JP2022512152A - 乳がんの予後についてのトランスクリプトームプロファイリング - Google Patents

Abstract

対象の乳がんの診断、予後および処置のための方法、システムおよびキットが開示される。本発明はまた、補助化学療法および内分泌療法を免れ得る、乳がん再発のリスクが低い対象を特定するためのバイオマーカーおよび臨床的に有用な分類器を提供する。特定の例では、対象の乳がん再発のリスクを判定するためにこのようなバイオマーカーの検出で使用するためのプローブセットが本明細書でさらに開示される。乳がん再発のリスクを判定するための発現プロファイリングに基づいて、乳がんを打ち負かす方法も提供される。

Description

関連出願
本出願は、全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１２月８日に出願された米国特許仮出願第６２／７７７，１２８号に基づく優先権を主張する。

本発明は、乳がんを処置するための個別化医療および方法の分野に関する。特に、本発明は、補助全身療法を免れ得る対象を特定するための、乳がんの予後についてのトランスクリプトームプロファイリングの使用に関する。

がんは、体の至る所の異常な細胞の制御されない増殖である。異常な細胞は、がん細胞、悪性細胞または腫瘍細胞と呼ばれる。多くのがんおよびがん組織を構成する異常な細胞は、異常な細胞が起源をもつ組織の名称によってさらに特定される（例えば、乳がん）。がん細胞は、制御不能な状態で増殖し、がん細胞の塊を形成する可能性がある。がん細胞は、この細胞の元の塊から離脱し、血液およびリンパ系を通して移動し、他の器官に入り、そこで再び制御されない増殖サイクルを繰り返す可能性がある。がん細胞がある領域を離れ、別の体の領域で増殖するこの過程は通常、転移拡散または転移性疾患と呼ばれる。例えば、乳がん細胞が骨（または他のどこか）に広がった場合、個体が転移性乳がんを有することを意味し得る。

腫瘍サイズ、悪性度、リンパ節の関与および腫瘍－リンパ節－転移（ＴＮＭ）病期分類（米国癌合同委員会）などの標準的な臨床パラメータは、転帰と相関し、（ネオ）アジュバント化学療法、免疫療法、抗体療法および／または放射線療法レジメンに関して対象を層別化するのに役立ち得る。分子マーカーを臨床診療に組み込むことにより、標的療法に応答する可能性がより高い腫瘍サブタイプを定義することができる。しかしながら、組織学的サブタイプまたは分子サブタイプによってグループ分けされた病期一致腫瘍は、同じ処置レジメンに異なって応答する場合がある。重要な病因学的寄与をもたらす追加の重要な遺伝子変化およびエピジェネティック変化が存在し得る。がん細胞および腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において働く分子機序および調節経路のより詳細な理解は、新規な抗腫瘍薬の設計を劇的に改善し、最適な治療戦略の選択を通知することができるだろう。各腫瘍の生物学を特徴づける診断、予後および治療バイオマーカーの開発および実行は、臨床医が個々の対象のケアおよび処置に関する重要な決定を行うのを助け得る。

原発性乳がんの処置は、高度に個別化されており、プレシジョン・メディシン（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の時代に入っている。市民意識の高まりおよびスクリーニングプログラムの強化により、低リスク腫瘍の割合が、対応する過剰処置のリスクと共に増加している（Hosseini et al. (2017) Eur. J. Surg. Oncol. 43:938-943）。したがって、現在のガイドラインは、高リスク腫瘍の処置を段階的に拡大することに加えて、低リスク対象における処置を段階的に縮小することに焦点を当てている（Curigliano et al. (2017) Ann Oncol 28:1700-1712）。補助化学療法による再発リスク低下を評価するのに役立つツールは最も成功しており、臨床ガイドラインに組み込まれているが、エストロゲン受容体（ＥＲ）の発現を除いて内分泌療法からの利益によって対象を層別化する試験は現在承認されていない（Curigliano et al.、上記）。

早期乳がん研究者共同グループ（Ｅａｒｌｙ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｉａｌｉｓｔｓ’ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ）（ＥＢＣＴＣＧ）からの大規模メタアナリシスは、ＥＲ陽性（ＥＲ＋）乳がんが、内分泌療法を停止した後１５年間にわたって比較的一貫した割合で再発し、死をもたらし続けることを確認し、特定の対象における内分泌療法の延長の必要性を示唆した（Pan et al. (2017) N. Engl. J. Med. 377:1836-1846）。しかしながら、内分泌療法は実質的な副作用を有する場合があり、これは５０～８０％のアドヒアランス率に反映されている（Chlebowski et al. (2006) Oncology 71:1-9）。このことが、内分泌療法を安全に省略することができるＥＲ＋がんの対象を特定する努力につながった。したがって、内分泌療法の非存在下でさえ再発リスクが最も低い女性を選択することができるような試験により、不必要な処置および関連する疾病なしで済ますことができるだろう。

これに対処するために、７０遺伝子サインが、いずれの全身処置も行わない場合でさえ、２０年にわたって再発リスクが低い対象の超低リスク群を特定することが近年示された（Esserman et al. (2017) JAMA Oncol. 3:1503-1510）。興味深いことに、同じ著者らが、７０遺伝子サインによって層別化される高リスク対象および低リスク対象にタモキシフェンを与える効果を評価し、補助的なタモキシフェンが両群において有意な効果を有することを見出した（Van 't Veer et al. (2017) Breast Cancer Res Treat 166:593-601）。これにより、予後判定は処置予測をもたらさず、サブグループにおける処置効果の遡及的分析を実施する場合、注意を払うべきであることが確認されている。

臨床的視点から、相対的処置効果はサブグループにわたって一貫していると考えることができ、ベースラインリスクレベルおよび絶対的処置効果に基づいて処置決定を行うことができるという主張がなされてきた（Peto et al. (2011) Br. J. Cancer 104:1057-1058）。しかしながら、遺伝子発現試験についてベースラインリスクの使用を考慮する場合、現れる課題は、現在の試験が個々の対象のレベルで不一致であるということである。遺伝子発現試験は、概して、群レベルにおいて類似の性能ではうまくいくが、個々の対象についての結果の実質的な不一致が存在し得る、すなわち、異なる試験を使用した場合、低リスク対象群および高リスク対象群は同じでない。実際、近年の試験は、５つの一般的な遺伝子発現試験の一致が中程度にすぎないことを見出し、対象の３９％が全試験によって一様に低リスクとして分類された一方、個々の試験は６１％～８２％を低リスクであると予測した（Bartlett et al. (2016) Comparing Breast Cancer Multiparameter Tests in the OPTIMA Prelim Trial: No Test Is More Equal Than the Others. J. Natl. Cancer Inst. 108, 2016）。したがって、早期乳がんの対象を層別化するより良い方法が依然として必要とされている。

この背景情報は、出願人によって本発明に関連する可能性があると考えられた公知の情報を公開する目的で提供されている。前記情報のいずれかが本発明に対する先行技術を構成するとの承認を必然的に意図しておらず、またそのように解釈されるべきでもない。

本発明は、対象の乳がんの診断、予後および処置のための方法、システムおよびキットに関する。本発明はまた、補助化学療法および内分泌療法を免れ得る、乳がん再発のリスクが低い対象を特定するためのバイオマーカーおよび分類器を提供する。特定の例では、対象の乳がん再発のリスクを判定するためにこのようなバイオマーカーの検出で使用するためのプローブセットが本明細書でさらに開示される。乳がん再発のリスクを判定するための発現プロファイリングに基づいて、乳がんを処置する方法も提供される。

いくつかの実施形態では、本発明は、乳がんについて予後を判定し、対象を処置する方法であって、ａ）対象から乳がん細胞を含む生体試料を得ることと；ｂ）生体試料における表２から選択される複数の遺伝子の発現レベルを測定することと；ｃ）生体試料における表２から選択される複数の遺伝子の発現レベルに基づいて、対象が、がん再発のリスクが低いかどうかを判定することと；ｄ）生体試料における表２から選択される複数の遺伝子の発現レベルに基づいて、対象が、がん再発のリスクが低いと特定されなかった場合、補助化学療法または内分泌療法を投与し、対象が、がん再発のリスクが低いと特定された場合、補助化学療法も内分泌療法も投与しないこととを含む方法を含む。他の実施形態では、表２から選択される遺伝子の１つまたは複数の発現のレベルが、対照と比較して上昇または低下し得る。さらに他の実施形態では、表２から選択される遺伝子の全部の発現レベルが生体試料において測定される。

いくつかの実施形態では、複数の遺伝子が、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＦメンバー１（ＡＢＣＦ１）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ＡＣＡＴ２）、アクチン様６Ａ（ＡＣＴＬ６Ａ）、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒サブユニット３Ｂ（ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ）、抗サイレンシング機能１Ｂヒストンシャペロン（ＡＳＦ１Ｂ）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、ガンマポリペプチド１（ＡＴＰ５Ｃ１）、ビスチン（ｂｙｓｔｉｎ）様（ＢＹＳＬ）、１番染色体オープンリーディングフレーム１０６（Ｃ１ｏｒｆ１０６）、細胞分裂周期２５Ｂ（ＣＤＣ２５Ｂ）、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）、クロマチンライセンス化ＤＮＡ複製因子１（ＣＤＴ１）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質ガンマ（ＣＥＢＰＧ）、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）、クロマチンアセンブリー因子１サブユニットＡ（ＣＨＡＦ１Ａ）、クロマチンアセンブリー因子１サブユニットＢ（ＣＨＡＦ１Ｂ）、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）、サイトカイン誘導アポトーシス阻害剤１（ＣＩＡＰＩＮ１）、細胞骨格関連タンパク質２（ＣＫＡＰ２）、ＣＴＰシンターゼ１（ＣＴＰＳ１）、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ベータ（ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｅ２Ｆ転写因子８（Ｅ２Ｆ８）、エモパミル（ｅｍｏｐａｍｉｌ）結合タンパク質（ステロールイソメラーゼ）（ＥＢＰ）、真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質１（ＥＩＦ４ＥＢＰ１）、ＥＲ膜タンパク質複合体サブユニット８（ＥＭＣ８）、配列類似性のあるファミリー９６メンバーＢ（ＦＡＭ９６Ｂ）、ファンコニ貧血相補群Ａ（ＦＡＮＣＡ）、Ｆボックスタンパク質５（ＦＢＸＯ５）、グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、グリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）、ジェミニン、ＤＮＡ複製阻害剤（ＧＭＮＮ）、Ｇタンパク質シグナル伝達モジュレーター２（ＧＰＳＭ２）、ＧＴＰ結合タンパク質４（ＧＴＰＢＰ４）、肝癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、血液および神経発現１（ＨＮ１）、熱ショックタンパク質ファミリーＡ（Ｈｓｐ７０）メンバー１４（ＨＳＰＡ１４）、熱ショックタンパク質ファミリーＤ（Ｈｓｐ６０）メンバー１（ＨＳＰＤ１）、イノシトールモノホスファターゼ２（ＩＭＰＡ２）、インターロイキン１受容体関連キナーゼ１（ＩＲＡＫ１）、リジル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＫＡＲＳ）、動原体関連１（ＫＮＴＣ１）、ＬＤＬ受容体関連タンパク質８（ＬＥＰ８）、ミニ染色体維持複合体成分５（ＭＣＭ５）、ミニ染色体維持複合体成分７（ＭＣＭ７）、ＭＩＳ１８動原体タンパク質Ａ（ＭＩＳ１８Ａ）、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｌ１５（ＭＲＰＬ１５）、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｓ１７（ＭＲＰＳ１７）、ミトコンドリア転写終結因子３（ＭＴＥＲＦ３）、核プレラミン（ｐｒｅｌａｍｉｎ）Ａ認識因子（ＮＡＲＦ）、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＤ２（ＮＣＡＰＤ２）、非ＳＭＣコンデンシンＩＩ複合体サブユニットＤ３（ＮＣＡＰＤ３）、ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼサブユニットＡ９（ＮＤＵＦＡ９）、核エンベロープ膜内在性タンパク質１（ＮＥＭＰ１）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ヌクレオシド二リン酸キナーゼ１（ＮＭＥ１）、ＮＯＰ２核小体タンパク質（ＮＯＰ２）、ヌクレオポリン２０５（ＮＵＰ２０５）、複製開始点認識複合体サブユニット１（ＯＲＣ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（リポアミド）アルファ１（ＰＤＨＡ１）、プレニル（デカプレニル）二リン酸シンターゼサブユニット１（ＰＤＳＳ１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、ポロ様キナーゼ４（ＰＬＫ４）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、ＤＮＡポリメラーゼアルファ２、アクセサリーサブユニット（ＰＯＬＡ２）、プロテインホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）、ペロキシレドキシン４（ＰＲＤＸ４）、プロテアソームサブユニットベータ４（ＰＳＭＢ４）、プロテアソームサブユニットベータ５（ＰＳＭＢ５）、プロテアソーム２６Ｓサブユニット、非ＡＴＰアーゼ１４（ＰＳＭＤ１４）、プロテアソーム２６Ｓサブユニット、非ＡＴＰアーゼ２（ＰＳＭＤ２）、プロテアソームアセンブリーシャペロン１（ＰＳＭＧ１）、ホスファチジルセリンシンターゼ１（ＰＴＤＳＳ１）、ＲＡＤ５１リコンビナーゼ（ＲＡＤ５１）、ＲＡＤ５４ホモログＢ（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））（ＲＡＤ５４Ｂ）、ＲＡＤ５４様（出芽酵母）（ＲＡＤ５４Ｌ）、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）、核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドＡ（ＳＮＲＰＡ１）、核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）、ＳＰＣ２５、ＮＤＣ８０動原体複合体成分（ＳＰＣ２５）、ＳＲＳＦプロテインキナーゼ１（ＳＲＰＫ１）、ストレス誘導リンタンパク質１（ＳＴＩＰ１）、トランスフォーミング酸性コイルド－コイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）、転写伸長因子Ｂサブユニット１（ＴＣＥＢ１）、膜貫通タンパク質９７（ＴＭＥＭ９７）、トポイソメラーゼ（ＤＮＡ）ＩＩアルファ（ＴＯＰ２Ａ）、トポイソメラーゼ（ＤＮＡ）ＩＩ結合タンパク質１（ＴＯＰＢＰ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ１（ＴＰＩ１）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）およびチロシン３－モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５－モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質ゼータ（ＹＷＨＡＺ）からなる群から選択される。

特定の実施形態では、対象が、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）、ヒト上皮増殖因子受容体２陰性（ＨＥＲ２－）乳がんを有し、閉経後である。

対象から得られる生体試料は、典型的には乳房生検または腫瘍試料であるが、乳がん細胞を含有する対象の体液または組織からの任意の試料であることができる。特定の実施形態では、表２から選択される遺伝子からの配列またはその相補配列を含む核酸（例えば、ＲＮＡ転写物）を生体試料からさらに単離する、および／または精製する、および／または分析前に増幅する。

バイオマーカーの発現レベルは、それだけに限らないが、インサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション、ＰＣＲベースの方法、アレイベースの方法、免疫組織化学法、ＲＮＡアッセイ法およびイムノアッセイ法を含む種々の方法によって決定することができる。遺伝子発現のレベルは、例えば、核酸プローブ、核酸プライマーおよび抗体などの１つまたは複数の試薬を使用して決定することができる。特定の実施形態では、バイオマーカーの発現のレベルを決定することが、核酸（例えば、ＲＮＡ転写物）のレベルを測定することを含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルが、対照と比較して低下している。他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルが、対照と比較して上昇している。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法が、補助化学療法または内分泌療法による対象の処置前に実施される。

他の実施形態では、本方法が、対象についての平均ゲノムリスク（ＡＧＲ）スコアを計算することをさらに含み、ＡＧＲスコアと生体試料における表２から選択される遺伝子の発現レベルの両方に基づいて、対象が、がん再発のリスクが低いと特定されなかった場合、補助化学療法または内分泌療法を対象に投与し、ＡＧＲスコアと生体試料における表２から選択される遺伝子の発現レベルの両方に基づいて、対象が、がん再発のリスクが低いと特定された場合、補助化学療法も内分泌療法も対象に投与しない。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカー遺伝子の発現レベルの有意性が、例えば、Ｔ検定、Ｐ値、ＫＳ（コルモゴロフ－スミルノフ）Ｐ値、精度、精度Ｐ値、陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性的中率（ＮＰＶ）、感度、特異度、ＡＵＣ、ＡＵＣ Ｐ値（Ａｕｃ．ｐｖaｌｕｅ）、ウィルコクソン検定Ｐ値、中央値倍率差（ＭＦＤ）、カプラン・マイヤー（ＫＭ）曲線、生存ＡＵＣ（ｓｕｒｖＡＵＣ）、カプラン・マイヤーＰ値（ＫＭ Ｐ値）、単変量解析オッズ比Ｐ値（ｕｖａＯＲＰｖａｌ）、多変量解析オッズ比Ｐ値（ｍｖａＯＲＰｖａｌ）、単変量解析ハザード比Ｐ値（ｕｖａＨＲＰｖａｌ）および多変量解析ハザード比Ｐ値（ｍｖａＨＲＰｖａｌ）を使用して評価され得る。他の実施形態では、１つまたは複数の標的の発現レベルの有意性が、ＡＵＣ、ＡＵＣ Ｐ値（Ａｕｃ．ｐｖaｌｕｅ）、ウィルコクソン検定Ｐ値、中央値倍率差（ＭＦＤ）、カプラン・マイヤー（ＫＭ）曲線、生存ＡＵＣ（ｓｕｒｖＡＵＣ）、単変量解析オッズ比Ｐ値（ｕｖａＯＲＰｖａｌ）、多変量解析オッズ比Ｐ値（ｍｖａＯＲＰｖａｌ）、カプラン・マイヤーＰ値（ＫＭ Ｐ値）、単変量解析ハザード比Ｐ値（ｕｖａＨＲＰｖａｌ）または多変量解析ハザード比Ｐ値（ｍｖａＨＲＰｖａｌ）を含む群から選択される２つ以上のメトリックスに基づき得る。

さらに他の実施形態では、本発明は、乳がんを有する対象の予後ならびに対象を補助化学療法および内分泌療法で処置するか否かを判定するためのプローブセットであって、複数の標的核酸を検出するための複数のプローブを含み、複数の標的核酸が表２から選択される遺伝子の１つもしくは複数の遺伝子配列、またはその相補配列を含む、プローブセットを含む。プローブを検出可能に標識して検出を容易にすることができる。

他の実施形態では、本発明は、乳がんを有する対象の予後ならびに対象を補助化学療法および内分泌療法で処置するか否かを判定するためのシステムであって、ａ）本明細書に記載されるプローブセットと；ｂ）乳がんを有する対象からの生体試料における複数のプローブにハイブリダイズした複数の標的核酸の発現レベルまたは発現プロファイルを分析し、発現レベルまたは発現プロファイルに基づいて、対象が、がん再発のリスクが低く、補助化学療法および内分泌療法による処置を免れることができるかどうかを判定するためのコンピュータモデルまたはアルゴリズムとを含むシステムを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、乳がんを有する対象の予後ならびに対象を補助化学療法および内分泌療法で処置するか否かを判定するためのキットであって、表２から選択される複数の遺伝子の発現のレベルを測定するための薬剤を含むキットを含む。他の実施形態では、キットが、表２から選択される１つまたは複数の遺伝子を含む複数の遺伝子の発現のレベルを測定するための１つまたは複数の薬剤（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマーまたはマイクロアレイ）と、試験用にヒト対象から単離された乳がん細胞を含む生体試料を保持するための容器と、薬剤を生体試料または生体試料の一部と反応させて、対象が、乳がんの再発のリスクが低く、補助化学療法および内分泌療法による処置を免れることができるかどうかを判定するための印刷された説明書とを含み得る。薬剤は別個の容器に包装されてもよい。さらに他の実施形態では、キットが、１つまたは複数の対照参照試料または遺伝子発現を測定するための他の試薬（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ノーザンブロット、イムノアッセイもしくは免疫組織化学を実施するための試薬）をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キットが、表２に列挙される複数の遺伝子の発現のレベルを測定するための薬剤を含む。他の実施形態では、キットが、表２に列挙される全ての遺伝子の発現のレベルを測定するための薬剤を含む。例えば、キットは、複数の標的核酸を検出するための、本明細書に記載される、プローブセットを含んでよく、複数の標的核酸は、表２から選択される遺伝子の１つもしくは複数の遺伝子配列、またはその相補配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む。

他の実施形態では、キットが、乳がんを有する対象の予後ならびに対象を補助化学療法および内分泌療法で処置するか否かを判定するためのシステムであって、ａ）表２から選択される遺伝子の１つもしくは複数の遺伝子配列、またはその相補配列を含む複数の標的核酸を検出するための複数のプローブを含むプローブセットと；ｂ）乳がんを有する対象からの生体試料における複数のプローブにハイブリダイズした複数の標的核酸の発現レベルまたは発現プロファイルを分析し、発現レベルまたは発現プロファイルに基づいて、対象が、がん再発のリスクが低く、補助化学療法および内分泌療法による処置を免れることができるかどうかを判定するためのコンピュータモデルまたはアルゴリズムとを含むシステムをさらに含む。

本発明のこれらのおよび他の実施形態は、当業者が本明細書の開示を考慮して容易に想到するだろう。

参照による組み込み
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別的に示されているのと同程度に、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

図１Ａ～１Ｃは、ＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴの７６５人の対象における以前公開されたサインの性能および比較を示す。図１Ａは、全７６５人の対象における１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての単変量（ＵＶＡ）標準化ハザード比（ＨＲ）を示すフォレストプロットを示す。連続リスクスコアを標準偏差で割って、異なる値の分布を有するスコア間のハザード比を直接比較した。標準偏差で割ると、最大可能ＨＲは２．５である。結果を全対象および遠隔転移エンドポイントについて示す。図１Ｂは、全７６５人の対象における異なるサインについてのピアソン相関および階層的クラスタリングを示す。ＥＲ＋がんを有する乳がん対象において、またはＥＲ＋がんを有する乳がん対象のために開発されたほとんどのサインについて中程度から高い相関が見られる。図１Ｃは、個々の対象の分類での以前公開されたサインの比較を示す。バープロットを着色して、サインにつき対象をどの四分位数にスコアリングしたかを示している。免疫組織化学スコアに基づく組織学的悪性度、転移までの時間およびサブタイプも比較のために示している。全７６５人の対象について結果を示す。１５個のサインの平均のランクによって試料を整列する。 図１Ａ～１Ｃは、ＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴの７６５人の対象における以前公開されたサインの性能および比較を示す。図１Ａは、全７６５人の対象における１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての単変量（ＵＶＡ）標準化ハザード比（ＨＲ）を示すフォレストプロットを示す。連続リスクスコアを標準偏差で割って、異なる値の分布を有するスコア間のハザード比を直接比較した。標準偏差で割ると、最大可能ＨＲは２．５である。結果を全対象および遠隔転移エンドポイントについて示す。図１Ｂは、全７６５人の対象における異なるサインについてのピアソン相関および階層的クラスタリングを示す。ＥＲ＋がんを有する乳がん対象において、またはＥＲ＋がんを有する乳がん対象のために開発されたほとんどのサインについて中程度から高い相関が見られる。図１Ｃは、個々の対象の分類での以前公開されたサインの比較を示す。バープロットを着色して、サインにつき対象をどの四分位数にスコアリングしたかを示している。免疫組織化学スコアに基づく組織学的悪性度、転移までの時間およびサブタイプも比較のために示している。全７６５人の対象について結果を示す。１５個のサインの平均のランクによって試料を整列する。 図１Ａ～１Ｃは、ＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴの７６５人の対象における以前公開されたサインの性能および比較を示す。図１Ａは、全７６５人の対象における１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての単変量（ＵＶＡ）標準化ハザード比（ＨＲ）を示すフォレストプロットを示す。連続リスクスコアを標準偏差で割って、異なる値の分布を有するスコア間のハザード比を直接比較した。標準偏差で割ると、最大可能ＨＲは２．５である。結果を全対象および遠隔転移エンドポイントについて示す。図１Ｂは、全７６５人の対象における異なるサインについてのピアソン相関および階層的クラスタリングを示す。ＥＲ＋がんを有する乳がん対象において、またはＥＲ＋がんを有する乳がん対象のために開発されたほとんどのサインについて中程度から高い相関が見られる。図１Ｃは、個々の対象の分類での以前公開されたサインの比較を示す。バープロットを着色して、サインにつき対象をどの四分位数にスコアリングしたかを示している。免疫組織化学スコアに基づく組織学的悪性度、転移までの時間およびサブタイプも比較のために示している。全７６５人の対象について結果を示す。１５個のサインの平均のランクによって試料を整列する。

図２Ａ～２Ｃは、どの対象が最低四分位数のリスクにあるかの分類におけるＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴの７６５人の対象における以前公開されたサインの一致を示す。バープロットは、それぞれの他のサインの最低四分位数にもある、表題サインで最低四分位数に分類された対象の割合を示す。この分析を全７６５人の対象について実施した。 図２Ａ～２Ｃは、どの対象が最低四分位数のリスクにあるかの分類におけるＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴの７６５人の対象における以前公開されたサインの一致を示す。バープロットは、それぞれの他のサインの最低四分位数にもある、表題サインで最低四分位数に分類された対象の割合を示す。この分析を全７６５人の対象について実施した。 図２Ａ～２Ｃは、どの対象が最低四分位数のリスクにあるかの分類におけるＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴの７６５人の対象における以前公開されたサインの一致を示す。バープロットは、それぞれの他のサインの最低四分位数にもある、表題サインで最低四分位数に分類された対象の割合を示す。この分析を全７６５人の対象について実施した。

図３は、ＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する４５４人の閉経後の全身未処置対象における以前公開されたサインの性能を示す。図３は、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する４５４人の閉経後の全身未処置対象についての１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての単変量（ＵＶＡ）標準化ハザード比（ＨＲ）を示すフォレストプロットを示す。連続リスクスコアを標準偏差で割って、異なって分布する値を有するスコア間のハザード比を直接比較した。結果をＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象における遠隔転移エンドポイントについて示す。

図４Ａ～４Ｃは、ＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する４５４人の閉経後の全身未処置対象における以前公開されたサインの性能を示す。図４Ａ～４Ｃは、１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについて、ＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴコホートのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する、全身治療を受けなかった４５４人の閉経後対象における転移についてのカプラン・マイヤープロットを示す。 図４Ａ～４Ｃは、ＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する４５４人の閉経後の全身未処置対象における以前公開されたサインの性能を示す。図４Ａ～４Ｃは、１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについて、ＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴコホートのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する、全身治療を受けなかった４５４人の閉経後対象における転移についてのカプラン・マイヤープロットを示す。 図４Ａ～４Ｃは、ＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する４５４人の閉経後の全身未処置対象における以前公開されたサインの性能を示す。図４Ａ～４Ｃは、１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについて、ＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴコホートのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する、全身治療を受けなかった４５４人の閉経後対象における転移についてのカプラン・マイヤープロットを示す。

図５Ａおよび５Ｂは、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象における平均ゲノムリスクおよびＭＥＴ１４１についてのカプラン・マイヤー生存分析を示す。平均ゲノムリスク（図５Ａ）およびＭＥＴ１４１サイン（図５Ｂ）についてのＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴコホートのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する、全身治療を受けなかった４５４人の閉経後対象における転移についてのカプラン・マイヤープロット。 図５Ａおよび５Ｂは、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象における平均ゲノムリスクおよびＭＥＴ１４１についてのカプラン・マイヤー生存分析を示す。平均ゲノムリスク（図５Ａ）およびＭＥＴ１４１サイン（図５Ｂ）についてのＳｗｅＢＣＧ ９１－ＲＴコホートのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する、全身治療を受けなかった４５４人の閉経後対象における転移についてのカプラン・マイヤープロット。

図６Ａおよび６Ｂは、ｒｅａｃｔｏｍｅ経路分析を示す。細胞周期、ＤＮＡ複製および遺伝子転写経路が以前公開されたサイン（図６Ａ）およびＭＥＴ１４１サイン（図６Ｂ）についての遺伝子リストで過剰発現されていることを示すｒｅａｃｔｏｍｅ分析経路プロット。この分析は、ＭＥＴ１４１が、主として以前のサインと同じ経路を捕捉することを示している。 図６Ａおよび６Ｂは、ｒｅａｃｔｏｍｅ経路分析を示す。細胞周期、ＤＮＡ複製および遺伝子転写経路が以前公開されたサイン（図６Ａ）およびＭＥＴ１４１サイン（図６Ｂ）についての遺伝子リストで過剰発現されていることを示すｒｅａｃｔｏｍｅ分析経路プロット。この分析は、ＭＥＴ１４１が、主として以前のサインと同じ経路を捕捉することを示している。

対象のフローチャート。遺伝子発現分析および最終サブグループ分析に含まれるＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴ腫瘍試料を示すフローチャート。

図８Ａ～８Ｃは、全対象、転移エンドポイントについてのカプラン・マイヤー生存分析を示す。１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての、完全ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴコホートにおける転移までの時間を示すカプラン・マイヤープロット。 図８Ａ～８Ｃは、全対象、転移エンドポイントについてのカプラン・マイヤー生存分析を示す。１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての、完全ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴコホートにおける転移までの時間を示すカプラン・マイヤープロット。 図８Ａ～８Ｃは、全対象、転移エンドポイントについてのカプラン・マイヤー生存分析を示す。１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての、完全ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴコホートにおける転移までの時間を示すカプラン・マイヤープロット。

図９は、単変量ハザード比、全対象および乳がん特異的生存エンドポイントについてのフォレストプロットを示す。エンドポイント乳がん特異的生存についての１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての単変量（ＵＶＡ）標準化ハザード比（ＨＲ）を示すフォレストプロット。スコアを標準偏差で割って、異なる範囲値を有するスコア間で比較をした。結果を全対象について示す。

図１０Ａ～１０Ｃは、全対象、ＢＣＳＳエンドポイントについてのカプラン・マイヤー生存分析を示す。１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての、完全ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴコホートにおける乳がん特異的生存を示すカプラン・マイヤープロット。 図１０Ａ～１０Ｃは、全対象、ＢＣＳＳエンドポイントについてのカプラン・マイヤー生存分析を示す。１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての、完全ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴコホートにおける乳がん特異的生存を示すカプラン・マイヤープロット。 図１０Ａ～１０Ｃは、全対象、ＢＣＳＳエンドポイントについてのカプラン・マイヤー生存分析を示す。１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての、完全ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴコホートにおける乳がん特異的生存を示すカプラン・マイヤープロット。

図１１Ａ～１１Ｃは、１５個のサイン、全対象、転移エンドポイントについての経時的なＡＵＣを示す。異なる時点についての受信者操作特性（ＲＯＣ）分析における曲線下面積（ＡＵＣ）。経時的な性能の明確な減少がほとんどのサインについて見られ、これらが概して早期再発を予測するのがより得意であることを示している。 図１１Ａ～１１Ｃは、１５個のサイン、全対象、転移エンドポイントについての経時的なＡＵＣを示す。異なる時点についての受信者操作特性（ＲＯＣ）分析における曲線下面積（ＡＵＣ）。経時的な性能の明確な減少がほとんどのサインについて見られ、これらが概して早期再発を予測するのがより得意であることを示している。 図１１Ａ～１１Ｃは、１５個のサイン、全対象、転移エンドポイントについての経時的なＡＵＣを示す。異なる時点についての受信者操作特性（ＲＯＣ）分析における曲線下面積（ＡＵＣ）。経時的な性能の明確な減少がほとんどのサインについて見られ、これらが概して早期再発を予測するのがより得意であることを示している。

図１２は、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象についての単変量ハザード比、乳がん特異的生存についてのフォレストプロットを示す。エンドポイント乳がん特異的生存についての１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについての単変量（ＵＶＡ）標準化ハザード比（ＨＲ）を示すフォレストプロット。スコアを標準偏差で割って、異なる範囲値を有するスコア間で比較した。結果を、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する４５４人の閉経後の全身未処置対象について示す。

図１３Ａ～１３Ｃは、カプラン・マイヤー生存分析、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象、乳がん特異的生存を示す。１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについて、ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴコホートのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する、全身治療を受けなかった４５４人の閉経後対象における乳がん特異的生存を示すカプラン・マイヤープロット。 図１３Ａ～１３Ｃは、カプラン・マイヤー生存分析、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象、乳がん特異的生存を示す。１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについて、ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴコホートのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する、全身治療を受けなかった４５４人の閉経後対象における乳がん特異的生存を示すカプラン・マイヤープロット。 図１３Ａ～１３Ｃは、カプラン・マイヤー生存分析、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象、乳がん特異的生存を示す。１５個の以前公開された遺伝子サインのそれぞれについて、ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴコホートのＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する、全身治療を受けなかった４５４人の閉経後対象における乳がん特異的生存を示すカプラン・マイヤープロット。

図１４Ａ～１４Ｃは、１５個のサイン、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象、転移エンドポイントについての経時的なＡＵＣを示す。異なる時点についての受信者操作特性（ＲＯＣ）分析における曲線下面積（ＡＵＣ）。経時的な性能の明確な減少がほとんどのサインについて見られ、これらが概して早期再発を予測するのがより得意であることを意味している。 図１４Ａ～１４Ｃは、１５個のサイン、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象、転移エンドポイントについての経時的なＡＵＣを示す。異なる時点についての受信者操作特性（ＲＯＣ）分析における曲線下面積（ＡＵＣ）。経時的な性能の明確な減少がほとんどのサインについて見られ、これらが概して早期再発を予測するのがより得意であることを意味している。 図１４Ａ～１４Ｃは、１５個のサイン、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象、転移エンドポイントについての経時的なＡＵＣを示す。異なる時点についての受信者操作特性（ＲＯＣ）分析における曲線下面積（ＡＵＣ）。経時的な性能の明確な減少がほとんどのサインについて見られ、これらが概して早期再発を予測するのがより得意であることを意味している。

図１５Ａ～１５Ｃは、対象を低リスクとして分類することにおける一致の比較を示す。どの対象が最低四分位数のリスクにあるか分類することにおけるサインの一致。バープロットは、それぞれの他のサインの最低四分位数にもある、表題サインで最低四分位数に分類された対象の割合を示す。この分析を、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象について実施する。 図１５Ａ～１５Ｃは、対象を低リスクとして分類することにおける一致の比較を示す。どの対象が最低四分位数のリスクにあるか分類することにおけるサインの一致。バープロットは、それぞれの他のサインの最低四分位数にもある、表題サインで最低四分位数に分類された対象の割合を示す。この分析を、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象について実施する。 図１５Ａ～１５Ｃは、対象を低リスクとして分類することにおける一致の比較を示す。どの対象が最低四分位数のリスクにあるか分類することにおけるサインの一致。バープロットは、それぞれの他のサインの最低四分位数にもある、表題サインで最低四分位数に分類された対象の割合を示す。この分析を、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有する閉経後の全身未処置対象について実施する。

本発明は、複数の標的の発現ベースの分析を使用した、対象の乳がんの状態または転帰を診断、予測および／または監視するためのシステムおよび方法を開示する。概して、本方法は、（ａ）対象からの試料を適宜用意することと；（ｂ）試料における複数の標的についての発現レベルをアッセイすることと；（ｃ）複数の標的の発現レベルに基づいて、乳がんの状態または転帰を診断、予測および／または監視することとを含む。

試料における複数の標的についての発現レベルをアッセイすることは、試料をマイクロアレイに適用することを含み得る。いくつかの例では、発現レベルをアッセイすることが、アルゴリズムの使用を含み得る。アルゴリズムを使用して分類器を作成することができる。あるいは、分類器はプローブ選択領域を含み得る。いくつかの例では、複数の標的についての発現レベルをアッセイすることが、複数の標的を検出および／または定量することを含む。いくつかの実施形態では、複数の標的についての発現レベルをアッセイすることが、複数の標的を配列決定することを含む。いくつかの実施形態では、複数の標的についての発現レベルをアッセイすることが、複数の標的を増幅することを含む。いくつかの実施形態では、複数の標的についての発現レベルをアッセイすることが、複数の標的を定量することを含む。いくつかの実施形態では、複数の標的についての発現レベルをアッセイすることが、複数の標的で多重化反応を行うことを含む。

対象が乳がんの再発リスクが低いかどうかを判定する方法が、本明細書でさらに開示される。概して、本方法は、（ａ）対象からの乳がん細胞を含む試料を用意することと；（ｂ）試料における複数の標的についての発現レベルをアッセイすることと；（ｃ）複数の標的の発現レベルに基づいて、対象が乳がんの再発のリスクが低いかどうか、および対象を補助化学療法および内分泌療法で処置するか否かを判定することとを含む。例えば、乳がんの再発リスクが低いと特定された対象は補助化学療法または内分泌療法による処置を免れ得るが、乳がんの再発リスクがより高いと特定された対象は補助化学療法および内分泌療法を投与され得る。

本発明をさらに詳細に説明する前に、このような方法、組成物、物品または機械は当然変化し得るので、本発明は記載される特定の方法、組成物、物品または機械に限定されないことを理解すべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解すべきである。

標的
いくつかの例では、複数の遺伝子の発現レベルをアッセイすることが、複数の標的分析物を検出および／または定量することを含む。いくつかの実施形態では、複数の遺伝子の発現レベルをアッセイすることが、複数の標的核酸を配列決定することを含む。いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカー遺伝子の発現レベルをアッセイすることが、複数の標的核酸を増幅することを含む。いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカー遺伝子の発現レベルをアッセイすることが、複数の標的分析物で多重化反応を行うことを含む。

本明細書に開示される方法は、通常、複数の標的の発現レベルをアッセイすることを含む。複数の標的は、タンパク質コード遺伝子または非タンパク質コード遺伝子のコード標的および／または非コード標的を含み得る。タンパク質コード遺伝子構造は、エクソンおよびイントロンを含み得る。エクソンは、コード配列（ＣＤＳ）および非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含み得る。タンパク質コード遺伝子は転写されてプレｍＲＮＡをもたらし得、プレｍＲＮＡはプロセシングされて成熟ｍＲＮＡをもたらし得る。成熟ｍＲＮＡは翻訳されてタンパク質をもたらし得る。

非タンパク質コード遺伝子構造は、エクソンおよびイントロンを含み得る。通常、非タンパク質コード遺伝子のエクソン領域は主にＵＴＲを含有する。非タンパク質コード遺伝子は転写されてプレｍＲＮＡをもたらし得、プレｍＲＮＡはプロセシングされて非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）をもたらし得る。

コード標的は、エクソンのコード配列を含み得る。非コード標的は、エクソンのＵＴＲ配列、イントロン配列、遺伝子間配列、プロモーター配列、非コード転写物、ＣＤＳアンチセンス、イントロンアンチセンス、ＵＴＲアンチセンスまたは非コード転写物アンチセンスを含み得る。非コード転写物は、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を含み得る。

いくつかの例では、複数の標的が、表２から選択される１つまたは複数の標的を含む。いくつかの例では、複数の標的が、表２から選択される少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、または少なくとも約５０個の標的を含む。

いくつかの実施形態では、複数の標的が、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＦメンバー１（ＡＢＣＦ１）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ＡＣＡＴ２）、アクチン様６Ａ（ＡＣＴＬ６Ａ）、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒サブユニット３Ｂ（ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ）、抗サイレンシング機能１Ｂヒストンシャペロン（ＡＳＦ１Ｂ）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、ガンマポリペプチド１（ＡＴＰ５Ｃ１）、ビスチン様（ＢＹＳＬ）、１番染色体オープンリーディングフレーム１０６（Ｃ１ｏｒｆ１０６）、細胞分裂周期２５Ｂ（ＣＤＣ２５Ｂ）、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）、クロマチンライセンス化ＤＮＡ複製因子１（ＣＤＴ１）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質ガンマ（ＣＥＢＰＧ）、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）、クロマチンアセンブリー因子１サブユニットＡ（ＣＨＡＦ１Ａ）、クロマチンアセンブリー因子１サブユニットＢ（ＣＨＡＦ１Ｂ）、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）、サイトカイン誘導アポトーシス阻害剤１（ＣＩＡＰＩＮ１）、細胞骨格関連タンパク質２（ＣＫＡＰ２）、ＣＴＰシンターゼ１（ＣＴＰＳ１）、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ベータ（ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｅ２Ｆ転写因子８（Ｅ２Ｆ８）、エモパミル結合タンパク質（ステロールイソメラーゼ）（ＥＢＰ）、真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質１（ＥＩＦ４ＥＢＰ１）、ＥＲ膜タンパク質複合体サブユニット８（ＥＭＣ８）、配列類似性のあるファミリー９６メンバーＢ（ＦＡＭ９６Ｂ）、ファンコニ貧血相補群Ａ（ＦＡＮＣＡ）、Ｆボックスタンパク質５（ＦＢＸＯ５）、グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、グリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）、ジェミニン、ＤＮＡ複製阻害剤（ＧＭＮＮ）、Ｇタンパク質シグナル伝達モジュレーター２（ＧＰＳＭ２）、ＧＴＰ結合タンパク質４（ＧＴＰＢＰ４）、肝癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、血液および神経発現１（ＨＮ１）、熱ショックタンパク質ファミリーＡ（Ｈｓｐ７０）メンバー１４（ＨＳＰＡ１４）、熱ショックタンパク質ファミリーＤ（Ｈｓｐ６０）メンバー１（ＨＳＰＤ１）、イノシトールモノホスファターゼ２（ＩＭＰＡ２）、インターロイキン１受容体関連キナーゼ１（ＩＲＡＫ１）、リジル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＫＡＲＳ）、動原体関連１（ＫＮＴＣ１）、ＬＤＬ受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、ミニ染色体維持複合体成分５（ＭＣＭ５）、ミニ染色体維持複合体成分７（ＭＣＭ７）、ＭＩＳ１８動原体タンパク質Ａ（ＭＩＳ１８Ａ）、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｌ１５（ＭＲＰＬ１５）、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｓ１７（ＭＲＰＳ１７）、ミトコンドリア転写終結因子３（ＭＴＥＲＦ３）、核プレラミンＡ認識因子（ＮＡＲＦ）、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＤ２（ＮＣＡＰＤ２）、非ＳＭＣコンデンシンＩＩ複合体サブユニットＤ３（ＮＣＡＰＤ３）、ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼサブユニットＡ９（ＮＤＵＦＡ９）、核エンベロープ膜内在性タンパク質１（ＮＥＭＰ１）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ヌクレオシドジホスファターゼキナーゼ１（ＮＭＥ１）、ＮＯＰ２核小体タンパク質（ＮＯＰ２）、ヌクレオポリン２０５（ＮＵＰ２０５）、複製開始点認識複合体サブユニット１（ＯＲＣ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（リポアミド）アルファ１（ＰＤＨＡ１）、プレニル（デカプレニル）二リン酸シンターゼサブユニット１（ＰＤＳＳ１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、ポロ様キナーゼ４（ＰＬＫ４）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、ＤＮＡポリメラーゼアルファ２、アクセサリーサブユニット（ＰＯＬＡ２）、プロテインホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）、ペロキシレドキシン４（ＰＲＤＸ４）、プロテアソームサブユニットベータ４（ＰＳＭＢ４）、プロテアソームサブユニットベータ５（ＰＳＭＢ５）、プロテアソーム２６Ｓサブユニット、非ＡＴＰアーゼ１４（ＰＳＭＤ１４）、プロテアソーム２６Ｓサブユニット、非ＡＴＰアーゼ２（ＰＳＭＤ２）、プロテアソームアセンブリーシャペロン１（ＰＳＭＧ１）、ホスファチジルセリンシンターゼ１（ＰＴＤＳＳ１）、ＲＡＤ５１リコンビナーゼ（ＲＡＤ５１）、ＲＡＤ５４ホモログＢ（出芽酵母）（ＲＡＤ５４Ｂ）、ＲＡＤ５４様（出芽酵母）（ＲＡＤ５４Ｌ）、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）、核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドＡ（ＳＮＲＰＡ１）、核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）、ＳＰＣ２５、ＮＤＣ８０動原体複合体成分（ＳＰＣ２５）、ＳＲＳＦプロテインキナーゼ１（ＳＲＰＫ１）、ストレス誘導リンタンパク質１（ＳＴＩＰ１）、トランスフォーミング酸性コイルド－コイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）、転写伸長因子Ｂサブユニット１（ＴＣＥＢ１）、膜貫通タンパク質９７（ＴＭＥＭ９７）、トポイソメラーゼ（ＤＮＡ）ＩＩアルファ（ＴＯＰ２Ａ）、トポイソメラーゼ（ＤＮＡ）ＩＩ結合タンパク質１（ＴＯＰＢＰ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ１（ＴＰＩ１）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）およびチロシン３－モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５－モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質ゼータ（ＹＷＨＡＺ）からなる群から選択される。

いくつかの例では、複数の標的が、コード標的、非コード標的またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの例では、コード標的がエクソン配列を含む。他の例では、非コード標的が非エクソン配列またはエクソン配列を含む。あるいは、非コード標的が、ＵＴＲ配列、イントロン配列、アンチセンスまたは非コードＲＮＡ転写物を含む。いくつかの例では、非コード標的が、ＵＴＲ配列またはイントロン配列と部分的に重複する配列を含む。非コード標的はまた、非エクソン転写物および／またはエクソン転写物を含む。エクソン配列は、エクソン、ＵＴＲまたはその一部などのタンパク質コード遺伝子上の領域を含み得る。非エクソン配列は、タンパク質コード遺伝子、非タンパク質コード遺伝子またはその一部上の領域を含み得る。例えば、非エクソン配列は、イントロン領域、プロモーター領域、遺伝子間領域、非コード転写物、エクソンアンチセンス領域、イントロンアンチセンス領域、ＵＴＲアンチセンス領域、非コード転写物アンチセンス領域またはその一部を含み得る。他の例では、複数の標的が非コードＲＮＡ転写物を含む。

複数の標的は、本明細書に開示される分類器から選択される１つまたは複数の標的を含み得る。分類器は、１つまたは複数のモデルまたはアルゴリズムから作成され得る。１つまたは複数のモデルまたはアルゴリズムは、ナイーブベイズ（ＮＢ）、再帰分割（Ｒｐａｒｔ）、ランダムフォレスト（ＲＦ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ｋ近傍法（ＫＮＮ）、高次元判別分析（ＨＤＤＡ）、線形モデルまたはこれらの組み合わせであり得る。分類器は０．６０以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．６１以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．６２以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．６３以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．６４以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．６５以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．６６以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．６７以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．６８以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．６９以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．７０以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．７５以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．７７以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．７８以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．７９以上のＡＵＣを有し得る。分類器は０．８０以上のＡＵＣを有し得る。ＡＵＣは、９５％信頼区間（ＣＩ）に基づいて臨床的に有意であり得る。分類器の精度は少なくとも約７０％であり得る。分類器の精度は少なくとも約７３％であり得る。分類器の精度は少なくとも約７５％であり得る。分類器の精度は少なくとも約７７％であり得る。分類器の精度は少なくとも約８０％であり得る。分類器の精度は少なくとも約８３％であり得る。分類器の精度は少なくとも約８４％であり得る。分類器の精度は少なくとも約８６％であり得る。分類器の精度は少なくとも約８８％であり得る。分類器の精度は少なくとも約９０％であり得る。分類器のｐ値は０．０５以下であり得る。分類器のｐ値は０．０４以下であり得る。分類器のｐ値は０．０３以下であり得る。分類器のｐ値は０．０２以下であり得る。分類器のｐ値は０．０１以下であり得る。分類器のｐ値は０．００８以下であり得る。分類器のｐ値は０．００６以下であり得る。分類器のｐ値は０．００４以下であり得る。分類器のｐ値は０．００２以下であり得る。分類器のｐ値は０．００１以下であり得る。

複数の標的は、ランダムフォレスト（ＲＦ）分類器から選択される１つまたは複数の標的を含み得る。複数の標的は、ランダムフォレスト（ＲＦ）分類器から選択される２個以上の標的を含み得る。複数の標的は、ランダムフォレスト（ＲＦ）分類器から選択される３個以上の標的を含み得る。複数の標的は、ランダムフォレスト（ＲＦ）分類器から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはそれより多い標的を含み得る。ＲＦ分類器はＲＦ２およびＲＦ３、またはＲＦ４分類器であり得る。ＲＦ分類器はＲＦ２２分類器（例えば、２２個の標的を含むランダムフォレスト分類器）であり得る。例えば、本発明のＲＦ分類器は、表２から選択される２個以上の標的を含み得る。

複数の標的は、ＳＶＭ分類器から選択される１つまたは複数の標的を含み得る。複数の標的は、ＳＶＭ分類器から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多い標的を含み得る。複数の標的は、ＳＶＭ分類器から選択される１２個、１３個、１４個、１５個、１７個、２０個、２２個、２５個、２７個、３０個またはそれより多い標的を含み得る。複数の標的は、ＳＶＭ分類器から選択される３２個、３５個、３７個、４０個、４３個、４５個、４７個、５０個、５３個、５５個、５７個、６０個またはそれより多い標的を含み得る。ＳＶＭ分類器はＳＶＭ２分類器であり得る。本発明のＳＶＭ分類器は、表２から選択される２個以上の標的を含み得る。

複数の標的は、ＫＮＮ分類器から選択される１つまたは複数の標的を含み得る。複数の標的は、ＫＮＮ分類器から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多い標的を含み得る。複数の標的は、ＫＮＮ分類器から選択される１２個、１３個、１４個、１５個、１７個、２０個、２２個、２５個、２７個、３０個またはそれより多い標的を含み得る。複数の標的は、ＫＮＮ分類器から選択される３２個、３５個、３７個、４０個、４３個、４５個、４７個、５０個、５３個、５５個、５７個、６０個またはそれより多い標的を含み得る。複数の標的は、ＫＮＮ分類器から選択される６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個またはそれより多い標的を含み得る。例えば、本発明のＫＮＮ分類器は、表２から選択される２個以上の標的を含み得る。

複数の標的は、ナイーブベイズ（ＮＢ）分類器から選択される１つまたは複数の標的を含み得る。複数の標的は、ＮＢ分類器から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多い標的を含み得る。複数の標的は、ＮＢ分類器から選択される１２個、１３個、１４個、１５個、１７個、２０個、２２個、２５個、２７個、３０個またはそれより多い標的を含み得る。複数の標的は、ＮＢ分類器から選択される３２個、３５個、３７個、４０個、４３個、４５個、４７個、５０個、５３個、５５個、５７個、６０個またはそれより多い標的を含み得る。複数の標的は、ＮＢ分類器から選択される６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個またはそれより多い標的を含み得る。例えば、本発明のＮＢ分類器は、表２から選択される２個以上の標的を含み得る。

複数の標的は、再帰分割（Ｒｐａｒｔ）分類器から選択される１つまたは複数の標的を含み得る。複数の標的は、Ｒｐａｒｔ分類器から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多い標的を含み得る。複数の標的は、Ｒｐａｒｔ分類器から選択される１２個、１３個、１４個、１５個、１７個、２０個、２２個、２５個、２７個、３０個またはそれより多い標的を含み得る。複数の標的は、Ｒｐａｒｔ分類器から選択される３２個、３５個、３７個、４０個、４３個、４５個、４７個、５０個、５３個、５５個、５７個、６０個またはそれより多い標的を含み得る。複数の標的は、Ｒｐａｒｔ分類器から選択される６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個またはそれより多い標的を含み得る。例えば、本発明のＲｐａｒｔ分類器は、表２から選択される２個以上の標的を含み得る。

複数の標的は、高次元判別分析（ＨＤＤＡ）分類器から選択される１つまたは複数の標的を含み得る。複数の標的は、高次元判別分析（ＨＤＤＡ）分類器から選択される２個以上の標的を含み得る。複数の標的は、高次元判別分析（ＨＤＤＡ）分類器から選択される３個以上の標的を含み得る。複数の標的は、高次元判別分析（ＨＤＤＡ）分類器から選択される５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個またはそれより多い標的を含み得る。例えば、本発明のＲｐａｒｔ分類器は、表２から選択される２個以上の標的を含み得る。

プローブ／プライマー
本発明は、複数のプローブを含む、対象の乳がんの状態または転帰を診断、監視および／または予測するためのプローブセットであって、（ｉ）セット中のプローブは、少なくとも１つの標的の発現レベルを検出することができ；（ｉｉ）発現レベルは、少なくとも約４０％の特異度で対象のがん状態（例えば、再発リスク）を判定する、プローブセットを提供する。

プローブセットは、１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブを含み得る。個々のポリヌクレオチドプローブは、標的配列またはその相補配列のヌクレオチド配列から誘導されるヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、標的配列に対応する、または相補配列に相補的であるように設計される。ポリヌクレオチドプローブは、ストリンジェントまたは低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、標的配列、またはその相補配列、またはそこから誘導される核酸配列（ｃＤＮＡなど）の領域に特異的にハイブリダイズすることができる。

ポリヌクレオチドプローブ配列の選択およびその一意性の決定は、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＵｎｉＧｅｎｅ、ｄｂＥＳＴまたはＮＣＢＩの非冗長データベースなどの遺伝子配列データベースに対する当のポリヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ検索に基づいて、当技術分野で公知の技術を使用してインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で行われ得る。本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドプローブが、プローブセットの標的配列から誘導される標的ｍＲＮＡの領域に相補的である。コンピュータプログラムを使用して、クロスハイブリダイズすることができず、非特異的にハイブリダイズすることもできないプローブ配列を選択することもできる。

いくつかの例では、乳がん組織試料から抽出され、増幅されたＲＮＡのマイクロアレイハイブリダイゼーションによって、その後要約され、ｆＲＭＡ技術によって正規化されるデータセットが得られ得る。クロスハイブリダイズＰＳＲ、および４個未満のプローブを含有するＰＳＲを除去（またはフィルタリング）した後、残っているＰＳＲをさらなる分析に使用することができる。ｆＲＭＡおよびフィルタリング後、データをその主成分に分解し、分散モデルの分析を使用して、バッチ効果が最初の１０個の主成分中に存在したままである程度を決定する。

次いで、これらの残っているＰＳＲを、ＣＲ（臨床的再発）試料と非ＣＲ試料との間のＴ検定によるフィルタリングに供することができる。０．０１のｐ値カットオフを使用して、残っている特徴（例えば、ＰＳＲ）をさらに精査することができる。ｅｌａｓｔｉｃ－ｎｅｔペナルティを使用して、規則化ロジスティック回帰によって特徴選択を実施することができる。全トレーニングデータを使用して１０００回にわたって規則化回帰をブートストラップすることができる；ブートストラップの各反復により、３倍交差検証後に非ゼロ係数を有する特徴を作表することができる。いくつかの例では、総実行数の少なくとも２５％で選択された特徴をモデル構築に使用した。

本発明のポリヌクレオチドプローブは、長さが約１５ヌクレオチド～コード標的または非コード標的の完全長に及び得る。本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドプローブが、少なくとも約１５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブが少なくとも約２０ヌクレオチド長である。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドプローブが少なくとも約２５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブが約１５ヌクレオチド長～約５００ヌクレオチド長の間である。他の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブが、約１５ヌクレオチド長～約４５０ヌクレオチド長の間、約１５ヌクレオチド長～約４００ヌクレオチド長の間、約１５ヌクレオチド長～約３５０ヌクレオチド長の間、約１５ヌクレオチド長～約３００ヌクレオチド長の間、約１５ヌクレオチド長～約２５０ヌクレオチド長の間、約１５ヌクレオチド長～約２００ヌクレオチド長の間である。いくつかの実施形態では、プローブが少なくとも１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プローブが少なくとも１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プローブが、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも２５ヌクレオチド長、少なくとも５０ヌクレオチド長、少なくとも７５ヌクレオチド長、少なくとも１００ヌクレオチド長、少なくとも１２５ヌクレオチド長、少なくとも１５０ヌクレオチド長、少なくとも２００ヌクレオチド長、少なくとも２２５ヌクレオチド長、少なくとも２５０ヌクレオチド長、少なくとも２７５ヌクレオチド長、少なくとも３００ヌクレオチド長、少なくとも３２５ヌクレオチド長、少なくとも３５０ヌクレオチド長、少なくとも３７５ヌクレオチド長である。

プローブセットのポリヌクレオチドプローブは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはＤＮＡ模倣物、またはこれらの組み合わせを含むことができ、一本鎖または二本鎖であることができる。よって、ポリヌクレオチドプローブは、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合ヌクレオシド間（骨格）結合、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するポリヌクレオチドプローブで構成され得る。このような改変または置換ポリヌクレオチドプローブは、例えば、標的遺伝子に対する増強した親和性および増加した安定性などの望ましい特性を提供し得る。プローブセットは、コード標的および／または非コード標的を含み得る。好ましくは、プローブセットは、コード標的と非コード標的の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、プローブセットが、少なくとも約５個のコード標的および／または非コード標的にハイブリダイズする複数の標的配列を含む。あるいは、プローブセットが、少なくとも約１０個のコード標的および／または非コード標的にハイブリダイズする複数の標的配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットが、少なくとも約１５個のコード標的および／または非コード標的にハイブリダイズする複数の標的配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットが、少なくとも約２０個のコード標的および／または非コード標的にハイブリダイズする複数の標的配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットが、少なくとも約３０個のコード標的および／または非コード標的にハイブリダイズする複数の標的配列を含む。

本発明のシステムはさらに、プローブセットによって定義される標的配列、またはその断片もしくは部分配列もしくは相補配列を増幅することができるプライマーおよびプライマーペアを提供する。プローブセットのヌクレオチド配列は、インシリコ適用のためのコンピュータ読み取り可能な媒体で、およびプローブセットの１つまたは複数の標的配列を増幅するための適切なプライマーの設計のための基礎として提供され得る。

標的配列のヌクレオチド配列に基づくプライマーは、標的配列の増幅に使用するために設計され得る。ＰＣＲなどの増幅反応に使用するために、プライマーのペアを使用することができる。プライマー配列の正確な組成は本発明にとって重大ではないが、ほとんどの適用について、プライマーは、当技術分野で知られているように、ストリンジェント条件下、特に高ストリンジェンシーの条件下でプローブセットの特異的配列にハイブリダイズし得る。プライマーのペアは通常、少なくとも約５０ヌクレオチド、さらに通常は少なくとも約１００ヌクレオチドの増幅産物をもたらすように選択される。プライマー配列を選択するためのアルゴリズムは、一般的に知られており、市販のソフトウェアパッケージで入手可能である。これらのプライマーを標準的な定量的または定性的ＰＣＲベースのアッセイに使用して、プローブセットによって定義されるＲＮＡの転写物発現レベルを評価することができる。あるいは、これらのプライマーを分子ビーコンなどのプローブと組み合わせて、リアルタイムＰＣＲを使用する増幅に使用することができる。

一実施形態では、プライマーまたはプライマーペアが、増幅反応に使用される場合、標的（もしくは本明細書に示されるそのサブグループ）の核酸配列の少なくとも一部、そのＲＮＡ形態、またはそのいずれかに対する相補配列を特異的に増幅する。

標識をプローブまたはプライマーポリヌクレオチドに結合させるかまたは組み込んで、目的の標的配列を表す標的ポリヌクレオチドの検出および／または定量を可能にしてもよい。標的ポリヌクレオチドは発現される標的配列ＲＮＡ自体、そのｃＤＮＡコピー、またはそこから誘導される増幅産物であり得、使用されるアッセイで特異的に検出され得る限り、プラス鎖であってもマイナス鎖であってもよい。同様に、抗体を標識してもよい。

特定の多重フォーマットでは、異なる標的を検出するために使用される標識が識別可能であり得る。標識は、直接（例えば、共有結合を介して）または間接的に、例えば、架橋分子もしくは一連の分子（例えば、アッセイ成分に結合することができる分子もしくは複合体、またはアッセイ成分に組み込むことができる結合ペアのメンバー、例えばビオチン－アビジンもしくはストレプトアビジンを介して）結合することができる。多くの標識はこのようなコンジュゲーション（例えばアミンアシル化を通して）に容易に使用することができる活性化形態で商業的に入手可能である、または標識は、その多くが当技術分野で公知である、公知のもしくは決定可能なコンジュゲーションスキームを通して結合することができる。

本明細書に記載される本発明で有用な標識には、目的の生体分子に結合するまたは組み込まれると検出することができる任意の物質が含まれる。光学、分光学、電気的、圧電、磁気、ラマン散乱、表面プラズモン共鳴、比色、熱量測定などを含む任意の有効な検出方法を使用することができる。標識は、典型的には発色団、ルミフォア（ｌｕｍｉｐｈｏｒｅ）、フルオロフォア、消光系の１つのメンバー、色素原、ハプテン、抗原、磁気粒子、非線形光学を示す材料、半導体ナノ結晶、金属ナノ粒子、酵素、抗体またはその結合部分もしくは等価物、アプタマー、および結合ペアの１つのメンバー、ならびにこれらの組み合わせから選択される。標的に結合して、フルオロフォアからのシグナルを導入するまたは消光すると、光学パラメータの変化が起こるように、消光ペアのメンバーとしての消光剤およびフルオロフォアがプローブ上で使用され得る消光スキームが使用され得る。このような系の一例は分子ビーコンである。適切な消光剤／フルオロフォア系は当技術分野で公知である。標識は種々の中間結合を通して結合され得る。例えば、ポリヌクレオチドはビオチン結合種を含むことができ、光学的に検出可能な標識をビオチンにコンジュゲートし、次いで、標識されたポリヌクレオチドに結合することができる。同様に、ポリヌクレオチドセンサーは、抗体または断片などの免疫学的種を含むことができ、光学的に検出可能な標識を含有する二次抗体を添加することができる。

本明細書に記載される方法で有用な発色団には、エネルギーを吸収して発光することができる任意の物質が含まれる。多重化アッセイのために、複数の異なるシグナル伝達発色団を検出可能に異なる発光スペクトルと共に使用することができる。発色団はルモフォア（ｌｕｍｏｐｈｏｒｅ）またはフルオロフォアであり得る。典型的なフルオロフォアには、蛍光色素、半導体ナノ結晶、ランタニドキレート、ポリヌクレオチド特異的色素および緑色蛍光タンパク質が含まれる。

いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドが、標的の核酸配列またはその相補配列の少なくとも２０個の連続塩基を含む。ポリヌクレオチドは、標的の核酸配列の少なくとも２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２７個、３０個、３２個、３５個、４０個、４５個、５０個またはそれより多い連続塩基を含み得る。

ポリヌクレオチドは、固体として、溶液で、またはアレイで、を含む種々のフォーマットで提供され得る。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに化学的および／または酵素的に組み込まれ得る１つまたは複数の標識を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１つまたは複数のポリヌクレオチドが、基質上に提供され得る。基質は、生物学的、非生物学的、有機、無機またはこれらのいずれかの組み合わせの広範囲の材料を含むことができる。例えば、基質は、重合ラングミュア・ブロジェット膜、官能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ_２、ＳｉＮ_４、変性ケイ素、または（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、架橋ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチドコグリコリド）、ポリ無水物、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（エチレン－コ－酢酸ビニル）、ポリシロキサン、ケイ酸ポリマー、ラテックス、デキストランポリマー、エポキシド、ポリカーボネートなどの多種多様なゲルもしくはポリマーのいずれか１つ、またはこれらの組み合わせであり得る。導電性ポリマーおよび光伝導性材料を使用することができる。

基質は、アレイ、光ダイオード、光電子半導体チップもしくは光電子薄膜半導体などの光電子センサー、またはバイオチップの形をとることができる。基質上のプローブの位置はアドレス可能であり得る；これは高密度フォーマットで行うことができ、位置はマイクロアドレス可能（ｍｉｃｒｏａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）またはナノアドレス可能（ｎａｎｏａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）であり得る。

診断試料
乳がん細胞を含有する生体試料を、がんの処置を必要とする対象から回収して、発現レベルまたは発現プロファイルに基づいて、対象が、がん再発のリスクが低く、補助化学療法および内分泌療法による処置を免れることができるかどうかを評価する。本発明のシステムおよび方法で使用するための診断試料は、ＲＮＡ発現情報を提供するのに適した核酸を含む。原則として、発現されるＲＮＡが得られ、標的遺伝子発現について分析される生体試料は、がん性乳房組織または細胞を含む疑いがある任意の材料であり得る。診断試料は、本発明の方法に直接使用される生体試料であり得る。あるいは、診断試料は、生体試料から調製される試料であり得る。

一実施形態では、がん性組織または細胞を含むまたは含む疑いがある試料または試料の一部が、細胞、組織、または体液を含む液体を含む、生体材料の任意の供給源であり得る。試料の供給源の非限定的な例としては、吸引液、針生検、細胞診ペレット、例えば外科手術または剖検によって得られるバルク組織調製物またはその切片、リンパ液、血液、血漿、血清、腫瘍および器官が挙げられる。いくつかの実施形態では、試料が乳房腫瘍生検由来のものである。

試料は、公知のおよび文章化された医学的転帰を有するアーカイブ試料であってもよいし、またはその最終的な医学的転帰がまだ知られていない現在の対象からの試料であってもよい。

いくつかの実施形態では、試料が分子分析前に解剖され得る。試料は、バルク腫瘍標本もしくはその一部のマクロ解剖（ｍａｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）を介して調製されてもよいし、または顕微解剖、例えばレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（Ｌａｓｅｒ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）（ＬＣＭ）を介して処理されてもよい。

試料は最初に、新鮮な組織、新鮮な凍結組織、細針生検として、種々の状態で提供されてもよく、固定されてもよいし、固定されなくてもよい。しばしば、医学実験室は、日常的に、医学試料を組織の保存を容易にする固定状態で調製する。種々の固定液を使用して、組織を固定して、細胞の形態を安定化することができ、これらの固定液は単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用され得る。例示的な固定液には、架橋剤、アルコール、アセトン、ブアン固定液、ツェンカー液、Ｈｅｌｙ液、オスミウム酸溶液およびカルノア液が含まれる。

架橋固定液は、２つ以上の共有結合を形成するのに適した任意の薬剤、例えばアルデヒドを含むことができる。固定に典型的に使用されるアルデヒド源には、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはホルマリンが含まれる。好ましくは、架橋剤が、その天然形態でまたはパラホルムアルデヒドもしくはホルマリンの形態で含まれ得るホルムアルデヒドを含む。当業者であれば、架橋固定液が使用されている試料については、例えば加熱工程およびプロテイナーゼ－ｋ消化を含む特別な調製工程が必要となり得ることを理解するだろう；方法を参照されたい。

１つまたは複数のアルコールを、単独でまたは他の固定液と組み合わせて使用して組織を固定してもよい。固定に使用される例示的なアルコールには、メタノール、エタノールおよびイソプロパノールが含まれる。

ホルマリン固定が医学実験室で頻繁に使用される。ホルマリンは、アルコール、典型的にはメタノールとホルムアルデヒドの両方を含み、これらの両方が作用して生体試料を固定することができる。

固定されているか固定されていないかにかかわらず、生体試料を包埋剤に包埋してもよい。組織学で使用される例示的な包埋剤には、パラフィン、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）Ｖ．Ｉ．Ｐ、Ｐａｒａｍａｔ、Ｐａｒａｍａｔ Ｅｘｔｒａ、Ｐａｒａｐｌａｓｔ、Ｐａｒａｐｌａｓｔ Ｘ－ｔｒａ、Ｐａｒａｐｌａｓｔ Ｐｌｕｓ、Ｐｅｅｌ Ａｗａｙ Ｐａｒａｆｆｉｎ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ Ｗａｘ、Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ Ｗａｘ、Ｃａｒｂｏｗａｘ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ、Ｐｏｌｙｆｉｎ、Ｔｉｓｓｕｅ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ＴＦＭＦＭ、Ｃｒｙｏ－ＧｅｆおよびＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）が含まれる。分子分析の前に、包埋剤を、当技術分野で公知の任意の適切な技術を介して除去することができる。例えば、試料をワックスに包埋する場合、有機溶媒、例えばキシレンによる抽出によって包埋剤を除去することができる。組織から包埋剤を除去するためのキットは商業的に入手可能である。試料またはその切片を必要に応じてさらなる処理工程、例えば連続的水和または脱水工程に供することができる。

いくつかの実施形態では、試料が、固定ワックス包埋生体試料である。しばしば、医学実験室の試料は、固定ワックス包埋試料として、最も一般定にはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織として提供される。

生体試料の供給源が何であっても、最終的にアッセイされる標的ポリヌクレオチドは合成的に調製することができるが（制御配列の場合）、典型的には、生物源から精製され、１つまたは複数の調製工程に供される。ＲＮＡを精製して、生体試料からの１つまたは複数の不要な成分を除去するもしくは減少させる、またはＲＮＡを濃縮することができる。逆に、ＲＮＡが特定のアッセイにとって濃縮されすぎている場合、これを希釈することができる。

ＲＮＡ抽出
ＲＮＡは任意の適切な技術を使用して生体試料から抽出および精製することができる。いくつかの技術が当技術分野で公知であり、いくつかが商業的に入手可能である（例えば、ＦｏｒｍａＰｕｒｅ核酸抽出キット、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）。ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して凍結組織切片から抽出し、ＲＮｅａｓｙ Ｐｒｏｔｅｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製することができる。ＲＮＡを、ＤＮＡｓｅ Ｉ処理（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用してさらに精製して、汚染ＤＮＡを排除することができる。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＤＥ）を使用してＲＮＡ濃縮を行うことができる。冷酢酸ナトリウム沈殿によって、ＲＮＡをさらに精製して、ｃＤＮＡ合成を妨害する汚染物質を排除することができる。電気泳動図を実行することによってＲＮＡ完全性を評価することができ、ＲＮＡ ６０００ ＰｉｃｏＡｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、ＲＮＡ完全性番号（ＲＩＮ、ｍＲＮＡの無損傷を示す相関尺度）を決定することができる。

キット
所望の方法を実施するためのキットも提供され、キットの成分を保持するための容器またはハウジングと、１つまたは複数の核酸を含有する１つまたは複数の容器と、適宜、１つまたは複数の試薬を含有する１つまたは複数の容器とを含む。試薬には、上記の組成物のセクションに記載されるもの、および増幅試薬を含む、記載される方法を実施するのに有用な試薬が含まれ、１つまたは複数プローブ、プライマーまたはプライマーペア、酵素（ポリメラーゼおよびリガーゼを含む）、インターカレート色素、標識プローブ、および増幅産物に組み込むことができる標識が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、キットが、本明細書に記載される標的配列のサブセットおよび組み合わせに特異的なプライマーまたはプライマーペアを含む。プライマーまたはプライマーのペアは、標的配列を選択的に増幅するのに適している。キットは、１つまたは複数の標的を選択的に増幅するのに適した少なくとも２個、３個、４個または５個のプライマーまたはプライマーのペアを含み得る。キットは、１つまたは複数の標的を選択的に増幅するのに適した少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個またはそれより多いプライマーまたはプライマーのペアを含み得る。

いくつかの実施形態では、キットのプライマーまたはプライマーペアが、増幅反応に使用される場合、本明細書に記載される非コード標的、コード標的、エクソンまたは非エクソン標的、表２から選択される標的に対応する核酸配列、そのＲＮＡ形態、またはそのいずれかの相補配列を特異的に増幅する。キットは、対応する複数の異なる本明細書に記載される非コード標的、コード標的、エクソンまたは非エクソン転写物、表２から選択される標的に対応する核酸配列、そのＲＮＡ形態、またはその相補配列を特異的に増幅することができる複数のこのようなプライマーまたはプライマーペアを含み得る。１つまたは複数の標的を選択的に増幅するのに適した少なくとも２個、３個、４個または５個のプライマーまたはプライマーのペアをキット形態で提供することができる。いくつかの実施形態では、キットが、１つまたは複数の標的を増幅するのに適した５～５０個のプライマーまたはプライマーのペアを含む。

試薬は独立に、液体形態または固体形態であり得る。試薬は混合物で提供され得る。対照試料および／または核酸がキットで提供されてもよい。対照試料には、疾患の証拠を示さない対象由来の腫瘍試料から得られるかまたはこれを表す組織および／または核酸、ならびに全身がんを発症している対象由来の腫瘍試料から得られるかまたはこれを表す組織および／または核酸が含まれ得る。

核酸はアレイフォーマットで提供され得、よって、アレイまたはマイクロアレイがキットに含まれ得る。キットは、がん対象の疾患転帰を予後判定するのに使用するため、および／または処置様式を指示するために政府機関によって認可され得る。

本発明の１つまたは複数の方法を実施するためのキットを使用するための説明書が容器に提供され得、任意の固定の媒体で提供され得る。説明書は、容器もしくはハウジングの内側もしくは外側に位置し得る、および／またはその任意の面の内部もしくは外部に印刷され得る。キットは、発現される標的遺伝子を表す１つまたは複数の異なる標的ポリヌクレオチドを同時に検出および／または定量するための多重形態であり得る。

増幅およびハイブリダイゼーション
試料回収および核酸抽出後、目的の標的ポリヌクレオチドを調製するために使用されるかまたは使用することができるＲＮＡを含む試料の核酸部分を、１つまたは複数の調製反応に供することができる。これらの調製反応は、インビトロ転写（ＩＶＴ）、標識、断片化、増幅および他の反応を含むことができる。検出、定量および／または増幅前に、ｍＲＮＡを最初に逆転写酵素およびプライマーで処理してｃＤＮＡを作り出すことができる；これはインビトロで精製ｍＲＮＡを使用して、またはインサイチューで、例えばスライドに取り付けられた細胞もしくは組織で行うことができる。

「増幅」とは、核酸、この場合、発現されるＲＮＡの少なくとも１つのコピーを産生する任意の過程を意味し、多くの場合、複数のコピーが産生される。増幅産物はＲＮＡまたはＤＮＡであり得、発現される標的配列の相補鎖を含み得る。ＤＮＡ増幅産物は、最初に逆翻訳を通して、次いで、適宜、さらなる増幅反応から産生され得る。増幅産物は、標的配列の全部または一部を含み、標識されてもよい。ポリメラーゼベースの方法およびライゲーションベースの方法を含む種々の増幅方法が使用するのに適している。例示的な増幅技術には、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、リパーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、リボザイムベースの方法、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、Ｑ Ｂｅｔａレプリカ―ゼの使用、逆転写、ニックトランスレーションなどが含まれる。

不斉増幅反応を使用して、標的ポリヌクレオチドとしての検出に使用される標的配列を表す１本の鎖を優先的に増幅することができる。いくつかの場合、増幅産物自体の存在および／または量を使用して、所与の標的配列の発現レベルを決定することができる。他の例では、増幅産物を使用して、センサーポリヌクレオチドを含むアレイまたは他の基質にハイブリダイズさせ、これらを使用して標的配列発現を検出および／または定量することができる。

ポリメラーゼベースの方法における増幅の最初のサイクルは、典型的には鋳型鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成する。鋳型が一本鎖ＲＮＡである場合、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを最初の増幅に使用して、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、追加の増幅サイクルを実施して、プライマー伸長産物をコピーすることができる。ＰＣＲ用のプライマーは当然、増幅可能なセグメントを産生することができる対応する鋳型中の領域にハイブリダイズするように設計されなければならない；よって、各プライマーは、その３’ヌクレオチドが、ＰＣＲで相補鋳型鎖を複製するために使用されるプライマーの３’ヌクレオチドから３’に位置する相補鋳型鎖のヌクレオチドと対形成するようにハイブリダイズしなければならない。

標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の鎖を、プライマー、およびプライマーを伸長し、標的ポリヌクレオチドをコピーするのに適した活性を有するポリメラーゼと接触させて、完全長相補ポリヌクレオチドまたはそのより小さな部分を産生することによって増幅することができる。ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、２種以上のポリメラーゼまたは酵素活性を有する酵素を含む、標的ポリヌクレオチドをコピーすることができるポリメラーゼ活性を有する任意の酵素を使用することができる。酵素は熱不安定性であっても熱安定性であってもよい。酵素の混合物も使用することができる。例示的な酵素には、ＤＮＡポリメラーゼＩ（「Ｐｏｌ Ｉ」）、Ｐｏｌ ＩのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４、Ｔ７、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）Ｔ７、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）バージョン２．０ Ｔ７、Ｔｕｂ、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｐｆｉｃ、Ｐｆｕ、Ｔｓｐ、Ｔｆｌ、Ｔｌｉおよびパイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種ＧＢ－Ｄ ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）、ＳＰ６、Ｔ３およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ；ならびにＡＭＶ、Ｍ－ＭｕＬＶ、ＭＭＬＶ、ＲＮＡｓｅ Ｈ ＭＭＬＶ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標））、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、ＨＩＶ－１およびＲＡＶ２逆転写酵素などの逆転写酵素が含まれる。これらの酵素の全てが商業的に入手可能である。複数の特異性を有する例示的なポリメラーゼには、ＲＡＶ２およびＴｌｉ（エキソ－）ポリメラーゼが含まれる。例示的な熱安定性ポリメラーゼには、Ｔｕｂ、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｐｆｉｃ、Ｐｆｕ、Ｔｓｐ、Ｔｆ１、Ｔｌｉおよびパイロコッカス属種ＧＢ－Ｄ ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。

ｐＨ、緩衝液、イオン強度、１つまたは複数の塩の存在および濃度、ヌクレオチドおよびマグネシウムおよび／または他の金属イオン（例えば、マンガン）などの反応物質および補因子の存在および濃度、任意の共溶媒、温度、ポリメラーゼ連鎖反応を含む増幅スキームについての熱サイクルプロファイルを含む適切な反応条件は、標的ポリヌクレオチドの増幅を可能にするように選択され、部分的には、使用されるポリメラーゼならびに試料の性質に依存し得る。共溶媒には、ホルムアミド（典型的には、約２～約１０％）、グリセロール（典型的には、約５～約１０％）、およびＤＭＳＯ（典型的には、約０．９～約１０％）が含まれる。偽陽性または増幅中に産生される人工産物の産生を最小化するための技術が増幅スキームに使用され得る。これらには、「タッチダウン」ＰＣＲ、ホットスタート技術、ネステッドプライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）の使用、またはＰＣＲプライマーがプライマーダイマー形成のイベントでステムループ構造を形成し、よって、増幅されないようにＰＣＲプライマーを設計することが含まれる。ＰＣＲを加速させる技術、例えば、試料内のより大きな対流を可能にし、試料の急速な加熱および冷却のための赤外線加熱工程を含む遠心ＰＣＲを使用することができる。１つまたは複数の増幅サイクルを実施することができる。過剰な１つのプライマーを使用してＰＣＲ中に過剰な１つのプライマー伸長産物を産生することができる；好ましくは、過剰に産生されたプライマー伸長産物が、検出される増幅産物である。複数の異なるプライマーを使用して、試料内の異なる標的ポリヌクレオチドまたは特定の標的ポリヌクレオチドの異なる領域を増幅することができる。

増幅反応は、標識されていてもよいセンサーポリヌクレオチドが増幅サイクルの少なくとも一部の間に増幅産物にハイブリダイズすることを可能にする条件下で実施することができる。アッセイをこの方法で実施する場合、このハイブリダイゼーションイベントのリアルタイム検出を、当技術分野で公知のように、増幅中の発光または蛍光を監視することによって行うことができる。

増幅産物をアレイまたはマイクロアレイとのハイブリダイゼーションに使用する場合、いくつかの適切な商業的に入手可能な増幅産物が利用可能である。これらには、単独でまたは組み合わせた、ＷＴ－ＯｖａｔｉｏｎＴｍ Ｓｙｓｔｅｍ、ＷＴ－ＯｖａｔｉｏｎＴｍ Ｓｙｓｔｅｍ ｖ２、ＷＴ－ＯｖａｔｉｏｎＴｍ Ｐｉｃｏ Ｓｙｓｔｅｍ、ＷＴ－ＯｖａｔｉｏｎＴｍ ＦＦＰＥ Ｅｘｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ、ＷＴ－ＯｖａｔｉｏｎＴｍ ＦＦＰＥ Ｅｘｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ ＲｉｂｏＡｍｐを含むＮｕＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ ＣＡ）から入手可能な増幅キット、およびＲｉｂｏＡｍｐ^Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（以前はＡｒｃｔｕｒｕｓ）（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、ＲａｍｐＵｐ Ｐｌｕｓ ａｎｄ ＳｅｎｓｅＡｍｐ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを含むＧｅｎｉｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）から入手可能な増幅キットが含まれる。増幅された核酸を、例えば磁気ビーズ（例えば、ＲＮＡＣ１ｅａｎ磁気ビーズ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、増幅および標識後に、１つまたは複数の精製反応に供することができる。

ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６００またはＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｅｐｈｅｉｄ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、ＡＢＩ ７９００ ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）、ｘＭＡＰ １００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ） Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ（ＢｉｏＴｒｏｖｅ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）およびＢｅａｄＸｐｒｅｓｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）などのリアルタイム定量多重ＲＴ－ＰＣＲプラットフォームおよび他の多重化技術を使用して、複数のＲＮＡバイオマーカーを分析することができる。

標的遺伝子の検出および／または定量
原則として、コードされる標的遺伝子の発現を検出および／または定量する任意の方法を本発明で使用することができる。発現される標的遺伝子を、直接検出および／または定量することができる、あるいはコピーおよび／または増幅して、発現される標的遺伝子の増幅されたコピーの検出を可能にしてもよい。

標的遺伝子を検出および／または定量する方法は、ノーザンブロット法、配列決定、アレイまたはマイクロアレイハイブリダイゼーション、特異的構造の酵素的切断（例えば、Ｃｌａｒｉｏｍ Ｓアッセイ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ、Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、例えば米国特許第５，８４６，７１７号、同第６，０９０，５４３号；同第６，００１，５６７号；同第５，９８５，５５７号；および同第５，９９４，０６９号に記載される）および増幅法、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．、例えば米国特許第５，９６２，２３３号および同第５，５３８，８４８号に記載される）を含むＲＴ－ＰＣＲを含むことができ、定量的であっても半定量的であってもよく、入手可能な生体試料の起源、量および状態に応じて変化し得る。これらの方法の組み合わせを使用してもよい。例えば、核酸を増幅し、標識し、マイクロアレイ分析に供することができる。標的遺伝子を検出および／または定量する方法は、マイクロアレイハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｌａｒｉｏｍ Ｓアッセイ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したアノテーション付加遺伝子の遺伝子レベル発現分析を含むことができる。

いくつかの例では、標的遺伝子が配列決定によって検出され得る。配列決定法は、全ゲノム配列決定またはエクソーム配列決定を含み得る。Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ、連鎖停止反応またはハイスループットシステムなどの配列決定法を使用してもよい。追加の適切な配列決定技術には、標識ターミネーターまたはプライマーおよびスラブまたはキャピラリーでのゲル分離を使用する古典的なジデオキシ配列決定反応（サンガー法）、可逆的停止標識ヌクレオチドを使用した合成による配列決定、パイロシーケンシング、４５４配列決定、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーとのアレル特異的ハイブリダイゼーション、標識クローンのライブラリーとのアレル特異的ハイブリダイゼーション、引き続いてライゲーションを使用した合成による配列決定、重合工程中の標識ヌクレオチドの取り込みのリアルタイムモニタリング、およびＳＯＬｉＤ配列決定が含まれる。

標的遺伝子を検出および／または定量する追加の方法には、一分子シーケンシング（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓ、ＰａｃＢｉｏ）、合成による配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）、ライゲーションによる配列決定（例えば、ＡＢＩ ＳＯＬＩＤ）、ハイブリダイゼーションによる配列決定（例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、インサイチューハイブリダイゼーション、ビーズアレイ技術（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＣｈｉｐｓ）、分岐ＤＮＡ技術（例えば、Ｐａｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）が含まれる。配列決定法は、ヌクレオチドを検出する蛍光（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）または電子（例えば、Ｉｒｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）法を使用し得る。

ＱＲＴ－ＰＣＲ分析のための逆転写
逆転写は当技術分野で公知の任意の方法によって実施することができる。例えば、ＲＴ－ＰＣＲのためにＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して逆転写を実施することができる。標的遺伝子の検出の感度を増加させ、標的特異的ｃＤＮＡを作製するために、標的特異的プライミングを実施することができる。

ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現分析
１ｎｇの全ＲＮＡに相当する標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを含む５１．１１容量でＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ（ＡＢＩ）７９００ＨＴ機器を使用して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ－ＰＣＲを実施することができる。

ＴａｑＭａｎ分析用のプライマーおよびプローブ濃縮物を添加して、９５℃で１０分間を１サイクル、９５℃で２０秒間および６０℃で４５秒間を４０サイクルなどのＰＣＲサイクル条件を使用して蛍光アンプリコンを増幅する。参照試料をアッセイして、試薬およびプロセスの安定性を保証することができる。陰性対照（例えば、鋳型なし）をアッセイして、任意の外因性核酸汚染を監視すべきである。

分類アレイ
本発明は、プローブセットまたはそこから得られるプローブがアレイフォーマットで提供され得ることを企図する。本発明の文脈において、「アレイ」は、ポリヌクレオチドプローブの空間的にまたは論理的に組織化された集合である。コード標的、非コード標的またはこれらの組み合わせに特異的なプローブを含むアレイを使用することができる。あるいは、２つ以上の標的の転写物またはその誘導される産物に特異的なプローブを含むアレイを使用することができる。望ましくは、アレイが、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個またはそれより多い標的遺伝子の転写物に特異的であり得る。これらの遺伝子の発現を単独でまたは他の転写物と組み合わせて検出することができる。いくつかの実施形態では、適切な制御配列と合わせて、乳房特異的発現産物の広範囲のセンサープローブを含むアレイが使用される。いくつかの例では、アレイが、Ｈｕｍａｎ Ｅｘｏｎ １．０ ＳＴ Ａｒｒａｙ（ＨｕＥｘ １．０ＳＴ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ．）を含み得る。

典型的には、ポリヌクレオチドプローブが、固体基質に結合され、それぞれの位置（基質上の）および素性が分かるように整列される。ポリヌクレオチドプローブを、アレイの使用に必要な試薬および条件に耐えることができる種々の固体基質の１つに結合することができる。例としては、それだけに限らないが、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレンおよびポリスチレンなどのポリマー；セラミック；ケイ素；二酸化ケイ素；変性ケイ素；（融解）シリカ、石英またはガラス；官能化ガラス；濾紙などの紙；ジアゾ化セルロース；ニトロセルロース繊維；ナイロン膜；ならびにポリアクリルアミドゲルパッドが挙げられる。光学的検出を伴うアッセイに使用され得るアレイには透光性の基質が有用である。

アレイフォーマットの例としては、膜またはフィルタアレイ（例えば、ニトロセルロース、ナイロンアレイ）、プレートアレイ（例えば、２４ウェル、９６ウェル、２５６ウェル、３８４ウェル、８６４ウェルまたは１５３６ウェルなどのマルチウェル、マイクロタイタープレートアレイ）、ピンアレイ、およびビーズアレイ（例えば、液体「スラリー」）が挙げられる。ガラスまたはセラミックスライドなどの基質上のアレイは通常、チップアレイまたは「チップ」と呼ばれる。このようなアレイは当技術分野で周知である。本発明の一実施形態では、Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｒｒａｙがチップである。

データ分析
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のパターン認識法を、標的遺伝子の発現レベルの分析に使用することができる。パターン認識法は、発現レベルの線形結合または発現レベルの非線形結合を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物の発現測定値またはＲＮＡ転写物レベルの組み合わせが線形または非線形のモデルまたはアルゴリズムに定式化され（例えば「発現サイン」）、尤度スコアに変換される。この尤度スコアは、生体試料が、疾患の証拠を示し得ない、全身がんを示し得る、または生化学的再発を示し得る対象由来のものである確率を示す。尤度スコアを使用して、これらの疾患状態を識別することができる。モデルおよび／またはアルゴリズムは、機械読み取り可能なフォーマットで提供することができ、これらを使用して発現レベルもしくは発現プロファイルと疾患状態を相関させる、および／または対象もしくは対象のクラスのための処置様式を指示することができる。

複数の標的遺伝子についての発現レベルをアッセイすることは、アルゴリズムまたは分類器の使用を含み得る。当技術分野で公知の技術を使用して、アレイデータを管理、分類および分析することができる。複数の遺伝子標的についての発現レベルをアッセイすることは、プローブセットモデリングおよびデータ前処理を含み得る。プローブセットモデリングおよびデータ前処理は、Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉ－Ａｒｒａｙ（ＲＭＡ）アルゴリズムまたは変異型ＧＣ－ＲＭＡ、ｆＲＭＡ、Ｐｒｏｂｅ Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｅｒｒｏｒ（ＰＬＩＥＲ）アルゴリズムまたは変異型ｉｔｅｒＰＬＩＥＲを使用して誘導することができる。ＲＭＡアルゴリズムを使用して、例えばそれぞれ、１０未満の標準偏差または正規化データ範囲の１００強度単位未満の平均強度を有する標的遺伝子を除去することによって、分散または強度フィルタを適用してデータを前処理することができる。

あるいは、複数の遺伝子標的についての発現レベルをアッセイすることは、機械学習アルゴリズムの使用を含み得る。機械学習アルゴリズムは、教師あり学習アルゴリズムを含み得る。教師あり学習アルゴリズムの例としては、Ａｖｅｒａｇｅ Ｏｎｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ Ｅｓｔｉｍａｔｏｒｓ（ＡＯＤＥ）、人工ニューラルネットワーク（例えば、バックプロパゲーション）、ベイズ統計学（例えば、ナイーブベイズ分類器、ベイジアンネットワーク、ベイジアンナレッジベース）、事例ベース推論、決定木、帰納論理プログラミング、ガウス過程回帰、データ処理のグループ方式（ＧＭＤＨ）、学習オートマタ、学習ベクトル量子化、最小メッセージ長（決定木、決定グラフなど）、怠惰学習、事例に基づく学習最近傍法、アナロジーモデリング、確率的で近似的に正しい学習（ＰＡＣ）学習、リップルダウンルール、知識獲得方法、シンボリック機械学習アルゴリズム、サブシンボリック機械学習アルゴリズム、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、分類器集合、ブートストラップ・アグリゲーティング（バギング）およびブースティングが挙げられ得る。教師あり学習は、回帰分析および情報ファジィネットワーク（ＩＦＮ）などの順序分類器を含み得る。あるいは、教師あり学習法は、ＡＯＤＥ、線形分類器（例えば、フィッシャーの線形判別、ロジスティック回帰、ナイーブベイズ分類器、パーセプトロン（Ｐｅｒｃｅｐｔｒｏｎ）およびサポートベクターマシン）、二次分類器、ｋ近傍法、ブースティング、決定木（例えば、Ｃ４．５、ランダムフォレスト）、ベイジアンネットワークおよび隠れマルコフモデルなどの統計学的分類を含み得る。

機械学習アルゴリズムは、教師なし学習アルゴリズムも含み得る。教師なし学習アルゴリズムの例としては、人工ニューラルネットワーク、データクラスタリング、期待値最大化アルゴリズム、自己組織化マップ、動径基底関数ネットワーク、ベクトル量子化、生成位相写像、情報ボトルネック法およびＩＢＳＥＡＤが挙げられ得る。教師なし学習はまた、Ａｐｒｉｏｒｉアルゴリズム、ＥｃｌａｔアルゴリズムおよびＦＰ－ｇｒｏｗｔｈアルゴリズムなどの相関ルール学習アルゴリズムも含み得る。単連結クラスタリングおよび概念クラスタリングなどの階層的クラスタリングも使用され得る。あるいは、教師なし学習は、Ｋ平均アルゴリズムおよびファジィクラスタリングなどの分割クラスタリングを含み得る。

いくつかの例では、機械学習アルゴリズムが、強化学習アルゴリズムを含む。強化学習アルゴリズムの例としては、それだけに限らないが、時間的差分学習、Ｑ学習および学習オートマタが挙げられる。あるいは、機械学習アルゴリズムがデータ前処理を含み得る。

好ましくは、機械学習アルゴリズムが、それだけに限らないが、Ａｖｅｒａｇｅ Ｏｎｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ Ｅｓｔｉｍａｔｏｒｓ（ＡＯＤＥ）、フィッシャーの線形判別、ロジスティック回帰、パーセプトロン、多層パーセプトロン、人工ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、二次分類器、ブースティング、決定木、Ｃ４．５、ベイジアンネットワーク、隠れマルコフモデル、高次元判別分析および混合ガウスモデルを含み得る。機械学習アルゴリズムは、サポートベクターマシン、ナイーブベイズ分類器、ｋ近傍法、高次元判別分析または混合ガウスモデルを含み得る。いくつかの例では、機械学習アルゴリズムがランダムフォレストを含む。

サブタイプ分類
分子サブタイプ分類は、乳がんを複数の遺伝的に異なるカテゴリーまたはサブタイプの１つに分類する方法である。各サブタイプは、異なる種類の処置に異なって応答し、特定のサブタイプの存在は、例えば、化学療法抵抗性、より高いもしくはより低い再発リスク、または個体についての良好なもしくは不良な予後を予測する。表２に列挙される複数の遺伝子標的の差次的発現分析は、補助化学療法および内分泌療法による処置を免れ得る、がん再発のリスクが低い対象の特定を可能にする。いくつかの例では、本発明の分子サブタイプ分類法が、乳がんを分析するために、他のバイオマーカー、例えば腫瘍悪性度およびホルモンレベルと組み合わせて使用される。例えば、閉経後の、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）、ヒト上皮増殖因子受容体２陰性（ＨＥＲ２－）乳がんを有する対象は、再発リスクがより低い可能性がより高くなり得る。

治療レジメン
がんの状態または転帰を診断、予測または監視することは、がんを処置すること、またはがん進行を防止することを含み得る。さらに、がんの状態または転帰を診断、予測または監視することは、対象の再発リスクが低いまたは高いことを特定または予測することを含み得る。いくつかの例では、診断、予測または監視することが、治療レジメンを決定することを含み得る。治療レジメンを決定することは、抗がん療法を投与することを含み得る。あるいは、治療レジメンを決定することが、抗がんレジメンを修正、推奨、継続または中止することを含み得る。例えば、本明細書に記載されるように、発現プロファイリングに基づいて、乳がんの再発リスクが低いと判定された対象は、補助化学療法または内分泌療法を免れ得る。いくつかの例では、試料発現パターンが、公知の疾患または疾患転帰についての発現パターンと一致する場合、発現パターンを使用して、１つまたは複数の処置様式（例えば、治療レジメン、抗がんレジメン）を指示することができる。抗がんレジメンは、１つまたは複数の抗がん療法を含み得る。抗がん療法の例としては、ホルモン／内分泌療法、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法／生物学的療法および光線力学療法が挙げられる。

ホルモン療法または内分泌療法は、ホルモン応答性がん細胞の増殖を停止させるかまたはアポトーシスを誘発するために、特定のホルモンのレベルを調節するために、ステロイドホルモンまたはホルモンアンタゴニストなどのホルモンの投与を伴い得る。例えば、乳がんは、それだけに限らないが、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェンおよびフルベストラントなどの選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）で処置され得る。あるいはまたはさらに、それだけに限らないが、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタンおよびアミノグルテチミドを含むアロマターゼ阻害剤などのホルモン合成の阻害剤を使用して乳がんを処置することができる。いくつかの例では、それだけに限らないが、酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲスチンによるホルモン補充が、ホルモン応答性進行乳がんの処置に使用され得る。特に、ＥＲ＋乳がんは、エストロゲン受容体アンタゴニスト（例えば、タモキシフェン）またはアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾールもしくはレトロゾール）などのエストロゲンの産生を遮断する薬物で処置することができる。ホルモン療法はまた、内分泌器官の外科的除去（例えば、精巣摘出術または卵巣摘出術）も含み得る。

外科的腫瘍学は、外科的方法を使用して、がんを診断、ステージ分類および処置し、特定のがん関連症状を軽減する。外科手術を使用して腫瘍を除去する（例えば、摘出、切除、腫瘍減量）、身体の一部を再建する（例えば、修復手術）、および／または疼痛などの症状を軽減する（例えば、緩和手術）ことができる。外科手術はまた凍結手術も含み得る。凍結手術（凍結療法とも呼ばれる）は、液体窒素（またはアルゴンガス）によってもたらされる超低温を使用して異常な組織を破壊し得る。凍結手術を使用して、皮膚上の腫瘍などの外部腫瘍を処置することができる。外部腫瘍については、液体窒素を綿棒または噴霧装置によりがん細胞に直接適用することができる。凍結手術を使用して、体の内側の腫瘍（内部腫瘍および骨内の腫瘍）を処置することもできる。内部腫瘍については、腫瘍と接触して配置されたクライオプローブと呼ばれる中空器具を通して液体窒素またはアルゴンガスを循環させることができる。超音波またはＭＲＩを使用してクライオプローブを導き、細胞の凍結を監視し、よって、近くの健康な組織への損傷を制限することができる。氷晶のボールがプローブの周りに形成し、近くの細胞を凍結し得る。時々、２つ以上のプローブを使用して液体窒素を腫瘍の種々の部分に送達する。プローブを、外科手術中にまたは皮膚を通して（経皮的に）腫瘍に入れることができる。凍結手術後、凍結組織は解凍し、体に自然に吸収され得る（内部腫瘍の場合）、または溶解し、痂皮を形成し得る（外部腫瘍の場合）。

化学療法剤をがんの処置に使用することもできる。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物アルカロイドおよびテルペノイド、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ならびに細胞毒性抗生物質が挙げられる。シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンがアルキル化剤の例である。他のアルキル化剤には、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミドが含まれる。アルキル化剤は、生物学的に重要な分子中のアミノ、カルボキシル、スルフヒドリルおよびホスフェート基と共有結合を形成することによって細胞機能を損ない得る。あるいは、アルキル化剤は、細胞のＤＮＡを化学修飾し得る。

代謝拮抗薬は、化学療法剤の別の例である。代謝拮抗薬は、プリンまたはピリミジンになりすまし、プリンおよびピリミジンが「Ｓ」期（細胞周期の）中にＤＮＡに組み込まれるのを防ぎ、それによって、正常な発達および分裂を停止し得る。代謝拮抗薬はまた、ＲＮＡ合成に影響も及ぼし得る。代謝物の例としては、アザチオプリンおよびメルカプトプリンが挙げられる。

アルカロイドは植物に由来し、細胞分裂を遮断することができ、がんの処置に使用することもできる。アルカロイド（Ａｌｋｙｌｏｉｄｓ）は微小管機能を妨げ得る。アルカロイドの例は、ビンカアルカロイドおよびタキサンである。ビンカアルカロイドは、チューブリンの特定の部位に結合し、チューブリンの微小管へのアセンブリーを阻害し得る（細胞周期のＭ期）。ビンカアルカロイドは、ニチニチソウ（Ｍａｄａｇａｓｃａｒ ｐｅｒｉｗｉｎｋｌｅ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ（以前はビンカ・ロゼア（Ｖｉｎｃａ ｒｏｓｅａ）として知られていた））に由来し得る。ビンカアルカロイドの例としては、それだけに限らないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンまたはビンデシンが挙げられる。タキサンは、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）（イチイ）の植物によって産生されるジテルペンである。タキサンは、天然源に由来してもよいし、人工的に合成されてもよい。タキサンには、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソテール）が含まれる。タキサンは、微小管機能を破壊し得る。微小管は細胞分裂にとって必須であり、タキサンは、微小管内のＧＤＰ結合チューブリンを安定化し、それによって、細胞分裂の過程を阻害し得る。よって、本質的に、タキサンは有糸分裂阻害剤であり得る。タキサンはまた、放射線増感性であり、通常、多数のキラル中心を含有し得る。

代替の化学療法剤には、ポドフィロトキシンが含まれる。ポドフィロトキシンは、消化を助け、エトポシドおよびテニポシドなどの細胞増殖抑制薬を製造するために使用され得る植物由来化合物である。これらは、細胞がＧ１期（ＤＮＡ複製の開始）およびＤＮＡの複製（Ｓ期）に入るのを防ぎ得る。

トポイソメラーゼは、ＤＮＡのトポロジーを維持する必須の酵素である。Ｉ型またはＩＩ型トポイソメラーゼの阻害剤は、適切なＤＮＡスーパーコイル化を覆すことによって、ＤＮＡの転写と複製の両方を妨害し得る。いくつかの化学療法剤がトポイソメラーゼを阻害し得る。例えば、いくつかのＩ型トポイソメラーゼ阻害剤には、カンプトテシン：イリノテカンおよびトポテカンが含まれる。ＩＩ型阻害剤の例としては、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシドおよびテニポシドが挙げられる。

化学療法剤の別の例は、細胞毒性抗生物質である。細胞毒性抗生物質は、抗生物質の一群であり、ＤＮＡ複製および／またはタンパク質合成を妨害し得るので、がんの処置に使用される。細胞毒性抗生物質には、それだけに限らないが、アクチノマイシン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびマイトマイシンが含まれる。

いくつかの例では、抗がん処置が放射線療法を含み得る。放射線は、体の外側の機械から（体外照射療法）またはがん細胞の近くの体内に配置された放射性物質から（内部照射療法、より一般的には近接照射療法）由来し得る。全身放射線療法は、口からまたは静脈中に与えられ、血液に入って体中の組織に移動する放射性物質を使用する。

体外照射療法は、光子ビーム（ｘ線またはガンマ線のいずれか）の形態で送達され得る。光子は、光および他の形態の電磁放射の基本単位である。体外照射療法の例は、三次元原体照射療法（３Ｄ－ＣＲＴ）と呼ばれる。３Ｄ－ＣＲＴは、コンピュータソフトウェアおよび先進的な処理機械を使用して、放射線を極めて正確に形作られた標的領域に送達し得る。多くの他の体外照射療法の方法が現在試験されており、がん処置に使用されている。これらの方法には、それだけに限らないが、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）、画像誘導放射線治療（ＩＧＲＴ）、定位手術的照射（ＳＲＳ）、体幹部定位放射線治療（ＳＢＲＴ）および陽子線治療が含まれる。

強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）は、体外照射の例であり、コリメーターと呼ばれる数百個の極小さな放射線ビーム整形具を使用して、単一線量の放射線を送達し得る。コリメーターは、据え付けであることができる、または処置中に移動して、放射線ビームの強度が処置セッション中に変化することを可能にすることができる。この種の線量調節は、腫瘍または近くの組織の異なる領域が異なる線量の放射線を受けることを可能にする。ＩＭＲＴは、逆に計画される（逆方向治療計画と呼ばれる）。逆方向治療計画では、腫瘍および周囲の組織の異なる領域への放射線量を事前に計画し、次いで、高性能コンピュータプログラムが、放射線処置の必要なビーム数および角度を計算する。対照的に、伝統的な（前方向）治療計画中には、放射線ビームの数および角度を事前に選択し、コンピュータが、どれくらい多くの線量が計画されたビームのそれぞれから送達され得るかを計算する。ＩＭＲＴの目標は、必要とする領域への放射線量を増加させ、周囲の正常組織の特定の感受性領域への放射線曝露を減少させることである。

体外照射の別の例は、画像誘導放射線治療（ＩＧＲＴ）である。ＩＧＲＴでは、処置中に繰り返しのイメージングスキャン（ＣＴ、ＭＲＩまたはＰＥＴ）が実施され得る。これらのイメージングスキャンを、コンピュータによって処理して、処置による腫瘍サイズおよび位置の変化を特定し、必要に応じて処置中に対象の位置または計画された放射線量を調節することを可能にすることができる。繰り返しのイメージングは、放射線処置の精度を増加させ、処置される組織の計画容量の減少を可能にし、それによって、正常な組織への総放射線量を減少させることができる。

トモセラピーは、画像誘導ＩＭＲＴの一種である。トモセラピーの機械は、ＣＴイメージングスキャナーと体外照射療法の機械のハイブリッドである。イメージングと処置の両方のために放射線を送達するトモセラピーの機械の部分は、通常のＣＴスキャナーと同様に対象の周りを完全に回転することができる。トモセラピーの機械は、処置セッション直前の対象の腫瘍のＣＴ像を取得して、極めて正確な腫瘍標的化および正常組織の回避を可能にすることができる。

定位手術的照射（ＳＲＳ）は、１回または複数回の高線量の放射線を小さな腫瘍に送達することができる。ＳＲＳは、極めて正確な画像誘導腫瘍標的化および対象の位置決めに使用する。したがって、正常組織への過剰な損傷なしに高線量の放射線を与えることができる。ＳＲＳを使用して、明確に定義された輪郭を有する小さな腫瘍を処置することができる。これは、脳または脊髄の腫瘍および他のがん型からの脳転移の処置に一般的に使用される。いくつかの脳転移の処置については、対象が、ＳＲＳに加えて、脳全体への放射線療法（全脳照射療法と呼ばれる）を受けることがある。ＳＲＳは、処置中に対象を固定して、確実に高線量の放射線が正確に送達されるようにするためにヘッドフレームまたは他の装置の使用を要する。

体幹部定位放射線治療（ＳＢＲＴ）は、ほとんどの場合で３Ｄ－ＣＲＴより小さな放射線場およびより高い線量を使用して、より少ないセッションで放射線療法を送達する。ＳＢＲＴは、脳および脊髄の外側にある腫瘍を処置することができる。これらの腫瘍は体の通常の運動で移動する可能性がより高く、したがって、脳または脊髄内の腫瘍ほど正確に標的化することができないので、ＳＢＲＴは通常、２回以上の投与で与えられる。ＳＢＲＴを使用して、肺および肝臓のがんを含む小さな、孤立した腫瘍を処置することができる。ＳＢＲＴシステムは、ＣｙｂｅｒＫｎｉｆｅ（登録商標）などのその商品名によって知られ得る。

陽子線治療では、体外照射療法が陽子によって送達され得る。陽子は、荷電粒子の一種である。陽子ビームは、主に生体組織でエネルギーを付与する方法において光子ビームとは異なる。光子は、全て組織を通る経路に沿って小さなパケットでエネルギーを付与するが、陽子は、経路の最後でそのエネルギーの多くを付与し（ブラッグピークと呼ばれる）、途中で少ないエネルギーを付与する。陽子の使用により、正常組織の放射線への曝露を減らし、おそらくより高い線量の放射線の腫瘍への送達を可能にすることができる。

電子ビームなどの他の荷電粒子ビームを使用して、皮膚がんまたは体の表面に近い腫瘍などの表在性腫瘍を照射することができるが、これらは組織を通ってそれほど遠くまで移動することができない。

内部照射療法（近接照射療法）は、体の内部または上に位置する放射線源（放射性物質）から送達される放射線である。いくつかの近接照射療法技術が、がん処置に使用される。組織内近接照射療法は、乳房腫瘍内などの腫瘍内に配置された放射線源を使用し得る。腔内近接照射療法は、腫瘍の近くの胸腔などの外科的腔または体腔内に配置された源を使用し得る。眼の内部の黒色腫を処置するために使用され得る、上強膜近接照射療法は、眼に取り付けられた源を使用し得る。近接照射療法では、放射性同位元素が極小さなペレットまたは「シード」に密封され得る。これらのシードは、針、カテーテルまたはいくつかの他の種類の担体などの送達装置を使用して対象に配置され得る。同位元素は、自然に崩壊するにつれて、近くのがん細胞に損傷を及ぼし得る放射線を放出する。近接照射療法は、正常組織へのより少ない損傷を引き起こしながら、体外照射療法よりも高い線量の放射線をいくつかのがんに送達することができる。

近接照射療法は、低線量率または高線量率処置として与えられ得る。低線量率処置では、がん細胞が、数日間にわたって線源から連続的な低線量放射線を受ける。高線量率処置では、体内に配置された送達管に取り付けられたロボット装置が、１つまたは複数の放射線源を腫瘍内または腫瘍の近くにガイドすることができ、次いで、各処置セッションの最後に線源を除去する。高線量率処置は、１つまたは複数の処置セッションで与えられ得る。高線量率処置の例は、ＭａｍｍｏＳｉｔｅ（登録商標）システムである。近接照射療法を使用して、乳房温存手術を受けた乳がんの対象を処置することができる。

近接照射療法の線源の配置は一時的であっても永続的であってもよい。永続的近接照射療法の場合、線源は、体内に外科的に密封され、放射線の全部が放出された後であっても、そこに残り得る。いくつかの例では、残っている材料（放射性同位元素が密封された）が、対象に不快感も害も引き起こさない。永続的近接照射療法は低線量率近接照射療法の一種である。一時的近接照射療法については、管（カテーテル）または他の担体を使用して放射線源を送達し、担体と放射線源の両方を処置後に除去する。一時的近接照射療法は低線量率処置であっても高線量率処置であってもよい。近接照射療法を、単独で、または体外照射療法に加えて使用して、周囲の正常組織を回避しながら、腫瘍への放射線の「ブースト」を提供することができる。

全身放射線療法では、対象が、放射性ヨウ素またはモノクローナル抗体に結合した放射性物質などの放射性物質を飲み込む、またはその注射を受けることができる。放射性ヨウ素（１３１Ｉ）は、甲状腺がんなどのがんを処置するのを助けるために一般的に使用される全身放射線療法の一種である。甲状腺細胞は、放射性ヨウ素を自然に取り込む。いくつかの他の種類のがんのための全身放射線療法については、モノクローナル抗体が、放射性物質を正しい場所に標的化するのを助け得る。放射性物質に連結された抗体が、血液中を移動し、腫瘍細胞の位置を突き止め、殺傷する。例えば、薬物イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））が、特定の種類のＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の処置に使用され得る。この薬物の抗体部分は、Ｂリンパ球の表面上に見られるタンパク質を認識し、これに結合する。トシツモマブおよびヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））の併用薬物レジメンは、ＮＨＬなどの特定の種類のがんの処置に使用され得る。このレジメンでは、非放射性トシツモマブ抗体を最初に対象に与え、引き続いて１３１Ｉが結合したトシツモマブ抗体による処置を与えることができる。トシツモマブは、イブリツモマブと同じＢリンパ球上のタンパク質を認識し、これに結合することができる。非放射性形態の抗体は、正常なＢリンパ球が１３１Ｉからの放射線によって損傷を受けるのを防ぐのに役立ち得る。

いくつかの全身放射線療法薬物は、骨に広がったがん（骨転移）による疼痛を軽減する。これは緩和的放射線療法の一種である。放射性薬物サマリウム－１５３レキシドロナム（Ｑｕａｄｒａｍｅｔ（登録商標））およびストロンチウム－８９クロリド（Ｍｅｔａｓｔｒｏｎ（登録商標））は、骨転移による疼痛を処置するために使用され得る放射性医薬品の例である。

生物学的療法（時々、免疫療法、生物療法、生物学療法または生体応答調節（ＢＲＭ）療法と呼ばれる）は、体の免疫系を使用して、直接的または間接的に、がんと戦うか、またはいくつかのがん処置によって引き起こされ得る副作用を減らす。生物学的療法には、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、モノクローナル抗体、ワクチン、遺伝子療法および非特異的免疫調節剤が含まれる。

インターフェロン（ＩＦＮ）は、体内で自然に生じるサイトカインの一種である。インターフェロンアルファ、インターフェロンベータおよびインターフェロンガンマは、がん処置に使用され得るインターフェロンの例である。

インターフェロンと同様に、インターロイキン（ＩＬ）は、体内で自然に生じ、実験室で作製することができるサイトカインである。多くのインターロイキンが、がんを処置するために特定されている。例えば、インターロイキン－２（ＩＬ－２またはアルデスロイキン）、インターロイキン７およびインターロイキン１２は、抗がん処置として使用され得る。ＩＬ－２は、がん細胞を破壊することができるリンパ球などの多くの免疫細胞の増殖および活性を刺激し得る。インターロイキンを使用して、白血病、リンパ腫、ならびに脳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、腎臓がんおよび前立腺がんを含むいくつかのがんを処置することができる。

コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（時々、造血成長因子と呼ばれる）も、がんの処置に使用され得る。ＣＳＦのいくつかの例としては、それだけに限らないが、Ｇ－ＣＳＦ（フィルグラスチム）およびＧＭ－ＣＳＦ（サルグラモスチム）が挙げられる。ＣＳＦは、骨髄幹細胞の分裂、ならびにその白血球、血小板および赤血球への発達を促進し得る。骨髄は、全ての血球の源であるので、体の免疫系にとって重要である。抗がん薬は、体が白血球、赤血球および血小板を作る能力に損傷を及ぼし得るので、ＣＳＦによる免疫系の刺激は、他の抗がん処置を受けている対象に役立つことができ、よって、ＣＳＦを化学療法などの他の抗がん療法と組み合わせることができる。ＣＳＦを使用して、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、ならびに脳、肺、食道、乳房、子宮、卵巣、前立腺、腎臓、結腸および直腸のがんを処置することができる。

別の種類の生物学的療法には、モノクローナル抗体（ＭＯＡＢまたはＭｏＡＢ）が含まれる。これらの抗体は、単一種類の細胞によって産生され得、特定の抗原に特異的であり得る。ＭＯＡＢを作製するために、ヒトがん細胞をマウスに注射することができる。これに応じて、マウス免疫系が、これらのがん細胞に対する抗体を産生することができる。抗体を産生するマウス形質細胞を単離し、実験室で増殖した細胞と融合して、ハイブリドーマと呼ばれる「ハイブリッド」細胞を作製することができる。ハイブリドーマは、大量のこれらの純粋な抗体またはＭＯＡＢを無制限に産生することができる。ＭＯＡＢはいくつかの方法でがん処置に使用され得る。例えば、特定の種類のがんと反応するＭＯＡＢは、がんに対する対象の免疫応答を増強し得る。ＭＯＡＢを細胞増殖因子に対して作用するようにプログラムすることができ、このようにして、がん細胞の増殖を妨害する。

ＭＯＡＢを、化学療法剤、放射性同位体（放射性物質）、他の生物学的療法または他の毒素などの抗がん療法と連結してもよい。抗体が、がん細胞に付着すると、これらの抗がん療法を直接腫瘍に送達し、これを破壊するのを助ける。放射性同位体を有するＭＯＡＢはまた、結腸直腸、卵巣、前立腺および乳房などの特定のがんを診断するのに有用であると分かり得る。

Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）は、生物学的療法として使用され得るＭＯＡＢの例である。Ｒｉｔｕｘａｎは、非ホジキンリンパ腫の処置に使用され得る。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを使用して、過剰量のＨＥＲ２と呼ばれるタンパク質を産生する腫瘍を有する対象の転移性乳がんを処置することができる。あるいは、ＭＯＡＢを使用して、リンパ腫、白血病、黒色腫、ならびに脳、乳房、肺、腎臓、結腸、直腸、卵巣、前立腺および他の領域のがんを処置することができる。

がんワクチンは、生物学的療法の別の形態である。がんワクチンは、対象の免疫系が、がん細胞を認識するよう促すように設計され得る。がんワクチンは、既存のがんを処置する（治療ワクチン）またはがんの発症を予防する（予防ワクチン）ように設計され得る。治療ワクチンは、がんと診断された後の人に注射することができる。これらのワクチンは、既存の腫瘍の成長を停止させる、がんが再発するのを防ぐ、または前の処置によって殺傷されなかったがんを排除することができる。腫瘍が小さい時に与えられるがんワクチンは、がんを根絶することができる。他方、予防ワクチンは、がんを発症する前の健康な個体に与えられる。これらのワクチンは、免疫系を刺激して、がんを引き起こし得るウイルスを攻撃するように設計される。これらのがんを引き起こすウイルスを標的化することによって、特定のがんの発症が予防され得る。例えば、サーバリックス（ｃｅｒｖａｒｉｘ）およびガーダシル（ｇａｒｄａｓｉｌ）は、ヒトパピローマウイルスを処置するワクチンであり、子宮頸がんを予防し得る。治療ワクチンを使用して、黒色腫、リンパ腫、白血病、ならびに脳、乳房、肺、腎臓、卵巣、前立腺、膵臓、結腸および直腸のがんを処置することができる。がんワクチンは他の抗がん療法と組み合わせて使用することができる。

遺伝子療法は、生物学的療法の別の例である。遺伝子療法は、遺伝物質を人の細胞に導入して疾患と戦うことを伴い得る。遺伝子療法は、がんに対する対象の免疫応答を改善し得る。例えば、遺伝子を免疫細胞に挿入して、がん細胞を認識し、これを攻撃する能力を増強することができる。別のアプローチでは、がん細胞にサイトカインを産生させ、免疫系を刺激する遺伝子を注射することができる。

いくつかの例では、生物学的療法が非特異的免疫調節剤を含む。非特異的免疫調節剤は、免疫系を刺激するか、または間接的に増強する物質である。通常、これらの薬剤は、重要な免疫系細胞を標的化し、サイトカインおよび免疫グロブリンの産生増加などの二次応答を引き起こし得る。がん処置に使用される２つの非特異的免疫調節剤は、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）およびレバミソールである。ＢＣＧは、外科手術後の表在性膀胱がんの処置に使用され得る。ＢＣＧは、炎症応答、およびおそらくは免疫応答を刺激することによって作用し得る。ＢＣＧの溶液を膀胱に滴下注入することができる。レバミソールは時々、外科手術後のＩＩＩ期（デュークスのＣ）結腸がんの処置においてフルオロウラシル（５－ＦＵ）化学療法と一緒に使用される。レバミソールは、抑制された免疫機能を回復するように作用し得る。

光線力学療法（ＰＤＴ）は、光増感剤または光感作性薬剤と呼ばれる薬物、および特定の種類の光を使用し得る抗がん処置である。光増感剤は、特定の波長の光に曝露されると、近くの細胞を殺傷するある形態の酸素を産生し得る。光増感剤は、特定の波長の光によって活性化され得る。この波長は、光がどれくらい体内を移動することができるかを決定する。よって、光増感剤および光の波長を使用して、ＰＤＴにより体の異なる領域を処置することができる。

がん処置のためのＰＤＴの第１の工程では、光感作性薬剤を血流中に注射することができる。薬剤は体中の細胞によって吸収され得るが、正常細胞よりも長くがん細胞にとどまり得る。薬剤のほとんどが正常細胞を出るが、がん細胞中には残る、注射のおよそ２４～７２時間後、腫瘍を光に曝露することができる。腫瘍中の光増感剤は、光を吸収することができ、近くのがん細胞を破壊する活性形態の酸素を産生する。がん細胞を直接殺傷することに加えて、ＰＤＴは、２つの他の方法で腫瘍を縮小するかまたは破壊し得る。光増感剤は、腫瘍内の血管に損傷を与え、それによって、がんが必要な栄養素を受けるのを防ぐことができる。ＰＤＴはまた、免疫系を活性化して腫瘍細胞を攻撃することもできる。

ＰＤＴに使用される光は、レーザーまたは他の源から由来し得る。レーザー光を、光ファイバーケーブル（光を透過させる薄いファイバー）を通して誘導して、光を体内の領域に送達することができる。例えば、光ファイバーケーブルを、内視鏡（体内の組織を見るために使用される薄い照光式チューブ）を通して肺または食道に挿入して、これらの器官内のがんを処置することができる。他の光源には、皮膚がんなどの表面腫瘍に使用され得る発光ダイオード（ＬＥＤ）が含まれる。ＰＤＴは通常、対象外（ｏｕｔｓｕｂｊｅｃｔ）手法として実施される。ＰＤＴは繰り返すこともでき、外科手術、放射線または化学療法などの他の療法と共に使用することもできる。

体外循環光療法（ＥＣＰ）は、対象の血球を回収するために機械が使用され得るＰＤＴの一種である。対象の血球を、体外で、光感作性薬剤によって処置し、光に曝露し、次いで、対象に戻すことができる。ＥＣＰを使用して、他の療法に応答しなかった皮膚Ｔ細胞リンパ腫の皮膚症状の重症度を減らすのを助けることができる。ＥＣＰを使用して他の血液がんを処置することができ、移植後の拒絶を減らすのを助けることもできる。

さらに、ポルフィマーナトリウムまたはＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）などの光感作性薬剤をＰＤＴで使用して、食道がんおよび非小細胞肺がんの症状を処置または軽減することができる。がんが食道を閉塞させている場合、またはレーザー療法のみでがんを満足に処置することができない場合、ポルフィマーナトリウムが食道がんの症状を軽減し得る。ポルフィマーナトリウムを使用して、通常の処置が適さない対象の非小細胞肺がんを処置し、気道を閉塞させている非小細胞肺がんを有する対象の症状を軽減することができる。ポルフィマーナトリウムはまた、バレット食道、食道がんにつながるおそれがある状態を有する対象の前がん病変の処置にも使用され得る。

レーザー療法は、高強度光を使用してがんおよび他の病気を処置し得る。レーザーを使用して、腫瘍または前がん増殖を縮小させるか、または破壊することができる。レーザーは、最も一般的には、基底細胞皮膚がんなどの表在がん（体の表面または内臓の裏層上のがん）、ならびに極めて初期段階の子宮頚がん、陰茎がん、膣がん、外陰がんおよび非小細胞肺がんなどの一部のがんを処置するために使用される。

レーザーを使用して、出血または閉塞などの、がんの特定の症状を軽減することもできる。例えば、レーザーを使用して、対象の気管（喉笛）または食道を閉塞させている腫瘍を縮小するかまたは破壊することができる。レーザーを使用して、結腸または胃を閉塞させている結腸ポリープまたは腫瘍を除去することもできる。

レーザー療法は通常、可撓性内視鏡（体内の組織を見るために使用される薄い照光式チューブ）を通して与えられる。内視鏡に光ファイバー（光を透過させる薄いファイバー）を取り付ける。これを、口、鼻、肛門または膣などの体の開口部を通して挿入する。次いで、レーザー光を、腫瘍を切断または破壊するよう正確に狙いをつける。

レーザー誘導間質温熱療法（ＬＩＴＴ）または組織内レーザー光凝固術もレーザーを使用して一部のがんを処置する。ＬＩＴＴは、熱を使用して、がん細胞に損傷を与えるかまたはこれを殺傷することによって腫瘍を縮小する、温熱療法と呼ばれるがん処置に類似している。ＬＩＴＴ中、光ファイバーが腫瘍に挿入される。ファイバーの先端のレーザー光が腫瘍細胞の温度を上昇させ、これらに損傷を与えるかまたはこれらを殺傷する。ＬＩＴＴは時々、肝臓の腫瘍を縮小するために使用される。

レーザー療法は単独で使用することができるが、ほとんどの場合、外科手術、化学療法または放射線療法などの他の処置と組み合わせられる。さらに、レーザーは、神経終末を塞いで外科手術後の疼痛を減少させ、リンパ管を塞いで膨潤を減少させ、腫瘍細胞の拡大を制限することができる。

がんを処置するために使用されるレーザーには、二酸化炭素（ＣＯ_２）レーザー、アルゴンレーザー、およびネオジム：イットリウム－アルミニウム－ガーネット（Ｎｄ：ＹＡＧ）レーザーが含まれ得る。これらの各々が腫瘍を縮小または破壊することができ、内視鏡を用いて使用することができる。ＣＯ_２およびアルゴンレーザーは、より深い層に行くことなく皮膚の表面を切断することができる。よって、これらを使用して、皮膚がんなどの表在がんを除去することができる。対照的に、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーは、より一般的には、子宮、食道および結腸などの内臓を処置するために内視鏡を通して適用される。Ｎｄ：ＹＡＧレーザー光も、ＬＩＴＴ中に光ファイバーを通して体の特定の領域に移動することができる。アルゴンレーザーは通常、ＰＤＴで使用される薬物を活性化するために使用される。

全身疾患を有する対象については、補助化学療法（例えば、ドセタキセル、ミトキサントロンおよびプレドニゾン）および全身放射線療法（例えば、サマリウムまたはストロンチウム）などの追加の処置様式を指示することができる。このような対象は、臨床的に検出することはできないが、標的遺伝子発現サインによって明らかにされ得る、推定される微小転移性疾患（ｍｉｃｒｏ－ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）を排除するために、放射線療法で直ちに処置される可能性があるだろう。このような対象はまた、疾患進行の徴候についてより厳密に監視され得る。

全身疾患を有さない対象については、局所補助放射線療法または化学療法（例えば、乳房組織に局在化された）を投与することができる。無病生存状態（ＮＥＤ）の対象については、本明細書に記載される、発現プロファイリングおよび／またはリスクスコアの計算を使用して、乳がんの再発リスクを判定することができる。本明細書に記載される方法を使用して乳がんの再発リスクが低いと特定された対象については、メタボリックシンドローム（例えば、高血圧、糖尿病および／または体重増加）、骨粗鬆症、直腸炎、失禁または勃起不全などの処置関連副作用を回避するために、医師によって補助化学療法および内分泌療法は推奨されないだろう。ＮＥＤと一致する試料を有する対象は、注意深い経過観察、または処置なしを指示され得る。

グループの標的遺伝子のセットについて得られた情報を使用して、診断、予後または処置選択などの臨床的に関連する判断を行うかまたは行うのを助けることができるように、標的遺伝子をグループ分けすることができる。

対象からの生体試料における複数の標的遺伝子の測定された発現レベルの表示を含む対象レポートも提供され、表示は、いずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、８個、１０個、２０個、３０個またはそれより多い本明細書に記載される標的遺伝子、サブセット、またはこれらの組み合わせに対応する標的遺伝子の発現レベルを含む。いくつかの実施形態では、測定された発現レベルの表示が、目的の標的遺伝子の発現レベルの線形または非線形組み合わせの形をとり得る。対象レポートは、機械（例えば、コンピュータ）読み取り可能なフォーマットおよび／またはハード（紙）コピーで提供され得る。レポートは、既知の疾患状態および／または転帰を有する対象の１つまたは複数のセットからの前記複数の標的遺伝子の発現レベルの標準測定値も含むことができる。レポートを使用して、対象および／または処置医師に、発現される標的遺伝子の発現レベル、適当な医学的診断および／または意義を通知することができ、レポートが対象のための処置様式を適宜推奨することができる。

疾患を処置、診断、予後判定およびその他の方法で評価するのに有用な遺伝子発現プロファイルの表示も提供される。いくつかの実施形態では、これらのプロファイル表示が、コンピュータ読み取り可能な媒体（磁気、光学など）などの、機械によって自動的に読み取ることができる媒体に変えられる。物品は、このような媒体中の遺伝子発現プロファイルを評価するための説明書も含むことができる。例えば、物品は、上記の遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現プロファイルを比較するためのコンピュータ説明書を有する読み取り可能な記憶形態を含み得る。物品はまた、対象試料からの遺伝子発現データと比較することができるようにそこにデジタル的に記録された遺伝子発現プロファイルを有し得る。あるいは、プロファイルを異なる表示フォーマットで記録することができる。グラフィック記録が１つのこのようなフォーマットである。クラスタリングアルゴリズムは、このようなデータの可視化に役立ち得る。

実施例１
包括的トランスクリプトームプロファイリングは補助全身療法を免れ得る乳がん対象を特定する
導入
この試験では、早期乳がんを有する対象をより良く層別化することを目的とした。遺伝子発現サインがリスクにより対象を首尾よく層別化する能力に影響を及ぼし得る因子には、大きな十分に定義された対象コホートについての長期フォローアップの欠如、全身処置のない対象コホートの欠如、および結果を他の発現サインを使用して得られた結果と比較する限られた能力が含まれる。よって、そのうちの７０３人が補助設定で全身未処置であったＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴトライアルからの７６５人の早期乳がん対象のトランスクリプトームを包括的にプロファイリングすることによってこれらの課題に対処するようにこの試験を設計した（Sjostrom M et al. J Clin Oncol 35:3222-3229, 2017.）。ＥＲ＋対象のために以前開発された１５個の異なる遺伝子発現サインを計算し、評価した。これらのサインの性能および不一致を、潜在的に補助化学療法および内分泌療法を免れることができた低リスク群の対象の特定において比較した。不一致サインの問題を軽減するために、サインを平均ゲノムリスク（ＡＧＲ）に組み合わせた。最後に、より少ない遺伝子および類似の性能を有する同じ生物学を捕捉する関連する新規な１４１遺伝子サインを開発した。

結果
コホートの特徴
ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴコホートの７６５人の対象のトランスクリプトームをプロファイリングした（図５）。臨床的特徴を表１に詳述する。コホートは、ＥＲ＋およびＨＥＲ２－（８３％）腫瘍に富み、対象の９２％は補助内分泌療法も化学療法も受けなかった。全コホート中、対象の８４％は１５年で転移イベントがなかった。

１５個の以前公開された遺伝子発現サインからのリスクスコアを、転移およびＢＣＳＳの予後の可能性について計算および評価した。以前公開されたサインからの１５個の計算されたスコアのうちの１３個が、転移エンドポイントに関して統計学的に有意であり（ＦＤＲ＜０．０５）（図１Ａおよび図６）、ＢＣＳＳについても同様の結果であり（図７Ａ～７Ｂ）、連続リスクスコアのほとんどが互いに高度に相関していた（図１Ｂ）。サインの高い相関にもかかわらず、個々の対象についてはサインのいたる所に相当な不一致があった（図１Ｃ）。リスクスコアをサブタイプおよび組織学的悪性度で比較した場合、グレード３およびトリプルネガティブおよびＨＥＲ－２サブタイプが、グレード１～２および管腔サブタイプと比較してリスクが高かった（図１Ｃ）。また、早期再発を発症した対象は、ほとんどの連続リスクスコアによってより高いリスクと分類される傾向があり（図１Ｃ）、後期再発（１５年）よりも早期再発（５年）について、全ての予後サインについての高いＡＵＣによって示されるように、サインは早期再発を特定するのがより得意であった（図８）。

低リスク対象を特定するための１５個のサインの一致をさらに評価するために、他のサインによっても最低四分位数のリスクに分類された、あるサインによって最低四分位数のリスクに分類された対象の平均割合を定量する、低リスク分類一致を計算した。平均分類一致は２８％～５３％に及んだ（図１Ｄ）。

全身補助処置の省略の潜在的な候補における１５個の以前公開されたサインから計算されたスコアの性能
全身補助処置の省略の臨床的候補となり得る対象に焦点を当てるために、閉経後であり、いずれの全身補助処置も受けなかったＥＲ＋、ＨＥＲ２－腫瘍を有する対象（Ｎ＝４５４、プロファイリングコホートの５９％）を選択した。この低リスクサブグループでは、対象の８６％が１５年で転移がなかった。１５個のサインのうちの１０個が転移と有意に関連しており（ＦＤＲ＜０．０５）、スケーリングハザード比（ＨＲ）が１．４～２．１であり（図２Ａ～２Ｂ）、同じサインのセットがＢＣＳＳも予知した（図９Ａ～９Ｂ）。後期再発のリスクが乳がん対象にとっての主要な懸念であるので、異なる時点でのＡＵＣを計算することによって、異なるサインの性能を分析した。ほとんどのサインについて、時間と共に予知能力が低下し（図１０）、ＡＵＣの平均は、５、１０および１５年でそれぞれ０．７３、０．６６および０．６０となった。サイン間の平均低リスク分類一致は２７％から５１％まで変化した（図１１）。

平均ゲノムリスク
予後判定の安定性を増加させるために、１５個のサインスコアの平均としての平均ゲノムリスク（ＡＧＲ）を計算した。ＡＧＲの予知性能は、ほとんどの予知個体ゲノムサインと一致した（低リスクコホートにおける転移について、ＨＲ＝１．７［１．４～２．１］、ｐ＜０．００１）。さらに、最低四分位数のＡＧＲスコアを有する対象（Ｎ＝１１４、サブグループの２５％）は最初の１０年以内に遠隔転移イベントを有さず、１５年で転移がない対象の割合は９４％（９５％ＣＩ８９～１００％）であった（図３Ａ）ので、ＡＧＲは、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－、閉経後および全身未処置サブグループ内の対象の極めて低リスク集団を特定した。

サイン比較および関連する１４１遺伝子サイン
サインの多くが転移までの時間に有意に関連していたので、サイン間の類似性を特定することを目的とした。サイン間で共有された遺伝子の評価を実施したところ、あるサイン（ＭＧＩサイン、５個の遺伝子で構成される）の遺伝子の最大１００％を別のサインで見出すことができることが分かった（表３）。本研究に含まれるサインの多くからの遺伝子リストを使用して誘導されているので、Ｔｏｒｏｎｔｏ２０１７サイン、および少ない遺伝子総数を有するＭＧＩサインをこの分析から除去すると、あるサイン中の遺伝子の最大で６９％が他と共通であることが見出された。個別に以前公開されたサインについてのエンリッチメント解析を実施すると、細胞周期および代謝経路がこれらのサイン遺伝子リストで有意におよび高度に濃縮されていることが見出された（ＦＤＲ＜０．０５、表４）。サイン間の遺伝子リスト組成の類似性を考慮して、これらの以前公開されたサインと遺伝子を重度には共有しなかったサインがこのデータセットにおいて依然として予知できるかどうかを調査した。このために、ＡＧＲと高度に相関するが、以前のサインとの重複遺伝子を除外した遺伝子を特定することによって、５個の公的に入手可能なコホートにおけるサインを誘導した。これにより、ＡＧＲと類似の性能：サブグループの最低四分位数のリスクについて９４％（９５％ＣＩ８８～１００％）が１５年で転移がない（図３Ｂ）、を有する１４１遺伝子サイン（ＭＥＴ１４１、表２）が得られた。ＡＧＲおよびＭＥＴ１４１遺伝子リストの遺伝子ネットワーク分析は、両者が、細胞周期制御、ＤＮＡ複製、転写および細胞外マトリックス組織化に焦点を当てた場合に類似の遺伝子セットにおいて濃縮されていることを示唆した（図４Ａ～４Ｂ）。

考察
包括的トランスクリプトームプロファイリングを使用して、ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴ、長期フォローアップをした全身未処置対象の特有のコホートにおける１５個の以前記載された予知乳がんサインの予知性能を評価した。これらの結果は、ほとんどのサインが群レベルでうまく働くが、個々の対象レベルでは相当な不一致があることを示した。そのため、平均ゲノムリスク（ＡＧＲ）および関連する新規な１４１遺伝子サイン（ＭＥＴ１４１）の概念を開発した。ＡＧＲとＭＥＴ１４１の両方が、予後が極めて良好なＥＲ＋、ＨＥＲ２－がんを有し、内分泌療法を含む全身療法の省略の候補となり得る閉経後の全身未処置対象を特定することができる。さらに、１５個の異なるサインからのリスクの計算および総和を要するＡＧＲと異なり、ＭＥＴ１４１サインは、類似の情報を単一サインに変換する。

近年のＥＢＣＴＣＧメタアナリシスは、後期再発が重大な臨床的課題であり、内分泌療法を回避する努力が長期フォローアップデータに依拠しなければならないことを示した（Pan H et al. N Engl J Med 377:1836-1846, 2017.）。この試験では、以前公開されたサインから計算されたスコアの性能が、より長期的なフォローアップとともに悪化することを示す。これにもかかわらず、サインの多くは、全身治療がない場合でさえ、１５年で転移がない９０％超および２０年でおよそ９０％の乳がん特異的生存を有する対象の大部分を特定することができる（図６および３Ｂ）。

出現するジレンマは、個々の対象についての現在臨床的に使用されている複数の遺伝子発現試験およびリスク予測の結果の間の相当な不一致である。実際、低リスクと５つの試験によって一様に分類された対象のわずか３９％を示す、異なるコホートにおける、Ｂａｒｔｌｅｔｔらによる結果を大いに確認したが、個々の試験は低リスクとしてはるかに多い割合を予測した。同じ著者らは、３つの異なるサブタイプ分類試験が腫瘍の４１％について不一致であることを示した（Bartlett JM et al. J Natl Cancer Inst 108, 2016.）。本発明者らの本研究では、全トランスクリプトームプラットフォームおよび全てのサインの平均を使用することによってこれを克服する戦略を提示する。このアプローチによって、最良の個々のサインと一致する結果が得られ、より多くのデータ点に依拠するので、サイン間変動性を改善することができた。

これらのデータは、全ての入手可能なサインにより腫瘍をプロファイリングすることが有用となり得ることを示唆しているが、費用および腫瘍からの十分な試料材料の入手可能性のために、これは実行可能となり得ない。そのため、ＡＧＲと相関する遺伝子に基づく新規な１４１遺伝子サイン（ＭＥＴ１４１）を開発した。ＭＥＴ１４１遺伝子サインは、ＡＧＲと同じ生物学を捕捉し、類似の性能を有するが、臨床設定においてより実行可能となる可能性が高いだろう。

これらの結果は、以前開発された乳がんサインから計算されたスコアが、ＥＲ＋、ＨＥＲ２－腫瘍を有する、閉経後の全身未処置の乳がんコホートにおいて大いに予知することを示した。これらのスコアは、全身処置、内分泌療法と化学療法の両方を免れ得る低リスク対象を特定する。しかしながら、サインは個々の対象レベルでは不一致であり、本発明者らの結果はサインの平均の使用がより堅牢な対象レベルの結果をもたらし得ることを示している。この平均、または関連する１４１遺伝子サインを使用して、いずれの全身処置がない場合でさえも転移が優れて長期間全くない対象を特定することができる。

これらの結果は、本発明の方法およびマーカーが転移を予知し、補助化学療法と内分泌処置の両方を免れ得る乳がん患者を特定することを示した。これらの結果はさらに、本発明の方法およびマーカーが乳がんを処置するのに有用であることを示した。

対象
その詳細が以前公開されている（Sjostrom M et al. J Clin Oncol 35:3222-3229, 2017；Killander F et al. Eur J Cancer 67:57-65, 2016；およびMalmstroem P et al. Eur J Cancer 39:1690-7, 2003.）、ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴトライアルの遡及的分析を実施した。手短に言えば、トライアルは、１、１７８人の乳房温存手術を受けたリンパ節転移陰性、ステージＩおよびＩＩＡ対象を補助全乳房放射線療法または放射線療法なしに無作為化した。全身補助療法を、その時、局所的ガイドラインに従って投与し、低密度に使用した。元の試験は、局所領域的イベントについての放射線からの利益を実証したが、乳がん特異的生存（ＢＣＳＳ）については実証しなかった。サブタイプ分類は、以前記載されたように（Sjostrom M et al. J Clin Oncol 35:3222-3229, 2017.）、Ｓｔ Ｇａｌｌｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（２０１３） Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌに従って実施した。この分析の主要エンドポイントは、外科手術の時間から転移、最後のフォローアップまたは死亡（死亡は打ち切りイベントとして）まで定義される、遠隔無再発期間（ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｆｒｅｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）（すなわち、転移までの時間）である（Gourgou-Bourgade S et al. Ann Oncol 26:873-9, 2015.）。対側乳がんまたは別の原発がんを患っている対象は、推奨される通り（Hudis CA et al. J Clin Oncol 25:2127-32, 2007.）、打ち切らなかった。中央フォローアップ時間は、転移がない対象については１４．３年であった。完璧を期するために、ＢＣＳＳについての結果を示すが、中央フォローアップ期間はイベントのない対象について１８．６年であった。トライアルおよびフォローアップ試験はＬｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ倫理委員会によって承認され（承認番号２０１０／１２７および２０１５／５４８）、口頭でのインフォームドコンセントを全ての対象から得た。

ＲＮＡ抽出および遺伝子発現分析
ＳｗｅＢＣＧ９１－ＲＴトライアルにおける９２２個の原発性腫瘍からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料がさらなる処理に利用可能であった（図５）。がん内容物を公認の乳房病理学者が確認し、代表的な腫瘍領域をヘマトキシリンおよびエオシン染色スライド上にマークした。を使用してＲＮＡを１．５ｍｍ組織パンチから抽出した。

本発明の好ましい実施形態を例示し、説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更をその中で行うことができることが理解されるだろう。Ｏｖａｔｉｏｎ ＦＦＰＥ ＷＴＡシステム（ＮｕＧＥＮ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）を使用して、ＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）およびｃＤＮＡを増幅した。増幅したｃＤＮＡを断片化し、Ｅｎｃｏｒｅ Ｂｉｏｔｉｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮｕＧＥＮ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）を使用して標識し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｅｘｏｎ １．０ＳＴ Ａｒｒａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）にハイブリダイズした。試料処理はＣＬＩＡ認証臨床操作実験室（ＧｅｎｏｍｅＤｘ Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で実施した。７６５個の試料が十分なＲＮＡを有し、ｃＤＮＡおよびマイクロアレイ品質管理に合格した。Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｎｎｅｌ Ａｒｒａｙ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを使用して遺伝子発現（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ ＧＳＥ１１９２９５）を正規化した（Piccolo SR et al. Genomics 100:337-44, 2012.）。

データ分析
以前公開された乳がんリスクスコアの計算
公開されているアルゴリズムを使用して、または公的に入手可能なＲパッケージによって、１５個の以前公開された遺伝子発現サインの代理スコアを計算した（Paik S et al. N Engl J Med 351:2817-26, 2004；Filipits M et al. Clin Cancer Res 17:6012-20, 2011；Sotiriou C et al. J Natl Cancer Inst 98:262-72, 2006；Parker JS et al. J Clin Oncol 27:1160-7, 2009；van de Vijver MJ et al. N Engl J Med 347:1999-2009, 2002；Haibe-Kains B et al. Genome Biol 11:R18, 2010；Loi S et al. BMC Genomics 9:239, 2008；Wang Y et al. Lancet 365:671-9, 2005；Loi S et al. Proc Natl Acad Sci U S A 107:10208-13, 2010；Tutt A et al. BMC Cancer 8:339, 2008；Davis LM et al. J Mol Diagn 9:327-36, 2007；Ring BZ et al. J Clin Oncol 24:3039-47, 2006；Ma XJ et al. Clin Cancer Res 14:2601-8, 2008；Bayani J et al. NPJ Breast Cancer 3:3, 2017；およびMa XJ et al. Cancer Cell 5:607-16, 2004.）。

統計分析
Ｒ ｓｕｒｖｉｖａｌパッケージ（バージョン２．４１－３）を使用して生存分析を実施した。異なる値の範囲を有するサイン間のハザード比を比較するために、各連続リスクスコアを、スコアをその標準偏差で割ることによって正規化した。Ｒ ｓｕｒｖｉｖａｌＲＯＣパッケージ（バージョン１．０．３）（Heagerty PJ et al. Biometrics 56:337-44, 2000.）を使用して、時間依存的曲線下面積（ＡＵＣ）の推定を計算した。時間依存的ＡＵＣについての信頼区間を、１０００個のブートストラップ試料にわたってＡＵＣ推定を繰り返してサンプリング分布を作成し、再サンプリング推定の２．５および９７．５パーセンタイルを計算することによって推定した。低リスク対象の分類がサイン間でどれほど異なるかを比較するために、個々のサインの連続リスクスコアの最低四分位数内の対象を特定し、それぞれの他のサインの最低四分位数内にも分類された対象の割合を計算した。次いで、目的のサイン（割合が１である）を除く、平均割合を計算した。これを「低リスク分類一致」と呼ぶ。

以前公開された乳がんリスクスコアの計算
以前公開された乳がんリスクスコアは種々のプラットフォームで開発された。本発明者らは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｅｘｏｎ １．０ＳＴマイクロアレイからの遺伝子発現データをゲノムサイン方程式に適用して代理連続リスクスコアを計算した。以下のリスクスコアは、Ｒ（バージョン３．３．２）におけるｇｅｎｅｆｕパッケージ（ｇｅｎｅｆｕ ｐａｃｋａｇｅ）（バージョン２．６．０）（Gendoo DM et al. Bioinformatics 32:1097-9, 2016）を使用して、公開されているその方程式に従って計算した：ＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘ様（Paik S et al. N Engl J Med 351:2817-26, 2004）、Ｅｎｄｏｐｒｅｄｉｃｔ様（Filipits M et al. Clin Cancer Res 17:6012-20, 2011）、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ様（Sotiriou C et al. J Natl Cancer Inst 98:262-72, 2006）、ＰＡＭ５０ＲＯＲ様（Parker JS et al. J Clin Oncol 27:1160-7, 2009）、Ｇｅｎｅ７０様（van 't Veer LJ et al. Nature 415:530-6, 2002）、ＧｅｎｉｕｓＭ３様（Haibe-Kains B et al. Genome Biol 11:R18, 2010）、ＴＡＭＲ様（(Loi S et al. BMC Genomics 9:239, 2008）、Ｇｅｎｅ７６様（Wang Y et al. Lancet 365:671-9, 2005）およびＰＩＫ３ＣＡＧＳ様リスクスコア（Loi S et al. Proc Natl Acad Sci U S A 107:10208-13, 2010.）。特定のマイクロアレイからのプローブに基づくサインについては、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子識別子へのｇｅｎｅｆｕアノテーションを使用して、プローブをマイクロアレイプラットフォーム上の適切な遺伝子にマッピングした。マイクロアレイ上で入手可能でない少ない遺伝子については、その遺伝子の項（係数および遺伝子発現値）をサイン方程式から省いた。使用したｇｅｎｅｆｕ関数を表１に列挙する。

Ｃｅｌｅｒａ様リスクスコア
以前記載されたように（Tutt A et al. BMC Cancer 8:339, 2008.）、１４個の遺伝子の発現の和を計算することによって、リスクスコアを算出した。

ＥｘａｇｅｎＢＣ様ＥＲ＋リスクスコア
以前記載されたように（Davis LM et al. J Mol Diagn 9:327-36, 2007.）、以下の方程式：Ｒ＝０．１２８^＊ＣＹＰ２４－０．１７３^＊ＰＤＣＤ６ＩＰ＋０．１８３^＊ＢＩＲＣ５に基づいて、リスクスコアを算出した。

Ｍａｍｍｏｓｔｒａｔ様リスクスコア
以前記載されたように（Ring BZ et al. J Clin Oncol 24:3039-47, 2006.）、以下の方程式：Ｒ＝１．５４^＊ＳＬＣ７Ａ５＋１．１２^＊ＴＰ５３＋１．０６^＊ＮＤＲＧ１＋０．７２^＊ＨＴＦ９Ｃ＋０．５^＊ＣＥＡＣＡＭ５に基づいて、リスクスコアを算出した。

ＭＧＩ様リスクスコア
以前記載されたように（Ma XJ et al. Clin Cancer Res 14:2601-8, 2008.）、５個の遺伝子のそれぞれについての発現レベルを、平均０および標準偏差１を有するようスコアを正規化し、次いで、第１の主成分としての単一スコアに合わせることによって、リスクスコアを算出した。

Ｔｏｒｏｎｔｏ２０１７様リスクスコア
以前記載されたように（Bayani J et al. NPJ Breast Cancer 3:3, 2017）、９５個の遺伝子の遺伝子発現および係数を伴う一次方程式を計算することによって、リスクスコアを算出した。

Ｔｗｏ ｇｅｎｅ ｒａｔｉｏ様リスクスコア
以前記載されたように（Ma XJ et al. Cancer Cell 5:607-16, 2004.）、ＨＯＸＢ１３の発現からＩＬ１７ＲＢの発現を差し引くことによって、リスクスコアを算出した。

平均ゲノムリスク
平均ゲノムリスクを計算するために、１４個のサインスコアの各々をコホート内で０～１にスケーリングし、次いで、平均を算出した。より大きな値の範囲を有するサインが平均リスクの計算で重みづけされるのを防ぐためにスケーリングが必要であった。

ＭＥＴ１４１
５個の公的に入手可能な乳がんデータセットをダウンロードした（Ｋｒｅｉｋｅ、ＧＥＯ３０６８２；Ｋａｏ、ＧＥＯ２０６８５；Ｗａｎｇ、ＧＥＯ２０３４；Ｈａｔｚｉｓ、ＧＥＯ１７７０５；ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ－ｐｕｂｓ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｗｏｕｎｄ＿ＮＫＩ／ｅｘｐｌｏｒｅ．ｈｔｍｌからダウンロード）。各データセットについて、プローブを遺伝子記号に変換し、５個のデータベース間で共通の遺伝子のサブセットを特定した（１０、９９０個の遺伝子）。平均ゲノムリスクをこれらの５個のコホートの各対象について計算した。新たなサインに含める遺伝子を評価するために、以前公開されたサインからの遺伝子と共通の遺伝子を除去し、残りの１０、３１５個の遺伝子を使用して、各遺伝子を各コホート内の平均ゲノムリスクと相関させた。全５個のコホートにおける平均ゲノムリスクに対して０．４超またはマイナス０．４未満のスピアマンの相関係数を有する遺伝子を保持したところ、全１４１個の遺伝子；８９個の正に相関する遺伝子と５２個の負に相関する遺伝子が得られた（表２）。最終ＭＥＴ１４１スコアは、正に相関する遺伝子の平均発現から負に相関する遺伝子の平均発現を差し引いたものである。

経路分析
遺伝子のリストで大きな比率を占める生物学的経路を評価するために、試験型としてＦＤＲ多重検定補正を用いるフィッシャーの正確確率検定、およびアノテーションデータセットとしてＰａｎｔｈｅｒ ＧＯ－Ｓｌｉｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ遺伝子リストを使用するＰａｎｔｈｅｒ統計過剰出現検定（バージョン１３．０、ｐａｎｔｈｅｒｄｂ．ｏｒｇ）（Mi H et al. Nucleic Acids Res 45:D183-d189, 2017）を使用した。二次的方法として、「ヒトへのプロジェクト（ｐｒｏｊｅｃｔ ｔｏ ｈｕｍａｎ）」オプションで、Ｒｅａｃｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ（ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ）（Fabregat A et al. Nucleic Acids Res 46:D649-d655, 2018およびMilacic M et al. Cancers (Basel) 4:1180-211, 2012参照）も使用した。両方法について、公式の遺伝子記号のリストを入力した。経路の有意な濃縮をＦＤＲ＜０．０５として定義した。

Claims (27)

1. 対象の乳がんを処置する方法であって、
   ａ）表２から選択される複数の遺伝子について、対象からの試料における発現レベルを得るまたは得ていることと；
   ｂ）前記発現レベルに基づいて、前記対象が、がん再発のリスクが低いことを判定すること、または前記発現レベルに基づいて、前記対象が、がん再発のリスクが低くないことを判定することと；
   ｃ）前記発現レベルに基づいて、前記対象が、がん再発のリスクが低いと特定されなかった場合、補助化学療法または内分泌療法を投与し、前記発現レベルに基づいて、前記対象が、がん再発のリスクが低いと特定された場合、補助化学療法も内分泌療法も投与しないことと
   を含む方法。
2. 前記対象についての平均ゲノムリスク（ＡＧＲ）スコアを計算することをさらに含み、前記ＡＧＲスコアと生体試料における表２から選択される遺伝子の発現レベルの両方に基づいて、前記対象が、がん再発のリスクが低いと特定されなかった場合、補助化学療法または内分泌療法を前記対象に投与し、前記ＡＧＲスコアと生体試料における表２から選択される遺伝子の発現レベルの両方に基づいて、前記対象が、がん再発のリスクが低いと特定された場合、補助化学療法も内分泌療法も前記対象に投与しない、請求項１に記載の方法。
3. 前記生体試料が生検または腫瘍試料である、請求項１に記載の方法。
4. 前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
5. 前記対象が、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）、ヒト上皮増殖因子受容体２陰性（ＨＥＲ２－）乳がんを有し、閉経後である、請求項１に記載の方法。
6. 表２から選択される遺伝子の全部の発現レベルが生体試料において測定される、請求項１に記載の方法。
7. 表２から選択される遺伝子の１つまたは複数の発現のレベルが、対照と比較して上昇または低下している、請求項１に記載の方法。
8. 前記発現のレベルを測定することが、インサイチューハイブリダイゼーション、ＰＣＲベースの方法、アレイベースの方法、免疫組織化学法、ＲＮＡアッセイ法またはイムノアッセイ法を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記発現のレベルを測定することが、核酸プローブ、１つまたは複数の核酸プライマー、および抗体からなる群から選択される試薬を使用することを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記発現のレベルを測定することが、ＲＮＡ転写物のレベルを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記補助化学療法または前記内分泌療法による前記対象の処置前に実施される、請求項１に記載の方法。
12. 乳がんを有する対象の予後ならびに前記対象を補助化学療法および内分泌療法で処置するか否かを判定するためのキットであって、表２から選択される複数の遺伝子の発現のレベルを測定するための薬剤を含むキット。
13. 表２に列挙される遺伝子の全部の発現のレベルを測定するための薬剤を含む、請求項１２に記載のキット。
14. 前記薬剤が、インサイチューハイブリダイゼーション、ＰＣＲベースの方法、アレイベースの方法、免疫組織化学法、ＲＮＡアッセイ法またはイムノアッセイ法を実施するための試薬を含む、請求項１２に記載のキット。
15. 前記薬剤が、マイクロアレイ、核酸プローブ、核酸プライマーまたは抗体の１つまたは複数を含む、請求項１２に記載のキット。
16. 表２から選択される遺伝子の配列またはその相補配列を含む核酸を増幅することができるＰＣＲプライマーの少なくとも１つのセットを含む、請求項１２に記載のキット。
17. 表２から選択される遺伝子の配列またはその相補配列を含む核酸にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブを含む、請求項１２に記載のキット。
18. 乳がんを有する対象の予後ならびに前記対象を補助化学療法および内分泌療法で処置するか否かをどのように判定するかについての説明書を含む、電子的形態または紙形態の、情報をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
19. １つまたは複数の対照参照試料をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
20. 乳がんを有する対象の予後ならびに前記対象を補助化学療法および内分泌療法で処置するか否かを判定するためのプローブセットであって、複数の標的核酸を検出するための複数のプローブを含み、前記複数の標的核酸が、表２から選択される遺伝子の１つもしくは複数の遺伝子配列、またはその相補配列を含む、プローブセット。
21. 表２から選択される遺伝子の遺伝子配列またはその相補配列を含む複数の標的核酸を検出するための複数のプローブを含む、請求項２０に記載のプローブセット。
22. 少なくとも１つのプローブが検出可能に標識されている、請求項２１に記載のプローブセット。
23. 乳がんを有する対象の予後ならびに前記対象を補助化学療法および内分泌療法で処置するか否かを判定するためのキットであって、請求項２２に記載のプローブセットを含むキット。
24. 乳がんを有する対象の予後ならびに前記対象を補助化学療法および内分泌療法で処置するか否かを判定するためのシステムであって、
    ａ）請求項２２に記載のプローブセットと；
    ｂ）前記乳がんを有する対象からの生体試料における複数のプローブにハイブリダイズした複数の標的核酸の発現レベルまたは発現プロファイルを分析し、前記発現レベルまたは発現プロファイルに基づいて、前記対象が、がん再発のリスクが低く、補助化学療法および内分泌療法による処置を免れることができるかどうかを判定するためのコンピュータモデルまたはアルゴリズムと
    を含むシステム。
25. 請求項２４に記載のシステムを含むキット。
26. 前記対象のための処置様式を指示するためのコンピュータモデルまたはアルゴリズムをさらに含む、請求項２５に記載のキット。
27. 前記複数の標的核酸の発現レベルまたは発現プロファイルを正規化するためのコンピュータモデルまたはアルゴリズムをさらに含む、請求項２５に記載のキット。

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