JP2022505158A - Ｎｋエンゲージャー分子およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

ＮＫ細胞を活性化して、癌および他の障害を治療するための免疫応答を刺激するための組成物が提供される。一実施形態では、本発明は、ＣＤ１６に結合するＮＫ結合ドメインと、ＮＫ結合ドメインに作動可能に連結されたＮＫ活性化ドメインと、標的細胞に選択的に結合する標的指向ドメインであって、ＮＫ活性化ドメインおよびＮＫ結合ドメインに作動可能に連結された、標的指向ドメインとを含む、化合物であって、標的指向ドメインが、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する、化合物を提供する。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１８年１０月１９日に出願された米国特許出願第６２／７４７９８３号の優先権の利益を主張するものであり、その全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

政府資金提供
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＣＡ１１１４１２およびＣＡ６５４９３の下で、国立癌研究所によって授与されたＣＡ３６７２５、ＣＡ７２６６９、ＣＡ０７７５９８およびＣＡ１９７２９２の下で、ならびに米国国防総省によって授与されたＣＡ１５００８５の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

配列表
添付の配列表の資料は、参照により本出願に組み込まれる。添付の配列表テキストファイル、名前ＧＴＢＩＯ２０９０ ＩＷＯ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔは、２０１９年１０月１５日に作成され、２３ｋｂである。このファイルには、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＯＳを使用するコンピューターでＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄを使用してアクセスできる。

発明の分野
本発明は、概して、免疫療法、より具体的にはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を免疫応答に関与させるのに有用な組成物に関する。

背景情報
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、免疫監視が可能な自然免疫系の細胞傷害性リンパ球である。細胞傷害性Ｔ細胞と同様に、ＮＫ細胞は膜貫通性およびアポトーシス誘導性のグランザイムおよびパーフォリン顆粒の貯蔵を提供する。Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は抗原刺激を必要とせず、ＭＨＣ認識がない場合に活性化受容体に結合することで標的を認識する。ＮＫ細胞は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する活性化受容体であるＣＤ１６を発現する。ＮＫ細胞はＩＬ－１５によって調節され、ＩＬ－１５は抗原依存性細胞傷害性、リンホカイン活性化キラー活性の増加を誘導し、および／またはインターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および／または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）応答を媒介することができる。これらのＩＬ－１５活性化機能はすべて、癌防御の改善に貢献する。

治療的には、ＮＫ細胞の養子移入は、例えば、リンパ球枯渇化学療法およびＩＬ－２と組み合わせてＮＫ細胞の生存およびインビボ増殖を刺激すると、難治性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者に寛解を誘導することができる。この治療法は、抗原特異性の欠如と、ＮＫ細胞の増殖および機能を抑制する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のＩＬ－２媒介性誘導によって制限される可能性がある。Ｔｒｅｇ阻害の悪影響を回避しながら、ＮＫ細胞抗原の特異性、増殖、および／または持続性を促進する試薬を生成することで、ＮＫ細胞ベースの免疫療法を強化することができる。

本発明は、ＮＫ細胞を活性化して、癌および他の障害を治療するための免疫応答を刺激するための化合物および組成物に関する。一実施形態では、本発明は、ＮＫ結合ドメインと、ＮＫ結合ドメインに作動可能に連結されたＮＫ活性化ドメインと、標的細胞に選択的に結合する標的指向ドメインであって、ＮＫ活性化ドメインおよびＮＫ結合ドメインに作動可能に連結された、標的指向ドメインとを含む、化合物であって、標的指向ドメインが、ＣＬＥＣ１２Ａに選択的に結合する、化合物を提供する。

いくつかの実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、ＣＤ１６に選択的に結合する部分を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ結合ドメイン部分は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはＶＨＨ）としても知られる抗体またはその結合フラグメント、あるいはナノボディを含む。いくつかの実施形態では、抗体結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその結合フラグメントあるいはナノボディは、ヒトのものであるかまたはヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗体またはその結合フラグメントあるいはナノボディは、ラクダ科動物のものである。

いくつかの実施形態では、ＮＫ活性化ドメインは、サイトカインまたはその機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ活性化ドメインは、ＩＬ－１５またはその機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５は、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。一態様では、ＩＬ－１５の機能的変異体は、配列番号９と比較して、Ｎ７２ＤまたはＮ７２Ａアミノ酸置換を含む。

いくつかの実施形態では、標的指向ドメイン部分は、抗体またはその結合フラグメント、あるいはナノボディを含む。いくつかの実施形態では、抗体結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂを含む。

いくつかの実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、ＣＤ１６に選択的に結合する部分を含み、ＮＫ活性化ドメインは、ＩＬ－１５を含み、標的指向ドメインは、ＣＬＥＣ１２Ａに選択的に結合する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および組成物は、２つのドメインを連結する少なくとも１つの隣接配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および組成物は、２つの連結されたドメインを第３のドメインと連結する第２の隣接配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、隣接配列は、ＮＫ活性化ドメインに隣接している。いくつかの実施形態では、第１の隣接配列は、ＮＫ結合ドメインのＣ末端側であり、第２の隣接配列は、抗ＣＬＥＣ１２Ａ標的指向ドメインのＮ末端側である。

いくつかの実施形態では、配列番号１を含む単離されたアミノ酸配列を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列をコードする単離されたＤＮＡ配列を本明細書で提供する。

いくつかの実施形態では、配列番号２を含む単離されたアミノ酸配列を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列をコードする単離されたＤＮＡ配列を本明細書で提供する。

いくつかの実施形態では、配列番号４を含む単離されたアミノ酸配列を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、配列番号４のアミノ酸配列をコードする単離されたＤＮＡ配列を本明細書で提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む組成物を本明細書で提供する。

いくつかの実施形態では、標的細胞のＮＫ媒介性殺傷を誘導するのに有効な量で本明細書に記載の化合物を対象に投与することを含む方法を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、癌細胞である。

いくつかの実施形態では、インビボでＮＫ細胞の増殖を刺激するための方法を本明細書に提供し、本方法は、対象におけるＮＫ細胞の増殖を刺激するのに有効な量の本明細書に記載の化合物を対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、対象における癌を治療する方法を本明細書に提供し、本方法は、癌を治療するのに有効な量の本明細書に記載の化合物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、癌には、前立腺癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、黒色腫、腎臓癌、腎癌、口腔癌、咽頭癌、膵臓癌、子宮癌、甲状腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、子宮頸癌、卵巣癌、または造血性癌が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、化学療法、腫瘍の外科的切除、または放射線療法の前、同時、または後に化合物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、化学療法は、アルトレタミン、アムサクリン、Ｌ－アスパラギナーゼ、コラスパーゼ（ｃｏｌａｓｐａｓｅ）、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、サイトホスファン（ｃｙｔｏｐｈｏｓｐｈａｎｅ）、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、フォテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファマイド（ｉｆｏｓｆａｍａｉｄｅ）、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、ラルチトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンを含む。いくつかの実施形態では、造血性癌は、ＡＭＬである。

ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥで処置したときのＮＫ細胞増殖を示している。 ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥで処置したときのＮＫ細胞殺傷を示している。 ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥで処置したときの機能アッセイを示している。 １０名の患者からの原発性ＡＭＬサンプルでのＣＤ３３およびＣＬＥＣ１２Ａ表面発現の割合を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥを示している。 作用機序を示している。 ＣＬＥＣ１２Ａを発現する標的へのＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの結合を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによるＮＫ細胞増殖の促進を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによるＮＫ細胞増殖の促進を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによるＡＭＬ標的細胞に対する脱顆粒の誘導を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによるＡＭＬ標的細胞に対するサイトカイン産生の誘導を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによるＡＭＬ標的細胞に対するサイトカイン産生の誘導を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによるＡＭＬ標的細胞殺傷の誘導を示している。 インビトロでの原発性ＡＭＬ標的のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。 インビトロでの原発性ＡＭＬ標的のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。 インビトロでの原発性ＡＭＬ標的のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。 インビトロでの原発性ＡＭＬ標的のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによるＮＫ細胞増殖の誘導を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによるＮＫ細胞増殖の誘導を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによるＮＫ細胞増殖の誘導を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの機能検証を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの機能検証を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの機能検証を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの機能検証を示している。 リアルタイムイメージングアッセイにおけるＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる標的細胞殺傷の誘導を示している。ＴＨＰ－１腫瘍標的が示されている。 リアルタイムイメージングアッセイにおけるＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる標的細胞殺傷の誘導を示している。ＴＨＰ－１腫瘍標的が示されている。 リアルタイムイメージングアッセイにおけるＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる標的細胞殺傷の誘導を示している。ＴＨＰ－１腫瘍標的が示されている。 原発性ＡＭＬ芽球のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。 原発性ＡＭＬ芽球のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。 原発性ＡＭＬ芽球のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。 原発性ＡＭＬ芽球のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。 原発性ＡＭＬ芽球のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。 原発性ＡＭＬ芽球のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。 原発性ＡＭＬ芽球のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥがインビボでの腫瘍増殖を制限することを示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥがインビボでの腫瘍増殖を制限することを示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥがインビボでの腫瘍増殖を制限することを示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥがインビボでの腫瘍増殖を制限することを示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥがインビボでの腫瘍増殖を制限することを示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥがインビボでの腫瘍増殖を制限することを示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥがインビボでの腫瘍増殖を制限することを示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの結合検証を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの結合検証を示している。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの結合検証を示している。 リアルタイムイメージングアッセイにおけるＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる標的細胞殺傷の誘導を示している。ＨＬ－６０腫瘍標的が示されている。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ媒介性標的殺傷を示している。標的ゲーティング戦略が示されている。ＡＭＬ芽球標的が示されている。 ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ媒介性標的殺傷を示している。標的細胞殺傷が示されている。ＡＭＬ芽球標的が示されている。 ＡＭＬ患者の骨髄サンプル中の癌幹細胞を同定するためのゲーティング戦略を示している。 骨髄のＣＤ３４ｐｏｓ前駆細胞コンパートメント内でのＣＬＥＣ１２ＡおよびＣＤ３３の発現を示している。２名の代表的なドナー由来の細胞集団を示す。 骨髄のＣＤ３４ｐｏｓ前駆細胞コンパートメント内でのＣＬＥＣ１２ＡおよびＣＤ３３の発現を示している。示されたＴｒｉＫＥによる処置後の細胞コロニーを示す。 健常骨髄サンプル中の様々なＣＤ３４ｐｏｓ前駆細胞亜集団を特定するためのゲーティング戦略を示している。

発明の詳細な説明
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、免疫監視が可能な自然免疫系の細胞傷害性リンパ球である。細胞傷害性Ｔ細胞と同様に、ＮＫ細胞は膜貫通性およびアポトーシス誘導性のグランザイムおよびパーフォリン顆粒の貯蔵を提供する。Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は抗原刺激を必要とせず、ＭＨＣ認識がない場合に活性化受容体に結合することで標的を認識する。ＮＫ細胞は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する活性化受容体であるＣＤ１６を発現する。ＮＫ細胞はＩＬ－１５によって調節され、ＩＬ－１５は抗原依存性細胞傷害性、リンホカイン活性化キラー活性の増加を誘導し、および／またはインターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および／または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）応答を媒介することができる。これらのＩＬ－１５活性化機能はすべて、癌防御の改善に貢献する。

治療的には、ＮＫ細胞の養子移入は、例えば、リンパ球枯渇化学療法およびＩＬ－２と組み合わせてＮＫ細胞の生存およびインビボ増殖を刺激すると、難治性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者に寛解を誘導することができる。この治療法は、抗原特異性の欠如と、ＮＫ細胞の増殖および機能を抑制する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のＩＬ－２媒介性誘導によって制限される可能性がある。Ｔｒｅｇ阻害の悪影響を回避しながら、ＮＫ細胞抗原の特異性、増殖、および／または持続性を促進する試薬を生成することで、ＮＫ細胞ベースの免疫療法を強化することができる。

本開示は、腫瘍細胞（例えば、ＣＤ３３＋および／またはＣＤ３３－腫瘍細胞）のＮＫ細胞媒介性殺傷を推し進めることができる２つのドメイン、およびＮＫ細胞自己持続シグナルを生成することができる分子内ＮＫ活性化ドメインを含む三重特異性分子の生成を記載する。三重特異性分子は、例えば、ＨＬ－６０標的、癌細胞、または癌細胞由来細胞株に対して、ＮＫ細胞増殖を推し進め、および／またはＮＫ細胞推進細胞傷害性を増強することができる。

本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を使用して急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞を標的とする、ＣＤ１６／ＩＬ－１５／ＣＤ３３三重特異性キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）分子の開発に基づいている。この分子には、ＮＫ細胞を活性化する抗ＣＤ１６ラクダ科動物ナノボディ、癌標的に結合する抗ＣＤ３３一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、およびＮＫ細胞の刺激、増殖および生存を促進するＩＬ－１５分子が含まれる。この分子の初期のバージョンを使用して、ＣＤ３３ ＴｒｉＫＥは、インビトロおよびインビボでＡＭＬ標的に対してＮＫ細胞を活性化するのに有効であることが示された。この前臨床データにより、２０１８年第３四半期に設定されたミネソタ大学で難治性ＡＭＬ患者を対象とした臨床試験が確立につながった。これらの以前の研究では、癌免疫療法でＮＫ細胞を利用する有効な戦略としてＴｒｉＫＥの使用が検証されているが、ＣＤ３３には標的抗原としての制限がある。

ＡＭＬ患者の高い死亡率と低い５年生存率（２６％）は、化学療法抵抗性と疾患の再発に起因する可能性がある。再発を促進すると仮定されている化学療法抵抗性白血病幹細胞（ＬＳＣ）の大部分は、ＣＤ３３を発現していない。さらに、すべての造血幹細胞および正常な骨髄細胞はＣＤ３３を発現するため、この抗原を標的にすると、造血に重大な欠陥が生じ、オンターゲット／オフ腫瘍毒性が生じる可能性がある。これらの制限に対処するために、本明細書では、ＣＬＥＣ１２ＡまたはＣ型レクチン様分子１（ＣＬＬ－１）を標的とするＴｒｉＫＥの開発について説明する。ＣＬＥＣ１２ＡはＡＭＬ細胞で高度に発現しており、ＣＤ３３陰性細胞の７０％以上がＣＬＥＣ１２Ａを発現している。ＣＬＥＣ１２Ａは、ＡＭＬの幹細胞マーカーであり、ＬＳＣで選択的に過剰発現しているとされている。ＣＬＥＣ１２Ａは、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８ ＬＳＣによって発現されるが、骨髄の再生において正常なＣＤ３４＋／ＣＤ３８造血幹細胞では発現されないため、オフターゲット効果が最小限に抑えられる。Ｃ型レクチンドメインファミリー１２のメンバーＡは、ヒトではＣＬＥＣ１２Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子は、Ｃ型レクチン／Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬ／ＣＴＬＤ）スーパーファミリーのメンバーをコードしている。このファミリーのメンバーは、共通のタンパク質フォールドを共有し、細胞接着、細胞間シグナル伝達、糖タンパク質代謝回転、ならびに炎症および免疫応答における役割など、多様な機能を有している。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、顆粒球および単球の機能の負の調節因子である。この遺伝子のいくつかの選択的スプライシングされた転写変異体が記載されているが、これらの変異体のいくつかの完全長の性質は決定されていない。この遺伝子は、染色体１２ｐ１３のナチュラルキラー遺伝子複合体領域にある他のＣＴＬ／ＣＴＬＤスーパーファミリーメンバーと密接に関連している。

ＢｉＫＥおよびＴｒｉＫＥ化合物
ヒトファージディスプレイライブラリー技術に由来する抗ヒト抗ＣＤ１６ ｓｃＦｖを組み込んだ二重特異性融合が行われている（ＭｃＣａｌｌら、１９９９年、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：４３３～４４５）。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）受容体を介して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ＣＤ１６受容体を介したシグナル伝達は、カルシウムフラックスおよびＩＴＡＭのリン酸化を誘導し、溶解性顆粒と、インターフェロン（ＩＦＮγ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）などのサイトカインの放出を引き起こす。二重特異性分子は、他の標的分子（Ｇｌｅａｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ．２０１４年（１９）：３０１６～２６）、いわゆる二重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）と組み合わせてＣＤ１６受容体を誘発するように設計されている。１つのｓｃＦｖがＮＫ細胞を認識し、第２のｓｃＦｖが腫瘍抗原を認識することで、ＢｉＫＥは、様々なヒトの癌における細胞傷害性による殺傷を著しく増強することができる。１つの例示的なＢｉＫＥは、ＣＤ３３を標的とし、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に対するＮＫ細胞応答を増強した。ＭＤＳは、末梢血（ＰＢ）血球減少症を伴う正常または過細胞性骨髄（ＢＭ）、およびＡＭＬに進行するリスクの増加を特徴とするクローン性不均一幹細胞障害である。

ＮＫ細胞は、例えば、ＮＫ細胞の恒常性、増殖、生存、活性化、および／または発生に関与するＩＬ－１５を含む様々なサイトカインに応答する。例えば、ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞を活性化し、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後にＮＫ細胞を移植する際の機能的欠陥を回復させることができる。ＩＬ－１５およびＩＬ－２は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ（ＣＤ１２２）および共通のガンマ鎖（ＣＤ１３２）など、いくつかのシグナル伝達成分を共有している。ＩＬ－２とは異なり、ＩＬ－１５は、Ｔｒｅｇを刺激せず、免疫応答のＴｒｅｇ阻害を回避しながらＮＫ細胞の活性化を可能にする。ＮＫ細胞の恒常性および増殖を促進することに加えて、ＩＬ－１５は、移植後の状況で発生する可能性のあるＮＫ細胞の機能的欠陥を救うことができる。ＩＬ－１５はまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を刺激し、免疫療法の潜在性をさらに高めることができる。さらに、前臨床試験に基づくと、ＩＬ－１５の毒性プロファイルは、低用量でＩＬ－２よりも有利である可能性がある。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物を使用して、ＮＫ細胞を活性化し、ＮＫ細胞の刺激、増殖、および生存を促進することができる。

本開示は、一態様では、１つまたは複数の標的指向ドメイン（例えば、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞を標的とする）、および１つまたは複数のサイトカインＮＫ活性化ドメイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、または他のＮＫ細胞増強サイトカイン、ケモカイン、および／または活性化分子）を概して含み、各ドメインが他のドメインに作動可能に連結された三重特異性キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）分子を記載する。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、直接または間接の共有結合を指す。したがって、作動可能に連結されている２つのドメインは、互いに直接共有結合してもよい。逆に、２つの作動可能に連結されたドメインは、介在する部分（例えば、隣接配列）への相互共有結合によって連結されてもよい。２つのドメインは、例えば、それらが第３のドメインによって分離され、１つまたは複数の介在隣接配列を有するかまたは有さない場合、作動可能に連結されていると見なすことができる。

例示的なＢｉＫＥおよびＴｒｉＫＥ分子または化合物は、国際公開第２０１７０６２６０４号に記載されており、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、いくつかの実施形態では、ＮＫ結合ドメインと、ＮＫ結合ドメインに作動可能に連結されたＮＫ活性化ドメインと、標的細胞に選択的に結合する標的指向ドメインであって、ＮＫ活性化ドメインおよびＮＫ結合ドメインに作動可能に連結された標的指向ドメインとを含む化合物を記載し、標的指向ドメインは、標的分子に選択的に結合する。標的分子は、例えば、標的細胞の表面上に発現させることができる。標的細胞は、例えば、腫瘍細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、標的指向ドメインは、ＣＬＥＣ１２Ａに選択的に結合する。

本明細書で使用される場合、「選択的に結合」または「選択的に結合する」という用語は、本明細書に記載の結合分子またはドメイン、例えば、抗体または結合ドメイン、活性化ドメイン、または標的指向ドメインと、その結合パートナー、例えば、抗原または受容体との相互作用に関して、その相互作用が、結合パートナー上の特定の構造、例えば、抗原決定基またはエピトープまたはアミノ酸配列の存在に依存することを意味する。言い換えれば、結合分子またはドメインは、結合パートナーが他の分子の混合物中に存在する場合でさえ、結合パートナーに優先的に結合または認識する。結合は、共有または非共有相互作用、あるいは両方の組合せによって媒介されてもよい。「選択的に結合」または「選択的に結合する」および「特異的に結合」または「特異的に結合する」という用語は、互換的に使用されてもよい。

本明細書に記載の化合物は、Ｈｉｓタグを有してもよく、欠いていてもよい。Ｈｉｓタグはタンパク質の精製を可能にし、例えば、研究応用に有用であり得る。Ｈｉｓタグは、本明細書に記載の化合物または分子のＣ末端またはＮ末端に配置することができ、ＨｉｓタグのＮ末端側またはＣ末端側にスペーサーを含めることができる。一例として、本明細書に記載の化合物または分子のＣ末端に配置されるＨｉｓタグは、ＨｉｓタグのＮ末端側にスペーサーを含むことができる。別の例として、本明細書に記載の化合物または分子のＮ末端に配置されるＨｉｓタグは、ＨｉｓタグのＣ末端側にスペーサーを含むことができる。スペーサーを有する例示的なＨｉｓタグは、配列番号３である。配列番号３は、本明細書に記載の化合物のＣ末端に配置することができる。当業者は、任意の数のＨｉｓリピートがＨｉｓタグを構成することができ、任意の長さの任意のスペーサー配列が使用され得るか、またはスペーサーが使用され得ないことを理解するであろう。

いくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに選択的に結合するＴｒｉＫＥ化合物または分子は、配列番号１の単離されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに選択的に結合するＴｒｉＫＥ化合物または分子は、配列番号２の単離されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに選択的に結合する本明細書に記載の化合物の標的指向ドメインは、配列番号４の単離されたアミノ酸配列を含む。

配列番号１、配列番号２、および配列番号４の配列をコードする核酸配列も本明細書に記載されている。例えば、配列番号１は、配列番号５によってコードすることができ、配列番号２は、配列番号６によってコードすることができ、配列番号４は、配列番号７によってコードすることができる。当業者は、本明細書で提供される核酸分子の任意の機能的変異体が本開示で企図されることを理解するであろう。機能的変異体は、親分子から翻訳されたものと相同または同一のアミノ酸配列を提供するために翻訳することができる核酸配列である。

ＮＫ結合ドメイン
ＮＫ結合ドメインは、ＮＫ細胞に結合および／またはＮＫ細胞を活性化する任意の部分、および／またはＮＫ細胞の阻害をブロックする任意の部分を含むことができる。例示的なＮＫ細胞結合ドメインは、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ１６＋ＣＤ２、ＣＤ１６＋ＤＮＡＭ、またはＣＤ１６＋ＮＫｐ４６に結合する部分を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ１６に選択的に結合する部分を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、ＮＫ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、ＮＫ細胞の阻害をブロックする。

いくつかの実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、ＮＫ細胞の表面の成分に選択的に結合する抗体を含むことができる。他の実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、ＮＫ細胞の表面の成分に選択的に結合するリガンドまたは小分子を含むことができる。本明細書で使用される場合、「選択的に結合する」という用語は、例えば、特定の標的に対して任意の程度で異なる親和性を有するなど、２つ以上の選択肢を区別する能力を指す。本明細書で使用される場合、「抗体」は、一般に免疫グロブリンまたはそのフラグメントを指し、したがって、モノクローナル抗体、そのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは他の改変形態）、モノクローナル抗体および／またはそのフラグメントの組合せ、および／またはポリクローナル抗体の組合せを含む。したがって、簡潔にするために、ＮＫ細胞の表面の成分に選択的に結合する抗体への言及は、記載された結合特性を示す任意の抗体フラグメントを含む。同様に、ＮＫ細胞の表面の成分に選択的に結合するリガンドへの言及は、記載された結合特性を示すリガンドの任意のフラグメントを含む。

いくつかの実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、ＮＫ細胞の表面に少なくとも部分的に位置する受容体に選択的に結合することができる。特定の実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、ＮＫ細胞に結合する機能を果たし、それにより、以下でより詳細に記載される標的指向ドメインが選択的に結合する標的とＮＫとを空間的に近接させることができる。しかし、特定の実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、ＮＫ細胞を活性化する受容体に選択的に結合することができ、したがって、活性化機能も有する。上記のように、ＣＤ１６受容体の活性化は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘発する可能性がある。したがって、特定の実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、ＣＤ１６受容体に選択的に結合するのに有効な抗ＣＤ１６受容体抗体の少なくとも一部を含むことができる。他の実施形態では、ＮＫエンゲージャー細胞ドメインは、ＮＫ細胞を阻害するメカニズムを妨害し得る。そのような実施形態では、ＮＫエンゲージャードメインは、例えば、抗ＰＤ１／ＰＤＬ１、抗ＮＫＧ２Ａ、抗ＴＩＧＩＴ、抗キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、および／または任意の他の阻害ブロッキングドメインを含むことができる。

所望の程度のＮＫ選択性、したがって、所望の免疫結合特性を有するようにＮＫ結合ドメインを設計することができる。例えば、ＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）として同定されている。これらの受容体は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害に対してＮＫ細胞を活性化する。抗ＣＤ１６抗体は、ＮＫ細胞に選択的に結合するが、好中球にも結合することができる。抗ＣＤ１６ａ抗体は、ＮＫ細胞に選択的に結合するが、好中球には結合しない。抗ＣＤ１６ａ抗体を含むＮＫ結合ドメインを含むＴｒｉＫＥの実施形態は、ＮＫ細胞に結合することができるが、好中球には結合することができない。したがって、ＮＫ細胞に結合するが好中球には結合しないことが望まれ得る状況では、抗ＣＤ１６ａ抗体を含むようにＴｒｉＫＥのＮＫ結合ドメインを設計することができる。

ＮＫ結合ドメインが抗ＣＤ１６受容体ｓｃＦｖを含む様々な実施形態の文脈で本明細書に記載されているが、ＮＫ結合ドメインは、ＣＤ１６受容体に選択的に結合する任意の抗体または他のリガンドを含むことができる。さらに、ＮＫ結合ドメインは、例えば、細胞傷害性受容体２Ｂ４、低親和性Ｆｃ受容体ＣＤ１６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＲ－１、および／またはＤＮＡＭ－１などの任意のＮＫ細胞受容体に選択的に結合する抗体またはリガンドを含むことができる。一実施形態では、本発明の組成物は、操作可能な結合ＮＫＧ２Ｃ／ＩＬ－１５／ＣＤ３３の構築物である。部分の位置決めは、活性アッセイ（例えば、ＣＤ３３／ＩＬ－１５／ＮＫＧ２Ｃ）に基づいて変更することができることを理解されたい。

いくつかの実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、抗体またはその結合フラグメント、あるいはナノボディを含む。抗体結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂであってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＫ結合ドメインは、ナノボディを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、動物ナノボディに由来するヒト化ＣＤ１６エンゲージャーの使用を含むことができる。ｓｃＦｖは、リンカーによって結合された重可変鎖成分および軽可変鎖成分を有するが、ナノボディは、標的に特異的に結合することができる単一の単量体可変鎖、すなわち、可変重鎖または可変軽鎖からなる。ナノボディは、例えば、ラクダ科動物（例えば、ラマまたはラクダ）または軟骨魚などの任意の適切な動物の抗体に由来し得る。ナノボディは、より大きな抗体フラグメントと比較して、優れた物理的安定性、深い溝に結合する能力、および産生収率の向上を提供することができる。

例示的な一実施形態では、ナノボディベースのＮＫエンゲージャー分子は、ＥＦ９１と呼ばれる、公開されたラマナノボディ（ＧｅｎｅＢａｎｋ配列ＥＦ５６１２９１、Ｂｅｈａｒら、２００８年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２１（１）：１～１０）に由来するヒト化ＣＤ１６ナノボディを含むことができる。ラマＥＦ９１は、最初に、ＣＤ１９を含むＢｉＫＥに組み込まれ、このＣＤ１６エンゲージャーがＮＫ細胞の活性化を促進する能力を試験した。Ｒａｊｉ標的を用いたクロム放出アッセイでリツキシマブ媒介性殺傷と同様の機能を示した。分子の機能性を確認したら、ＣＤＲをヒト化ラクダ科スキャフォールドにクローン化し（Ｖｉｎｃｋｅら、２００９年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８４（５）：３２７３～３２８４）、ここではＨｕＥＦ９１と呼ばれているＣＤ１６エンゲージャーをヒト化した。ＨｕＥＦ９１の結合は、標準ＣＤ１６ ｓｃＦｖを使用して観察された結合と同等であり、ラマナノボディ可変重鎖をヒト化バックボーンに組み込んでも分子の特異性が妨げられていないことを示している。本明細書に記載のＴｒｉＫＥ分子におけるＮＫエンゲージャーとしてのＨｕＥＦ９１の使用は、薬剤収量を増加させ、安定性を増加させ、および／またはＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣの有効性を増加させることができる。

したがって、いくつかの実施形態によれば、抗体またはその結合フラグメントあるいはナノボディは、ヒトのものであるかまたはヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗体またはその結合フラグメントあるいはナノボディは、ラクダ科動物のものである。

ＮＫ活性化ドメイン
ＮＫ活性化ドメインは、ＮＫ細胞を活性化し、ＮＫ細胞の持続を促進し、またはそうでなければＮＫ細胞活性を促進するアミノ酸配列を含むことができる。ＮＫ活性化ドメインは、ＮＫ細胞を活性化および／または維持することができる１つまたは複数のサイトカインであってもよく、またはそれらに由来してもよい。本明細書で使用される場合、「由来する」という用語は、ＮＫ細胞の活性化および／または持続活性を提供するのに十分なサイトカイン（例えば、ＩＬ－１５）のアミノ酸フラグメントを指す。複数のＮＫ活性化ドメインを含む実施形態では、ＮＫ活性化ドメインは、連続して、または任意の他の組合せで提供され得る。さらに、各サイトカインベースのＮＫ活性化ドメインは、サイトカインの完全なアミノ酸配列を含むことができ、またはＴｒｉＫＥ分子に含まれる他のＮＫ活性化ドメインの性質とは無関係に、アミノ酸フラグメントであってもよい。ＮＫ活性化ドメインが基づくことができる例示的なサイトカインには、例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－１２、およびＩＬ－２１が含まれる。したがって、ＮＫ活性化ドメインがＩＬ－１５に由来する例示的なモデル実施形態の文脈で本明細書に詳細に記載されているが、ＴｒｉＫＥは、任意の適切なサイトカインであるか、または任意の適切なサイトカインに由来するＮＫ活性化ドメインを使用して設計され得る。

この説明を簡潔にするために、ＮＫ活性化ドメインが基づくサイトカインを同定することによるＮＫ活性化ドメインへの言及は、サイトカインの完全なアミノ酸配列、サイトカインの任意の適切なアミノ酸フラグメント、および／または１つまたは複数のアミノ酸置換を含むサイトカインの改変バージョンの両方を含む。したがって、「ＩＬ－１５」ＮＫ活性化ドメインへの言及は、ＩＬ－１５の完全なアミノ酸配列を含むＮＫ活性化ドメイン、ＩＬ－１５のフラグメントを含むＮＫ活性化ドメイン、または野生型ＩＬ－１５アミノ酸配列と比較したアミノ酸置換を含む、例えばＩＬ－１５Ｎ７２ＤまたはＩＬ－１５Ｎ７２ＡなどのＮＫ活性化ドメインを含む。

ＴｒｉＫＥでＩＬ－１５ ＮＫ活性化ドメインを使用すると、３週間後でさえ、ヒトＮＫ細胞が劇的に上昇し、癌が減少することを示すマウスモデルにおいて証明されるように、持続的なＮＫ細胞活性を提供することができる。ＮＫ細胞はマウスで活性化され、一連の抗癌因子およびサイトカインを産生する。さらに、ＩＬ－１５ ＮＫ活性化ドメインは、これらの分子の化学的性質を変化させて、リフォールディングをより容易にし、および／またはより高い収率で回収できるようにし、したがって、ＴｒｉＫＥ分子を臨床スケールアップにより適したものにする。

したがって、いくつかの実施形態では、ＮＫ活性化ドメインは、サイトカインまたはその機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、活性化ドメインは、ＩＬ－１５またはその機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５は、野生型ＩＬ－１５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５は、ヒトのものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５は、野生型ヒトＩＬ－１５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５は、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５の機能的変異体は、配列番号９と比較して、Ｎ７２ＤまたはＮ７２Ａアミノ酸置換を含む。

本明細書で使用される場合、「機能的変異体」という用語は、結合分子を含む分子を指し、例えば、親分子のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸により改変されたヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含む。結合分子については、機能的変異体は、結合パートナーへの結合について、親結合分子と依然として競合することができる。言い換えれば、親結合分子のアミノ酸および／またはヌクレオチド配列の修飾は、ヌクレオチド配列によってコードされるか、またはアミノ酸配列を含む結合分子の結合特性に有意に影響を及ぼすことも変化させることもなく、すなわち、結合分子は依然としてその標的を認識して結合することができる。機能的変異体は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加および欠失を含む保存的な配列修飾を有し得る。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発およびランダムＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で知られている標準的な技術によって導入することができる。

機能的変異体はまた、限定されるものではないが、一次構造配列が実質的に類似しているが、例えば、親結合分子には見られない化学的および／または生化学的なインビトロまたはインビボ改変を含む誘導体を含むことができる。このような修飾としては、とりわけ、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、例えばアルギニル化、ユビキチン化などが挙げられる。

標的指向ドメインおよび標的
標的指向ドメインは、例えば、腫瘍細胞、癌間質の標的、ＣＤ３３＋である骨髄由来サプレッサー細胞などの阻害細胞上の標的、またはウイルス感染細胞の標的などの意図される標的に選択的に結合する任意の部分を含むことができる。したがって、標的指向ドメインは、例えば、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、アフツズマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ペルツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ラベツズマブ（抗ＣＥＡ）、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、シタツズマブボガトックス（抗ＥｐＣＡＭ）、エドレコロマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、アルシツモマブ（抗ＣＥＡ）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ－Ａ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ザルツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（抗ＣＤ３３）、リンツズマブ（抗ＣＤ３３）、エタラシズマブ（抗インテグリンα_ｖβ_３）、インテツムマブ（抗ＣＤ５１）、イピリムマブ（抗ＣＤ１５２）、オレゴボマブ（抗ＣＡ－１２５）、ボツムマブ（抗腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、またはペムツムマブ（抗ＭＵＣ１）、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ１３３、抗ＣＤ３８抗メソテリン、抗ＲＯＲ１、ＣＳＰＧ４、ＳＳ１、またはＩＧＦＲ１などの抗腫瘍抗体を含むことができる。任意の腫瘍マーカーを標的にすることができる。いくつかの実施形態では、標的指向ドメイン、または標的とされる腫瘍関連抗原は、例として、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、インテグリンα_Ｖβ_３、ＣＤ５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１２５、ＣＴＡＡ１６．８８、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３８、メソテリン、ＲＯＲ１、ＣＳＰＧ４、ＳＳ１、またはＩＧＦＲ１、ＮＫＧ２ファミリーメンバー（２Ａ、２Ｂ、２Ｃなどを含むがこれらに限定されない）、ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７Ｈ３、およびＰＳＭＡを含むことができる。

いくつかの実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ＣＤ３３＋である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ＣＤ３３－である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、造血性癌細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、白血病細胞である。いくつかの実施形態では、白血病細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。他の実施形態では、標的指向ドメインは、例えば、ＥＢＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、および／またはＨＰＶなどのウイルスに感染した細胞上の標的に選択的に結合することができる。いくつかの実施形態では、ウイルス標的は、腫瘍マーカーまたは腫瘍抗原である。任意のウイルス腫瘍マーカーあるいはウイルスまたは非ウイルス腫瘍抗原を標的にすることができる。

標的指向ドメイン部分は、上記のように、抗体、または抗体の結合フラグメント、あるいはナノボディを含むことができる。抗体結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂを含むことができる。

特定の実施形態では、標的指向ドメインは、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体を含むことができる。他の特定の実施形態では、第２の標的指向ドメインを含めることができる。第２の標的指向ドメインは、上記の標的のいずれかに結合することができる部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の標的指向ドメインは、ＣＤ３３に選択的に結合することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、ＣＤ１６に選択的に結合する部分を有するＮＫ結合ドメイン、ＩＬ－１５を有する活性化ドメイン、およびＣＬＥＣ１２Ａに選択的に結合する標的指向ドメインを含む。「ＣＬＥＣ１２Ａ Ｔｒｉｋｅ」、「１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫｅ」、および「ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ」という用語は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、ＣＬＥＣ１２Ａを標的とするＴｒｉＫＥを指すために互換的に使用することができる。

隣接配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、上記のドメインのうちの２つを連結することができる隣接配列またはリンカー配列をさらに含むことができる。「隣接配列」および「リンカー配列」という用語は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、互換的に使用することができる。いくつかの実施形態では、隣接配列の存在は、ＮＫ細胞の活性化をさらに増加させることができる。任意のアミノ酸配列は、隣接配列またはリンカー配列であってもよい。１つの例示的な隣接配列は、配列番号１３の２０個のアミノ酸を含む。別の例示的な隣接配列は、配列番号１４の７個のアミノ酸を含む。さらに別の例示的な隣接配列は、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１５を含む。さらに別の例として、アミノ酸配列の任意の数の反復は、隣接配列またはリンカー配列であってもよい。例えば、配列番号１５の配列の任意の数の反復は、隣接配列またはリンカー配列であってもよい。配列反復は完全または部分的であってもよく、完全または部分的反復は、隣接配列またはリンカー配列の最初、すなわちＮ末端に、または最後、すなわちＣ末端にあってもよい。隣接配列は任意の方向にすることができる。

特定の実施形態（例えば、Ｈｉｓタグのない１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ、配列番号１またはＨｉｓタグのある１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ、配列番号２）は、２つ以上の隣接配列を含むことができる。一例として、配列番号１および／または配列番号２は、ＮＫ結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ１６受容体ｓｃＦｖ）をＮＫ活性化ドメイン（例えば、ＩＬ－１５）と連結する配列番号１１の隣接配列を含む。配列番号１および／または配列番号２はまた、ＮＫ活性化ドメインを標的指向ドメイン（例えば、抗ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖ）と連結する配列番号１２の隣接配列を含む。分子のドメインを連結する隣接配列は、同じでもよく、または異なってもよい。一例として、同じまたは異なる隣接配列は、ＮＫ結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ１６受容体ｓｃＦｖ）をＮＫ活性化ドメイン（例えば、ＩＬ－１５）と連結し、ＮＫ活性化ドメインを標的指向ドメイン（例えば、ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖ）と連結することができる。いくつかの実施形態では、隣接配列を欠く構築物は、隣接配列を有する構築物と比較して低下した活性を示す。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、２つのドメインを連結する少なくとも１つの隣接配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、２つの連結されたドメインを第３のドメインと連結する第２の隣接配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、隣接配列は同じである。いくつかの実施形態では、隣接配列は異なる。

いくつかの実施形態では、隣接配列は、ＮＫ活性化ドメインに隣接している。いくつかの実施形態では、第１の隣接配列は、ＮＫ結合ドメインのＣ末端側である。いくつかの実施形態では、第２の隣接配列は、抗ＣＬＥＣ１２Ａ標的指向ドメインのＮ末端側である。いくつかの実施形態では、第１の隣接配列は、ＮＫ結合ドメインのＣ末端側であり、第２の隣接配列は、抗ＣＬＥＣ１２Ａ標的指向ドメインのＮ末端側である。

製剤
本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容される担体を配合することができる。本明細書で使用される場合、「担体」には、任意の溶媒、分散媒体、媒体、コーティング、希釈剤、抗菌剤、および／または抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。医薬活性物質のためのそのような溶媒および／または薬剤の使用は、当技術分野で公知である。従来の溶媒または薬剤が有効成分と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が企図されている。補助的な有効成分もまた、組成物に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、生物学的または他の点で望ましくないものではない材料を指し、すなわち、この材料は、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはこの材料が含まれる医薬組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することなく、ＴｒｉＫＥ分子とともに個体に投与することができる。

したがって、ＴｒｉＫＥ分子を医薬組成物に配合することができる。医薬組成物は、好ましい投与経路に適合した様々な形態で配合することができる。したがって、組成物は、例えば、経口、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内など）、または局所（例えば、鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、経皮、直腸など）を含む公知の経路を介して投与することができる。医薬組成物は、例えば、鼻粘膜または呼吸粘膜への投与（例えば、スプレーまたはエアロゾル）などによって、粘膜表面に投与することができる。組成物はまた、持続放出または遅延放出を介して投与することができる。

したがって、ＴｒｉＫＥ分子は、溶液、懸濁液、乳濁液、スプレー、エアロゾル、または任意の形態の混合物を含むが、これらに限定されない任意の適切な形態で提供され得る。組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤、担体、または媒体を含む製剤で送達することができる。例えば、製剤は、例えば、クリーム、軟膏、エアロゾル製剤、非エアゾルスプレー、ゲル、ローションなどの従来の局所剤形で送達することができる。製剤は、例えば、アジュバント、皮膚浸透促進剤、着色剤、香料、香味料、保湿剤、増粘剤などを含む１つまたは複数の添加剤をさらに含むことができる。

製剤は、単位剤形で好都合に提示することができ、薬局の分野で公知の方法によって調製することができる。薬学的に許容される担体を含む組成物を調製する方法は、１つまたは複数の付属成分を構成する担体とＴｒｉＫＥ分子とを結合させるステップを含む。一般に、製剤は、活性分子を液体担体、細かく分割された固体担体、またはその両方と均一におよび／または密接に会合させ、次いで、必要に応じて、生成物を所望の製剤に成形することによって調製することができる。

処置法
いくつかの実施形態では、標的細胞のＮＫ媒介性殺傷を誘導するのに有効な量で本明細書に記載の化合物または分子を対象に投与することを含む方法を本明細書で提供する。どの細胞も標的細胞にすることができる。いくつかの実施形態では、標的細胞は、癌細胞である。本明細書に記載の方法は、対象の標的細胞のＮＫ媒介性殺傷を誘導するのに有効な量でＴｒｉＫＥ分子を対象に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＴｒｉＫＥ分子は、対象の疾患または状態を治療するために投与される。

本明細書で使用される場合、「治療する」またはその変形は、状態に関連する症状または徴候を、任意の程度まで、低減させること、進行を制限すること、改善すること、または解決することを指す。本明細書で使用される場合、「改善する」は、特定の状態に特徴的な症状または臨床徴候の程度、重症度、頻度、および／または可能性における任意の減少を指し、「症状」は、病気または患者の状態の任意の主観的な証拠を指し、「徴候」または「臨床徴候」は、対象または患者以外の者が発見することができる特定の状態に関連する客観的な身体的所見を指す。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本明細書に開示される方法が実行される任意の個人または患者を指す。「対象」という用語は、「個体」または「患者」という用語と互換的に使用することができる。「対象」は、例えば、哺乳動物（例えば、犬、猫、馬、牛、羊、山羊、猿など）などの任意の動物であってもよい。特定の実施形態では、対象は、ヒトであってもよい。

「処置」は、治療的または予防的であってもよい。「治療的」およびその変形は、状態に関連する１つまたは複数の既存の症状または臨床的徴候を改善する処置を指す。「予防的」およびその変形は、状態の症状または臨床的徴候の発生および／または出現を任意の程度制限する処置を指す。一般に、「治療的」処置は、状態が対象に現れた後に開始され、「予防的」処置は、状態が対象に現れる前に開始される。したがって、特定の実施形態では、この方法は、状態を発症するリスクがある対象の予防的処置を含むことができる。「リスクがある」は、記載されているリスクを実際に有していても有していなくてもよい対象を指す。したがって、例えば、特定の状態を発症する「リスクがある」対象は、対象が状態を有するまたは発症する任意の症状または臨床的徴候を示すかどうかにかかわらず、１つまたは複数の兆候を欠く個体と比較して、特定の状態を有するまたは発症するリスクが高い１つまたは複数の兆候を有する対象である。状態の例示的な兆候は、例えば、遺伝的素因、祖先、年齢、性別、地理的位置、ライフスタイル、または病歴を含むことができる。症状が解消した後、例えば再発を予防または遅延させるために、処置を継続することもできる。

他の実施形態では、インビボでＮＫ細胞の増殖を刺激するための方法は、対象におけるＮＫ細胞の増殖を刺激するのに有効な量で本明細書に記載の化合物または分子を対象に投与することを含み、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＴｒｉＫＥ分子は、対象の疾患または状態を治療するために投与される。インビボ処置の一部としてＴｒｉＫＥ分子を使用すると、ＮＫ細胞を抗原特異的にすると同時に、抗原特異的であってもよい共刺激、生存の増強、および増殖を行うことができる。その他の場合、ＴｒｉＫＥは、ＮＫ細胞養子移入療法のアジュバントとしてインビトロで使用することができる。

さらに他の実施形態では、癌を治療する方法は、癌を治療するのに有効な本明細書に記載の化合物または分子を対象に投与することを含み、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、黒色腫、腎臓癌、腎癌、口腔癌、咽頭癌、膵臓癌、子宮癌、甲状腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、子宮頸癌、卵巣癌、または造血性癌である。いくつかの実施形態では、造血性癌は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。いくつかの実施形態では、造血性癌は、リンパ腫である。いくつかの実施形態では、造血性癌は、白血病である。いくつかの実施形態では、造血性癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

本明細書で使用される場合、「骨髄性白血病」という用語は、骨髄組織の増殖、ならびに循環血液中の顆粒球、骨髄球および骨髄芽球の数の異常な増加を特徴とする白血病を指す。この用語は、骨髄球性白血病（ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、および顆粒球性白血病（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）という用語と同義である。「骨髄性白血病」という用語は、とりわけ、骨髄の骨髄系要素（例えば、白血球、赤血球および巨核球）が関与する、急性および慢性骨髄性白血病（ＡＭＬおよびＣＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性骨髄単球性白血病（「ＣＭＭＬ」）、骨髄異形成症候群、および若年性骨髄単球性白血病を表すことができ、当業者に公知の形態学的、組織化学的および免疫学的手法によって定義されるすべてのサブタイプを含む。ＡＭＬのサブタイプには、ＦＡＢ分類に従って、ＦＡＢ－Ｍ０、ＦＡＢ－Ｍ１、ＦＡＢ－Ｍ２、ＦＡＢ－Ｍ３、ＦＡＢ－Ｍ４、ＦＡＢ－Ｍ５、ＦＡＢ－Ｍ６およびＦＡＢ－Ｍ７が含まれる。

本明細書で使用される場合、「骨髄異形成症候群」という用語は、骨髄の初期造血細胞に起因する、密接に関連したクローン性造血障害の異種群を包含する。すべての障害は、形態および成熟の障害（骨髄造血不全）を伴う細胞骨髄、および無効な血球産生に起因する末梢血血球減少症を特徴とする。言い換えれば、成熟中の血球は、完全に成熟して血液に入る前に骨髄で死滅することが多く、血球濃度が低いことを説明する。骨髄異形成症候群を患っている患者では、白血病芽球細胞と呼ばれる非常に未熟な骨髄細胞の蓄積もあり得る。

投与されるＴｒｉＫＥ分子の量は、使用される特定のＴｒｉＫＥ分子、対象の体重、健康状態、および／または年齢、および／または投与経路を含むがこれらに限定されない様々な要因に応じて変化し得る。したがって、所与の単位剤形に含まれるＴｒｉＫＥ分子の絶対重量は、大きく変動する可能性があり、対象の種、年齢、体重および健康状態、および／または投与方法などの要因に依存する。したがって、すべての可能な用途に有効なＴｒｉＫＥ分子の量を構成する量を一般的に説明することは実用的ではない。しかし、当業者は、そのような要因を十分に考慮して、適切な量を容易に決定することができる。

いくつかの実施形態では、この方法は、例えば、約１００ｎｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量を対象に提供するのに十分な量のＴｒｉＫＥ分子を投与することを含むことができるが、いくつかの実施形態では、この方法は、この範囲外の用量でＴｒｉＫＥ分子を投与することにより行ってもよい。これらの実施形態のいくつかでは、この方法は、対象に約１０μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、約１００μｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの用量を提供するのに十分な量のＴｒｉＫＥ分子を投与することを含む。

あるいは、用量は、処置過程の開始直前に得られた実際の体重を使用して計算することができる。この方法で計算された用量の場合、体表面積（ｍ２）は、デュボア法を使用して処置過程の開始前に計算され、ｍ２＝（体重ｋｇ０．４２５×身長ｃｍ０．７２５）×０．００７１８４である。

いくつかの実施形態では、この方法は、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍ２～約１０ｍｇ／ｍ２の用量を提供するのに十分な量のＴｒｉＫＥ分子を投与することを含むことができる。

いくつかの実施形態では、ＴｒｉＫＥ分子は、例えば、週に単回投与から複数回投与まで投与することができるが、いくつかの実施形態では、この方法は、この範囲外の頻度でＴｒｉＫＥ分子を投与することによって行うことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉＫＥ分子は、月に約１回から週に約５回まで投与することができる。

いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数の追加の治療薬を投与することをさらに含む。１つまたは複数の追加の治療薬は、ＴｒｉＫＥ分子の投与の前、後、および／または同時に投与することができる。ＴｒｉＫＥ分子および追加の治療薬を同時投与することができる。本明細書で使用される場合、「同時投与」は、組合せの治療または予防効果が、単独で投与されるいずれかの成分の治療または予防効果よりも大きくなり得るように投与される、組合せの２つ以上の成分を指す。２つの成分を同時にまたは順次に同時投与することができる。同時に同時投与される成分は、１つまたは複数の医薬組成物で提供することができる。２つ以上の成分の連続同時投与は、各成分が同時に処置部位に存在することができるように成分が投与される場合を含む。あるいは、２つの成分の連続同時投与は、少なくとも１つの成分が処置部位から除去されているが、１つまたは複数の追加の成分が処置部位に投与されるまで、投与している成分の少なくとも１つの細胞効果（例えば、サイトカイン産生、特定の細胞集団の活性化など）が処置部位で持続する場合を含むことができる。したがって、同時投与される組合せは、特定の状況では、互いに化学混合物中に決して存在しない成分を含むことができる。他の実施形態では、ＴｒｉＫＥ分子および追加の治療薬は、混合物またはカクテルの一部として投与することができる。いくつかの態様では、ＴｒｉＫＥ分子の投与は、他の治療薬（複数可）単独の投与と比較した場合、他の治療法のより低い用量の有効性を可能にし、それにより、より高い用量の他の治療薬（複数可）が投与される場合に観察される毒性の可能性、重症度、および／または程度を減少させることができる。

例示的な追加の治療薬は、アルトレタミン、アムサクリン、Ｌ－アスパラギナーゼ、コラスパーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、サイトホスファン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、フォテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファマイド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、ラルチトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンを含む。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される癌を治療する方法は、化学療法、腫瘍の外科的切除、または放射線療法の前、同時、または後に、本明細書に記載の化合物、分子、組成物、または製剤を投与することをさらに含む。化学療法は、例えば、アルトレタミン、アムサクリン、Ｌ－アスパラギナーゼ、コラスパーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、サイトホスファン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、フォテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファマイド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、ラルチトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、本明細書に記載の十分なＴｒｉＫＥ分子を投与すること、および少なくとも１つの追加の治療薬を投与することを含むことができ、ＴｒｉＫＥ分子および少なくとも１つの追加の治療薬の投与は、治療的相乗効果を示す。本発明の方法のいくつかの態様では、本明細書に記載のＴｒｉＫＥ分子および追加の治療薬の両方を投与した後に観察される処置に対する応答の測定は、ＴｒｉＫＥ分子または追加の治療薬のいずれかを単独で投与した後に観察される処置に対する同様の測定よりも改善される。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、例えば、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３を標的とするモノクローナルハイブリッド抗体であるカツマキソマブなどのＥｐＣＡＭ特異的モノクローナル抗体を含む、ＥｐＣＡＭを標的とする追加の薬剤を含むことができる。

本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、表に記載された要素の１つまたはすべて、あるいは表に記載された要素の任意の２つ以上の組合せを意味し、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、およびそれらの変形は、制限がないと解釈されるべきであり、すなわち、追加の要素またはステップは任意選択であり、存在してもしなくてもよい。

本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の言及を含む。特に明記しない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および「少なくとも１つ」は互換的に使用することができ、１つまたは複数を意味することができる。したがって、例えば、「方法」への言及は、１つまたは複数の方法、および／または本開示などを読むと当業者に明らかになる本明細書に記載のタイプのステップを含む。

本明細書で使用される場合、エンドポイントによる数値範囲の表記には、その範囲内に含まれるすべての数値が含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などが含まれる）。

本明細書で使用される「約」は、量、持続時間などの測定可能な値を指す場合、特定の値から±２０％、または±１０％、または±５％、またはさらに±１％の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示される方法に適切であるか、または開示される方法を実施するのに適切である。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」という用語と互換的に使用され、アミノ酸のポリマー鎖も指す。「タンパク質」という用語は、天然または人工のタンパク質、タンパク質フラグメント、およびタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。タンパク質は、単量体または高分子であってもよい。「タンパク質」という用語は、文脈によって別段の矛盾がない限り、そのフラグメントおよび変異体（変異体のフラグメントを含む）を包含する。

本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、任意のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、または核酸類似体を指す。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、二本鎖または一本鎖であってもよく、任意のサイズであってもよい。例示的な核酸は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）、ｈｎＲＮＡを含むが、これらに限定されない。例示的な核酸類似体は、ペプチド核酸、モルホリノおよびロックド核酸、グリコール核酸、およびスレオース核酸を含む。

前述の説明では、明確にするために、特定の実施形態を単独で説明することができる。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と互換性がないことを特に明記されない限り、特定の実施形態は、１つまたは複数の実施形態に関連して本明細書に記載の互換性のある特徴の組合せを含むことができる。

個別のステップを含む本明細書に開示される任意の方法について、ステップは、任意の実行可能な順序で実施することができる。さらに、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組合せを同時に実施することができる。

本発明は、以下の実施例によって説明される。特定の例、材料、量、および手順は、本明細書に記載されている本発明の範囲および精神に従って広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。

実施例１
この実施例では、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの開発について説明する。

１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥは、適切な翻訳後修飾が存在することを確実するために、哺乳類細胞系で開発された。ＣＬＥＣ１２Ａを発現しないＲａｊｉ細胞と比較して、ＣＬＥＣ１２Ａを発現するＨＬ－６０およびＴＨＰ１標的細胞へのＴｒｉＫＥの特異的結合が確認された。１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の処置は、ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖまたはＩＬ－１５単独での処置と比較して、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ希釈で測定した場合、７日間にわたってＮＫ細胞特異的増殖の有意な増加をもたらした（６９．７±６．７％対１１．９±２．５％対３８．４±７．３％）（図１Ａ）。ＮＫ細胞の殺傷を測定するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍアッセイを行った。ここで、ＨＬ－６０標的細胞はカスパーゼ３／７試薬で標識されており、色の変化は標的細胞死を示している。１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥは、４８時間アッセイの終了時に生存標的細胞の数で測定した場合、ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖまたはＩＬ－１５よりも多くの標的細胞殺傷を誘導することができた（５３．９±１．９％対１０３．３±３．４％対７１．１±１．４％）。１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥは、ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖまたはＩＬ－１５単独での処置と比較して、４時間の機能アッセイでＨＬ－６０ ＡＭＬ腫瘍標的に対するＣＤ１０７ａ発現によって測定されるＮＫ細胞脱顆粒の増加を誘導した（６２．３±１．１％対１９．４±３．８％対２７．５±４．９％）。このアッセイでは、ＩＦＮｇおよびＴＮＦａでそれぞれ測定されるサイトカイン産生の増加もあった（１６．７±４．２％対２．３±１．５％対４．７±１．９％および１８．０±５．１％対２．５±１．７％対４．６±２．５％）（図１Ｂ）。ＴＨＰ－１ ＡＭＬ腫瘍標的による同様の増強された機能的応答が観察された。これらの機能アッセイでは、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる処置は、ＣＤ３３ ＴｒｉＫＥと比較してバックグラウンド活性化が少なく、ＰＢＭＣに対するオフターゲット効果が少ないことを示している。この分子の臨床的関連性を確認するために、原発性ＡＭＬ標的に対する１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの有効性を試験した。ＡＭＬ芽球は、ＳＳＣ低細胞、ＣＤ４５中細胞、およびＣＤ３４高細胞として同定された。試験した９つのＡＭＬサンプルのうち、７つは高レベルのＣＤ３３（７０．４±６．３％）およびＣＬＥＣ１２Ａ（７８．１±５．２％）を発現した。これらのサンプルを用いた機能アッセイでは、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥは、ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖまたはＩＬ－１５と比較して、ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮｇの発現を増加させることができ、生存／死滅染色で測定した腫瘍標的の殺傷を促進することができた（図１Ｃ）。これらのアッセイでは、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの有効性は、ＣＤ３３ ＴｒｉＫＥと同等であった。これらのデータは、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥが、インビトロでのＮＫ細胞特異的な増殖、脱顆粒、サイトカイン分泌、および腫瘍標的の殺傷を促進することを示している。ＡＭＬとは別に、ＣＬＥＣ１２Ａは、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）患者の癌細胞とＬＳＣに発現している。これらの知見は、ＭＤＳおよびＡＭＬの処置のための１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥを個別に、またはＣＤ３３ ＴｒｉＫＥと組み合わせて臨床的に可能性を強調している。

実施例２
この実施例では、ＡＭＬ細胞でのＣＤ３３およびＣＬＥＣ１２Ａの発現について説明する。

造血器悪性腫瘍による全死亡の大部分は、５年生存率が２６％と低い急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が原因であり、新しい治療法の必要性を強調している。ＡＭＬ細胞を標的とするために使用される最も一般的な抗原は、ＣＤ３３である。しかし、ＣＤ３３に対する治療法の開発には多くの制限がある。例えば、難治性ＡＭＬ患者の癌細胞を含め、すべての癌細胞がＣＤ３３を発現するわけではない。さらに、骨髄系のすべての細胞と、活性化されたＮＫ細胞やＴ細胞などのリンパ球系の一部の細胞がＣＤ３３を発現し、オフターゲット毒性を引き起こす。さらに、再発を促進すると考えられている癌幹細胞は、ＣＤ３３を発現しない。

Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ－１）またはＣＬＥＣ１２Ａと呼ばれる新規抗原は、上記の制限に対処するために標的にされた。

図２は、１０名の患者からの原発性ＡＭＬサンプルのフローサイトメトリー分析によって測定されたＣＤ３３およびＣＬＥＣ１２Ａ表面発現の割合を示している。ＣＬＥＣ１２Ａは、ＡＭＬ細胞で高度に発現していた。ＣＤ３３陰性細胞の約７０％がＣＬＥＣ１２Ａを発現した。ＣＬＥＣ１２Ａの発現は骨髄細胞のサブセットに限定され、オフターゲット毒性を制限した。ＣＬＥＣ１２Ａは白血病幹細胞に存在したが、造血幹細胞には存在しなかった。

これらのデータは、ＣＤ３３を発現する原発性ＡＭＬ細胞およびＣＤ３３発現を欠く原発性ＡＭＬ細胞の両方の表面マーカーとしてＣＬＥＣ１２Ａを確立する。したがって、いくつかの実施形態によれば、ＣＬＥＣ１２Ａは、ＣＤ３３を発現または欠如するＡＭＬおよび他の細胞上の三重特異性キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）分子によって標的とされ得る。

実施例３
この実施例では、ＣＬＥＣ１２Ａを標的とする三重特異的キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）分子について説明する。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を使用して癌細胞を標的とするために、ＮＫ細胞を活性化する抗ＣＤ１６重鎖抗体、ＮＫ細胞の刺激、増殖、および生存を推し進めるＩＬ－１５分子、ならびに癌標的に結合する抗ＣＬＥＣ１２Ａ単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む三重特異性キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）分子を開発した。ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの概略図および作用機序を図３Ａ～Ｂに示す。

ＴｒｉＫＥは、ラマ抗ＣＤ１６ Ｖ_ＨＨのＣＤＲをヒト化Ｖ_ＨＨバックボーンに組み込むことによって構築された抗ＣＤ１６重鎖抗体を含む（図３Ａ）。これは、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体からのｓｃＦｖに連結されている野生型ＩＬ－１５分子に連結されている。ＴｒｉＫＥ（配列番号１）は、Ｅｘｐｉ－２９３細胞を用いて哺乳動物系で産生され、分子を精製するために使用されるＨｉｓタグを含む。いくつかの実施形態によれば、ＴｒｉＫＥ分子は、Ｈｉｓタグを欠いてもよい。Ｈｉｓタグを欠くＴｒｉＫＥ分子は、臨床応用での使用に適しているが、Ｈｉｓタグを含むａＴｒｉＫＥも使用することができる。ＴｒｉＫＥは、ＣＬＥＣ１２Ａ＋腫瘍細胞とＮＫ細胞の間に免疫シナプスを形成し、細胞傷害性顆粒の放出および標的細胞を殺傷するサイトカインの分泌を促進する（図３Ｂ）。

例示的な実施例として上記の抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体からのｓｃＦｖ（配列番号４、米国特許第７，７４１，４４３号のＳＣ０２－３５７に対応する）に加えて、ＴｒｉＫＥ標的指向ドメインは、ｓｃＦｖ ＳＣ０２－３７８およびＳＣ０２－１６１、ならびにｓｃＦｖ ＳＣ０２－３５７、ＳＣ０２－３７８、およびＳＣ０２－１６１の任意の誘導体などの、ＣＬＥＣ１２Ａを標的とするまたはそれに結合することができる任意の配列を含むことができる。ｓｃＦｖ ＳＣ０２－３５７、ＳＣ０２－３７８、およびＳＣ０２－１６１は、米国特許第７，７４１，４４３号に記載されており、その開示は、特にｓｃＦｖ ＳＣ０２－３５７、ＳＣ０２－３７８、およびＳＣ０２－１６１の配列に関して、その全体が本明細書に組み込まれる。

実施例４
この実施例では、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの標的細胞への結合検証について説明する。

ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＨＬ－６０およびＣＬＥＣ１２Ａ－Ｒａｊｉ標的を、等モル濃度の１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥまたはｓｃＦｖと共にインキュベートした。結合は、ＴｒｉＫＥまたはｓｃＦｖのＨｉｓタグに結合する抗Ｈｉｓ抗体によって評価した。フローサイトメトリーによって検出された二次ストレプトアビジン抗体を使用した。図４のデータは、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥがＨＬ－６０標的に結合するが、Ｒａｊｉ標的には結合していないことを示している。

１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの様々な成分の結合は、ＣＤ１６（図１４Ａ）、ＩＬ１５受容体アルファ（図１４Ｂ）、およびＣＬＥＣ１２Ａ細胞外ドメイン（ＥＤ、図１４Ｃ）に対するＥＬＩＳＡを使用して試験した。ＴｒｉＫＥは、９００ｎＭ～０．４ｎＭの３倍連続希釈で試験し、３０ｎＭで最も高い結合を有し、これを、特に断りのない限り、その後の実験で使用した。

これらのデータは、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの各成分がそれぞれの標的分子に結合し、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥがＣＬＥＣ１２Ａを発現する標的に特異的に結合したことを示している。

実施例５
この実施例では、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによって誘導されるＮＫ細胞の増殖について説明する。

ＰＢＭＣをＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅで標識し、等モル濃度のＩＬ－１５、ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖ、またはＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥと７日間インキュベートした（図５Ａ）。フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ５６＋ＣＤ３－集団におけるＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ色素の希釈を評価することにより、ＮＫ細胞集団を評価した（図５Ｂ）。増殖したＮＫ細胞の割合は、ＦｌｏｗＪｏ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して計算した。統計は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、Ｎ＝１０で計算された群間の有意差を反映している。ＩＬ－１５またはＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖと比較して、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの存在下では、増殖したＮＫ細胞の割合が高くなった。

他の実験では、ＰＢＭＣを新鮮な健常ドナーサンプル（ｎ＝６）から単離し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識し、上記のように３０ｎＭで１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥまたは対照処置と共に７日間インキュベートした。インキュベーション期間後、細胞を回収し、ＮＫ細胞（ＣＤ３－、ＣＤ５６＋）の増殖をフローサイトメトリーで評価した。

プールされたデータ（図９Ａ）と代表的なヒストグラム（図９Ｂ）は、様々な処置群のＮＫ細胞増殖（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ希釈による）を示している。図９Ｃは、回収時のプールされたＮＫ細胞数（一定速度で４５秒）を示している。反復測定による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ群と比較した差を計算した。エラーバーは、平均の＋／－標準誤差を示す。統計的有意性は、^＊＊Ｐ＜０．００５、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１として決定される。ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥでの処置では、無処置、ＩＬ－１５での処置、またはＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖでの処置と比較して、増殖したＮＫ細胞の割合が大幅に高くなった。

これらのデータは、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥが強力なＮＫ細胞増殖を誘導したことを示している。

実施例６
この実施例では、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの機能検証について説明する。

ＰＢＭＣを、等モル濃度のＩＬ－１５、ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖまたはＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの存在下で、２：１のエフェクター対標的比でＣＬＥＣ１２Ａ＋ＨＬ－６０およびＴＨＰ１細胞と共にインキュベートした。脱顆粒を評価するための表面ＣＤ１０７ａ（図６Ａ）、細胞内ＩＦＮｇ（図６Ｂ）、および炎症性サイトカイン産生を評価するためのＴＮＦａ（図６Ｃ）を、フローサイトメトリーによってＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＮＫ細胞で評価した。ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる処置と、ＩＬ－１５またはＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖ対照による処置とを比較した統計は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、^＊＊Ｐ＜０．００５、Ｎ＝６で計算された群間の有意差を反映している。ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの存在下では、ＨＬ６０標的細胞およびＴＨＰ１標的細胞の両方について、無処置、ＩＬ－１５による処置、またはＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖによる処置と比較して、ＣＤ１０７ａ表面染色の割合が高く、ＮＫ細胞のＩＦＮｇおよびＴＮＦａ細胞内染色の割合が高くなった。

他の実験では、健常ドナー（ｎ＝６）からの凍結ＰＢＭＣを、示された処置（３０ｎＭ）と共にインキュベートして、４時間アッセイにおいて、脱顆粒のマーカーとしてのＣＤ１０７ａ発現（図１０Ａ）、細胞内ＩＦＮｇ産生（図１０Ｂ）、またはＮＫ細胞における細胞内ＴＮＦａ発現（ＣＤ３－、ＣＤ５６＋、図１０Ｃ）を評価した。細胞は、ＰＢＭＣ単独を使用して、または２：１のエフェクター／標的比でＴＨＰ１およびＨＬ－６０標的の存在下で評価した。ＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞（ＣＤ３－、ＣＤ５６＋）の活性化は、４時間アッセイにおいて、ＰＢＭＣ単独を使用して、または２：１のエフェクター／標的比でＴＨＰ１およびＨＬ－６０標的の存在下でＣＤ６９発現を使用して評価した（図１０Ｄ）。反復測定による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ群に対する差を計算した。エラーバーは、平均の＋／－標準誤差を示す。統計的有意性は、^＊Ｐ、．０５、^＊＊Ｐ、．０１、^＊＊＊Ｐ、．００１、および^＊＊＊＊Ｐ、．０００１として決定される。

より大きなＮＫ細胞活性化が見られ、これは、ＴＨＰ１標的細胞およびＨＬ６０標的細胞の両方について、無処置、ＩＬ－１５による処置、またはｓｃＦｖによる処置と比較して、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥとのインキュベーション時にＣＤ１０７ａ、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、およびＣＤ６９に対する染色の増加によって実証された（図１０Ａ～Ｄ）。

これらのデータは、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥが、ＴＨＰ１およびＨＬ－６０標的を含むＡＭＬ標的細胞に対して脱顆粒およびサイトカイン産生を誘導したことを示している。

実施例７
この実施例では、ＡＭＬ標的のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷について説明する。

濃縮したＮＫ細胞を、等モル濃度のＩＬ－１５、ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖ、またはＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの存在下で、２：１のエフェクター対標的比でＣＬＥＣ１２Ａ＋ＨＬ－６０（図７Ａ）およびＴＨＰ１（図７Ｂ）標的と共にインキュベートした。標的細胞は、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ色素およびカスパーゼ３／７緑色アポトーシスアッセイ試薬（エッセンバイオサイエンス社）で標識した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍマシンを使用して殺傷を評価し、細胞数を標的細胞の初期数に正規化することによって分析した。図７Ａ～Ｂのグラフは、以下の（上から）、（ｉ）無処置（一番上）、（ｉｉ）ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖによる処置（上から２番目）、（ｉｉｉ）ＩＬ－１５による処置（上から３番目／下から２番目）、（ｉｖ）ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる処置（上／下から４番目）を示している。生存標的細胞の割合は、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥで処置したときに最も低かった。

標的細胞殺傷の１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ媒介性誘導は、リアルタイムイメージングアッセイで評価した。濃縮したＮＫ細胞（ＣＤ３－、ＣＤ５６＋）を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ標識ＴＨＰ－１細胞と、２：１のエフェクター対標的比で、記載の処置（３０ｎＭ）と共に、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３イメージャー内で４８時間インキュベートした。死滅ＴＨＰ－１細胞は、カスパーゼ３／７試薬を使用して測定した。図１１Ａは、０時間の時点で、標的のみに対して正規化された生存ＴＨＰ－１腫瘍標的（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ／カスパーゼ３／７）の割合の定量化を示している。読み取りは、４８時間にわたって３０分ごとに行った。３つの別個の実験の代表例。上から１番目は無処置に対応し、上から２番目はＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖによる処置に対応し、上から３番目はＩＬ－１５による処置に対応し、上から４番目はＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる処置に対応する。生存ＴＨＰ－１細胞の割合が最も低いのは、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの存在下であった。

図１１Ｂは、０、１８、および３６時間での代表的な画像（元の倍率３４：２．８２ｍｍ／ピクセル）を表示し、ＴＨＰ－１細胞（より大きな細胞）およびＮＫ細胞（より小さな細胞）を示している。０時間では、示されたすべての処置条件で死細胞はほとんど存在しなかった。１８時間および３６時間で、無処置およびＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖ条件全体で、死滅ＴＨＰ－１細胞のクラスターはほとんど見られず、ＩＬ－１５による処置については死滅しつつあるＴＨＰ－１細胞のクラスターがいくつか存在し、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる処置については死滅しつつある細胞のクラスターがより多く存在した。

図１１Ｃは、異なるエフェクター対標的比（１：１、２：１および５：１）での生存ＴＨＰ－１腫瘍標的の割合の定量化を示す。上から１、２、３番目はＮＫ単独に対応し、上から４番目は１：１のＮＫ＋ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥに対応し、上から５番目は２：１のＮＫ＋ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥに対応し、上から６番目は５：１のＮＫ＋ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥに対応する。ＮＫ細胞単独と比較して、すべてのエフェクター対標的比で生存ＴＨＰ－１細胞の割合が低く、エフェクター対標的比が５：１で生存ＴＨＰ－１細胞の割合が最も低くなったが、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ処置が存在する場合、ＴＨＰ－１細胞の生存率のこの低下は最大であった。

他の実験では、濃縮したＮＫ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ標識ＨＬ－６０細胞と、２：１のエフェクター対標的比で、記載の処置（それぞれ３０ｎＭ）と共に、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ｓ３イメージャー内で４８時間インキュベートした。死滅ＨＬ－６０細胞は、カスパーゼ３／７試薬を使用して測定した。

図１５Ａは、標的のみおよび０時間の時点で正規化された生存ＨＬ－６０腫瘍標的（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ／カスパーゼ３／７）の割合の定量化を示している。読み取りは、４８時間にわたって３０分ごとに行った。３つの別個の実験の代表例。上から１番目は無処置に対応し、上から２番目はＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖによる処置に対応し、上から３番目はＩＬ－１５による処置に対応し、上から４番目はＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる処置に対応する。生存ＨＬ－６０細胞の割合が最も低いのは、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの存在下であった。

図１５Ｂは、０、１８、および３６時間の代表的な画像を表示し、ＨＬ－６０標的細胞（より大きな細胞）およびＮＫ細胞（より小さな細胞）を示している。０時間では、示されたすべての処置条件で死細胞はほとんど存在しなかった。１８時間および３６時間で、無処置およびＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖ条件全体で、死滅ＨＬ－６０細胞のクラスターはほとんど見られず、ＩＬ－１５による処置については死滅しつつあるＨＬ－６０細胞のクラスターがいくつか存在し、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる処置については死滅しつつある細胞のクラスターがより多く存在した。

これらのデータは、ＴＨＰ－１およびＨＬ－６０標的細胞を含むＡＭＬ標的のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。

実施例８
この実施例は、インビトロでの原発性ＡＭＬ芽球のＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ誘導殺傷を示している。

濃縮したＮＫ細胞を、等モル濃度のＩＬ－１５、ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖ、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ、またはＣＤ３３ ＴｒｉＫＥの存在下で、２：１のエフェクター対標的比で原発性ＡＭＬ芽球と共にインキュベートした。図８Ａは、ＦｌｏｗＪｏアナライザーを使用してＡＭＬ芽球を識別するためのゲーティングスキームを示している。図８Ｂは、４８時間後に芽球細胞をゲーティングした後、生存／死滅マーカーによって評価したＡＭＬ芽球の殺傷の割合を示している。脱顆粒を評価するための表面ＣＤ１０７ａ発現（図８Ｃ）および炎症性サイトカイン産生を評価するための細胞内ＩＦＮｇ（図８Ｄ）を、４時間後にフローサイトメトリーによってＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＮＫ細胞で評価した。統計は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、^＊Ｐ＜０．０５^＊＊Ｐ＜０．００５、Ｎ＝１０で計算された群間の有意差を反映している。死滅ＡＭＬ芽球の割合、およびＣＤ１０７ａおよびＩＦＮｇについての染色の割合は、ＩＬ－１５とのインキュベーションまたはＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖとのインキュベーションと比較して、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥとのインキュベーションで有意に大きかった（図８Ｂ～Ｄ）。

他の実験では、フローサイトメトリーを使用して、原発性ＡＭＬ芽球（ＳＳＣｈ低、ＣＤ４５中、ＣＤ１１７＋、ＣＤ１４－、ＣＤ３４＋）を、ＣＤ３３およびＣＬＥＣ１２Ａの発現について評価した（図１２Ａ）。示されているように、細胞は、ＣＤ３３、ＣＬＥＣ１２Ａ、またはＣＤ３３とＣＬＥＣ１２Ａの両方を発現した。

健常ドナー（ｎ＝１０）からの濃縮したＮＫ細胞（ＣＤ５６＋、ＣＤ３－）を、示された処置（３０ｎＭ）で原発性ＡＭＬ芽球と共にインキュベートして、２：１のエフェクター／標的比での４時間アッセイにおいて、脱顆粒のマーカーとしてのＣＤ１０７ａ発現（図１２Ｂ）および細胞内ＩＦＮｇ産生（図１２Ｃ）を評価した。ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥおよびＣＤ３３ ＴｒｉＫＥは、示されているように脱顆粒およびＩＦＮｇ産生を誘導した。標的細胞の殺傷はまた、フローサイトメトリーおよび生存／死滅マーカーを使用して４８時間にわたって評価した（図１２Ｄ）。ＩＬ－１５、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ、およびＣＤ３３ ＴｒｉＫＥで処置すると、示されているようにＡＭＬ芽球細胞が殺傷され、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ媒介性殺傷が増加した。

ＡＭＬ芽球の様々な群の割合（ＣＤ３３およびＣＬＥＣ１２Ａの発現に基づく）を４８時間にわたって追跡して、１６１５ＣＤ３３ ＴｒｉＫＥと比較した１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの特異性を評価した（図１２Ｅ）。生存しているＡＭＬ芽球の割合を示すバーは、以下の（各バーの上から）、（ｉ）無処置、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＣＤ３３＋およびＣＬＥＣ１２Ａ＋ＣＤ３３－の場合、（ｉｉ）ＩＬ－１５、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＣＤ３３＋、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＣＤ３３－、およびＣＬＥＣ１２Ａ－ＣＤ３３－の場合、（ｉｉｉ）ＣＬＥＣ１２Ａ ｓｃＦｖ、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＣＤ３３＋、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＣＤ３３－、ＣＬＥＣ１２Ａ－ＣＤ３３＋、およびＣＬＥＣ１２Ａ－ＣＤ３３－の場合、（ｉｖ）ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＣＤ３３＋、ＣＬＥＣ１２Ａ－ＣＤ３３＋、およびＣＬＥＣ１２Ａ－ＣＤ３３－の場合、（ｖ）ＣＤ３３ ＴｒｉＫＥ、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＣＤ３３＋およびＣＬＥＣ１２Ａ＋ＣＤ３３－の場合に対応する。これらのデータは、１６１５ＣＤ３３ ＴｒｉＫＥと比較した１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥの特異性を確認する。

他の実験では、健常ドナー（ｎ＝５）からの濃縮したＮＫ細胞（ＣＤ５６＋、ＣＤ３－）を、示された処置（３０ｎＭ）でＡＭＬ患者からの骨髄サンプルと共にインキュベートして、２：１のエフェクター／標的比での４時間アッセイにおいて、癌幹細胞の殺傷（ＳＳＣｈ低、ＣＤ４５中、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－）を評価した（図１２Ｆ）。代表的なフロープロットは、ＣＬＥＣ１２ＡおよびＣＤ３３陽性の癌幹細胞の殺傷を示している。

図１２Ｇは、アッセイ終了時に存在する癌幹細胞の割合を示す癌幹細胞殺傷アッセイからの組合せデータを示す。反復測定による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ群に対する差を計算した。エラーバーは、平均の＋／－標準誤差を示す。統計的有意性は、^＊Ｐ、．０５、^＊＊Ｐ、．０１、^＊＊＊Ｐ、．００１、および^＊＊＊＊Ｐ、．０００１として決定される。ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによる処置では、無処置と比較してＬＳＣの割合が大幅に低くなった。

ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥによって媒介される殺傷の標的細胞としての原発性ＡＭＬ芽球を調べるために、ゲーティング戦略を採用した。原発性ＡＭＬ芽球を同定するためのゲーティング戦略を図１６Ａに示す。次に、原発性ＡＭＬ芽球（ｎ＝５）を、示された処置（３０ｎＭ）でインキュベートして、フローサイトメトリーおよび生存／死滅マーカーを使用して、４８時間にわたって標的細胞の殺傷を評価した（図１６Ｂ）。４８時間での死滅ＡＭＰ芽球の割合を示す。

これらのデータは、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥが、ＮＫ細胞が制限されている急性転化時の患者サンプルの原発性ＡＭＬ芽球の殺傷のわずかな増加を誘導したことを示している。

実施例９
この実施例では、インビボでの腫瘍増殖の１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ媒介性制限について説明する。

図１３Ａは、ＨＬ－６０ｌｕｃマウス実験の概略図を示している。モデルは、ＮＳＧマウス（２２５ｃＧｙ）をコンディショニングし、ＨＬ－６０ｌｕｃ細胞を静脈内注射することによって確立した（７．５×１０５細胞／マウス）。３日後、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５で一晩活性化した１×１０^６個の正常なヒトドナーＮＫ細胞（磁気的に枯渇したＣＤ３／ＣＤ１９産物から計算）を注入した。１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥまたは１６１５３３ ＴｒｉＫＥ（２０ｕｇ）を、研究の次の３週間を通じてＭＴＷＴｈＦに投与し（合計１５用量）、対照群にはＨＬ－６０ｌｕｃ細胞のみを投与した。

ＮＫ注入後７日目、１４日目および２１日目の４つの処置群からの発光の定量化を図１３Ｂに示す。各ドットは異なるマウスを表し、バーは平均＋／－標準偏差を表す。一致比較を伴わない一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ群に対する差を計算した。統計的有意性は、^＊Ｐ、．０５、^＊＊＊Ｐ、．００１、および^＊＊＊＊Ｐ、．０００１として決定された。図１３Ｃは、７、１４、および２１日目の２分間の曝露後の個々のマウスのフォトルミネッセンス（暗領域）を示す。ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ処置は、ＨＬ６０対照と比較して、調べたすべての時点で腫瘍量の減少をもたらした。さらに、２１日目でのＮＫ細胞対照処置と比較して、ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ処置時の腫瘍量の有意な減少が見られた。

図１３Ｄは、ｐｄｘマウス実験の概略図を示している。モデルは、ＮＳＧ ＳＧＭ３マウス（１２５ｃＧｙ）をコンディショニングし、ＨＬ－６０ｌｕｃ細胞を静脈内注射することによって確立した（７．５×１０^５細胞／マウス）。血液中に少なくとも１％のＡＭＬ芽球が発生するまで腫瘍を増殖させた。次に、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５で一晩活性化した１×１０^６個の正常なヒトドナーＮＫ細胞（磁気的に枯渇したＣＤ３／ＣＤ１９産物から計算）を注入した。１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥまたは１６１５３３ ＴｒｉＫＥ（２０ｕｇ）を、研究の次の３週間、月、火、水、木、金曜日に投与し（合計１５用量）、対照群にはＮＫ細胞を投与したが、処置は行わなかった。２１日目にマウスを屠殺し、大腿骨からの骨髄中のＡＭＬ芽球（ＣＤ４５ｉｎｔ、ＣＤ３３＋）の割合をフローサイトメトリーによって計算した（図１３Ｅ）。各ドットは異なるマウスを表す。骨髄サンプル（図１３Ｆ）および末梢血（図１３Ｇ）中のＮＫ細胞（ＣＤ３－、ＣＤ５６＋）の割合をフローサイトメトリーによって計算した。イベントを６０秒間にわたって収集し、ヒトＮＫ細胞イベントの数を計算した。ＣＤ４５＋ゲート内）のＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ３－）細胞イベントの数を示す代表的なドットプロットを示す。一致比較を伴わない一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ群に対する差を計算した。エラーバーは平均＋／－標準偏差を示す。統計的有意性は、^＊Ｐ、．０５、^＊＊＊Ｐ、．００１、および^＊＊＊＊Ｐ、．０００１として決定された。結果は、ＮＫ＋ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ処置が、腫瘍単独と比較して、原発性ＡＭＬ芽球の割合を有意に減少させたことを示している（図１３Ｅ）。さらに、ＮＫ＋ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥ処置は、腫瘍単独または腫瘍＋ＮＫ処置と比較して、骨髄（図１３Ｆ）および末梢血（図１３Ｇ）中のＮＫ細胞の割合を有意に増加させた。

まとめると、これらの結果は、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥがインビボでの腫瘍増殖を制限したことを示している。

実施例１０
この実施例では、幹細胞および前駆細胞の分析について説明する。

癌幹細胞は、図１７に示すゲーティング戦略を使用して骨髄サンプルで同定した。健常骨髄サンプル中の様々なＣＤ３４^ｐｏｓ前駆細胞亜集団を特定するためのゲーティング戦略を図１９に示す。図１９に示すゲーティング戦略を使用して、図１８Ａに示す細胞集団を分析した。

図１８Ａは、２名の代表的な健常ドナーからの骨髄のＣＤ３４^ｐｏｓ前駆体コンパートメント内でのＣＬＥＣ１２ＡおよびＣＤ３３の発現を示している。ＨＳＣ：造血幹細胞、ＭＰＰ：多能性前駆細胞、ＬＭＰＰ：リンパ球で刺激された多能性前駆細胞、ＣＬＰ：一般的なリンパ球前駆細胞、ＣＭＰ：一般的な骨髄系前駆細胞、ＧＭＰ：顆粒球－マクロファージ前駆細胞、ＭＥＰ：巨核球－赤血球前駆細胞。ＣＬＥＣ１２Ａの発現は、ＣＭＰ、ＧＭＰ、およびＭＥＰの集団で見られたが、ＨＳＣ、ＭＰＰ、ＣＬＰ、およびＬＭＰＰの集団では比較的低かった。さらに、ＧＭＰ集団を除いて、ＣＬＥＣ１２Ａは、ＣＤ３３よりも低いレベルで見出された。赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ－Ｅ）および赤芽球コロニー形成単位（ＣＦＵ－Ｅ）のコロニーは、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥまたは１６１５３３ ＴｒｉＫＥで処置した後に計数した（図１８Ｂ）。１６１５３３ ＴｒｉＫＥでの処置と比較して、１６１５ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥでの処置では、より多くのＢＦＵ－ＥおよびＣＦＵ－ＧＭコロニー数が見られた。

データは、ＣＬＥＣ１２Ａが正常なドナー幹細胞および前駆細胞の集団で差次的に発現し、１６１５３３ ＴｒｉＫＥでの処置がＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥでの処置と比較して幹細胞の形成および／または分化を減少させたことを示している。理論に制限されることなく、これは、ＣＬＥＣ１２Ａを使用して白血病幹細胞を標的とすることができる一方で、正常な造血再構成を可能にするはずであり、一方でＣＤ３３標的指向は再構成に影響を与える可能性がより高いことを示している。言い換えれば、ＣＬＥＣ１２Ａ標的指向は、正常な骨髄性再構成の観点から、オフターゲット効果が少ないはずである。

要約すると、上記のデータは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＬＥＣ１２Ａ ＴｒｉＫＥがＣＬＥＣ１２Ａを発現する標的細胞に特異的に結合し、ＮＫ細胞の増殖を促進し、ＮＫ細胞の機能を増強し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ ｚｏｏｍアッセイでＡＭＬ細胞株の殺傷を促進し、原発性ＡＭＬおよびＭＤＳ芽球の殺傷を誘導したことを示している。

実施例１１
この実施例は、ＣＬＥＣ１２Ａおよび第２の標的または腫瘍抗原を標的とするＴｅｔｒａＫＥの産生を示している。

複数の標的指向ドメインを含むＴｅｔｒａＫＥ（テトラマー）分子を設計することができる。例として、ＴｅｔｒａＫＥは、ＮＫ結合ドメイン、ＮＫ活性化ドメイン、および２つの標的指向ドメインを含むことができる。本明細書に記載のＮＫ結合ドメインおよびＮＫ活性化ドメインのいずれかを使用することができる。標的指向ドメインは、例えば、異なる標的または腫瘍抗原を標的にすることができる。標的または腫瘍抗原の任意の組合せをＴｅｔｒａＫＥに含めることができる。例えば、第１の標的指向ドメインはＣＬＥＣ１２Ａに結合することができ、第２の標的指向ドメインは別の標的または腫瘍抗原に結合することができる。

本明細書に記載の標的または腫瘍抗原のいずれかは、例えば、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、インテグリンαＶβ３、ＣＤ５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１２５、ＣＴＡＡ１６．８８、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３８、メソテリン、ＲＯＲ１、ＣＳＰＧ４、ＳＳ１、またはＩＧＦＲ１、ＮＫＧ２Ｃ、ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７Ｈ３、およびＰＳＭＡ、あるいはＥＢＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、および／またはＨＰＶに由来するウイルス抗原に結合する第２の標的指向ドメインを含む、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第１の標的指向ドメインを有するＴｅｔｒａＫＥに含めることができる。さらに、ＴｅｔｒａＫＥドメインは、本明細書に記載されるように、隣接配列またはリンカー配列を使用して互いに作動可能に連結することができる。例示的なＴｅｔｒａＫＥは、ＣＤ１６に選択的に結合する部分、ＩＬ－１５を含むＮＫ活性化ドメイン、ＣＬＥＣ１２Ａに選択的に結合する第１の標的指向ドメイン、およびＣＤ３３に選択的に結合する第２の標的指向ドメインを有する化合物を含む。

本開示を通じてなされた、特許、特許出願、特許刊行物、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書に対するすべての参照および引用は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、上記の実施例におけるその特定の実施形態の特定の詳細を参照して説明されてきたが、修正および変形は、本発明の精神および範囲内に含まれることが理解される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (29)

1. ＮＫ結合ドメインと、
   前記ＮＫ結合ドメインに作動可能に連結されたＮＫ活性化ドメインと、
   標的細胞に選択的に結合する標的指向ドメインであって、前記ＮＫ活性化ドメインおよび前記ＮＫ結合ドメインに作動可能に連結された、前記標的指向ドメインと
   を含む、化合物であって、
   前記標的指向ドメインが、ＣＬＥＣ１２Ａに選択的に結合する、
   前記化合物。
2. 前記ＮＫ結合ドメインが、ＣＤ１６に選択的に結合する部分を含む、請求項１に記載の化合物。
3. 前記ＮＫ結合ドメイン部分が、抗体またはその結合フラグメント、あるいはナノボディを含む、請求項１に記載の化合物。
4. 前記抗体結合フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂを含む、請求項３に記載の化合物。
5. 前記抗体またはその結合フラグメントあるいは前記ナノボディが、ヒトのものであるかまたはヒト化されている、請求項３に記載の化合物。
6. 前記抗体またはその結合フラグメントあるいは前記ナノボディが、ラクダ科動物のものである、請求項３に記載の化合物。
7. 前記ＮＫ活性化ドメインが、ＩＬ－１５またはその機能的フラグメントを含む、請求項１に記載の化合物。
8. 前記ＩＬ－１５が、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、請求項７に記載の化合物。
9. 前記標的指向ドメイン部分が、抗体またはその結合フラグメント、あるいはナノボディを含む、請求項１に記載の化合物。
10. 前記抗体結合フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦａｂを含む、請求項９に記載の化合物。
11. 前記ＮＫ結合ドメインが、ＣＤ１６に選択的に結合する部分を含み、前記ＮＫ活性化ドメインが、ＩＬ－１５を含み、かつ前記標的指向ドメインが、ＣＬＥＣ１２Ａに選択的に結合する、請求項１に記載の化合物。
12. 前記ドメインのうちの２つを連結する少なくとも１つの隣接配列を含む、請求項１に記載の化合物。
13. 前記２つの連結されたドメインを第３のドメインと連結する第２の隣接配列をさらに含む、請求項１２に記載の化合物。
14. 前記隣接配列が、前記ＮＫ活性化ドメインに隣接している、請求項１３に記載の化合物。
15. 第１の隣接配列が、前記ＮＫ結合ドメインのＣ末端側であり、かつ第２の隣接配列が、前記抗ＣＬＥＣ１２Ａ標的指向ドメインのＮ末端側である、請求項１４に記載の化合物。
16. 配列番号１を含む、単離されたアミノ酸配列。
17. 配列番号１のアミノ酸配列をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
18. 配列番号２を含む、単離されたアミノ酸配列。
19. 配列番号２のアミノ酸配列をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
20. 前記ＣＬＥＣ１２Ａドメインが、配列番号４に記載されている、請求項１に記載の化合物。
21. 請求項１に記載の化合物と、
    薬学的に許容される担体と
    を含む、組成物。
22. 標的細胞のＮＫ媒介性殺傷を誘導するのに有効な量の請求項１に記載の化合物を対象に投与することを含む、方法。
23. 前記標的細胞が、癌細胞である、請求項２２に記載の方法。
24. インビボでＮＫ細胞の増殖を刺激するための方法であって、
    対象におけるＮＫ細胞の増殖を刺激するのに有効な量の請求項１に記載の化合物を前記対象に投与すること
    を含む、前記方法。
25. 対象の癌を治療する方法であって、
    前記癌を治療するのに有効な量の請求項１に記載の化合物を前記対象に投与すること
    を含む、前記方法。
26. 前記癌が、前立腺癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、黒色腫、腎臓癌、腎癌、口腔癌、咽頭癌、膵臓癌、子宮癌、甲状腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、子宮頸癌、卵巣癌、または造血性癌を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 化学療法、腫瘍の外科的切除、または放射線療法の前、同時、または後に前記化合物を投与することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記化学療法が、アルトレタミン、アムサクリン、Ｌ－アスパラギナーゼ、コラスパーゼ（ｃｏｌａｓｐａｓｅ）、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、サイトホスファン（ｃｙｔｏｐｈｏｓｐｈａｎｅ）、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、フォテムスチン、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファマイド（ｉｆｏｓｆａｍａｉｄｅ）、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ニムスチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、ラルチトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンを含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記造血性癌が、ＡＭＬである、請求項２６に記載の方法。

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