JP2022502372A

JP2022502372A - 皮膚状態の治療におけるグランザイムｋ活性の調節

Info

Publication number: JP2022502372A
Application number: JP2021516564A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．グランヴィル，デイビッド; ターナー，クリストファー; ゼグリンスキー，マシュー; リチャードソン，カトリン; 翔廣保
Original assignee: ザユニヴァーシティオブブリティッシュコロンビア
Priority date: 2018-09-24
Filing date: 2019-09-24
Publication date: 2022-01-11
Also published as: IL281721A; EP3856234A4; US20220031820A1; KR20210065983A; CA3113820A1; EP3856234A1; WO2020061688A1; AU2019350072A1; CN113164567A

Abstract

【課題】皮膚状態の治療におけるグランザイムＫ活性の調節に関する。【解決手段】一態様では、アトピー性皮膚炎及び乾癬などの炎症性皮膚状態を治療するための方法が提供される。別の態様では、皮膚創傷治癒を促進するための方法が提供される。さらなる態様では、熱的傷害及び圧迫傷害などの皮膚創傷を治療するための方法が提供される。本方法では、グランザイムＫの活性が低下される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月２４日に出願された米国特許出願第６２／７３５，４１４号、及び２０１９年５月２３日に出願された米国特許出願第６２／８５１，７９０号の優先権を主張するものであり、各出願はその内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される。

配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、７０３８１＿Ｓｅｑ＿Ｆｉｎａｌ＿２０１９−０９−２０．ｔｘｔである。テキストファイルは４，０９６ＫＢであり；２０１９−０９−２０に作成され、明細書の提出と共にEFS-Web経由で提出されている。

発明の背景
顆粒分泌酵素（グランザイム）は、ペルフォリン依存性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）顆粒開口分泌媒介性細胞死に寄与することが長い間提案されているセリンプロテアーゼのファミリーである（Lobe et al., 1986；Masson and Tschopp, 1987；Tschopp et al., 1986）。ヒトには、グランザイムＡ（トリプターゼ）、グランザイムＢ（アスパルターゼ）、グランザイムＨ（キマーゼ）、グランザイムＫ（ＧｚｍＫ；トリプターゼ）、及びグランザイムＭ（メターゼ）の５種のグランザイムがある。各グランザイムは異なる細胞型によって独自に発現され、それぞれが別々の基質特異性と機能を有する（（Turner et al., 2017a；Voskoboinik et al., 2015）で概説される）。

新たに出現した証拠は、ＧｚｍＫが細胞傷害性であるという概念に異議を唱え、実際には炎症誘発性サイトカインの放出を促進するように作用してもよいことを示唆する（Joeckel et al., 2017；Joeckel et al., 2011）。ＧｚｍＫは健常人の血漿中に低レベルで生じるが、ウイルス感染（Bade et al., 2005）、アレルギー性喘息、肺炎（Bratke et al., 2008）、敗血症（Rucevic et al., 2007）、及び内毒血症（Wensink et al., 2016）に応答して急速に上昇する。リンパ球性脈絡髄膜炎（Joeckel et al., 2017）又はチクングニアウイルス（Wilson et al., 2017）のどちらかに感染したマウスもまた、血漿由来のＣＴＬ中及び血漿中でそれぞれ増加したＧｚｍＫ発現を示す。ＧｚｍＫ−／−マウスは、チクングニアウイルス感染に応答した足の腫れの減少を示す（Wilson et al., 2017）。培養された肺線維芽細胞及び内皮細胞のＧｚｍＫへの曝露は、ＰＡＲ−１活性化に依存する炎症誘発性サイトカイン放出を刺激する（Cooper et al., 2011；Sharma et al., 2016）。ＧｚｍＫはまた、マクロファージ中のＩＬ−１産生を誘導する（Joeckel et al., 2011）。

炎症は、熱傷／火傷によって引き起こされる、過度の瘢痕の発生、及び痛みを伴う皮膚拘縮の発生に重要な役割を果たす。熱傷治癒には、複数の細胞型と細胞外微小環境の間の相互作用が関与するイベントの複雑な協調が必要である。過度の炎症を抑えることは、二次的な熱傷創の拡大、瘢痕化、及び線維症を低減させるための主要なストラテジーである。炎症を増強することによって、ＧｚｍＫは熱傷創の治癒に重要な貢献を提供してもよい。異常な免疫細胞の浸潤及び活性はまた、乾癬、皮膚炎、及びその他の形態の創傷治癒をはじめとする、その他の皮膚状態の発症及び／又は進行においても重要な役割を果たす。

炎症性皮膚状態を治療するため、皮膚創傷を治療するため、及び皮膚創傷治癒を促進するための効果的な方法に対する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、さらに関連する利点を提供する。

発明の概要
本発明は、グランザイムＫ（ＧｚｍＫ）の活性を低下させることによって、炎症性皮膚状態を治療し、皮膚創傷を治療し、皮膚創傷治癒を促進するための方法を提供する。

一態様では、本発明は、対象におけるグランザイムＫの活性を低下させ、それによって炎症性皮膚状態を治療することを含む、対象における炎症性皮膚状態を治療する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、対象におけるグランザイムＫの活性を低下させ、それによって創傷を治療することを含む、対象における創傷を治療する方法を提供する。

上記の方法の特定の実施形態では、グランザイムＫの活性を低下させることは、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することを含む。

関連実施形態では、本発明は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与し、それによって炎症性皮膚状態を治療することを含む、対象の炎症性皮膚状態を治療する方法、及び有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与し、それによって創傷を治療することを含む、対象の創傷を治療する方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、創傷治癒を促進するための方法を提供する。一実施形態では、本発明は、対象におけるグランザイムＫの活性を低下させることによって、ケラチノサイトにおけるシンデカン−１の切断を阻害することを含む、対象における創傷治癒を促進する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、対象におけるグランザイムＫの活性を低下させることによって、ケラチノサイト、線維芽細胞、マクロファージ、及び／又は内皮細胞における炎症誘発性サイトカイン応答を低減することを含む、対象における創傷治癒を促進する方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することによってシンデカン−１の切断を阻害することを含む、対象における創傷治癒を促進する方法を提供する。なおもさらなる実施形態では、本発明は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することによって、ケラチノサイト、線維芽細胞、マクロファージ、及び／又は内皮細胞における炎症誘発性サイトカイン応答を低減することを含む、対象の創傷治癒を促進する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、再上皮化を促進するための方法を提供する。一実施形態では、本発明は、創傷に近接するケラチノサイトにおけるグランザイムＫの活性を低下させることを含む、創傷の再上皮化を促進するための方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することによって、ケラチノサイトにおけるシンデカン−１の切断を阻害することを含む、対象における創傷再上皮化を促進するための方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することを含む、対象における創傷の再上皮化を促進するための方法を提供する。なおも別の実施形態では、本発明は、創傷又は損傷を受けた組織領域におけるＧｚｍＫの活性を低下させることによって、ケラチノサイトにおけるシンデカン−１切断を阻害することを含む、再上皮化を刺激する方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、グランザイムＫの活性を低下させることによって、グランザイムＫ媒介性免疫細胞動員と、傷害部位に位置する血管における内皮炎症誘発性応答とを含む、対象における血管透過性（漏出）を防止する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、創傷又は損傷を受けた組織領域におけるグランザイムＫの活性を低下させることによって、ケラチノサイト、線維芽細胞、マクロファージ、及び／又は内皮細胞の炎症誘発性サイトカイン応答を低下させることを含む、炎症誘発性表現型を治癒促進性創傷修復表現型に変換する方法を提供する。

上記の方法で治療可能な炎症性皮膚状態としては、乾癬及びアトピー性皮膚炎が挙げられる。

上記の方法で治療可能な創傷としては、熱傷創、慢性創傷、急性創傷、圧迫傷害創傷、及び虚血性傷害創傷が挙げられる。

上記の方法において、適切なグランザイムＫ阻害剤としては、小分子、核酸分子、ペプチド、及び抗体が挙げられる。代表的なグランザイムＫ阻害剤としては、インターα阻害剤タンパク質（ＩαＩｐ）及びビクニンが挙げられる。本方法では、阻害剤は局所的又は全身的に投与され得る。

なおも別の態様では、本発明は、炎症性皮膚状態を治療する能力又は創傷治癒を促進する能力について化合物をスクリーニングするための方法を提供する。一実施形態では、本発明は、候補化合物を生体外でグランザイムＫと接触させることを含み、候補化合物と接触していないグランザイムＫと比較したグランザイムＫ活性の阻害が、候補化合物が炎症性皮膚状態又は創傷の治療に有用であってもよいことを示す、炎症性皮膚状態を治療する能力又は創傷治癒を促進する能力について候補化合物をスクリーニングするための方法を提供する。特定の実施形態では、候補化合物は、グランザイムＫを選択的に阻害し、同じ化合物濃度でグランザイムＡを実質的に阻害しない。

図面の説明
本発明の前述の態様及び付随する利点の多くは、添付の図面と併せて、以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解されるであろう。

ＧｚｍＫがヒトの熱傷組織で上昇していることを図示する。ＧｚｍＫの免疫組織化学を示し、健常皮膚及び熱傷を陰性対照と比較する。炎症性細胞の浸潤（矢頭）と結合したＧｚｍＫ＋細胞、及び真皮−表皮接合部（２００μｍのサイズバー）。図１Ａの陰性対照は、二次抗体のみである。ＧｚｍＫがヒトの熱傷組織で上昇していることを図示する。ヒト熱傷炎症性細胞浸潤において、ＧｚｍＫがＣＤ６８と共局在していることを示す（明るさはＧｚｍＫ／ＣＤ６８の共局在を示す。図１Ａ及び１Ｂは、患者２からの画像である（傷害後２１日目）（５０μｍのサイズバー）。図１Ｂの陰性対照は、二次抗体のみである。ＧｚｍＫがヒトの熱傷組織で上昇していることを図示する。Ｍ０に分極され、次に古典的に（Ｍ１）又は代替的に（Ｍ２ａ）活性化されたＴＨＰ−１細胞における、ＧｚｍＫ免疫蛍光を比較する（１０μｍのサイズバー）。ＧｚｍＫがヒトの熱傷組織で上昇していることを図示する。マクロファージｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを示す。ＧｚｍＫがヒトの熱傷組織で上昇していることを図示する。無血清培地中でのインキュベーションの２４時間後の培養上清における、ＥＬＩＳＡ法によるＧｚｍＫの検出結果を示す（１ｍｇの全細胞タンパク質あたりのＧｚｍＫのｎｇ）（平均±ＳＤ、各群あたりｎ＝３）。ＧｚｍＫがヒトの熱傷組織で上昇していることを図示する。マウスの火傷におけるＧｚｍＫの免疫組織化学を示す（ＷＴ及びＧｚｍＫ−／−マウス、３日目及び６日目、対照あり）（２０μｍのサイズバー）（１Ｆ）。図１Ｆの陰性対照は、二次抗体のみである。ＧｚｍＫ−／−マウスが改善された創傷治癒を示したことを図示する。ＧｚｍＫ−／−及びＷＴマウスの熱的傷害の経時的な写真による比較（１日目、３日目、６日目、９日目、及び１２日目）（５ｍｍのサイズバー）（２Ａ）。ＧｚｍＫ−／−マウスが改善された創傷治癒を示したことを図示する。巨視的な創傷領域の定量分析（ＧｚｍＫ−／−（破線）及びＷＴ（実線）マウス；データは平均±ＳＥＭ（群当たりｎ≧６マウス）として提示される）（２Ｂ）。ＧｚｍＫ−／−マウスが改善された創傷治癒を示したことを図示する。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライドから測定された、創傷の開き（ｍｍ）の定量分析。データは平均±ＳＥＭとして提示される（群あたりｎ＝５）（２Ｃ）。ＧｚｍＫ−／−マウスが改善された創傷治癒を示したことを図示する。ＧｚｍＫ−／−及びＷＴについて、傷害後６日目の創傷の代表的なＨ＆Ｅ画像が比較される（２００μｍのサイズバー）（２Ｄ）。ＧｚｍＫ−／−マウスが改善された創傷治癒を示したことを図示する。ＧｚｍＫ−／−及びＷＴマウスについて、傷害後３日目及び６日目の創傷のｉＮＯＳ（Ｍ１マクロファージ）染色が比較される（２００μｍのサイズバー）（２Ｅ）。ＧｚｍＫ−／−マウスが改善された創傷治癒を示したことを図示する。ＧｚｍＫ−／−及びＷＴマウスの傷害後３日目及び６日目のＭ１マクロファージの定量化（データは平均±ＳＥＭとして提示される（群あたりｎ＝５））。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、スチューデントのｔ検定で計算されたＷＴ対照との比較（２Ｆ）。ＧｚｍＫ−／−マウスが再上皮化と組織修復の改善を示すことを図示する。ＧｚｍＫ−／−及びＷＴマウスの傷害後３日目及び６日目の火傷の再上皮化（３Ａ）。３Ａのデータは、平均±ＳＥＭとして提示される（群あたりｎ≧５マウス）。ＧｚｍＫ−／−マウスが再上皮化と組織修復の改善を示すことを図示する。かさぶたの脱落は、間接的な再上皮化尺度を提供する（ＧｚｍＫ−／−（破線；ｎ＝１８）及びＷＴマウス（実線；ｎ＝１５）（３Ｂ）。ＧｚｍＫ−／−マウスが再上皮化と組織修復の改善を示すことを図示する。ＧｚｍＫ−／−及びＷＴマウスのマウス熱傷肉芽組織における代表的なマッソン３色染色、コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＩＩ染色（傷害後１４日目；ｎ＝６）（１００μｍのサイズバー）；ＧｚｍＫ−／−マウスが再上皮化と組織修復の改善を示すことを図示する。ＧｚｍＫ−／−及びＷＴマウス（傷害後１４日目；ｎ＝６）のマッソン３色染色定量化（１００μｍのサイズバー）（３Ｄ）；３Ｄのデータは、平均±ＳＥＭとして提示される（群あたりｎ≧５マウス）。ＧｚｍＫ−／−マウスが再上皮化と組織修復の改善を示すことを図示する。ＧｚｍＫ−／−及びＷＴマウス（傷害後１４日目；ｎ＝６）のコラーゲンＩ／ＩＩＩ比（３Ｅ）。３Ｅのデータは、平均±ＳＥＭとして提示される（群あたりｎ≧５マウス）。ＧｚｍＫ−／−マウスが再上皮化と組織修復の改善を示すことを図示する。ＧｚｍＫ−／−及びＷＴマウスの傷害後２１日目及び４１日目における、最小創傷破断力、群あたりｎ≧６マウス（３Ｆ）。平均と個々のデータ点（群あたりｎ≧５マウス）。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、スチューデントのｔ検定（３Ｆ）で計算されたＷＴとの比較。ＧｚｍＫが生体外でケラチノサイトの創傷治癒を損ない、炎症誘発性サイトカインの発現を誘導することを図示する。ＥＣＩＳ創傷アッセイでは、細胞は、１０ｎＭ（３００ｎｇ／ｍＬ）、２５ｎＭ（６００ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＧｚｍＫと共にインキュベートされ、又は未処理（ｎ＝３）である、ｎ＝３、３回実施（ＨａＣａＴと皮膚線維芽細胞の経時的な抵抗を比較する）（４Ａ）。ＧｚｍＫが生体外でケラチノサイトの創傷治癒を損ない、炎症誘発性サイトカインの発現を誘導することを図示する。細胞上清のＩＬ−６ＥＬＩＳＡ（ＨａＣａＴと皮膚線維芽細胞のＩＬ−６（ｐｇ／１０^５細胞）を比較する）（４Ｂ）。ＧｚｍＫが生体外でケラチノサイトの創傷治癒を損ない、炎症誘発性サイトカインの発現を誘導することを図示する。細胞上清のＩＬ−６ＥＬＩＳＡ（ＨａＣａＴと皮膚線維芽細胞のＩＬ−６（ｐｇ／１０^５細胞）を比較する）（４Ｃ）。ＧｚｍＫが生体外でケラチノサイトの創傷治癒を損ない、炎症誘発性サイトカインの発現を誘導することを図示する。細胞上清のＩＬ−６ＥＬＩＳＡ（ＨａＣａＴと皮膚線維芽細胞のＩＬ−６（ｐｇ／１０^５細胞）を比較する）（４Ｄ）。ＧｚｍＫが生体外でケラチノサイトの創傷治癒を損ない、炎症誘発性サイトカインの発現を誘導することを図示する。細胞上清のＩＬ−６ＥＬＩＳＡ（ＨａＣａＴと皮膚線維芽細胞のＩＬ−６（ｐｇ／１０^５細胞）を比較する）（４Ｅ）。ＧｚｍＫが生体外でケラチノサイトの創傷治癒を損ない、炎症誘発性サイトカインの発現を誘導することを図示する。マクロファージ上清のＩＬ−１β ＥＬＩＳＡ（マクロファージとＭ１のＩＬ−１β（ｐｇ／ｍｇ）をそれぞれ比較する）（４Ｆ）。ＧｚｍＫが生体外でケラチノサイトの創傷治癒を損ない、炎症誘発性サイトカインの発現を誘導することを図示する。マクロファージ上清のＩＬ−１β ＥＬＩＳＡ（マクロファージとＭ１のＩＬ−１β（ｐｇ／ｍｇ）をそれぞれ比較する）（４Ｇ）。図４Ｃ、４Ｅ、４Ｆ、及び４Ｇの細胞は、５０ｎＭのｒｈＧｚｍＫと共にインキュベートされた。５μｇ／ｍＬのＰＡＲ−１阻害剤ＡＴＡＰ−２；４μＭのＧｚｍＫ阻害剤ＩαＩｐ；熱不活化ＧｚｍＫ＝ｈｉＧｚｍＫ（平均±ＳＤ（ｎ＝３）として提示される、２回実施）；ＩＬ−６データは１０^５個の細胞あたりのｐｇとして、ＩＬ−１βは１ｍｇの細胞タンパク質あたりのｐｇとして提示される。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、未処理との比較；二元配置ＡＮＯＶＡ（４Ａ）を除き、スチューデントのｔ検定による統計。マウスの熱傷創における炎症性細胞浸潤とサイトカイン発現の変化を図示する。マウス熱傷組織における炎症誘発性サイトカインのＥＬＩＳＡ検出（３日目及び６日目におけるＷＴ及びＧｚｍＫ−／−マウスのＩＬ−６及びＩＬ−１βが比較される）（データは、ｐｇ／ｍｇ細胞タンパク質として提示される（群あたりｎ≧３）（５Ａ）。マウスの熱傷創における炎症性細胞浸潤とサイトカイン発現の変化を図示する。傷害後３日目及び６日目のマウス熱傷組織におけるＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１の遺伝子発現（ＷＴサンプルに対する倍数の増加として提示される（群あたりｎ≧３））（５Ｂ）。マウスの熱傷創における炎症性細胞浸潤とサイトカイン発現の変化を図示する。傷害後３日目及び６日目のマウス熱傷組織における炎症性細胞浸潤、Ｆ４／８０（マクロファージ）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、及びＮＣＲ１（ＮＫ細胞）陽性細胞が比較される（１００μｍのサイズバー、Ｈ＆Ｅ）及び１５μｍ（ＩＨＣ）；データは、ＷＴの負傷していない皮膚対照に対する細胞の百分率として提示され、平均±ＳＤ（ｎ＝６）を示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、ＷＴとの比較；二元配置ＡＮＯＶＡによる統計（５Ｃ）。熱的傷害修復障害におけるＧｚｍＫの機序の概略図である。（１）皮膚の熱的傷害に続いて、単球及び常在真皮マクロファージが傷害部位に動員され、古典的に活性化される。ＧｚｍＫの発現はＭ１で上方制御され、一部は創傷領域に分泌される（２）。ＧｚｍＫは再上皮化を阻害し（３）、Ｍ１マクロファージ、ケラチノサイト、皮膚線維芽細胞、内皮細胞からの炎症誘発性サイトカイン放出を誘導する（４）。内皮細胞はまた、ＧｚｍＫ曝露に応答してケモカインと接着分子を分泌し（５）、創傷への単球動員の上方制御をもたらす（６）。合わせて、ＧｚｍＫは熱傷が誘発する炎症誘発性応答の増強を誘導し、創傷治癒の遅延に寄与する。ＷＴマウスと比較して、ＧｚｍＫ−／−マウスの創傷の開きが減少していることを示す巨視的分析である。ＧｚｍＫ−／−（破線）及びＷＴ（実線）マウス。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、群あたりｎ≧１０マウス。ＧｚｍＫが、ケラチノサイト、皮膚線維芽細胞、及びマクロファージに対して、それぞれ非細胞傷害性であることを示す。トリパンブルー色素排除が、細胞生存率の尺度として定量化された。データは、処置群あたりの生細胞の百分率として提示される（群あたりｎ≧３）。ＧｚｍＫが、ケラチノサイト、皮膚線維芽細胞、及びマクロファージに対して、それぞれ非細胞傷害性であることを示す。トリパンブルー色素排除が、細胞生存率の尺度として定量化された。データは、処置群あたりの生細胞の百分率として提示される（群あたりｎ≧３）。ＧｚｍＫが、ケラチノサイト、皮膚線維芽細胞、及びマクロファージに対して、それぞれ非細胞傷害性であることを示す。トリパンブルー色素排除が、細胞生存率の尺度として定量化された。データは、処置群あたりの生細胞の百分率として提示される（群あたりｎ≧３）。ヒト病変アトピー性皮膚炎組織におけるＧｚｍＫ免疫組織化学を比較し、健常皮膚対照（９Ａ）と比較して病変アトピー性皮膚炎組織（９Ｂ）でＧｚｍＫ＋細胞が上昇していることを示す。ヒト病変アトピー性皮膚炎組織におけるＧｚｍＫ免疫組織化学を比較し、健常皮膚対照（９Ａ）と比較して病変アトピー性皮膚炎組織（９Ｂ）でＧｚｍＫ＋細胞が上昇していることを示す。ヒトアトピー性皮膚炎組織のＧｚｍＫ免疫組織化学と（１０Ｂ）ＴＢＯ（マスト細胞）（１０Ａ）連続染色を比較し、マスト細胞の大部分がＧｚｍＫを発現しているが、その他の細胞型もまたＧｚｍＫを発現していることが示される。ヒトアトピー性皮膚炎組織のＧｚｍＫ免疫組織化学と（１０Ｂ）ＴＢＯ（マスト細胞）（１０Ａ）連続染色を比較し、マスト細胞の大部分がＧｚｍＫを発現しているが、その他の細胞型もまたＧｚｍＫを発現していることが示される。本明細書で説明され使用される、ＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスモデルのオキサゾロン曝露スケジュールを図示する。ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスを比較したＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の鱗屑評価を図示し、ＷＴマウスと比較して鱗屑が減少していることが示される。ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスを比較したＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の糜爛評価を図示し、糜爛はＧｚｍＫ−／−マウスで最初は悪化するが、ＷＴ対照と比較して１７日目から有意に減少していることが示される。ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスを比較したＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の紅斑評価を図示し、紅斑はＧｚｍＫ−／−マウスで最初に悪化するが、ＷＴ対照と比較して１７日目から減少していることが示される。ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスを比較したＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の脱毛症評価を図示し、ＷＴ対照と比較してＧｚｍＫ−／−マウスで脱毛症が減少していることが示される。ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスを比較したＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の複合重症度スコア評価を図示し、ＷＴ対照と比較して１５日目からＧｚｍＫ−／−マウスで全体的な重症度が低下していることが示される。７日目、１７日目、及び２７日目にＨ＆Ｅ染色された耳組織から測定された、ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスのＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の病変カバー率を比較し、ＷＴ対照と比較してＧｚｍＫ−／−マウスの病変重症度が減少していることが示される（データは、病変で覆われた耳の表面の全体的な百分率として提示される）。ヒト圧迫傷害組織のＧｚｍＫの免疫組織化学を比較し、対照皮膚（１８Ａ）と比較してヒト圧迫傷害組織（１８Ｂ）でＧｚｍＫ＋細胞が上昇していることが示される。ヒト圧迫傷害組織のＧｚｍＫの免疫組織化学を比較し、対照皮膚（１８Ａ）と比較してヒト圧迫傷害組織（１８Ｂ）でＧｚｍＫ＋細胞が上昇していることが示される。ヒト圧迫傷害組織のＧｚｍＫ免疫組織化学（１９Ｂ）とＴＢＯ（マスト細胞）（１９Ａ）連続染色を比較し、マスト細胞の大部分がＧｚｍＫを発現しているが、その他の細胞型もまたＧｚｍＫを発現していることが示される。ヒト圧迫傷害組織のＧｚｍＫ免疫組織化学（１９Ｂ）とＴＢＯ（マスト細胞）（１９Ａ）連続染色を比較し、マスト細胞の大部分がＧｚｍＫを発現しているが、その他の細胞型もまたＧｚｍＫを発現していることが示される。本明細書で説明され使用される圧迫傷害マウスモデルを図示する。負傷していない対照と比較した、傷害後３日目の創縁におけるＧｚｍＫ＋細胞数の増加を示す、マウス圧迫傷害組織のＧｚｍＫ免疫組織化学を比較する。負傷していない対照と比較した、傷害後３日目の創縁におけるＧｚｍＫ＋細胞数の増加を示す、マウス圧迫傷害組織のＧｚｍＫ免疫組織化学を比較する。傷害後３日目、７日目、及び１０日目のマウス圧迫傷害組織のＨ＆Ｅ染色組織切片の創縁によって測定された、ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスの創傷閉鎖の改善を図示する。ＷＴマウスと比較して、ＧｚｍＫ−／−マウスは、３日目及び１０日目で有意に増加した創縁（真皮の中間点の創縁から測定される）を示した。生体外シンデカン−１切断アッセイの結果を図示する。アッセイでは、組換えシンデカン−１（０．７μｇ）が、組換えＧｚｍＡ（５００ｎＭ）、ＧｚｍＫ（５００ｎＭ）、及びＧｚｍＢ（５００ｎＭ）と共にインキュベートされ、クーマシーゲル上で泳動された。グランザイムの非存在下のシンデカン−１が、対照として含まれていた。結果は、シンデカン−１が全ての３つのグランザイムによって切断されたことを示す。シンデカン−１の免疫細胞化学を図示する。ＨａＣａＴはコンフルエンスまで培養され、ＦＢＳ非含有培地上に２４時間置かれ、次にＧｚｍＫ（０、１０、１００ｎＭ）で１４時間にわたり処理された。細胞は固定され、ブロッキングされて、次にシンデカン−１抗体と共に一晩インキュベートされた。ウェルは洗浄され、次に抗ウサギ４８８と共に１時間インキュベートされた。ＤＡＰＩは核染色として含まれていた。蛍光顕微鏡で撮影された画像（２４Ａ）。強度は、画像Ｊ（２５Ｂ）を使用して定量化された。シンデカン−１の免疫細胞化学を図示する。ＨａＣａＴはコンフルエンスまで培養され、ＦＢＳ非含有培地上に２４時間置かれ、次にＧｚｍＫ（０、１０、１００ｎＭ）で１４時間にわたり処理された。細胞は固定され、ブロッキングされて、次にシンデカン−１抗体と共に一晩インキュベートされた。ウェルは洗浄され、次に抗ウサギ４８８と共に１時間インキュベートされた。ＤＡＰＩは核染色として含まれていた。蛍光顕微鏡で撮影された画像（２４Ａ）。強度は、画像Ｊ（２５Ｂ）を使用して定量化された。シンデカン−１の免疫組織化学を図示する。シンデカン−１は、ヒトの圧迫傷害組織（２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄ）及び負傷していない対照皮膚（２５Ａ）で分析された。結果は、圧迫傷害組織サンプル（２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄ）でシンデカン−１染色強度が低下していることを示す。シンデカン−１の免疫組織化学を図示する。シンデカン−１は、ヒトの圧迫傷害組織（２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄ）及び負傷していない対照皮膚（２５Ａ）で分析された。結果は、圧迫傷害組織サンプル（２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄ）でシンデカン−１染色強度が低下していることを示す。シンデカン−１の免疫組織化学を図示する。シンデカン−１は、ヒトの圧迫傷害組織（２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄ）及び負傷していない対照皮膚（２５Ａ）で分析された。結果は、圧迫傷害組織サンプル（２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄ）でシンデカン−１染色強度が低下していることを示す。シンデカン−１の免疫組織化学を図示する。シンデカン−１は、ヒトの圧迫傷害組織（２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄ）及び負傷していない対照皮膚（２５Ａ）で分析された。結果は、圧迫傷害組織サンプル（２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄ）でシンデカン−１染色強度が低下していることを示す。シンデカン−１が、マウス組織傷害で減少したことを示す。シンデカン−１は、免疫組織化学によってマウスの圧迫傷害組織（７日目）で分析された。ＧｚｍＫ−／−マウス（２６Ｂ）組織サンプルと比較して、ＷＴマウス（２６Ａ）ではシンデカン−１染色強度が低下する。シンデカン−１の減少の定量化は、図２６Ｃで比較される。シンデカン−１が、マウス組織傷害で減少したことを示す。シンデカン−１は、免疫組織化学によってマウスの圧迫傷害組織（７日目）で分析された。ＧｚｍＫ−／−マウス（２６Ｂ）組織サンプルと比較して、ＷＴマウス（２６Ａ）ではシンデカン−１染色強度が低下する。シンデカン−１の減少の定量化は、図２６Ｃで比較される。シンデカン−１が、マウス組織傷害で減少したことを示す。シンデカン−１は、免疫組織化学によってマウスの圧迫傷害組織（７日目）で分析された。ＧｚｍＫ−／−マウス（２６Ｂ）組織サンプルと比較して、ＷＴマウス（２６Ａ）ではシンデカン−１染色強度が低下する。シンデカン−１の減少の定量化は、図２６Ｃで比較される。１７日目（２７Ｂ）及び２７日目（２７Ｃ）のＯＸＡ誘発性皮膚炎耳のプルシアンブルー染色を無傷の耳対照（２７Ｃ）と比較し、ＧｚｍＫ−／−耳と比較してＷＴ耳で染色が上昇していることを示し、ＧｚｍＫが血管の損傷と止血に役割を果たしていることが示唆される。染色の定量化は、図２７Ｄに示される。１７日目（２７Ｂ）及び２７日目（２７Ｃ）のＯＸＡ誘発性皮膚炎耳のプルシアンブルー染色を無傷の耳対照（２７Ｃ）と比較し、ＧｚｍＫ−／−耳と比較してＷＴ耳で染色が上昇していることを示し、ＧｚｍＫが血管の損傷と止血に役割を果たしていることが示唆される。染色の定量化は、図２７Ｄに示される。１７日目（２７Ｂ）及び２７日目（２７Ｃ）のＯＸＡ誘発性皮膚炎耳のプルシアンブルー染色を無傷の耳対照（２７Ｃ）と比較し、ＧｚｍＫ−／−耳と比較してＷＴ耳で染色が上昇していることを示し、ＧｚｍＫが血管の損傷と止血に役割を果たしていることが示唆される。染色の定量化は、図２７Ｄに示される。１７日目（２７Ｂ）及び２７日目（２７Ｃ）のＯＸＡ誘発性皮膚炎耳のプルシアンブルー染色を無傷の耳対照（２７Ｃ）と比較し、ＧｚｍＫ−／−耳と比較してＷＴ耳で染色が上昇していることを示し、ＧｚｍＫが血管の損傷と止血に役割を果たしていることが示唆される。染色の定量化は、図２７Ｄに示される。健常（２８Ａ）及び乾癬罹患（２８Ｂ）ヒト皮膚（ｎ＝３）のＧｚｍＫ免疫組織化学を比較し、健常皮膚と比較して乾癬罹患組織のＧｚｍＫ陽性細胞が増加していることが示される。ＧｚｍＫ陽性細胞は、主にリンパ球及び樹状突起を有する細胞中で、皮膚免疫細胞浸潤に局在化するように見える。挿入図は高倍率を示す。図２８Ａでは、データは平均±平均標準誤差として提示される。（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＷＴ対照との比較。健常（２８Ａ）及び乾癬罹患（２８Ｂ）ヒト皮膚（ｎ＝３）のＧｚｍＫ免疫組織化学を比較し、健常皮膚と比較して乾癬罹患組織のＧｚｍＫ陽性細胞が増加していることが示される。ＧｚｍＫ陽性細胞は、主にリンパ球及び樹状突起を有する細胞中で、皮膚免疫細胞浸潤に局在化するように見える。挿入図は高倍率を示す。図２８Ｂでは、データは平均±平均標準誤差として提示される。（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＷＴ対照との比較。ＫＯ（ＧｚｍＫ−／−）マウス及びＷＴマウスの０日目と７日目（群あたりｎ＝６）の薬物誘発性乾癬の代表的な写真による比較を示す。黒枠は、ＩＭＱが適用され、引き続いて重症度がスコア付けされた領域に相当する。図２９Ａでは、データは平均±平均標準誤差として提示される。（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＷＴ対照との比較。ＫＯマウスと比較して、ＷＴマウスにおいて増加した重症度（累積紅斑及び鱗屑スコアとして定義される）を示す、ＩＭＱ処置ＷＴ及びＫＯマウスにおける皮膚重症度の毎日の変化を比較する。図２９Ｂでは、データは平均±平均標準誤差として提示される。（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＷＴ対照との比較。７日目における未処置及びＩＭＱ処置ＷＴと、未処置及びＩＭＱ処置ＫＯマウスの代表的なヘマトキシリン及びエオシン染色された背側組織を示す（群あたりｎ＝６）。図３０Ａでは、データは平均±平均標準誤差として提示される。（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＷＴ対照との比較。７日目の未処置及びＩＭＱ処置ＷＴと、未処置及びＩＭＱ処置ＫＯマウスの背側組織の表皮の厚さを比較する、３度の相互作用を伴う多変数線形回帰である。ＫＯマウスと比較して、ＷＴマウスの表皮の厚さが増加した。図３０Ｂでは、データは平均±平均標準誤差として提示される。（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＷＴ対照との比較。７日目の未処置及びＩＭＱ処置ＷＴと、未処置及びＩＭＱ処置ＫＯマウスの背側組織の代表的なＫｉ６７免疫組織化学を示す。図３０Ｃでは、データは平均±平均標準誤差として提示される。（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＷＴ対照との比較。

発明の詳細な説明
グランザイムＫ（ＧｚｍＫ）は、創傷／皮膚組織傷害に続いて、及び炎症性皮膚疾患に応答して、組織内で上昇する。これは、続いて、創傷の修復及び再生に悪影響を与える。本明細書に記載されるように、グランザイムＫの活性を低下させることは、創傷の修復及び再生に好ましい効果をもたらす。グランザイムＫの阻害は、これらの病気を治療するための治療的アプローチを提供してもよい。

本明細書に記載のデータは、火傷（ヒト及びマウス）、圧迫傷害（ヒト及びマウス）などの創傷において、並びに乾癬（ヒト）及びアトピー性皮膚炎（ヒト）などの炎症性皮膚状態において、健常対照皮膚と比較してＧｚｍＫが実際に上昇していることを確認している。

創傷治癒（火傷及び圧迫傷害）のマウスモデルでは、ＧｚｍＫの存在は、ＧｚｍＫのないマウス（すなわち、ＧｚｍＫノックアウトマウス、ＧｚｍＫ−／−マウス）と比較して創傷の重症度を悪化させる一因となる。

炎症性皮膚疾患（乾癬及びアトピー性皮膚炎）のマウスモデルでは、ＧｚｍＫの存在は、ＧｚｍＫのないマウス（すなわち、ＧｚｍＫノックアウトマウス、ＧｚｍＫ−／−）と比較して疾患の重症度を悪化させる一因となる。

本明細書に記載されるように、ＧｚｍＫは、感染に対する隔壁となる創傷修復の重要なステップである再上皮化（すなわち、表皮の閉鎖）を損なう；ＧｚｍＫは、細胞遊走を調節するように機能して不在であれば創傷治癒を損なうシンデカン−１を、表皮の主要な細胞型であるケラチノサイトにおいて切断する；ＧｚｍＫは、炎症誘発性から治癒促進性の創傷修復表現型への移行の遅延をはじめとする、炎症誘発性応答を誘発する。

したがって、本発明は、グランザイムＫの活性を低下させることによって、炎症性皮膚状態を治療し、皮膚創傷を治療し、皮膚創傷治癒を促進するための方法を提供する。

一態様では、本発明は、炎症性皮膚状態又は創傷を有する対象におけるグランザイムＫの活性を低下させることを伴う、炎症性皮膚状態を治療し、創傷を治療し、創傷治癒を促進するための方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、対象におけるグランザイムＫの活性を低下させ、それによって炎症性皮膚状態を治療することを含む、対象における炎症性皮膚状態（例えば、乾癬又はアトピー性皮膚炎）を治療する方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、対象におけるグランザイムＫの活性を低下させ、それによって創傷を治療することを含む、対象における創傷（例えば、熱傷創、慢性創傷、急性創傷、圧迫傷害、虚血性傷害）を治療する方法を提供する。

さらなる実施形態では、本発明は、対象におけるグランザイムＫの活性を低下させることによって、ケラチノサイト、線維芽細胞、及び／又は内皮細胞における炎症誘発性サイトカイン応答を低減することを含む、対象における創傷治癒を促進する方法を提供する。

なおも別の実施形態では、本発明は、（例えば、創傷に近接するケラチノサイトにおいて）グランザイムＫの活性を低下させることを含む、対象における創傷の再上皮化を促進するための方法を提供する。

なおもさらなる実施形態では、本発明は、グランザイムＫの活性を低下させることによってシンデカン−１の切断を阻害することを含む、対象の創傷治癒を促進する方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、グランザイムＫの活性を低下させることによって、グランザイムＫ媒介性免疫細胞動員と、傷害部位に位置する血管における内皮炎症誘発性応答とを含む、対象における血管透過性（漏出）を防止する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、炎症性皮膚状態又は創傷を有する対象におけるグランザイムＫを阻害することを伴う、炎症性皮膚状態を治療し、創傷を治療し、創傷治癒を促進するための方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与し、それによって炎症性皮膚状態を治療することを含む、対象における炎症性皮膚状態（例えば、乾癬又はアトピー性皮膚炎）を治療する方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象者に投与し、それによって傷害を治療することを含む、対象における傷害（例えば、熱傷創、慢性創傷、急性創傷、圧迫傷害、又は虚血性傷害）を治療する方法を提供する。

さらなる実施形態では、本発明は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することによってシンデカン−１の切断を阻害することを含む、対象における創傷治癒を促進する方法を提供する。

なおも別の実施形態では、本発明は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することによって、ケラチノサイト、線維芽細胞、マクロファージ、及び／又は内皮細胞における炎症誘発性サイトカイン応答を低減することを含む、対象の創傷治癒を促進する方法を提供する。

なおもさらなる実施形態では、本発明は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することによって、ケラチノサイトにおけるシンデカン−１の切断を阻害することを含む、対象における創傷再上皮化を促進するための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することを含む、対象における創傷の再上皮化を促進するための方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、炎症誘発性表現型を治癒促進性創傷修復表現型に変換するための方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、創傷又は損傷を受けた組織領域におけるグランザイムＫの活性を低下させることによって、ケラチノサイトにおけるシンデカン−１切断を阻害することを含む、再上皮化を刺激する方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、創傷又は損傷を受けた組織におけるＧｚｍＫの活性を低下させることによって、ケラチノサイト、線維芽細胞、マクロファージ、及び／又は内皮細胞の炎症誘発性サイトカイン応答を低下させることを含む、炎症誘発性表現型を治癒促進性創傷修復表現型に変換する方法を提供する。

本発明の方法の有効性を以下に説明する。

創傷治癒
一態様では、本発明は、対象において創傷を治療するか、又は創傷治癒を促進する方法を提供する。本発明の方法は、熱傷創（熱的傷害）、慢性創傷、急性創傷、圧迫及び虚血性傷害（例えば、虚血再灌流傷害）をはじめとする創傷を治療し、又は治癒を促進するのに適する。

特定の実施形態では、方法は、対象におけるグランザイムＫの活性を低下させ、それによって対象における創傷を治療し、又は創傷治癒を促進することを含む。特定の実施形態では、方法は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与し、それによって対象の炎症性皮膚状態を治療することを含む。

適切なグランザイムＫ阻害剤としては、小分子（例えば、約８００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物）、核酸、ペプチド、又は抗体などのタンパク質が挙げられる。一実施形態では、グランザイムＫ阻害剤は、インターα阻害剤タンパク質（ＩαＩｐ）である。別の実施形態では、グランザイムＫ阻害剤は、ビクニンである。

熱的傷害
熱的傷害に応答した炎症及び組織修復におけるグランザイムＫ（ＧｚｍＫ）の役割を本明細書に記載する。ヒトの熱傷組織では、ＧｚｍＫは正常皮膚と比較して上昇し、発現は主にマクロファージ中に見られた。ＧｚｍＫは、培養された古典的に活性化されたヒトマクロファージによって発現され分泌された。皮膚創傷に応答したＧｚｍＫの役割を評価するために、野生型（ＷＴ）及びＧｚｍＫ−／−マウスをＩＩ度の熱的傷害に曝した。ＧｚｍＫ−／−マウスは、野生型マウスと比較して、改善された創傷閉鎖、マトリックス組織化、及び引張強度を示した。炎症誘発性ＩＬ−６、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、及びＭＣＰ−１の発現低下は、傷害後３日目に観察された。さらに、ＧｚｍＫは、プロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）の活性化に依存する、ケラチノサイト及び皮膚線維芽細胞におけるＩＬ−６発現を誘導した。再上皮化は、全ての治癒パラメータの最大の改善を示し、ケラチノサイトがＧｚｍＫ媒介性タンパク質分解の影響を受けることが示唆された。裏付けとして、ＧｚｍＫに曝露されたケラチノサイトは、生体外での創傷治癒の障害を示したが、皮膚線維芽細胞は示さなかった。要約すると、ＧｚｍＫは、上皮化を妨げながら炎症を増強することによって、創傷治癒に影響を及ぼす。

ＧｚｍＫはヒトの火傷において上昇し、古典的に活性化されたマクロファージによって分泌された
傷害後２日目から３０日目までに摘出されたヒト急性熱傷組織において、ＧｚｍＫの発現を評価した。表１を参照されたい。

健常未損傷皮膚では、ＧｚｍＫ＋細胞は真皮全体に最小限に分散していた（図１Ａ）。対照的に、部分的な厚さの熱傷を負った皮膚はＧｚｍＫ＋細胞数の増加を示し、大部分は炎症性細胞の浸潤に局在していたが、真皮−表皮接合部にもまた近接して局在していた。特に、ＧｚｍＫ＋細胞の量と局在は、傷害後の時間、創傷の部位、及び創傷の重症度の違いにもかかわらず、９つの熱傷サンプル全ての間で類似していた。

ＧｚｍＫは、熱傷組織内のＣＤ６８＋細胞（循環単球及び組織マクロファージのマーカー）と強く共局在した（図１Ｂ）。また、ＧｚｍＫの染色強度は低下しているものの、別のＧｚｍＫ＋細胞集団が熱傷創組織に観察された（図１Ｂ）。この細胞集団は同定されなかった。

創傷修復の異なる段階で、マクロファージの複数の極性化されたサブタイプが同定されており、それぞれが炎症誘発性（Ｍ１）及び治癒促進性（Ｍ２）をはじめとする、炎症における独自の役割を果たす（Murray, 20l7）。そこでＧｚｍＫの発現に関与するマクロファージのサブタイプを調査した。Ｍ１マクロファージはＧｚｍＫ免疫陽性を示し、Ｍ２ａマクロファージではごくわずかな染色が観察された（図１Ｃ）。古典的に活性化されたＭ１マクロファージのみがＧｚｍＫｍＲＮＡを発現し（図１Ｄ）、免疫蛍光を支持した。ＧｚｍＫ分泌もまた、Ｍ１マクロファージにおいて著しく上昇したが、Ｍ２ａマクロファージによってごくわずかなレベルが放出された（図１Ｅ）。

ＧｚｍＫ−／−マウスの創傷治癒の改善
ＧｚｍＫ−／−及び野生型（ＷＴ）マウスは、８週齢の雌マウスの背部で熱的傷害に曝した。以前に報告されたように、真皮に達するが筋層には達しない組織損傷によって示されるように、創傷は部分的な厚さ（等級ＩＩｂ）であった（図２Ｄ）（Shen et al., 2012）。

健常対照皮膚ではＧｚｍＫの免疫反応性はごくわずかであったが、ＷＴマウスの火傷では３日目と６日目の双方でＧｚｍＫ＋細胞が検出され；創縁の炎症性細胞の浸潤部に局在していた（図２Ｅ）。ＧｚｍＫ−／−マウスの火傷では、ＧｚｍＫの免疫反応性は不在であった。肉眼的には、ＷＴマウスと比較して、ＧｚｍＫ−／−では、傷害後５日目〜１０日目まで創傷面積（Ｐ＜０．００５；図２Ａ及び２Ｂ）と創傷の開き（Ｐ＜０．０５；図７）の双方に有意な減少があった。組織学的評価は巨視的データを支持するものであり、６日目に創傷の開きが有意に減少したことを示した（Ｐ＜０．００５、図２Ｃ及び２Ｄ）。

傷害後の再上皮化は、ＷＴマウスと比較して、ＧｚｍＫ−／−マウスでは、３日目及び６日目の双方で有意に改善した（Ｐ＜０．００５；図３Ａ）。ＧｚｍＫ−／−マウスの創傷からかさぶたが落ちるのは、ＷＴ対照よりもおよそ２日間（２５％）早く、再上皮化が促進されていることが裏付けられた（図３Ｂ）。

傷害後１４日目のＧｚｍＫ−／−熱傷創のマッソン３色染色では、ＷＴマウスと比較して、創傷を受けた皮膚領域内のコラーゲンの成熟度が改善されていた（Ｐ＜０．０５、図３Ｃ及び３Ｄ）。コラーゲン−Ｉ対コラーゲン−ＩＩＩの比率もまた、ＷＴと比較してＧｚｍＫ−／−創傷で有意に上昇した（Ｐ＜０．０５；図３Ｃ及び３Ｅ）。創傷の引張強度は、ＷＴ対照と比較して損傷後２１日目（Ｐ＝０．０４６）及び４１日目（Ｐ＝０．０２６）の双方で改善を示した（図３Ｆ）。

ＧｚｍＫは創傷を受けたケラチノサイトの治癒を損なう
古典的に活性化されたマクロファージはＧｚｍＫを分泌するので（図１Ｅ）、皮膚の主要な細胞型であるヒトＨａＣａＴ（ケラチノサイト）と初代ヒト皮膚線維芽細胞におけるＧｚｍＫの下流効果を生体外で調べた。細胞への組換えヒトＧｚｍＫ（ｒｈＧｚｍＫ）の添加（≦１００ｎＭ）は、内皮細胞で（Sharma et al., 2016）及び肺線維芽細胞中で（Cooper et al., 2011）以前に報告されたように、培養中４８時間まで検出可能な細胞傷害性を示さなかった（図８）。電気的細胞基質インピーダンスセンシング（ＥＣＩＳ）創傷治癒アッセイを用いて、ｒｈＧｚｍＫは、ＨａＣａＴの創傷閉鎖の用量依存的で再現性のある阻害を示し、これは未処理対照と比較しておよそ５０％遅かった（図４Ａ）。ＧｚｍＫの非存在下での改善されたＨａＣａＴ遊走は、ＷＴマウスの火傷と比較して、ＧｚｍＫ−／−で観察された改善された再上皮化を説明するのに役立ってもよい。ＨａＣａＴとは対照的に、皮膚線維芽細胞は、ｒｈＧｚｍＫに応答した創傷閉鎖に変化を示さなかった。

ＧｚｍＫは、ケラチノサイト、皮膚線維芽細胞、及び古典的に活性化されたマクロファージからの、ＰＡＲ−１媒介性炎症誘発性サイトカインの放出を誘導する
ｒｈＧｚｍＫは、内皮細胞と肺線維芽細胞の双方で炎症誘発性サイトカインの発現を誘導し、ＰＡＲ−１媒介性経路を介して機能する（Cooper et al., 2011；Sharma et al., 2016）。そこで、ＨａＣａＴ及び皮膚線維芽細胞におけるＧｚｍＫ曝露が、類似様式で炎症誘発性サイトカイン発現を誘導するかどうかを判定するための試験を実施し、熱傷創修復におけるＧｚｍＫの役割に関する機構の詳細を提供した。ｒｈＧｚｍＫは、ＨａＣａＴ（１０ｎＭ以上でＰ＜０．００５、図４Ｂ）と皮膚線維芽細胞（１０ｎＭ以上でＰ＜０．００５、図４Ｄ）の双方からのＩＬ−６分泌を用量依存的に有意に増加させ、どちらも同様の量を分泌していた。ｒｈＧｚｍＫ（５０ｎＭ）処理の前に、細胞をＰＡＲ−１中和抗体であるＡＴＡＰ−２（５μｇ／ｍＬ）と共に３０分間プレインキュベートすると、未処理対照と比較してＨａＣａＴからのＩＬ−６分泌の有意な減少（Ｐ＜０．００５、図４Ｃ）、及びＧｚｍＫ媒介皮膚線維芽細胞ＩＬ−６分泌の完全な改善（Ｐ＜０．００５、図４Ｅ）が観察された。

ＧｚｍＫは、ＬＰＳで活性化された初代マウスマクロファージを誘導し、炎症誘発性サイトカインであるＩＬ−１βをプロセスして分泌する（Joeckel et al., 2011）。本明細書に記載されるように、ＴＨＰ−１由来のＭ０、Ｍ１、及びＭ２ａマクロファージをパーフォリンの非存在下でｒｈＧｚｍＫに曝し、ＩＬ−１β分泌を判定した。最大１００ｎＭのｒｈＧｚｍＫで処理された細胞は、細胞傷害性の証拠を示さなかった（図８）。未処理のＭ１はＩＬ−１βを分泌したが、ｒｈＧｚｍＫ（５０ｎＭ）とのインキュベーションはＩＬ−１β放出を有意に増加させた（Ｐ＜０．００５、図４Ｆ）。Ｍ０又はＭ２ａは、ｒｈＧｚｍＫへの曝露の有無にかかわらずＩＬ−１βを放出しなかった。ｒｈＧｚｍＫ（５０ｎＭ）を添加する前の、Ｍ１マクロファージのＰＡＲ−１拮抗薬ＡＴＡＰ−２（５μｇ／ｍＬ）とのプレインキュベーションは、ＧｚｍＫ媒介性ＩＬ−１βの放出を改善し（図４Ｇ）、マクロファージからのＧｚｍＫ媒介性ＩＬ−１β分泌が、ＰＡＲ−１依存性であることが示唆された。ＡＴＡＰ−２単独での細胞のプレインキュベーションに応答した、ＩＬ−１β分泌への影響は観察されなかった。

ＧｚｍＫはマウス熱傷創における炎症誘発性サイトカイン発現を増強する
傷害後３日目のＧｚｍＫ−／−マウスの創傷は、ＷＴ対照と比較して、有意に減少したＩＬ−６タンパク質を示した（Ｐ＜０．０５；図５Ａ）。傷害後６日目には、このパターンが逆転し、ＩＬ−６タンパク質が増加する傾向があった（Ｐ＝０．０６２）。ＩＬ−６タンパク質濃度は、傷害後３日目には差を示さなかったが、６日目にはＧｚｍＫ−／−マウスの火傷で有意に減少した（Ｐ＝０．０１４）。

ＧｚｍＫ−／−マウス熱傷創におけるケモカイン及び接着分子発現の増強
ｒｈＧｚｍＫと共に培養された内皮細胞は、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１の発現を増加させたので（Sharma et al., 2016）、それぞれの遺伝子発現をマウス熱傷創において定量化した。傷害後３日目のＧｚｍＫ−／−マウスにおけるＭＣＰ−１（Ｐ＝０．０３５）、ＩＣＡＭ−１（Ｐ＝０．００４９）、及びＶＣＡＭ−１（Ｐ＝０．００１７）の発現は、ＷＴマウスと比較して有意に減少した（図５Ｂ）。６日目には、３日目に観察されたパターンとは逆に、ＭＣＰ−１（Ｐ＝０．０２５）、ＩＣＡＭ−１（有意ではない、Ｐ＝０．２）、及びＶＣＡＭ−１（Ｐ＝０．０２３）の発現がＧｚｍＫ−／−マウスで増加した。

ＧｚｍＫはマウス熱傷創によるマクロファージの動員を増加させる
傷害後３日目及び６日目の双方で、ＧｚｍＫ−／−マウスとＷＴマウスの間に炎症性細胞浸潤の量の差は検出されなかった（図５Ｃ）。しかし、マクロファージ／単球及びＮＫ細胞数は、ＷＴ火傷と比較して、傷害後３日目にＧｚｍＫ−／−マウスで有意に減少した（Ｐ＜０．０５）一方で、Ｔ細胞に変化は見られなかった。対照的に、６日目には、ＷＴマウスと比較して、ＧｚｍＫ−／−マウスはＴ細胞（Ｐ＜０．０５）、ＮＫ細胞（Ｐ＜０．０５）、及びマクロファージ／単球の増加（有意ではない、Ｐ＝０．１２）を示した。Ｍ１は、ヒトの火傷においてＧｚｍＫを発現する優勢なマクロファージサブタイプであるので、マウスの火傷のｉＮＯＳ陽性細胞を定量化した。傷害後３日目（Ｐ＜０．００５）及び６日目（有意ではない）では、ＷＴ火傷と比較して、ＧｚｍＫ−／−でＭ１マクロファージの数が減少した（図２Ｅ及び２Ｆ）。

非致死性火傷は病的状態の主原因であり、長期の入院、容貌の変形、及び身体障害につながる。米国だけでも、毎年４０万件を超える熱傷が発生しており、そのうち約２万件は入院を要する（Peck, 2011）。限られた治療選択肢が、利用可能である。そのため、新たな標的化ストラテジーが必要である。傷害直後の炎症の規模を低減することは、このような標的の１つとして特定されている。（Farina et al., 2013）。

本発明は、ＧｚｍＫが熱傷創に豊富に存在し、炎症、上皮化、及び組織修復において病的役割を果たすことを初めて実証する。これまで、ＧｚｍＫの発現は、ＣＴＬ、ＮＫ、及びＣＤ４＋Ｔ細胞で報告されていた（Joeckel et al., 2017；Joeckel et al., 2011；Joeckel et al., 2012；Wilson et al., 2017）。本明細書に記載されるように、熱傷創では、ＧｚｍＫは主に真皮内のＣＤ６８＋単球／マクロファージ細胞集団に局在する。示差的に分極した、炎症誘発性／修復促進性マクロファージが記載されており、抗炎症性及び炎症誘発性サイトカインの双方の発現が、組織修復中の早期時点で同時に誘導されることが報告されている（Murray, 2017）。本明細書に記載されるように、古典的に活性化されたＭ１マクロファージは、ＧｚｍＫを発現及び分泌した一方で、Ｍ２ａマクロファージは、ごくわずかなＧｚｍＫ発現を提示した。したがって、理論に束縛されることなく、ＧｚｍＫは火傷に続く炎症誘発性応答に寄与してもよい。

ＧｚｍＫ−／−マウスの熱的傷害は、ＷＴマウスの創傷と比較して、全体的な創傷治癒の改善、再上皮化の向上、皮膚の成熟の改善、及びより強い引張強度を提示した。再上皮化は、ＷＴマウスの火傷と比較して、ＧｚｍＫ−／−で特に顕著であった。ＧｚｍＫ−／−マウスの上皮舌は、傷害後早くも３日目に、ＷＴマウスの上皮舌の長さの２倍を超えていた。生体外では、ＧｚｍＫはケラチノサイトの創傷閉鎖を損ない、細胞遊走への直接的な影響が示唆される。迅速な再上皮化と創傷閉鎖は、一つには、慢性に移行する創傷の大きな要因である感染に対する障壁を再確立することによって、全体的な創傷治癒に大きな利益をもたらす。創傷修復中に細胞増殖／遊走が増加することの欠点は、線維症を誘発する可能性である。しかし、本明細書に記載の細胞遊走のＧｚｍＫ媒介性減少は、培養ケラチノサイトに限定された一方で、線維症に関与する主要な細胞型である線維芽細胞は、ＧｚｍＫ曝露に応答した変化を示さなかった。

タイムリーな創傷治癒に不可欠な炎症誘発性ＩＬ−６は、急性期応答、炎症、及びリンパ球分化の発生に関与する（McFarland-Mancini et al., 2010）。ＧｚｍＫ媒介性ＩＬ−６分泌は内皮細胞で発生し（Sharma et al., 2016）、本発明者らのデータは、それぞれから同様の量が放出される、培養されたＨａＣａＴ及び皮膚線維芽細胞からのＧｚｍＫ媒介性ＩＬ−６分泌が、どちらもＰＡＲ−１を通じて動作することを示した。実際、傷害後３日目のＧｚｍＫ−／−マウスの火傷では、同等のＷＴサンプルと比較してＩＬ−６の発現が低下していた。この傾向は６日目までに逆転したようであり、ＧｚｍＫの不在が、熱的傷害に応答した炎症誘発性プロファイルの遅延に寄与してもよいことが示唆される。

Joeckel et al., 2011は、インフラマソーム依存性であると予測されている、ＬＰＳ活性化マクロファージからのＧｚｍＫ媒介性ＩＬ−１β分泌を以前に報告した（Joeckel et al., 2011）。データは、古典的に活性化されたマクロファージからのＧｚｍＫ媒介性ＩＬ−１β分泌を確認し、ＰＡＲ−１依存性放出が示された。ＩＬ−１βは創傷治癒に重要な役割を有しているので、持続的な炎症誘発性創傷表現型を維持できる正のフィードバックループを提供し（Mirza et al., 2013）、熱的傷害後のＩＬ−１β発現に対するＧｚｍＫノックアウトの影響が調査された。ＩＬ−１βの発現は傷害後３日目には差はなかったが、６日目にはＧｚｍＫ−／−熱傷創で有意に減少した。したがって、ＧｚｍＫは、炎症誘発性ＩＬ−１βプロファイルを遅延させ、又はおそらく減少させる役割を果たしているようであり、これは、火傷後のマクロファージ動員を減少させてもよい。

ＧｚｍＫは内皮細胞において、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１の発現を誘導し（Sharma et al., 2016）、これらの要因が一緒になって、免疫細胞の接着と経内皮遊走を促進する（Ley et al., 2007）。ＧｚｍＫは培養内皮細胞へのＴＨＰ−１単球の接着を増加させ（Sharma et al., 2016）、ＧｚｍＫが免疫細胞動員に直接影響を与えてもよいことが、示唆される。本明細書に記載されるように、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１の遺伝子発現は、ＷＴマウス創傷と比較して、ＧｚｍＫ−／−で傷害後３日目に有意に減少しており、創傷環境内のマクロファージとＮＫ細胞の双方が減少していることに対応する。以前は、チクングニアウイルスに感染したＧｚｍＫ−／−マウスは足の腫れの有意な減少を示し、炎症性細胞浸潤又はマクロファージ数に全体的な変化はなかったが、ＮＫ細胞とＴ細胞はどちらも減少した（Wilson et al., 2017）。本明細書に記載の傷害後３日目のデータもまた、全体的な炎症性細胞又はＴ細胞動員の変化及びＮＫ細胞の減少を示さなかった。これらの研究間でマクロファージの動員が異なる理由は不明のままであるが、病理学の違いによって説明され得る。傷害後６日目には、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１の発現パターンは、３日目と逆転し、ＧｚｍＫ−／−マウスでは増加を示し、火傷後の炎症誘発性応答が減少するのではなく、むしろ遅延することが示唆され、炎症誘発性ＩＬ−６の発現データと一致する。

結論として、ＧｚｍＫは、炎症誘発性サイトカインの発現とそれに続く傷害部位への免疫細胞動員を促進しながら、再上皮化を損なうことによって、熱傷創治癒の治癒を遅延させる（図６）。本明細書に記載されているように、ＧｚｍＫは、火傷の文脈で炎症を軽減し、上皮化を促進することを標的化し得る。

圧迫傷害
本発明の方法はまた、圧迫傷害を治療するのにも有用である。虚血再灌流に関連する炎症は、圧迫傷害の大きな要因である。

ＧｚｍＫは、圧迫傷害組織で上昇する。図１８Ａ及び１８Ｂは、ヒト圧迫傷害組織のＧｚｍＫの免疫組織化学を比較し、対照皮膚（１８Ａ）と比較して、ヒト圧迫傷害組織（１８Ｂ）でＧｚｍＫ＋細胞が上昇していることが示される。図１９Ａ及び１９Ｂは、ヒト圧迫傷害組織のＧｚｍＫ免疫組織化学（１９Ｂ）とＴＢＯ（マスト細胞）（１９Ａ）連続染色を比較し、マスト細胞の大部分がＧｚｍＫを発現しているが、その他の細胞型もまたＧｚｍＫを発現していることが示される。

本明細書で説明され使用される圧迫傷害マウスモデルは、図２０に示される。

図２１Ａ及び２１Ｂは、負傷していない対照と比較した、傷害後３日目の創縁におけるＧｚｍＫ＋細胞数の増加を示す、マウス圧迫傷害組織のＧｚｍＫ免疫組織化学を図示する。図２２は、傷害後３日目、７日目、及び１０日目のマウス圧迫傷害組織のＨ＆Ｅ染色組織切片の創縁によって測定された、ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスの創傷閉鎖の改善を図示する。ＷＴマウスと比較して、ＧｚｍＫ−／−マウスは、３日目及び１０日目に有意に増加した創縁を示した。

シンデカン−１は創傷治癒を促進する
シンデカン−１は、細胞質ゾル、膜貫通、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質との結合を可能にする構造を有する、膜内在性ＨＳプロテオグリカンである。シンデカン−１は、細胞接着、細胞遊走、エンドサイトーシス、エキソソーム形成、及び線維症をはじめとするいくつかの重要なプロセスを調節するので、創傷治癒中の重要なイベントの媒介に重要な役割を果たす。シンデカン−１の不在は、創傷治癒の遅延と好中球動員の増加をもたらす。

図２３は、生体外シンデカン−１切断アッセイの結果を図示する。アッセイでは、組換えシンデカン−１（０．７μｇ）を組換えＧｚｍＡ（５００ｎＭ）、ＧｚｍＫ（５００ｎＭ）、及びＧｚｍＢ（５００ｎＭ）と共にインキュベートし、クーマシーゲル上で泳動した。グランザイムの非存在下のシンデカン−１を対照として含めた。結果は、シンデカン−１が全ての３つのグランザイムによって切断されたことを示す。

図２４Ａ及び２４Ｂは、シンデカン−１の免疫細胞化学を図示する。ＨａＣａＴはコンフルエンスまで培養し、ＦＢＳ非含有培地上に２４時間置いて、次にＧｚｍＫ（０、１０、１００ｎＭ）で１４時間にわたり処理した。細胞を固定し、ブロッキングして、次にシンデカン−１抗体と共に一晩インキュベートした。ウェルを洗浄し、次に抗ウサギ４８８と共に１時間インキュベートした。ＤＡＰＩを核染色として含めた。蛍光顕微鏡で撮影された画像（２４Ａ）。強度は、画像Ｊ（２５Ｂ）を使用して定量化した。

図面２５Ａ〜２５Ｄは、シンデカン−１の免疫組織化学を図示する。シンデカン−１は、ヒトの圧迫傷害組織（２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄ）及び負傷していない対照皮膚（２５Ａ）で分析した。結果は、圧迫傷害組織サンプル（２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄ）でシンデカン−１染色強度が低下していることを示す。

図２６Ａ〜２６Ｃは、シンデカン−１が、マウス組織傷害で減少したことを示す。シンデカン−１は、免疫組織化学によってマウスの圧迫傷害組織（７日目）で分析した。ＧｚｍＫ−／−マウス（２６Ｂ）組織サンプルと比較して、ＷＴマウス（２６Ａ）ではシンデカン−１染色強度が低下する。シンデカン−１の減少の定量化は、図２６Ｃで比較される。

本発明の方法は、関与する組織においてグランザイムＫが上昇している、熱的及び圧迫創傷をはじめとする創傷の治療に有効であることが実証されている。

炎症性皮膚状態
別の態様では、本発明は、対象の炎症性皮膚状態を治療する方法を提供する。本方法で治療可能な代表的な炎症性皮膚状態としては、アトピー性皮膚炎及び乾癬が挙げられる。

特定の実施形態では、本方法は、対象におけるグランザイムＫの活性を低下させ、それによって対象の皮膚状態を治療することを含む。その他の実施形態では、方法は、有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与し、それによって対象の炎症性皮膚状態を治療することを含む。適切なグランザイムＫ阻害剤としては、小分子（例えば、約８００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物）、核酸、ペプチド、又は抗体などのタンパク質が挙げられる。一実施形態では、グランザイムＫ阻害剤は、インターα阻害剤タンパク質（ＩαＩｐ）である。別の実施形態では、グランザイムＫ阻害剤は、ビクニンである。

アトピー性皮膚炎
以下は、アトピー性皮膚炎を治療するための本発明の方法の有効性を実証する。

健常皮膚対照（図９Ａ）と比較して、病変アトピー性皮膚炎組織（図９Ｂ）で上昇したＧｚｍＫ＋細胞を示すヒト病変アトピー性皮膚炎組織におけるＧｚｍＫ免疫組織化学。ヒトアトピー性皮膚炎組織のＧｚｍＫ免疫組織化学及び（図１０Ｂ）ＴＢＯ（マスト細胞）（図１０Ａ）連続染色は、マスト細胞の大部分がＧｚｍＫを発現しているが、その他の細胞型もＧｚｍＫを発現していることを示す。

図１１は、本明細書に記載の実験について記述されたＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスモデルのオキサゾロン曝露スケジュールを図示する。ハプテン誘発性皮膚炎のマウスモデルにおいて、マウスをオキサゾロン（腹部及び足）で感作させる。７日後に、オキサゾロンでマウスの耳に皮膚炎を誘発させた。オキサゾロンの曝露は２７日間繰り返した（週に３回）。このモデルは、亜慢性接触皮膚炎又はアトピー性皮膚炎と様々に言及される（本明細書ではＯＸＡ誘発性皮膚炎と称される）。モデルの結果を以下に記載する。

鱗屑は、ＷＴマウスと比較して、ＧｚｍＫ−／−マウスで減少することが観察された。図１２は、ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスを比較したＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の鱗屑評価を図示する。

糜爛は、ＧｚｍＫ−／−マウスで最初は悪化することが観察されたが、ＷＴ対照と比較して１７日目から有意に減少した。図１３は、ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスを比較したＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の糜爛評価を図示する。

紅斑は、ＧｚｍＫ−／−マウスで最初は悪化することが観察されたが、ＷＴ対照と比較して１７日目から減少した。図１４は、ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスを比較したＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の紅斑評価を図示する。

脱毛症は、ＷＴ対照と比較して、ＧｚｍＫ−／−マウスで減少することが観察された。図１５は、ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスを比較したＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の脱毛症評価を図示する。

ＷＴ対照と比較して、ＧｚｍＫ−／−マウスでは１５日目から重症度が低下することが観察された。図１６は、ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスを比較した、ＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の複合重症度スコア評価を図示する。

ＷＴ対照と比較して、ＧｚｍＫ−／−マウスでは病変の重症度の低下が観察された。図１７は、７日目、１７日目、及び２７日目にＨ＆Ｅ染色された耳組織から測定された、ＷＴマウスとＧｚｍＫ−／−マウスのＯＸＡ誘発性皮膚炎マウスの耳の病変カバー率を比較する。

乾癬
以下は、乾癬を治療するための本発明の方法の有効性を実証する。

理論に束縛されることなく、本明細書に記載されるように、ＧｚｍＫは、炎症及び／又は表皮増殖の増強を通じて乾癬の発症及び進行に寄与するようである。

以下に説明するように、ヒト乾癬におけるＧｚｍＫタンパク質レベルと組織局在を特徴付け、乾癬におけるＧｚｍＫの役割をマウスモデルを用いて評価し、ＧｚｍＫ媒介性炎症誘発性活性と表皮増殖に関連する生物学的経路と基質を調べた。

事前に切片化されたヒト乾癬生検は、Vancouver General Hospital, Vancouver, BCから入手した。）生検は、免疫組織化学によってＧｚｍＫ分布について評価した。

ＧｚｍＫは、ヒトの乾癬組織で上昇し、真皮内の免疫細胞から分泌されることが判明した。ＧｚｍＫ発現は、切除したヒト乾癬病変で評価した。健常皮膚では、ＧｚｍＫ陽性細胞は真皮全体を通じて最小限に分散していた（図２８Ａを参照されたい）。対照的に、乾癬病変皮膚は、ＧｚｍＫ陽性細胞の数の増加を示し、大部分は、真皮内に浸潤する炎症性細胞、特にリンパ球及び樹状突起を有する細胞に局在していた（図２８Ｂを参照されたい）。ＧｚｍＫ陽性細胞の量と局在は、重症度、病変特性、及び個人の年齢の違いにもかかわらず、３つ全ての乾癬サンプル間で類似していた。

マウスモデルを用いて、乾癬におけるＧｚｍＫの役割を評価した。

全ての動物の手順は、the Animal Care Committee of the University of British Columbiaによって承認された動物実験に関する指針に従って実施した。全てのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの雌であった。野生型（ＷＴ）マウスは、５週齢でJackson Laboratoriesから購入した。ＧｚｍＫノックアウト（ＫＯ又はＧｚｍＫ−／−））マウスは施設内で飼育し、ＷＴマウスと齢数を一致させた。

十分確立されたマウスモデルを用いて、８〜１１週齢のＧｚｍＫＫＯマウス及びＷＴマウスに、６２．５ｍｇのイミキモド（ＩＭＱ）クリーム（５％ｖ／ｖ）を毎日、左耳及び剃毛した背側皮膚に直接、７日間（完了）又は１４日間（完了したが、組織学的分析のためのホルマリン固定パラフィン包埋ブロックを待つ状態）にわたり連続して局所塗布し、乾癬プラークの形成を促進した。これらの時点は、以前の文献で使用されたエンドポイントと一致しており、本発明者らの先行する皮膚の傷害及び疾患のモデルで使用されたものと同一であった。

麻酔されたマウスの背中の乾癬プラークの高解像度デジタル写真は、メートル定規の存在下で規定の距離から撮影し、視覚的に分析した。薬剤塗布の各２４時間前に、定規の存在下で背側領域の写真を撮影し、乾癬病変重症度の変化を捕捉した。これに続いて、観察可能な紅斑、厚さ、及び鱗屑に基づく定量的な重症度評価である乾癬重症度指数（ＰＳＩ）を使用して、乾癬重症度を定量化した。炎症のマーカーとして、耳介厚もまた測定した（キャリパーを使用）。

安楽死に続いて、皮膚領域を採取した。背側領域を水平に半分に切断した。片方はホルマリン中で２４時間固定し、組織学的分析と免疫組織化学のためにパラフィンに包埋した。もう片方は液体窒素中で急速冷凍し、ＥＬＩＳＡ及び／又はウエスタンブロットによる炎症誘発性サイトカイン分析のために、−８０℃で保存した。さらに、安楽死時に心臓穿刺によって１ｍＬの血液サンプルを採取し、遠心分離して血漿ＧｚｍＫレベルの定量化のための血漿を取得した。

パラフィン包埋切片は、皮膚形態学（具体的には表皮の厚さ）を評価するために、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。

ＧｚｍＫ−／−（ＫＯ）マウスでは疾患重症度の低下が観察された。ＧｚｍＫＫＯ及びＷＴマウスは、左耳及び背側領域上の乾癬病変に曝された。肉眼的には、７日目に、ＷＴマウスと比較して、ＧｚｍＫＫＯマウスにおける紅斑、厚さ、及び鱗屑が劇的に減少した（図２９Ａ及び２９Ｂ、ＫＯマウス及びＷＴマウスの０日目及び７日目の薬物誘発性乾癬の写真による比較を参照されたい）。組織学的評価は巨視的データを支持し、７日目に、ＷＴマウスと比較して、ＧｚｍＫＫＯマウスにおける表皮の厚さの有意な減少を示した（図３０Ａ及び３０Ｂ、７日目の未処置及びＩＭＱ処置ＷＴと、未処置及びＩＭＱ処置ＫＯマウスのヘマトキシリン及びエオシン染色された背側組織を参照されたい）。さらに、表皮増殖マーカーＫｉ６７は、７日目にＩＭＱ処置ＫＯマウス対ＩＭＱ処置ＷＴマウスで減少した（図３０Ｃ、７日目の未処置及びＩＭＱ処置ＷＴと、未処置及びＩＭＱ処置ＫＯマウスの背側組織のＫｉ６７免疫組織化学を参照されたい）。

本発明の方法は、アトピー性皮膚炎及び乾癬をはじめとする炎症性皮膚状態の治療に有効であることが実証されており、グランザイムＫは、関与する組織において上昇する。

スクリーニング方法
さらなる態様では、本発明は、炎症性皮膚状態を治療し又は創傷治癒を促進する能力について、候補化合物をスクリーニングするための方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、候補化合物を生体外でグランザイムＫと接触させることを含み、候補化合物と接触していないグランザイムＫと比較したグランザイムＫ活性の阻害が、候補化合物が炎症性皮膚状態又は創傷の治療に有用であってもよいことを示す、炎症性皮膚状態を治療する能力又は創傷治癒を促進する能力について候補化合物をスクリーニングするための方法を提供する。代表的な候補化合物は、ＧｚｍＫを選択的に阻害し、同じ化合物濃度でＧｚｍＡを実質的に阻害しない。

材料と方法
ヒトサンプル
正常なヒト皮膚及び急性火傷は、the University of British Columbia Human Research Ethics Committee（Ｈ１２−００５４０）の承認を得て、Vancouver General Hospital Burns Clinicから入手した。組織学及び／又は免疫蛍光のために、サンプルを１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン中で固定した。

細胞培養
ＴＨＰ−１単球を培養し、以前記載されたようにＭ０、Ｍ１、及びＭ２ａマクロファージに極性化した。（Geninetal.,2015）。初代ヒト皮膚線維芽細胞は、健康そうであるボランティアが提供した皮膚生検からのものであった。線維芽細胞及びＨａＣａＴ細胞は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）からの１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で維持した。細胞は、各実験の前及び最中に、無血清（ＨａＣａＴ）又は低血清（２％熱不活化ＦＢＳ；線維芽細胞及びマクロファージ）培地条件で培養した。

定量ＰＣＲ
ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Invitrogen, Burlington, ON, Canada）を使用して、製造業者の指示に従って分離した。ＤＮａｓｅＩ処理により、混入しているゲノムＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡ合成には、ランダムヘキサマーとＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素が必要であった。酵素を不活性化するために、ｃＤＮＡ反応液を室温で５分間、４２℃で６０分間、６５℃で２０分間インキュベートした。ｑＰＣＲは、次に対するプライマーを使用して、二連でＶｉｉＡ上のＰｏｗｅｒＵｐＳＹＢＲマスターミックスを使用した：
ＩＣＡＭ１
順方向５’ ＣＴＣＧＡＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＡＣＴＧＧＡＡＧ３’
（配列番号１）
逆方向５’ ＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＴＣＴＣＡＧ３’
（配列番号２）
ＶＣＡＭ１
順方向５’ ＧＡＡＣＡＣＴＣＴＴＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＧＣ３’
（配列番号３）
逆方向５’ ＣＴＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＣＴＴＣＣ３’
（配列番号４）
ＭＣＰ１
順方向５’ ＡＡＣＧＣＣＣＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧ３’
（配列番号５）
逆方向５’ ＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧ３’
（配列番号６）
ＧＡＰＤＨ
順方向５’ ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ３’
（配列番号７）
逆方向５’ ＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧ３’
（配列番号８）

サイクリング条件は、次のとおりであった：５０℃で２分間を１回、９５℃で５分間を１回、９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間を４０回。ｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨに対して正規化し、ＷＴマウスと比較した。

逆転写酵素ＰＣＲ
マクロファージからの全ＲＮＡ及びｃＤＮＡ合成を上記のように達成した。ヒトグランザイムＫは、ＢｉｏＲａｄＴ１００を使用して増幅した；
順方向５’ ＣＣＴＡＡＴＡＧＴＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＡＴＧＡＣ３’
（配列番号９）
逆方向５’ ＧＣＣＴＡＡＡＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＧ３’）
（配列番号１０）

サーモサイクリングは次のとおりであった：９５℃で５分間を１回、９５℃で１５秒間、６１℃で４５秒間を４０回、６１℃で２分間。ＧＡＰＤＨの増幅を対照として使用した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分離し、６００ｎｍチャネル下でLiCOR Odyssey Fcシステムを使用して視覚化した。

免疫組織化学及び免疫蛍光
免疫組織化学及び免疫蛍光は、抗体：ＧｚｍＫ、ヒト、NovusBio（Oakville, CA）、１／３００希釈；ＧｚｍＫ、マウス、NBP2-49387；ＣＤ６８、ヒト、Abcam（Cambridge, MA）、ａｂ１２５２１２、１μｇ／ｍＬ；コラーゲンＩ、マウス、Abcam（Cambridge, MA）、ａｂ３４７１０、１／２００希釈；コラーゲンＩＩＩ、マウス、Abcam（Cambridge, MA）、ａｂ７７７８、１／２００希釈；Ｆ４／８０、マウス、Abcam（Cambridge, MA）、ａｂ１００７９０、１／１００希釈；ＣＤ３、マウス、Abcam（Cambridge, MA）、ａｂ５６９０、１／１００希釈；及びＮＣＲ１、マウス、Abcam（Cambridge, MA）、ａｂ２１４４６８、１／３００希釈を使用して、以前に記載されたように（Shen et al., 2012）実施した。

形態計測解析
再上皮化は、（前縁から創縁までの新しい上皮の距離）／（創傷床の距離）×１００として測定した。総マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞の存在は、創傷切片の肉芽組織中の２００×１６０μｍ^２の２つの代表的な長方形における染色強度によって判定した（各群、各時点で６匹のマウスに５つ以上の創傷）。データは、創傷組織における陽性染色細胞の数をＷＴの負傷していない皮膚における陽性染色細胞の百分率として提示される。負傷していないＷＴ及びＧｚｍＫ−／−皮膚の間で、細胞数に差はなかった。高密度の青色核染色を特徴とする炎症性浸潤物、ひいては総浸潤物は、青色（核）対赤色（細胞質）染色の比率によって測定した（Poo et al., 2014；Wilson et al., 2017）。

電気的細胞基質インピーダンスセンシング
コンフルエントな創傷線維芽細胞とケラチノサイトの電気的特性をＥＣＩＳ（Applied Biophysics, Troy, NY, USA）を使用して調べ、以前記載されたような創傷アッセイ機能を適用した（Turner et al., 2017b）。簡潔に述べると、細胞を８Ｗ１ＥＰＥＴＥＣＩＳカルチャーウェアアレイ（Applied Biophysics, Troy, NY, USA）内に播種し、コンフルエンスまで維持した。ウェルをＰＢＳ、ｐＨ７．２で２回洗浄し、次にＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ中で１時間インキュベートした後、ＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ中でｒｈＧｚｍＫ処理（１０ｎＭ低用量、２５ｎＭ高用量）した。１時間後、アレイセンサーを２５００μＡ、４８，０００Ｈｚで２０秒間傷つけた。創傷回復をインピーダンス（３６，０００Ｈｚ）によってリアルタイムで判定し、回復は信号が平坦域に達するまでにかかる時間として定義した。

ＥＬＩＳＡ
キットＥＬＩＳＡを使用して、線維芽細胞、ケラチノサイト、及びマクロファージ又は組織抽出物からの無血清上清中で、ヒトＩＬ−６（ＨｕｍａｎＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡＤＹ２０６；R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）、マウスＩＬ−６（Ｒａｂ０３０９；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA）、ヒトＩＬ−１Ｂ（ａｂ１００５６２；Abcam, Cambridge, MA, USA）、マウスＩＬ−１Ｂ（ａｂ１００７０５；Abcam, Cambridge, MA, USA）、及びＧｚｍＫ（LSBio, Seattle, WA, USA）を評価した。

動物実験
全ての手順は、the Animal Experimentation Committee, University of British Columbiaによって承認されたガイドライン（Ａ１７−００２４）に従って実施した。ＧｚｍＫ−／−マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンド）は、説明されているように作製した（Joeckel et al., 2017）。ＧｚｍＫ−／−マウスは、解剖学、健康、繁殖力、同腹仔数、造血発達をはじめとして、ＷＴマウスとの表現型の違いを示さなかった（Joeckel et al., 2017）。Ｃ５７Ｂｌ／６ＷＴマウスはJackson Laboratories（Bar Harbor, ME, USA）から入手し、実験手順を開始する前に２週間順応させた。処置群あたり６匹の雌マウス（７〜１０週齢）を含めた。

マウス熱的傷害技術
マウスを吸入イソフルランで麻酔して背部を剪毛し、１０％（ｗ／ｖ）ポビドンヨード溶液で洗浄した。熱的傷害は、直径６ｍｍの金属棒を沸騰水中で１０分間加熱し、背部に６秒間置くことによって実施した。創傷の隣に整列させた定規を使用してデジタル写真を毎日撮影し、創傷を直接測定できるようにした。創傷を３日目、６日目、及び１４日目に採取し、二分した。片方は、１０％（ｖ／ｖ）緩衝ホルマリン中で固定し、創傷の中点を切断して群間で比較するように処理した。もう片方は、タンパク質抽出のために液体窒素で急速凍結した。皮膚張力測定のために、２１日目と４１日目に追加的な創傷を採取した。

皮膚張力測定
熱傷創皮膚の引張り破断力は、以前に報告されたのと同様に、Mecmesin Motorised Force Tester（Mecmesin Corporation, Slinfold, UK）を使用して評価した（Kopeckietal.,2013）。簡潔に述べると、摘出した皮膚（１×４ｃｍ；中心内の創傷領域）を２００Ｎのスプリングアクションバイスクランプに取り付け、MultiTest 2.5-d Test System Standを使用して、３ｃｍ／分で引き離した。引張強度は、Advanced Force Gauge 100Nで評価し、Emperor Liteソフトウェアを使用してリアルタイムで記録した。引張強度は、皮膚の破損を引き起こすのに必要な最小の力として評価した。

トリパンブルー排除
採取時の培養細胞の生存率を評価するために、細胞懸濁液の２０μＬアリコートを等容積の０．１％（ｖ／ｖ）トリパンブルーと混合し、２０℃で５分間インキュベートした。得られた細胞懸濁液の２０μＬアリコートを血球計数装置に移し、１００倍の倍率で調べた。血球計数装置の５つの１ｍｍ^２グリッドの正方形内で、１００個を超える細胞をカウントした。生存不能な細胞はトリパンブルーが細胞に取り込まれるので、青色に染色された。培養生存率は、青色に染色されなかった全細胞の百分率として評価した。トリパンブルー排除率が９０％未満の対照線維芽細胞の培養からは、データを収集しなかった。

統計解析
統計的差異は、スチューデントのｔ検定又は二元配置ＡＮＯＶＡを使用して判定した。正規分布に従わないデータについては、マン・ホイットニーのＵ検定を実施した。０．０５未満のＰ値を有意であると見なした。

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例示的な実施形態を例示し説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、その中で様々な変更を加え得ることが理解されるであろう。

本発明の実施形態のうち、独占的権利又は特権が主張されるものは、特許請求の範囲のように定義される。

Claims

対象におけるグランザイムＫの活性を低下させ、それによって炎症性皮膚状態を治療することを含む、対象における前記炎症性皮膚状態を治療する方法。
前記炎症性皮膚状態が、乾癬又はアトピー性皮膚炎である、請求項１に記載の方法。
対象におけるグランザイムＫの活性を低下させ、それによって創傷を治療することを含む、対象の前記創傷を治療する方法。
前記創傷が、熱傷創、慢性創傷、急性創傷、圧迫傷害、又は虚血性傷害である、請求項３に記載の方法。
前記圧迫傷害が、虚血再灌流傷害である、請求項４に記載の方法。
グランザイムＫの活性を低下させることが、有効量のグランザイムＫ阻害剤を前記対象に投与することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記グランザイムＫ阻害剤が、小分子、核酸分子、ペプチド、又は抗体である、請求項６に記載の方法。
前記グランザイムＫ阻害剤が、インターα阻害剤タンパク質（ＩαＩｐ）である、請求項６に記載の方法。
前記グランザイムＫ阻害剤が、ビクニンである、請求項６に記載の方法。
有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与し、それによって炎症性皮膚状態を治療することを含む、前記対象の前記炎症性皮膚状態を治療する方法。
前記炎症性皮膚状態が、乾癬又はアトピー性皮膚炎である、請求項１０に記載の方法。
有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与し、それによって創傷を治療することを含む、前記対象の前記創傷を治療する方法。
前記創傷が、熱傷創、急性創傷、慢性創傷、圧迫傷害、又は虚血性傷害である、請求項１２に記載の方法。
前記圧迫傷害が、虚血再灌流傷害である、請求項１３に記載の方法。
前記グランザイムＫ阻害剤が、小分子、核酸分子、ペプチド、又は抗体である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
前記グランザイムＫ阻害剤が、インターα阻害剤タンパク質（ＩαＩｐ）である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
前記グランザイムＫ阻害剤が、ビクニンである、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
対象におけるグランザイムＫの活性を低下させることによって、ケラチノサイトにおけるシンデカン−１の切断を阻害することを含む、前記対象における創傷治癒を促進する方法。
対象におけるグランザイムＫの活性を低下させることによって、ケラチノサイト、線維芽細胞、マクロファージ、及び／又は内皮細胞における炎症誘発性サイトカイン応答を低減することを含む、前記対象における創傷治癒を促進する方法。
創傷に近接するケラチノサイトにおけるグランザイムＫの活性を低下させることを含む、前記創傷の再上皮化を促進するための方法。
有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することによって、シンデカン−１の切断を阻害することを含む、前記対象の創傷治癒を促進する方法。
有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することによって、ケラチノサイト、線維芽細胞、マクロファージ、及び／又は内皮細胞における炎症誘発性サイトカイン応答を低減することを含む、前記対象の創傷治癒を促進する方法。
有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することによって、ケラチノサイトにおけるシンデカン−１の切断を阻害することを含む、前記対象における創傷の再上皮化を促進するための方法。
有効量のグランザイムＫ阻害剤を対象に投与することを含む、前記対象における創傷の再上皮化を促進するための方法。
前記創傷が、熱傷創、慢性創傷、急性創傷、圧迫傷害、又は虚血性傷害である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
前記阻害剤が、局所的又は全身的に投与される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
前記グランザイムＫ阻害剤が、小分子、核酸分子、ペプチド、又は抗体である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
前記グランザイムＫ阻害剤が、インターα阻害剤タンパク質（ＩαＩｐ）である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
前記グランザイムＫ阻害剤が、ビクニンである、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
創傷又は損傷を受けた組織領域におけるＧｚｍＫの活性を低下させることによって、ケラチノサイトにおけるシンデカン−１の切断を阻害することを含む、再上皮化を刺激する方法。
創傷又は損傷を受けた組織領域におけるＧｚｍＫの活性を低下させることによって、ケラチノサイト、線維芽細胞、マクロファージ、及び／又は内皮細胞における炎症誘発性サイトカイン応答を低減することを含む、炎症誘発性表現型を治癒促進性創傷修復表現型に変換する方法。
候補化合物を生体外でグランザイムＫと接触させることを含み、前記候補化合物と接触していないグランザイムＫと比較したグランザイムＫの活性の阻害が、前記候補化合物が炎症性皮膚状態又は創傷の治療に有用であってもよい化合物であることを示す、前記炎症性皮膚状態を治療する能力又は創傷治癒を促進する能力について、前記候補化合物をスクリーニングするための方法。
前記候補化合物がＧｚｍＫを選択的に阻害し、同じ化合物濃度でＧｚｍＡを実質的に阻害しない、請求項３２に記載の方法。