JP2022184025A - 皮膚モデルおよびその製造方法、ならびに皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の目的は、安定的に長期間培養可能な新たな皮膚モデルおよびそれを製造する方法を提供することである。【解決手段】本発明は、細胞培養基材の上に播種された線維芽細胞を含む第１細胞群と；一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜であって、前記第１細胞群の上方に配置された多孔膜と；を含む、皮膚モデルであって、前記線維芽細胞は、光照射により損傷が与えられた線維芽細胞であり、前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群が混合されることなく、同一の培地で共培養される、皮膚モデルを提供する。また、本発明は、皮膚モデルを製造する方法、および、皮膚モデルを用いた、皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法を提供する。【選択図】図１
Description
本発明は、皮膚モデルおよびそれを製造する方法に関する。また、本発明は、皮膚モデルを用いた皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法に関する。
皮膚は生体内と生体外の環境を分ける体表を覆う器官である。皮膚は、物理的なバリアとして働き、乾燥や有害物質が生体内へ侵入することから守り、生命の維持に不可欠な役割を果たしている。
高等脊椎動物の皮膚は、最外層から大別すると表皮、真皮、皮下組織の層から形成されている。表皮は、主にケラチノサイト（角化細胞）と呼ばれる細胞から構成されており、表皮の最深部（基底層）でケラチノサイトが分裂しながら、上層に向かって有棘層、顆粒層、そして角層へと分化しながら表面へと移動し、やがて垢となって脱落する。
表皮の基底層にはメラノサイト（色素細胞）が存在し、メラノサイト内のメラノソームにおいてメラニンが生成される。生成されたメラニンは、周囲のケラチノサイトに取り込まれる。取り込まれたメラニンはケラチノサイトのターンオーバーとともに角層まで移行し約４０日かけて生体外へと排出される。
皮膚のしみ・そばかすなどの色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線曝露、局所の炎症等により、メラノサイトでメラニンが過剰に形成されることや、メラニン顆粒が表皮基底層のケラチノサイト内に沈着することなどが原因であると考えられている。色素沈着、例えば、加齢による老人性色素斑などを治療または予防する方法や、治療剤（美白剤）が開発されているが、期待された効果が得られなかったり、一時的な効果が得られるが、効果が持続せず再発するなどの課題があり、新たな治療法または予防法や、治療剤を開発するニーズが存在し続けている。
そのような状況の下、新たな治療法を開発するために、従来の動物モデルに代わって、近年では皮膚の構造およびその機能を模倣した皮膚モデルが開発されており、利用されている（例えば、特許文献１及び２）。
本発明の目的は、安定的かつ品質にばらつきが少なく、短期～中長期（例えば、3日～２１日程度）の実験系においても評価可能な新たな皮膚モデルおよびそれを製造する方法を提供することである。また、本発明の目的は、新たな皮膚モデルを用いた皮膚の色素沈着を治療または予防するための候補因子を評価する方法を提供することである。
本発明者らが鋭意検討を行った結果、細胞培養基材の上に播種された線維芽細胞を含む第１細胞群と；
一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜であって、前記第１細胞群の上方に配置された多孔膜と；を含む、皮膚モデルが、安定的かつ品質にばらつきが少なく、短期～中長期（例えば、３日～２１日程度）の実験系においても評価可能な皮膚モデルとなり得ることを見出した。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜であって、前記第１細胞群の上方に配置された多孔膜と；を含む、皮膚モデルが、安定的かつ品質にばらつきが少なく、短期～中長期（例えば、３日～２１日程度）の実験系においても評価可能な皮膚モデルとなり得ることを見出した。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］ 細胞培養基材の上に播種された線維芽細胞を含む第１細胞群と；
一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜であって、前記第１細胞群の上方に配置された多孔膜と；
を含む、皮膚モデルであって、
前記線維芽細胞は、光照射により損傷が与えられた線維芽細胞であり、
前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群が混合されることなく、同一の培地で共培養される、皮膚モデル。
［２］ 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、項目１に記載の皮膚モデル。
［３］ 前記光増感剤が、ソラレン、ＮＡＤ、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チオール基で保護された金ナノクラスター（ＡＵｘＳＲｙ）からなる群から選択される、項目２に記載の皮膚モデル。
［４］ 前記光照射が、ＵＶＡの光照射である、項目１～３のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
［５］ 前記多孔膜が、生体適合性成分からなる多孔膜である、項目１～４のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
［６］ 前記多孔膜が、コラーゲン膜である、項目１～５のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
［７］ 前記第１細胞群は、さらに、評価対象の線維芽細胞を含む、項目１～６のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜であって、前記第１細胞群の上方に配置された多孔膜と；
を含む、皮膚モデルであって、
前記線維芽細胞は、光照射により損傷が与えられた線維芽細胞であり、
前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群が混合されることなく、同一の培地で共培養される、皮膚モデル。
［２］ 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、項目１に記載の皮膚モデル。
［３］ 前記光増感剤が、ソラレン、ＮＡＤ、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チオール基で保護された金ナノクラスター（ＡＵｘＳＲｙ）からなる群から選択される、項目２に記載の皮膚モデル。
［４］ 前記光照射が、ＵＶＡの光照射である、項目１～３のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
［５］ 前記多孔膜が、生体適合性成分からなる多孔膜である、項目１～４のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
［６］ 前記多孔膜が、コラーゲン膜である、項目１～５のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
［７］ 前記第１細胞群は、さらに、評価対象の線維芽細胞を含む、項目１～６のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
［８］ 皮膚モデルの製造方法であって、
光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第１細胞群が播種された細胞培養基材の上方に、一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜を配置し、前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群が混合されることなく、同一の培地で共培養する、工程
を含む、方法。
［９］ 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、項目８に記載の方法。
［１０］ 前記光増感剤が、ソラレン、ＮＡＤ、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チオール基で保護された金ナノクラスター（ＡＵｘＳＲｙ）からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
［１１］ 前記光照射が、ＵＶＡの光照射である、項目８～１０のいずれか１項に記載の方法。
［１２］ 前記多孔膜が、生体適合性成分からなる多孔膜である、項目８～１１のいずれか１項に記載の方法。
［１３］ 前記多孔膜が、コラーゲン膜である、項目８～１２のいずれか１項に記載の方法。
［１４］ 前記第１細胞群は、さらに、評価対象の線維芽細胞を含む、項目８～１３のいずれか１項に記載の方法。
光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第１細胞群が播種された細胞培養基材の上方に、一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜を配置し、前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群が混合されることなく、同一の培地で共培養する、工程
を含む、方法。
［９］ 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、項目８に記載の方法。
［１０］ 前記光増感剤が、ソラレン、ＮＡＤ、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チオール基で保護された金ナノクラスター（ＡＵｘＳＲｙ）からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
［１１］ 前記光照射が、ＵＶＡの光照射である、項目８～１０のいずれか１項に記載の方法。
［１２］ 前記多孔膜が、生体適合性成分からなる多孔膜である、項目８～１１のいずれか１項に記載の方法。
［１３］ 前記多孔膜が、コラーゲン膜である、項目８～１２のいずれか１項に記載の方法。
［１４］ 前記第１細胞群は、さらに、評価対象の線維芽細胞を含む、項目８～１３のいずれか１項に記載の方法。
［１５］ 皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法であって、
（１）光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第１細胞群が播種された細胞培養基材の上方に、一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜を配置し、前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群を混合することなく、同一の培地で共培養する、皮膚モデルを作製する工程
（２）前記皮膚モデルに、候補因子を適用して培養する工程；
（３）前記工程（２）で得られる第１細胞群の色素沈着の指標を解析し、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程、
を含む、方法。
［１６］ 前記候補因子が、線維芽細胞であり、前記第１細胞群に適用される、項目１５に記載の方法。
［１７］ 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、項目１５又は１６に記載の方法。
［１８］ 前記光増感剤が、ソラレン、ＮＡＤ、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チオール基で保護された金ナノクラスター（ＡＵｘＳＲｙ）からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
［１９］ 前記多孔膜が、生体適合性成分からなる多孔膜である、項目１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
［２０］ 前記多孔膜が、コラーゲン膜である、項目１５～１９のいずれか１項に記載の方法。
［２１］ 前記光照射が、ＵＶＡの光照射である、項目１５～２０のいずれか１項に記載の方法。
（１）光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第１細胞群が播種された細胞培養基材の上方に、一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜を配置し、前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群を混合することなく、同一の培地で共培養する、皮膚モデルを作製する工程
（２）前記皮膚モデルに、候補因子を適用して培養する工程；
（３）前記工程（２）で得られる第１細胞群の色素沈着の指標を解析し、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程、
を含む、方法。
［１６］ 前記候補因子が、線維芽細胞であり、前記第１細胞群に適用される、項目１５に記載の方法。
［１７］ 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、項目１５又は１６に記載の方法。
［１８］ 前記光増感剤が、ソラレン、ＮＡＤ、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チオール基で保護された金ナノクラスター（ＡＵｘＳＲｙ）からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
［１９］ 前記多孔膜が、生体適合性成分からなる多孔膜である、項目１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
［２０］ 前記多孔膜が、コラーゲン膜である、項目１５～１９のいずれか１項に記載の方法。
［２１］ 前記光照射が、ＵＶＡの光照射である、項目１５～２０のいずれか１項に記載の方法。
本発明によって、安定的かつ品質にばらつきが少なく、短期～中長期（例えば、3日～２１日程度）の実験系においても、疑似シミ部位の形成を確認することが可能な皮膚モデルが提供される。また本発明により提供される皮膚モデルを用いることによって、皮膚の色素沈着を治療または予防するための候補因子の探索や、評価が可能となる。
以下、本発明を実施するための形態について図面等を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されない。
本明細書において、「第１」「第２」「第３」等の用語は、１つの要素をもう１つの要素と区別するために用いており、例えば、第１の要素を第２の要素と表現し、同様に第２の要素を第１の要素と表現してもよく、これによって本発明の範囲を逸脱するものではない。
特段の定義がない限り、本明細書で使用する用語（技術的用語および科学的用語）は、当業者が一般に理解している用語と同一の意味を有する。
＜皮膚モデルおよびその製造方法＞
図１は、一実施形態における、皮膚モデル１およびそれを製造する方法を説明する概略図である。一実施態様において、皮膚モデル１は、細胞培養基材の上に播種された線維芽細胞を含む第１細胞群と；
一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜であって、前記第１細胞群の上方に配置された多孔膜と；
を含む、皮膚モデルであって、
前記線維芽細胞は、光照射により損傷が与えられた線維芽細胞であり、
前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群が混合されることなく、同一の培地で共培養される、皮膚モデルである（例えば、図１（Ｅ）及び（Ｆ）参照）。
図１は、一実施形態における、皮膚モデル１およびそれを製造する方法を説明する概略図である。一実施態様において、皮膚モデル１は、細胞培養基材の上に播種された線維芽細胞を含む第１細胞群と；
一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜であって、前記第１細胞群の上方に配置された多孔膜と；
を含む、皮膚モデルであって、
前記線維芽細胞は、光照射により損傷が与えられた線維芽細胞であり、
前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群が混合されることなく、同一の培地で共培養される、皮膚モデルである（例えば、図１（Ｅ）及び（Ｆ）参照）。
また、一実施態様における皮膚モデル１は、
光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第１細胞群が播種された細胞培養基材の上方に、一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜を配置し、前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群が混合されることなく、同一の培地で共培養する、工程
を含む方法によって提供することができる。
光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第１細胞群が播種された細胞培養基材の上方に、一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜を配置し、前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群が混合されることなく、同一の培地で共培養する、工程
を含む方法によって提供することができる。
ケラチノサイト（角化細胞）とは、表皮を構成する細胞の一つであり、生体の表皮組織においては、最深部（基底層）で分裂しながら上層に向かって有棘層、顆粒層、そして角層へと分化しながら表面へ移動し、やがて垢となって脱落する細胞である。
メラノサイト（色素細胞）とは、表皮組織を構成する細胞の一つであり、生体においては表皮の基底層に存在し、メラニンを形成する細胞である。
線維芽細胞とは、結合組織を構成する細胞の一つであり、多くの臓器および組織に存在している細胞である。線維芽細胞は、皮膚においては、主に真皮組織に含まれている。本発明の皮膚モデル１に用いられる線維芽細胞は、好ましくは真皮由来の線維芽細胞である。
本発明に用いられる線維芽細胞、ケラチノサイトおよびメラノサイトは、それぞれ、生体組織から採取された初代培養細胞であってもよく、予め単離および／または増殖され市販または頒布されている細胞であってもよく、株化された細胞であってもよく、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又はＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導された細胞であってもよい。
本発明において用いられる細胞は、いずれの動物由来であってもよいが、脊椎動物由来が好ましく、哺乳動物由来がより好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。
第１細胞群１０に含まれる線維芽細胞は、光照射によって損傷が与えられた線維芽細胞が用いられる。光照射によって損傷が与えられた線維芽細胞は、好ましくは光増感剤の存在下で光照射され、損傷が与えられたものである。用いられる光増感剤としては、例えば、ソラレン、ＮＡＤ、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チオール基で保護された金ナノクラスター（ＡＵｘＳＲｙなどが挙げられる。光増感剤を用いることにより、照射された光が増感され、効率よく線維芽細胞に損傷を与えることができる。
線維芽細胞に損傷を与える時に用いられる光は、細胞内の核酸、例えばＤＮＡやＲＮＡに損傷を与えるが、全ての細胞が死滅しない程度の波長であればよく、紫外光（約２００ｎｍ～約４００ｎｍ）であることが好ましく、より好ましくはＵＶＡ（約３２０ｎｍ～約４００ｎｍ）である。照射する光の強さは、細胞内の核酸、例えばＤＮＡやＲＮＡに損傷を与えるが、アポトーシス等が誘導されて全ての細胞が死滅しない程度であればよく、波長や照射する時間、細胞密度などによって適宜調整すればよい。例えば、ＵＶＡを照射する場合、０．０１Ｊ／ｃｍ２～１００Ｊ／ｃｍ２、好ましくは０．１Ｊ／ｃｍ２～２０Ｊ／ｃｍ２、より好ましくは０．５Ｊ／ｃｍ２～１０Ｊ／ｃｍ２を照射すればよい。
光照射した線維芽細胞を一定期間培養することによって、アポトーシス等が誘導されず、生存した線維芽細胞のみを増殖させることができる（図１の（Ａ）に相当）。光照射によって損傷を受けた線維芽細胞は、例えば、細胞の形態が伸長し、増殖能力が低下し、メラニン生成因子（例えば幹細胞増殖因子（ＳＣＦ））の産生量が増加するなど、細胞の老化レベルが増加した特徴を示す。細胞の老化レベルは、一般に知られる細胞老化マーカー、例えば、老化関連酸性β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－βｇａｌ）の発現量、ｐ２１／ｐ５３経路やｐ１６経路など細胞周期チェック機構の恒常的な活性化、ＩＬ－６などの細胞老化関連分泌現象（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（ＳＡＳＰ））因子の発現量などを測定することによって調べることができる。光照射量を調節することよって、所望の老化レベルの線維芽細胞を得ることができる。
皮膚モデル１を構成する第１細胞群１０に含まれる線維芽細胞は、光照射によって損傷を有するが、死滅することなく生存した線維芽細胞である。そのため、本発明の皮膚モデル１には、概ね均質な線維芽細胞が含まれることとなり、活性のばらつきが少ない安定した系を提供することができる。
一実施態様において、皮膚モデル１を構成するメラノサイトを含む第２細胞群２０は、可溶性成分透過性の多孔膜２２を有する第２細胞培養基材２１を用いて、多孔膜２２の一方の面に播種される（例えば、図１（Ｃ））。第２細胞群２０が多孔膜２２の一方の面に接着したら、多孔膜２２の他方の面に、ケラチノサイトを含む第３細胞群３０が播種される（例えば、図１（Ｄ））。第２細胞群２０と第３細胞群３０が播種される順番は限定されず、ケラチノサイトを含む第３細胞群３０が多孔膜２２の一方の面に先に播種されてもよく、メラノサイトを含む第２細胞群２０が多孔膜２２の一方の面に先に播種されてもよい。
皮膚モデル１において、多孔膜２２は可溶性成分透過性の多孔膜であり、例えば、セルカルチャーインサートであってもよいが、細胞接着性の足場に用いられる生体適合性成分によって作製されている、又はコーティングされているものが好ましい。例えば、生体適合性成分としては、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン／トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン／ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）およびその共重合体、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される材料からなる又はコーティングされているものであってもよい。また、多孔膜２２は、コラーゲン膜であることがより好ましい。多孔膜２２が、コラーゲン膜である第２細胞培養基材２１は、公知のものを使用することができ、例えば、関東化学株式会社（日本）のａｄ－ＭＥＤ ビトリゲルや、株式会社高研（日本）の透過性コラーゲン膜を使用することができる。
多孔膜２２の平均孔径は、例えば、約０．０１μｍ～約１００μｍの平均孔径（例えば、０．０１μｍ～１００μｍ、０．０１μｍ～５０μｍ、０．０１μｍ～１０μｍ、０．１μｍ～５０μｍ、または０．１μｍ～１０μｍ）であってもよい。また、多孔膜２２の細孔の密度も適宜選択することができるが、例えば、１×１０４／ｃｍ２以上、１×１０５／ｃｍ２以上、５×１０５／ｃｍ２以上、１０×１０５／ｃｍ２以上、５０×１０５／ｃｍ２以上、または１００×１０５／ｃｍ２以上の細孔の密度であってもよく、１×１０４／ｃｍ２～１００×１０８／ｃｍ２、１×１０５／ｃｍ２～１００×１０８／ｃｍ２であってもよい。
一実施態様において、本発明の皮膚モデル１に用いられる第１、第２又は第３細胞群は、上記以外の細胞が含まれていてもよく、例えば表皮組成に含まれるランゲルハンス細胞や、メルケル細胞が含まれていてもよい。皮膚モデル１において播種される細胞数は特に限定されないが、例えば、１×１０２～１０６個／ｃｍ２、１．０～１０×１０４個／ｃｍ２、又は約４～８×１０４個／ｃｍ２を含むものであってもよい。
本発明の皮膚モデル１は、メラノサイトを含む第２細胞群２０と、ケラチノサイトを含む第３細胞群３０とが、それぞれ多孔膜２２の両面に播種された第２細胞培養基材２１が、第１細胞群１０の上方に配置されている。第１細胞群１０、第２細胞群２０及び第３細胞群３０は、それぞれが混合されることなく、同一の培地で共培養されている。これにより、第１細胞群１０、第２細胞群２０及び第３細胞群３０のそれぞれから産生される可溶性成分が交換される。
一実施態様において、本発明に用いられる細胞としては、例えば、市販もされている、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（商標）ＬＳＥ－ｍｅｌａｎｏ（ＴＯＹＯＢＯ）、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）（ＭａｔＴｅｋ）などに含まれる細胞を用いても良い。
皮膚モデル１は、例えば培養液として通常のケラチノサイト培養に用いられる培養液、例えばＫＧ培地、ＥｐｉｌｉｆｅＫＧ２（クラボウ）、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ）、アッセイ培地（ＴＯＹＯＢＯ）などを用い、約３７℃で０～１４日間かけて行うことができる。培地としては、その他にＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）又はアスコルビン酸含有ＫＧＭとＤＭＥＭを１：１混合した培地などが使用できる。
一実施態様において、皮膚モデル１の培地には、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはその塩の存在下が含まれてもよい。アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはその塩が存在すると、線維芽細胞の増殖やコラーゲン産生が促進されることにより真皮の構造のように重層化が促進される。本明細書において、「アスコルビン酸誘導体」とは、例えば、アスコルビン酸２リン酸、アスコルビン酸１リン酸、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ－アスコルビン酸２－グルコシド等をいい、さらに、その塩（ナトリウム塩、マグネシウム塩等）も含まれる。
本発明によって提供される皮膚モデル１は、光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が直接または間接的に作用し、皮膚の色素沈着を形成する要因、例えば、ケラチノサイトの過増殖、過剰分化、又は色素顆粒の取り込みや、メラノサイトによるメラニンの産生など、様々な要因を評価することができる。また、皮膚モデル１において、「色素沈着の指標」を測定し、解析することによって、色素沈着に影響を及ぼす因子についても評価することができる。
本発明の皮膚モデル１を用いることによって、例えば、皮膚の色素沈着を治療または予防するための評価対象としての候補因子を評価することが可能となる。
＜皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法＞
本発明は、皮膚モデルを用いた、皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法を提供することができる。一実施態様において、本発明の方法は、
（１）光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第１細胞群が播種された細胞培養基材の上方に、一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜を配置し、前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群を混合することなく、同一の培地で共培養する、皮膚モデルを作製する工程
（２）前記皮膚モデルに、候補因子を適用して培養する工程；
（３）前記工程（２）で得られる第１細胞群の色素沈着の指標を解析し、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程、
を含む。
本発明は、皮膚モデルを用いた、皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法を提供することができる。一実施態様において、本発明の方法は、
（１）光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第１細胞群が播種された細胞培養基材の上方に、一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜を配置し、前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群を混合することなく、同一の培地で共培養する、皮膚モデルを作製する工程
（２）前記皮膚モデルに、候補因子を適用して培養する工程；
（３）前記工程（２）で得られる第１細胞群の色素沈着の指標を解析し、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程、
を含む。
一実施態様において、候補因子は、例えば、低分子化合物、ペプチド、核酸、タンパク質、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の細胞、組織抽出物又は細胞培養上清、植物由来の化合物又は抽出物（例えば、生薬エキス、生薬由来の化合物）、及び微生物由来の化合物若しくは抽出物又は培養産物などであってもよい。
一実施態様において、候補因子ＣＡは、図１（Ｆ）で示されるように、任意の細胞、例えば、間葉系幹細胞を含む線維芽細胞の前駆細胞、線維芽細胞（例えば、光照射による損傷を受けていない線維芽細胞、または光照射による損傷が低い線維芽細胞）等であってもよい。本明細書において、「光照射による損傷を受けていない線維芽細胞」または「光照射による損傷が低い線維芽細胞」とは、上記の光照射工程が実施されていない線維芽細胞であり、上記の「光照射による損傷が与えられた線維芽細胞」よりも、老化レベルが低い線維芽細胞をいう。
候補物質を皮膚モデル１に添加し、所望の期間培養後、皮膚モデル１における色素沈着の指標を解析することによって、候補物質による色素沈着の治療または予防効果を評価することができる。例えば、候補物質を非添加、または色素沈着の治療または予防効果を有しない任意の物質を添加した皮膚モデル１の色素産生および／または色素沈着の度合いと比較し、候補物質を添加した皮膚モデル１における色素沈着の指標が改善した場合、その候補物質は、色素沈着の治療または予防効果を有するものと評価することができる。
「色素沈着の指標」としては、例えば、含有色素量の違い、ターンオーバーレベル（例えば、分化マーカーの発現の変化）、色素顆粒の凝集若しくは拡散、細胞形質の不均一性、メラニン合成因子（例えば、メラノサイトにおけるチロシナーゼ（ＴＹＲ）；チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１）；ドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）；又は小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ））、あるいはケラチノサイトにおけるエンドセリン１（ＥＴ１）；又は幹細胞因子（ＳＣＦ１））の発現、分化又は増殖能の増進（例えば、Ｋｉ６７など）、色素顆粒の分布差発現、あるいはケラチノサイトの食作用増進などを指標とすることができるが、これに限定されない。
本明細書において「色素産生」とは、皮膚モデル１がメラノサイトを含む場合、メラノサイトが産生する色素、例えば、メラニン色素の産生をいう。色素産生量は、例えば皮膚モデル、特に第２細胞群２０からメラニン色素を抽出して、４０５ｎｍの吸光度を測定することによってメラニン量を求めることができる。また、色素産生量は、例えば皮膚モデル、特に第２細胞群２０に含まれるメラニンまたはそれをコードする核酸量（例えばｍＲＮＡ量）を、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメーター法、ウエスタンブロット法、免疫組織化学法、ｑＰＣＲ法等の方法を用いることによって測定することができるが、これに限定されない。
本明細書において、「色素沈着の度合い」とは、可視光下における皮膚モデル、特に第１細胞群の色の明度をいう。本発明の皮膚モデル１は、メラノサイトが産生するメラニン量に依存して明度が変化する。そのため、メラニン量が多くなると明度が低下し、皮膚モデル１の第２細胞群２０は濃い色を呈する。逆にメラニン量が低下すると明度が上昇し、皮膚モデル１の第２細胞群２０は淡い色を呈する。すなわち、皮膚モデル１の色の明度を比較することによって、添加される候補物質による色素沈着の治療または予防効果を評価することができる。明度は、皮膚モデル１の第２細胞群２０を画像として記録し、公知の画像測定手段を用いることによって定量することができる。
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
１．使用した材料及び実験方法
１－１．表皮細胞の培養
正常ヒト表皮メラノサイト（Ｋｕｒａｂｏ）は、ヒトメラノサイト増殖サプリメント（ＨＭＧＳ２，）を添加した培地Ｍｅｄｉｕｍ２５４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。正常ヒト表皮ケラチノサイト（Ｋｕｒａｂｏ）は、ケラチノサイト成長サプリメント（ＥＤＧＳ）を添加した６０μＭカルシウムを含むＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。
１－２．線維芽細胞の培養およびＰＵＶＡ 処理
正常ヒト線維芽細胞（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ）を増殖用培地（１０％牛胎児血清含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ （以下、１０％ＤＭＥＭ））で培養し、６穴プレートにそれぞれ１ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ播種した。細胞密度が１００％コンフルエントになる前に光増感剤・ソラレン（終濃度２５ｎｇ／ｍＬ）を加えた１０％ＤＭＥＭに置換し、培養した。２４時間後に１ｍＬ のＰＢＳで膨潤させた後取り除き、ソラレン（終濃度２５ｎｇ／ｍＬ）を加えた１ｍＬ ＰＢＳに置換した状態で６Ｊ／ｃｍ２ ＵＶＡ照射を行った（以下、ＰＵＶＡ処理）。その後、１ｍＬのＰＢＳで膨潤させた後、ＰＢＳを取り除き、１０％ＤＭＥＭに置換した後、３日間培養し、培養上清と細胞をそれぞれ回収した。ＰＵＶＡ未処理の同一ドナー由来線維芽細胞を上記ＰＵＶＡ 処理線維芽細胞に対するコントロールとした。
正常ヒト線維芽細胞（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ）を増殖用培地（１０％牛胎児血清含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ （以下、１０％ＤＭＥＭ））で培養し、６穴プレートにそれぞれ１ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ播種した。細胞密度が１００％コンフルエントになる前に光増感剤・ソラレン（終濃度２５ｎｇ／ｍＬ）を加えた１０％ＤＭＥＭに置換し、培養した。２４時間後に１ｍＬ のＰＢＳで膨潤させた後取り除き、ソラレン（終濃度２５ｎｇ／ｍＬ）を加えた１ｍＬ ＰＢＳに置換した状態で６Ｊ／ｃｍ２ ＵＶＡ照射を行った（以下、ＰＵＶＡ処理）。その後、１ｍＬのＰＢＳで膨潤させた後、ＰＢＳを取り除き、１０％ＤＭＥＭに置換した後、３日間培養し、培養上清と細胞をそれぞれ回収した。ＰＵＶＡ未処理の同一ドナー由来線維芽細胞を上記ＰＵＶＡ 処理線維芽細胞に対するコントロールとした。
１－３．角化細胞、色素細胞、線維芽細胞非接触三層培養モデルの作製
三層培養モデルの作成は、ａｄ－ＭＥＤ ビトリゲル（関東化学株式会社）もしくは透過性コラーゲン膜（株式会社高研）のような、両面培養の可能なコラーゲン膜を用いた。メラノサイトをコラーゲン膜の片面に１×１０４～１×１０５ ｃｅｌｌｓ播種し、２４時間培養することで膜状に接着させた後、もう片方の面にケラチノサイトを１×１０４ ｃｅｌｌｓ～１×１０５ ｃｅｌｌｓ播種した。前もってＰＵＶＡ処理を施した線維芽細胞を１ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種した２４ｗｅｌｌプレートに、ケラチノサイト及びメラノサイトの接着したコラーゲン膜を設置し、表皮細胞にシミ部位様の変化を誘導するため、３～５日間共培養した。疑似シミ部位表皮細胞が誘導された後、２４ｗｅｌｌプレートに、最初に播種したＰＵＶＡ処理線維芽細胞の数に対し１／１０、１／５、１／２、及び等量の治療用線維芽細胞（図１（Ｆ）の「ｎｏｎ－ＰＵＶＡ－ＦＢ」に相当）を加え、更に３～５日間培養し、疑似シミ部位表皮細胞における線維芽細胞の治療効果の検討を行った。培養には、線維芽細胞培養培地である１０％ＤＭＥＭ、メラノサイトの培養培地であるＭ２５４、ケラチノサイトの培養培地であるＥｐｉＬｉｆｅを１：１：１で混合したものを用いた。
１－４．細胞内外メラニン含量測定
メラノサイトをコラーゲンゲルの片側に１×１０５ ／ｗｅｌｌずつ播種し、上記のモデルを用いて培養した。培地を回収し、遠心分離（４℃、２００×ｇ、１０分間）によって細胞残渣を取り除いた後、得られた上清をＯＤ４０５ｎｍで測定したものを細胞外放出メラニン量とした。また、メラノサイトはトリプシン処理により回収し、遠心分離（４℃、２，３００×ｇ、５分間）をかけた。得られた細胞塊に１２０μｌの０．２Ｎ ＮａＯＨを加え、８０℃で３０分間湯煎して細胞内メラニンを抽出した。得られた上清はＯＤ４０５ｎｍで測定し、これを細胞内含有メラニン量とした。結果は３回の独立した実験により得た（図２）。
１－５．ＲＴ－ＰＣＲ
全てのＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２００ｎｇを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ）を用いて逆転写した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ）を用いて実施した。線維芽細胞処理後のメラノサイトにおけるチロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１）、ドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、ケラチノサイトにおけるエンドセリン１（ＥＴ１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びＧＡＰＤＨの遺伝子発現を、ＲＴ－ＰＣＲアッセイにより解析した。ＰＣＲの結果は３回の独立した実験により得た（図３及び図４）。なお、本実験では以下の配列のプライマーを用いて解析を行った。
全てのＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２００ｎｇを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ）を用いて逆転写した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ）を用いて実施した。線維芽細胞処理後のメラノサイトにおけるチロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１）、ドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、ケラチノサイトにおけるエンドセリン１（ＥＴ１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びＧＡＰＤＨの遺伝子発現を、ＲＴ－ＰＣＲアッセイにより解析した。ＰＣＲの結果は３回の独立した実験により得た（図３及び図４）。なお、本実験では以下の配列のプライマーを用いて解析を行った。
１－６．統計処理
統計処理はＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用い、一次元配置分散分析によって行った。ｐ ＜ ０．０５の時に統計学的優位差があると判断し、その程度はそれぞれ以下のアスタリスク表記により示した。（＊ｐ＜０．０５， ＊＊ｐ＜０．０１， ＊＊＊ｐ＜０．００１）すべての実験は３回以上繰り返し、再現性の確認を行った。
２．結果
皮膚モデルからメラノサイトとケラチノサイトをそれぞれ回収し、細胞内メラニン量及びメラニン合成に関与する遺伝子発現を測定したところ、ＰＵＶＡ Ｆｂのみ存在下のモデルと比較し、非照射Ｆｂを添加したモデルではメラニン量の増加が抑制されることが明らかになった。この黒化抑制は、メラノサイト内に発現するメラニン合成酵素Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅやチロシナーゼ関連遺伝子として知られるＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、及びそれらの転写因子であるＭＩＴＦの遺伝子発現減少によるものであることがＲＴ－ＰＣＲ解析より示された。更に、ケラチノサイトでも、メラニン合成を誘導するＳＣＦやＥＴ１の遺伝子発現が非照射Ｆｂ濃度依存的に減少した。以上のことから、非照射Ｆｂがメラノサイトとケラチノサイトの両方に働きかけ、ＰＵＶＡ Ｆｂによって誘導されたメラニン合成を抑制することが示された。
１、１ａ、１ｂ 皮膚モデル
１０ 第１細胞群
１１ 第１細胞培養基材
１２ 第１培地
２０ 第２細胞群
２１ 第２細胞培養基材
２２ 多孔膜
２３ 第２培地
２４ 第３細胞培養基材
３０ 第３細胞群
ＲＤ 光照射
ＦＢ 線維芽細胞
ｂＦＢ 光照射による損傷を受けた線維芽細胞
ＫＣ ケラチノサイト
ＭＣ メラノサイト
ＣＡ 候補物質
１０ 第１細胞群
１１ 第１細胞培養基材
１２ 第１培地
２０ 第２細胞群
２１ 第２細胞培養基材
２２ 多孔膜
２３ 第２培地
２４ 第３細胞培養基材
３０ 第３細胞群
ＲＤ 光照射
ＦＢ 線維芽細胞
ｂＦＢ 光照射による損傷を受けた線維芽細胞
ＫＣ ケラチノサイト
ＭＣ メラノサイト
ＣＡ 候補物質
Claims (21)
- 細胞培養基材の上に播種された線維芽細胞を含む第１細胞群と；
一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜であって、前記第１細胞群の上方に配置された多孔膜と；
を含む、皮膚モデルであって、
前記線維芽細胞は、光照射により損傷が与えられた線維芽細胞であり、
前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群が混合されることなく、同一の培地で共培養される、皮膚モデル。 - 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、請求項１に記載の皮膚モデル。
- 前記光増感剤が、ソラレン、ＮＡＤ、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チオール基で保護された金ナノクラスター（ＡＵｘＳＲｙ）からなる群から選択される、請求項２に記載の皮膚モデル。
- 前記光照射が、ＵＶＡの光照射である、請求項１～３のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
- 前記多孔膜が、生体適合性成分からなる多孔膜である、請求項１～４のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
- 前記多孔膜が、コラーゲン膜である、請求項１～５のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
- 前記第１細胞群は、さらに、評価対象の線維芽細胞を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の皮膚モデル。
- 皮膚モデルの製造方法であって、
光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第１細胞群が播種された細胞培養基材の上方に、一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜を配置し、前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群が混合されることなく、同一の培地で共培養する、工程
を含む、方法。 - 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、請求項８に記載の方法。
- 前記光増感剤が、ソラレン、ＮＡＤ、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チオール基で保護された金ナノクラスター（ＡＵｘＳＲｙ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
- 前記光照射が、ＵＶＡの光照射である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記多孔膜が、生体適合性成分からなる多孔膜である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記多孔膜が、コラーゲン膜である、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１細胞群は、さらに、評価対象の線維芽細胞を含む、請求項８～１３のいずれか１項に記載の方法。
- 皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法であって、
（１）光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第１細胞群が播種された細胞培養基材の上方に、一方の面にメラノサイトを含む第２細胞群が播種され、かつ、他方の面にケラチノサイトを含む第３細胞群が播種された可溶性成分透過性の多孔膜を配置し、前記第１細胞群、前記第２細胞群及び前記第３細胞群を混合することなく、同一の培地で共培養する、皮膚モデルを作製する工程
（２）前記皮膚モデルに、候補因子を適用して培養する工程；
（３）前記工程（２）で得られる第１細胞群の色素沈着の指標を解析し、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程、
を含む、方法。 - 前記候補因子が、線維芽細胞であり、前記第１細胞群に適用される、請求項１５に記載の方法。
- 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、請求項１５又は１６に記載の方法。
- 前記光増感剤が、ソラレン、ＮＡＤ、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チオール基で保護された金ナノクラスター（ＡＵｘＳＲｙ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
- 前記多孔膜が、生体適合性成分からなる多孔膜である、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記多孔膜が、コラーゲン膜である、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記光照射が、ＵＶＡの光照射である、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021091633A JP2022184025A (ja) | 2021-05-31 | 2021-05-31 | 皮膚モデルおよびその製造方法、ならびに皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法 |
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| JP2021091633A JP2022184025A (ja) | 2021-05-31 | 2021-05-31 | 皮膚モデルおよびその製造方法、ならびに皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法 |
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2021
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