JP2022139042A - ホスファチジルグリセロールの定量方法および定量用キット - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ＰＧに特異的な定量方法および定量用キットを提供することを課題とする。【解決手段】本発明者は、ＰＧ特異的なホスホリパーゼＣを用いてＰＧを特異的に定量することを着想した。１つの局面において本発明は、試料中のＰＧを定量する方法を提供する。本発明のＰＧ定量方法の利点は、従来の定量方法（薄層クロマトグラフィー、質量分析など）と比較して簡便で、コストも安く、かつ血液などの種々の成分が混合した生物試料を利用できる点にある。【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り （刊行物等１）日本農芸化学会東北支部第１１５回大会要旨集オンライン公開（公開日：令和２年１１月７日） （刊行物等２）日本農芸化学会東北支部第１１５回大会発表（公開日：令和２年１１月７日） （刊行物等３）２０２０年度第２回脂質駆動学術産業創生研究部会講演会要旨集オンライン公開（公開日：令和３年１月２０日） （刊行物等４）２０２０年度第２回脂質駆動学術産業創生研究部会講演会発表（公開日：令和３年１月２７日） （刊行物等５）日本農芸化学会２０２１年度大会要旨集公開（公開日：令和３年３月５日）

本発明は、ホスファチジルグリセロールの定量方法および定量用キットに関する。

ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）は肺胞を構成する肺サーフェクタントの重要な成分であり、肺サーフェクタントの欠如は、特に新生児において呼吸窮迫症候群を引き起こすことが知られている。また近年、ミトコンドリアの機能低下が老化や疾患に関与し、ミトコンドリア内膜に局在するＰＧなどのリン脂質がその機能に深く関係することが報告されている。そのため、簡便なＰＧの定量方法が開発が必要とされている。

今日まで、ＰＧの定量は、主に薄層クロマトグラフィ―／リン定量法により行われてきた。この定量法は検出感度および検出精度が低く、時間および熟練の技術を必要とした。高速液体クロマトグラフィーを用いた定量ではアシル基の種類が定量結果に影響するため、定量性は低かった。質量分析ではアシル基の種類を区別してＰＧが検出されるため、ＰＧの総量としての測定は困難であり、種々のアシル基を含有し得る細胞内や各種サンプル中のＰＧの測定において不利となった。

ここで、リン脂質を定量する簡便な方法としては、リン脂質を基質とする酵素を用いた酵素法も用いられてきた。しかしながら、同じくリン脂質であるカルジオリピン（ＣＬ）についての酵素に依る定量方法は知られているものの（国際公開第２０１５／１５１８０１号）、ＰＧを特異的に定量する方法についての報告は本発明者が知る限りなかった。

国際公開第２０１５／１５１８０１号

本発明は、ＰＧに特異的な定量方法および定量用キットを提供することを課題とする。

本発明者は、ＰＧ特異的なホスホリパーゼＣを用いてＰＧを特異的に定量することを着想した。

代表的な実施形態としては：
（１）（ａ）試料に、ＰＧ特異的なホスホリパーゼＣを反応させ、ＰＧをグリセロールリン酸とジアシルグリセロールに分解する工程
（ｂ）生じたグリセロールリン酸にグリセロールリン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）を反応させ、過酸化水素を発生させる工程
（２）生じた過酸化水素とペルオキシダー（ＰＯＤ）によりに色素を酸化し、色素の蛍光、吸光、または発光の強度を測定することでＰＧを定量する工程
を含む方法が挙げられる。

本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
以下の工程を有する、試料中のホスファチジルグリセロールの定量方法：
（１）（ａ）試料に、ホスファチジルグリセロール特異的なホスホリパーゼＣを反応させる工程、および
（２）反応により生じた化合物の量を測定する工程。
（項目２）
工程（１）において、（ｂ１）グリセロールリン酸オキシダーゼを反応させる工程、（ｂ２）グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼを反応させる工程、または（ｂ３）アルカリフォスファターゼを反応させる工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
工程（２）における測定が、前記化合物に起因する蛍光、吸光、または発光の強度を測定することによる、項目１～２のいずれかに記載の方法。
（項目４）
生体試料中のホスファチジルグリセロールの量を被験体における疾患の状態の指標として用いる方法であって、
（ａ）ホスファチジルグリセロール特異的なホスホリパーゼＣを用いて前記被験体由来の生体試料におけるホスファチジルグリセロールを定量する工程と、
（ｂ）前記ホスファチジルグリセロールの量を参照値と比較する工程
とを含み、前記参照値と比較した前記ホスファチジルグリセロールの量の差異が、前記疾患の状態の指標となる方法。
（項目５）
前記疾患が自己免疫性疾患、および呼吸窮迫症候群からなる群から選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記生体試料が前記被験体の血液、尿、羊水、細胞、または細胞破砕物、あるいは各種生物由来サンプルである、項目４または５に記載の方法。
（項目７）
前記ホスファチジルグリセロール特異的なホスホリパーゼＣが、ホスファチジルグリセロールに対する基質特異性を有し、カルジオリピンと実質的に反応しない、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
定量されるホスファチジルグリセロールが、種々のアシル基を有するホスファチジルグリセロールの総量である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
ホスファチジルグリセロール特異的なホスホリパーゼＣを含む、ホスファチジルグリセロールの定量用キット。

本発明の代表的な実施形態についての模式図。

図２は、培地の種類とＰＧ－ＰＬＣの活性の関係を示す。ＩＳＰ２培地を用いて培養した場合のＰＧ－ＰＬＣ活性を１００％として正規化した。

図３は、精製ＰＧ－ＰＬＣのＳＤＳ－ＰＡＧＥ（分離ゲル濃度１２％）分析結果を示す。レーンＭ：マーカー、レーン１：精製ＰＧ－ＰＬＣ（０．０３ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ、０．３μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ）。

図４－１は、ＰＬＣ活性に対するｐＨの影響を示す。ＰＯＰＧを基質として用い、酵素活性は０．１６Ｍの各種バッファー中、３７℃で測定した。用いたバッファーはＡｃ－Ｎａ（〇）、ＢｉｓＴｒｉｓ－ＨＣｌ（△）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ（●）、またはＴｒｉｓ－ＨＣｌ（□）である。

図４－２は、ＰＬＣ活性に対する温度の影響を示す。ＰＯＰＧを基質として用い、酵素活性は各温度で０．１６Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中で測定した。

図５－１は、ＰＬＣのｐＨ安定性を示す。精製酵素サンプルを５０ｍＭの各バッファー中、４℃で４時間インキュベートした。残存活性を、ＰＯＰＧを基質として用い、５５℃で０．１６Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中で測定した。インキュベーションに用いたバッファーはＡｃ－Ｎａ（□）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ（△）、またはＴｒｉｓ－ＨＣｌ（〇）である。

図５－２は、ＰＬＣの温度安定性を示す。精製酵素サンプルを各温度で５０ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中で３０分間インキュベートした。残存活性を、ＰＯＰＧを基質として用い、５５℃で０．１６Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中で測定した。

図６－１は、ＰＯＰＧを基質として用いた際のＰＧ－ＰＬＣ活性に対する金属イオンの影響を示す。酵素活性は５５℃、０．１４Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中で測定した。

図６－２は、ＰＯＰＧを基質として用いた際のＰＧ－ＰＬＣ活性に対する界面活性剤の影響を示す。酵素活性は５５℃、０．１４Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中で測定した。

図７は、精製酵素サンプルの基質特異性を示す。酵素（ＰＬＣ）活性は５５℃、０．１６Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中で測定した。

図８は、ＬＣ－ＭＳ解析により得られたペプチドの配列、およびこれらのペプチド配列と合致するデータベースから得られたタンパク質配列を示す。

図９は、ＤＮＡシークエンシングにより得られたＰＧ－ＰＬＣ遺伝子のタンパク質配列を示す。

図１０－１は、２０℃培養の培養上清を用いた酵素反応（基質ＰＯＰＧ、反応温度４５℃、緩衝液：０．１６Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）。横軸は酵素反応時間、縦軸はＧ３Ｐ生成量を示す。

図１０－２は、３０℃培養の粗タンパク質液（ＣＦＥ）を用いた酵素反応（基質ＰＯＰＧ、反応温度４５℃、緩衝液：０．１６Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）。横軸は酵素反応時間、縦軸はＧ３Ｐ生成量を示す。

ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌを利用したＰＧ－ＰＬＣの予測立体構造に基づく、基質結合に関与すると推定されたアミノ酸残基を示す。当該アミノ酸残基を枠で囲っている。

［用語の定義］
本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

本明細書において「約」は、特に別の定義が示されない限り、示された値±１０％を指す。

本明細書において「リン脂質」は、リン酸エステルおよびホスホン酸エステルを有する脂質の総称である。脂質二重膜から成る細胞膜の主成分であり、グリセロールを骨格とするグリセロリン脂質はその１種である。
グリセロリン脂質：

グリセロリン脂質では、グリセロールのｓｎ－１位とｓｎ－２位とに脂肪酸が、ｓｎ－３位にリン酸が結合している。このリン酸に結合するリン脂質親水部分（上記の構造式中のＸ）により、グリセロリン脂質はさらに分類される。最も単純にリン脂質親水部分が水素であればホスファチジン酸（ＰＡ）、コリンであればホスファチジルコリン（ＰＣ）、エタノールアミンであればホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、セリンであればホスファチジルセリン（ＰＳ）、イノシトールであればホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、グリセロールであればホスファチジルグリセロール（ＰＧ）と称される。したがって、本明細書において「ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）」とは、グリセロールのｓｎ－１位とｓｎ－２位とに脂肪酸がエステル結合し、ｓｎ－３位にリン酸がエステル結合し、さらにリン酸にグリセロールが結合したリン脂質を指す。
ホスファチジルグリセロール：

また、特殊な構造を有するリン脂質として「カルジオリピン」（別名ジホスファチジルグリセロール；ＣＬ）が知られている。これは２つのＰＡがグリセロールで連結しており、四本のアシル鎖に由来する疎水性と２つのリン酸の負電荷を帯びた極性を示す構造を有するリン脂質であり、ＰＧのｐＫａが約３であることからＣＬも同様にｐＨ３以上では５０％以上が負電荷を帯びていると考えられている。

本発明のＰＧに含まれる２本のアシル基は、同一のアシル基であってもよく、異なるアシル基であってもよい。また、飽和していても不飽和であってもよい。１つの実施形態において、本発明のＰＧに含まれるアシル基は、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、またはリグノセリン酸などの飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ゴンド酸、エルカ酸、またはネルボン酸などの１価不飽和脂肪酸、リノール酸、γ－リノレン酸、ジホモ－γ－リノレン酸、アラキドン酸、またはドコサペンタエン酸などのｎ－６（ω６）系列の多価不飽和脂肪酸、あるいはα－リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸などのｎ－３（ω３）系列の多価不飽和脂肪酸に由来してもよいが、これらに限定されない（木原章雄，「脂肪酸の多彩な代謝，生理機能と関連疾患」，生化学，８２（７），５９１－６０５，（２０１０））。一般にホスホリパーゼは、リン脂質に含まれるアシル基が上記のいずれであっても加水分解能を有し得る。

本明細書において「ホスホリパーゼ」は、グリセロリン脂質を加水分解する酵素を指す。ホスホリパーゼはグリセロリン脂質を加水分解する部位により分類され、ホスホリパーゼＡ１はグリセロールのｓｎ－１位のエステル結合を分解し、ホスホリパーゼＡ２はグリセロールのｓｎ－２位のエステル結合を分解し、ホスホリパーゼＢはグリセリンのｓｎ－１位およびｓｎ－２位の両方のエステル結合を分解し、いずれも脂肪酸を遊離する。ホスホリパーゼＣは、グリセロールとＸを結ぶホスホジエステル結合のグリセロール骨格側のエステル結合を分解し、ホスホリパーゼＤはホスホジエステル結合のグリセロール骨格とは反対側のエステル結合を分解する。したがって、本明細書において「ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）」は、グリセロリン脂質を加水分解するホスホリパーゼのなかでも、グリセロール骨格に結合したホスホジエステル結合のグリセロール骨格側のエステル結合を分解し、リン酸が結合したリン脂質親水部分（リン酸エステル化合物）、およびジアシルグリセロールを産出する酵素を指す。
ＰＬＣによる加水分解様式：

本明細書において「グリセロールリン酸」は、グリセロールの３つのヒドロキシ基のいずれかがリン酸基に置換された分子を指し、代表的なものとして「ｓｎ－グリセロール－１－リン酸（Ｇ１Ｐ）」および「ｓｎ－グリセロール－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）」の鏡像異性体が挙げられる。
ｓｎ－グリセロール－１－リン酸：

ｓｎ－グリセロール－３－リン酸：

本明細書において「ジアシルグリセロール」（ＤＧ）は、ジグリセリドとも称される、グリセロールの脂肪酸エステルのうちアシル基２個が結合しているものを指す。中でも、以下の化学式で表される１，２－ジアシルグリセロールはリン脂質またはトリグリセリドの生合成の中間体として重要であることが知られている。
ジアシルグリセロール：

（式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ任意のアシル基である）

上記の用語の定義で記載したように、ＰＬＣは、グリセロール骨格に結合したホスホジエステル結合のグリセロール骨格側のエステル結合を分解し、リン酸が結合したリン脂質親水部分、およびＤＧを産出する。ＰＧをＰＬＣで加水分解すると、以下の反応式のように、ＤＧとグリセロールリン酸とが生じる。

（式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ任意のアシル基である）

一般に酵素は、化学反応を触媒し、その反応の種類に対する特異性と基質に対する特異性とを有する。本明細書において酵素が「基質特異的」であるとは、その酵素が特定の化学物質に対して選択的に化学反応を触媒すること、つまり酵素が特定の化学物質以外の化学物質に対して化学反応を触媒しないか、触媒の程度が十分に弱いことを意味する。本明細書において、ある酵素またはポリペプチドが「ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的」、「ホスファチジルグリセロール特異的」または「ＰＧ特異的」であるとは、例えば、その酵素またはポリペプチドのｐＨ６．０、５５℃、５分間の条件におけるＰＧの加水分解能を１００％とした場合に、ＰＧ以外の基質に対する加水分解能が高くとも約３０％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、または約０％であることにより定められてよい。ここで、ＰＧ以外の基質はリン脂質であり、例えば、ＰＡ、ＰＥ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＳ、およびＰＩからなる群から選択されてよく、好ましくはＣＬである。さらに好ましい実施形態において、他の基質は、ＰＡ、ＰＥ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＳ、およびＰＩを含んでよい。

本明細書においてアミノ酸配列の「同一性」とは、複数のアミノ酸配列を比較したときに、アミノ酸が同一である残基の割合を指す。なお、アミノ酸配列の相同性においては、複数のアミノ酸配列を比較したときに、アミノ酸が同一であるか、またはアミノ酸が同一ではないが同じ性質を持つアミノ酸である場合には相同として扱い、相同な残基の割合を指す。

本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、ゲノムあるいはその消化物、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０Ｍ ＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ストリンジェントな条件は、通常、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より約５℃～約３０℃、好ましくは約１０℃～約２５℃低い温度であって、特異的なハイブリッドが形成される条件であり、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている条件が挙げられる。また、例えば、９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件であってもよい。具体的には、例えば、完全ハイブリッドのＴｍ～（Ｔｍ－３０）℃、好ましくはＴｍ～（Ｔｍ－２０）℃の温度範囲で、かつ１×ＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、好ましくは０．１×ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリダイズを行う条件が挙げられる。

［実施形態］
ＰＧの定量方法
１つの局面において本発明は、試料中のＰＧを定量する方法を提供する。本発明のＰＧ定量方法の利点は、従来の定量方法（薄層クロマトグラフィー、質量分析など）と比較して簡便で、コストも安く、かつ血液などの種々の成分が混合した生物試料を利用できる点にある。

１つの実施形態において、本発明の方法は、（１）（ａ）試料に、ＰＧ特異的なＰＬＣを反応させる工程を包含する。ＰＧ特異的なＰＬＣは、ＰＧ以外のリン脂質（ＣＬなど）を基質としないため、ＰＧ量に比例してグリセロールリン酸が生じる。ＰＧ特異的なＰＬＣとしては、その基質特異性と酵素活性があればいかなるものでもよい。１つの実施形態において、ＰＧ特異的なＰＬＣは合成ポリペプチドであってもよく、動植物・微生物に由来してもよい。好ましくは微生物に由来するＰＬＣであり、特に好ましくは、放線菌由来のＰＬＣが好ましい。生物由来のＰＬＣに対してアミノ酸の欠失・置換・付加を施した人為的なＰＬＣであってもよい。

１つの実施形態において、本発明の方法で用いるＰＧ特異的なＰＬＣは、そのポリペプチドをコードするベクターを形質導入された宿主生物（大腸菌など）により発現され、その後、回収・精製されたタンパク質であってよい。タグなどを含む特定のポリペプチドを発現するベクターの作成方法、ベクターの導入法（電気穿孔法、ウイルスによる遺伝子導入法、リポフェクション法など）、発現されたタンパク質の回収・精製方法（アフィニティークロマトグラフィー法など）は本分野で公知である。そのポリペプチドを本来有していた特定の菌ではなく、大腸菌のような扱いの確立された系を用いて大量に発現・精製されたポリペプチドを利用することで、コスト削減だけでなく、ポリペプチドの品質が一定になり定量が安定したものになる。また、無細胞タンパク質合成を用いて同様に生産しても良い．

特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＰＧ特異的なＰＬＣとして放線菌由来の配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドにコードされた、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドがある（特願２０２０－１４９２３７）。このポリペプチドは、ＰＧの加水分解能を１００％とした時にＰＥ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＳ、およびＰＩに対する加水分解能がいずれも５％以下という、ＰＧに対する高い基質特異性を有する。

したがって、１つの実施形態において、本発明の方法で用いるＰＧ特異的なＰＬＣは、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、または（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付与されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよく、アミノ酸を欠失、置換または付与する方法は当業者に公知である。１つの実施形態において、ＰＧ特異的なＰＬＣが含み得る欠失、置換または付与されたアミノ酸の数は、機能が大きく変化しなければ（実質的に同等の機能であれば）、つまり基質特異性が、例えばｐＨ６．０、５５℃、５分間の条件におけるＰＧの加水分解能を１００％とした場合に、この条件における他の基質（ＰＡ、ＰＥ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＳ、およびＰＩのうちの１または複数）に対する加水分解能が高くとも３０％以下であれば、１００個以上であってよく、１５０個以下、１４０個以下、１３０個以下、１２０個以下、１１０個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下であってもよく、好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個である。また、アミノ酸の変異は人為的な変異であってもよく、自然界で発生した変異であってもよい。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。同一性は、本発明において意図される基質特異性を有する限りにおいて、少なくとも約８０％であってよく、好ましくは少なくとも約９０％であってよく、さらに好ましくは、少なくとも約９５％であってよい。

特定の酵素を基にして同一の機能を有する新たな酵素を作成する方法は本分野において公知であり、例えば、完全コンセンサス法および祖先型配列法が知られている。完全コンセンサス法では、機能の近いタンパク質の配列を複数比較し、共通するアミノ酸残基は優れた生物活性を与えるという仮定の下に新たなポリペプチド配列を作製する。また、祖先型配列法は、配列の複数比較と生物の系統に関する情報とを組み合わせ、これらの生物に共通する祖先が有していたであろう配列を予想するものであり、高温高圧な過酷な環境に生きていた生物の祖先の有するタンパク質は優れた安定性を有していたであろうという仮定に基づく。本分野においては、短鎖型Ｌ－スレオニン脱水素酵素（約３５０アミノ酸長）に対して１００個以上のアミノ酸変異を加えても基質特異性および比活性は維持されたことが報告されている（Ｎａｋａｎｏ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＮＡＤ＋－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８，３７２－３７３２）。この文献では、Ｘ線構造解析などの複雑な実験手法に依らず、ＢＬＡＳＴ検索によりインターネットから得られた機能の近いタンパク質の配列を基に、完全コンセンサス設計法または祖先型設計法を適用し、優れた生物活性を有するであろうセリンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）の配列を予想した。そしてこの予想に基づいて、野生型と比べて最大で１１２／３１８アミノ酸の置換を有する酵素（相同性６５％）を実際に作製したところ、基質特異性および反応速度が維持されたことが記載されている。

さらに、中野ら（２０１９年）”Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｔｒａｃｋ ｏｆ ａ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌ－Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｏｘｉｄａｓｅ ｂｙ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｃｅｓｔｒａｌ ａｎｄ Ｎａｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ．”では、Ｌ－アルギニンオキシダーゼ（ＡＲＯＤ）に祖先型設計法を適用し、生物活性を有するであろう配列として野生型と比較して７３％または７８％の相同性を有する配列を予測し、実際にこの配列を有する酵素が基質特異性および酵素活性を維持したことが報告されている。中野ら（２０１９年）”Ｄｅｒａｃｅｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｅｒｅｏｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｏ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｄ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｃｅｓｔｒａｌ Ｌ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｏｘｉｄａｓｅ．”では、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＬＡＡＯ）に祖先型設計法を適用して生物特性を有する配列を予想し、実際にこの配列を有する酵素が基質特異性を維持したことが記載されている。齋藤ら（２０１８年）”Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＮＴ１株由来Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼのフルコンセンサス設計による耐熱性の向上”では、放線菌のＬ－グルタミン酸オキシダーゼにフルコンセンサス法を適用し、６９０アミノ酸の内の１０４か所（相同性８５％）を有する配列が生物活性を有することを予測し、実際にこれが高い酵素活性と基質特異性を維持したことを報告している。城戸ら（２０２０年）”ＡｉｒＩＤ， ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ， ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”では、ビオチンリガーゼに対して祖先型設計法を適用して、野生型と比較して８２％の相同性を有する配列を生物活性を有するものと予想し、これが基質特異性および酵素活性を維持したことを報告している。

まとめると、これらの先行技術文献では、配列データベースから入手した種々のポリペプチドの配列情報に基づき、目的の生物活性を有し基質特異性および酵素活性を維持した酵素を設計することに成功している。特に中野ら（２０１８年）では、配列情報に基づいた設計に加え、立体構造解析による情報も組み合わせてから実際に酵素を作成し、『これら両方の方法は、タンパク質の配列情報さえあればよいため、利用しやすく汎用性に優れる』と述べ、完全コンセンサス法および祖先型配列法という配列情報に基づいた方法が当業者にとって簡便であることも記載している。さらにこれらの先行技術文献では、計５種の酵素について配列情報と立体構造との組み合わせにより酵素の設計を行い、５種のすべてにおいて基質特異性を維持した酵素が得られたことを報告している。そのため、当業者であれば、これら５種以外の酵素でもこの方法が有効であることを容易に理解できる。したがって、当業者であれば、目的の酵素活性・基質特異性を有するポリペプチドを基にして、立体構造モデルと配列情報とを利用して、基になったポリペプチドからは低い同一性を有するにもかかわらず同一の生物活性を有するポリペプチドを予想し、過度な労力なく、これを実際に作製することが可能であることが理解されよう。

さらに、配列番号２のポリペプチドに関しては、複数の金属イオン要求性ホスホエステラーゼをモデルとした立体構造モデルの解析により基質結合部位および活性中心アミノ酸残基が推測されており（特願２０２０－１４９２３７）、当業者であれば、これらの情報を基にして同一の酵素活性を有する同一性の低いポリペプチドを作成できる。本発明において使用するＰＧ特異的なＰＬＣの基質結合部位は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の、５６Ｌ，５９ＦＶＧ６１，２０４ＩＰＧＩ２０７，２０９ＡＷ２１０，および３１６ＧＧＦＡ３２０に相当するアミノ酸を含んでもよく、または、これらのアミノ酸から選択されてもよい。これらのアミノ酸残基は疎水性であることから、ＰＧのアシル基に相互作用すると考えられる。１つの実施形態において、ＰＧ特異的なＰＬＣは基質と相互作用する触媒残基を有する。触媒残基は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＨ４３、およびＨ４０９に相当するアミノ酸を含んでもよく、または、これらのアミノ酸から選択されてもよい。１つの実施形態において、基質と相互作用する活性中心アミノ酸残基を有する。活性中心アミノ酸残基は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｄ４１、Ｄ１０３、Ｎ１９１、Ｈ３６４、およびＨ４０７に相当するアミノ酸残基を含んでもよく、またはこれらのアミノ酸から選択されてもよく、触媒残基を含んでもよい。基質結合部位は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の、４０Ｔ～７５Ｔ、１００Ｔ～１２０Ｌ、１８４Ｐ～１９７Ｖ、２０５Ｐ～２２７Ｋ、２６６Ｆ、２７１Ｌ、２９６Ｙ～２９７Ｙ、３１０Ｌ～３２２Ｓ、３６３Ｓ～３６６Ｔ、３７８Ｒ～３８４Ｒ、４０６Ｇ～４０９Ｈ、および４３２Ｓ～４３５Ｄに相当するアミノ酸を含んでもよく、または、これらのアミノ酸から選択されてもよい。１つの実施形態において、本発明において使用するＰＧ特異的なＰＬＣは、１つまたは複数の原核生物由来亜鉛依存性ホスホリパーゼＣシグネチャー（Ｈ－Ｙ－ｘ－［ＧＴ］－Ｄ－［ＬＩＶＭＡＦ］－［ＤＮＳＨ］－ｘ－Ｐ－ｘ－Ｈ－［ＰＡ］－ｘ－Ｎ；Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｍｏ２６４２ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ（２０１１））を有してもよい。

ここで、本願明細書において、「あるアミノ酸残基に相当するアミノ酸」とは、あるポリペプチドＡと別のポリペプチドＢとを比較する際にポリペプチドＡにおいてあるアミノ酸残基Ａ’が基質との相互作用において重要な残基であった場合に、ポリペプチドＢにおいてアミノ酸残基Ａ’と同様の基質と相互作用するアミノ酸残基Ｂ’を意味する。そのため、例えば、ポリペプチドＡがシグナル配列を含むがポリペプチドＢが含まなかったために、ポリペプチドＡにおけるアミノ酸残基Ａ’の一次構造的位置（つまりＮ末端から数えたときのアミノ酸残基番号）と、これに相当するポリペプチドＢにおけるアミノ酸残基Ｂ’の位置とが異なる場合であっても、基質との相互作用における役割が同様であれば、アミノ酸残基Ｂ’はアミノ酸残基Ａ’に相当するアミノ酸であると言える。

特定の理論に束縛されることを望むものではないが、配列番号２の一部のアミノ酸配列（配列番号５）については、種々の放線菌の有するタンパク質間で保存されていると判明しており、基質結合部位、活性中心アミノ酸残基、および触媒残基は、この保存された配列に含まれる。そのため、例えば、ある特定のポリペプチドの基質結合部位に属する残基Ａ’について、このアミノ酸残基が保存され、他の放線菌のポリペプチドにおいて、一次構造的位置が異なるが基質結合における役割が同様であるアミノ酸残基Ｂ’が存在することが容易に推測される。つまり、当業者は当該タンパク質の一次構造（アミノ酸配列）から容易に立体構造を予測でき、かなりの精度で構成アミノ酸の空間的位置を予測可能であるため、３次元構造上類似位置に配置されるアミノ酸残基をある程度特定できる。したがって、基質結合部位、活性中心残基、および触媒中心を含む保存された配列に含まれるアミノ酸残基について、原核生物間では、あるいは少なくとも放線菌間では、相当あるいは類似するアミノ酸残基が存在し、配列比較によりこれを見出すことができる。さらには全生物間においても、基質結合部位、活性中心残基、および触媒中心を含むアミノ酸残基が種の近縁性に応じて保存され、あるアミノ酸残基に相当あるいは類似するアミノ酸を見出すことが可能であろう。これはタンパク質の進化の観点からも当然の現象として広く認知され、普遍性があるとも言える．

以上の先行技術から、当業者であれば、配列番号２のポリペプチドを基にして、少なくとも約８０％の配列の同一性を有する、ＰＧ定量に十分使用できる酵素活性・基質特異性を有するポリペプチドを容易に作成することができることに留意されたい。

さらに当業者であれば、配列番号１のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドと同一の酵素活性・基質特異性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドも作成できる。１つの実施形態において、本発明において使用するＰＧ特異的な酵素は、（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１個以上の塩基が欠失、置換または付与された塩基配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と同義なコドンを含む塩基配列を含むポリヌクレオチド、（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも約８０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、およびの（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と相同的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、によりコードされてもよい。ストリンジェントな条件は本明細書で定義されている。１つの実施形態において、ＰＧ特異的ＰＬＣは（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１個以上の塩基が欠失、置換または付与された塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされてよく、塩基を欠失、置換または付与する方法は当業者に公知である。１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドが含み得る欠失、置換または付与された塩基の数は、発現されるポリペプチドの機能が大きく変化しなければ（実質的に同等の機能であれば）、つまり基質特異性が、例えばｐＨ６．０、５５℃、５分間の条件におけるＰＧの加水分解能を１００％とした場合に、この条件における他の基質（ＰＡ、ＰＥ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＳ、およびＰＩのうちの１または複数）に対する加水分解能が高くとも３０％以下であれば、３００個以上であってよく、３５０個以下、３４０個以下、３３０個以下、３２０個以下、３１０個以下、３００個以下、２９０個以下、２８０個以下、２７０個以下、２６０個以下、２５０個以下、２４０個以下、２３０個以下、２２０個以下、２１０個以下、２００個以下、１９０個以下、１８０個以下、１７０個以下、１６０個以下、１５０個以下、１４０個以下、１３０個以下、１２０個以下、１１０個以下であってよく、好ましくは１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下であってよく、さらに好ましくは１０個以下である。また、塩基の変異は、人為的な変異であってもよく、自然界で発生した変異であってもよい。同一性は、コードされるポリペプチドが本発明において意図される基質特異性を有する限りにおいて、少なくとも約８０％であってよく、好ましくは少なくとも約９０％であってよく、さらに好ましくは、少なくとも約９５％、であってよい。

代表的な実施形態において、ＰＧ特異的なＰＬＣは、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上５０個以下のアミノ酸が欠失、置換または付与されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、または（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。代表的な実施形態において、ＰＧ特異的なＰＬＣは、（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１個以上１５０個以下の塩基が欠失、置換または付与された塩基配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と同義なコドンを含む塩基配列を含むポリヌクレオチド、（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされてよい。

１つの実施形態において、工程（１）（ａ）で生じたグリセロールリン酸にさらなる酵素を反応させてもよい。これにより、グリセロールリン酸から定量方法が広く知られた化合物（過酸化水素およびＮＡＤＨなど）を得ることができる。さらなる酵素反応工程としては、（ｂ１）グリセロールリン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）を反応させる工程、（ｂ２）グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＨ）を反応させる工程、および（ｂ３）アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）を反応させる工程が挙げられる。

グリセロールリン酸オキシダーゼは、グリセロールリン酸を酸化して過酸化水素とジヒドロキシアセトンリン酸を生じさせる酵素である。

グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼは、グリセロールリン酸を脱水素化してＮＡＤ^＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）をＮＡＤＨに還元する酵素である。

アルカリフォスファターゼは、グリセロールリン酸のリン酸エステル結合を切断してグリセロールとリン酸とに分解する化合物である。１つの実施形態において、この工程により生じたグリセロールにグリセロールオキシダーゼを作用させて過酸化水素を得てもよく、グリセロールデヒドロゲナーゼを反応させてＮＡＤ^＋からＮＡＤＨを得てもよい。

１つの実施形態において、本発明の定量方法は（２）反応により生じた化合物の量を測定する工程を包含する。反応化合物の定量は本分野において公知のいかなる方法を用いてもよく、過酸化水素を色素と反応させて得られる蛍光、吸光、または発光の強度を測定する方法が知られている。なお、反応によりＮＡＤＨが得られていた場合には、ＮＡＤＨにＮＡＤＨオキシダーゼを反応させることで過酸化水素が得られる。過酸化水素を定量するための代表的なものとしては、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により試薬を酸化して試薬の色変化や呈色の程度を測定するものであり、トリンダー試薬と称されるフェノール系化合物と４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）を縮合させてキノイミン色素を生成させる方法、ＡＤＨＰ（１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン）などの化合物に過酸化水素を反応させて蛍光化合物を生成させてその蛍光強度を測定する方法、酵素反応により遊離した無機リン酸を呈色するモリブデンブルー法、およびマラカイトグリーン法などが知られている。ＮＡＤＨを定量するための代表的なものとしては、これらの反応では、ＰＧ１分子からグリセロールリン酸１分子が生じ、過酸化水素１分子が生じ、色素１分子が生じるため、ＰＧ量の既知な試料を用いて検量線を作成して試料由来の蛍光などを比較することでＰＧ量を定量できる。

１つの実施例において、各工程は同時に施してもよく、逐次的に施してもよい。１つの実施形態において、工程（１）の前に試料を前処理する工程を包含してもよく、前処理としては、試料中に存在するグリセロールリン酸（ＧＰ）、過酸化水素、またはＮＡＤＨを除去する工程、例えば先述のＧＰＯを用いて内在性（既にサンプル中に含まれていた持込分）のＧＰを酸化して除去（本反応に影響しないように）するなど、酵素反応に適した濃度まで希釈・濃縮する工程、加熱殺菌する工程、リン脂質を抽出する工程などが挙げられる。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、試料が生物由来である場合には、生物が本来持つ定量に影響し得る分子を除去するためにリン脂質を抽出することが考えられる。生物試料から脂質のみを抽出する方法は本分野において公知であり、Ｂｌｉｇｈ－Ｄｙｅｒ法およびＦｏｌｃｈ法などが知られている。

本発明における試料としては、ＰＧの定量の必要があれば生物由来であってもそうでなくてもよく、細胞、細胞の培養液、細胞の懸濁液、細胞破砕物など、ヒトなどの動物の組織に由来する液体（血液、尿、羊水、髄液、唾液など）、植物に由来する液体、動植物由来の加工物、細菌由来の加工物、サプリメント、食品、医薬組成物などが挙げられる。特に生物由来の試料の場合、種々のアシル基を有する複数種のＰＧが含まれる。本発明の定量方法ではこれらの総量を定量できるため、ＰＧの総量を知りたい場合には有効である。

各酵素反応の反応条件は、使用する酵素の特性に合わせて適宜設定してよい。至適ｐＨの一例としてはｐＨ約４～約１０であり、ｐＨ約５．５～約６．５の範囲である。１つの実施形態において、至適ｐＨの下限はｐＨ約４であり、好ましくはｐＨ約５であり、さらに好ましくはｐＨ約５．５である。上限は、ｐＨ約１０であり、好ましくはｐＨ約８．５であり、さらに好ましくはｐＨ約６．５である。至適温度の一例としては３７℃付近、または細菌由来の酵素であれば５０℃以上である。１つの実施形態において至適温度は約５３～約５７℃である。１つの実施形態において、至適温度の下限は、約３０℃であり、好ましくは約３７℃であり、特に好ましくは約５０℃である。上限は、約７０℃であり、好ましくは約６５℃であり、特に好ましくは約６０℃である。

１つの実施形態において、本発明のポリペプチドの反応時間は、ＰＧの意図した分解が達成できる範囲で変更してもよい。反応時間は、約１５秒以上、好ましくは約１分以上、更に好ましくは約３分以上である。反応時間の上限は特にないが、好ましくは約３０分以下、更に好ましくは約１５分以下、特に好ましくは約１０分以下であり得る。酵素反応における酵素濃度も基質濃度と費用に合わせて適宜設定してもよく、一例として、約０．１Ｕ／ｍＬ、約０．５Ｕ／ｍＬ、約１Ｕ／ｍＬ、約５Ｕ／ｍＬ、約１０Ｕ／ｍＬ、約１０Ｕ／ｍＬ、約１００Ｕ／ｍＬ、約５００Ｕ／ｍＬ、約１０００Ｕ／ｍＬである。

１つの実施形態において、酵素を含む溶液の組成は使用する酵素に合わせて適宜設定され得る。溶液はバッファーを含んでもよく、例えば、酢酸バッファー（Ａｃ－Ｎａ）、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、クエン酸リン酸バッファー、ホウ酸バッファー、酒石酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓバッファー、ＭＥＳバッファー（ＭＥＳ－ＮａＯＨ）、ＨＥＰＥＳバッファー、またはリン酸バッファーなどがある。１つの実施形態において、溶液は金属イオンまたは金属イオンのキレーターを含んでもよく、金属イオンとしては、Ａｌ^３＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｌｉ^２＋、Ｎａ^＋、Ｍｎ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ｌｉ^＋、Ｃｕ^２＋、Ｃｏ^２＋、またはＺｎ^２＋などであってよいが、これらに限定されない。金属イオンのキレーターとしては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＧＬＤＡ、ＴＴＨＡ、ＨＩＤＡ、またはＤＨＥＧなどであってよいが、これらに限定されない。１つの実施形態において、溶液は、界面活性剤を含んでもよく、界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ノニデットＰ４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｂｒｉｊｉ３５、およびコール酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。

１つの実施形態において、本発明のＰＧの定量方法を用いてＣＬの量を求めることもできる。既存の酵素法による定量ではＰＧとＣＬとを区別できず、ＰＧとＣＬの合計濃度しか測定できなかった。この既存の定量方法によって求めた生体試料中のＰＧとＣＬの合計量から、本発明によって求めたＰＧ量を差し引くことにより、ＣＬ量を求めることができる。

ＰＧ量を疾患の状態の指標として使用する方法
１つの局面において、本発明は、生体試料中のＰＧ量を被験体における疾患の状態の指標として用いる方法を提供する。ＰＧおよびＣＬの関与が推察されている疾患について、先行技術文献を引用しながら記載する。当業者であれば、以下の知見に基づきＰＧ量と疾患の状態が関連することを理解できる。

本明細書において「抗リン脂質抗体」とは、リン脂質またはリン脂質・タンパク質複合体に対する抗体を指す。「抗リン脂質抗体症候群」とは、抗リン脂質抗体により引き起こされる、後天性の血栓傾向を示す自己免疫疾患を指す。リン脂質・プロトロンビン複合体などに結合する自己抗体である病原性抗リン脂質抗体は、血栓傾向を惹起して脳梗塞・下肢静脈血栓などを誘発し、また、習慣性流産への危険因子としても注目されている。血清中の抗リン脂質抗体の濃度は、抗リン脂質抗体症候群の検査指標として用いられている。

本明細書において「呼吸窮迫症候群」とは、新生児にみられる呼吸窮迫症候群と成人の急性呼吸窮迫症候群を合わせた呼吸困難を主症状とした疾患を指し、肺胞が潰れることを防ぐ肺サーフェクタントが不足していることに起因する。肺サーフェクタントは脂質とタンパク質とからなり、構成脂質はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルグリセロール、およびパルミチン酸である。肺サーフェクタントは、これらのリン脂質が疎水部を肺胞腔側に、親水部を上皮細胞側に配列した単分子膜である（中原広道，「新規人工調製肺サーフェクタントの研究と高機能性特化への応用展開」，薬学雑誌，１３２（２），８１７－８２２（２０１２））。このような構造を取った単分子膜において、ＤＰＰＣは、肺を縮小する際に肺胞表面の表面張力をほぼ０ｍＮ／ｍにまで引き下げ、他方、強い陰イオン性脂質であるＰＧは、肺を膨らます際に陽イオン性のタンパク質と相互作用して肺の再展開を助ける。この肺サーフェクタントが欠如すると呼吸困難が起こり、特に肺サーフェクタントの分泌が十分になる前に生まれた新生児においては呼吸窮迫症候群を、成人において肺の障害により肺サーフェクタントの機能が低下すると急性呼吸窮迫症候群を引き起こす。羊水に含まれるＰＧ濃度と呼吸窮迫症候群の関連が示唆されており、生体中のＰＧ量は、呼吸窮迫症候群の指標として用いられ得ると考えられる。

ＣＬがミトコンドリアの機能維持に必要であることが知られている。ここでＣＬは、以下に述べる合成経路によりＰＧから合成されることが調べられている。

（１）ホスファチジン酸およびＣＴＰから、ＣＤＰ－ジアシルグリセロールが合成される（ＣＤＰ－ＤＡＧ合成酵素１／２，ＣＤＳ１／２）
（２）ＣＤＰ－ジアシルグリセロールのＣＭＰがグリセロール－３－リン酸に置換され、ホスファチジルグリセロールリン酸が合成される（ＰＧＰ合成酵素１，ＰＧＳ１）
（３）ホスファチジルグリセロールリン酸のリン酸が除去され、ホスファチジルグリセロールが合成される（ＰＧＰ脱リン酸化酵素，ＰＴＰＭＴ１）
（４）（２）のＣＤＰ－ジアシルグリセロールのＣＭＰが（３）のホスファチジルグリセロールに置換され、カルジオリピンが合成される（ＣＬ合成酵素１，ＣＬＳ１）
（５－７）カルジオリピンのアシル基が変換されて種々のアシル基を有するカルジオリピンに再構成される
カルジオリピンの合成経路：

この代謝経路において酵素が欠損または機能低下すると、ミトコンドリアの機能が低下し様々な異常が発生することが報告されている。ホスファチジルグリセロールリン酸を合成するＰＧＳ１を欠損したげっ歯類由来のＣＨＯ細胞では、ミトコンドリア膜におけるＰＧおよびＣＬが減少し、ミトコンドリアの形態異常およびＡＴＰ合成能力の低下が起こり、細胞の増殖能が低下することが報告されている。ホスファチジルグリセロールリン酸からＰＧを合成するＰＴＰＭＴ１を欠損したマウスは胎生致死であり、ＰＧの減少が観察され、さらにミトコンドリアの形態と機能とに異常を示したことが報告されている（Ｚｈａｎｇ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，”Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＰＴＰＭＴ１ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．”Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１３，６９０－７００（２０１１））。さらに、ＰＧからＣＬを合成する酵素を欠いた酵母では、ミトコンドリアのＡＴＰ合成能が低下したことも報告されている（Ｊｉａｎｇ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，”Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｒｄ１ ｎｕｌｌ ｍｕｔａｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２９），２２３８７－２２３９４（２０００））。このように、ＣＬだけでなくＰＧも、さらにはその合成経路にかかわる種々の酵素も、ミトコンドリアの機能に影響することが報告されている。従って、本発明のＰＧおよび／またはＣＬの定量法は、ミトコンドリアにおけるＰＧおよび／またはＣＬの定量のために使用され得る。

光合成への関与
シアノバクテリアおよび植物の葉緑体にはＰＧが多量に含まれ、光合成においてホスファチジルグリセロールが重要な役割を果たすと考えられている（Ｗａｄａ Ｈ．ａｎｄ Ｍｕｒａｔａ Ｎ．，”Ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｉｎ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．”Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ，Ｒｅｓ．，９２，２０５－２１５（２００７））。１つの実施形態において、植物におけるＰＧ量を定量することで、植物の状態を判断するための指標とすることが考えられる。

定量用キット
本発明のＰＧ定量用のキットはＰＧ特異的なＰＬＣを含むことを特徴とする。好ましくは、さらにグリセロールリン酸オキシダーゼ、グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、またはアルカリフォスファターゼを含む。アルカリフォスファターゼを使用する場合、グリセロールオキシダーゼまたはグリセロールデヒドロゲナーゼを含んでもよい。本発明のキットは、各種酵素を酵素液として含んでもよく、乾燥形態で含んでもよい。緩衝剤、金属塩、および／または界面活性剤をさらに含んでもよい。

以下に、本発明をさらに理解するための実施例を記載する。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されない。

［実施例１：ＰＧ－ＰＬＣ生産菌の獲得を目的としたスクリーニングとＰＧ－ＰＬＣ生産菌の属種決定のための分類学上の同定］
（実験方法）
実験に使用した試薬は以下の通りである。Ｂａｃｔｏ－Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、型番２１８６３０）、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ＢＳＰ－Ｂ（オリエンタル酵母工業）、Ｌ－α－Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ， Ｅｇｇ（ＰＧ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＯＤ、オリエンタル酵母工業株式会社、型番４６２６１００３）、Ｌ－α－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ（ＧＰＯ、東洋紡株式会社、型番Ｇ３Ｏ－３２１）、４－Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（４－ＡＡ、ナカライテスク、型番０１９０７）、Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（４－ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ， ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＴＯＤＢ、同仁化学研究所、型番ＯＣ２２）、その他、特に記載のない試薬は全て市販特級品を使用した。

目的酵素の生産菌のスクリーニング
（１）培養
１）試験管（Φ１８×１８０ｍｍ）にＩＳＰ２培地５ｍｌとガラスビーズ（Φ４ｍｍ）３粒を入れ、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５ｍｉｎ）した。
２）滅菌した培地にスクリーニング菌株のグリセロールストック懸濁液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、２８℃、１６０ｓｐｍ、往復振とう培養を行った。

（２）ＰＬＣ測定法
ＰＬＣがＰＧに作用すると、ＰＧがラセミ体である場合、ＤＧと、２種のグリセロールリン酸（Ｇ１ＰおよびＧ３Ｐ）が生じる。中でもＧ３Ｐは、グリセロール－３－リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）によって酸化され過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素はペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用により４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）とＮ，Ｎ－Ｂｉｓ（４－ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ，ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＴＯＤＢとを定量的に酸化縮合させ赤紫色のキノイミン色素を生成する。この呈色の強度を、５００～６３０ｎｍ、特に５５０ｎｍの吸光度（Ａ_５５０）を測定することで、ＰＬＣの加水分解能を測定できることが知られている。この酵素による測定法を用いて、スクリーニング菌株の培養液の上清にＰＧを加水分解するＰＬＣが存在しているか調べた。なお、１ｍｉｎに１μｍｏｌのＧ３Ｐを生成する酵素量を１Ｕと定義した。

（結果と考察）
ＰＬＣ生産菌の取得と分類学上の同定
（１）スクリーニング計７２菌株した結果、ＮＴ１１５株の培養上清中にＰＧ－ＰＬＣ活性を見い出した。簡易形態観察の結果、ＮＴ１１５株はＩＳＰ２寒天培地上で円形の中央陥没上のコロニーを示し、表面の色調は白色、裏面は茶色を示した。また、微視的観察の結果、気菌糸を形成し、連鎖胞子の観察が見られた。テクノスルガ・ラボ微生物同定システムを用いた、ＤＢ－ＢＡおよび国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ相同性検査を基に解析した分子系統樹において、ＮＴ１１５株はＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属が構成するクラスター内に含まれたが、既知の種とは異なる分子系統学的位置を示した。よって、今回の１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列解析の結果からは、ＮＴ１１５株はＡｍｙｃｏｌｏｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．と帰属した。また、この結果は、簡易形態観察の結果とも一致した。

［実施例２：ＮＴ１１５株が菌体外に分泌生産するＰＬＣの精製］
（実験方法）
Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．ＮＴ１１５株ＰＬＣの精製
（１）培養
試験管（Φ１８×１８０ｍｍ）にＩＳＰ２培地５ｍｌとガラスビーズ（Φ４ｍｍ）３粒を入れ、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５ｍｉｎ）した。冷却後、クリーンベンチ内でＮＴ１１５株の１０％（ｖ／ｖ）グリセロールストック懸濁液５０μｌを植菌し、２８℃，１６０ｓｐｍで２日間往復振とう培養し、前培養液とした。５００ｍｌ容三角フラスコにＩＳＰ２培地１００ｍｌとステンレスコイルを入れたものを１０本用意し、オートクレーブ滅菌した。クリーンベンチ内で培地に前培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、２８℃，１６０ｒｐｍで７２時間旋回振とう培養した。

（２）硫酸アンモニウム（ＡＳ）分画
（１）の培養液を遠心分離（１８，８００×ｇ，１０ｍｉｎ）し、培養上清を得た。培養上清に２０％飽和となるように飽和ＡＳ水溶液（４℃保存）を加えた。１時間静置した後、生じた沈殿物を遠心分離（１８，８００×ｇ，１０ｍｉｎ）により回収した。

（３）ＰＬＣ活性
以下の実験では、実施例１と同様に酵素反応によりＰＬＣ活性値を算出した。

（４）ＰＰＧ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
回収した沈殿物を１Ｍ ＡＳ／２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で溶解した（フィルター、遠心分離なし）。
１）表１の条件でＰＰＧ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィーを行った。
Ａ ｓｏｌ．：１Ｍ ＡＳ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７）
Ｂｓｏｌ．：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７）
Ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ：１５ｍｌ（＝Φ２．５ｃｍ， Ｈ＝３．０ｃｍ）
Ｅｌｕｔｉｏｎ１：ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ １ ｔｏ ０Ｍ ＡＳ
ｗｉｔｈ ４ＣＶ
Ｅｌｕｔｉｏｎ２：１００％ Ｂ ｓｏｌ． ｗｉｔｈ ４ＣＶ
Ｆｒａｃｔｉｏｎ：６ｍｌ
表１：ＰＰＧ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィーの条件

２）各フラクションのＰＬＣ活性（基質；ＰＧ）を測定し、２．５Ｕ／ｍｌ以上の活性を示したフラクションを回収した（ＰＰＧ画分）。

（５）透析
ＰＰＧ画分を透析膜（三光純薬、セルロースチューブ３６／３２）に移し、サンプル量の１０倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で２回透析（ｂｕｆ交換；１ｈ，１２ｈ）した。

（６）Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
１）透析内液を回収し、Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（以下ＧＣＱと略す）にロードした。サンプルはフィルターろ過、遠心分離なしでカラムロードし、表２の条件でＧＣＱカラムクロマトグラフィーを行った。
Ａｓｏｌ．：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）
Ｂ ｓｏｌ．：０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）
Ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ：１５ｍｌ（＝Φ２．５ｃｍ， Ｈ＝３．０ｃｍ）
Ｅｌｕｔｉｏｎ：ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ ０ ｔｏ ０．５Ｍ ＮａＣｌ ｗｉｔｈ １０ＣＶ
Ｆｒａｃｔｉｏｎ：５ｍｌ
表２：Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィーの条件

２）各フラクションのＰＧ－ＰＬＣ活性を測定し、活性のあったフラクションをＧＣＱ画分とした。

（７）ゲルろ過クロマトグラフィー
Ａｍｉｃｏｎ－３０Ｋ（１５ｍＬ）を用いてＧＣＱ画分を５００μｌまで濃縮した。濃縮サンプルは、０．４５μｍフィルターろ過後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（Ｓｐｄ ２００ Ｉｎｃ）にロードした。
１）以下の条件と表３に示す条件でカラムクロマトグラフィーを行った。
Ａ ｓｏｌ．：０．１５Ｍ ＮａＣｌ／Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
Ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ：２４ｍｌ（＝Φ１．０ｃｍ， Ｈ＝３０ｃｍ）
Ｅｌｕｔｉｏｎ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｗｉｔｈ １．５ＣＶ
Ｆｒａｃｔｉｏｎ：０．５ｍｌ
表３：ゲルろ過クロマトグラフィーの条件

２）各フラクションのＰＧ－ＰＬＣ活性を測定し、Ａｍｉｃｏｎ－３０Ｋにより２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にｂｕｆｆｅｒ交換を行い、精製ＰＧ－ＰＬＣとした。

タンパク質濃度の定量
ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用し、取扱説明書に従って５６２ｎｍにおける吸光度（Ａ_５６２）を測定し、タンパク質濃度を定量した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法を行った。タンパク質バンドの検出には銀染色キット（アプロサイエンス）を使用し、取扱説明書に従って行った。

（結果と考察）
ＩＳＰ２培地で２日間培養した（図２）上清から、ＰＧ－ＰＬＣを２９８１倍まで精製することができ（表４）、比活性は６．１９ Ｕ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎとなった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析では分子量は約５４ｋＤａの単一バンドとして検出された（図３）。
表４：ＮＴ１１５株由来ＰＧ－ＰＬＣの精製結果

［実施例３：ＰＧ－ＰＬＣの諸特性解析］
（実験方法）
基質特異性試験以外は、実施例１に記載の方法により酵素活性を測定した。基質特異性試験では、基質として１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＯＰＧ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＯＰＣ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＯＰＥ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＰＯＰＩ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ（ＰＯＰＳ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈａｔｅ（ＰＯＰＡ）、ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ（ＣＬ）、Ｌ－α－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＧ）を使用した。その他にＢＩＯＭＯＬ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、以下ＢＧと略記）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（オリエンタル酵母工業、仔ウシ小腸由来、以下ＣＩＡＰと略記）を使用した。酵素反応液に加える酵素液（精製ＰＧ－ＰＬＣサンプル）は０．０５Ｕ／ｍｌ， １．５０Ｕ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ以上のものを使用し、基質消費が１０％程度以下となるように適宜希釈した。

１）酵素反応におけるｐＨ、温度の影響、ｐＨおよび温度安定性試験
酢酸－酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０～５．５，以下Ａｃ－Ｎａと略す）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ５．５～７．０）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０～９．０）を使用する温度でｐＨ調整し、酵素反応あるいは酵素に及ぼすｐＨおよび温度（図４－１、図４－２）の影響と安定性（図５－１、図５－２）について調べた。

２）ＰＬＣ活性に対する金属イオン、界面活性剤の影響については０．１４Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、５５℃の条件下で金属イオン（図６－１）、界面活性剤（図６－２）の影響を調べた。

３）ＰＬＣの基質特異性試験
各基質とＰＬＣとを反応させ、各基質に対する酵素活性を調べた。酵素反応により生じるグリセロールリン酸など対応するリン酸モノエステルを脱リン酸化酵素であるＣＩＡＰにより遊離した無機リン酸（Ｐｉ）を定量した。ただし、ＰＯＰＡは脱リン酸化酵素処理せず、そのままＰＧ－ＰＬＣによって遊離される無機リン酸（Ｐｉ）を定量した。無機リン酸の定量は、ＢＧ試薬を使用して取扱説明書に従い、６２０ｎｍにおける吸光度（Ａ_６２０）を測定して行った。

（結果と考察）
以下に示す各データは、特に記載がない場合は全て３回試験した結果を平均値±標準偏差（ＳＤ）で示す。
ｐＨ、温度の酵素反応と酵素の安定性への影響
各ｐＨにおけるＰＬＣ活性（３７℃）を調べたところ、弱酸性域ｐＨ５．０～ｐＨ６．０で高い活性を示し、ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）で最も高い活性を示した（図４－１）。ｐＨ６．０で各温度における活性を調べたところ５５℃で最大活性を示し、２０℃では約３０％、７０℃では約４０％の相対活性を示した（図４－２）。基質調製に使用したＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００の曇点は６３℃であることから６０℃以下においてはＰＬＣ活性の特徴を示していると考えられる。

図５－１に示すようにｐＨ４．０からｐＨ９．０という広範囲でｐＨが安定であった。また温度安定性試験では、図５－２に示すように５０℃まで安定であり、６０℃で活性が半減した。

金属イオンの影響
図６－１に示すように、ＥＤＴＡの存在下でも活性を示し、Ｃａ^２＋によってわずかに活性が向上し、Ａｌ^３＋の存在下で約１．３倍活性が向上した。また、図６－２に示すように試験した条件においてはＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００が最も良好な結果を示した。

基質特異性
図７に示すようにＰＣ、ＰＥ、ＣＬには全く活性を示さなかった他、ＰＡにも全く活性を示さず（データ示さず）、ＰＧ以外にはほとんど作用しなかったことから本酵素はＰＧ特異的ＰＬＣであると判断できる。

［実施例４：ＰＧ－ＰＬＣの配列］
（実験方法）
ペプチドの配列決定
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりＰＧ－ＰＬＣを泳動後、バンドを切り出し、株式会社アンテグラルにてトリプシン処理およびＬＣ－ＭＳ解析を行い、アミノ酸配列を解析した。ＬＣ－ＭＳ解析により得られたペプチドの配列、およびこれらのペプチド配列と合致するデータベースから得られたタンパク質配列を図８に示す。グレーハイライト部分が本酵素のペプチド配列と一致した配列である。計１１本のペプチド配列が解読され、それらすべてのペプチドのアミノ酸配列がＷＰ＿０３７３６９５１３．１として公共データベースに登録されているＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ由来メタロホスホエステラーゼ中の配列と一致した。

アミノ酸配列番号６から配列番号５のフォワードプライマーを、アミノ酸配列番号８から配列番号７のリバースプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は下記の通りである。
９４℃、１分→（９８℃、１０秒→５５℃、１５秒→６８℃、４５秒）を２５サイクル、６８℃、５分
ＰＣＲによって得られた増幅断片をクローニングベクターｐＭＤ２０（タカラバイオ）に連結し、大腸菌ＤＨ５アルファを形質転換、培養し、組換えプラスミドを回収、精製した。それをＤＮＡシーケンサーで解析することで本酵素遺伝子の一部の塩基配列（配列番号９，１０）を解読した。次に、５’、３’未解読領域を解読するため配列番号１１，１２のプライマーセットによりインバースＰＣＲ（ｉＰＣＲ）を行った。ｉＰＣＲ条件は下記の通りである。
９４℃、１分→（９８℃、１０秒→５７℃、１５秒→６８℃、２．５分）を２５サイクル、６８℃、５分
ｉＰＣＲ反応液をカラム精製し、シーケンスをした。解析結果から、５’、３’未解読領域を解読し、本酵素遺伝子の全長配列（配列番号１、２の配列に、配列番号３、４のシグナル配列が付与されたもの）を解読し、図９に示すアミノ酸配列を得た。図９に示すアミノ酸配列の内、２５アミノ酸からなるシグナル配列を配列番号４、その塩基配列を配列番号３として示し、５１４アミノ酸からなる成熟タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２、その塩基配列を配列番号１として示す。

［実施例５：異種組換えＰＧ－ＰＬＣの製造および大腸菌ＰＧの分解］
実施例４で得られた、配列番号１に記載のＰＧ－ＰＬＣをコードするＤＮＡを、配列番号１３、１４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ゲル電気泳動し、増幅バンドを切り出し精製した。ＰＣＲ条件は下記の通りである。
９４℃、１分→（９８℃、１０秒→６４℃、１５秒→６８℃、１分１５秒）を２５サイクル、６８℃、５分
同様にｐＥＴ－２４ａ（＋）をＨｉｎｄＩＩＩ消化後にゲル電気泳動し、切り出し精製した。両者を混合し、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ）を用いてｐＥＴ－２４ａ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＰＧ－ＰＬＣ／ｐＥＴ－２４ａ（＋）を作成した。そのため、ＰＧ－ＰＬＣ成熟配列のＮ末端側にはマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）由来ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＧＳＱＦＱＬＲＲＱからなる２１アミノ酸が付加した状態である。

ＰＧ－ＰＬＣ／ｐＥＴ－２４ａ（＋）を、Ｚｉｐ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＢＬ２１（ＤＥ３）（バイオダイナミクス、品番：ＤＳ２５５）に形質転換し、終濃度５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、ＰＧ－ＰＬＣ／ｐＥＴ－２４ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。これを、同じくカナマイシンを５０μｇ／ｍＬの終濃度で含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ ５ ｍＬ（液体培地）に植菌し、２０℃あるいは３０℃で１日間培養し、ＰＧ－ＰＬＣを発現させた。２０℃で培養した培養液を遠心分離して培養上清を得、また、３０℃で培養した培養液を遠心分離してＰＧ－ＰＬＣ／ｐＥＴ－２４ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）菌体と培養上清を回収し得られた菌体を緩衝液に懸濁して超音波破砕し、これを遠心分離して上清を得、粗タンパク質液（ＣＦＥ）とした。

２０℃の培養上清、または３０℃のＣＦＥを酵素液として、ＰＯＰＧを基質として用いて、実施例１に記載の加水分解能の測定方法によりＰＧ－ＰＬＣの酵素活性を測定した。そうしたところ、いずれの反応液において時間依存的にＧ３Ｐの濃度が上昇し、Ｇ３Ｐ濃度は反応時間に比例した（図１０－１、図１０－２）。これにより、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＰＧ－ＰＬＣが異種発現されたことが確認できた．２０℃の培養上清は１．４Ｕ／Ｌ、３０℃のＣＦＥは１Ｕ／Ｌであった．

ＭＣＳに外来遺伝子を含まない空のｐＥＴ－２４ａ（＋）ベクターで形質転換し、培養した組換えＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を遠心分離により回収し、得られた菌体を水あるいは緩衝液で懸濁し、それを超音波破砕してＥ．ｃｏｌｉ破砕液を得た。この破砕液５μＬに、精製した親酵素、あるいは、２０℃の培養上清、または３０℃のＣＦＥを混合し、ｐＨ６．０（ＭＥＳ－ＮａＯＨ）、４５℃で３０分間反応させ、実施例１に記載の加水分解能の測定方法によりＰＧ－ＰＬＣの酵素活性を測定した。そうしたところ、いずれの反応液においてもＧ３Ｐの生成が確認できた。一例として、上記条件のもと、精製した親酵素を用いた場合、３０分間で熱失活酵素をブランクとして算出したΔＡ_５５０は０．１５９であった。これにより、Ｅ．ｃｏｌｉ破砕液に含まれるＥ．ｃｏｌｉ膜由来ＰＧが当該ＰＧ－ＰＬＣの作用により加水分解され、グリセロールリン酸が生成したことが確認された。

［実施例６：触媒（活性）中心部位および基質結合部位の推定］
ＰＧ－ＰＬＣの触媒（活性）中心部位および基質結合部位を推定するために、データベース上の構造および配列が既存のタンパク質をもとにＰＧ－ＰＬＣの３次元的（立体）構造を予測し、これに基づいて酵素の触媒（活性）中心部位および基質結合部位となるアミノ酸を推定した。

まず、タンパク質のドメイン・モチーフのデータベースであるＰｆａｍおよびタンパク質の立体構造・ファミリーのデータベースであるＣＡＴＨを用いて、ＰＧ－ＰＬＣが属するタンパク質ファミリーを調べた。そうしたところ、いずれのデータベースを用いても、ＰＧ－ＰＬＣは金属イオン要求性ホスホエステラーゼに属すると推定され、原核生物由来の亜鉛依存（要求）性ホスホリパーゼＣシグネチャー（Ｈ－Ｙ－ｘ－［ＧＴ］－Ｄ－［ＬＩＶＭＡＦ］－［ＤＮＳＨ］－ｘ－Ｐ－ｘ－Ｈ－［ＰＡ］－ｘ－Ｎ）に属する配列を５つ有していた。さらに、このファミリーに属するタンパク質の３次元的（立体）構造を比較したところ、構造が類似していた。これらの結果から、ＰＧ－ＰＬＣと金属イオン要求性ホスホエステラーゼとでは３次元的（立体）構造に類似性があり、そのため、金属イオン要求性ホスホエステラーゼをモデルにしてＰＧ－ＰＬＣの構造が推定できると考えた。

ＰＧ－ＰＬＣの構造を予想するために、タンパク質立体構造のデータベースであるＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌを用いてアミノ酸配列の類似した３次元的（立体）構造既知のタンパク質を調べた。そうしたところ、２ｘｍｏという金属イオン要求性ホスホエステラーゼが見出され、２ｘｍｏの立体構造に基づいてＰＧ－ＰＬＣの立体構造モデルを得た。２ｘｍｏの立体構造との比較から、ＰＧ－ＰＬＣにおいてリン酸と相互作用する活性中心残基を推定したところ、Ｄ４１／Ｈ４３／Ｄ１０３／Ｎ１９１／Ｈ３６４／Ｈ４０７／Ｈ４０９のヒスチジン（Ｈ）およびアスパラギン酸（Ｄ）が活性中心残基であると予想され、中でもリン酸との距離が近いＨ４３およびＨ４０９が触媒残基であると推定した。

次に、基質結合部位を予想するために、ＰＧ－ＰＬＣの立体構造モデルと、構造既知の４種類のＰＬＣとを比較した。そうしたところ、いずれのＰＬＣもタンパク質の中央付近に酸性アミノ酸の多いポケットを有し、このポケットに基質が結合すると考えられた。さらに、構造既知のＰＧ非特異的ＰＬＣ（例えば、ＰＣ特異的ＰＬＣなど）における基質の位置をＰＧ－ＰＬＣにあてはめ、基質と接触するアミノ酸残基を推定したところ、図１１に得られるアミノ酸残基が基質と接触し、基質結合部位に当たると推定できた（配列番号２で表されるアミノ酸配列の、４０Ｔ～７５Ｔ、１００Ｔ～１２０Ｌ、１８４Ｐ～１９７Ｖ、２０５Ｐ～２２７Ｋ、２６６Ｆ、２７１Ｌ、２９６Ｙ～２９７Ｙ、３１０Ｌ～３２２Ｓ、３６３Ｓ～３６６Ｔ、３７８Ｒ～３８４Ｒ、４０６Ｇ～４０９Ｈ、および４３２Ｓ～４３５Ｄ）。中でも、非極性アミノ酸である５６Ｌ／５９ＦＶＧ６１／２０４ＩＰＧＩ２０７／２０９ＡＷ２１０／３１６ＧＧＦＡ３２０は、ＰＧのアシル基に結合するアミノ酸残基であると考えられる。

さらに、これらの基質結合部位、活性中心アミノ酸残基、および触媒残基が放線菌間で保存されている調べるため、配列番号２の部分配列について、種々の放線菌間でＢＬＡＳＴを用いて配列を比較した。そうしたところ、配列番号２の３５～４８８位のアミノ酸（ＡＦＶ・・・ＳＹＮ；配列番号１６）において、２５種を超える放線菌間で高い配列の相同性と類似性が見られ、基質結合部位、活性中心アミノ酸残基、および触媒残基が少なくとも放線菌間で種を超えて保存されていることが示された。また、Ｐｆａｍによる解析では配列番号２の３６～４０９位のアミノ酸がＭｅｔａｌｌｏｐｈｏｓモチーフ（Ｐｆａｍ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ： ＰＦ００１４９）として帰属された。

［実施例７：組換え型タンパク質によるＰＧの定量］
（材料と方法）
実施例７において使用する試薬を以下に示す。
放線菌由来のＰＧ特異的ＰＬＣ（アミノ酸配列は配列番号２）
卵由来ホスファチジルグリセロール（Ｌ－α－Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ，Ｅｇｇ，Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）
その他、特に記載のない試薬は全て市販特級品を使用する。その他の試薬については実施例１、３と同じものを使用する。

ＰＧ特異的ＰＬＣの作成
配列番号２のタンパク質の、Ｎ末端あるいはＣ末端にＨｉｓタグを融合させたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをｐＥＴ－２４ａ（＋）ベクターに組み込み、Ｅ．ｃｏｌｉに形質導入してタンパク質を発現させる。実施例５と同様にして調製した培養上清およびＣＦＥを回収し、Ｈｉｓタグを用いたアフィニティークロマトグラフィー（Ｃｙｔｉｖａ、製品番号２９０５１０２１および１７５２４８０１）によりタンパク質を精製する。精製プロトコルは製品説明書に従う。

ＰＧの定量
５μｌの酵素液（例、０．２Ｕ／ｍＬ ＰＧ特異的ＰＬＣ（１Ｕとは、１分間に１μｍｏｌのグリセロールリン酸を生成する酵素量である））、４０μｌの０．２Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、終濃度既知の０～１０００μＭ ＰＧ水溶液（０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００で可溶化）５μｌを添加し、３７～５５℃で３０分間インキュベートする。１００℃、５分間の加熱によりＰＧ特異的ＰＬＣを失活させた後、本反応液５μＬをＡＰ反応液（９４μＬ ＣＩＡＰ ｂｕｆｆｅｒ，１μＬの１６００Ｕ／ｍＬ ＣＩＡＰ）９５μＬに加えて５６℃、１０分間インキュベートすることにより脱リン酸化を行う。本脱リン酸化液７５μＬを１５０μＬのＢＧ試薬と混合し、室温（２５℃）で２０分間インキュベートすることにより、遊離した無機リン酸を呈色させる。呈色の強度を６２０ｎｍにおける吸光度としてマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＭＵＬＴＩＳＣＡＮ ＦＣ）を用いて測定する。ＡＰ Ｂｕｆｆｅｒなどの各反応液の組成を以下に示す。

［結果］
ＰＧ量と呈色強度の関係
０μＭ～１０００μＭのうちのいくつかの終濃度のＰＧ水溶液を用いて検量線を作成する。ＰＧ量に応じて呈色強度の増加が見られる。

配列番号１：Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．由来のＰＧ－ＰＬＣの塩基配列
配列番号２：Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．由来のＰＧ－ＰＬＣの成熟タンパク質配列
配列番号３：Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．におけるＰＧ－ＰＬＣのシグナル配列の塩基配列
配列番号４：Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．におけるＰＧ－ＰＬＣのシグナル配列
配列番号５：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのフォワードプライマー
配列番号６：配列番号５のプライマーに対応するアミノ酸配列
配列番号７：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのリバースプライマー
配列番号８：配列番号７のプライマーに対応するアミノ酸配列
配列番号９：特定されたＰＧ－ＰＬＣの部分塩基配列
配列番号１０：特定されたＰＧ－ＰＬＣの部分アミノ酸配列
配列番号１１：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのｉＰＣＲ用プライマー１
配列番号１２：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのｉＰＣＲ用プライマー２
配列番号１３：サブクローニングのためのフォワードプライマー
配列番号１４：サブクローニングのためのリバースプライマー
配列番号１５：大腸菌発現の際にＰＧ－ＰＬＣのＮ末端に付与したＭＣＳ由来２１アミノ酸を含むアミノ酸配列
配列番号１６：ＰＧ－ＰＬＣ中の種間で保存性が高いことが確認された配列

Claims (9)

1. 以下の工程を有する、試料中のホスファチジルグリセロールの定量方法：
   （１）（ａ）試料に、ホスファチジルグリセロール特異的なホスホリパーゼＣを反応させる工程、および
   （２）反応により生じた化合物の量を測定する工程。
2. 工程（１）において、（ｂ１）グリセロールリン酸オキシダーゼを反応させる工程、（ｂ２）グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼを反応させる工程、または（ｂ３）アルカリフォスファターゼを反応させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 工程（２）における測定が、前記化合物に起因する蛍光、吸光、または発光の強度を測定することによる、請求項１～２のいずれかに記載の方法。
4. 生体試料中のホスファチジルグリセロールの量を被験体における疾患の状態の指標として用いる方法であって、
   （ａ）ホスファチジルグリセロール特異的なホスホリパーゼＣを用いて前記被験体由来の生体試料におけるホスファチジルグリセロールを定量する工程と、
   （ｂ）前記ホスファチジルグリセロールの量を参照値と比較する工程
   とを含み、前記参照値と比較した前記ホスファチジルグリセロールの量の差異が、前記疾患の状態の指標となる方法。
5. 前記疾患が自己免疫性疾患、および呼吸窮迫症候群からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記生体試料が前記被験体の血液、尿、羊水、細胞、または細胞破砕物、あるいは各種生物由来サンプルである、請求項４または５に記載の方法。
7. 前記ホスファチジルグリセロール特異的なホスホリパーゼＣが、ホスファチジルグリセロールに対する基質特異性を有し、カルジオリピンと実質的に反応しない、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 定量されるホスファチジルグリセロールが、種々のアシル基を有するホスファチジルグリセロールの総量である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. ホスファチジルグリセロール特異的なホスホリパーゼＣを含む、ホスファチジルグリセロールの定量用キット。

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