JP2022512701A - 新規制御スイッチ - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒト対象の治療に適したキメラ抗原受容体(CAR)であって、(i)膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達鎖;(ii)標的結合ドメイン及び膜貫通ドメインを含む非シグナル伝達鎖を含み、前記鎖の一方がHIVインテグラーゼ触媒コアドメイン(CCD)又はその機能的フラグメント若しくは変異体をさらに含み、他方の鎖がLEDGF/p75インテグラーゼ結合ドメイン(IBD)又はその機能的フラグメント若しくは変異体をさらに含む、上記キメラ抗原受容体に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、CARシグナル伝達活性に対する制御を提供するキメラ抗原受容体(CAR)に関する。
キメラ抗原受容体(CAR)は、現代の個別化治療法の最先端の人工T細胞受容体である(Lee et al. (2012) Clin. Cancer Res., 18(10):2780-90)。個別化治療は、従来利用可能な治療法に対して抵抗性の患者においてがんを治療し、患者自身の免疫細胞を用いて疾患と闘うために開発された。免疫細胞は、腫瘍抗原に特異的なCARを発現するようにex vivoで遺伝子操作され、これらの細胞はその後患者に戻される。CARはT細胞の表面に存在し、膜貫通ドメインにより分離されているエクトドメイン及びエンドドメインからなる。エクトドメインは、疾患細胞上でのみ発現される抗原に向けられた標的結合領域(例えば、一本鎖可変フラグメント)を有する。エンドドメイン(通常、CD3ζ-CD28又はCD3ζ-41BBを含む)はサイトゾルに向いており、抗原が細胞の表面上の標的結合領域に結合した後、活性化シグナルをT細胞に伝える。
第1世代のCARは、CD3ゼータ又はFc受容体ガンマ鎖の細胞質領域に由来するシグナル伝達ドメインに結合した標的結合ドメインを含んでいた。第1世代CARは、首尾よくT細胞を選択された標的へと向け直すことが示されたが、これらはin vivoにおいてT細胞の長期増殖及び抗腫瘍活性を提供することはできなかった。従って、第2世代CAR及び第3世代CARは、CD28、OX-40(CD134)及び4-1BB(CD137)などの共刺激分子を含めることにより、改変されたT細胞の生存率を高め、且つ増殖を増加させることに重点を置いてきた。
しかし、重要臓器(例えば、肺)に対する潜在的な交差反応性を通して、この有望な治療法の安全性の懸念が生じてきた。臨床試験中に、CAR-T細胞で治療した患者においてオンターゲット(on-target)並びにオフターゲット(off-target)の両方のオフ腫瘍毒性(off-tumour toxicities)が観察されており、CAR研究により2例の死亡が報告されている(Morgan et al. (2010) Mol. Ther., 18(4):843-51)。これらの毒性は、動物モデルにおいては予測することが困難であり、小分子及び生物製剤とは対照的に、CAR-T細胞は特有の薬物動態(PK)プロファイルを有するリビングドラッグ(living-drug)である。従って、CAR-T細胞の殺活性をオフにするか又は低減させ、より制御され且つより安全な治療法を可能とする安全スイッチが開発されている。
1つのタイプの安全スイッチは、CAR-T細胞が、外部から薬剤を投与するとCAR-T細胞の選択的破壊を可能とする「自殺遺伝子」又は「消去遺伝子」を発現するようにさらに操作されている、自殺スイッチである。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)を組み込むことは、プロドラッグであるガンシクロビルを投与すると、複製しているDNA中にGCV-トリホスフェートが組み込まれることによって細胞死がもたらされることを意味する。別の方法は、誘導型カスパーゼ9(iCasp9)を使用することであり、これは小分子AP1903に結合するキメラタンパク質であり、カスパーゼ9の二量体化及び最終的にCAR-T細胞のアポトーシスをもたらす。しかし、自殺スイッチの主な欠点は、それが非可逆的であること、及び治療が破壊されることである。他の欠点は、外部からの薬剤の投与がそれほど迅速に作用しないこと(スイッチエレメントはしばしば免疫原性(例えば、HSV-TK)である)、又はスイッチが100%の有効性を達成しないことがあり得る(自殺剤が十分に均一又は頑強ではないことから)ことである。
CARの活性を調節する別の戦略は、in vivoでCARのエンドドメイン及びエクトドメインの集合(ON型)又は分解(OFF型)を制御することである。これは、CARのシグナル伝達ドメイン及び標的結合ドメインを、シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖に分離した後、2つの異なる鎖の二量体化の誘導剤又は阻害剤として作用することができる小分子を付加又は除去することによってシグナル伝達活性を調節することによって達成される。このタイプのスイッチ戦略の利点は、スイッチ切り替えが可逆的であること、及び小分子の濃度を変化させることによってシグナル伝達を調節することができることである。しかし、既に使用されている小分子の薬理学的特性は必ずしも最適ではなく、受容体をオフにする速度論が、小分子の投薬量によって直接制御可能であるという保証はない。受容体をオフにする速度論を直接制御することができることは、いかなる副作用も最小限に低減させながら、疾患/状態を有効に治療するレベルまでCAR活性を微調整できることを意味し得る。
可逆性のON型集合スイッチの一例は、ラパマイシンがCARのシグナル伝達及び非シグナル伝達鎖の二量体化を誘導するラパマイシン-FKPB12-mTOR複合体である(Wu et al. (2015) Science, 350(6258): aab4077)。ラパマイシンCARにおいて、活性化は、化合物の濃度を変化させることを通して主に制御される。一方、ラパマイシンの中止によるラパマイシンCARの非活性化は、化合物の濃度に依存するのみならず、複合体の解離及び化合物のクリアランスの速度によって影響を受け、これらは化合物の投薬量によって制御することが難しいパラメーターである。この戦略の別の欠点は、治療期間を通してラパマイシンを連続的に投与しなければならないことである。
WO2016/030691は、Tetリプレッサー(TetR)とTetR相互作用タンパク質(TiP)との間の相互作用を使用してCARの活性化を制御する可逆的OFF型解離スイッチを記載する。この機構は、小分子の添加がTetR-TiPドメインの二量体化を破壊することから、ON型集合スイッチとは反対の様式で作用し、このように構成成分の鎖を分離することによってCARを非活性化する。このことは、CARがスイッチ切り替えオフを必要とする場合又はその活性をダウンレギュレートする必要がある場合に、破壊分子を投与するだけでよいことを意味する。しかし、WO2016/030691は、ヒト対象において潜在的に免疫原性である細菌由来のテトラサイクリン結合タンパク質/ペプチドを使用している。
従って、ヒトにおけるCAR T細胞治療を制御するための可逆的OFF型解離スイッチを開発することが当技術分野でなおも必要である。
本発明の第1の態様に従って、ヒト対象の治療に適したキメラ抗原受容体(CAR)であって、
(i)膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達鎖;
(ii)標的結合ドメイン及び膜貫通ドメインを含む非シグナル伝達鎖
を含み、前記鎖の一方が、HIVインテグラーゼ触媒コアドメイン(CCD)又はその機能的フラグメント若しくは変異体をさらに含み、他方の鎖がLEDGF/p75インテグラーゼ結合ドメイン(IBD)又はその機能的フラグメント若しくは変異体をさらに含む、上記キメラ抗原受容体が提供される。
本発明の別の態様によれば、本明細書中で定義されるCARのシグナル伝達鎖をコードするポリヌクレオチド、非シグナル伝達鎖をコードするポリヌクレオチド、並びにシグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明の別の態様によれば、本明細書中で定義されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
本発明の別の態様によれば、本明細書中で定義されるCARを含む免疫調節細胞が提供される。
本発明の別の態様によれば、治療に使用するための本明細書中で定義される免疫調節細胞が提供される。
本発明の別の態様によれば、本明細書中で定義される免疫調節細胞を含む医薬組成物が提供される。
本発明の別の態様によれば、本明細書中で定義される医薬組成物をヒト対象に投与することを含む、疾患を治療及び/又は予防する方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、本明細書中で定義されるCARを発現する免疫調節細胞を作製する方法であって、
(a)本明細書中で定義されるポリヌクレオチド又は発現ベクターを前記免疫調節細胞に形質導入又はトランスフェクトすること;及び
(b)前記ポリヌクレオチド又は前記発現ベクターを免疫調節細胞中で発現させること
を含む、上記方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、本明細書中で定義される方法によって得られる免疫調節細胞が提供される。
本発明の別の態様によれば、ヒト対象における本明細書中で定義されるCARの活性を制御する方法であって、CARによる治療を受けているヒト対象に、LEDGF/p75-HIVインテグラーゼ相互作用を阻害する薬剤を投与することを含む、上記方法が提供される。
HIVインテグラーゼ及びヒトLEDGF/p75タンパク質のフラグメントを組み込むオフスイッチキメラ抗原受容体(構築物1～5)の模式的機構。HIVインテグラーゼドメイン又はCD8αヒンジなどの成分の二量体化は、簡潔にするために表示していない。scFvは抗ヒトBCMA一本鎖可変領域フラグメントであり、CD8αはヒトCD8αのヒンジ及び膜貫通ドメインであり、p75はヒトLEDGF/p75タンパク質のIBDを含むフラグメントであり、INはHIVインテグラーゼのCCDを含むフラグメントであり、41BBはヒト4-1BBタンパク質の細胞内ドメインであり、CD3ζはヒトCD3ζのシグナル伝達ドメインである。成分は、実施例1に記載されるリンカーによって組み立てられる。 BCMA抗原提示細胞ARH-77-10B5との相互作用によって誘発されたJurkat細胞におけるNFATプロモーターの活性化(黒色の棒グラフ)。Jurkat細胞に、実施例1に記載される構築物1～5をトランスフェクトした。BI224436の添加がこれらの構築物のNFAT活性化に与える影響を灰色の棒グラフで表す。 BCMA抗原提示細胞ARH-77-10B5との相互作用によって誘発されるJurkat細胞におけるNFATプロモーターの活性化(黒色の棒グラフ)。Jurkat細胞に、実施例2に記載される構築物5～6をトランスフェクトした。構築物5と6の間の差は、実施例2に記載されるHIVインテグラーゼドメイン上の点変異である。小分子BI224436の添加がこれらの構築物のNFAT活性化に与える影響を灰色の棒グラフで表す。 (A)Phe1332Lys変異を有するHIVインテグラーゼのフラグメント及びヒトLEDGF/p75タンパク質のフラグメントを組み込むオフスイッチキメラ抗原受容体構築物6及び7の模式的機構。HIVインテグラーゼ又はCD8αヒンジなどの成分の二量体化は、簡潔にするために表示していない。scFvは抗ヒトBCMA一本鎖可変領域フラグメントであり、CD8αはヒトCD8αのヒンジ及び膜貫通ドメインであり、p75はヒトLEDGF/p75タンパク質のフラグメントであり、INはHIVインテグラーゼのフラグメントであり、41BBはヒト4-1BBタンパク質の細胞内ドメインであり、CD3ζはヒトCD3ζのシグナル伝達ドメインである。成分は、実施例2及び実施例3に記載されるリンカーによって組み立てられる。(B)BCMA抗原提示細胞ARH-77-10B5との相互作用によって誘発されるJurkat細胞におけるNFATプロモーターの活性化(黒色の棒グラフ)。Jurkat細胞に、実施例1に記載される構築物6及び7をトランスフェクトした。構築物6と7の間の差は、LEDGF/p75鎖フラグメントとscFvエレメントとの交換、及びHIVインテグラーゼフラグメントとCD3ζドメインとの交換である。BI224436の添加がこれらの構築物のNFAT活性化に与える影響を灰色の棒グラフで表す。 形質導入されたJurkat細胞におけるオフスイッチCARの発現レベル。構築物7～12を形質導入したJurkat細胞を、形質導入の20日後にフローサイトメトリーによって分析し、抗BCMA scFv発現によって示されるオフスイッチCAR発現が陽性の細胞のパーセントを測定した。全ての構築物に関して、Jurkat細胞の形質導入に関して同じMOIを使用した。 小分子BI224436が初代T細胞における構築物9及び構築物10のサイトカイン放出プロファイルに与える影響(実施例6)。 図６ａの続きである。 小分子BI224436の滴定が抗原によって刺激した初代T細胞からのTNFα、IFN-γ、及びIL-2の放出に与える影響。滴定は、構築物13を形質導入したT細胞について実行した(実施例6)。 図７ａの続きである。 小分子BI224436が標的細胞に対するT細胞の細胞傷害作用に与える影響(実施例7)。 (A)形質導入されたT細胞におけるオフスイッチCAR及び等価な従来のCARの発現レベル。構築物14及び10を形質導入した初代T細胞を、形質導入の12日後にフローサイトメトリーによって分析し、抗BCMA scFv発現によって示されるCAR発現が陽性の細胞のパーセントを測定した。(B)小分子BI224436が、オフスイッチCAR(構築物10)を形質導入したT細胞及び等価な従来のCAR(構築物14)を形質導入したT細胞の細胞障害作用に与える影響(実施例8)。 図９ａの続きである。
本発明は、異なる濃度の小分子化合物を通して直接制御することができる即時作用型の可逆性オフスイッチである。有害事象が起こった場合、このシステムは、CARシグナル伝達の急速な不活化又はダウンレギュレーションを可能にし、その後に長期間の全身コルチコステロイド投与を通してのCAR T細胞の除去、細胞特異的mAbによる免疫抑制、又は必要であればリンパ枯渇化学療法(例えば、シクロホスファミド)を可能とする。
本発明は、2つの異なるタンパク質、すなわちシグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖を含むCARであって、シグナル伝達鎖と非シグナル伝達鎖が複合体を形成する場合にCARからのシグナル伝達が起こる、上記CARである。複合体が破壊されると、シグナル伝達もまた破壊される。望ましくない副作用のリスクは、CARシグナル伝達を破壊することが公知であるがヒトにおいて安全であることもまた公知である小分子を使用して低減される。さらに、使用するタンパク質成分は、低い免疫原性潜在性を有し、小分子のサイズ、並びに他のCAR成分との最適な融合にとって適切なN及びC末端によって十分に特徴づけられている。
定義
別段に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学の分野における当業者)に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。分子的、遺伝学的及び生化学的方法のための標準技術(一般的には、Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.(これらはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる)を参照)及び化学法のための標準技術が用いられる。本明細書中で言及される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」又は「からなる(consisting)」を包含し、例えばXを「含む(comprising)」組成物は、Xのみからなるものであってもよく、又は何か付加的なものを含んでいてもよい(例えばX+Y)。
本明細書中で使用される用語「約」は、量、持続時間(temporal duration)などの測定可能な値を指す場合、特定される値からの±20%又は±10%の変動(±5%、±1%及び±0.1%を含む)を包含することを意味する。
本明細書中で使用される用語「キメラ抗原受容体」(「CAR」)は、(通常はモノクローナル抗体又はそのフラグメントに由来する)標的結合ドメイン、場合によりスペーサー領域、膜貫通領域、及び1つ以上の細胞内エフェクタードメインを含む操作された受容体を指す。CARは、キメラT細胞受容体又はキメラ免疫受容体(CIR)とも呼ばれている。CARは、T細胞などの造血系細胞に遺伝子導入され、細胞の特異性を所望の細胞表面抗原へと向け直す。
「CARシグナル伝達」との言及は、免疫調節細胞の活性化をもたらす(例えば、標的細胞の殺傷及びT細胞活性化を引き起こす)、CARのシグナル伝達ドメインを通じたシグナル伝達を指す。本明細書中に記載される系において、シグナル伝達鎖と共局在する非シグナル伝達鎖による標的の結合は、シグナル伝達鎖に存在するシグナル伝達ドメインを通して生産的CARシグナル伝達をもたらす。しかし、シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖を非局在化させる薬剤が存在する場合、受容体成分による標的の結合は、シグナルがシグナル伝達ドメインを通して活性化されないため、非生産的なシグナル伝達をもたらす。
用語「安全スイッチ」又は「制御スイッチ」は、害を引き起こし得る生物プロセスを制御するために、要求に応じて活性化することができる生化学機構を指す。安全スイッチは、それらがCAR治療の安全性を高めるために外部から制御することができるように(すなわち、細胞の外部からの投与を介して)CAR分子において使用することができる。例えば、CARのシグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖を、別々の成分に分割することができる。成分は、標的抗原が結合した場合にシグナル伝達を活性化するために、シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖と相互作用してそれらを共に結合させる結合ドメインを含む。この系の利点は、結合ドメイン間の相互作用を、例えば結合ドメインを破壊するか又は共に結合させる薬剤の投与によって、外部から制御することができることである。
用語「LEDGF/p75」は、ヒト水晶体上皮由来増殖因子タンパク質を指す。このタンパク質には他の同義語、例えばPC4及びSFRS1相互作用タンパク質、CLL関連抗原KW-7、Dense fine speckles 70 kDaタンパク質(DFS 70)、又は転写コアクチベーターp75/p52が存在する。LEDGF/p75のN末端ドメインは、染色体DNAに結合するが、そのC末端ドメインは、HIVインテグラーゼの触媒コアドメイン(CCD) (UniProt:O75475)と相互作用してHIVインタソームを宿主細胞クロマチンにつなぐ。
用語「LEDGF/p75 C末端領域」は、タンパク質のアミノ酸残基411からC末端までのLEDGF/p75タンパク質のアミノ酸配列を指す。
用語「HIVインテグラーゼ」は、レトロウイルス遺伝子材料を感染細胞のDNAに組み込むことを可能とする酵素であるヒト免疫不全ウイルス(HIV)インテグラーゼ(IN)を指す。これは、HIV pol遺伝子産物(UniProt: P12497)のC末端部分から産生された32 kDaタンパク質であり、新規抗HIV薬の魅力的な標的である。しかし、本明細書中に記載されるCARにおいて使用されるインテグラーゼドメイン(その任意のフラグメント又は変異体を含む)は、HIVの任意の変異体又はサブタイプ、例えばHIV-1又はHIV-2を含む任意のレトロウイルスに由来し得ることが理解される。
用語「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分とは独立にその三次構造を保持する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的に、ドメインはタンパク質の個別の機能的特性に関与し、多くの場合、タンパク質の残りの部分及び/又はドメインの機能を失うことなく他のタンパク質に付加、除去、又は転移され得る。
本明細書中で使用される用語「標的結合ドメイン」は、抗原又はリガンドなどの特定の標的に結合することができるオリゴペプチド又はポリペプチドとして定義される。特に、この標的は細胞表面分子であり得る。例えば、標的結合ドメインは、例えば特定の病状に関連する病原性ヒト細胞などの病原性細胞上で細胞表面マーカーとして機能する標的を認識するように選択され得る。標的結合ドメインは、例えば、抗原に結合する任意の種類のタンパク質であり得る。
本明細書中で使用される用語「スペーサー領域」は、膜貫通ドメインを標的結合ドメインに連結させるように機能するオリゴペプチド又はポリペプチドを指す。またこの領域は、「ヒンジ領域」又は「ストーク領域」とも呼ばれ得る。スペーサーのサイズは、CAR:標的結合の際の設定距離(例えば14nm)を維持するため、標的エピトープの位置に応じて変動し得る。
用語「膜貫通ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、細胞膜を横断するCAR分子の部分を指す。
用語「シグナル伝達ドメイン」(「細胞内エフェクタードメイン」と呼ばれる場合もある)は、本明細書中で使用される場合、標的結合ドメインの標的への結合後の細胞内シグナル伝達に関与するCAR中のドメインを指す。シグナル伝達ドメインは、CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化に関与する。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、又は例えばサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
用語「抗体」は、本明細書中で最も広い意味において使用され、免疫グロブリン様ドメイン(例えばIgG、IgM、IgA、IgD又はIgE)を有する分子を指し、モノクローナル抗体、組換え抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多特異性抗体(二重特異性抗体、及び異種結合(heteroconjugate)抗体を含む);単一可変ドメイン(例えば、VH、VHH、VL、ドメイン抗体(dAb(商標)))、抗原結合抗体フラグメント、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合したFv、一本鎖Fv、ジスルフィド結合したscFv、二重特異性抗体（diabody）、TANDABS(商標)等、及び前述のいずれかの改変型を包含する。
用語「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインを指す。従って、この用語は、VH、VHH及びVLなどの完全な抗体可変ドメイン、及び例えば1つ以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列で置換されている改変された抗体可変ドメイン、又はトランケートしているか若しくはN末端伸長若しくはC末端伸長を含む抗体可変ドメイン、並びに少なくとも完全長ドメインの結合活性及び特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれたフラグメントを包含する。単一可変ドメインは、異なる可変領域又はドメインとは独立して抗原又はエピトープに結合することができる。「ドメイン抗体」又は「dAb(商標)」は「単一可変ドメイン」と同じであると考えることができる。単一可変ドメインはヒト単一可変ドメインであってよいが、他の種に由来する単一可変ドメイン、例えば齧歯類(例えばWO 00/29004中に開示される)、テンジクザメ（nurse shark）及びラクダVHH dAb(商標)も包含する。ラクダVHHは、軽鎖を天然に欠如している重鎖抗体を産生するラクダ種(フタコブラクダ及びヒトコブラクダ、ラマ、ビクーナ、アルパカ、及びグアナコを含む)に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。このようなVHHドメインは当技術分野において利用可能な標準技術に従ってヒト化することができ、このようなドメインは「単一可変ドメイン」と考えられる。本明細書中で使用されるVHは、ラクダVHHドメインを包含する。
「親和性」は、単一の結合部位における1つの分子、例えば本発明のCARの標的結合タンパク質の、別の分子、例えばその標的抗原に対する結合の強さである。標的結合タンパク質の、その標的に対する結合親和性は、平衡法(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)又はラジオイムノアッセイ(RIA))、又はキネティクス(例えば、BIACORE(商標)分析)により決定することができる。
本明細書中で使用される「配列同一性」は、配列を比較することにより決定される、2つ以上のアミノ酸配列又は2つ以上の核酸配列間の関連性の程度である。配列の比較及び配列同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる;当業者は、2つの配列を整列させ、それらの間の同一性パーセントを決定するために利用し得るコンピュータプログラムを認識する。当業者は、異なるアルゴリズムはわずかに異なる結果を生じ得ることを理解する。
したがって、クエリー核酸配列とサブジェクト核酸配列間の「同一性パーセント」は、ペアワイズBLASTNアラインメントが実行された後にサブジェクト核酸配列がクエリー核酸配列と100%クエリーカバー率を有する場合、BLASTNアルゴリズムにより算出される、パーセントとして表される「同一性」値である。このようなクエリー核酸配列とサブジェクト核酸配列との間のペアワイズBLASTNアラインメントは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Institute)のウェブサイト上で利用可能なBLASTNアルゴリズムのデフォルト設定を、低複雑度領域のフィルタをオフにして使用することにより実行される。重要なことに、クエリー核酸配列は、本明細書中の1以上の請求項において特定される核酸配列により記載され得る。
同様に、クエリーアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列間の「同一性パーセント」は、パーセントとして表される「同一性」値であり、ペアワイズBLASTPアラインメントが実行された後にサブジェクトアミノ酸配列がクエリーアミノ酸配列と100%クエリーカバー率を有する場合、BLASTPアルゴリズムにより算出される。このようなクエリーアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列間のペアワイズBLASTPアラインメントは、米国国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイト上で利用可能なBLASTPアルゴリズムのデフォルト設定を、低複雑度領域のフィルタをオフにして使用することにより実行される。重要なことに、クエリーアミノ酸配列は、本明細書中の1以上の請求項において特定されるアミノ酸配列により記載され得る。
クエリー配列はサブジェクト配列と100%同一であってもよく、又はクエリー配列は、サブジェクト配列と比較して同一性%が100%未満であるような一定の整数までのアミノ酸変化又はヌクレオチド変化を含んでいてもよい。例えば、クエリー配列は、サブジェクト配列と少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、又は99%同一である。このような変更としては、例えば、少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換(保存的置換及び非保存的置換を含む)又は挿入などが挙げられ、ここで前記変更は、クエリー配列のアミノ末端位置若しくはカルボキシ末端位置において生じ得るか、あるいはこれらの末端位置間のいずれかの場所に、クエリー配列中のアミノ酸若しくはヌクレオチド間に個別に又はクエリー配列内の1つ以上の連続グループ中に分散して生じ得る。
本明細書中で使用される用語「自己」は、同一ヒト対象に由来する細胞を指す。本明細書中で使用される用語「同種」は、比較される細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。
用語「ヒト対象」及び「患者」は、本明細書中で互換的に使用される。
用語「医薬組成物」は、細胞又は対象への投与のために、製薬上許容可能な溶液又は生理学的に許容可能な溶液中で製剤化された組成物を指す。また本発明の組成物は、上記組成物が意図される治療法を送達する能力に付加的な薬剤が悪影響を及ぼさない限り、他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。
用語「がん」(「新生物」と呼ばれる場合もある)は、身体の一部分における異常な細胞の無制御な分裂により引き起こされる疾患を指す。無制御な分裂は、多くの場合、一般的には「腫瘍」又は「新生物」と呼ばれる塊を生じさせ得る。
本明細書中で使用される用語「腫瘍関連抗原」又は「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞上で発現される抗原を指す。この抗原は、正常な、すなわち非がん性の細胞と比較すると、腫瘍細胞上に固有に又は差次的に発現され得る。
本明細書中に記載されるCARは、それを必要とする対象の治療方法においても使用することができる。治療は、治療的、予防的又は防止的であり得る。治療は、疾患の少なくとも1つの態様又は症状の軽減、低減又は予防を包含し、また本明細書中に記載される疾患の予防又は治癒を包含する。
本明細書中に記載されるCARは、治療的、予防的又は防止的治療のための有効量で使用され得る。本明細書中に記載されるCARの治療有効量は、疾患の1つ以上の症状を改善若しくは低減する、又は疾患を予防若しくは治癒するために有効な量である。
キメラ抗原受容体
本発明の第1の態様によれば、ヒト対象の治療に適したキメラ抗原受容体(CAR)であって、
(i)膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達鎖;
(ii)標的結合ドメイン及び膜貫通ドメインを含む非シグナル伝達鎖
を含み、前記鎖の一方が、HIVインテグラーゼ触媒コアドメイン(CCD)又はその機能的フラグメント若しくは変異体をさらに含み、他方の鎖が、LEDGF/p75インテグラーゼ結合ドメイン(IBD)又はその機能的フラグメント若しくは変異体をさらに含む、前記キメラ抗原受容体が提供される。
HIVインテグラーゼドメインがLEDGF/p75ドメインに結合すると、シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖のヘテロ二量体化及び共局在化を引き起こす。このように、非シグナル伝達鎖の標的結合ドメインが標的に結合し、HIVインテグラーゼドメイン及びLEDGF/p75ドメインが結合する場合、シグナル伝達鎖を通してのシグナル伝達が存在する。
本明細書中に記載されるCARは、可逆的オフスイッチメカニズムにおいてHIVインテグラーゼ-LEDGF/p75タンパク質-タンパク質相互作用を使用する。複合体は、HIVインテグラーゼホモ二量体の触媒コアと、ヒト転写活性化LRDGF/p75の4-ヘリックスバンドルドメインとの間で形成する(Cherepanov et al. (2005) PNAS, 102(48): 17308-13)。この特定のタンパク質-タンパク質相互作用は、強力で十分に特徴づけられ、生物学的に利用可能な化合物を産生するHIVインテグラーゼアロステリック阻害剤研究の標的である(Tsiang et al. (2012) J. Biol. Chem., 287(25): 21189-203; Christ & Debyser, (2013) Virology, 435(1): 102-9)。細菌由来のテトラサイクリン結合タンパク質/ペプチドを使用する他の公開された例(例えば、WO 2016/030691)と比較した場合の本明細書中に記載されるCARの潜在的利点は、CARがヒト対象に存在することが既に見出されているタンパク質ドメインからなり、潜在的により低い免疫原性潜在性を有することである。さらに、提案される系の成分は、サイズが小さく(約150残基のHIVインテグラーゼ触媒コアドメイン(CCD)及び約80残基のLEDGF/p75インテグラーゼ結合ドメイン(IBD))、末端アミノ酸残基の位置はCAR成分の残りを接続するために適している。
小分子に加えて、タンパク質-タンパク質相互作用はまた、短いペプチドによっても調節することができる(Hayouka et al. (2010) Biochem. Biophys. Res. Commun., 394(2): 260-265)。
本明細書中に記載されるCARは、HIVインテグラーゼ及びLEDGF/p75ドメインが互いに結合することを必要とすることが理解される。一実施形態において、CARは、HIVインテグラーゼ触媒コアドメイン(CCD)又はその機能的フラグメント若しくは変異体、及びLEDGF/p75インテグラーゼ結合ドメイン(IBD)又はその機能的フラグメント若しくは変異体を含む。HIVインテグラーゼ及びLEDGF/p75タンパク質の他の部分、例えばN末端ドメイン又はC末端ドメインにおける追加の残基もまた含まれ得ることが理解される。
一実施形態では、LEDGF/p75 IBDは、野生型タンパク質(Uniprot O75475)の残基347～426を含む。さらなる実施形態において、LEDGF/p75 IBDは配列番号1を含む。
一実施形態では、HIVインテグラーゼCCDは、野生型タンパク質(Uniprot P12497)の残基1203～1355を含む。さらなる実施形態において、HIVインテグラーゼCCDは配列番号2を含む。
「機能的フラグメント」との言及は、それらが由来する野生型タンパク質の結合機能を依然として保持する完全長の野生型アミノ酸配列のフラグメントを指す(すなわち、結合ドメインを相互作用させることを依然として可能とする)。フラグメントは、好適には少なくとも10アミノ酸長、例えば25、50、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、又は300アミノ酸長を含み得る。フラグメントは、全タンパク質のC末端トランケーション、又はN末端トランケーションも含み得る。
一実施形態において、LEDGF/p75の機能的フラグメントは、野生型タンパク質(Uniprot O75475)の残基347～430を含む。さらなる実施形態において、LEDGF/p75の機能的フラグメントは、配列番号47を含む。
一実施形態において、LEDGF/p75の機能的フラグメントは、野生型タンパク質(Uniprot O75475)の残基347～442を含む。さらなる実施形態において、LEDGF/p75の機能的フラグメントは配列番号48を含む。
一実施形態において、LEDGF/p75の機能的フラグメントは、野生型タンパク質(Uniprot O75475)の残基347～471を含む。さらなる実施形態において、LEDGF/p75の機能的フラグメントは配列番号49を含む。
一実施形態において、HIVインテグラーゼCCDは、野生型タンパク質(Uniprot P12497)の残基1203～1355を含む。さらなる実施形態において、HIVインテグラーゼCCDは配列番号2を含む。
一実施形態において、HIVインテグラーゼの機能的フラグメントは、野生型タンパク質(Uniprot P12497)の残基1203～1355を含む。さらなる実施形態において、HIVインテグラーゼは配列番号2を含む。
「機能的変異体」との言及は、野生型配列と類似のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有するが、それらが由来する野生型タンパク質の結合機能を依然として保持する(すなわち、結合ドメインを相互作用させることを依然として可能とする)変異体を生じさせる1つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドの変化を有する変異体を含む。すなわち、機能的変異体は、標的が標的結合ドメインに結合すると生産的なシグナル伝達が起こるために十分な受容体及び細胞内シグナル伝達成分の共局在を容易にすることを条件とする。
一実施形態において、HIVインテグラーゼの機能的変異体は、配列がLEDGF/p75との結合を依然として可能とする限り、野生型配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を含む。同様に一実施形態において、LEDGF/p75の機能的変異体は、配列がHIVインテグラーゼとの結合を依然として可能とする限り、野生型配列と80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を含む。
一実施形態において、LEDGF/p75の機能的変異体は、LEDGF/p75 C末端領域において1つ以上のアミノ酸変化を含み、疎水性側鎖を有するアミノ酸が親水性又は中性側鎖を有するアミノ酸に交換されている。疎水性側鎖を有するアミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンである。
一実施形態において、LEDGF/p75の機能的変異体は、Leu428Gln及びVal429Arg変異を有する野生型タンパク質(Uniprot O75475)の残基347～430を含む。さらなる実施形態において、HIVインテグラーゼの機能的変異体は配列番号50を含む。
一実施形態において、LEDGF/p75の機能的変異体は、Leu428Gln及びVal429Gln変異を有する野生型タンパク質(Uniprot O75475)の残基347～430を含む。さらなる実施形態において、HIVインテグラーゼの機能的変異体は配列番号51を含む。
一実施形態において、HIVインテグラーゼCCDは、野生型タンパク質(Uniprot P12497)の残基1203～1355を含む。さらなる実施形態において、HIVインテグラーゼCCDは配列番号2を含む。
シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖の結合は、適した薬剤の存在によって破壊され得る。さらなる実施形態において、本発明は、シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖の結合を破壊する薬剤をさらに含む。用語「薬剤」は、HIVインテグラーゼとLEDGF/p75ドメインとの間の相互作用を破壊する任意の実体(例えば、小薬物分子、又はペプチド)を指すことが理解される。これは、持続的なCARシグナル伝達に関連する潜在的な毒性の副作用を回避するために、CARシグナル伝達を制御可能な方法で可逆的に終止させることを可能とする。薬剤の使用はまた、CAR細胞の効力を薬理学的に制御することを可能とし、所望の治療効果の達成と望ましくない毒性の回避との間の許容可能なバランスが得られるように調整することを可能とする。
破壊剤は、シグナル伝達鎖又は非シグナル伝達鎖に優先的に結合し、それによってシグナル伝達にとって必要なヘテロ二量体化を破壊することによって、シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖を置換（displace）し得る。
本明細書中に記載される系の使用は、自殺スイッチの場合のように単に破壊剤の投与により治療が除去されないという利点を有する。破壊剤はまた、その「不活性」(すなわち、オフ)状態でそれを投与するためにCARの前又はCARと同時に患者に投与され得る。その不活性状態でのCARの投与は、活性化前にその分布を可能とする。CARが活性化されると、破壊剤による投与は、重度の副作用の場合に限って必要である。必要であれば、CAR-T細胞は依然として当技術分野で公知の方法、例えば長期間の全身コルチコステロイド投与、細胞特異的mAbによる免疫抑制、又はリンパ枯渇化学療法(例えば、シクロホスファミド)を通して除去することができる。
破壊剤は、標的細胞の細胞質に送達されることが可能で、細胞内結合のために利用することが可能であり得る。破壊剤は、血液-脳関門を通過することが可能であり得る。
「LEDGIN」として公知の薬剤が既に記載されており、これはHIVインテグラーゼの二量体界面に結合することによってLEDGF/p75-HIVインテグラーゼ相互作用の強力な阻害剤として作用し(例えば、Tsiang et al. (2012) J. Biol. Chem., 287(25): 21189-203; Christ & Debyser, (2013) Virology, 435(1): 102-9を参照されたい)、HIV/AIDSの治療のための抗ウイルス剤として開発されている。それらは二重の作用メカニズム、すなわちLEDGF/p75-HIVインテグラーゼタンパク質-タンパク質相互作用の強力な阻害及び触媒機能のアロステリック阻害によってHIV複製を阻害することができる。過去数年の集中的な薬物発見努力により、LEDGF/p75-HIVインテグラーゼ相互作用は、抗ウイルス治療のドラッガブル標的であることが検証されており、LEDGINの設計及び合成がもたらされた。本明細書中に記載されるCARにおいて使用することができる薬剤の例は、臨床での用途のために最適化されており、従ってヒトの治療にとって適している。従って、一実施形態において、破壊剤はLEDGINである。
一実施形態において、破壊剤は、LEDGF/p75-HIVインテグラーゼ相互作用の阻害剤である。さらなる実施形態において、破壊剤は、2-(キノリン-3-イル)酢酸誘導体、2-(ピリジン-3-イル)酢酸誘導体、2-(チエノ[2,3-b]ピリジン-5-イル)酢酸誘導体、又は(S)-2-(tert-ブトキシ)-2-フェニル酢酸誘導体から選択される。
一実施形態において、破壊剤は、キノリン誘導体、例えば2-(キノリン-3-イル)酢酸誘導体である。さらなる実施形態において、破壊剤は、3-キノリン酢酸、4-(2,3-ジヒドロピラノ[4,3,2-de]キノリン-7-イル)-α-(1,1-ジメチルエトキシ)-2-メチル-、(αS,4R)-、及び3-キノリン酢酸、4-(3,4-ジヒドロ-2H-1-ベンゾピラン-6-イル)-α-(1,1-ジメチルエトキシ)-2-メチル-から選択される。
一実施形態において、薬剤は、参照により本明細書中に組み込まれるDemeulemeester et al. (2014) Expert Opin. Ther. Pat. 24, 609-632に記載の薬剤のいずれかから選択される。
一実施形態において、薬剤は、表1に記載の化合物のいずれかから選択される。
Figure 2022512701000001
Figure 2022512701000002
Figure 2022512701000003
一実施形態において、シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖は、野生型HIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインより低い親和性で結合するHIVインテグラーゼCCD又はLEDGF/p75 IBDのペプチド模倣体を含み得る。次いでこれは、天然のHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインを、競合的結合を通してペプチド模倣体の結合を破壊するための薬剤として使用することを可能とする。
破壊剤の非存在下での非シグナル伝達鎖による抗原結合は、破壊剤の存在下で非シグナル伝達鎖が抗原に結合した場合に起こるシグナル伝達より2、5、10、50、100、1000、又は10000倍高いシグナル伝達鎖を通してのシグナル伝達をもたらし得る。
シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖は、存在する破壊剤の濃度に比例するCARを通してのシグナル伝達を促進し得る。このように、破壊剤は、シグナル伝達鎖と非シグナル伝達鎖との間の結合を置換することができるが、シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖の共局在は、低濃度の破壊剤の存在下では完全には低減されない場合がある。従って、低濃度の破壊剤は、シグナル伝達を完全に阻害することなくシグナル伝達のレベルを減少させ得る。シグナル伝達のレベル及び破壊剤の濃度とのその関連は、当技術分野で公知の方法を使用して決定することができる。
CARシグナル伝達は、当技術分野で公知の多様な方法によって決定され得る。例えば、シグナル伝達を測定するアッセイ、例えば特異的なタンパク質チロシンキナーゼ(PTK)のレベル、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート(PIP2)の切断、タンパク質キナーゼC(PKC)の活性化、及び細胞内カルシウムイオン濃度の上昇をアッセイすることを使用してもよい。機能的読取り、例えばT細胞のクローン性の増大、細胞表面上の活性化マーカーのアップレギュレーション、エフェクター細胞への分化、及び細胞傷害性の誘導又はサイトカイン(例えば、IL-2)分泌の測定もまた使用してもよい。例えば、PromegaのBio-Glo(商標)NFATルシフェラーゼ活性化アッセイは、使用することができる市販のアッセイの一例である。
本発明は、可逆的CARオフスイッチにおけるLEDGF/p75-HIVインテグラーゼ相互作用の阻害剤の使用を初めて記載する。従って、本発明のさらなる態様に従って、本明細書中に記載されるCARを阻害するための本明細書中に記載される破壊剤の使用が提供される。
リンカーは、シグナル伝達及び非シグナル伝達鎖を含む1つ以上のドメインの間に存在し得る。一実施形態において、CARはさらに、膜貫通ドメインとHIVインテグラーゼ若しくはLEDGF/p75ドメインとの間、及び/又は膜貫通ドメインとHIVインテグラーゼ若しくはLEDGF/p75ドメインとの間、及び/又はシグナル伝達ドメインとHIVインテグラーゼ若しくはLEDGF/p75ドメインとの間にリンカーを含む。共刺激ドメインが存在する場合、CARは、共刺激ドメインと隣接するドメインとの間にリンカーをさらに含み得る。例えば、リンカーは、膜貫通ドメインとHIVインテグラーゼ若しくはLEDGF/p75ドメインとの間、及び/又はHIVインテグラーゼ若しくはLEDGF/p75ドメインと共刺激ドメインとの間、及び/又は膜貫通ドメインとHIVインテグラーゼ若しくはLEDGF/p75ドメインとの間、及び/又はHIVインテグラーゼ若しくはLEDGF/p75ドメインと共刺激ドメインとの間、及び/又はシグナル伝達ドメインとHIVインテグラーゼ若しくはLEDGF/p75ドメインとの間、及び/又はシグナル伝達ドメインと共刺激ドメインとの間であり得る。
理想的には、HIVインテグラーゼに接続されたリンカーは、隣り合う成分からのHIVインテグラーゼとの二量体化を可能とするため及びそれを正確な方向に向けるために十分な長さのリンカーである。
リンカーは、PDB受託コード2B4Jによって、Cherepanov et al., (2005) PNAS, 102(48): 17308-13に報告される構造情報に従う適切な長さの配列によって設計され得る。例えば、あるドメインをHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインに接続するリンカーは、2コピーのLEDGF/p75ドメインのN末端と、2コピーのHIVインテグラーゼドメインのN末端とを接続する2つの軸の周囲に複合体を回転させることができる十分な長さであり得る。従って、一実施形態において、リンカーは、長さ少なくとも15アミノ酸残基、例えば長さ15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、又は55アミノ酸残基である。さらなる実施形態において、膜貫通ドメインとLEDGF/p75との間のリンカーは長さ少なくとも20アミノ酸残基である。一実施形態において、膜貫通ドメインとHIVインテグラーゼとの間のリンカーは長さ少なくとも17アミノ酸残基である。
本発明によるリンカーは、単独で、又は他のリンカーに加えて、GS残基の1つ以上のセットを含み得る。一実施形態において、リンカーは、(GGGGS)n(DPS)m(GGS)p(式中、n=1～10、m=0～3、且つp=0～3である)を含む。例えば、一実施形態において、リンカーは、(GGGGS)n(DPS)m(GGS)p(式中n=4、m=1、且つp=0である)を含む。代替的実施形態において、リンカーは、(GGGGS)n(DPS)m(GGS)p(式中、n=4、m=0、且つp=1である)を含む。
一実施形態において、リンカーは、(SDPS)q(GGGGS)n(GGS)p(式中、n=1～10、p=0～3、且つq=0～3である)を含む。例えば、一実施形態において、リンカーは、(SDPS)q(GGGGS)n(GGS)p(式中、n=3、p=0、且つq=1である)を含む。代替的実施形態において、リンカーは、(SDPS)q(GGGGS)n(GGS)p(式中、n=1、p=0、且つq=1である)を含む。
一実施形態において、リンカーは、配列番号3～9と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を含む。一実施形態において、リンカーは、配列番号3～9のいずれか1つ、又はその組合せを含む。
本明細書中に記載されるリンカー配列において、結合ドメインの開始及び/又は末端での残基SPDの付加は、HIVインテグラーゼCCD及び/又はLEDGF/p75 IBDのN末端ヘリックス及びC末端ヘリックスを切断するために提供することができる。
本明細書中に記載されるCARにおける異なるドメイン間で異なるリンカーを使用することができることが理解される。このように、一実施形態において、膜貫通ドメインと第1の結合ドメインとの間、及び/又は膜貫通ドメインと第2の結合ドメインとの間のリンカーは、配列番号3又は4を含む。さらなる実施形態において、膜貫通ドメインと第1の結合ドメインとの間のリンカーは、配列番号3又は4を含む。なおさらなる実施形態において、膜貫通ドメインとLEDGF/p75との間のリンカーは、配列番号3又は4を含む。CAR内に共刺激ドメインが含まれる場合、本明細書中に記載される実施形態は等しく当てはまり得ること、例えば共刺激ドメインとLEDGF/p75との間のリンカーは配列番号3又は4を含み得ることが理解される。
一実施形態において、シグナル伝達ドメインとHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインとの間のリンカーは、配列番号5～7のいずれか1つを含む。さらなる実施形態において、シグナル伝達ドメインとHIVインテグラーゼドメインとの間のリンカーは、配列番号5～7のいずれか1つを含む。代替的実施形態において、シグナル伝達ドメインとLEDGF/p75ドメインとの間のリンカーは、配列番号5～7のいずれか1つを含む。
共刺激ドメインが存在する場合、共刺激ドメインとHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインとの間のリンカーは、配列番号5～7のいずれか1つを含み得る。共刺激ドメインが、HIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインの後に存在する場合、リンカー配列は配列番号5又は6、特にLEDGF/p75ドメインの場合には配列番号5、及び/又はHIVインテグラーゼドメインの場合には配列番号6を含み得る。この実施形態において、共刺激ドメインがHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインドメインとシグナル伝達ドメインとの間に存在する場合、共刺激ドメインとシグナル伝達ドメインとの間のリンカーは配列番号7を含み得る。
標的結合ドメインは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、又はリンパ球による認識及び除去を媒介するのに適した標的細胞集団上で発現される他の任意の分子である標的に結合する。一実施形態において、標的結合ドメインは、抗体、抗原結合フラグメント又はリガンドを含む。一実施形態において、標的結合ドメインは、抗体又はそのフラグメントを含む。一実施形態において、標的結合ドメインはリガンド(例えば、標的抗原の天然のリガンド)である。代替的実施形態において、標的結合ドメインは抗原結合フラグメントである。さらなる実施形態において、抗原結合フラグメントは、一本鎖可変フラグメント(scFv)又はdAb(商標)である。なおさらなる実施形態において、前記scFvは、フレキシブルリンカーにより連結された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖(VL)及び重鎖(VH)可変フラグメントを含む。
一実施形態において、標的結合ドメインは、2つ以上の標的、例えば2つの異なる標的に結合することができる。このような標的結合ドメインは、二重特異性一本鎖抗体に由来し得る。例えば、ブリナツモマブ(AMG 103又はMT103としても知られる)は、単一のポリペプチド鎖に構築される4つの免疫グロブリン可変ドメインからなる組換えCD19及びCD3二重特異性scFv抗体である。これらの可変ドメインのうち2つは、大部分の正常B細胞及び悪性B細胞上で発現される細胞表面抗原であるCD19に対する結合部位を形成する。他の2つの可変ドメインは、T細胞上のT細胞受容体複合体の一部であるCD3に対する結合部位を形成する。これらの可変ドメインは、CARにおいて直列（タンデム）に配置されていてよく、すなわち、2つの一本鎖抗体可変フラグメント(scFv)が、スペーサー、並びに膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインにつながれている。4つの可変ドメインは、CAR分子内で任意の特定の順序で配置され得る(例えば、VL(第1標的)-VH(第1標的)-VH(第2標的)-VL(第2標的)又はVL(第2標的)-VH(第2標的)-VH(第1標的)-VL(第1標的)等)。
標的結合ドメインは様々な細胞表面抗原に結合し得るが、一実施形態において、標的結合ドメインは腫瘍関連抗原に結合する。さらなる実施形態において、腫瘍関連抗原は、以下から選択される:BCMA、がん胎児抗原(CEA)、がん抗原-125、CA19-9、CD5、CD13、CD19、CD20、CD22、CD27、CD30、CD33、CD34、CD45、CD52、CD70、CD117、CD138、CD160、上皮成長因子受容体(EGFR)、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドG2(GD2)、HER2、メソテリン、MUC-1、神経細胞接着分子(NCAM)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)、タンパク質メラン-A、シナプトフィシス(synaptophysis)、前立腺の6回膜貫通上皮抗原I(STEAP1)、TARP、Trp-p8、チロシナーゼ又はビメンチン。なおさらなる実施形態において、腫瘍関連抗原はBCMAである。
一実施形態において、標的結合ドメインは、約500ナノモル濃度(nM)未満、例えば約400nM未満、350nM未満、300nM未満、250nM未満、200nM未満、150nM未満、100nM未満、90nM未満、80nM未満、70nM未満、60nM未満、50nM未満、40nM未満、30nM未満、20nM未満、10nM未満、9nM未満、8nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満、1nM未満、0.5nM未満又は0.25nM未満の結合親和性を有する。一実施形態において、標的結合ドメインは、約10nM～約0.25nMの結合親和性を有する。さらなる実施形態において、標的結合ドメインは、約1nM～約0.5nM(すなわち、約1000pM～約500pM)の結合親和性を有する。
一実施形態において、CARは、標的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサードメインをさらに含む。スペーサーは、標的結合ドメインが、結合を容易にするために異なる方向に配向するのを可能とし、標的結合相互作用を高めるために用いることができる。一実施形態において、スペーサーは、IgG(例えば、IgG1 Fc領域又はIgG1ヒンジ領域)、CD8又はCD4に由来する配列を含む。
シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖のそれぞれにおける膜貫通ドメインは、細胞表面でシグナル伝達鎖を維持するための膜の足場として作用する。
一実施形態において、膜貫通ドメインは、天然源に由来してもよく、又は合成源に由来してもよい。一実施形態において、膜貫通ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来し得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。
例えば、膜貫通ドメインは、CDタンパク質(例えばCD4、CD8、CD3又はCD28)の膜貫通ドメイン、T細胞受容体のサブユニット(例えばα、β、γ又はδ)の膜貫通ドメイン、IL-2受容体のサブユニット(α鎖)の膜貫通ドメイン又はFc受容体のサブユニット鎖の膜貫通ドメインであり得る。一実施形態において、膜貫通ドメインは、CD4、CD8又はCD28の膜貫通ドメインを含む。さらなる実施形態において、膜貫通ドメインは、CD4又はCD8の膜貫通ドメイン(例えば、NCBI参照配列:NP_001139345.1に記載されるCD8アルファ鎖、参照により本明細書中に組み込まれる)を含む。
一実施形態において、膜貫通ドメインは配列番号10を含む。
一実施形態では、シグナル伝達鎖は、膜貫通ドメインの隣にヒンジ配列をさらに含み得る。さらなる実施形態において、ヒンジ配列は配列番号11を含む。さらなる実施形態において、このヒンジ及び膜貫通ドメインは、配列番号12の完全長配列を含む。
一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、CD8α膜貫通へリックスと、その直後に続く、膜界面と適合性がある配列のストレッチを含む4-1BBの完全長細胞内ドメインで構成される。膜貫通ドメインの隣のドメインが膜界面と適合性がある配列を有さない場合、リンカーを使用してもよい。
このように、一実施形態において、膜貫通ドメインと細胞膜の細胞内側で膜貫通ドメインの直後に続くドメインとの間にリンカーが存在する。さらなる実施形態において、膜貫通ドメインとHIVインテグラーゼ若しくはLEDGF/p75ドメインとの間、又は存在する場合は膜貫通ドメインと共刺激ドメインとの間にリンカーが存在する。なおさらなる実施形態では、リンカーは配列番号13を含む。このリンカーは、それが膜貫通ヘリックスの直後に続くCD8αからの単なるネイティブ配列であるために、膜貫通ドメインがCD8αに由来する場合には特に有利である。
本明細書中に記載されるCARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原結合後にシグナル伝達を開始するように協調して作用する天然T細胞受容体及び共受容体の細胞質配列、並びに同じ機能的能力を有するこれらの配列の任意の誘導体又は変異体及び任意の合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、2つのクラス:抗原依存性一次活性化を開始するドメイン、及び抗原非依存性様式で作用して二次シグナル又は共刺激シグナルを提供するドメイン、に分けられる。一次活性化エフェクタードメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ITAMは十分に定義されたシグナル伝達モチーフであり、様々な受容体の細胞質内の尾部に共通して見られ、syk/zap70クラスのチロシンキナーゼに対する結合部位としての役割を果たす。本発明において使用されるITAMの例としては、非限定的な例として、CD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、FcRイプシロン、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b及びCD66dに由来するITAMなどが挙げられる。一実施形態において、シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータシグナル伝達ドメイン(CD247としても知られる)を含む。さらなる実施形態において、CD3ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号14を含む。この配列は、Uniprot P20963、残基51～164においても見られる。天然TCRはCD3ゼータシグナル伝達分子を含み、従ってこのエフェクタードメインの使用は、天然に存在するTCR構築物に最も近い。
一実施形態において、シグナル伝達鎖のシグナル伝達ドメインは、配列番号14と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、90%、95%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む。さらなる実施形態において、CARのシグナル伝達ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含むCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
CARのシグナル伝達鎖又は非シグナル伝達鎖は、成分が細胞において発現される場合、新生タンパク質が小胞体に向けられ、その後それが発現される細胞表面に向けられるように、シグナルペプチドをさらに含み得る。
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファへリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、転位中のポリペプチドの適切なトポロジーを増強するのに役立つ短く正に荷電したアミノ酸のストレッチで開始し得る。シグナルペプチドの終端には、典型的には、シグナルペプチダーゼにより認識されて切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、移行（トランスロケーション）中又は移行の完了後のいずれかに切断を行い、遊離シグナルペプチドと成熟タンパク質を生成することができる。その後この遊離シグナルペプチドは特定のプロテアーゼにより消化される。シグナルペプチドは本分子のアミノ末端に存在し得る。
一実施形態において、シグナルペプチドはCD8(UniProt P01732を参照)に由来する。さらなる実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号15、又は5、4、3、2又は1個のアミノ酸変異(挿入、欠失、置換又は付加)を有するその変異体を含むが、シグナルペプチドが依然として成分(すなわち、機能的変異体)の細胞表面発現を引き起こすように機能することを条件とする。
本明細書中に記載される場合、シグナル伝達鎖及び/又は非シグナル伝達鎖は、二次シグナル又は共刺激シグナルをさらに含み得る。T細胞は、例えば増殖活性化、分化などを高めることによりT細胞応答を増強するため、抗原提示細胞上の同種共刺激リガンドに結合する共刺激分子を付加的に含む。従って、一実施形態において、シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖は共刺激ドメインをさらに含む。さらなる実施形態において、共刺激ドメインは、CD28、CD27、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、ICOS(CD278)、CD30、CD40、PD-1(CD279)、CD2、CD7、NKG2C(CD94)、B7-H3(CD276)又はそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、共刺激ドメインは、CD28、CD27、4-1BB、OX40、ICOS又はそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞内ドメイン、特に4-1BBの細胞内ドメインを含む。
一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号16と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する4-1BBシグナル伝達ドメインを含む。さらなる実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号16の4-1BBシグナル伝達ドメインを含む。この配列はまた、Uniprot Q07011、残基214～255においても見出される。
キメラ抗原受容体系の配置
本明細書中に記載されるCARに関係するドメインの様々な構成が可能であるが、標的化結合ドメインが膜貫通ドメインの細胞外側に必ず存在し、シグナル伝達、共刺激、及びHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインが膜貫通ドメインの細胞内側に必ず存在することが当業者によって理解される。
一実施形態において、非シグナル伝達鎖は、以下の順序で以下のドメイン:標的結合ドメイン;膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン;及びHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメイン(配置A)を含む。
代替的実施形態において、非シグナル伝達鎖は、以下の順序で以下のドメイン:標的結合ドメイン;膜貫通ドメイン;HIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメイン;及び共刺激ドメイン(配置B)を含む。
別の実施形態では、非シグナル伝達鎖は、以下の順序で以下のドメイン:標的結合ドメイン;膜貫通ドメイン及びHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメイン(配置C)を含む。
一実施形態において、シグナル伝達鎖は、以下の順序で以下のドメイン:膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン;HIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメイン;及びシグナル伝達ドメイン(配置I)を含む。
代替的実施形態において、シグナル伝達鎖は、以下の順序で以下のドメイン:膜貫通ドメイン;HIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメイン;共刺激ドメイン;及びシグナル伝達ドメイン(配置II)を含む。
別の実施形態において、シグナル伝達鎖は、以下の順序で以下のドメイン:膜貫通ドメイン;HIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメイン;及びシグナル伝達ドメイン(配置III)を含む。
したがって、一実施形態において、CARは、配置I、II、又はIIIで配置された任意のシグナル伝達鎖と組み合わせた配置A、B、又はCの非シグナル伝達鎖を含む。
これらの配置のいずれにおいても、(i)非シグナル伝達鎖がHIVインテグラーゼドメインを含み、且つシグナル伝達鎖がLEDGF/p75ドメインを含むか、又は(ii)非シグナル伝達鎖がLEDGF/p75ドメインを含み、且つシグナル伝達鎖がHIVインテグラーゼドメインを含むことのいずれかであることが理解される。
別の実施形態において、CARは、配置Aの非シグナル伝達鎖と配置Iのシグナル伝達鎖とを含む。別の実施形態において、CARは、配置Aの非シグナル伝達鎖と配置IIのシグナル伝達鎖とを含む。別の実施形態において、CARは、配置Aの非シグナル伝達鎖と配置IIIのシグナル伝達鎖とを含む。
別の実施形態において、CARは、配置Bの非シグナル伝達鎖と配置Iのシグナル伝達鎖とを含む。別の実施形態において、CARは、配置Bの非シグナル伝達鎖と配置IIのシグナル伝達鎖とを含む。別の実施形態において、CARは、配置Bの非シグナル伝達鎖と配置IIIのシグナル伝達鎖とを含む。
別の実施形態において、CARは、配置Cの非シグナル伝達鎖と配置Iのシグナル伝達鎖とを含む。別の実施形態において、CARは、配置Cの非シグナル伝達鎖と配置IIのシグナル伝達鎖とを含む。別の実施形態において、CARは、配置Cの非シグナル伝達鎖と配置IIIのシグナル伝達鎖とを含む。
一実施形態において、非シグナル伝達鎖は、複数のHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインを含み得る。これは、非シグナル伝達鎖が2つ以上のシグナル伝達鎖を動員することを可能とし、このように標的結合に応答してシグナルを増幅することが可能となる。HIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインは、それぞれ異なる結合親和性を有する変異体又はフラグメントであり得る。
一実施形態において、CARは、それぞれが異なる標的を認識するが、同じHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインを含む2つ以上の標的結合ドメインを含み得る。このような系は、複数の抗原を認識することが可能であろう。この配置のさらなる実施形態において、受容体成分のHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインは、シグナル伝達鎖のHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインに対するその親和性を指示する残基が異なる。このようにして、1つの抗原に応答するシグナル伝達が別の抗原に対する応答より大きくなるように又は小さくなるように、CARを調整することができる。
一実施形態において、本明細書中に記載されるCARは、複数のシグナル伝達鎖であって、それぞれがシグナル伝達ドメイン及びHIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインを含み、シグナル伝達鎖が異なるシグナル伝達ドメイン(例えば、CD3ゼータ、CD28、4-1BB、及び/又はOX-40)を含む、上記シグナル伝達鎖を含み得る。これは、複数の異なるシグナル伝達ドメインの同時の活性化を可能とする。
HIVインテグラーゼ又はLEDGF/p75ドメインのアミノ酸残基を、2つのドメイン間の結合親和性が変化するように変化させるのに適した方法は、当技術分野で公知である。例えば、このような方法は、標的化及びランダム変異誘発の両方を使用するアミノ酸の置換、付加、及び除去を含む。
HIVインテグラーゼとLEDGF/p75ドメインとの間の結合親和性を決定する方法もまた、当技術分野で周知である。これらとしては、タンパク質-タンパク質相互作用のバイオインフォマティクス予測、アフィニティ電気泳動、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二重偏波干渉法、静的光散乱法、及び動的光散乱法が挙げられる。
ポリヌクレオチド及び発現ベクター
本発明のさらなる態様に従って、本明細書中に記載されるCARのシグナル伝達鎖をコードするポリヌクレオチド、非シグナル伝達鎖をコードするポリヌクレオチド、又はシグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖をコードするポリヌクレオチド鎖が提供される。
本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。遺伝コード中に見られる縮重は、各アミノ酸が、多くの代替的核酸配列が同一タンパク質をコードすることを可能とする1～6の同義コドンによりコードされることを可能にする(Gustafsson et al. (2004) Trends Biotechnol. 22(7):346-53)。コドン最適化は、異種発現系における遺伝子の発現率を増加させることを目的として遺伝子配列を改変するために用いられる技術である;典型的には、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、コドン使用頻度が宿主細胞のコドンバイアスにより密接に類似するが、依然として同一アミノ酸配列をコードするようにコドン最適化される。
本明細書中に記載される核酸は、DNA又はRNAを含み得る。これらは一本鎖であってもよく、又は二本鎖であってもよい。またこれらは、その中に合成ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。メチルホスホネートバックボーン及びホスホロチオエートバックボーン、又はアクリジンの付加若しくはポリリシン鎖の付加などの多数の異なる種類の修飾が当技術分野において周知である。このような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのin vivo活性又は寿命を高めるために使用することができる。
CARのシグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖は、別々の核酸から発現され得るか、又は同じ核酸から共発現され得る。
単一のプラスミドを使用して細胞又は生物において2つ以上の遺伝子を共発現させる方法は、当技術分野で周知である。例えば方法は、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)に融合された複数のプロモーター;遺伝子間へのスプライシングシグナルの挿入;その発現が単一のプロモーターによって駆動される遺伝子の融合;遺伝子間へのタンパク質分解切断部位の挿入;遺伝子間への配列内リボソーム進入部位(IRES)の挿入;遺伝子間への自己切断ペプチド配列の挿入を含む。
成分が共発現される場合、核酸は、切断部位によって結合されたシグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖を含むポリペプチドを産生し得る。切断部位は、ポリペプチドが産生される場合に、それがいかなる外部の切断活性も必要とすることなく、シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖成分へと直ちに切断されるように自己切断であり得る。従って、本発明のさらなる態様によれば、シグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖が、翻訳後にシグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖の間で切断される自己切断ペプチドによって共発現される、本明細書中に記載されるCARをコードするポリヌクレオチドが提供される。
自己切断ペプチドの例は、当技術分野で公知であり、例えばKim et al. (2011) PLoS ONE 6(4): e18556を参照されたい。
一実施形態において、自己切断ペプチドは、2a自己切断ペプチドである。さらなる実施形態において、2a自己切断ペプチドは、ブタテスコウイルス-1、トセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)、又は口蹄疫ウイルス(FMDV)、特にブタテスコウイルス-1に由来する。従って、自己切断ペプチドは、P2A(ブタテスコウイルス-1 2A)、T2A(トセア・アシグナウイルス2A)、E2A(ウマ鼻炎Aウイルス2A)、及びF2A(口蹄疫ウイルス2A)から選択され得る。なおさらなる実施形態では、2a自己切断ペプチドは配列番号17を含む。
一実施形態において、シグナル伝達鎖と自己切断ペプチドとの間、及び/又は非シグナル伝達鎖と自己切断ペプチドとの間にリンカーが存在する。さらなる実施形態において、リンカーは配列番号8又は9を含む。
一実施形態において、成分は、共発現配列を含むポリヌクレオチドを使用して共発現させる。さらなる実施形態において、共発現配列は配列内リボソーム進入部位(IRES)又は内部プロモーターである。
ポリヌクレオチドは、発現カセット又は発現ベクター(例えば、細菌宿主細胞への導入用のプラスミド、又は哺乳動物宿主細胞のトランスフェクション用のレンチウイルスなどのウイルスベクター)中に存在し得る。従って、本発明のさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
用語「ベクター」は、外来遺伝物質を、それが複製及び/又は発現され得る別の細胞中に人工的に運ぶことができるビヒクルを指す。一実施形態において、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾンベースのベクター又は合成mRNAである。
一実施形態において、発現ベクターはレトロウイルスベクターである。さらなる実施形態において、レトロウイルスベクターは、レンチウイルス、アルファ-レトロウイルス、ガンマ-レトロウイルス又は泡沫状レトロウイルス(例えばレンチウイルス又はガンマ-レトロウイルス、特にレンチウイルス)に由来するか又はこれらから選択される。さらなる実施形態において、レトロウイルスベクター粒子は、HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV及びVisnaからなる群から選択されるレンチウイルスである。レンチウイルスは非分裂(すなわち、静止)細胞に感染することが可能であり、このことが、このウイルスを魅力的な遺伝子療法用ベクターとしている。なおさらなる実施形態において、レトロウイルスベクター粒子は、HIV-1であるか、又はHIV-1に由来する。幾つかのレトロウイルスのゲノム構造は、当技術分野において見出され得る。例えば、HIV-1についての詳細は、NCBI Genbank(ゲノム受託No. AF033819)から見出すことができる。HIV-1は最もよく理解されているレトロウイルスの1つであり、このため、しばしばウイルスベクターとして用いられる。
免疫調節細胞
本発明のさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるCARを含む免疫調節細胞が提供される。本発明の別の態様によれば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む免疫調節細胞が提供される。
一実施形態において、免疫調節細胞は、本明細書中に記載されるCARのシグナル伝達鎖及び非シグナル伝達鎖を含む。さらなる実施形態において、免疫調節細胞は、多数の異なるシグナル伝達鎖及び多数の異なる非シグナル伝達鎖を含む。例えば、免疫調節細胞は、本明細書中に記載されるCARの1、2、3、4、5個以上の異なるシグナル伝達鎖、及び1、2、3、4、5個以上の異なる非シグナル伝達鎖を含み得る。
用語「免疫調節細胞」は、自然免疫応答及び/又は適応免疫応答の調節(例えば、開始及び/又は実行)に機能的に関与する造血系由来の細胞を指す。本発明による前記免疫調節細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、さらに特に非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導性多能性幹細胞、全能性幹細胞又は造血系幹細胞であり得る。また前記免疫調節細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞又はT細胞であってもよい。T細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球若しくはヘルパーTリンパ球、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。従って、一実施形態において、免疫調節細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球又はヘルパーTリンパ球に由来する。別の実施形態において、前記細胞は、CD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。
一実施形態において、免疫調節細胞はヒト免疫調節細胞であり得る。
一実施形態において、免疫調節細胞は同種又は自己である。「自己」は、患者自身から得られた細胞を指すが、「同種」は、ドナーから得られた細胞を指すことが理解される。自己細胞は、これらが患者に適合し、このため移植片対宿主病(GvHD)をもたらす任意の免疫学的適合性の問題を回避するという利点を有する。同種細胞が患者に拒絶されるのを防ぐためには、これらの細胞は、適合性のドナーに由来する必要性があるか、又は望ましくない免疫応答を開始する可能性がある抗原が確実に細胞表面に提示されないように改変される必要性がある。
本発明の細胞の増殖及び遺伝子改変前に、様々な非限定的方法により対象から細胞源を得ることができる。細胞は、例えば末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍などの多数の非限定的な源から得ることができる。本発明の特定の実施形態において、当業者に利用可能且つ公知の任意数のT細胞株を用いることができる。別の実施形態において、前記細胞は、健常ドナー、又はがんと診断された患者若しくは感染していると診断された患者などの疾患ドナーに由来し得る。別の実施形態において、前記細胞は、異なる表現型的特徴を示す細胞の混合集団の一部である。
免疫調節細胞は、本明細書中に記載されるCARをコードするポリヌクレオチド又は発現ベクターが形質導入される前に活性化及び/又は増殖させることができる。例えば、上記細胞を抗CD3モノクローナル抗体で処理して活性化を引き起こすことができる。
免疫調節細胞は、本明細書中に記載されるCARを(使用されるトランスフェクション法及びキメラ抗原受容体系をコードするポリヌクレオチドが免疫調節細胞のゲノムに組み込まれているか否かに応じて)一時的に又は安定的に/恒久的に発現し得ることが理解される。
CARの導入後、免疫調節細胞は、例えば非シグナル伝達鎖の標的結合ドメインを発現する細胞を選択することによって精製され得る。
用途
本発明のさらなる態様によれば、治療法において使用するための、本明細書中に記載される免疫調節細胞が提供される。一実施形態において、治療は、そのような治療法を必要とするヒト対象への免疫調節細胞の投与を含む。
一実施形態において、治療法は養子細胞療法である。「養子細胞療法」(又は「養子免疫療法」)は、標的細胞上で発現される表面分子に特異的なCAR(例えば、本発明のCAR)を発現するように遺伝子導入により操作されたヒトTリンパ球の養子移入を指す。この治療法は、選択される標的(例えば、がんを治療するための腫瘍特異的抗原)に応じて様々な疾患を治療するために使用することができる。養子細胞療法は、白血球アフェレーシス（leukapheresis）と呼ばれる方法を用いて患者の白血球の一部を除去することを含む。その後、CARをT細胞に永久的に移入するため、T細胞を増殖させて本明細書中に記載される発現ベクターと混合し得る。このT細胞を再び増殖させ、増殖の最後にT細胞を洗浄し、濃縮し、その後、試験、輸送、及び患者が操作されたT細胞の注入を受ける準備ができるまでの保存の時間を考慮して凍結させる。
本明細書中に記載される本発明は、CARにおけるHIVインテグラーゼ-LEDGF/p75相互作用の使用を初めて提供する。従って、本発明のさらなる態様によれば、LEDGF/p75ドメイン及びHIVインテグラーゼドメイン又はその機能的フラグメント若しくは変異体の、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法(例えば、誘導型CARの一部として)における安全スイッチとしての使用が提供される。
医薬組成物
本発明のさらなる態様によれば、本明細書中に記載される複数の免疫調節細胞を含む医薬組成物が提供される。
付加的な医薬組成物成分の例としては、限定するものではないが、例えば、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素/着色剤、調味料、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、乳化剤、緩衝剤(例えばリン酸緩衝生理食塩水(PBS))、糖(例えばグルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン)、アミノ酸、抗酸化剤又はキレート剤(例えばEDTA又はグルタチオン)などが挙げられる。
一実施形態において、医薬組成物は、製薬上許容可能な賦形剤、担体、又は希釈剤をさらに含む。担体、賦形剤又は希釈剤は、組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではないという意味において「許容可能」でなければならない。本発明によれば、使用される任意の賦形剤、ビヒクル、希釈剤又は添加剤は、本明細書中に記載されるCARと適合性を有し得る。好適な製剤を調製するため、「Remington's Pharmaceutical Science」第17版(1985年)などの、当技術分野において公知の標準的な教科書(参照により本明細書中に組み込まれる)を参考にすることができる。
医薬組成物は、注射又は持続注入(例としては、限定するものではないが、静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内及び門脈内などが挙げられる)により投与することができる。一実施形態において、組成物は静脈投与に好適である。本発明の治療用組成物(例えば、本明細書中に記載される遺伝子改変免疫調節細胞を含む医薬組成物)を投与する場合、これは、一般的に単位用量注射可能形態(溶液剤、懸濁剤、乳剤)で製剤化される。医薬組成物は、局所投与(例えば、限定するものではないが、皮膚上投与、吸入投与、鼻腔内投与又は眼内投与など)又は腸内投与(例えば、限定するものではないが、経口投与又は直腸投与など)に好適であり得る。
このような医薬組成物の調製方法は当業者に周知である。この組成物に、使用される投与様式及び特定のタンパク質に適するように、他の賦形剤を添加してもよい。
本発明の組成物を投与するための有効用量及び治療レジメンは、患者の年齢、体重及び健康状態並びに治療対象の疾患などの因子により決定され得る。このような因子は、担当医師の権限内である。
本発明のさらなる態様によれば、疾患の治療又は予防において使用するための、本明細書中で定義される医薬組成物が提供される。
一実施形態において、疾患は、がん、病原性免疫応答及び感染から選択される。
本発明のさらなる態様によれば、疾患の治療及び/又は予防のための医薬の製造における、本明細書中に記載される医薬組成物の使用が提供される。
キット
本発明のさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド又は発現ベクターを含むキットが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、本明細書中に記載される免疫調節細胞又は医薬組成物を含むキットが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるCARを含むキットが提供される。
方法
本発明のさらなる態様によれば、免疫調節細胞を操作して、本明細書中に記載されるCARを発現させる方法であって、
(a)免疫調節細胞を提供すること;
(b)本明細書中で定義されるポリヌクレオチド又は発現ベクターを、前記免疫調節細胞に形質導入又はトランスフェクトすること;及び
(c)前記ポリヌクレオチド又は前記発現ベクターを免疫調節細胞中で発現させること
を含む、上記方法が提供される。
一実施形態において、免疫調節細胞は、患者(すなわち自己)から単離されたサンプルから得られる。代替的実施形態において、免疫調節細胞はドナー(すなわち同種)から得られる。
非限定的な例として、CARは、本明細書中に記載される発現ベクターによりコードされる導入遺伝子として導入され得る。また発現ベクターは、前記ベクターを受容した細胞の同定及び/又は選択を提供する選択マーカーも含み得る。
ポリペプチドは、細胞中への前記CARをコードするポリヌクレオチドの導入の結果として、上記細胞中でin situで合成され得る。あるいは、前記ポリペプチドは、細胞の外側で産生され、その後細胞に導入されてもよい。ポリヌクレオチド構築物を細胞中に導入する方法は、当技術分野において公知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノム中に組み込まれる安定な形質転換法、又はポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノム中に組み込まれない一時的形質転換法及びウイルス媒介法などが挙げられる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス)、リポソームなどにより細胞中に導入され得る。例えば、一時的形質転換法として、例えばマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法又は微粒子銃法などが挙げられる。ポリヌクレオチドは、細胞中で発現されることを考慮して、ベクター、さらに具体的にはプラスミド又はウイルス中に含めてもよい。
本明細書中で使用される用語「トランスフェクション」、「形質転換」及び「形質導入」は、標的細胞中への発現ベクターの挿入を表するために使用することができる。ベクターの挿入は、通常、細菌細胞については形質転換（transformation）、また真核細胞についてはトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入は、形質導入（transduction）と呼ぶこともできる。当業者は、例えば、限定するものではないが、物理的方法(例えば、エレクトロポレーション、細胞スクイージング(cell squeezing)、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション(impalefection)、マグネトフェクション、遺伝子銃法又は微粒子銃法)、化学試薬(例えば、リン酸カルシウム、多分岐有機化合物又はカチオン性ポリマー)又はカチオン性脂質(例えば、リポフェクション)の使用などの、一般的に用いられる様々な非ウイルス性のトランスフェクション法も認識する。多くのトランスフェクション法は、プラスミドDNA溶液の細胞への接触を必要とし、これらの細胞はその後増殖され、マーカー遺伝子発現について選択される。
CARが免疫調節細胞に導入されると、前記細胞は「形質転換された免疫調節細胞」と呼ばれ得る。従って、本発明のさらなる態様によれば、本明細書中に記載される方法によって得られた免疫調節細胞が提供される。同様に、本明細書中に記載される方法による形質転換された免疫調節細胞から得た細胞株も本発明の範囲内である。
本発明のさらなる態様によれば、対象におけるCARを阻害する方法であって、LEDGF/p75-HIVインテグラーゼドメイン相互作用を阻害する薬剤を対象に投与することを含む、上記方法が提供される。
本明細書に記載される系によるCARシグナル伝達のレベルは、存在する破壊剤の量、又は破壊剤が存在する時間の量を変化させることにより調整され得る。従って、一実施形態において、CAR細胞活性化のレベルは、対象に投与される破壊剤の用量を減少させること、又はその投与頻度を減少させることによって増加させることができる。代替的実施形態において、CAR細胞活性化のレベルは、破壊剤の用量、又は対象への投与頻度を増加させることによって低減させることができる。
より高いレベルのCARシグナル伝達は、疾患進行の低減、しかし毒性活性の増加に関連する可能性があり、より低いレベルのCARシグナル伝達は、疾患進行の増加、しかし毒性活性の低減に関連する可能性がある。
本発明のさらなる態様によれば、本明細書中で定義される免疫調節細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患を治療及び/又は予防する方法が提供される。
一実施形態において、疾患はがんである。さらなる実施形態において、がんは、以下:血液、骨髄、リンパ、リンパ系、膀胱、乳房、結腸、頸部、食道、腎臓、大腸、肺、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、皮膚又は胃から選択される。なおさらなる実施形態において、がんは血液がんであり、例えば、以下:B細胞白血病、多発性骨髄腫(MM)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)及び非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
本明細書中に記載される方法が、がんを治療するために用いられる場合、一実施形態において、この方法は、対象における腫瘍細胞の数を低下させ、腫瘍サイズを低下させ、及び/又は腫瘍を根絶する。
一実施形態において、疾患は、自己免疫疾患、アレルギー又は移植片対宿主拒絶反応などの病原性免疫応答である。自己免疫疾患は、体内に正常に存在する物質及び組織に対する体の異常な免疫応答から生じる。これは、組織の損傷若しくは破壊、又は器官の成長若しくは機能の変化をもたらし得る。自己免疫疾患の例としては、限定するものではないが、以下:1型糖尿病、関節炎(例えば、若年性関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎及びリウマチ性関節炎など)、乾癬、多発性硬化症、血管炎、円形脱毛症、悪性貧血、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、シェーグレン症候群、セリアック病、クローン病及びヴェーグナー症候群などが挙げられる。
一実施形態において、疾患は感染である。感染は、細菌、ウイルス、寄生生物、原虫又は真菌などの病原体により引き起こされ得る。さらなる実施形態において、感染はウイルス感染又は細菌感染である。
一実施形態において、対象はヒトである。
治療及び/又は予防の方法は、以下のステップ:
(a)免疫調節細胞を提供するステップ;
(b)本明細書中で定義されるポリヌクレオチド又は発現ベクターを前記免疫調節細胞に形質導入又はトランスフェクトするステップ;
(c)前記ポリヌクレオチド又は前記発現ベクターを免疫調節細胞中で発現させるステップ;並びに
(d)免疫調節細胞を対象に投与するステップ
を含み得る。
本明細書中に記載される免疫調節細胞又は医薬組成物は、疾患に関連する少なくとも1つの症状を低減し、低下させ若しくは改善し及び/又は疾患の進行を遅延させ、低下させ又は阻止するために(すなわち治療的に)、既に疾患を有する患者に投与され得る。本明細書中に記載される免疫調節細胞又は医薬組成物は、疾患の原因を防止するため(すなわち予防的に)、疾患に罹患していない患者及び/又は疾患の任意の症状を示していない患者に投与してもよい。上記の患者は、疾患を発症する危険性の素因を有し得るか、又は疾患を発症する危険性を有すると考えられ得る。
一実施形態において、方法は、本明細書中に記載されるCARのLEDGF/p75-とHIVインテグラーゼドメインとの間の相互作用を破壊する薬剤の投与をさらに含む。薬剤は、CARをその「不活性」(すなわちオフ(OFF))状態で投与するために免疫調節細胞/医薬組成物の前に又はこれらと同時に(すなわち、上記に概説される治療ステップの方法におけるステップ(d)の前に又は最中に)患者に投与され得る。その後、CARを活性化するために薬剤の量を低減することもできる。CARを不活性状態で投与することは、免疫調節細胞の均一な分布の達成を可能とし、従って活性化細胞の局所的な蓄積を妨げる。
あるいは、CARがその「活性」(すなわちオン(ON))状態で投与されるように、薬剤を、免疫調節細胞/医薬組成物の投与後(すなわち、上記に概説される治療ステップの方法におけるステップ(d)の後)に患者に投与してもよい。
薬剤は、医薬組成物の形態で投与することができる。この実施形態において、組成物は、本明細書中で概説される製薬上許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含み得る。
本明細書中に記載される場合、本発明は、CAR-T細胞療法と共に使用される可逆的なオフスイッチを提供する。この方法は、患者における毒性活性をモニタリングすることを含み得る。従って、毒性活性のレベルが高くなりすぎる場合、この方法は、有害な毒性の副作用を低減するために、LEDGF/p75-HIVインテグラーゼ相互作用を阻害する薬剤を投与することを含み得る。毒性活性として、例えば、免疫学的毒性、胆汁毒性及び呼吸窮迫症候群などが挙げられる。
同様に、本方法は、許容可能なレベルの疾患進行(例えば、改善)が達成される場合、疾患の進行をモニタリングすること及びその後にLEDGF/p75-HIVインテグラーゼ相互作用を阻害する薬剤を投与することを含み得る。「許容可能」であると判断される特定のレベルの疾患進行は、特定の環境に従って変動することになるし、またこのような基準に基づいて評価されるべきである。
疾患の進行をモニタリングすることは、疾患に関連する症状が低下/改善するか、又は増加/悪化するか否かを判断するために、これらの症状を経時的に評価することを意味する。
本発明のさらなる態様によれば、本明細書中で定義されるCARを阻害するのに適した薬剤が提供される。
本明細書中に記載される実施形態は、本発明の全ての態様に適用され得ることが理解される。さらに、この明細書中で引用される全ての刊行物、例えば限定するものではないが、特許及び特許出願などは、完全に示されるかのように参照により本明細書中に組み込まれる。
Figure 2022512701000004
Figure 2022512701000005
Figure 2022512701000006
[実施例1]
オフスイッチ制御エレメントとして作用するHIVインテグラーゼ及びヒトLEDGF/p75のドメインを組み込むキメラ抗原受容体の構築
LEDGF/p75及びHIVインテグラーゼエレメントによって調製したCARは、シグナル伝達鎖及び抗原結合鎖の両方が細胞膜につながれている限り、T細胞NFATシグナル伝達カスケードを抗原特異的に活性化することが可能である。オフスイッチCARをトランスフェクトしたJurkat細胞のNFAT活性化シグナルは、LEDGIN化合物BI224436の存在によって調節される。
材料及び方法
構築物の生成:以下の構築物をpG3ベクターにクローン化した。構築物の模式図を図1に示し、構築物の全配列の詳細は以下に示される。
構築物1(配列番号21):
Figure 2022512701000007
Figure 2022512701000008
構築物1の説明
Figure 2022512701000009
構築物2(配列番号22):
Figure 2022512701000010
説明は構築物1と同じである。
構築物3(配列番号23)
Figure 2022512701000011
説明は構築物1と同じである。
構築物4(配列番号24)
Figure 2022512701000012
説明は構築物1と同じである。
構築物5(配列番号25)
Figure 2022512701000013
Figure 2022512701000014
構築物によるJurkat細胞のトランスフェクション及びNFAT-ルシフェラーゼアッセイ
NFAT-luc2 Jurkat細胞(Promega)を、Jurkat培地:L-グルタミンを含まず、フェノールレッド(Gibco)、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)熱不活性化(Gibco)、1%(v/v)最小必須培地非必須アミノ酸(MEM NEAA)(ThermoFisher)、1%(v/v)ピルビン酸ナトリウム(Sigma)、1%(v/v)L-グルタミン(Gibco)を含むRPMI培地1640(1x)中で培養した。ARH-77-10B5細胞を、1mg/mL G418(Thermo、10131035)を加えたJurkat培地中で培養した。細胞を、5%CO2と共に37℃で48時間インキュベートした。各構築物からの20μgのプラスミドDNAを8x106 NFAT-luc2 Jurkat細胞と混合し、4D-Nucleofector(Lonza)を細胞株用SE Nucleofectorキット(Lonza)と共に製造者の使用説明書に従って使用して、プログラムCL-120を使用して細胞をトランスフェクトした。100%DMSO(Sigma、D2650)中100mMのストック濃度のBI224436化合物(Chemexpress HY-18595)を、Jurkat培地中で希釈し100μMのストック濃度を得た。Jurkat培地中の100μM BI224436ストックを使用して、NFAT-luc2 Jurkat細胞を3μMの最終化合物濃度で5%CO2と共に37℃で48時間インキュベートした。次いで、NFAT-luc2 Jurkat細胞を、ARH-77-10B5細胞(BCMA陽性細胞)と共に(1x105/ウェル、1:1エフェクター:標的比)6.5時間共培養した。NFAT-ルシフェラーゼ発光を、Bio-Gloルシフェラーゼアッセイ系(Promega G7940)(製造者の使用説明書に従う)及びEnSpireマルチモードプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用することによって測定した。
結果
構築物1～4は、標的結合ドメイン(抗BCMA scFv)がヒトLEDGF/p75ドメイン又はHIVインテグラーゼドメインのいずれかに融合されたオフスイッチCARをコードする(図1)。これらの構築物において、シグナル伝達鎖は、細胞膜につながれていない。構築物1～4は、抗原提示細胞によって刺激した場合にNFAT活性化を示さないか又は低いNFAT活性化を示し、BI224436(LEDGF/p75に対するその結合を阻害するHIVインテグラーゼの小分子結合体)の添加は活性化レベルを低減させない(図2)。構築物5は、シグナル伝達鎖がCD8α膜貫通ドメインとの融合を介して細胞膜につながれているオフスイッチCARをコードする。構築物5は、抗原発現細胞(ARH-77-10B5)によって提示された場合にJurkat細胞においてNFATを活性化させ、NFAT活性化は、BI224436の存在下で低減される。
[実施例2]
オフスイッチエレメントを含むキメラ抗原受容体の活性化は、HIVインテグラーゼ溶解変異を組み込むことによって改善される
LEDGF/p75及びHIVインテグラーゼオフスイッチCARが、NFATプロモーターを抗原特異的に活性化する能力は、Jenkins et. al.(1995)PNAS Vol. 92, pp 6057-6061に記載される1つのHIVインテグラーゼ変異の導入によって改善することができる。この変異は、インテグラーゼドメインにおけるフェニルアラニン185のリシンへの置換(F185K)である。変異は、UniprotエントリーP12497を有するHIV Gag-Polポリタンパク質上のフェニルアラニン1332に対応する。
構築物の生成:構築物5を実施例1において生成した。以下の構築物をpG3ベクターにクローン化した。構築物の全配列の詳細は以下に示される。
構築物6(配列番号26):
Figure 2022512701000015
構築物によるJurkat細胞のトランスフェクション及びNFAT-ルシフェラーゼアッセイ
方法は実施例1に記載される。
結果
構築物6における野生型HIVインテグラーゼのフェニルアラニン1332(UniprotエントリーP12497)からリシンへの変異は、構築物5と比較してJurkat細胞におけるNFATプロモーターの活性化の3倍増加をもたらす(図3)。化合物BI224436がNFATのダウンレギュレーションに与える影響は、構築物5及び6の両方において保存される。
[実施例3]
オフスイッチエレメントを含むキメラ抗原受容体の活性化は、LEDGF/p75ドメインを抗原結合鎖と交換することによって改善される
LEDGF/p75及びHIVインテグラーゼオフスイッチCARがNFATプロモーターを活性化する能力は、抗原結合鎖に融合したLEDGF/p75ドメイン及びシグナル伝達鎖に融合したHIVインテグラーゼドメインを有することによってさらに改善することができる。
構築物の生成:構築物6を実施例2において生成した。以下の構築物をpG3ベクターにクローン化した。構築物の全配列の詳細は以下に示される。
構築物7(配列番号27):
Figure 2022512701000016
説明は構築物6と同じである。
構築物によるJurkat細胞のトランスフェクション及びNFAT-ルシフェラーゼアッセイ:方法は、実施例1に記載される。
結果
NFAT活性化は、LEDGF/p75ドメインが抗原結合鎖に融合され、HIVインテグラーゼドメインがシグナル伝達鎖に融合される構築物7では、HIVインテグラーゼドメインが抗原結合鎖に融合され、LEDGF/p75がシグナル伝達鎖に融合される構築物6と比較して4倍を超える(図4)。化合物BI224436が、NFATのダウンレギュレーションに与える影響は、構築物6及び7の両方において保存される。
[実施例4]
オフスイッチエレメントを有するCARの発現レベルはヒトLEDGF/p75ドメインに対する変化によって改善する
オフスイッチCARの発現レベルは、LEDGF/p75ドメインを変異させることによって改善することができる。5つのLEDGF/p75操作変異体を生成した:3つの変異体は、非構造(PDBエントリー1Z9Eに基づく)野生型LEDGF/p75配列の構築物7へのC末端付加を含み、他の2つの変異体は、オフスイッチCARの発現を増強する新規点変異を含む。
構築物の生成:構築物7は実施例3において生成された。以下の構築物をpG3ベクターにクローン化した。構築物の全配列の詳細は以下に示される。
構築物8(配列番号28)
Figure 2022512701000017
説明は以下を除き構築物7と同じである:
Figure 2022512701000018
構築物9(配列番号29)
Figure 2022512701000019
Figure 2022512701000020
説明は以下を除き構築物7と同じである:
Figure 2022512701000021
構築物10(配列番号30)
Figure 2022512701000022
説明は以下を除き構築物7と同じである:
Figure 2022512701000023
構築物11(配列番号31):
Figure 2022512701000024
Figure 2022512701000025
説明は以下を除き構築物7と同じである:
Figure 2022512701000026
構築物12(配列番号32):この構築物は、構築物8のLEGF/p75ドメインのC末端におけるLEDGF/p75残基ロイシン428がグルタミンに変異し、残基バリン429がグルタミンに変異している。
Figure 2022512701000027
説明は以下を除き構築物7と同じである:
Figure 2022512701000028
レンチウイルスベクター産生、Jurkat細胞の形質導入及びフローサイトメトリー:レンチウイルスベクター産生のため、3.0x107 Lenti-X 293T(Takara Bio)細胞を20mL DMEM(Gibco)中に播種し、5%CO2と共に37℃で一晩インキュベートした。Lenti-X 293T細胞を、構築物を含む21μgのトランスファーベクター、3.75μg ViraSafe pRSV-Rev、5.25μg ViraSafe pCMV-VSVG、7.5μg ViraSafe pCgp V-(gag-pol)、75μg jetPRIME(Polyplus)及び1500μg jetPRIMEバッファー(Polyplus)を混合することによりトランスフェクトした。2日後、上清を清澄化してウイルスを濃縮し、50mLオークリッジPPCO超遠心分離管(ThermoFisher)中、Ultrapure sucrose(ThermoFisher)を用いた20%スクロースクッション上の超遠心分離により精製した。上記の方法を使用して、構築物7、8、9、10、11、及び12のレンチウイルスベクターを産生した。
Jurkat細胞を実施例1に記載されるように成長させた。形質導入の前、細胞を2x105細胞/mlの密度に分割した。Jurkat細胞に、構築物7、8、9、10、11、及び12をコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。形質導入反応は、MOI 5を達成するように調製した。形質導入したJurkat細胞を2x105細胞/mlの密度で20日間培養した。形質導入の20日後、細胞を、AlexaFluor 647コンジュゲートBCMA-Fc(施設内で生成)によって染色し、CAR上の抗BCMA scFvドメインを標識した。Cytoflex S(Beckman Coulter)を使用して測定を行い、FlowJo(FlowJo)を使用してデータを分析した。
結果
LEDGF/p75のC末端部分の伸長(構築物8、9、及び10)並びにLEDGF/p75残基428及び429の変異(構築物11及び12)は、HIV LEDGF/p75 OFF-CARを発現する細胞のパーセントの増加をもたらした(図5)。
[実施例5]
HIVインテグラーゼLEDGF/p75 OFF-CARを形質導入した初代T細胞のサイトカイン放出
HIVインテグラーゼLEDGF/p75 OFF-CARを形質導入した初代T細胞は、抗原提示細胞によって刺激すると、サイトカイン放出の形態で機能的応答を産生する。BI224436の添加は、サイトカイン放出を負に調節する。
材料と方法
初代T細胞形質導入及びサイトカイン放出:2人の健康なヒトドナーの新鮮な血液に由来する末梢血単核細胞(PBMC)を、15mLのHistopaque-1077(Sigma)を含むアクスピン管(Sigma)中、製造者の使用説明書に従って密度勾配遠心分離により単離した。細胞を、100単位/mLのIL-2(Sigma)及びTransActビーズ(Miltenyi Biotec)を含むTEXMacs培地(Miltenyi Biotec)中、1x106細胞/mLで再懸濁し、5%CO2と共に37℃で48時間インキュベートした。
2人のドナー由来のT細胞に、構築物10及び構築物11をコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。MOI 5を得るように形質導入反応を調製した。100単位/mLのIL-2を有するTEXMacs培地(Miltenyi Biotec)中でT細胞を培養し、3日毎に新鮮培地を添加した。ARH-77-10B5細胞を、実施例1に記載されるように培養した。100%DMSO中100mMのストック濃度のBI224436化合物をJurkat培地中で希釈して100μMのストック濃度を得た。各T細胞集団を、Jurkat培地中、BI224436の10μM又は0μM(培地単独)の最終濃度で、5%CO2と共に37℃で1時間インキュベートした。次いでT細胞を、ARH-77-10B5細胞(BCMA陽性細胞)又は培地(抗原なし)のいずれかと共に、Jurkat培地中、5%CO2と共に37℃で24時間共培養した(1ウェル当たり5x105細胞、1:1のエフェクター:標的比)。細胞をペレット化し(1200rpm、5分間)、上清を回収した。MSD V-plex Proinflammatory Panel 1 Human Kit(MSD、K15049D-2)及びMSD Sector Imager(MSD)を使用して、サイトカインレベルについて上清を分析した。
結果
オフスイッチCAR(構築物10及び11)を形質導入した初代T細胞は、BCMA陽性細胞(ARH-77-10B5)による刺激によってサイトカインであるTNF-アルファ、IL-2、及びIFN-ガンマを放出する(図6)。全ての場合において、サイトカイン放出は、BI224435化合物の添加によって弱められた。
[実施例6]
HIVインテグラーゼLEDGF/p75 OFF-CARを形質導入した初代T細胞によるサイトカイン放出のレベルの調整
HIVインテグラーゼ LEDGF/p75オフスイッチCARを形質導入した初代T細胞によるサイトカイン放出は、BI224436の濃度によって調整することができる。シグナル伝達鎖上にMyc-タグを有するオフスイッチCARを使用した。
材料と方法
構築物の生成:構築物13をpG3ベクターにクローン化した。構築物の全配列の詳細は以下に示される。
構築物13(配列番号33):この構築物は、3xFlagタグがMyc-タグに置換されている構築物10と等価である。
Figure 2022512701000029
Figure 2022512701000030
説明は以下を除き構築物10と同じである:
Mycタグ
レンチウイルスベクターの産生及び初代T細胞の形質導入:レンチウイルス産生方法は実施例4に記載され、初代T細胞形質導入方法は実施例5に記載される。
サイトカイン放出: ARH-77-10B5細胞を実施例1に記載されるように培養した。100%DMSO中100mMのストック濃度のBI224436化合物をJurkat培地中で希釈し、100μMのストック濃度を得た。各T細胞集団を、Jurkat培地中、BI224436の10μM、3.3μM、1.1μM、0.37μM、0.12μM、0.04μM、0.013μM、0.004μM、0.001μM又は0μM(培地単独)の最終濃度で、5%CO2と共に37℃で1時間インキュベートした。T細胞をARH-77-10B5細胞(BCMA陽性細胞)と共に、Jurkat培地中、5%CO2と共に37℃で24時間共培養した(1ウェル当たり5x104細胞、1:1のエフェクター:標的比)。細胞をペレット化し(1200rpm、5分間)、上清を回収した。MSD V-plex Proinflammatory Panel 1 Human Kit(MSD、K15049D-2)及びMSD Sector Imager(MSD)を使用して、サイトカインレベルについて上清を分析した。
結果
BCMA陽性細胞(ARH-77-10B5)提示細胞によって刺激すると、BI224436の濃度は、オフスイッチCAR(構築物13)を形質導入した初代T細胞からのTNF-アルファ、IL-2、及びIFN-ガンマ放出レベルを調整する(図7)。BI224436のIC50濃度は100nMである。この濃度は、BI224436の200mg経口用量の24時間後のヒト対象の血漿中で達成されたBI224436濃度の10分の1である(臨床試験ID NCT01276990、会議報告書によって提示された分析http://www.natap.org/2011/ICAAC/ICAAC_35.htm)。
[実施例7]
HIVインテグラーゼLEDGF/p75オフスイッチCARを形質導入した初代T細胞による細胞傷害性
HIVインテグラーゼLEDGF/p75オフスイッチCARは、細胞傷害性応答を活性化し、細胞傷害性は化合物BI224436の存在下で弱められる。
材料と方法
初代T細胞の形質導入:実施例5に記載した方法。
xCelligence細胞傷害アッセイ:ARH-77-10B5細胞は実施例1に記載されるとおりであった。100%DMSO中100mMのストック濃度のBI224436化合物をJurkat培地中で希釈し、100μMのストック濃度を得た。xCelligence E-プレート(ACEA、06472460001)を、B細胞キリング(抗CD40)アッセイキット(ACEA、8100004)の製造者の使用説明書に従って、抗CD40テザリング（tethering）剤によってコーティングした。プレートをxCelligenceステーション(ACEA)(37℃、5%CO2)に挿入し、37℃で1時間平衡にさせた後、バックグラウンド測定を行った。ARH-77-10B5細胞又はJurkat培地をプレート(1ウェル当たり1x104細胞)に添加し、20時間培養した。各T細胞集団をJurkat培地中、BI224436の10μM又は0μMの最終濃度で、5%CO2と共に37℃で1時間インキュベートした。T細胞をプレート(1ウェル当たり1x104細胞、1:1エフェクター:標的比)に添加し、xCelligenceステーションにおいて24時間インキュベートした。データ分析は、xCELLigence免疫療法ソフトウェア(ACEA)を使用して実行した。試料の細胞指数をT細胞添加の時点で正規化した後、T細胞の正規化細胞指数を標的細胞単独の正規化細胞指数によって除算し、所定の時点での%生存細胞を得た。
結果
オフスイッチCAR(構築物10)を形質導入した初代T細胞は、BCMA陽性細胞(ARH-77-10B5)に対して細胞障害応答を誘導する(図8)。応答は、化合物BI224436の存在下で低減される。
[実施例8]
BI224436が、HIVインテグラーゼLEDGF/p75オフスイッチCAR又は等価の従来のCARを形質導入した初代T細胞の細胞傷害性に与える影響
オフスイッチCARの抗原特異的細胞傷害性は、等価の従来のCARと同等であり、BI22436のみがオフスイッチCARの細胞傷害性を弱める。オフスイッチCARからの必須のCAR成分(抗BCMA scFv、CD8-アルファヒンジ及び膜貫通、4-1BB、及びCD3-ゼータ)を使用して等価の従来の一本鎖CARを生成した。
材料と方法
構築物の生成:構築物14をpG3ベクターにクローン化した。構築物の全配列の詳細は以下に示される。
構築物14(配列番号52):この構築物は、従来の一本鎖CARであり、構築物10からの成分を使用する。
構築物14:
Figure 2022512701000031
説明:
Figure 2022512701000032
構築物14のDNA配列(配列番号53):
Figure 2022512701000033
Figure 2022512701000034
レンチウイルスベクター産生:方法は実施例4に記載される。
CD4+及びCD8+T細胞の単離及び形質導入:1人の健康なヒトドナーの新鮮な血液に由来する末梢血単核細胞(PBMC)を、15mLのHistopaque-1077(Sigma)を含むアクスピン管(Sigma)中、製造者の使用説明書に従って密度勾配遠心分離により単離した。CD4+及びCD8+T細胞を、CD4及びCD8マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)及びAutoMACS Pro-separator(Miltenyi Biotec)を使用して単離した。細胞を、100単位/mLのIL-7(Sigma)、100単位/mLのIL-15(Sigma)、及びTransActビーズ(Miltenyi Biotec)を含むTEXMacs培地(Miltenyi Biotec)中、1x106細胞/mLで再懸濁し、5%CO2と共に37℃で48時間インキュベートした。
T細胞に、構築物14又は構築物10をコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。形質導入T細胞及び非形質導入(UT)T細胞を、100単位/mLのIL-7(Sigma)及びIL-15(Sigma)を有するTEXMax培地(Miltenyi Biotec)中で培養し、3日毎に新鮮培地を添加した。形質導入反応を、構築物14と構築物10の間で同等のCAR発現レベルを達成するように調製した。1x105の各T細胞集団を、AlexaFluor 647コンジュゲートBCMA-Fc(施設内で生成)によって染色し、CAR上の抗BCMA scFvを標識した。Cytoflex S(Beckman Coulter)を使用して測定を行い、FlowJo(FlowJo)を使用してデータを分析した。
K562 BCMA細胞(BCMA陽性)を、0.8mg/mL G418(Gibco)を加えたJurkat培地中で培養し、K562細胞(BCMA陰性)をJurkat培地中で培養した。両方の細胞株を、5%CO2と共に37℃で培養した。100%DMSO(Sigma)中100mMのストック濃度のBI224436化合物をJurkat培地中で希釈し、100μMのストック濃度を得た。K562細胞を、Cell Trace Far Red(0.5μM、ThermoFisher)によって染色し、K562 BCMA細胞を、Cell Trace Violet(2.5μM、ThermoFisher)によって染色した。T細胞を、Jurkat培地中、BI224436の10μM又は0μM(培地単独)の最終濃度で、5%CO2と共に37℃で1時間インキュベートした。次いでT細胞を、K562又はK562 BCMA細胞と、10μM又は0μMのBI224436を含むJurkat培地中、5%CO2と共に37℃で48時間共培養した(1ウェル当たり1x104のK562又はK562 BCMA細胞、1:1又は4:1のエフェクター:標的比)。48時間後、SytoxAADvanced(1μM、ThermoFisher)、DNアーゼ(2.5mg/ml、ThermoFisher)、及びEDTA(10mM、Invitrogen)を、細胞を含むウェルに添加し、25℃で5分間インキュベートした。各ウェルの50μLを、Cytoflex S(Beckman Coulter)において分析し、FlowJo(FlowJo)を使用してデータを分析した。生存しているK562及びK562 BCMA細胞のパーセントを、各条件におけるK562及びK562 BCMA細胞の数を0μM BI224436中のUT T細胞との共培養後に見出されたK562及びK562 BCMA細胞の数によって除算することによって計算した。
結果
オフスイッチCAR(構築物10)を形質導入した初代T細胞及び等価の従来のCAR(構築物14)を形質導入した初代T細胞はいずれも、BCMA陽性細胞(K562 BCMA)の殺作用を有するが、BCMA陰性細胞(K562 WT)の殺作用は有さなかった(図9B)。BI224436は、従来のCAR(構築物14)の細胞傷害性に影響を及ぼさないが、オフスイッチCAR(構築物10)の細胞傷害性を有効に弱める。

Claims (30)

  1. ヒト対象の治療に適したキメラ抗原受容体(CAR)であって、
    (i)膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達鎖;
    (ii)標的結合ドメイン及び膜貫通ドメインを含む非シグナル伝達鎖
    を含み、前記鎖の一方がHIVインテグラーゼ触媒コアドメイン(CCD)又はその機能的フラグメント若しくは変異体をさらに含み、他方の鎖がLEDGF/p75インテグラーゼ結合ドメイン(IBD)又はその機能的フラグメント若しくは変異体をさらに含む、前記キメラ抗原受容体。
  2. シグナル伝達鎖が共刺激ドメインをさらに含む、請求項1に記載のCAR。
  3. 非シグナル伝達鎖が共刺激ドメインをさらに含む、請求項1又は2に記載のCAR。
  4. 非シグナル伝達鎖が、以下の順序で以下のドメイン:標的結合ドメイン;膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン;及びHIVインテグラーゼCCD又はLEDGF/p75 IBD(配置A)を含み、シグナル伝達鎖が、以下の順序で以下のドメイン:膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン;HIVインテグラーゼCCD又はLEDGF/p75 IBD;及びシグナル伝達ドメイン(配置I)を含む、請求項1～3のいずれか一項に記載のCAR。
  5. 非シグナル伝達鎖がLEDGF/p75 IBDを含む、請求項1～4のいずれか一項に記載のCAR。
  6. 前記LEDGF/p75 IBD機能的変異体が、残基428及び429で低減された疎水性を有する、請求項1～5のいずれか一項に記載のCAR。
  7. 前記LEDGF/p75 IBDが、IBDのC末端にLEDGF/p75タンパク質配列からの追加のアミノ酸残基を含む、請求項1～6のいずれか一項に記載のCAR。
  8. 前記LEDGF/p75 IBDが、IBDのC末端にLEDGF/p75タンパク質配列からの追加の1～45個のアミノ酸残基を含む、請求項7に記載のCAR。
  9. 標的結合ドメインが抗体、抗原結合フラグメント、又はリガンドを含む、請求項1～8のいずれか一項に記載のCAR。
  10. 標的結合ドメインが、腫瘍関連抗原に結合する、請求項1～9のいずれか一項に記載のCAR。
  11. 腫瘍関連抗原が、BCMA、がん胎児抗原(CEA)、がん抗原-125、CA19-9、CD5、CD13、CD19、CD20、CD22、CD27、CD30、CD33、CD34、CD45、CD52、CD70、CD117、CD138、CD160、上皮成長因子受容体(EGFR)、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドG2(GD2)、HER2、メソテリン、MUC-1、神経細胞接着分子(NCAM)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、前立腺酸性ホスファターゼ(prostatic acid phosphatise)(PAP)、タンパク質メラン-A、シナプトフィジン(synaptophysis)、前立腺の6回膜貫通上皮抗原I(STEAP1)、TARP、Trp-p8、チロシナーゼ、又はビメンチンから選択される、請求項10に記載のCAR。
  12. 膜貫通ドメインが、CD8又はCD4の膜貫通ドメインを含む、請求項1～11のいずれか一項に記載のCAR。
  13. シグナル伝達ドメインが、CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項1～12のいずれか一項に記載のCAR。
  14. 共刺激ドメインが、4-1BB、CD28、CD27、OX40、ICOS、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、又はその任意の組合せから選択される、請求項1～13のいずれか一項に記載のCAR。
  15. HIVインテグラーゼCCD又はその機能的変異体と、ヒト水晶体上皮由来成長因子(LEDGF/p75)タンパク質又はその機能的フラグメント若しくは変異体との結合を破壊する薬剤をさらに含む、請求項1～14のいずれか一項に記載のCARの使用。
  16. 薬剤が、2-(キノリン-3-イル)酢酸誘導体、2-(ピリジン-3-イル)酢酸誘導体、2-(チエノ[2,3-b]ピリジン-5-イル)酢酸誘導体、又は(S)-2-(tert-ブトキシ)-2-フェニル酢酸誘導体から選択される、請求項15に記載のCARの使用。
  17. 薬剤が、
    3-キノリン酢酸、4-(2,3-ジヒドロピラノ[4,3,2-de]キノリン-7-イル)-α-(1,1-ジメチルエトキシ)-2-メチル-、(αS,4R)-;及び
    3-キノリン酢酸、4-(3,4-ジヒドロ-2H-1-ベンゾピラン-6-イル)-α-(1,1-ジメチルエトキシ)-2-メチル-
    から選択される、請求項15又は16に記載のCARの使用。
  18. 請求項1～14のいずれか一項に記載のCARのシグナル伝達鎖及び/又は非シグナル伝達鎖をコードするポリヌクレオチド。
  19. 請求項16に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  20. 請求項1～14のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体(CAR)系を含む免疫調節細胞。
  21. 炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、又はヘルパーTリンパ球に由来する、請求項20に記載の免疫調節細胞。
  22. 治療に使用するための請求項20又は請求項21に記載の免疫調節細胞。
  23. 請求項20及び請求項21に記載の複数の免疫調節細胞を含む医薬組成物。
  24. 請求項23に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患を治療及び/又は予防する方法。
  25. HIVインテグラーゼタンパク質又はその機能的変異体の触媒コアドメイン(CCD)と、ヒト水晶体上皮由来成長因子(LEDGF/p75)タンパク質又はその機能的フラグメント若しくは変異体との間の相互作用を破壊する薬剤を投与することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
  26. 薬剤が、医薬組成物の前、同時、又は後に患者に投与される、請求項25に記載の方法。
  27. 請求項20、21、又は22のいずれか一項に記載の免疫調節細胞を作製する方法であって、
    (a)免疫調節細胞を提供すること;
    (b)請求項18に記載のポリヌクレオチド又は請求項19に記載の発現ベクターを前記免疫調節細胞に形質導入又はトランスフェクトすること;及び
    (c)前記ポリヌクレオチド又は前記発現ベクターを免疫調節細胞中で発現させること
    を含む、前記方法。
  28. 免疫調節細胞が同種又は自己である、請求項27に記載の方法。
  29. 請求項27又は請求項28に記載の方法によって得られる免疫調節細胞。
  30. 請求項24、25又は29のいずれか一項に記載の免疫調節細胞を含む対象における請求項20、21、又は22のいずれか一項に記載のCARを阻害する方法であって、LEDGF/p75-HIVインテグラーゼ相互作用を阻害する薬剤を対象に投与することを含む、前記方法。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592014A (zh) * 2019-08-14 2019-12-20 广东美赛尔细胞生物科技有限公司 一种在nk细胞治疗中免辐照体外体内持续去除饲养细胞的方法
CN114057890A (zh) * 2020-07-31 2022-02-18 南京北恒生物科技有限公司 新型共刺激结构域及其用途

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016508518A (ja) * 2013-02-15 2016-03-22 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア キメラ抗原受容体及びその使用方法
JP2017502690A (ja) * 2013-12-20 2017-01-26 ノバルティス アーゲー 調節可能キメラ抗原受容体
WO2017120546A1 (en) * 2016-01-08 2017-07-13 The Regents Of The University Of California Conditionally active heterodimeric polypeptides and methods of use thereof
JP2017526361A (ja) * 2014-08-29 2017-09-14 ユーシーエル ビジネス ピーエルシー シグナル伝達系
JP2018506293A (ja) * 2015-02-24 2018-03-08 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 結合誘発型転写スイッチ及びその使用方法
WO2018067992A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
WO2018148440A1 (en) * 2017-02-08 2018-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Regulating chimeric antigen receptors

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016508518A (ja) * 2013-02-15 2016-03-22 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア キメラ抗原受容体及びその使用方法
JP2017502690A (ja) * 2013-12-20 2017-01-26 ノバルティス アーゲー 調節可能キメラ抗原受容体
JP2017526361A (ja) * 2014-08-29 2017-09-14 ユーシーエル ビジネス ピーエルシー シグナル伝達系
JP2018506293A (ja) * 2015-02-24 2018-03-08 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 結合誘発型転写スイッチ及びその使用方法
WO2017120546A1 (en) * 2016-01-08 2017-07-13 The Regents Of The University Of California Conditionally active heterodimeric polypeptides and methods of use thereof
WO2018067992A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
WO2018148440A1 (en) * 2017-02-08 2018-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Regulating chimeric antigen receptors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANCER RES., vol. Vol.78, No.13 Suppl., JPN6023040000, 1 July 2018 (2018-07-01), pages 2570, ISSN: 0005165541 *
EXPERT OPIN. THER. PATENTS, vol. 24, no. 6, JPN7023003653, 2014, pages 609 - 632, ISSN: 0005165542 *

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