JP2022162535A - Method for producing cell-conditioned medium, and method for producing cosmetic product - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞を培養した培養液から細胞を除去した培養上清液の製造方法、及び当該培養上清液を配合した化粧品の製造方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a culture supernatant obtained by removing cells from a culture solution in which cells are cultured, and a method for producing cosmetics containing the culture supernatant.
医療分野では、医薬品での治療が困難な病への代替療法として、幹細胞を利用した再生医療が注目されている。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、体性幹細胞などが報告されており、体性幹細胞としては、骨髄、脂肪組織、皮膚、臍帯、胎盤等の様々な組織から単離される間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、臨床において用いられてきている。
幹細胞移植医療においては、幹細胞自体が治療効果をもたらすだけでなく、幹細胞が分泌するサイトカインやエクソソーム等の種々の生理活性物質が治療効果に大きく寄与していることが分かってきている。
サイトカイン（Cytokine）とは、細胞から分泌されて細胞間の相互応答に関与する生理活性物質の総称であり、受容した細胞において、細胞の増殖、分化、機能発現等の応答が起きる。また、エクソソーム（Exosome）とは、細胞が分泌する小胞で、様々なタンパク質や核酸を内包しており、細胞間の情報伝達を担う可能性が明らかになってきている。
幹細胞を人工的に培養すると、培養液中に細胞からこれらの生理活性物質が放出されることから、細胞を除去した培養液を培養上清液として回収し有効利用することができる。
In the medical field, regenerative medicine using stem cells is attracting attention as an alternative therapy for diseases that are difficult to treat with pharmaceuticals. As stem cells, for example, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), somatic stem cells, etc. have been reported. Mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from a variety of tissues, such as, have been used clinically.
In stem cell transplantation medicine, it has been found that not only stem cells themselves bring about therapeutic effects, but also various physiologically active substances such as cytokines and exosomes secreted by stem cells greatly contribute to the therapeutic effects.
Cytokine is a general term for physiologically active substances that are secreted from cells and participate in mutual responses between cells, and responses such as cell proliferation, differentiation, and expression of functions occur in the cells that receive them. In addition, exosomes are vesicles secreted by cells that contain various proteins and nucleic acids, and it has become clear that they may play a role in intercellular communication.
When stem cells are artificially cultured, these physiologically active substances are released from the cells into the culture medium, so that the culture medium from which the cells have been removed can be recovered as a culture supernatant and effectively used.
ここで、特許文献１には、臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清を含有する育毛剤が開示されている。
また、特許文献２には、透過性膜中空糸の内表面に播種した幹細胞に培養液を供給する工程と、幹細胞に培養液を接触させて幹細胞を培養する工程と、幹細胞が分泌した成分を含む培養液を回収する工程を含む幹細胞培養上清液の製造方法が開示されている。
Here,
Further,
幹細胞のような接着系細胞は培養用容器の中で底面に貼り付いて層状に増殖するため、浮遊培養が可能な細胞と異なり、細胞の量に対して培養液の量が多くなる。また、培地を頻繁に交換する必要があるなど幹細胞の培養には多大な手間がかかるが、細胞の成長が悪いと有用成分の濃度が低い培養上清液（培養上清）が生成されることとなる。
そこで本発明は、有効成分を高濃度に含む培養上清液、及び当該培養上清液を配合した化粧品の製造方法を提供することを目的とする。
Adhesive cells such as stem cells adhere to the bottom surface of the culture vessel and proliferate in layers, so unlike cells that can be cultured in suspension, the amount of culture solution is large relative to the amount of cells. In addition, culturing stem cells takes a lot of time and effort, such as the need to change the medium frequently. becomes.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a culture supernatant containing a high concentration of active ingredients, and a method for producing cosmetics containing the culture supernatant.
請求項１記載に対応した細胞培養上清液の製造方法においては、細胞を培養した培養液から細胞を除去した培養上清液の製造方法であって、幹細胞を出発物質として、培地にプラセンタ、サイタイ、又は羊膜の抽出物を添加することを特徴とする。
請求項１に記載の本発明によれば、有効成分を高濃度に含む培養上清液を提供することができる。
A method for producing a cell culture supernatant corresponding to
According to the first aspect of the present invention, it is possible to provide a culture supernatant containing a high concentration of active ingredients.
請求項２記載の本発明は、請求項１に記載の細胞培養上清液の製造方法において、幹細胞は、ヒト由来の臍帯幹細胞、又は臍帯血幹細胞であることを特徴とする。
請求項２に記載の本発明によれば、アレルギーのリスクを回避でき、また、サイトカインがバランスよく含まれている幹細胞培養上清液を得ることができる。
The present invention according to
According to the present invention of
請求項３記載の本発明は、請求項２に記載の細胞培養上清液の製造方法において、幹細胞は、ヒト由来の臍帯血幹細胞であり、培地に添加する抽出物は、ウマ又はブタのプラセンタの抽出物であることを特徴とする。
請求項３に記載の本発明によれば、培養上清液に含まれるサイトカイン及びエクソソームの濃度をさらに高めることができる。
The present invention according to
According to the present invention of
請求項４記載の本発明は、請求項２に記載の細胞培養上清液の製造方法において、幹細胞は、ヒト由来の臍帯血幹細胞であり、培地に添加する抽出物は、ウマ又はブタのサイタイの抽出物であることを特徴とする。
請求項４に記載の本発明によれば、培養上清液に含まれるサイトカイン及びエクソソームの濃度をさらに高めることができる。
The present invention according to
According to the present invention according to
請求項５記載の本発明は、請求項２に記載の細胞培養上清液の製造方法において、幹細胞は、ヒト由来の臍帯血幹細胞であり、培地に添加する抽出物は、ウマの羊膜の抽出物であることを特徴とする。
請求項５に記載の本発明によれば、培養上清液に含まれるサイトカイン及びエクソソームの濃度をさらに高めることができる。
The present invention according to
According to the present invention according to
請求項６記載に対応した化粧品の製造方法においては、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の細胞培養液の製造方法によって得られた細胞培養上清液を配合することを特徴とする。
請求項６記載の本発明によれば、幹細胞の寿命の減少をより一層抑制しながら新たな細胞を生み出す化粧品を得ることができる。
A method for producing a cosmetic according to claim 6, characterized in that the cell culture supernatant obtained by the method for producing a cell culture medium according to any one of
According to the sixth aspect of the present invention, it is possible to obtain cosmetics that generate new cells while further suppressing the decrease in the life span of stem cells.
本発明によれば、有効成分を高濃度に含む培養上清液を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a culture supernatant containing a high concentration of active ingredients.
以下に、本発明の実施形態による細胞培養上清液の製造方法、及び細胞培養上清液について説明する。 A method for producing a cell culture supernatant and a cell culture supernatant according to embodiments of the present invention will be described below.
幹細胞培養上清液の製造工程においては、特に限定されず通常用いられる条件をそのまま適用することができる。また、幹細胞の種類に応じて幹細胞の単離及び選抜工程を適宜調整する。
幹細胞とは、自己複製能と分化能を持つ特殊化していない細胞と定義され、具体的には、様々な組織に分化できる「分化能」と、複数の細胞分裂の周期を経ても未分化状態を維持する「自己複製能」を、特性として持っている細胞のことである。
哺乳類では、体内での幹細胞の存在位置により、様々な種類の幹細胞があり、膵臓幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、血管幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、網膜幹細胞等が含まれる。その中でも間葉系幹細胞の例としては、上皮幹細胞、毛包幹細胞、脂肪幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、胎盤幹細胞、歯髄幹細胞、骨格筋幹細胞などが知られている。
In the process of producing the stem cell culture supernatant, the conditions normally used can be applied as they are without any particular limitation. In addition, the steps of isolating and selecting stem cells are appropriately adjusted depending on the type of stem cells.
Stem cells are defined as non-specialized cells with self-renewal and differentiation abilities. It is a cell that has as a characteristic "self-renewal ability" that maintains
In mammals, there are various types of stem cells depending on the location of stem cells in the body, including pancreatic stem cells, hepatic stem cells, hematopoietic stem cells, hemangioblasts, mesenchymal stem cells, neural stem cells, retinal stem cells, and the like. Among them, known mesenchymal stem cells include epithelial stem cells, hair follicle stem cells, adipose stem cells, bone marrow stem cells, umbilical cord stem cells, placental stem cells, dental pulp stem cells, and skeletal muscle stem cells.
細胞培養上清液の製造方法にあたっては、ドナーから組織を採取する必要がある。
本実施形態における培養対象の幹細胞は、ヒト由来の臍帯血幹細胞としている。なお、培養対象の幹細胞をヒト由来の臍帯幹細胞とすることもできる。
臍帯とは胎盤と胎児を繋ぐ全長３０～７０ｃｍの組織であり、出産時に娩出された後は医療廃棄物として処分されてしまう。ドナーの同意を得て臍帯を回収し、静脈より臍帯血を採取し、必要に応じて抗凝固処理をする。次の作業工程までは５℃前後で保管し、２４時間以内に細胞分離をおこなう。
In the method for producing the cell culture supernatant, it is necessary to collect tissue from a donor.
The stem cells to be cultured in the present embodiment are human-derived cord blood stem cells. The stem cells to be cultured can also be human-derived umbilical cord stem cells.
The umbilical cord is a tissue with a total length of 30 to 70 cm that connects the placenta and the fetus, and is disposed of as medical waste after being expelled during childbirth. With the donor's consent, the umbilical cord is collected, umbilical cord blood is collected from a vein, and anticoagulation is performed as necessary. Store at around 5°C until the next step, and perform cell separation within 24 hours.
次に、臍帯血幹細胞を単離する。
臍帯血を２ｍＭ ＥＤＴＡ－ＰＢＳなどの緩衝液で希釈後にフィコール密度勾配遠心分離により単核細胞を取得する。培養プレートに１×１０６／ｃｍ２の細胞密度で播種し、必要に応じて抗生物質を補充したダルベッコ改変イーグル培地－低グルコース（ＤＭＥＭ－ＬＧ）培地にて培養する。
１２～４８時間後に非付着性の細胞を除去し、得られた付着性細胞は５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気、３７℃で、１０％ＭＳＣＧＳを含むダルベッコ改変イーグル培地－低グルコース（ＤＭＥＭ－ＬＧ）にて培養する。培地は一日おきに交換する。トリプシンを用いてサブコンフルエント時に細胞を採取し、必要な継代をおこなう。
１．０×１０７／ｍＬまで細胞を増殖させた後、回収して、臍帯血幹細胞を得る。引き続いて幹細胞培養上清液の作製をおこなうほか、必要に応じて細胞を液体窒素中で保管し、適宜解凍して使用する。
Next, cord blood stem cells are isolated.
After diluting cord blood with a buffer solution such as 2 mM EDTA-PBS, mononuclear cells are obtained by Ficoll density gradient centrifugation. Culture plates are seeded at a cell density of 1×10 6 /cm 2 and cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium-Low Glucose (DMEM-LG) medium supplemented with antibiotics as needed.
After 12-48 hours, non-adherent cells were removed and the resulting adherent cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium-Low Glucose (DMEM-LG) containing 10% MSCGS at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO2 . ). Medium is changed every other day. Cells are harvested when subconfluent using trypsin and passaged as required.
Cells are grown to 1.0×10 7 /mL and then harvested to obtain cord blood stem cells. Subsequently, the stem cell culture supernatant is prepared, and if necessary, the cells are stored in liquid nitrogen and thawed as appropriate for use.
次に、臍帯血幹細胞培養上清液を作製する。
「培養上清液」とは、細胞の増殖が可能な条件下で、適した細胞培養用培地を用いて細胞を培養し、培養後の培養液から細胞を除去した上清液を意味する。具体的には、「培地」とは、細胞培養に必要な成分をあらかじめ含むように調整された細胞培養用の液体で、細胞に接触していないものをいう。培地が細胞と接触する状態で培養をおこなった結果得られた液体を「培養液」と呼び、細胞の存在の有無を問わない。「培養液」から明確に細胞を除去したものを「培養上清液」と呼び、培養液からの細胞の除去は、例えば遠心分離、透析、又は膜分離等を適宜おこなうことで達成できる。
幹細胞培養上清液の製造に用いる培地は、市販されているものを使用できる。例えば、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ Ｆ－１２、ＭＥＭα、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ－１６４０などを基礎培地とし、各種ビタミンやミネラルなどを添加して適宜調製したものを使用できる。
なお、幹細胞培養上清液は、安全性を高めるため動物血清を含まないことが好ましい。そのための方法としては、幹細胞の培養において複数回の継代培養をおこなうことにし、全工程または最後から数回の継代培養において無血清培地を使用することによって、動物血清を含まない幹細胞培養上清液を得ることができる。また、幹細胞培養上清液に対して、透析や溶媒置換などを利用して血清を除去することもできる。
Next, a cord blood stem cell culture supernatant is prepared.
“Culture supernatant” means a supernatant obtained by culturing cells using a suitable cell culture medium under conditions that allow cell growth, and removing the cells from the culture medium after culturing. Specifically, the term "medium" refers to a liquid for cell culture that has been adjusted to contain components necessary for cell culture in advance, and that does not come into contact with cells. The liquid obtained as a result of culturing in a state where the medium is in contact with the cells is called a "culture medium", regardless of the presence or absence of cells. A "culture medium" from which cells are clearly removed is called a "culture supernatant", and removal of cells from the culture solution can be achieved by, for example, centrifugation, dialysis, membrane separation, or the like as appropriate.
A commercially available medium can be used for the production of the stem cell culture supernatant. For example, DMEM, Ham F-12, MEMα, EMEM, IMDM, RPMI-1640 or the like can be used as a basal medium, and various vitamins and minerals can be added to appropriately prepare the medium.
In addition, the stem cell culture supernatant preferably does not contain animal serum in order to improve safety. As a method for that purpose, we decided to perform multiple subcultures in the culture of stem cells, and used serum-free medium in the entire process or the last few subcultures, thereby improving stem cell culture without animal serum. Clear fluid can be obtained. Serum can also be removed from the stem cell culture supernatant using dialysis, solvent replacement, or the like.
本実施形態では、臍帯血幹細胞を、ＤＭＥＭ等の基本培地に必要に応じて血清を加え、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気、３７℃の条件で、適宜継代をしながら１２０～２４０時間培養する。
臍帯血幹細胞培養上清液として回収される培地には事前に無菌化したサイタイエキスを０．０１～１％添加して培養をおこなう。サイタイエキスは、化粧品用原料および健康食品用原料として、ウマ又はブタ由来のものが供給されている。サイタイエキスは、臍帯を洗浄し、水と酵素を加えて加水分解後にろ過し、適宜防腐剤を加えて化粧品原料とするほか、乾燥処理をおこなって主に健康食品原料とする。
得られた交換後の培地を回収し、細胞を通過させない分離膜を用いて、臍帯血幹細胞培養上清液（臍帯血由来幹細胞培養上清液）を得る。
なお、培地には、サイタイエキスに代えて、プラセンタエキス又は羊膜エキスを添加することもできる。さらに、サイタイエキス、プラセンタエキス、又は羊膜エキスのうち少なくとも二つを培地に添加することもできる。
In this embodiment, umbilical cord blood stem cells are cultured for 120 to 240 hours in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 at 37° C. in a basal medium such as DMEM, with serum added as necessary, while subculturing as appropriate. do.
0.01 to 1% sterilized Saitai extract is added to the medium collected as the cord blood stem cell culture supernatant, and the cells are cultured. Saitai extracts derived from horses or pigs are supplied as raw materials for cosmetics and health foods. Saitai extract is made by washing the umbilical cord, adding water and enzymes, hydrolyzing it, filtering it, adding an appropriate preservative, and using it as a raw material for cosmetics.
The obtained culture medium after exchange is recovered, and a cord blood stem cell culture supernatant (cord blood-derived stem cell culture supernatant) is obtained using a separation membrane that does not allow cells to pass through.
Placenta extract or amniotic membrane extract can be added to the medium instead of rhinoceros Tai extract. In addition, at least two of Rhinoceros rhinoceros Tai extract, placenta extract, or amniotic membrane extract can be added to the medium.
幹細胞を用いて得られた培養上清液が「幹細胞培養上清液」であり、特定の由来名が記載されているものはその組織から分離された幹細胞を用いていることを示し、「臍帯血由来幹細胞培養上清液」は臍帯血由来幹細胞を培養して得られる培養上清液のことである。
幹細胞培養上清液の作製に用いる幹細胞の例としては、前述の種々の幹細胞を使用することができる。幹細胞は、ドナーから採取した天然（プライマリー）のものをはじめ、遺伝子改変等などにより株化したもの、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が使用できる。
幹細胞の由来動物種としては、アレルギーのリスク回避および、親和性の観点から、ヒト由来が最も望ましい。その他に、遺伝的類似性が高いことや、感染危険性が低いものとして、例えば、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマのものが使用できる。
The culture supernatant obtained using stem cells is "stem cell culture supernatant", and those with a specific origin name indicate that stem cells isolated from the tissue are used, and "umbilical cord "Blood-derived stem cell culture supernatant" refers to a culture supernatant obtained by culturing cord blood-derived stem cells.
As an example of stem cells used for preparing the stem cell culture supernatant, the above-mentioned various stem cells can be used. Stem cells that can be used include natural (primary) stem cells collected from donors, strains established by genetic modification and the like, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like.
From the viewpoint of allergy risk avoidance and affinity, human-derived stem cells are most desirable as the animal species from which stem cells are derived. In addition, those with high genetic similarity and low risk of infection, such as pigs, cows, sheep, and horses, can be used.
幹細胞は、培養中に、表皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子－α（ＴＧＦ－α）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、増殖分化因子－１１（ＧＤＦ－１１）等の種々のサイトカインを産生し、培養液中に分泌することが分かっている。なお、これらのサイトカイン濃度は、市販されている各サイトカインのＥＬＩＳＡキット等を使用して簡便に測定することができる。
また、幹細胞はその由来によって、幹細胞培養上清液中に含まれるサイトカイン等の生理活性物質の含有量とそのバランスが異なることが分かってきている。成人の組織ではなく、新生児の付属器官から採取する臍帯血、臍帯、胎盤、羊膜などから採取した幹細胞は、特に有用性が高いと考えられる。
Stem cells are grown in culture on epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), insulin-like growth factor (IGF), hepatocyte growth factor (HGF), transforming growth factor-α (TGF-α ), keratinocyte growth factor (KGF), fibroblast growth factor (FGF), growth differentiation factor-11 (GDF-11) and other cytokines are produced and secreted into the culture medium. . The concentrations of these cytokines can be easily measured using a commercially available ELISA kit or the like for each cytokine.
In addition, it has been found that the content and balance of physiologically active substances such as cytokines contained in the stem cell culture supernatant differ depending on the origin of stem cells. Stem cells harvested from neonatal appendages, such as cord blood, umbilical cord, placenta, and amniotic membrane, rather than adult tissues, may be particularly useful.
回収した臍帯血幹細胞培養上清液は、そのまま化粧品等の原料として使用してもよく、あるいは、濃縮、溶媒の置換、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩などの調整を適宜実施した後に化粧品等の原料として使用してもよい。また、臍帯血幹細胞培養上清液にレシチン、コレステロールなどを添加してリポソーム化してもよい。
培養上清液は、化粧品成分としては「順化培養液」や「コンディションドメディウム（Conditioned medium）」と呼ばれることがあるが、ここでの「培養上清液」と同義である。また、「培養液」と呼ぶ場合でも、細胞が除去されていることが明確に確認できる場合は「培養上清液」と同義である。
培養上清液には、細胞自体や細胞成分は含まれないことから免疫拒絶反応の懸念が無く、使用者自身でないドナーの幹細胞から作製した培養上清液であっても問題なく使用することができる。また、細胞そのものではないので管理や保存が簡便で、あらかじめ作製した培養上清液を保存しておき、要時にすぐ使用することができる。
The collected umbilical cord blood stem cell culture supernatant may be used as it is as a raw material for cosmetics or the like, or after appropriate adjustment such as concentration, solvent replacement, freezing, drying, freeze-drying, dilution, desalting, etc. You may use it as raw materials, such as cosmetics. In addition, lecithin, cholesterol, or the like may be added to the cord blood stem cell culture supernatant to form liposomes.
The culture supernatant is sometimes called "conditioned medium" or "conditioned medium" as a cosmetic component, but is synonymous with "culture supernatant" here. Further, even when the term "culture medium" is used, it is synonymous with "culture supernatant" when it can be clearly confirmed that cells have been removed.
Since the culture supernatant does not contain the cells themselves or cell components, there is no concern about immunological rejection. can. In addition, since they are not cells themselves, they are easy to manage and store, and the culture supernatant prepared in advance can be stored and used immediately when required.
図１は幹細胞培養上清液に含まれるサイトカインの含有量を比較したグラフであり、図１（ａ）は、ヒトの臍帯血幹細胞を出発物質とし、培地にウマのサイタイの抽出物（ウマサイタイエキス）を０．１％添加して培養することにより得られた本実施形態の臍帯血幹細胞培養上清液（実施形態１）のデータ、図１（ｂ）は、比較例として、ヒトの脂肪由来幹細胞を出発物質とし、培地にサイタイエキス等のエキスを添加せずに培養することにより得られた脂肪由来幹細胞培養上清液（比較例１）のデータである。なお、見やすくするため含有量の表示上限を７００[pg/ml]とし、実際の含有量を各データの上部に記載している。
図１より、実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液は、比較例１の脂肪由来幹細胞培養上清液と比較して、ＧＤＦ－１１を多く含有していることが分かる。ＧＤＦ－１１は、幹細胞が通常細胞に分化することを抑制し、幹細胞として維持されるように働きかける因子である。つまり、臍帯血幹細胞は、脂肪由来幹細胞よりも幹細胞を維持しながら細胞増殖を進めることができる。このため、化粧品の原料に臍帯血幹細胞培養上清液を用いると、幹細胞の寿命の減少を抑制しながら新たな細胞を生み出すことができ、肌の状態をより長く若く保つことができる。一方、化粧品の原料に単に幹細胞や成長因子を用いるだけでは、新しい細胞を生み出す反面、幹細胞の寿命を縮めてしまう。
また、図１に示すように、実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液には、ＧＤＦ－１１の他にも、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、及びＫＧＦがバランスよく含有されている。このようにサイトカインがバランスよく含まれている臍帯血幹細胞培養上清液を化粧品に配合することで、より一層幹細胞の寿命の減少を抑制しながら新たな細胞を生み出すことができる。
FIG. 1 is a graph comparing the contents of cytokines contained in stem cell culture supernatants. FIG. The data of the umbilical cord blood stem cell culture supernatant of this embodiment (Embodiment 1) obtained by culturing with the addition of 0.1% of extract), and FIG. Fig. 2 shows data of an adipose-derived stem cell culture supernatant (Comparative Example 1) obtained by culturing adipose-derived stem cells as a starting material without adding an extract such as rhinoceros cypress extract to the medium. For ease of viewing, the display upper limit of the content is set to 700 [pg/ml], and the actual content is indicated above each data.
1 shows that the cord blood stem cell culture supernatant of
Moreover, as shown in FIG. 1, the cord blood stem cell culture supernatant of
培地にウマサイタイエキスを添加して培養製造した本実施形態の臍帯血幹細胞培養上清液（実施形態１）に含まれるサイトカインの含有量と、比較例として培地にサイタイエキス等のエキスを添加せずに製造している他社の三種類の臍帯血幹細胞培養上清液（比較例２）に含まれるサイトカインの含有量を下表１に示す。
このように、化粧品や健康食品の原料に使われるサイタイエキスを培養液中に含有させて細胞培養に供することで、細胞あたりの放出する生理活性物質をより増やし、有効成分を高濃度に含む培養上清液の回収を達成できる。これにより、有効成分を高濃度に含む培養上清液を提供することができる。また、実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液は、ＥＧＦが比較例２の場合と比べて多く含有されていることで、細胞の増進をより一層促進することができる。また、実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液は、若返り因子と呼ばれるＧＤＦ－１１が比較例２の場合と比べて多く含有されていることで、コラーゲン、エラスチンなどの増殖を促し、皮膚の再生やエイジングケア作用がさらに期待できる。
The content of cytokines contained in the cord blood stem cell culture supernatant of this embodiment (Embodiment 1), which is cultured and manufactured by adding horse rhinoceros rotunda extract to the medium, and an extract such as rhinoceros rotundus extract is added to the medium as a comparative example. Table 1 below shows the contents of cytokines contained in the three types of cord blood stem cell culture supernatants (Comparative Example 2) manufactured by other companies without the use of
In this way, by including Rhinoceros sophia extract, which is used as a raw material for cosmetics and health foods, in the culture solution and subjecting it to cell culture, the amount of physiologically active substances released per cell is increased, and the active ingredient is contained at a high concentration. Recovery of the culture supernatant can be achieved. This makes it possible to provide a culture supernatant containing a high concentration of active ingredients. In addition, since the cord blood stem cell culture supernatant of
培地にエキスを１％添加して幹細胞培養した本実施形態の臍帯血幹細胞培養上清液（実施形態２～５）に含まれるエクソソームの定量結果を下表２に示す。培地に添加した抽出物は、実施形態２ではブタのプラセンタの抽出物（ブタプラセンタエキス）、実施形態３ではウマのサイタイの抽出物（ウマサイタイエキス）、実施形態４ではウマのプラセンタの抽出物（ウマプラセンタエキス）、実施形態５ではウマの羊膜の抽出物（ウマ羊膜エキス）である。また、実施形態２～５で培養した幹細胞は、ヒトの臍帯血幹細胞である。なお、培地にサイタイエキス等のエキスを添加せずにヒトの臍帯血幹細胞を培養して得られた臍帯血幹細胞培養上清液（比較例３）の値を１００として表している。また、比較対象として、上記の比較例１、及び比較例２の製品３のデータも掲出している。
このように、培地にエキスを添加して培養することで、細胞あたりの放出する生理活性物質をより増やし、有効成分を高濃度に含む培養上清液の回収を達成できる。これにより、有効成分を高濃度に含む培養上清液を得ることができる。特に、実施形態３及び実施形態５、すなわち、培地に添加するエキスとしてウマサイタイエキス又はウマ羊膜エキスを用いることで、無添加培養である比較例３に比べてＣＤ９とＣＤ６３の両方を多く含有する臍帯血幹細胞培養上清液を得ることができる。
Table 2 below shows the quantitative results of exosomes contained in the cord blood stem cell culture supernatant of this embodiment (
In this way, by adding an extract to the medium and culturing, it is possible to increase the amount of physiologically active substance released per cell and to recover a culture supernatant containing a high concentration of the active ingredient. As a result, a culture supernatant containing a high concentration of active ingredients can be obtained. In particular, in
実施形態２～５の幹細胞培養における細胞生存率を下表３に示す。なお、比較例３の値を１００として表している。
実施形態２～５の幹細胞培養上清液におけるサイトカイン定量結果を下表４に示す。
このように、ブタ又はウマ由来の抽出物を培養液中に含有させて細胞培養に供することで、細胞あたりの放出する生理活性物質をより増やし、有効成分を高濃度に含む培養上清液の回収を達成できる。これにより、有効成分を高濃度に含む培養上清液を得ることができる。また、実施形態２～５の臍帯血幹細胞培養上清液は、ＥＧＦ及びＧＤＦ－１１が比較例３の場合と比べて多く含有されているため、細胞の増進をより一層促進することができると共に、コラーゲン、エラスチンなどの増殖を促し、皮膚の再生やエイジングケア作用がさらに期待できる。
The results of cytokine quantification in the stem cell culture supernatants of
In this way, by including the porcine or horse-derived extract in the culture medium and subjecting it to cell culture, the physiologically active substance released per cell is further increased, and the culture supernatant containing the active ingredient at a high concentration is produced. recovery can be achieved. As a result, a culture supernatant containing a high concentration of active ingredients can be obtained. In addition, since the cord blood stem cell culture supernatants of
図２は保湿効果を比較したグラフである。
温度２７℃、湿度３５％の条件において、以下の試験方法にて各試料をヒトの腕に塗布して肌水分量を測定した。試料は、実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液（ウマサイタイエキス添加培養）と、比較例３の臍帯血幹細胞培養上清液（無添加培養）と、比較例としての水（比較例４）、の三種類である。
［試験方法］
１．油性ペンで縦３．０ｃｍ、横２．０ｃｍ四方の枠を下腕内側部の測定ポイントにしるしを付ける。
２．石けんで測定ポイントを洗い、３０分安静に過ごす。
３．測定ポイントの通常時（各試料の塗布前）の肌水分量を測定する。この測定は５回行い、平均値を求める。
４．試料０．１ｇを測定部位にとり、指の第二関節部分までを使用し縦・横１０回ずつ試料を均一になじませる。
５．試料塗布後、１０、３０、９０分後の肌水分量を皮表角層水分量測定装置（株式会社ヤヨイ製 ＳＫＩＣＯＮ－２００ＥＸ）を用いて測定する。
［結果］
図２中の「×」を結ぶ線は実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液（ウマサイタイエキス添加培養）のデータを示し、「■」を結ぶ線は比較例３の臍帯血幹細胞培養上清液（無添加培養）のデータを示し、「◆」を結ぶ線は比較例４の水のデータを示している。なお、通常時の肌水分量を０としている。
図２より、塗布９０分後において、実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液（ウマサイタイエキス添加培養）を塗布した場合の肌水分量は、比較例３、４の場合よりも高いことが分かる。
FIG. 2 is a graph comparing moisturizing effects.
Under conditions of a temperature of 27° C. and a humidity of 35%, each sample was applied to human arms according to the following test method to measure the skin moisture content. The samples were the cord blood stem cell culture supernatant of Embodiment 1 (horseradish extract added culture), the cord blood stem cell culture supernatant of Comparative Example 3 (additive-free culture), and water as a comparative example (Comparative Example 4 ), and three types.
[Test method]
1. A 3.0 cm long by 2.0 cm wide frame was marked with an oil-based pen at the measurement points on the inside of the lower arm.
2. Wash the measurement points with soap and rest for 30 minutes.
3. Measure the skin moisture content at the measurement point under normal conditions (before application of each sample). This measurement is performed 5 times and an average value is obtained.
4. Take 0.1 g of the sample on the measurement site and evenly apply the
5. 10, 30, and 90 minutes after application of the sample, the skin moisture content is measured using a skin surface stratum corneum moisture content measuring device (SKICON-200EX manufactured by Yayoi Co., Ltd.).
[result]
The line connecting "x" in FIG. The data of the clear liquid (additive-free culture) is shown, and the line connecting "♦" shows the data of the water of Comparative Example 4. Note that the normal skin moisture content is set to 0.
From FIG. 2, 90 minutes after application, the skin moisture content when the cord blood stem cell culture supernatant of Embodiment 1 (horseradish root extract-added culture) was applied was higher than in Comparative Examples 3 and 4. I understand.
図３は肌理改善効果を比較した図である。
実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液（ウマサイタイエキス添加培養）と、比較例３の臍帯血幹細胞培養上清液（無添加培養）を試料とし、温度２５℃、湿度３５％の条件において、洗顔後に試料を２滴（約０．１ｇ）手に取って目尻に指先を使って優しくなじませ、肌理改善効果を確認した。
図３（ａ）は実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液（ウマサイタイエキス添加培養）の結果を示し、図３（ｂ）は比較例３の臍帯血幹細胞培養上清液（無添加培養）の結果を示している。図３（ａ）、（ｂ）において、左側はマイクロスコープ画像、右側は解析後であり、上段は試料の塗布前のもの、下段は試料の塗布６０分後のものである。なお、塗布前と塗布６０分後のマイクロスコープ画像は同一部位を撮影したものであり、同じ箇所を丸印又は実線で示している。
マイクロスコープ画像を解析し、両試料について塗布前後の肌理を目視で比較した。肌理の状態が悪いと、肌理が流れ皮丘と皮溝との差がない。肌理の状態が良いときは皮丘がふっくらとして網目が格子状である。図３に示すように、塗布前は肌理の状態が悪いが、両試料とも塗布６０分後にはくっきりとした肌理が確認され、どちらの培養上清液を塗布しても肌理が改善されている。さらに実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液（ウマサイタイエキス添加培養）の場合は、皮丘と皮溝との差がよりはっきりと確認でき、ハリが出ていた。よって、実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液（ウマサイタイエキス添加培養）は、比較例３の臍帯血幹細胞培養上清液（無添加培養）と比較して、肌理改善により有効であるといえる。
FIG. 3 is a diagram comparing texture improvement effects.
The umbilical cord blood stem cell culture supernatant of Embodiment 1 (horse rotten extract-added culture) and the umbilical cord blood stem cell culture supernatant of Comparative Example 3 (non-additive culture) were used as samples, and the temperature was 25 ° C. and the humidity was 35%. After washing the face, 2 drops (about 0.1 g) of the sample were applied to the outer corners of the eyes with the fingertips, and the effect of improving the texture was confirmed.
FIG. 3(a) shows the results of the cord blood stem cell culture supernatant of Embodiment 1 (horse rhinoceros tie extract added culture), and FIG. 3(b) shows the cord blood stem cell culture supernatant of Comparative Example 3 (culture without addition ) are shown. In FIGS. 3(a) and 3(b), the left side is the microscope image, the right side is after analysis, the upper side is before application of the sample, and the lower side is after 60 minutes of application of the sample. The microscope images before application and 60 minutes after application were taken from the same site, and the same site is indicated by a circle or a solid line.
Microscopic images were analyzed and the textures before and after application were visually compared for both samples. If the condition of the texture is poor, the texture is smooth and there is no difference between the cruciformis and the sulcus cutis. When the texture is good, the skin mounds are plump and the mesh is grid-like. As shown in FIG. 3, the texture was poor before application, but a clear texture was confirmed 60 minutes after application for both samples, and the texture was improved regardless of which culture supernatant was applied. . Furthermore, in the case of the umbilical cord blood stem cell culture supernatant of Embodiment 1 (Equine rhinoceros seaweed extract-added culture), the difference between the corniculus and the sulcus cutis could be confirmed more clearly, and firmness was observed. Therefore, the cord blood stem cell culture supernatant of Embodiment 1 (horse rotten extract-added culture) is more effective than the cord blood stem cell culture supernatant of Comparative Example 3 (additive-free culture) for improving texture. I can say.
図４は細胞遊走像の全体像を示す写真、図５は細胞遊走像のギャップ領域拡大像を示す写真である。
正常ヒト表皮角化細胞を用い、実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液（ウマサイタイエキス添加培養）を１０倍濃縮して被験物質（ｎ＝５）とし、細胞の存在しない領域であるギャップ領域を細胞が遊走することでどれだけ穴埋めできるかを観察した。
結果、被験物質０．３％（３％相当）添加にて有意にギャップ領域を遊走することを確認した。
FIG. 4 is a photograph showing the entire image of cell migration, and FIG. 5 is a photograph showing an enlarged gap region image of the cell migration image.
Using normal human epidermal keratinocytes, the umbilical cord blood stem cell culture supernatant of Embodiment 1 (horse mackerel extract-added culture) was concentrated 10-fold to obtain a test substance (n = 5), and a gap, which is a cell-free region, was obtained. It was observed how much holes could be filled by migration of cells in the area.
As a result, it was confirmed that addition of 0.3% (equivalent to 3%) of the test substance significantly migrated in the gap region.
また、図４、図５の画像についてギャップ領域の蛍光強度を測定し、細胞の遊走率を数値化した。図６は細胞遊走率定量結果を示す表、図７は細胞遊走率定量結果を示すグラフである。
統計解析を行ったところ、被験物質の添加濃度０．３％（３％相当）以上で有意な遊走率の上昇が確認された。
このように、実施形態１の臍帯血幹細胞培養上清液（ウマサイタイエキス添加培養）は、３％相当の添加で角化細胞の遊走を促進することができ、細胞の存在しない領域の穴埋め、すなわち、例えば、損傷部位などの遊走による治癒効果が期待できる。
Fluorescence intensity in the gap region was measured for the images of FIGS. 4 and 5, and the cell migration rate was quantified. FIG. 6 is a table showing the quantitative results of cell migration rate, and FIG. 7 is a graph showing the quantitative results of cell migration rate.
Statistical analysis confirmed a significant increase in migration rate at concentrations of 0.3% (equivalent to 3%) or more of the test substance added.
Thus, the umbilical cord blood stem cell culture supernatant of Embodiment 1 (horse mackerel extract-added culture) can promote keratinocyte migration when added at an amount equivalent to 3%, filling voids in cell-free regions, That is, for example, a healing effect can be expected due to migration of injured sites.
Claims (6)
幹細胞を出発物質として、培地にプラセンタ、サイタイ、又は羊膜の抽出物を添加することを特徴とする細胞培養上清液の製造方法。 A method for producing a culture supernatant obtained by removing the cells from a culture medium in which cells are cultured,
A method for producing a cell culture supernatant, which comprises using stem cells as a starting material and adding an extract of placenta, rhinoceros Tai or amniotic membrane to a medium.
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