JP2022180634A - 幹細胞由来星状細胞、作製方法および使用方法 - Google Patents

幹細胞由来星状細胞、作製方法および使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】幹細胞由来星状細胞、作製方法および使用方法の提供。【解決手段】本開示の主題は、グリアコンピテント細胞（例えば、星状細胞前駆体）および星状細胞への幹細胞の分化を誘導するインビトロ方法、ならびにこのような方法により生成されるグリアコンピテント細胞（例えば、星状細胞前駆体）および星状細胞を提供する。本開示の主題はまた、神経変性障害を処置するための、このようなグリアコンピテント細胞（例えば、星状細胞前駆体）および星状細胞の使用を提供する。さらに、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月２１日に出願された米国仮出願第６２／４７４，４２９号、および２０１７年３月２１日に出願された米国仮出願第６２／４７４，５９６号の優先権を主張し、これらの内容はそれぞれ、その全体が参照により組み込まれ、これらのそれぞれの優先権が主張される。
１．イントロダクション
本開示の主題は、グリアコンピテント細胞（例えば、星状細胞前駆体）および幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）由来星状細胞ならびに細胞ベースの神経障害処置のためのそれらの使用に関する。
２．発明の背景
星状細胞は、脳内のアミノ酸、栄養素およびイオン代謝を調節し、神経活動および脳血流をつなぎ、興奮性シナプス伝達をモジュレートするように機能するグリア細胞である。プリオン病、アルツハイマー病およびパーキンソン病を有する患者の脳では、星状細胞は封入体を有すると報告されており、死後脳において疾患の重症度と相関する。加えて、Ｍｅｃｐ２を星状細胞からノックアウトすると、細胞は野生型ニューロンの正常な樹状形態を支持することができず、さらに、ミトコンドリアを放出し、脳卒中後にこれがニューロンに入ることが観察されている。したがって、星状細胞は、いくつかの神経疾患の病因において役割を果たし、傷害による神経損傷の重症度をモジュレートする可能性がある。このため、安定な星状細胞系を生成するインビトロ方法は、このような状態の研究に有用であろう。さらに、インビトロ分化の方法により調製された星状細胞は、神経障害を有する患者に治療的に投与され得るか、または神経損傷を患っている患者における損傷の重症度を軽減するために投与され得る。しかしながら、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来星状細胞は、７５～２００日間の培養後にインビトロで確立されているのみであるので、ｈＰＳＣから星状細胞を誘導するためのロバストな方法はない。
３．発明の概要
本開示の主題は、例えばインビトロ分化による幹細胞由来の星状細胞およびグリアコンピテント細胞（例えば、星状細胞前駆体）に関する。
本開示の主題は、少なくとも部分的には、（ｉ）神経幹細胞（ＮＳＣ）における核因子Ｉ－Ａ（ＮＦＩＡ）シグナリングの促進（例えば、ＮＦＩＡの発現の増加）がグリアコンピテンシープログラムを開始するという発見に基づく。ヒト胚性幹細胞由来ＮＳＣ集団としては、限定されないが、二重ＳＭＡＤ阻害から誘導されるものおよびＬＴＮＳＣ（「ＬＴ－ｈＥＳＣＮＳＣ」としても公知。長期自己再生ロゼット型ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）由来神経幹細胞）が挙げられる。本開示の主題はまた、少なくとも部分的には、（ｉｉ）グリアコンピテンシーの達成後、ＮＦＩＡシグナリングの低減（例えば、ＮＦＩＡの発現の減少）が、星状細胞へのグリアコンピテント細胞の分化を促進するという発見に基づく。さらに、白血病抑制因子（ＬＩＦ）（または、１つもしくはそれを超えるその誘導体、類似体もしくはアクチベーター）へのグリアコンピテント細胞の曝露は、星状細胞へのグリアコンピテント細胞の分化を促進する。
本開示の主題はまた、少なくとも部分的には、（ｉｉｉ）（例えば、ＦＧＦ２の非存在下における）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）へのＮＳＣ（例えば、ロゼット型ＮＳＣ、例えばＬＴ－ｈＥＳＣＮＳＣ）の曝露が、星状細胞へのＮＳＣの分化を誘導するという発見に基づく。
本開示は、少なくとも１つのグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団への、１つまたはそれを超える神経幹細胞（ＮＳＣ）マーカー（例えば、ＮＳＣ、例えばロゼット型ＮＳＣ、例えばＬＴ－ｈＥＳＣＮＳＣ）を発現する細胞の分化を誘導するためのインビトロ方法を提供する。特定の実施形態では、前記方法は、１つまたはそれを超える神経幹細胞（ＮＳＣ）マーカーを発現する細胞の集団におけるＮＦＩＡシグナリングを有効な期間促進して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む。
特定の実施形態では、前記方法は、１つまたはそれを超える神経幹細胞マーカーを発現する細胞の集団の細胞周期のＧ１期を延長して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント神経幹細胞マーカーは、ＰＡＸ６、ネスチン、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＬＺＦ、ＺＯ－１およびＢＲＮ２からなる群より選択される。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント神経幹細胞マーカーは、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＰＬＺＦおよびＺＯ－１からなる群より選択される。
本開示はまた、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞、例えば多能性幹細胞）を、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団に分化させるためのインビトロ方法を提供する。特定の実施形態では、該方法は、幹細胞の集団をＳＭＡＤシグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるインヒビター（「ＳＭＡＤインヒビター」と称される）に曝露すること、および細胞におけるＮＦＩＡシグナリングを促進して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む。特定の実施形態では、ＮＦＩＡシグナリングの促進は、１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターへの細胞の曝露後であるかまたはそれと同時である。特定の実施形態では、ＮＦＩＡシグナリングの初期促進は、１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターへの細胞の初期曝露から約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２日間である。
特定の実施形態では、該方法は、幹細胞の集団をＳＭＡＤシグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるインヒビターに曝露すること、および細胞の細胞周期のＧ１期を延長して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む。特定の実施形態では、Ｇ１期の初期延長は、ＳＭＡＤシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターへの細胞の初期曝露から少なくとも約８日間である。
特定の実施形態では、分化細胞はグリアコンピテント細胞である。特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞は星状細胞前駆細胞である。
特定の実施形態では、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングの前記促進は、細胞におけるＮＦＩＡの発現を増加させることを含む。
特定の実施形態では、ＮＦＩＡの発現の増加は、ＮＦＩＡの過剰発現を誘導するように細胞を改変することを含む。特定の実施形態では、改変細胞は、組換えＮＦＩＡタンパク質、例えばＮＦＩＡ核酸を発現し、前記ＮＦＩＡ核酸の発現は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。
特定の実施形態では、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングの前記促進は、細胞をＮＦＩＡの１つまたはそれを超えるアクチベーター（「ＮＦＩＡアクチベーター」と称される）に曝露することを含む。特定の実施形態では、ＮＦＩＡの１つまたはそれを超えるアクチベーターは、ＮＦＩＡ遺伝子の上流アクチベーターを含む。特定の実施形態では、ＮＦＩＡ遺伝子の上流アクチベーターはＴＧＦβ１である。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターは、細胞に外因的に曝露されたＮＦＩＡタンパク質を含む。
有効な期間は、少なくとも１つのグリアコンピテント細胞マーカーの検出可能レベルが達成され、および／または少なくとも１つのグリアコンピテント細胞マーカーの発現レベルが少なくとも約１０％増加した期間である。
特定の実施形態では、該方法は、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングを少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間もしくはそれを超えて；または最大約２日間、最大約３日間、最大約４日間、最大約５日間、最大約６日間、最大約７日間、最大約８日間、最大約９日間、最大約１０日間、最大約１１日間、最大約１２日間、最大約１３日間、最大約１４日間、最大約１５日間、最大約１６日間、最大約１７日間、最大約１８日間、最大約１９日間、最大約２０日間もしくはそれを超えて促進することを含む。特定の実施形態では、該方法は、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングを約５日間促進することを含む。特定の実施形態では、該方法は、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングを約５日間～約１５日間促進することを含む。特定の実施形態では、該方法は、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングを約８日間促進することを含む。特定の実施形態では、該方法は、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングを約１０日間～約２０日間促進することを含む。特定の実施形態では、該方法は、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングを約１５日間促進することを含む。
特定の実施形態では、ＮＦＩＡシグナリングの初期促進は、ＳＭＡＤシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターへの幹細胞の初期曝露から少なくとも約８日間である。特定の実施形態では、検出可能レベルの１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーは、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングの初期促進から少なくとも約５日間存在する。
特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞マーカーは、ＣＤ４４、ＡＱＰ４、ＳＯＸ２およびネスチンからなる群より選択される。特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞マーカーは、ＣＤ４４およびＡＱＰ４からなる群より選択される。
特定の実施形態では、細胞集団は、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれを超える分化細胞を含む。特定の実施形態では、少なくとも約９９％またはそれを超える分化細胞は検出可能レベルのＣＤ４４を発現し、少なくとも約１０％の分化細胞は検出可能レベルのＡＱＰ４を発現する。
特定の実施形態では、該方法は、細胞をＥＧＦおよび／またはＦＧＦ２シグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるアクチベーターに曝露することをさらに含む。特定の実施形態では、ＥＧＦおよび／またはＦＧＦ２シグナリングの１つまたはそれを超えるアクチベーターへの曝露は、ＮＦＩＡシグナリングの促進と同時である。
特定の実施形態では、細胞集団は、検出可能レベルの１つまたはそれを超えるニューロンマーカーを発現する約１５％未満の細胞を含む。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるニューロンマーカーは、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２およびＤＣＸからなる群より選択される。
特定の実施形態では、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングの促進は、（例えば、ＮＦＩＡインヒビターへの細胞の曝露により）約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日後またはそれよりも後に中断、減少または他の方法で阻害される。特定の実施形態では、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングの促進は、約５日間または約８日間の曝露期間後に中断される。特定の実施形態では、機能的ＮＦＩＡの発現レベルは、細胞に初期曝露された機能的ＮＦＩＡの発現レベルと比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約１００％減少する。特定の実施形態では、機能的ＮＦＩＡの発現レベルは、細胞に初期曝露された機能的ＮＦＩＡの発現レベルと比較して少なくとも約１０％減少する。特定の実施形態では、機能的ＮＦＩＡの発現レベルは、細胞に初期曝露された機能的ＮＦＩＡの発現レベルと比較して少なくとも約９０％減少する。
特定の実施形態では、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングの促進は、複数の細胞における１つまたはそれを超える星状細胞マーカーの検出可能な発現レベルを増加させるために有効な期間にわたって中断される。特定の実施形態では、細胞の少なくとも１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれより多くは、検出可能レベルの１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約５０％またはそれより多くは、検出可能レベルの１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する。特定の実施形態では、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーは、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）、ＡＱＰ４（アクアポリン４）、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ（カルシウム結合タンパク質Ｂ）、ＳＯＸ９（ＳＲＹ－Ｂｏｘ９）、ＮＦＩＡ、ＧＬＴ－１およびＣＳＲＰ１からなる群より選択される。特定の実施形態では、ＮＦＩＡシグナリングの促進は、複数の細胞におけるＳＯＸ２、ネスチンまたはその両方の検出可能な発現レベルを減少させるために有効な期間にわたって中断されるかまたは減少する。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより多くは、検出可能レベルのＳＯＸ２、ネスチンまたはその両方を発現しない。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約５０％またはそれより多くは、検出可能レベルのＳＯＸ２、ネスチンまたはその両方を発現しない。
特定の実施形態では、前記有効な期間は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間もしくはそれを超えるか；または最大約１日間、最大約２日間、最大約３日間、最大約４日間、最大約５日間、最大約６日間、最大約７日間、最大約８日間、最大約９日間もしくは最大約１０日間もしくはそれを超える。特定の実施形態では、有効な期間は約５日間である。
特定の実施形態では、検出可能レベルの１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーは、Ｇ１期の初期延長から少なくとも約１０日間存在する。特定の実施形態では、Ｇ１期の前記延長は、細胞周期のＧ１期を延長することができる１つまたはそれを超える化合物（「Ｇ１期を延長する化合物」と称される）に細胞を曝露することを含む。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＧ１延長化合物は小分子化合物を含む。特定の実施形態では、小分子化合物は、オロモウシン（Ｏｌｏ）を含む。特定の実施形態では、該方法は、細胞を１つまたはそれを超えるＧ１延長化合物に約２日間以下曝露することを含む。
特定の実施形態では、Ｇ１期の前記延長は、細胞におけるＦＺＲ１の発現を増加させることを含む。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるグリアコンピテントマーカーを発現する細胞は、皮質グリアコンピテント細胞または脊髄グリアコンピテント細胞である。
特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターに約１０、１１または１２日間曝露する。
特定の実施形態では、該方法は、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の細胞を含む細胞集団を、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の細胞を含む細胞集団への細胞の分化を促進するために適切な条件に供することをさらに含む。特定の実施形態では、条件は、細胞を有効量のＬＩＦ（または１つもしくはそれを超えるその誘導体、類似体および／またはアクチベーター）に曝露して、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーの検出可能レベルを増加させることを含む。特定の実施形態では、細胞を有効量のＬＩＦに少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間もしくはそれを超えて；または最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間もしくはそれを超えて接触させる。
特定の実施形態では、細胞を有効量のＬＩＦに約７、８、９または１０日間曝露する。特定の実施形態では、ＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、１つもしくはそれを超えるその類似体および／または１つもしくはそれを超えるそのアクチベーターへの細胞の初期曝露は、ＳＭＡＤシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターへの幹細胞の初期曝露から少なくとも約１０日間である。特定の実施形態では、ＮＦＩＡシグナリングの促進後にまたはそれと同時に、細胞をＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、１つもしくはそれを超えるその類似体および／または１つもしくはそれを超えるそのアクチベーターに曝露する。特定の実施形態では、ＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、１つもしくはそれを超えるその類似体および／または１つもしくはそれを超えるそのアクチベーターへの細胞の初期曝露は、ＮＦＩＡシグナリングの初期促進から約１、２、３、４または５日間である。特定の実施形態では、ＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、類似体および／またはアクチベーターへの細胞の初期曝露は、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングの初期促進から少なくとも約２日間または少なくとも約５日間である。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する細胞は、皮質星状細胞または脊髄星状細胞である。
さらに、本開示は、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団に幹細胞を分化させるためのインビトロ方法を提供する。特定の実施形態では、該方法は、幹細胞の集団をＳＭＡＤシグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるインヒビターに曝露すること、および細胞を有効量のウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」）に曝露して、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む。特定の実施形態では、ＦＢＳへの細胞の初期曝露から少なくとも約３０日間に幹細胞を前記細胞集団に分化させる。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターは、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングインヒビターおよび／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングのインヒビター（「ＢＭＰインヒビター」と称される）を含む。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターは、ＳＢ４３１５４２、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される化合物を含む。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターはＳＢ４３１５４２を含む。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターは、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される化合物を含む。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターはＬＤＮ１９３１８９を含む。
本開示の主題はまた、１つまたはそれを超える脊髄前駆体マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団に幹細胞を分化させるためのインビトロ方法を提供する。特定の実施形態では、該方法は、幹細胞の集団を有効量の１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターに曝露すること、ならびに細胞をレチノイン酸（ＲＡ）シグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるアクチベーター（「ＲＡアクチベーター」と称される）およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるアクチベーター（「ＳＨＨアクチベーター」と称される）に曝露して、１つまたはそれを超える脊髄前駆体マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＳＨＨアクチベーターへの細胞の初期曝露は、１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターへの細胞の初期曝露から少なくとも約１日間である。
特定の実施形態では、検出可能レベルの１つまたはそれを超える脊髄前駆体マーカーは、１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＳＨＨアクチベーターへの細胞の初期曝露から少なくとも約１２日間存在する。特定の実施形態では、１つまたはそれを超える脊髄前駆体マーカーは、ＨＯＸＢ４、ＩＳＬ１およびＮＫＸ６．１からなる群より選択される。
特定の実施形態では、幹細胞はヒト幹細胞である。特定の実施形態では、幹細胞は多能性幹細胞である。特定の実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の実施形態では、前記ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞およびＦクラス多能性幹細胞およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の実施形態では、幹細胞はＮＳＣである。特定の実施形態では、幹細胞はロゼット型ＮＳＣである。特定の実施形態では、幹細胞はＬＴ－ＮＳＣである。
本開示の主題はさらに、少なくとも約１０％の１つもしくはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーおよび／または１つもしくはそれを超える星状細胞マーカーを発現するインビトロ分化細胞の集団であって、本明細書に開示される方法により得られる集団を提供する。本開示の主題はさらに、前記細胞集団を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物は医薬組成物である。
さらに、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、以下：（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビター、（ｂ）１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビター；（ｃ）１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター；（ｄ）ＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、類似体および／またはアクチベーター；（ｅ）ＦＢＳ、ならびに（ｆ）１つもしくはそれを超える星状細胞マーカーおよび／または１つもしくはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する分化細胞の集団への幹細胞の分化を誘導するための指示の１つまたはそれよりも多くを含む。
本開示の主題はさらに、インビトロ分化細胞の集団を含む組成物であって、細胞の集団の少なくとも約５０％が１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーを発現し、細胞の集団の約２５％未満が１つまたはそれを超える幹細胞マーカーを発現する組成物を提供する。本開示の主題はまた、インビトロ分化細胞の集団を含む組成物であって、細胞の集団の少なくとも約５０％が１つもしくはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーまたはグリアコンピテント細胞マーカーを発現し、細胞の集団の約２５％未満が、幹細胞マーカー、ＮＳＣマーカーおよびニューロンマーカーからなる群より選択される１つまたはそれを超えるマーカーを発現する組成物を提供する。本開示の主題はまた、インビトロ分化細胞の集団を含む組成物であって、細胞の集団の少なくとも約５０％が１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現し、細胞の集団の約２５％未満が、幹細胞マーカー、ＮＳＣマーカー、ニューロンマーカーおよびグリアコンピテントＮＳＣマーカー／グリアコンピテント細胞マーカーからなる群より選択される１つまたはそれを超えるマーカーを発現する組成物を提供する。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超える幹細胞マーカーは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３からなる群より選択される。特定の実施形態では、１つまたはそれを超える神経幹細胞（ＮＳＣ）マーカーは、ＰＡＸ６、ネスチン、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＬＺＦ、ＺＯ－１およびＢＲＮ２からなる群より選択される。特定の実施形態では、１つまたはそれを超える神経幹細胞マーカーは、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＰＬＺＦおよびＺＯ－１からなる群より選択される。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーは、ＣＤ４４、ＡＱＰ４、ＳＯＸ２およびネクチンからなる群より選択される。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーは、ＣＤ４４およびＡＱＰ４からなる群より選択される。特定の実施形態では、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーは、ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ、ＧＬＴ－１およびＣＳＲＰ１からなる群より選択される。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるニューロンマーカーは、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２およびＤＣＸからなる群より選択される。
本開示の主題はさらに、被験体における神経変性障害を処置するかまたは神経傷害による損傷、例えば被験体における虚血または脳卒中を軽減する方法を提供する。特定の実施形態では、該方法は、本明細書に記載される分化細胞集団または本明細書に記載される組成物を被験体に投与することを含む。特定の実施形態では、被験体は神経変性障害を患っており、および／または神経傷害を経験している。
本開示の主題はさらに、神経変性障害の処置を必要とする被験体における神経変性障害を処置するための、または神経傷害による損傷を軽減するための、本明細書に記載される分化細胞集団またはそれを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、被験体は、神経変性障害と診断されているかまたはそれを有するリスクがある。
本開示の主題はさらに、神経変性障害を処置するための、神経傷害による損傷を軽減するための、または神経傷害による損傷、例えば脳卒中の重症度を軽減するための医薬の製造における、本明細書に記載される分化細胞集団または本明細書に記載される組成物の使用を提供する。
特定の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはレット症候群である。
Ａ１．特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、幹細胞を分化させるためのインビトロ方法であって、幹細胞の集団をＳＭＡＤシグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるインヒビターおよびＮＦＩＡの１つまたはそれを超えるアクチベーターに曝露して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含むインビトロ方法を提供する。
Ａ２．ＳＭＡＤシグナリングの該１つまたはそれを超えるインヒビターへの幹細胞の初期曝露から少なくとも約８日間、該幹細胞の該集団をＮＦＩＡの１つまたはそれを超えるアクチベーターに初期曝露する、Ａ１に記載の方法。
Ａ３．検出可能レベルの該１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーが、ＮＦＩＡの該１つまたはそれを超えるアクチベーターへの該細胞の該初期曝露から少なくとも約５日間存在し、必要に応じて、該１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーが、ＣＤ４４、ＡＱＰ４、ＳＯＸ２およびネスチンからなる群より選択される、Ａ２に記載の方法。
Ａ４．検出可能レベルの該１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーの存在後、複数の細胞において、機能的ＮＦＩＡ活性の発現レベルが減少し、その後、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する細胞への該細胞の分化を促進するための条件下で該細胞を培養する、Ａ３に記載の方法。
Ａ５．該１つまたはそれを超える星状細胞マーカーが、ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ、ＧＬＴ－１およびＣＳＲＰ１からなる群より選択される、Ａ４に記載の方法。
Ａ６．該１つまたはそれを超える星状細胞マーカーがＧＦＡＰを含む、Ａ５に記載の方法。
Ａ７．機能的ＮＦＩＡ活性の該発現レベルが少なくとも約９０％減少する、Ａ４に記載の方法。
Ａ８．ＮＦＩＡの該１つまたはそれを超えるアクチベーターに曝露された該細胞が検出可能レベルの１つまたはそれを超えるニューロンマーカーを発現せず、必要に応じて、該１つまたはそれを超えるニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２およびＤＣＸからなる群より選択される、Ａ１に記載の方法。
Ａ９．該細胞を白血病抑制因子（ＬＩＦ）、１つもしくはそれを超えるその誘導体、１つもしくはそれを超えるその類似体および／または１つもしくはそれを超えるそのアクチベーターに曝露することをさらに含む、Ａ１に記載の方法。
Ａ１０．ＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、１つもしくはそれを超えるその類似体および／または１つもしくはそれを超えるそのアクチベーターへの該細胞の該初期曝露が、ＳＭＡＤシグナリングの該１つまたはそれを超えるインヒビターへの該細胞の該初期曝露から少なくとも約１０日間である、Ａ９に記載の方法。
Ａ１１．ＳＭＡＤシグナリングの該１つまたはそれを超えるインヒビターが、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターを含む、Ａ１に記載の方法。
Ａ１２．ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの該１つまたはそれを超えるインヒビターが、ＳＢ４３１５４２、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される化合物を含む、Ａ１１に記載の方法。
Ａ１３．骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングの該１つまたはそれを超えるインヒビターが、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される化合物を含む、Ａ１１に記載の方法。
Ａ１４．ＮＦＩＡの該１つまたはそれを超えるアクチベーターが、該幹細胞に外因的に曝露されたＮＦＩＡタンパク質を含む、Ａ１に記載の方法。
Ａ１５．ＮＦＩＡの該１つまたはそれを超えるアクチベーターが、該幹細胞により発現される組換えＮＦＩＡタンパク質を含む、Ａ１に記載の方法。
Ａ１６．特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、幹細胞を分化させるためのインビトロ方法であって、幹細胞の集団をＳＭＡＤシグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるインヒビターおよびウシ胎仔血清に曝露して、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含むインビトロ方法を提供する。
Ａ１７．該ウシ胎仔血清への該細胞の該初期曝露から少なくとも約３０に、該幹細胞を前記細胞集団に分化させる、Ａ１６に記載の方法。
Ａ１８．該幹細胞がヒト幹細胞である、上記方法のいずれかに記載の方法。
Ａ１９．該幹細胞が多能性幹細胞である、上記方法のいずれかに記載の方法。
Ａ２０．該幹細胞が、ヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞およびＦクラス多能性幹細胞からなる群より選択される、上記方法のいずれかに記載の方法。
Ａ２１．特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、多能性幹細胞を分化させるためのインビトロ方法であって、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント神経幹細胞マーカーを発現する細胞の集団をＮＦＩＡの有効量の１つまたはそれを超えるアクチベーターに曝露して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含むインビトロ方法を提供する。
Ａ２２．検出可能レベルの該１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーが、ＮＦＩＡの該１つまたはそれを超えるアクチベーターへの該細胞の該初期曝露から少なくとも約５日間存在し、必要に応じて、該１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーが、ＣＤ４４、ＡＱＰ４、ＳＯＸ２およびネスチンからなる群より選択される、Ａ２１に記載の方法。
Ａ２３．検出可能レベルの該１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーが複数の細胞により発現された後、該複数の細胞において、機能的ＮＦＩＡ活性の発現レベルが減少し、その後、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する細胞への該細胞の分化を促進するための条件下で該細胞を培養する、Ａ２２に記載の方法。
Ａ２４．該１つまたはそれを超える星状細胞マーカーが、ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ、ＧＬＴ－１およびＣＳＲＰ１からなる群より選択される、Ａ２３に記載の方法。
Ａ２５．特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、１つもしくはそれを超える星状細胞マーカーおよび／または１つもしくはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％のインビトロ分化細胞を含む細胞集団であって、必要に応じて、Ａ１～２４のいずれか一項に記載の方法により得られる細胞集団を提供する。
Ａ２６．特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、Ａ２５に記載の細胞集団を含む組成物であって、必要に応じて、医薬組成物である組成物を提供する。
Ａ２７．特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、被験体における神経変性障害を処置するかまたは神経傷害による損傷を軽減する方法であって、有効量のＡ２５に記載のインビトロ分化細胞の集団またはＡ２６に記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。
Ａ２８．該被験体が、神経変性障害と診断されているかまたはそれを有するリスクがある、Ａ２７に記載の方法。
Ａ２９．該神経変性障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびレット症候群からなる群より選択される、Ａ２８に記載の方法。
Ａ３０．特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、神経変性障害を処置するためのまたは神経傷害による損傷を軽減するための医薬の製造における、Ａ２５に記載のインビトロ分化細胞の集団またはＡ２６に記載の組成物の使用を提供する。
Ａ３１．特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビター、
（ｂ）ＢＭＰシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビター；
（ｃ）ＮＦＩＡの１つまたはそれを超えるアクチベーター；
（ｄ）ＬＩＦ、その誘導体、その類似体および／またはそのアクチベーター；ならびに
（ｅ）１つもしくはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーおよび／または１つもしくはそれを超える星状細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団への該幹細胞の分化を誘導するための指示
の１つまたはそれよりも多くを含むキットを提供する。
Ａ３２．特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、Ａ２５に記載の細胞集団を含むキットを提供する。
４．図面の簡単な説明
図１Ａ～１Ｈは、二重ＳＭＡＤ阻害が、長期自己再生ロゼット型ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）由来神経幹細胞（ＬＴＮＳＣ）の非常に均一な神経幹細胞集団を生成したことを示す。（Ａ）ＬＴＮＳＣを生成するための分化戦略の概略図。ｈＥＳＣをＬＴＮＳＣに分化させるために使用した二重ＳＭＡＤ培養プロトコールの説明であり、ｈＥＳＣを神経幹細胞（ＮＳＣ）に分化させ、続いて、ＦＧＦ２／ＥＧＦで培養した。（Ｂ）ＬＴＮＳＣの形態は、非常に初期の神経外胚葉に似ている。（Ｃ）グリアコンピテントＮＳＣ（ＮＳＣＥＧＦ／ＦＧＦ）と比較したＬＴＮＳＣ（ｐ２０）におけるＳＯＸ２、ネスチン、ＳＯＸ１、ＺＯ－１およびＰＬＺＦの免疫蛍光。ＬＴＮＳＣは、神経幹細胞（ＮＳＣ）マーカーＳＯＸ２、ネスチンおよびＳＯＸ１を発現し、ＰＬＺＦおよび限局性発現のＺＯ－１（ロゼットまたは初期ＮＳＣ発生のマーカー）も発現する。（Ｄ）局所マーカーＦＯＸＧ１およびＯＴＸ２について、ＬＴＮＳＣ（ｐ３およびｐ２０）およびＮＳＣＥＧＦ／ＦＧＦの免疫蛍光染色。ＬＴＮＳＣの持続培養は、前脳マーカーＯＴＸ２およびＦＯＸＧ１、続いて（Ｅ）より尾側および腹側のマーカー、例えばそれぞれＧＢＸ２およびＮＫＸ２．１の発現の増加をもたらした。（Ｅ）ＬＴＮＳＣ（ｐ２０）におけるさらなる局所マーカーの定量的ＰＣＲ分析の棒グラフ。（Ｆ）ＬＴＮＳＣおよびグリアコンピテントＮＳＣの分化中のβＩＩＩ－チューブリンおよびＧＦＡＰの免疫蛍光。ＬＴＮＳＣの持続培養は、ニューロンマーカーＴＵＪ１を発現するニューロンへの分化をもたらした。（Ｇ）ＬＴＮＳＣ（ｐ３０）におけるＳＯＸ２、ＮＥＳ、ＺＯ－１、β－チューブリンおよびＰＬＺＦの免疫蛍光。（Ｈ）ＣＤ４４、ＮＦＩＡ、ＧＦＡＰ、ＡＱＯ４、ＳＯＸ２、ネスチンおよびＴＵＪ１の免疫蛍光は、ＬＴＮＳＣが非常に均一な集団であることを示す。 同上 同上 同上
図２Ａ～Ｂは、（Ａ）ＬＴＮＳＣは幹細胞マーカーＳＯＸ２およびネスチンを発現するが、グリアコンピテンシーマーカー（すなわち、星状細胞前駆体マーカー）ＣＤ４４、ＧＦＡＰおよびＡＱＰ４または神経マーカー（ｎｅｕｒａｌ ｍａｒｋｅｒ）ＴＵＪ１を発現しないことを示す。（Ｂ）ＬＴＮＳＣを異なる因子で１４日間処理するときの、βＩＩＩ－チューブリンおよびＧＦＡＰの免疫蛍光。グリア形成分子ＬＩＦ、ＢＭＰ４またはＦＢＳを含有する培地におけるＬＴＮＳＣの培養は、星状細胞マーカーＧＦＡＰではなくニューロンマーカーＴＵＪ１の発現を増加させた。
図３Ａ～３Ｂ。血清因子は、ヒトＮＳＣからのグリア形成の開始を加速する。（Ａ）ＮＳＣ分化の分化戦略および時間経過分析を示す図。（Ｂ）１％ＦＢＳで３０日間処理した後のＧＦＡＰ、ＭＡＰ２およびＡＱＰ４：：Ｈ２Ｂ ＧＦＰの免疫蛍光分析。スケールバーは５０μｍである。 図３Ｃ～３Ｅ。（Ｃ）ＮＳＣ分化の分化戦略および時間経過分析を示す図。（Ｄ）は、ＦＢＳで神経ロゼットまたはＬＴＮＳＣを長期約３０日間培養することにより、成長因子、Ｎｏｔｃｈインヒビター、ＬＩＦまたはＢＭＰ４なしの培養と比較して、グリアコンピテンシーマーカーＡＱＰ４およびＧＦＡＰの発現が増加したことを示す。（Ｅ）加えて、ＦＢＳ処理細胞はまた、他の処理と比較して、より高いレベルのグリア形成因子ＳＯＸ９およびＮＦＩＡを発現した。
図４Ａ～Ｃは、（Ａ）ＮＦＩＡ ｃＤＮＡを含むドキシサイクリン誘導性ベクターによるＬＴＮＳＣのウイルス感染により、ＮＦＩＡの過剰発現が達成されたことを示す。（Ｂ）７日間のドキシサイクリン処理後、ＮＦＩＡ誘導細胞がＣＤ４４を発現した細胞集団では、大きな形態学的変化があった。ＦＢＳで細胞を培養した場合、星状細胞マーカーＧＦＡＰの発現が観察された。（Ｃ）ＮＦＩＡの誘導発現を中断した後、ＬＩＦ、ＢＭＰ４およびＦＢＳで細胞を培養することにより、特にＦＧＦ２の非存在下で、ＧＦＡＰの発現が増強された。
図５は、ＮＦＩＡがグリアコンピテンシーの獲得を可能にしたが、グリア分化に対して阻害的であったことを示す。ＦＢＳの非存在下におけるＮＦＩＡ発現の増加は、星状細胞マーカーＧＦＡＰの発現を増加させなかった。しかしながら、その後のＮＦＩＡ発現の減少およびＬＩＦによる培養は、ＧＦＡＰの発現を増加させた。
図６Ａ～６Ｉは、ＮＦＩＡがグリアコンピテンシーの獲得を可能にしたが、グリアコンピテンシー状態を維持することができないことを示す。（Ａ）継続的なドキシサイクリンまたはドキシサイクリン除去で処理したＣＤ４４発現細胞のＦＡＣＳプロットは、ドキシサイクリン除去後にＣＤ４４発現が喪失することを実証する。（Ｂ）ＮＳＣ、ＮＦＩＡ誘導ＮＳＣ、およびドキシサイクリン除去を伴うＮＦＩＡ誘導ＮＳＣにおけるＮＦＩＡ、ＧＦＡＰおよびＴＵＢＢ３の免疫蛍光染色。（Ｃ）ＮＦＩＡで誘導し、グリアコンピテンシーを獲得し、次いで、ドキシサイクリンの中止によりグリア非コンピテンシーに戻る細胞の概略図。（Ｄ）Ｃに表されている時間経過に沿ったＮＦＩＡ発現の定量的ＰＣＲデータ。（Ｅ）Ｃに関連する異なる時点におけるＮＳＣのＲＮＡ発現のサンプル距離プロット。（Ｆ）グリアコンピテントＮＳＣ（ｇｃＮＳＣ）およびｈＰＳＣ由来星状細胞（２００日間のインビトロ培養）と比較したクロマチンアクセシビリティのサンプル距離プロット。（Ｇ）いくつかのＮＳＣサンプルにおけるクロマチンアクセシビリティの欠如を示すＧＦＡＰ遺伝子座のＡＴＡＣ－ｓｅｑ追跡の例。（Ｈ）ＧＦＡＰプロモーターのプロモーター領域のバイサルファイトシーケンシングは、ＮＦＩＡの過剰発現から生じるＣＤ４４陽性細胞が、ＧＦＡＰプロモーター上の特定のＣｐＧの脱メチル化をもたらすことを示唆する。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．により計算される。（Ｉ）ニューロン形成状態では、ＧＦＡＰプロモーターがメチル化されることを示す概略図 同上 同上 同上 図６Ｊ～６Ｋ。（Ｊ）ＮＦＩＡ発現の増加は、ＣＤ４４発現（グリアコンピテント細胞のマーカー）の対応する増加を誘導した。（Ｋ）ニューロン形成細胞におけるＧＦＡＰ発現は、ＳＴＡＴ３ ＣｐＧ部位のメチル化により遮断されるが（矢印）、グリア細胞ではこの部位は脱メチル化され（矢頭）、ここで、ＧＦＡＰが発現される。ＮＦＩＡにより誘導したＣＤ４４＋細胞では、ＳＴＡＴ３ ＣｐＧ部位は脱メチル化される（矢頭）。 図６Ｌ～６Ｑ。（Ｌ）明視野は、継続的なドキシサイクリンまたはドキシサイクリン除去で処理した細胞の形態を示す。（Ｍ）ＮＳＣ、ＮＦＩＡ誘導ＮＳＣ、およびドキシサイクリン除去を伴うＮＦＩＡ誘導ＮＳＣにおけるＤＡＰＩ、ＧＦＡＰおよびＮＦＩＡの免疫蛍光染色。（Ｎ）継続的なドキシサイクリンまたはドキシサイクリン除去で処理したＣＤ４４発現細胞のＦＡＣＳプロットは、ドキシサイクリン除去後にＣＤ４４発現が喪失することを実証する。（Ｏ）ＮＳＣ、ＮＦＩＡ誘導ＮＳＣ、およびドキシサイクリン除去を伴うＮＦＩＡ誘導ＮＳＣにおけるＤＡＰＩ、ＧＦＡＰ、ＮＦＩＡ、ＡＱＰ４およびＣＤ４４の免疫蛍光染色。（Ｐ）ＬＴＮＳＣ、ドキシサイクリン除去を伴うＮＦＩＡ誘導ＮＳＣ、およびドキシサイクリンが継続的に存在するＮＦＩＡ誘導ＮＳＣにおけるＤＡＰＩ、ＮＦＩＡおよびＴＵＪ１の免疫蛍光染色。ＬＴＮＳＣは、継続的なＮＦＩＡ活性化後に神経形成能を再獲得する。（Ｑ）（Ｆ）に関連するＮＦＩＡ過剰発現トップモチーフおよび星状細胞トップモチーフ。 同上 同上
図７は、ドキシサイクリンの制御下で組換えＮＦＩＡ誘導性ｈＥＳＣ系を星状細胞に培養するための戦略を示しており、ここで、二重ＳＭＡＤ阻害で細胞を培養して神経幹細胞を生成し、続いて、ＮＦＩＡ発現が増加し、ＣＤ４４およびＧＦＡＰを発現するグリアコンピテント細胞の分化が誘導され、続いて、ＮＦＩＡ発現がダウンレギュレートされ、ＬＩＦで培養し、ＧＦＡＰ、ＣＤ４４およびＡＱＰ４を発現する星状細胞への細胞の分化が誘導される。
図８Ａ～８Ｂ。ＮＦＩＡ誘導星状細胞の生成のためのプロトコールの非制限的な例。（Ａ）一過性ＮＦＩＡ発現を使用してＮＳＣから星状細胞を誘導するためのプロトコールと、（Ｂ）ｈＰＳＣからの現在の長期グリア分化戦略の概要とを比較した概略図。 図８Ｃ～８Ｅは、（Ｃ）ＦＢＳで細胞を培養することにより幹細胞（ＬＴＮＳＣ）を星状細胞に分化させるか、または（Ｄ）ＬＩＦによる培養と組み合わせてＮＦＩＡの発現をモジュレートするためのプロトコールの非限定的な例を示す。（Ｅ）ＮＦＩＡ誘導星状細胞の生成のためのプロトコールの非制限的な例。 同上
図９Ａ～９Ｃは、（Ｂ）野生型星状細胞とのｏＭＮの培養は、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ星状細胞との培養と比較して、運動ニューロンの生存を増加させたが、野生型星状細胞は、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ星状細胞と比較してｓＭＮの細胞死を減少させたことを示す。（Ａ）培養プロトコールの概略図。（Ｃ）ＶＡＣＨＴ＋細胞の免疫蛍光染色。
図１０Ａ～１０Ｌ。神経上皮幹細胞におけるＮＦＩＡの一過性発現は、グリアコンピテンシーを与える。（Ａ）血清条件で３０日間処理したグリアコンピテンシーに関連する候補遺伝子の定量的ＰＣＲ（ｎ＝３）、ｐ値＜０．０１（ＮＦＩＡ）およびｐ値＜０．０１５（ＬＩＮ２８Ｂ）を、血清およびＮ２を比較する対応のあるｔ検定を使用して計算した。（Ｂ）ＮＦＩＡの過剰発現は、黄色矢頭によりマークされた５日間のドキシサイクリン処理内に顕著な形態学的変化をもたらす。（Ｃ）ドキシサイクリンで５日間処理したＮＳＣにおけるＮＦＩＡ（赤色）、ＧＦＡＰ（緑色）およびＣＤ４４（遠赤色）の免疫蛍光染色。（Ｄ）ドキシサイクリンで５日間処理したＮＳＣにおけるＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰレポーターおよびＳＯＸ２の免疫蛍光染色。（Ｅ）ドキシサイクリンで５日間処理し、続いてさらに３日間および５日間除去したか、または継続的に処理（＋ｄｏｘ）したＮＳＣにおけるＧＦＡＰおよびＮＦＩＡ発現の定量的ＰＣＲ分析（ｎ＝２）。（Ｆ）ＮＦＩＡで一過性誘導し、続いてＦＧＦ２またはＬＩＦ含有培地中で維持したＮＳＣにおけるＧＦＡＰの免疫蛍光染色。Ｇ、代表的な星状細胞の明視野画像（ＣＤ４４選別の６０日後）。（Ｈ）６０日目の（ｄ６０）星状細胞培養物におけるＧＦＡＰおよびＳＬＣ１Ａ２の免疫蛍光染色。（Ｉ）ＮＳＣ、ニューロン、星状細胞およびＮＦＩＡ誘導星状細胞由来の希突起膠細胞に関連する遺伝子の定量的ＰＣＲ分析（ｎ＝２）。（Ｊ）初代ヒト星状細胞を用いて複数回誘導および継代したＮＦＩＡ誘導星状細胞における、胎児および成体星状細胞に関連する遺伝子の定量的ＰＣＲ分析（ｎ＝２）。スケールバーは５０μｍである。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．により計算される。（Ｋ）ドキシサイクリンで４日間処理したＮＳＣにおけるＮＦＩＡ（赤色）、ＧＦＡＰ（緑色）およびＣＤ４４（遠赤色）の免疫蛍光染色。（Ｌ）ドキシサイクリンで５日間処理したＮＳＣにおけるＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰレポーター、ＳＯＸ、ＮＩＦＡおよびＧＦＡＰの免疫蛍光染色。 同上 同上 同上
図１１Ａ～１１Ｋ。ＮＦＩＡ誘導星状細胞は機能的である。（Ａ）単独で培養した、またはＮＦＩＡ誘導星状細胞と共培養したニューロンの免疫蛍光染色。（Ｂ）星状細胞ありまたはなしで培養したニューロンにおける成熟度のマーカー（ＭＵＮＣ１３．１およびシナプシンＩ）のウエスタンブロット分析。（Ｃ）Ｂと同様の培養物におけるグルタミン酸興奮毒性アッセイ後の細胞生存を表す棒グラフ。ｔ検定（ｎ＝３）で計算したＰ値（ｐ値＜０．０００１）およびエラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．により計算される。（Ｄ）ＩＬ１α、ＴＮＦおよびＣ１ｑで２４時間処理したＮＦＩＡ誘導または初代星状細胞から放出された補体（Ｃ３）の量を表す棒グラフ（ｎ＝２）。（Ｅ）Ｆｕｒａ－２カルシウム色素と共にインキュベートし、ＡＴＰ、ＫＣｌおよびグルタメートで刺激した精製ＮＦＩＡ誘導星状細胞（６０日間）のレシオメトリックプロット。すべてのデータポイントは、下のヒートマップとしてプロットされている。（Ｆ）星状細胞のみの培養物（赤色）およびニューロンと共培養した星状細胞（青色）におけるＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ強度のＦＡＣＳヒストグラム（ＧＦＰ陰性画分は、下のヒストグラムにプロットされている）。（Ｇ）Ｆｕｒａ－２カルシウム色素と共にインキュベートし、ＡＴＰ、ＫＣｌおよびグルタメートで刺激したニューロンと共培養したＮＦＩＡ誘導星状細胞のレシオメトリックプロット。ＧＦＰ陽性核において比を計算した。すべてのデータポイントは、下のヒートマップとしてプロットされている。（Ｈ）（Ｅ）Ｆに示されているデータおよび拡張データ図７からの、ＡＴＰ、ＫＣｌまたはグルタメートに反応する星状細胞の数の定量。（Ｉ）マウス皮質に移植したＮＦＩＡ誘導グリア前駆体の免疫蛍光は、脳梁を介した移動を示す。スケールバー５０μｍ（Ｊ）ＮＦＩＡ誘導星状細胞の免疫蛍光は、ＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ、ＧＦＡＰおよびヒト特異的マーカーＳＣ－１２１の共発現を実証する。スケールバー１０μｍ。（Ｋ）長いヒト星状細胞突起の免疫蛍光画像。スケールバー５μｍ。 同上 同上
図１２Ａ～１２Ｎ。ＮＦＩＡは、より遅いＧ１細胞周期相を誘導して、グリアコンピテンシーを誘導する。（Ａ）時間経過中の遺伝子の不偏階層的クラスタリングであり、３つの主要なクラスタが強調されている。（Ｂ）Ａに表されている各クラスタからの重要な生物学的プロセスの遺伝子オントロジー分析。（Ｃ）すべての遺伝子および細胞周期オントロジーに特異的な遺伝子のグローバル分析。超幾何分布を使用して計算したＰ値。（Ｄ）時間経過中のすべての細胞分裂周期（ＣＤＣ）遺伝子の発現動力学のグラフ。（Ｅ）７日間のｄｏｘありまたはなしでのＮＳＣにおけるＦＡＣＳによる細胞周期分析。（Ｆ）７日間のｄｏｘありまたはなしでのＬＴＮＳＣにおけるＣＣＮＡ１およびＣＤＫＮ１Ａのウエスタンブロット分析。（Ｇ）ＮＦＩＡ過剰発現の存在下におけるｓｈＦＺＲ１のノックダウン効率を評価する定量的ＰＣＲ（ｎ＝３）。（Ｈ）ＦＺＲ１に対するｓｈＲＮＡありまたはなしでの細胞周期相の分析。（Ｉ）ｓｈＦＺＲ１ありまたはなしでのＮＦＩＡ誘導細胞におけるＣＤ４４発現の定量的ＰＣＲ分析（ｎ＝３）。（Ｊ）ＬＩＦでさらに誘導した以外はＩと同様のＮＦＩＡ誘導細胞におけるＧＦＡＰ発現の定量的ＰＣＲ分析（ｎ＝２）。（Ｋ）様々なレベルのＴＧＦβ１で７日間誘導した場合のＮＦＩＡのウエスタンブロット分析。（Ｌ）ＴＧＦβ１ありまたはなしで４８時間処理したＮＳＣにおけるＦＡＣＳによる細胞周期分析。（Ｍ）ＴＧＦβ１ありまたはなしで１４日間処理した培養物におけるＮＦＩＡおよびＧＦＡＰの免疫蛍光染色。（Ｎ）ＮＦＩＡ誘導グリアコンピテンシーのモデル。スケールバーは５０μｍである。 同上 同上 同上 同上
図１３Ａ～１３Ｉ。アクアポリン－４ノックインｈＥＳＣレポーター系の生成および特性評価。（Ａ）Ｈ２Ｂ－ＧＦＰレポーター系をＡＱＰ４遺伝子座に組み込むためのノックイン戦略の概略図。（Ｂ）ヘテロ接合性ノックインのゲノムＰＣＲ確認。（Ｄ）ＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ ｈＥＳＣにおけるＯＣＴ４およびＳＯＸ２の免疫蛍光。（Ｃ）ＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ系としてのＰＬＺＦおよびＰＡＸ６の免疫蛍光は、神経外胚葉に向けて分化する。（Ｅ）長期培養では、ＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ系としてのＡＱＰ４およびＧＦＰの免疫蛍光は、星状細胞に向けて分化する。（Ｆ）ＧＦＰおよびβＩＩＩ－チューブリンの免疫蛍光以外は（Ｅ）と同じ。ＧＦＰおよびＧＦＡＰの免疫蛍光以外は（Ｅ）と同じ。（Ｈ）ＧＦＰおよびＳＯＸ２の免疫蛍光の（Ｅ）と同様。スケールバーは５０μｍである。（Ｉ）１００日間を超える培養では、ＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ系としてのＡＱＰ４およびＧＦＰの明視野および免疫蛍光は、星状細胞に向けて分化する。 同上
図１４Ａ～１４Ｄ。ＬＩＦは、星状細胞への効率的な分化を促進する。（Ａ）ＢＭＰ４および１％ＦＢＳでＮＦＩＡ誘導細胞を処理した後のＧＦＡＰ発現の免疫蛍光分析。（Ｂ、Ｃ）ＮＦＩＡ誘導後にＦＧＦ２／ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＨＢ－ＥＧＦ、ＢＭＰ４、１％ＦＢＳおよびＬＩＦで処理した際のＮＦＩＡ発現およびＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰレポーターシグナルの免疫蛍光染色。スケールバーは１００μｍである。（Ｄ）ＬＴＮＳＣ段階では、ＮＦＩＡおよび他のグリア関連タンパク質は存在しない。
図１５Ａ～１５Ｄ。ＮＦＩＡ誘導は、前脳および脊髄パターン形成ＮＳＣに適用可能である。（Ａ、Ｃ）神経外胚葉へのいくつかのｈＰＳＣの分化後（多能性から１０日目）の前部マーカーＯＴＸ２、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６ならびに後部マーカーＨＯＸＢ４、ＦＯＸＡ２およびＮＫＸ６．１の定量的ＰＣＲ測定。（Ｂ）ＮＦＩＡのＮＦＩＡ一過性発現後（多能性から１８日目）のＯＴＸ２、ＮＦＩＡおよびＧＦＡＰの免疫蛍光。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．により計算される（Ｄ）異なる局所パターン形成前駆体から星状細胞を誘導するためのプロトコールの非限定的な例。 同上 同上
図１６Ａ～１６Ｆ。初代星状細胞、ｈＰＳＣ由来前駆体および星状細胞のカルシウムイメージング。（Ａ）ＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰレポーター系に由来する後期ＮＳＣ集団の明視野およびＧＦＰ画像。（Ｂ）ＫＣｌ、グルタメートおよびＡＴＰで処理したｈＰＳＣ由来ＮＳＣのカルシウムイメージングの時間経過であり、各灰色線は個々の細胞トレースを表す。黒色線は平均シグナルを表す。（Ｃ）ＡＱＰ４：：Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ選別星状細胞の明視野およびＧＦＰ画像。（Ｄ）ｈＰＳＣ由来星状細胞を用いた以外は（Ｂ）と同様（１２０日目）。（Ｅ）特定の刺激に反応する細胞の数の定量。（Ｆ）市販の初代星状細胞を用いた以外は（Ｂ）と同様。各線は細胞を表す（上）。ヒートマップ形式で分析したすべての細胞のヒートマップ（下）。
図１７Ａ～１７Ｃ。ＡＴＡＣ－ｓｅｑモチーフ分析は、ＮＦＩモチーフの富化を示す。（Ａ）継続的なドキシサイクリン（ｄｏｘ）処理の（左）またはｄｏｘを除去した後の（右）ＬＴＮＳＣにおけるＮＦＩＡおよびＧＦＡＰの免疫蛍光染色。スケールバーは５０μｍである。Ｂ．ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、オープンクロマチンを示すＳＯＸ２遺伝子座を追跡する。Ｃ．４つの条件におけるＡＴＡＣ－ｓｅｑピークのモチーフ分析；Ｘ軸の値は－ｌｏｇ１０ｐ値を表す。バイサルファイトシーケンシングのためのＦＡＣＳ分析ならびにＣＤ４４陽性および陰性画分の選別。スケールバーは５０μｍである。 同上
図１８Ａ～１８Ｂ。一過性ＮＦＩＡ活性化中のグループＩおよびＩＩクラスタの分析。（Ａ）グループＩは、胎児星状細胞のマーカーに関連する遺伝子発現の変化を強調する。（Ｂ）成長因子関連遺伝子の誘導に関連する遺伝子発現の変化を強調するグループＩＩ。
図１９Ａ～１９Ｂ。サイクリン関連遺伝子の遺伝子発現の変化。（Ａ）一過性ＮＦＩＡ活性化中のサイクリン遺伝子の発現パターンを示す棒グラフ。（Ｂ）ＮＦＩＡ過剰発現によるＣＣＮＡ１アップレギュレーションの定量的ＰＣＲ検証（ｎ＝３）。
図２０Ａ～２０Ｅ。ＮＦＩＡの滴定による星状細胞分化能の変化。（Ａ）分化の時間経過にわたるＮＦＩＡ発現の定量的ＰＣＲ（ｎ＝２）。（Ｂ）ＦＵＣＣＩ－Ｏレポーター構築物を使用した、ＬＴＮＳＣおよびＮＦＩＡで誘導したＬＴＮＳＣのＧ１タイミング分析。（Ｃ）５日間のｄｏｘ滴定中の細胞周期プロファイルの棒グラフ。（Ｄ）ＮＦＩＡ発現の滴定中のＮＦＩＡ、ＣＤ４４およびＧＦＡＰの発現の定量的ＰＣＲ（ｎ＝３）。（Ｅ）１０日後に様々な濃度のｄｏｘで処理したＬＴＮＳＣにおけるＧＦＡＰおよびＮＦＩＡ発現の免疫蛍光。スケールバーは５０μｍである。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．により計算される
図２１Ａ～２１Ｆ。オロモウシンにより化学的に誘導したＧ１延長は、グリアコンピテント遺伝子発現をアップレギュレートすることができる。（Ａ）オロモウシンで処理したＧ１期の細胞の割合のＦＡＣＳ分析。（Ｂ）４８時間後にオロモウシンで処理した後のＮＦＩＡ、ＣＤ４４およびＳ１００βの定量的ＰＣＲ分析（ｎ＝２）。（Ｃ）オロモウシンありまたはなしでＬＴＮＳＣを１２日間処理した後のＮＦＩＡ、ＣＤ４４およびＳ１００β発現の定量的ＰＣＲ分析（ｎ＝３）。（Ｄ）１２日後にＬＩＦおよびオロモウシンで処理した細胞におけるＧＦＡＰの免疫蛍光染色。（Ｅ）１％ＦＢＳで処理したＬＴＮＳＣのＦＡＣＳ分析は、Ｇ１停止を実証する。（Ｆ）オロモウシンありまたはなしでＦＢＳ処理したＬＴＮＳＣにおけるＮＦＩＡおよびＣＤ４４の免疫蛍光染色。スケールバーは５０μｍである。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．５により計算される。
詳細な説明
本明細書に記載される本開示の主題は、グリアコンピテント細胞（例えば、「星状細胞前駆体」）および／または幹細胞由来星状細胞を調製する方法、ならびにこのような細胞を産生するための方法に関する。神経変性障害を処置するためのこのような細胞の使用も提供される。
本開示を、制限することなく明らかにする目的で、詳細な説明を、以下の小区分に分ける。
５．１ 定義
５．２ 幹細胞を分化させる方法
５．３ 局所星状細胞への幹細胞のインビトロ分化
５．４ 分化細胞集団を含む組成物
５．５ 神経変性障害を予防および／または処置する方法 および
５．６ キット
５．１ 定義
本明細書で使用される用語は、一般に、それぞれの用語が使用される本発明の文脈内および特定の文脈において、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらをどのように作製し使用するかについての説明により、実務者に追加の指針を提供するための特定の用語を、以下または本明細書の他所で論じる。
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される特定の値について許容され得る誤差範囲内であることを意味し、この範囲は、部分的に、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定系の限界に応じて決まる。例えば、「約」は、当技術分野の実施にしたがって、標準偏差の３倍以内または３倍超を意味し得る。あるいは、「約」は、所定の値の２０％まで、例えば１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物系またはプロセスに関して、この用語は、値のある桁以内、例えば５倍以内または２倍以内であることを意味し得る。
本明細書で使用される場合、「神経幹細胞」または「ＮＳＣ」という用語は、ニューロン形成性であり、グリア形成スイッチを受けていない幹細胞を指す。特定の実施形態では、ＮＳＣはロゼット期神経幹細胞である。特定の実施形態では、ＮＳＣは長期ＮＳＣ（ＬＴＮＳＣ）である。特定の実施形態では、ＮＳＣは１つまたはそれを超える神経幹細胞マーカーを発現する。神経幹細胞マーカーの非限定的な例としては、ＰＡＸ６、ネスチン、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＬＺＦ、ＺＯ－１およびＢＲＮ２が挙げられる。特定の実施形態では、神経幹細胞マーカーは、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＰＬＺＦ、ＺＯ－１およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
本明細書で使用される場合、「ＬＴＮＳＣ」または「ＬＴ－ｈＥＳＣＮＳＣ」という用語は、長期自己再生ロゼット型ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）由来神経幹細胞を指す）。ＬＴＮＳＣの形態は、非常に初期の神経外胚葉に似ている。ＬＴＮＳＣは、いくつかの神経幹細胞（ＮＳＣ）マーカー、例えばＳＯＸ２、ネスチンおよびＳＯＸ１を発現するが、ＰＬＺＦも発現し、ＺＯ－１の限局性発現を示すが、これは、ロゼットまたは初期ＮＳＣ性質を示す。
本明細書で使用される場合、「グリアコンピテンス」という用語は、グリア分化に方向付けられたＮＳＣのコンピテンスを指す。
本明細書で使用される場合、「グリアコンピテント細胞」という用語は、グリア形成スイッチを受けており、グリアコンピテンスを有している細胞を指す。特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞は、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する。グリアコンピテント細胞マーカーの非限定的な例としては、ＣＤ４４、ＡＱＰ４、ＳＯＸ２およびネクチンが挙げられる。特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞マーカーは、ＣＤ４４、ＡＱＰ４およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞は星状細胞前駆体である。
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達タンパク質」に関する「シグナリング」という用語は、膜受容体タンパク質とのリガンドの結合またはいくらかの他の刺激により活性化されるか、または他の方式で影響を受けるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例としては、限定されないが、ＳＭＡＤ、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、アクチビン、ノーダル、骨形成（ＢＭＰ）およびＮＦＩＡタンパク質が挙げられる。多くの細胞表面受容体または内部受容体タンパク質については、リガンドと受容体の相互反応は、細胞の応答に直接関係しない。リガンドにより活性化された受容体は、最初に、細胞内部の他のタンパク質と相互反応することができ、その後、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理的効果が生じる。しばしば、相互反応する一連のいくつかの細胞タンパク質の挙動が、受容体の活性化または阻害後に変わる。受容体の活性化により誘導された一連の細胞変化の全体は、シグナル伝達機構またはシグナリング経路と称される。
本明細書で使用される場合、「シグナル」という用語は、細胞の構造および機能の変化を制御する、内部および外部の因子を指す。それらは、化学的または物理的性質であり得る。
本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、受容体に結合する分子およびタンパク質、例えば、形質転換成長因子－ベータ（ＴＦＧβ）、アクチビン、ノーダル、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などを指す。
本明細書で使用される場合、「インヒビター」は、分子または経路のシグナリング機能を妨害する（例えば、低減、低下、抑制、排除、または遮断する）、化合物または分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣物、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、または抗体）を指す。インヒビターは、命名されたタンパク質（シグナリング分子、命名されたシグナリング分子に関与する任意の分子または命名された関連分子）（例えば、限定されないが、本明細書に記載されるシグナリング分子を含む）の任意の活性を変化させる、任意の化合物または分子であり得る。一例として、ＳＭＡＤシグナリングのインヒビターは、例えば、ＳＭＡＤと直接接触し、ＳＭＡＤ ｍＲＮＡと接触し、ＳＭＡＤのコンフォメーション変化を引き起こし、ＳＭＡＤタンパク質レベルを低下させ、またはシグナリングパートナーとのＳＭＡＤとの相互反応を妨害し、ＳＭＡＤ標的遺伝子の発現に影響を及ぼすことにより機能し得る。またインヒビターには、上流シグナリング分子（例えば、細胞外ドメイン内）を遮断することによりＳＭＡＤ生物活性を間接的に調節する分子が含まれる。ＳＭＡＤシグナリングインヒビター分子および効果の例としては、骨形成タンパク質を隔離し、ＡＬＫ受容体１、２、３および６の活性化を阻害し、したがって下流ＳＭＡＤ活性化を防止するノギンが挙げられる。同じく、コーディン、ケルベロス、フォリスタチンも同様に、ＳＭＡＤシグナリングの細胞外アクチベーターを隔離する。膜貫通タンパク質であるＢａｍｂｉも、細胞外ＴＧＦβシグナリング分子を隔離する疑似受容体として作用する。アクチビン、ノーダル、ＴＧＦβ、およびＢＭＰを遮断する抗体は、ＳＭＡＤシグナリングなどの細胞外アクチベーターを中和するための使用を企図される。先の例は、ＳＭＡＤシグナリング阻害に関するが、他のシグナリング分子を阻害するために、同様または類似の機構を使用することができる。インヒビターの例としては、限定されないが、ＳＭＡＤシグナリング阻害のためのＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ）およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）（ＬＳＢ）が挙げられる。
インヒビターは、命名された分子の阻害もまた引き起こす命名されたシグナリング分子から上流にある分子に結合し、影響を及ぼすことにより誘導される阻害に加えて、競合的阻害（別の公知の結合化合物の結合を排除または低減するような方式で、活性部位に結合する）およびアロステリック阻害（タンパク質の活性部位への化合物の結合を妨害するような方式で、タンパク質コンフォメーションを変化させる方式でタンパク質に結合する）に関して説明される。インヒビターは、実際にシグナリング標的と接触することにより、シグナリング標的またはシグナリング標的経路を阻害する「直接的インヒビター」であり得る。
本明細書で使用される場合、「アクチベーター」は、タンパク質もしくは分子の活性化、またはタンパク質、分子もしくは経路のシグナリング機能、例えば、ＮＦＩＡ転写因子活性の活性化を増大し、誘導し、刺激し、活性化し、容易にし、または増強する化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、類似のコア構造を有する化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「細胞の集団」または「細胞集団」という用語は、少なくとも２個の細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約１０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個の細胞、少なくとも約５，０００個の細胞または少なくとも約１０，０００個の細胞または少なくとも約１００，０００個の細胞または少なくとも約１，０００，０００個の細胞を含み得る。集団は、１種の細胞型を含む純粋な集団、例えばグリアコンピテント細胞（例えば、星状細胞前駆体）の集団、または未分化幹細胞の集団であり得る。あるいは、集団は、１種を超える細胞型、例えば混合細胞集団を含み得る。
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、培養で無期限に分裂し、専門化した細胞を生じる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞は、ヒト由来の幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」という用語は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知の、着床前段階の胚から誘導される初期（primitive）（未分化）細胞を指す。ヒト胚
性幹細胞は、ヒト由来の胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知の、胚盤胞段階までを含む初期段階のヒト胚から誘導されるタイプの多能性幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞系」という用語は、数日間、数カ月間から数年間まで、分化なしに増殖を可能にするインビトロ条件下で培養された、胚性幹細胞集団を指す。例えば、「胚性幹細胞」は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知の、着床前段階の胚から誘導される初期（未分化）細胞を指し得る。ヒト胚性幹細胞は、ヒト由来の胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知の、胚盤胞段階までを含む初期段階のヒト胚から誘導されるタイプの多能性幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む、生物の３種の発生上の胚葉へと発生する能力を指す。
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、特定の胚性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４導入遺伝子）が、体細胞、例えばＣＩ ４、Ｃ７２などに導入されることにより形成された、胚性幹細胞に類似したタイプの多能性幹細胞を指す（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６，６６３－６７６（２００６）（これは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、配偶子（卵または精子）以外の体内の任意の細胞を指し、時に「成体」細胞と称される。
本明細書で使用される場合、「体性（成体）幹細胞」という用語は、自己再生（実験室中）および分化の両方について能力が制限されている、多くの臓器および分化した組織に見出される相対的に稀な未分化細胞を指す。このような細胞は、それらの分化能が異なっているが、通常は起源臓器の細胞型に限定される。
本明細書で使用される場合、「ニューロン」という用語は、神経系の主要な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体、ならびにその突起である軸索および１つまたはそれを超える樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスで神経伝達物質を放出することにより、他のニューロンまたは細胞に情報を伝達する。
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞数の増加を指す。
本明細書で使用される場合、「未分化」という用語は、専門化した細胞型にまだ発生していない細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、専門化していない胚性細胞が、心臓、肝臓または筋細胞などの専門化した細胞の特質を獲得するプロセスを指す。分化は、通常は細胞表面に埋め込まれたタンパク質を伴うシグナリング経路を介して、細胞遺伝子と細胞外側の物理的および化学的条件との相互反応により制御される。
本明細書で使用される場合、「定方向性分化」という用語は、星状細胞およびその前駆体などの特定の（例えば、所望の）細胞型への分化を誘導するための、幹細胞の培養条件の操作を指す。特定の実施形態では、幹細胞に関する「定方向性分化」という用語は、多能性状態から、より成熟したまたは専門化した細胞の運命（例えば、星状細胞など）への幹細胞の移行を促進するための、小分子、成長因子タンパク質、および他の成長条件の使用を指す。
細胞に関して本明細書で使用される場合、「分化を誘導する」という用語は、デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）から非デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）への変化を指す。したがって、「幹細胞の分化を誘導する」は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を、幹細胞とは異なる特徴、例えば遺伝子型（例えば、遺伝子分析、例えばマイクロアレイにより決定される遺伝子発現の変化）および／または表現型（例えば、タンパク質、例えばＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ、ＳＯＸ９、ＧＬＴ－１、ＣＳＲＰ１および／またはＮＦＩＡの発現の変化）を有する後代細胞に分裂するように誘導することを指す。
本明細書で使用される場合、「培養培地」という用語は、培養容器、例えばペトリプレート、マルチウェルプレートなどの細胞をカバーし、細胞に栄養を与え、細胞を補助するための栄養分を含有する液体を指す。また培養培地は、細胞における所望の変化をもたらすために添加される成長因子を含み得る。
本明細書で使用される場合、細胞を化合物（例えば、１つまたはそれを超えるインヒビター、アクチベーター、および／または誘導因子）と「接触させる」という用語は、細胞を化合物に曝露すること、例えば化合物を、細胞に触れさせる位置に置くことを指す。接触は、任意の適切な方法を使用して達成され得る。例えば接触は、化合物を、細胞のチューブに添加することにより達成され得る。また接触は、化合物を、細胞を含む培養培地に添加することにより達成され得る。化合物のそれぞれ（例えば、インヒビター、アクチベーターおよび／またはインデューサー）は、細胞を含む培養培地に、溶液（例えば、濃縮溶液）として添加され得る。あるいはまたはさらには、化合物（例えば、本明細書に開示されるインヒビター、アクチベーター、およびインデューサー）ならびに細胞は、調合された細胞培養培地中に存在し得る。
有効量は、所望の効果をもたらす量である。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。インビトロ環境は、限定されないが、試験管および細胞培養物により例示される。
本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）、および自然環境内で生じるプロセスまたは反応、例えば胚発生、細胞分化、神経管形成などを指す。
遺伝子またはタンパク質に関して本明細書で使用される場合、「発現する」という用語は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどのアッセイを使用して観察され得るｍＲＮＡまたはタンパク質を作製すること指す。
本明細書で使用される場合、「マーカー」または「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞または細胞型、例えば星状細胞またはグリアコンピテント細胞（例えば、星状細胞前駆体）を特定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞のためのマーカーは、１種のマーカーに限定することができず、複数のマーカーは、マーカーの指定の群により、ある細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から同定することができるように、マーカーの「パターン」を指し得る。
本明細書で使用される場合、「から誘導された」または「から確立された」または「から分化した」という用語は、本明細書に開示される任意の細胞に関する場合、細胞系、組織中の親細胞（例えば、解離された胚、または体液）から、任意の操作、例えば限定されないが、単一細胞単離、インビトロ培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染を使用する処置および／または変異誘発、ＤＮＡ配列、例えばモルフォゲンなどを用いるトランスフェクション、培養した親細胞に含有されている任意の細胞の選択（例えば連続培養による）を使用して得られた（例えば、単離された、精製されたなど）細胞を指す。誘導された細胞は、成長因子、サイトカイン、サイトカイン処置の選択された進行、接着性、接着性の欠如、ソーティング手順などに対する応答に関して、混合集団から選択され得る。
本明細書の「個体」または「被験体」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物などの脊椎動物である。哺乳動物としては、限定されないが、ヒト、霊長類、家畜動物、スポーツ用動物、齧歯類およびペットが挙げられる。非ヒト動物被験体の非限定的な例としては、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどの齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに非ヒト霊長類、例えば類人猿およびサルが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、細胞、組織または臓器の正常な機能を損なうまたは妨害する任意の状態または障害を指す。
本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」という用語は、処置を受ける個体または細胞の疾患過程を変えるための臨床的な介入を指し、この処置は、予防のために、または臨床病理の過程中のいずれかに実施され得る。処置の治療効果としては、限定されないが、疾患の発生または再発の予防、症候の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の縮小、転移の予防、疾患進行速度の低下、病状の回復または緩和、および寛解または予後の改善が挙げられる。疾患または障害の進行を予防することにより、処置は、影響を受けているもしくは診断を受けた被験体、または障害を有することが疑われる被験体の障害に起因する悪化を予防することができ、障害の危険性がある、または障害を有すると疑われる被験体の障害または障害の症候の発症を予防することもできる。
本明細書で使用される場合、「分化日（differentiation day）」という用語は、幹細胞培養物を分化分子と接触させた後の、２４時間間隔を有するタイムライン（すなわち、日数）を指す。例えば、このような分子としては、限定されないが、ＳＭＡＤインヒビター分子およびＮＦＩＡアクチベーターが挙げられ得る。培養物を分子と接触させる日は、分化１日目と称される。例えば、分化２日目は、幹細胞培養物を分化分子と接触させた後の２４時間～４８時間の任意時点を表す。
５．２幹細胞の分化方法
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのインビトロ方法を提供する。特定の実施形態では、幹細胞はヒト幹細胞である。ヒト幹細胞の非限定的な例としては、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または系統特異的に分化することができる任意の他の細胞が挙げられる。特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。特定の実施形態では、幹細胞は、非ヒト幹細胞である。非ヒト幹細胞の非限定的な例、非ヒト霊長類幹細胞、齧歯類幹細胞、イヌ幹細胞、ネコ幹細胞。特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。特定の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞である。特定の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。特定の実施形態では、幹細胞は、限定されないが、哺乳動物幹細胞、霊長類幹細胞、または齧歯類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジなど由来の幹細胞を含む非ヒト幹細胞である。
本開示の主題は、幹細胞由来グリアコンピテント細胞（例えば、星状細胞前駆体）および星状細胞を提供する。特定の実施形態では、星状細胞への幹細胞の分化は、３つの段階：（ａ）ＮＳＣへの幹細胞のインビトロ分化、（ｂ）グリアコンピテント細胞（例えば、星状細胞前駆体）へのＮＳＣのインビトロ分化、および（ｃ）星状細胞へのグリアコンピテント細胞のインビトロ分化を含む。特定の実施形態では、幹細胞の集団をＮＳＣの集団にインビトロで分化させ、これをグリアコンピテント細胞の集団（例えば、星状細胞前駆体）にインビトロで分化させ、これを星状細胞の集団にインビトロでさらに分化させる。特定の実施形態では、ＳＭＡＤ阻害により、幹細胞からＮＳＣをインビトロで分化させる。特定の実施形態では、該方法は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の集団をＳＭＡＤシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビター（例えば、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つもしくはそれを超えるインヒビターおよび／または１つもしくはそれを超えるＢＭＰインヒビター）と接触させることを含む。特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞は星状細胞前駆体である。
特定の実施形態では、グリアコンピテンシーを誘導することにより、ＮＳＣからグリアコンピテント細胞をインビトロで分化させる。特定の実施形態では、グリアコンピテンシーの誘導は、細胞（例えば、ＳＭＡＤシグナリングの阻害により幹細胞から誘導されるＮＳＣ）におけるＮＦＩＡシグナリングを促進することにより達成される。特定の実施形態では、グリアコンピテンシーの誘導は、細胞（例えば、ＳＭＡＤシグナリングの阻害により幹細胞から誘導されるＮＳＣ）における細胞周期のＧ１期を延長することにより達成される。
特定の実施形態では、星状細胞分化を加速することにより、グリアコンピテント細胞から星状細胞をインビトロで分化させる。特定の実施形態では、星状細胞分化は、細胞（例えば、ＮＳＣから誘導されるグリアコンピテント細胞）におけるＮＦＩＡの発現を減少させることにより（例えば、細胞をＮＦＩＡシグナリングのインヒビターに曝露することにより）達成される。特定の実施形態では、星状細胞分化は、細胞（例えば、ＮＳＣから誘導されるグリアコンピテント細胞）をＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、１つもしくはそれを超えるその類似体および／または１つもしくはそれを超えるそのアクチベーターに曝露することにより達成される。
特定の実施形態では、星状細胞への幹細胞の分化は、２つの段階：（ａ）ＮＳＣへの幹細胞のインビトロ分化、および（ｂ）星状細胞へのＮＳＣのインビトロ分化を含む。特定の実施形態では、幹細胞の集団をＮＳＣの集団にインビトロで分化させ、これを星状細胞の集団にインビトロで分化させる。特定の実施形態では、星状細胞分化を誘導することにより、ＮＳＣから星状細胞をインビトロで分化させる。特定の実施形態では、星状細胞分化の誘導は、ＮＳＣ（例えば、ＳＭＡＤシグナリングの阻害により幹細胞から誘導されるＮＳＣ）の集団をウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に曝露することにより達成される。
本開示の主題はまた、幹細胞由来局所グリアコンピテント細胞および局所星状細胞を対象とする。特定の実施形態では、局所星状細胞への幹細胞の分化は、３つの段階：（ａ）局所パターン形成前駆体への幹細胞のインビトロ分化、（ｂ）局所グリアコンピテント細胞への局所パターン形成前駆体のインビトロ分化、および（ｃ）局所星状細胞への局所グリアコンピテント細胞のインビトロ分化または成熟を含む。特定の実施形態では、幹細胞の集団を局所パターン形成前駆体の集団にインビトロで分化させ、これを局所グリアコンピテント細胞の集団にインビトロで分化させ、これを局所星状細胞の集団にインビトロで分化させる。
特定の実施形態では、局所パターン形成前駆体は皮質前駆体であり、局所グリアコンピテント細胞は皮質グリアコンピテント細胞であり、局所星状細胞は皮質星状細胞である。
特定の実施形態では、局所パターン形成前駆体は脊髄前駆体であり、局所グリアコンピテント細胞は脊髄グリアコンピテント細胞であり、局所星状細胞は脊髄星状細胞である。
特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナリングの阻害（「Ｗｎｔインヒビター」と称される）により、幹細胞から皮質前駆体をインビトロで分化させる。特定の実施形態では、該方法は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の集団を１つまたはそれを超えるＷｎｔインヒビターに曝露することを含む。
特定の実施形態では、グリアコンピテンシーを誘導することにより、幹細胞から脊髄前駆体をインビトロで分化させる。特定の実施形態では、グリアコンピテンシーの誘導は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の集団を１つもしくはそれを超えるＲＡアクチベーターおよび／または１つもしくはそれを超えるＳＨＨアクチベーターに曝露することにより達成される。
特定の実施形態では、皮質前駆体におけるＮＦＩＡシグナリングを促進することにより、皮質前駆体から皮質グリアコンピテント細胞をインビトロで分化させる。特定の実施形態では、皮質前駆体における細胞周期のＧ１期を延長することにより、皮質前駆体から皮質グリアコンピテント細胞をインビトロで分化させる。
特定の実施形態では、星状細胞分化を加速することにより、皮質グリアコンピテント細胞から皮質星状細胞をインビトロで分化させる。特定の実施形態では、星状細胞分化は、皮質グリアコンピテント細胞におけるＮＦＩＡの発現を減少させる（または、細胞を１つもしくはそれを超えるＮＦＩＡインヒビターに曝露する）ことにより達成される。特定の実施形態では、星状細胞分化は、皮質グリアコンピテント細胞の集団をＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、１つもしくはそれを超えるその類似体および／または１つもしくはそれを超えるそのアクチベーターに曝露することにより達成される。
特定の実施形態では、グリアコンピテンシーを誘導することにより、脊髄前駆体から脊髄グリアコンピテント細胞をインビトロで分化させる。特定の実施形態では、グリアコンピテンシーの誘導は、脊髄前駆体におけるＮＦＩＡシグナリングを促進することにより達成される。特定の実施形態では、グリアコンピテンシーの誘導は、脊髄前駆体における細胞周期のＧ１期を延長することにより達成される。
特定の実施形態では、星状細胞分化を加速することにより、脊髄グリアコンピテント細胞から脊髄星状細胞をインビトロで分化させる。特定の実施形態では、星状細胞分化の加速は、脊髄グリアコンピテント細胞におけるＮＦＩＡの発現を減少させる（または、ＮＦＩＡインヒビターを接触させる）ことにより達成される。特定の実施形態では、星状細胞分化の加速は、脊髄グリアコンピテント細胞をＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、１つもしくはそれを超えるその類似体および／または１つもしくはそれを超えるそのアクチベーターに曝露することにより達成される。
５．２．１．星状細胞への幹細胞のインビトロ３段階分化
特定の実施形態では、星状細胞への幹細胞の分化は、３つの段階：（ａ）ＮＳＣへの幹細胞のインビトロ分化、（ｂ）グリアコンピテント細胞へのＮＳＣのインビトロ分化、および（ｃ）星状細胞へのグリアコンピテント細胞のインビトロ分化または成熟を含む。例えば、幹細胞を、１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカー（限定されないが、ＰＡＸ６、ネスチン、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＬＺＦ、ＺＯ－１、ＢＲＮ２を含む）を発現する細胞（例えば、ＮＳＣ）にインビトロで分化させ、これを、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する細胞（例えば、グリアコンピテント細胞、例えば星状細胞前駆体）にインビトロで分化させ、これを、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する細胞（例えば、星状細胞）へさらにインビトロで誘導する。
５．２．１．１．ＮＳＣへの幹細胞のインビトロ分化
特定の実施形態では、ＮＳＣ（例えば、ロゼット期神経幹細胞、例えばＬＴ－ＮＳＣ）への幹細胞の分化をインビトロで誘導する方法は、幹細胞の集団を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターと接触させることを含む。ＳＭＡＤインヒビターの非限定的な例としては、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングのインヒビターおよびＢＭＰインヒビターが挙げられる。
特定の実施形態では、本開示の分化方法は、幹細胞の集団を形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターで曝露し、それにより、ＳＭＡＤシグナリングを阻害することを含む。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングのインヒビターは、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、ノーダルおよびアクチビンを含むリガンドを中和するか、または受容体および下流エフェクターの遮断を介してそれらのシグナル経路を遮断する。ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングのインヒビターの非限定的な例は、国際公開第２０１０／０９６４９６号、国際公開第２０１１／１４９７６２号、国際公開第２０１３／０６７３６２号、国際公開第２０１４／１７６６０６号、国際公開第２０１５／０７７６４８号、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７，２７５－２８０（２００９）およびＣｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０，７１５－７２０（２０１２）（これらは、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる）に開示されている。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターは、ＳＢ４３１５４２、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される小分子である。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターはＳＢ４３１５４２を含む。
「ＳＢ４３１５４２」は、ＣＡＳ番号３０１８３６－４１－９、Ｃ２２Ｈ１８Ｎ４Ｏ３の分子式、および４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミドの名称を有する分子を指し、例えば、以下の構造：
Figure 2022180634000001
 を参照のこと。
特定の実施形態では、ＮＳＣ（例えば、ロゼット期神経幹細胞、例えばＬＴＮＳＣ）への幹細胞の分化をインビトロで誘導する方法は、幹細胞を１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと接触させ、それにより、ＳＭＡＤシグナリングを阻害することをさらに含む。ＢＭＰインヒビターの非限定的な例は、国際公開第２０１０／０９６４９６号、国際公開第２０１１／１４９７６２号、国際公開第２０１３／０６７３６２号、国際公開第２０１４／１７６６０６号、国際公開第２０１５／０７７６４８号、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７，２７５－２８０（２００９）およびＣｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０，７１５－７２０（２０１２）（これらは、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる）に開示されている。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターは、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される小分子である。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターはＬＤＮ１９３１８９を含む。
「ＬＤＮ１９３１８９」は、Ｃ２５Ｈ２２Ｎ６の化学式を有し、以下の式：
Figure 2022180634000002
 を有する４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリンのＩＵＰＡＣ名である小分子ＤＭ－３１８９を指す。
ＬＤＮ１９３１８９は、ＳＭＡＤシグナリングインヒビターとして機能することができる。ＬＤＮ１９３１８９はまた、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）であるＡＬＫ２、ＡＬＫ３およびＡＬＫ６の非常に強力な小分子インヒビターであり、Ｉ型ＴＧＦβ受容体のＡＬＫ１およびＡＬＫ３ファミリーのメンバーのシグナリングを阻害し、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７およびアクチビンサイトカインシグナルを含む複数の生物学的シグナルの伝達の阻害、続いてＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化をもたらす（Ｙｕら、（２００８）Ｎａｔ Ｍｅｄ
１４：１３６３－１３６９；Ｃｕｎｙら、（２００８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８：４３８８－４３９２（これらは、参照により本明細書に組み込まれる））。
ＮＳＣへの幹細胞のインビトロ分化のために、幹細胞をＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間または少なくとも約１５日間接触させ得る。特定の実施形態では、幹細胞をＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと最大約５日間、最大約６日間、最大約７日間、最大約８日間、最大約９日間、最大約１０日間、最大約１１日間、最大約１２日間、最大約１３日間、最大約１４日間または最大約１５日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞をＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと約５日間～約１５日間、約５日間～約１０日間または約１０日間～約１５日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞をＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと約１０日間～約１５日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞をＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間または約１５日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞をＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと約８日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞をＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと約１０日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞をＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと約１１日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞をＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと約１２日間接触させる。
ＮＳＣへの幹細胞のインビトロ分化のために、幹細胞を１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間または少なくとも約１５日間接触させ得る。特定の実施形態では、幹細胞を１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと最大約５日間、最大約６日間、最大約７日間、最大約８日間、最大約９日間、最大約１０日間、最大約１１日間、最大約１２日間、最大約１３日間、最大約１４日間または最大約１５日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと約５日間～約１５日間、約５日間～約１０日間または約１０日間～約１５日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと約１０日間～約１５日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間または約１５日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと約８日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと約１０日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと約１１日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと約１２日間接触させる。
特定の実施形態では、幹細胞を、約１μＭ～約１００μＭ、約１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約１５μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約５μＭ、約５μＭ～約１０μＭ、約５μＭ～約１５μＭ、約１５μＭ～約２０μＭ、約２０μＭ～約３０μＭ、約３０μＭ～約４０μＭ、約４０μＭ～約５０μＭ、約５０μＭ～約６０μＭ、約６０μＭ～約７０μＭ、約７０μＭ～約８０μＭ、約８０μＭ～約９０μＭまたは約９０μＭ～約１００μＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、約５μＭ～約１５μＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、約１０μＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、上記濃度のいずれか１つのＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと毎日、一日おきまたは２日ごとに接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、約１０μＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターと毎日接触させる。
特定の実施形態では、幹細胞を、約１ｎＭ～約３００ｎＭ、約５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１０ｎＭ～約５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１５０ｎＭ、約８０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約９０ｎＭ～約１１０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１００ｎＭ～約１５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約２００ｎＭ、約２００ｎＭ～約２５０ｎＭまたは約２５０ｎＭ～約３００ｎＭの濃度の１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、約８０ｎＭ～約１２０ｎＭの濃度の１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、約１００ｎＭの濃度の１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、上記濃度のいずれか１つの１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと毎日、一日おきまたは２日ごとに接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、約１００ｎＭの濃度の１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと毎日接触させる。
特定の実施形態では、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を、１つまたはそれを超える神経幹細胞（ＮＳＣ）マーカーを発現する少なくとも約１０％の（例えば、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれを超える）細胞を含む細胞集団を産生するための有効量のＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターおよび／または１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと接触させる。ＮＳＣマーカーの非限定的な例としては、ＰＡＸ６、ネスチン、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＬＺＦ、ＺＯ－１およびＢＲＮ２が挙げられる。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーは、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＰＬＺＦおよびＺＯ－１からなる群より選択される。
５．２．１．２．グリアコンピテント細胞へのＮＳＣのインビトロ分化
特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞へのＮＳＣの分化を誘導する方法は、ＮＳＣ（例えば、１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーを発現する細胞、例えば、セクション５．２．１．１に記載されている方法により得られる分化細胞）におけるＮＦＩＡシグナリングを促進して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を産生することを含む。
特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞へのＮＳＣの分化を誘導する方法は、ＮＳＣ（例えば、１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーを発現する細胞、例えば、セクション５．２．１．１に記載されている方法により得られる分化細胞）の細胞周期のＧ１期を延長して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を産生することを含む。
特定の実施形態では、ＮＳＣの細胞周期のＧ１期の延長は、ＮＳＣを１つまたはそれを超えるＧ１期を延長する化合物（例えば、オロモウシン）に曝露することを含む。特定の実施形態では、ＮＳＣの細胞周期のＧ１期の延長は、ＦＺＲ１（ＡＰＣＣＤＨ１としても公知）の発現を増加させることを含む。
特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞は星状細胞前駆体である。
特定の実施形態では、該方法は、細胞をＦＧＦシグナリングの１つもしくはそれを超えるアクチベーター（「ＦＧＦアクチベーター」）および／または１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と接触させることをさらに含む。
ＦＧＦアクチベーターの非限定的な例としては、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、それらの誘導体および混合物が挙げられる。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＦＧＦアクチベーターはＦＧＦ２である。
ＥＧＦファミリータンパク質の非限定的な例としては、ＥＧＦ、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）、エピレグリン（ＥＰＲ）、エピゲン（Epigen）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、ニューレグリン－１（ＮＲＧ１）、ニューレグリン－２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン－３（ＮＲＧ３）、ニューレグリン－４（ＮＲＧ４）およびそれらの混合物が挙げられる。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質はＥＧＦである。
５．２．１．２．１．ＮＦＩＡシグナリングの促進
特定の実施形態では、ＮＳＣにおけるＮＦＩＡシグナリングの促進は、ＮＳＣを１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターに曝露することを含む。特定の実施形態では、ＮＳＣにおけるＮＦＩＡシグナリングの促進は、ＮＦＩＡの発現を増加させることを含む。
特定の実施形態では、ＮＦＩＡアクチベーターはＮＦＩＡの上流アクチベーターである。特定の実施形態では、ＮＦＩＡの上流アクチベーターはＴＧＦβ１である。
特定の実施形態では、ＮＦＩＡの発現の増加は、ＮＦＩＡの過剰発現を誘導するようにＮＳＣを改変することを含む。特定の実施形態では、改変細胞は、組換えＮＦＩＡタンパク質、例えばＮＦＩＡ核酸（例えば、ＮＦＩＡ ｃＤＮＡ）を発現する。特定の実施形態では、ＮＦＩＡ核酸の発現は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。
特定の実施形態では、ＮＦＩＡ核酸は、レトロウイルスベクター、例えばガンマレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを使用して細胞に送達される。ヒト細胞を感染させるためにカプシドタンパク質が機能し得るレトロウイルスベクターおよび適切なパッケージング系の組み合わせが適切である。両種指向性ウイルス産生細胞系の非限定的な例としては、ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１－４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５－２９０２）；およびＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４６０－６４６４）が挙げられる。非両種指向性粒子も使用され得る。非両種指向性粒子の非限定的な例としては、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４またはＧＡＬＶエンベロープでシュードタイプ化された粒子および当技術分野で公知の任意の他のものが挙げられる。
形質導入方法の非限定的な例としては、産生細胞を用いた細胞培養（例えば、Ｂｒｅｇｎｉら、（１９９２）Ｂｌｏｏｄ ８０：１４１８－１４２２の方法による）、適切な成長因子およびポリカチオンの有りまたは無しでの、ウイルス上清のみまたは濃縮ベクターストックを用いた細胞培養（例えば、Ｘｕら、（１９９４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２２：２２３－２３０；およびＨｕｇｈｅｓら、（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１８１７の方法による）が挙げられる。あるいはまたは加えて、形質導入ウイルスベクターを使用して、ＮＦＩＡ核酸を細胞に送達し得る。特定の実施形態では、ベクターは、高い感染効率ならびに安定な組み込みおよび発現を示す。ウイルスベクターの非限定的な例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクター（adena-associated viral vector）、ワクシ
ニアウイルス、ウシパピローマウイルスまたはヘルペスウイルス（例えば、エプスタインバーウイルス）が挙げられる。
ＮＦＩＡ核酸を細胞に送達するために、非ウイルス的アプローチも用いられ得る。例えば、核酸分子は、リポフェクション、アシアロオロソムコイド－ポリリジンコンジュゲーションの存在下で核酸を投与することにより、または外科的条件下におけるマイクロインジェクションにより、ＮＳＣに導入され得る。遺伝子移入のための他の非ウイルス的手段としては、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーションおよびプロトプラスト融合を使用したインビトロトランスフェクションが挙げられる。リポソームもまた、細胞への核酸分子の送達に潜在的に有益であり得る。被験体の罹患組織への正常遺伝子の移植は、正常核酸をエクスビボで培養可能細胞型（例えば、自己または異種の初代細胞またはその後代（progeny））に移入することにより達成され得、その後、細胞（
またはその子孫（descendant））は標的組織に注射されるか、または全身注射される。
特定の実施形態では、ＮＦＩＡシグナリングの促進は、１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質への細胞の曝露と同時である。特定の実施形態では、１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質は両方とも、ＮＦＩＡシグナリングが促進されたかまたは促進されている細胞を含む細胞培養培地中に存在する。特定の実施形態では、ＮＦＩＡシグナリングの促進は、細胞を１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター（例えば、ＴＧＦβ１）に曝露することである。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター、１つまたはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質を、ＮＳＣを含む細胞培養培地に一緒に毎日（または一日おきまたは２日ごとに）添加する。
特定の実施形態では、ＮＳＣにおいて、ＮＦＩＡシグナリングを少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間もしくはそれを超えて；または最大約２日間、最大約３日間、最大約４日間、最大約５日間、最大約６日間、最大約７日間、最大約８日間、最大約９日間、最大約１０日間、最大約１１日間、最大約１２日間、最大約１３日間、最大約１４日間、最大約１５日間、最大約１６日間、最大約１７日間、最大約１８日間、最大約１９日間、最大約２０日間促進して（および必要に応じて、ＮＳＣを有効量の１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または有効量の１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質に曝露して）、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、ＮＳＣにおいて、ＮＦＩＡシグナリングを促進し、必要に応じて、ＮＳＣを有効量の１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または有効量の１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と約２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間接触させる。特定の実施形態では、ＮＳＣにおいて、ＮＦＩＡシグナリングを促進し、必要に応じて、ＮＳＣを有効量の１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または有効量の１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と約５日間接触させる。
特定の実施形態では、ＮＦＩＡシグナリングの促進は、細胞を１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターに曝露することである。特定の実施形態では、ＮＦＩＡアクチベーターはＮＦＩＡの上流アクチベーターである。特定の実施形態では、ＮＦＩＡの上流アクチベーターはＴＧＦβ１である。
特定の実施形態では、ＮＳＣを、約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ～２５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～７０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ～９０ｎｇ／ｍｌまたは約９０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターと接触させて、グリアコンピテントＮＳＣを産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター（例えば、ＴＧＦβ１）と接触させて、グリアコンピテントＮＳＣを産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＴＧＦβ１と接触させて、グリアコンピテントＮＳＣを産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、上記濃度のいずれか１つの１つまたはそれを超えるＴＧＦβ１と毎日、一日おきまたは２日ごとに接触させて、グリアコンピテントＮＳＣを産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター（例えば、ＴＧＦβ１）と毎日接触させて、グリアコンピテントＮＳＣを産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター（例えば、ＴＧＦβ１）と毎日接触させて、グリアコンピテントＮＳＣを産生する。
特定の実施形態では、ＮＳＣを１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター（例えば、ＴＧＦβ１）と少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間もしくはそれを超えて；および／または最大約５日間、最大約６日間、最大約７日間、最大約８日間、最大約９日間、最大約１０日間、最大約１１日間、最大約１２日間、最大約１３日間、最大約１４日間、最大約１５日間、最大約１６日間、最大約１７日間、最大約１８日間、最大約１９日間、最大約２０日間、最大約２１日間、最大約２２日間、最大約２３日間、最大約２４日間、最大約２５日間、最大約２６日間、最大約２７日間、最大約２８日間、最大約２９日間もしくは最大約３０日間接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、ＮＳＣを有効量の１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター（例えば、ＴＧＦβ１）と約５日間～約１５日間、または約１０日間～約２０日間接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、ＮＳＣを有効量の１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター（例えば、ＴＧＦβ１）と約５日間（例えば、約７日間）接触させて、グリアコンピテントＮＳＣを産生する。特定の実施形態では、ＮＳＣを有効量の１つまたはそれを超えるＴＧＦβ１と約１５（例えば、約１４）日間接触させて、グリアコンピテントＮＳＣを産生する。
特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ～２５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～７０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ～９０ｎｇ／ｍｌまたは約９０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＦＧＦアクチベーターと接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＦＧＦアクチベーターと接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＦＧＦアクチベーターと接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、上記濃度のいずれか１つの１つまたはそれを超えるＦＧＦアクチベーターと毎日、一日おきまたは２日ごとに接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＦＧＦアクチベーターと毎日接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＦＧＦアクチベーターと毎日接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。
特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ～２５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～７０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ～９０ｎｇ／ｍｌまたは約９０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約５ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、上記濃度のいずれか１つの１つまたはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と毎日、一日おきまたは２日ごとに接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と毎日接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と毎日接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。
特定の実施形態では、少なくとも約１０％（例えば、約５０％）のＮＳＣ（例えば、１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーを発現する細胞）を含む細胞集団は、細胞におけるＮＦＩＡシグナリングを促進し、細胞を１つのＦＧＦアクチベーター（例えば、ＦＧＦ２、例えば１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２）および１つのＥＧＦファミリータンパク質（例えば、ＥＧＦ、例えば１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ）に曝露することにより、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の細胞を含む細胞集団に分化する。特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター（例えば、ＴＦＧβ１、例えば１０ｎｇ／ｍＬ ＴＦＧβ１）に約５～約２０日間、１つのＦＧＦアクチベーター（例えば、ＦＧＦ２、例えば１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２）および１つのＥＧＦファミリータンパク質（例えば、ＥＧＦ、例えば１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ）に曝露することにより、少なくとも約１０％（例えば、約５０％）のＮＳＣ（例えば、１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーを発現する細胞）を含む細胞集団を、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の細胞を含む細胞集団に分化させる。
特定の実施形態では、ＮＦＩＡシグナリングの促進は、複数の細胞における１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカー（限定されないが、ＣＤ４４、ＡＱＰ４、ＳＯＸ２および／またはネクチンを含む）の検出可能レベルの増加をもたらす。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれより多くは、検出可能レベルのＣＤ４４、ＡＱＰ４、ＳＯＸ２および／またはネクチンを発現する。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約９９％またはそれより多くは検出可能レベルのＣＤ４４を発現し、少なくとも約１０％は検出可能レベルのＡＱＰ４を発現する。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する分化細胞は、検出可能レベルの１つまたはそれを超えるニューロンマーカー（例えば、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２およびＤＣＸ）を発現しない。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターへのＮＳＣの曝露は、複数の細胞における１つまたはそれを超える星状細胞マーカー（限定されないが、ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ、ＳＯＸ９、ＧＬＴ－１、ＣＳＲＰ１およびＮＦＩＡを含む）の検出可能な発現レベルを増加させるために有効な期間にわたって中断されるかまたは減少する。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより多くは、検出可能レベルの１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約５０％またはそれより多くは、検出可能レベルの１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターへのＮＳＣの曝露は、複数の細胞におけるＳＯＸ２、ネスチンまたはその両方の検出可能な発現レベルを減少させるために有効な期間にわたって中断されるかまたは減少する。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより多くは、検出可能レベルのＳＯＸ２、ネスチンまたはその両方を発現しない。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約５０％またはそれより多くは、検出可能レベルのＳＯＸ２、ネスチンまたはその両方を発現しない。
特定の実施形態では、前記有効な期間は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間；または最大約１日間、最大約２日間、最大約３日間、最大約４日間、最大約５日間、最大約６日間、最大約７日間、最大約８日間、最大約９日間もしくは最大約１０日間である。特定の実施形態では、有効な期間は約５日間である。
特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターと少なくともまたは最大約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはそれを超えて接触させた後、ＮＦＩＡの発現レベル（または機能活性）は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％減少する。
５．２．１．２．２．細胞周期のＧ１期の延長
特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞へのＮＳＣの分化を誘導するための方法は、ＮＳＣの細胞周期のＧ１期を延長することを含む。特定の実施形態では、ＮＳＣの細胞周期のＧ１期の延長は、ＮＳＣを１つまたはそれを超えるＧ１期を延長する化合物に曝露することを含む。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＧ１期を延長する化合物は小分子化合物である。特定の実施形態では、小分子化合物は、インビトロでＧ１タイミングを延長することが公知のオロモウシン（Ｏｌｏ）である３６。
特定の実施形態では、ＮＳＣの細胞周期のＧ１期の延長は、ＦＺＲ１（ＡＰＣＣＤＨ１としても公知）の発現を増加させることを含む。特定の実施形態では、ＦＺＲ１の発現の増加は、ＦＺＲ１の過剰発現を誘導するようにＮＳＣを改変することを含む。特定の実施形態では、改変細胞は、組換えＦＺＲ１タンパク質、例えばＦＺＲ１核酸（例えば、ＦＺＲ１ ｃＤＮＡ）を発現し、ここで、前記ＦＺＲ１核酸の発現は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。ＦＺＲ１核酸は、当技術分野で公知の任意の方法およびセクション５．２．１．２．１に開示されている方法を使用して、ＮＳＣに送達され得る。
特定の実施形態では、１つもしくはそれを超えるＧ１期を延長する化合物、１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質はすべて、ＮＳＣを含む細胞培養培地中に存在する。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＧ１期を延長する化合物、１つまたはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質を、ＮＳＣ（例えば、１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーを発現する細胞、例えば、幹細胞の集団を１つまたはそれを超えるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングおよび必要に応じて１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターと接触させた後の分化細胞）を含む細胞培養培地に一緒に毎日（または一日おきもしくは２日ごとに）添加する。
特定の実施形態では、ＮＳＣを１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質とさらに接触させる。特定の実施形態では、ＮＳＣを１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間もしくはそれを超えて；または最大約１２日間、最大約１３日間、最大約１４日間、最大約１５日間、最大約１６日間、最大約１７日間、最大約１８日間、最大約１９日間、最大約２０日間もしくはそれを超えて接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、ＮＳＣを１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日間接触させる。特定の実施形態では、ＮＳＣを１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と約１０日間～約２０日間、例えば約１０日間～約１５日間接触させる。特定の実施形態では、ＮＳＣを１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と約１２日間接触させる。特定の実施形態では、ＮＳＣを１つもしくはそれを超えるＦＧＦアクチベーターおよび／または１つもしくはそれを超えるＥＧＦファミリータンパク質と約１５日間接触させる。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１０ｕＭ～約５００μＭ、約１０μＭ～約４００μＭ、約１０μＭ～約３００μＭ、約１０μＭ～約２００μＭ、約２０μＭ～約５００μＭ、約２０μＭ～約４００μＭ、約２０μＭ～約３００μＭ、約２０μＭ～約２００μＭ、約３０μＭ～約５００μＭ、約３０μＭ～約４００μＭ、約３０μＭ～約３００μＭ、約３０μＭ～約２００μＭ、約４０μＭ～約５００μＭ、約４０μＭ～約４００μＭ、約４０μＭ～約３００μＭ、約４０μＭ～約２００μＭ、約５０μＭ～約５００μＭ、約５０μＭ～約４００μＭ、約５０μＭ～約３００μＭ、約５０μＭ～約２００μＭの濃度の有効量の１つまたはそれを超えるＧ１期を延長する化合物（例えば、Ｏｌｏ）と接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１１０μＭ～約１５０μＭの濃度の有効量の１つまたはそれを超えるＧ１期を延長する化合物（例えば、Ｏｌｏ）と接触させて、グリアコンピテントＮＳＣを産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１００μＭの濃度の有効量の１つまたはそれを超えるＧ１期を延長する化合物（例えば、Ｏｌｏ）と接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＧ１期を延長する化合物はオロモウシンである。
特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を有効量の１つまたはそれを超えるＧ１期を延長する化合物（例えば、Ｏｌｏ）と約２日間または４８日間以下、例えば約１８時間以下、約２４時間以下、約３６時間以下接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、上記濃度のいずれか１つの有効量の１つまたはそれを超えるＧ１期を延長する化合物と毎日、一日おきまたは２日ごとに接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。特定の実施形態では、細胞（例えば、ＮＳＣ）を、約１００μＭの濃度の有効量の１つまたはそれを超えるＧ１期を延長する化合物と毎日接触させて、グリアコンピテント細胞を産生する。
セクション５．２．１．２．１に開示されているＦＧＦアクチベーターおよびＥＧＦファミリータンパク質はいずれも、本明細書で使用され得る。
特定の実施形態では、ＮＳＣの細胞周期のＧ１期を延長し、細胞を１つのＦＧＦアクチベーター（例えば、ＦＧＦ２、例えば１０ｎＭ ＦＧＦ２）および１つのＥＧＦファミリータンパク質（例えば、ＥＧＦ、例えば１０ｎＭ ＥＧＦ）に約１２日間曝露することにより、少なくとも約１０％（例えば、約５０％）のＮＳＣ（例えば、１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーを発現する細胞）を含む細胞集団を、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％（例えば、約５０％）の細胞を含む細胞集団に分化させる。特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＧ１期延長分子（例えば、オロモウシン、例えば１００μＭオロモウシン）に約２日間以下曝露し、細胞を１つのＦＧＦアクチベーター（例えば、ＦＧＦ２、例えば１０ｎＭ ＦＧＦ２）および１つのＥＧＦファミリータンパク質（例えば、ＥＧＦ、例えば１０ｎＭ ＥＧＦ）に約１２日間曝露することにより、少なくとも約１０％（例えば、約５０％）のＮＳＣ（例えば、１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーを発現する細胞）を含む細胞集団を、１つのグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％（例えば、約５０％）の細胞を含む細胞集団に分化させる。
５．２．１．３．星状細胞へのグリアコンピテントＮＳＣのインビトロ分化
グリアコンピテント細胞を星状細胞にインビトロでさらに分化させ得る。グリアコンピテントグリアコンピテント細胞を、星状細胞へのグリアコンピテント細胞の分化に有利に働く条件に供し得る。
特定の実施形態では、該方法は、細胞を１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターに約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはそれを超えて曝露した後、（例えば、ＮＦＩＡインヒビターとの接触またはＮＦＩＡ発現レベルの減少により）１つまたはそれを超えるＮＩＦＡアクチベーターへの細胞の曝露を中断し、中止し、阻害しおよび／または減少させることを含む。特定の実施形態では、約５日間または約８日間の曝露期間後、１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターとの接触を中断しまたは減少させる。
特定の実施形態では、星状細胞へのグリアコンピテント細胞の分化に有利に働く条件は、細胞を有効量のＬＩＦ（１つまたはそれを超えるその誘導体、類似体および／またはアクチベーター）に曝露して、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーの検出可能レベルを増加させることを含む。特定の実施形態では、細胞をＬＩＦに少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間もしくはそれを超えて；または最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間もしくはそれを超えて接触させる。特定の実施形態では、細胞をＬＩＦに約７、８、９または１０日間曝露する。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターへの細胞の曝露の後、またはそれと同時に、細胞をＬＩＦに曝露する。特定の実施形態では、ＬＩＦへの細胞の初期曝露は、１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターへの細胞の初期曝露から約１、２、３、４または５日間である。
特定の実施形態では、星状細胞およびその前駆体への幹細胞の分化を誘導するためのインビトロ方法は、幹細胞の集団を有効量の（ｉ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つもしくはそれを超えるインヒビターおよび／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングの１つもしくはそれを超えるインヒビター、（ｉｉ）１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター、ならびに（ｉｉｉ）ＬＩＦ（１つまたはそれを超えるその誘導体、類似体および／またはアクチベーター）に曝露することを含む。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターへの細胞の初期曝露は、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つもしくはそれを超えるインヒビターおよび／またはＢＭＰシグナリングの１つもしくはそれを超えるインヒビターへの細胞の初期曝露から少なくとも約８日間である。特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターに最大約８日間曝露する。特定の実施形態では、ＬＩＦ（１つまたはそれを超えるその誘導体、類似体および／またはアクチベーター）への細胞の初期曝露は、１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーターへの細胞の初期曝露から少なくとも約２日間または少なくとも約５日間である。
特定の実施形態では、幹細胞をＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つもしくはそれを超えるインヒビターおよび／またはＢＭＰシグナリングの１つもしくはそれを超えるインヒビターと接触させる日は０日目に対応する。
特定の実施形態では、該方法は、分化細胞の前記集団を、星状細胞の集団への前記細胞の成熟を促す条件に供することをさらに含む。特定の実施形態では、成熟を促す条件は、適切な細胞培養培地中で細胞を培養することを含む。特定の実施形態では、適切な細胞培養培地は、ニューロベーサル（ＮＢ）培地またはＮ２培地を含む。特定の実施形態では、適切な細胞培養培地は、Ｌ－グルタミンおよびＢ２７（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）が補充されたＮＢ培地である。
Ｎ２サプリメントは、培養液中の未分化神経幹細胞および前駆細胞の拡大に使用される化学的に定義された動物質を含まない（animal-free）サプリメントである。Ｎ２サプリ
メントは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と共に使用するためのものである。Ｎ２培地の成分は、国際公開第２０１１／１４９７６２号に開示されている。特定の実施形態では、Ｎ２培地は、グルコース、重炭酸ナトリウム、プトレシン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリンおよびインスリンが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む。特定の実施形態では、１リットルのＮ２培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２粉末、１．５５ｇのグルコース、２．００ｇの重炭酸ナトリウム、プトレシン（１．６１ｇを１００ｍＬの蒸留水に溶解させたものの１００ｕＬアリコート）、プロゲステロン（０．０３２ｇを１００ｍＬの１００％エタノールに溶解させたものの２０ｕＬアリコート）、亜セレン酸ナトリウム（蒸留水中０．５ｍＭ溶液の６０ｕＬアリコート）、１００ｍｇのトランスフェリン、および１０ｍＬの５ｍＭ ＮａＯＨ中２５ｍｇのインスリンを含む９８５ｍｌの蒸留水（dist.Ｈ２Ｏ）を含む。
５．２．２ ＦＢＳを使用した星状細胞への幹細胞のインビトロ分化の方法
特定の実施形態では、星状細胞への幹細胞の分化は、２つの段階：（ａ）ＮＳＣへの幹細胞のインビトロ分化、および（ｂ）星状細胞へのＮＳＣのインビトロ分化を含む。特定の実施形態では、幹細胞の集団をＮＳＣの集団にインビトロで分化させ、これを星状細胞の集団にインビトロで分化させる。特定の実施形態では、星状細胞分化を誘導することにより、ＮＳＣから星状細胞をインビトロで分化させる。特定の実施形態では、星状細胞分化の誘導は、ＮＳＣ（例えば、ＳＭＡＤシグナリングの阻害により幹細胞から誘導されるＮＳＣ）の集団をウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に曝露することにより達成される。
特定の実施形態では、本明細書のセクション５．２．１．１に開示されている方法を使用して、幹細胞をＮＳＣに分化させる。
特定の実施形態では、星状細胞へのＮＳＣの分化を誘導するための方法は、細胞を有効量のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に曝露することを含む。特定の実施形態では、ＦＢＳは、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％ＦＢＳの濃度で細胞に曝露される組成物中にある。特定の実施形態では、複数の細胞における１つまたはそれを超える星状細胞マーカーの検出可能な発現レベルを増加させるために十分な期間にわたって、細胞をＦＢＳに曝露させる。星状細胞マーカーの非限定的な例としては、ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ、ＧＬＴ－１およびＣＳＲＰ１が挙げられる。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより多くは、検出可能レベルの１つまたはそれを超える星状細胞マーカー（例えば、ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ、ＳＯＸ９ ＧＬＴ－１、ＣＳＲＰ１および／またはＮＦＩＡ）を発現する。特定の実施形態では、複数の細胞におけるＳＯＸ２、ネスチンまたはその両方の検出可能な発現レベルを減少させるために十分な期間にわたって、細胞をＦＢＳに曝露する。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより多くは、検出可能レベルのＳＯＸ２、ネスチンまたはその両方を発現しない。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約５０％またはそれより多くは、検出可能レベルのＳＯＸ２、ネスチンまたはその両方を発現しない。
特定の実施形態では、細胞を、ＦＢＳを含む組成物であって、ＥＧＦおよび／またはＦＧＦ２を含まない組成物に曝露する。
特定の実施形態では、前記十分な／有効な期間は、少なくともまたは最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間であるかまたはそれを超える。
５．３ 局所星状細胞への幹細胞のインビトロ分化
本開示の主題はまた、幹細胞を局所星状細胞に分化させるための方法を提供する。特定の実施形態では、局所星状細胞への幹細胞の分化は、３つの段階：（ａ）局所パターン形成前駆体への幹細胞のインビトロ分化、（ｂ）局所グリアコンピテント細胞への局所パターン形成前駆体のインビトロ分化、および（ｃ）局所星状細胞への局所グリアコンピテント細胞のインビトロ分化または成熟を含む。特定の実施形態では、幹細胞を局所パターン形成前駆体にインビトロで分化させ、これを局所グリアコンピテント細胞にインビトロで分化させ、これを局所星状細胞にさらにインビトロで分化させる。特定の実施形態では、局所パターン形成前駆体は皮質前駆体であり、局所グリアコンピテント細胞は皮質グリアコンピテント細胞であり、局所星状細胞は皮質星状細胞である。特定の実施形態では、局所パターン形成前駆体は脊髄前駆体であり、局所グリアコンピテント細胞は脊髄グリアコンピテント細胞であり、局所星状細胞は脊髄星状細胞である。
５．３．１．皮質星状細胞への幹細胞のインビトロ分化
特定の実施形態では、皮質前駆体への幹細胞のインビトロ分化の方法は、幹細胞を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビター（例えば、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つもしくはそれを超えるインヒビターおよび／または１つもしくはそれを超えるＢＭＰインヒビター）と接触させること、および細胞をＷｎｔシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビター（「Ｗｎｔインヒビター」と称される）と接触させて、１つまたはそれを超える皮質前駆体マーカーを発現する少なくとも約１０％の細胞を含む細胞集団を得ることを含む。皮質前駆体マーカーの非限定的な例としては、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ネスチンおよびＴＢＲ２が挙げられる。
セクション５．２．１．１に開示されているＳＭＡＤインヒビターはいずれも、これらの方法において使用され得る。
Ｗｎｔインヒビターの非限定的な例としては、ＸＡＶ９３９、タンキラーゼインヒビター（例えば、Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ４６１，６１４－６２０（２００９）に開示されているもの）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）タンパク質、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）、ＩＷＲ（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５（２）：１００－１０７（２００９）；およびＫｕｌａｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４；３５（１４）：２４２５－３５（２０１５）に開示されているもの）、２，４－ジアミノ－キナゾリン（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ，１；１９（１７）：４９８０－３（２００９）に開示されている）、ＩＷＰ（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｆｅｂ；５（２）：１００－７に開示されている）、ＬＧＫ９７４、Ｃ５９（例えば、Ｐｒｏｆｆｉｔｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３ Ｊａｎ １５；７３（２）：５０２－７に開示されている）、Ａｎｔ１．４Ｂｒ／Ａｎｔ １．４Ｃｌ（例えば、Ｍｏｒｒｅｌｌら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００８ Ａｕｇ １３；３（８）：ｅ２９３０に開示されている）、ニクロサミド（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００９ Ｎｏｖ ３；４８（４３）：１０２６７－７４に開示されている）、アピクラレンおよびバフィロマイシン（例えば、Ｃｒｕｃｉａｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０ Ｊａｎ ２２；３２７（５９６４）：４５９－６３に開示されている）、Ｇ００７－ＬＫおよびＧ２４４－ＬＭ（例えば、Ｌａｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３ Ｍａｙ １５；７３（１０）：３１３２－４４に開示されている）、ピルビニウム（例えば、Ｔｈｏｒｎｅら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｎｏｖ；６（１１）：８２９－３６に開示されている）、ＮＳＣ６６８０３６（例えば、Ｓｈａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５ Ｎｏｖ
２９；４４（４７）：１５４９５－５０３に開示されている）、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ（例えば、Ｐａｒｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００５ Ｍａｒ ４；３２８（１）：２２７－３４に開示されている）、ＩＣＧ－００１（例えば、Ｅｍａｍｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００４ Ａｕｇ ２４；１０１（３４）：１２６８２－７に開示されている）、ＰＫＦ１１５－５８４（例えば、Ｌｅｐｏｕｒｃｅｌｅｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２００４ Ｊａｎ；５（１）：９１－１０２に開示されている）、ＢＣ２０５９（例えば、Ｆｉｓｋｕｓら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１５ Ｊｕｎ；２９（６）：１２６７－７８に開示されている）、Ｓｈｉｚｏｋａｏｌ Ｄ（例えば、Ｔａｎｇら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１６ Ｍａｒ ２４；１１（３）：ｅ０１５２０１２に開示されている）、２０１７年１月２７日に出願された国際公開第２０１７／１３２５９６号に記載されているＷｎｔシグナリングインヒビター、２０１４年４月２８日に出願された国際公開第２０１４／１７６６０６号に記載されているＷｎｔインヒビター（これらは、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる）、それらの誘導体およびそれらの混合物が挙げられる。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＷｎｔインヒビターはＸＡＶ９３９を含む。
特定の実施形態では、ＸＡＶ９３９は、化学式Ｃ１４Ｈ１１Ｆ３Ｎ２ＯＳを有する３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オンである。特定の実施形態では、ＸＡＶ９３９は、以下の構造：
Figure 2022180634000003
 を有する。
幹細胞を皮質前駆体に分化させる方法は、国際公開第２０１７／１３２５９６号（これは、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている任意の方法であり得る。
特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビター（例えば、ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルインヒビターおよびＢＭＰインヒビター）および１つまたはそれを超えるＷｎｔインヒビターと少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０日間またはそれを超えて接触させて、１つまたはそれを超える皮質前駆体マーカーを発現する少なくとも約１０％の細胞を含む細胞集団を得る。特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビター（例えば、ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルインヒビターおよびＢＭＰインヒビター）および１つまたはそれを超えるＷｎｔインヒビターと約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０日間もしくはそれを超えておよび／または最大約４、最大約５、最大約６、最大約７、最大約８、最大約９、最大約１０、最大約１１、最大約１２、最大約１３、最大約１４、最大約１５、最大約１６、最大約１７、最大約１８、最大約１９、最大約２０日間もしくはそれを超えて接触させて、１つまたはそれを超える皮質前駆体マーカーを発現する少なくとも約１０％の細胞を含む細胞集団を得る。特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビター（例えば、ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルインヒビターおよびＢＭＰインヒビター）および１つまたはそれを超えるＷｎｔインヒビターと約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはそれを超えて接触させて、１つまたはそれを超える皮質前駆体マーカーを発現する少なくとも約１０％の細胞を含む細胞集団を得る。
特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターと接触させる日は０日目に対応し、０～５日目、０～６日日目または０～７日目に、細胞をインヒビター（すなわち、１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターおよび１つまたはそれを超えるＷｎｔインヒビター）と接触させる。
特定の実施形態では、細胞を、約１～２０μＭ、約２～１８μＭ、約４～１６μＭ、約６～１４μＭ、約８～１２μＭまたは約１０μＭの濃度の１つまたはそれを超えるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約１～１８μＭ、約１～１６μＭ、約１～１４μＭ、約１～１２μＭ、約１～１０μＭ、約１～８μＭ、約１～６μＭ、約１～４μＭまたは約１～２μＭの濃度の１つまたはそれを超えるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約２～２０μＭ、約４～２０μＭ、約６～２０μＭ、約８～２０μＭ、約１０～２０μＭ、約１２～２０μＭ、約１４～２０μＭ、約１６～２０μＭまたは約１８～２０μＭの濃度の１つまたはそれを超えるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルインヒビターと接触させる。
特定の実施形態では、細胞を、約１０～５００ｎＭ、約２５～４７５ｎＭ、約５０～４５０ｎＭ、約１００～４００ｎＭ、約１５０～３５０ｎＭ、約２００～３００ｎＭまたは約２５０ｎＭまたは約１００ｎＭまたは約５０ｎＭの濃度の１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約１０～４７５ｎＭ、約１０～４５０ｎＭ、約１０～４００ｎＭ、約１０～３５０ｎＭ、約１０～３００ｎＭ、約１０～２５０ｎＭ、約１０～２００ｎＭ、約１０～１５０ｎＭ、約１０～１００ｎＭまたは約１０～５０ｎＭの濃度の１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約２５～５００ｎＭ、約５０～５００ｎＭ、約１００～５００ｎＭ、約１５０～５００ｎＭ、約２００～５００ｎＭ、約２５０～５００ｎＭ、約３００～５００ｎＭ、約３５０～５００ｎＭ、約４００～５００ｎＭまたは約４５０～５００ｎＭの濃度の１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと接触させる。
特定の実施形態では、細胞を、約０．１～１０μＭ、約０．５～８μＭ、約１～６μＭ、約２～５．５μＭまたは約５μＭまたは約２μＭ．または約１μＭの濃度の１つまたはそれを超えるＷｎｔインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約０．１～８μＭ、約０．１～６μＭ、約０．１～４μＭ、約０．１～２μＭ、約０．１～１μＭまたは約０．１～０．５μＭの濃度の１つまたはそれを超えるＷｎｔインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約０．５～１０μＭ、約１～１０μＭ、約２～０μＭ、約４～１０μＭ、約６～１０μＭまたは約８～１０μＭの濃度の１つまたはそれを超えるＷｎｔインヒビターと接触させる。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターと同時に、細胞を１つまたはそれを超えるＷｎｔインヒビターに曝露する。特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＷｎｔインヒビターに少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間またはそれを超えて曝露する。
例えばセクション５．２．１．２に開示されている方法により、皮質前駆体を皮質グリアコンピテント細胞にさらに分化させ得る。例えばセクション５．２．１．３に開示されている方法により、皮質グリアコンピテント細胞を皮質星状細胞にさらに分化させ得る。５．３．２．脊髄星状細胞への幹細胞のインビトロ分化
特定の実施形態では、脊髄前駆体への幹細胞のインビトロ分化の方法は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビター（例えば、１つもしくはそれを超えるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルインヒビターおよび／または１つもしくはそれを超えるＢＭＰインヒビター）、レチノイン酸（「ＲＡ」）シグナリングの１つまたはそれを超えるアクチベーター（「ＲＡアクチベーター」と称される）およびソニックヘッジホッグシグナリングの１つまたはそれを超えるアクチベーター（「ＳＨＨアクチベーター」と称される）と接触させて、１つまたはそれを超える脊髄前駆体マーカーを発現する少なくとも約１０％の細胞を含む細胞集団を得ることを含む。ＲＡアクチベーターの非限定的な例としては、ＲＡ、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチナート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、２０１６年１２月２２日に出願された国際公開第２０１７／１１２９０１号に開示されているものが挙げられる）。
本明細書で使用される場合、「ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨまたはＳｈｈ）」という用語（ｔｅｅｎ）は、ヘッジホッグと称される哺乳動物シグナル伝達経路ファミリーの少なくとも３つのタンパク質の１つであるタンパク質を指し、別のものはデザートヘッジホッグ（ＤＨＨ）であり、第３のものはインディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）である。ＳＨＨは、膜貫通分子Ｐａｔｃｈｅｄ（ＰＴＣ）およびＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）と相互作用することにより、少なくとも２つの膜貫通タンパク質と相互作用する。典型的には、ＳＨＨはＰＴＣに結合し、次いで、これがシグナルトランスデューサーとしてのＳＭＯの活性化を可能にする。ＳＨＨの非存在下では、典型的には、ＰＴＣはＳＭＯを阻害し、次にこれが転写リプレッサーを活性化するので、特定の遺伝子の転写は起こらない。ＳＨＨが存在し、ＰＴＣに結合する場合、ＰＴＣはＳＭＯの機能に干渉し得ない。ＳＭＯが阻害されない場合、特定のタンパク質が核に入り、転写因子として作用して、特定の遺伝子の活性化を可能にする（Ｇｉｌｂｅｒｔ，２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．：Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照のこと）。
ＳＨＨアクチベーターの非限定的な例としては、ＰＴＣに結合する分子、ＳＭＯに結合する分子が挙げられる。ＰＴＣに結合する分子の非限定的な例としては、ＳＨＨ、組換えＳＨＨ（例えば、Ｎ末端ＳＨＨ、例えばＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ、ＳＨＨ Ｃ２４ＩＩ）が挙げられる。ＳＭＯに結合する分子の非限定的な例としては、ＳＭＯアゴニスト（例えば、プルモルファミン）が挙げられる。本明細書で使用される場合、「ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ」という用語は、ＳＨＨを活性化するためにＳＨＨ受容体に結合することができる完全長マウスソニックヘッジホッグタンパク質の組換えＮ末端断片を指し、一例は、Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ：４６４－５Ｈ－０２５／ＣＦである。
本明細書で使用される場合、「プルモルファミン」という用語は、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの標的化を含むヘッジホッグ経路を活性化するプリン誘導体、例えばＣＡＳ番号：４８３３６７－１０－８を指す。一例については、以下の構造を参照のこと。
Figure 2022180634000004
特定の実施形態では、プルモルファミンは、Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）プルモルファミン，Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．，Ｕｎｉｔｅｄ
Ｓｔａｔｅｓである。２０１２年１１月２日に出願された国際公開２０１３／０６７３６２号に開示されている任意のＳＨＨアクチベーターが本明細書に記載される方法において使用され得る。
脊髄前駆体マーカーの非限定的な例、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ネスチンおよびＴＢＲ２。
特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビター（例えば、１つもしくはそれを超えるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルインヒビターおよび／または１つもしくはそれを超えるＢＭＰインヒビター）、１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＳＨＨアクチベーターと少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０日間もしくはそれを超えて、および／または最大約１、最大約２、最大約３、最大約４、最大約５、最大約６、最大約７、最大約８、最大約９、最大約１０、最大約１１、最大約１２、最大約１３、最大約１４、最大約１５、最大約１６、最大約１７、最大約１８、最大約１９、最大約２０日間もしくはそれを超えて接触させて、１つまたはそれを超える脊髄前駆体マーカーを発現する少なくとも１０％の細胞を含む細胞集団を得る。特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビター、１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＳＨＨアクチベーターと約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはそれを超えて接触させる。
特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターと接触させる日は０日目に対応し、１～１２日目に、細胞を１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビター、１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＳＨＨアクチベーターと接触させる。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターと同時に、細胞を１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＳＨＨアクチベーターに曝露する。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＳＨＨアクチベーターへの細胞の初期曝露は、１つまたはそれを超えるＳＭＡＤインヒビターへの細胞の初期曝露から約１、２、３、４、５日間であるかまたはそれを超える。
特定の実施形態では、細胞を１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＳＨＨアクチベーターに少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間またはそれを超えて曝露する。
特定の実施形態では、細胞を、約１～２０μＭ、約２～１８μＭ、約４～１６μＭ、約６～１４μＭ、約８～１２μＭまたは約１０μＭの濃度の１つまたはそれを超えるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約１～１８μＭ、約１～１６μＭ、約１～１４μＭ、約１～１２μＭ、約１～１０μＭ、約１～８μＭ、約１～６μＭ、約１～４μＭまたは約１～２μＭの濃度の１つまたはそれを超えるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約２～２０μＭ、約４～２０μＭ、約６～２０μＭ、約８～２０μＭ、約１０～２０μＭ、約１２～２０μＭ、約１４～２０μＭ、約１６～２０μＭまたは約１８～２０μＭの濃度の１つまたはそれを超えるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルインヒビターと接触させる。
特定の実施形態では、細胞を、約１０～５００ｎＭ、約２５～４７５ｎＭ、約５０～４５０ｎＭ、約１００～４００ｎＭ、約１５０～３５０ｎＭ、約２００～３００ｎＭまたは約２５０ｎＭまたは約１００ｎＭまたは約５０ｎＭの濃度の１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約１０～４７５ｎＭ、約１０～４５０ｎＭ、約１０～４００ｎＭ、約１０～３５０ｎＭ、約１０～３００ｎＭ、約１０～２５０ｎＭ、約１０～２００ｎＭ、約１０～１５０ｎＭ、約１０～１００ｎＭまたは約１０～５０ｎＭの濃度の１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約２５～５００ｎＭ、約５０～５００ｎＭ、約１００～５００ｎＭ、約１５０～５００ｎＭ、約２００～５００ｎＭ、約２５０～５００ｎＭ、約３００～５００ｎＭ、約３５０～５００ｎＭ、約４００～５００ｎＭまたは約４５０～５００ｎＭの濃度の１つまたはそれを超えるＢＭＰインヒビターと接触させる。
特定の実施形態では、細胞を、約０．１～１０μｇ／ｍｌ、約０．１～５μｇ／ｍｌ、約０．１～４μｇ／ｍｌ、約０．１～３μｇ／ｍｌ、約０．１～２μｇ／ｍｌ、約０．１～１μｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーター（例えば、ＲＡ）と接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約１μｇ／ｍｌの濃度の１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーター（例えば、ＲＡ）と接触させて、脊髄前駆体を産生する。
例えばセクション５．２．１．２に開示されている方法により、脊髄前駆体を脊髄グリアコンピテント細胞にさらに分化させ得る。例えばセクション５．２．１．３に開示されている方法により、脊髄グリアコンピテント細胞を脊髄星状細胞にさらに分化させ得る。
分化星状細胞またはその前駆体は、例えば細胞培養培地における分化後に精製され得る。本明細書で使用される場合、「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」および「単離」という用語は、サンプルからの少なくとも１つの夾雑物の量の減少を指す。例えば、所望の細胞型は、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または少なくとも９９．９％またはそれを超えて精製され、望ましくない細胞型の量の対応する減少が起こる。「精製する」という用語は、サンプルからの特定の細胞（例えば、望ましくない細胞）の除去を指し得る。非星状細胞またはその前駆体の除去または選択は、サンプル中の所望の細胞の割合の増加をもたらす。特定の実施形態では、細胞は、混合細胞集団を、少なくとも１つの星状細胞マーカーを発現する細胞に選別することにより精製される。特定の実施形態では、細胞は、混合細胞集団を、少なくとも１つの星状細胞マーカー、例えばＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ、ＳＯＸ９、ＧＬＴ－１、ＣＳＲＰ１および／またはＮＦＩＡまたはそれらの組み合わせを発現する細胞に選別することにより精製される。
５．４．分化細胞集団を含む組成物
本開示の主題はさらに、本明細書に記載されるインビトロ分化方法により産生される分化ＮＳＣの集団を含む組成物を提供する。さらに、本開示の主題は、本明細書に記載される方法によりインビトロ分化ＮＳＣから分化されたグリアコンピテント細胞の集団を含む組成物を提供する。加えて、本開示の主題は、本明細書に記載される方法によりインビトロ分化グリアコンピテント細胞から分化または成熟された星状細胞の集団を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞は星状細胞前駆細胞である。
特定の実施形態では、本開示の主題は、インビトロ分化細胞の集団を含む組成物であって、細胞の集団の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％）が１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーを発現し、細胞の集団の約２５％未満（例えば、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満または約０．１％未満）が１つまたはそれを超える幹細胞マーカーを発現する組成物を提供する。
さらに、本開示の主題は、インビトロ分化細胞の集団を含む組成物であって、細胞の集団の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％）が１つまたはそれを超えるグリアコンピテントＮＳＣマーカーまたはグリアコンピテント細胞マーカーを発現し、細胞の集団の約２５％未満（例えば、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満または約０．１％未満）が、幹細胞マーカー、ＮＳＣマーカーおよびニューロンマーカーからなる群より選択される１つまたはそれを超えるマーカーを発現する組成物を提供する。
さらに、本開示の主題は、インビトロ分化細胞の集団を含む組成物であって、細胞の集団の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％）が１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現し、細胞の集団の約２５％未満（例えば、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満または約０．１％未満）が、幹細胞マーカー、ＮＳＣマーカー、ニューロンマーカーおよびグリアコンピテント細胞マーカーからなる群より選択される１つまたはそれを超えるマーカーを発現する組成物を提供する。
幹細胞マーカーの非限定的な例としては、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３が挙げられる。
神経幹細胞マーカーの非限定的な例としては、ＰＡＸ６、ネスチン、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＬＺＦ、ＺＯ－１およびＢＲＮ２が挙げられる。特定の実施形態では、神経幹細胞マーカーは、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＰＬＺＦおよびＺＯ－１からなる群より選択される。
グリアコンピテント細胞マーカーの非限定的な例としては、ＣＤ４４、ＡＱＰ４、ＳＯＸ２およびネスチンが挙げられる。特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞マーカーは、ＣＤ４４およびＡＱＰ４からなる群より選択される。
ニューロンマーカーの非限定的な例としては、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２およびＤＣＸが挙げられる。
星状細胞マーカーの非限定的な例としては、ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ、ＧＬＴ－１およびＣＳＲＰ１が挙げられる。
特定の実施形態では、分化細胞集団は、ヒト幹細胞の集団に由来する。本開示の主題はさらに、このような分化細胞集団を含む組成物を提供する。
特定の実施形態では、組成物は、約１×１０４個～約１×１０１０個、約１×１０４個～約１×１０５個、約１×１０５個～約１×１０９個、約１×１０５個～約１×１０６個、約１×１０５個～約１×１０７個、約１×１０６個～約１×１０７個、約１×１０６個～約１×１０８個、約１×１０７個～約１×１０８個、約１×１０８個～約１×１０９個、約１×１０８個～約１×１０１０個または約１×１０９個～約１×１０１０個の本開示の幹細胞由来グリアコンピテント細胞または星状細胞の集団を被験体に投与することを含む。特定の実施形態では、組成物は、約１×１０５個～約１×１０７個の本開示のグリアコンピテント細胞または星状細胞の集団を含む。特定の実施形態では、グリアコンピテント細胞は星状細胞前駆細胞である。
特定の実施形態では、前記組成物は凍結されている。特定の実施形態では、前記組成物は、１つまたはそれを超える凍結防止剤、例えば限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、スクロース、トレハロース、デキストロースまたはそれらの組み合わせをさらに含み得る。
特定の非限定的な実施形態では、組成物は、生体適合性のある足場またはマトリックス、例えば、細胞が被験体に埋め込まれる（implanted）または移植される（grafted）と組織再生を容易にする、生体適合性のある三次元足場をさらに含む。特定の非限定的な実施形態では、生体適合性のある足場は、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチドもしくはタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロースもしくはゼラチンを含む多糖、および／またはヒドロゲルを含む。（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１３５号、米国特許出願公開第２０１１／０２９６５４２号、米国特許出願公開第２００９／０１２３４３３号および米国特許出願公開第２００８／０２６８０１９号（これらの内容はそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）。
特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物である。組成物は、本明細書に記載される神経変性障害を予防および／または処置するために使用され得る。
本開示の主題はまた、本明細書に開示される分化細胞またはそれを含む組成物を含むデバイスを提供する。デバイスの非限定的な例としては、シリンジ、微細ガラスチューブ、定位針およびカニューレが挙げられる。
５．５ 神経変性障害を予防および／または処置する方法
１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現するインビトロ分化細胞（「幹細胞由来星状細胞」とも称される）またはその前駆体は、神経変性障害を予防および／または処置するために使用され得る。本開示の主題は、神経変性障害を予防および／または処置する方法であって、有効量の本開示の幹細胞由来星状細胞および／もしくはその前駆体またはそれを含む組成物を、神経変性障害を患っている被験体に投与することを含む方法を提供する。神経変性障害の非限定的な例としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびレット症候群が挙げられる。本開示の主題はまた、神経傷害による損傷、例えば虚血または脳卒中の重症度を軽減する方法であって、有効量の本開示の幹細胞由来星状細胞および／もしくはその前駆体またはそれを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
神経変性障害を処置もしくは予防するかまたは神経傷害による損傷を軽減するために、本開示の幹細胞由来星状細胞およびその前駆体またはそれを含む組成物は、被験体に全身的または直接的に投与または提供され得る。特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来星状細胞およびその前駆体またはそれを含む組成物は、目的の器官（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ））に直接的に注射される。
本開示の幹細胞由来星状細胞およびその前駆体またはそれらを含む組成物は、任意の生理的に許容され得るビヒクルにより投与され得る。本開示の幹細胞由来の細胞および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物も提供される。本開示の幹細胞由来星状細胞およびその前駆体、ならびにそれらを含む医薬組成物は、局所注射、同所性（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内注射、または非経口投与を介して投与され得る。特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来星状細胞およびその前駆体は、神経変性障害を患っている被験体に、同所性（ＯＴ）注射を介して投与される。
本開示の幹細胞由来星状細胞およびその前駆体、ならびにそれらを含む医薬組成物は、好都合には、無菌液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘性組成物として提供することができ、これらは、選択されたｐＨに緩衝され得る。液体調製物は、普通は、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも容易に調製される。さらに、液体組成物は、特に注射により投与するために、いくらかより好都合である。他方では、粘性組成物は、特定の組織とより長期間接触させるために適切な粘度範囲内で製剤化され得る。液体または粘性組成物は、担体を含むことができ、この担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）および適切なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。注射可能な滅菌液剤は、本開示の主題の組成物、例えば本開示の幹細胞由来の前駆体を含む組成物を、所望に応じて様々な量の他の成分と共に、必要量の適切な溶媒に組み込むことにより調製され得る。このような組成物は、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの、適切な担体、希釈剤、または賦形剤の混合物で存在し得る。また組成物は、凍結乾燥させることができる。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散化剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化添加物または増粘添加物、保存剤、香味剤、着色剤などの補助物質を含有し得る。過度の実験なしに適切な調製物を調製するために、“ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ”，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５（これは、参照により本明細書に組み込まれる）などの標準書を参考にし得る。
抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加物を添加し得る。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより確保され得る。注射可能な医薬形態の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム（ａｌｕｍ ｉｎｕｒｎ ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）およびゼラチンを使用することによりもたらされ得る。しかしながら、本開示の主題によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加物は、本開示の幹細胞由来星状細胞およびその前駆体と適合しなければならない。
組成物の粘度は、所望に応じて薬学的に許容され得る増粘剤を使用して、選択されたレベルに維持され得る。メチルセルロースは、容易に、経済的に利用可能であり、取り扱いが容易であるため使用され得る。他の適切な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが含まれる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に応じて決まり得る。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。明らかに、適切な担体および他の添加物の選択は、正確な投与経路、および特定の剤形、例えば液体剤形の性質（例えば、組成物を、液剤、懸濁剤、ゲル剤または別の液体形態、例えば持続放出形態または液体充填形態のいずれに製剤化すべきか）に応じて決まる。
当業者は、組成物の構成成分が、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本開示の幹細胞由来星状細胞およびその前駆体の生存率または有効性に影響を及ぼさないことを認識されよう。このことは、当業者にとって、化学的および薬学的原理の問題にならず、または問題は、標準書を参照することによりもしくは簡単な実験により（過度の実験を伴わない）、本開示および本明細書に引用される文献から容易に回避され得る。
本開示の幹細胞由来星状細胞およびその前駆体の治療上の使用に関する１つの考察は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。最適な効果としては、限定されないが、神経変性障害を患っている被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）もしくは末梢神経系（ＰＮＳ）領域への再配置（repopulation）、ならびに／または被験体のＣＮＳおよび／もしくはＰＮＳ機能の改善が挙げられる。
「有効量」（または「治療有効量」）は、処置した際の有益なまたは所望の臨床的な結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、１つまたはそれを超える用量で被験体に投与され得る。処置に関して、有効量とは、神経変性障害の進行を緩和し、回復させ、安定化し、逆行させ、もしくは緩徐するか、または神経変性障害の病理学的結果を他の方法で軽減するか、または神経傷害による損傷の重症度を軽減するために十分な量である。有効量は、一般に、個々の場合に応じて医師により決定され、当業者の知識の範囲内である。典型的に、有効量を達成するために適切な投与量を決定する場合には、複数の因子が考慮される。これらの因子には、被験体の年齢、性別および体重、処置を受ける状態、状態の重症度、ならびに投与される細胞の形態および有効濃度が含まれる。
特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来星状細胞およびその前駆体の有効量は、神経変性障害を患っている被験体のＣＮＳまたはＰＮＳ領域に再配置させるために十分な量である。
特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来星状細胞およびその前駆体の有効量は、神経変性障害を患っているかまたは神経傷害を経験した被験体のＣＮＳおよび／またはＰＮＳの機能を改善するために十分な量であり、例えば、改善された機能は、正常者のＣＮＳおよび／またはＰＮＳの機能の約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約１００％であり得る。
投与される細胞の量は、処置を受ける被験体ごとに変わる。特定の実施形態では、約１×１０４～約１×１０１０個、約１×１０４～約１×１０５個、約１×１０５～約１×１０９個、約１×１０５～約１×１０６個、約１×１０５～約１×１０７個、約１×１０６～約１×１０７個、約１×１０６～約１×１０８個、約１×１０７～約１×１０８個、約１×１０８～約１×１０９個、約１×１０８～約１×１０１０個または約１×１０９～約１×１０１０個の本開示の幹細胞由来細胞が投与される。
５．６ キット
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、以下：（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビター、（ｂ）ＢＭＰシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビター、（ｃ）１つまたはそれを超えるＮＦＩＡアクチベーター、（ｄ）ＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、類似体および／またはアクチベーター、（ｅ）ＦＢＳ、ならびに（ｆ）１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する分化細胞またはその前駆体細胞の集団への幹細胞の分化を誘導するための指示の１つまたはそれよりも多くを含む。
本開示の主題はまた、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する分化細胞またはその前駆体細胞の集団を含むキットであって、該細胞が、本明細書に記載される方法にしたがって調製されるキットを提供する。特定の実施形態では、細胞は、医薬組成物に含まれる。
６．実施例
本開示の主題は、本開示の主題の例として、限定のためではなく提供される、以下の実施例を参照することにより、より良く理解される。
６．１ 実施例１：幹細胞の集団におけるＮＦＩＡ発現レベルをモジュレートすることにより、幹細胞由来星状細胞を調製する方法
二重ＳＭＡＤ阻害法（ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングのインヒビターであるＳＢ４３１５４２、およびＢＭＰシグナリングのインヒビターであるＬＤＮ１９３１８９）を使用して、ヒト多能性幹細胞からＬＴＮＳＣ（またはＬＴ－ｈＥＳＣＮＳＣ）を誘導した（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７，２７５－２８０（２００９））。細胞を単層として１２日間培養し、次いで、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２および２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを含有するニューロスフェア培養物（非接着プレート）に入れた。次いで、スフェアを、ポリオルナチン、ラミニンおよびフィブロネクチンコーティングディッシュに載せて、成長を可能にした。ＬＴＮＳＣであると決定される前に、細胞を約１０継代にわたって継続的に継代した（図１Ａ）。ＬＴＮＳＣの形態は、非常に初期の神経外胚葉に似ていた（図１Ｂ）。ＬＴＮＳＣは、いくつかの重要な神経幹細胞（ＮＳＣ）マーカー、例えばＳＯＸ２、ネスチンおよびＳＯＸ１を発現したが、ＰＬＺＦも発現し、ＺＯ－１の限局性発現を示したが、これは、ロゼットまたは初期ＮＳＣ性質を示していた（図１Ｃ）。ＬＴＮＳＣは、前脳マーカーを発現し始めるにつれて局所同一性を喪失するが、それぞれＧＢＸ２およびＮＫＸ２．１発現により表されるように、より長い培養時間では、より尾側および腹側になる（図１Ｄおよび１Ｅ）。分化誘導培地にもかかわらず、ＦＢＳ条件下であっても、細胞のこの集団は迅速にニューロンになった（図１Ｆ）。
ＬＴＮＳＣ集団は、グリアコンピテンシーを示唆するマーカー（すなわち、グリアコンピテント細胞のマーカー）、例えばＣＤ４４、ＧＦＡＰおよびＡＱＰ４を発現しなかった。これらの細胞はまたＴＵＪ１陰性であったが、これは、ほぼ１００％の神経幹細胞であるという同種性を示している（図２Ａ）。グリア形成分子（すなわち、ＬＩＦおよびＢＭＰ４）を含有する培地中でＬＴＮＳＣを培養すると、短期では、これらの細胞はＧＦＡＰ＋星状細胞ではなくニューロンになった（図２Ｂ）。しかしながら、ＬＩＦ／ＣＮＴＦ、ＢＭＰ４またはＦＢＳを含む様々な条件で、神経ロゼットまたはＬＴＮＳＣのいずれかをより長い培養時間（約３０日間）培養すると、ＡＱＰ４およびＧＦＡＰの発現により同定されるように、ＦＢＳ条件では、一部の細胞はグリアコンピテンシーを獲得した。ＦＢＳ条件では、グリア形成因子の発現が評価され、ＦＢＳで培養すると、他の処理と比較して、ＳＯＸ９およびＮＦＩＡの発現がより強化された（図３）。
星状細胞への幹細胞の分化に対するＮＦＩＡ発現の効果を調べた。ＮＦＩＡ ｃＤＮＡをドキシサイクリン誘導性ベクターにクローニングすることにより、ＮＦＩＡの過剰発現を達成した。細胞を構築物によるウイルス感染に供し、ＮＦＩＡの発現について評価した（図４Ａ）。７日間のドキシサイクリン処理後、ＮＦＩＡ誘導細胞がＣＤ４４（細胞表面マーカー）を発現した細胞集団では、大きな形態学的変化があった。ＦＢＳで細胞を培養すると、ＧＦＡＰの発現が観察された（図４Ｂ）。ＮＦＩＡの発現を除去した後、グリアコンピテント因子が星状細胞へのＮＦＩＡ曝露細胞の分化を促進することができるかを決定した。特にＦＧＦ２の非存在下では、ＬＩＦ、ＢＭＰ４およびＦＢＳはＧＦＡＰの発現を増強した（図４Ｃ）。
ＮＦＩＡはグリアコンピテンシーの獲得を可能にするが、グリア分化に対して阻害的である。ＮＦＩＡで誘導した細胞は、ＧＦＡＰをアップレギュレートすることができない（図５）。しかしながら、その後のＮＦＩＡ発現の減少およびＬＩＦによる培養は、ＧＦＡＰの発現を増加させた。ＮＦＩＡ発現の増加は、グリアコンピテント細胞のマーカーであるＣＤ４４発現の対応する増加を誘導した。ニューロン形成細胞におけるＧＦＡＰ発現は、ＳＴＡＴ３ ＣｐＧ部位におけるメチル化により遮断されるが、ＧＦＡＰが発現されるグリア細胞では、この部位は脱メチル化される。ＮＦＩＡにより誘導したＣＤ４４＋細胞では、ＳＴＡＴ３ ＣｐＧ部位は脱メチル化された（図６）。
ドキシサイクリンの制御下で、組換えＮＦＩＡ誘導性ｈＥＳＣ系も作り出した。二重ＳＭＡＤ阻害を使用して、グリアコンピテントＮＳＣおよび星状細胞を約２０日間の培養で生成したところ（図７）、ＥＧＦ／ＦＧＦ２による培養などの他のプロトコールと比較して分化が３．５～１０倍加速された。図８は、幹細胞を星状細胞に分化させるための細胞培養プロトコールおよびタイムラインの概要である。
本実施例により記載されているように、幹細胞におけるＮＦＩＡの発現レベルを増加させることにより、グリアコンピテント細胞マーカーの発現が増加したが、星状細胞への分化は阻害された。グリアコンピテント細胞のＮＦＩＡ発現を減少させることにより、星状細胞への細胞の分化が可能になった。
６．２ 実施例２：野生型星状細胞は、脊髄運動ニューロン（ｓＭＮ）および眼球運動ニューロン（ｏＭＮ）の細胞死を減少させる。
ＳＯＤ１変異Ａ４Ｖは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）ならびにその結果として起こるｓＭＮおよびｏＭＮ細胞の細胞死の１つの原因である。ＳＯＤ１Ａ４Ｖ変異星状細胞の存在がｓＭＮおよびｏＭＮ細胞の生存に影響を及ぼすかを調べるために、ｓＭＮおよびｏＭＮ細胞を、上記のように野生型または野生型ＳＯＤ１Ａ４Ｖ前駆体のいずれかから分化させた星状細胞と共に培養した。ｓＭＮおよびｏＭＮを星状細胞と共に最大１５日間培養し、ＶＡＣＨＴ＋細胞を測定することにより、細胞生存を決定した。野生型星状細胞とのｏＭＮの培養は、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ星状細胞との培養と比較して、運動ニューロンの生存を増加させたが、野生型星状細胞は、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ星状細胞と比較してｓＭＮの細胞死を減少させた（図９）。
６．３ 実施例３：ＮＦＩＡは、Ｇ１細胞周期の長さをモジュレートすることにより、多能性幹細胞からの機能的ヒト星状細胞の迅速な誘導を可能にする
概要
星状細胞は、ヒト脳における最も豊富なグリア細胞型であり、その機能不全は、神経発達障害および神経変性障害の両方の病因の駆動因子である１。星状細胞は、後期神経幹細胞（ＮＳＣ）に由来する。初期発生では、ＮＳＣはニューロンのみを産生するように運命制限されるが、より後期段階では、それらは、ニューロン形成コンピテンシーからグリア形成コンピテンシーへのスイッチを受けて、星状細胞および乏突起膠細胞が漸進的に産生される２。グリア形成スイッチの分子的性質は依然として理解し難く、そのタイミングは、マウスにおける７日間からヒト発生における６～９カ月間まで種間で劇的に変動する３。これらの種特異的タイミング差は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に由来するＮＳＣにも同様に適用される４。ｈＰＳＣにおいてグリアコンピテンシーを獲得するタイミングが非常に長期であることは、基本的およびトランスレーショナルな用途のためにヒト星状細胞の誘導を探求する上で大きな障壁となる。
ここでは、核因子ＩＡ（ＮＦＩＡ）は、ヒトグリアコンピテンシーを誘導するための分子スイッチであることが同定された。グリア促進因子の存在下における５日間のＮＦＩＡの一過性発現は、現在のプロトコールを使用した３～６カ月間の分化と比較して、ｈＰＳＣ由来星状細胞を生成するために十分であった。ＮＦＩＡ誘導星状細胞はシナプス形成を促進し、神経保護特性を示し、適切な刺激に応答してカルシウムトランジェントを示し、成体脳に生着した。最後に、活性化星状細胞の特徴を発現するようにＮＦＩＡ誘導星状細胞を誘導した。ＮＦＩＡ誘導グリアコンピテンシーの根底にある機構は、迅速だが可逆的なクロマチンリモデリング、ＧＦＡＰプロモーターの脱メチル化、および細胞周期のＧ１期の顕著な延長を伴う。Ｇ１の長さの遺伝的または薬理学的な操作は、グリアコンピテンシーにおけるＮＦＩＡ機能を部分的に模倣した。この研究は、グリア形成スイッチの重要な機構的特徴を定義することにより、ならびに疾患モデリングおよび再生医療のためにヒト星状細胞の迅速な産生を可能にすることにより、ｈＰＳＣおよびグリア生物学の大きな障壁に対処した。
方法および材料
細胞培養
１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２３３－ＦＢ－００１ＭＧ／ＣＦ）を含有する以前に記載されている幹細胞維持培地（Ｃｈａｍｂｅｒｓら）中、放射線照射マウス胚線維芽細胞（Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｅｍ）上で、ヒト多能性幹細胞を維持した。細胞を２～３カ月ごとにマイコプラズマ試験に供した。１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦおよび１：１０００ Ｂ２７サプリメントを含むＮ２培地からなるＮＳＣ培地中、ポリオルニチン（ＰＯ）、ラミニン（Ｌａｍ）およびフィブロネクチン（ＦＮ）コーティングディッシュ上で、神経幹細胞およびグリア前駆体を維持した。１０ｎｇのＨＢ－ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２５９－ＨＥ）を含むＮ２培地からなる星状細胞培地中、ＰＯ／Ｌａｍ／ＦＮコーティングディッシュ上で、星状細胞を維持した。ｈＰＳＣからの前部前脳神経外胚葉の誘導
ヒト多能性幹細胞（細胞２．５～３．０×１０５個／ｃｍ２）を単一細胞に解離し、１０ｕＭ ＲＯＣＫインヒビター（Ｙ－２７６３２）を含有する幹細胞維持培地中、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コーティングディッシュ上にプレーティングした。翌日、培地を神経誘導培地（１５％ＫＳＲ、Ｌ－グルタミン、ＮＥＡＡ、１００ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ，Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）および１０μＭ ＳＢ４３１５４２（ＳＢ，Ｔｏｃｒｉｓ）を含むノックアウトＤＭＥＭ）に変更した（これが分化０日目に相当する）。以前に記載されているように、４～１０日目に、ＫＳＲ成分を徐々に減少させ、漸増量のＮ２培地で置き換える４９。前部前脳の運命を促進するために、０～５日目に、２μＭ ＸＡＶ９３９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を神経誘導培地に添加する５０。分化１０～１２日目に、細胞を使用して、ａ．）ロゼット期ＮＳＣまたはｂ．）ＬＴＮＳＣのいずれかを生成した。
ａ．）ロゼット期ＮＳＣの生成。Ａｃｃｕｔａｓｅで分化細胞を３０分間解離し、細胞を０．４５ミクロンセルストレーナーに通し、ペレット化した。次いで、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、１０ｍＭアスコルビン酸（ＡＡ）および１ｎｇ／ｍｌソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）を含有するＮ２培地に細胞４×１０５個／μｌの濃度で再懸濁した。２０μｌの液滴を乾燥ＰＯ／Ｌａｍ／ＦＮプレート上に作る。細胞が沈降した後、ＢＤＮＦ、ＡＡおよびＳＨＨを含有するＮ２培地を残りのディッシュに充填する。３～５日間の培養までに、神経ロゼット形成が現れるはずである。
ｂ．）ＬＴＮＳＣの生成。１０％Ｄｉｓｐａｓｅを使用して、分化細胞を１０分間解離した。次いで、細胞を塊として分離し、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２を含有するＮ２培地に再懸濁し、滅菌非ＴＣ処理ディッシュで培養した。細胞は多数のニューロスフェアを形成し、３～５日までに、スフェア内の神経ロゼット形成が現れるはずである。ニューロスフェア培養物が純粋になると、それらをＰＯ／Ｌａｍ／ＦＮプレートに載せ、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦおよび１：１０００ Ｂ２７サプリメントを含むＮ２（ＮＳＣ培地）で培養する。コンフルエンシーまでロゼット期ＮＳＣの成長が観察され、次いで、高密度（およそ１：３継代）で２～３カ月間かけて継代する。１０継代まで神経上皮形態を維持する細胞をＮＳＣ培地で維持し、初期ＮＳＣマーカーおよび分化能について分析した。
脊髄運動ニューロン（ＳＭＮ）誘導プロトコール
以前に記載されているように、ヒト多能性幹細胞を脊髄運命に分化させた２３。簡潔に言えば、人工多能性細胞をマトリゲルコーティングディッシュに播種し、ＬＤＮ、ＳＢおよびレチノイン酸（１μｇ／ｍｌ）で１０～１２日間分化させた。細胞を解離し、ＢＤＮＦ、ＡＡおよびグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含むＮ２培地で１４日間培養した。
星状細胞誘導プロトコール
典型的には、ＦＵＷ－ＮＦＩＡおよびＦＵＷ－Ｍ２－ｒｔＴＡを含有するレンチウイルス粒子を局所パターン形成神経幹細胞に感染させ、感染の翌日にドキシサイクリン（ｄｏｘ）で誘導する。ｄｏｘ培地で細胞を最低５日間維持し、次いで、ｄｏｘを含まない星状細胞誘導培地（１０ｎｇ／ｍｌ ＨＢ－ＥＧＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）および１０ｎｇ／ｍｌ白血病抑制因子（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含むＮ２培地）に最低５日間交換する。ＣＤ４４を使用して、グリア前駆体および星状細胞を単離し得る。
免疫組織化学およびＣＤ４４のＦＡＣＳ分析
免疫組織化学では、４％パラホルムアルデヒド（ＥＭＳ）を含有するＰＢＳで細胞を１０分間固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含むＰＢＳを使用して５分間透過処理し、０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで保存した。ブロッキング溶液は、０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ中５％ロバ血清を含有していた。ブロッキング溶液で一次抗体を希釈し、典型的には４℃で一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５またはＡｌｅｘａ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ）にコンジュゲートした二次抗体を細胞に添加し、３０分間インキュベートした。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｔｈｅｒｍｏ）で細胞を染色することにより、核を同定した。この研究で使用した抗体のリストは、表１に示されている。
Figure 2022180634000005
ＦＡＣＳおよび分析では、０．０５％トリプシンを使用して細胞を解離し、血清含有培地で不活性化した。次いで、細胞を選別バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２％ＦＢＳを含む１倍ＰＢＳ）に再懸濁し、ＣＤ４４－Ａｌｅｘａ６４７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用した選別または分析に供した。
ＮＦＩＡおよびＳＯＸ９誘導性構築物の生成およびレンチウイルス産生
ｈＰＳＣ由来アストログリア前駆体由来のｃＤＮＡから、ＮＦＩＡおよびＳＯＸ９をクローニングした（９０日目）。ＥｃｏＲＩでＦＵＷ－ｔｅｔＯ－ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ
３０１３０）を消化してＧＦＰ断片を除去し、伝統的なライゲーションクローニングを使用してＮＦＩＡまたはＳＯＸ９を挿入した。ＮＦＩＡ、ＳＯＸ９、ＦＵＣＣＩ－ＯまたはＭ２－ｒｔＴＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ ２０３４２）を含有するプラスミド、ｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ １２２６０）パッケージングベクターおよびｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ １２２５９）エンベロープを、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ ＨＰ（Ｓｉｇｍａ）を使用して２９３Ｔ細胞にそれぞれ１：２：１のモル比でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後にウイルスを回収し、ＡＭＩＣＯＮ Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。
遺伝子発現およびＡＴＡＣ－Ｓｅｑ分析
ＲＮＡ配列決定：アダプターのために未加工ＦＡＳＴＱファイルをトリミングし、ＳＴＡＲ２．５．０を使用してＥＮＳＥＭＢＬ ＧＲＣｈ３８ゲノムビルドにアライメントした。ＨＴＳｅｑ５１を使用してアライメントしたファイルからマトリックスを生成し、標準パイプラインを使用したさらなる分析のためにＤＥＳｅｑ２５２にインポートした。
ＡＴＡＣ配列決定：Ｂｏｗｔｉｅ２５３を使用して未加工ＦＡＳＴＱファイルをｈｇ１９ゲノムビルドにアライメントした。ｄｅｅｐＴｏｏｌｓソフトウェアパッケージ５４を使用して、アライメントファイルの比較分析を実施した。ＨＯＭＥＲソフトウェア５５を使用してモチーフ分析およびピークアノテーションを実施し、ＩＧＶブラウザー５６を使用して視覚化した。すべてのＦＡＳＴＱファイルおよび補足ファイルは、アクセッションＧＳＥ１０４２３２でＮＣＢＩ ＧＥＯにアップロードされている。
細胞周期分析
細胞を解離し、細胞周期分析のために核を単離した。ヨウ化プロピジウム（propidium
iodine）（２５０ｎｇ／ｍｌ）を細胞に添加し、ＦＡＣＳにより分析した。１条件当たり最低１０，０００個の事象を分析した。取得したデータをインポートし、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアにより分析した。
成体皮質へのＮＳＣ、グリア前駆体および星状細胞の移植
すべての手術はＮＩＨガイドラインにしたがって実施し、地方施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）、施設内生物安全委員会（ＩＢＣ）および胚性幹細胞研究委員会（ＥＳＣＲＯ）により承認された。合計８（または２０）匹の［ＣＦ１］ ＮＯＤ－ＳＣＩＤ ＩＬ２－Ｒｇｃヌルマウス（２０～３５ｇ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が細胞移植を受けた。イソフルラン５％でマウスを麻酔し、２～３％の維持流量を維持した（kipping）。定位マイクロマニピュレーターに取り付けた注入ポンプにより、１μｌ／
分の速度で５μｌハミルトンシリンジを介して、合計７×１０４個のＮＦＩＡ誘導星状細胞を２μｌで脳梁膝に移植した（座標：ブレグマからＡＰ＋０．７４０、ＭＬ－１．００、ＤＶ－２．３０）。２μｌ当たり合計２×１０５個のＬＴＮＳＣを皮質下灰白質、線条体（座標 ブレグマからＡＰ＋０．５００、ＭＬ－１．９００、ＤＶ－３．２００）に移植した。２μｌで合計７．５×１０４個のＨ１由来星状細胞ＧＦＰを脳梁膝に移植した（座標：ブレグマからＡＰ＋０．７４０、ＭＬ－１．００、ＤＶ－２．３０）。ＩＨＣ分析のために、移植の１、６および１２週間後にマウスを屠殺した。
組織処理
ペントバルビタールの腹腔内過剰投与でマウスを安楽死させ、リン酸緩衝食塩水、次いでパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）４％を経心臓的に灌流させた。慎重な解剖の後に脳を摘出し、４％ＰＦＡで一晩維持し、次いで、３０％スクロースに２～３日間浸漬した。Ｏ．Ｃ．Ｔ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ）で脳を包埋した後、クリオスタットにより、厚さ３０μｍの脳冠状切開を－２０℃で実施した。
カルシウムイメージング
ｈＰＳＣ由来神経幹細胞または星状細胞および初代星状細胞（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ）をＰＯ／ラミニン／フィブロネクチンコーティング０．５ｍｍブラックΔＴディッシュ（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ）上にプレーティングし、ｈＰＳＣから６０～１２０日目に以前に記載されているように５７カルシウムイメージングに使用した。培養物を５ｕＭのＦｕｒａ－２（Ｔｈｅｒｍｏ）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、ディッシュをΔＴ Ｈｅａｔｅｄ Ｌｉｄ ｗ／Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ）にマウントした。１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭグルコース、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２および０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有する通常タイロード液（ｐＨ７．４）で培養物を灌流した。グルタメート（１００μＭ）、ＡＴＰ（３０μＭ）またはＫＣｌ（６５ｍＭ）を培養物に１分間補充し、た。最低７つの位置において３４０および３８０ｎｍで３０秒ごとにイメージングした。ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）を使用して、３８０／３４０ｎｍのシグナル比を計算することにより、タイムラプス画像を分析した。
グルタミン酸興奮毒性アッセイ
ｈＰＳＣを神経外胚葉運命に向けて分化させることにより、皮質ニューロンを誘導した（上記を参照のこと）。次いで、神経外胚葉細胞を解離し、再プレーティングして神経ロゼットを生成し、ＤＡＰＴによる処理によりニューロンにさらに分化させた。次いで、ニューロンを再プレーティングし、星状細胞ありまたはなしでの成熟度のマーカーまたはグルタミン酸興奮毒性５８についてアッセイした。グルタミン酸興奮毒性研究では、１ｃｍ２当たり１００，０００個のニューロンを、ＢＤＮＦ、ＡＡおよびＧＤＮＦを含むＮ２培地中のＰＯ／ラミニン／フィブロネクチンディッシュ上にプレーティングした。ＮＦＩＡ誘導星状細胞を細胞１５０，０００個／ｃｍ２で添加し、さらに５日間共培養した。次いで、ＨＢＳＳ中、１００または５００μｍ（最終）Ｌ－グルタメートで細胞を１時間処理し、ＢＤＮＦ、ＡＡおよびＧＤＮＦを含むＮ２培地で回収した。グルタメート処理の４８時間後に、レサズリンを添加して、細胞生存率を決定した。
バイサルファイト変換および配列決定
ＮＦＩＡを感染させたＬＴＮＳＣをｄｏｘで５日間処理し、ＣＤ４４について選別した。細胞を単離し、製造業者により記載されているようにＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｄｉｒｅｃｔ（商標）Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を使用して、バイサルファイト変換を実施した。ＤＮＭＴ１ ＳＴＡＴ３結合部位の領域に対するプライマーは以前に記載されていた５９。ＺｙｍｏＴａｑ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＭＴ１プロモーター領域を増幅し、ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。１条件当たり最低１０個のコロニーを配列決定のために送った。
結果
これまで、ヒト星状細胞生物学の研究は、その限定的なアベイラビリティおよび局所的な異質性のために困難であった５。現在のところ、発生および疾患における役割を調べるためのロバストなインビトロ系がないので、ヒトの星状細胞生物学における初期発生事象を理解することは特に困難である。ヒトＰＳＣは、初期ヒト発生に関する洞察を獲得するための、および人体の規定の細胞型へのアクセスを提供するための理想的なモデル系を表わす。定方向性ｈＰＳＣ分化のユニークな特徴は、細胞が胚発生プログラムを最初に開始してから、最終的に後期成体様細胞の産生に移行することである４。ＮＳＣへのｈＰＳＣの定方向性分化は、長いニューロン形成期とそれに続く遅いグリア形成スイッチをもたらし、ヒト発生のタイムラインを模倣する。以前の研究では、分化により機能的星状細胞の大集団を得る前に、ｈＰＳＣ由来ＮＳＣを最大２４週間培養する必要性が報告されている６，７。このような拡大培養の後、グリア形成スイッチが自発的に起こるが、スイッチの基礎となる分子機構は依然として不明である８。
ｈＰＳＣ分化中に星状細胞が発生する時期を正確にモニタリングするために、核緑色蛍光タンパク質（Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ）を有するアクアポリン－４（ＡＱＰ４）遺伝子座をターゲティングするノックインレポーター系を生成した（図１３Ａ～１３Ｈ）。ｈＰＳＣから星状細胞を生成する以前の戦略は、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＢＭＰまたは血清などの因子をＮＳＣに曝露して、グリア分化をトリガーすることを含む１３，１４。血清で処理したＮＳＣでは、グリア分化の開始は中程度に加速され（図３Ａ～３Ｂ）、ＮＦＩＡおよびＬＩＮ２８Ｂ（グリア運命獲得に以前に関与していた因子）１５，１６，１７，１８，１９の発現の有意な変化と相関していた（図１０Ａ）。いずれかの遺伝子がグリアコンピテンシーまたは分化に影響を与えるかを直接試験するために、長期培養によりグリア形成スイッチを自然発生的に受けないｌｔ－ｈＥＳＮＳＣ２１（ＬＴＮＳＣ）と称される均一かつ安定なニューロン形成ＮＳＣ集団を使用した（図１Ａ～１Ｈ）。ＬＩＮ２８Ｂのノックダウンはいかなる明白な効果も示さなかったが、ＮＦＩＡの過剰発現はＬＴＮＳＣ形態を顕著に変化させ（図１０Ｂ）、ＮＦＩＡタンパク質およびＣＤ４４２２（グリアコンピテンシーのマーカー）の発現と相関していたが、ＧＦＡＰ陽性細胞をもたらさなかった（図１０Ｃ）。興味深いことに、ＮＦＩＡ発現細胞の一部は、ＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰレポーターを活性化した（図１０Ｄ）。これらの結果に基づいて、ＮＦＩＡの過剰発現はグリアコンピテンシーをトリガーするが、グリア分化を遮断すると仮説を立てた。時間経過研究を実施し、強制的なＮＦＩＡ発現の存在下（ｄｏｘ＋）または非存在下（ｄｏｘ－）で、ＬＴＮＳＣを培養した。５日後、グリア促進条件（＋ＬＩＦ）またはＮＳＣ維持培地（＋ＥＧＦ／ＦＧＦ２）のいずれかで、細胞を（ｄｏｘ－）に変更した。両条件について、ドキシサイクリンの除去はＮＦＩＡ発現の段階的な低下をもたらしたが、（＋ＬＩＦ）群のみにおいて、ＮＦＩＡが十分にダウンレギュレートされた後にのみ、ＧＦＡＰ発現が強く誘導された（図１０Ｅ）。興味深いことに、ＬＩＦの存在下であっても、ＮＦＩＡの継続的な発現（ｄｏｘ＋）は、ＬＴＮＳＣによるＧＦＡＰの発現を妨げた（図１０Ｅ（ｄｏｘ＋））。まとめると、現在のプロトコールを使用した９０～１８０日間と比較して、ＮＦＩＡの一過性発現により、グリアコンピテンシーを５日間で達成することができる（図８Ａ～８Ｂ）。
次に、ｄｏｘの除去後に、ＢＭＰ４またはＦＢＳなどの他のグリア分化因子が、ＬＩＦよりも効率的にＬＴＮＳＣの星状細胞分化を促進するかを分析した。しかしながら、ＧＦＡＰ＋細胞の生成およびＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰレポーターの活性化において、ＬＩＦが最も効率的であった（図１Ｆ、図５）。さらに培養したところ、ＮＦＩＡ誘導ＮＳＣ由来の細胞は、複雑な形態を有する星状細胞に似ており（図１Ｇ）、ＧＦＡＰおよびＳＬＣ１Ａ２（図１０Ｈ）、ならびに星状細胞同一性に特異的に関連する一連の遺伝子（図１０Ｉ）を発現した。次いで、初代ヒト星状細胞と比較して、ＮＦＩＡ誘導星状細胞の発生段階を調べた５。長期培養により、ＮＦＩＡ誘導ＮＳＣは、ＣＲＥＢ５、ＳＰＡＲＣＬ１、ＡＴＰ１Ｂ２およびＣＳＴ３の発現を特徴とする胎児様星状細胞プログラムを介して、ＣＳＲＰ１およびＳＯＸ９の発現を特徴とする成体様パターンに向けて移動する（図１０Ｊ）。最後に、異なる局所同一性のＮＳＣを確立するためにパターン形成戦略をＮＦＩＡ発現と組み合わせて２０，２３、前脳または脊髄同一性の局所特異的星状細胞を生成した（図１５Ａ～１５Ｂ）。次いで、ＮＦＩＡ誘導星状細胞の機能を調べた。ＣＮＳ発生中、星状細胞は、とりわけニューロン成熟２４、代謝恒常性の維持、および神経系における炎症の調節を含む重要な役割を果たす２５。ＮＦＩＡ誘導星状細胞の存在下で共培養した未成熟ニューロンは、ＳＹＮ１（シナプシン－Ｉ）の点状発現（図１１Ａ）ならびにＳＹＮ１および活性帯マーカーＭＵＮＣ１３．１２６の発現増加により、加速された成熟の証拠を示すことが観察された（図１１Ｂ）。グルタミン酸興奮毒性に供すると、ＮＦＩＡ誘導星状細胞はニューロン生存も促進した（図１１Ｃ）２７。重要なことに、サイトカイン処理により、ＮＦＩＡ誘導星状細胞では、補体（Ｃ３）分泌などの反応特性が容易にトリガーされた１，１１（図１１Ｄ）。また、特異的刺激に反応してカルシウムトランジェントを誘発するように星状細胞を刺激することができる２８。ヒト胎児脳（１９－２３ｐｃｗ）から単離された市販の初代星状細胞は、ＮＦＩＡ誘導星状細胞に類似の形態を示した；しかしながら、刺激に反応した細胞は非常に少なかった（図１６Ｆ）。対照的に、ＮＦＩＡ誘導星状細胞は、ＫＣｌおよびＡＴＰにロバストに反応した（図１１Ｅ）。ｈＰＳＣ由来ニューロンと共培養すると、ＮＦＩＡ誘導星状細胞はＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰシグナルの増加を示し（図１１Ｆ）、ＡＴＰに対する反応レベルは２倍増加した（図１１Ｇ～１１Ｈ）。加えて、グルタミン酸反応の規模が増強されたが、これは、グリア成熟およびニューロン成熟の両方の駆動における２つの細胞型間の相乗的相互作用を示唆している。
最後に、ＮＦＩＡ誘導グリアコンピテントＮＳＣおよび星状細胞を成体マウス皮質および脳梁に移植した。移植の２週間後に、白質路に沿って、移植片コアからのグリア前駆体の広範な移動が観察された（図１１Ｉ）。移植細胞はＡＱＰ４－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰおよびＧＦＡＰの発現を維持し、移植後６週間まで、ヒト星状細胞に特有の形態学的特徴、例えば複数の皮質領域に及ぶ長い複雑な形態２９を示した（図１１Ｊ）。上記インビトロおよびインビボデータは、一過性ＮＦＩＡ発現が、オンデマンドかつ異例の速度および効率で、機能的な領域特異的ヒト星状細胞を生成する強力な戦略であることを実証している。さらに、この結果は、ＮＦＩＡが、ヒトグリアコンピテンシーをトリガーするための以前は理解し難い分子スイッチであることを強く示唆している。ＮＦＩＡ作用機序を調査する第１段階として、一過性ＮＦＩＡ発現はグリアコンピテンシーをトリガーしたが、内因性ＮＦＩＡ発現を誘導しなかったという最初の観察結果に戻った（図１０Ｅを参照のこと）。ドキシサイクリンを除去すると、細胞はグリアコンピテンシー（ＣＤ４４発現を含む）を徐々に喪失し（図６Ａ）、ニューロン形成状態に戻った（図６Ｂ）。異所性ＮＦＩＡ発現の時間経過分析を実施し、続いて、ＣＤ４４陽性細胞を選別し、ｄｏｘの非存在下（ｄｏｘ－）で再プレーティングした（図６Ｃ）。ドキシサイクリンなしで３日間培養した後、ＮＦＩＡ発現が喪失したことが確認された（９日目）（図６Ｄ）。時間経過を通じて、サンプル間で３つの主要クラスタも観察された（図６Ｅ）。これらのうち、神経上皮期ＮＳＣ、ＬＴＮＳＣ（０日目）およびサンプルは共にｄｏｘ－クラスタに戻ったが、これは、ＮＦＩＡを中止すると、ＮＦＩＡパルスがグリアコンピテンシーを維持することができないという考えを裏付けている。重要なことに、６日間のＮＦＩＡ発現は、ｈＰＳＣ由来星状細胞（２００日目）またはグリアコンピテントＮＳＣ（８０日目）のそれに類似のクロマチンアクセシビリティランドスケープを誘導した（図６Ｆ）。転写因子結合モチーフの富化の明確な変化があり、０日目（ｄｏｘ－）および１２日目（リバース）条件ではＳＯＸおよびＺＮＦ３５４Ｃモチーフが富化され、６日目（ｄｏｘ＋）および星状細胞条件ではＡＰ－１、ＮＦＩＸおよびＮＦＩハーフサイトモチーフが高度に富化された（図１７Ａ～１７Ｃ）。驚くべきことに、ＧＦＡＰプロモーターは差次的アクセシビリティ（differential accessibility）を示さなかったが（図６Ｇ、下）、以前の実験は、ＮＦＩＡの短
いパルスのみの後、ＬＩＦの存在下においてＧＦＡＰのロバストな誘導を示したが、ＬＩＦ処理のみではそうではなかった。しかしながら、バイサルファイトシーケンシングでは、ＧＦＡＰプロモーター中の１つのＣｐＧは、ＮＦＩＡ誘導ＣＤ４４＋細胞におけるメチル化の喪失を一貫して示し（図６Ｈ）、星状細胞においても同様にメチル化されなかったが、ＬＴＮＳＣでも他のロゼット期ＮＳＣでもそうではなかった。重要なことに、ＣｐＧは、メチル化されるとＳＴＡＴ３結合を阻害すると予測されるＳＴＡＴ３結合部位３１とマッチする。これらのデータは、ＮＦＩＡが、クロマチンアクセシビリティおよびＤＮＡ脱メチル化の調節を含む複数のグリアコンピテンシー誘導モードを発揮することを示唆している。次に、ＲＮＡ配列決定およびＤＡＶＩＤ機能アノテーション分析ソフトウェア３２を使用して、ＬＴＮＳＣにおけるＮＦＩＡ中止後にＮＦＩＡ過剰発現により誘導される差次的な遺伝子発現プログラムに注目した。時間経過中のすべての差次的に発現される遺伝子の階層的クラスタリングは、異なる時間プロファイルを有する３つの主要クラスタを示した（図１２Ａ、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩと表示）。クラスタＩ（１，００１個の遺伝子）は、グリア分化に関連する遺伝子、例えばＣＤ４４およびＡＱＰ４を含む。このクラスタでは、星状細胞同一性に関連するさらなる遺伝子－ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＳＬＣ４Ａ４およびＣＬＵ５－も検出された（図１８Ａ）。クラスタＩＩ（２，９６０個の遺伝子）は、ＮＦＩＡ発現により直接的な影響を受ける遺伝子であって、ＮＦＩＡ減少により迅速に喪失される遺伝子から構成される。これは、いくつかのＷＮＴ、ＴＧＦβおよびＢＭＰファミリーのメンバー、ならびに栄養因子、例えばグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む（図１８Ｂ）。クラスタＩＩＩ（２，５９３個の遺伝子）は、ＮＦＩＡ発現によりダウンレギュレートされる遺伝子を包含する。注目すべきことに、細胞分裂、染色体分離、ＤＮＡ修復および複製などの細胞周期関連プロセスについて、クラスタＩＩＩ遺伝子は特異的に富化されていた（図１２Ｂ）。興味深いことに、ＮＦＩＡは、細胞周期特異的遺伝子の負の調節（これは、ＮＦＩＡ除去後に可逆的であった（図１２Ｄ、図１９Ａ））をトリガーした（図１２Ｃ）。
次に、ＮＦＩＡが、グリアコンピテンシーの獲得に重要であり得る細胞周期進行の機能的変化を引き起こすかを調査した。興味深いことに、ＬＴＮＳＣにおけるＮＦＩＡ発現後、大部分の細胞がＧ１に留まることが観察された（図１２Ｅ）。ＮＦＩＡによりＣＣＮＡ１の発現はアップレギュレートされた一方（図１９Ｂ）、ＣＣＮＡ１タンパク質の顕著な減少およびＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）の著しい増加（図１２Ｆ）が観察されたが、これは、ＮＦＩＡがＮＳＣをＧ１期に維持しているさらなる証拠である。Ｇ１の漸進的な延長は、初期胚（ニューロン形成）期から後期胎児（グリア形成）期への発生中の齧歯類皮質に特有の特徴として以前に報告されており３４、この移行中に、ｈＰＳＣ由来ＮＳＣはＮＦＩＡの漸進的な内因性発現を示す（図２０Ａ）。細胞周期延長を直接測定するために、ＦＵＣＣＩ－Ｏベクターを使用して、細胞がＧ１に費やした時間を決定した３５。タイムラプス分析により、（ｄｏｘ＋）条件では、非誘導細胞と比較して、細胞の大部分がＧ１期の延長を示したことが実証された（図２０Ｂ）。次に、継続的なＮＦＩＡ過剰発現が星状細胞分化を遮断する理由は、細胞周期進行を防止する完全なＧ１停止によるものであるか、およびＮＦＩＡレベルの減少は、グリア運命獲得と適合するより適度なＧ１の長さをもたらすかを調査した。実際、ｄｏｘ濃度を変動させることによりＮＦＩＡレベルを滴定すると、ｄｏｘレベルの減少と相関してＧ１の細胞の割合は徐々に減少し、ＬＩＦの存在下でより低いｄｏｘ濃度においてのみ、ＧＦＡＰ発現が誘導された（図２０Ｄ ２０Ｅ）。
ＮＦＩＡ発現の非存在下における細胞周期のみの薬理学的モジュレーションがグリア形成スイッチをトリガーするために十分であるかを調べるために、細胞をオロモウシン（Ｏｌｏ）（インビトロでＧ１タイミングを延長することが公知である小分子３６）で処理した。ＯｌｏによるＬＴＮＳＣの処理は、Ｇ１の細胞の割合の増加をトリガーしたが（図２１Ａ）、グリアコンピテンシー遺伝子の発現を即時に増加させなかった（図２１Ｂ）。しかしながら、Ｏｌｏ処理ＬＴＮＳＣをさらに１２日間維持または誘導して分化させると、ＮＦＩＡ、ＣＤ４４およびＳ１００βの発現の増加が検出され、ＧＦＡＰ陽性細胞が顕著に検出された（図２１Ｃ、２１Ｄ）。反対に、ＦＺＲ１（ＣＤＨ１）（これは、以前の研究では、Ｇ１細胞周期相の短縮をもたらすことが示されている３７，３８）をノックダウンすることにより、グリアコンピテンシーのＮＦＩＡ媒介性誘導中にＧ１を長くすることの必要性について試験した。ＦＺＲ１をターゲティングするｓｈＲＮＡ構築物は、転写産物の効率的なノックダウンを示し（図１２Ｇ）、ＮＦＩＡ発現のレベルに影響を与えず、Ｇ１の細胞の割合を減少させた（図１２Ｈ）。実際、ＦＺＲ１のノックダウンは、ＣＤ４４およびＧＦＡＰ発現のＮＦＩＡ媒介性誘導を部分的に防止した（図１２Ｉ、１２Ｊ）。最後に、ＮＦＩＡの候補上流アクチベーターの同一性を探索した。形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）ファミリーシグナリングは、脊髄における細胞運命決定のタイミングに関与しており３９、様々な増殖細胞系におけるＧ１停止をモジュレートすることが公知である４０。ニューロン形成ＮＳＣのＴＧＦβ１処理はＮＦＩＡの発現を誘導し（図１２Ｋ）、細胞周期のＧ１期の細胞を増加させた（図１２Ｌ）。ＴＧＦβありまたはなしでニューロン形成ＮＳＣを処理し、続いて、ＬＩＦ含有培地で２週間培養すると、ＧＦＡＰ＋細胞が現れた（図１２Ｍ）。これらの結果は、ＮＦＩＡのＴＧＦβ１媒介性誘導および付随するＧ１延長が、早期グリア形成をトリガーするために十分であることを示している。しかしながら、その結果として生じるＮＦＩＡ発現レベル、速度および効率は、異所性ＮＦＩＡ発現で得られた結果とマッチしなかったが、これは、強制的なＮＦＩＡ発現を完全に代替するために、追加因子のさらなる調査が必要であり得ることを示唆している。ｈＰＳＣ由来ニューロンを用いて神経発達疾患または神経変性疾患をモデル化することは日常的になっているが４１，４２、このような研究におけるｈＰＳＣ由来星状細胞の使用は依然として非常に限られている６，４３。これは、少なくとも部分的には、インビトロで再現される齧歯類細胞と比較して、ヒトにおけるグリア形成スイッチが極めて長期に発現されることが原因であり、それにより、このような研究は非常に面倒で、費用がかかり、非効率的となる。この研究は、グリアコンピテンシーおよび星状細胞分化を駆動する単一因子の使用に基づく簡潔かつ有効な戦略を提示する（図１２Ｎ）。ＮＦＩＡの過剰発現をパターン形成中の初期ＮＳＣと組み合わせる開示される能力は、領域特異的星状細胞の迅速な誘導を可能にし、特定の脳領域に影響を及ぼす障害、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ＲＴＴ症候群、ＡＬＳまたは肝性脳症に対する星状細胞の寄与を研究する上で特に興味深いものである。このような領域特異的星状細胞は、別個の脳領域に由来する初代星状細胞について報告されているように４４、別個の栄養支持体の研究にさらに利用され得る。
ＮＦＩＡを使用してヒト神経発生を劇的に早めることの潜在的な懸念は、得られる細胞型が真のインビボ由来星状細胞とマッチするか、または人工インビトロ細胞型に相当し得るかである。本発明者らは、ＡＴＰ、ＫＣｌまたはグルタメートなどの関連刺激物に対するカルシウム反応を含むＮＦＩＡ誘導星状細胞（これは、市販の初代ヒト胎児星状細胞とマッチするだけではなくその性能を上回る）のロバストな機能的特徴を実証した。したがって、ＮＦＩＡプロトコールは、ヒト分子研究、生理学研究および疾患関連研究に非常に適切な星状細胞集団をもたらす。星状細胞分化のコンピテンシーの促進におけるＮＦＩＡ過剰発現の役割とは反対に、ＮＦＩＡは、少なくとも高レベルで発現される場合には、ダウンレギュレートされない限り、星状細胞へのさらなる分化を防止する。この知見により、ニワトリ脊髄の過去の異所性発現研究において星状細胞誘導効率が低いこと１６、および最適な結果を達成するためには、ＮＦＩＡレベルを慎重に滴定し、または続いてＮＦＩＡを中止する必要があることを説明することが可能である。ＮＦＩＡヌル変異マウスは、成体脳におけるＧＦＡＰ発現のほぼ完全な喪失を示す４５。ＮＦＩＢ変異マウスでは、同様の表現型が観察される４６。ＮＦＩＡおよびＮＦＩＢがインビボで冗長性である可能性は、単一変異マウスが、さらに一層厳密な初期発生グリア専門化した表現型を示さない理由を説明し得る２。将来の研究は、グリアコンピテンシーをトリガーするｈＰＳＣの機能獲得研究において、ＮＦＩＢがＮＦＩＡを機能的に代替することができるかについても対処し得る。別の興味深い知見は、ＮＦＩＡの一過性過剰発現が、不可逆的な内因性グリアコンピテンシープログラムを活性化するために十分ではないことである。任意のＳＴＡＴまたはＢＭＰシグナルアクチベーターの非存在下でＮＦＩＡ発現をその後に喪失するＮＦＩＡ誘導ＮＳＣは、転写的およびエピジェネティック的に初期ニューロン形成状態に戻る。これらの知見は、インビボ発生中に、ＮＦＩＡがＳＯＸ９などの他の因子と協調して作用して、グリア形成プログラムを安定化し得ることを示している。
機構研究は、ＮＦＩＡが、星状細胞のものと同様のクロマチン状態を迅速にトリガーし得ることを実証している。同様に、遺伝子発現データは、ＮＦＩＡが、グリア専門化に関連する広範な一連の遺伝子の転写を誘導することを明らかにしている。ＮＦＩＡ過剰発現が解除されても、星状細胞同一性に関連するいくつかの遺伝子は依然として少なくとも３日間アップレギュレートされているが、これは、ＮＦＩＡが、これらの特定の遺伝子においてクロマチンランドスケープを開放して、外部因子に応じた活性化をそれらに促すことを示唆している。核因子１Ｂ（ＮＦＩＢ）（ＮＦＩＡのホモログ）は、クロマチンのアクセシビリティを増加させて、転移プログラムの活性化を可能にすることにより、小肺がんの転移を駆動することが示されている４７。ＮＦＩＢの役割と一致して、ＮＦＩＡ発現により、アクセス可能なクロマチンでは、ＮＦＩ－モチーフが高度に富化されることが見出された。星状細胞分化またはグリアコンピテント状態の維持における潜在的な役割を調査するために、他の高度に富化されたモチーフ、例えばＡＰ－１／ＪｕｎＢのさらなる研究が必要である。
特に興味深い知見は、長期Ｇ１期をトリガーする負の細胞周期調節因子としてのＮＦＩＡの役割であった。Ｇ１期の薬理学的または遺伝的モジュレーションは、グリア前駆体マーカーの発現に影響を及ぼし得ることが実証された。未分化ｈＰＳＣ集団における細胞運命決定のモジュレートにおける細胞周期の役割は以前に記載されており４８、ｈＥＳＣは、細胞周期の段階に応じて分化能を歪める。これらのデータは、Ｇ１期を延長することにより、ＮＦＩＡ発現が細胞周期進行を阻害すること、および高いＮＦＩＡレベルがＧ１停止をトリガーし得ることを実証している。ＮＦＩＡの中止は、細胞が細胞周期に再び入ることを可能にし、それにより、グリア分化と適合性のＧ１細胞周期期間を作り出すであろう。インビボ発生中にグリアコンピテント状態を促進する細胞周期の協調的な漸進的モジュレーションを確立する上で、ＴＧＦ、ＮＦＩＡおよび他の因子間の相互作用のさらなる調査が特に興味深い。
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本開示の主題およびその利点を詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書では様々な変更、置換および修正が行われ得ることを理解すべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、機械、製造、ならびに物質の組成、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されることを意図されない。当業者は、本開示の主題、プロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法または工程の開示から容易に理解するとおり、本明細書に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ結果を達成する、既存のまたは今後に開発されるものは、本開示の主題にしたがって利用され得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、それらの範囲内に、このようなプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法または工程を含むことが意図される。
特許文書、特許出願、刊行物、生成物の説明およびプロトコールが、本出願を通して引用されており、それらの開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
多能性幹細胞を分化させるためのインビトロ方法であって、１つまたはそれを超える神経幹細胞マーカーを発現する細胞の集団におけるＮＦＩＡシグナリングを促進して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む、インビトロ方法。
（項目２）
幹細胞を分化させるためのインビトロ方法であって、幹細胞の集団をＳＭＡＤシグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるインヒビターに曝露すること、および該細胞におけるＮＦＩＡシグナリングを促進して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む、インビトロ方法。
（項目３）
ＮＦＩＡシグナリングの初期促進が、ＳＭＡＤシグナリングの前記１つまたはそれを超えるインヒビターへの前記幹細胞の該初期曝露から少なくとも約８日間である、項目２に記載の方法。
（項目４）
検出可能レベルの前記１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーが、前記細胞におけるＮＦＩＡシグナリングの前記初期促進から少なくとも約５日間存在する、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
検出可能レベルの前記１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーの存在後、複数の細胞において、機能的ＮＦＩＡ活性の発現レベルが減少する、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
機能的ＮＦＩＡ活性の前記発現レベルが少なくとも約９０％減少する、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記分化細胞が、検出可能レベルの１つまたはそれを超えるニューロンマーカーを発現しない、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記１つまたはそれを超えるニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２およびＤＣＸからなる群より選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
ＮＦＩＡシグナリングを前記促進することが、前記細胞をＮＦＩＡの１つまたはそれを超えるアクチベーターに曝露することを含む、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
ＮＦＩＡの前記１つまたはそれを超えるアクチベーターが、前記幹細胞に外因的に曝露されたＮＦＩＡタンパク質を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
ＮＦＩＡの前記１つまたはそれを超えるアクチベーターが、前記幹細胞により発現される組換えＮＦＩＡタンパク質を含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
ＮＦＩＡの前記１つまたはそれを超えるアクチベーターが、ＮＦＩＡの上流アクチベーターを含む、項目９に記載の方法。
（項目１３）
ＮＦＩＡの前記上流アクチベーターがＴＧＦβ１である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ＮＦＩＡシグナリングを前記促進することが、ＮＦＩＡの発現を増加させることを含む、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
ＮＦＩＡの発現を前記増加することが、ＮＦＩＡの過剰発現を誘導するようにＮＳＣを改変することを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
過剰発現した前記ＮＦＩＡが、ＮＦＩＡ核酸により発現される組換えＮＦＩＡタンパク質である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記ＮＦＩＡ核酸が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、項目１７に記載の方法。
（項目１８）
幹細胞を分化させるためのインビトロ方法であって、幹細胞の集団をＳＭＡＤシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターに曝露すること、および該細胞をウシ胎仔血清に曝露して、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む、インビトロ方法。
（項目１９）
前記ウシ胎仔血清への前記幹細胞の前記初期曝露から少なくとも約３０日間に、該幹細胞を前記細胞集団に分化させる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
多能性幹細胞を分化させるためのインビトロ方法であって、１つまたはそれを超える神経幹細胞マーカーを発現する細胞の集団の細胞周期のＧ１期を延長して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む、インビトロ方法。
（項目２１）
前記神経幹細胞マーカーが、ＰＡＸ６、ネスチン、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＬＺＦ、ＺＯ－１およびＢＲＮ２からなる群より選択される、項目１または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記神経幹細胞マーカーが、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＰＬＺＦおよびＺＯ－１からなる群より選択される、項目１～２１に記載の方法。
（項目２３）
幹細胞を分化させるためのインビトロ方法であって、幹細胞の集団をＳＭＡＤシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターに曝露すること、および該細胞の細胞周期のＧ１期を延長して、１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む、インビトロ方法。
（項目２４）
前記Ｇ１期の初期延長が、ＳＭＡＤシグナリングの該１つまたはそれを超えるインヒビターへの前記細胞の初期曝露から少なくとも約８日間である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
検出可能レベルの前記１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーが、前記Ｇ１期の前記初期延長から少なくとも約１０日間存在する、項目２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記Ｇ１期の前記延長が、前記細胞を１つまたはそれを超えるＧ１期を延長させる化合物に曝露することを含む、項目２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記１つまたはそれを超えるＧ１を延長させる化合物が小分子化合物を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記小分子化合物がオロモウシン（Ｏｌｏ）を含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞の前記細胞周期の前記Ｇ１期を前記延長させることが、ＦＺＲ１の発現を増加させることを含む、項目２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーが、ＣＤ４４、ＡＱＰ４、ＳＯＸ２およびネスチンからなる群より選択される、項目１～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する前記細胞が、皮質グリアコンピテント細胞または脊髄グリアコンピテント細胞である、項目１～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の細胞を含む前記細胞集団を、１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する細胞への該細胞の分化を促進するために適切な条件に供することをさらに含む、項目１～３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記条件が、前記細胞集団を白血病抑制因子（ＬＩＦ）、１つもしくはそれを超えるその誘導体、１つもしくはそれを超えるその類似体および／または１つもしくはそれを超えるそのアクチベーターに曝露することを含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
ＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、１つもしくはそれを超えるその類似体および／または１つもしくはそれを超えるそのアクチベーターへの前記幹細胞の初期曝露が、ＳＭＡＤシグナリングの前記１つまたはそれを超えるインヒビターへの該幹細胞の該初期曝露から少なくとも約１０日間である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記１つまたはそれを超える星状細胞マーカーが、ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ、ＧＬＴ－１およびＣＳＲＰ１からなる群より選択される、項目３２～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記１つまたはそれを超える星状細胞マーカーがＧＦＡＰを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現する細胞が皮質星状細胞または脊髄星状細胞である、項目３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
ＳＭＡＤシグナリングの前記１つまたはそれを超えるインヒビターが、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビターを含む、項目２～１６および２３～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナリングの前記１つまたはそれを超えるインヒビターが、ＳＢ４３１５４２、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される化合物を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングの前記１つまたはそれを超えるインヒビターが、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される化合物を含む、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４１）
幹細胞を分化させるためのインビトロ方法であって、幹細胞の集団をＳＭＡＤシグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるインヒビターに曝露すること、ならびに該細胞をレチノイン酸（ＲＡ）シグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるアクチベーター（「ＲＡアクチベーター」）およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナリングの有効量の１つまたはそれを超えるアクチベーター（「ＳＨＨアクチベーター」）に曝露して、１つまたはそれを超える脊髄前駆体マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団を得ることを含む、インビトロ方法。
（項目４２）
ＳＭＡＤシグナリングの前記１つまたはそれを超えるインヒビターへの前記幹細胞の初期曝露から少なくとも１日間、該幹細胞の集団を１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＳＨＨアクチベーターに初期曝露する、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
検出可能レベルの前記１つまたはそれを超える脊髄前駆体マーカーが、前記１つまたはそれを超えるＲＡアクチベーターおよび１つまたはそれを超えるＳＨＨアクチベーターへの前記細胞の前記初期曝露から少なくとも約１２日間存在する、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記１つまたはそれを超える脊髄前駆体マーカーが、ＨＯＸＢ４、ＩＳＬ１およびＮＫＸ６．１からなる群より選択される、項目４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記幹細胞がヒト幹細胞である、項目１～４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記幹細胞が多能性幹細胞である、項目１～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１～４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
少なくとも約１０％の１つもしくはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーおよび／または１つもしくはそれを超える星状細胞マーカーを発現するインビトロ分化細胞の集団であって、項目１～４０のいずれか一項に記載の方法により誘導される、集団。
（項目５０）
項目４９に記載の集団を含む、組成物。
（項目５１）
医薬組成物である、項目５０に記載の組成物。
（項目５２）
被験体における神経変性障害を処置するかまたは神経傷害による損傷を軽減する方法であって、有効量の項目４９に記載の集団または項目５０もしくは５１に記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
（項目５３）
前記被験体が、神経変性障害と診断されているかまたはそれを有するリスクがある、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記神経変性障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびレット症候群からなる群より選択される、項目５２または５３に記載の方法。
（項目５５）
神経変性障害を処置するためのまたは神経傷害による損傷を軽減するための医薬の製造における、項目４９に記載の集団または項目５０もしくは５１に記載の組成物の使用。
（項目５６）
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビター、
（ｂ）ＢＭＰシグナリングの１つまたはそれを超えるインヒビター；
（ｃ）ＮＦＩＡの１つまたはそれを超えるアクチベーター；
（ｄ）ＬＩＦ、１つもしくはそれを超えるその誘導体、１つもしくはそれを超えるその類似体および／または１つもしくはそれを超えるそのアクチベーター；ならびに
（ｅ）１つもしくはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーおよび／または１つもしくはそれを超える星状細胞マーカーを発現する少なくとも約１０％の分化細胞を含む細胞集団への該幹細胞の分化を誘導するための指示
の１つまたはそれよりも多くを含む、キット。
（項目５７）
インビトロ分化細胞の集団を含む組成物であって、細胞の該集団の少なくとも約５０％が１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーを発現し、細胞の該集団の約２５％未満が１つまたはそれを超える幹細胞マーカーを発現する、組成物。
（項目５８）
インビトロ分化細胞の集団を含む組成物であって、細胞の該集団の少なくとも約５０％が１つまたはそれを超えるグリアコンピテントＮＳＣマーカーまたはグリアコンピテント細胞マーカーを発現し、細胞の該集団の約２５％未満が、幹細胞マーカー、ＮＳＣマーカーおよびニューロンマーカーからなる群より選択される１つまたはそれを超えるマーカーを発現する、組成物。
（項目５９）
インビトロ分化細胞の集団を含む組成物であって、細胞の該集団の少なくとも約５０％が１つまたはそれを超える星状細胞マーカーを発現し、細胞の該集団の約２５％未満が、幹細胞マーカー、ＮＳＣマーカー、ニューロンマーカーおよびグリアコンピテント細胞マーカー／グリアコンピテントＮＳＣマーカーからなる群より選択される１つまたはそれを超えるマーカーを発現する、組成物。
（項目６０）
前記１つまたはそれを超える幹細胞マーカーが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３からなる群より選択される、項目５７～６０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６１）
前記１つまたはそれを超えるニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２およびＤＣＸからなる群より選択される、項目５８～６０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６２）
前記１つまたはそれを超えるＮＳＣマーカーが、ＰＡＸ６、ネスチン、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＬＺＦ、ＺＯ－１およびＢＲＮ２からなる群より選択される、項目５８～６１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６３）
前記１つまたはそれを超える神経幹細胞マーカーが、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＰＬＺＦおよびＺＯ－１からなる群より選択される、項目５８～６３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６４）
前記１つまたはそれを超えるグリアコンピテント細胞マーカーが、ＣＤ４４、ＡＱＰ４、ＳＯＸ２およびネクチンからなる群より選択される、項目５８～６４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６５）
前記１つまたはそれを超える星状細胞マーカーが、ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、ＣＤ４４、Ｓ１００ｂ、ＳＯＸ９、ＮＦＩＡ、ＧＬＴ－１およびＣＳＲＰ１からなる群より選択される、項目５９～６５のいずれか一項に記載の組成物。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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