JP2022150054A - Scanning type fluorescent microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、走査型蛍光顕微鏡に関する。 The present invention relates to scanning fluorescence microscopes.
蛍光顕微鏡として、標本を観察する光学系の光軸に交差する方向から標本に励起光を照射し、励起光の集光領域を2次元平面内に走査して得られる標本の蛍光像を撮像する走査型蛍光顕微鏡が開発されている。この走査型蛍光顕微鏡では、励起光の走査領域と標本との相対位置を変化させる仕組みが必要になる。このような仕組みには、例えば、励起光に対する標本をピエゾ素子の駆動で移動させたり(非特許文献1参照)、流体レンズでレンズの曲率を変化させたりするもの(非特許文献2参照)が考えられる。 As a fluorescence microscope, excitation light is applied to the specimen from a direction that intersects the optical axis of the optical system for observing the specimen, and a fluorescence image of the specimen obtained by scanning the focused region of the excitation light in a two-dimensional plane is captured. Scanning fluorescence microscopes have been developed. This scanning fluorescence microscope requires a mechanism for changing the relative position between the scanning region of the excitation light and the specimen. Such mechanisms include, for example, moving a sample with respect to excitation light by driving a piezo element (see Non-Patent Document 1), and changing the curvature of the lens with a fluid lens (see Non-Patent Document 2). Conceivable.
また、非特許文献3、4には、励起光の集光領域を標本上で走査させる顕微鏡が開示されている。この顕微鏡では、励起光の集光領域の位置を正弦波状に変化させ、集光領域を標本上で走査しており、その走査周波数は固定となっている。 Non-Patent Documents 3 and 4 disclose a microscope that scans a condensed region of excitation light on a specimen. In this microscope, the position of the condensed region of the excitation light is changed sinusoidally, and the condensed region is scanned on the specimen, and the scanning frequency is fixed.
正確かつ高速な撮像のためには、励起光の集光位置の走査周波数は大きければ大きいほどよい。しかしながら、ピエゾ素子で標本を1mm移動させようとすると走査周波数は10Hz程度が限界となる。また、流体レンズでは、レンズの曲率の整定時間が10ms以上必要となり、正確に走査可能な走査周波数は20~30Hz程度が限界となる。また、上記非特許文献3、4に開示された顕微鏡で励起光の集光領域の位置を標本上で正弦波状に変化させた場合では、励起光の強度を常に一定としたままでは標本上の位置によって励起光の照射量が異なり、標本の画像に輝度むらが生じるため、励起光の強度を集光領域の位置の変化に応じて変化させる必要がある。また、この顕微鏡では、走査の周波数が固定となっているので、励起光を照射する光源の方で、走査のタイミングに照射タイミングを合わせる制御系が必要となり、装置構成が複雑なものとなる。 For accurate and high-speed imaging, the higher the scanning frequency of the condensing position of the excitation light, the better. However, when trying to move the sample by 1 mm with the piezo element, the scanning frequency is limited to about 10 Hz. Moreover, the liquid lens requires a settling time of 10 ms or more for the curvature of the lens, and the scanning frequency at which accurate scanning is possible is limited to about 20 to 30 Hz. In the microscopes disclosed in Non-Patent Documents 3 and 4 above, when the position of the condensed region of the excitation light is changed sinusoidally on the specimen, if the intensity of the excitation light is kept constant, Since the irradiation amount of the excitation light differs depending on the position, and uneven brightness occurs in the image of the specimen, it is necessary to change the intensity of the excitation light according to the positional change of the light collection region. In addition, since the scanning frequency is fixed in this microscope, the light source that irradiates the excitation light requires a control system for synchronizing the irradiation timing with the scanning timing, which complicates the device configuration.
本発明は、上記実情の下になされたものであり、高速かつ正確に励起光の集光領域を走査するとともに、輝度むらのない画像を得ることができる走査型蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。 SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a scanning fluorescence microscope capable of scanning a condensed region of excitation light accurately at high speed and obtaining an image with no brightness unevenness. and
上記目的を達成するために、本発明に係る走査型蛍光顕微鏡は、
標本に蛍光を発生させる励起光を集光しつつ前記標本に照射することにより、前記励起光の集光領域を前記標本上に形成する照明光学系と、
前記照明光学系の光軸と交差する光軸を有し、前記集光領域で発生した前記標本の蛍光像を結像する結像光学系と、
撮像素子が2次元配列された撮像面を有し、前記撮像面が前記結像光学系による前記蛍光像の結像位置に配置された撮像部と、を備え、
前記照明光学系は、
回転軸及び前記回転軸を回転駆動する駆動部を有し、前記回転軸の回転により、光路途中で集光又は拡散される前記励起光を入射する入射位置が前記回転軸の回転方向に変化する反射部を有する回転ミラーを備え、
前記反射部には、
前記回転軸の回転角度の変化に対して、反射する前記励起光の進行方向に関する前記励起光の反射位置が第1の位置から第2の位置まで線形変化する反射面と、
前記回転軸の回転により、前記反射位置を前記第2の位置から前記第1の位置に変化させる段差と、
が設けられている。
In order to achieve the above object, the scanning fluorescence microscope according to the present invention comprises:
an illumination optical system for forming a focused area of the excitation light on the specimen by irradiating the specimen while condensing the excitation light that causes the specimen to generate fluorescence;
an imaging optical system having an optical axis that intersects with the optical axis of the illumination optical system and that forms a fluorescent image of the specimen generated in the condensing area;
an imaging unit having an imaging surface in which imaging elements are arranged two-dimensionally, and wherein the imaging surface is arranged at a position where the fluorescent image is formed by the imaging optical system;
The illumination optical system is
It has a rotating shaft and a driving unit that rotates the rotating shaft, and the rotation of the rotating shaft changes the incident position of the excitation light condensed or diffused in the optical path in the rotating direction of the rotating shaft. comprising a rotating mirror having a reflective portion;
In the reflecting part,
a reflecting surface in which the reflection position of the excitation light in the traveling direction of the reflected excitation light changes linearly from a first position to a second position with respect to a change in the rotation angle of the rotation shaft;
a step that changes the reflecting position from the second position to the first position by rotation of the rotating shaft;
is provided.
この場合、前記駆動部により前記回転軸を回転駆動して前記集光領域を前記標本上で走査させるとともに前記集光領域に対応する前記撮像面上の撮像領域にある前記撮像素子から撮像信号を読み出すように前記撮像部を制御する制御部を備え、
前記撮像部は、
前記撮像領域内の前記撮像素子から読み出される前記撮像信号に基づいて前記標本の蛍光像を取得する、
こととしてもよい。
In this case, the drive section rotates the rotating shaft to scan the condensed area on the specimen, and an imaging signal is received from the imaging device located in the imaging area on the imaging surface corresponding to the condensed area. A control unit that controls the imaging unit to read out,
The imaging unit is
Acquiring a fluorescent image of the specimen based on the imaging signal read from the imaging device in the imaging region;
You can do it.
前記回転軸の回転位置が基準位置となったことを検出する第1の検出部を備え、
前記制御部は、
前記第1の検出部で前記回転位置が前記基準位置となったことが検出されると、前記撮像面における前記撮像領域の位置を初期化する、
こととしてもよい。
A first detection unit that detects that the rotational position of the rotating shaft has become a reference position,
The control unit
Initializing the position of the imaging region on the imaging plane when the first detection unit detects that the rotational position has become the reference position;
You can do it.
前記回転軸の回転角度を検出する第2の検出部を備え、
前記制御部は、
前記第2の検出部で検出された前記回転角度に基づいて、前記撮像面における前記撮像領域の位置を制御する、
こととしてもよい。
A second detection unit that detects the rotation angle of the rotation shaft,
The control unit
controlling the position of the imaging region on the imaging plane based on the rotation angle detected by the second detection unit;
You can do it.
前記回転軸の1回転に対して、前記励起光の反射位置が1周期分又は複数周期分変化する、
こととしてもよい。
The reflection position of the excitation light changes by one cycle or by a plurality of cycles with respect to one rotation of the rotating shaft.
You can do it.
前記反射部の重心が、前記回転軸上にある、
こととしてもよい。
the center of gravity of the reflector is on the axis of rotation;
You can do it.
前記照明光学系は、前記標本に対して前記励起光を照射する方向を切り替え可能である、
こととしてもよい。
wherein the illumination optical system is capable of switching a direction in which the specimen is irradiated with the excitation light;
You can do it.
本発明によれば、光路途中で集光又は拡散される励起光の反射位置を、励起光の反射方向に第1の位置から第2の位置まで線形変化させるとともに第2の位置から第1の位置へ段差で瞬時に変化させることができるので、励起光の集光領域を標本上で遅れなく正確に走査させることができるうえ、標本に対する励起光の照射量を均一なものとすることができる。このため、高速かつ正確に励起光の集光領域を走査するとともに、輝度むらのない画像を得ることができる。 According to the present invention, the reflection position of the excitation light condensed or diffused in the optical path is changed linearly from the first position to the second position in the reflection direction of the excitation light, and from the second position to the first position. Since the position can be changed instantaneously by steps, the excitation light condensing region can be accurately scanned on the sample without delay, and the irradiation amount of the excitation light to the sample can be made uniform. . Therefore, it is possible to scan the condensed region of the excitation light accurately at high speed, and to obtain an image with no brightness unevenness.
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。各図面においては、同一又は同等の部分には同一の符号が付される。なお、図面では、必要に応じてxyz3軸直交座標系が規定されている。以下では、この座標系を参照して説明を行う。 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. In each drawing, the same reference numerals are given to the same or equivalent parts. In the drawings, an xyz three-axis orthogonal coordinate system is defined as necessary. The following description will be made with reference to this coordinate system.
図1に示すように、本実施の形態に係る走査型蛍光顕微鏡1は、生体試料または非生体試料である標本Sから発せられる蛍光ELにより標本Sを観察する顕微鏡である。走査型蛍光顕微鏡1は、照明光学系10と、結像光学系11と、撮像部12と、制御部13と、ステージ14と、を備える。
As shown in FIG. 1, a
照明光学系10は、光軸AX1を有しており、光軸AX1に沿って励起光ILを標本Sに照射する光学系である。照明光学系10は、励起光ILを集光しつつ標本Sに照射する。これにより、励起光ILの集光領域A1が標本S上に形成され、集光領域A1における標本Sの分子が励起されて蛍光ELが発せられる。
The illumination
結像光学系11は、照明光学系10の光軸AX1と交差する光軸AX2を有している。図1では、光軸AX2はz軸と平行に延びている。結像光学系11は、標本Sから発せられる蛍光ELを入射し、光軸AX2に沿って進む蛍光ELを出射して、集光領域A1で発生した標本Sの蛍光像(倒立像)を結像面上に結像する。結像光学系11は、テレセントリック光学系であり、調整可能な倍率で蛍光像を結像面上に投影する。
The imaging optical system 11 has an optical axis AX2 that intersects the optical axis AX1 of the illumination
撮像部12は、撮像素子12aが2次元配列された撮像面12sを有する。撮像部12では、撮像面12sが結像光学系11による蛍光像の結像位置に配置されている。撮像部12としては、例えばCMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor)センサが用いられる。撮像部12では、2次元配列された撮像素子の撮像結果を示す信号を、1ラインずつ読み出し可能である。本実施の形態では、図2に示すように、y軸方向に沿った一列の撮像素子12aの撮像信号を、位置X1から位置X2までx軸方向に沿って順番に出力するものとする。読み出される撮像素子12aのy方向の列を読み出しラインともいう。
The
図1に戻り、制御部13は、照明光学系10及び撮像部12を制御するコントローラである。制御部13は、後述のように、照明光学系10の後述の回転ミラー20の回転のタイミングを検出し、撮像部12の撮像信号の出力タイミング、すなわち読み出される読み出しラインを制御する。
Returning to FIG. 1 , the
ステージ14には、標本Sが結像光学系11に対向する状態で搭置される。ステージ14は、x軸、y軸、z軸方向の位置、x軸周り、y軸周り、z軸周りのステージ14の傾斜の6自由度で、位置及び姿勢を調整可能であってもよい。この場合、制御部13が、ステージの位置及び姿勢を制御する。
A specimen S is mounted on the
照明光学系10は、回転ミラー20を備えている。回転ミラー20は、励起光ILの光路途中で集光又は拡散される励起光ILを入射し、これを反射する。回転ミラー20は、回転軸21と、反射部22と、駆動部としての回転モータ23(図3(A)参照)と、を備えている。回転軸21は、反射部22を回転させる。反射部22は、回転軸21の回転により、光路途中で集光又は拡散される励起光ILを入射する入射位置が回転軸21の回転方向に変化する。回転モータ23は、回転軸21を回転駆動する。
The illumination
制御部13は、図1の矢印で示すように、回転モータ23(図3(A)参照)により回転軸21を回転駆動して集光領域A1を標本S上で走査させるとともに集光領域A1に対応する撮像領域A2を撮像面12s上で同期走査する。すなわち、制御部13は、集光領域A1に対応する撮像面12s上の撮像領域A2にある撮像素子12aから撮像信号を読み出すように撮像部12を制御する。撮像部12は、撮像領域A2にある撮像素子12aから出力される撮像信号に基づいて標本Sの蛍光像を取得する。なお、本実施の形態では、撮像領域A2のx軸方向の幅は、撮像素子12aのx軸方向の幅以下となるように規定されているものとする。
As indicated by the arrow in FIG. 1, the
照明光学系10のより詳細な構成について説明する。図3(A)に示すように、照明光学系10は、光源30と、レンズ31a,31bと、反射ミラー32と、偏光ビームスプリッタ33と、1/4波長板34と、集光レンズ35と、を備える。
A more detailed configuration of the illumination
光源30は、励起光ILを出射する。光源30から発せられる励起光ILは、観察対象から蛍光ELを発生させる波長の光である。この光は例えば400nm以上1500nm以下の光を含むことができる。この光は、インコヒーレントな光であってもコヒーレントな光であってもよい。光源30としては水銀ランプ、キセノンランプ、発光ダイオード又はレーザ光源が用いられる。
The
レンズ31a、31bは、光源30から出射された励起光ILを中継し、励起光ILを平行光に整形する。反射ミラー32は、レンズ31a、31bで中継された励起光ILを反射する。反射ミラー32で反射した励起光ILは、平行光の状態で偏光ビームスプリッタ33に至る。
The
ここで、励起光ILは、P偏光となっており、偏光ビームスプリッタ33は、励起光ILを透過する。偏光ビームスプリッタ33を透過した励起光ILは、1/4波長板34、集光レンズ35を経て集光又は拡散し、回転ミラー20の反射部22の反射面22a、22b(図4(A)参照)に入射した後、逆方向に反射する。回転ミラー20で逆方向に反射した励起光ILは、集光レンズ35で平行光になり、1/4波長板34でS偏光となって、偏光ビームスプリッタ33に入射する。
Here, the excitation light IL is P-polarized, and the
図3(B)に示すように、偏光ビームスプリッタ33に入射したS偏光としての励起光ILは、偏光ビームスプリッタ33で-z方向に反射する。照明光学系10は、レンズ36と、ガルバノミラー37と、レンズ38とを備える。y’軸は、xy平面に平行、かつ、x軸とy軸と斜交する方向に延びている。回転ミラー20で反射し、偏光ビームスプリッタ33に入射した励起光ILは、レンズ36を経てガルバノミラー37で反射し、-y’方向に進んでレンズ38に至る。レンズ36は、焦点を調整するために設けられており、ガルバノミラー37は、励起光ILのz位置を調整するために設けられている。
As shown in FIG. 3B, the excitation light IL as S-polarized light incident on the
図3(C)に示すように、照明光学系10は、ガルバノミラー39と、直角プリズム40と、を備える。レンズ38を経た励起光ILは、ガルバノミラー39に入射する。ガルバノミラー39で反射した励起光ILは、直角プリズム40に入射する。ガルバノミラー39は、励起光ILが入射する直角プリズム40の面を-x側とするか+x側とするかを切り替えるために設けられている。
As shown in FIG. 3C, the illumination
照明光学系10は、さらに、レンズ41Aと、反射ミラー42Aと、レンズ43Aa、43Abと、ガルバノミラー44Aと、対物レンズ45Aと、を備える。これらの構成要素によって構成される光学系を光学系50Aとする。ガルバノミラー39で反射した励起光ILが直角プリズム40の-x側の面に入射した場合、直角プリズム40で反射した励起光ILは、レンズ41Aを経て、反射ミラー42Aに進む。励起光ILは、反射ミラー42Aで反射した後、レンズ43Aa、43Abを経て、ガルバノミラー44Aで反射される。ガルバノミラー44Aで反射した励起光ILは、対物レンズ45Aで集光されつつ、-x側から+x方向に標本Sに入射し、励起光ILの集光領域A1を標本S上に形成する。ガルバノミラー44Aの振動により、集光領域A1は、y軸方向に延びる線状の領域となる。ガルバノミラー44Aの信号周波数は、撮像部12の各撮像素子12aの露光時間の2倍の周波数となっている。
The illumination
照明光学系10は、さらに、レンズ41Bと、反射ミラー42Bと、レンズ43Ba、43Bbと、ガルバノミラー44Bと、対物レンズ45Bと、を備える。これらの構成要素によって構成される光学系を光学系50Bとする。光学系50Bの構成要素は、光学系50Aの構成要素と同じである。ガルバノミラー39で反射した励起光ILが直角プリズム40の+x側の面に入射した場合、これらの光学系は、励起光ILを+x側から-x方向に標本Sに入射して、励起光ILの集光領域A1を標本S上に形成する。ガルバノミラー44Bの振動により、集光領域A1は、y軸方向に延びる線状の領域となる。
The illumination
このように、照明光学系10は、ガルバノミラー39の向きに応じて標本Sに対して励起光ILを照射する光学系を、光学系50Aか、光学系50Bかのいずれかに切り替え可能である。光学系50Aと光学系50Bとの切り替えを行うことにより、互いに逆方向から励起光ILが照射された2つの画像が撮像部12で撮像可能となる。この2つの画像を例えばタイリングして表示すれば、標本Sの観察結果へのアーチファクトの影響を少なくすることができる。なお、回転ミラー20の回転方向は、光学系50Aにより励起光ILを照射する場合と、光学系50Bにより励起光ILを照射する場合とで逆向きとなる。
Thus, the illumination
回転ミラー20の詳細な構成について説明する。回転ミラー20の反射部22は、図4(A)及び図4(B)に示すように、全体として円板状である。反射部22は、例えばリン青銅で形成されている。反射部22には、反射面22a、22bが設けられている。反射面22a、22bは、アルミニウムでコーティングされている。反射面22aと反射面22bとで、中心軸AX3を中心として環状の反射面が形成されている。しかしながら、回転ミラー20の素材は、これには限定されず、様々なものを適用することができる。
A detailed configuration of the
図4(B)に示すように、この円柱の中心軸AX3に沿って回転軸21が取り付けられている。この円柱の中心軸AX3の方向が回転軸21の軸方向となる。回転ミラー20の回転により、励起光ILの入射位置は、反射面22aと反射面22bとを交互に繰り返すようになる。
As shown in FIG. 4B, a
図4(A)及び図4(B)に示すように、反射面22a、22bとは、中心軸AX3に直交する平面に対して傾斜している。特に、反射面22a、22bは、中心軸AX3の回転方向に沿って当該平面に対して一定の傾斜角度で傾斜している。すなわち、反射面22a、22bは、それぞれ中心軸AX3周りにらせん状となっている。反射面22aと反射面22bとの2つの境界には、段差22c、22dが設けられている。本実施の形態では、反射部22は、図4(B)の矢印の方向に回転するものとする。
As shown in FIGS. 4A and 4B, the reflecting
また、反射面22a、22bは、図4(B)に示すように、中心軸AX3に直交する平面に対して中心軸AX3の中心を通る切断面において反射面22a、22bが全体として山形を形成するように半径方向外側に向かって角度θで傾斜している。
Further, as shown in FIG. 4B, the reflecting
励起光ILは、図5(A)及び図5(B)に示すように、x軸方向に沿って、反射部22の反射面22a又は反射面22bに入射する。回転モータ23、回転軸21及び反射部22は、x軸に平行な方向に対して角度θ傾けて設置されている。この傾斜により、反射面22a、22bには、中心軸AX3周りの半径方向に沿ったx軸方向に直交する線状の部分が形成される。励起光ILはこの線状の部分に入射する。したがって、励起光ILは、入射した方向の逆方向に反射して進む。
The excitation light IL is incident on the reflecting
図5(A)及び図5(B)に示すように、回転ミラー20の回転により、反射する励起光ILの進行方向に関する励起光ILの集光位置が変化する。ここで、図4(B)の紙面方向表側から見て、反射部22が時計回りに回転しているものとする。図5(A)では、励起光ILが反射面22bから段差22dを越えて反射面22aで反射した状態が示されている。この状態では、反射する励起光ILの進行方向に関する励起光ILの反射位置は第1の位置P1となっている。
As shown in FIGS. 5A and 5B, the rotation of the
回転ミラー20がさらに回転すると、励起光ILの反射位置は、回転ミラー20の回転速度に応じて、反射面22a上を進み、第1の位置P1から第2の位置P2に線形変化する。図5(B)には、回転ミラー20が180度回転して、励起光ILの反射位置が反射面22aにおいて、段差22cの直前に差しかかった状態が示されている。この状態では、反射する励起光ILの進行方向に関する励起光ILの反射位置は第2の位置P2となっている。励起光ILの反射位置が段差22cを超えると、励起光ILは反射面22bに入射し、その反射位置は第2の位置P2から第1の位置P1に変化する。
As the
同様に、励起光ILが反射面22bから段差22dを越えて反射面22aに入射したときに、励起光ILの反射位置は、第1の位置P1となり、その後、回転ミラー20の回転角度に応じて励起光ILの反射位置は、第1の位置P1から第2の位置P2に線形変化する。励起光ILが段差22cの直前に差しかかったときに励起光ILの反射位置は、第2の位置P2となる。励起光ILの反射位置が段差22cを超えると、励起光ILは反射面22bに入射し、その反射位置は、第2の位置P2から第1の位置P1に変化する。
Similarly, when the excitation light IL passes over the
このように、回転モータ23の駆動により、反射部22が回転すると、反射部22では、反射する励起光ILの進行方向に関する励起光ILの反射位置が第1の位置P1から第2の位置P2まで回転軸21の回転角度の変化に対して線形変化する。回転軸21の回転により、段差22c、22dは、回転軸21の軸方向に関する励起光ILの反射位置を第2の位置P2から第1の位置P1に変化させる。
In this way, when the reflecting
図6(A)に示すように、第1の位置P1と第2の位置P2との間の中間位置PNにおいて、励起光ILが集光しているものとし、この集光位置をFNとする。この場合、励起光ILの反射位置が第1の位置P1にあるときには、反射する励起光ILの焦点位置は、F1となる。また、励起光ILの反射位置が第2の位置P2にあるときには、励起光ILの反射光の焦点位置は、F2となる。 As shown in FIG. 6A, it is assumed that the excitation light IL is condensed at an intermediate position PN between the first position P1 and the second position P2, and this condensing position is FN. . In this case, when the reflection position of the excitation light IL is at the first position P1, the focal position of the reflected excitation light IL is F1. Further, when the reflection position of the excitation light IL is at the second position P2, the focal position of the reflected light of the excitation light IL is F2.
回転ミラー20付近の焦点位置F1、F2と、標本S上の焦点位置F1’、F2’とは、共役の関係にある。したがって、上述の励起光ILの焦点位置の変化により、図6(B)に示すように、標本S上における集光領域A1は、焦点位置F1’から焦点位置F2’に移動する。すなわち、回転ミラー20を回転させて、励起光ILの反射位置を第1の位置P1から第2の位置P2に移動させることにより、標本S上の集光領域A1を焦点位置F1’から焦点位置F2’に走査することができる。
The focal positions F1 and F2 near the rotating
図3(A)に示すように、照明光学系10は、第1の検出部としての検出部25をさらに備えている。回転ミラー20の回転軸21には、回転モータ23の駆動軸が連結されており、回転モータ23の駆動により、回転軸21及び反射部22が一定速度で回転する。検出部25は、カム26と、フォトセンサ27と、を備える。
As shown in FIG. 3A, the illumination
カム26は、回転軸21に固定された円板状の部材である。カム26は、回転軸21の回転に伴って回転する。図7(A)に示すように、カム26には、回転方向に沿った段差22c、22dに対応する位置に半径方向に延びるスリット26aが形成されている。
The
図7(B)及び図7(C)に示すように、フォトセンサ27は、カム26の外縁にビーム24を照射している。フォトセンサ27では、図7(C)に示すように、ビーム24の照射位置にスリット26aが位置したときにのみ、ビーム24を受光する。ビーム24を受光したときの回転ミラー20の回転位置を基準位置とする。
As shown in FIGS. 7B and 7C, the
検出部25は、回転軸21の回転位置が基準位置となったことを検出するために設けられている。基準位置になったことは、図7(A)に示すように、検出部25から制御部13に送られる。制御部13は、検出部25で回転位置が基準位置となったことが検出されると、撮像面12sにおける撮像領域A2の位置を位置X1に初期化する。制御部13は、このタイミングで、集光領域A1と撮像領域A2とを同期走査する。
The
このように、この回転ミラー20では、図8(A)に示すように、回転軸21が半回転する度(時間0~T)に、励起光ILの反射位置が第1の位置P1から第2の位置P2まで線形変化する。これにより、図8(B)に示すように、集光領域A1は、標本S上を焦点位置F1’から焦点位置F2’まで線形変化する。制御部13は、撮像部12の撮像面12sにおいて、撮像領域A2の読み出しラインを、図8(C)に示すように、位置X1から位置X2まで線形変化させる。これにより、標本S上の集光領域A1に対応する撮像領域A2の撮像信号が読み出される。制御部13は、撮像領域A2内の撮像素子12aから出力された撮像信号により、標本Sの撮像画像Imを生成する。なお、回転ミラー20が1回転すると、励起光ILの反射位置、集光領域A1、撮像領域A2はそれぞれ2回走査、すなわち、2周期分走査されるようになる。すなわち、回転ミラー20の1回転につき、撮像画像Imが2枚得られる。
Thus, in this
照明光学系10では、1回走査する度に、ガルバノミラー37の角度を変更して励起光ILのz位置を変更することにより、標本S上の異なるz位置でxy平面の蛍光像の撮像画像Imを撮像することができる。z位置が異なる標本Sの撮像画像Imを重ね合わせることにより、図9に示すように、標本Sの3次元画像60を得ることができる。
The illumination
なお、反射部22において、その重心は、回転軸21上、すなわち中心軸AX3上にあるのが望ましい。本実施の形態では、反射部22は、反射面22aの部分と、反射面22bの部分とを有しているため、これら2つの部分が、中心軸AX3を中心として2回回転対称となっている。したがって、反射部22の重心は、回転軸21上にある。これにより、回転モータ23によって回転駆動される反射部22に、偏心による不要な振動が発生するのを防止することができる。この結果、反射部22の安定した回転が可能となる。
In addition, it is desirable that the center of gravity of the reflecting
本実施の形態に係る走査型蛍光顕微鏡1では、照明光学系10は、図3の対物レンズ45Aの代わりに、図10(A)及び図10(B)に示すように、シリンドリカルレンズ55を備え、ガルバノミラー44Aに代えて、位置が固定された反射ミラー44A’を備えるようにしてもよい。この場合、反射ミラー44A’で反射した励起光ILは、シリンドリカルレンズ55に入射した後、z軸方向に集光して、y軸方向に延びる線状の集光領域A1を形成する。この集光領域A1が、回転ミラー20の回転により、x軸方向に走査されるのは、上記実施の形態1と同じである。
In the
以上詳細に説明したように、上記実施の形態に係る走査型蛍光顕微鏡1によれば、光路途中で集光又は拡散される励起光ILの反射位置を、励起光ILの反射方向に第1の位置P1から第2の位置P2まで線形変化させるとともに、第2の位置P2から第1の位置P1へ段差22c、22dで瞬時に変化させることができるので、励起光ILの集光領域A1を標本S上で遅れなく正確に走査させることができるうえ、標本Sに対する励起光ILの照射量を均一なものとすることができる。このため、高速かつ正確に励起光ILの集光領域を走査するとともに、輝度むらのない画像を得ることができる。
As explained in detail above, according to the
すなわち、回転ミラー20の回転により集光領域A1を走査するため、その位置制御を行う際の整定時間は考慮する必要がなく、集光領域A1の位置を瞬時かつ正確に制御することが可能となる。
That is, since the condensing area A1 is scanned by the rotation of the
また、上記実施の形態では、回転ミラー20の反射部22では、回転軸21の軸方向に関する励起光ILの反射位置が第1の位置P1から第2の位置P2まで回転軸21の回転角度に応じて線形変化するものとしている。このようにすれば、標本S上の集光領域A1を均一な速度で変化させ、標本Sから発せられる蛍光による撮像画像を均一な強度の励起光ILによるものとすることができる。
Further, in the above-described embodiment, in the reflecting
また、上記実施の形態では、回転ミラー20の反射部22における励起光ILの反射面には、入射する励起光ILの進行方向に関する励起光ILの反射位置を第1の位置P1から第2の位置P2に変化させる段差22c、22dが設けられているものとしている。段差22c、22dを設けることにより、集光領域A1を焦点位置F2’から焦点位置F1’まで瞬時に移動させることができる。
In the above-described embodiment, the reflecting surface of the reflecting
また、上記実施の形態では、回転ミラー20の回転軸21の回転位置が基準位置となったことを検出する検出部25を備えている。制御部13は、検出部25で回転ミラー20の回転位置が基準位置となったことが検出されると、撮像面12sにおける撮像領域A2の位置を初期化することにより、集光領域A1と撮像領域A2とを同期させるものとしている。このようにすれば、集光領域A1と撮像領域A2との同期ずれを蓄積させることなく、標本Sを撮像することができる。
Further, in the above-described embodiment, the
なお、回転モータ23がその回転位置を検出するエンコーダを備え、エンコーダを、回転軸の回転位置を検出する第2の検出部として用いるようにしてもよい。この場合、制御部13は、エンコーダで検出された回転位置に、撮像面12sにおける撮像領域A2の位置が同期するように撮像部12を制御する。このようにすれば、常に、撮像領域A2の位置を、エンコーダで検出された回転位置に同期させることができるので、集光領域A1と撮像領域A2との同期ずれを低減することができる。
It should be noted that the
本実施の形態では、回転軸21が1回転する度に、集光領域A1が2回走査されるものとしている。しかしながら、これには限られない。例えば、図11に示すように、回転軸21が1回転する度に、集光領域A1が1回走査される、すなわち1周期分変化する回転ミラー20を用いてもよい。この場合、回転軸21の反射面22eは、環状、かつ、らせん状となっており、始点と終点との間に段差22fが設けられている。また、回転軸21が1回転する度に、集光領域A1が3回以上走査されるものとしてもよい。回転軸21が1回転したときの集光領域A1の走査回数を増やせば増やすほど、回転ミラー20の回転速度を低くすることができる。
In this embodiment, the condensing area A1 is scanned twice each time the rotating
上記実施の形態では、反射部22の重心は、回転軸21上にあるものとしている。このようにすれば、回転ミラー20の回転による不要な振動の発生を防止することができる。また、図11に示される回転ミラー20では、反射面22eの反対側の形状を、反射面22eと同じ形状で、中心軸AX3を中心に、反射面22eと2回回転対称となる形状としているため、その重心が中心軸AX3上に位置している。
In the above-described embodiment, the center of gravity of the
このように、反射部22は、1回走査、2回走査、3回以上の走査可能な形状とし、その重心を中心軸AX3上とすることができる。しかしながら、偏心が発生しないのであれば、反射部22の重心は、回転軸21上になくてもよい。
In this way, the reflecting
また、上記実施の形態では、回転ミラー20の回転軸21を照明光学系10の光軸AX1に対して角度θだけ傾斜している。しかしながら、本発明はこれには限られない。励起光ILは、入射方向に直交する反射面に入射するようにすればよい。
Further, in the above embodiment, the
上記実施の形態では、照明光学系10は、標本に対して励起光ILを照射する方向を2方向から切り替え可能としている。しかしながら、本発明はこれには限られない。励起光ILを照射する方向を一方向としてもよいし、三方向以上から照射可能としてもよい。多方向から励起光ILを入射し、その蛍光像を得るようにすれば、退色や吸収の影響を少なくして、輝度むらのない蛍光像を得ることができる。
In the above embodiment, the illumination
上記実施の形態では、回転ミラー20は、入射方向と逆方向に励起光ILを反射している。しかしながら、本発明はこれには限られない。回転ミラー20では、励起光ILの入射方向と出射方向とが異なっていてもよい。回転ミラー20は、その回転に応じて、反射する励起光ILの進行方向に関する励起光ILの反射位置が、回転軸21による回転に従って周期的に線形変化するものであればよい。
In the above embodiment, the rotating
また、上記実施の形態では、撮像部12におけるy軸方向に延びる読み出しラインをx軸方向で同期走査し、読み出しラインからの信号で、撮像画像Imを得ている。しかしながら、本発明はこれには限定されない。撮像部12の1枚の撮像画像Imを撮像する時間よりも回転ミラー20の回転速度を遅くし、例えば、図12に示すように、回転ミラー20が1回転する間に複数枚の撮像画像Im1~Im6を撮像するようにし、撮像画像Im1~Im6の中で、集光領域A1と共役な撮像領域A2に対応する画像領域M1~M6を撮像画像Im1~Im6から抽出し、撮像画像Im1~Im6を合成して、1枚の撮像画像Imを生成するようにしてもよい。なお、ここでは、合成用の撮像画像Im1~Im6を6枚としているが、合成する撮像画像の枚数は、5枚以下であってもよいし、7枚以上であってもよい。
In the above-described embodiment, the readout line extending in the y-axis direction in the
また、撮像部12の撮像面12sにシャッタを設けるようにしてもよい。制御部13は、シャッタでは、集光領域A1の移動に沿ってシャッタの開口部分を位置X1から位置X2まで移動させ、集光領域A1と撮像領域A2との同期走査を行うようにしてもよい。このようなシャッタは、結像光学系11における撮像面12sと共役な位置に設けるようにしてもよい。
Also, a shutter may be provided on the
また、上記実施の形態では、撮像部12をCMOSセンサで構成している。しかしながら、これには限られない。撮像部12をCCD(Charge-Coupled Device)センサで構成するようにしてもよい。
Further, in the above-described embodiment, the
この発明は、この発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、この発明の範囲を限定するものではない。すなわち、この発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。 The present invention is capable of various embodiments and modifications without departing from the broader spirit and scope of the invention. Moreover, the embodiment described above is for explaining the present invention, and does not limit the scope of the present invention. That is, the scope of the present invention is indicated by the claims rather than the embodiments. Various modifications made within the scope of the claims and within the meaning of equivalent inventions are considered to be within the scope of the present invention.
本発明は、励起光により蛍光を発する試料を観察するのに適用することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be applied to observe a sample that emits fluorescence due to excitation light.
1 走査型蛍光顕微鏡、10 照明光学系、11 結像光学系、12 撮像部、12a 撮像素子、12s 撮像面、13 制御部、14 ステージ、20 回転ミラー、21 回転軸、22 反射部、22a、22b 反射面、22c、22d 段差、22e 反射面、22f 段差、23 回転モータ、24 ビーム、25 検出部、26 カム、26a スリット、27 フォトセンサ、30 光源、31a、31b レンズ、32 反射ミラー、33 偏光ビームスプリッタ、34 1/4波長板、35 集光レンズ、36 レンズ、37 ガルバノミラー、38 レンズ、39 ガルバノミラー、40 直角プリズム、41A,41B レンズ、42A,42B 反射ミラー、43Aa,43Ab,43Ba,43Bb レンズ、44A,44B ガルバノミラー、44A’ 反射ミラー、45A,45B 対物レンズ、50A、50B 光学系、55 シリンドリカルレンズ、60 3次元画像、A1 集光領域、A2 撮像領域、AX1 光軸、AX2 光軸、AX3 中心軸、EL 蛍光、IL 励起光、Im、Im1~Im6 撮像画像、M1~M6 画像領域、S 標本
1 scanning fluorescence microscope, 10 illumination optical system, 11 imaging optical system, 12 imaging unit, 12a imaging element, 12s imaging plane, 13 control unit, 14 stage, 20 rotating mirror, 21 rotating shaft, 22 reflecting unit, 22a,
上記目的を達成するために、本発明に係る走査型蛍光顕微鏡は、
標本に蛍光を発生させる励起光を集光しつつ前記標本に照射することにより、前記励起光の集光領域を前記標本上に形成する照明光学系と、
前記照明光学系の光軸と交差する光軸を有し、前記集光領域で発生した前記標本の蛍光像を結像する結像光学系と、
撮像素子が2次元配列された撮像面を有し、前記撮像面が前記結像光学系による前記蛍光像の結像位置に配置された撮像部と、を備え、
前記照明光学系は、
回転軸及び前記回転軸を回転駆動する駆動部を有し、前記回転軸の回転により、光路途中で集光される前記励起光を入射する入射位置が前記回転軸の回転方向に変化する反射部を有する回転ミラーを備え、
前記反射部には、
前記回転軸の回転角度の変化に対して、反射する前記励起光の進行方向に関する前記励起光の反射位置が第1の位置から第2の位置まで線形変化する反射面と、
前記回転軸の回転により、前記反射位置を前記第2の位置から前記第1の位置に変化させる段差と、
が設けられ、
前記反射部では、前記励起光の入射方向と出射方向とが逆向きでなく、
前記撮像部は、前記回転ミラーが1回転する間に複数枚の画像を撮像し、前記複数枚の画像を合成して、1枚の撮像画像を生成する。
In order to achieve the above object, the scanning fluorescence microscope according to the present invention comprises:
an illumination optical system for forming a focused area of the excitation light on the specimen by irradiating the specimen while condensing the excitation light that causes the specimen to generate fluorescence;
an imaging optical system having an optical axis that intersects with the optical axis of the illumination optical system and that forms a fluorescent image of the specimen generated in the condensing area;
an imaging unit having an imaging surface in which imaging elements are arranged two-dimensionally, and wherein the imaging surface is arranged at a position where the fluorescent image is formed by the imaging optical system;
The illumination optical system is
A reflecting unit having a rotating shaft and a driving unit for rotationally driving the rotating shaft, wherein the incident position of the excitation light condensed in the optical path changes in the rotating direction of the rotating shaft due to the rotation of the rotating shaft. a rotating mirror having
In the reflecting part,
a reflecting surface in which the reflection position of the excitation light in the traveling direction of the reflected excitation light changes linearly from a first position to a second position with respect to a change in the rotation angle of the rotation shaft;
a step that changes the reflecting position from the second position to the first position by rotation of the rotating shaft;
is provided ,
In the reflecting section, the incident direction and the emitting direction of the excitation light are not opposite to each other,
The imaging unit captures a plurality of images while the rotating mirror rotates once, and synthesizes the plurality of images to generate a single captured image .
Claims (7)
前記照明光学系の光軸と交差する光軸を有し、前記集光領域で発生した前記標本の蛍光像を結像する結像光学系と、
撮像素子が2次元配列された撮像面を有し、前記撮像面が前記結像光学系による前記蛍光像の結像位置に配置された撮像部と、を備え、
前記照明光学系は、
回転軸及び前記回転軸を回転駆動する駆動部を有し、前記回転軸の回転により、光路途中で集光又は拡散される前記励起光を入射する入射位置が前記回転軸の回転方向に変化する反射部を有する回転ミラーを備え、
前記反射部には、
前記回転軸の回転角度の変化に対して、反射する前記励起光の進行方向に関する前記励起光の反射位置が第1の位置から第2の位置まで線形変化する反射面と、
前記回転軸の回転により、前記反射位置を前記第2の位置から前記第1の位置に変化させる段差と、
が設けられている、
走査型蛍光顕微鏡。 an illumination optical system for forming a focused area of the excitation light on the specimen by irradiating the specimen while condensing the excitation light that causes the specimen to generate fluorescence;
an imaging optical system having an optical axis that intersects with the optical axis of the illumination optical system and that forms a fluorescent image of the specimen generated in the condensing area;
an imaging unit having an imaging surface in which imaging elements are arranged two-dimensionally, and wherein the imaging surface is arranged at a position where the fluorescent image is formed by the imaging optical system;
The illumination optical system is
It has a rotating shaft and a driving unit that rotates the rotating shaft, and the rotation of the rotating shaft changes the incident position of the excitation light condensed or diffused in the optical path in the rotating direction of the rotating shaft. comprising a rotating mirror having a reflective portion;
In the reflecting part,
a reflecting surface in which the reflection position of the excitation light in the traveling direction of the reflected excitation light changes linearly from a first position to a second position with respect to a change in the rotation angle of the rotation shaft;
a step that changes the reflecting position from the second position to the first position by rotation of the rotating shaft;
is provided with
Scanning fluorescence microscopy.
前記撮像部は、
前記撮像領域内の前記撮像素子から読み出される前記撮像信号に基づいて前記標本の蛍光像を取得する、
請求項1に記載の走査型蛍光顕微鏡。 The rotating shaft is rotationally driven by the driving unit to scan the converging area on the specimen, and an imaging signal is read out from the imaging element located in the imaging area on the imaging surface corresponding to the condensing area. A control unit that controls the imaging unit,
The imaging unit is
Acquiring a fluorescent image of the specimen based on the imaging signal read from the imaging device in the imaging region;
A scanning fluorescence microscope according to claim 1 .
前記制御部は、
前記第1の検出部で前記回転位置が前記基準位置となったことが検出されると、前記撮像面における前記撮像領域の位置を初期化する、
請求項2に記載の走査型蛍光顕微鏡。 A first detection unit that detects that the rotational position of the rotating shaft has become a reference position,
The control unit
Initializing the position of the imaging region on the imaging plane when the first detection unit detects that the rotational position has become the reference position;
A scanning fluorescence microscope according to claim 2 .
前記制御部は、
前記第2の検出部で検出された前記回転角度に基づいて、前記撮像面における前記撮像領域の位置を制御する、
請求項2に記載の走査型蛍光顕微鏡。 A second detection unit that detects the rotation angle of the rotation shaft,
The control unit
controlling the position of the imaging region on the imaging plane based on the rotation angle detected by the second detection unit;
A scanning fluorescence microscope according to claim 2 .
請求項1から4のいずれか一項に記載の走査型蛍光顕微鏡。 The reflection position of the excitation light changes by one cycle or by a plurality of cycles with respect to one rotation of the rotating shaft.
A scanning fluorescence microscope according to any one of claims 1 to 4.
請求項1から5のいずれか一項に記載の走査型蛍光顕微鏡。 the center of gravity of the reflector is on the axis of rotation;
A scanning fluorescence microscope according to any one of claims 1 to 5.
請求項1から6のいずれか一項に記載の走査型蛍光顕微鏡。 wherein the illumination optical system is capable of switching a direction in which the specimen is irradiated with the excitation light;
A scanning fluorescence microscope according to any one of claims 1 to 6.
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