JP2022140304A

JP2022140304A - 新規菌株及びそれを含む組成物並びにイネ科植物の細菌性病害の防除剤

Info

Publication number: JP2022140304A
Application number: JP2022017859A
Authority: JP
Inventors: 千春冨山（秋本）; Tomiyama, (Akimoto) Chiharu; 雄介香西; Yusuke Kozai
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2021-03-12
Filing date: 2022-02-08
Publication date: 2022-09-26

Abstract

【課題】本発明は、微生物資材のバリエーションを広げるため、イネ科植物の細菌性病害の防除に有用な新規菌株を提供することを目的としている。【解決手段】本発明は、パントエア・ディスペルサ（Ｐａｎｔｏｅａｄｉｓｐｅｒｓａ）ＢＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥＰ－０３３６５）及びそれを含む組成物に関する。また、本発明は、トキソフラビン耐性菌を含む、イネ科植物の細菌性病害の防除剤、及び、トキソフラビン耐性菌を含むイネ科植物の種子にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、新規菌株及びそれを含む組成物並びにイネ科植物の細菌性病害の防除剤に関しており、イネ科植物の種子にも関している。

水稲の育苗期に発生する病害として、イネもみ枯細菌病及びイネ苗立枯細菌病などの細菌性の病害が知られている。近年、加温型育苗器の普及や地球温暖化の進展に伴って、そのような細菌性の病害が世界的に増加してきている。特許文献１には、非病原性パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａａｎａｎａｔｉｓ）細菌が、イネもみ枯細菌病などの防除に有用である旨が記載されている。

また、パントエア・ディスペルサ（Ｐａｎｔｏｅａｄｉｓｐｅｒｓａ）について、非特許文献１及び２には、その特定の菌株が、ある種の糸状菌に対して抗真菌活性を有する旨が記載されている。一方、いずれの先行技術文献にも、Ｐ．ディスペルサが、イネ科植物の細菌性病害の防除に有用であるとは記載されていない。

特開２０１５－０５９０９０号公報

Jiang et al. Sci Rep (2019), 9(1), 16354. doi: 10.1038/s41598-019-52804-3 Verma et al. J App Microbiol (2017), 122(6), 1680-1691. doi: 10.1111/jam.13463

持続可能な農業の実現に向けて、薬剤耐性菌の発生が少なく、かつ環境負荷が低い微生物資材の開発が求められているが、微生物資材は適用病害及び作物が限定的であり、生産コストが高いという問題がある。そこで、本発明は、微生物資材のバリエーションを広げるため、イネ科植物の細菌性病害の防除に有用な新規菌株を提供することを目的としている。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｐ．ディスペルサなどの細菌が、イネもみ枯細菌病の病原菌であるバークホルデリア・グルメ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｇｌｕｍａｅ）が産生する毒素（トキソフラビン）に対して耐性を示し、イネの生育抑制に対して改善作用を奏することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に示す菌株及びそれを含む組成物、イネ科植物の細菌性病害の防除剤、並びにイネ科植物の種子を提供するものである。
〔１〕パントエア・ディスペルサ（Ｐａｎｔｏｅａｄｉｓｐｅｒｓａ）ＢＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥＰ－０３３６５）。
〔２〕パントエア・ディスペルサＢＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥＰ－０３３６５）又はその培養上清を含む組成物。
〔３〕バークホルデリア・グルメ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｇｌｕｍａｅ）の増殖を抑制するための、前記〔２〕に記載の組成物。
〔４〕イネ科植物の細菌性病害の防除のための、前記〔２〕又は〔３〕に記載の組成物。
〔５〕トキソフラビン耐性菌又はその培養上清を含む、イネ科植物の細菌性病害の防除剤。
〔６〕前記トキソフラビン耐性菌が、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の細菌及び／又はパエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌を含む、前記〔５〕に記載の防除剤。
〔７〕前記トキソフラビン耐性菌が、パントエア・ディスペルサＢＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥＰ－０３３６５）を含む、前記〔５〕又は〔６〕に記載の防除剤。
〔８〕前記細菌性病害が、イネもみ枯細菌病である、前記〔５〕～〔７〕のいずれか１項に記載の防除剤。
〔９〕トキソフラビン耐性菌を含むイネ科植物の種子。
〔１０〕前記トキソフラビン耐性菌が、パントエア・ディスペルサＢＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥＰ－０３３６５）を含む、前記〔９〕に記載の種子。

本発明に従えば、Ｐ．ディスペルサＢＢ１株などのトキソフラビン耐性菌は、病原性細菌によるイネ科植物の生育抑制に対して改善作用を奏する。したがって、Ｐ．ディスペルサＢＢ１株などのトキソフラビン耐性菌は、イネ科植物の細菌性病害の防除に有用である。

毒素（トキソフラビン）の非存在下又は存在下でのＰ．ディスペルサＢＢ１株の増殖曲線を示す。毒素（トキソフラビン）の非存在下又は存在下でのＰ．ディスペルサＢＢ４４株の増殖曲線を示す。毒素（トキソフラビン）の非存在下又は存在下でのパントエアｓｐ．ＮＣＣＰ－５６８の増殖曲線を示す。毒素（トキソフラビン）の非存在下又は存在下でのパエニバシラス・フナネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｈｕｎａｎｅｎｓｉｓ）の増殖曲線を示す。Ｐ．ディスペルサＢＢ１株の培養上清の有無に応じたＢ．グルメの増殖曲線を示す。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、新規菌株であるＰ．ディスペルサＢＢ１株及びＰ．ディスペルサＢＢ１株又はその培養上清を含む組成物に関している。Ｐ．ディスペルサは、イネ科植物の内部に共生している内生菌の一種である。Ｐ．ディスペルサＢＢ１株は、イネもみ枯細菌病の病原菌であるＢ．グルメが感染したイネから単離され、１６ＳリボソームＲＮＡの解析により同定された新規菌株であり、２０２１年１月１９日より独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている（受託番号：ＮＩＴＥＰ－０３３６５）。Ｐ．ディスペルサＢＢ１株は、イネもみ枯細菌病の病原菌であるＢ．グルメが産生する毒素（トキソフラビン）に対して耐性を示し、イネの生育抑制に対して改善作用を奏する。特定の理論に拘束されるものではないが、トキソフラビンの毒性は、それによって生成される過酸化水素に依拠していると考えられるところ、Ｐ．ディスペルサＢＢ１株は、トキソフラビンによって生成される過酸化水素の影響を低減し、病原性細菌が感染したイネ科植物においても増殖することができるため、当該病原性細菌の増殖を拮抗的に阻害し、イネもみ枯細菌病などの細菌性の病害の防除に有用であると考えられる。

すなわち、本発明のＰ．ディスペルサＢＢ１株及びＰ．ディスペルサＢＢ１株又はその培養上清を含む組成物は、Ｂ．グルメなどの病原性細菌の増殖を抑制するためのもの、又は、イネ科植物の細菌性病害の防除のためのものであり得る。そのため、本発明のＰ．ディスペルサＢＢ１株及びＰ．ディスペルサＢＢ１株又はその培養上清を含む組成物は、イネ科植物などに適用され得る。もともとＰ．ディスペルサはイネ科植物の内生菌であるため、本発明のＰ．ディスペルサＢＢ１株及びＰ．ディスペルサＢＢ１株又はその培養上清を含む組成物については、薬剤耐性菌の発生が少なく、かつ環境負荷が低いことが期待される。前記イネ科植物は、特に制限されないが、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、ヒエ、及び、トウモロコシなどであってもよい。また、前記細菌性病害は、特に制限されないが、例えば、バークホルデリア属の病原性細菌によって引き起こされる細菌性病害であってもよく、イネもみ枯細菌病、イネ苗立枯細菌病、及び、イネ褐条病などであってもよい。なお、「イネもみ枯細菌病」及び「イネ苗立枯細菌病」は、バークホルデリア属の病原性細菌により引き起こされるイネ科植物の細菌性病害であり、前者の病原菌はＢ．グルメや一部のＢ．グラジオリ（ｇｌａｄｉｏｌｉ）であり、後者の病原菌はＢ．プランタリー（ｐｌａｎｔａｒｉｉ）であることが知られている。また、「イネ褐条病」は、シュードモナス・アベナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｖｅｎａｅ）により引き起こされるイネ科植物の細菌性病害であることが知られている。

別の態様では、本発明は、トキソフラビン耐性菌を含む、イネ科植物の細菌性病害の防除剤にも関している。トキソフラビンは、バークホルデリア属の病原性細菌が産生する毒素である。この毒素の存在下では、他の細菌の増殖は著しく制限されるが、前記トキソフラビン耐性菌は、当該毒素によって生成される過酸化水素の影響を低減し、その存在下であっても依然として増殖することが可能である。対象の細菌のトキソフラビン耐性は、当技術分野において通常用いられる方法により適宜確認することができる。例えば、対象の細菌を液体培地で培養し、その濃度をＯＤ６００ｎｍ＝０．１となるように調整し、そこへトキソフラビンを終濃度約１００μＭで添加してさらに培養を続けたときに、ＯＤ６００ｎｍの値の上昇が観察されれば、当該対象の細菌はトキソフラビン耐性菌であることが確認できる。好ましくは、前記トキソフラビン耐性菌は、約１００μＭのトキソフラビン存在下で培養したときに、４８時間以内に増殖を開始できるものであり、さらに好ましくは、２４時間以内に増殖を開始できるものである。特定の理論に拘束されるものではないが、病原性細菌が感染したイネ科植物において前記トキソフラビン耐性菌が増殖すると、当該病原性細菌の増殖が拮抗的に阻害されるため、その病原性細菌が引き起こす細菌性病害の防除が可能となると考えられる。

ある態様では、前記トキソフラビン耐性菌は、イネ科植物の内生菌を含み、より具体的には、Ｐ．ディスペルサなどのパントエア属の細菌、及び／又は、パエニバシラス・フナネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｈｕｎａｎｅｎｓｉｓ）などのパエニバシラス属の細菌を含み、好ましくはＰ．ディスペルサＢＢ１株を含む。前記パントエア属の細菌及び前記パエニバシラス属の細菌は、当技術分野において通常用いられる方法により適宜同定することができる。例えば、対象の細菌の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列を解析し、データベースに対する相同性検索及び系統分類解析を行うことにより、当該対象の細菌の種類を同定することができる。

前記トキソフラビン耐性菌を前記イネ科植物に適用する方法は、特に制限されないが、例えば、前記トキソフラビン耐性菌は、液体培地又は各種水性溶媒に懸濁した状態で、前記イネ科植物の種子（種もみ）又は穂に適用してもよい。前記トキソフラビン耐性菌を種もみに適用する場合には、例えば、当該種もみを、減圧環境下で、約１分～約１０分の間、約１５℃～約３５℃の温度で、前記トキソフラビン耐性菌を含む液体培地又は各種水性溶媒中に浸漬させてもよい。適用時の菌体濃度は特に制限されず、例えば、液体培地又は各種水性溶媒に懸濁したときのＯＤ６００ｎｍの値が、約０．００４以上であってもよく、好ましくは約０．０１～約１．０である。

本発明の組成物又は防除剤は、本発明の目的を損なわない限り、当技術分野で通常使用され得る任意の成分をさらに含んでもよく、イネ科植物の細菌性病害の防除に有効な他の成分をさらに含んでもよい。

また別の態様では、本発明は、トキソフラビン耐性菌を含むイネ科植物の種子にも関している。発芽する前に、イネ科植物の種子を前記トキソフラビン耐性菌で保護することによって、イネ科植物の細菌性病害の発生を予防できることが期待される。前記トキソフラビン耐性菌をイネ科植物の種子に含ませる手段は、特に制限されず、例えば、前記トキソフラビン耐性菌を、液体培地又は各種水性溶媒に懸濁した状態で、前記イネ科植物の未処理の種子に適用し、当該トキソフラビン耐性菌を種子の表面に付着させたり、種子の内部に浸透させたりしてもよい。本発明の種子は、当技術分野で通常採用される方法により発芽させ、栽培することができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

〔試験例１：菌株の単離〕
種もみの表面を殺菌して水に浸し、それを３０℃で３日間生育して発芽させた。そこへ、イネもみ枯細菌病の病原菌であるＢ．グルメを減圧下で植菌した。そして、発芽した種もみを滅菌した土（ボンソル２号、住友化学株式会社製）に植えて、人工気象器で４日間栽培した。

栽培したイネをチューブに採取し、滅菌水１ｍＬを加えてマイクロスマッシュで破砕した。破砕液を適宜希釈し、固体培地に塗布して３日間培養した。固体培地に現れたコロニーをピックアップしてＤＮＡを抽出し、１６ＳリボソームＲＮＡの配列を解析することで、ピックアップした菌種を同定した。そして、イネの内生菌であって、病原菌感染により増加したパントエア・ディスペルサ２種（ＢＢ１株及びＢＢ４４株）、パントエアｓｐ．ＮＣＣＰ－５６８、及び、パエニバシラス・フナネンシスを、以降の実験に使用した。

〔試験例２：トキソフラビンに対する耐性試験〕
単離した各菌株をＯＤ６００ｎｍ＝０．１となるようにＬＢ培地に植菌し、トキソフラビン（終濃度１００μＭ）を添加して、２５℃で４６時間培養した。そして、菌の増殖の程度を調べるために、定期的に６００ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１Ａ～図１Ｄに示す。

Ｐ．ディスペルサＢＢ１株（図１Ａ）、Ｐ．ディスペルサＢＢ４４株（図１Ｂ）、パントエアｓｐ．ＮＣＣＰ－５６８（図１Ｃ）、及び、Ｐ．フナネンシス（図１Ｄ）はいずれも、トキソフラビンの存在下であっても増殖することができた。特に、Ｐ．フナネンシスはトキソフラビンに対する耐性が高かった。Ｂ．グルメは、トキソフラビンを毒素として産生するため、単離した各菌株は、Ｂ．グルメが感染したイネにおいてＢ．グルメと拮抗的に増殖し、Ｂ．グルメの病原性を弱めることができると期待された。

〔試験例３：イネもみ枯細菌病に対する試験〕
日本晴の種もみの表面を次亜塩素酸ナトリウム水溶液で１０分間殺菌し、当該種もみ２５粒に、１０ｍＬのＢ．グルメ培養液（ＯＤ６００ｎｍ＝０．０００４又は０．００４）と、１０ｍＬの供試菌株培養液（ＯＤ６００ｎｍ＝０．０４）とを減圧下で接種した。各細菌を接種した種もみ（各２５粒）をボンソル１号土壌（住友化学株式会社製）に播種し、明期１４時間（２８℃）と暗期１０時間（２４℃）の反復環境下で育成した。播種後１０日目に、葉（地上部）及び根の最も長い部分の長さをそれぞれ計測し、その平均値（ｎ＝２５）を計算した。結果を表１及び表２に示す。

Ｂ．グルメを接種した場合にはイネの生育が抑制され、種もみを播種してから１０日経っても、根も葉もあまり成長しなかったが、上記試験例１で単離した内生菌を一緒に接種した場合には根及び葉の成長が観察された。特に、Ｐ．ディスペルサＢＢ１株を接種した場合には、他の供試菌株と比較して顕著な改善効果が確認された。

〔試験例４：培養上清によるＢ．グルメの増殖抑制作用〕
Ｐ．ディスペルサＢＢ１株を３ｍＬのＬＢ培地により３０℃で一晩培養した。培養液を遠心分離し、その上清をフィルターろ過に供して生菌を取り除き、Ｐ．ディスペルサＢＢ１株の培養上清を取得した。そして、ＬＢ培地でＯＤ６００ｎｍ＝０．１となるように調整したＢ．グルメの菌液１００μＬに、ＬＢ培地（ＬＢ）、蒸留水（ＤＷ）、又は蒸留水で５０％に希釈したＰ．ディスペルサＢＢ１株の培養上清（ＢＢ１Ｓｕｐ５０％）を１００μＬ加えて、経時的にＯＤ６００ｎｍを測定した。

図２に示されているように、Ｐ．ディスペルサＢＢ１株の培養上清はＢ．グルメの増殖を阻害した。したがって、Ｐ．ディスペルサＢＢ１株の培養上清には、Ｂ．グルメに対する抗菌成分が含まれていると考えられる。

以上より、Ｐ．ディスペルサＢＢ１株などのトキソフラビン耐性菌又はその培養上清は、病原性細菌によるイネ科植物の生育抑制に対して改善作用を奏することが期待される。したがって、Ｐ．ディスペルサＢＢ１株などのトキソフラビン耐性菌又はその培養上清は、イネ科植物の細菌性病害の防除に有用である。

Claims

パントエア・ディスペルサ（Ｐａｎｔｏｅａｄｉｓｐｅｒｓａ）ＢＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥＰ－０３３６５）。
パントエア・ディスペルサＢＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥＰ－０３３６５）又はその培養上清を含む組成物。
バークホルデリア・グルメ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｇｌｕｍａｅ）の増殖を抑制するための、請求項２に記載の組成物。
イネ科植物の細菌性病害の防除のための、請求項２又は３に記載の組成物。
トキソフラビン耐性菌又はその培養上清を含む、イネ科植物の細菌性病害の防除剤。
前記トキソフラビン耐性菌が、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の細菌及び／又はパエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌を含む、請求項５に記載の防除剤。
前記トキソフラビン耐性菌が、パントエア・ディスペルサＢＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥＰ－０３３６５）を含む、請求項５又は６に記載の防除剤。
前記細菌性病害が、イネもみ枯細菌病である、請求項５～７のいずれか１項に記載の防除剤。
トキソフラビン耐性菌を含むイネ科植物の種子。
前記トキソフラビン耐性菌が、パントエア・ディスペルサＢＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥＰ－０３３６５）を含む、請求項９に記載の種子。