JP2022169813A - Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性を制御する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ＤＮＡ切断活性を可逆的に制御可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を提供する。【解決手段】 Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性を制御する方法であって、（１）標的ＤＮＡにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体を接触させるステップと、ここで、前記複合体が、ガイドＲＮＡと、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列に基づく番号付けで８４０番目の位置に対応するヒスチジン残基における点変異を含む不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを含み、次いで、（２）前記複合体にイミダゾールまたはその誘導体を接触させるステップとを含む方法。【選択図】 なし

Description

本発明は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性を制御する方法に関する。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、現在最も注目を集めるゲノム編集技術である。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、ガイドＲＮＡにより標的化された任意のＤＮＡ配列を特異的に切断する。しかし、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、標的配列以外の類似の配列も非特異的に切断してしまうオフターゲット効果を有しており、ゲノム編集の精度を高めるためには、オフターゲット効果を抑制する必要がある。オフターゲット効果は、活性化状態のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が細胞内に存在する時間が長ければ長いほど増大することから、複合体のＤＮＡ切断活性を時間的に制御する方法が望まれている。

Ｚｅｔｓｃｈｅらは、ラパマイシン誘導型スプリットＣａｓ９を報告している（非特許文献１）。この方法では、ＦＫＢＰおよびＦＲＢをそれぞれ融合させた２つのスプリットＣａｓ９断片を用い、ラパマイシンの添加によりＣａｓ９が再構成されると、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断活性が誘導される。この方法はゲノム編集の開始をタンパク質レベルで制御した初めての報告である。しかし、ラパマイシン、ＦＫＢＰおよびＦＲＢの高い親和性のために、ラパマイシンを除去しても再構成されたＣａｓ９が維持され、ゲノム編集を停止させることができず、ゆえに、ゲノム編集を時間的に制御することができない。また、Ｎｉｈｏｎｇａｋｉらは、光誘導性二量体化ドメインをそれぞれ融合させた２つのスプリットＣａｓ９断片を用い、光を照射することによりＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を誘導する方法を報告している（非特許文献２）。しかし、この方法でも、再構成されたＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を迅速に停止することには成功していない。

Zetsche, B. et al., Nat. Biotechnol., Vol. 33, pp. 139-142 (2015) Nihongaki, Y. et al., Nat. Biotechnol., Vol. 33, pp. 755-760 (2015)

本発明は、従来技術の諸問題を解消し、ＤＮＡ切断活性を可逆的にＯＮ／ＯＦＦ可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を提供することを目的としてなされたものである。

発明者らは、鋭意研究の結果、変異により低下したタンパク質の機能を低分子化合物の存在により回復させる「ケミカルレスキュー」の手法を採用することにより、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断活性を時間的に制御できることを見出した。

すなわち、本発明は、一実施形態によれば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性を制御する方法であって、（１）標的ＤＮＡにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体を接触させるステップと、ここで、前記複合体が、ガイドＲＮＡと、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列に基づく番号付けで８４０番目の位置に対応するヒスチジン残基における点変異を含む不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを含み、次いで、（２）前記複合体にイミダゾールまたはその誘導体を接触させるステップとを含む方法を提供するものである。

上記方法は、（３）前記ステップ（２）の後、イミダゾールまたはその誘導体を前記複合体から分離するステップをさらに含むことが好ましい。

前記点変異は、アラニン残基またはグリシン残基による置換であることが好ましい。

前記イミダゾールまたはその誘導体は、１～５００ｍＭの濃度であることが好ましい。

前記イミダゾールまたはその誘導体は、イミダゾールならびにイミダゾール環の２位および／または４位に置換基を有するイミダゾール誘導体からなる群から選択されることが好ましい。

上記方法は、インビトロで実施されてもよいし、インビボで実施されてもよい。

また、本発明は、一実施形態によれば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列に基づく番号付けで８４０番目の位置に対応するヒスチジン残基における点変異を含む不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸と、イミダゾールまたはその誘導体とを含む、ゲノム編集のためのキットを提供するものである。

本発明に係る方法によれば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断活性を時間的に制御することができる。そのため、本発明に係る方法によれば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系のオフターゲット効果を最小化することができ、高い精度でのゲノム編集が可能となる。

図１は、イミダゾールによるＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＡのＤＮＡ切断活性のケミカルレスキューの概略図である。 図２は、イミダゾール非存在下または存在下におけるＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０ＧのＤＮＡ切断活性を示す図である。 図３は、イミダゾール非存在下または存在下におけるＣａｓ９変異体Ｈ９８３ＡおよびＨ９８３ＧのＤＮＡ切断活性を示す図である。 図４は、種々のイミダゾール濃度におけるＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０ＧのＤＮＡ切断活性を示す図である。 図５は、イミダゾール存在下におけるＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＡのＤＮＡ切断活性の経時的回復を示す図である。 図６は、イミダゾール存在下におけるＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＧのＤＮＡ切断活性の経時的回復を示す図である。 図７は、種々の塩化マグネシウム濃度における、イミダゾールによるＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＡのＤＮＡ切断活性の回復を示す図である。 図８は、種々の塩化マグネシウム濃度における、イミダゾールによるＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＧのＤＮＡ切断活性の回復を示す図である。 図９は、各種イミダゾール誘導体によるＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＡのＤＮＡ切断活性の回復を示す図である。 図１０は、各種イミダゾール誘導体によるＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＧのＤＮＡ切断活性の回復を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。

本発明は、第一の実施形態によれば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性を制御する方法であって、（１）標的ＤＮＡにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体を接触させるステップと、ここで、前記複合体が、ガイドＲＮＡと、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列に基づく番号付けで８４０番目の位置に対応するヒスチジン残基における点変異を含む不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを含み、次いで、（２）前記複合体にイミダゾールまたはその誘導体を接触させるステップとを含む方法である。

本実施形態の方法では、ガイドＲＮＡと不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体を用いる。「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体」とは、ガイドＲＮＡにより認識される部位特異的にＣａｓ９ヌクレアーゼが誘導され、標的ＤＮＡ配列と相互作用することができる複合体を意味する。以降、本明細書では、ガイドＲＮＡと不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体を、「不活性型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体」とも記載する。

「ガイドＲＮＡ」とは、標的ＤＮＡ配列に対して相補的なガイド配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体を標的ＤＮＡへとガイドして特異的に結合させる機能を有するＲＮＡを意味する。ガイドＲＮＡの構造は、ガイド配列を含みさえすれば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系において上記の機能を有する限り、特に限定されない。すなわち、本実施形態におけるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とのデュアルＲＮＡであってもよいし、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとがリンカーにより連結された一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。ガイドＲＮＡの設計方法はすでに確立されており、例えば、当分野において公知のデザインツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ）など）を用いて設計することができる。

本実施形態における「不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列に基づく番号付けで８４０番目の位置に対応するヒスチジン残基における点変異を含む。

本実施形態における「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」は、化膿レンサ球菌、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）などの任意の細菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼであってよいが、好ましくは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ（配列番号１２；ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ：ＷＰ＿０１０９２２２５１）である。

また、本実施形態におけるＣａｓ９ヌクレアーゼには、細菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼと同等の生理機能が維持されている（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体が構成されると活性化され、標的ＤＮＡ配列を切断する）ことを限度として、これらの変異体やホモログなどが含まれてよい。したがって、本実施形態におけるＣａｓ９ヌクレアーゼには、細菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼと同等の生理機能が維持されている（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体が構成されると活性化され、標的ＤＮＡ配列を切断する）ことを限度として、上記細菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて算出することができる。細菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼの配列情報は、所定のデータベースなどから入手することができる。

本実施形態における不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、従来公知の任意の遺伝子工学的方法により、上で定義されたＣａｓ９ヌクレアーゼにおいて、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列に基づく番号付けで８４０番目の位置に対応するヒスチジン残基に点変異を導入することにより調製することができる。本実施形態における不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼにおいて、点変異によりヒスチジン残基に代えて導入されるアミノ酸残基は任意であってよいが、非極性アミノ酸残基であることが好ましく、アラニン残基またはグリシン残基であることが特に好ましい。

本実施形態の方法では、標的ＤＮＡに、不活性型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を接触させる。なお、本実施形態の方法は、インビトロ（すなわち、反応溶液中）で実施されてもよいし、インビボ（すなわち、細胞内）で実施されてもよい。

本実施形態の方法をインビトロで実施する場合には、例えば、標的ＤＮＡと、不活性型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体とを含む反応液を調製し、反応液を一定時間インキュベートすればよい。反応液の組成は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの酵素活性のために適したものであれば、特に限定されず、すでに確立されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集法において使用される反応液の組成に準じて適切に決定することができる。例えば、反応液は、不活性型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体と標的ＤＮＡとを、バッファー（例えば、１～１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０～８．０）、１～１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．０～８．０）など）および／または塩（例えば、５０～３００ｍＭのＮａＣｌ、５０～３００ｍＭのＫＣｌ、０～１００ｍＭのＭｇＣｌ_２など）を含む水性溶媒に添加することにより、調製することができる。反応液における不活性型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の終濃度は、例えば、１０～３００ｎＭの範囲であってよい。反応液における標的ＤＮＡの終濃度は、例えば、１～１０００ｎＭの範囲であってよい。インキュベート時間は適宜決定することができ、例えば、５分～２４時間であってよい。

本実施形態の方法をインビボで実施する場合には、例えば、標的ＤＮＡを含む細胞に、不活性型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を導入すればよい。細胞は、標的ＤＮＡを含むものであれば特に限定されず、大腸菌などの原核生物、酵母などの真菌、昆虫、植物、動物など、あらゆる生物種の細胞であってよい。本実施形態の方法における好ましい細胞は、植物または動物由来の細胞であり、特に好ましくはヒトなどの哺乳動物由来の細胞である。動物細胞の種類も、特に限定されず、任意の組織から単離された細胞、受精卵、培養細胞などを用いることができる。また、細胞に含まれる標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡやミトコンドリアＤＮＡなどの内在性のＤＮＡであってもよいし、プラスミドベクターなどの外因性のＤＮＡであってもよい。不活性型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、すでに確立されたゲノム編集法のプロトコールにしたがって細胞に導入することができる。例えば、予め調製されたガイドＲＮＡと不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを、リポフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどにより細胞に導入することができる。あるいは、ガイドＲＮＡおよび／または不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸を含む発現ベクターを細胞に導入し、不活性型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を細胞内で発現させてもよい。発現ベクターには、不活性型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を導入する細胞の種類に応じて、適切なウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを選択して用いることができる。

次いで、不活性型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体に、イミダゾールまたはその誘導体を接触させる。これにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性が回復され、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が活性化状態となることができる。

本実施形態の方法では、イミダゾールの他、イミダゾール環の２位および／または４位に置換基を有するイミダゾール誘導体を用いることができる。イミダゾール環の２位および４位に置換基を有する場合は、両置換基は同一であってもよいし、異なっていてもよい。置換基としては、例えば、置換もしくは非置換のアルキル基、またはハロゲン原子などが挙げられる。アルキル基は、例えばＣ_１－１０アルキル基、好ましくはＣ_１－６アルキル基であってよく、直鎖状、分枝鎖状、および環状のいずれの形態のものであってもよい。アルキル基は、１つまたは複数の水素原子が置換基によって置換されていてもよく、この場合における置換基には、例えば、ハロゲン原子などが挙げられる。また、アルキル基における置換基の数および置換位置は特に限定されないが、置換基の数としては、０～３個が好ましい。

すなわち、本実施形態の方法では、好ましくは、イミダゾール、４－メチルイミダゾール、２－メチルイミダゾール、４－エチルイミダゾール、２－エチルイミダゾール、２－エチル－４－メチルイミダゾール、２－ブロモイミダゾールなどを用いることができる。

本実施形態の方法をインビトロで実施する場合には、例えば、イミダゾールまたはその誘導体を上記反応液に添加し、一定時間インキュベートすればよい。本実施形態の方法をインビボで実施する場合には、例えば、イミダゾールまたはその誘導体を細胞培養液に添加し、一定時間インキュベートすればよい。反応液または細胞培養液におけるイミダゾールまたはその誘導体の終濃度は、例えば、１～５００ｍＭの範囲であってよく、好ましくは、１０～２００ｍＭの範囲であってよい。インキュベート時間は適宜決定することができ、例えば、５分～２４時間であってよい。

本実施形態の方法では、その後、イミダゾールまたはその誘導体を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体から分離することが好ましい。これにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性が消失し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を不活性化状態に戻すことができる。

本実施形態の方法をインビトロで実施する場合には、例えば、透析や限外ろ過などにより、反応液からイミダゾールを除去することにより、イミダゾールまたはその誘導体をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体から分離することができる。本実施形態の方法をインビボで実施する場合には、例えば、イミダゾールまたはその誘導体を含まない細胞培養液に交換してイミダゾールを除去することにより、イミダゾールまたはその誘導体をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体から分離することができる。

本実施形態の方法の概略を図１に示す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体がガイドＲＮＡ（図中、「ｇＲＮＡ」）により標的二本鎖ＤＮＡにホーミングされ、野生型Ｃａｓ９の場合には、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメインにより、ＰＡＭ配列（図中、「ＮＧＧ」）の上流の二本鎖ＤＮＡが切断される（図１（ａ））。しかし、８４０番目のヒスチジン残基がアラニン残基に置換され、ヒスチジン残基の側鎖であるイミダゾール基が削除されたＣａｓ９変異体（Ｈ８４０Ａ）の場合には、ＨＮＨドメインがＤＮＡ切断活性を失っており、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は標的二本鎖ＤＮＡのうちの片鎖のみしか切断できないため、ゲノム編集は起こらない（図１（ｂ））。ここで、外部からイミダゾールを添加すると、ＨＮＨドメインのＤＮＡ切断活性が回復され、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的二本鎖ＤＮＡを切断できるようになり、ゲノム編集が可能となる（図１（ｃ））。その後、イミダゾールが取り除かれると、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は図１（ｂ）の状態に戻り、ＨＮＨドメインのＤＮＡ切断活性が再び失われ、ゲノム編集が停止される。このように、本実施形態の方法によれば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体のＤＮＡ切断活性を可逆的に制御することができ、オフターゲット効果の低減された高い精度でのゲノム編集を可能とする。

本発明は、第二の実施形態によれば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列に基づく番号付けで８４０番目の位置に対応するヒスチジン残基における点変異を含む不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸と、イミダゾールまたはその誘導体とを含む、ゲノム編集のためのキットである。本実施形態における「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」、「不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」、および「イミダゾールまたはその誘導体」は、第一の実施形態で定義したものと同様である。

本実施形態のキットは、上記構成に加え、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集に用いるバッファーやその他の試薬、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集のプロトコールを記載した説明書などをさらに含んでもよい。

以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

＜１．材料および方法＞
（１）Ｃａｓ９変異体の作製
以下の手順により、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ（配列番号１２）（以下では、単に「Ｃａｓ９」と表記する）の８４０番目のヒスチジン残基をアラニン残基に置換した変異体Ｈ８４０Ａ、８４０番目のヒスチジン残基をグリシン残基に置換した変異体Ｈ８４０Ｇ、９８３番目のヒスチジン残基をアラニン残基に置換した変異体Ｈ９８３Ａ、および、９８３番目のヒスチジン残基をグリシン残基に置換した変異体Ｈ９８３Ｇを作製した。

野生型Ｃａｓ９のＣ末端に核局在化シグナル配列およびヒスチジンタグを付加したタンパク質をコードする核酸を含むベクターｐＥＴ－Ｃａｓ９－ＮＬＳ－Ｈｉｓ（♯４７３２７，Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型として、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、続いてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うことにより、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９変異体Ｄ１０Ａ）、Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０Ａ、Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０Ｇ、Ｃａｓ９変異体Ｈ９８３Ａ、およびＣａｓ９変異体Ｈ９８３Ｇの発現ベクターを得た。以下に示すプライマーの配列中、下線部は、変異アミノ酸に対応する核酸配列を示し、小文字は、野生型Ｃａｓ９から変更された核酸配列を示す（アミノ酸配列の変更を伴わないサイレント変異も含まれる）。

（ｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９変異体Ｄ１０Ａ）のためのプライマーセット

（ｉｉ）Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０Ａのためのプライマーセット

（ｉｉｉ）Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０Ｇのためのプライマーセット

（ｉｖ）Ｃａｓ９変異体Ｈ９８３Ａのためのプライマーセット

（ｖ）Ｃａｓ９変異体Ｈ９８３Ｇのためのプライマーセット

得られた発現ベクターにより大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。得られた形質転換体を、ＬＢ培地中で３７℃にて３時間振盪培養した後、終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、１８℃で一晩振盪培養した。回収した大腸菌を溶解緩衝液（０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのベンジルスルホニルフルオリド、１ｍＭのジチオトレイトール、ｐＨ８．０）により溶解し、Ｎｉ－ＮＴＡカラム（３０２３０、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製することにより、Ｃａｓ９変異体の粗精製物を得た。その後、ゲルろ過クロマトグラフィーによりＣａｓ９変異体を精製し、－８０℃で保存した。

（２）Ｃａｓ９変異体のＤＮＡ切断活性の評価
基質プラスミドＤＮＡには、ｐＣＸ－ＥＧＦＰ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．；４０７（３）：３１３－３１９（１９９７）、大阪大学より供与）を用いた。ガイドＲＮＡには、ＥＧＦＰ遺伝子を標的とする以下のｓｇＲＮＡを用いた。

ｓｇＲＮＡ（ＥＧＦＰ）

Ｃａｓ９反応バッファー（終濃度２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））中に、終濃度３０ｎＭのＣａｓ９変異体、３０ｎＭのｓｇＲＮＡ、および図に記載された濃度のイミダゾール（ｐＨ８．０）を添加し、室温で１０分間インキュベートした。その後、終濃度３ｎＭのｐＣＸ－ＥＧＦＰを添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによりＤＮＡ切断反応を行った。その後、反応液に６×Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ，Ｐｕｒｐｕｌｅ（Ｂ７０２４Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えて混合し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。ＴＡＥバッファーにより１／１００００希釈したＧｅｌＧｒｅｅｎ（４１００４、Ｂｉｏｔｉｕｍ）染色液により泳動後のゲルを２０分間染色した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）により撮影した。また、対照として、Ｃａｓ９変異体に代えて、野生型Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９変異体Ｄ１０Ａ）を用い、同様の手順によりＤＮＡ切断活性の評価を行った。

イミダゾールまたはその誘導体には、以下のものを使用した。イミダゾール（０９７－０５３９１、富士フイルム和光純薬）、４－メチルイミダゾール（１３２－１１２０２、富士フイルム和光純薬）、１－メチルイミダゾール（１３４－１２８０１、富士フイルム和光純薬）、２－メチルイミダゾール（１３８－１１１６２、富士フイルム和光純薬）、１，２，３－トリアゾール（３２０－７４１６１、富士フイルム和光純薬）、１，２，４－トリアゾール（３２７－９１８５２、富士フイルム和光純薬）、ピロール（１６７－０５６６２、富士フイルム和光純薬）、ピラゾール（１６５－０６９０３、富士フイルム和光純薬）。

＜２．イミダゾールによるＣａｓ９変異体のＤＮＡ切断活性の回復＞
上記（１）で調製された４種類のＣａｓ９変異体Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｇ、Ｈ９８３ＡおよびＨ９８３Ｇについて、上記（２）の手順により、イミダゾールの添加によるＤＮＡ切断活性の変化を評価した。なお、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断メカニズムは詳細には解明されていないが、ＨＮＨドメイン中のＤ８３９、Ｈ８４０、Ｎ８５４およびＮ８６３、ならびにＲｕｖＣドメイン中のＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３およびＤ９８６が、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断活性に関連するアミノ酸残基と推定されている。

Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０Ｇについての結果を図２に、Ｃａｓ９変異体Ｈ９８３ＡおよびＨ９８３Ｇについての結果を図３に示す。なお、図中、「ｎｏｎｅ」はＣａｓ９を添加していないサンプルであり、すなわち、基質プラスミドＤＮＡが切断されなかった場合の結果を示し（図中、「ｐｌａｓｍｉｄ」のバンドが確認できる）；「Ｃａｓ９」は野生型Ｃａｓ９を添加したサンプルであり、すなわち、基質プラスミドＤＮＡの二本鎖が切断された場合の結果を示し（図中、「ｌｉｎｅａｒ」のバンドが確認できる）；「ｎＣａｓ９」はＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９変異体Ｄ１０Ａ）を添加したサンプルであり、すなわち、基質プラスミドＤＮＡの片鎖のみが切断された場合の結果を示す（図中、「ｎｉｃｋ」のバンドが確認できる）。

Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０Ｇはいずれも、イミダゾールの非存在下ではＤＮＡ切断活性を示さないが、イミダゾールを添加するとＤＮＡ切断活性を回復した（図２）。一方、Ｃａｓ９変異体Ｈ９８３ＡおよびＨ９８３Ｇはいずれも、イミダゾールを添加してもＤＮＡ切断活性が変化しなかった（図３）。また、Ｃａｓ９変異体Ｈ９８３Ｇは、イミダゾールの非存在下であっても基質プラスミドＤＮＡの二本鎖切断が起きており（図３）、ＤＮＡ切断活性を有していることが確認された。これらの結果から、ケミカルレスキューの手法によりＤＮＡ切断活性を制御するための不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼには、Ｈ８４０点変異体が適している可能性が示唆された。

＜３．Ｃａｓ９変異体のＤＮＡ切断活性を回復するためのイミダゾール濃度の検討＞
上記（１）で調製されたＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０Ｇについて、上記（２）の手順により、０～２００ｍＭのイミダゾール濃度範囲におけるＤＮＡ切断活性を評価した。

結果を図４に示す。Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０Ｇのいずれにおいても、１０ｍＭのイミダゾールの添加により基質プラスミドＤＮＡの二本鎖切断がみられ、さらに、イミダゾールの濃度依存的に切断された基質プラスミドＤＮＡが増加した。この結果から、１０ｍＭのイミダゾールからＨ８４０点変異体のＤＮＡ切断活性を回復でき、５０ｍＭ以上のイミダゾールにより、十分なＤＮＡ切断活性の回復が可能であることが示された。

＜４．イミダゾールによるＣａｓ９変異体のＤＮＡ切断活性の経時的回復＞
上記（１）で調製されたＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０Ｇについて、イミダゾール濃度を１００ｍＭとし、ＤＮＡ切断反応のためのインキュベート時間を０～１２０分間とした以外は、上記（２）の手順により、ＤＮＡ切断活性を評価した。

Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０Ａについての結果を図５に、Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０Ｇについての結果を図６に示す。Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０Ｇのいずれの場合も、インキュベート時間依存的に切断された基質プラスミドＤＮＡが増加した。また、Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０Ｇのいずれの場合も、６０分間以上のインキュベートで切断された基質プラスミドＤＮＡが顕著に増加した。同様の反応条件下で野生型Ｃａｓ９が数分ですべての基質ＤＮＡを切断することを考慮すると（Ｓｃｉｅｎｃｅ；３６１（６４０８）：１２５９－１２６２（２０１８））、イミダゾール添加による不活性化Ｃａｓ９変異体のケミカルレスキューは非常に緩やかであり、このことは、ＤＮＡ切断活性の精密な制御を容易にするため有益であると考えられた。

＜５．イミダゾールによるＣａｓ９変異体のＤＮＡ切断活性の回復における塩化マグネシウム濃度の影響＞
Ｃａｓ９のＨＮＨドメインがＤＮＡを切断するためにはマグネシウムイオンが必要であることが明らかにされている（Ｃｅｌｌ；１５６（５）：９３５－９４９（２０１４））。そこで、上記（１）で調製されたＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０Ｇについて、イミダゾール濃度を１００ｍＭとし、ＭｇＣｌ_２濃度を０～１０ｍＭとした以外は、上記（２）の手順により、ＤＮＡ切断活性を評価した。

Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０Ａについての結果を図７に、Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０Ｇについての結果を図８に示す。Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０Ｇのいずれも、５～１０ｍＭのＭｇＣｌ_２において有意なＤＮＡ切断活性を示した。

＜６．イミダゾール誘導体によるＣａｓ９変異体のＤＮＡ切断活性の回復＞
上記（１）で調製されたＣａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０Ｇについて、イミダゾールに代えて各種イミダゾール誘導体（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）を用いた以外は、上記（２）の手順により、ＤＮＡ切断活性を評価した。

Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０Ａについての結果を図９に、Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０Ｇについての結果を図１０に示す。Ｃａｓ９変異体Ｈ８４０ＡおよびＨ８４０Ｇのいずれも、４－メチルイミダゾールおよび２－メチルイミダゾールによってＤＮＡ切断活性を回復できることが確認された。この結果から、イミダゾール誘導体を用いても、イミダゾールと同様のケミカルレスキューが可能であることが示された。

Claims (8)

1. Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性を制御する方法であって、
   （１）標的ＤＮＡにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体を接触させるステップと、ここで、前記複合体が、ガイドＲＮＡと、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列に基づく番号付けで８４０番目の位置に対応するヒスチジン残基における点変異を含む不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを含み、次いで、
   （２）前記複合体にイミダゾールまたはその誘導体を接触させるステップと
   を含む、方法。
2. （３）前記ステップ（２）の後、イミダゾールまたはその誘導体を前記複合体から分離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記点変異が、アラニン残基またはグリシン残基による置換である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記イミダゾールまたはその誘導体が、１～５００ｍＭの濃度である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記イミダゾールまたはその誘導体が、イミダゾールならびにイミダゾール環の２位および／または４位に置換基を有するイミダゾール誘導体からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. インビトロで実施される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. インビボで実施される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
8. 化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列に基づく番号付けで８４０番目の位置に対応するヒスチジン残基における点変異を含む不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸と、イミダゾールまたはその誘導体とを含む、ゲノム編集のためのキット。

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