルで行った。
全体として、最高用量までのＦＰ２のＩＶ及びＳＣ投与は、ＣＶエンドポイント、中核体温、呼吸数、神経学的又は行動的エンドポイントに影響を及ぼさなかった。
毒性
非臨床安全性試験（表６５を参照）が、ＧＬＰ、２１ＣＦＲ、パート５８、及び／又は経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学品安全性データの相互受理に加盟している国々でＯＥＣＤ－ＧＬＰの原理に準拠して行われており、適切な文書化を含むものである。非臨床安全性試験に使用されるＦＰ２試験物質（バッチ番号ＣＶＣ＿ＰＣＭ０１）は、臨床試験物質を代表するものとみなされる。
Figure 2022513098000076
 凡例：ｂｉｗ＝週２回、ＩＶ＝静脈内；ｑｗ＝週１回；ＳＣ＝皮下；ＳＤ＝Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ。
カニクイザル及びＳＤラットにおけるＦＰ２の反復投与は、全般的によく忍容された。死亡例はなく、明らかな徴候はなかった。いくつかの所見（例えば、食物摂取量及び体重の減少）は、想定された作用機序の結果と考えられ、毒性影響とはみなされない。
関連する生物種の選択
ＦＰ２は、天然アミノ酸からなる短いペプチドを介して連結されたヒトＧＤＦ１５とＨＳＡドメインの両方を有する完全組換え融合タンパク質であるため、毒性プログラムは、主としてＩＣＨガイドラインＳ６（Ｒ１）「Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」（バイオテクノロジーの前臨床安全性評価－誘導医薬品）に従って設計される。
関連する動物種の決定に関して、ＦＰ２のＧＤＦ１５部分が生物学的活性成分であるのに対し、ＨＳＡ成分は、主として新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用を介して機能して半減期を延長し、それによりＦＰ２の曝露を増加させる。ＧＤＦ１５受容体（ＧＦＲＡＬ）及びＧＦＲＡＬシグナル伝達共受容体（ＲＥＴ）は、最近になって同定された１７，２４，５，１５。
異なる生物種における生物学的活性成分（ＧＤＦ１５）、その受容体（ＧＦＲＡＬ及びＲＥＴ）、その半減期延長成分（ＨＳＡ）、及びアルブミン受容体（ＦｃＲｎ）のインシリコでのアミノ酸配列相同性分析により、ヒトとサル（すなわち、カニクイザル）との間で最も高い類似度（９５～１００％）、及びヒトとラットとの間で相応に高い類似度（７８～１００％）が明らかとなった（表６６）。
Figure 2022513098000077
 凡例:Ｃｙｎｏ＝カニクイザル；ＦｃＲｎ＝新生児Ｆｃ受容体ＧＦＲＡＬ＝ＧＤＮＦファミリー受容体α様；ＲＥＴ＝ＧＦＲＡＬシグナル伝達共受容体、毒性試験用に選択された＊非げっ歯類及び＊＊げっ歯類種。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合分析は、ヒト、ラット、及びカニクイザルの組換えＧＦＲＡＬ融合タンパク質に対するＦＰ２結合を示し、ヒトとカニクイザルとの間で２倍の範囲内、ヒトとラットとの間で５倍の範囲内の親和性を示した。更に、異なる生物種におけるＧＦＲＡＬ受容体の組織発現分析により、ラット、サル、及びヒトにおいて、同等の発現パターン（主に後脳の最後野）が明らかになった２４。
ｉｎ ｖｉｖｏ薬力学（ＰＤ）試験は、カニクイザル及びラットの両方でＦＰ２の仮定されたＰＤ効果（例えば、食物摂取量及び体重の減少）を実証した。
しかしながら、単回投与ＰＫ試験は、ラットＦｃＲｎ受容体に対するヒトＨＳＡのより低い親和性、及びカニクイザルＦｃＲｎに対するヒトＨＳＡの同様の親和性のため、カニクイザル（Ｔ１／２：約７～９日）とＳＤラット（Ｔ１／２：約１～２日）との間でＰＫのある程度の有意差も示している。
したがって、カニクイザルが、最も関連する／予測的な動物種であると考えられ、ファースト・イン・ヒューマン（ＦＩＨ）を可能とする非臨床安全性試験を行うための非げっ歯類種として選択した。ラットは、ＰＫにおけるいくつかの制限を有するげっ歯類毒性試験動物種として選択した。
薬物動態プロファイル
ＦＰ２のＰＫ及び毒物動態（ＴＫ）を、単回投与後及び４週間までの長期投与後に、げっ歯類及び痩せたカニクイザルで特性評価した。最大濃度（Ｔｍａｘ）に達するまでの時間の中央値は、マウス、ラット、及びカニクイザルでそれぞれ１日、１日、及び１．６７日であると推定された。ＦＰ２のクリアランス（それぞれげっ歯類及びサルで約２５及び５ｍＬ／日／ｋｇ）及び消失半減期（それぞれげっ歯類及びサルで約１．５及び７．１日）は、おそらくはげっ歯類又はサルＦｃＲｎに対するＨＳＡの親和性の違い（すなわち、ＨＳＡはヒトＦｃＲｎよりも低い親和性でげっ歯類ＦｃＲｎに結合するのに対して、ＨＳＡのサルＦｃＲｎに対する親和性はヒトに対する親和性と同様である）に起因してサルとげっ歯類との間で有意に異なる。したがって、サルは、ヒトにおいてげっ歯類よりもよりＦＰ２のＰＫの予測的な種であると考えられる。９０ｋｇのヒトでは、予測される消失半減期は約１２～１７日である。
ＦＰ２は、完全な二量体としてｅｘ ｖｉｖｏではヒト血漿中で最大４８時間、ｉｎ ｖｉｖｏではＳＣ及びＩＶ投与後のカニクイザルで安定的であることが示されている。完全なＦＰ２の代謝は、標準的なタンパク質分解経路を介していると予想される。
１．１．２．臨床試験
これは、ヒトにおけるＦＰ２の最初の投与であるため、臨床経験は存在していない。
ヒトでの薬物動態及び免疫原性
現在まで、ＦＰ２を用いたヒトＰＫ試験は行われていない。
効果／安全性試験
現在まで、ＦＰ２を用いた臨床試験は行われていない。
２．目的及び仮説
２．１目的
２．１．１．第１部：用量漸増単回投与
過体重（ＢＭＩが２５以上～２９．９ｋｇ／ｍ２以下）である以外は健康な被験者において、ＦＰ２の単回の用量漸増ＳＣ投与後：
主目的
皮下（ＳＣ）投与されたＦＰ２の安全性及び忍容性を評価する。
副次的目的
・ＦＰ２のＰＫを評価する。
・潜在的なＡＤＡ形成の観点からＦＰ２の免疫原性を評価すること、また内因性ＧＤＦ１５に対する抗体形成の可能性を評価する。
・体重及び食物摂取量などの薬力学的（ＰＤ）エンドポイントを評価する。
探索的目的
・ＦＰ２の投与が、ビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）質問票を使用して評価された食欲評価、及び食品嗜好性などのＰＤエンドポイントの変化と関連しているかどうかを評価する。
・ＧＤＦ１５の内因性レベルがＰＤエンドポイントと関連しているかどうかを評価する。
・ＦＰ２のＰＫがＰＤエンドポイントと関連しているかどうかを評価する。
２．１．２．第２部：絶対的バイオアベイラビリティー
過体重（ＢＭＩが２５以上～２９．９ｋｇ／ｍ２以下）である以外は健康な被験者において、ＦＰ２の単回静脈内（ＩＶ）投与の後：
主目的
年齢、性別、及び体重を一致させた（第１部における上記の用量漸増ＳＣ投与群の１つに参加している被験者に一致させた）被験者への３０分間の短期ＩＶ注入（一定速度）による単回投与によってＦＰ２の絶対的ＳＣバイオアベイラビリティーを推定する。
副次的目的
ＩＶ投与されたＦＰ２の安全性及び忍容性を評価する
２．２．仮説
主目的が安全性及び忍容性であるという前提により、この試験において正式な統計的仮説の検定は予定外である。全ての他の分析は、探索的である。
３．試験設計及び理論的根拠
試験設計の概要
これは、ＦＰ２についてのファースト・イン・ヒューマン（ＦＩＨ）試験である。この研究は２部構成であり、過体重である以外は健康な被験者において、単一の試験施設で実施される。第１部は、ＦＰ２の単回用量漸増ＳＣ投与の安全性、忍容性、及びＰＫを評価するためのランダム化、二重盲検のプラセボ対照試験である。第２部は、３０分間にわたる単回用量の短期ＩＶ注入（一定速度）として単回投与されたＦＰ２の全身曝露及びＰＫを評価するための非盲検のシングルアーム試験である。
最大でおよそ６２人の過体重（ＢＭＩが２５以上～２９．９ｋｇ／ｍ２以下）である以外は健康な男性及び女性（妊娠の可能性のない）被験者がこの試験に参加するように計画する（第１部及び第２部）。最大でおよそ５６人の被験者をこの研究の第１部にランダムに割り当て、約６人の被験者を第２部に割り当てる。
－２８日目～－３日目に被験者を適格性についてスクリーニングする。適格とされた被験者は、実施医療機関（ＣＲＵ）に－２日目に入院してもらい、ベースラインの安全性評価を受けてもらう。－１日目及び－３日目に、被験者に２４時間の食物摂取量の測定を受けてもらい、食欲評価及び食品嗜好性を評価するためのＶＡＳ質問票に記入してもらう。被験者に１日目に試験薬を投与し、安全性、忍容性、ＰＫ／ＡＤＡ、及びＰＤ評価を行うために５日目の朝までＣＲＵに引き続き滞在してもらい、試験評価を完了した時点で退院してもらってよい。被験者には、第１週（７日目）、第２週（１４日目）、第３週（２１日目）、第４週（２８日目）、第６週（４２日目）、第８週（５６日目）、第１０週（７０日目）、第１２週目（８４日目）、及び試験終了時の来院（７～１０日後）に外来患者来院でＣＲＵに戻ってもらうように求める。各被験者の全試験継続期間はおよそ１７週間となる。
図３８に、試験計画の概略を示す。
３．１．１．第１部：単回用量漸増投与
過体重である以外は健康な被験者の最大７つの投与群（ＤＧ）で順次試験する（ＤＧ当たり８人の被験者）。各ＤＧ内で、６人の被験者をＦＰ２にランダム化し、２人の被験者をマッチングさせたプラセボにランダム化する。したがって、活性薬物とプラセボとの比は、各用量レベルで３：１である（表６７を参照）。４人の男性被験者及び４人の女性被験者（各性別群で３人を活性物質に、１人をプラセボにランダム化する）を、試験の第２部の対応するＩＶ投与群と各被験者をマッチングさせることができるように未希釈の試験薬（すなわち、５０ｍｇ／ｍＬの未希釈製剤）の投与が計画された第１部の第１のＤＧに登録する。
ＦＰ２の計画された用量漸増スキームを、以下の表６７に記載する。試験中に投与される用量は、縦列「ＦＰ２（ｍｇＳＣ）」に指定される、８０ｋｇの個人について計算されたフラット用量手法に基づく。
Figure 2022513098000078
処置は二重盲検とし、各用量レベルでランダム化する。
各用量レベルで被験者を４つのサブグループ（ｎ＝最大２／サブグループ）に分け、異なる日に投与を行う。最初に２人のセンチネル被験者に同日に同時に投与し（１人にプラセボ、１人にＦＰ２）、７２時間の安全性監視期間を完了した後、そのＤＧの次の被験者に投与を行うことができる。安全性データを検証した後、全ての被験者が投与を完了するまで、１日当たり最大２人の更なる被験者に投与を行うことができる（約２時間間隔で）。前の群の最後の被験者と続くＤＧの最初の被験者との間に少なくとも１０日間を置く。
それぞれ用量レベルの完了後、予備安全性及びＰＫデータを治験依頼者及び治験責任医師（ＰＩ）が検証して次の計画投与レベルを決定する。各用量漸増の決定は、投与後少なくとも７２時間で特定のＤＧの全ての被験者で収集された盲検の予備安全性、忍容性、及びＰＫデータに基づく。用量漸増の検証に必要とされる評価可能な被験者（すなわち、最低でも投与後７２時間の試験手順を完了した被験者）の最小数は、ＤＧ当たりＮ＝７である。
ＦＰ２の予測される平均血清曝露（Ｃｍａｘ又はＡＵＣ０～４８時間）が、最も関連する種（すなわち、カニクイザル）における１ヶ月のＧＬＰ毒性試験から得られた最低の無毒性量（ＮＯＡＥＬ）の曝露を上回る用量は投与されない。
３．１．２．第２部：絶対的バイオアベイラビリティー
第２部は、健康な過体重（ＢＭＩが２５以上～２９．９ｋｇ／ｍ２以下）の男性及び女性被験者に対する、３０分間にわたるＩＶ注入（一定速度）としてのＦＰ２の単回投与の全身曝露及びＰＫを評価するための非盲検のシングルアーム試験である。第２部からのＰＫデータを用いてＳＣによるＦＰ２剤形の絶対的バイオアベイラビリティーを測定する。
第２部では、６人の過体重（ＢＭＩが２５以上～２９．９ｋｇ／ｍ２以下）である以外は健康な男性（ｎ＝３）及び女性（ｎ＝３）被験者を登録する。被験者は、第１部からのＳＣ投与群の被験者（おそらくＤＧ５；５０ｍｇ／ｍＬの未希釈のＦＰ２製剤が使用される３０ｍｇの第１の投与群）と性別、年齢（±５歳）、及び体重（±５ｋｇ）を一致させる。第２部は、試験の第１部の前のＤＧからの盲検の予備安全性及び忍容性データを治験依頼者及び治験責任医師（ＰＩ）が検証した後、試験の第１部の完了前に開始することができる。
第２部における各適格被験者には、適当な前腕静脈内の留置カテーテルを介して３０分間にわたる一定速度の短期注入として投与されるＦＰ２の単回ＩＶ用量を投与する。第２部におけるＩＶ用量は、第１部における予備安全性及びＰＫデータに基づいて選択される。選択されたＩＶ用量は、ＩＶ投与時の最大曝露レベルの予想される差、及び場合によっては、ＳＣ製剤の不完全なバイオアベイラビリティーを考慮するために、第１部において充分に許容されるものとして既に評価されている用量の３分の１を超えない。詳細については、実施例２１のセクション３．５、用量選択の第２部を参照されたい。安全性のモニタリングのため、１人のセンチネル被験者に最初に投与し、７２時間の安全監視期間を完了した後、次の被験者に投与を行うことができる。残りの５人の被験者をサブグループに更に分け（少なくとも２４時間間隔で投与）、１日に２人よりも多い被験者に投与が行われないようにする（約２時間間隔で）。
３．２．試験設計の理論的根拠
３．２．１．全般的な試験設計における考慮事項
提案される試験は、ＨＳＡに融合されたＧＤＦ１５の完全組換えホモ二量体であるＦＰ２の安全性、忍容性、ＰＫ、免疫原性、及びＰＤ（すなわち、食物摂取量、体重、食欲評価及び食品嗜好性）を評価するための、過体重である以外は健康な成人被験者における、ＦＩＨ、二重盲検のランダム化されたプラセボ対照の単回用量漸増投与（ＳＡＤ）試験である。
この試験は、ファースト・イン・ヒューマン及び他の初期臨床開発試験に対する関連規制ガイドライン（ＥＭＡ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＳＷＰ／２８３６７／０７ Ｒｅｖ．１，２０１７；ＦＤＡ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，２００５）に従って設計されている。
予想される全身安全性に関して、利用可能な非臨床データ及び薬理学的特性に基づけば、ＦＰ２は、ＥＭＡの「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｄ ｍｉｔｉｇａｔｅ ｒｉｓｋｓ ｆｏｒ ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｈｕｍａｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ」（治験医薬品によるファースト・イン・ヒューマン試験におけるリスクを特定及び低減するための戦略に対するガイドライン）に概説される基準に従って「高リスク」の新規生物学的実体（ＮＢＥ）であるとはみなされない４。
安全開始用量（推定最小薬理作用量［ＭＡＢＥＬ］、薬理学的活性用量［ＰＡＤ］及びＮＯＡＥＬデータに基づく）の決定、用量漸増戦略及び中止基準の定義などの重要な試験設計要素は、現在の科学的、医学的及び倫理的基準及び要件（実施例２１のセクション３．３、３．４、３．５、３．６）を満たし、同様の目的を有する同等の製品を検討する他の現在のＦＩＨ試験の設計と一致する。
標的化された患者集団はよく定義されており、適用可能な組み入れ及び除外基準の包括的なセットに基づいて慎重に選択される（プロトコルのセクション４被験者集団を参照）。全ての被験者を、投与後１３週間にわたって定期的な安全性フォローアップで監視する。
この試験は、必要に応じて、高い確率での有害事象の早期検出及び適当な治療的介入を確実とする医療監視条件下で、専門のＣＲＵにおいて設計され、実施される。
３．２．２．盲検、対照、試験の相／期間、処置群
第１部
二重盲検、プラセボ対照のランダム化された試験設計は、データ収集の間の潜在的なバイアスを最小化することによるＦＰ２の安全性及び忍容性プロファイルの最良の実用的評価及び臨床的エンドポイントの評価を可能とする。能動的治療が行われない場合に起こり得る臨床的エンドポイントにおける変化の頻度及び大きさを評価するために、第１部ではプラセボ対照が用いられる。ランダム化を用いて、処置群への被験者の割り当てにおけるバイアスを最小化し、既知及び未知の被験者属性（例えば、人口統計的特性及びベースライン特性）が処置群間で均等にバランスが取られる可能性を高める。
第２部
第２部は、非盲検のシングルアーム試験設計であり、他の方法では取得できないＦＰ２の消失に関する製剤と独立したＩＶのＰＫデータを提供し、ＳＣによるＦＰ２剤形の絶対的バイオアベイラビリティー（ＢＡ）を推定するために用いられる。
３．２．３．試験集団
過体重である以外は健康な被験者を登録する理論的根拠は、以下のとおりである。
ＦＰ２はＳＣ経路によって投与され、ＳＣ組織からの薬物吸収特性（すなわち、吸収速度及び吸収量）は、異なる被験者（例えば、男性と女性）及び対象集団（すなわち、痩せた被験者と過体重被験者と肥満被験者）間で異なる傾向がある。したがって、この試験は、より長期の試験に過体重又は肥満の被験者を曝露する前に、標的集団に近い集団における反復投与のＰＫ及び用量選択の確実な予測を可能にするため、関連集団における初期のヒトＰＫを決定することを目的とする。
過体重である以外は健康な被験者の被験者リスクは、スクリーニング基準によって過体重の個人においてより高頻度に見られることが知られている臨床的に有意な状態（例えば、２型糖尿病、高血圧）を有する被験者は除外されるため、痩せた健康な被験者の被験者リスクと同等であるとみなされる。
過体重である以外は健康な被験者の登録は、第２相に登録されることが予想される試験集団に近い／同等である被験者集団におけるＦＰ２の安全性及びＰＤ効果（食品摂取量、体重、食欲評価及び食品嗜好性など）の予備評価を可能とする。
３．２．４．薬物動態及び薬力学
この試験におけるＰＫサンプリングのタイミング及び持続時間は、アロメトリックモデル予測を含む非臨床的ＰＫデータに基づく。この情報を使用することで、頻繁な血液試料採取スケジュールによって、ＰＫプロファイルの完全な特性評価が可能となり、更なる臨床開発を支援するために必要な主要なＰＫパラメータを定義するために必要とされるデータが与えられる。
食物摂取量（投与前及び予測されたＴｍａｘにおける）の２４時間評価、及び試験全体を通じた体重の監視により、ＦＰ２の単回投与の際に起こり得る食物摂取量の減少（すなわち、カロリー摂取量の減少、及び見込まれる体重減少）の評価が可能となる。ＶＡＳ質問票に頻繁に記入してもらうことで、ＦＰ２の単回投与による治療時の食物摂取量の減少及び体重減少に関連し得る食欲挙動の変化の特性評価を行うことができる。
３．２．５．安全性及び忍容性
ＦＰ２を用いたラット及びサルにおける１ヶ月のＧＬＰ毒性試験で記録された所見の大部分は、観察された有意な食物摂取量の減少及び体重減少に２次的なものであると考えられ、これはこのクラスの薬物で仮定された標的薬理学的動態であった。全体として、ＦＰ２は、毒性試験において充分に忍容され、特別な監視を必要とする所見は認められなかった。
したがって、この試験における安全モニタリングは、バイタルサイン（心拍数、収縮期及び拡張期血圧、体温）、標準的な臨床検査（血液学、臨床化学、臨床化学、尿検査、脂質、凝固）、身体検査、アレルギー反応／過敏症及び局所注射部位反応を含む治療により発現した兆候及び症状／有害事象［ＴＥＡＥ］のモニタリング、並びに一連の標準１２誘導ＥＣＧの文書化などの一連の標準的な安全性評価からなるものとなる。連続的な第ＩＩ誘導ＥＣＧモニタリングは第２部でも行われる。
３．２．６．免疫原性
ＮＢＥの免疫原性能力はその全体的な安全性プロファイルの一部であるため、ＦＰ２の潜在的免疫原性は、ＡＤＡの一連の定量、及び内因性ＧＤＦ１５に対して形成され得る抗体のスクリーニングによって監視される。
３．２．９．ＩＶ投与（第２部）
試験の第２部は、適当なＳＣ参照群（未希釈の研究薬が投与される部分１の第１投与群）と年齢、性別及び体重について一致させた、過体重である以外は健康な被験者に対して３０分間にわたってＩＶ注入（一定速度）として単回投与したＦＰ２の全身曝露及びＰＫを評価するための非盲検のシングルアーム試験である。第２部は、他の方法では取得できないＦＰ２の消失に関する製剤と独立したＩＶのＰＫデータを提供し、ＳＣによるＦＰ２剤形の絶対的バイオアベイラビリティー（ＢＡ）を推定するために用いられる。第２部でＦＰ２をＩＶ投与した６人の被験者は、絶対的ＢＡの推定において通例であり、ＳＣ剤形の医薬品品質属性の評価のベンチマークとして機能する。
３．３．第１部における用量選択及び漸増の理論的根拠
過体重カニクイザルにおける反復投与試験で試験した３つの用量レベル（実施例１９を参照）において、ＦＰ２のＰＫ及びＰＤ（ベースラインと比較した食物摂取量及びＢＷの変化率（％））を同時に特性評価するため、食物摂取量と体重（ＢＷ）との間の関係の生理学的表現と組み合わせた、ＦＰ２のＰＫと食物摂取量との間の間接的反応ＰＫ／ＰＤモデルを開発した。この試験では、食物摂取量の減少が２週目～３週目で最大であり、持続的な治療とともに用量依存的な減弱を示したのに対して、体重は、４週目（１ｎｍｏｌ／ｋｇ群）又は７週目（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ群）まで連続的に減少し、その後、プラトーに達した。これらの観察結果を特徴付けるため、体重減少に応答して生じる食物摂取量及びエネルギー消費の補償的変化を記述する項を含むことによって、食品摂取量（ＦＩ）及びその結果として生じる体重（ＢＷ）の両方における治療誘発変化を記述する、新規な生理機能に基づいたＰＫ／ＰＤモデルを開発した。体重の変化は、食物摂取量の変化の長期的な影響を経時的なエネルギー消費量の変化と併せたものとして記述された。このＰＫ／ＰＤモデルは、１２週間の試験中の食物摂取量及び体重の軌跡を記述することができ、過体重のカニクイザルにおけるＦＰ２の曝露－反応関係を与えた。このモデルにおける体重減少依存性の補償的な食品摂取量の項によって、特定の曝露について食物摂取量に対する薬物の効果のパラメータが経時的に一定に維持される。カニクイザルで開発されたこの半機械論的モデルは、ヒトにおけるエネルギー摂取量と体重の変化との既知の関係に基づいて更なる変換可能なモデリングを可能とし、その結果は、特定のエネルギー摂取量の減少率（％）ではカニクイザルと比べてヒトの体重の減少率（％）がより大きいことを示している。このモデリング結果はまた、ＦＰ２の作用機序を定量的に支持するものであり、体重減少は、過体重カニクイザルでは薬物により誘発される食物摂取量の減少によって主としてもたらされる。このモデリングアプローチを用いて、ヒトにおけるＰＡＤ及び有効な臨床用量／曝露を決定した。
ＦＰ２のＰＫ／ＰＤの関係性、並びに生理学的に関連するパラメータ及びＳＣバイオアベイラビリティーが、過体重のカニクイザルとヒトとの間で変換可能であると仮定すると、１２週目に２０％の食物摂取量の減少をもたらすと予想される、事前に予測されるヒトでの週１回のＳＣ用量は、約０．０８ｍｇ／ｋｇ（約０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ）である。公開文献１３、１２、１１及びモデルシミュレーションに基づけば、週１回のＳＣ投与後の１２週目に食物摂取量の２０％の減少をもたらす用量は、１年間の治療後の１０％超の体重減少に相当し得る。
３．３．１．開始用量が正当である理由
この試験の開始用量は、毒性（ＮＯＡＥＬ）及び薬理学的データ（ＰＡＤ）に基づいて、ファースト・イン・ヒューマン試験の関連する規制ガイドライン３，６に従って選択した。
１ヶ月の毒性試験におけるラット及びカニクイザルのＮＯＡＥＬ用量は、ラットでは１００ｍｇ／ｋｇ、カニクイザルでは５０ｍｇ／ｋｇであった。人体等価用量（ＨＥＤ）は、体表面積に対して用量を正規化することによって計算した。最大推奨開始用量（ＭＲＳＤ）の計算には、初期臨床用量を投与したヒト被験者を保護するための安全性のマージンを与えるデフォルトの安全係数として１０を用いる６。以下に記載される曝露比計算で反映されるように、安全係数として１０を使用した場合、ＦＰ２のＭＲＳＤは１．６ｍｇ／ｋｇ ＢＷと計算された。体重８０ｋｇのヒトの場合、ＭＲＳＤ用量は１２８ｍｇと計算された。
その薬理学的作用に基づけば、ＦＰ２は、内因性ＧＤＦ１５のように機能して食物摂取量を減少させ、体重の減少をもたらすことが予想される。ＦＰ２の作用機序及び非臨床的安全性プロファイルは、ＦＰ２が高リスク医薬品とみなされるための基準を満たさないことを示唆するものである。
反復投与のカニクイザルの試験結果は、大幅に低い用量での薬理活性（すなわち、食物摂取量の減少）を示したため、ＭＲＳＤは、ＰＡＤベースのアプローチによって誘導される必要がある。この目的のため、ＦＰ２のヒトＰＫパラメータを、過体重のカニクイザルにおける単回ＳＣ投与後の体重に基づく、モデルから推定されたＰＫパラメータの固定指数アロメトリックスケーリングによって予測した。
これに基づいて、カニクイザルにおける３つの試験用量レベルにわたるＰＫ及びＰＤデータを用いてＦＰ２のＰＫ／ＰＤモデルが開発され、このモデルにより、０．０５ｍｇ／ｋｇ（約０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）の単回ＳＣ用量が、薬理活性を示すうえで有意な閾値とみなされる、約１０％の最大食物摂取量の減少をもたらすと予測された。０．０５ｍｇ／ｋｇに伴う食物摂取量減少の予測レベルは被験者の安全性にとって重大であるとはみなされず、他の既知の安全性に関わる重要なＰＤ効果はないことから、安全係数５（デフォルトの安全係数１０の代わりに）を、モデルから推定された０．０５ｍｇ／ｋｇ用量に適用する。この安全係数の選択はまた、ヒト及びカニクイザルの組換えＧＦＲＡＬ融合タンパク質に対するＦＰ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合親和性の２倍の範囲内の値、並びにサル及びヒトにおけるＧＦＲＡＬ受容体の同等の組織発現パターンも考慮しており、０．０１ｍｇ／ｋｇのＭＲＳＤを与える。この試験では体重８０ｋｇに対するフラット投与アプローチが用いられるため、ＰＡＤに基づくＭＲＳＤは、０．８ｍｇ（０．０１ｍｇ／ｋｇ×８０ｋｇ）と計算された。これは、ＰＡＤに基づいたＭＲＳＤがＮＯＡＥＬに基づいたＭＲＳＤよりも約１６０倍低いことを示す。
０．０１ｍｇ／ｋｇのＰＡＤに基づくＭＲＳＤは、約０．６ｎＭの最大血清薬物濃度をもたらすものと予測され、これは、内因性ＧＤＦ１５の正常な範囲レベル（すなわち、約０．０４６ｎＭ又は１．１５ｎｇ／ｍＬ）よりも１３倍高く２、また、合併症のない妊娠中の女性で見られる内因性ＧＤＦ１５レベルの中央値（すなわち、約３．２ｎＭ又は８０，０００ｐｇ／ｍＬ）よりも５倍低い２０。この濃度の値は、１）ヒトＧＦＲＡＬ受容体結合親和性（内因性ＧＤＦ１５と比較した場合に１１倍低いＦＰ２の結合親和性）の差、及び２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイの効力の差（ｒｈＧＦＲＡＬ発現ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞を用いたｐＡＫＴ機能的アッセイにおける内因性ＧＤＦ１５に対するＦＰ２の約１９倍低いＥＣ５０値）の差について補正した場合、０．０１ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与後のヒトにおけるＦＰ２の予想される最大濃度は、痩せた個人における内因性ＧＤＦ１５の正常な上限の１．２倍以内であるとの予測を与える。
更に、０．０１ｍｇ／ｋｇの開始用量からのＣｍａｘは、ｒｈＧＦＲＡＬ発現細胞を使用したｐＡＫＴ機能的アッセイの読み取り値のＥＣ１０よりも低いと予想される。
３．３．２．最大用量
４週間のＧＬＰラット又はカニクイザル毒性試験におけるＮＯＡＥＬ用量は、それぞれ、４１５μｇ／ｍＬ（１～４日目、雌及び雄）及び１１１７μｇ／ｍＬ（２２～２９日目、雌及び雄）の平均Ｃｍａｘ値、並びに８８３μｇ・日／ｍＬ（１～４日目、雄及び雌）及び６３４１μｇ・日／ｍＬ（２２～２９日目、雄及び雌）の平均ＡＵＣ値を与えた。雄と雌のカニクイザルの間で、性別による平均薬物曝露（Ｃｍａｘ及びＡＵＣによって評価される）及び他のＴＫパラメータの明らかな差は認められなかった。雌ラットにおける薬物曝露（最初の用量後のＣｍａｘ及びＡＵＣ１～４日目によって評価される）は、雄ラットよりもわずかに高い傾向がみられた。第１部で計画された１．０８ｍｇ／ｋｇ（ＢＷ）の最大用量は、カニクイザルのＮＯＡＥＬ用量における平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣ曝露の約９７～２１倍低い平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣ曝露を与えることが予想される。この試験の第１部の進行に従って、各連続したＤＧからのＰＫデータをＦＰ２の全身曝露を予測するシミュレーションに用い、これらの曝露推定値を更に改善する。その後の用量を新たな安全性、忍容性、及びＰＫデータの検証に基づいて調整することができるが、計画された最大用量を超えないようにする。
機器を装着したカニクイザルにおけるＣＶ安全性試験は、５０ｍｇ／ｋｇで試験した最も高いＳＣ用量まで何らの有意な所見も示さなかったため、上記に要約した計画された最大曝露を制限するものとはみなされなかった。
３．４．用量漸増
第１部における計画された用量範囲は、肥満被験者における将来的な試験で検討されるであろう治療有効用量の予想される反復投与曝露からの安全性マージン（≧１０倍）を与えることが予想される用量を特徴付けることを可能とするものであり、特別な集団（例えば、腎障害及び肝障害を有する被験者）及び状況（例えば、薬物－薬物相互作用試験、ｔｈｏｒｏｕｇｈ ＱＴ／ＱＴｃ試験など）における潜在的曝露の増加を説明するであろう。
提案される用量漸増戦略は、前の用量レベルが安全であることが示され、曝露レベル（Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０～７２時間）が概ね用量に比例した線形ＰＫ（又は比例しない曝露量の増加）を示す場合、試験の最初の２つの用量漸増ステップから第３の用量レベルまで約３倍刻みの用量増分の概念に従う。同じ規定の下で、用量レベル４、５、及び６への第３、第４、及び第５の用量漸増ステップは約２倍の用量漸増からなるのに対して、全ての後続の用量漸増ステップ（もしあれば）は、約５０％の用量増分で計画される（表３）。
それぞれ用量レベルの完了後、予備安全性及びＰＫデータを治験依頼者及びＰＩが検証して次の計画投与レベルへの漸増量を決定する。各用量漸増の決定は、投与後少なくとも７２時間で特定の投与群の全ての被験者で収集された盲検の予備安全性、忍容性、及びＰＫデータ、並びに投与後少なくとも７２時間で得られた予備ＰＫデータに基づく。検証に必要とされる評価可能な被験者（すなわち、最低でも投与後７２時間の試験手順を完了した被験者）の最小数は、投与群当たりＮ＝７である。投与後７２時間から検討会議までのあらゆる更なる臨床的関連情報は、検討会議において治験責任医師によって報告される。試験の進行に伴い、前の投与群の累積安全性データも各漸増用量決定会議の一環として定期的に検証する。計画された用量は、前の投与からの予備ＰＫ、安全性、及び／又は忍容性データによって支持される場合には変更されてもよく、減らすか又は反復することができるが、試験プロトコルに対する大幅な補正が発布されて法的資格を有する保健当局（ＨＡ）及び独立倫理委員会（ＩＥＣ）に提出されない限りは増やされることはない。
前の投与群の最後の被験者と続くＤＧの最初の被験者との間に少なくとも１０日間を置く。
４週間のＧＬＰラット又はカニクイザルの毒性試験におけるＮＯＡＥＬ用量を用いて、この試験において目標とされる曝露上限が誘導される（詳細については実施例２１、セクション３．３．２を参照）。
３．５．用量選択第２部
第２部の用量強度は、第１部における予備安全性及びＰＫデータに基づいて選択され、第１部で充分に忍容されるものとして評価された用量の１／３を超えないようにすることで、過体重のヒト被験者におけるＦＰ２のＳＣによるＢＡが痩せたカニクイザルで決定されたものよりも大幅に低い場合（１．０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与時の絶対ＢＡが９９％）に約３倍の安全マージンを与える。４週間のカニクイザルＴＫ試験におけるＩＶ投与時に観察されたＣｍａｘ値（５０ｍｇ／ｋｇ（ＢＷ））は、同じ用量のＳＣ投与で観察されたものよりも約２倍高かっただけであるため、忍容性の高いＳＣ用量の３倍の低減は、３０分間にわたるＦＰ２の一定速度のＩＶ注入で予想される安全な最大曝露（Ｃｍａｘ）についても適切なマージンを与えることが予想される。例えば、投与群５に投与された３０ｍｇのＳＣ用量が安全かつ忍容性が高いと考えられる場合、第２部のＩＶ用量は、このＤＧに基づいて選択することができ、３０ｍｇの１／３、すなわち１０ｍｇとなるであろう。これは、過体重被験者におけるＳＣ投与時の絶対ＢＡが約３３％と低く、したがって、１０ｍｇのＩＶ用量強度では、ＩＶ投与時のＡＵＣは、３０ｍｇのＳＣ投与後に得られるＡＵＣを確実に超えないという仮定に基づいたものである。ＢＡはＡＵＣ（Ｃｍａｘではない）から計算され、３３％ＢＡの仮定は控えめであるため、ＳＣ用量の１／３のＩＶ用量強度は、３０ｍｇＳＣのＩＶ用量強度よりも低いＣｍａｘ（すなわち、注入の終了時）となる可能性が高い。
３．６．中止基準
３．６．１．個々の中止基準－第１部
試験の第１部ではＦＰ２の単回ＳＣ投与のみを行っているため、試験薬の個々の中止基準（投与の中断など）は適用できない。しかしながら、ランダム化された被験者には、試験を中止した場合に試験薬は投与されない（実施例２１、セクション１０．２を参照）。
３．６．２．個々の中止基準－第２部
ＩＶ注入は、医学的に重要なＡＥの場合には中断され、治験責任医師によって判断された被験者に対する潜在的リスクを意味する。このような医学的に重要なＡＥとしては、これらに限定されるものではないが、以下の所見が挙げられる。
被験者は、Ｆｒｉｄｅｒｉｃｉａの式（ＱＴｃＦ）に従って補正された絶対ＱＴが５００ミリ秒以上であるか、又は最初の発生後の２回の連続測定（１５分間隔）におけるベースラインからのＱＴｃＦの増加が６０ミリ秒よりも大きい。
継続的な心拍数モニタリングに基づき、最初の発生後少なくとも１５分間にわたって持続する安静時の仰臥位心拍数が１００ｂｐｍ超として定義される頻脈を有する被験者。
継続的な心拍数モニタリングに基づき、最初の発生後少なくとも１５分間にわたって持続する安静時の仰臥位心拍数が４５ｂｐｍ未満として定義される徐脈を有する被験者。
１８０ｍｍＨｇを超える安静時収縮期血圧（ＳＢＰ）として定義され、最初の発生後少なくとも１５分間にわたって持続する高血圧症を発症した被験者。
被験者が重度又は重篤な有害事象を有しており、治験責任医師が安全性の理由から、静脈内注入を中断することが被験者の最善の利益であると考えている。
これらの理由の１つのために中止された時点で、試験薬投与は明確に終了されたものとみなされる（すなわち、再開されない）。試験薬中止の理由は文書化される。
３．６．３．試験中止基準
試験の進行（まだ完了していないＤＧ内での、又はより高い用量レベルへの進行）は、下記の場合、いつでも保留される。すなわち、
－２人の被験者で、－治験責任医師によって、可能性として、おそらくは、又は高い確率で試験薬に関連していると評価された何らかの医学的に重要又は重篤な有害事象（ＳＡＥ）を有することによって、試験が中止される（投与群又は期間に関係なく）場合、又は
－１人の被験者が、治験責任医師によって、可能性として、おそらくは、又は高い確率で試験薬に関連していると評価されたＳＡＥを有する場合。
臨床試験チームとは独立した内部のＤＲＣを招集することができる（セクション１１．８を参照されたい）。ＤＲＣの目的は、全ての非盲検化された安全性データを検証することである。この詳細な安全性の検証の終了時に、以下の推奨のうちの１つが行われる。すわわち、
計画された研究を継続すること（すなわち、重大な安全性の懸念がない）。
より多くの被験者で現在の用量を反復することによって試験を継続すること。
現在の用量と次の計画された用量の間の用量、又は現在の用量と前のより低い用量の間の用量で試験を継続すること。
試験を終了すること。
４．被験者集団
適格な被験者のためのスクリーニングは、試験薬の投与前２８日以内に実施される。
第１部及び第２部の両方について、少なくとも２人の更なる予備被験者に入院患者期間の－２日目に入院してもらい、投与に至るまでの全ての評価を行って全投与群が確実にランダム化されるようにする。
交代が必要である場合には、更なる被験者を登録できる。各交代用被験者は、ランダム化スケジュールに従って交代用被験者が交代する被験者についての全試験を完了する（プロトコルのセクション５、試験薬の割り当て及び盲検化を参照）。どの被験者も複数の投与群又はこの試験の一部だけには参加しない。予備被験者には、試験の別の投与群に参加するための再スクリーニングを行うことができる。
第１部では、４人の男性及び４人の女性（各性別群で３人を活性物質に、１人をプラセボにランダム化する）を、試験の第２部の対応するＩＶ投与群と各被験者をマッチングさせることができるように未希釈の試験薬（すなわち、５０ｍｇ／ｍＬの未希釈製剤）の投与が計画された第１の投与群に登録する。
この試験に被験者を登録するための組み入れ基準及び除外基準は、以下の２つのサブセクションに記述される。以下の組み入れ基準又は除外基準について疑問がある場合、治験責任医師は、適切な治験依頼者の担当者に相談し、試験に被験者を登録する前に全ての問題を解決する。逸脱事例は許可されない。
被験者選択の統計的考慮事項の考察については、実施例２１の「セクション１１．２標本サイズの決定」を参照する。
４．１．組み入れ基準
各潜在被験者は、この試験に登録されるためには以下の基準の全てを満たす。すなわち、
男性又は女性
１８～４５歳（境界値を含む）。
ボディマス指数（ＢＭＩ）が２５．０～２９．９ｋｇ／ｍ２（境界値を含む）であり、かつ体重８０ｋｇ以上。
身体検査、病歴、バイタルサイン、臨床検査、並びにスクリーニング及びベースライン（－２日目及び／又は－１日目）で行われた１２誘導ＥＣＧに基づいて健康である。結果のいずれかが異常である場合、治験責任医師が異常又は正常からの逸脱が臨床的に重要でないと判断した場合にのみ、被験者を組み入れることができる。この決定は、被験者の原試料に記録され、治験責任医師によって署名される。
被験者が試験の目的及びそれに必要な手順を理解し、試験に参加する意思があることを示すインフォームドコンセントフォーム（ＩＣＦ）に署名する。
女性は、以下のいずれかとして定義される、妊娠の可能性のない女性である。すなわち、
閉経後
閉経後状態は、他の医学的原因なしで少なくとも１２ヶ月間生理がなく、かつスクリーニング時の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レベルが閉経後範囲（＞４０ＩＵ／Ｌ又はｍＩＵ／ｍＬ）であるものとして定義される。しかしながら、被験者の無月経期間が１２ヶ月未満である場合、２回のＦＳＨ測定（１回は被験者の医療記録から得られてもよい）が閉経後状態を確認するために求められる。全ての女性は、スクリーニング時の血清βヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）妊娠検査が陰性であり、かつ－２日目の入院時の尿妊娠検査が陰性である必要がある。
永久不妊
永久不妊方法としては、医療記録に文書化された、子宮摘出術、両側卵管切除術、両側卵管閉塞／結紮術、及び両側卵巣摘出術により、又は他の形で妊娠不能であることが挙げられる。全ての女性は、スクリーニング時の血清ｈＣＧ妊娠検査が陰性であり、かつ－２日目の入院時の尿妊娠検査が陰性である必要がある。
安静時心拍数（被験者が５分間仰臥位を取った後の）が５０～９０回拍動／分（ｂｐｍ）である。心拍数が範囲外である場合、最大２回の反復評価が許可される。
血圧（被験者が５分間仰臥位を取った後の）が、収縮期で９０～１４０ｍｍＨｇ（境界値を含む）、拡張期で９０ｍｍＨｇ以下である。血圧が範囲外である場合、最大２回の反復評価が許可される。
男性（精管切除を行っている男性を含め）は、パートナーが妊娠している場合であっても、コンドームの使用に同意し（胎児が膣吸収によって試験薬に曝露されないようにするため）、試験期間中及び試験終了後３ヶ月間に精子を提供しないことに同意する。男性被験者は、男性被験者が使用するコンドーム以外に、有効な避妊法（例えば、処方経口避妊薬、避妊薬注射、子宮内器具、ダブルバリア法、及び避妊用パッチ）を使用するように女性パートナーを促さる必要がある。
試験プロトコルで指定された禁止事項及び制限事項を守る意思があること。
被験者は、２４時間の食物摂取量評価のために供される食事品目（少なくとも、メインディッシュと、昼食及び夕食メニューからのサイドディッシュのうちの１つ）を好み、典型的には摂食し、１日３食（朝食、昼食、及び夕食）の習慣的な食事パターンを有する。
研究用に任意のＤＮＡ試料を提供することに同意する場合は、別のインフォームドコンセントフォームに署名する。任意のＤＮＡ研究試料の提供への同意に対する拒否は、この試験への参加から被験者を除外しない。
４．２．除外基準
以下の基準のいずれかに該当する潜在被験者は、試験への参加から除外される。すなわち、
ＣＶ疾患（心不整脈、心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患を含む）、内分泌又は代謝疾患（例えば、糖尿病、甲状腺機能亢進／低下、重度の高トリグリセリド血症［＞４００ｍｇ／ｄＬ］）、血液疾患（例えば、ヴォン・ヴィレブランド病又は他の出血性疾患）、呼吸器疾患、肝臓若しくは消化器疾患、神経若しくは精神疾患、眼疾患（網膜障害若しくは白内障を含む）、腫瘍性疾患、皮膚疾患、腎疾患、又は治験責任医師が被験者を除外すべきとみなすか又は試験結果の解釈を妨げる可能性のある他の病気を含む（ただしこれらに限定されない）重大な疾患又は医学的障害の病歴、又は現時点の活性。
以前の肥満の外科処置、又は、商業的な体重減少プログラムを含む食事療法、若しくはスクリーニングの６ヶ月以内の薬物治療による最近の体重変化（≧５％）。
何らかの摂食障害の生涯病歴、又は摂食障害の高いリスク（摂食及び体重パターンに関する質問票５［ＱＥＷＰ－５］を使用）２５。補遺１を参照されたい。
悪性腫瘍の生涯病歴、又は家族の同じ側の少なくとも２人の近親者（親、きょうだい、子供、祖父母、叔母、叔父、甥、姪として定義される）における同じタイプのがん若しくは近親者である１人における複数のタイプのがんとして定義される、悪性腫瘍に対する感受性の家族歴、又は
若年（５０歳未満）で癌を発症した近親者、又は１対の臓器の両方（例えば、両方の腎臓）に発生するがん、又はきょうだいにおける複数の小児がん、又は男性近親者における乳癌、又は多くの世代（例えば、祖父、父親、息子）に発生するがんを有する近親者も除外される。
通常のがんスクリーニング検査（例えば、男性における前立腺特異的抗原［ＰＳＡ］、パパニコロウ［ＰＡＰ］塗抹、又は女性におけるマンモグラム）における異常な又は陽性の結果の履歴。
がんに罹りやすくなる遺伝子症候群（例えば、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２、リンチ症候群、家族性大腸腺腫症候群、リ・フラウメニ症候群、及び多発性内分泌腫瘍症候群）。
スクリーニング時又は－２日目の入院時の臨床検査室の基準範囲の基準値上限（ＵＬＮ）を上回るアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）。
ジルベール症候群（ＵＧＴ１Ａ１多型による無害な先天性非溶血性低悪性度の高ビリルビン血症）を示唆する、ＵＬＮの１．５倍（すなわち、１．５×ＵＬＮ）を上回る総ビリルビン。
スクリーニング時又は－２日目の入院時の臨床検査室の基準範囲の基準値下限を下回るヘモグロビン、ヘマトクリット値、又は赤血球数。
スクリーニング時又は２日目の異常空腹時血糖（すなわち、＞１２５ｍｇ／ｄＬ又は＞６．９ｍｍｏｌ／Ｌ；静脈血液試料からのマトリクス血漿）及び／又はヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）（すなわち、＞６．４％［高性能液体クロマトグラフィー］又は＞４２ｍｍｏｌ／ｍｏｌ（Ｈｂ）。必要とされる終夜絶食期間に食事不遵守が疑われる場合に、スクリーニング期間中に血糖値測定を繰り返すことができる。
スクリーニング時又は－２日目の入院時の臨床試験室の基準範囲のＵＬＮを上回る血清クレアチニン。
スクリーニング時の臨床試験室の基準範囲の基準限界値の外側の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レベル。
計画された試験薬の第１の用量の最大３０日前までに何らかの不許可治療、予備試験、及び併用治療を行った。
スクリーニングの２年前以内の「精神疾患の診断及び統計マニュアル」（第５版）（ＤＳＭ－Ｖ）基準による薬物若しくはアルコール乱用の履歴、又はスクリーニング時若しくは－２日目のアルコール若しくは薬物の乱用（バルビツール、オピエート、コカイン、カンナビノイド、アンフェタミン、及びベンゾジアゼピンを含むがこれらに限定されない）についての検査結果が陽性。
ＦＰ２の賦形剤のいずれかに対する既知のアレルギー、過敏症、又は不耐性（「ＩＢ、セクション２．３製剤情報」を参照）。
試験薬の初回投与の２ヶ月前以内に血液若しくは血液製剤（約４５０ｍＬ）を献血した、又は大量の血液を失った。
試験薬の計画された初回投与の前の１ヶ月以内又は薬物の半減期の１０倍未満の期間内のうち、いずれか長い方において、治験薬（治験ワクチンを含む）を投与したか又は侵襲性の治験医療装置を使用した。
この試験に登録している間、又は試験薬の最終投与後１２週間以内に妊娠していたか又は授乳中であったか又は妊娠を計画していた。
この試験に登録している間、又は試験薬の最終投与後１２週間以内に子供を作ることを計画していた。
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）若しくはＣ型肝炎抗体（抗ＨＣＶ）陽性又は他の臨床的に活性な肝疾患の履歴、又はスクリーニング時のＨＢｓＡｇ若しくは抗ＨＣＶ検査が陽性。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体陽性の履歴、又はスクリーニング時のＨＩＶ検査が陽性。
スクリーニング前６ヶ月以内に大きな手術（例えば、全身麻酔を要する）を受けたか、又は手術から完全に回復していないか、又は被験者が試験に参加することが予想される期間若しくは試験薬物投与の最終投与後１２週間以内に手術が予定されている。注：局所麻酔下で行われる外科手術が予定されている被験者は、治験責任医師によって承認される場合には参加可能である。
被験者が、試験薬投与の３ヶ月前にタバコ（又は同等物）を喫煙したかかつ／又はニコチンを用いた製品を使用したか、又はスクリーニング時若しくは－２日目の入院時のコチニン検査が陽性。
１日当たり平均して１２００ｍＬ超（すなわち、５カップ、加え合わせた総容積）の茶／コーヒー／ココア／コーラ／カフェイン添加飲料（例えば、エネルギー飲料）を飲んでいる。
完全菜食主義者又は菜食主義者である被験者が、食物アレルギー又は食物不耐性を有する。
インフォームドコンセントを無効とするような、又は被験者が試験の要件に準拠する能力を制限するような心理的及び／又は感情的問題。
被験者が、低い忍容性又は静脈へのアクセスが困難であるために、複数回の静脈穿刺を行うことができない、又は行う意思がない場合。
治験責任医師の意見によれば、参加が被験者の最善の利益とならない（例えば、健全性を損ねる）か、又はプロトコルに指定された評価を妨げる、制限する、若しくは混乱させる可能性がある何らかの条件。
治験依頼者、治験責任医師又は治験実施施設の被雇用者であり、その治験責任医師若しくは治験実施施設の指示に基づいて提案される試験又は他の試験に直接的に関与している者、並びにそのような被雇用者若しくは治験責任医師若しくは治験依頼者の家族。
被験者が裁判所又は機関の命令により施設で生活している。
この試験の前の投与群でランダム化されている。
４．３．禁止事項及び制限事項
潜在被験者は、試験期間中に参加に適格であるためには、以下の禁止事項及び制限事項を遵守する意思があり、遵守する必要がある。
組み入れ及び除外基準（例えば、避妊要件）に記載された、試験中に満たされる全ての要件に従うことに同意する。
激しい運動は、試験により指定される評価及び安全性検査結果に影響を及ぼし得る。そのため、激しい運動（例えば、５ｋｍ／日の長い距離のランニング、ウェイトリフティング、又は被験者が慣れていないあらゆる身体活動）は、試験の３日前から開始して、試験全体を通じて、試験終了時の来院の完了まで避ける必要がある。
被験者は、試験の終了（すなわち、試験終了時の来院）後少なくとも３ヶ月間、献血を避けるように指示される。
アルコール消費又はアルコール含有製品は、スクリーニング及び－２日目のＣＲＵへの入院の少なくとも２４時間前から開始して、５日目の滞在期間の終了まで、並びに他の全ての外来診療来院の少なくとも２４時間前には許可されない。試験の残り日数の間、アルコール消費量は、男性で１日当たり最大量２４グラム（すなわち、１日当たり０．５Ｌのビール又は１日当たり０．２５Ｌのワイン、又は１日当たりグラス３杯［グラス１杯当たり２ｃＬ）の蒸留酒、また、女性で１日当たり１２グラム（すなわち、１日当たり０．２５Ｌのビール又は１日当たり０．１２５Ｌのワイン又は１日当たりグラス１．５杯［グラス１杯当たり２ｃＬ］の蒸留酒）に制限する必要がある。
被験者は、１日目の４８時間前から５日目の滞在期間の終了までグレープフルーツジュース、セビルオレンジ（オレンジマーマレードを含む）、又はキニーネ（例えば、トニックウォーター）を含有するあらゆる食品又は飲料を摂取しない方がよい。
被験者は、１日目の試験薬投与の４８時間前から５日目まであらゆるメチルキサンチン含有製品（例えば、チョコレートバー若しくは飲料、コーヒー、茶、コーラ、又はエネルギードリンク）の使用を控える。スクリーニングとフォローアップ来院との間のその他の日には、被験者は、平均して１日当たり１２００ｍＬを超える茶／コーヒー／ココア／コーラ（５カップ、加え合わせた総容量）を飲まないように指示される。
被験者は、薬物スクリーニングを妨げうることから、ＣＲＵへの入院の少なくとも７２時間前にケシの実の摂取を控えるように指示される。
タバコ（又は等価物）の喫煙、及び／又はニコチンを用いた製品の使用は、試験薬投与の３ヶ月前から試験終了時の来院の完了まで許可されない。
被験者は、入院フェーズの間は治験実施施設の職員によって提供されるもの以外のあらゆる食物又は飲料を摂取しない。
組み入れ基準に記載される避妊要件に従うことに同意する。精子又は体内での精子の産生に対するＦＰ２の影響に関する情報はなく、胎児の発育に及ぼす影響に関する情報もない。被験者及び被験者のパートナーは、試験期間中又は試験後最大３ヶ月間は妊娠しないことが重要である。被験者は、試験期間中又は試験終了（すなわち、試験終了時の来院）後３ヶ月以内にパートナーが妊娠した場合には治験責任医師に報告する必要がある。
５．試験薬の割り当て及び盲検化
第１部
試験参加に適格であった全ての被験者を、１日目の試験薬投与の前にランダム化する。コンピュータで作成されたランダム化スケジュールが治験依頼者によって提供され、ＣＲＵの薬局で保有される。
各ＤＧ内で、被験者は、治験依頼者により、又はその監督下で試験前に作成された、コンピュータ作成ランダム化スケジュールに基づいて、活性薬治療（ＦＰ２）又はプラセボにランダムに割り当てられる。ランダム化は、ランダムに並べ替えられたブロックを使用することによってバランス調整される。各ＤＧ内で合計６人の被験者にＦＰ２を投与し、２人の被験者にプラセボを投与する。第２部とマッチングさせる第１部のＤＧについて、４人の女性及び４人の男性を、各性別群を３：１でランダム化（３人のＦＰ２と１人のプラセボ）して登録する。
各ＤＧで被験者を４つのサブグループ（ｎ＝最大２／サブグループ）に分け、異なる日に投与を行う。各ＤＧの１日目に、２人の被験者からなる第１のサブグループ（センチネルグループ）を、１：１の比でＦＰ２又はプラセボのいずれかにランダムに割り当て、同じ日のほぼ同じ時間に投与を行うことで７２時間までの安全性及び忍容性を評価することができる。ＤＧ内の残りの被験者の投与に影響を及ぼし得る、第１のサブグループ内で投与された被験者で報告／観察されたあらゆるＡＥは、更なる被験者のランダム化及び投与の前に治験依頼者に報告される。残りの６人の被験者（１人のプラセボ、５人のＦＰ２）は、５：１の比（５人のＦＰ２と１人のプラセボ）でＦＰ２又はプラセボのいずれかにランダムに割り当てられる。センチネル被験者が投与された後、各ＤＧで、残りの６人の被験者に、２人からなる群（約２時間の投与間隔）で約３日間（少なくとも２４時間間隔で）にわたって投与を行う。
ＣＲＵの盲検化されていない薬剤師が、ランダム化スケジュールに従って個々の被験者の試験薬用量を調製し、分注の前に盲検化されたラベルを貼付して注射器をマスクすることで、溶液の色による偶発的な非盲検化を防止する。試験薬の投与は、試験のいずれの安全性評価にも関与しない治験担当者によって行われる。治験責任医師には、試験薬のコード化された詳細を含む、各被験者についてのシールされたランダム化コードが提供される。これらのシールされたコードは、１日当たり２４時間アクセス可能な限られたアクセスエリア内で一緒に保管される。全てのランダム化コードは、開封されているか又はシールされているかによらず、被験者の試験における参加の終了後に回収される。
試験薬の割り当てを潜在的に非盲検化し得るデータ（すなわち、試験薬の血清濃度、ＦＰ２に対する抗薬物抗体のデータ、試験薬調製／アカウンタビリティのデータ、治療の割り当て）は、盲検の完全性を維持し、バイアスの可能性を最小限に抑えるように特別な注意を払って取り扱う。これは、データベースのロック及び非盲検化の時点まで、必要に応じて治験責任医師、臨床チーム、又はその他が当該データを見ることができないようにすることなどの特別の規定を設けることを含み得る。ＰＫデータへの任意の実施施設又は試験チームによるアクセスは匿名化される（すなわち、個々の被験者データが割り当てられたグループレベルのデータ及び／又はダミー被験者番号のみ）である。
通常の状況下では、全ての被験者が試験を終了し、データベースが確定されるまで、盲検が解除されてはならない。そうでない場合には、被験者の治療ステータスを知ることによって特定の緊急処置／一連の行動が指定される場合に限り、個々の被験者の盲検は解除する必要がある。そのような場合、治験責任医師は、緊急措置としてシールされたコードを開封することにより試験薬が何であるかを決定することができる。治験責任医師は、盲検を解除する前に、可能であれば治験依頼者又はその指定担当者に連絡して、その特定の状況について検討することが推奨される。治験依頼者又はその指定担当者との電話連絡は、１日２４時間、週７日間行うことができる。盲検が解除された場合、治験依頼者にはできるだけ速やかに通知する必要がある。非盲検化の日付、時間及び理由は、原資料に文書化される。
試験薬の割り当てが非盲検化されている被験者は、引き続きスケジュールされた評価に戻って行われる必要がある。
概して、ランダム化コードは、試験が完了し、臨床データベースがロックされている場合にのみ、完全に開示される。しかしながら、非盲検化されたＤＲＣによる検証を行うためには、ランダム化コード並びに必要に応じてランダム化コードの処置群及びプラセボ群への変換が、権限を有する者に対して開示される。
第２部
第２部は、単回治療を行う非盲検であり、全ての被験者に同じＩＶ用量のＦＰ２が投与されることから、ランダム化又は治療割り当てのための他の特別な規定は必要とされない。
被験者は、性別、年齢（±５歳）、及び体重（±５ｋｇ）について、試験の第１部の参照ＳＣ投与群の個々の被験者に一致するように選択される。
第１部及び第２部
第１部及び第２部の両方について、及び各ＤＧについて、少なくとも２人の更なる予備被験者に－２日目に入院してもらい、投与に至るまでの全ての評価を行って全投与群が確実にランダム化されるようにする。
ランダム化番号を、第１部では１００１から、第２部では３００１から始めて適格被験者に順番に割り当てる。更なる被験者を交代用の被験者として登録することで、第１部で投与群当たり少なくとも７人の被験者が最低でも投与後７２時間の試験手順を完了し、第２部で６人の被験者がＦＰ２の半減期（第１部の前の投与群からのＰＫデータに基づいて決定される）の少なくとも２倍に相当する時間にわたって試験手順を完了するようにしてもよい。交代用の被験者には、交代される被験者と同じ治療を行い、交代される被験者のランダム化番号と同じであるが最初の数字が第１部では「２」に、第２部では「４」に置き換えられた新しいランダム化番号を割り当てる。例えば、第１部において被験者１００４は被験者２００４により交代され、第２部において被験者３００６は被験者４００６により交代される。第２部では、全ての被験者に非盲検形式でＦＰ２を投与する。
６．投与量及び投与
６．１試験薬
ＦＰ２は、注射用の無菌溶液として供給され、－４０℃で保存され、光から遮断される。この溶液は、黄褐色の外観であり、ｐＨ６．５で、１０ｍＭリン酸ナトリウム、８％スクロース、及び０．０４％ポリソルベート２０中、５０ｍｇ／ｍＬのＦＰ２濃度を有する。ＦＰ２は、１．２ｍＬの充填容量を有するＲ２ガラスバイアル中で凍結された状態で提供される（表６８）。
ＦＰ２製剤中に使用される製剤化緩衝液は、この試験においてプラセボ製剤としても使用され、また最初のＦＰ２のＳＣ用量（ＤＧ１～ＤＧ４）の調製における希釈剤として使用されるために供給される。この製剤化緩衝液は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、８．０％スクロース及び０．０４％ポリソルベート２０からなる無菌透明溶液である。製剤化緩衝液はプラセボ注射液を調製するために使用される。製剤化緩衝液は、１．２ｍＬの充填容積を有するＲ２ガラスバイアル中で凍結された状態で提供される。
Figure 2022513098000079
ＦＰ２医薬品（黄褐色溶液）とプラセボ（透明無色溶液）とは外観が異なるため、盲検化されていない薬剤師が、「Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ（ＩＭＰ）Ｈａｎｄｌｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ」の指示に従って、第１部において試験を盲検に維持し、試験担当者及び被験者による製品の視認を防止する。
用量調製、投与手順、及び保存条件に関する詳細な指示は、追加の指針資料として治験実施施設に別に提供される。
第１部投与：
試験薬は、試験チームとは独立した、臨床試験の実施のいずれの他の側面にも関与しない、指定された、訓練された、有資格の実施施設担当者によって投与される。少なくとも１０時間の一晩絶食後、試験薬（ＦＰ２又はプラセボ）を、単回ＳＣ用量（最大容量２ｍＬ）として１．０ｍＬのインスリン注射器（ＤＧ１、ＤＧ２、及びＤＧ５）又は２．０ｍＬ注射器（ＤＧ３、ＤＧ４、ＤＧ６、及びＤＧ７）を使用して、腹部の右下四分区画に１日目に投与する。各投与群で被験者を４つのサブグループ（ｎ＝最大２／サブグループ）に分け、異なる日に投与を行う。最初に２人のセンチネル被験者に同日のほぼ同じ時間に投与し（１人にプラセボ、１人にＦＰ２）、７２時間の安全性監視期間を完了した後、そのＤＧの次の被験者に投与を行うことができる。盲検化された安全性データの検証の後、投与群の全ての被験者が投与を完了するまで、１日当たり最大２人の更なる被験者に交互に投与を行うことができる（およそ２時間間隔で、１人の被験者に午前７時頃に投与し、１人の被験者に午前９時頃に投与する）。
時間ゼロ（０）は、試験薬注射の時間である。
全てのＳＣ注射は、臍の周囲の２インチ（約５ｃｍ）の範囲を避けて前腹壁に行われる。注射を行う前に、担当の実施施設担当者が、計画された注入部位を検査／触診する。注射は、異常と評価された腹壁の範囲に行ってはならない。
救急医療及び救急用機器（アナフィラキシーの治療のための即時使用用薬剤を含む）で経験を積み、訓練された医師が、試験薬の投与中、常時、投与室内で直ちに診療に当たれるようにする。
第２部投与：
自動注入装置（Ｂｒａｕｎ Ｐｅｒｆｕｓｏｒ（登録商標）Ｃｏｍｐａｃｔ Ｓ又は同等の装置）を使用し、フィルターを備えた投与セットを使用して別のラインを介して適当な前腕静脈内に留置カテーテルを介して、３０分間かけて定速注入液としてＦＰ２を単回投与する。投与は、各日のほぼ同じ時間に行われるが、交互に行われる（１日当たり１人の被験者に午前７時頃、及び１人の被験者に午前９時頃）。２人のセンチネル被験者に最初に投与し、２人のセンチネル被験者が投与された少なくとも２４時間後に次の２人の被験者に投与し、その少なくとも２４時間後に最後の２人の被験者を処置する。１人のセンチネル被験者に最初に投与し、７２時間の安全監視期間を完了した後、次の被験者に投与を行うことができる。残りの５人の被験者をサブグループに更に分け（少なくとも２４時間間隔で投与）、１日に２人よりも多い被験者に投与が行われないようにする（約２時間間隔で）。
時間ゼロ（０）は、試験薬のＩＶ注入の開始時間である。
ＦＰ２のＩＶ投与についてプラセボ比較は予定されないため、試験薬を盲検化する措置は必要ではない。
救急医療及び救急用機器（アナフィラキシーの治療のための即時使用用薬剤を含む）で経験を積み、訓練された医師が、試験薬の投与中、常時、投与室内で直ちに診療に当たれるようにする。
試験薬投与の一時的な中断を要する技術的問題（例えば、留置カテーテルの故障、及び新しいカテーテルを留置する必要がある場合など）が生じる場合がある。この場合、注入をできるだけ早く再開することができ、中断時間及びそれぞれの理由は文書化する必要がある。
７．治療コンプライアンス
試験薬は、有資格の試験実施施設担当者によってＳＣ注射液（第１部）として、又はＩＶ注入液（第２部）として投与され、それぞれの投与の詳細は、適用可能な場合、電子データ収集システムに記録される［第１部ＳＣ：注射日、注射時間、注射容量、注入部位；第２部ＩＶ：ＩＶ注入の開始及び停止時間、並びに注入容量］。
８．試験前治療及び併用治療
試験薬の最初の投与の３０日前までに投与された試験前治療は記録される。試験の全体を通じ、試験薬の計画された最初の投与前の３０日以内及び試験中にパラセタモールを例外として、いっさいの治療は認められない（ワクチン、ビタミン、ミネラルサプリメント、栄養補給剤、ハーブサプリメント［セント・ジョーンズ・ワート、ニンニクエキス及びハーブティーを含む］を含む処方薬又は市販薬）。被験者が試験中に処方薬又は非処方薬の投与を必要とする場合、被験者は治験依頼者（又は指定担当者）及び治験責任医師の同意及び承認を得て試験に登録されるか又は継続することができる。
何らかの併用治療の投与が必要となる場合、電子症例報告書（ｅＣＲＦ）の適当なセクションに報告される。記録される情報には、薬物の説明、治療期間、投与レジメン、投与経路、及びその適応が含まれる。
パラセタモールの使用は、試験薬投与の３日前まで許容される。試験全体を通じて、１日当たり最大で３回の５００ｍｇ用量、かつ１週当たり３ｇ以下のパラセタモールが、頭痛又は他の疼痛の治療のために許可される。
併用治療は、試験薬の最初の投与の開始から試験終了時の来院まで試験全体を通じて記録される。併用療法は、新たな又は悪化する有害事象及び基準を満たす重篤な有害事象を伴う場合にのみ、試験終了時の来院以降にも記録する必要がある。
９．試験の評価
９．１．試験の手順
９．１．１．概論
「時間及び事象のスケジュール」では、本試験に適用可能なＰＫの頻度及びタイミング、免疫原性、ＰＤ、探索的バイオマーカー、薬理ゲノミクス、及び安全性測定について要約している。
食事及びＶＡＳ質問票のタイミングは、「食事及びＶＡＳ質問票時間及び事象のスケジュール」において指定されている。
複数の評価が同じ時点でスケジュールされている場合、及び／又は１つ以上の評価が食事と同時にスケジュールされている場合、バイタルサイン、ＥＣＧ、ＰＫ、採血、食欲評価についてのＶＡＳ質問票、食事、及び食品嗜好性についてのＶＡＳ質問票（食品の最初のひとくちの後）の順序で手順が行われることが推奨される。ＰＫ評価のための採血は、指定の時間にできるだけ近く保たれる必要がある。ＥＣＧがＰＫと同じ時点で行われる場合、ＰＫ検体は、ＥＣＧの終了直後に採取する必要がある。必要に応じて、指定の時点よりも先に他の測定を行うことができる。同じ時点での複数の評価の順序は、試験全体を通じて同じである必要がある。実際の評価日及び時間は、原資料及びｅＣＲＦに記録する。
可能な場合、バイタルサイン（すなわち、血圧［ＢＰ］、心拍数［ＨＲ］）は、血液試料が採取される腕とは反対の腕から記録する必要がある（ＩＶ注入時間の間を除く）。
全ての女性にスクリーニング時及び試験全体を通じて妊娠検査を行う。血清妊娠検査をスクリーニング時に行い、尿妊娠検査を「時間及び事象のスケジュール」の他の全ての時点で得る。
Figure 2022513098000080
 ａ試料当たりの血液の量を乗じた試料の数として計算される。
ｂ血清化学は、血清学（ＨＢｓＡｇ、抗ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ １及び２抗体）及び血清β－ｈＣＧ妊娠検査を含む。
ｃ女性被験者のみ。
ｄ血液試料は、研究用に任意のＤＮＡ試料を提供することに同意した被験者からのみ採取される。
ｅ安全上の理由で、又は試料に関する技術的問題のため、反復試料又はスケジュール外の試料を採取してもよい。注：血液試料採取に留置静脈内カニューレを使用してもよい。［マンダリン（オブチュレータ）を使用する場合、廃棄による血液損失は予想されない。］
これらの容量は、本試験において各被験者から採取される血液の最大量が５００ｍＬを超えない限り、最終的な検査マニュアルで調整することができる（採血チューブの径の変更又はアベイラビリティを許容する）。更なる血液試料を、必要に応じて、得られたデータに基づく更なる安全性、免疫原性、又はＰＫ評価を行うために採取することができるが、本試験において個々の被験者から採取される総血液量は、事前の独立倫理委員会（ＩＥＣ）及び保健当局の承認なしに、本試験のプロトコルに記載される量を超えることはない。反復試料又はスケジュール外の試料を、安全上の理由で、又は試料に関する技術的問題のために採取することができ、事前の独立倫理委員会（ＩＥＣ）及び保健当局の承認を必要としない。
各被験者について、この試験で採取される血液の最大量は、５００ｍＬを超えない。各被験者から採取される総血液容量はおよそ３１５ｍＬである。
９．１．２．スクリーニング期間（第１部及び第２部）
潜在被験者は、１日目の試験薬投与前、２８日以内にスクリーニング来院で受診して試験参加の被験者の適格性が判定される。被験者が登録基準を満たす場合、－２日目にＣＲＵに入院する。
いずれかの試験手順を行う前に、ＰＩ（又は指定された試験担当者）が書面のＩＣＦを確認し、各被験者に説明する。被験者がＩＣＦに署名するまで、試験手順（試験の臨床検査のための絶食を含む）を実施することはできない。スクリーニング来院では、被験者によって報告される全ての評価は、これらの組み入れ基準のいずれかを満たさない被験者を中止するため、あらゆる試験、手順、又は相談の前に行われる必要がある。
治験責任医師（又は指定された試験担当者）はまた、薬理ゲノミクス血液サンプリングの前に、任意の遺伝子研究試料について記載されたＩＣＦの確認及び説明も行う。
全ての有害事象は、重篤であるかないかにかかわらず、署名及び日付が記入されたインフォームドコンセントフォームが得られた時点から、最後の試験終了時の来院時の最終試験手順まで報告され、また特定の時点における直接の質問により報告される。（「時間及び事象のスケジュール」を参照）
除外につながり得る異常値の再検査は、１回のみ許容される。再検査は、スケジュール外の来院の間に行うことができる。いずれかのスクリーニング試験が反復される場合、検査結果はＣＲＵへの入院の前（例えば、－２日目）に適格性要件を満たし、治験責任医師による検証のために与えられる。
９．１．３．入院患者治療期間（第１部及び第２部）
－２日目及び－１日目（ベースライン）
適格とされた被験者は、「時間及び事象のスケジュール」に指定されるように、－２日目にＣＲＵに入院させ、ベースラインの安全性評価（－２日目）及び－１日目のベースラインのＥＣＧ収集（１日目のＥＣＧと時間を一致させた）を行う。－１日目に、被験者は２４時間の食物摂取量の測定も行い、食欲評価及び食品嗜好性を評価するためのＶＡＳ質問票に記入する。
１日目／ランダム化及び投与
全ての登録基準が満たされたことを確認した後、適格被験者を１日目の試験薬投与の直前にランダム化する。
試験薬は、ＰＩ又はその指定担当者の監督下で投与される。試験手順の詳細及び時点については「時間及び事象のスケジュール」を参照されたい。
第１部及び第２部の各用量レベルについて、被験者を１日当たり２人以上の被験者が投与されないようにサブグループに分け、異なる日に投与を行う。最初に第１部の２人のセンチネル被験者（１人のプラセボ、１人のＦＰ２）及び第２部の１人のセンチネル被験者（ＦＰ２）に投与を行い、７２時間の安全監視期間を完了した後、投与群の後続の被験者に投与を行うことができる。安全性データを検証した後、全ての被験者が投与を完了するまで、１日当たり最大２人の更なる被験者に交互に投与を行うことができる（約２時間間隔で）。
３日目～５日目
３日目に、２４時間の食物摂取量の測定及びＶＡＳ質問票の実施を反復する。
被験者は、安全性、忍容性、ＰＫ及びＰＤ評価を行うために５日目の朝までＣＲＵに引き続き滞在し、試験評価を完了した時点で退院することができる。
９．１．４．外来患者期間（第１部及び第２部）
被験者は、「時間及び事象のスケジュール」で詳しく述べたように、ＣＲＵに戻り、安全性、忍容性、ＰＫ、ＰＤ、及び免疫原性評価を行うために絶食する（少なくとも１０時間）。試験終了時の来院の完了は、試験への被験者の参加の終了を構成する。スケジュールされた時点（すなわち、各来院の特定の日）で外来患者来院を行うために無理のない範囲でできる限りの取り組みが行われる必要があるが、±１日間以内のウインドウが第４週目（２８日目）まで許容され、±３日間のウインドウが、試験終了時の来院まで残りの外来患者来院について許容される。全ての後続の来院は、以前のスケジュール変更された来院の日付ではなく、第１の試験薬投与（１日目）の日付に対してスケジュールされる必要がある。
早期の中止
被験者が、外来患者期間の終了前に何らかの理由で試験を中止する場合、試験終了時の評価を得る必要がある。
９．２．薬物動態及び免疫原性
「時間及び事象のスケジュール」に示されるように静脈血試料を経時的に採取する。ＰＫサンプリング時間は、前の投与群からの予備ＰＫデータに基づいて調整することができる（例えば、ＦＰ２の血清濃度が定量下限値［（ＬＬＯＱ］未満である場合には、後のサンプリング時間を省略することができる）。各ＰＫ及び免疫原性血液試料（ＡＤＡ）採取の実際の日付及び時間は、電子データ収集システム内のｅＣＲＦ上に記録される。試験への参加を途中で終了する被験者は、最終評価試料を終了時に採取する必要がある。
９．２．１．評価
ＦＰ２の血清濃度及びＦＰ２に対する抗体の分析のために採取された試料を更に用いて、免疫原性の更なる特性評価又は関連バイオマーカーの評価のために、試験期間中又は期間後に生じる懸念に対処する安全性又は効力の側面を評価することができる。被験者の機密は保持される。
９．２．２．分析手順
薬物動態
治験依頼者により、又はその監督下で血清試料を分析し、検証されている特異的かつ感受性の高いイムノアッセイ法を用いてＦＰ２の濃度を決定する。
免疫原性
治験依頼者により、又はその監督下で、抗ＦＰ２抗体及び血清中の内因性ＧＤＦ１５に対する潜在的抗体の検出及び特性評価を、検証されているアッセイ法を用いて行うことができる。ＡＤＡを検出するために採取された全ての試料をＦＰ２血清濃度についても評価することで抗体データの解釈が可能となる。
９．２．３．薬物動態パラメータ
ＦＰ２の薬物動態パラメータは、ノンコンパートメント分析を用いて血清濃度－時間プロファイルから計算される。ＦＰ２の単回投与後の薬物動態パラメータとしては、これらに限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。
Ｃｍａｘ：最大観察血清濃度
Ｔｍａｘ：最大観察血清濃度に達するまでの時間。
ＡＵＣｉｎｆ：末端消失相を外挿した時間０～無限大までの血清濃度時間曲線下面積。
ＡＵＣｌａｓｔ：時間０～最終定量可能濃度に対応する時間までの血清濃度時間曲線下面積。
Ｔ１／２＝終末消失半減期。
ＣＬ：総全身クリアランス（ＩＶのみ）。
ＣＬ／Ｆ：血管外投与後の見かけの総全身クリアランス（ＳＣのみ）。
Ｖｚ：末端消失相に基づく分布の容量（ＩＶのみ）。
Ｖｚ／Ｆ：血管外投与後の末端消失相に基づく見かけの分布容量（ＳＣのみ）。
Ｆ（％）：全身的に利用可能な投与量の割合として計算される絶対ＳＣバイオアベイラビリティーを百分率で表したもの。絶対バイオアベイラビリティーは、下式を用いて計算される。
Figure 2022513098000081
９．２．４．免疫原性の評価
「時間及び事象のスケジュール」に従って、抗ＦＰ２抗体を全ての被験者から採取された血液について評価する。更に、血液試料は、試験を中止した被験者の試験終了時の来院時にも採取する必要がある。これらの試料は、治験依頼者又は治験依頼者の指定担当者により検査される。
血清試料は、ＦＰ２に結合する抗体についてスクリーニングされ、確認された陽性試料の力価が報告される。その他の分析を実施して、ＦＰ２の免疫原性を更に特性評価することができる。
９．３．薬力学的評価
体重は、「時間及び事象のスケジュール」で詳しく述べたように、午前中の朝食前と排尿後に２回測定される。被験者は、靴を履かず、ガウン又は軽い屋内用の衣服を着用した状態で、較正された秤で計量される。
２４時間の食物摂取を、－１日目及び３日目に、両方の日に同時に供される４回の食事（朝食、昼食、軽食、及び夕食）を提供することによって評価する。食事は、各日間で標準化される（－１日目と３日目で同じ食事）。食事はまた、全ての被験者について組成及び一人前の分量が同じとなるように被験者間でも標準化され、試験栄養士により評価される地域的嗜好及びガイドラインに基づいたものとする。各食事の各品目は摂食前及び摂食後に計量し、各食事品目の摂食されたグラム数を計算し、記録する。消費されるカロリーを、各食事品目の消費されたグラム数、及びその栄養素量に基づいて推定する。２４時間のカロリー摂取量の１日目から３日目までの変化を評価する。食物摂取量が記録されない日（－２、１、２、４，日目及び５日目）では、全ての食事（朝食及び軽食を含む）は、－１日目及び３日目に提供される食事と異なる必要がある。
食欲評価（空腹、乾き、むかつき、及び満腹度）を評価するためのＶＡＳ質問票を、－１日目及び３日目の覚醒時間中の毎時間、１、２、４、及び５日目の覚醒時間中の３時間毎、並びに各食事の直前及び終了時（－１日目～５日目）に実施する。食品嗜好性（可能な食物嫌悪を示し得る）を評価するためのＶＡＳ質問票は、食べ物の匂い、味、及び食事の食感の快感に関する質問を含み、各食事のメインディッシュの最初のひとくちを食べた直後に被験者によって記入される（－１日目～５日目）。ＶＡＳ質問票が実施される時点の詳細な説明については、「食物摂取に関する時間及び事象のスケジュール及びＶＡＳ質問票」を参照されたい。
９．６．安全性の評価
９．６．２．臨床検査
化学的検査、血液学的検査、凝固検査、脂質検査用の空腹時血液試料、及び尿検査用の尿試料を採取する。被験者は、全ての検査用試料の採取前に、一晩、少なくとも１０時間絶食する。臨床検査評価の時間については、「時間及び事象のスケジュール」を参照されたい。治験責任医師は、検査結果を検証し、この検証を文書化し、試験の間に生じたあらゆる臨床的に関連する変化をｅＣＲＦの有害事象セクションに記録する。検査報告は、原資料と共に提出される。
以下の検査が各検査施設によって行われる。
Figure 2022513098000082
注：ＷＢＣ評価はあらゆる異常細胞を含んでよく、異常細胞はその後、検査施設によって報告される。ＲＢＣ評価は、ＲＢＣ数、ＲＢＣパラメータ、又はＲＢＣの形態の異常を含んでよく、異常はその後、検査施設によって報告される。更に、血液塗抹中のあらゆる他の異常細胞も報告される。
Figure 2022513098000083
Figure 2022513098000084
ディップスティックの結果が異常である場合、顕微鏡検査を用いて沈殿物を測定する。
顕微鏡検査では、ＷＢＣ、ＲＢＣ、及び円柱細胞の存在以外の観察結果も検査施設によって報告され得る。
他の臨床検査
以下の臨床検査は、「時間及び事象のスケジュール」に示される時点において実施される。
血清及び尿妊娠検査（β－ｈＣＧ）が全ての女性に対して行われる。
ＦＳＨ（女性のみ）、ＴＳＨ及びＨｂＡ１ｃ
血清学（ＨＩＶ１及び２抗体、ＨＢｓＡｇ，及び抗ＨＣＶ抗体）
尿薬物（アンフェタミン、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、カンナビノイド、コカイン、オピエート、メタドン）及びコチニンスクリーン
アルコール呼気検査
９．６．３．心電図
標準的な１２誘導ＥＣＧを、「時間及び事象のスケジュール」に示されるように収集する。各ＥＣＧを印刷し、治験実施施設において被験者の医療ファイルに保管する。更に、ＥＣＧデータを、ＩＣＨ Ｅ１４の推奨に従って中央分析を行うために特殊なＥＣＧ検査施設（Ｎａｂｉｏｓ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ）に電子的に転送する。ＥＣＧ分析の方法、用量漸増会議の結果の読み取り及び送達のタイミング並びにフォーマットの詳細は、別のＥＣＧマニュアルに詳しく記載されている。
１２誘導ＥＣＧは、被験者が仰臥位で少なくとも５分間安静にし、会話又は手足を動かすことを控えた後の各時点で２分以内に個別に３回捕捉する。ＥＣＧを収集する間、被験者は、気を散らすもの（例えば、テレビ、携帯電話）がない静かな環境にいる必要がある。複数の評価が同じ時点でスケジュールされている場合、及び／又は１つ以上の評価が食事と同時にスケジュールされている場合、バイタルサイン、ＥＣＧ、ＰＫ、採血、食欲評価についてのＶＡＳ質問票、食事、及び食品嗜好性についてのＶＡＳ質問票（食品の最初のひとくちの後）の順序で手順が行われることが推奨される。ＰＫ評価のための採血は、指定の時間にできるだけ近く保たれる必要がある。ＥＣＧがＰＫと同じ時点で行われる場合、ＰＫ検体は、ＥＣＧの終了直後に採取する必要がある。必要に応じて、指定の時点よりも先に他の測定を行うことができる。同じ時点での複数の評価の順序は、試験全体を通じて同じである必要がある。
ＥＣＧは、より正確なＱＴｃ間隔の変化の評価を行うために、スケジュールされた各時点で３回行われる。－１日目に得られたＥＣＧは、１日目に得られたＥＣＧと時間を一致させる必要がある。３回のＥＣＧが必要とされる各時点で、３つの個々のＥＣＧトレーシングは、連続してできるだけ近くで、ただし２分間以下の間隔で得られる必要がある。３回のＥＣＧの全セットは、４分未満で完了する必要がある。
－１日目の各時点における３回の測定値の平均は、１日目の対応するパラメータについて各被験者の時間一致ベースライン値としての役割を果たす。
ＥＣＧのオフサイトの中央読み取りプロセスとは別に、各ＥＣＧは、有資格の治験実施施設の医師によって収集された後、可能性のある臨床安全性関連性（例えば、ＱＴｃ間隔の延長）の所見について検証する必要がある。あらゆる病理学的所見及びそれぞれの医療的介入（もしあれば）は、ｅＣＲＦで文書化される。
９．６．４．連続的第ＩＩ誘導ＥＣＧモニタリング（第２部のみ）
連続的第ＩＩ誘導ＥＣＧモニタリングは、１日目のＩＶ注入の開始の３０分前から、注入の終了の２時間後まで第２部でのみ行われる。治験責任医師（又は指定担当者）の裁量により、連続的第ＩＩ誘導ＥＣＧモニタリングを延長することができる。これらのデータは、リアルタイムの視覚的モニタリングのためのものであり、ＥＣＧ監視装置によって、又は治験責任医師によって検出されたあらゆる異常は印刷され、原データとして保持される。異常が特定された後、できるだけ速やかにスケジュール外の１２誘導ＥＣＧ測定も行われる必要がある。臨床的に有意な異常は有害事象として記録される。
９．６．５．バイタルサイン
血圧測定及びＨＲ測定は、完全自動オシロメトリック装置を用いて仰臥位で評価される。自動装置が利用できない場合にのみマニュアル法を用いた。バイタルサインは、血液試料が採取される腕とは反対の腕から記録する必要がある（ＩＶ注入時間の間を除く）。
血圧及びＨＲ測定の前に、気を散らすもの（例えば、テレビ、携帯電話）がない静かな環境で少なくとも５分間安静にする必要がある。全ての時点で単一のＢＰ及びＨＲ測定を行って、記録する。
体温測定（すなわち、鼓膜）におけるのと同じ方法が、試験期間全体にわたって全ての被験者の全ての測定に使用される。
これらの検査の時点は、「時間及び事象のスケジュール」に指定される。
９．６．６．身体検査
完全な身体検査は、全般的な外観、神経学的、眼、耳／鼻／咽喉、甲状腺、心臓血管、呼吸器、腹部／消化器、肝臓、筋骨格、及び皮膚科学的検査を含む、通常の医学的検査を含む。
簡単な物理的検査には、皮膚、呼吸器系、心臓血管系、腹部（肝臓、脾臓）及び中枢神経系の評価が含まれる。
これらの検査の時点は、「時間及び事象のスケジュール」に指定される。「スクリーニング」に記載されていない新たな臨床的に有意な所見（治験責任医師の所見）は、ＡＥとして捉えられる。
９．６．７．アレルギー反応／全身性過敏症
全ての被験者を、試験中、あらゆるアレルギー反応の発生について、また、パート２におけるＩＶ試験薬投与中のあらゆる注入反応について観察し、慎重に監視する。
試験薬の投与中、医師が治験実施施設で常時、直ちに診療に当たれるようにする。
全ての被験者は、「時間及び事象のスケジュール」に示されるように、ＩＶ投与の間及びその後の注入反応の症状について慎重に観察される。治験責任医師は、あらゆる注入反応の強度を評価する際に臨床的判断を用いる必要がある。
注入反応が観察された場合、アレルギー反応の性質及び症状の重症度に応じて、経口パラセタモール及び／又は経口／ＩＶ抗ヒスタミン剤及び／又は吸入型βアゴニスト及び／又はＩＶコルチコステロイド及び／又はＩＶエピネフリンなどの治療薬を投与することができる。以下の予防措置が、第２部における試験薬のＩＶ投与中に適用する必要がある。
注入が開始される前に、適切な人員、薬剤（例えば、エピネフリン、吸入型β－アゴニスト、抗ヒスタミン剤、及びコルチコステロイド）、並びにアナフィラキシーを含むアレルギー反応を治療するための注入溶液などの他の要件を利用可能とする。
被験者が中度又は重度の注入反応を有する場合には注入を直ちに中止する必要があり、被験者を施設のガイドラインに従って適切に治療する必要がある。
注入反応のために試験薬を中止する被験者は、試験終了時の来院までのスケジュールされた全ての来院において必要な評価を行うために戻るように求められる。
薬物投与後の反応は注入又は注射の１～２１日後に起こり得るが、発現は徴候及び症状において異なり得るものであり、常に著明ではない（これらに限定されるものではないが、発熱を伴う筋肉痛及び／又は関節痛及び／又は発疹を含み［他の認識されている臨床的症候群の徴候及び症状を代表するものではない］、掻痒、顔、手、又は唇の浮腫、嚥下障害、じんましん、咽頭痛、及び／又は頭痛を含む他の症状を伴い得る）。いずれのアレルギー反応又は過敏症もＡＥとして記録する必要があり、反応の種類が示される必要がある。被験者が注入の遅延又は注入反応を示す場合、被験者は、更なるスケジュール外の試料（炎症性マーカー用の尿、血清、及び血漿）を提供するように求められる。これらの試料を、遅延過敏症反応を示唆する有害事象の発生のできるだけ近くで採取するためにあらゆる取り組みが行われる必要がある。これらの試料は、症状の病因を試し、理解するために使用される。皮膚反応（すなわち、発疹）が観察された場合、やはり発疹の原因を理解するために用いられる皮膚生検を得るための許可が被験者に求められる。
９．６．８．局所注射部位反応（第１部）
試験薬のＳＣ投与後の注射部位を、「時間及び事象のスケジュール」に示される時点における局所注射部位反応について評価する。
あらゆる有害反応（例えば、疼痛、紅斑、及び／又は硬結）は、文書に記録され、１）疼痛度、２）圧痛、３）紅斑／発赤、４）硬結／腫脹の４つのパラメータに基づき、「Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｇｒａｄｉｎｇ Ｓｃａｌｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈｙ Ａｄｕｌｔ ａｎｄ Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ Ｅｎｒｏｌｌｅｄ ｉｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ」７に記載されるように特徴付けが行われる必要がある。詳細は以下の表７０を参照されたい。
Figure 2022513098000085
 ＥＲ＝救急外来
ａ最大の単一直径で測定された局所反応を等級付けする以外に、測定値は連続変数として記録する必要がある。ｂ硬結／腫脹は、機能的スケール並びに実際の測定値を用いて評価及び等級付けする必要がある。
視覚的所見（例えば、発赤、硬結、腫脹）を有するＡＥとして捉えられた全ての局所注射部位反応は、後の評価のために指標定規と共に写真撮影するものとする。
９．７．試料の採取及び取り扱い
試料採取の正確な日付及び時間をｅＣＲＦに記録する。留置カニューレを介して血液試料を採取する場合、各血液試料が採取される前に、ロックのデッドスペース容量よりもわずかに多い適量（１ｍＬ）の漿液をカニューレから除去し、廃棄する。血液試料採取後、カニューレを、０．９％塩化ナトリウムでフラッシュし、ロックのデッドスペース容量に等しい量を充填した。マンダリン（オブチュレータ）を使用する場合、廃棄による血液損失は予想されない。ヘパリンによるフラッシングは許容されない。
全ての試料採取のタイミング及び頻度については「時間及び事象のスケジュール」を参照されたい。
試料の収集、取り扱い、保管及び輸送に関する指示は、提供される検査室マニュアルに示される。試料の採取、取り扱い、保管、及び輸送は、検査室マニュアルに示されるように、指定された、また適用可能な場合には、調節された温度条件下で行われる。
１０．被験者の試験処置の完了／中断／試験の中止
１０．１．完了
被験者は、試験終了時の来院で評価を完了した場合に試験を完了したものとみなされる。
１０．２．試験治療の中断／試験の中止
被験者は、以下の理由のいずれによっても自動的に試験を中止する。
フォローアップ不能
同意の撤回
死亡
被験者が、外来患者期間の終了前に何らかの理由で試験を中止する場合、試験終了時の評価を得る必要がある。被験者が、試験終了時の来院までのいずれかの来院において戻る意思がある場合、あらゆる追加の情報が収集され、許容されるあらゆる手順が行われる。
被験者がフォローアップ不能となった場合、実施施設担当者により、被験者と連絡を取って中断／中止の理由を決定するための無理のない範囲のあらゆる取り組みが行われる。フォローアップのために取られた措置は文書化する必要がある。
被験者が試験を完了する前に中止する場合、中止の理由は、ｅＣＲＦ及び原資料に文書化する必要がある。中止した被験者に割り当てられた試験薬は、別の被験者に割り当てられなくてもよい。中止する被験者は交代させることができる。
ＰＩ又は治験依頼者が、更なる試験参加を中止することが被験者の最善の利益であると考える場合（例えば、安全性の理由又は忍容性の理由から）、それは許容されるが、被験者は試験終了時の来院により試験評価を完了する必要がある。
１１．統計的方法
統計的分析は、治験依頼者によって、又は治験依頼者の権限の下で行われる。
試験の探索的及び記述的性質のため、正式な仮説検定は計画されない。
１１．１．被験者情報
少なくとも部分用量の試験薬が投与される全ての被験者は、記述統計及び安全性の分析に含まれる。
１１．２．標本サイズの決定
ＦＰ２に関して利用可能なヒトＰＫデータは存在しないため、この最初のＦＩＨ第１相試験では、正式な標本サイズの計算は行わなかった。各投与群で計画される被験者の数は、研究の主目的が安全性及び忍容性であり、副次的目的のうちの１つがＰＫプロファイルを評価することである、新規薬物の単回用量漸増投与第１相試験における通常の標本サイズと一致する。各投与群で６人の被験者をＦＰ２にランダム化し、２人の被験者をプラセボにランダム化する。したがって、活性試験薬とプラセボとの比は、各投与群内で３：１となる。計画される被験者の数は、更なる臨床開発の可能性の評価を可能とするようなＦＰ２の安全性、忍容性、及び薬物動態に関する充分な情報を与えるものと予想される。投与群当たり２人のプラセボが投与される被験者は、各用量レベルでの安全性及び忍容性の判断を可能とするうえで充分なはずであり、適切な場合、プラセボ被験者は、試験の完了時にデータ分析の目的でプールされる。異質分散などの問題のためにプラセボ被験者をプールすることが適当ではない場合、代替的な統計的方法（対数変換など）を用いてデータの全てを分析に利用できるようにすることができる。
用量レベル当たり６人のＦＰ２で処理された被験者の標本サイズは、安全性シグナル（例えば、過敏症）の確率を推定するのに充分である。約１０％の安全性シグナルの真のリスクを仮定すると、活性薬剤が投与される６人の被験者は、約４７％の確率で少なくとも１つの事象を検出することを可能とする。一方、約５０％のリスクを仮定すると、少なくとも１つの事象が検出される確率は約９８％である。
薬物動態パラメータについては、第２部においてＦＰ２のＩＶ投与が行われる６人の被験者（男性３人、女性３人）は、絶対バイオアベイラビリティーの推定に適切な精度を与えるものと予想される。６人の被験者の標本サイズは、ＩＶ投与時のＦＰ２のＡＵＣを推定するための適切な精度を与え、ＳＣ剤形の薬学的品質特性を評価するためのベンチマークとして機能するものと予想される。
１１．３．薬物動態の分析
少なくとも１回用量の試験薬が投与され、投与後に少なくとも１つのＰＫ及び免疫原性試料を採取した全ての被験者が、ＰＫデータの分析及び報告に含まれる。被験者は、被験者のデータがＰＫの正確な評価を可能にしない場合（例えば、試験薬の不完全な投与、投与時間及び試料採取時間の情報がない場合、濃度データがＰＫパラメータの計算に充分でない場合）には、ＰＫ分析から除外される。
記述統計（平均値、中央値、標準偏差、及び変動係数）を用いて、各試料採取時点におけるＦＰ２の血清濃度を要約し、また各ＤＧのＦＰ２のＰＫパラメータについても要約する。最低定量可能濃度（ＢＬＱ）未満の全ての血清濃度は要約統計量において０として補完され、ＰＫ分析から除外された全ての被験者及び試料は明確に文章化される。ＰＫパラメータはまた、ＤＧごとにも要約される。
平均及び／又は中央値の血清ＦＰ２の濃度時間プロファイルを、試験薬投与後の完全なプロファイルにわたってプロットする。平均プロットでは、ＢＬＱ値は０に設定される。個々の血清濃度時間プロファイルでは、最初の測定濃度までのＢＬＱ値を０に設定し、最後の測定濃度の後のＢＬＱ値は分析から除外する。
ＰＫデータの統計分析は、少なくとも１回のＦＰ２用量が投与された全ての被験者について行われる。幾何平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣを、用量比例性を視覚的に評価するために用量に対してプロットする。ＦＰ２のＳＣ投与時の用量比例性は、自然対数変換したＣｍａｘ及びＡＵＣデータ（パワーモデル）の線形回帰分析を用いて調べることができる。必要に応じてデータの更なる分析を行うことができる。
絶対ＳＣバイオアベイラビリティーは、全身的に利用可能な投与量の割合として計算され、百分率で表される。個々のバイオアベイラビリティーを調べるには、ＳＣ投与からの個々の用量正規化ＡＵＣｉｎｆとＩＶ投与群からの用量正規化ＡＵＣｉｎｆの幾何平均との比を計算し、百分率として表す。適切であるとみなされる場合、ＡＵＣｉｎｆの代わりに、部分ＡＵＣ（０～４週間）を使用してもよい。ＦＰ２の絶対ＳＣバイオアベイラビリティーは、上記に述べた個々の絶対ＳＣバイオアベイラビリティーの平均を計算することによって導出される。個々の絶対ＳＣバイオアベイラビリティーの９５％信頼区間及びプロットを検討することもできる。
１１．４．免疫原性の分析
抗ＦＰ２抗体の発生率を、ＦＰ２の少なくとも１回用量が投与され、かつＦＰ２に対する抗体の検出に適当な試料を有する全ての被験者（すなわち、ＦＰ２の投与後に少なくとも１つの試料を得た被験者）について要約する。
ＦＰ２に対する抗体について陽性である被験者のリストが提供される。ＦＰ２に対する抗体の最大力価も、ＦＰ２に対する抗体について陽性である被験者について報告される。
ＦＰ２に対する中和抗体（ＮＡｂ）の発生率を、ＦＰ２に対する抗体について陽性であり、かつＦＰ２に対するＮＡｂについて評価可能な試料を有する被験者について要約する。
１１．５．薬力学分析（体重、食物摂取量）並びに探索的ＰＤ評価（ＶＡＳ）及びバイオマーカー
薬力学分析は、少なくとも１回用量の試験薬（ＦＰ２又はプラセボ）が投与され、治療後少なくとも１回のＰＤ評価を行った全ての被験者について実施される。各用量について、各ＰＤエンドポイント（例えば、体重、食物摂取量）並びに探索的ＰＤ転帰（ＶＡＳ）及びバイオマーカーパラメータについて各時点で記述統計量を計算する。パラメータは、１）各被験者について、及び２）用量関連効果の視覚的評価のための各エンドポイントについての用量対計画された試料採取時間により平均値±標準偏差（又は他の適切な要約手段）として、グラフで表示することができる。更なる記述統計分析には、選択された薬力学的及び探索的バイオマーカーのベースライン（すなわち、投与前の）値からの変化及び変化率（％）が含まれてもよい。
薬力学的及び探索的バイオマーカーは、単回用量漸増投与、連続的パネル設計に適切な混合効果モデルを用いて分析することができる。混合効果モデルは、治療、来院ごとの治療相互作用、ベースライン、及び来院ごとのベースライン相互作用についての固定因子を、被験者のランダム因子とともに含み得る。ベースライン共変量がモデルに含まれてもよい（例えば、年齢、性別、体重など）。適切な場合、ベースラインからの最小二乗平均の変化量の差（治療－プールされたプラセボ）及び平均の差の９０％信頼区間を、線形モデルからの平均二乗誤差を用い、ｔ分布を参照して得ることができる。ベースライン（投与前）からのＰＤ／バイオマーカーエンドポイントの変化の最小二乗平均及び９０％信頼区間も、治療群ごとに計算することができる。
必要に応じて更なる探索的分析を行うことができる。ＶＡＳなどのＰＤパラメータは、上記に述べた線形混合効果モデルにおける分析に先立って、曲線下面積（台形法）又は時間加重平均を用いて来院内で経時的に要約することができる。
１１．６．薬物動態／薬力学分析
ＰＫデータとＰＤデータとの間の関係を検証することができる。適切な場合、血清薬物濃度と対応するＰＤ測定値をプロットして、それらの関係を評価することができる。適切であるとみなされる場合、曝露効果関係を記述するために適当なモデルを適用することができる。
ＰＫ／ＰＤの関係はグラフで調べることができ、適切であるとみなされる場合、適当な統計的方法を使用して更に分析することができる。ＰＤ変数（例えば、体重、食物摂取量、ＶＡＳ）に対するＰＫ曝露（Ｃｍａｘ及び／又はＡＵＣｉｎｆ）はグラフで調べることができる。この関係のグラフ表示が妥当であるとみなされる場合、これらのデータを適当なモデルを用いて統計的に分析することができる。
安全性変数（例えば、ＥＣＧ応答）に対するＰＫ曝露（Ｃｍａｘ及び／又はＡＵＣｉｎｆ）はグラフで調べることができる。この関係のグラフ表示が妥当であるとみなされる場合、これらのデータを適当なモデルを用いて統計的に分析することができる。
１１．７．安全性分析
ＦＰ２又はプラセボの少なくとも１回用量が投与された全ての被験者の安全データの報告には、有害事象の発生率及び種類、並びに投与前から最終の投与後時点までの血圧、心拍数、臨床検査データ、及び１２誘導ＥＣＧデータの絶対値及び変化が含まれる。
有害事象
治験責任医師によりｅＣＲＦで有害事象を特定するために使用される用語は、医薬規制用語集（ＭｅｄＤＲＡ）を使用して逐語的にコード化される。試験薬により発現する有害事象は、介入期中に発生する有害事象であるか、又はベースラインから悪化した既往症の結果である有害事象である。報告された全ての有害事象を分析に含める。各有害事象について、特定の事象の少なくとも１回の発生があった被験者の割合を介入群ごとに要約する。更に、適切な場合、介入群間の比較が与えられる。
有害事象のために死亡した、試験薬を中止した、又は重度若しくは重篤な有害事象を有した被験者の要約、リスト、データセット、又は被験者のナラティブが適宜与えられてもよい。
臨床検査
臨床検査の種類ごとに検査データをまとめる。基準範囲及び著しく異常な結果（「統計分析プラン」に示される）は、検査データの要約に使用する。記述統計量を、ベースラインの各検査検体について、並びにスケジュールされた各時点における観測値及びベースラインからの変化について計算する。ベースライン結果からの変化は、介入前対介入後のクロス集計で提示される（正常範囲よりも下、正常範囲内、及び正常範囲を超えるクラスにより）。基準範囲外のあらゆる検査結果を有する被験者のリストが与えられる。あらゆる著しく異常な検査結果を有する被験者のリストも与えられる。
心電図（ＥＣＧ）
分析されるＥＣＧ変数は、心拍数、ＰＲ間隔、ＱＲＳ間隔、ＱＴ間隔、及び、以下の補正方法、すなわち、Ｂａｚｅｔｔの式に従って補正されたＱＴ（ＱＴｃＢ）、及びＦｒｉｄｅｒｉｃｉａの式に従って補正されたＱＴ（ＱＴｃＦ）１，１９，１４，１６を使用して補正されたＱＴ（ＱＴｃ）間隔である。
ＱＴｃ間隔の記述統計量及びベースラインからの変化を、スケジュールされた各時点で要約する。ＱＴｃ間隔が＞４５０ｍｓ、＞４８０ｍｓ、又は＞５００ｍｓである被験者の割合を要約し、同様にベースラインからのＱＴｃ間隔の増加が＞３０ｍｓ、又は＞６０ｍｓである被験者の割合も要約する。
ベースライン読み取り値からの変化量であるＥＣＧ波形の全ての臨床的に関連のある異常は報告される（例えば、Ｔ波形態の変化又はＵ波の発生）。
ＪＮＪ－６４３７９０９０血清濃度と主要エンドポイントΔΔＱＴＣ（時間一致ベースラインＱＴｃからのプラセボ補正された変化）との間の関係は、適切な場合、線形又は非線形混合効果モデリングアプローチを用いて定量化することができる。
バイタルサイン
ＨＲ及び血圧（収縮期及び拡張期）（仰臥位）の値並びにベースラインからの変化の記述統計量を、スケジュールされた各時点で要約する。臨床的に重要な限界値を超える値を有する被験者の割合を要約する。
身体検査
ベースラインからの変化の記述統計量を、スケジュールされた各時点で要約する。
１１．８．中間分析／データ検証委員会
中間分析は計画されていない。しかしながら、用量漸増決定を行う目的で各投与群が完了した後、盲検化データ検証を試験チームによって実施することができる。
１２．有害事象の報告
臨床試験からの安全性情報の適時の、正確、かつ完全な報告及び分析は、被験者、治験責任医師、及び治験依頼者の保護にとって重要であり、世界中の規制機関によって命じられている。治験依頼者は、安全性情報の適切な報告を確実にするために世界的な規制要件に準拠して標準業務手順（Standard Operating Procedures）を確立し、治験依頼者又はその関係者によって実施される全ての臨床試験は、これらの手順に従って実施される。
有害事象及び重篤な有害事象を検出する方法
ＡＥＳ又はＳＡＥを検出する際にバイアスを導入しないよう注意する。被験者の非盲検かつ非誘導的な言葉による質問は、有害事象の発生について問診するための好ましい方法である。
非自発的な有害事象
非自発的ＡＥは、被験者がそれについて具体的に質問される既定の局所的及び全身的事象である。この試験では、局所注射部位反応（痛み又は痒みなど）は、「時間及び事象のスケジュール」に示されるように非自発的である。
自発的な有害事象
自発的ＡＥは、自発的に報告される全ての有害事象である（すなわち、被験者はそれについて具体的に質問されない）。
１２．１．定義
１２．１．１．有害事象の定義及び分類
有害事象
有害事象とは、医薬品（治験用又は非治験用医薬品）を投与された臨床試験被験者における任意の好ましくない医療上の出来事である。有害事象は、必ずしも介入と因果関係を有するわけではない。したがって、有害事象とは、医薬品（治験用又は非治験用）医薬品の使用と時間的に関連のある、あらゆる好ましくない、意図しない徴候（例えば、臨床検査値の異常）、症状又は疾患のことであり得、医薬品（治験用又は非治験用）医薬品との因果関係の有無は問わない。（医薬品規制調和国際会議（［International Conference on Harmonisation、ＩＣＨ］による定義）。
これには、新たな発症又はベースライン状態からの重症度若しくは頻度における悪化である任意の発症、あるいは検査室試験の異常を含む診断手順の異常な結果が含まれる。
治験依頼者はＩＣＦの署名の時点から有害事象を収集する。
重篤な有害事象
ヒト使用のための医薬品の安全性情報監視のＩＣＨ及びＥＵガイドライン（ICH and EU Guidelines on Pharmacovigilance for Medicinal Products for Human Use）に基づく重篤な有害事象とは、任意の用量で、
死に至る、
生命に関わる、
（被験者はその事象の時点において死の危険に曝されていたものである。「命に関わる」とは、仮により重度であれば死を招いたかもしれない事象を指すわけではない。）
入院又は現行の入院期間の延長が必要となる、
永続的又は重大な障害／機能不全に至る、
先天異常／先天性欠損を来す、
医薬品を介した任意の感染因子の疑いのある伝播を来す、
医学的に重要である＊、好ましくないあらゆる医療上の出来事である。
＊直ちに生命を脅かしたり、又は死や入院に至らなくとも、被験者を危険にさらす恐れがあったり、又は上記の定義に挙げられている他の結果のうちの１つを防止するための介入が必要となり得る重要な医学的事象などの他の状況においても適切であるかどうかを決定する際に、医学的及び科学的判断を実行する必要がある。これらは通常、重篤であるとみなされる必要がある。
試験介入と事象（例えば、アナフィラキシーによる死）との間の因果関係を示唆する証拠が存在する重篤かつ予期せぬ有害事象が発生した場合、それが試験エンドポイントの構成要素（例えば、総死亡率）である場合であっても、その事象は、重篤かつ予期せぬ疑われる有害反応として報告される。
未記載の（予測できない）有害事象／安全に関する参考情報
性質又は重症度が適用可能な製品参照安全性情報と一致しない場合、有害事象は、列挙されていないと考えられる。ＦＰ２については、有害事象の期待度は、治験薬概要書に記載されているか否かによって決定される。
介入の使用に関連する有害事象
セクション１２．１．２「因果関係の定義」に記載される定義によって、因果関係が考えられるか、因果関係がおそらくあるか、又は因果関係がある可能性が極めて高い場合、有害事象は介入の使用に関連していると考えられる。
これまでにＦＰ２で臨床試験は行われていないため、ヒトにおけるＦＰ２の影響に関するデータは存在していない。
１２．１．２．因果関係の定義
関連なし
介入の使用に関連しない有害事象。
ほぼ関連なし
代替的な説明がより可能性が高い有害事象、例えば、併用薬、併発症、又は時間の関係は、因果関係がおそらくないことを示唆する。
可能性あり
介入の使用に起因し得る有害事象。代替的な説明、例えば、併用薬、併発症は決定的ではない。時間の関係は合理的であり、したがって、因果関係を除外することができない。
多分関連あり
介入の使用に起因し得る有害事象。時間の関係は、暗示的である（例えば、薬剤の投与中断によって確認される）。代替的な説明、例えば、併用薬、併発症は可能性が低い。
非常に可能性が高い
有害事象は、可能な有害反応として列挙され、代替的な説明、例えば、併用薬、併発症によって合理的に説明することができない。時間の関係は、非常に暗示的である（例えば、薬剤の投与中断及び再開によって確認される）。
１２．１．３．重症度基準
重症度グレードの評価は、以下の全般的なカテゴリー記述子を使用して行われる：
軽度：容易に耐容され、最小限の不快感を引き起こし、日常活動を妨害しない症状の認識。
中程度：普段の活動の妨害を引き起こすような十分な不快感が存在する。
重度：機能の重大な障害又は機能不全を引き起こす、極度の苦痛。正常な日常活動が妨害される。
治験責任医師は、被験者が直接経験していない事象の重症度（例えば、検査室の異常）を評価する際に臨床的判断を使用する必要がある。
１２．１．特別な報告状況
緊急報告又は安全性評価を必要とし得る治験依頼者治験介入に対する関心の安全性事象としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
治験依頼者治験介入の過剰投与
治験依頼者治験介入の乱用／誤用の疑い
治験依頼者治験介入への不注意又は偶発的曝露
治験依頼者製剤に関与する投薬エラー（治験依頼者治験介入への被験者／患者の曝露を伴うか又は伴わない、例えば、名前の混乱）
特別な報告状況は、ｅＣＲＦに記録する必要がある。重篤な有害事象の基準を満たす任意の特別な報告状況は、ｅＣＲＦの重篤な有害事象ページに記録する必要がある。
１２．３．手順
１２．３．１．全ての有害事象
重篤であるか非重篤であるかにかかわらず、全ての有害事象及び特別な報告状況は、署名され、かつ日付を記入したＩＣＦが取得された時間から、安全性の経過観察のための連絡を含み得る、被験者の最後の試験関連処置の完了まで報告される。試験終了時の来院までに治験責任医師に自発的に報告されたものを含む重篤な有害事象は、「重篤な有害事象フォーム」を使用して報告される。治験依頼者は、プロトコルに指定された時間枠を越えて治験責任医師によって自発的に報告された全ての安全性情報を評価する。
重篤な有害事象の定義を満たす全ての事象は、それらがプロトコル特異的評価であるかどうかにかかわらず、重篤な有害事象として報告される。
全ての有害事象は、治験介入に対する重篤性、重症度、又は推定される関係にかかわらず、医療専門用語を使用して原資料及びｅＣＲＦに記録される。可能な場合はいつでも、徴候及び症状が、全般的な病因のために、診断を行う必要がある（例えば、咳、鼻音、くしゃみ、咽頭炎、及び鼻詰まりが「上気道感染」として報告されるべきである）。治験責任医師は、試験療法に対する有害事象の関係に関する意見をｅＣＲＦに記録する。有害事象管理に必要な全ての測定は、原資料に記録され、治験依頼者命令に従って報告される。
１４．試験薬情報
１４．１．試験薬の物理的記述
この試験のために供給されるＦＰ２は、ｐＨ６．５の、１０ｍＭリン酸ナトリウム、８％スクロース、及び０．０４％ポリソルベート２０中、５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する無菌の黄褐色溶液である。
ＦＰ２は、１．２ｍＬの充填容積を有するガラスバイアル中で凍結された状態で提供される。
この試験のために供給される製剤化緩衝液は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、８．０％スクロース及び０．０４％ポリソルベート２０からなる無菌透明溶液である。製剤化緩衝液は、プラセボ注射液を調製するために、また、最初のＦＰ２のＳＣ用量の調製における希釈剤として使用される。
製剤化緩衝液は、１．２ｍＬの充填容積を有するガラスバイアル中で凍結された状態で提供される。
これは、治験依頼者の責任の下で製造及び提供される。賦形剤のリストを上記に示す。
１４．２．パッケージング
試験薬（ＦＰ２と、ＦＰ２の希釈用及びプラセボとしての製剤緩衝液）は、バルク供給品として提供される。試験薬は、施錠された薬局で保管され、ＩＶ注入液（第２部）の調製後、又はＳＣ注射液（第１部）の盲検化調製後に投与するため、適当な資格を有する試験チームのメンバーにのみ渡される。
１４．３．ラベル付与
試験薬のラベルは、適用可能な規制要件を満たす情報を含む。
１４．４．調製、取り扱い、及び保管
全ての試験薬は、－３０℃～－４０℃の範囲に調節された温度で保存され、光から遮断される。
最初の４つの計画されたＳＣ投与群では、製剤化緩衝液を用いて薬剤を使用前に必要な濃度に希釈する（ＤＧ１ ０．５ｍｇ／ｍＬ、ＤＧ２及びＤＧ３ ５．０ｍｇ／ｍＬ、ＤＧ ４ １０．０ｍｇ／ｍＬ）。ＩＶ投与用の薬剤は１０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、インライン濾過して投与する。
参考文献
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実施例２２：臨床試験の結果
以下の点を除いて、実施例２１に記載のプロトコルに従って実施した。すなわち、（１）試験の第２部（絶対バイオアベイラビリティー）を実施しなかった点、（２）参加者年齢を定義する組み入れ基準を、適格上限年齢を５５歳まで上げた点。（３）尿コチニン検査が陽性である参加者に基づく除外基準を、入院期間中に喫煙を控えてもらえる軽度及び断続的喫煙者を組み入れるように変更した点。コホート１～６の投与が完了したのに対して、コホート７の投与は継続中である。それぞれ８人の被験者からなる６つのコホート（コホート１～６）に分けられた４８人の被験者を、単回投与のＦＰ２又は一致するプラセボのいずれかに曝露した。各コホートにおいて、６人の被験者にＦＰ２を投与し、２人の被験者に一致するプラセボを投与した。以下は、各コホート１～６に投与されるＦＰ２（又は一致するプラセボ）の用量の要約である（表７１）。
Figure 2022513098000086
盲検化した安全性及び忍容性情報が、投与を行った全ての被験者について利用可能である（コホート１～６）。群レベルの要約した薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）の結果が、コホート１～５について利用可能である。
安全性及び忍容性：処置は概して安全で忍容性が高いと考えられた。
薬物動態
薬物動態データは、コホート１～５について利用可能であった。投与するＦＰ２の用量を増加させると、概ね用量比例的な形で曝露が増加した。Ｔｍａｘは６日目に生じ、Ｔ１／２は約１２日であったことから、週１回の投与を支持した。
Figure 2022513098000087
 Ｃ７２はＣｍａｘの７２％を表す
薬力学
食物摂取量の評価は、ベースライン（－１日目）及び試験薬投与後の３日目に再び行った。このＳＡＤ試験の最初の４つのコホートで観察されたＴｍａｘは概ね６日目であり、３日目のＦＰ２の血漿濃度は、６日目に得られた濃度の約７０～８０％である。
食物摂取量を評価するため、４回の標準化された食事（朝食、昼食、軽食、夕食）を被験者に与えた。各被験者に同じ食事（同じ食料品及び同じ量）を両方の日（すなわち、－１日目と３日目）に与えた。４回の食事で消費されたカロリーを合計して、ベースライン（－１日目）及び３日目に消費された総カロリーを得た。ベースラインから３日目までの食物摂取量の変化を、ＦＰ２の薬力学的作用機序の探索的尺度として用いた。
食物摂取量の変化は、プラセボ及び活性薬剤を投与した両方の被験者で変動し、ベースラインに対する３日目の変化はコホート１～４で約±２０％であった。しかしながら、食物摂取量は、３０ｍｇのＦＰ２で処置した６人の被験者（コホート５）のうち、４人で５０％よりも大きく（５５～９６％の範囲で）減少した。これに対して、併せたプラセボ群（１０人の被験者）で、３０％を上回る食物摂取量の減少を達成した者はいなかった。この同じ投与群（コホート５、３０ｍｇ）では、食物摂取量の最大減少率を示した２人の被験者（食物摂取量の－８５％及び－９６％の減少）は、最も高いＦＰ２の曝露に達した被験者でもあった。プラセボ又はＦＰ２を投与した被験者におけるベースラインから投与後３日目までの食事摂取量の変化率のパーセントの中央値を表７３に示す。
Figure 2022513098000088
以上、本発明を詳細に、かつその具体的な実施形態を参照して説明したが、当業者には、発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更及び改変を行い得る点は明らかであろう。

Claims (50)

  1. 対象の体重を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、前記融合タンパク質が０．８ｍｇ～９０ｍｇの範囲の用量で投与され、前記対象の体重が８０ｋｇ以上である、方法。
  2. 前記対象が、過体重である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記対象が、２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する、請求項２に記載の方法。
  4. 前記対象が、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記融合タンパク質が、０．８ｍｇ、２．５ｍｇ、７．５ｍｇ、１５ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、及び９０ｍｇからなる群から選択される用量で投与される、請求項１に記載の方法。
  6. 融合タンパク質が、０．８ｍｇの用量で投与される、請求項５に記載の方法。
  7. 融合タンパク質が、２．５ｍｇの用量で投与される、請求項５に記載の方法。
  8. 融合タンパク質が、７．５ｍｇの用量で投与される、請求項５に記載の方法。
  9. 融合タンパク質が、１５ｍｇの用量で投与される、請求項５に記載の方法。
  10. 融合タンパク質が、３０ｍｇの用量で投与される、請求項５に記載の方法。
  11. 融合タンパク質が、６０ｍｇの用量で投与される、請求項５に記載の方法。
  12. 融合タンパク質が、９０ｍｇの用量で投与される、請求項５に記載の方法。
  13. 融合タンパク質が、皮下注射により投与される、請求項１に記載の方法。
  14. 前記組成物が、前記対象に週１回投与される、請求項１に記載の方法。
  15. 対象の食物摂取量を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、前記融合タンパク質が０．８ｍｇ～９０ｍｇの範囲の用量で投与され、前記対象の体重が８０ｋｇ以上である、方法。
  16. 前記対象が、過体重である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記対象が、２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記対象が、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記融合タンパク質が、０．８ｍｇ、２．５ｍｇ、７．５ｍｇ、１５ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、及び９０ｍｇからなる群から選択される用量で投与される、請求項１５に記載の方法。
  20. 融合タンパク質が、０．８ｍｇの用量で投与される、請求項１９に記載の方法。
  21. 融合タンパク質が、２．５ｍｇの用量で投与される、請求項１９に記載の方法。
  22. 融合タンパク質が、７．５ｍｇの用量で投与される、請求項１９に記載の方法。
  23. 融合タンパク質が、１５ｍｇの用量で投与される、請求項１９に記載の方法。
  24. 融合タンパク質が、３０ｍｇの用量で投与される、請求項１９に記載の方法。
  25. 融合タンパク質が、６０ｍｇの用量で投与される、請求項１９に記載の方法。
  26. 融合タンパク質が、９０ｍｇの用量で投与される、請求項１９に記載の方法。
  27. 前記融合タンパク質が、皮下注射により投与される、請求項１５に記載の方法。
  28. 前記組成物が、前記対象に週１回投与される、請求項１５に記載の方法。
  29. 対象の体重を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、前記組成物が、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１．０８ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される、方法。
  30. 前記組成物が、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．３６ｍｇ／ｋｇ、０．７２ｍｇ／ｋｇ、及び１．０８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記組成物が、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記組成物が、０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９に記載の方法。
  33. 前記組成物が、０．０９ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９に記載の方法。
  34. 前記組成物が、０．１８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９に記載の方法。
  35. 前記組成物が、０．３６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９に記載の方法。
  36. 前記組成物が、０．７２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９に記載の方法。
  37. 前記組成物が、１．０８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９に記載の方法。
  38. 前記融合タンパク質が、皮下注射により投与される、請求項２９に記載の方法。
  39. 前記組成物が、前記対象に週１回投与される、請求項２９に記載の方法。
  40. 対象の食物摂取量を減少させる方法であって、配列番号９２を有する融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む組成物を投与することを含み、前記組成物が、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１．０８ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される、方法。
  41. 前記組成物が、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．３６ｍｇ／ｋｇ、０．７２ｍｇ／ｋｇ、及び１．０８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記組成物が、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記組成物が、０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記組成物が、０．０９ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記組成物が、０．１８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
  46. 前記組成物が、０．３６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
  47. 前記組成物が、０．７２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
  48. 前記組成物が、１．０８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
  49. 前記融合タンパク質が、皮下注射により投与される、請求項４１に記載の方法。
  50. 前記組成物が、前記対象に週１回投与される、請求項４１に記載の方法。
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