JP2022179099A - Lactic acid bacteria with immunostimulatory activity - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新たに単離されたラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）の新規株、並びに当該新規株が有する免疫賦活作用を利用した食品及び医薬に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel strain of newly isolated Lactobacillus pentosus, and foods and medicines utilizing the immunostimulatory action of the novel strain.
乳酸菌は従来から、整腸作用やヒトの健康に有益な効果をもたらすプロバイオティクスとして知られている。乳酸菌とは、乳酸を生成する細菌の総称であり、乳酸菌と呼ばれる微生物群は分類学上の多数の属や種にまたがっている。代表的な乳酸菌として、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属等に属する細菌が知られている。こうした乳酸菌の分類には、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく系統解析が利用されている。乳酸菌の生態や生理学的な特徴は極めて多様である。一部の乳酸菌は、投与された際に、整腸作用を有するほか、免疫調節作用、血圧低下作用、アレルギー低下作用、抗コレステロール作用などの生理作用を発揮することが見出されている。 Lactic acid bacteria have long been known as probiotics that have beneficial effects on intestinal regulation and human health. Lactic acid bacteria is a general term for bacteria that produce lactic acid, and the group of microorganisms called lactic acid bacteria covers many taxonomic genera and species. Bacteria belonging to the genera Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus, etc. are known as typical lactic acid bacteria. Phylogenetic analysis based on the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene is used for classification of such lactic acid bacteria. The ecological and physiological characteristics of lactic acid bacteria are extremely diverse. It has been found that some lactic acid bacteria, when administered, exhibit physiological actions such as immunoregulatory action, blood pressure-lowering action, allergy-lowering action, and anti-cholesterol action, in addition to intestinal regulation action.
ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）は、グラム陽性の通性嫌気性乳酸菌であり、漬物から分離されることの多い乳酸菌として知られている。ラクトバチルス・ペントーサスの特定の菌株については、免疫賦活作用や免疫調節作用を有する菌株が単離されている（特許文献１：特開２００５－３３３９１９号公報、特許文献２：特許第５５５７４８３号公報）。このような機能性を有する乳酸菌を利用して、漬物、ヨーグルトやチーズなどの乳製品、さらには乳酸菌を含むサプリメント又は医薬品などの製品が開発されている。 Lactobacillus pentosus is a Gram-positive facultative anaerobic lactic acid bacterium and is known as a lactic acid bacterium often isolated from pickles. Regarding specific strains of Lactobacillus pentosa, strains having immunostimulatory and immunomodulatory effects have been isolated (Patent Document 1: JP-A-2005-333919, Patent Document 2: Patent No. 5557483). . Utilizing such functional lactic acid bacteria, pickles, dairy products such as yogurt and cheese, and products such as supplements and pharmaceuticals containing lactic acid bacteria have been developed.
様々な乳酸菌種において、数多くの機能性に関する報告がある中で、どの株がより優れているかを評価するためには同種の乳酸菌の学術的な基準株を指標として比較することが望ましい。しかしながら現状では、乳酸菌添加の有無によってサイトカインの産生量が変化したかという検討をしている報告がほとんどであり、同種の基準株を指標として比較を行った報告は少なく、特許文献２：特許第５５５７４８３号のように限られている。 Among various reports on the functionality of various lactic acid bacteria, it is desirable to compare academic standard strains of the same type of lactic acid bacteria as indicators in order to evaluate which strain is superior. However, at present, most reports are examining whether the amount of cytokine production changed depending on the presence or absence of the addition of lactic acid bacteria, and there are few reports comparing the same type of standard strain as an index. 5557483 is limited.
そこで本発明者らは、漬物から単離した新規の乳酸菌であるラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）ＫＹ５－Ｌ２株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５８）及びＫＹ５－Ｌ１０株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５９）について、ラクトバチルス・ペントーサスの基準株であるＪＣＭ１５５８T株とそれぞれ比較検討を行った。その結果、驚くべきことにマウス脾臓細胞培養物に対してＫＹ５－Ｌ２株、及びＫＹ５－Ｌ１０株の加熱殺菌菌体を添加した場合に、基準株の加熱殺菌菌体を添加した場合と比較して、ＩＬ－１２誘導能が顕著に高く、そしてＩＬ－１２とＩＬ－１０の誘導能のバランスがＩＬ－１２に傾くことを見出し、本発明に至った。 Therefore, the present inventors have isolated novel lactic acid bacteria from pickles, Lactobacillus pentosus strain KY5-L2 (acceptance number: NITE AP-03358) and KY5-L10 strain (acceptance number: NITE AP- 03359) was compared with the type strain JCM1558 T strain of Lactobacillus pentosus. As a result, surprisingly, when the heat-killed cells of the KY5-L2 strain and the KY5-L10 strain were added to the mouse spleen cell culture, compared with the case where the heat-killed cells of the reference strain were added. As a result, the present inventors have found that the IL-12 inducibility is remarkably high, and that the balance between the inducibility of IL-12 and IL-10 is favored by IL-12, leading to the present invention.
したがって、本発明は、以下の発明に関する：
［１］ 受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５８及び受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５９からなる群から選ばれるラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）である乳酸菌。
［２］ 項目１に記載の乳酸菌、その培養物、又はその死菌体を含む、組成物。
［３］ 項目１に記載の乳酸菌、その培養物、又はその死菌体を含む、免疫賦活剤。
［４］ ＩＬ－１２の産生を促進し、基準株ＪＣＭ１５５８T株と比較してＩＬ－１０の産生量に対するＩＬ－１２の産生量の比を高くする、項目３に記載の免疫賦活剤。
［５］ 項目１に記載の乳酸菌の死菌体。
［６］ 項目１に記載の乳酸菌、その培養物、又はその死菌体を含む、食品。
［７］ 項目１に記載の乳酸菌、その培養物、又はその死菌体を含む、免疫賦活作用を有する機能性食品。
［８］ 項目１に記載の乳酸菌又はその培養物を含む、スターターカルチャ。
［９］ 項目１に記載の乳酸菌又はその培養物を食品原料と接触させ、発酵させる工程を含む、発酵食品の製造方法。
Accordingly, the present invention relates to the following inventions:
[1] A lactic acid bacterium that is Lactobacillus pentosus selected from the group consisting of Receipt No.: NITE AP-03358 and Receipt No.: NITE AP-03359.
[2] A composition comprising the lactic acid bacterium according to Item 1, its culture, or its dead cells.
[3] An immunostimulant comprising the lactic acid bacterium according to item 1, its culture, or its dead cells.
[4] The immunopotentiating agent according to item 3, which promotes IL-12 production and increases the ratio of IL-12 production to IL-10 production compared to the reference strain JCM1558 T strain.
[5] Dead cells of the lactic acid bacterium according to Item 1.
[6] A food comprising the lactic acid bacterium according to item 1, its culture, or its dead cells.
[7] A functional food having an immunostimulatory action, comprising the lactic acid bacterium according to item 1, its culture, or its dead cells.
[8] A starter culture comprising the lactic acid bacterium according to item 1 or a culture thereof.
[9] A method for producing a fermented food, comprising the step of bringing the lactic acid bacterium according to item 1 or a culture thereof into contact with a food material and fermenting it.
本発明の乳酸菌は、免疫機能の賦活化に関わるＩＬ－１２の産生を誘導する。これにより、基準株と比較して、免疫バランスを免疫促進側にシフト可能であり、乳酸菌又はその培養物を摂取した対象において免疫賦活効果が発揮される。 The lactic acid bacterium of the present invention induces production of IL-12 involved in activation of immune function. As a result, the immune balance can be shifted to the immunostimulatory side compared to the reference strain, and an immunostimulatory effect is exhibited in subjects who have ingested the lactic acid bacterium or its culture.
本発明は、ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）に属する単離された乳酸菌の新規株ＫＹ５－Ｌ２株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５８）又はＫＹ５－Ｌ１０株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５９）に関する。これらの乳酸菌は、しば漬けの発酵物から単離されており、全ゲノム解析に供されている。これらの菌株は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく系統解析によりラクトバチルス・ペントーサスに属することが決定されている。本発明にかかる菌株の加熱殺菌菌体がマウスの培養脾臓細胞に添加された場合に、免疫機能の賦活化に関わるＩＬ－１２の高い産生量を誘導する（図１）。これにより、基準株ＪＣＭ１５５８T株と比較すると、本発明にかかる菌株により、免疫バランスが免疫促進側にシフトすることを意味する。乳酸菌を摂取した場合にも同様のサイトカイン誘導能を発揮すると考えられ、本発明の菌株を免疫機能の活性を賦活化する免疫賦活剤として使用することができる。本発明の乳酸菌には、受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５８、及び受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５９で寄託されている株、並びに当該株と同等の免疫賦活作用を有する、当該株の子孫株又は変異株も包含する。 The present invention relates to an isolated novel strain of lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus pentosus, strain KY5-L2 (acceptance number: NITE AP-03358) or strain KY5-L10 (acceptance number: NITE AP-03359). . These lactic acid bacteria have been isolated from fermented pickles and subjected to whole genome analysis. These strains have been determined to belong to Lactobacillus pentosus by phylogenetic analysis based on the nucleotide sequences of the 16S rRNA genes. When heat-killed cells of the strain according to the present invention are added to cultured spleen cells of mice, they induce a high production of IL-12, which is involved in activation of immune function (Fig. 1). This means that the strain according to the present invention shifts the immune balance to the immunostimulatory side as compared with the reference strain JCM1558 T strain. It is thought that the same cytokine-inducing ability is exhibited even when lactic acid bacteria are ingested, and the strain of the present invention can be used as an immunostimulator that activates the activity of immune function. The lactic acid bacteria of the present invention include the strains deposited under Accession No.: NITE AP-03358 and Accession No.: NITE AP-03359, and progeny strains or mutant strains of the strains having immunostimulatory effects equivalent to those of the strains. also includes
免疫賦活作用とは、免疫活性を亢進することをいう。免疫は、炎症促進性サイトカイン、例えばＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α等の産生量と、炎症抑制性サイトカイン、例えばＩＬ－１０等の産生量とのバランスにより調節されている。炎症促進性サイトカインの産生が増加すると、免疫バランスは免疫促進側にシフトし、これにより免疫賦活作用が生じる。免疫賦活作用は、培養細胞による炎症促進性サイトカインの発現量又は産生量により簡易的に計測することができる。また、炎症促進性サイトカインと炎症抑制性サイトカインとの比に基づき、免疫賦活と免疫鎮静のどちらの作用が強いのかを決定することができる。培養細胞としては、特に脾臓細胞、マクロファージ、単球などの細胞を利用することができる。別の手法として、経口投与された動物における免疫機能を測定することによっても計測することができる。 Immunostimulatory action refers to enhancement of immune activity. Immunity is regulated by the balance between the production of pro-inflammatory cytokines such as IL-12, IL-6 and TNF-α and the production of anti-inflammatory cytokines such as IL-10. Increased production of proinflammatory cytokines shifts the immune balance toward immunostimulatory effects, resulting in immunostimulatory effects. The immunostimulatory action can be simply measured by the amount of expression or production of pro-inflammatory cytokines by cultured cells. In addition, based on the ratio of pro-inflammatory cytokines to anti-inflammatory cytokines, it is possible to determine which effect, immunostimulatory or immunosedative, is stronger. Cells such as spleen cells, macrophages, and monocytes can be used as cultured cells. Alternatively, it can be measured by measuring immune function in orally administered animals.
免疫賦活作用により、本発明に係る乳酸菌を摂取することで、ウイルスや細菌などによる感染症に対し、また癌などの疾患に対しても抵抗性となり、これらの疾患に対して、治療又は予防効果を発揮する。 By ingesting the lactic acid bacterium according to the present invention due to its immunostimulatory action, it becomes resistant to infectious diseases caused by viruses and bacteria, and to diseases such as cancer, and has therapeutic or preventive effects against these diseases. demonstrate.
本発明の別の態様では、ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）に属する単離された乳酸菌の新規株ＫＹ５－Ｌ２株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５８）及びＫＹ５－Ｌ１０株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５９）からなる群から選ばれる乳酸菌、その培養物、又はその死菌体を含む組成物又は免疫賦活剤にも関する。免疫賦活剤は、投与された場合に生体において、免疫機能を亢進することができる物をいう。免疫賦活剤は、ＩＬ－１２産生促進剤ともいうことができる。免疫賦活剤を投与、好ましくは経口投与することにより、動物において免疫賦活作用が発揮される。本発明の組成物及び免疫賦活剤は、医薬品として使用されてもよいし、食品又は機能性食品として用いられてもよい。免疫機能が亢進されることで、ウイルスや細菌による感染症、癌の治療、予防、軽減、又は緩和することができる。したがって、本発明の免疫賦活剤とは、感染症や癌の治療又は予防剤ともいうことができる。本発明の免疫賦活剤は、動物、特にヒトに対して投与されることが好ましいが、家畜動物、ペット動物、実験動物、動物園動物などに対して投与されてもよい。本発明の組成物及び免疫賦活剤を動物の食餌に混ぜて飼料として与えてもよいし、本発明の乳酸菌で発酵された食品を飼料として与えてもよい。 In another aspect of the present invention, isolated novel strains of lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus pentosus, KY5-L2 strain (accession number: NITE AP-03358) and KY5-L10 strain (accession number: NITE AP) -03359). An immunostimulant refers to a substance that can enhance immune function in a living body when administered. An immunostimulant can also be referred to as an IL-12 production promoter. Immunostimulatory effects are exhibited in animals by administration, preferably oral administration, of the immunostimulatory agent. The composition and immunostimulant of the present invention may be used as pharmaceuticals, foods or functional foods. By enhancing the immune function, viral and bacterial infections and cancer can be treated, prevented, alleviated, or alleviated. Therefore, the immunostimulant of the present invention can also be referred to as a therapeutic or preventive agent for infectious diseases and cancer. The immunostimulant of the present invention is preferably administered to animals, particularly humans, but may also be administered to livestock animals, pet animals, experimental animals, zoo animals, and the like. The composition and immunostimulant of the present invention may be mixed with animal diet and given as feed, or the food fermented with the lactic acid bacterium of the present invention may be given as feed.
本発明の別の態様ではＫＹ５－Ｌ２株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５８）及びＫＹ５－Ｌ１０株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５９）からなる群から選ばれる乳酸菌、その培養物、又は死菌体を含む食品に関する。このような食品は、本発明の乳酸菌を添加することで製造される。本発明に係る乳酸菌を含む食品は、免疫賦活作用を有しうる。このような食品の例として、発酵野菜製品、発酵乳製品、発酵魚製品、発酵肉製品、発酵調味料、乳酸菌飲料、食べるぬか床が挙げられる。発酵野菜製品の一例として、漬物が挙げられる。漬物では、本発明にかかる乳酸菌を添加して発酵された発酵漬物が好ましいが、浅漬けや酢漬けなど、発酵を介していない漬物であってもよい。発酵を介していない漬物に対し、本発明にかかる乳酸菌又はその培養物を添加することで、免疫賦活作用を付与することができる。発酵乳製品としては、チーズ、ヨーグルト、バターなどが挙げられる。 In another aspect of the present invention, a lactic acid bacterium selected from the group consisting of KY5-L2 strain (accession number: NITE AP-03358) and KY5-L10 strain (accession number: NITE AP-03359), its culture, or killed bacteria relating to food containing Such foods are produced by adding the lactic acid bacteria of the present invention. Foods containing lactic acid bacteria according to the present invention can have an immunostimulatory effect. Examples of such foods include fermented vegetable products, fermented milk products, fermented fish products, fermented meat products, fermented seasonings, lactic acid beverages, and rice bran beds. One example of a fermented vegetable product is pickles. For pickles, fermented pickles fermented by adding the lactic acid bacteria according to the present invention are preferable, but pickles that are not fermented, such as light pickles and vinegar pickles, may also be used. Immunostimulatory action can be imparted to unfermented pickles by adding the lactic acid bacterium of the present invention or its culture. Fermented milk products include cheese, yogurt, butter, and the like.
漬物に用いられる食品原料として、一般に市販されている漬物に用いられる任意の野菜が使用され、ナス、ダイコン、カブ、ニンジン、ショウガ、ミョウガ、キュウリ、ゴーヤ、ピーマン、トウガラシ、ハクサイ、アオナ、高菜、野沢菜、壬生菜、シソ、ニンニク、トマト、ゴボウ、米、豆類、糠などが挙げられるが、これらに限定されることを意図するものではない。これらの野菜は、通常、洗浄後、塩を含む調味料で下漬け処理を行い、その後に本発明の乳酸菌を添加して発酵処理が行なわれる。下漬け処理及び発酵処理は、目的の漬物製品に応じて適宜選択されうる。発酵処理として、目的の野菜とともに、任意に添加物を加えて発酵される。かかる添加物として糠、ふすま、昆布、唐辛子、陳皮などが使用されうる。食品原料としては、上述の野菜類の他、生乳、加工乳、大豆、米、ぬかなどが用いられる。 As a food material used for pickles, any vegetables that are commonly used for pickles on the market are used, including eggplant, radish, turnip, carrot, ginger, Japanese ginger, cucumber, bitter gourd, green pepper, hot pepper, Chinese cabbage, Aona, mustard greens, Nozawana, mibuna, perilla, garlic, tomato, burdock, rice, beans, rice bran, etc., but not limited to these. After washing, these vegetables are usually pre-pickled with a seasoning containing salt, and then fermented by adding the lactic acid bacteria of the present invention. Pre-pickle treatment and fermentation treatment can be appropriately selected according to the target pickled product. Fermentation is carried out with the desired vegetables, optionally adding additives. As such additives, rice bran, wheat bran, kelp, red pepper, chili pepper, etc. can be used. Raw milk, processed milk, soybeans, rice, rice bran, etc. are used as food raw materials in addition to the above-mentioned vegetables.
本発明に係る乳酸菌、その培養物、又はその死菌体を含む食品は、免疫賦活作用を有する機能性食品として製造されてもよい。機能性食品とは、機能を発揮することが特定された食品のことをいう。機能性食品としては、本発明にかかる乳酸菌又はその培養物を含み、免疫賦活作用を表示されたサプリメント、機能性表示食品、特定保健用食品、および飲料剤などが挙げられる。 A food containing the lactic acid bacterium, its culture, or its dead cells according to the present invention may be produced as a functional food having an immunostimulatory action. A functional food is a food that has been specified to exhibit a function. Examples of functional foods include supplements containing the lactic acid bacterium of the present invention or its culture and labeled with immunostimulatory action, foods with function claims, foods for specified health uses, beverages, and the like.
ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２ｐ３５とＩＬ－１２ｐ４０から構成されるヘテロ二量体のタンパク質であり、炎症性のサイトカインとして知られている。ヘテロ二量体のことを、特にＩＬ－１２ｐ７０と呼ぶ。ＩＬ－１２は、細菌を貪食した食細胞および樹状細胞によって主に産生される。ＩＬ－１２は、ＮＫ細胞の刺激の他、ナイーブＴ細胞をＴｈ１細胞への分化を誘導し、細菌やウイルスに対する抵抗性を付与するとともに、抗血管新生活性を示し、免疫関連疾患の病因となりうる。 IL-12 is a heterodimeric protein composed of IL-12p35 and IL-12p40, and is known as an inflammatory cytokine. The heterodimer is specifically referred to as IL-12p70. IL-12 is produced primarily by phagocytes and dendritic cells that have phagocytosed bacteria. In addition to stimulating NK cells, IL-12 induces differentiation of naive T cells into Th1 cells, confers resistance to bacteria and viruses, exhibits anti-angiogenic activity, and causes immune-related diseases. sell.
ＩＬ－１０は、３５～４０ｋＤの２つのサブユニットから構成されるホモ二量体タンパク質であり、炎症抑制性のサイトカインとして知られている。ＩＬ－１０は、主に２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）より産生され、活性化Ｂ細胞、単球、肥満細胞、又は角化細胞などからも産生される。ＩＬ－１０の生理作用は、多岐に渡るが、マクロファージにおけるＩＦＮ－γの合成を阻害し、また単核細胞におけるＩＬ－１２の産生を阻害することが知られており、炎症反応に対し抑制的に寄与する。また、ＩＬ－１０は、ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖とサイトカイン合成を阻害することも知られている。 IL-10 is a homodimeric protein composed of two subunits of 35-40 kD, and is known as an anti-inflammatory cytokine. IL-10 is mainly produced by type 2 helper T cells (Th2), and also produced by activated B cells, monocytes, mast cells, or keratinocytes. IL-10 has a wide range of physiological actions, but it is known to inhibit the synthesis of IFN-γ in macrophages and the production of IL-12 in monocytes, suppressing inflammatory reactions. contribute to IL-10 is also known to inhibit CD4 + T cell proliferation and cytokine synthesis.
培養細胞により産生されるＩＬ－１２の産生量とＩＬ－１０の産生量のバランス、例えば比（ＩＬ－１０／ＩＬ－１２比又はＩＬ－１２／ＩＬ－１０比）を、炎症に対する作用を示す指標として使用することができる。ＩＬ－１０に対するＩＬ－１２比が高くなるほど、炎症促進性であることを示し、低くなると炎症抑制性であることを示す。基準株を適用した場合のＩＬ－１０の産生量とＩＬ－１２の産生量のバランスと比較することで、乳酸菌の炎症に対する作用を決定することができる。 The balance between IL-12 production and IL-10 production produced by the cultured cells, for example, the ratio (IL-10/IL-12 ratio or IL-12/IL-10 ratio) shows the effect on inflammation. can be used as an index. A higher IL-12 to IL-10 ratio is indicative of pro-inflammatory and a lower ratio is indicative of anti-inflammatory. By comparing the balance between the IL-10 production amount and the IL-12 production amount when the reference strain is applied, the effect of lactic acid bacteria on inflammation can be determined.
本発明における乳酸菌の培養物は、一例として乳酸菌を培地で培養した培養液である。培養物には、乳酸菌及び／又はその死菌体が含まれうる。培養物は、乳酸菌を公知の方法で培養することにより得られる。乳酸菌の培養に通常用いられる培地、例えばＭＲＳ培地、ＢＣＰ培地などが用いられ、乳酸菌株に応じ適切なｐＨ、例えば３～８、好ましくは４～７を選択しうる。株の分離・保存のために固体培地が用いられてよいし、液体培地が用いられてもよい。培養は、１０～４５℃、好ましくは２５～４０℃、さらにより好ましくは３０～３７℃で、嫌気条件又は好気条件下で行なわれうる。培養物に遠心分離を適用して、乳酸菌を収集することができる。収集された乳酸菌の菌体をそのまま、又は殺菌処理後の死菌体を製剤化し、サプリメントを製造することができる。このようなサプリメントは、錠剤、カプセル剤、液剤に剤形されうる。本発明に乳酸菌は、死菌体について免疫賦活作用が誘導されることが見いだされている。理論に限定されることを意図するものではないが、かかる作用は、死菌体の構成成分の一部、例えば細胞外多糖（ＥＰＳ）により誘導されるものであり、生きた乳酸菌でも当然に同等の作用が発揮される。腸内での生存し、菌叢を構成する観点では、生きた乳酸菌の使用が好ましい。 The culture of lactic acid bacteria in the present invention is, for example, a culture solution obtained by culturing lactic acid bacteria in a medium. The culture may contain lactic acid bacteria and/or dead cells thereof. A culture is obtained by culturing lactic acid bacteria by a known method. A medium commonly used for culturing lactic acid bacteria, such as MRS medium and BCP medium, can be used, and an appropriate pH, such as 3-8, preferably 4-7, can be selected according to the lactic acid strain. A solid medium or a liquid medium may be used for isolating and preserving strains. Cultivation can be performed at 10-45° C., preferably 25-40° C., even more preferably 30-37° C. under anaerobic or aerobic conditions. Centrifugation can be applied to the culture to harvest the lactic acid bacteria. The collected lactic acid bacteria can be used as they are, or the dead cells after sterilization can be formulated to produce supplements. Such supplements can be formulated as tablets, capsules, and liquids. It has been found in the present invention that lactic acid bacteria induce an immunostimulatory effect on dead cells. Although not intended to be limited to theory, such action is induced by some of the constituent components of dead bacteria, such as extracellular polysaccharide (EPS), and is naturally equivalent in live lactic acid bacteria. The action of is exhibited. It is preferable to use live lactic acid bacteria from the viewpoint of survival in the intestine and formation of bacterial flora.
本発明の乳酸菌を医薬品に用いる場合には、生きた乳酸菌又は死菌体を、適切な賦形剤とともに製剤化することとを含む。剤形としては、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、坐剤、注射剤などを上げることができる。本医薬品は、経口、経直腸など任意の投与経路で投与されてよいが、腸内へ簡便に投与する観点で経口投与が好ましい。 The use of the lactic acid bacteria of the present invention in pharmaceuticals includes formulating live lactic acid bacteria or dead cells with appropriate excipients. Dosage forms include tablets, capsules, powders, syrups, suppositories, injections and the like. The drug may be administered by any administration route such as oral or rectal administration, but oral administration is preferable from the viewpoint of easy administration into the intestine.
発明の別の態様では、ＫＹ５－Ｌ２株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５８）及びＫＹ５－Ｌ１０株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５９）からなる群から選ばれる乳酸菌、又はその培養物を含むスターターカルチャに関する。スターターカルチャとは、特定の菌叢での発酵を促進するために使用される乳酸菌又はその培養物をいう。スターターカルチャとしては、単離培養された乳酸菌の培養物又は培養物から収集された菌体を凍結乾燥された粉末であってもよいし、乳酸菌を含む培養物又はその凍結物であってもよい。スターターカルチャの一例として、乾燥菌体やぬか床が挙げられる。食品原料に添加される前に、前培養を行うことで対数増殖期にある培養物をスターターカルチャとして用いてもよい。 In another aspect of the invention, a starter culture comprising a lactic acid bacterium selected from the group consisting of strain KY5-L2 (accession number: NITE AP-03358) and strain KY5-L10 (accession number: NITE AP-03359), or a culture thereof Regarding. Starter culture refers to lactic acid bacteria or cultures thereof that are used to promote fermentation in specific flora. The starter culture may be a culture of lactic acid bacteria isolated and cultured, a powder obtained by freeze-drying the cells collected from the culture, a culture containing lactic acid bacteria, or a frozen product thereof. . Examples of starter cultures include dried cells and rice bran beds. A culture in the logarithmic growth phase may be used as a starter culture by pre-cultivating it before it is added to the food material.
本発明の一の態様では、本発明にかかる乳酸菌又はその培養物と食品原料とを接触させる工程を含む、発酵食品の製造方法にも関する。乳酸菌又はその培養物はスターターカルチャとして添加されてもよいし、別に製造された発酵物の一部として添加されてもよい。乳酸菌又はその培養物と食品原料とを接触後、発酵工程が行なわれる。ここで接触とは、、乳酸菌又はその培養物を食品原料に添加すること、及び食品原料を乳酸菌又はその培養物に添加することを含み、さらに混合が行われてもよい。発酵工程は、適切な温度管理がされていてもよいし、周囲環境の温度で行なわれてもよい。発酵期間は、良味を呈するよう、食品の種類に応じて適宜選択される。 One aspect of the present invention also relates to a method for producing a fermented food, comprising the step of contacting the lactic acid bacterium of the present invention or its culture with a food material. Lactic acid bacteria or cultures thereof may be added as a starter culture or as part of a separately produced fermentate. After contacting the lactic acid bacteria or its culture with the food material, a fermentation step is performed. Here, contacting includes adding the lactic acid bacterium or its culture to the food raw material, and adding the food raw material to the lactic acid bacterium or its culture, and further mixing may be performed. The fermentation process may be appropriately temperature controlled or may be carried out at ambient temperature. The fermentation period is appropriately selected according to the type of food so as to exhibit good taste.
変異株とは、単離された菌株に対し、人為的又は偶発的変異が加えられた菌株のことを指す。変異株は、単離された菌株を継代することで自然に生じうるし、変異原、例えば変異を引き起こす化学物質で処理する化学処理や、紫外線、Ｘ線、ガンマ線などを照射する物理処理が挙げられる。化学処理としては、核酸に作用して変異を生じさせる物質、例えば亜硝酸、ヒドロキシルアミン、アクリジンの他に、塩基アナログ、例えば５－ブロモウラシル、２－アミノプリンなどが用いられる。 A mutant strain refers to a strain in which an artificial or accidental mutation is added to an isolated strain. Mutant strains can be naturally generated by subculturing isolated strains, and mutagens, such as chemical treatments that treat with chemical substances that cause mutations, and physical treatments that irradiate ultraviolet rays, X-rays, gamma rays, etc. be done. Chemical treatments include substances that act on nucleic acids to induce mutations, such as nitrous acid, hydroxylamine, and acridine, as well as base analogues, such as 5-bromouracil and 2-aminopurine.
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。 All documents mentioned herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。 The embodiments of the invention described below are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention. The technical scope of the present invention is limited only by the description of the claims. Modifications of the present invention, such as additions, deletions and replacements of constituent elements of the present invention, can be made without departing from the gist of the present invention.
実施例１：試験に供した乳酸菌株と培地
（１）乳酸菌菌株と培養培地
基準株としてラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）ＪＣＭ１５５８T株を使用した。基準株は理化学研究所 微生物材料開発室から入手した。評価株としては、漬物から分離したＫＹ５－Ｌ２株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５８）及びＫＹ５－Ｌ１０株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５９）を使用した。これらの乳酸菌は全ゲノム解析を行い、種を同定した。これらの乳酸菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託された（受領日：２０２０年１２月２５日）。
培地はベクトンアンドディッキンソン社製のＭＲＳ培地を使用した。平板培地で使用する場合は寒天濃度が１．５％となるように添加した。製造者のマニュアルに従い、１２１℃ １５分で加熱滅菌したものを使用した。
（２）乳酸菌の加熱菌体の調製
あらかじめ作製した、使用する乳酸菌株のグリセロールストックを、ＭＲＳ平板培地に塗抹した。三菱ガス化学社製アネロパックを使用し、嫌気的に３０℃で１８時間培養を行なった。得られた菌体を、ネジ口試験管に入れたＭＲＳ液体培地に１白金耳分接種し、３０℃で２４時間静置培養を行い、これを前培養とした。前培養液を、同じくネジ口試験管に入れたＭＲＳ液体培地に、波長６００ｎｍで測定した時の濁度が０．１となるように接種し、３０℃で２４時間、静置培養を行なった。培養後の培養液を１ｍＬ取り、２０４００ｘｇ４℃１０分で遠心し生理食塩水で菌体を洗浄する作業を２回繰り返したのち、湿菌体重量を測定した。湿菌体重量が１０ｍｇ得られる培養液量をエッペンチューブに取り、８０℃で３０分加熱を行なった。加熱後の菌体をさらに２０４００ｘｇ５分２０℃で遠心したのち、ＰＢＳバッファー（ニッポンジーン社製10x PBS Buffer pH7.4を１０倍希釈）で洗浄したのち、再度２０４００ｘｇ５分２０℃で遠心したものを１ｍＬのＰＢＳバッファーに懸濁し、これを加熱菌体サンプルとした。
Example 1: Lactic acid bacterium strain and culture medium used in the test (1) Lactic acid bacterium strain and culture medium Lactobacillus pentosus JCM1558 T strain was used as a reference strain. The type strain was obtained from the Microbial Materials Development Division, RIKEN. As strains to be evaluated, KY5-L2 strain (acceptance number: NITE AP-03358) and KY5-L10 strain (acceptance number: NITE AP-03359) isolated from pickles were used. Whole-genome analysis was performed on these lactic acid bacteria, and species were identified. These lactic acid bacteria were deposited at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depository (NPMD) (acceptance date: December 25, 2020).
The medium used was MRS medium manufactured by Becton and Dickinson. When used in a plate medium, it was added so that the agar concentration was 1.5%. According to the manufacturer's manual, heat sterilization at 121° C. for 15 minutes was used.
(2) Preparation of Heated Cells of Lactic Acid Bacteria A previously prepared glycerol stock of the lactic acid bacteria strain to be used was smeared on an MRS plate medium. Aneropack manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd. was used and anaerobically cultured at 30° C. for 18 hours. One platinum loop of the obtained bacterial cells was inoculated into the MRS liquid medium placed in a screw cap test tube, and statically cultured at 30° C. for 24 hours, which was used as a preculture. The preculture solution was inoculated into the MRS liquid medium similarly placed in a screw cap test tube so that the turbidity measured at a wavelength of 600 nm was 0.1, and static culture was performed at 30 ° C. for 24 hours. . After culturing, 1 mL of the culture solution was collected, centrifuged at 20400×g, 4° C. for 10 minutes, and the cells were washed with physiological saline twice, after which the wet cell weight was measured. An amount of the culture solution that gave a wet cell weight of 10 mg was placed in an Eppendorf tube and heated at 80° C. for 30 minutes. The heated cells were further centrifuged at 20,400 xg for 5 minutes at 20°C, washed with PBS buffer (10-fold dilution of Nippon Gene 10x PBS Buffer pH 7.4), and centrifuged again at 20,400 xg for 5 minutes at 20°C. It was suspended in PBS buffer and used as a heated cell sample.
（３）ＩＬ－１２誘導能評価
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌性、１０週齢）から脾臓細胞を採取し、細胞濃度が２．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう細胞液を調製した。これに、乳酸菌の加熱菌体サンプル（菌体の終濃度は０．５又は１．０μｇ／ｍｌ）を添加して培養を行なった。培養は３７℃、５％ＣＯ2環境下で行い、ＩＬ－１２を測定するサンプルについては２４時間、ＩＬ－１０を測定するサンプルについては５日間培養した。その後、遠心にて培養上清を回収しＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１０濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した（ｎ＝３）。ラクトバチルス・ペントーサスの菌株を用いた場合のＩＬ－１２についての結果を図１に示す。ラクトバチルス・ペントーサスの菌株を用いた場合のＩＬ－１０についての結果を図２に示す。ラクトバチルス・ペントーサスの菌株を用いた場合のＩＬ－１０とＩＬ－１２の比（ＩＬ－１２／ＩＬ－１０）についての結果を図３に示す。乳酸菌ＫＹ５－Ｌ２株及びＫＹ５－Ｌ１０株は、ＩＬ－１２及びＩＬ－１０の産生を誘導した。一方、基準株ＪＣＭ１５５８T株もＩＬ－１０及びＩＬ－１２の両方の産生を誘導した。しかしながら、ＩＬ－１０の産生量とＩＬ－１２の産生量のバランスについて比較すると、ＫＹ５－Ｌ２株及びＫＹ５－Ｌ１０株では、ＩＬ－１０の産生量とＩＬ－１２の産生量のバランスが、ＩＬ－１２側にシフトしており、基準株ＪＣＭ１５５８T株と比較して、免疫バランスを免疫促進側にシフトさせる。
(3) Evaluation of IL-12 Induction Ability Spleen cells were collected from BALB/c mice (female, 10 weeks old), and a cell solution was prepared at a cell concentration of 2.5×10 6 cells/ml. A heated cell sample of lactic acid bacteria (final cell concentration: 0.5 or 1.0 μg/ml) was added to the mixture and cultured. Cultivation was carried out at 37° C. in a 5% CO 2 environment. Samples for IL-12 measurement were cultured for 24 hours, and IL-10 samples for 5 days. After that, the culture supernatant was collected by centrifugation and IL-12p70 and IL-10 concentrations were measured by ELISA (n=3). Results for IL-12 with strains of Lactobacillus pentosus are shown in FIG. Results for IL-10 using strains of Lactobacillus pentosus are shown in FIG. The results for the IL-10 to IL-12 ratio (IL-12/IL-10) when using the Lactobacillus pentosus strain are shown in FIG. Lactic acid bacteria strains KY5-L2 and KY5-L10 induced the production of IL-12 and IL-10. On the other hand, the type strain JCM1558 T strain also induced production of both IL-10 and IL-12. However, when comparing the balance between IL-10 production and IL-12 production, in KY5-L2 strain and KY5-L10 strain, the balance between IL-10 production and IL-12 production is It is shifted to the -12 side, shifting the immune balance to the immunostimulatory side compared to the reference strain JCM1558 T strain.
製造例１：ヨーグルト
乳酸菌ＫＹ５－Ｌ２株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５８）又はＫＹ５－Ｌ１０株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５９）を牛乳に植菌し、室温で３日間静置し、ヨーグルトを調製した。
Production Example 1: Yogurt Lactic acid bacterium KY5-L2 strain (receipt number: NITE AP-03358) or KY5-L10 strain (receipt number: NITE AP-03359) is inoculated in milk and allowed to stand at room temperature for 3 days to produce yogurt. prepared.
製造例２：漬物
ナスをスライスし、ナスの重量の１５％の赤しその葉と混ぜ合わせ、ナスと赤しその重量の４％の塩を添加して、１０分放置し、揉み合わせた後に絞って水を捨てる。漬物容器に移し、ＫＹ５－Ｌ２株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５８）又はＫＹ５－Ｌ１０株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３３５９）を添加し、重石をして１０日間室温で放置し、柴漬けを製造した。
Production Example 2: Pickles Eggplants are sliced, mixed with 15% of the weight of the eggplant with red perilla leaves, added with 4% of the weight of the eggplant and red perilla, and left for 10 minutes. Squeeze and discard the water. Transfer to a pickle container, add KY5-L2 strain (receipt number: NITE AP-03358) or KY5-L10 strain (receipt number: NITE AP-03359), weight and leave at room temperature for 10 days to pickle shibazuke. manufactured.
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