JP2022510645A - 顕微鏡検査方法及びシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、光学的顕微鏡検査の分野に関する。1つの形式では、本開示は、光学顕微鏡及び増強型試料保持器を使用するシステム及び方法を提供する。
La Trobe Universityの名義におけるPCT/オーストラリア特許出願公開第2018/050496号(その内容全体が参照により本明細書に援用される)は、サブミクロン構造の周期的アレイを含むプラズモニック層を有する試料保持器の使用を通して増強型画像コントラストを提供する光学顕微鏡検査のシステム及び方法を開示している。この開示では、ナノスライドへの参照は、その両方の内容がすべての目的のために参照により本明細書に援用されるPCT/オーストラリア特許出願公開第2018/050496号又は2018年11月29日出願の本出願人の同時係争中の「Microscopy method and system」という名称のオーストラリア特許出願公開第2018904553号及び本出願と同じ日に出願されたオーストラリア特許出願公開第2018904553号に対する優先権を主張する国際特許出願の教示による試料保持器への参照である。このような試料保持器を使用する顕微鏡検査は、本明細書において組織学的プラズモニックス又は色コントラスト顕微鏡検査(CCMと略称される)と呼ばれる。試料は、プラズモニック層に隣接して試料保持器上に置かれる。使用中、試料及び試料保持器が照明され、試料の画像が生成される。本発明者らは、試料及びプラズモニック層と光との相互作用を介して色コントラストが観測対象画像内に呈示されることを観測した。特に、異なる誘電定数を有する試料の領域は、異なる色で画像内に出現する。強度コントラストの増加も実現される。CCMとは対照的に、非特異性染色を使用する従来の光学顕微鏡検査から取得される画像は、通常、使用される染色に対応する単一色の強度コントラストを呈示するのみである。対比染色又はバイオマーカが使用された場合でも、これらの従来技術は、特異色の画像を提供するのみである。
当業者に知られているように、反射光顕微鏡検査は、広い概念では、試料の画像を形成するために、試料から反射された光を使用する顕微鏡検査技術である。PCT/オーストラリア特許出願公開第2018/050496号において開示されたナノスライドの例示的実施形態は、修正なしに反射顕微鏡検査において使用され得るが、本発明者らは、このような試料保持器が、反射光顕微鏡検査におけるその使用を改善するために強化され得ると判断した。本明細書では、「画像を形成すること」は、ユーザが試料(若しくはその一部)の画像を知覚し得るように人間知覚可能画像を形成すること(例えば、光を集束することにより)又は格納、伝送、表示若しくは他の下流処理のために試料(若しくはその一部)のデジタル若しくは写真画像を生成することを含む。
本試料保持器は、物体を支持するとき、サブミクロン構造の周期的アレイが物体に隣接するように物体を支持するように構成され、
サブミクロン構造の周期的アレイは、分離されたプラズモニック領域のアレイを含む。
本試料保持器は、物体を支持するとき、サブミクロン構造の周期的アレイが物体に隣接するように物体を支持するように構成され、
その領域内では、サブミクロン構造の周期的アレイにより、プラズモニック層が面積で前記領域の80%以下を充填する。
上側表面及び下側表面を有する試料保持器を提供することであって、上側表面は、それに関連するプラズモニック層を有し、プラズモニック層は、サブミクロン構造の周期的アレイを含む、提供すること、
生体試料を試料保持器の上側表面に貼り付けること、
光が試料及び試料保持器と相互作用するように、前記光で試料を照明すること、
蛍光によって試料から発された光を受け取り、且つその画像を形成すること
を含む方法も提供する。
本発明の例示的実施形態は、添付図面を参照して非限定的例として説明されことになる。本国際出願と共に出願された添付図面は、本発明の実施形態において使用されるカラー画像であって、その使用から生じるカラー画像を含む。色情報は、実施形態の本開示の一部を形成する。画像の白黒再生又は階調再生が発生すれば、色開示は、元々申請された文書から取得され得る。
図1aは、本開示の一例において使用される試料保持器の実施形態を示す。図1aは、本発明における使用に好適な試料保持器全体に渡る断面を示す。試料保持器100は、プラズモニック層102が蒸着される基板を含む。図1b及び1cは、作製され、且つ実施形態において使用され得るサブミクロンアレイを有する、PCT/オーストラリア特許出願公開第2018/050496号に例示されるような2つのタイプのプラズモニック層102を示す。層は、それぞれ150nmの厚さを有する銀塩フィルムであるが、他の好適な材料が使用され得る。図1bは、六角形パターンで配置された450nm周期を有する円形状ナノ開口の形式のサブミクロンアレイを有する。図1cは、長方形パターン上の十字形ナノ開口を有する。十字形ナノ開口は、一方向(ここでは、0°方向として定義される)に450nm周期を、且つ直交方向(90°方向として定義される)に400nm周期を有する。これらのアレイは、470~550nm範囲(電磁スペクトルの可視領域内である)内の表面プラズモンポラリトン(SPP)共振モードを有する。プラズモニック層102の表面を保護するために、ガラス様材料である水素シルセスキオキサン(HSQ)の層104(10nm±1nm)がプラズモニック層102の製作後に蒸着される。HSQによりキャッピングした後、試料保持器100は、試料が支持され得る従来の顕微鏡用スライドのものと同様の上側表面を有する。使用中、HSQ層は、組織付着力を促進する極性表面も提示する。他の実施形態では、金属酸化物キャッピング層(例えば、SiO2)がHSQの代わりに使用され得る。
R=1を有する試料(すなわち試料なしであるか又は試料が空気である)、
R=1.33を有する試料(例えば、水からなる試料)、
R=1.5を有する試料(例えば、ポリマーなどの材料)。
RI=1試料(左側)は、その反射スペクトル内のピークの位置に対応して青色に見え、
RI=1.33試料(中央)は、その反射スペクトル内のピークの位置に対応して橙色に見え、
RI=1.5試料(右側)は、その反射スペクトル内のピークの位置に対応して赤色に見え、
反射顕微鏡検査においてナノスライドを使用して形成された画像が、試料の屈折率に関係する試料の誘電定数に基づいて色コントラストを表示することを実証する。
上側表面及び下側表面を有する試料保持器を提供することであって、上側表面は、それに関連するプラズモニック層を有し、プラズモニック層は、サブミクロン構造の周期的アレイを含む、提供することと、
試料を試料保持器の上側表面に貼り付けることと、
光が試料及び試料保持器と相互作用するように、前記光で試料を照明することと、
蛍光によって試料から発された光を受け取り、且つその画像を形成することと
を含む。
Claims (34)
- 光学顕微鏡において使用される試料保持器であって、サブミクロン構造の周期的アレイを画定するプラズモニック層を含み、
物体を支持するとき、前記サブミクロン構造の周期的アレイが前記物体に隣接するように前記物体を支持するように構成され、
前記サブミクロン構造の周期的アレイは、分離されたプラズモニック領域のアレイを含む、試料保持器。 - 前記プラズモニック領域は、プラズモニック材料のアイランドである、請求項1に記載の試料保持器。
- 前記サブミクロン構造は、200nm~500nmの範囲における前記サブミクロン構造間の分離を有する周期的アレイで配置される、請求項1又は2に記載の試料保持器。
- 前記周期的アレイは、1次元又は2次元アレイである、請求項1~3のいずれか一項に記載の試料保持器。
- 前記サブミクロン構造は、50nm~300nmの範囲の最大寸法を有する、請求項1~4のいずれか一項に記載の試料保持器。
- 前記サブミクロン構造は、約100nm~200nmにわたるプラズモニック材料の領域である、請求項1~5のいずれか一項に記載の試料保持器。
- 前記プラズモニック領域は、円、トーラス、楕円、十字形、長方形、正方形、線、ストリップの任意の1つ又は複数として整形される、請求項1~6のいずれか一項に記載の試料保持器。
- 前記プラズモニック層は、Al、Ag、Au、Ni、Pt及びPdの任意の1つから選択される1つ又は複数の金属から形成される、請求項1~7のいずれか一項に記載の試料保持器。
- 前記プラズモニック層は、20nm~300nmの範囲の厚さを有する、請求項1~8のいずれか一項に記載の試料保持器。
- 前記分離されたプラズモニック領域のアレイは、第1及び第2の方向において、隣接するプラズモニック領域間の等しい又は等しくない間隔を有するアレイで配置される、請求項1~9のいずれか一項に記載の試料保持器。
- 前記第1及び第2の方向は、直交方向である、請求項10に記載の試料保持器。
- 前記プラズモニック層のための機械的支持を提供するために、前記プラズモニック層の第1の表面の少なくとも一部分に接続される基板を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の試料保持器。
- 前記プラズモニック層を分離するために、光学的に透明な保護層を前記プラズモニック層の上側に含む、請求項12に記載の試料保持器。
- 前記光学的に透明な保護層は、150nm未満の厚さを有する、請求項13に記載の試料保持器。
- 前記光学的に透明な保護層は、80nm未満の厚さを有する、請求項13に記載の試料保持器。
- 前記光学的に透明な保護層は、酸化シリコン、窒化シリコン、透明金属酸化物及びポリマーの任意の1つ又は複数を含む、請求項13~15のいずれか一項に記載の試料保持器。
- 試料を通して前記プラズモニック層に透過される光が、反射光を含む画像の生成のために前記試料保持器から反射されることを可能にするように使用中に配置される、請求項1~16のいずれか一項に記載の試料保持器。
- 入射光は、前記試料及び試料保持器を照明し、且つ前記試料及び前記プラズモニック層と相互作用する、請求項17に記載の試料保持器。
- 前記反射光は、各色が、前記試料保持器上に保持された試料の局所化誘電定数に依存する特性スペクトルを含む、請求項17又は18に記載の試料保持器。
- 試料を撮像する方法であって
上側表面及び下側表面を有する試料保持器を提供することであって、前記上側表面は、それに関連するプラズモニック層を有し、前記プラズモニック層は、サブミクロン構造の周期的アレイを含む、提供することと、
前記試料を前記試料保持器の前記上側表面に貼り付けることと、
光が前記試料及び試料保持器と相互作用するように、前記光で前記試料を照明することと、
蛍光によって前記試料から発された光を受け取り、且つその画像を形成することと
を含む方法。 - 前記試料及び試料保持器との相互作用後の光を受け取り、且つ少なくとも1つのその画像を形成することをさらに含み、前記試料の少なくとも1つの局所化構造特性は、前記受け取られた光の色に基づいて前記画像内で可視である、請求項20に記載の方法。
- 蛍光によって前記試料から発された前記光から形成される画像は、第1の期間において形成され、且つ前記試料及び試料保持器との相互作用後の光から形成される画像は、第2の期間において形成される、請求項21に記載の方法。
- 前記第1の期間において第1の照明スペクトルを有する光を、且つ前記第2の期間において第2の照明スペクトルを有する光を使用して前記試料を照明することを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記第1の照明スペクトルは、前記試料の蛍光特性に基づいて選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記第1及び第2の照明スペクトルは、同じであるか又は異なるかのいずれかである、請求項23又は24に記載の方法。
- 蛍光によって前記試料から発された光を受け取ることは、前記蛍光以外の源からの受け取られる光を最小限にするために、前記試料及び/又は試料保持器から受け取られる光をフィルタリングすることを含む、請求項20~25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料保持器の、前記試料が置かれる側から前記試料を照明し、且つ蛍光によって前記試料から発された光と、また前記試料及び試料保持器と相互作用した後の光とを前記照明と同じ側から受け取ることを含む、請求項20~26のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光によって前記試料から発された光から形成される画像と、前記試料及び試料保持器との相互作用後の光から形成される画像とを空間的に相関付けることをさらに含む、請求項20~27のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光によって前記試料から発された前記光から形成される少なくとも1つの画像と、前記試料及び試料保持器との相互作用後の光から形成される少なくとも1つの画像とを含む合成画像を形成することをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 前記画像は、デジタル画像としての捕捉前又は捕捉後にデジタル合成によって光学的に合成される、請求項29に記載の方法。
- 前記試料は、生体試料である、請求項20~30のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項20~31のいずれか一項に記載の方法に従って画像を形成するためのシステム。
- 画像形成システムを有する反射光顕微鏡、
照明システム、
上側表面及び下側表面を有する試料保持器であって、前記上側表面は、それに関連するプラズモニック層を有し、前記プラズモニック層は、サブミクロン構造の周期的アレイを含む、試料保持器
を含む、請求項32に記載のシステム。 - 前記試料の少なくとも1つのデジタル画像を生成するための画像捕捉システムを含む、請求項33に記載のシステム。
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