JP2022502482A - 骨損傷を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、対象の大分節性骨欠損を治療し、改善し、治癒を加速する組成物及び方法に関する。その方法は、治療を必要とする患者に有効量の全血、クエン酸ナトリウム、エカリン、及びＢＭＰ−２を投与することを含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７３２，５３４号及び２０１９年５月９日に出願された米国仮特許出願第６２／８４５，５００号の利益を主張するものである。これら先行して提出された出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

平均７９０万件の骨折が米国だけで毎年発生し、約５〜１０％が癒合の遅延、非癒合、重症に準じた（ｓｕｂ−ｃｒｉｔｉｃａｌ）サイズ欠損又は大きな骨欠損をもたらし、外科医にとって著しい治療上の課題をもたらす（Ｚｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｓｕｒｇ．２０１６ Ｎｏｖ１６；１５１）。一般集団において、骨折の重症度、解剖学的位置、患者の併存症、喫煙、及び特定の薬剤の使用は、骨折治癒の問題に大いに寄与し得る（Ｚｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｓｕｒｇ．２０１６ Ｎｏｖ１６；１５１）。脛骨、大腿骨、又は上腕骨の非癒合の治療費は、各場合で３１，５００ドルから３４，４００ドルの範囲であり、年間の医療費の大きな負担である（Ｋａｎａｋａｒｉｓ ＮＫ，Ｇｉａｎｎｏｕｄｉｓ ＰＶ．Ｉｎｊｕｒｙ．２００７；３８ Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ７７ Ｓ８４及びＷｕ，ｅｔ ａｌ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１３：５ ２１−３３）。

更に、５９，０００人以上の軍人がイラク及びアフガニスタンでの勤務中に、戦闘関連の作戦で負傷し、そのうちの５０％は大分節性骨欠損を含む筋骨格損傷であった（Ｂｅｌｍｏｎｔ Ｊｒ．ＰＪ，ＭｃＣｒｉｓｋｉｎ ＢＪ，Ｓｉｅｇ ＲＮ，Ｂｕｒｋｓ Ｒ，Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ ＡＪ．Ｃｏｍｂａｔ ｗｏｕｎｄｓ ｉｎ Ｉｒａｑ ａｎｄ Ａｆｇｈａｎｉｓｔａｎ ｆｒｏｍ ２００５ ｔｏ ２００９．Ｊ Ｔｒａｕｍａ Ａｃｕｔｅ Ｃａｒｅ Ｓｕｒｇ．２０１２；７３：３−１２）。これらの衝突で受けた筋骨格損傷の７８％は大きな肢体損傷であったと推定されている（Ｓｔａｎｓｂｕｒｙ ＬＧ、Ｌａｌｌｉｓｓ ＳＪ，Ｂｒａｎｓｔｅｔｔｅｒ ＪＧ，Ｂａｇｇ ＭＲ，Ｈｏｌｃｏｍｂ ＪＢ．Ａｍｐｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｕ．Ｓ．ｍｉｌｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｆｌｉｃｔｓ ｉｎ Ａｆｇｈａｎｉｓｔａｎ ａｎｄ Ｉｒａｑ．Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｔｒａｕｍａ．２００８；２２：４３−４６）。そのような骨損傷、特に、局所的に低下した組織血管分布と組み合わされた汚染された骨及び軟組織破壊による高衝撃性爆発損傷に関連するものは、治癒が不十分である。このような合併症がなくても、臨界サイズを超える骨欠損は治癒する本質的能力を有しない。大分節性骨欠損を有する患者の管理は、依然として軍人及び民間外科医が直面する最も困難な臨床問題の１つである（Ｐｏｌｌａｋ ＡＮ，Ｆｉｃｋｅ ＪＲ，Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ Ｗａｒ Ｉｎｊｕｒｉｅｓ ＩＩＩ Ｓｅｓｓｉｏｎ Ｍｏｄｅｒａｔｏｒｓ．Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｗａｒ ｉｎｊｕｒｉｅｓ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２００８；１６：６２８−３４）。これらの破壊的な傷害は、しばしば失敗や最終的な切断の重大なリスクを伴い、必然的に費用のかかる継続的な医療の長期経過をもたらすため、これらの傷害をうまく管理するための臨床医の能力向上の重要性は強調され過ぎることはない。イラク及びアフガニスタンでの軍事活動（ＯＩＦ／ＯＥＦ）の結果、２，０００人以上の兵士が少なくとも１回の切断を必要とした（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｈ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｕ．Ｓ．Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｃａｓｕａｌｔｙ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ’ｓ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ，Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｉｎｈｅｒｅｎｔ Ｒｅｓｏｌｖｅ，Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｎｅｗ Ｄａｗｎ，Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｉｒａｑｉ Ｆｒｅｅｄｏｍ，ａｎｄ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ Ｆｒｅｅｄｏｍ．Ｃｏｎｇｒ Ｒｅｓ Ｓｅｒｖ．２０１５；７）。更に、持続的な非治癒性骨欠損は、職場復帰又は軍事任務の遅延と関連し、それに応じて個人の生活の質が低下する。したがって、明らかに満たされていない臨床的ニーズが存在し、それはこれらの潜在的な壊滅的損傷に対処するためのより効果的な治療戦略の開発への強力な動機となる。

本明細書に開示されるのは、（ａ）単離された全血と、（ｂ）クエン酸ナトリウムと、（ｃ）エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムとを含むエクスビボ血腫であって、エクスビボ血腫は、少なくとも１５０〜３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン繊維を含む。

本明細書に開示されるのは、（ａ）多血小板血漿、血漿、若しくは赤血球を有する血漿と、（ｂ）エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムとを含むエクスビボ血腫であって、エクスビボ血腫は、少なくとも１５０〜３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン繊維を含む。

本明細書に開示されるのは、インプラントの構築方法であって、方法は、ａ）デポーインプラントの骨欠損への移植を容易にする形状及びサイズのうちの少なくとも１つにおいて、デポーインプラントを寸法決定することと、ｂ）（ｉ）単離された全血及びクエン酸ナトリウム、又は多血小板血漿、血漿、若しくは赤血球を有する血漿、並びに（ｉｉ）エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムを導入することによって、デポーインプラントを足場を有するように構造化し、足場を作製することと、を含み、足場は５５〜７５％の多孔率を有する。

本発明の組成物及び方法の他の特徴及び利点は、以下の説明、図面及び特許請求の範囲に例示される。

哺乳動物の凝固カスケードにおける蛇毒由来の血栓促進剤の機序を図示する概略図。 ラット骨折血腫の走査電子顕微鏡画像を示す。０．５ｍｍ（通常は治癒する骨欠損；左画像）及び５ｍｍ（自然に治癒せず、外科医の介入を必要とする分節性骨欠損；右画像）骨欠損。スケール＝１μｍ。 手術の３日後の、０．５ｍｍ（Ａ）及び５ｍｍ（Ｂ）のラットにおける大腿骨欠損における血腫形成を示す。 ラットの血栓、天然凝塊（Ａ）、エカリンが低濃度（Ｂ）、中濃度（Ｃ）、及び高濃度（Ｄ）のものを示す。 ０．５Ｕ／ｍＬのエカリンの添加後の血栓における幹細胞生存率を示す。図５Ａは幹細胞を含まない凝塊を示す。自動蛍光赤血球（緑色）、細胞核（青色）、幹細胞の細胞骨格（赤色）。スケールバー＝５０μｍ。 ０．５Ｕ／ｍＬのエカリンの添加後の血栓における幹細胞生存率を示す。図５Ｂは幹細胞を有する凝塊を示す。自動蛍光赤血球（緑色）、細胞核（青色）、幹細胞の細胞骨格（赤色）。スケールバー＝５０μｍ。 ラット大腿骨欠損モデルの図。白の四角は、エクスビボ血腫、多血小板血漿（ＰＲＰ）又はＢＭＰ−２の移植についての５ｍｍの欠損ギャップを示している。 骨折血腫の走査電子顕微鏡画像を示す。０．５ｍｍ（左画像、通常骨折）及び５ｍｍ（右画像、大きな骨欠損）。スケール＝１μｍ。 ラット骨折血腫の走査電子顕微鏡画像（上段）及び繊維直径、繊維密度及び多孔性の定量化（下段）を示す。 フィブリン繊維のトポグラフィーを示す走査電子顕微鏡画像を示す。 エカリン及び塩化カルシウムを使用したラットのエクスビボ全血及び多血小板血漿の凝塊を示す走査電子顕微鏡画像を示す。全血（ＷＢ）＋０．１Ｕ／ｍＬのエカリン（上段左）。全血＋０．５Ｕ／ｍＬのエカリン（上段中央）。全血＋１０ｍＭの塩化カルシウム（上段右）。多血小板血漿（ＰＲＰ）＋０．１Ｕ／ｍＬのエカリン（下段左）。多血小板血漿＋０．５Ｕ／ｍＬのエカリン（下段中央）。多血小板血漿＋１０ｍＭの塩化カルシウム（下段右）。 ラットエクスビボ血栓マイクロアーキテクチャの走査電子顕微鏡画像（上段）並びに繊維直径、繊維密度及び多孔率の定量化（下段）を示す。平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３。 は蛇毒酵素、エカリン（２Ｄ、インビトロ、＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３）の存在下でのラットＭＳＣの細胞生存率を示す。 蛇毒酵素、エカリン（３Ｄ、インビトロ）の存在下での組織培養における細胞生存率を示す。 異なるインプラントを使用した骨の治癒を示す。図１４Ａは８週時の全血（ＷＢ）＋０．１Ｕ／ｍＬのエカリンを示す。図１４Ｂは８週時の多血小板血漿（ＰＲＰ）＋塩化カルシウムを示す。図１４Ｃは８週時のコラーゲン足場＋１．１μｇのＢＭＰ−２を示す。図１４Ｄは８週時の全血＋０．３Ｕ／ｍＬのエカリン＋１．１μｇのＢＭＰ−２を示す。図１４Ｅは８週時の全血＋０．３Ｕ／ｍＬのエカリン＋０．５５μｇのＢＭＰ−２を示す。図１４Ｆは４週時の全血＋０．６Ｕ／ｍＬのエカリン＋０．５５μｇのＢＭＰ−２を示す。 治療の８週間後の大きな骨欠損治癒を示す放射線画像を示す。代表的な画像は、各研究グループ内の２匹の異なる動物について示される。「＋＋」＝架橋された欠損、「＋」＝わずかに遅延した治癒（残りの少量の軟骨）、「−」＝非癒合。

本開示は、以下の本明細書に含まれる発明の詳細な説明、図面及び実施例を参照することによってより容易に理解され得る。

本組成物及び方法が開示及び説明される前に、それらは、特に指定されない限り特定の合成方法、又は特に指定されない限り特定の試薬に限定されないこと、そのようなものは、もちろん変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、限定することを意図されるものではないことも理解されたい。本明細書に記載のものと類似又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用され得るが、次に例示的な方法及び材料がここに記載される。

更に、別途明記しない限り、本明細書に記載されるあらゆる方法が、そのステップが特定の順序で実行されることを必要とするものとして解釈されることを決して意図されるものではないことを理解されたい。したがって、方法クレームが、そのステップに続くべき順序を実際に記載していない場合、又はステップが特定の順序に限定されることを特許請求の範囲又は明細書において別途特に記載していない場合、いかなる点においても、順序が推測されることは決して意図されていない。これは、ステップ又は操作フローの配置に関する論理の問題、文法的な構成又は句読点から導き出された明確な意味、及び本明細書に記載されている態様の数又は種類を含む、解釈のためのあらゆる可能性のある非明示的な根拠に当てはまる。

本明細書で言及される全ての刊行物は、引用された刊行物に関連して方法及び／又は材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。更に、本明細書に提供される刊行物の日付は実際の公開日とは異なる可能性があり、これらは独立した確認を必要とし得る。

定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により別段明らかに指示されない限り、複数の指示対象を含む。

本明細書で使用される単語「又は」は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。

本明細書の説明及び特許請求の範囲全体にわたって、単語「含む」、並びにその単語の変形例、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などは、「含むが、これらに限定されない」を意味し、例えば、他の添加剤、成分、整数又はステップを除外することを意図されるものではない。特に、１つ以上のステップ又は動作を含むと記載される方法では、各ステップが列挙されるものを含むことが具体的に企図され（そのステップが「からなる」などの限定用語を含む場合を除く）、これは、各ステップが、例えば、ステップに列挙されていない他の添加剤、成分、整数又はステップを除外することを意図されていないことを意味する。

範囲は、本明細書において、「約」若しくは「およそ」１つの特定の値から、及び／又は「約」若しくは「およそ」別の特定の値までと表現することができる。そのような範囲が表現されるとき、さらなる態様は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表されるとき、先行詞の「約」又は「およそ」の使用によって、特定の値がさらなる態様を形成することが理解されるであろう。範囲の各々のエンドポイントは、別のエンドポイントと関連して、及び別のエンドポイントとは独立して、両方とも有意であることが更に理解されるであろう。本明細書で開示される多くの値が存在し、各値は、値自体に加えてその特定の値について「約」としても本明細書で開示されることも理解されたい。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。２つの特定のユニット間の各ユニットもまた開示されることも理解されたい。例えば、１０及び１５が開示される場合、次いで１１、１２、１３、及び１４も開示される。

本明細書で使用される場合、「任意の」又は「任意に」という用語は、その後に記載された事象又は状況が発生し得るか、又は発生しない場合があり、説明が、前記事象又は状況が発生する事例及びそれが発生しない事例を含むことを意味する。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒトを指す。したがって、開示される方法の対象は、哺乳動物、魚、鳥、爬虫類、又は両生類などの脊椎動物であり得る。「対象」という用語はまた、飼いならされた動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、フルーツハエなど）を含む。一態様において、対象は、哺乳動物である。別の態様において、対象は、ヒトである。この用語は、特定の年齢又は性別を示すものではない。したがって、男性又は女性を問わず、成人、子供、思春期及び新生児対象、並びに胎児に及ぶことが意図される。

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、疾患又は障害又は状態に罹患している対象を指す。用語「患者」は、ヒト及び獣医学的対象を含む。開示される方法のいくつかの態様において、「患者」は、例えば、投与ステップの前など、骨損傷の治癒のための治療の必要性があると診断されている。

本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、特定の疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状又は特徴を、部分的又は完全に、軽減する、改善する、緩和する、発症を遅延させる、その進行の阻害又は遅延させる、重症度を低減する、及び／又はその発症率を低減することを指す。治療は、疾患、障害、及び／若しくは状態に関連する病理学を発症するリスクを低減する目的で、疾患、障害、及び／若しくは状態の徴候を呈さない対象、並びに／又は疾患、障害、及び／若しくは状態の初期徴候のみを呈する対象に施され得る。例えば、疾患、障害、及び／又は状態は、骨損傷又は骨折であり得る。

大分節性骨欠損を治療するための現在の方法自家骨移植、様々な骨移植代替物、イリザロフ法、巨大な人口装具を用いた関節形成術、生物学的製剤、及び最終手段として切断を含む、骨格欠損の治療のために多くの技術が採用されてきた。しかしながら、これらの既存の治療選択肢は、特徴的に、複数の手術を伴う長時間の治療を必要とし、高価であり、高い合併症率を有し、治療失敗の重大なリスクと関連している。例えば、大分節性骨欠損を治癒させる際に、自家移植片は選択される治療のままである（Ｋｈａｎ ＳＮ，Ｃａｍｍｉｓａ ＦＰ，Ｓａｎｄｈｕ ＨＳ，Ｄｉｗａｎ ＡＤ，Ｇｉｒａｒｄｉ ＦＰ，Ｌａｎｅ ＪＭ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２００５；１３：７７−８６）。しかしながら、十分な自家移植材料の供給は、特に民間集団及び重度の負傷兵士における重度の外傷性負傷又は骨折の非癒合の場合に限定され得、そしてドナー部位での著しい罹患率に関連する。対照的に、同種移植骨は大量に利用可能であるが、その使用は、疾患伝播及び免疫応答の懸念を膨らませるが（Ｋｈａｎ ＳＮ，Ｃａｍｍｉｓａ ＦＰ，Ｓａｎｄｈｕ ＨＳ，Ｄｉｗａｎ ＡＤ，Ｇｉｒａｒｄｉ ＦＰ，Ｌａｎｅ ＪＭ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２００５；１３：７７〜８６）、より重要なことに、それは、うまく再吸収又は再構築しない死骨からなる。また、負荷時に微小の骨折が徐々に蓄積され、５年間の故障率が３０％以上になることが示されている（Ｅｎｎｅｋｉｎｇ ＷＦ，Ｃａｍｐａｎａｃｃｉ ＤＡ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２００１；８３−Ａ：９７１−９８６、及びＷｈｅｅｌｅｒ ＤＬ，Ｈａｙｎｉｅ ＪＬ，Ｂｅｒｒｅｙ Ｈ，Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ Ｍ，Ｅｎｎｅｋｉｎｇ Ｗ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ｉｎｓｔｒｕｍ．２００１；３７：２５１−２５６）。更に、大分節性骨欠損の治療を支援するために様々な骨代替物も開発されているが、これらのアプローチは転帰のわずかな改善に限定されている。不適切な骨形成、不十分な機械的及び取り扱い特性、生体適合性の欠如、予測不可能な再吸収、並びに関連する炎症反応は、かかる材料の主要な制限のままである（ＭｃＫｅｅ ＭＤ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２００６；１４：Ｓ１６３−７）。このため、８ｃｍを超える骨欠損については、仮骨延長術は軍の外科医による選択の治療のままである。しかしながら、この技術は煩雑であり、痛みを伴い、信頼性が低く、ピントラック感染によって複雑になり、治癒が遅くなる可能性がある（Ｐｏｌｌａｋ ＡＮ，Ｆｉｃｋｅ ＪＲ，Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２００８；１６：６２８−３４）。何よりも、大分節性骨欠損に対する利用可能な治療オプションの主な複雑な要因は、機能の迅速な回復を確保することができないこと、及び屈折率を低減する能力である。

骨形成の生物学的研究は、骨形成の最も強力な誘導物質のいくつかである骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の発見につながった（Ｕｒｉｓｔ ＭＲ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．１９９７；１２：３４３−６）。ＢＭＰファミリーの２つのメンバー、組換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２；ＩＮＦＵＳＥ（登録商標））及び組換えヒトＢＭＰ−７（ｒｈＢＭＰ−７；ＯＰ−１（登録商標））が、臨床使用について承認されている。ＢＭＰは、動物モデルにおける前臨床有効性を示しているが、それらの臨床有効性は期待外れであった。これらのタンパク質への若干の臨床応答は、送達問題と関連している。更に、そのほとんどは、適用部位から急速に浸出する、ＢＭＰの非常に高い超生理学的用量を使用する現在の実践は、転移性／異所性骨化の発生率及び重症度、並びに抗体形成、移植の剥離、骨吸収、及び癌でさえといった多くの他の関連する副作用を増加させる可能性を有している（Ｃａｒｒａｇｅｅ ＥＪ，Ｈｕｒｗｉｔｚ ＥＬ，Ｗｅｉｎｅｒ ＢＫ．Ｓｐｉｎｅ Ｊ．２０１１；１１：４７１−４９１）。したがって、必要な用量を大幅に最小限に抑えることによって、ＢＭＰの有効性を改善するために好適な担体を開発する必要があり、したがって、それらの潜在的な副作用及び関連する治療費を制限する。

近年、高濃度の血小板が豊富な血漿である多血小板血漿（ＰＲＰ）は、筋骨格損傷の治療を含む広範囲な用途で試験されている。ＰＲＰは、超生理学的濃度で様々な増殖因子及びサイトカインを分泌し、フィブリン凝塊の形態における細胞支持マトリックスを生成すると考えられている。具体的には、骨治癒を促進するためのＰＲＰの効果（Ｉｑｂａｌ Ｊ，Ｐｅｐｋｏｗｉｔｚ ＳＨ，Ｋｌａｐｐｅｒ Ｅ．Ｃｕｒｒ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ Ｒｅｐ．２０１１；９：２５８−２６３、及びＫｕｒｉｋｃｈｙ ＭＱ，Ａｌ−Ｒａｗｉ ＮＨ，Ａｙｏｕｂ ＲＳ，Ｍｏｈａｍｍｅｄ ＳＳ．Ｃｌｉｎ Ｏｒａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２０１３；１７：８９７−９０４）は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）などの因子の濃度の増加に起因することが示唆されている（Ｓｏｆｆｅｒ Ｅ，Ｏｕｈａｙｏｕｎ ＪＰ，Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ Ｆ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｏｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｅｎｄｏｄｏｎｔｉｃｓ２００３．ｐｐ．５２１−５２８）。それでも、経口及び顎顔面骨移植手術においてＰＲＰを使用した実験的（Ｓｉｍｍａｎ Ｒ、ＨｏｆｆｍａｎｎＡ、Ｂｏｈｉｎｃ ＲＪ、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＷＣ、Ｒｕｓｓ ＡＪ．Ａｎｎ Ｐｌａｓｔ Ｓｕｒｇ．２００８；６１：３３７−４４）、及び臨床試験（Ｍａｒｘ ＲＥ，Ｃａｒｌｓｏｎ ＥＲ，Ｅｉｃｈｓｔａｅｄｔ ＲＭ，Ｓｃｈｉｍｍｅｌｅ ＳＲ，Ｓｔｒａｕｓｓ ＪＥ，Ｇｅｏｒｇｅｆｆ ＫＲ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄ．１９９８；８５：６３８−４６）の結果は、物議を醸しており、それが実際に骨治癒を改善又は加速させることを示唆する証拠は現在のところほとんどなく、実際には、ほとんどの場合、骨形成の減少があった（Ｃｈｏｉ Ｂ−Ｈ，Ｉｍ Ｃ−Ｊ，Ｈｕｈ Ｊ−Ｙ，Ｓｕｈ Ｊ−Ｊ，Ｌｅｅ Ｓ−Ｈ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ Ｓｕｒｇ．２００４；３３：５６−９、及びＭａｒｄｅｎ ＬＪ，Ｆａｎ ＲＳＰ，Ｐｉｅｒｃｅ ＧＦ，Ｒｅｄｄｉ ＡＨ，Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ＪＯ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９３；９２：２８９７−２９０５）。この明らかな有効性の欠如は、長骨及び背骨にも及ぶ。羊における最近の研究では、大腿骨幹の骨切り術を使用した後、仮骨延長術を使用したが、ＰＲＰの適用が新たな骨形成を改善したことを示さなかった（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ａ，Ｖｅｌｅｚ Ｒ，Ｓｏｌｄａｄｏ Ｆ，Ｓａｅｎｚ−Ｒｉｏｓ ＪＣ，Ｂａｒｂｅｒ Ｉ，Ａｇｕｉｒｒｅ−Ｃａｎｙａｄｅｌｌ Ｍ．Ｉｎｊｕｒｙ．２０１３；４４：９０１−７）。同様に、げっ歯類研究では、ＰＲＰは骨治癒に有益な効果を有さない（Ｐｒｙｏｒ ＭＥ，Ｙａｎｇ Ｊ，Ｐｏｌｉｍｅｎｉ Ｇ，Ｋｏｏ Ｋ，Ｈａｒｔｍａｎ ＭＪ，Ｇｒｏｓｓ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．２００５；７６：１２８７−１２９２、及びＲａｎｌｙ ＤＭ，Ｌｏｈｍａｎｎ ＣＨ，Ａｎｄｒｅａｃｃｈｉｏ Ｄ，Ｂｏｙａｎ ＢＤ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｚ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２００７；８９：１３９−１４７）、又はせいぜい低い再生の可能性を示した（Ｓａｎｃｈｅｚ ＡＲ，Ｓｈｅｒｉｄａｎ ＰＪ，Ｅｃｋｅｒｔ ＳＥ，Ｗｅａｖｅｒ ＡＬ．Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．２００５；７６：１６３７−１６４４）。脊椎癒合後の骨治癒を促すための研究では、いずれの動物（Ｌｉ Ｈ，Ｚｏｕ Ｘ，Ｘｕｅ Ｑ，Ｅｇｕｎｄ Ｎ，Ｌｉｎｄ Ｍ，Ｂｕｎｇｅｒ Ｃ．Ｅｕｒ Ｓｐｉｎｅ Ｊ．２００４；１３：３５４−８）、又はヒト対象（Ｗｅｉｎｅｒ ＢＫ，Ｗａｌｋｅｒ Ｍ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ Ｐａ １９７６）．２００３；２８：１９６８−１９７０）においても利点はなかった。これらの研究における変わりやすい転帰の原因となる因子は知られていないが、血小板中に存在するプロテアーゼが増殖因子を分解し（Ｔｈｉｂａｕｌｔ Ｌ，Ｂｅａｕｓｅｊｏｕｒ Ａ，Ｄｅ Ｇｒａｎｄｍｏｎｔ ＭＪ，Ｌｅｍｉｅｕｘ Ｒ，Ｌｅｂｌａｎｃ ＪＦ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２００６；４６：１２９２−１２９９）、それによって、ＰＲＰの組成を変更し、その実験及び臨床有効性を低下させ得ることが示唆されてきた。更に、ＰＲＰ活性化には、増殖因子のバースト放出、及び総増殖因子濃度の低減につながるトロンビンが必要である。ウシのトロンビンは、治癒プロセスに影響を及ぼすと考えられるトロンビンに対する抗体を刺激することによってヒト凝固タンパク質と干渉する（Ｏｒｙａｎ Ａ，Ａｌｉｄａｄｉ Ｓ，Ｍｏｓｈｉｒｉ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６；１６：２１３−３２）。これはまた、ＰＲＰが適切な構造特性を有する凝塊を形成することができないことに関連し得る。

ＰＲＰの性能の低さに基づいて、多血小板フィブリン（ＰＲＦ）と呼ばれる血小板濃縮物の「第２世代」が、フランスの顎顔面外科医Ｊｏｓｅｐｈ Ｃｈｏｕｋｒｏｕｎによって開発された。（Ｃｈｏｕｋｒｏｕｎ Ｊ，Ｄｉｓｓ Ａ，Ｓｉｍｏｎｐｉｅｒｉ Ａ，Ｇｉｒａｒｄ Ｍ−Ｏ，ＳｃｈｏｅｆｆｌｅｒＣ，Ｄｏｈａｎ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄ．２００６；１０１：２９９−３０３）。これは、ＰＲＰに対して特定の利点を有し、治癒及び免疫に有益な血液成分を含有するより天然のフィブリンマトリックスとして記載された。例えば、凝固プロセスは、トロンビンがＰＲＰに添加されるときに生じる速い重合と比較して、より遅い自然な重合によって起こる。最も重要なことに、ＰＲＦは、抗凝固剤又はトロンビン添加剤を必要としない（Ｄｏｈａｎ ＤＭ、Ｃｈｏｕｋｒｏｕｎ Ｊ，Ｄｉｓｓ Ａ，Ｄｏｈａｎ ＳＬ、Ｄｏｈａｎ ＡＪＪ，Ｍｏｕｈｙｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ、Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ．２００６；１０１）。インビトロ研究ではまた、ＰＲＦが、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、及びＢＭＰなどの増殖因子のより持続的な放出を有し、最大２８日間続くことも示されている（Ｈｅ Ｌ，Ｌｉｎ Ｙ，Ｈｕ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｗｕ Ｈ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ、Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ．２００９；１０８：７０７−７１３）。この放出プロファイルは、１日以内にサイトカイン及び増殖因子のバースト放出を特徴とするＰＲＰと顕著に異なる。それにもかかわらず、ＰＲＦは、経口及び顎顔面手術で適用された場合に、いかなる有意な改善も示されていない（Ｃｈｏｕｋｒｏｕｎ Ｊ，Ｄｉｓｓ Ａ，Ｓｉｍｏｎｐｉｅｒｉ Ａ，Ｇｉｒａｒｄ Ｍ−Ｏ，Ｓｃｈｏｅｆｆｌｅｒ Ｃ，Ｄｏｈａｎ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄ．２００６；１０１：２９９−３０３、及びＢｕｓｅｎｌｅｃｈｎｅｒ Ｄ，Ｈｕｂｅｒ ＣＤ，Ｖａｓａｋ Ｃ，Ｄｏｂｓａｋ Ａ，Ｇｒｕｂｅｒ Ｒ，Ｗａｔｚｅｋ Ｇ．Ｃｌｉｎ Ｏｒａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｓ Ｒｅｓ．２００９；２０：１０７８−１０８３）。再び、これは、ＰＲＰと同様に、構造特性が不適切であるとともに、送達される血小板の量が不十分であることに関連する可能性がある。

血腫形成の骨折治癒に及ぼす影響骨折血腫形成は、骨損傷の数分以内に起こり、骨形成因子及び血管新生因子を含む炎症促進性サイトカイン及び増殖因子など、血液系からの活性化凝固因子だけでなく骨髄及び周囲の軟組織に由来するいくつかの分子因に関与する一連の生物学的事象を含む（Ｌａｉ ＢＦＬ，Ｚｏｕ Ｙ，Ｂｒｏｏｋｓ ＤＥ，Ｋｉｚｈａｋｋｅｄａｔｈｕ ＪＮ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｌｔｄ；２０１０；３１：５７４９−５７５８）。骨折部位では、血管が収縮して持続的な失血を防止し、続いて、破損した断片の間に血腫又は血栓が形成される凝固カスケードが起こる（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｅｒ Ａ，ＭｃＤｏｎａｌｄ ＭＭ，Ｂｏｋｋｏ Ｐ，Ｌｉｔｔｌｅ ＤＧ．Ｓｅｍｉｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２００８；１９：４５９−６６）。凝固プロセスには、内因性経路と外因性経路の２つの主な経路があり、共通の経路は凝固因子ＸからＸａへの変換である。凝固カスケードにおける最終プロテアーゼであるトロンビンは、キモトリプシンファミリーの典型的なセリンプロテアーゼであり、凝固促進機能及び抗凝固機能の両方を有する（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ ＪＡ．Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂ．Ｖ．；２０１２；１８２４：２４６−２５２）。通常の血液凝固中、凝固カスケードは、チモーゲンプロトロンビンをセリンプロテアーゼトロンビンに変換することによって、チモーゲンプロトロンビンを活性化する。次いで、トロンビンは可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリン繊維に変換する。最後に、これらのフィブリン繊維は、凝固因子ＸＩＩＩの助けで、成熟したウェブ様フィブリン凝塊の形成に寄与する（Ｃｈｅｒｎｙｓｈ ＩＮ，Ｎａｇａｓｗａｍｉ Ｃ，Ｐｕｒｏｈｉｔ ＰＫ，Ｗｅｉｓｅｌ ＪＷ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１２；２：８７９）。したがって、フィブリノーゲン、トロンビン、及び凝固因子ＸＩＩＩの濃度勾配は、フィブリン凝塊立体構造の調節に重要な役割を果たす（Ｗｏｌｂｅｒｇ ＡＳ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＲＡ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ａｐｈｅｒ Ｓｃｉ．２００８；３８：１５−２３）。フィブリン凝塊における構造パラメータは、繊維の直径、密度、分岐点の数、分岐点間の距離、及び細孔の寸法によって特徴付けられ得る（Ｗｅｉｓｅｌ ＪＷ，Ｌｉｔｖｉｎｏｖ ＲＩ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１：１７１２−１７１９）。フィブリン繊維の直径の上昇は、フィブリン繊維の密度に反比例し、細孔サイズに正比例する（Ｅｉｃｈｈｏｒｎ ＳＪ，Ｓａｍｐｓｏｎ ＷＷ．Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．２００５；２：３０９−３１８、及びＫａｕｒ Ｓ，Ｓｕｎｄａｒｒａｊａｎ Ｓ，Ｒａｎａ Ｄ，Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｔ，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓ．Ｊ Ｍｅｍｂ Ｓｃｉ．２０１２；３９２−３９３：１０１−１１１）。加えて、繊維の直径及び密度は、フィブリン凝塊の多孔性及び表面積に影響を及ぼし（Ｐｈａｍ ＱＰ，Ｓｈａｒｍａ Ｕ，Ａｎｔｏｎｉｏｓ Ｇ．Ｍｉｋｏｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２００６；７：２７９６−２８０５）、並びに、接着、増殖、及び分化などの幹細胞の生物学的機能を担う（Ｂａｄａｍｉ ＡＳ，Ｋｒｅｋｅ ＭＲ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＭＳ，Ｒｉｆｆｌｅ ＪＳ、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＡＳ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００６；２７：５９６−６０６）。例えば、低トロンビン濃度（＜１ｎＭ）は、線維素溶解に非常に影響を受けやすい厚いフィブリン繊維の多孔質ネットワークを生成し、一方で、高濃度のトロンビンは、線維素溶解に対して比較的耐性のある透過性の低いフィブリンネットワークを形成する細い繊維をもたらす（Ｇａｂｒｉｅｌ ＤＡ，Ｍｕｇａ Ｋ，Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄ ＥＭ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：２４２５９−６３）。更に、個々の太い繊維はより高い機械的強度（剛性）を有するが、太い繊維で構成されるフィブリン凝塊は、繊維の数が減少しているため、しばしば機械的強度が低くなる（Ｃａｒｌｉｓｌｅ ＣＲ，Ｃｏｕｌａｉ Ｃ，Ｇｕｔｈｏｌｄ Ｍ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２０１０；６：２９９７−３００３、及びＬｉｕ Ｗ，Ｔｈｏｍｏｐｏｕｌｏｓ Ｓ，Ｘｉａ Ｙ．Ａｄｖ Ｈｅａｌｔｈｃ Ｍａｔｅｒ．２０１２；１：１０−２５）。

骨折治癒における血腫形成の重要性についての研究は多数あるにもかかわらず、通常は自ら治癒する骨折の治癒とそうでない分節性骨欠損との間に形成される血腫の構造的特性及び生物学的特性の違い、並びに大分節性骨欠損の修復を強化するために血腫特性を調節することができるかどうかを報告する研究はない。

代わりに、ほとんどの研究は、「第２世代」産物ＰＲＦで明らかにされているように、ＰＲＰの特性を洗練することに焦点を当てているように見える。いくつかの研究では、ＰＲＦがその対応するＰＲＰと比較してやや効果的な産物であることが示唆されているが、これまでの研究は説得力がなく、特に長骨の修復及び再生に関連するさらなる調査が必要である。

本明細書に開示されるのは、大分節性骨欠損の治癒を強化するための、誘発血栓の構造的及び生物学的特性を改善する方法である。例えば、兵士及び民間人における大分節性骨欠損の治癒を著しく改善及び加速させるために、本明細書に記載されるのは、先天性骨折血腫の構造的特性を模倣するフィブリン凝塊を構築することによって作製されるエクスビボ血腫である。このために、ラットモデルを使用して、骨折部位で形成される血腫の質が大骨欠損の治癒可能性を決定するかどうかを評価し、及び蛇毒酵素を使用して全血が操作され得る場合、通常の骨折血腫の固有の構造特性を模倣する血栓を形成し、次いで大骨欠損の治癒を強化するために使用した。

プロトロンボティック・ヘビの毒多くの蛇毒毒素は、凝固トロンビン様酵素及びプロトロンビン活性化毒素の作用によって止血に影響を与えるタンパク質分解酵素を含有する（図１）。図１に示すように、第Ｘ因子から（活性化された）Ｘａへの変換は、外因性及び内因性凝固経路間の共通接合部である。蛇毒酵素は、凝固カスケードの様々な段階を利用するために進化してきた。これらの毒は、血小板、内皮細胞及び血漿タンパク質と、脊椎動物の止血の段階に影響を及ぼす毒タンパク質との間に存在する脆弱な相互作用を利用するために進化した（Ｍｅｉｅｒ Ｊ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｋ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９１；２１：１７１−１８２）。ヘビの種類に応じて、それぞれに特定の凝集因子を有する。例えば、沿岸タイパン（ｃｏａｓｔａｌ ｔａｉｐａｎ）（Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ）の毒中に見出された凝固促進因子オスキャリンは、哺乳動物凝固因子Ｘと構造的に及び機能的に類似している。オスキャリンは、Ｃ群プロトロンビン活性化因子の毒に属するセリンプロテアーゼであり、哺乳動物因子Ｘとは異なり、それらが独自の因子Ｖａ様分子を含有するため、非酵素因子Ｖを必要としない。（Ｓｔ．Ｐｉｅｒｒｅ Ｌ，Ｍａｓｃｉ ＰＰ，Ｆｉｌｉｐｐｏｖｉｃｈ Ｉ，Ｓｏｒｏｋｉｎａ Ｎ，Ｍａｒｓｈ Ｎ，Ｍｉｌｌｅｒ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｎｏｍ ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｅｌａｐｉｄｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ．２００５；２２：１８５３−１８６４）。同様に、ノコギリバイパー（Ｓａｗ−ｓｃａｌｅｄ ｖｉｐｅｒ）（Ｅｃｈｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓ）の毒に見られるエカリンは、塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）及びリン脂質などの補因子の関与なしに作用するメタロプロテイナーゼである。補因子要件の欠如により、エカリンはカルボキシル化及び脱カルボキシル化プロトロンビンの両方をメイゾトロンビンに変換することができる（Ｈｕｔｔｏｎ Ｒ．Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．１９９３；７：１７６−１８９）。メイゾトロンビンは、全血凝固中のトロンビン生成の中間産物であり、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換において限定的な酵素活性を有することが報告されている（Ｂｏｖｉｌｌ ＥＧ，Ｔｒａｃｙ ＲＰ，Ｈａｙｅｓ ＴＥ，Ｊｅｎｎｙ ＲＪ，Ｂｈｕｓｈａｎ ＦＨ，Ｍａｎｎ ＫＧ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．１９９５；１５：７５４−７５８、及びＫｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ Ｓ，Ｍａｎｎ ＫＧ，Ｎｅｓｈｅｉｍ ＭＥ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８６；２６１：８９７７−８９８４）。他方では、ラッセル毒蛇（Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ ｖｉｐｅｒ）（Ｄａｂｉｏａ ｒｕｓｓｅｌｌｉ）の毒から単離したセリンプロテアーゼＲＶＶ−Ｖは、カルシウム依存に依存しない方法で第Ｖ因子を特異的に活性化する。ラッセル毒蛇の毒からも単離された別の十分に特徴付けられたプロテアーゼＲＶＶ−Ｘは、第Ｘ因子の強力で特異的な活性化因子である。ＲＶＶ−Ｖとは対照的に、ＲＶＶ−Ｘは、補因子としてＣａ²⁺を必要とするがリン脂質を必要としないメタロプロテイナーゼである（Ｔａｋｅｙａ Ｈ，Ｎｉｓｈｉｄａ Ｓ，Ｍｉｙａｔａ Ｔ，Ｋａｗａｄａ ＳＩ，Ｓａｉｓａｋａ Ｙ，Ｍｏｒｉｔａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１４１０９−１４１１７、並びにＴｏｋｕｎａｇａ Ｆ，Ｎａｇａｓａｗａｑ Ｋ，Ｍｉｙａｔａｑ Ｔ，Ｉｗａｎａｇａｑｌｌ Ｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８８；２６３：１７４７１−１７４８１）。比較的すると、通常の骨折部位では、第Ｘ因子は血小板膜上の第Ｖ因子に結合し、これはトロンビンの生成を何千倍も加速させる。これは、一次止血プラグを安定化させる成熟した凝固の形成につながる機構である（Ｐｒｏｂｓｔ Ａ，Ｓｐｉｅｇｅｌ Ｈ−Ｕ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｓｕｒｇ．１９９７；１０：７７−８６）。前述のことから、蛇毒から単離された凝固促進因子は、血栓の構造特性を改変するためのより天然の凝塊剤として好適であるはずであることが示唆されている。実際、蛇毒タンパク質は、凝固カスケードを支配し、血小板機能を決定する複雑な生理学的メカニズムを解明する上で重要であった。更に、それらは、それらの効力、選択性、及び高い生物学的有効性のために、ヒト凝塊因子及び血小板糖タンパク質の構造的及び機能的関係を解明するのに有用であった（Ｈｏｎｇ Ｔ−Ｔ，Ｈｕａｎｇ Ｊ，Ｌｕｃｃｈｅｓｉ ＢＲ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００６；２９０：Ｈ９５９−６７、Ｈａｎ ＳＭ，Ｗｅａｖｅｒ ＦＡ，Ｃｏｍｅｒｏｔａ ＡＪ，Ｐｅｒｌｅｒ ＢＡ，Ｊｏｉｎｇ Ｍ．Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ．２０１０；５１：６００−９、Ｓａｎｃｈｅｚ ＥＦ，Ｂｕｓｈ ＬＲ，Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｓ，Ｍａｒｋｌａｎｄ ＦＳ．血栓Ｒｅｓ．１９９７；８７：２８９−３０２、Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｓ，Ｂｕｓｈ ＬＲ，Ｍａｒｋｌａｎｄ ＦＳ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０００；３８４：２２７−３７、及びＳｈａｈ ＡＲ，Ｓｃｈｅｒ Ｌ．ＩＤｒｕｇｓ．２００７；１０：３２９−３５）。その結果、いくつかの活性毒性化合物が同定され、単離され、特徴付けられ、精製されており、現在、診断目的及び薬学的目的の両方に使用されている（Ｋｉｎｇ ＧＦ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１；１１：１４６９−８４；及びＢｕｔｌｅｒ ＭＳ．Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ．２００８；２５：４７５−５１６）。本明細書に記載されるのは、臨床的に使用されるときに副作用を有することが示されているトロンビンの添加とは対照的に、代替凝塊剤として蛇毒凝固酵素（ＳＶＣＥ）を含む組成物である（Ｏｒｙａｎ Ａ，Ａｌｉｄａｄｉ Ｓ，Ｍｏｓｈｉｒｉ Ａ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６；１６：２１３−３２）。特定のＳＶＣＥは、それらの哺乳動物の対応物よりも触媒的により活性であることが示されており、追加のジスルフィド架橋の存在により熱安定であり、及びタンパク質分解に対してより耐性があることが知られている（Ｋａｎｇ ＴＳ，Ｇｅｏｒｇｉｅｖａ Ｄ，Ｇｅｎｏｖ Ｎ，Ｍｕｒａｋａｍｉ ＭＴ，Ｓｉｎｈａ Ｍ，Ｋｕｍａｒ ＲＰ，ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｊ．２０１１；２７８：４５４４−７６）。本明細書に開示されるのは、ラットモデルを使用して、ヘビ毒酵素が血腫の特性を変化させる能力、及び大分節性欠損を治癒するその能力を実証する組成物及び方法である。本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、血腫の特性を改変するための組成物及び方法である。

蛇毒由来の凝固因子は、例えば、他の凝塊因子に影響を与えず、小さい分子サイズが使用時に体の免疫系によって認識される可能性を低くし、したがって攻撃される可能性が低いなどのいくつかの理由で好ましかった。更に、その分子は、体内のそれらの標的に結合するときに選択的であり、望ましくない副作用の可能性を最小限に抑える。エカリンは、活性化のために補因子を必要としないため、特に選択された。

本開示は、重度の外傷及び戦場傷害の結果として、一般市民だけでなく軍隊内の両方において、骨傷害の治癒を強化し、生活の質を向上させ、高い治療費を削減し、肢体切断の割合を低減するための新しい改善された治療戦略の開発にとって重要である。本明細書に開示される結果は、自然治癒骨折血腫の固有の構造的及び生物学的特性を模倣することによって骨治癒の有効性を増加させる特性を有するエクスビボ産生血腫の要件を提供し得る。本開示はまた、増殖因子リザーバーとして機能し、骨誘導性及び骨伝導性であるだけでなく生体適合性足場として働き、大分節性骨欠損、重症に準じたサイズ欠損の治癒を強化するだけでなく、非治癒性骨折（遅延した癒合又は非癒合）の治療のためのエクスビボ血腫の開発に重要である。

民間又は軍の臨床環境で高度に専門的な機器を使用せずに、手術室で、必要な量の全血と特定の濃度の蛇毒凝固酵素とを単に混合するだけで、迅速な産物変換とオンデマンドアプリケーションが期待される。本明細書に記載される結果はまた、血腫の適合構造特性をバイオマテリアル足場の設計に組み込み、現在再生医療で使用されている性能の悪い足場の能力を改善して骨修復を補助することによって、バイオマテリアル研究者にも利益をもたらし得る。更に、蛇毒から単離された凝固促進因子を血栓の構造特性を改変するために好適な凝塊剤として使用され得、並びに病院環境及び戦場で制御不能な出血を停止するために使用され得る。また、本明細書に開示されるのは、持ち運びが容易であり、長い貯蔵寿命を有し、吸収可能である又は除去が容易であり、かつ安価である、数秒以内に出血を止めることができる産物である。これらのヘビは、瞬時に大量の凝固障害を引き起こすことで獲物を殺すように進化したため、血液をゼラチンに変える非常に特異的な生物学的薬剤を開発した。しかし、適切に単離し、制御条件下で慎重に調製すると、エカリンなどの同じ凝固因子を使用して代わりに生命を救うことができる。直ちに失血を制御することで、この著しい特性は、民間患者又は戦場の負傷した兵士のさらなる失血を制限し得る。

本明細書に開示されるのは、大きな骨欠損を治癒させるための生体適合性蛇毒誘発エクスビボ血腫である。本明細書には、エクスビボ血腫（血栓）を、その超微細構造特性を修正し、それによって様々な臨床状況におけるその挙動を変化させる特定の方法で処理及び操作する方法も開示される。本明細書に開示されるのは、様々な異なる医学的状態の治療に使用できるように、その構造的形態を変化させ、その生物学的活性を変化させる薬剤で全血又は血液産物を処置する方法である。

本明細書に開示されるのは、大きな骨欠損、重症に準じたサイズ欠損の再生及び修復を改善するために、並びに非治癒性骨折（遅延した癒合又は非癒合）の治療のために使用され得る組成物及び方法である。本明細書に開示されるのは、重要な増殖因子の連続放出のための一時的な貯蔵庫として機能し、適切な空間を提供することで、細胞浸潤、増殖、及び分化を同時に補助することによって骨の治癒を強化するために使用され得る組織化された血栓（エクスビボ血腫／生体適合性足場）である。本明細書に開示されるのは、自然治癒骨折血腫を模倣する血栓（エクスビボ血腫）を産生することを伴う修復プロセスを増強するための組成物及び方法である。コンセプトは、エクスビボ産物である血腫の構造的特性は、蛇の毒に由来する凝固因子、エカリンを使用して変更され、骨欠損に移植されると、骨の治癒を強化し、加速する固有の骨折血腫を模倣し得るということである。ヘビ毒に由来する凝固因子、エカリンも、出血を止めるために使用され得る。いくつかの態様において、組成物は粉末、液体又はスプレーとして製剤化され得る。

全血、エカリン、及びＢＭＰ−２を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの態様において、エカリンは特定の濃度で存在し得る。いくつかの態様において、低用量又は著しく減少した用量のＢＭＰ−２を使用することができる。いくつかの態様において、前記組成物を使用して、骨欠損治癒を強化ことができる。いくつかの態様において、組成物は液体又はゲルとして製剤化され得る。

本明細書に記載の治癒の種類は、吸収性コラーゲンスポンジ（Ｉｎｆｕｓｅ（商標））で送達されるｒｈＢＭＰ−２を使用する、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃによって販売される市販の製品によって提供される治癒に類似している。本明細書に記載の組成物又は産物は、骨治癒を開始するために有意に低い用量のＢＭＰ−２（例えば、ｒｈＢＭＰ−２）を必要とする。いくつかの態様では、ＢＭＰ−２の用量は、任意の市販の製品又は組成物よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０倍又はそれよりも多く低くなり得る。

本明細書に開示されるように、ＢＭＰ−２は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のファミリーに属する。これらのタンパク質は、軟骨内の骨新形成を誘導する能力を有する骨増殖因子である。いくつかの態様において、ＢＭＰ−２は組換えＢＭＰ−２であり得る。組換えＢＭＰ−２を産生する方法は当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第７，３５４，９０１号に見出され、参照により本明細書に組み込まれ得る。

組成物
本明細書に開示されるのは、エクスビボ血腫である。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、（ａ）単離された全血と、（ｂ）クエン酸ナトリウムと、（ｃ）エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムとを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、（ａ）多血小板血漿、血漿、又は赤血球を有する血漿と、（ｂ）エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムとを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫はクエン酸ナトリウムを更に含み得る。いくつかの態様において、語句「赤血球を有する血漿」は血小板を含まない血漿を意味する。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、少なくとも１５０〜３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン繊維を含み得る。いくつかの態様において、エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムは、少なくとも１５０〜３００ｎｍ±１０％の厚さを有する１つ以上のフィブリン繊維の形成をもたらし得る。本明細書で使用される「エクスビボ」という用語は、例えば、外部環境において、生物の外側で形成することができる血腫を指す。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、（ａ）単離された全血及びクエン酸ナトリウム多血小板血漿、血漿単独、赤血球を有する血漿（血小板を含まない）又は他の血液産物と（ｂ）１つ以上の凝固因子とを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、全血と１つ以上の凝固因子とを含み得る。

本明細書で使用される場合、「全血」及び「血液」という用語は、血漿又は血小板を含む成分のうちのいずれも除去されていない体内から直接採取され得る血液を意味して本明細書で使用される。いくつかの態様において、全血又は血液は、本明細書に記載の組成物のいずれか又は本明細書に記載のエクスビボ血腫のいずれかの受容体である対象又は患者由来であり得る。いくつかの態様において、全血又は血液は、ドナー対象又は患者由来であり得る。全血は赤血球、白血球、血小板、血漿で構成されている。いくつかの態様において、フィブリンゲルが全血の代わりに使用され得る。

当業者は、血液が、栄養素及び酸素などの重要な物質を細胞に送達し、代謝廃棄産物をそれらの同じ細胞から離して輸送する専門の体液であることを理解するであろう。脊椎動物では、血液は血漿中に懸濁された血液細胞からなる。血液は、異なる成分、例えば、血漿、赤血球（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ））、血小板（血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ））及び白血球（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））を含み得る。血漿は血液の約５５％を占める主な成分であり、主にイオン、タンパク質、栄養素、及び廃棄物を含む水から構成されている。血漿は、体内で産生される全てのタンパク質の一部を含有し得る。例えば、血漿は、約９０％の水及び以下の混合物を１０％を含み得る：イオン（Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｍｇ⁺²、Ｃａ⁺²、Ｃｌ^-、ＨＣＯ₃ ^-、ＨＰＯ₄ ^-2、ＳＯ₄ ^-2）（Ｎｅｚａｆａｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、タンパク質（例えば、主にアルブミン−５５％、グロブリン、増殖因子、酵素、ホルモン、抗体）、凝固因子（第Ｉ−ＸＩＩＩ因子）（ｌａｂｔｅｓｔｓｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ．ａｕ）、糖（グルコース）、脂質（コレステロール）、ミネラル（ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、鉄、亜鉛、銅、及びセレン）（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、廃棄産物並びに溶解性ガス。赤血球（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ））は酸素及び二酸化炭素を運ぶ役割を担っている。それらは、約７〜８μｍのサイズであり、成熟時にミトコンドリア又は核を含まず、平均寿命は１２０日である。女性は約３６０〜５００万／ｍｍ³の赤血球を有し、男性は約４２０〜５４０万／ｍｍ³の赤血球を有している。血小板（血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ））は血栓の原因である。正常な血小板数は、約１５０，０００〜４５０，０００／ｍｍ³の範囲である。白血球（ＷＢＣ；白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））は免疫応答における免疫系の一部及び機能である。その細胞の約１％が血液中に見られる。赤血球よりも大きく、正常な核とミトコンドリアを含んでいる。正常な白血球数は、約５，０００〜１０，０００／ｍｍ³の範囲である。白血球は、５つの主要なタイプに分けることができ、更に２つの異なる群に分けられる。顆粒球：好中球：ＷＢＣの６０〜７０％又は３，０００〜７，０００／ｍｍ³、好酸球：ＷＢＣの１〜３％又は５０〜４００／ｍｍ³、及び好塩基球：ＷＢＣの０．３〜０．５％又は２５〜２００／ｍｍ³、並びに無顆粒球：リンパ球：ＷＢＣの２０〜３０％又は１，０００〜４，０００／ｍｍ³、及び単球：ＷＢＣの３〜８％又は１００〜６００／ｍｍ³。

本明細書で使用される場合、「多血小板血漿」という用語（自己調節血漿としても知られる）は、全血に由来する多血小板血漿タンパク質の濃縮形態を指す。例えば、全血を遠心分離して赤血球を除去し得る。いくつかの態様において、「血液血漿単独」、「血漿単独」、又は「血漿」という用語は、通常、全血中の血液細胞を懸濁液中に保持する全血に由来する黄色がかった液体成分を指し得る。例えば、血漿は、血液細胞がチューブの底部に落ちるまで血液を遠心分離することによって全血から分離され得、次いで血漿をチューブの上部から汲み出し得る。いくつかの態様において、「赤血球を有する血漿」という用語は、追加の赤血球を有する「血漿単独」を指すことができる。例えば、赤血球は、全血をチューブの底部に落ちるまで遠心分離することによって得られ、チューブの上部から血漿、白血球及び血小板を除去した後に回収される。

いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、１つ以上の増殖因子を含み得る。いくつかの態様において、１つ以上の増殖因子は、骨形成タンパク質のうちの１つ以上であり得る。ＢＭＰの例は、これに限定されないが、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、及びＢＭＰ−１４（ＧＤＦ５としても知られる）を含む。ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１８を含む任意のＢＭＰが想定される。いくつかの態様において、１つ以上の増殖因子は血小板由来増殖因子であり得る。いくつかの態様において、１つ以上の増殖因子は血管内皮増殖因子であり得る。いくつかの態様において、１つ以上の増殖因子は線維芽細胞増殖因子２であり得る。いくつかの態様において、１つ以上の増殖因子は、骨形成タンパク質、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上であり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫はＢＭＰ−２を更に含み得る。いくつかの態様において、１つ以上の増殖因子は、ＢＭＰ−２であり得る。

いくつかの態様において、全血は生存細胞を含み得る。いくつかの態様において、全血の生存細胞の約５０％〜７０％は、血腫の形成後も生存可能なままである。いくつかの態様において、全血の生存細胞の少なくとも５０％は、血腫の形成後も生存可能なままである。いくつかの態様において、全血の生存細胞の少なくとも６０％は、血腫の形成後も生存可能なままである。いくつかの態様において、全血の生存細胞の少なくとも７０％は、血腫の形成後も生存可能なままである。いくつかの態様において、全血の生存細胞の少なくとも８０％は、血腫の形成後も生存可能なままである。いくつかの態様において、全血の生存細胞の少なくとも９０％は、血腫の形成後も生存可能なままである。いくつかの態様において、全血の生存細胞の９０％超は、血腫の形成後も生存可能なままである。

いくつかの態様において、全血は、１つ以上の生物学的因子を含み得る。いくつかの態様において、「生物学的因子」又は「他の生物学的因子」という用語は、水を除く全血の血漿成分を指す。他の生物学的因子の例は、これに限定されないが、イオン、タンパク質、凝固因子、糖、脂質、及びミネラルを含む。

いくつかの態様において、全血中に存在する１つ以上の生物学的因子は、内因性生物学的因子であり得る。血小板は全血中に存在する。多くの増殖因子が血小板に見られ得る。多血小板血漿α顆粒中の増殖因子は、これに限定されないが、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子β１、β２、β３（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、血小板由来血管新生因子（ＰＤＡＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、血小板因子４（ＰＦ−４）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び他のサイトカインを含み、創傷治癒において重要な非活性形態の関連する治癒分子とともに有糸分裂促進性及び走化性増殖因子を含有することが示されている。加えて、血漿流体は、増殖因子ＩＧＦ−Ｉ及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの多くの生物学的に活性なタンパク質も含有する。通常の創傷治癒の間、閉じ込められた血小板が活性化され脱顆粒され、α顆粒成分が放出される。血小板に存在する増殖因子の例としては、限定されないが、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子β１、β２、β３、血小板由来血管新生因子、インスリン様増殖因子１、血小板因子４、上皮増殖因子、上皮細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、及び他のサイトカイン、だけでなく、血小板由来内皮増殖因子（ＰＤＥＧＦ）、インターロイキン１、オステオカルシン及びオステオネクチン含む。血漿中に存在する増殖因子は、これ限定されないが、インスリン様増殖因子１、及び肝細胞増殖因子を含む。

いくつかの態様において、エクスビボ血腫は全血、エカリン及びクエン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は全血、塩化カルシウム及びクエン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は多血小板血漿及びエカリンを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は多血小板血漿及び塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、全血と、塩化カルシウム、又はオスクタリン及び塩化カルシウムと、クエン酸ナトリウムとを含み得る。いくつかの態様において、（ａ）単離された全血及びクエン酸ナトリウム、多血小板血漿、又は赤血球を有する血漿のうちの１つの組み合わせは、（ｂ）エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、又は塩化カルシウムのうちの１つと組み合わせられ得る。いくつかの態様において、（ａ）単離された全血及びクエン酸ナトリウム、多血小板血漿、又は赤血球を有する血漿のうちの１つの組み合わせは、（ｂ）トロンビン又はトロンビン及び塩化カルシウムのうちの１つと組み合わせられ得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のエクスビボ血腫組み合わせのいずれかは、１つ以上の抗生物質を更に含み得る。

いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在する塩化カルシウムの濃度は、１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲内であり得る。いくつかの態様では、塩化カルシウムの濃度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍＭ、又はその間の任意の数であり得る。いくつかの態様において、塩化カルシウムの濃度は、約１０ｍＭであり得る。

いくつかの態様において、トロンビンの濃度は、０．１〜１Ｕ／ｍＬの範囲内であり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するトロンビンの濃度は、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１Ｕ／ｍＬ、又はこれらの間の任意の数以上であり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するトロンビンの濃度は、０．５Ｕ／ｍＬであり得る。

いくつかの態様において、エクスビボ血腫に存在するエカリンの濃度は、少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するエカリンの濃度は、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１Ｕ／ｍＬ、又はこれらの間の任意の数以上であり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するエカリンの濃度は、０．３Ｕ／ｍＬであり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するエカリンの濃度は、０．６Ｕ／ｍＬであり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するエカリンの濃度は、０．７５Ｕ／ｍＬであり得る。

いくつかの態様において、本明細書に記載のエクスビボ血腫は、ＢＭＰ−２を更に含み得る。いくつかの態様において、ＢＭＰ−２は組換えＢＭＰ−２であり得る。いくつかの態様において、組換えＢＭＰ−２はヒトＢＭＰ−２を含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するＢＭＰ−２の用量は、少なくとも０．０１ｍｇであり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫に存在するＢＭＰ−２の用量は、０．０１〜５ｍｇであり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するＢＭＰ−２の用量は、０．０１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０ｍｇ、又はその間の任意の数であり得る。いくつかの態様において、組換えＢＭＰ−２は、約０．０１ｍｇ〜約１２ｍｇの用量で使用され得る。いくつかの態様では、組換えＢＭＰ−２は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０ｍｇ又はこれらの間の任意の数の用量で使用され得る。いくつかの態様において、組換えＢＭＰ−２は、１２．０ｍｇ超の用量で使用され得る。いくつかの態様において、ＢＭＰ−２の用量は、約１ｍｇ〜５ｍｇであり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するＢＭＰ−２の用量は、少なくとも０．０１μｇであり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するＢＭＰ−２の用量は、０．０１〜５μｇであり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するＢＭＰ−２の用量は、０．０１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０μｇ、又はその間の任意の数であり得る。いくつかの態様において、組換えＢＭＰ−２は、約０．０１μｇ〜約１２μｇの用量で使用され得る。いくつかの態様では、組換えＢＭＰ−２は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０μｇの用量又はこれらの間の任意の数で使用され得る。いくつかの態様において、組換えＢＭＰ−２は、１２．０μｇ超の用量で使用され得る。いくつかの態様において、ＢＭＰ−２の用量は約１μｇ〜５μｇであり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するＢＭＰ−２の用量は、０．３〜０．４μｇであり得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するＢＭＰ−２の用量は、標準用量よりも低くし得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するＢＭＰ−２の用量は、標準用量又はＢＭＰ−２／ＡＣＳの最低有効用量よりも１０〜５０倍低くし得る。

いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するエカリンの量は、少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、かつ、エクスビボ血腫中に存在するＢＭＰ−２の量は、少なくとも０．０１ｍｇであり得る。

いくつかの態様において、エクスビボ血腫中に存在するエカリンの量は、少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、かつ、エクスビボ血腫中に存在するＢＭＰ−２の量は、少なくとも０．０１μｇであり得る。

いくつかの態様において、クエン酸ナトリウムの濃度は、約３．２〜４ｍｇ／ｍｌであり得る。いくつかの態様において、溶液は、約３．２〜４％（重量／体積）のクエン酸ナトリウムであり、その後、この溶液１部を９部の全血と混合することができる。

いくつかの態様において、本明細書に記載のエクスビボ血腫は、１つ以上の治療剤を更に含み得る。いくつかの態様において、治療剤は増殖因子であり得る。いくつかの態様において、治療剤はＢＭＰ−２であり得る。いくつかの態様において、治療剤は組換えＢＭＰ−２であり得る。いくつかの態様において、治療剤は、これらに限定されないが間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、及び人工多能性幹細胞を含む、幹細胞又は予め分化された幹細胞であり得る。いくつかの態様において、治療剤はエカリンであり得る。

いくつかの態様において、エクスビボ血腫は液体又はゲルとして製剤化され得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は凍結乾燥形態又は粉末形態として製剤化され得る。前記凍結乾燥形態又は粉末形態は、エクスビボ血腫を貯蔵のためにより安定にすることができる。いくつかの態様において、増殖因子（ＢＭＰ及び他）、凝固因子（エカリン、塩化カルシウムなど）及びクエン酸ナトリウムは、凍結乾燥形態又は粉末形態として利用可能であり得る。いくつかの態様において、本明細書に開示されるエクスビボ血腫を作製するために使用される化合物は、全血又は他の血液産物（例えば、ＰＲＰ、血漿など）と混合する前に滅菌蒸留水に溶解され得る。希釈剤は滅菌蒸留水である。準備又は保管に追加のコンポーネントは必要ない。全血（又は他の血液産物）は、手術前（例えば、手術直前）に患者から採取し、凝固を防止するためにクエン酸化され得る。いくつかの態様では、ドナー血液は、例えば、血液障害又は、これらに限定されないが、貧血、血友病、白血病、ＨＩＶなどを含む疾患を有する患者に使用され得る。エクスビボ血腫の残りの構成要素は、貯蔵のための任意の追加の安定剤を必要としない。例えば、ＢＭＰ−２は、すぐに使用できるボトルで市販されており、ＣａＣｌ₂は、粉末形態で入手可能であり、場合によっては、既に滅菌蒸留水に溶解されている場合がある（溶解後に非常に安定している）。ＢＭＰ−２及びＣａＣｌ₂の両方は、室温で保管し得る。エカリンは、凍結乾燥形態（凍結乾燥）で入手可能であり、−２０℃で保管され、使用前に滅菌蒸留水に溶解され得る。エクスビボ血腫は、充填する欠損の体積に基づく量で本明細書に記載の成分を使用して、比較的単純に調製し得る。このため、成分が調製された後、それらをチューブ／モールドに一緒に混合し得る。一般に、エクスビボ血腫は、約３０〜４５分で形成され、次いで骨欠損部に挿入（又は移植）され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のエクスビボ血腫は、例えば、無線周波数識別ベースのシステム（例えば、Ｓｍａｒｔｓｔｏｒａｇｅ（商標））を使用する「スマート保管システム」を使用して保管され得、それは正確な使用履歴及び温度ログを保持することを含む在庫管理を合理化することができるほぼリアルタイムの組織追跡システムを伴う。

いくつかの態様において、本明細書に記載のエクスビボ血腫は、担体を更に含み得る。例えば、担体は、生分解性生物材料足場（例えば、絹フィブロイン足場、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコライド（ＰＬＧＡ）、又は他の類似の吸収性産物若しくは材料）であり得る。かかる担体を使用して、エクスビボ血腫の追加の機械的支持を提供し得る。

いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、局所投与のために製剤化され得る。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物（例えば、液体形態）又はエクスビボ血腫（例えば、ゲル形態）は、局所投与、外科的に移植、又は経皮的に注射され得る。いくつかの態様において、液体製剤はシリンジを通して送達され得る。いくつかの態様において、ゲル製剤は骨欠損部位に移植され得る。ゲル製剤は、骨欠損部位への移植のための骨サイズ及び形状に対応する体外のモールドを使用して調製され得る。いくつかの態様において、製剤は、液体とゲルとの間の中間形態であり得る。いくつかの態様において、中間製剤は固体バイオ足場に適用され得、固体バイオ足場自体に存在し得るギャップ（例えば、大きなギャップ）を架橋すると同時に、独立して機械的支持体を提供し得る。固体バイオ足場の例は、これに限定されないが、チタンケージ又は他の多孔性金属インプラントを含む。かかるバイオ足場は、骨格欠損を再構築するか、又は脊髄融合を達成するのに使用され得る。本明細書に開示される製剤は、ＰＥＥＫ自体が生物学的に不活性であり、固有の骨治癒能力を有さないことを考慮して、ＰＥＥＫ脊椎ケージが椎体間脊椎固定術に使用される場合、治癒を増強するために使用され得る。あるいは、本明細書に開示される製剤のいずれかは、分節又は準分節の骨格欠損を再構築するために使用され得るように、吸収性バイオ足場に注入又は局所適用され得る。金属多孔性インプラント又は吸収性バイオ足場のいずれかと併せて使用する場合、これは、開口楔骨切開術（大腿骨、脛骨、又は他の長骨の）、仮伸延関節形成部位、及び関節形成術に関連する骨欠損も含む。更に、本明細書に開示される製剤のいずれかは、足首、膝、手首、肩、股関節、又はこれに限定されないが、リスフラン関節、手、手首、又は足における小さな関節を含む他のより小さな関節などの骨欠損を伴う他の関節固定部位に同じ方法で適用され得、そして、二次解剖学的位置への移植のために骨移植片を採取する際に生じた骨欠損を埋めるための適用を含むように拡張される。

いくつかの態様において、エカリンは、単独で又は本明細書に記載の１つ以上の成分と組み合わせて、出血を止めるために使用され得る。いくつかの態様において、出血は重篤であり得る。いくつかの態様において、出血は動脈、静脈、又は毛細血管の出血であり得る。いくつかの態様において、エカリンは、粉末、液体、又はスプレーとして製剤化され得る。いくつかの態様において、エカリンは、ビーズ（例えば、コラーゲンビーズ）として製剤化され得る。いくつかの態様において、エカリンはナノ粒子として製剤化され得る。

方法
本明細書に開示されるのは、骨治癒を促進する方法である。骨置換材料の産生方法も本明細書に開示される。本明細書では、インプラントの産生方法が更に開示される。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は組み合わせ得る。本明細書に開示されるのは、骨治癒を促進する、骨置換材料を産生する方法、インプラント又はそれらの組み合わせを産生する方法である。いくつかの態様において、本方法は、本明細書に開示されるエクスビボ血腫を含む治療有効量の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるエクスビボ血腫を含む治療有効量の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、対象において骨治癒を促進する方法、骨置換材料を産生する方法、インプラント又はそれらの組み合わせを産生する方法である。

いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、（ａ）単離された全血と、（ｂ）クエン酸ナトリウムと、（ｃ）エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、（ａ）多血小板血漿、血漿、又は赤血球を有する血漿と、（ｂ）エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムとを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫はクエン酸ナトリウムを更に含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、少なくとも１５０〜３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン繊維を含み得る。いくつかの態様において、エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムは、少なくとも１５０〜３００ｎｍ±１０％の厚さを有する１つ以上のフィブリン繊維の形成をもたらし得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、（ａ）単離された全血及びクエン酸ナトリウム多血小板血漿、血漿単独、赤血球を有する血漿（血小板を含まない）又は他の血液産物と（ｂ）１つ以上の凝固因子とを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、全血と１つ以上の凝固因子とを含み得る。いくつかの態様において、全血は、１つ以上の生存細胞を含み得る。いくつかの態様において、全血は、１つ以上の生物学的因子を含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、全血、エカリン、及びクエン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、全血、塩化カルシウム、及びクエン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は多血小板血漿及びエカリンを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は多血小板血漿及び塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は血漿及びエカリンを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は血漿及び塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、赤血球及びエカリンを有する血漿を含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、赤血球及び塩化カルシウムを有する血漿を含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、オスクタリン及び塩化カルシウムを有する血漿を含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、トロンビン及び塩化カルシウムを有する血漿を含み得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を更に含み得る。いくつかの態様において、ＢＭＰ−２は組換えＢＭＰ−２であり得る。いくつかの態様において、組換えＢＭＰ−２はヒトＢＭＰ−２を含み得る。いくつかの態様では、組成物は、１つ以上の増殖因子、１つ以上の血小板、及び１つ以上の細胞を更に含み得る。いくつかの態様において、組成物は血栓又は足場として製剤化され得る。いくつかの態様において、足場は走化性であり得る。いくつかの態様において、足場は骨治癒に有利な内因性増殖因子を引き付け得る。

いくつかの態様において、対象はヒトであり得る。いくつかの態様において、対象は骨格欠損を有する。いくつかの態様において、骨格欠損は大分節性骨欠損であり得る。いくつかの態様において、対象は１つ以上の骨折を有する。いくつかの態様において、対象は１つ以上の骨損傷を有する。

いくつかの態様において、組成物は凝塊又は足場として製剤化され得る。いくつかの態様において、組成物はエクスビボ血腫として製剤化され得る。いくつかの態様において、組成物は局所投与用に製剤化され得る。いくつかの態様において、組成物は、局所的に投与され得る。いくつかの態様において、組成物は移植され得る。いくつかの態様において、組成物は経皮注射され得る。いくつかの態様において、組成物はシリンジで注射され得る。いくつかの態様において、組成物中に存在するエカリンの量は、少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、組成物中に存在するＢＭＰ−２の量は、少なくとも０．０１〜５ｍｇ又はその間の任意の量であり得る。いくつかの態様において、組成物中に存在するエカリンの量は、少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、組成物中に存在するＢＭＰ−２の量は、少なくとも０．０１〜１μｇ又はその間の任意の量であり得る。

いくつかの態様において、治療レジメンは、任意の骨欠損を治療するための標準治療レジメンであり得る。簡潔に述べると、欠損した創傷は、破砕され、内部プレート、外部固定器、又は髄内釘で固定され得る。次いで、本明細書に記載の組成物及びエクスビボ血腫は、創傷を閉じる前に骨格欠損部に挿入され得る。治療レジメンは、感染が存在せず、そうでなければ欠損が最終的な治療の準備ができていれば、一貫して不変であり得る。本明細書に開示されるインプラントは、皮膚を介して、又は体腔又は解剖学的開口部を介して体内に入ることによって骨領域内に挿入され得、付近の構造に対する追加の損傷を最小限に抑え得る。インプラントのサイズ及び形状を含む種類の選択は、これらに限定されないが、インプラントが植え込まれる骨の形状及び／又はサイズ、骨密度の割合（すなわち、残りの骨の多孔性）、並びに／又は足場若しくはインプラントの骨内への拡散の所望の速度及び分布、又はそのような要因の組み合わせを含む多くの要因に基づき得る。いくつかの態様において、インプラントの形状は、骨又は脊椎体の形状に一致するように構築され得、したがって、足場、インプラント若しくはエクスビボ血腫、又は足場、インプラント若しくはエクスビボ血腫に存在する成分のより均一な分布を可能にする。インプラント又はエクスビボ血腫の適用は、手術時に、又は任意の他の好適な方法で起こり得る。

本明細書に開示されるのは、インプラントを構築する方法である。いくつかの態様において、インプラントを構築する方法は、ａ）デポーインプラントを、デポーインプラントの骨欠損への移植を容易にすることができる形状及びサイズのうちの少なくとも１つにおいて寸法を決定すること、並びにｂ）（ｉ）単離された全血及びクエン酸ナトリウム、又は多血小板血漿、血漿単独、赤血球を有する血漿（血小板を含まない）と、（ｉｉ）エカリン、塩化カルシウム、オスクタリン及び塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムとを導入することによって、デポーインプラントを足場を有するように構造化し、足場を作製すること、を含む。いくつかの態様において、足場は５５〜７５％の多孔率を有することができる。いくつかの態様において、足場は少なくとも１５０〜３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン繊維を含み得る。いくつかの態様において、足場中に存在するエカリンの量は、少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、骨格中に存在するＢＭＰ−２の量は、少なくとも０．０１ｍｇであり得る。いくつかの態様において、足場中に存在するエカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、足場中に存在するＢＭＰ−２の量は少なくとも０．０１μｇであり得る。いくつかの態様において、足場は少なくとも１つの生存血液細胞を含み得る。いくつかの態様において、足場は適切な生物学的因子を含み得る。

いくつかの態様において、デポーインプラントの形状は球又はシリンダの形状であり得る。いくつかの態様において、デポーインプラントの形状は、球体又は臨床的緊急性によって指示される任意の他の患者固有の形状（ｇｅｏｍｅｔｒｉｅｓ）、形態、又は形状（ｓｈａｐｅｓ）であり得る。いくつかの態様において、シリンダ形状は、少なくとも５ｍｍ〜約３０ｃｍ（又はそれ以上）の長さであり得る。いくつかの態様において、シリンダ形状は、直径が少なくとも１ｍｍ〜約６０ｍｍ（又はそれ以上）であり得る。いくつかの態様において、シリンダ形状はストレートであり得、及び／又は湾曲し得る。いくつかの態様において、シリンダ形状は、直線ロッド又は湾曲ロッドであり得る。シリンダ又はロッド形状は、他の方向よりも一方向に沿って長くなり得る長手方向軸を有する任意の形状であり得る。縦軸にわたるデポの断面形状は、任意の形状であり得る。いくつかの態様において、断面形状は楕円形、円形、三つ葉、又は任意の他の形状であり得る。いくつかの態様において、インプラントは、そのような長手方向にまっすぐであるか、又は湾曲しているかのいずれかであり得る。インプラントの端面は、形状が平らであるか、丸いか、又は畳み込まれているかのいずれかであるように形状化し得る。

インプラントの寸法は、骨欠損の大きさと治療した解剖学的部位に依存し得る。いくつかの態様において、足場は、欠損の実際のサイズよりも約２０％長くすることができ、しっかりとフィットし、欠損した骨の体積を完全に満たす。例えば、骨欠損のサイズが３ｃｍであり、成人の中軸大腿骨である場合、インプラントは、例えば、直径約３〜４ｃｍ及び長さ約３．６ｃｍの寸法で構築される必要がある可能性が高い。いくつかの態様において、骨格は所与の骨欠損のサイズ及び形状に類似し得る。いくつかの態様において、骨格は走化性であり得る。

本明細書に開示されるのは、インプラントを構築する方法である。インプラントを構築する方法は、ａ）デポーインプラントを骨欠損物へのデポーインプラントの挿入又は移植を容易にすることができる形状及びサイズの少なくとも１つで寸法決定すること、並びにｂ）（ｉ）単離された全血及びクエン酸ナトリウム、又は多血小板血漿、血漿、若しくは赤血球を有する血漿と（ｉｉ）エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムとを導入することによって、デポーインプラントを足場を有するように構造化し、足場を製造すること、を含む。いくつかの態様において、足場は５５〜７５％の多孔率を有し得る。いくつかの態様において、足場は血栓の形態で構築され得る。いくつかの態様において、エクスビボ血腫は、１つ以上の増殖因子を更に含み得る。いくつかの態様において、１つ以上の増殖因子は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１４、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの態様において、ＢＭＰ−２は足場又はエクスビボ血腫に導入され得る。加えて、足場又は凝塊又はエクスビボ血腫は、外科的除去の必要なしに分解するように生分解性であり得る。

また、本明細書に開示されるのは、骨治癒を開始又は強化するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、分節性骨欠損を再構築するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、腫瘍、外傷、又は感染に起因する分節性骨欠損を再構築するために、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して、触媒量のＢＭＰを送達することによって通常の骨折治癒カスケードを開始する生体模倣血腫１２ｑを作製し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、リスクのある骨折（例えば、骨粗鬆症、糖尿病、高齢者、又は喫煙者における）を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、リスクのある骨折を治療するために、本明細書に記載される組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して、触媒量のＢＭＰを送達することによって通常の骨折治癒カスケードを開始する生体模倣血腫を作製し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、非定型的な大腿骨骨折を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、非定型的な大腿骨骨折を経皮的に治療するために、本明細書に記載される組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して、触媒量のＢＭＰを送達することによって通常の骨折治癒カスケードを開始する生体模倣血腫を作製し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、わずかに変位した大腿骨頚部骨折を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、経皮的にわずかに変位した大腿頸部骨折を治療するために、本明細書に記載される組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して、触媒量のＢＭＰを送達することによって通常の骨折治癒カスケードを開始する生体模倣血腫を作製し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、骨粗鬆症性不全骨折（骨盤、脊椎）を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、経皮的に骨粗鬆症性不全骨折（例えば、骨盤、背骨）を治療するために本明細書に記載される組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して、触媒量のＢＭＰを送達することによって通常の骨折治癒カスケードを開始する生体模倣血腫を作製し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、脊髄ケージ（セラミック、ＰＥＥＫ、又は金属合金のいずれか）と併せて脊髄融合手順を増強するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、完全な即時重量負荷を可能にし、より安定した固定を提供し、術後回復を強化する脊髄ケージ（セラミック、ＰＥＥＫ、又は金属合金のいずれか）と併せて脊髄融合手順を増強するために本明細書に記載される組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して、ケージを含む基質に埋め込まれた生体模倣血腫の局所形成を誘導し、触媒量のＢＭＰを送達することによって骨折治癒カスケードを開始し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、長骨骨折（経皮的又は開放的）の遅延した癒合を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、（長骨骨折（経皮的又は開放的）の遅延結合を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して、生体模倣血腫を作製し、触媒量のＢＭＰを送達することによって骨折治癒カスケードを開始し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、長骨骨折（経皮的又は開放的）の確立された非結合を治療する方法である。また、本明細書に開示されるのは、確立された長骨骨折（経皮的又は開放的）の非結合を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して、生体模倣血腫を作製し、触媒量のＢＭＰを送達することによって骨折治癒カスケードを開始し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、長骨骨折の治癒を改善（例えば、加速）するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、エカリンを使用して生体模倣血腫を作製することによって、より迅速な回復を促進するために、選択された候補（高性能アスリートなど）における長骨骨折の回復を改善する（例えば、加速する）ために、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法であり、触媒量のＢＭＰを送達することによって骨折治癒カスケードを開始し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、本選択された獣医学的候補（サラブレッド競走馬など）における長骨骨折の治癒を加速させるために明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、エカリンを使用して生体模倣血腫を作製することによって、選択された獣医学的候補（サラブレッド競走馬など）における長骨骨折の治癒を加速させ、より迅速な回復を促進するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法であり、触媒量のＢＭＰを送達することによって骨折治癒カスケードを開始し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、より迅速及び予測可能な歯科及び顎顔面再構築を容易にするために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、エカリンを使用して生体模倣血腫を作製することによって、より迅速及び予測可能な歯科及び上顎顔面再構築を容易にするために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法であり、触媒量のＢＭＰを送達することによって骨折治癒カスケードを開始し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、そして自発的な顎骨吸収をもたらす状態を逆転させるために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、そして自発的な顎骨吸収をもたらす状態を逆転させるために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して、生体模倣血腫を作製し、骨を局所的に再生する。

また、本明細書に開示されるのは、自発性骨壊死をもたらす状態を治療する、及び／又は逆転させるために本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、自然骨壊死をもたらす状態を逆転させるために本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して経皮的又は開放的（キエンボック病、大腿骨頭の虚血性壊死、及びこれに限定されないが大腿顆を含む様々な他の解剖学的位置の骨壊死など）に送達される生体模倣血腫を作製する。

また、本明細書に開示されるのは、大腿骨頭が崩壊した大腿骨頭の自発的な虚血性壊死をもたらす状態を治療及び／又は逆転させるために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、大腿骨頭が崩壊した大腿骨頭の自発的な虚血性壊死をもたらす状態を治療及び／又は逆転させるために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して、股関節の外科的脱臼後に開放手順で送達される生体模倣血腫を作製する。

また、本明細書に開示されるのは、化学療法、アルコール依存症、喫煙、又は他の外因性薬剤から生じる骨壊死を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、化学療法、アルコール依存症、喫煙、又は他の外因性薬剤から生じる骨壊死を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用して、経皮的又は開放的に送達される生体模倣血腫を作製する。

また、本明細書に開示されるのは、任意の標準的な癒合手順を増強するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、任意の標準的な癒合手順（例えば、股関節、膝、足首、手首、肘、肩、距骨下関節、手根骨又は中足における限定的な融合のいずれか、足指又は指のいずれかの、第一趾、親指、又はより小さい指などの小さい関節のいずれかにおける融合を増強するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用方法であり、エカリンを使用して、生体模倣血腫を作成し、触媒量のＢＭＰを送達することによって骨折形成カスケードを開始し、そして、内因性成長因子を局所的に多活性化する。

また、本明細書に開示されるのは、舟状骨腰骨折の治癒を加速させるために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、舟状骨腰骨折の治癒を加速させ、より迅速な回復を促進するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法であり、エカリンを使用することによって、触媒量のＢＭＰを送達することによって骨折治癒カスケードを開始する生体模倣血腫を作製し、そして、内因性増殖因子を局所的に多活性化する。

本明細書に開示されるのは、複雑な骨格欠損を再構築するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法でもある。また、本明細書に開示されるのは、エカリンを使用して生体模倣血腫を作製し、触媒量のＢＭＰを送達することによって骨形成カスケードを開始し、そして、内因性増殖因子を局所的に多活性化することによって、外傷、腫瘍、又は感染に起因するかどうかにかかわらず、頭蓋骨における複雑な骨格欠損を再構築するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。

また、本明細書に開示されるのは、胸骨切開の治癒を加速させるために本明細書に記載される組成物のいずれかを使用する方法である。また、本明細書に開示されるのは、エカリンを使用して生体模倣血腫を作製し、触媒量のＢＭＰを送達することによって骨形成カスケードを開始し、そして、内因性増殖因子を局所的に多活性化することによって、開放心臓手術に関連する胸骨切開の治癒を加速させ、より迅速な回復を促進するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。

また、本明細書に開示されるのは、構造基質上に埋め込まれた生体模倣血腫の局所形成を誘導し、骨癒合カスケードをより迅速に開始するために、エカリンで増強された特別に適合された骨の内方成長面を有する関節形成術成分において本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。

また、本明細書に開示されるのは、構造基質上に埋め込まれた生体模倣血腫の局所形成を誘導し、骨癒合カスケードをより迅速に開始するために、エカリンで増強された特別に適合された骨の内方成長面を有する、オッセオインテグレーションステム及び関節形成術成分で本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。

本明細書で使用される場合、「生体模倣血腫」という用語は、「エクスビボ血腫」を指すために使用され得る。

また、本明細書に開示されるのは、出血を減少させる、又は出血を管理するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。

また、本明細書に開示されるのは、外科的処置中に広範囲にわたる静脈出血／滲出を管理するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法において、本明細書に記載の組成物のいずれかは、（患部へのエカリン分布のためのアトマイザーを使用して）水性エアロゾルとして局所的に噴霧されるように製剤化され得る。

また、本明細書に開示されるのは、個々の傷ついた血管（例えば、大規模な出血素因部）からの出血を手術中又は緊急の犠牲者の状況で管理又は止血するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法において、本明細書に記載の組成物のいずれかは、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）で投与し得る。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法において、本明細書に記載の組成物のいずれかは、血管の端部でのクランプ／クラムシェルとして適用され得、同時にクランプオフし、エカリンを局所的に送達し、特定の傷ついた血管端部への適用を制限し得る。クランプ又はクランプ要素は、隣接する傷ついた血管を隣接して収縮させ得、そして組成物の全身投与のリスクを排除又は最小限に抑え得る。

また、本明細書に開示されるのは、選択的塞栓形成として本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法において、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかは、介入放射線科医を介して長いＸ線撮影用カテーテルを使用して、１つ以上の標的血管に送達され得、骨盤内／腹腔内／食道／頭蓋内出血を管理又は停止することができ、そして、指示されるように（例えば、血管造影コイルを使用して行われる方法に類似して）別個の病理に限定されるエカリンの選択的かつ高度に特異的な投与を可能にする。

また、本明細書に開示されるのは、半月板出血を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを、罹患した女性の子宮に設置又は配置することを指示するために使用され得る。いくつかの態様において、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。

また、本明細書に開示されるのは、血友病関連の自発性関節症を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。いくつかの態様において、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。

また、本明細書に開示されるのは、抗凝固剤過剰投与（例えば、ワルファリン、クマジンなど）に関連する自発的な関節リウマチを治療するために本明細書に記載される組成物のいずれかを使用する方法である。いくつかの態様において、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。

また、本明細書に開示されるのは、抗凝固剤の過剰投与（例えば、ワルファリン、クマジンなど）に関連する自発的な筋肉内出血を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法において、本明細書に記載の組成物のいずれかを選択的塞栓形成として使用することができる。

また、本明細書に開示されるのは、血友病に関連する自発的な筋肉内出血を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法において、本明細書に記載の組成物のいずれかは選択的塞栓として使用され得る。

また、本明細書に開示されるのは、任意の選択的全膝置換術における術後の関節血症を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。いくつかの態様において、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）又はナノ粒子（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。いくつかの態様において、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）又はナノ粒子（複数可）は、創傷の閉鎖の直前に自由に関節に送達又は散布され得る。

また、本明細書に開示されるのは、鼻血を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。いくつかの態様において、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。いくつかの態様において、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）は、それらの分布を制限し、それらを局所的に封じ込めるために、生地パッキング材料に埋め込まれ得る、又は生地鞘内に封入され得る。いくつかの態様において、エカリンは、生体分解性コラーゲンビーズ（複数可）の一部であるように製剤化され、生地パッキング材料に埋め込まれる、又は生地鞘内に封入されるように、鼻パックの形態で送達され得る。

また、本明細書に開示されるのは、網膜出血を治療するために本明細書に記載の組成物のいずれかを使用する方法である。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法において、本明細書に記載の組成物のいずれかは選択的塞栓として使用され得る。いくつかの態様において、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）又はナノ粒子（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。いくつかの態様において、生分解性コラーゲンビーズ又はナノ粒子製剤が使用され、自己付着形状を作製することによってベルクロタイプ効果を作製し、再発のリスクを最小限に抑え、網膜剥離に積極的に対処する

いくつかの態様において、「出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）」は出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）であり得る。いくつかの態様において、血液は、１つ以上の損傷した血管から循環系を逃れ得る。いくつかの態様において、出血は内部又は外部であり得る。

製造品
本明細書に記載される組成物及びエクスビボ血腫は、例えば、骨欠損を治療するための療法として、又は本明細書に開示される方法のいずれかを使用するために、標識された好適な容器にパッケージ化され得る。したがって、本明細書に記載の少なくとも単離された全血及びクエン酸ナトリウム、又は多血小板血漿、血漿、若しくは赤血球を有する血漿と、エカリン、オスクタリン及び塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、又はトロンビン及び塩化カルシウムとを含むパッケージ製品（例えば、本明細書に記載の組成物又はエクスビボ血腫を含有し、濃縮又は使用可能な濃度で保管、出荷、若しくは販売のためにパッケージ化された滅菌容器）及びキット、並びに使用説明書もまた、本開示の範囲内である。製品は、本明細書に記載の組成物又はエクスビボ血腫を含有する容器（例えば、バイアル、ジャー、ボトル、バッグなど）を含み得る。更に、製造品は、例えば、包装材料、使用説明書、シリンジ、緩衝液、又は予防若しくは治療が必要とされる状態を治療又は監視するための他の対照試薬を更に含み得る。製品はまた、凡例（例えば、印刷されたラベル若しくは挿入物、又は製品の使用を説明する他の媒体（例えば、音声又はビデオテープ）を含み得る。凡例は、容器と関連付けられ得（例えば、容器に貼付される）、その中の組成物又はエクスビボ血腫を投与すべき方法（例えば、投与の頻度及び経路）、したがって、指示、並びに他の使用を説明することができる。組成物又はエクスビボ血腫は、投与の準備ができ（例えば、用量に適した単位で存在する）、薬学的に許容されるアジュバント、担体、又は他の希釈剤を含み得る。あるいは、化合物は、希釈剤とともに濃縮形態で、希釈のための添付の説明書とともに提供され得る。

実施例１：血腫の構造及び生物学的特性。
大分節性骨欠損を治癒するためのアプローチ骨折部位に形成された血腫が骨折の治癒方法に著しく影響を及ぼすことは十分に確立されている。例えば、研究は、血腫の除去が骨折治癒を遅らせることを示した（Ｓｃｈｅｌｌ Ｈ，Ｐｅｔｅｒｓ Ａ，Ｄｕｄａ ＧＮ．Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｆｒａｃｔｕｒｅ ｈｅｍａｔｏｍａ ａｎｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｆｒｅｓｈ ｈｅｍａｔｏｍａ ｄｅｌａｙｓ ｂｏｎｅ ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｓｈｅｅｐ．Ｂｏｎｅ．２０１２）。更に、フィブリン繊維の多孔性及び厚さなどの形成されたフィブリン凝塊の構造的特性が骨修復に影響を及ぼすことを示唆する報告がある（Ｗａｎｇ Ｘ，Ｆｒｉｉｓ ＴＥ，Ｍａｓｃｉ ＰＰ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＲＷ，Ｌｉａｏ Ｗ，Ｘｉａｏ Ｙ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｂｅｔａ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｈｅａｌｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ． Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ；２０１６；６：３５６４５、及びＷａｎｇ Ｘ，Ｆｒｉｉｓ Ｔ，Ｇｌａｔｔ Ｖ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｒ，Ｘｉａｏ Ｙ．Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ．２０１７；１１：２８６４−２８７５）。本明細書に記載の結果は、０．５ｍｍラット大腿骨欠損（通常は治癒する骨折）から単離されたインビボ血腫が、術後３日後に５ｍｍの分節性骨欠損（介入なしでは治癒しない；３２０±６４ｎｍ）と比較して、３５％細いフィブリン繊維（２０９±２０ｎｍ）を有したことを実証する（図２、７、８、及び９）。更に、０．５ｍｍと比較して５ｍｍ欠損においてもより少ない多孔性ネットワークが観察され（４２．５６％対５０．０３％）、グループ間で１６％の差が生じた。大きな骨欠損（５ｍｍ）で形成された血腫と、通常は治癒する骨折（０．５ｍｍ）で形成された血腫との間に生物学的特性に差があるかどうかを調査するために、ＲＮＡシーケンシング分析を使用してインビボ研究が行われた（表１）。

炎症応答を媒介する遺伝子（例えば、Ｉｌ１ｂ−活性化されたマクロファージによって産生される、Ｓｄｆ１−炎症性骨破壊の領域で発現し、破骨細胞形成に対するそれらの抑制効果を媒介する）について大きな違いが見られ、０．５ｍｍ欠損に対して主に５ｍｍ欠損において上方制御されていた。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構造成分（例えば、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ２ａ１、Ｃｏｌ３ａ１）、だけでなくＥＣＭプロテアーゼ（例えば、Ｍｍｐ２）及びそれらの阻害剤（例えば、Ｔｉｍｐ１）にとって重要な遺伝子は、ほとんど下方制御された。対照的に、細胞接着分子（例えば、Ｔｈｂｓ１）を調節する遺伝子が上方制御された。血管新生のプロセスに関与する遺伝子の分析は、新たな血管形成の強力な刺激因子である血管新生因子（Ａｎｇ）が下方制御されている一方で、骨芽細胞系統における細胞も刺激する強力な血管収縮因子である血管新生サイトカインであるエンドセリン（Ｅｄｎ１）は上方制御されていることを示した。骨形成に関連する遺伝子の発現は、骨芽細胞の分化（例えば、Ｂｇｌａｐ、オステオカルシンとしても知られる、骨芽細胞によって分泌されて骨修復を開始する）及び骨形成（例えば、Ｂｍｐ７−間葉細胞の骨及び軟骨への形質転換において重要な役割を果たす）に関与する下方制御された遺伝子のかなりの部分を実証した。
表１．遺伝子制御

これらの結果は、骨治癒の初期段階で、通常治癒する骨折と大きな骨欠損との間の遺伝子発現の重要な違いを最初に実証したものである。最も顕著な相違点は、骨折後の重要事象である炎症反応に関与する遺伝子セットに見出された。０．５ｍｍ欠損に対する５ｍｍ欠損における炎症性遺伝子の上方制御は、大きな骨欠損が通常の骨折よりも強い炎症応答を誘導し、これは、マクロファージ、線維芽細胞、ＭＳＣ、及び骨前駆細胞の動員の増加をもたらすことを示唆する。侵入する炎症細胞は血管新生促進サイトカインも産生し、これは５ｍｍ欠損に対して０．５ｍｍ欠損を比較した際に観察される上方制御を説明している。同時に、骨格発達、骨ミネラル代謝、及びＥＣＭの形成に重要な多くの遺伝子の下方制御は、大きな骨欠損における骨生成反応の減少を示唆している。

また、エクスビボ血栓がＳＶＣＥ、エカリンを使用して特定の構造特性で産生され得るかどうかを決定し、かつ、エカリンが幹細胞に対して毒性であるかどうかを決定するために、インビトロ試験も実施された。結果は、エカリンの濃度に応じて血栓の構造特性が変化したことを革新的に示した（図１１）。例えば、より高い濃度のエカリンは、平均厚さ９３±３ｎｍのより薄いフィブリン繊維をもたらしたが、最も低い濃度では、フィブリン繊維の厚さは１７３±９ｎｍであった。１〜７日の細胞増殖速度は、エカリン濃度の増加とともに低かった（図１２）。例えば、エカリンなしの１４．８±２．６倍の増加と比較して、最高濃度では４．３±０．７倍の増加があり、最低濃度では、１３．７±３．１倍の増加があった。エクスビボ血腫内で培養した細胞は、７日間にわたって安定した細胞数を有した。したがって、これらの結果は、エカリンが毒性を引き起こさないことを示唆するが、濃度が高いほど、細胞増殖速度が低下する可能性がある（図１３）。

これらの観察に基づいて、治癒する正常な骨折における形成された血腫の構造的及び生物学的特性を決定し、それらを介入なしに治癒しない大きな骨欠損と比較するために、追加の実験を実施する（以下の実施例を参照されたい）。例えば、よく組織化されたフィブリン凝塊は、増殖因子の継続的な放出のための一時的な貯蔵庫としての役割を果たすことによって、並びに、細胞浸潤、増殖、及び分化を補助するための十分な空間を提供することによって、骨の治癒を強化する能力について研究される。したがって、修復プロセスを強化する主な機会は、骨折血腫の治癒の固有の特性を模倣する血栓の産生にある。エクスビボで産生された血腫の構造的特性は、ＳＶＣＥを使用して改変され得、それによって、分節性骨欠損に移植されると、骨治癒を強化及び加速する内因性の骨折血腫を模倣する。様々な蛇毒は、心臓病、癌、及び脳卒中を有する患者において、だけでなく狼瘡等の疾患の診断目的にも成功して使用されている。したがって、これらの実験はまた、臨床的に使用されるときに副作用を有することが示されているウシトロンビンの添加と比較して、代替凝塊剤として蛇毒酵素であるエカリンの使用を検討する最初の実験である（Ｄｉｅｓｅｎ ＤＬ，Ｌａｗｓｏｎ ＪＨ．Ｖａｓｃｕｌａｒ．２００８；１６：Ｓ２９−３６、Ｏｆｏｓｕ ＦＡ，Ｃｒｅａｎ Ｓ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＭＷ．Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ．２００９；３１：６７９−６９１、及びＳａｎｄｓ ＪＪ，Ｎｕｄｏ ＳＡ，Ａｓｈｆｏｒｄ ＲＧ，Ｍｏｏｒｅ ＫＤ，Ｏｒｔｅｌ ＴＬ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．２０００；３５：７９６−８０１）。このアプローチは、ＢＭＰなどの増殖因子の必要性を完全に排除するか、又は骨の修復プロセスを強化するために必要な用量を大幅に最小限に抑えるかのいずれかによって、骨治癒をより確実に強化するために使用され得るバイオ足場であるため、改善された治療戦略として探索される。その結果、現在利用可能なものよりも固有の治療戦略が生まれる。これは大幅なコスト削減をもたらし、最も重要なことは、高用量のＢＭＰに関連する多くの有害な副作用を排除する。更に、本明細書に記載される結果は、一般市民及び軍務につく人々に対する骨損傷の治療に重大な影響を及ぼし得る。

実施例２：インビボ骨折血腫の構造及び生物学的特性。
骨欠損は、雄のＳＡＳフィッシャーラット（１０〜１２週齢、ｎ＝３８；ｎ＝５〜８／群）の群で作製され、外部固定器で安定化され（ＲＩＳｙｓｔｅｍ ＡＧ；Ｇｌａｔｔ Ｖ，Ｅｖａｎｓ ＣＨ，Ｍａｔｔｈｙｓ Ｒ．Ｅｕｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｅｒ．２０１２；２３：２８９−９８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ２９９、及びＧｌａｔｔ Ｖ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｍ，Ｉｖｋｏｖｉｃ Ａ，Ｌｉｕ Ｆ，Ｐａｒｒｙ Ｎ，Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２０１２Ｎｏｖ２１；９４（２２）：２０６３−７３）、通常の骨治癒（０．５ｍｍ、図３Ａ）中に形成された血腫及び大分節性骨欠損（５ｍｍ、図３Ｂ）中に形成された血腫の構造的及び生物学的特性を特徴付け、比較された。骨折治癒の経過を評価するために、同じ外部固定装置でも可能な０．５ｍｍの骨切り術が行われた。骨切り術を使用する理由は、それらが再現可能であり、血腫構造特性の特徴付けに重要な、より一貫したサイズの血腫形成を可能にすることである。血栓が成熟した後、手術の３日後に動物を屠殺して、骨折血腫の構造特性を評価した（図３Ａ、Ｂ）。フィブリン繊維の太さ、密度、及び多孔性などの血腫の構造特性は、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ；ｎ＝８／群）及びＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して評価された。更に、異なる試料セットが使用され、ＲＮＡシーケンシングを使用して骨修復プロセスの開始に関与する発現差のある遺伝子を分析した（ｎ＝６／群）。組織を特徴付けるため、並びに、マクロファージ（ＣＤ６８、ＣＤ４０、及びＣＤ２０６）オステリックス、ＰＥＣＡＭ１、ｖＷＦ、ＶＥＧＦ、Ｉ型コラーゲンなどの修復プロセスの開始に関与する主要なタンパク質の存在、及び全体的な組織形態についてのＨ＆Ｅを確認するために組織学及び免疫組織化学（ＩＨＣ）もまた実施される（ｎ＝５／群）。その結果を使用して、３日齢の血腫における構造特性と特定の遺伝子及びタンパク質の発現との間に相関があるかどうかを判定した。

方法ラット、大きな臨床サイズ欠損及び骨切りモデル。およそ２００〜２５０ｇ（１０〜１２週齢）の雄のＳＡＳフィッシャーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、小型動物気化器でイソフルオラン（２％、２ｌ／分）の投与によって麻酔した。その後、動物は、左大腿部に２０ｍｇ／ｋｇのセファゾリン（抗生物質）及び０．０８ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィン（鎮痛剤）の筋肉内注射を受けた。外科的手順の詳細情報は確認され得る（Ｇｌａｔｔ Ｖ，Ｍａｔｔｈｙｓ Ｒ．Ａｄｊｕｓｔａｂｌｅ ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ，ｅｘｔｅｒｎａｌ ｆｉｘａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔ ｆｅｍｕｒ ｏｓｔｅｏｔｏｍｙ ａｎｄ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１４）。簡潔に述べると、各動物の右後肢を剃毛し、クロルヘキシジンで消毒し、滅菌領域に配置し、右足のみに曝露する滅菌の手術用ドレープで覆った。大転子から膝の顆上領域にかけて、右大腿骨の表面上で前側面方向に走る皮膚を通して約３．５〜４ｃｍ切開された。大腿四頭筋とハムストリング筋との間の穏やかな解離によって大腿骨の軸が露出された。外部固定器バーが最初にＧｉｇｌｉワイヤーのこぎりガイドにクリップされ、大腿骨の前側面に配置してドリルをガイドし、ペンドリルを使用して４つのドリル穴の再現可能な配置できるようにした（ＲＩＳｙｓｔｅｍ ＡＧ，Ｄａｖｏｓ Ｐｌａｔｚ，ＣＨ）。取り付けピンは、近位側から始まり、一度に１つずつ事前に開けられた穴に挿入された。固定器が所定の位置に配置された後、のこぎりガイドを使用して欠損を作製した。このため、Ｇｉｇｌｉワイヤーのこぎりは大腿骨の下の２つの溝に通され、往復運動によって５ｍｍの分節性欠損を作成し、単一のワイヤーのこぎりを使用して０．５ｍｍの欠損を作製した。欠損が作成されると、ソーガイドが取り外され、創傷は層で閉じられた。術後３日間、ラットは１２時間毎に鎮痛剤を、２４時間毎に抗生物質を与えられた。構造解析及び生物学的解析のために３日目に血腫が収集された。

走査型電子顕微鏡法インビボ骨折血腫及びエクスビボ血栓は同様に処置された。試料は４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定された。日立ＳＵ１５１０ＶＰ−ＳＥＭを使用して、全体の形態が１００〜１，０００倍の倍率で捕捉された。繊維直径及び密度の分析のために、試料は４％の四酸化オスミウム中で後固定され、エタノール溶液の勾配（２５〜１００％）を通して脱水された。次いで、血腫及び血栓のスライスはＬｅｉｃａ ＥＭ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｐｏｉｎｔ Ｄｒｙｅｒを使用して乾燥され、シリコンチップ標本支持体上に取り付けられ、１０，０００倍（日立Ｓ５５００ＳＥＭ／ＳＴＥＭ）で撮像される前にゴールドパラジウムでスパッタコーティングされ、高分解能で構造特性を明らかにした。画像は、ＩｍａｇｅＪを使用して解析された。

ＲＮＡシーケンシングＲＮＡ（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）の並列シーケンシングは、遺伝子転写産物の存在量をグローバルに測定できるハイスループットな方法である（Ｗａｎｇ Ｚ，Ｇｅｒｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｓｎｙｄｅｒ Ｍ．ＲＮＡ−Ｓｅｑ：Ａ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ．２００９．ｐｐ．５７−６３）。骨折血腫における遺伝子の発現差を決定するために、試料をマイクロ遠心チューブに収集し、直ちに液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。製造業者のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用してＲＮＡ抽出を行った。ＲＮＡの濃度及び品質は、ナノドロップ分光光度計（ＮＤ−１０００，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用して決定され、ＲＮＡの完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して製造業者のプロトコルに従って評価された。５ｍｍの骨欠損を作製するために除去される骨シリンダを、健康な骨の遺伝子発現状態を表す対照として使用した。グローバルトランスクリプトーム分析を使用して、骨修復の開始プロセスに大きな影響を及ぼす上方制御及び／又は下方制御された遺伝子を同定した。この作業は、ｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ３０００を使用して行われた。

組織学及び免疫組織化学。試料はヘマトキシリン及びエオシンで染色され、全体の組織形態が観察された。標準的な免疫組織化学プロトコルがパラフィン包埋切片（５μｍ）に適用された。切片は、マクロファージ（ＣＤ６８及びＣＤ２０６）、オステリックス、ＰＥＣＡＭ１、ＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲンなどのタンパク質の空間発現を決定するために抗体パネルで標識される（Ｍａｅｓ Ｃ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ，Ｓｅｌｉｇ ＭＫ，Ｔｏｒｒｅｋｅｎｓ Ｓ，Ｒｏｔｈ ＳＩ，Ｍａｃｋｅｍ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｍａｔｕｒｅ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，ｍｏｖｅ ｉｎｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｎｄ ｆｒａｃｔｕｒｅｄ ｂｏｎｅｓ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ｉｎｖａｄｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｌｔｄ；２０１０；１９：３２９−３４４）。

これらの実験を実施するために、５ｍｍ及び０．５ｍｍの大腿骨欠損モデルを使用し、記載した外部固定装置で安定化した。これは確立された研究モデルである。使用された主な転帰測定は、日常的な手順である、走査電子顕微鏡法、ＲＮＡシーケンシング、及び組織学／免疫組織化学である。本明細書に開示されるように、ＳＥＭ（図２、７、８、及び９）並びにＲＮＡシーケンシング分析を使用するデータは、５ｍｍ欠損と比較して、０．５ｍｍ欠損で形成される血腫間の構造的及び生物学的特性に顕著な差があることを示した（表１）。

図７〜９は骨折血腫の構造特性を示す走査電子顕微鏡画像を示す。これらのデータは、通常治癒する骨折（０．５ｍｍ）と大きな骨欠損（５ｍｍ）との間の明確な構造差を示す。通常の骨折（０．５ｍｍ）は、より多孔性で、より密度が低く、より細いフィブリン繊維、及びより粗い表面を示した。大きな骨欠損（５ｍｍ）は、多孔性が少なく、より密度が高く、より太いフィブリン繊維、及び滑らかな表面を示した。

実施例３：ヘビ毒凝固酵素を使用して形成されたエクスビボ血栓／血腫の構造特性。
様々な濃度のエカリンを使用して、取り組みの中で血栓の構造特性を変更し、０．５ｍｍの骨切りモデルで形成された天然血腫の特性を模倣するために、ＳＶＣＥ、エカリンが使用された。安楽死時に２１ゲージ針を用いた心臓穿刺によって実施例２で使用した同じ動物から全血が収集された。血液の予想収率は、１匹当たり約５〜１０ｍＬであった。凝固を防ぐために、血液は、９部の血液に１部の４％クエン酸ナトリウム溶液を混合した。ノコギリヘビ毒から精製された酵素、エカリンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入された。ｐＨ、イオン強度、及びカルシウムなどの変数は一定に維持され、一方で、血栓促進酵素は、最終濃度のためにピコモルからナノモルまでの範囲にわたって適用された。塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）及びＣａＣｌ₂＋組換えヒトトロンビンを対照として使用した。エクスビボ血栓は、欠損サイズにまたがる高さ５ｍｍ、及びラット大腿骨の平均直径と一致する直径４ｍｍのシリンダを有することが意図される。高さが０．５ｍｍの血栓が対照として使用され、同じ濃度のＳＶＣＥがより少ない体積の血液に添加されると、形成された血栓において同じ構造特性を産生するかどうかを決定した。ＳＥＭを用いて、構造変化、特にフィブリン繊維の太さ及び密度、並びに凝塊構造全体を評価した。図４Ａ〜Ｄは、本明細書に記載される方法を使用して、異なる構造特性を有するラットにおける血栓を示す。

エクスビボ血栓の調製。エクスビボ血栓を作製するために、安楽死時に麻酔したラットから心臓穿刺によって５〜１０ｍＬの全血を収集された。収集直後、血液は９：１で４％のクエン酸ナトリウム溶液と混合され、凝固を防止した。様々な濃度のエカリンを使用して、血栓化を誘導した。試料を室温で２時間放置し、完全に凝固させた。続いて、エクスビボ血栓は、走査型電子顕微鏡法のために処理される前に、４℃で一晩、４％ＰＦＡで固定された。

走査型電子顕微鏡法。インビボ骨折血腫及びエクスビボ血栓は本質的に同じ方法で処置された。試料は４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定された。日立ＳＵ１５１０ＶＰ−ＳＥＭを使用して、全体の形態は１００〜１，０００倍の倍率で捕捉された。繊維直径及び密度の分析のために、試料は４％の四酸化オスミウム中で後固定され、エタノール溶液の勾配（２５〜１００％）を通して脱水された。次いで、血腫及び血栓のスライスはＬｅｉｃａ ＥＭ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｐｏｉｎｔ Ｄｒｙｅｒを使用して乾燥され、シリコンチップ標本支持体に取り付けられ、１０，０００倍（日立Ｓ５５００ＳＥＭ／ＳＴＥＭ）で撮像される前にゴールドパラジウムでスパッタコーティングされ、高分解能で構造特性を明らかにした。画像は、ＩｍａｇｅＪを使用して解析された。本明細書に開示されるように、ＳＶＣＥ、様々な濃度のエカリンが使用され、０．５ｍｍの骨切りモデルで形成される血腫の特性を模倣するために、試みにおいて全血又は多血小板血漿（ＰＲＰ）のいずれかを使用して、血栓（エクスビボ血腫）の構造特性を変更した。エカリン（０．１及び０．５Ｕ／ｍＬ）又はＣａＣｌ₂（１０ｍＭ）は凝固剤として使用された。本明細書に開示される結果は、全血又はＰＲＰのいずれかを使用して、様々な濃度のエカリンによって必要な構造的特性を有するエクスビボ血腫を作製することが可能であることを実証した。

図１０〜１１は蛇毒誘発エクスビボ血腫の構造特性を示す走査電子顕微鏡画像を示す。これらの結果は、フィブリン繊維の太さ及び密度に影響を及ぼす蛇毒酵素又は塩化カルシウムを使用して血栓の形態が操作され得ること（図１１）、並びにエクスビボ血腫の構造特性が、ＰＲＰで作製されたものと比較して全血で作製されたものと異なること（図１０）を示す。

実施例４：このエクスビボ血腫が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に対して生存可能な環境を提供するかどうかを決定する。
これらの実験が実施され、ＭＳＣが、エカリンの存在下だけでなくエカリン誘導血栓内で播種されたときに生存する能力を決定し、これらの足場の生体適合性を評価する。様々な濃度でのエカリンの細胞生存率及び潜在的な細胞毒性は、２Ｄ及び３Ｄアッセイで測定される。ラット骨ＭＳＣが、異なる濃度のエカリンの存在下で培養され、細胞生存率を決定する。細胞増殖（例えば、ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）及び細胞毒性（例えば、Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）は、１日目、７日目、１４日目、及び２１日目に測定される。その後、エカリンを、決定された特定の構造特性とともに細胞生存率を考慮に入れて、以前の実験から確立された濃度でクエン酸化血液の混合物に添加される。凝固後、血栓は、成長培地を含有する２４ウェルプレートに移される。

エカリン誘導血栓の生体適合性を試験するために、１日目、７日目、１４日目、及び２１日目（ｎ＝３／群）に試料が培養物から除去され、播種された細胞の生存率及び分化可能性、並びに細胞外マトリックスを形成するそれらの能力を研究する。更に、骨組織の再生能力を最大化するために血栓に必要な細胞数が決定される。血栓内の細胞生存率は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞生存率アッセイ及び共焦点イメージングを使用して評価される。

細胞の分化能力を試験するために、細胞は、脂肪生成、軟骨生成、及び骨生成分化培地で培養される。ｑＲＴ−ＰＣＲが使用されて、選択された時点での遺伝子の発現差が決定される。細胞生存率が確立されると、０．５ｍｍ欠損／骨切開骨治癒中に天然血腫の構造的及び生物学的特性に最も類似する血腫が、インビボラット、５ｍｍ大腿骨欠損モデルに移植され、それらの大分節性骨欠損を治癒する能力を研究する。図５Ａ、Ｂの結果に基づいて、より低い濃度の凝固酵素（＜０．５Ｕ／ｍＬ）エカリンを使用しても、細胞に毒性がないことが予想される。

細胞培養。ラット骨髄幹細胞が標準的なプロトコルに従って培養される。培地は３〜４日ごとに交換される。

２Ｄ細胞生存率アッセイ。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、１、３、及び７日目にウェルプレート中で成長させたラット骨髄幹細胞の培養培地に直接添加する。３７℃で２０分間インキュベートした後、蛍光は製造業者の指示に従ってマルチプレートリーダーで読み取られる。

２Ｄ細胞毒性アッセイ。ラット骨髄幹細胞は、９６ウェルプレート中で培養される。１日目、３日目、及び７日目に、上清が収集され、製造業者の指示（Ｐｉｅｒｃｅ ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＡＧ，Ｒｅｉｎａｃｈ ＢＬ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に従って乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性を決定するために使用される。マイクロプレートリーダーを使用して、吸光度は、６８０ｎｍで背景減算されて４９０ｎｍで測定される。

３Ｄエクスビボ血栓における生死染色及び共焦点顕微鏡法。ラット骨髄幹細胞は３Ｄ血栓内で培養される。１、３、及び７日目に、血栓は培養培地から除去され、矢状に半分に切断されてから、１０μＭのＣａｌｃｅｉｎ ＡＭストック及び１μＭのエチジウムホモ二量体−１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を含む無血清培地に２４ウェルプレート中で浸漬される。４℃で３時間、及び３７℃、５％ＣＯ₂、及び１００％の湿度で１時間のインキュベートの後、試料を共焦点顕微鏡を使用して２００μｍの深さまで撮像される（Ｇａｎｔｅｎｂｅｉｎ−Ｒｉｔｔｅｒ Ｂ，Ｓｐｒｅｃｈｅｒ ＣＭ，Ｃｈａｎ Ｓ，Ｉｌｌｉｅｎ−Ｊｕｎｇｅｒ Ｓ，Ｇｒａｄ Ｓ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；７４０：１２７−４０）。

３Ｄ細胞分化アッセイ。細胞が播種された血栓は、製造業者のプロトコルに従って脂肪生成培地、軟骨生成培地、又は骨生成培地（ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）のいずれかで培養される。細胞分化は、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びカスタマイズしたＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアレイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用して評価される。

リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。エクスビボ血栓はマイクロ遠心チューブに収集され、直ちに液体窒素中で急速冷凍され、−８０℃で保管される。ＲＮＡ抽出は、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して行われる。ＲＮＡの濃度及び品質は、ナノドロップ分光光度計（ＮＤ−１０００，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）で決定され、ＲＮＡの完全性は、製造業者のプロトコルに従ってＡｇｉｌｅｎｔ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して評価される。ＴａｑＭａｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用して１μｇの抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、カスタマイズされたＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアレイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用して、炎症、血管新生、及び骨新生関連遺伝子の発現を分析する。

本明細書に開示されるように、骨髄ＭＳＣがエカリンの存在下で生存する能力は、これらの足場の生体適合性を評価するために、エカリン誘導血栓内に播種された場合だけでなく更に調査される。ヘビ毒由来の様々な濃度の凝固酵素を使用しても、エクスビボ血栓に添加されたＭＳＣに毒性はなかった（図１２〜１３）。酵素、エカリンは高度に精製される。したがって、エクスビボ血腫がインビボで移行されると、エカリンは遊走細胞に対して毒性がないことが予想される。更に、ラットモデルにおけるインビボ実験を実施し、これは、２つの異なる濃度（０．３及び０．６Ｕ／ｍｌ）のエカリンが毒性を引き起こさないことを実証した（図１４Ｄ〜Ｆ）。しかしながら、ヒト対象のための特定の構造的及び生物学的特性を有する血栓を作製するためにより高い濃度が必要とされることによって、エカリンが細胞に対して毒性であることが証明される場合、本明細書に記載の塩化カルシウム又は他の凝固因子は、凝塊剤と見なされる。本明細書で言及されるように、トロンビンは、多血小板血漿中の凝固カスケードを活性化するために以前に使用されているが、この産物は、骨修復において不十分な性能を示した（Ｄｉｅｓｅｎ ＤＬ，Ｌａｗｓｏｎ ＪＨ．Ｖａｓｃｕｌａｒ．２００８；及びＳａｎｄｓ ＪＪ，Ｎｕｄｏ ＳＡ，Ａｓｈｆｏｒｄ ＲＧ，Ｍｏｏｒｅ ＫＤ，Ｏｒｔｅｌ ＴＬ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．２０００；３５：７９６−８０１）。これは、ＰＲＰにトロンビンを添加したことが純粋に活性化剤として使用され、凝塊の構造特性が考慮されないという事実に関連し得る。いくつかの態様において、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ｈＦＧＦ−２又はＢＭＰ−２（他のＢＭＰ）などの少用量の増殖因子が添加され得る。

図１２〜１３はエクスビボ蛇毒誘発エクスビボ血腫の構造特性を示す走査電子顕微鏡画像を示す。これらの結果は、細胞生存率が蛇毒酵素の存在によって有意に影響を受けなかったことを示し、生体適合性を示唆している。

実施例５：大きな骨欠損に挿入されたエクスビボで産生されたエクスビボ血腫がラット大腿骨５ｍｍの大きな臨界サイズ欠損モデルにおける骨の再生プロセスを強化できるかどうかを調査する。
雄のＳＡＳフィッシャーラット（１０〜１２週齢、ｎ＝８〜１６；パイロット研究ｎ＝４；エクスビボ血腫、ＢＭＰ−２、ＰＲＰ）の群で作製され、本明細書に記載の外部固定器で安定化された５ｍｍの大腿骨欠損。エクスビボ血腫を骨折ギャップに移植し、大分節性骨欠損の治癒力を強化する能力を決定した（図６）。２つの対照群が使用され、骨治癒過程を実験群と比較した。第１の対照群における治癒は、現在臨床的に使用されているものと同じ製品である吸収性コラーゲンスポンジ（Ｉｎｆｕｓｅ（登録商標）、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ ｐｌｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）上に送達される組換えヒトＢＭＰ−２を使用して強化された。これはＢＭＰ−２を使用した確立された研究モデルで、８週間以内に治癒することが報告されており（Ｇｌａｔｔ Ｖ，Ｂａｒｔｎｉｋｏｗｓｋｉ Ｎ，Ｑｕｉｒｋ Ｎ，Ｓｃｈｕｅｔｚ Ｍ，Ｅｖａｎｓ Ｃ．Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｄｙｎａｍｉｚａｔｉｏｎ：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｉｘａｔｏｒ Ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｏｄｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｌａｒｇｅ−Ｂｏｎｅ−Ｄｅｆｅｃｔ Ｈｅａｌｉｎｇ ａｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ｒｈＢＭＰ−２．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２０１６；９８：６７７−８７、Ｙａｓｋｏ ＡＷ，Ｌａｎｅ ＪＭ，Ｆｅｌｌｉｎｇｅｒ ＥＪ，Ｒｏｓｅｎ Ｖ，Ｗｏｚｎｅｙ ＪＭ，Ｗａｎｇ ＥＡ．Ｔｈｅ ｈｅａｌｉｎｇ ｏｆ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔｓ，ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｒｈＢＭＰ−２）．Ａ ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ，ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；１９９２；７４：６５９−７０、及びＧａｎｔｅｎｂｅｉｎ−Ｒｉｔｔｅｒ Ｂ，Ｓｐｒｅｃｈｅｒ ＣＭ，Ｃｈａｎ Ｓ，Ｉｌｌｉｅｎ−Ｊｕｎｇｅｒ Ｓ，Ｇｒａｄ Ｓ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；７４０：１２７〜４０）、したがって、減少した数の動物が使用された（ｎ＝４）。第２の対照群では、ＰＲＰが使用され、高濃度の血小板が豊富なフィブリン凝塊と比較して、エクスビボ血腫が優れた治癒転帰を有するかどうかを決定した。実験群では、エクスビボ血腫が使用され、作成された足場が骨欠損を再生する能力を有するかどうかを決定した。エクスビボ血腫のメリットは以下の通りである：（１）骨誘導性−重要な増殖因子が長期期間存続し、新しい骨形成を刺激する、及び（２）骨伝導性−よく組織化されたフィブリン構造は、ＭＳＣの移行及び早期鉱物化に好ましい微小環境を作り出す。この概念証明系の実験を成功させることで、自然増殖因子リザーバーとして機能することができるエクスビボ血腫だけでなくｒｈＢＭＰ−２などの増殖因子を添加することなく大分節性骨欠損の治癒を改善する生体適合性自己足場の発達がもたらされることが予想される。これを評価するために、動物は週１回のＸ線によって監視され、８週間で安楽死された。安楽死後、回復した欠損をマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ；全ての試料）による評価のために回収し、組織学／ＩＨＣ（ｎ＝４／群；ｎ＝２（ＢＭＰ−２群）及び生体力学的試験（ｎ＝１２／群；ｎ＝６（ＢＭＰ−２群））について使用された。

手術。ラット手術は本明細書に記載のとおりに行われた。

移植のためのエクスビボ血腫の調製。エクスビボ血栓を作製するために、安楽死時に心臓穿刺によって麻酔したラットから５〜１０ｍＬの全血が収集された。収集直後、血液は９：１で４％のクエン酸ナトリウム溶液と混合され凝固を防止した。以前に決定された０．３及び０．６Ｕ／ｍｌの濃度でエカリンが使用され、０．５５μｇのｒｈＢＭＰ−２と組み合わせて血液凝塊を誘導した。試料は２２℃（室温）で４５分間〜１時間凝固させた後、５ｍｍのラット骨欠損部に移植された。

多血小板血漿（ＰＲＰ）調製及びＢＭＰ−２。ラット血液からＰＲＰを調製するために、安楽死時に心臓穿刺によって麻酔したラットから５〜１０ｍＬの全血が収集された。収集直後、血液は９：１で４％のクエン酸ナトリウム溶液と混合され凝固を防止した。全血は室温で１５０×ｇで１０分間、ソフトブレーキで遠心分離し、血漿及び赤血球から血小板層を分離した。下位赤血球層は廃棄され、中央血小板層及び上位血漿層が回収された。全血中及びＰＲＰ中の血小板数は、細胞計数チャンバーを使用して決定され、ＰＲＰの質を確認した。塩化カルシウムが添加されて、ＰＲＰゲルを作製し、これが欠損ギャップに移植された。組換えヒトＢＭＰ−２（５．５μｇ）が、骨欠損の形状の吸収性コラーゲンスポンジキャリア（Ｉｎｆｕｓｅ（商標）Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ，Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）に適用され、これがインプラントとして使用された。

骨治癒の評価。１６匹の動物の各群の大腿骨は、毎週Ｘ線により生体内で評価され、安楽死後、μＣＴにより評価される。１２個の試料は生体力学的試験に供し、４個は組織学に使用される。パイロット試験のために、群あたり４匹の動物が使用された。

Ｘ線撮影。骨の治癒は毎週の放射線撮影によって監視された。外科的処置に記載されるように、全身麻酔下で、ラットは腹部位置に配置し、後肢を横方向に回転させて、再現可能で標準的な画像が欠損に対して正常になるようにした。

マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）。大腿骨は、１０ｍｍ焦点マイクロフォーカスＸ線管を備えたデスクトップ顕微鏡像システム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｓｋｙｓｃａｎ １１７２，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用してスキャンされる。大腿骨は、１検体当たり約６００μＣＴスライスで、７５ｋｅＶのエネルギー及び２５０ｍｓの積分時間で１６μｍの等方性ボクセルサイズを使用してスキャンされる。評価は、既存の皮質骨が分析に含まれていないことを確認するために、４ｍｍの中央欠損領域に適用される。関心領域を評価するために、欠損の全断面積（ＴＶ、ｍｍ³）及び骨体積（ＢＶ、ｍｍ³）、骨体積分画（ＢＶ／ＴＶ、％）、骨鉱物密度（ＢＭＤ、ｍｇＨＡ／ｃｃｍ）、及び極性慣性モーメント（ｐＭＯＩ、ｍｍ⁴）の変数が評価される。画像は、適応反復アルゴリズムを使用して閾値化され、形態測定変数は、基礎となる構造に関するいかなる以前の仮定にも依存しない直接３Ｄ技術を使用して、二値化された画像から計算される。

機械的試験。非侵襲的イメージングに続いて、各群から１２個の検体がねじれから破損まで試験される。各検体の端部がポリメチルメタクリレートに埋め込まれ、試験モジュールとの適切で再現可能なグリップインターフェースを提供する。検体は、規則的な変形制御下で、５ｒａｄ／ｍｉｎの一定の変形速度で破損を試験される。角度変形と負荷荷重データは１０Ｈｚで取得される。トルク及び回転データが使用され、治癒した欠損のねじり剛性及び強度を計算する。

骨試料の組織学。大腿骨（ｎ＝４）は氷冷した４％パラホルムアルデヒド中で４８時間固定され、続いて最大４週間、１４％ＥＤＴＡ中で脱石灰する。埋め込みと切断の前に、ピンは骨から取り外される。固定及び脱石灰された組織は、１００％まで勾配エタノール中で脱水され、キシレンに移され、パラフィンに埋め込まれる。５ミクロンのパラフィン切片はポリＬ−リジンでコーティングしたスライド上に配置され、一晩乾燥され、直ちに染色されるか、又は４℃で保管される。代替切片は、光学顕微鏡で検査する前に、ヘマトキシリン及びエオシン又はサフラニンＯ及びファストグリーンで染色される。サフラニンＯは、軟骨内骨化プロセスを監視する一環として軟骨を染色するために含まれる。

パワー分析と統計。すべての個々の群の試料サイズは、収集されたデータの種類における１５％の変動係数に基づいており、０．０５のアルファレベル及び８０％のパワー（ベータ＝０．２０）を使用している。パワー分析は、群当たりｎ＝８〜１６匹の動物が、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−検定を用いた１．３の効果サイズに基づいて、各転帰パラメータについて群間の有意差の検出を可能にすることを明らかにした。これらのラットモデルに関する以前の経験は、ｎ＝１０が十分な統計力を与えることを確認する。インビトロ実験は、三重で実施され、ＡＮＯＶＡ試験を使用して統計的有意性について比較される。ｎＱｕｅｒｙ Ａｄｖｉｃｅソフトウェアプログラム（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）のバージョン４．０を使用して、試料サイズ及びパワー計算が決定された。統計解析は、ＳＡＳバージョン６．１２ソフトウェア（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して実施される。両側ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なされる。

インビトロでの用量応答を決定するための実験は、自然治癒骨折血腫の構造特性を模倣する特定の構造特性を有するエクスビボ血腫を作製するために重要である。治癒がエクスビボ血栓のみを使用して達成され得ない場合、エクスビボ血腫は、ラット骨髄間葉系幹細胞、現在臨床的に使用されている超生理学的用量と比較して著しく減少した量のｒｈＢＭＰ−２、又は他の増殖因子のいずれかと組み合わされる。

本明細書に開示されるように、８週間及び４週間（０．６Ｕ／ｍｌ＋０．５５μｇのＢＭＰ−２を有する群）の骨欠損治癒時間（図１４Ａ〜Ｆ）の終了時のインビボ試験のインビボ結果は、全血＋エカリン（０．１Ｕ／ｍＬ）（図１４Ａ）及び多血小板血漿（ＰＲＰ）＋ＣａｌＣｌ₂（１０ｍＭ）（図１４Ｂ）が、試験した凝固因子の濃度で骨治癒／再生を強化しないことを明確に実証する。対照的に、０．３Ｕ／ｍＬのエカリン及びＢＭＰ−２の１．１μｇ（図１４Ｄ）又は０．５５μｇ（図１４Ｅ）のいずれかを欠損に加えると、５ｍｍの大腿ラット欠損は治癒した。同じ量のＢＭＰ−２を使用してＭｅｄｔｒｏｎｉｃ（Ｉｎｆｕｓｅ（商標））によって販売されるコラーゲンスポンジ上に送達されるＢＭＰ−２は骨欠損の治癒を開始しなかったことに留意することが重要である（図１４Ｃ）。興味深いことに、０．６Ｕ／ｍＬのエカリン＋０．５５μｇのＢＭＰ−２を使用した場合（図１４Ｆ）、より低い濃度のエカリンで観察されたものと比較して、治癒ははるかに良好であった。この結果は、血栓の超微細構造特性（エクスビボ血腫）が骨欠損の治癒を強化するために大きな影響を与えることを示しているように思われる。

実施例６：生体模倣血腫：ｒｈＢＭＰ−２／ＡＣＳに対する骨治癒における凝固剤及びｒｈＢＭＰ−２濃度の影響。
凝固剤、エカリン、カルシウム／トロンビン、だけでなくＢＭＰ−２の様々な濃度が試験され、大分節性骨欠損の治癒を開始する能力を実証した。試験したエカリンの濃度は、０．３、０．６、及び０．７５Ｕ／ｍＬを含み、これらの濃度は正常に治癒を開始した（図１５、４〜８列）が、０．６Ｕ／ｍＬのエカリンの濃度は、試験した用量の最良の結果を示した。同様に、凝固剤１０ｍＭのＣａＣｌ₂及び０．５Ｕ／ｍＬのトロンビンの組み合わせ（図１５、３列目）もまた、０．６Ｕ／ｍＬのエカリンと０．３３μｇのＢＭＰ−２と同様の方法で大きな骨欠損を効果的に治癒させた（図１５、４列目）。このラットモデルにおいて一貫して５ｍｍ骨欠損の治癒を開始したＢＭＰ−２の濃度は、０．３３μｇである。この用量は、１１μｇの標準用量よりも３３倍低く、この用量は、５ｍｍの大腿骨欠損ラットモデル（５．５μｇ、図１５、１番目のカラム）において、大分節性骨を効率的に治癒させるＢＭＰ−２／ＡＣＳ（ＡＣＳ＝吸収性コラーゲンスポンジ）の最低有効用量よりも１７倍低い。骨欠損の治癒を開始した他の２つの試験された用量は、０．１６５μｇ及び０．０８２５μｇであった（図１５、７列及び８列参照）が、これらの用量による応答は、０．３３μｇと比較して、一貫性が低く、それぞれ７５％及び５０％であった（例えば、カラム５を参照）。

Claims (54)

1. （ａ）単離された全血と、（ｂ）クエン酸ナトリウムと、（ｃ）エカリン；オスクタリン及び塩化カルシウム；塩化カルシウム；トロンビン；又はトロンビン及び塩化カルシウムとを含むエクスビボ血腫であって、少なくとも１５０〜３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン繊維を含むことを特徴とするエクスビボ血腫。
2. （ａ）多血小板血漿、血漿、又は赤血球を有する血漿と、（ｂ）エカリン；オスクタリン及び塩化カルシウム；塩化カルシウム；トロンビン；又はトロンビン及び塩化カルシウムとを含むエクスビボ血腫であって、少なくとも１５０〜３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン繊維を含む、前記エクスビボ血腫。
3. クエン酸ナトリウムを更に含む、請求項２に記載のエクスビボ血腫。
4. 抗生物質を更に含む、請求項１又は２に記載のエクスビボ血腫。
5. １つ以上の増殖因子を更に含む、請求項１又は２に記載のエクスビボ血腫。
6. 前記１つ以上の増殖因子が、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１４、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、又はそれらの組み合わせである、請求項１又は５に記載のエクスビボ血腫。
7. 前記全血が、生存細胞及び１つ以上の生物学的因子を含む、請求項１に記載のエクスビボ血腫。
8. 前記全血の前記生存細胞の約５０％〜７０％が、前記血腫の形成後、生存可能なままである、請求項７に記載のエクスビボ血腫。
9. 治療剤を更に含む、請求項１又は２に記載のエクスビボ血腫。
10. 全血と、エカリンと、クエン酸ナトリウムとを含む、請求項１に記載のエクスビボ血腫。
11. 全血と、塩化カルシウムと、クエン酸ナトリウムとを含む、請求項１に記載のエクスビボ血腫。
12. 多血小板血漿と、エカリンとを含む、請求項２に記載のエクスビボ血腫。
13. 多血小板血漿と、塩化カルシウムとを含む、請求項２に記載のエクスビボ血腫。
14. 全血と、クエン酸ナトリウムと、トロンビンとを含む、請求項１に記載のエクスビボ血腫。
15. 全血と、塩化カルシウム、又はオスクタリン及び塩化カルシウムと、クエン酸ナトリウムとを含む、請求項１に記載のエクスビボ血腫。
16. 前記エクスビボ血腫中に存在する前記エカリンの濃度が、少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬである、請求項１又は２に記載のエクスビボ血腫。
17. 前記エクスビボ血腫中に存在する前記エカリンの濃度が、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１Ｕ／ｍＬである、請求項１又は２に記載のエクスビボ血腫。
18. 骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を更に含む、請求項１又は２に記載のエクスビボ血腫。
19. 前記治療剤が、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）である、請求項９に記載のエクスビボ血腫。
20. 前記エクスビボ血腫中に存在する前記ＢＭＰ−２の用量が、少なくとも０．０１ｍｇである、請求項１８に記載のエクスビボ血腫。
21. 前記ＢＭＰ−２が、組換えＢＭＰ−２である、請求項１８に記載のエクスビボ血腫。
22. 前記組換えＢＭＰ−２が、ヒトＢＭＰ−２を含む、請求項２１に記載のエクスビボ血腫。
23. 増殖因子、血小板、及び細胞を更に含む、請求項１又は２に記載のエクスビボ血腫。
24. ゲル又は液体として製剤化される、請求項１又は２に記載のエクスビボ血腫。
25. 局所投与のために製剤化される、請求項１又は２に記載のエクスビボ血腫。
26. 前記エクスビボ血腫中に存在する前記エカリンの量が、少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり、前記エクスビボ血腫中に存在する前記ＢＭＰ−２の量が少なくとも０．０１ｍｇである、請求項１８に記載のエクスビボ血腫。
27. 骨治癒を促進する、又は骨置換材料又はインプラントを産生する方法であって、請求項１又は２に記載のエクスビボ血腫を含む治療有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
28. 前記全血が、生存細胞及び１つ以上の生物学的因子を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記エクスビボ血腫が、全血、エカリン及びクエン酸ナトリウム；全血、塩化カルシウム及びクエン酸ナトリウム；多血小板血漿及びエカリン；又は多血小板血漿及び塩化カルシウムを含む、請求項２７に記載の方法。
30. 前記エクスビボ血腫が、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を更に含む、請求項２７に記載の方法。
31. 前記ＢＭＰ−２が、組換えＢＭＰ−２である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記組換えＢＭＰ−２が、ヒトＢＭＰ−２を含む、請求項３１に記載の方法。
33. 増殖因子、血小板、及び細胞を前記更に含む、請求項２７に記載の方法。
34. 前記対象が、ヒトである、請求項２７に記載の方法。
35. 前記組成物が、凝塊又は足場として製剤化される、請求項２７に記載の方法。
36. 前記組成物が、局所投与のために製剤化される、請求項２７に記載の方法。
37. 前記組成物が、局所投与され、移植され、又は経皮的に送達される、請求項２７に記載の方法。
38. 前記組成物が、移植される、請求項２７に記載の方法。
39. 前記組成物中に存在する前記エカリンの量が少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり、前記組成物中に存在する前記ＢＭＰ−２の量が少なくとも０．０１〜５ｍｇである、請求項３０に記載の方法。
40. 前記対象が、骨格欠損を有する、請求項２７に記載の方法。
41. 前記骨格欠損が、大分節性骨欠損である、請求項４０に記載の方法。
42. 前記対象が、１つ以上の骨折を有する、請求項２７に記載の方法。
43. 前記対象が、１つ以上の骨損傷を有する、請求項２７に記載の方法。
44. インプラントを構築する方法であって、
    ａ）デポーインプラントの骨欠損への移植を容易にする形状及びサイズのうちの少なくとも１つにおいて、前記デポーインプラントを寸法決定する工程と、
    ｂ）（ｉ）単離された全血及びクエン酸ナトリウム；又は多血小板血漿、血漿、若しくは赤血球を有する血漿；並びに（ｉｉ）エカリン；オスクタリン及び塩化カルシウム；塩化カルシウム；トロンビン；又はトロンビン及び塩化カルシウムを導入することによって、足場を有するための前記デポーインプラントを構築して、前記足場を作製する工程と、
    を含み、前記足場が、５５〜７５％の多孔率を有することを特徴とする方法。
45. 前記足場が、少なくとも１５０〜３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン繊維を含む、請求項４４に記載の方法。
46. 前記デポーインプラントの前記形状が、シリンダ又は球体の形状である、請求項４４に記載の方法。
47. 前記足場が、凝塊として構築される、請求項４４に記載の方法。
48. １つ以上の増殖因子を更に含む、請求項４４に記載の方法。
49. 前記１つ以上の増殖因子が、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１４、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、又はそれらの組み合わせである、請求項４４に記載の方法。
50. 前記ＢＭＰ−２が、前記足場に導入される、請求項４９に記載の方法。
51. 前記足場中に存在する前記エカリンの量が少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり、前記足場中に存在する前記ＢＭＰ−２の量が少なくとも０．０１ｍｇである、請求項４９に記載の方法。
52. 前記足場が、所与の骨欠損の前記サイズ及び形状に類似する、請求項４４に記載の方法。
53. 前記足場が、走化性である、請求項４４に記載の方法。
54. 前記足場が、生存可能な血液細胞及び適切な生物学的因子を含む、請求項４４に記載の方法。

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