JP2022134907A - Methods for producing biofilms, biofilms and methods for producing organic materials - Google Patents

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Abstract

To provide methods for producing biofilms advantageous for producing organic materials using cyanobacteria.SOLUTION: In a method for producing a biofilm 20, a culture fluid 15 containing a modified cyanobacterium 10 is stored such that a gas-liquid interface 17 to be present between the culture fluid 15 and the air. In addition, the modified cyanobacterium 10 aggregates along the gas-liquid interface 17 as a sheet. In the modified cyanobacterium 10, the total amount of a protein participating the connection between outer membrane 5 and cell wall 4 is suppressed to from 30% to 70% of the total amount of that protein in a parent strain.SELECTED DRAWING: Figure 15

Description

特許法第30条第2項適用申請有り 1.刊行物にて公開 発行日:令和2年3月5日、刊行物:日本農芸化学会2020年度大会 講演要旨集 2.電気通信回線を通じて発表 掲載日:令和2年3月25日、掲載アドレス:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.24.006684v1.fullThere is an application for the application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act. Published in publication Publication date: March 5, 2nd year of Reiwa, Publication: 2020 Annual Meeting of the Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry 2. Announced via telecommunications line Posting date: March 25, 2020 Posting address: https://www. biorxiv. org/content/10.1101/2020.03.24.006684v1. full

本開示は、バイオフィルムの製造方法、バイオフィルム、及び有機物の製造方法に関する。 The present disclosure relates to methods of producing biofilms, biofilms, and methods of producing organic matter.

化石燃料に依存せず、かつ、環境負荷が低い物質生産方式が、化学工業から農水畜産業に至る幅広い産業分野で求められている。微生物を用いた物質生産は、常温常圧の環境下で行うことができ、かつ、近年の遺伝子操作技術の発展に伴い幅広い化合物種を生産できるようになったことから、上記の要求を満たす生産系として注目されている。その中で、シアノバクテリア及び藻類などの光合成微生物は、光をエネルギー源として空気中の二酸化炭素(CO2)を原料として利用できるので、カーボンニュートラルな次世代の物質生産系として特に期待されている。 Substance production methods that do not depend on fossil fuels and have a low environmental load are required in a wide range of industrial fields from the chemical industry to the agriculture, aquaculture and livestock industries. Substance production using microorganisms can be performed in an environment of normal temperature and normal pressure, and with the recent development of genetic manipulation technology, it has become possible to produce a wide range of chemical compounds. attention as a system. Among them, photosynthetic microorganisms such as cyanobacteria and algae can use light as an energy source and carbon dioxide (CO 2 ) in the air as a raw material. .

例えば、シアノバクテリアを用いて生産される物質として、エタノール(非特許文献1参照)、イソブタノール(非特許文献2参照)、アルカン類(特許文献2参照)、脂肪酸(特許文献1参照)、及びタンパク質(非特許文献3参照)等が報告されている。 For example, substances produced using cyanobacteria include ethanol (see Non-Patent Document 1), isobutanol (see Non-Patent Document 2), alkanes (see Patent Document 2), fatty acids (see Patent Document 1), and Proteins (see Non-Patent Document 3) and the like have been reported.

また、例えば、非特許文献4には、シアノバクテリアにタンパク質を発現させる手法が開示されている。 Further, for example, Non-Patent Document 4 discloses a technique for expressing proteins in cyanobacteria.

特許第6341676号公報Japanese Patent No. 6341676 特開2015-109828号公報JP 2015-109828 A

Jason Dexter and Pengcheng Fu, “Metabolic engineering of cyanobacteria for ethanol production”, Energy & Environmental Science, Royal Society of Chemistry, 2009, Vol.2, pp.857-864Jason Dexter and Pengcheng Fu, “Metabolic engineering of cyanobacteria for ethanol production”, Energy & Environmental Science, Royal Society of Chemistry, 2009, Vol.2, pp.857-864 Shota Atsumi et al., “Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde”, Nature Biotechnology, Nature Publishing Group, 2009, Vol.27, No.12, pp.1177-1180Shota Atsumi et al., “Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde”, Nature Biotechnology, Nature Publishing Group, 2009, Vol.27, No.12, pp.1177-1180 Jie Zhou et al., “Discovery of a super-strong promoter enable efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria”, Scientific Reports, Nature Research, 2014, Vol.4, Article No.4500Jie Zhou et al., “Discovery of a super-strong promoter enable efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria”, Scientific Reports, Nature Research, 2014, Vol.4, Article No.4500 Andrew H. Ng et al., ”Fine-Tuning of Photoautotrophic Protein Production by Combining Promoters and Neutral Sites in the Cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803”, Applied and Environmental Microbiology, American Society for Microbiology, 2015, Vol.81, pp.6857-6863Andrew H. Ng et al., ``Fine-Tuning of Photoautotrophic Protein Production by Combining Promoters and Neutral Sites in the Cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803'', Applied and Environmental Microbiology, American Society for Microbiology, 2015, Vol.81, pp. .6857-6863 木幡光, Studies on molecular basis of cyanobacterial outer membrane function and its evolutionary relationship with primitive chloroplasts, 博士論文,[オンライン], 2018.03.27,インターネット:<URL: http://hdl.handle.net/10097/00122689>Hikaru Kohata, Studies on molecular basis of cyanobacterial outer membrane function and its evolutionary relationship with primitive chloroplasts, Doctoral thesis,[Online], 2018.03.27,Internet:<URL: http://hdl.handle.net/10097/00122689> 児島征司, 葉緑体表層膜で機能する細菌由来の膜安定化機構と物質透過機構の解明と応用, 科研費, [オンライン], 2018.04.23, インターネット:<URL: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18H02117>Seiji Kojima, Elucidation and application of bacterial-derived membrane stabilization and material permeation mechanisms that function in the chloroplast surface membrane, KAKENHI, [Online], 2018.04.23, Internet:<URL: https://kaken.nii .ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18H02117> Jurgens and Weckesser, 1986, J. Bacteriol., 168:568-573Jurgens and Weckesser, 1986, J. Bacteriol., 168:568-573 Kojima et al., 2016, Biosci. Biotech. Biochem., 10:1954-1959Kojima et al., 2016, Biosci. Biotech. Biochem., 10:1954-1959 Kowata et al., 2017, J. Bacteriol., 199:e00371-17Kowata et al., 2017, J. Bacteriol., 199:e00371-17 Kojima et al., 2016, J. Biol. Chem., 291:20198-20209Kojima et al., 2016, J. Biol. Chem., 291:20198-20209 Mesnage et al., 2000, EMBO J., 19:4473-4484Mesnage et al., 2000, EMBO J., 19:4473-4484 Yao et al., ACS Synth. Biol., 2016, 5:207-212Yao et al., ACS Synth. Biol., 2016, 5:207-212

しかしながら、上記の従来技術では、シアノバクテリアを用いて効率良くタンパク質等の有機物を製造することは難しい。 However, it is difficult to efficiently produce organic substances such as proteins using cyanobacteria with the above conventional techniques.

そこで、本開示は、シアノバクテリアを用いた有機物の製造に有利なバイオフィルムの製造方法を提供する。 Therefore, the present disclosure provides a biofilm production method that is advantageous for the production of organic matter using cyanobacteria.

本開示の一態様に係るバイオフィルムの製造方法は、
シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に抑制されている改変シアノバクテリアを含む培養液を前記培養液と空気との間の気液界面が存在するように貯留することと、
前記改変シアノバクテリアを前記気液界面に沿って面状に凝集させることと、を含む。
A method for producing a biofilm according to one aspect of the present disclosure includes:
A culture medium containing a modified cyanobacterium in which the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed to 30% to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain is placed between the culture medium and air. storing such that there is a gas-liquid interface of
aggregating the modified cyanobacteria into a planar shape along the air-liquid interface.

本開示のバイオフィルムの製造方法によれば、シアノバクテリアを用いた有機物の製造に有利なバイオフィルムを製造できる。 According to the biofilm production method of the present disclosure, a biofilm can be produced that is advantageous for the production of organic matter using cyanobacteria.

図1は、シアノバクテリアの細胞表層を模式的に示した図である。FIG. 1 is a diagram schematically showing the cell surface layer of cyanobacteria. 図2は、実施の形態の一例に係る改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡観察像である。FIG. 2 is a transmission electron microscope observation image of an ultra-thin section of modified cyanobacteria according to an example of the embodiment. 図3は、図2の破線領域Aの拡大像及びその模写を含む図である。FIG. 3 is a diagram including an enlarged image of the dashed line area A in FIG. 2 and a copy thereof. 図4は、実施の形態の別の一例に係る改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。FIG. 4 is a transmission electron microscope image of an ultra-thin section of modified cyanobacteria according to another example of the embodiment. 図5は、図4の破線領域Bの拡大像及びその模写を含む図である。FIG. 5 is a diagram including an enlarged image of the dashed line area B in FIG. 4 and a replica thereof. 図6は、参考例に係る改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。FIG. 6 is a transmission electron microscope image of an ultra-thin section of modified cyanobacteria according to Reference Example. 図7は、図6の破線領域Cの拡大像及びその模写を含む図である。FIG. 7 is a diagram including an enlarged image of the dashed line area C in FIG. 6 and a copy thereof. 図8は、サンプル1、サンプル2、及びサンプル3の改変シアノバクテリアの培養液中のタンパク質量を示すグラフである。FIG. 8 is a graph showing the amount of protein in culture media of modified cyanobacteria of samples 1, 2, and 3; 図9は、サンプル1、2、3、4、及び5の改変シアノバクテリアにおける外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の量を示す電気泳動像である。FIG. 9 is an electropherogram showing the amounts of proteins involved in the binding of the outer membrane and the cell wall in the modified cyanobacteria of samples 1, 2, 3, 4, and 5; 図10Aは、サンプル4の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。10A is a transmission electron micrograph of an ultra-thin section of modified cyanobacteria of sample 4. FIG. 図10Bは、図10Aの破線で囲まれた部分の拡大像である。FIG. 10B is an enlarged image of the portion enclosed by the dashed line in FIG. 10A. 図11Aは、サンプル5の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。11A is a transmission electron micrograph of an ultra-thin section of modified cyanobacteria of sample 5. FIG. 図11Bは、図11Aの破線で囲まれた部分の拡大像である。FIG. 11B is an enlarged image of the portion enclosed by the dashed line in FIG. 11A. 図12は、サンプル1、2、3、4、及び5の改変シアノバクテリアの培養液中のタンパク質の量を示すグラフである。FIG. 12 is a graph showing the amount of protein in cultures of modified cyanobacteria of samples 1, 2, 3, 4, and 5; 図13は、サンプル2及び3の改変シアノバクテリアの細胞壁結合型糖鎖に共有結合しているピルビン酸の量を示すグラフである。13 is a graph showing amounts of pyruvic acid covalently bound to cell wall-bound sugar chains of modified cyanobacteria of samples 2 and 3. FIG. 図14は、バイオフィルムの製造方法の一例を示す図である。FIG. 14 is a diagram showing an example of a biofilm production method. 図15は、バイオフィルムの製造方法の別の一例を示す図である。FIG. 15 is a diagram showing another example of a biofilm production method. 図16Aは、実施例1における培養液の状態を示す写真である。16A is a photograph showing the state of the culture solution in Example 1. FIG. 図16Bは、比較例1における培養液の状態を示す写真である。16B is a photograph showing the state of the culture solution in Comparative Example 1. FIG. 図17は、参考例4及び5の懸濁液の吸収スペクトルの測定結果を示すグラフである。17 is a graph showing measurement results of absorption spectra of suspensions of Reference Examples 4 and 5. FIG. 図18は、参考例4及び5の懸濁液の写真である。18 is a photograph of suspensions of Reference Examples 4 and 5. FIG. 図19は、参考例6で用いた培養容器の断面図である。19 is a cross-sectional view of a culture vessel used in Reference Example 6. FIG. 図20は、参考例6における分泌タンパク質量及び浮遊細胞濃度と培養日数との関係を示すグラフである。FIG. 20 is a graph showing the relationship between the amount of secreted protein, the floating cell concentration, and the number of culture days in Reference Example 6.

(本開示の基礎となった知見)
藍色細菌又は藍藻とも呼ばれるシアノバクテリアは、真正細菌の一群であり、光合成により水を分解して酸素を産生し、得られたエネルギーにより空気中のCO2を固定する。なお、シアノバクテリアは、種によっては、空気中の窒素(N2)も固定できる。また、シアノバクテリアの特性として、生育が早く光利用効率が高いことが知られており、加えてその他の藻類種と比較して遺伝子操作が容易であるので、光合成微生物の中でもシアノバクテリアの利用に関して活発な研究開発が行われている。上述のように、シアノバクテリアを用いた物質生産の例として、エタノール(非特許文献1参照)、イソブタノール(非特許文献2参照)、アルカン類(特許文献2参照)、及び脂肪酸(特許文献1参照)等の燃料の生産が報告されている。
(Findings on which this disclosure is based)
Cyanobacteria, also called cyanobacteria or cyanobacteria, are a group of eubacteria that split water through photosynthesis to produce oxygen and use the energy obtained to fix CO 2 in the air. Depending on the species, cyanobacteria can also fix nitrogen (N 2 ) in the air. In addition, cyanobacteria are known to grow quickly and use light efficiently as a characteristic of cyanobacteria. Active research and development is taking place. As described above, examples of substance production using cyanobacteria include ethanol (see Non-Patent Document 1), isobutanol (see Non-Patent Document 2), alkanes (see Patent Document 2), and fatty acids (Patent Document 1). See) and other fuel production has been reported.

シアノバクテリアを用いた生物の栄養源となる物質の生産に関する研究開発も行われている。例えば、タンパク質は生物にしか合成できないので、簡便に、かつ、効率良くタンパク質を生産するために用いる生物種の1つとして、光エネルギーと大気中のCO2を利用する光合成微生物が有用であると考えられている。 Research and development related to the production of substances that serve as nutrients for organisms using cyanobacteria is also being conducted. For example, since proteins can only be synthesized by living organisms, photosynthetic microorganisms that utilize light energy and CO 2 in the atmosphere are useful as one biological species that can be used to produce proteins easily and efficiently. It is considered.

例えば、非特許文献3には、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803株を用いたタンパク質の生産方法が記載されている。当該文献では、エチレン合成酵素の遺伝子の転写を高効率で活性化させるためのプロモーターの塩基配列と、翻訳を増強するためのリボソーム結合配列とが開示されている。 For example, Non-Patent Document 3 describes a protein production method using the cyanobacterial Synechocystis sp. PCC6803 strain. This document discloses a promoter nucleotide sequence for activating transcription of the ethylene synthase gene with high efficiency and a ribosome binding sequence for enhancing translation.

非特許文献4には、Synechocystis sp. PCC6803株を宿主として組み換えタンパク質を発現させる場合において、本株が保持するプラスミド上のNS-pCC2領域にタンパク質をコードする遺伝子を挿入する手法が開示されている。当該手法を用いることで、染色体DNA(deoxyribonucleic acid)上に当該遺伝子を挿入した場合と比較して組み換えタンパク質の発現効率が約14倍に向上することが報告されている。 Non-Patent Document 4 discloses a method of inserting a gene encoding a protein into the NS-pCC2 region of a plasmid carried by this strain when expressing a recombinant protein using the Synechocystis sp. PCC6803 strain as a host. . It has been reported that the expression efficiency of the recombinant protein is improved by about 14 times compared with the case where the gene is inserted onto chromosomal DNA (deoxyribonucleic acid) by using the technique.

しかしながら、上述した従来技術では、タンパク質がPCC6803株の菌体内で産生されたタンパク質を回収するために、PCC6803株の菌体を破砕する必要がある。そのため、タンパク質の回収に手間がかかる。また、菌体内には様々な物質が存在するため、それらの物質を除去して、目的のタンパク質を精製することが必要となる場合がある。そのため、タンパク質の回収率が低くなる。また、タンパク質の生産の度に、新たな菌株を準備する必要があるため、手間がかかり、生産コストも嵩む。このように、上述した従来技術では、シアノバクテリアを用いたタンパク質の生産効率は未だ低いレベルであり、より生産効率の高い技術の開発が望まれている。 However, in the conventional technology described above, it is necessary to disrupt the cells of the PCC6803 strain in order to recover the proteins produced in the cells of the PCC6803 strain. Therefore, it takes time and effort to recover the protein. In addition, since various substances are present in the cells, it may be necessary to remove these substances and purify the target protein. Therefore, protein recovery is low. Moreover, since it is necessary to prepare a new strain each time protein is produced, it takes time and effort, and the production cost also increases. As described above, in the above-described prior art, the efficiency of protein production using cyanobacteria is still at a low level, and the development of techniques with higher production efficiency is desired.

シアノバクテリアの細胞壁及び細胞膜の構造はタンパク質透過性を左右するが、細胞膜および細胞壁構造を人為的に改変してタンパク質分泌生産能力を向上させることは容易ではない。例えば、非特許文献5及び非特許文献6には、外膜と細胞壁の接着に関与し、細胞表層の構造的安定性に寄与するslr1841遺伝子又はslr0688遺伝子を欠損させると、細胞の増殖能力が失われることが記載されている。 The structure of the cell wall and cell membrane of cyanobacteria affects protein permeability, but it is not easy to artificially modify the cell membrane and cell wall structure to improve the protein secretion production capacity. For example, Non-Patent Documents 5 and 6 disclose that deletion of the slr1841 gene or slr0688 gene, which is involved in adhesion between the outer membrane and the cell wall and contributes to the structural stability of the cell surface layer, results in loss of cell proliferation ability. It is stated that

そこで、本発明者らは、シアノバクテリア細胞の増殖能力を維持したまま、タンパク質等の有機物の生産能力を高める細胞膜及び細胞壁の最適な構造改変方法を鋭意検討した。その結果、シアノバクテリアの外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量を親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に抑制することにより、菌体内で産生された有機物が菌体外に分泌されやすくなることを見出した。このような改変がなされた改変シアノバクテリアの使用により、シアノバクテリアの菌体を破砕することなく、菌体外に分泌されたタンパク質等の有機物を効率よく回収できる。また、タンパク質等の有機物を回収した後も、継続してシアノバクテリアを使用することができるので、有機物の生産効率が高くなりやすい。 Accordingly, the present inventors diligently studied methods for optimally modifying the structure of cell membranes and cell walls to enhance the ability to produce organic substances such as proteins while maintaining the growth ability of cyanobacterial cells. As a result, by suppressing the total amount of proteins involved in the binding between the outer membrane and the cell wall of cyanobacteria to 30% to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain, the organic substances produced in the cells are released outside the cells. It was found that it is easily secreted. By using such modified cyanobacteria, it is possible to efficiently recover organic substances such as extracellularly secreted proteins without disrupting the cells of the cyanobacteria. In addition, since the cyanobacteria can be used continuously even after organic substances such as proteins are recovered, the production efficiency of organic substances tends to be high.

加えて、本発明者らは、このような改変シアノバクテリアを含むバイオフィルムを形成できれば、改変シアノバクテリアが均一に分散された培養液を用いる場合に比べて、有機物をより生産しやすくなるのではないかと考えた。そこで、改変シアノバクテリアを含むバイオフィルムを形成可能な方法につき鋭意検討し、その方法を遂に見出した。 In addition, the present inventors believe that if biofilms containing such modified cyanobacteria can be formed, it will be easier to produce organic matter than when using a culture medium in which the modified cyanobacteria are uniformly dispersed. I wondered. Therefore, we have made intensive investigations into methods capable of forming biofilms containing modified cyanobacteria, and have finally found the method.

したがって、本開示によれば、シアノバクテリアを用いた有機物の製造に有利なバイオフィルムの製造方法を提供する。また、本開示はそのようなバイオフィルムを提供する。さらに、本開示は、そのようなバイオフィルムを用いた有機物の製造方法を提供する。 Therefore, according to the present disclosure, there is provided a biofilm production method that is advantageous for producing organic matter using cyanobacteria. The present disclosure also provides such biofilms. Furthermore, the present disclosure provides methods for producing organic matter using such biofilms.

(本開示の概要)
本開示の一態様の概要は、以下の通りである。
(Summary of this disclosure)
A summary of one aspect of the disclosure follows.

本開示の第1態様に係るバイオフィルムの製造方法は、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に抑制されている改変シアノバクテリアを含む培養液を前記培養液と空気との間の気液界面が存在するように貯留することと、前記改変シアノバクテリアを前記気液界面に沿って面状に凝集させることと、を含む。 In the method for producing a biofilm according to the first aspect of the present disclosure, the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed from 30% to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain. Storing a culture solution containing cyanobacteria such that an air-liquid interface exists between the culture solution and air; and aggregating the modified cyanobacteria into a planar shape along the air-liquid interface. include.

これにより、改変シアノバクテリアでは、細胞の増殖能力が損なわれることなく、細胞壁と外膜との結合が部分的に低下し、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。結合とは、結合量及び結合力を意味する。そのため、菌体内で産生されたタンパク質等の有機物が外膜の外、つまり、菌体外に漏出しやすくなる。したがって、第1態様に係る改変シアノバクテリアによれば、タンパク質等の有機物の分泌生産性が向上したシアノバクテリアを提供できる。また、第1態様に係る改変シアノバクテリアによれば、菌体を破砕してタンパク質等の有機物を回収する必要がないので、有機物を回収した後でも、改変シアノバクテリアを繰り返し使用して有機物を産生させることができる。外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の30%未満に抑制されると細胞の増殖能力が損なわれてしまう。また、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の総量の70%を超えると菌体内で産生されたタンパク質を菌体外に漏出させることができない。 As a result, in the modified cyanobacteria, the binding between the cell wall and the outer membrane is partially reduced, and the outer membrane is more likely to partially detach from the cell wall, without impairing the ability of the cells to proliferate. Binding means binding amount and binding strength. Therefore, organic substances such as proteins produced in the cells tend to leak out of the outer membrane, that is, out of the cells. Therefore, according to the modified cyanobacteria according to the first aspect, it is possible to provide cyanobacteria with improved secretion productivity of organic substances such as proteins. In addition, according to the modified cyanobacteria according to the first aspect, it is not necessary to crush the cells to recover organic matter such as proteins. can be made If the total amount of proteins involved in the binding of the outer membrane to the cell wall is suppressed to less than 30% of the total amount of these proteins in the parent strain, the cell's ability to proliferate will be impaired. In addition, when the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall exceeds 70% of the total amount of the proteins in the parent strain, the proteins produced in the cells cannot leak out of the cells.

加えて、第1態様によれば、改変シアノバクテリアを含むバイオフィルムを製造できる。このようなバイオフィルムは、改変シアノバクテリアが均一に分散された培養液を用いる場合に比べて、有機物をより製造しやすい。改変シアノバクテリアが均一に分散された培養液を用いて有機物を製造する場合、撹拌及び通気が必要であり、培養液における細胞密度のモニタリングも必要である。加えて、培養液から有機物を回収するために培養液を収容する容器に接した別の容器が必要になり、容器の洗浄が煩雑である。このため、改変シアノバクテリアが均一に分散された培養液を用いて有機物を製造する方法では、スケールアップが難しい。一方、第1態様に係るバイオフィルムの製造方法によって製造されたバイオフィルムを用いて有機物を製造する場合、改変シアノバクテリアが均一に分散された培養液を用いて有機物を製造する場合の上記のデメリットが生じにくい。このため、第1態様に係るバイオフィルムの製造方法によって製造されたバイオフィルムは、スケールアップがしやすく、シアノバクテリアを用いた有機物の製造に有利である。 Additionally, according to the first aspect, biofilms comprising modified cyanobacteria can be produced. Such biofilms are more likely to produce organic matter than when using a culture solution in which modified cyanobacteria are uniformly dispersed. When producing an organic matter using a culture medium in which modified cyanobacteria are uniformly dispersed, agitation and aeration are required, and cell density monitoring in the culture medium is also necessary. In addition, a separate container in contact with the container containing the culture solution is required in order to recover the organic matter from the culture solution, and the cleaning of the container is complicated. Therefore, it is difficult to scale up the method of producing an organic substance using a culture solution in which modified cyanobacteria are uniformly dispersed. On the other hand, when producing an organic substance using a biofilm produced by the method for producing a biofilm according to the first aspect, the above disadvantages of producing an organic substance using a culture solution in which modified cyanobacteria are uniformly dispersed is less likely to occur. Therefore, the biofilm produced by the method for producing a biofilm according to the first aspect is easy to scale up, which is advantageous for producing organic substances using cyanobacteria.

本開示の第2態様において、第1態様に係るバイオフィルムの製造方法では、前記改変シアノバクテリアを前記気液界面に沿って面状に凝集させるときに、前記培養液に対して光が照射されてもよい。これにより、改変シアノバクテリアを培養しつつ、改変シアノバクテリアを含むバイオフィルムを製造できる。 In the second aspect of the present disclosure, in the method for producing a biofilm according to the first aspect, when the modified cyanobacteria are planarly aggregated along the air-liquid interface, the culture solution is irradiated with light. may Thereby, a biofilm containing the modified cyanobacteria can be produced while culturing the modified cyanobacteria.

本開示の第3態様において、第1態様又は第2態様に係るバイオフィルムの製造方法では、前記改変シアノバクテリアを前記気液界面に沿って面状に凝集させるときに、前記培養液において前記改変シアノバクテリアは静置培養されていてもよい。これにより、改変シアノバクテリアが気液界面に沿って面状に凝集しやすい。 In the third aspect of the present disclosure, in the method for producing a biofilm according to the first aspect or the second aspect, when the modified cyanobacteria are planarly aggregated along the air-liquid interface, the modified The cyanobacteria may be statically cultured. This makes it easier for the modified cyanobacteria to aggregate in a plane along the gas-liquid interface.

本開示の第4態様において、第1態様から第3態様のいずれか1つの態様に係るバイオフィルムの製造方法では、前記培養液のpHは、例えば6.5以上8.4以下であってもよい。これにより、改変シアノバクテリアが気液界面に沿って面状に凝集しやすい。 In the fourth aspect of the present disclosure, in the biofilm production method according to any one aspect of the first to third aspects, the pH of the culture solution is, for example, 6.5 or more and 8.4 or less. good. This makes it easier for the modified cyanobacteria to aggregate in a plane along the gas-liquid interface.

本開示の第5態様において、第1態様から第4態様のいずれか1つの態様に係るバイオフィルムの製造方法では、前記タンパク質は、Surface Layer Homology(SLH)ドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素の少なくとも1つであってもよい。細胞壁-ピルビン酸修飾酵素は、細胞壁の表面の結合糖鎖をピルビン酸修飾する反応を触媒する酵素である。これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、細胞壁と結合するSLHドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁の表面の結合糖鎖をピルビン酸修飾する反応を触媒する酵素の少なくとも1つの機能が抑制されている。もしくは、SLHドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素の少なくとも1つの発現が抑制される。そのため、外膜中のSLHドメイン保持型外膜タンパク質のSLHドメインと、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖との結合が低下する。結合は、結合量及び結合力を意味する。これにより、外膜と細胞壁との結合が弱まった部分において外膜が細胞壁から脱離しやすくなる。したがって、菌体内で産生されたタンパク質等の有機物が菌体外に漏出しやすくなる。 In the fifth aspect of the present disclosure, in the method for producing a biofilm according to any one of the first to fourth aspects, the protein is a Surface Layer Homology (SLH) domain-retaining outer membrane protein, and a cell wall - at least one pyruvate modifying enzyme. A cell wall-pyruvate-modifying enzyme is an enzyme that catalyzes a reaction that modifies sugar chains bound to the cell wall surface with pyruvate. As a result, in the modified cyanobacteria, for example, at least one function of an SLH domain-retaining outer membrane protein that binds to the cell wall and an enzyme that catalyzes a reaction that catalyzes pyruvic acid modification of sugar chains bound to the surface of the cell wall is suppressed. Alternatively, expression of at least one of an SLH domain-retaining outer membrane protein and a cell wall-pyruvate modifying enzyme is suppressed. Therefore, the binding between the SLH domain of the SLH domain-retaining outer membrane protein in the outer membrane and the covalent sugar chain on the surface of the cell wall is reduced. Binding means binding amount and binding strength. This makes it easier for the outer membrane to detach from the cell wall at the portion where the bond between the outer membrane and the cell wall is weakened. Therefore, organic substances such as proteins produced within the cells are likely to leak out of the cells.

本開示の第6態様に係るバイオフィルムは、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に抑制されている改変シアノバクテリアを含む。 The biofilm according to the sixth aspect of the present disclosure is a modified cyanobacterium in which the total amount of proteins involved in binding the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed to 30% to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain. include.

本開示の第7態様において、第6態様に係るバイオフィルムは、培養液と空気との間の気液界面に沿って配置されていてもよい。 In a seventh aspect of the present disclosure, the biofilm according to the sixth aspect may be arranged along an air-liquid interface between the culture medium and the air.

本開示の第8態様に係る有機物の製造方法は、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に抑制されている改変シアノバクテリアを含むバイオフィルムの前記改変シアノバクテリアにおける前記改変シアノバクテリアにおいて有機物を産生し、前記有機物を前記改変シアノバクテリアの外部に分泌させることを含む。 In the method for producing an organic substance according to the eighth aspect of the present disclosure, the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed from 30% to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain. Producing organic matter in said modified cyanobacteria in said modified cyanobacteria of a biofilm containing bacteria and secreting said organic matter to the outside of said modified cyanobacteria.

本開示の第9態様において、前記バイオフィルムは、培養液と空気との間の気液界面に沿って配置されていてもよい。 In the ninth aspect of the present disclosure, the biofilm may be arranged along an air-liquid interface between the medium and the air.

以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present disclosure will be specifically described with reference to the drawings.

なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、材料、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、本開示を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。 It should be noted that the embodiments described below are all comprehensive or specific examples. Numerical values, materials, steps, order of steps, and the like shown in the following embodiments are examples and are not intended to limit the present disclosure. In addition, among the constituent elements in the following embodiments, constituent elements that are not described in independent claims representing the highest concept will be described as arbitrary constituent elements.

また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化される場合がある。 Also, each figure is not necessarily strictly illustrated. In each figure, substantially the same configurations are denoted by the same reference numerals, and redundant description may be omitted or simplified.

また、以下において、数値範囲は、厳密な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば、タンパク質の数及び濃度等の量又はその範囲を計測することによって特定されるものなどを含む。 In addition, hereinafter, the numerical range does not represent only a strict meaning, but a substantially equivalent range, such as those specified by measuring the amount or range such as the number and concentration of proteins include.

また、本明細書では、菌体及び細胞は、いずれも1つのシアノバクテリアの個体を表す。 Also, in this specification, both fungal bodies and cells represent a single cyanobacterial individual.

(実施の形態)
[1.定義]
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)アルゴリズムによって計算される。具体的には、National Center for Biotechnology Information(NCBI)のウェブサイト(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)で利用できるBLASTプログラムにてペアワイズ解析を行うことにより算出される。シアノバクテリアの遺伝子及び当該遺伝子がコードするタンパク質に関する情報は、例えば上述のNCBIデータベース及びCyanobase(http://genome.microbedb.jp/cyanobase/)において公開されている。これらのデータベースから、目的のタンパク質のアミノ酸配列及びそれらのタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を取得できる。
(Embodiment)
[1. definition]
As used herein, the identity of nucleotide sequences and amino acid sequences is calculated by the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) algorithm. Specifically, it was calculated by performing pairwise analysis with the BLAST program available on the National Center for Biotechnology Information (NCBI) website (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). be. Information on cyanobacterial genes and proteins encoded by the genes are published, for example, in the above-mentioned NCBI database and Cyanobase (http://genome.microbedb.jp/cyanobase/). From these databases, the amino acid sequences of the proteins of interest and the base sequences of the genes encoding those proteins can be obtained.

シアノバクテリアは、藍藻又は藍色細菌とも呼ばれ、クロロフィルで光エネルギーを捕集して得たエネルギーで水を電気分解して酸素を発生しながら、光合成をおこなう原核生物の一群である。シアノバクテリアは、多様性に富んでおり、例えば、細胞形状ではSynechocystis sp. PCC 6803のような単細胞性の種及びAnabaena sp. PCC 7120のような多細胞が連なった糸状性の種がある。生育環境についても、Thermosynechococcus elongatusのような好熱性の種、Synechococcus elongatusのような海洋性の種、Synechocystisのような淡水性の種がある。また、Microcystis aeruginosaのようにガス小胞を持ち毒素を産生する種、及び、チラコイドを持たずに原形質膜に集光アンテナであるフィコビリソームと呼ばれるタンパク質を有するGloeobacter violaceusのように、独自の特徴をもつ種も多数挙げられる。 Cyanobacteria, also called cyanobacteria or cyanobacteria, are a group of prokaryotic organisms that perform photosynthesis while generating oxygen by electrolyzing water with energy obtained by capturing light energy with chlorophyll. Cyanobacteria are rich in diversity, and in terms of cell shape, for example, there are unicellular species such as Synechocystis sp. PCC 6803 and filamentous species such as Anabaena sp. As for habitat, there are thermophilic species such as Thermosynechococcus elongatus, marine species such as Synechococcus elongatus, and freshwater species such as Synechocystis. Other species, such as Microcystis aeruginosa, which have gas vesicles and produce toxins, and Gloeobacter violaceus, which lacks thylakoids but have proteins called phycobilisomes, which are light-harvesting antennas in the plasma membrane, have unique characteristics. Many species are also included.

図1は、シアノバクテリアの細胞表層を模式的に示した図である。図1に示されるように、シアノバクテリアの細胞表層は、内側から順に、原形質膜1、ペプチドグリカン2、及び外膜5で構成されている。原形質膜1は、内膜1とも呼ばれる。外膜5は、細胞最外層を形成する脂質膜である。ペプチドグリカン2には、グルコサミン及びマンノサミンなどで構成される糖鎖3が共有結合している。これらの共有結合型の糖鎖3には、ピルビン酸が結合している(非特許文献7参照)。本明細書では、ペプチドグリカン2と共有結合型の糖鎖3とを含めて細胞壁4と呼ぶ。また、原形質膜1、つまり内膜1と、外膜5との間隙は、ペリプラズムと呼ばれる。この間隙には、タンパク質の分解又は立体構造の形成、脂質又は核酸の分解、若しくは、細胞外の栄養素の取り込み等の事象に関与する様々な酵素が存在する。 FIG. 1 is a diagram schematically showing the cell surface layer of cyanobacteria. As shown in FIG. 1, the cell surface layer of cyanobacteria is composed of plasma membrane 1, peptidoglycan 2, and outer membrane 5 in order from the inside. The plasma membrane 1 is also called the inner membrane 1 . Outer membrane 5 is a lipid membrane that forms the outermost layer of the cell. Peptidoglycan 2 is covalently bound to sugar chain 3 composed of glucosamine, mannosamine, and the like. Pyruvate is bound to these covalent sugar chains 3 (see Non-Patent Document 7). In the present specification, the cell wall 4 including the peptidoglycan 2 and the covalent sugar chain 3 is referred to. The space between the plasma membrane 1, that is, the inner membrane 1, and the outer membrane 5 is called the periplasm. Various enzymes involved in events such as protein degradation or conformation formation, lipid or nucleic acid degradation, or extracellular nutrient uptake are present in this space.

図1に示すSlr1841等のSLHドメイン保持型外膜タンパク質は、外膜5である脂質膜に埋め込まれたC末端側領域と、脂質膜から突き出したN末端側のSLHドメイン7からなる。このSLHドメイン保持型外膜タンパク質は、シアノバクテリア及びグラム陰性細菌の一群であるNegativicutes綱に属する細菌において広く分布している(非特許文献8参照)。外膜5である脂質膜に埋め込まれた領域は、親水性物質の外膜透過を可能にするためのチャネルを形成する。一方で、この領域は、SLHドメイン7は細胞壁4に結合する機能をもつ(非特許文献9参照)。SLHドメイン7が細胞壁4に結合するためには、ペプチドグリカン2における共有結合型の糖鎖3がピルビン酸で修飾されている必要がある(非特許文献10参照)。SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子の例としては、Synechocystis sp. PCC 6803が保持するslr1841若しくはslr1908、又はAnabaena sp. 90が保持するoprB等が挙げられる。 SLH domain-retaining outer membrane proteins such as Slr1841 shown in FIG. 1 consist of a C-terminal region embedded in the lipid membrane, which is the outer membrane 5, and an N-terminal SLH domain 7 protruding from the lipid membrane. This SLH domain-retaining outer membrane protein is widely distributed in bacteria belonging to the Negativicutes class, which is a group of cyanobacteria and Gram-negative bacteria (see Non-Patent Document 8). The region embedded in the lipid membrane, which is the outer membrane 5, forms a channel to allow hydrophilic substances to permeate the outer membrane. On the other hand, SLH domain 7 has a function of binding to cell wall 4 in this region (see Non-Patent Document 9). In order for SLH domain 7 to bind to cell wall 4, covalent sugar chain 3 in peptidoglycan 2 must be modified with pyruvate (see Non-Patent Document 10). Examples of genes encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 include slr1841 or slr1908 retained by Synechocystis sp. PCC 6803, and oprB retained by Anabaena sp.

ペプチドグリカン2における共有結合型の糖鎖3のピルビン酸修飾反応を触媒する酵素を、以下、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9と呼ぶ。細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9は、グラム陽性菌であるBacillus anthracisにおいて同定され、CsaBと命名されている(非特許文献11参照)。ゲノム塩基配列が公開されているシアノバクテリアにおいて、多くの種がCsaBとアミノ酸配列の同一性が30%以上となる相同タンパク質をコードする遺伝子を保持している。その遺伝子の例としては、Synechocystis sp. PCC 6803が保持するslr0688又はSynechococcus sp. 7502が保持するsynpcc7502_03092等が挙げられる。 An enzyme that catalyzes the pyruvate modification reaction of the covalent sugar chain 3 in peptidoglycan 2 is hereinafter referred to as cell wall-pyruvate modification enzyme 9 . A cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 was identified in the Gram-positive bacterium Bacillus anthracis and named CsaB (see Non-Patent Document 11). Among cyanobacteria whose genome nucleotide sequences have been published, many species possess genes encoding homologous proteins having an amino acid sequence identity of 30% or more with CsaB. Examples of such genes include slr0688 retained by Synechocystis sp. PCC 6803 and synpcc7502_03092 retained by Synechococcus sp. 7502.

シアノバクテリアでは、光合成により固定されたCO2が多段階の酵素反応を経て各種アミノ酸に変換される。それらのアミノ酸を原料として、シアノバクテリアの細胞質内でタンパク質が合成される。それらのタンパク質の中には、細胞質内で機能するタンパク質もあるし、細胞質からペリプラズムに輸送されてペリプラズム内で機能するタンパク質もある。しかしながら、細胞外にタンパク質を積極的に分泌するシアノバクテリアは現在のところ報告されていない。 In cyanobacteria, CO 2 fixed by photosynthesis is converted into various amino acids through multistep enzymatic reactions. Using these amino acids as raw materials, proteins are synthesized in the cytoplasm of cyanobacteria. Some of these proteins function within the cytoplasm, while others are transported from the cytoplasm to the periplasm and function within the periplasm. However, no cyanobacteria that actively secrete proteins outside the cell have been reported so far.

シアノバクテリアは、高い光合成能力を有するので、必ずしも有機物を栄養分として外から取り込む必要がない。そのため、シアノバクテリアは、図1に示すSlr1270等の有機物チャネルタンパク質8のように、有機物を透過させるチャネルタンパク質を外膜5に非常にわずかにしか有していない。例えば、Synechocystis sp. PCC 6803では、有機物を透過させる有機物チャネルタンパク質8は、外膜5の総タンパク質量の約4%しか存在しない。一方、シアノバクテリアは、生育に必要な無機イオン類を高効率で細胞内に取り込むために、図1に示すSlr1841等のSLHドメイン保持型外膜タンパク質6のように、無機イオン類のみを透過させるイオンチャネルタンパク質を外膜5に多く有する。例えば、Synechocystis sp. PCC 6803では、無機イオンを透過させるイオンチャネルタンパク質は、外膜5の総タンパク質量の約80%を占める。 Since cyanobacteria have high photosynthetic ability, they do not necessarily need to take in organic matter from the outside as nutrients. Therefore, cyanobacteria have very few channel proteins permeable to organic matter in the outer membrane 5, such as the organic matter channel protein 8 such as Slr1270 shown in FIG. For example, in Synechocystis sp. PCC 6803, organic matter channel protein 8, which allows organic matter to permeate, is present in only about 4% of the total protein content of outer membrane 5. On the other hand, cyanobacteria allow only inorganic ions to permeate, like SLH domain-retaining outer membrane protein 6 such as Slr1841 shown in Fig. 1, in order to take in inorganic ions necessary for growth into cells with high efficiency. The outer membrane 5 has many ion channel proteins. For example, in Synechocystis sp. PCC 6803, ion channel proteins permeable to inorganic ions account for approximately 80% of the total protein content of outer membrane 5 .

このように、シアノバクテリアでは、外膜5におけるタンパク質などの有機物を透過させるチャネルが非常に少ないので、菌体内で産生された有機物を菌体外に積極的に分泌することが難しいと考えられる。また、シアノバクテリアの細胞壁及び細胞膜の構造は、タンパク質透過性を左右するが、細胞膜及び細胞壁構造を人為的に改変してタンパク質分泌生産能力を向上させることは容易ではない。例えば、非特許文献5および非特許文献6には、外膜と細胞壁との接着に関与して細胞表層の構造的安定性に寄与するslr1841遺伝子又はslr0688遺伝子を欠損させると、細胞の増殖能力が失われることが記載されている。 In this way, cyanobacteria have very few channels through which organic substances such as proteins permeate in the outer membrane 5, so it is considered difficult to positively secrete organic substances produced inside the cells to the outside of the cells. In addition, although the structure of the cell wall and cell membrane of cyanobacteria affects protein permeability, it is not easy to artificially modify the cell membrane and cell wall structure to improve the protein secretion production capacity. For example, in Non-Patent Documents 5 and 6, deletion of the slr1841 gene or slr0688 gene, which is involved in adhesion between the outer membrane and the cell wall and contributes to the structural stability of the cell surface layer, increases the cell proliferation ability. stated to be lost.

[2.改変シアノバクテリア]
本実施の形態に係る改変シアノバクテリアについて図1を参照しながら説明する。
[2. modified cyanobacteria]
The modified cyanobacteria according to this embodiment will be described with reference to FIG.

本実施の形態に係る改変シアノバクテリアは、シアノバクテリアにおいて外膜5と細胞壁4との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の30から70%に抑制されている。このタンパク質を、以下、結合関連タンパク質ともいう。ここで、例えば、「結合関連タンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の30%に抑制されている」とは、親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に相当するタンパク質が喪失し、その総量の30%から70%に相当するタンパク質が残存している状態のことを意味する。これにより、改変シアノバクテリアでは、外膜5と細胞壁4との結合が部分的に低下するので、外膜5が細胞壁4から部分的に脱離しやすくなる。結合の高低は、例えば、結合量及び結合力によって特定されうる。改変シアノバクテリアでは、菌体内で産生されたタンパク質等の有機物を菌体外に分泌する有機物の分泌生産性が向上する。また、菌体を破砕して有機物を回収する必要がないので、タンパク質等の有機物を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用して有機物を産生させることができる。なお、本明細書では、改変シアノバクテリアが菌体内でタンパク質を作り出すことを産生といい、産生されたタンパク質等の有機物を菌体外に分泌することを分泌生産という。 In the modified cyanobacteria according to the present embodiment, the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 in cyanobacteria is suppressed to 30 to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain. This protein is hereinafter also referred to as binding-associated protein. Here, for example, "the total amount of the binding-related protein is suppressed to 30% of the total amount of the protein in the parent strain" means that the protein corresponding to 30% to 70% of the total amount of the protein in the parent strain is lost. , means a state in which protein corresponding to 30% to 70% of the total amount remains. As a result, in the modified cyanobacteria, the binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 is partially reduced, so that the outer membrane 5 becomes easier to partially detach from the cell wall 4 . The level of binding can be specified, for example, by the amount and strength of binding. In the modified cyanobacteria, the productivity of secretion of organic substances such as proteins produced in the cells is improved. In addition, since it is not necessary to crush the cells to recover the organic matter, the modified cyanobacteria can be repeatedly used to produce the organic matter even after the organic matter such as proteins has been recovered. In the present specification, production by a modified cyanobacterium to produce a protein inside the cell is referred to as production, and secretion of an organic substance such as the produced protein to the outside of the cell is referred to as secretory production.

外膜5と細胞壁4との結合に関与するタンパク質は、例えば、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9の少なくとも1つであってもよい。本実施の形態では、改変シアノバクテリアは、例えば、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9の少なくとも1つのタンパク質の機能が抑制されている。例えば、改変シアノバクテリアでは、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9の少なくとも1つの機能が抑制されていてもよい。もしくは、細胞壁4と結合するSLHドメイン保持型外膜タンパク質6の発現、及び、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9の発現の少なくとも1つが抑制されてもよい。これにより、外膜5におけるSLHドメイン保持型外膜タンパク質6のSLHドメイン7と細胞壁4の表面の共有結合型の糖鎖3との結合、つまり、その結合の結合量及び結合力が低下する。そのため、これらの結合が弱まった部分において外膜5が細胞壁4から脱離しやすくなる。外膜5が細胞壁4から部分的に脱離することにより、改変シアノバクテリアの細胞内、特にペリプラズムに存在するタンパク質等の有機物が、細胞の外である外膜5の外へ漏出しやすくなる。 The protein involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 may be at least one of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9, for example. In the present embodiment, in the modified cyanobacterium, for example, the function of at least one of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is suppressed. For example, in modified cyanobacteria, at least one function of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be suppressed. Alternatively, at least one of the expression of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 that binds to the cell wall 4 and the expression of the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be suppressed. As a result, the bond between the SLH domain 7 of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5 and the covalent sugar chain 3 on the surface of the cell wall 4, that is, the amount and strength of the bond is reduced. Therefore, the outer membrane 5 is easily detached from the cell wall 4 at the portion where these bonds are weakened. Partial detachment of the outer membrane 5 from the cell wall 4 facilitates the leakage of organic matter such as proteins present in the cell of the modified cyanobacterium, particularly in the periplasm, to the outside of the outer membrane 5 outside the cell.

上述したように、シアノバクテリアは、高い光合成能力を有するので、必ずしも有機物を栄養分として外から取り込む必要がない。そのため、シアノバクテリアの培養には、光、空気、水、及び微量の無機物があればよく、シアノバクテリアは、外膜5のイオンチャネルを通じて細胞内に無機物を取り込み、細胞内でタンパク質等の有機物を産生する。特に、外膜5と細胞壁4との間の空隙のペリプラズムには種々のタンパク質等の有機物が存在している。本実施の形態に係る改変シアノバクテリアでは、外膜5と細胞壁4との結合に関与するタンパク質の機能が抑制されている。その結果、外膜5が細胞壁4から部分的に剥離し易くなる。そして、外膜5の剥離部分から、ペリプラズム内のタンパク質等の有機物が培養液中に漏出する。これにより、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生されたタンパク質を菌体外に分泌するタンパク質の分泌生産性が高い。 As described above, cyanobacteria have high photosynthetic ability, so they do not necessarily need to take in organic matter from the outside as nutrients. Therefore, cyanobacteria need only be cultured with light, air, water, and a small amount of inorganic substances. produce. In particular, organic substances such as various proteins are present in the periplasm of the space between the outer membrane 5 and the cell wall 4 . In the modified cyanobacterium according to the present embodiment, the functions of proteins involved in binding between outer membrane 5 and cell wall 4 are suppressed. As a result, the outer membrane 5 becomes easier to partially peel off from the cell wall 4 . Organic matter such as proteins in the periplasm leaks into the culture solution from the exfoliated portion of the outer membrane 5 . As a result, the modified cyanobacteria have a high protein secretion productivity that secretes intracellularly produced proteins to the outside of the cells.

以下、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9の少なくとも1つの結合関連タンパク質の機能が抑制されることにより外膜5が部分的に細胞壁4から脱離するように改変されたシアノバクテリアについてより具体的に説明する。 Subsequently, the outer membrane 5 is partially detached from the cell wall 4 by suppressing the function of at least one binding-related protein of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9. cyanobacteria will be described more specifically.

本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの親微生物である親株の種類は、特定の種類に限定されず、あらゆる種類のシアノバクテリアであってもよい。親株は、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6の発現及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9の発現の少なくとも1つを抑制する前のシアノバクテリアである。本明細書では、親株を、親シアノバクテリアともいう。親シアノバクテリアは、Syenechocystis属であってもよく、Synechococcus属であってもよく、Anabaena属であってもよく、Thermosynechococcus属であってもよい。これら中でも、親シアノバクテリアは、Synechocystis sp. PCC 6803、Synechococcus sp. PCC 7942、又はThermosynechococcus elongatus BP-1であってもよい。親株は、結合関連タンパク質の総量を30%から70%に抑制する前のシアノバクテリアであれば、野生のものであってもよいし、改変したものであって、野生のものと同等の結合関連タンパク質を有するものであってもよい。 The type of the parent strain, which is the parent microorganism of the modified cyanobacterium according to the present embodiment, is not limited to a specific type, and may be any type of cyanobacterium. The parental strain is a cyanobacterium before at least one of expression of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and expression of cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is repressed. Parental strains are also referred to herein as parental cyanobacteria. The parent cyanobacterium may be of the genera Syenechocystis, Synechococcus, Anabaena, or Thermosynechococcus. Among these, the parent cyanobacterium may be Synechocystis sp. PCC 6803, Synechococcus sp. PCC 7942, or Thermosynechococcus elongatus BP-1. The parental strain can be wild or modified, as long as it is a cyanobacterium prior to suppressing the total amount of binding-associated proteins from 30% to 70%, and has binding associations equivalent to those in the wild. It may have protein.

これらの親シアノバクテリアにおけるSLHドメイン保持型外膜タンパク質6及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9のアミノ酸配列は、上述のNCBIデータベース及びCyanobaseで確認できる。加えて、それらの結合関連タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、及び、当該遺伝子の染色体DNA又はプラスミド上での位置も、上述のNCBIデータベース及びCyanobaseで確認できる。 The amino acid sequences of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 in these parent cyanobacteria can be found in the NCBI database and Cyanobase mentioned above. In addition, the nucleotide sequences of genes encoding these binding-related proteins and the locations of the genes on chromosomal DNA or plasmids can also be confirmed with the above-mentioned NCBI database and Cyanobase.

改変シアノバクテリアにおいて機能が抑制されるSLHドメイン保持型外膜タンパク質6及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9は、親シアノバクテリアが保有しているものである限り、いずれの親シアノバクテリアのものであってもよい。改変シアノバクテリアにおいて機能が抑制されるSLHドメイン保持型外膜タンパク質6及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9は、それらをコードする遺伝子の存在場所、例えば、染色体DNA上又はプラスミド上における存在場所により制限されない。 The SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 whose functions are suppressed in the modified cyanobacteria may be of any parent cyanobacterium as long as they are possessed by the parent cyanobacterium. good too. SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9, whose functions are suppressed in modified cyanobacteria, are not restricted by the location of genes encoding them, for example, on chromosomal DNA or plasmids. .

例えば、親シアノバクテリアがSyenchocystis属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6は、Slr1841、Slr1908、又はSlr0042等であってもよい。親シアノバクテリアがSynechococcus属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6はNIES970_09470等であってもよい。親シアノバクテリアがAnabaena属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6はAnacy_5815又はAnacy_3458等であってもよい。親シアノバクテリアがMicrocystis属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6はA0A0F6U6F8_MICAE等であってもよい。親シアノバクテリアがCyanothese属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6はA0A3B8XX12_9CYAN等であってもよい。親シアノバクテリアがLeptolyngbya属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6はA0A1Q8ZE23_9CYAN等であってもよい。親シアノバクテリアがCalothrix属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6はA0A1Z4R6U0_9CYAN等であってもよい。親シアノバクテリアがNostoc属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6はA0A1C0VG86_9NOSO等であってもよい。親シアノバクテリアがCrocosphaera属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6はB1WRN6_CROS5等であってもよい。親シアノバクテリアがPleurocapsa属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6はK9TAE4_9CYAN等であってもよい。 For example, when the parent cyanobacterium is of the genus Synchocystis, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be Slr1841, Slr1908, Slr0042, or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechococcus, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be NIES970_09470 or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Anabaena, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be Anacy_5815, Anacy_3458, or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Microcystis, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be A0A0F6U6F8_MICAE or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Cyanothese, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be A0A3B8XX12_9CYAN or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Leptolyngbya, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be A0A1Q8ZE23_9CYAN or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Calothrix, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be A0A1Z4R6U0_9CYAN or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Nostoc, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be A0A1C0VG86_9NOSO or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Crocosphaera, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be B1WRN6_CROS5 or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Pleurocapsa, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be K9TAE4_9CYAN or the like.

より具体的には、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6は、例えば、Synechocystis sp. PCC 6803のSlr1841(配列番号1)、Synechococcus sp. NIES-970のNIES970_09470(配列番号2)、又はAnabaena cylindrica PCC 7122 のAnacy_3458(配列番号3)等であってもよい。また、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6は、これらのSLHドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が50%以上同一であるタンパク質であってもよい。 More specifically, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 is, for example, Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1841 (SEQ ID NO: 1), Synechococcus sp. Anacy_3458 (SEQ ID NO: 3), etc. may be used. Moreover, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be a protein having 50% or more of the same amino acid sequence as these SLH domain-retaining outer membrane proteins.

改変シアノバクテリアでは、例えば、上記の配列番号1から3で示されるいずれかのSLHドメイン保持型外膜タンパク質6又はこれらのいずれかのSLHドメイン保持型外膜タンパク質6とアミノ酸配列が50%以上同一であるタンパク質の機能が抑制されていてもよい。もしくは、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号1から3で示されるいずれかのSLHドメイン保持型外膜タンパク質6又はこれらのいずれかのSLHドメイン保持型外膜タンパク質6とアミノ酸配列が50%以上同一であるタンパク質の発現が抑制されていてもよい。そのため、改変シアノバクテリアでは、外膜5におけるSLHドメイン保持型外膜タンパク質6又はSLHドメイン保持型外膜タンパク質6と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制される。もしくは、外膜5における、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6又はSLHドメイン保持型外膜タンパク質6と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低下する。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアでは、SLHドメイン7のように外膜5が細胞壁4と結合するための結合ドメインが細胞壁4と結合する結合量及び結合力が低下し、外膜5が細胞壁4から部分的に脱離しやすい。 In the modified cyanobacteria, for example, any SLH domain-retaining outer membrane protein 6 shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 above or any of these SLH domain-retaining outer membrane proteins 6 has an amino acid sequence identical to 50% or more. The function of the protein may be suppressed. Alternatively, in modified cyanobacteria, the amino acid sequence is 50% or more identical to any of the SLH domain-retaining outer membrane proteins 6 shown in SEQ ID NOS: 1 to 3 above, or any of these SLH domain-retaining outer membrane proteins 6. The expression of the protein may be suppressed. Therefore, in the modified cyanobacteria, the function of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5 or a protein having a function equivalent to that of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 is suppressed. Alternatively, the expression level of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 or a protein having a function equivalent to that of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5 is decreased. Therefore, in the modified cyanobacterium according to the present embodiment, the binding amount and binding strength of the binding domain for binding the outer membrane 5 to the cell wall 4, such as the SLH domain 7, with the cell wall 4 are reduced. tends to partially detach from the cell wall 4.

一般に、異なる種類のタンパク質において、タンパク質のアミノ酸配列が30%以上同一であれば、それらのタンパク質の立体構造の相同性が高く、それらのタンパク質は、互いに同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、機能が抑制されるSLHドメイン保持型外膜タンパク質6は、例えば、上記の配列番号1から3で示されるSLHドメイン保持型外膜タンパク質のいずれかのアミノ酸配列と40%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。加えて、そのSLHドメイン保持型外膜タンパク質6は、細胞壁4の糖鎖3と結合する機能を有するタンパク質又はポリペプチドでありうる。SLHドメイン保持型外膜タンパク質6のアミノ酸配列と、上記の配列番号1から3で示されるSLHドメイン保持型外膜タンパク質のいずれかのアミノ酸配列との同一性は、望ましくは50%以上である。その同一性は、より望ましくは60%以上であり、さらに望ましくは70%以上であり、特に望ましくは80%以上であり、とりわけ望ましくは90%以上である。アミノ酸配列の同一性は、全体のアミノ酸配列の数に対する同一のアミノ酸配列の数の比によって評価されうる。 In general, if the amino acid sequences of different kinds of proteins are 30% or more identical, it is said that there is a high degree of homology in the three-dimensional structures of these proteins, and that these proteins are highly likely to have the same functions as each other. It is Therefore, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 whose function is suppressed has, for example, 40% or more identity with any of the amino acid sequences of the SLH domain-retaining outer membrane proteins shown in SEQ ID NOS: 1 to 3 above. has an amino acid sequence with In addition, the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 can be a protein or polypeptide that has a function of binding to the sugar chain 3 on the cell wall 4 . The identity of the amino acid sequence of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 with any of the amino acid sequences of SLH domain-retaining outer membrane proteins shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 above is desirably 50% or more. The identity is more preferably 60% or higher, still more preferably 70% or higher, particularly preferably 80% or higher, particularly preferably 90% or higher. Amino acid sequence identity can be evaluated by the ratio of the number of identical amino acid sequences to the total number of amino acid sequences.

また、例えば、親シアノバクテリアがSyenchocystis属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9はSlr0688等であってもよい。親シアノバクテリアがSynechococcus属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9はSyn7502_03092又はSynpcc7942_1529等であってもよい。親シアノバクテリアがAnabaena属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9はANA_C20348又はAnacy_1623等であってもよい。親シアノバクテリアがMicrocystis属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9はCsaB (NCBIのアクセスID:TRU80220)等であってもよい。親シアノバクテリアがCyanothese属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9はCsaB(NCBIのアクセスID:WP_107667006.1)等であってもよい。親シアノバクテリアがSpirulina属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9はCsaB(NCBIのアクセスID:WP_026079530.1)等であってもよい。親シアノバクテリアがCalothrix属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9はCsaB(NCBIのアクセスID:WP_096658142.1)等であってもよい。親シアノバクテリアがNostoc属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9はCsaB(NCBIのアクセスID:WP_099068528.1)等であってもよい。親シアノバクテリアがCrocosphaera属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9はCsaB(NCBIのアクセスID:WP_012361697.1)等であってもよい。親シアノバクテリアがPleurocapsa属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9はCsaB(NCBIのアクセスID:WP_036798735)等であってもよい。 Further, for example, when the parent cyanobacterium belongs to the genus Synenchocystis, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be Slr0688 or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Synechococcus, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be Syn7502_03092, Synpcc7942_1529, or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Anabaena, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be ANA_C20348, Anacy_1623, or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Microcystis, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be CsaB (NCBI Accession ID: TRU80220) or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Cyanothese, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be CsaB (NCBI access ID: WP_107667006.1) or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Spirulina, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be CsaB (NCBI access ID: WP_026079530.1) or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Calothrix, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be CsaB (NCBI Access ID: WP_096658142.1) or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Nostoc, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be CsaB (NCBI access ID: WP_099068528.1) or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Crocosphaera, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be CsaB (NCBI access ID: WP_012361697.1) or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Pleurocapsa, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be CsaB (NCBI access ID: WP_036798735) or the like.

より具体的には、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9は、Synechocystis sp. PCC 6803のSlr0688(配列番号4)、Synechococcus sp. PCC 7942のSynpcc7942_1529(配列番号5)、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122のAnacy_1623(配列番号6)等であってもよい。また、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9は、これらの細胞壁-ピルビン酸修飾酵素のアミノ酸配列と50%以上のアミノ酸配列が同一であるタンパク質であってもよい。 More specifically, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is Slr0688 (SEQ ID NO: 4) of Synechocystis sp. PCC 6803, Synpcc7942_1529 (SEQ ID NO: 5) of Synechococcus sp. PCC 7942, or Anacy_1623 of Anabaena cylindrica PCC 7122 ( Sequence number 6) etc. may be sufficient. Moreover, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be a protein whose amino acid sequence is 50% or more identical to that of these cell wall-pyruvate modifying enzymes.

改変シアノバクテリアでは、例えば、上記の配列番号4から6で示されるいずれかの細胞壁-ピルビン酸修飾酵素又はこれらのいずれかの細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9とアミノ酸配列が50%以上同一であるタンパク質の機能が抑制されうる。もしくは、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号4から6で示されるいずれかの細胞壁-ピルビン酸修飾酵素又はこれらのいずれかの細胞壁-ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が50%以上同一であるタンパク質の発現が抑制されうる。そのため、改変シアノバクテリアでは、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制されうる。もしくは、改変シアノバクテリアでは、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減されうる。これにより、細胞壁4の表面の共有結合型の糖鎖3がピルビン酸で修飾されにくくなるので、外膜5におけるSLHドメイン保持型外膜タンパク質6のSLHドメイン7と細胞壁4の糖鎖3とが結合する結合量及び結合力が低下する。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアでは、細胞壁4の表面の共有結合型の糖鎖3がピルビン酸で修飾されにくくなるので、細胞壁4と外膜5との結合力が弱まり、外膜5が細胞壁4から部分的に脱離しやすくなる。 In modified cyanobacteria, for example, a protein whose amino acid sequence is 50% or more identical to any of the cell wall-pyruvate modifying enzymes shown in SEQ ID NOS: 4 to 6 or any of these cell wall-pyruvate modifying enzymes 9 function can be inhibited. Alternatively, in the modified cyanobacteria, any of the cell wall-pyruvate modifying enzymes shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 above, or any of these cell wall-pyruvate modifying enzymes and proteins whose amino acid sequences are 50% or more identical Expression can be suppressed. Therefore, in modified cyanobacteria, the function of cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 or a protein having a function equivalent to this enzyme can be suppressed. Alternatively, in the modified cyanobacteria, the expression level of cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 or a protein having a function equivalent to this enzyme can be reduced. As a result, the covalent sugar chain 3 on the surface of the cell wall 4 is less likely to be modified with pyruvic acid, so that the SLH domain 7 of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5 and the sugar chain 3 on the cell wall 4 are The binding amount and binding strength are reduced. Therefore, in the modified cyanobacterium according to the present embodiment, the covalent sugar chains 3 on the surface of the cell wall 4 are less likely to be modified with pyruvic acid. 5 becomes easier to partially detach from the cell wall 4.

また、上述したとおり、異なるタンパク質においてそれらのアミノ酸配列が30%以上同一であれば、それらのタンパク質は、お互いに同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、機能が抑制される細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9は、例えば、上記の配列番号4から6で示される細胞壁-ピルビン酸修飾酵素のいずれかのアミノ酸配列と40%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。加えて、その細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9は、細胞壁4のペプチドグリカン2の共有結合型の糖鎖3をピルビン酸で修飾する反応を触媒する機能を有するタンパク質又はポリペプチドである。細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9のアミノ酸配列と、上記の配列番号4から6で示される細胞壁-ピルビン酸修飾酵素のいずれかのアミノ酸配列との同一性は、望ましくは50%以上である。その同一性は、より望ましくは60%以上であり、さらに望ましくは70%以上であり、特に望ましくは80%以上であり、とりわけ望ましくは90%以上である。 In addition, as described above, it is said that if different proteins have 30% or more of the same amino acid sequence, the proteins are highly likely to have equivalent functions. Therefore, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 whose function is suppressed is, for example, an amino acid having 40% or more identity with any of the amino acid sequences of the cell wall-pyruvate modifying enzymes shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 above. Contains arrays. In addition, the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is a protein or polypeptide that has the function of catalyzing the reaction of modifying the covalent sugar chain 3 of the peptidoglycan 2 on the cell wall 4 with pyruvate. The identity between the amino acid sequence of cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 and the amino acid sequence of any of the cell wall-pyruvate modifying enzymes shown in SEQ ID NOS: 4 to 6 above is desirably 50% or more. The identity is more preferably 60% or higher, still more preferably 70% or higher, particularly preferably 80% or higher, particularly preferably 90% or higher.

SLHドメイン保持型外膜タンパク質6の機能の抑制には、当該タンパク質の細胞壁4との結合能力の抑制、当該タンパク質の外膜5への輸送の抑制、又は、当該タンパク質が外膜5に埋め込まれて機能する能力を抑制することが含まれる。 Suppression of the function of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 includes suppression of the binding ability of the protein to the cell wall 4, suppression of transport of the protein to the outer membrane 5, or embedding of the protein in the outer membrane 5. include inhibiting the ability to function as

細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9の機能の抑制とは、当該タンパク質が細胞壁4の共有結合型の糖鎖3をピルビン酸で修飾する機能を抑制することである。 Suppression of the function of the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 means suppression of the function of the protein to modify the covalently bound sugar chain 3 of the cell wall 4 with pyruvate.

これらのタンパク質の機能を抑制する手段としては、タンパク質の機能の抑制が可能である限り特定の手段に限定されない。当該手段は、例えば、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化させるものである。当該手段は、これらの遺伝子の転写を阻害するものであってもよいし、これらの遺伝子の転写産物の翻訳を阻害するものであってもよいし、これらのタンパク質を特異的に阻害する阻害剤の投与であってもよいし、他の手段であってもよい。 Means for inhibiting the functions of these proteins are not limited to specific means as long as the protein functions can be inhibited. The means is, for example, to delete or inactivate the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 . The means may inhibit the transcription of these genes, may inhibit the translation of transcripts of these genes, or may be inhibitors that specifically inhibit these proteins. may be administered, or by other means.

本実施の形態では、改変シアノバクテリアは、外膜5と細胞壁4との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子が欠失又は不活性化されていてもよい。これにより、改変シアノバクテリアでは、細胞壁4と外膜5との結合に関与するタンパク質の発現が抑制される、又は、当該タンパク質の機能が抑制される。このため、細胞壁4と外膜5との結合、いわゆる、結合量及び結合力が部分的に低下する。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜5が細胞壁4から部分的に脱離しやすくなるので、菌体内で産生されたタンパク質等の有機物が外膜5の外、つまり、菌体外に漏出しやすい。そのため、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアは、菌体内で産生された有機物を菌体外に分泌する有機物の分泌生産性が向上する。また、菌体を破砕してタンパク質等の有機物を回収する必要がないので、有機物を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用して有機物を産生させることができる。 In the present embodiment, the modified cyanobacterium may have deleted or inactivated genes that express proteins involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 . As a result, in the modified cyanobacteria, the expression of proteins involved in binding between the cell wall 4 and the outer membrane 5 is suppressed, or the functions of the proteins are suppressed. As a result, the bond between the cell wall 4 and the outer membrane 5, that is, the amount and strength of bond, is partially reduced. As a result, in the modified cyanobacteria, the outer membrane 5 tends to partially detach from the cell wall 4, so that organic substances such as proteins produced in the cells tend to leak out of the outer membrane 5, that is, outside the cells. . Therefore, the modified cyanobacterium according to the present embodiment improves the secretory productivity of organic substances produced in the cells to the outside of the cells. In addition, since it is not necessary to crush the cells to recover organic matter such as proteins, the modified cyanobacteria can be repeatedly used to produce organic matter even after the organic matter has been recovered.

外膜5と細胞壁4との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子は、例えば、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子の少なくとも1つであってもよい。改変シアノバクテリアでは、例えば、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子、及び、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子の少なくとも1つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、例えば、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9の少なくとも1つの発現が抑制される。もしくは、改変シアノバクテリアでは、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9の少なくとも1つの機能が抑制される。そのため、外膜5中のSLHドメイン保持型外膜タンパク質6のSLHドメイン7と、細胞壁4の表面の共有結合型の糖鎖3との結合、つまり、結合量及び結合力が低下する。これにより、外膜5と細胞壁4との結合が弱まった部分において外膜5が細胞壁4から脱離しやすくなる。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアによれば、外膜5と細胞壁4との結合が低下することにより外膜5が細胞壁4から部分的に脱離しやすくなるので、菌体内で産生されたタンパク質が菌体外に漏出しやすい。 The gene that expresses the protein involved in the binding of the outer membrane 5 and the cell wall 4 is, for example, at least one of the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9. There may be. In the modified cyanobacteria, for example, at least one of the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is deleted or inactivated. Therefore, in modified cyanobacteria, for example, expression of at least one of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is suppressed. Alternatively, in modified cyanobacteria, at least one function of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is suppressed. Therefore, the bond between the SLH domain 7 of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5 and the covalently bound sugar chain 3 on the surface of the cell wall 4, that is, the amount and strength of binding decreases. This makes it easier for the outer membrane 5 to detach from the cell wall 4 at the portion where the bond between the outer membrane 5 and the cell wall 4 is weakened. Therefore, according to the modified cyanobacterium according to the present embodiment, since the bond between the outer membrane 5 and the cell wall 4 is reduced, the outer membrane 5 becomes easier to partially detach from the cell wall 4. proteins easily leak out of the cells.

本実施の形態では、例えば、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子の少なくとも1つの転写を抑制してもよい。これにより、シアノバクテリアにおけるSLHドメイン保持型外膜タンパク質6及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9の少なくとも1つの機能を抑制できる。 In this embodiment, for example, transcription of at least one of the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be suppressed. This can suppress at least one function of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 in cyanobacteria.

例えば、親シアノバクテリアがSyenchocystis属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子はslr1841、slr1908、又は、slr0042等であってもよい。親シアノバクテリアがSynechococcus属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子はnies970_09470等であってもよい。親シアノバクテリアがAnabaena属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子はanacy_5815又はanacy_3458等であってもよい。親シアノバクテリアがMicrocystis属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子はA0A0F6U6F8_MICAE等であってもよい。親シアノバクテリアがCyanothese属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子はA0A3B8XX12_9CYAN等であってもよい。親シアノバクテリアがLeptolyngbya属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子はA0A1Q8ZE23_9CYAN等であってもよい。親シアノバクテリアがCalothrix属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子はA0A1Z4R6U0_9CYAN等であってもよい。親シアノバクテリアがNostoc属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子はA0A1C0VG86_9NOSO等であってもよい。親シアノバクテリアがCrocosphaera属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子はB1WRN6_CROS5等であってもよい。親シアノバクテリアがPleurocapsa属である場合、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子はK9TAE4_9CYAN等であってもよい。これらの遺伝子の塩基配列は、上述したNCBIデータベース又はCyanobaseから入手できる。 For example, when the parent cyanobacterium is of the genus Synchocystis, the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be slr1841, slr1908, slr0042, or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechococcus, the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be nies970_09470 or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Anabaena, the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be anacy_5815, anacy_3458, or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Microcystis, the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be A0A0F6U6F8_MICAE or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Cyanothese, the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be A0A3B8XX12_9CYAN or the like. When the parent cyanobacterium is the genus Leptolyngbya, the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be A0A1Q8ZE23_9CYAN or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Calothrix, the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be A0A1Z4R6U0_9CYAN or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Nostoc, the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be A0A1C0VG86_9NOSO or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Crocosphaera, the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be B1WRN6_CROS5 or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Pleurocapsa, the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be K9TAE4_9CYAN or the like. The nucleotide sequences of these genes can be obtained from the NCBI database or Cyanobase mentioned above.

より具体的には、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子は、Synechocystis sp. PCC 6803のslr1841(配列番号7)、Synechococcus sp. NIES-970のnies970_09470(配列番号8)、Anabaena cylindrica PCC 7122 のanacy_3458(配列番号9)、又は、これらの遺伝子とアミノ酸配列が50%以上同一である遺伝子であってもよい。 More specifically, the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 is Synechocystis sp. PCC 6803 slr1841 (SEQ ID NO: 7), Synechococcus sp. 7122 anacy_3458 (SEQ ID NO: 9), or genes having 50% or more identical amino acid sequence with these genes.

これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、上記の配列番号7から9で示されるいずれかのSLHドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの遺伝子の塩基配列と50%以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、上記のいずれかのSLHドメイン保持型外膜タンパク質又はこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される。もしくは、上記のいずれかのSLHドメイン保持型外膜タンパク質又はこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制される。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアでは、SLHドメイン7等の、外膜5が細胞壁4と結合するための結合ドメインが細胞壁4と結合する結合量及び結合力が低下するので、外膜5が細胞壁4から部分的に離脱しやすくなる。 Thus, in modified cyanobacteria, for example, genes encoding any of the SLH domain-retaining outer membrane proteins shown in SEQ ID NOs: 7 to 9 above, or nucleotide sequences that are 50% or more identical to the nucleotide sequences of any of these genes. A gene is deleted or inactivated. Therefore, in modified cyanobacteria, the expression of any of the above SLH domain-retaining outer membrane proteins or proteins having functions equivalent to any of these proteins is suppressed. Alternatively, the functions of any of the above SLH domain-retaining outer membrane proteins or proteins having functions equivalent to any of these proteins are suppressed. Therefore, in the modified cyanobacterium according to the present embodiment, the binding amount and binding strength of the binding domain for binding the outer membrane 5 to the cell wall 4, such as the SLH domain 7, to the cell wall 4 are reduced. 5 becomes easier to partially detach from the cell wall 4.

上述したように、タンパク質のアミノ酸配列が30%以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が30%以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される可能性が高いと考えられる。そのため、機能が抑制されるSLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子は、例えば、上記の配列番号7から9で示されるSLHドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列と、40%以上の同一性を有する塩基配列を含む。加えて、その遺伝子は、細胞壁4の共有結合型の糖鎖3と結合する機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする。機能が抑制されるSLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子の塩基配列と、上記の配列番号7から9で示されるSLHドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列との同一性は、望ましくは50%以上である。その同一性は、より望ましくは60%以上であり、さらに望ましくは70%以上であり、特に望ましくは80%以上であり、とりわけ望ましくは90%以上である。 As described above, it is said that if the amino acid sequence of a protein is 30% or more identical, it is highly likely that the protein has a function equivalent to that of the protein. Therefore, if the base sequences of genes encoding proteins are 30% or more identical, it is highly likely that proteins having functions equivalent to those of the proteins will be expressed. Therefore, the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 whose function is suppressed is, for example, any of the nucleotide sequences of the genes encoding the SLH domain-retaining outer membrane proteins shown in SEQ ID NOs: 7 to 9 above. and base sequences having 40% or more identity. In addition, the gene encodes a protein or polypeptide that has the function of binding to the covalent sugar chain 3 on the cell wall 4 . The nucleotide sequence of the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 whose function is suppressed and the nucleotide sequence of any of the genes encoding the SLH domain-retaining outer membrane proteins shown in SEQ ID NOs: 7 to 9 above The identity of is desirably 50% or more. The identity is more preferably 60% or higher, still more preferably 70% or higher, particularly preferably 80% or higher, particularly preferably 90% or higher.

例えば、親シアノバクテリアがSyenchocystis属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子はslr0688等であってもよい。親シアノバクテリアがSynechococcus属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子はsyn7502_03092又はsynpcc7942_1529等であってもよい。親シアノバクテリアがAnabaena属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子はana_C20348又はanacy_1623等であってもよい。親シアノバクテリアがMicrocystis属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子はcsaB (NCBIのアクセスID:TRU80220)等であってもよい。親シアノバクテリアがCynahothese属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子はcsaB(NCBIのアクセスID:WP_107667006.1)等であってもよい。親シアノバクテリアがSpirulina属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子はcsaB(NCBIのアクセスID:WP_026079530.1)等であってもよい。親シアノバクテリアがCalothrix属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子はcsaB(NCBIのアクセスID:WP_096658142.1)等であってもよい。親シアノバクテリアがNostoc属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子はcsaB(NCBIのアクセスID:WP_099068528.1)等であってもよい。親シアノバクテリアがCrocosphaera属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子はcsaB(NCBIのアクセスID:WP_012361697.1)等であってもよい。親シアノバクテリアがPleurocapsa属である場合、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子はcsaB(NCBIのアクセスID:WP_036798735)等であってもよい。これらの遺伝子の塩基配列は、上述したNCBIデータベース又はCyanobaseから入手できる。 For example, when the parent cyanobacterium belongs to the genus Synchocystis, the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be slr0688 or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechococcus, the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be syn7502_03092, synpcc7942_1529, or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Anabaena, the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be ana_C20348, anacy_1623, or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Microcystis, the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be csaB (NCBI Accession ID: TRU80220) or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Cynahothese, the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be csaB (NCBI Accession ID: WP_107667006.1) or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Spirulina, the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be csaB (NCBI Accession ID: WP_026079530.1) or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Calothrix, the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be csaB (NCBI accession ID: WP_096658142.1) or the like. When the parent cyanobacterium belongs to the genus Nostoc, the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be csaB (NCBI access ID: WP_099068528.1) or the like. When the parent cyanobacterium is the genus Crocosphaera, the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be csaB (NCBI Accession ID: WP_012361697.1) or the like. When the parent cyanobacterium is of the genus Pleurocapsa, the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be csaB (NCBI Accession ID: WP_036798735) or the like. The nucleotide sequences of these genes can be obtained from the NCBI database or Cyanobase mentioned above.

より具体的には、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子は、Synechocystis sp. PCC 6803のslr0688(配列番号10)、Synechococcus sp. PCC 7942のsynpcc7942_1529(配列番号11)、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122 のanacy_1623(配列番号12)であってもよい。また、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子は、これらの遺伝子と塩基配列が50%以上同一である遺伝子であってもよい。 More specifically, the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is Synechocystis sp. PCC 6803 slr0688 (SEQ ID NO: 10), Synechococcus sp. PCC 7942 synpcc7942_1529 (SEQ ID NO: 11), or Anabaena cylindrica PCC 7122 anacy_1623 (SEQ ID NO: 12). Also, the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be a gene having 50% or more of the same base sequence as these genes.

改変シアノバクテリアでは、例えば、上記の配列番号10から12で示されるいずれかの細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子が欠失又は不活性化される。もしくは、改変シアノバクテリアでは、例えば、これらのいずれかの酵素をコードする遺伝子と塩基配列が50%以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、上記のいずれかの細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9又はこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される。もしくは、上記のいずれかの細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9又はこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制される。これにより、細胞壁4の表面の共有結合型の糖鎖3がピルビン酸で修飾されにくくなるので、細胞壁4の糖鎖3が外膜5中のSLHドメイン保持型外膜タンパク質6のSLHドメイン7と結合に関する結合量及び結合力が低下する。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアでは、細胞壁4が外膜5と結合するための糖鎖3がピルビン酸で修飾される量が低下するので、細胞壁4と外膜5との結合力が弱まり、外膜5が細胞壁4から部分的に離脱しやすくなる。 In the modified cyanobacteria, for example, any gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 shown in SEQ ID NOs: 10 to 12 above is deleted or inactivated. Alternatively, in modified cyanobacteria, for example, genes whose base sequences are 50% or more identical to genes encoding any of these enzymes are deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacteria, expression of any of the cell wall-pyruvate modifying enzymes 9 or proteins having functions equivalent to any of these enzymes is suppressed. Alternatively, the function of any of the above cell wall-pyruvate modifying enzymes 9 or proteins having functions equivalent to any of these enzymes is inhibited. As a result, the covalent sugar chain 3 on the surface of the cell wall 4 is less likely to be modified with pyruvic acid, so that the sugar chain 3 on the cell wall 4 becomes the SLH domain 7 of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5. The amount of binding and binding strength associated with binding are reduced. Therefore, in the modified cyanobacterium according to the present embodiment, the amount of pyruvic acid modification of the sugar chain 3 for binding the cell wall 4 to the outer membrane 5 is reduced. is weakened, and the outer membrane 5 tends to partially detach from the cell wall 4 .

異なるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が30%以上同一であれば、互いに同等の機能を有するタンパク質が発現される可能性が高いと考えられる。機能が抑制される細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子は、例えば、上記の配列番号10から12で示される細胞壁-ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列と40%以上の同一性を有する塩基配列を含む。加えて、その遺伝子は、細胞壁4のペプチドグリカン2の共有結合型の糖鎖3をピルビン酸で修飾する反応を触媒する機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする。細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子の塩基配列と、上記の配列番号10から12で示される細胞壁-ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列との同一性は、望ましくは50%以上である。その同一性は、より望ましくは60%以上であり、さらに望ましくは70%以上であり、特に望ましくは80%以上であり、とりわけ望ましくは90%以上である。 If the base sequences of genes encoding different proteins are 30% or more identical, it is highly likely that proteins having equivalent functions will be expressed. The gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 whose function is suppressed is, for example, any of the nucleotide sequences of the genes encoding the cell wall-pyruvate modifying enzymes shown in SEQ ID NOS: 10 to 12 above and 40% or more contains a base sequence having the identity of In addition, the gene encodes a protein or polypeptide that has the function of catalyzing the reaction of modifying the covalent sugar chain 3 of the peptidoglycan 2 on the cell wall 4 with pyruvate. The identity of the nucleotide sequence of the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 with any of the nucleotide sequences of the genes encoding the cell wall-pyruvate modifying enzymes shown in SEQ ID NOS: 10 to 12 above is preferably 50% or more. The identity is more preferably 60% or higher, still more preferably 70% or higher, particularly preferably 80% or higher, particularly preferably 90% or higher.

[3.改変シアノバクテリアの製造方法]
本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの製造方法について説明する。改変シアノバクテリアの製造方法は、例えば、シアノバクテリアにおいて外膜5と細胞壁4との結合に関与するタンパク質の機能を抑制させるステップを含む。
[3. Method for Producing Modified Cyanobacteria]
A method for producing a modified cyanobacterium according to this embodiment will be described. A method for producing a modified cyanobacterium includes, for example, a step of suppressing the function of a protein involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 in cyanobacteria.

本実施の形態では、外膜5と細胞壁4との結合に関与するタンパク質は、例えば、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9の少なくとも1つであってもよい。 In the present embodiment, the protein involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 may be at least one of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9, for example.

タンパク質の機能を抑制する手段は、特定の手段に限定されない。例えば、その手段は、SLHドメイン保持型外膜タンパク質6をコードする遺伝子及び細胞壁-ピルビン酸修飾酵素9をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化させることを含む。その手段は、これらの遺伝子の転写を阻害すること、これらの遺伝子の転写産物の翻訳を阻害すること、又はこれらのタンパク質を特異的に阻害する阻害剤を投与することを含んでいてもよい。 Means for inhibiting protein function are not limited to specific means. For example, the means include deleting or inactivating the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 . The means may involve inhibiting transcription of these genes, inhibiting translation of transcripts of these genes, or administering inhibitors that specifically inhibit these proteins.

上記の遺伝子を欠失又は不活性化させる手段は、例えば、該当遺伝子の塩基配列上の1つ以上の塩基に対する突然変異の導入である。その手段は、該当塩基配列に対する他の塩基配列への置換若しくは他の塩基配列の挿入、又は、該当遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部の削除等であってもよい。 A means of deleting or inactivating the above gene is, for example, introduction of mutation to one or more bases on the base sequence of the gene. The means may be replacement of the base sequence with another base sequence, insertion of another base sequence, deletion of part or all of the base sequence of the gene, or the like.

上記遺伝子の転写を阻害する手段は、例えば、該当遺伝子のプロモーター領域に対する変異導入である。その手段は、他の塩基配列への置換若しくは他の塩基配列の挿入による当該プロモーターの不活性化、又は、CRISPR干渉法(非特許文献12参照)等であってもよい。上記の変異導入、又は、塩基配列の置換若しくは挿入の具体的な手法は、例えば、紫外線照射、部位特異的変異導入、又は相同組換え法等であってもよい。 A means of inhibiting the transcription of the above gene is, for example, mutation introduction to the promoter region of the gene. The means may be inactivation of the promoter by substitution with or insertion of another base sequence, CRISPR interference method (see Non-Patent Document 12), or the like. Specific techniques for the introduction of mutation or substitution or insertion of base sequences may be, for example, UV irradiation, site-directed mutagenesis, homologous recombination, or the like.

上記遺伝子の転写産物の翻訳を阻害する手段は、例えば、ribonucleic acid(RNA)干渉法等であってもよい。 Means for inhibiting translation of the transcription product of the gene may be, for example, ribonucleic acid (RNA) interference method or the like.

以上のいずれかの手段を用いることにより、シアノバクテリアにおける外膜5と細胞壁4との結合に関与するタンパク質の機能を抑制させて、改変シアノバクテリアを製造してもよい。 A modified cyanobacterium may be produced by suppressing the function of a protein involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 in cyanobacteria by using any one of the above means.

これにより、本実施の形態に係る製造方法で製造された改変シアノバクテリアは、細胞壁4と外膜5との結合、つまり、結合量及び結合力が部分的に低下するので、外膜5が細胞壁4から部分的に脱離しやすくなる。このため、改変シアノバクテリアでは、菌体内で産生されたタンパク質等の有機物が外膜5の外に、つまり、菌体の外に漏出しやすい。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの製造方法によれば、有機物の分泌生産性が向上した改変シアノバクテリアを提供できる。 As a result, in the modified cyanobacterium produced by the production method according to the present embodiment, the binding between the cell wall 4 and the outer membrane 5, that is, the amount of binding and the binding strength are partially reduced. It becomes easier to partially detach from 4. Therefore, in the modified cyanobacteria, organic substances such as proteins produced within the cells tend to leak out of the outer membrane 5, that is, out of the cells. Therefore, according to the method for producing a modified cyanobacterium according to the present embodiment, it is possible to provide a modified cyanobacterium with improved secretion productivity of organic matter.

また、本実施の形態に係る製造方法で製造された改変シアノバクテリアでは、菌体内で産生されたタンパク質等の有機物が菌体外に漏出するので、有機物の回収のために菌体を破砕する必要がない。例えば、改変シアノバクテリアを適切な条件で培養し、次いで培養液中に分泌された有機物を回収すればよいので、改変シアノバクテリアを培養しながら培養液中の有機物を回収することも可能である。そのため、本製造方法により得られる改変シアノバクテリアを使用すれば、効率のよい微生物学的タンパク質生産等の有機物生産を実施できる。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの製造方法によれば、タンパク質等の有機物を回収した後も繰り返し使用することができる利用効率の高い改変シアノバクテリアを提供できる。 In addition, in the modified cyanobacteria produced by the production method according to the present embodiment, organic substances such as proteins produced in the cells leak out of the cells, so it is necessary to crush the cells in order to recover the organic substances. There is no For example, modified cyanobacteria may be cultured under appropriate conditions, and then the organic matter secreted into the culture medium may be collected. Therefore, it is possible to collect the organic matter in the culture medium while culturing the modified cyanobacteria. Therefore, by using the modified cyanobacteria obtained by this production method, organic matter production such as microbiological protein production can be carried out with high efficiency. Therefore, according to the method for producing a modified cyanobacterium according to the present embodiment, it is possible to provide a modified cyanobacterium with high utilization efficiency that can be used repeatedly even after organic substances such as proteins are recovered.

なお、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの製造方法により製造される改変シアノバクテリアは、例えば、ペプチダーゼ又はフォスファターゼ等の、主として元来ペリプラズムに存在する有機物を細胞外に分泌する。本実施の形態では、例えば、ペリプラズムに存在するタンパク質群のように元来シアノバクテリアの細胞内で産生されるタンパク質をコードする遺伝子を改変して、他のタンパク質をコードする遺伝子に置き換えてもよい。これにより、改変シアノバクテリアに所望のタンパク質を生産させることも可能である。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの製造方法によれば、所望のタンパク質等の有機物を簡便に、かつ、効率よく産生可能な改変シアノバクテリアを提供できる。 The modified cyanobacteria produced by the method for producing modified cyanobacteria according to the present embodiment extracellularly secretes, for example, peptidases, phosphatases, and other organic substances originally present mainly in the periplasm. In the present embodiment, for example, genes encoding proteins originally produced in cyanobacterial cells, such as proteins present in the periplasm, may be modified and replaced with genes encoding other proteins. . This also allows the modified cyanobacterium to produce the desired protein. Therefore, according to the method for producing a modified cyanobacterium according to the present embodiment, it is possible to provide a modified cyanobacterium capable of easily and efficiently producing an organic substance such as a desired protein.

[4.改変シアノバクテリアの製造例]
以下に改変シアノバクテリアの製造例を示す。シアノバクテリアの外膜を細胞壁から部分的に脱離させる方法として、SLHドメイン保持型外膜タンパク質をコードするslr1841遺伝子の発現抑制を採用することにより、サンプル1が得られる。加えて、シアノバクテリアの外膜を細胞壁から部分的に脱離させる方法として、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素をコードするslr0688遺伝子の発現抑制を採用することにより、サンプル2が得られる。サンプル1及び2の作製に用いたシアノバクテリア種は、Synechocystis sp. PCC 6803であり、本項目において、この種を、単に、「シアノバクテリア」と呼ぶことがある。
[4. Production Example of Modified Cyanobacteria]
Examples of production of modified cyanobacteria are shown below. Sample 1 is obtained by suppressing the expression of the slr1841 gene, which encodes an SLH domain-retaining outer membrane protein, as a method for partially detaching the outer membrane of cyanobacteria from the cell wall. In addition, sample 2 is obtained by adopting expression suppression of the slr0688 gene, which encodes a cell wall-pyruvate modifying enzyme, as a method for partially detaching the outer membrane of cyanobacteria from the cell wall. The cyanobacterial species used to prepare Samples 1 and 2 was Synechocystis sp. PCC 6803, and this species is sometimes referred to simply as "cyanobacteria" in this section.

(サンプル1)
サンプル1に係る改変シアノバクテリアでは、SLHドメイン保持型外膜タンパク質をコードするslr1841遺伝子の発現が抑制されている。
(Sample 1)
In the modified cyanobacteria of sample 1, the expression of the slr1841 gene, which encodes an SLH domain-retaining outer membrane protein, is suppressed.

(1)slr1841遺伝子の発現が抑制されたシアノバクテリア改変株の構築
遺伝子発現抑制法として、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(CRISPR)干渉法を用いた。この方法では、dCas9タンパク質をコードする遺伝子であるdCas9遺伝子と、slr1841_sgRNA(single-guide Ribonucleic Acid)遺伝子とを、シアノバクテリアの染色体DNAに導入することにより、slr1841遺伝子の発現を抑制できる。また、slr1841_sgRNAの転写活性を制御することにより、slr1841遺伝子の抑制の程度をコントロールすることができる。
(1) Construction of Cyanobacterial Modified Strain with Suppressed Expression of slr1841 Gene Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) interference method was used as a method for suppressing gene expression. In this method, the expression of the slr1841 gene can be suppressed by introducing the dCas9 gene, which is a gene encoding the dCas9 protein, and the slr1841_sgRNA (single-guide Ribonucleic Acid) gene into the chromosomal DNA of cyanobacteria. In addition, the degree of suppression of the slr1841 gene can be controlled by controlling the transcriptional activity of slr1841_sgRNA.

この方法による遺伝子発現抑制の仕組みは次の通りである。まず、ヌクレアーゼ活性を欠損したCas9タンパク質(dCas9)と、slr1841遺伝子の塩基配列に相補的に結合するsgRNA(slr1841_sgRNA)とが、複合体を形成する。次に、この複合体がシアノバクテリアの染色体DNA上のslr1841遺伝子を認識し、slr1841遺伝子と特異的に結合する。この結合が立体障害となることにより、slr1841遺伝子の転写が阻害される。その結果、シアノバクテリアのslr1841遺伝子の発現が抑制される。また、slr1841_sgRNAの転写活性を制御することにより、slr1841遺伝子の抑制の程度をコントロールすることができる。 The mechanism of gene expression suppression by this method is as follows. First, Cas9 protein lacking nuclease activity (dCas9) forms a complex with sgRNA (slr1841_sgRNA) that complementarily binds to the base sequence of slr1841 gene. This complex then recognizes the slr1841 gene on the cyanobacterial chromosomal DNA and binds specifically to the slr1841 gene. The steric hindrance of this binding inhibits transcription of the slr1841 gene. As a result, the expression of the cyanobacterial slr1841 gene is suppressed. In addition, the degree of suppression of the slr1841 gene can be controlled by controlling the transcriptional activity of slr1841_sgRNA.

以下、上記の2つの遺伝子の各々をシアノバクテリアの染色体DNAに導入する方法を具体的に説明する。 A method for introducing each of the above two genes into the chromosomal DNA of cyanobacteria will be specifically described below.

(1-1)dCas9遺伝子の導入
Synechocystis LY07株(以下、LY07株ともいう)(非特許文献12参照)の染色体DNAを鋳型として、dCas9遺伝子及びdCas9遺伝子の発現制御のためのオペレーター遺伝子、並びに、遺伝子導入の目印となるスペクチノマイシン耐性マーカー遺伝子を増幅する。この増幅は、例えば、表1に記載のプライマーpsbA1-Fw(配列番号13)及びpsbA1-Rv(配列番号14)を用いてPolymerase chain reaction(PCR)法によりなされる。LY07株では、上記の3つの遺伝子は、連結した状態で染色体DNA上のpsbA1遺伝子に挿入されているので、1つのDNA断片としてPCR法により増幅できる。ここで、得られたDNA断片を「psbA1::dCas9カセット」と表記する。In-Fusion PCRクローニング法(登録商標)を用いて、psbA1::dCas9カセットをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-dCas9プラスミドを得る。
(1-1) Introduction of dCas9 gene
Using the chromosomal DNA of the Synechocystis LY07 strain (hereinafter also referred to as LY07 strain) (see Non-Patent Document 12) as a template, the dCas9 gene, an operator gene for regulating the expression of the dCas9 gene, and spectinomycin as a marker for gene introduction. Amplify the resistance marker gene. This amplification is performed by the polymerase chain reaction (PCR) method using primers psbA1-Fw (SEQ ID NO: 13) and psbA1-Rv (SEQ ID NO: 14) shown in Table 1, for example. In the LY07 strain, the above three genes are inserted into the psbA1 gene on the chromosomal DNA in a ligated state, so that they can be amplified as one DNA fragment by PCR. Here, the resulting DNA fragment is referred to as "psbA1::dCas9 cassette". The psbA1::dCas9 cassette is inserted into the pUC19 plasmid using the In-Fusion PCR Cloning Method®, resulting in the pUC19-dCas9 plasmid.

Figure 2022134907000002
Figure 2022134907000002

得られたpUC19-dCas9プラスミド1μgと、0.5程度の菌体濃度OD730を有するシアノバクテリア培養液とを混合し、自然形質転換によりpUC19-dCas9プラスミドをシアノバクテリアの細胞内に導入した。形質転換された細胞を20μg/mLのスペクチノマイシンを含むBG-11寒天培地上で生育させることにより、選抜した。選抜された細胞では、染色体DNA上のpsbA1遺伝子と、pUC19-dCas9プラスミド上のpsbA1上流断片領域及びpsbA1下流断片領域との間で相同組み換えが起こる。これにより、psbA1遺伝子領域にdCas9カセットが挿入されたSynechocystis dCas9株が得られる。BG-11培地の組成は、例えば表2に示す通りである。 1 μg of the obtained pUC19-dCas9 plasmid was mixed with a cyanobacterial culture medium having a cell concentration OD 730 of about 0.5, and the pUC19-dCas9 plasmid was introduced into cyanobacterial cells by spontaneous transformation. Transformed cells were selected by growing on BG-11 agar medium containing 20 μg/mL spectinomycin. In the selected cells, homologous recombination occurs between the psbA1 gene on the chromosomal DNA and the psbA1 upstream fragment region and psbA1 downstream fragment region on the pUC19-dCas9 plasmid. This yields a Synechocystis dCas9 strain with a dCas9 cassette inserted into the psbA1 gene region. The composition of the BG-11 medium is as shown in Table 2, for example.

Figure 2022134907000003
Figure 2022134907000003

(1-2)slr1841_sgRNA遺伝子の導入
CRISPR干渉法では、sgRNA遺伝子上のprotospacerと呼ばれる領域に、標的配列と相補的な約20塩基の配列を導入することにより、sgRNAが標的遺伝子に特異的に結合する。サンプル1で用いたprotospacer配列を表3に示す。
(1-2) Introduction of slr1841_sgRNA gene
In the CRISPR interference method, sgRNA specifically binds to a target gene by introducing a sequence of about 20 bases complementary to the target sequence into a region called protospacer on the sgRNA gene. Table 3 shows the protospacer sequences used in sample 1.

Figure 2022134907000004
Figure 2022134907000004

Synechocystis LY04株、LY05株、又はLY07株では、protospacer領域を除くsgRNA遺伝子と、カナマイシン耐性マーカー遺伝子とが連結した形で、染色体DNA上のslr2030-slr2031遺伝子に挿入されている。従って、当該sgRNA遺伝子をPCR法により増幅する際に用いるプライマーにslr1841遺伝子(配列番号7)と相補的なprotospacer配列(配列番号21)を付与することにより、slr1841_sgRNAを容易に得ることができる。また、slr1841_sgRNAの転写活性を制御することにより、slr1841遺伝子の抑制の程度をコントロールすることができる。 In the Synechocystis LY04, LY05, or LY07 strain, the sgRNA gene excluding the protospacer region and the kanamycin resistance marker gene are linked and inserted into the slr2030-slr2031 gene on the chromosomal DNA. Therefore, slr1841_sgRNA can be easily obtained by adding a protospacer sequence (SEQ ID NO: 21) complementary to the slr1841 gene (SEQ ID NO: 7) to the primers used for amplifying the sgRNA gene by PCR. In addition, the degree of suppression of the slr1841 gene can be controlled by controlling the transcriptional activity of slr1841_sgRNA.

LY07株の染色体DNAを鋳型とし、表1に記載のプライマーslr2030-Fw(配列番号15)及びsgRNA_slr1841-Rv(配列番号16)のセット、並びに、sgRNA_slr1841-Fw(配列番号17)及びslr2031-Rv(配列番号18)のセットを用いて2つのDNA断片をPCR法により増幅する。 Using the chromosomal DNA of the LY07 strain as a template, a set of primers slr2030-Fw (SEQ ID NO: 15) and sgRNA_slr1841-Rv (SEQ ID NO: 16) described in Table 1, and sgRNA_slr1841-Fw (SEQ ID NO: 17) and slr2031-Rv ( Two DNA fragments are amplified by PCR using the set of SEQ ID NO: 18).

次に、上記のDNA断片の混合溶液を鋳型として、表1に記載のプライマーslr2030-Fw(配列番号15)とslr2031-Rv(配列番号18)とを用いてPCR法により増幅する。これにより、(i)slr2030遺伝子断片、(ii)slr1841_sgRNA、(iii)カナマイシン耐性マーカー遺伝子、及び(iv)slr2031遺伝子断片がこの順に連結したDNA断片(slr2030-2031::slr1841_sgRNA)が得られる。In-Fusion PCRクローニング法(登録商標)を用いて、slr2030-2031::slr1841_sgRNAをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-slr1841_sgRNAプラスミドが得られる。 Next, using the mixed solution of the above DNA fragments as a template, the primers slr2030-Fw (SEQ ID NO: 15) and slr2031-Rv (SEQ ID NO: 18) listed in Table 1 are used for amplification by PCR. As a result, a DNA fragment (slr2030-2031::slr1841_sgRNA) is obtained in which (i) the slr2030 gene fragment, (ii) slr1841_sgRNA, (iii) the kanamycin resistance marker gene, and (iv) the slr2031 gene fragment are linked in this order. Using the In-Fusion PCR Cloning Method®, slr2030-2031::slr1841_sgRNA is inserted into the pUC19 plasmid, resulting in the pUC19-slr1841_sgRNA plasmid.

上記(1-1)と同様の方法でpUC19-slr1841_sgRNAプラスミドをSynechocystis dCas9株に導入し、形質転換された細胞を30μg/mLのカナマイシンを含むBG-11寒天培地上で選抜した。これにより、染色体DNA上のslr2030-slr2031遺伝子にslr1841_sgRNAが挿入された形質転換体Synechocystis dCas9 slr1841_sgRNA株が得られる。以下、この株をslr1841抑制株ともいう。 The pUC19-slr1841_sgRNA plasmid was introduced into the Synechocystis dCas9 strain in the same manner as in (1-1) above, and the transformed cells were selected on BG-11 agar medium containing 30 μg/mL kanamycin. As a result, a transformant Synechocystis dCas9 slr1841_sgRNA strain in which slr1841_sgRNA is inserted into the slr2030-slr2031 gene on the chromosomal DNA is obtained. Hereinafter, this strain is also referred to as slr1841-suppressed strain.

(1-3)slr1841遺伝子の抑制
上記dCas9遺伝子及びslr1841_sgRNA遺伝子のプロモーター配列は、アンヒドロテトラサイクリン(aTc)の存在下で発現誘導されるように設計されている。サンプル1では、培地中に終濃度が1μg/mLであるaTcを添加することによりslr1841遺伝子の発現を抑制しうる。
(1-3) Suppression of slr1841 gene The promoter sequences of the dCas9 gene and slr1841_sgRNA gene are designed to induce expression in the presence of anhydrotetracycline (aTc). In sample 1, the expression of the slr1841 gene can be suppressed by adding aTc at a final concentration of 1 μg/mL to the medium.

これにより、細胞の増殖能力を損なわせることなく、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁の結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の量と比較して30%程度に抑制されたサンプル1の改変シアノバクテリアが得られる。ここで、後述のサンプル3のSynechocystis dCas9株が親株に相当し、外膜と細胞壁の結合に関与するタンパク質は、slr1841、slr1908、及びslr0042である。なお、外膜と細胞壁の結合に関与するタンパク質の量の測定結果については、後述の(6-1)で説明する。 As a result, the total amount of proteins involved in the binding of the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria was suppressed to about 30% compared to the amount of the proteins in the parent strain, without impairing the ability of the cells to proliferate. A cyanobacterium is obtained. Here, the Synechocystis dCas9 strain of sample 3 described later corresponds to the parent strain, and the proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall are slr1841, slr1908, and slr0042. The results of measuring the amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall will be described later in (6-1).

(サンプル2)
サンプル2では、下記の手順により、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素をコードするslr0688遺伝子の発現が抑制された改変シアノバクテリアが得られる。
(Sample 2)
In sample 2, a modified cyanobacterium in which the expression of the slr0688 gene encoding a cell wall-pyruvate modifying enzyme is suppressed is obtained by the following procedure.

(2)slr0688遺伝子の発現が抑制されたシアノバクテリア改変株の構築
上記(1-2)と同様の手順により、slr0688遺伝子(配列番号4)と相補的なprotospacer配列(配列番号22)を含むsgRNA遺伝子をSynechocystis dCas9株に導入し、Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株が得られる。なお、表1に記載のプライマーslr2030-Fw(配列番号15)及びsgRNA_slr0688-Rv(配列番号19)のセット、並びに、sgRNA_slr0688-Fw(配列番号20)及びslr2031-Rv(配列番号18)のセットを用いたことと、(i)slr2030遺伝子断片、(ii)slr0688_sgRNA、(iii)カナマイシン耐性マーカー遺伝子、(iv)slr2031遺伝子断片が順に連結したDNA断片(slr2030-2031::slr0688_sgRNA)をIn-Fusion PCRクローニング法(登録商標)を用いて、pUC19プラスミドに挿入し、pUC19-slr0688_sgRNAプラスミドを得ること以外は、上記(1-2)と同様の条件で行うことができる。また、slr0688_sgRNAの転写活性を制御することにより、slr0688遺伝子の抑制の程度をコントロールすることができる。
(2) Construction of a cyanobacterial modified strain in which the expression of the slr0688 gene is suppressed sgRNA containing a protospacer sequence (SEQ ID NO: 22) complementary to the slr0688 gene (SEQ ID NO: 4) by the same procedure as in (1-2) above The gene is introduced into the Synechocystis dCas9 strain to obtain the Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain. The set of primers slr2030-Fw (SEQ ID NO: 15) and sgRNA_slr0688-Rv (SEQ ID NO: 19) and the set of sgRNA_slr0688-Fw (SEQ ID NO: 20) and slr2031-Rv (SEQ ID NO: 18) described in Table 1 were used. In-Fusion PCR was performed on a DNA fragment (slr2030-2031::slr0688_sgRNA) in which (i) the slr2030 gene fragment, (ii) slr0688_sgRNA, (iii) the kanamycin resistance marker gene, and (iv) the slr2031 gene fragment were linked in order. It can be performed under the same conditions as in (1-2) above, except that it is inserted into the pUC19 plasmid using the cloning method (registered trademark) to obtain the pUC19-slr0688_sgRNA plasmid. In addition, the degree of suppression of the slr0688 gene can be controlled by controlling the transcriptional activity of slr0688_sgRNA.

さらに、上記(1-3)と同様の手順により、slr0688遺伝子の発現を抑制できる。 Furthermore, the expression of the slr0688 gene can be suppressed by the same procedure as (1-3) above.

以上のようにして、細胞の増殖能力を損なわせることなく、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁の結合に関与するタンパク質の量が親株における当該タンパク質の量と比較して、50%程度に抑制されたサンプル2の改変シアノバクテリアが得られる。ここで、後述のサンプル3のSynechocystis dCas9株が親株に相当し、外膜と細胞壁の結合に関与するタンパク質は、slr0688である。なお、外膜と細胞壁の結合に関与するタンパク質の量に関係するピルビン酸量の測定結果については、後述の(6-4)で説明する。 As described above, the amount of a protein involved in the binding of the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria was suppressed to about 50% of the amount of the protein in the parent strain without impairing the ability of the cells to proliferate. A sample 2 modified cyanobacterium is obtained. Here, the Synechocystis dCas9 strain of Sample 3, which will be described later, corresponds to the parent strain, and the protein involved in binding between the outer membrane and the cell wall is slr0688. The results of measurement of the amount of pyruvic acid, which is related to the amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall, will be described later in (6-4).

(サンプル3)
サンプル3として、サンプル1の(1-1)と同様の手順により、Synechocystis dCas9株が得られる。この株をControl株ともいう。
(Sample 3)
As sample 3, a Synechocystis dCas9 strain is obtained by the same procedure as in sample 1 (1-1). This strain is also called the control strain.

サンプル1、サンプル2、及びサンプル3で得られた菌株について、それぞれ、細胞表層の状態の観察及びタンパク質の分泌生産性試験の詳細について説明する。 For the strains obtained from Sample 1, Sample 2, and Sample 3, the details of the observation of the state of the cell surface layer and the protein secretion productivity test will be described.

(3)菌株の細胞表層の状態の観察
サンプル1の改変シアノバクテリア、サンプル2の改変シアノバクテリア、及び、サンプル3の改変シアノバクテリアのそれぞれを含む超薄切片を作製し、その超薄切片を、電子顕微鏡を用いて観察することにより、細胞表層の状態、換言すると、外膜構造を確認できる。超薄切片は、例えば、以下の様にして作製できる。
(3) Observation of the state of the cell surface layer of the strain An ultra-thin section containing each of the modified cyanobacteria of sample 1, the modified cyanobacteria of sample 2, and the modified cyanobacteria of sample 3 is prepared, and the ultra-thin section is By observing with an electron microscope, the state of the cell surface layer, in other words, the structure of the outer membrane can be confirmed. An ultra-thin section can be produced, for example, as follows.

(3-1)菌株の培養
初発菌体濃度OD730が0.05となるように、サンプル1のslr1841抑制株を、1μg/mLのaTcを含むBG-11培地に接種し、100μmolm-2・s-1の光量での光照射及び30℃の条件下で5日間振とう培養する。サンプル2のslr0688抑制株及びサンプル3のControl株もサンプル1と同様の条件で培養できる。
(3-1) Cultivation of strain The slr1841-suppressing strain of sample 1 was inoculated into BG-11 medium containing 1 μg/mL aTc so that the initial cell concentration OD 730 was 0.05. Shaking culture is performed for 5 days under the conditions of light irradiation at a light intensity of s -1 and 30°C. The slr0688-suppressed strain of sample 2 and the control strain of sample 3 can also be cultured under the same conditions as sample 1.

(3-2)菌株の超薄切片の作製
上記(3-1)で得られた培養液を、室温にて2,500gの遠心力で10分間遠心分離して、サンプル1のslr1841抑制株の細胞を回収できる。次に、この細胞を-175℃の液体プロパンで急速凍結した後、2質量%のグルタルアルデヒド及び1質量%のタンニン酸を含むエタノール溶液を用いて-80℃で2日間固定する。固定後の細胞をエタノールにより脱水処理し、脱水した細胞を酸化プロピレンに浸透させたあと、樹脂Quetol-651の溶液中に沈める。その後、60℃で48時間静置し、樹脂を硬化させて、細胞を樹脂で包埋する。樹脂中の細胞を、ウルトラミクロトームUltracutを用いて、70nmの厚さに薄切りし、超薄切片が得られる。この超薄切片を、2質量%の酢酸ウラン及び1質量%クエン酸を含む鉛溶液を用いて染色して、サンプル1のslr1841抑制株の透過型電子顕微鏡の試料を準備できる。なお、サンプル2のslr0688抑制株及びサンプル3のControl株についてもそれぞれ同様の操作を行い、透過型電子顕微鏡の試料を準備できる。
(3-2) Preparation of ultra-thin sections of the strain The culture solution obtained in (3-1) above is centrifuged at room temperature with a centrifugal force of 2,500 g for 10 minutes to extract the slr1841-suppressed strain of sample 1. Cells can be harvested. Next, the cells are rapidly frozen in liquid propane at −175° C. and then fixed at −80° C. for 2 days with an ethanol solution containing 2% by mass of glutaraldehyde and 1% by mass of tannic acid. The fixed cells are dehydrated with ethanol, the dehydrated cells are permeated with propylene oxide, and then submerged in a solution of resin Quetol-651. After that, the resin is allowed to stand at 60° C. for 48 hours to cure and embed the cells in the resin. Cells in resin are sliced to a thickness of 70 nm using an ultramicrotome Ultracut to obtain ultrathin sections. This ultra-thin section can be stained with a lead solution containing 2% by weight uranium acetate and 1% by weight citric acid to prepare a sample for transmission electron microscopy of the slr1841 suppressor strain of Sample 1. The slr0688-suppressed strain of sample 2 and the control strain of sample 3 are also subjected to the same operation to prepare samples for transmission electron microscopy.

(3-3)電子顕微鏡による観察
日本電子株式会社製の透過型電子顕微鏡JEM-1400 Plusを用いて、100kV加速電圧の条件で、上記(3-2)で得られた超薄切片の観察を行うことができる。この観察結果を図2から図7に示す。
(3-3) Observation with an electron microscope Using a transmission electron microscope JEM-1400 Plus manufactured by JEOL Ltd., under the conditions of an acceleration voltage of 100 kV, observe the ultrathin section obtained in (3-2) above. It can be carried out. The observation results are shown in FIGS. 2 to 7. FIG.

図2は、サンプル1のslr1841抑制株の透過型電子顕微鏡(TEM)像である。図3は、図2の破線領域Aの拡大像及びその模写を含む図である。図3の(a)は、図2の破線領域Aの拡大像であり、図3の(b)は、図3の(a)の拡大像を模写した図である。 2 is a transmission electron microscope (TEM) image of the slr1841-suppressed strain of sample 1. FIG. FIG. 3 is a diagram including an enlarged image of the dashed line area A in FIG. 2 and a copy thereof. FIG. 3(a) is an enlarged image of the dashed line area A in FIG. 2, and FIG. 3(b) is a copy of the enlarged image of FIG. 3(a).

図2に示す通り、サンプル1のslr1841抑制株では、外膜が細胞壁から部分的に剥離し、つまり、外膜が部分的に剥がれ落ちており、かつ、外膜が部分的に撓んでいる。 As shown in FIG. 2, in the slr1841-suppressed strain of sample 1, the outer membrane is partially detached from the cell wall, that is, the outer membrane is partially sloughed off and the outer membrane is partially flexed.

細胞表層の状態をより詳細に確認するために破線領域Aを拡大観察すると、図3の(a)及び(b)において一点鎖線で囲まれた領域a1及びa2に示されるように、外膜が部分的に剥がれ落ちた部分が確認される。また、領域a1の傍に外膜が大きく撓んだ部分を確認できる。この部分は、外膜と細胞壁との結合が弱められた部分であり、外膜からペリプラズムの内部に培養液が浸透して、外膜が外側に膨張して撓んで発生しているものと考えられる。 In order to confirm the state of the cell surface layer in more detail, when the broken line area A is enlarged and observed, as shown in areas a1 and a2 surrounded by dashed lines in FIGS. Partially peeled off parts are confirmed. Also, a portion where the adventitia is greatly bent can be confirmed near the region a1. This part is a part where the bond between the outer membrane and the cell wall is weakened, and it is thought that the culture medium permeates from the outer membrane into the inside of the periplasm, causing the outer membrane to expand and bend outward. be done.

図4は、サンプル2のslr0688抑制株のTEM像である。図5は、図4の破線領域Bの拡大像及びその模写を含む図である。図5の(a)は、図4の破線領域Bの拡大像であり、図5の(b)は、図5の(a)の拡大像を模写した図である。 4 is a TEM image of the slr0688-suppressed strain of sample 2. FIG. FIG. 5 is a diagram including an enlarged image of the dashed line area B in FIG. 4 and a replica thereof. FIG. 5(a) is an enlarged image of the dashed line area B in FIG. 4, and FIG. 5(b) is a copy of the enlarged image of FIG. 5(a).

図4に示されるように、サンプル2のslr0688抑制株では、外膜が細胞壁から部分的に剥離し、かつ、外膜が部分的に撓んでいる。また、slr0688抑制株では、外膜が部分的に細胞壁から脱離していることが確認できる。 As shown in Figure 4, in the sample 2 slr0688-suppressed strain, the outer membrane is partially detached from the cell wall and the outer membrane is partially flexed. In addition, in the slr0688-suppressed strain, it can be confirmed that the outer membrane is partially detached from the cell wall.

細胞表層の状態をより詳細に確認するために破線領域Bを拡大観察すると、図5の(a)及び(b)において一点破線で囲まれた領域b1のように膜が大きく撓んだ部分が確認される。加えて、図5の(a)及び(b)において一点破線で囲まれた領域b2及びb3のように外膜が部分的に剥がれ落ちた部分が確認される。また、領域b1、b2、及びb3のそれぞれの近傍に外膜が細胞壁から脱離している部分を確認できる。 In order to confirm the state of the cell surface layer in more detail, when the broken line area B is magnified and observed, there is a portion where the membrane is greatly bent, such as the area b1 surrounded by the dashed line in FIGS. It is confirmed. In addition, portions where the adventitia has partially peeled off are confirmed, such as regions b2 and b3 surrounded by dashed lines in FIGS. 5(a) and 5(b). In addition, portions where the outer membrane is detached from the cell wall can be confirmed in the vicinity of each of the regions b1, b2, and b3.

図6は、サンプル3のControl株のTEM像である。図7は、図6の破線領域Cの拡大像及ぼその模写である。図7の(a)は、図6の破線領域Cの拡大像であり、図7の(b)は、図7の(a)の拡大像を模写した図である。 6 is a TEM image of the control strain of sample 3. FIG. FIG. 7 is an enlarged image of the dashed line area C in FIG. 6 and its copy. FIG. 7(a) is an enlarged image of the dashed line area C in FIG. 6, and FIG. 7(b) is a copy of the enlarged image of FIG. 7(a).

図6に示す通り、サンプル3のControl株の細胞表層は、整っており、内膜、細胞壁、外膜、及びS層がこの順に積層された状態を保っている。Control株では、サンプル1及び2のように、外膜が細胞壁から脱離した部分、外膜が細胞壁から剥離した部分、つまり、外膜が剥がれ落ちた部分、及び外膜が撓んだ部分は確認されない。 As shown in FIG. 6, the cell surface layer of the control strain of sample 3 is well-ordered, and maintains a state in which the inner membrane, cell wall, outer membrane, and S layer are layered in this order. In the control strain, as in samples 1 and 2, the part where the outer membrane detached from the cell wall, the part where the outer membrane detached from the cell wall, that is, the part where the outer membrane fell off, and the part where the outer membrane flexed Not confirmed.

(4)タンパク質の分泌生産性試験
サンプル1のslr1841抑制株、サンプル2のslr0688抑制株、及び、サンプル3のControl株をそれぞれ培養し、細胞外に分泌されたタンパク質量を測定できる。このタンパク質量を以下、分泌タンパク質量ともいう。培養液中のタンパク質量により、上記の菌株それぞれのタンパク質の分泌生産性を評価できる。なお、タンパク質の分泌生産性とは、細胞内で産生されたタンパク質を細胞外に分泌することにより、タンパク質を生産する能力をいう。
(4) Protein secretion productivity test The slr1841-suppressed strain of sample 1, the slr0688-suppressed strain of sample 2, and the control strain of sample 3 are cultured, respectively, and the extracellular secreted protein amount can be measured. This amount of protein is hereinafter also referred to as the amount of secreted protein. The protein secretion productivity of each of the above strains can be evaluated from the amount of protein in the culture medium. The protein secretion productivity refers to the ability to produce a protein by secreting the protein produced in the cell to the outside of the cell.

(4-1)菌株の培養
サンプル1のslr1841抑制株を上記(3-1)と同様の方法で培養する。培養は、独立して3回行う。なお、サンプル2及び3の菌株についてもサンプル1の菌株と同様の条件で培養する。
(4-1) Culture of strain The slr1841-suppressed strain of sample 1 is cultured in the same manner as in (3-1) above. Cultures are performed three times independently. The strains of samples 2 and 3 are also cultured under the same conditions as the strain of sample 1.

(4-2)細胞外に分泌されたタンパク質の定量
上記(4-1)で得られた培養液を、室温にて2,500gの遠心力で10分間遠心分離し、培養上清を得る。得られた培養上清を、ポアサイズ0.22μmのメンブレンフィルターを用いてろ過し、サンプル1のslr1841抑制株の細胞を完全に除去する。ろ過後の培養上清に含まれる総タンパク質量をBicinchoninic acid(BCA)法により定量する。この一連の操作を、独立して培養した3つの培養液のそれぞれについて行い、サンプル1のslr1841抑制株の細胞外に分泌されたタンパク質量の平均値及び標準偏差を求める。なお、サンプル2及び3の菌株についても、それぞれ、同様の条件で3つの培養液のタンパク質の定量を行い、3つの培養液中のタンパク質量の平均値及び標準偏差を求める。
(4-2) Quantification of Extracellularly Secreted Protein The culture medium obtained in (4-1) above is centrifuged at room temperature with a centrifugal force of 2,500 g for 10 minutes to obtain a culture supernatant. The resulting culture supernatant is filtered using a membrane filter with a pore size of 0.22 μm to completely remove the cells of the slr1841-suppressing strain of sample 1. The total amount of protein contained in the filtered culture supernatant is quantified by the bicinchoninic acid (BCA) method. This series of operations is performed for each of the three independently cultured cultures, and the average value and standard deviation of the protein amount extracellularly secreted from the slr1841-suppressing strain of Sample 1 are determined. Also for the strains of Samples 2 and 3, the proteins in the three culture solutions are quantified under the same conditions, and the average value and standard deviation of the protein amounts in the three culture solutions are obtained.

タンパク質の分泌生産性試験の結果を図8に示す。図8は、サンプル1、2、及び3の改変シアノバクテリアの培養液中のタンパク質量を示すグラフである。このグラフにおいて、データ数nが3であり、エラーバーは、標準偏差(SD)を示す。 FIG. 8 shows the results of the protein secretion productivity test. FIG. 8 is a graph showing protein amounts in culture media of modified cyanobacteria of samples 1, 2, and 3; In this graph, the number of data n is 3, and error bars indicate standard deviation (SD).

図8に示す通り、サンプル1のslr1841抑制株及びサンプル2のslr0688抑制株のいずれにおいても、サンプル3のControl株と比較して、培養上清中に分泌されたタンパク質量(mg/L)は、約25倍向上しうる。 As shown in FIG. 8, in both the slr1841-suppressed strain of sample 1 and the slr0688-suppressed strain of sample 2, the protein amount (mg/L) secreted into the culture supernatant was lower than that of the control strain of sample 3. , can be improved by a factor of about 25.

データの記載を省略するが、サンプル1のslr1841抑制株及びサンプル2のslr0688抑制株のいずれにおいても、菌体乾燥重量1gあたりの分泌タンパク質量(mg protein/g cell dry weight)は、比較例1のControl株と比較して、約36倍向上しうる。菌体乾燥重量1gあたりの分泌タンパク質量は、波長730nmにおける培養液の吸光度を測定することによって決定できる。 Although description of data is omitted, in both the slr1841-suppressed strain of sample 1 and the slr0688-suppressed strain of sample 2, the amount of secreted protein per 1 g of cell dry weight (mg protein/g cell dry weight) was about 36-fold improvement compared to the Control strain. The amount of secreted protein per 1 g of dry cell weight can be determined by measuring the absorbance of the culture solution at a wavelength of 730 nm.

図8に示す通り、サンプル1のslr1841抑制株よりも、サンプル2のslr0688抑制株の培養上清中に分泌されるタンパク質量は、サンプル1のslr1841抑制株の培養上清中に分泌されるタンパク質量よりも多い。これは、細胞壁表面の共有結合型の糖鎖の数が外膜中のSLHドメイン保持型外膜タンパク質Slr1841の数よりも多いことと関係していると考えられる。つまり、サンプル2のslr0688抑制株では、サンプル1のslr1841抑制株に比べて、外膜と細胞壁との結合量及び結合力がより低下しており、分泌されるタンパク質量がサンプル1のslr1841抑制株に比べて多くなりやすいと考えられる。 As shown in FIG. 8, the amount of protein secreted into the culture supernatant of the slr0688-suppressed strain of sample 2 was higher than that of the slr1841-suppressed strain of sample 1. more than quantity. This is thought to be related to the fact that the number of covalent sugar chains on the cell wall surface is greater than the number of SLH domain-retaining outer membrane protein Slr1841 in the outer membrane. That is, in the slr0688-suppressed strain of sample 2, the binding amount and binding strength between the outer membrane and the cell wall are lower than the slr1841-suppressed strain of sample 1, and the amount of secreted protein is lower than that of the slr1841-suppressed strain of sample 1. It is thought that it is likely to be more than .

以上の通り、外膜と細胞壁との結合に関連するタンパク質の機能を抑制することにより、シアノバクテリアの外膜と細胞壁との結合が部分的に弱められ、外膜が細胞壁から部分的に脱離することが確認できる。加えて、外膜と細胞壁との結合が弱まることにより、シアノバクテリアの細胞内で産生されたタンパク質が細胞外に漏出しやすくなることも確認できる。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリア及びその製造方法によれば、タンパク質の分泌生産性が大きく向上しうる。 As described above, by suppressing the functions of proteins involved in the binding between the outer membrane and the cell wall, the binding between the outer membrane and the cell wall of cyanobacteria is partially weakened, and the outer membrane partially detaches from the cell wall. can be confirmed. In addition, it can also be confirmed that the weakened bond between the outer membrane and the cell wall makes it easier for the proteins produced in the cyanobacterial cells to leak out of the cells. Therefore, according to the modified cyanobacterium and the production method thereof according to the present embodiment, the protein secretion productivity can be greatly improved.

(5)分泌されたタンパク質の同定
上記(4-2)で得られた培養上清中に含まれる分泌タンパク質を、液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS/MS)により同定できる。
(5) Identification of secreted protein The secreted protein contained in the culture supernatant obtained in (4-2) above can be identified by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS).

(5-1)試料調製
各サンプルの培養上清の液量に対して8倍量の冷アセトンを加え、20℃で2時間静置した後、20,000gの遠心力で15分間遠心分離し、タンパク質の沈殿物を得る。この沈殿物に8.5のpHを有する100mMのTris及び0.5質量%のドデカン酸ナトリウム(SDoD)を加え、密閉式超音波破砕機によってタンパク質を溶解させる。タンパク質濃度の濃度を1μg/mLに調整した後、終濃度10mMのジチオスレイトール(DTT)を添加して50℃で30分間静置する。続いて、終濃度30mMのヨードアセトアミド(IAA)を添加し、遮光した状態の室温で30分間静置する。IAAの反応を止めるために、終濃度60 mMのシステインを添加して室温で10分間静置する。トリプシン400ngを添加して37℃で一晩静置する。これにより、タンパク質をペプチド断片化できる。5質量%のTrifluoroacetic Acid(TFA)を加えた後、室温にて15,000gの遠心力で10分間遠心分離し、上清を得る。この作業によりSDoDが除去される。C18スピンカラムを用いて脱塩後、遠心エバポレーターにより試料を乾固する。その後、3質量%アセトニトリル、0.1質量%のformic acidを加え、密閉式超音波破砕機を用いて試料を溶解する。ペプチド濃度が200ng/μLになるように調製する。
(5-1) Sample preparation Cold acetone was added in an amount 8 times the volume of the culture supernatant of each sample, allowed to stand at 20°C for 2 hours, and centrifuged at a centrifugal force of 20,000 g for 15 minutes. , to obtain a protein precipitate. 100 mM Tris with a pH of 8.5 and 0.5% by weight sodium dodecanoate (SDoD) are added to this precipitate and the proteins are dissolved by an internal sonicator. After adjusting the protein concentration to 1 μg/mL, dithiothreitol (DTT) with a final concentration of 10 mM is added and allowed to stand at 50° C. for 30 minutes. Subsequently, iodoacetamide (IAA) with a final concentration of 30 mM is added, and the mixture is allowed to stand at room temperature for 30 minutes while shielded from light. In order to stop the IAA reaction, cysteine is added to a final concentration of 60 mM, and the mixture is allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Add 400 ng of trypsin and leave overnight at 37°C. This allows the protein to be peptide fragmented. After adding 5% by mass of Trifluoroacetic Acid (TFA), the mixture is centrifuged at room temperature with a centrifugal force of 15,000 g for 10 minutes to obtain a supernatant. This work removes SDoD. After desalting using a C18 spin column, the sample is dried using a centrifugal evaporator. After that, 3% by mass of acetonitrile and 0.1% by mass of formic acid are added, and the sample is dissolved using a closed ultrasonic crusher. Prepare a peptide concentration of 200 ng/μL.

(5-2)LC-MS/MS分析
LC-MS/MS装置 UltiMate 3000 RSLCnano LC System を用いて、上記(5-1)で得られた試料の分析を以下の条件で実施する。
(5-2) LC-MS/MS analysis
Using an LC-MS/MS device UltiMate 3000 RSLCnano LC System, the sample obtained in (5-1) above is analyzed under the following conditions.

試料注入量:200ng
カラム:CAPCELL CORE MP 75 μm × 250 mm
A溶媒:0.1質量%のギ酸水溶液
B溶媒:0.1質量%ギ酸及び80質量%のアセトニトリルの溶液
グラジエントプログラム:試料注入4分後にB溶媒8%、27分後にB溶媒44%、28分後にB溶媒80%、34分後に測定終了
Sample injection amount: 200 ng
Column: CAPCELL CORE MP 75 μm × 250 mm
A solvent: 0.1 wt% formic acid aqueous solution B solvent: a solution of 0.1 wt% formic acid and 80 wt% acetonitrile Gradient program: 4 min after sample injection, 8% B solvent, 27 min after sample injection, 44% B solvent, 28 B solvent 80% after 34 minutes, end of measurement after 34 minutes

(5-3)データ解析
得られたデータは以下の条件で解析し、タンパク質及びペプチドの同定ならびに定量値の算出を行う。
(5-3) Data analysis The obtained data are analyzed under the following conditions to identify proteins and peptides and to calculate quantitative values.

ソフトウェア:Scaffold DIA
データベース:UniProtKB/Swiss Prot database ( Synechocystis sp. PCC 6803)
Fragmentation:HCD
Precursor Tolerance:8 ppm
Fragment Tolerance:1 0 ppm
Data Acquisition Type:Overlapping DIA
Peptide Length:8-70
Peptide Charge:2-8
Max Missed Cleavages:1
Fixed Modification:Carbamidomethylation
Peptide FDR:1%以下
Software: Scaffold DIA
Database: UniProtKB/Swiss Prot database ( Synechocystis sp. PCC 6803)
Fragmentation: HCD
Precursor Tolerance: 8ppm
Fragment Tolerance: 10ppm
Data Acquisition Type: Overlapping DIA
Peptide Length: 8-70
Peptide Charge: 2-8
Max Missed Cleavages: 1
Fixed Modification: Carbamidomethylation
Peptide FDR: 1% or less

同定されたタンパク質のうち相対定量値が最も大きいものから順に10種類のタンパク質を表4に示す。 Table 4 shows 10 proteins among the identified proteins in descending order of relative quantification value.

Figure 2022134907000005
Figure 2022134907000005

10種類のタンパク質の全ては、サンプル1のslr1841抑制株及びサンプル2のslr0688抑制株の培養上清のそれぞれに含まれている。これらのタンパク質の全てにおいて、外膜と内膜との間隙であるペリプラズムの移行シグナルが保持されている。この結果により、サンプル1及び2の改変株では、外膜が細胞壁から部分的に脱離することによってペリプラズム内のタンパク質等の有機物が外膜の外、つまり、菌体外に漏出しやすいことが確認される。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアは、タンパク質の分泌生産性が大幅に向上している。 All 10 types of proteins are contained in the culture supernatants of the sample 1 slr1841-suppressed strain and the sample 2 slr0688-suppressed strain. All of these proteins retain translocation signals for the periplasm, the space between the outer and inner membranes. From these results, it was found that in the modified strains of samples 1 and 2, organic substances such as proteins in the periplasm tend to leak out of the outer membrane, that is, out of the cells, due to partial detachment of the outer membrane from the cell wall. It is confirmed. Therefore, the modified cyanobacterium according to the present embodiment has significantly improved protein secretion productivity.

(6)非特許文献5及び6に記載された従来例との比較
以下に、非特許文献5及び6に記載された従来例であるサンプル4及び5と、本実施の形態であるサンプル1及び2との比較結果について説明する。
(サンプル4)
サンプル4として、非特許文献5の記載に基づいてslr1908を欠損させた改変シアノバクテリア(いわゆるslr1908欠損株)を得た。
(サンプル5)
サンプル5として、非特許文献6の記載に基づいてslr0042を欠損させた改変シアノバクテリア(いわゆるslr0042欠損株)を得た。
(6) Comparison with conventional examples described in Non-Patent Documents 5 and 6 Below, Samples 4 and 5, which are conventional examples described in Non-Patent Documents 5 and 6, and Samples 1 and 1, which are the present embodiment 2 will be described.
(Sample 4)
As sample 4, a modified cyanobacterium lacking slr1908 (so-called slr1908-deficient strain) was obtained based on the description in Non-Patent Document 5.
(Sample 5)
As sample 5, a modified cyanobacterium lacking slr0042 (so-called slr0042-deficient strain) was obtained based on the description in Non-Patent Document 6.

(6-1)外膜と細胞壁の結合に関与するタンパク質の総量
サンプル1及び2でそれぞれ得たslr1841抑制株及びslr0688抑制株と、サンプル4及び5でそれぞれ得たslr1908欠損株及びslr0042欠損株とを上記(3-1)と同様に培養する。その後、培養液を5,000×gの遠心力で10分間遠心分離し、菌体ペレットを得た。超音波破砕機にて菌体を破砕し、5,000×gの遠心力で10分間遠心分離することにより未破砕の菌体を沈殿させ除去する。その後、遠心上清をさらに20,000×gで30分間遠心分離して菌体由来の膜画分ペレットを得る。この膜画分ペレットを2%のSDSの中で、37℃で15分間インキュベートすることにより外膜以外の成分を可溶化させ、次に20,000×gの遠心力で30分間遠心分離する。これにより、外膜画分ペレットを得る。上記の(4-2)に記載のBCA法により外膜画分ペレットに含有されるタンパク質量を定量したあと、5μgタンパク質当量を電気泳動SDS-PAGEに供し、外膜ペレット画分に含まれるタンパク質成分を分析する。
(6-1) Total amount of proteins involved in binding between outer membrane and cell wall are cultured in the same manner as in (3-1) above. After that, the culture solution was centrifuged at a centrifugal force of 5,000×g for 10 minutes to obtain a cell pellet. Cells are disrupted with an ultrasonicator, and centrifuged at a centrifugal force of 5,000×g for 10 minutes to precipitate and remove uncrushed cells. Thereafter, the centrifugation supernatant is further centrifuged at 20,000×g for 30 minutes to obtain a cell-derived membrane fraction pellet. Components other than the outer membrane are solubilized by incubating the membrane fraction pellet in 2% SDS at 37° C. for 15 minutes, followed by centrifugation at 20,000×g for 30 minutes. This yields an outer membrane fraction pellet. After quantifying the amount of protein contained in the outer membrane fraction pellet by the BCA method described in (4-2) above, 5 μg protein equivalent was subjected to electrophoresis SDS-PAGE, and the protein contained in the outer membrane pellet fraction Analyze the ingredients.

サンプル1の改変シアノバクテリア、サンプル3から5の改変シアノバクテリアにおける、外膜と細胞壁の結合に関与するタンパク質(slr1841, slr1908, およびslr0042)それぞれの量を示す電気泳動結果を図9に示す。図9の(a)は、各サンプルにおける外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の量を示す電気泳動像である。図9の(b)は、破線領域Zの拡大図である。図9の電気泳動写真のバンドの強度(濃さ及び太さ)はそれぞれのタンパク質の量を表す。図9において、(A)は分子量マーカー、(B)はサンプル3、(C)はサンプル5、(D)はサンプル1、(E)はサンプル4の電気泳動像である。バンド強度は、ImageJソフトウェアを用いて定量する。バンド強度の比較から、サンプル1の改変シアノバクテリアにおいては、slr1841タンパク質の発現が抑制されることにより、外膜と細胞壁の結合に関与するタンパク質(slr1841, slr1908, およびslr0042)の合計量が親株であるサンプル3の改変シアノバクテリアと比較して、約30%程度まで低下している。 FIG. 9 shows the results of electrophoresis showing the amounts of proteins (slr1841, slr1908, and slr0042) involved in the binding of the outer membrane to the cell wall in the modified cyanobacteria of sample 1 and the modified cyanobacteria of samples 3-5. FIG. 9(a) is an electrophoretic image showing the amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in each sample. (b) of FIG. 9 is an enlarged view of the dashed line area Z. FIG. The intensity (darkness and thickness) of the bands in the electropherogram of FIG. 9 represents the amount of each protein. In FIG. 9, (A) is the molecular weight marker, (B) is the sample 3, (C) is the sample 5, (D) is the sample 1, and (E) is the electrophoretic image of the sample 4. Band intensities are quantified using ImageJ software. Comparison of band intensities revealed that in the modified cyanobacteria of sample 1, the total amount of proteins (slr1841, slr1908, and slr0042) involved in the binding of the outer membrane to the cell wall was reduced by suppressing the expression of the slr1841 protein. Compared with the modified cyanobacteria of a certain sample 3, it is reduced to about 30%.

一方、サンプル5の改変シアノバクテリアでは、元来、図9右側の拡大写真に示す通り、slr0042タンパク質量は非常に少ないので、slr0042遺伝子が欠損しても外膜と細胞壁の結合に関与するタンパク質(slr1841, slr1908, およびslr0042)の合計量は、親株と数%程度しか低下していない。サンプル4の改変シアノバクテリアにおいては、slr1908タンパク質が欠損する代わりに、slr1841タンパク質の量が増加しているので、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質(slr1841, slr1908, およびslr0042)の合計量は、親株と比較して10%程度増加している。特定の外膜タンパク質の欠損により、別の類似タンパク質の増加が起こる現象は、他の細菌においてよく見られる現象である。 On the other hand, in the modified cyanobacteria of sample 5, as shown in the enlarged photograph on the right side of FIG. The total amount of slr1841, slr1908, and slr0042) decreased by only a few percent compared to the parent strain. In the modified cyanobacteria of sample 4, the amount of slr1841 protein is increased instead of lacking slr1908 protein. increased by about 10% compared to the parent strain. A phenomenon in which deficiency of a specific outer membrane protein leads to an increase in another similar protein is a phenomenon commonly seen in other bacteria.

(6-2)電子顕微鏡写真
サンプル4及び5の改変シアノバクテリアの外膜の状態を、上記(3)と同様の条件で透過電子顕微鏡を用いて観察した。図10A及び図10Bは、サンプル4の改変シアノバクテリアのTEM像を示す。図10Bは、図10Aにおいて破線で囲まれた領域の拡大像を示す。図11A及び図11Bは、サンプル5の改変シアノバクテリアのTEM像を示す。図11Bは、図11Aにおいて破線で囲まれた領域の拡大像を示す。図10A、図10B、図11A、及び図11Bに示す通り、サンプル4及び5の改変シアノバクテリアの外膜構造は、親株である比較例1とほとんど差異が無い。
(6-2) Electron Micrograph The state of the outer membrane of the modified cyanobacteria of Samples 4 and 5 was observed using a transmission electron microscope under the same conditions as in (3) above. 10A and 10B show TEM images of the modified cyanobacteria of sample 4. FIG. FIG. 10B shows a magnified image of the area enclosed by the dashed line in FIG. 10A. 11A and 11B show TEM images of modified cyanobacteria of sample 5. FIG. FIG. 11B shows a magnified image of the area enclosed by the dashed line in FIG. 11A. As shown in FIGS. 10A, 10B, 11A, and 11B, the outer membrane structure of the modified cyanobacteria of samples 4 and 5 is almost the same as that of the parent strain, Comparative Example 1.

(6-3)分泌生産されるタンパク質の量
サンプル1から5の改変シアノバクテリアを培養した場合に培養上清中に分泌生産されるタンパク質量を上記(4-2)と同様に測定する。その結果を図12に示す。図12から分かる通り、サンプル1及び2の改変シアノバクテリアのみ、培養液中に多量のタンパク質を分泌生産している。
(6-3) Amount of Protein Secreted and Produced When the modified cyanobacteria samples 1 to 5 are cultured, the amount of protein secreted and produced in the culture supernatant is measured in the same manner as in (4-2) above. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 12, only the modified cyanobacteria of samples 1 and 2 secrete and produce a large amount of protein into the culture medium.

(6-4)ピルビン酸量
サンプル2及び3の改変シアノバクテリアの菌体由来膜画分ペレットを上記(3-1)と同様の方法で得る。これを2%SDSの中で1時間煮沸したあと、40,000×gの遠心力で60分間遠心分離することにより、細胞壁画分を沈殿させる。細胞壁画分を0.5MのHCに懸濁させ、100℃で30分間加水分解を行う。NaOHを添加しpHを7.0に調整したあと、この加水分解産物中に含まれるピルビン酸量を市販のピルビン酸定量キットを用いて定量する。ピルビン酸量の定量結果を図13に示す。図13において、(A)はサンプル3の結果を示し、(B)はサンプル2の結果を示す。サンプル2の改変シアノバクテリアでは、親株であるサンプル3と比較して、ピルビン酸量が約50%程度まで低下していることがわかる。このことから、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質である細胞壁-ピルビン酸修飾酵素の量についても、親株における当該タンパク質の約50%程度に抑制されているものと考えられる。
(6-4) Amount of pyruvic acid Pellets of modified cyanobacterial cell-derived membrane fractions of samples 2 and 3 are obtained in the same manner as in (3-1) above. After boiling in 2% SDS for 1 hour, the cell wall fraction is sedimented by centrifugation at a centrifugal force of 40,000×g for 60 minutes. Cell wall fractions are suspended in 0.5 M HC and hydrolyzed at 100° C. for 30 minutes. After adjusting the pH to 7.0 by adding NaOH, the amount of pyruvic acid contained in this hydrolyzate is quantified using a commercially available pyruvic acid quantification kit. FIG. 13 shows the results of quantification of the amount of pyruvic acid. In FIG. 13, (A) shows the results of sample 3, and (B) shows the results of sample 2. FIG. It can be seen that in the modified cyanobacteria of sample 2, the amount of pyruvic acid is reduced to about 50% of that of sample 3, which is the parent strain. From this, it is considered that the amount of the cell wall-pyruvate modifying enzyme, which is a protein involved in binding between the outer membrane and the cell wall, is also suppressed to about 50% of the protein in the parent strain.

(7)考察
サンプル1及び2によれば、本実施の形態の改変シアノバクテリアは、菌体内(ここでは、ペリプラズム内)に存在するタンパク質を菌体外に分泌することを確認できる。本実施の形態の改変シアノバクテリアは、例えば、上記で同定されたタンパク質、つまり、元来菌体内で産生されるタンパク質の代わりに他のタンパク質を産生するように遺伝子改変することが可能である。このため、所望のタンパク質等の有機物を効率よく製造可能となる。また、シアノバクテリアは、光合成能が高いので、光、水、空気、及び微量の無機物を与えて培養することにより、必要な時に必要なタンパク質を簡便に得ることができるため、タンパク質の製造のために複雑な装置を用いる必要がない。また、タンパク質は、例えばサプリメントなどへの加工の際にその機能が失われやすい。そのため、本開示の改変シアノバクテリアによれば、タンパク質の機能を維持した状態でタンパク質を提供することが可能となる。以上の利点により、本開示の改変シアノバクテリアは、様々な分野での応用が期待される。
(7) Consideration According to samples 1 and 2, it can be confirmed that the modified cyanobacteria of the present embodiment secrete proteins present inside the cells (inside the periplasm here) to the outside of the cells. The modified cyanobacteria of the present embodiment can be genetically modified to produce other proteins instead of the proteins identified above, that is, the proteins originally produced in the cells. Therefore, it becomes possible to efficiently produce an organic substance such as a desired protein. In addition, since cyanobacteria have a high photosynthetic ability, they can easily obtain the necessary proteins when they are needed by culturing them with light, water, air, and a trace amount of inorganic substances. There is no need to use complicated equipment for In addition, proteins tend to lose their functions during processing into supplements, for example. Therefore, according to the modified cyanobacteria of the present disclosure, it is possible to provide proteins while maintaining their functions. Due to the above advantages, the modified cyanobacteria of the present disclosure are expected to be applied in various fields.

また、「(3-3)電子顕微鏡による観察」により、外膜と細胞壁との結合に関連するタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制した改変株では、外膜と細胞壁との結合が弱まることにより外膜が部分的に剥がれ落ちていたこと、及び、外膜が部分的に膨張していたことを確認できる。これは、外膜と細胞壁との結合が弱まることにより、外膜が細胞壁から部分的に脱離した箇所に、浸透圧により細胞外から培養液が流入しやすくなり、流入した培養液により外膜が部分的に膨張したと考えられる。そして、培養液のタンパク質濃度とペリプラズム内のタンパク質濃度との差が大きいため、外膜からペリプラズムに流入する培養液は止まることがなく、内圧に耐えられなくなった外膜は、破裂して、剥がれ落ち、つまり、剥離したと考えられる。 In addition, according to "(3-3) Observation by electron microscope", in the modified strain that suppresses the expression of the gene encoding the protein related to the binding between the outer membrane and the cell wall, the binding between the outer membrane and the cell wall is weakened. It can be confirmed that the adventitia was partially peeled off and that the adventitia was partially swollen. This is because the bond between the outer membrane and the cell wall weakens, and the osmotic pressure makes it easier for the culture medium to flow from the outside of the cell into the place where the outer membrane has partially detached from the cell wall. is thought to have partially expanded. Since the difference between the protein concentration in the culture medium and the protein concentration in the periplasm is large, the culture medium flowing from the outer membrane into the periplasm does not stop, and the outer membrane, which cannot withstand the internal pressure, ruptures and peels off. It is thought that it fell off, that is, peeled off.

また、表3には、LC-MS/MS分析で同定された全てのタンパク質のうち、相対定量値が最も大きい順に10種類だけ記載した。そして、「(5-3)データ解析」では、表3に記載の10種類の全てのタンパク質がサンプル1のslr1841抑制株及びサンプル2のslr0688株のそれぞれの培養上清に含まれていたと記載したが、LC-MS/MS分析で同定された他の全てのタンパク質についても同様に、サンプル1及びサンプル2の培養上清のそれぞれに含まれていることを確認した。そして、分泌されたタンパク質は、元来ペリプラズム内に存在するタンパク質と、細胞質からペリプラズムに輸送されてペリプラズム内で機能するタンパク質とを含むことが確認される。 In addition, Table 3 lists only 10 proteins among all proteins identified by LC-MS/MS analysis in descending order of relative quantification value. Then, in "(5-3) Data analysis", it was stated that all the 10 types of proteins listed in Table 3 were contained in the culture supernatants of the slr1841-suppressed strain of sample 1 and the slr0688 strain of sample 2. was similarly found in the culture supernatants of samples 1 and 2 for all other proteins identified by LC-MS/MS analysis. It is also confirmed that the secreted proteins include proteins originally present in the periplasm and proteins transported from the cytoplasm to the periplasm and functioning in the periplasm.

[5.バイオフィルムの製造方法]
本実施の形態に係るバイオフィルムの製造方法を説明する。バイオフィルムは、例えば、培養液に含まれる改変シアノバクテリアを面状に凝集させることによって得られる。ここで、改変シアノバクテリアでは、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に抑制されている。換言すると、本実施の形態に係るバイオフィルムは、上記の本実施の形態に係る改変シアノバクテリアを面状に凝集させることによって得られる。
[5. Biofilm production method]
A method for producing a biofilm according to this embodiment will be described. A biofilm is obtained, for example, by planarly aggregating modified cyanobacteria contained in a culture medium. Here, in the modified cyanobacteria, the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed to 30% to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain. In other words, the biofilm according to this embodiment is obtained by planarly aggregating the modified cyanobacteria according to this embodiment.

図14は、バイオフィルムの製造方法の一例を示す図である。図14に示す通り、この製造方法では、基材30を用いる。まず、改変シアノバクテリア10を含む培養液15を基材30の周囲に存在させる。例えば、容器40の内部に基材30を配置し、容器40の内部に基材30に接触するように培養液15を収容する。その後、改変シアノバクテリア10を基材30上に付着させる。これにより、改変シアノバクテリア10が面状に凝集して、バイオフィルム20が得られる。改変シアノバクテリア10では、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に抑制されている。 FIG. 14 is a diagram showing an example of a biofilm production method. As shown in FIG. 14, a base material 30 is used in this manufacturing method. First, culture solution 15 containing modified cyanobacteria 10 is allowed to exist around substrate 30 . For example, the substrate 30 is arranged inside the container 40 and the culture solution 15 is accommodated inside the container 40 so as to be in contact with the substrate 30 . The modified cyanobacteria 10 are then deposited onto the substrate 30 . As a result, the modified cyanobacteria 10 agglomerate in a plane to obtain a biofilm 20 . In the modified cyanobacterium 10, the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed from 30% to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain.

改変シアノバクテリア10を基材30上に付着させる方法は、特定の方法に限定されない。例えば、培養液15において改変シアノバクテリア10を沈降させることにより、基材30上に改変シアノバクテリア10を付着させることができる。容器40の内部で培養液15の流れを生じさせ、その流れの抵抗となるように基材30を配置して基材30上に改変シアノバクテリア10を付着させてもよい。 The method of attaching the modified cyanobacteria 10 onto the substrate 30 is not limited to a particular method. For example, the modified cyanobacteria 10 can adhere to the substrate 30 by allowing the modified cyanobacteria 10 to settle in the culture medium 15 . The modified cyanobacteria 10 may adhere to the substrate 30 by arranging the substrate 30 so as to create a flow of the culture solution 15 inside the container 40 and resist the flow.

図14に示す通り、改変シアノバクテリア10を基材30上に付着させるときに、培養液15に対して光が照射されてもよい。例えば、光源50からの光が培養液15に対して照射される。これにより、培養液15において改変シアノバクテリア10の培養が促され、改変シアノバクテリア10が基材30上に付着してバイオフィルム20が形成されやすい。光の照射条件は、特定の条件に限定されない。照射される光は、連続光であってもよいし、単色光であってもよい。光源50は、人工光源であってもよいし、太陽光であってもよい。照射される光の光量子束密度は、特定の値に限定されない。 As shown in FIG. 14 , the culture solution 15 may be irradiated with light when the modified cyanobacteria 10 are adhered onto the substrate 30 . For example, the culture solution 15 is irradiated with light from the light source 50 . As a result, the culture of the modified cyanobacteria 10 is promoted in the culture solution 15 , and the modified cyanobacteria 10 easily adhere to the substrate 30 to form the biofilm 20 . Light irradiation conditions are not limited to specific conditions. The irradiated light may be continuous light or monochromatic light. The light source 50 may be an artificial light source or sunlight. The photon flux density of the irradiated light is not limited to a specific value.

改変シアノバクテリア10を基材30上に付着させるときに、培養液15が収容された空間に対して通気がなされてもよい。これにより、培養液15において多くの改変シアノバクテリア10が基材30上に付着しやすくなり、バイオフィルム20の生産性が向上しやすい。図14に示す通り、容器40は、インレット41及びアウトレット42を有する。例えば、インレット41を通過して容器40の内部45に空気が供給され、かつ、内部45の空気がアウトレット42を通過して容器40の外部に排出される。これにより、培養液15が収容された空間に対して通気がなされる。通気は、改変シアノバクテリア10を基材30上に付着させるときに、全期間にわたって連続的に行われてもよいし、一部の期間で連続的に行われてもよいし、断続的に行われてもよい。改変シアノバクテリア10を基材30上に付着させるときに、培養液15が収容された空間に対して通気がなされなくてもよい。なお、本明細書において、「空間」とは、物質が存在し現象がおこる場所を意味する。通気は、培養液15が収容された空間に対して空気を積極的に送り込むことを含む。 When the modified cyanobacteria 10 are attached onto the substrate 30, the space containing the culture solution 15 may be ventilated. This makes it easier for many modified cyanobacteria 10 to adhere to the base material 30 in the culture solution 15, and the productivity of the biofilm 20 tends to be improved. As shown in FIG. 14, container 40 has inlet 41 and outlet 42 . For example, air is supplied to the interior 45 of the container 40 through the inlet 41 and the air in the interior 45 is discharged to the outside of the container 40 through the outlet 42 . Thereby, the space in which the culture solution 15 is stored is ventilated. When the modified cyanobacteria 10 are deposited on the substrate 30, aeration may be performed continuously over the entire period, continuously during a part of the period, or intermittently. may be broken. When the modified cyanobacteria 10 are adhered onto the substrate 30, the space containing the culture medium 15 may not be ventilated. In this specification, "space" means a place where a substance exists and a phenomenon occurs. Aeration includes actively sending air into the space in which the culture solution 15 is accommodated.

改変シアノバクテリア10が基材30上に付着する限り、基材30は特定の基材に限定されない。基材30は、例えば、シリコーンラバー又はポリ塩化ビニルを含む。これにより、改変シアノバクテリア10が基材30上に付着しやすく、バイオフィルム20を製造しやすい。また、基材30がシリコーンラバーを含む場合、良好な品質のバイオフィルム20が得られやすい。 Substrate 30 is not limited to a particular substrate, as long as modified cyanobacteria 10 adhere to substrate 30 . Substrate 30 includes, for example, silicone rubber or polyvinyl chloride. This makes it easier for the modified cyanobacteria 10 to adhere onto the substrate 30 and to produce the biofilm 20 easily. Moreover, when the base material 30 contains silicone rubber, the biofilm 20 of good quality is likely to be obtained.

改変シアノバクテリア10が基材30上に付着する限り、容器40の材料は特定の材料に限定されない。例えば、培養液15に対して光が照射される場合、容器40はその光を透過する。容器40は、例えば、無機ガラス製であってもよいし、有機ガラス製であってもよいし、樹脂製であってもよいし、プラスチック製であってもよい。 As long as the modified cyanobacteria 10 adhere to the substrate 30, the material of the container 40 is not limited to a specific material. For example, when the culture solution 15 is irradiated with light, the container 40 transmits the light. The container 40 may be made of, for example, inorganic glass, organic glass, resin, or plastic.

改変シアノバクテリア10を基材30上に付着させることができる限り、培養液15に含まれる成分は特定の成分に限定されない。培養液15は、シアノバクテリアの培養に必要な公知の成分を含みうる。 As long as the modified cyanobacteria 10 can adhere to the substrate 30, the components contained in the culture solution 15 are not limited to specific components. The culture solution 15 may contain known components necessary for culturing cyanobacteria.

改変シアノバクテリア10を基材30上に付着させるときの培養液15の温度は、バイオフィルム20を製造できる限り、特定の値に限定されない。その温度は、例えば、改変シアノバクテリア10の培養が可能な温度である。 The temperature of the culture solution 15 when the modified cyanobacteria 10 are adhered onto the substrate 30 is not limited to a specific value as long as the biofilm 20 can be produced. The temperature is, for example, a temperature at which the modified cyanobacteria 10 can be cultured.

図15は、バイオフィルムの製造方法の別の一例を示す図である。この製造方法では、基材30を使用せずにバイオフィルム20を製造できる。この製造方法では、まず、改変シアノバクテリア10を含む培養液15を培養液15と空気との間の気液界面17が存在するように貯留する。例えば、培養液15は、容器46の内部47に貯留され、気液界面17より上に空気が存在する。その後、改変シアノバクテリア10を気液界面17に沿って面状に凝集させる。これにより、バイオフィルム20を製造できる。 FIG. 15 is a diagram showing another example of a biofilm production method. In this manufacturing method, biofilm 20 can be manufactured without using substrate 30 . In this manufacturing method, first, a culture solution 15 containing modified cyanobacteria 10 is stored such that an air-liquid interface 17 exists between the culture solution 15 and air. For example, the culture solution 15 is stored in the interior 47 of the container 46 and air exists above the air-liquid interface 17 . After that, the modified cyanobacteria 10 are aggregated in a plane along the gas-liquid interface 17 . Thereby, the biofilm 20 can be manufactured.

図15に示す通り、改変シアノバクテリア10を気液界面17に沿って面状に凝集させるときに、培養液15に対して光が照射されてもよい。例えば、光源50からの光が培養液15に対して照射される。これにより、培養液15において改変シアノバクテリア10の培養が促され、改変シアノバクテリア10が気液界面17に沿って面状に凝集してバイオフィルム20が形成されやすい。光の照射条件は、特定の条件に限定されない。照射される光は、連続光であってもよいし、単色光であってもよい。光源50は、人工光源であってもよいし、太陽光であってもよい。照射される光の光量子束密度は、特定の値に限定されない。 As shown in FIG. 15, the culture medium 15 may be irradiated with light when the modified cyanobacteria 10 are planarly aggregated along the air-liquid interface 17 . For example, the culture solution 15 is irradiated with light from the light source 50 . As a result, the culture of the modified cyanobacteria 10 is promoted in the culture solution 15 , and the modified cyanobacteria 10 easily aggregate in a plane along the air-liquid interface 17 to form a biofilm 20 . Light irradiation conditions are not limited to specific conditions. The irradiated light may be continuous light or monochromatic light. The light source 50 may be an artificial light source or sunlight. The photon flux density of the irradiated light is not limited to a specific value.

改変シアノバクテリア10を気液界面17に沿って面状に凝集させるときに、培養液15において改変シアノバクテリア10は静置培養されている。これにより、改変シアノバクテリア10が気液界面17に沿って面状に凝集しやすい。この静置培養において、容器46の内部47は、典型的には通気されない。 The modified cyanobacteria 10 are statically cultured in the culture solution 15 when the modified cyanobacteria 10 are agglutinated in a plane along the air-liquid interface 17 . This makes it easier for the modified cyanobacteria 10 to aggregate in a plane along the gas-liquid interface 17 . In this static culture, interior 47 of container 46 is typically not aerated.

改変シアノバクテリア10を気液界面17に沿って面状に凝集させることができる限り、培養液15のpHは特定の値に限定されない。培養液15のpHは、例えば6.5以上8.4以下である。この場合、改変シアノバクテリア10を気液界面17に沿って面状に凝集しやすい。培養液15のpHは、例えば、改変シアノバクテリア10の培養直前における値を意味する。 The pH of the culture solution 15 is not limited to a specific value as long as the modified cyanobacteria 10 can be planarly aggregated along the air-liquid interface 17 . The pH of the culture solution 15 is, for example, 6.5 or more and 8.4 or less. In this case, the modified cyanobacteria 10 tend to aggregate in a plane along the gas-liquid interface 17 . The pH of the culture medium 15 means, for example, the value immediately before the culture of the modified cyanobacteria 10 .

[6.バイオフィルム]
本実施の形態に係るバイオフィルムの製造方法により、図14及び図15に示す通り、バイオフィルム20を提供できる。バイオフィルム20は、改変シアノバクテリア10を含んでいる。改変シアノバクテリア10では、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に抑制されている。
[6. biofilm]
A biofilm 20 can be provided as shown in FIGS. 14 and 15 by the method for producing a biofilm according to the present embodiment. Biofilm 20 contains modified cyanobacteria 10 . In the modified cyanobacterium 10, the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed from 30% to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain.

バイオフィルム20は、図14に示すように基材30上に配置された状態で提供されてもよいし、基材レスで提供されてもよい。例えば、バイオフィルム20は、図15に示す通り、培養液15と空気との気液界面17に沿って配置された状態で提供されうる。この場合、バイオフィルム20は、培養液等の液体が収容された容器とともに提供される。バイオフィルム20は、基材上に配置された状態で提供されてもよいし、バイオフィルム20単体で提供されてもよい。 The biofilm 20 may be provided on a substrate 30 as shown in FIG. 14, or may be provided without a substrate. For example, the biofilm 20 can be provided along the air-liquid interface 17 between the culture solution 15 and the air, as shown in FIG. In this case, the biofilm 20 is provided together with a container containing a liquid such as culture medium. The biofilm 20 may be provided in a state arranged on a substrate, or may be provided as a single biofilm 20 .

[7.バイオフィルムを用いた有機物の製造方法]
本実施の形態に係るバイオフィルムを用いた有機物の製造方法を説明する。この製造方法において、バイオフィルム20の改変シアノバクテリア10において、有機物を産生し、その有機物を改変シアノバクテリア10の外部に分泌させる。この場合、バイオフィルム20は、基材上に配置されていてもよいし、基材上に配置されていなくてもよい。また、バイオフィルム20は、培養液15と空気との気液界面17に沿って配置された状態で配置されていてもよいし、他の状態で配置されていてもよい。有機物は、例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、又は他の生体分子である。
[7. Method for producing organic matter using biofilm]
A method for producing an organic substance using a biofilm according to this embodiment will be described. In this production method, the modified cyanobacteria 10 of the biofilm 20 produce organic substances and secrete the organic substances to the outside of the modified cyanobacteria 10 . In this case, biofilm 20 may or may not be placed on a substrate. In addition, the biofilm 20 may be arranged along the air-liquid interface 17 between the culture medium 15 and the air, or may be arranged in another state. Organics are, for example, proteins, peptides, polypeptides, enzymes, amino acids, nucleic acids, lipids, carbohydrates, or other biomolecules.

バイオフィルム20を用いて有機物を製造するときに、典型的には、改変シアノバクテリア10の培養がなされる。シアノバクテリアの培養は、一般に、表2に示すBG-11培地を用いた液体培養又はその変法に基づいて実施できる。そのため、改変シアノバクテリア10の培養も同様に実施してもよい。改変シアノバクテリア10の培養は、例えば、静置培養にて行われる。これにより、バイオフィルム20の形態が保たれやすい。バイオフィルム20を用いて有機物を製造するときの改変シアノバクテリア10の培養において、バイオフィルム20の周囲の空間に対し、通気がなされていてもよいし、通気がなされていなくてもよい。 When biofilms 20 are used to produce organic matter, modified cyanobacteria 10 are typically cultured. Cultivation of cyanobacteria can generally be carried out based on liquid culture using the BG-11 medium shown in Table 2 or a modification thereof. Therefore, culturing of modified cyanobacteria 10 may be carried out in the same manner. Cultivation of the modified cyanobacteria 10 is performed, for example, by static culture. Thereby, the shape of the biofilm 20 is easily maintained. In culturing the modified cyanobacteria 10 when producing an organic matter using the biofilm 20, the space around the biofilm 20 may or may not be ventilated.

バイオフィルム20を用いて有機物を製造するときに、培地の一部又は全体が交換されてもよい。例えば、培養液の上清の所定量を回収して、新たな培地を供給することにより、培地の交換が可能である。培養液の上清の回収により、製造された有機物を回収できる。また、新たな培地の供給により、バイオフィルム20を用いて有機物を連続的に製造できる。バイオフィルム20を用いると、例えば、35日以上の長期間にわたって有機物を製造できる。 Part or all of the medium may be replaced when the biofilm 20 is used to produce organic matter. For example, the medium can be replaced by collecting a predetermined amount of the supernatant of the culture medium and supplying a new medium. By collecting the supernatant of the culture medium, the produced organic matter can be collected. Also, by supplying new culture medium, organic matter can be continuously produced using the biofilm 20 . By using biofilm 20, organic matter can be produced over a long period of time, for example, 35 days or longer.

バイオフィルム20を用いて有機物を製造するときに、改変シアノバクテリア10の培養のための培地にaTc等の誘導物質が所定のタイミングで供給される。これにより、バイオフィルム20を用いて有機物を連続的に製造できる。 When producing an organic substance using the biofilm 20, an inducer such as aTc is supplied to the medium for culturing the modified cyanobacteria 10 at a predetermined timing. As a result, organic matter can be continuously produced using the biofilm 20 .

バイオフィルム20を用いて有機物を製造する場合、培養液の撹拌及び通気を不要にでき、有機物を製造するための制約が少ない。加えて、培養液における細胞密度が安定しやすく、培養液における細胞密度を常時モニタリングしなくてもよい。また、培養液の上清の回収により製造された有機物を回収できるので、培養液を収容する容器に接して有機物を回収するための容器を配置する必要がない。このため、容器の洗浄が容易である。このため、バイオフィルム20を用いて有機物を製造する方法は、スケールアップに適している。 When an organic substance is produced using the biofilm 20, stirring and aeration of the culture solution can be made unnecessary, and there are few restrictions for producing the organic substance. In addition, the cell density in the culture medium tends to be stable, and constant monitoring of the cell density in the culture medium is not required. Moreover, since the organic substances produced by collecting the supernatant of the culture solution can be recovered, there is no need to dispose a container for collecting the organic substances in contact with the container containing the culture solution. Therefore, cleaning of the container is easy. Therefore, the method of producing organic matter using the biofilm 20 is suitable for scale-up.

以下、実施例にて本開示のバイオフィルムの製造方法、バイオフィルム、及び有機物の製造方法について具体的に説明するが、本開示は以下の実施例のみに何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the biofilm production method, biofilm, and organic matter production method of the present disclosure will be specifically described in Examples, but the present disclosure is not limited only to the following Examples.

(実施例1及び比較例1)
上記のサンプル2と同様にして、Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を得た。この株は、遺伝子操作によって外膜が細胞壁から剥離されている株であった。上記のサンプル3と同様にして、Synechocystis dCas9株を得た。Synechocystis dCas9株は、Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株の親株に相当する。
(Example 1 and Comparative Example 1)
Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain was obtained in the same manner as sample 2 above. This strain was a strain in which the outer membrane was detached from the cell wall by genetic manipulation. Synechocystis dCas9 strain was obtained in the same manner as Sample 3 above. The Synechocystis dCas9 strain corresponds to the parent strain of the Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain.

Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を、菌体濃度OD730が0.05となるように、誘導物質である1μg/mLのaTcを含んだBG-11液体培地で希釈し、実施例1に係る培養液を調製した。BG-11液体培地のpHは、7.6であった。Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株の代わりに、Synechocystis dCas9株を用いた以外は、実施例1と同様にして、比較例1に係る培養液を調製した。実施例1に係る培養液及び比較例1に係る培養液のそれぞれを、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製の4穴プレートNunclon Delta Surfaceの各ウェルに1mL注入し、培養液に対して、100μmol m-2・s-1の光量子束密度を有する連続光を照射しながら、30℃で7日間静置培養した。この静置培養において、通気は行わなかった。 The Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain was diluted with BG-11 liquid medium containing 1 μg/mL of aTc, an inducer, so that the cell concentration OD 730 was 0.05, and the culture solution according to Example 1 was prepared. did. The pH of the BG-11 liquid medium was 7.6. A culture solution according to Comparative Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the Synechocystis dCas9 strain was used instead of the Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain. 1 mL of each of the culture solution according to Example 1 and the culture solution according to Comparative Example 1 was injected into each well of a 4-well plate Nunclon Delta Surface manufactured by Thermo Fisher Scientific, and 100 μmol m was added to the culture solution. Static culture was carried out at 30° C. for 7 days while irradiating continuous light having a photon flux density of 2 ·s −1 . No aeration was performed in this static culture.

図16A及び図16Bは、静置培養の開始から7日目の培養液の状態を示す写真である。図16Aが実施例1に対応しており、図20Bが比較例1に対応している。静置培養の開始から7日目の培養液の状態を確認した結果、実施例1では、培養液の気液界面に沿って面状の細胞の塊が浮遊しており、実施例1に係るバイオフィルムが確認された。比較例1では、培養液の気液界面付近には細胞の塊は存在しておらず、細胞はウェルの底面に沈殿していた。 16A and 16B are photographs showing the state of the culture solution on day 7 from the start of static culture. 16A corresponds to Example 1, and FIG. 20B corresponds to Comparative Example 1. FIG. As a result of confirming the state of the culture solution on the 7th day from the start of the stationary culture, in Example 1, planar cell masses were floating along the air-liquid interface of the culture solution. biofilm was confirmed. In Comparative Example 1, no clumps of cells were present near the air-liquid interface of the culture solution, and the cells were deposited on the bottom of the well.

(実施例2及び3並びに比較例2から5)
Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を、菌体濃度OD730が0.1となるように、誘導物質である1μg/mLのaTcを含んだ12mLのBG-11液体培地で希釈して、培養原液を調製した。このBG-11液体培地のpHは7.6であった。この培養原液を三角フラスコに入れて、培養原液に対して、100μmol m-2・s-1の光量子束密度を有する連続光を照射しながら30℃で3日間振とう培養した。この培養原液を、菌体濃度OD730が0.1となるように、誘導物質である1μg/mLのaTcを含んだpH6.9、pH7.9、及びpH8.8のBG-11液体培地で希釈して、それぞれ、実施例2、実施例3、及び比較例2に係る培養液を調製した。また、Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株の代わりに、Synechocystis dCas9株を用いた以外は、実施例2、実施例3、及び比較例2と同様にして、それぞれ、比較例3、4、及び5に係る培養液を調製した。実施例2及び3に係る培養液並びに比較例2、3、4、及び5に係る培養液のそれぞれをサーモフィッシャーサイエンティフィック社製の4穴プレートNunclon Delta Surfaceの各ウェルに1mL注入し、培養液に対して、100μmol m-2・s-1の光量子束密度を有する連続光を照射しながら、30℃で6日間静置培養した。この静置培養において通気は行わなかった。
(Examples 2 and 3 and Comparative Examples 2 to 5)
The Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain was diluted with 12 mL of BG-11 liquid medium containing 1 μg/mL of aTc as an inducer to prepare a culture stock solution so that the cell concentration OD 730 was 0.1. The pH of this BG-11 liquid medium was 7.6. This undiluted culture solution was placed in an Erlenmeyer flask and cultured with shaking at 30° C. for 3 days while irradiating the undiluted culture solution with continuous light having a photon flux density of 100 μmol m −2 ·s −1 . This culture stock solution was added to BG-11 liquid medium of pH 6.9, pH 7.9, and pH 8.8 containing 1 μg/mL of aTc as an inducer so that the cell concentration OD 730 was 0.1. After dilution, culture solutions according to Example 2, Example 3, and Comparative Example 2 were prepared. Further, instead of the Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain, except for using the Synechocystis dCas9 strain, in the same manner as in Example 2, Example 3, and Comparative Example 2, the culture solutions according to Comparative Examples 3, 4, and 5, respectively was prepared. 1 mL of each of the culture solutions according to Examples 2 and 3 and the culture solutions according to Comparative Examples 2, 3, 4, and 5 was injected into each well of a 4-well plate Nunclon Delta Surface manufactured by Thermo Fisher Scientific, and cultured. The liquid was statically cultured at 30° C. for 6 days while being irradiated with continuous light having a photon flux density of 100 μmol m −2 ·s −1 . No aeration was performed in this static culture.

6日間の静置培養後の各培養液の状態を確認した。その結果、実施例2及び3に係る培養液では、培養液の気液界面に沿って面状の細胞の塊が浮遊しており、実施例2及び3に係るバイオフィルムが確認された。一方、比較例2に係る培養液では、ウェルの底面に細胞の塊が沈殿していた。比較例3、4、及び5に係る培養液では、細胞の塊は確認されず、細胞はウェル底面に沈殿していた。 The state of each culture solution after 6 days of stationary culture was confirmed. As a result, in the culture solutions according to Examples 2 and 3, planar cell masses were floating along the air-liquid interface of the culture solutions, and biofilms according to Examples 2 and 3 were confirmed. On the other hand, in the culture solution according to Comparative Example 2, cell clusters were deposited on the bottom of the well. In the culture solutions according to Comparative Examples 3, 4, and 5, no cell clumps were observed, and cells were sedimented on the bottom of the wells.

(比較例1及び比較参考例1)
18.1cm2の底面を有し、その底面に基材を挟み込むことができる培養容器を作製した。この培養容器は、インレット及びアウトレットを有していた。培養容器のインレットは、培養容器の底面に基材を挟み込んだときに、その基材から2.5cmの高さに位置していた。一方、アウトレットは、基材から9.2cmの高さに位置していた。培養容器の底面に信越化学工業社製のシリコーンラバー シンエツ シリコシート BAグレード(エコノミータイプ)を基材として配置した。この基材の厚みは、0.3mmであった。
(Comparative Example 1 and Comparative Reference Example 1)
A culture vessel having a bottom surface of 18.1 cm 2 in which a substrate can be sandwiched was prepared. This culture vessel had an inlet and an outlet. The inlet of the culture vessel was located at a height of 2.5 cm from the substrate when the substrate was sandwiched between the bottom of the culture vessel. The outlet, on the other hand, was located at a height of 9.2 cm from the substrate. A silicon rubber Shin-Etsu Silico Sheet BA grade (economy type) manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. was arranged as a base material on the bottom surface of the culture vessel. The thickness of this substrate was 0.3 mm.

Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を、菌体濃度OD730が0.1となるように、誘導物質である1μg/mLアンヒドロテトラサイクリン(aTc)を含んだBG-11液体培地150mLで希釈し、参考例1に係る培養液を調製した。OD730は、波長730nmにおける光学濃度を意味する。BG-11液体培地のpHは、7.6であった。なお、特に説明する場合を除き、以下の記載において、BG-11液体培地のpHは、7.6である。Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株の代わりにSynechocystis dCas9株を用いた以外は、参考例1に係る培養液の調製と同様にして、比較参考例1に係る培養液を調製した。参考例1に係る培養液及び比較参考例1に係る培養液のそれぞれを上記の培養容器に注入し、培養液に対して、100μmol m-2・s-1の光量子束密度を有する連続光を照射しながら、30℃で2日間通気培養した。この通気培養において、3.6L/分の流量でインレットから培養容器の内部に空気を供給した。 The Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain was diluted with 150 mL of BG-11 liquid medium containing 1 μg/mL anhydrotetracycline (aTc), which is an inducer, so that the cell concentration OD 730 was 0.1. Such a culture medium was prepared. OD730 means optical density at a wavelength of 730 nm. The pH of the BG-11 liquid medium was 7.6. In the description below, the pH of the BG-11 liquid medium is 7.6, unless otherwise specified. A culture solution according to Comparative Reference Example 1 was prepared in the same manner as the culture solution according to Reference Example 1, except that the Synechocystis dCas9 strain was used instead of the Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain. The culture solution according to Reference Example 1 and the culture solution according to Comparative Reference Example 1 were each injected into the culture vessel, and continuous light having a photon flux density of 100 μmol m −2 ·s −1 was applied to the culture solution. The aeration culture was carried out at 30° C. for 2 days while irradiating. In this aeration culture, air was supplied from the inlet into the culture vessel at a flow rate of 3.6 L/min.

2日間の通気培養後の参考例1に係る培養液を観察したところ、基材上に菌体が付着して面状に凝集しており、参考例1に係るバイオフィルムが確認された。2日間の通気培養後の各培養液における菌体濃度OD730を浮遊細胞濃度として測定し、浮遊細胞濃度の値に培養液の体積である150mLを乗じて、浮遊細胞数の指標A[OD730・mL]の値を決定した。また、各培養液において、培養液の全量を除去して、基材に付着した菌体を新しいBG-11液体培地において剥離及び懸濁させて懸濁液を得た。得られた懸濁液の菌体濃度OD730をバイオフィルム化細胞濃度として測定し、バイオフィルム化細胞濃度の値に懸濁液の体積を乗じて、バイオフィルム化細胞数の指標B[OD730・mL]を決定した。これらの値を用いて、{指標Bの値/(指標Aの値+指標Bの値)}×100の演算を行い、演算結果をバイオフィルム化細胞割合[%]と決定した。結果を表5に示す。表5において、参考例1につき5回の測定結果の平均値±標準偏差を示しており、比較参考例1につき3回の測定結果の平均値±標準偏差を示している。 Observation of the culture solution according to Reference Example 1 after 2 days of aeration culture confirmed that bacterial cells adhered to the base material and aggregated in a plane, and biofilms according to Reference Example 1 were confirmed. After 2 days of aeration culture, the bacterial cell concentration OD 730 in each culture solution was measured as the floating cell concentration, and the value of the floating cell concentration was multiplied by the volume of the culture solution, 150 mL, to give an indicator of the number of floating cells A [OD 730 • mL] was determined. Further, in each culture solution, the entire amount of the culture solution was removed, and the cells adhering to the substrate were detached and suspended in a new BG-11 liquid medium to obtain a suspension. The bacterial cell concentration OD 730 of the resulting suspension was measured as the biofilm cell concentration, and the value of the biofilm cell concentration was multiplied by the volume of the suspension to give an index of the number of biofilm cells B [OD 730 • mL] was determined. Using these values, calculation of {value of index B/(value of index A + value of index B)}×100 was performed, and the calculation result was determined as biofilm cell ratio [%]. Table 5 shows the results. Table 5 shows the average ± standard deviation of the results of five measurements for Reference Example 1, and the average ± standard deviation of the results of three measurements for Comparative Reference Example 1.

Figure 2022134907000006
Figure 2022134907000006

表5に示す通り、比較参考例1における浮遊細胞数の指標Aの値は、参考例1における浮遊細胞数の指標Aの値より大きかった。この統計的仮説検定におけるp値は0.15であった。一方、参考例1におけるバイオフィルム化細胞数の指標Bの値は、比較参考例1におけるバイオフィルム化細胞数の指標Bの値より大きかった。この統計的仮説検定におけるp値は0.8×10-5であった。また、参考例1におけるバイオフィルム化細胞割合の値は、比較参考例1におけるバイオフィルム化細胞割合の値の約35倍であった。 As shown in Table 5, the value of index A for the number of suspended cells in Comparative Reference Example 1 was greater than the value of index A for the number of suspended cells in Reference Example 1. The p-value for this statistical hypothesis test was 0.15. On the other hand, the value of index B for the number of biofilm-forming cells in Reference Example 1 was greater than the value of index B for the number of biofilm-forming cells in Comparative Reference Example 1. The p-value in this statistical hypothesis test was 0.8×10 −5 . In addition, the value of the biofilm-forming cell ratio in Reference Example 1 was approximately 35 times the value of the biofilm-forming cell ratio in Comparative Reference Example 1.

(参考例2及び比較参考例2)
シリコーンラバーの代わりに、アズワン社が提供するポリ塩化ビニルシート ビニールフィルムシートを基材として用いた以外は、参考例1及び比較参考例1と同様にして、それぞれ、参考例2及び比較参考例2に係る培養液を調製した。加えて、参考例1及び比較参考例1に係る培養液の代わりに、参考例2及び比較参考例2に係る培養液を用いた以外は、それぞれ、参考例1及び比較参考例1と同様にして各培養液の通気培養を行った。2日間の通気培養後の参考例2に係る培養液を観察したところ、基材上に菌体が付着して面状に凝集しており、参考例2に係るバイオフィルムが確認された。また、2日間の通気培養の各培養液及び基材に付着した菌体を用いて参考例1及び比較参考例1と同様に、浮遊細胞数の指標A、バイオフィルム化細胞数の指標B、及びバイオフィルム化細胞割合の値を決定した。結果を表6に示す。表6において、参考例2につき3回の測定結果の平均値±標準偏差を示しており、比較参考例2につき8回の測定結果の平均値±標準偏差を示している。
(Reference Example 2 and Comparative Reference Example 2)
Comparative Reference Example 2 and Comparative Reference Example 2 were prepared in the same manner as in Reference Example 1 and Comparative Reference Example 1, respectively, except that a polyvinyl chloride sheet vinyl film sheet provided by AS ONE was used as the base material instead of the silicone rubber. A culture solution according to was prepared. In addition, instead of the culture solutions according to Reference Example 1 and Comparative Reference Example 1, the culture solutions according to Reference Example 2 and Comparative Reference Example 2 were used, respectively, in the same manner as in Reference Example 1 and Comparative Reference Example 1. Aeration culture of each culture solution was performed. Observation of the culture solution according to Reference Example 2 after 2 days of aeration culture revealed that bacterial cells adhered to the base material and aggregated in a plane, and a biofilm according to Reference Example 2 was confirmed. In addition, in the same manner as in Reference Example 1 and Comparative Reference Example 1, using each culture medium of aerobic culture for 2 days and the bacterial cells attached to the substrate, index A for the number of floating cells, index B for the number of biofilm cells, and biofilm cell percentage values were determined. Table 6 shows the results. Table 6 shows the average value±standard deviation of the results of three measurements for Reference Example 2, and the average value±standard deviation of the results of eight measurements for Comparative Reference Example 2.

Figure 2022134907000007
Figure 2022134907000007

表6に示す通り、比較参考例2における浮遊細胞数の指標Aの値は、参考例2における浮遊細胞数の指標Aの値より大きかった。この統計的仮説検定におけるp値は0.06であった。一方、参考例2におけるバイオフィルム化細胞数の指標Bの値は、比較参考例2におけるバイオフィルム化細胞数の指標Bの値より大きかった。この統計的仮説検定におけるp値は0.06であった。また、参考例2におけるバイオフィルム化細胞割合の値は、比較参考例2におけるバイオフィルム化細胞割合の値の約5倍であった。 As shown in Table 6, the value of index A for the number of suspended cells in Comparative Reference Example 2 was greater than the value of index A for the number of suspended cells in Reference Example 2. The p-value for this statistical hypothesis test was 0.06. On the other hand, the value of index B for the number of biofilm-forming cells in Reference Example 2 was greater than the value of index B for the number of biofilm-forming cells in Comparative Reference Example 2. The p-value for this statistical hypothesis test was 0.06. In addition, the value of the biofilm-forming cell ratio in Reference Example 2 was approximately five times the value of the biofilm-forming cell ratio in Comparative Reference Example 2.

(参考例3)
Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を、菌体濃度OD730が0.1となるように、誘導物質である1μg/mLのaTcを含んだBG-11液体培地12mLで希釈し、参考例3に係る培養液を調製した。この培養液を三角フラスコに入れ、100μmol m-2・s-1の光量子束密度を有する連続光を照射しながら、30℃で2日間振とう培養した。2日間の振とう培養後の培養液を、菌体濃度OD730に培養液の体積を乗じて算出される細胞数の指標が32[OD730・mL]になるように、参考例1の通気培養で用いた培養容器に注入した。その後、100μmol m-2・s-1の光量子束密度を有する連続光を培養液に照射しながら、30℃で2日間静置培養した。この静置培養において培養容器の内部に対して通気は行わなかった。また、この静置培養において、参考例1の通気培養と同様に基材としてシリコーンラバーを用いた。2日間の静置培養後の培養液を観察したところ、基材上に菌体が付着して面状に凝集しており、参考例3に係るバイオフィルムが確認された。
(Reference example 3)
The Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain was diluted with 12 mL of BG-11 liquid medium containing 1 μg/mL aTc as an inducer so that the cell concentration OD 730 was 0.1, and the culture solution according to Reference Example 3 was added. prepared. This culture solution was placed in an Erlenmeyer flask and cultured with shaking at 30° C. for 2 days while being irradiated with continuous light having a photon flux density of 100 μmol m −2 ·s −1 . The culture solution after shaking culture for 2 days was aerated as in Reference Example 1 so that the cell count index calculated by multiplying the cell concentration OD 730 by the volume of the culture solution was 32 [OD 730 mL]. It was injected into the culture vessel used for culture. After that, static culture was carried out at 30° C. for 2 days while irradiating the culture medium with continuous light having a photon flux density of 100 μmol m −2 ·s −1 . In this stationary culture, the inside of the culture vessel was not aerated. In addition, in this stationary culture, silicone rubber was used as a base material in the same manner as in the aerobic culture of Reference Example 1. Observation of the culture solution after static culture for 2 days revealed that bacterial cells adhered to the base material and agglomerated in a plane, and a biofilm according to Reference Example 3 was confirmed.

2日間の静置培養後の培養液及び基材に付着した菌体を用いて、参考例1と同様に、浮遊細胞数の指標A、バイオフィルム化細胞数の指標B、及びバイオフィルム化細胞割合の値を決定した。結果を表7に示す。表7において、参考例3につき3回の測定結果の平均値±標準偏差を示している。また、比較のために、参考例1の結果を表7に再掲する。 Using the culture solution after static culture for 2 days and the bacterial cells attached to the substrate, in the same manner as in Reference Example 1, the indicator A for the number of floating cells, the indicator B for the number of biofilm-forming cells, and the biofilm-forming cells Percentage values were determined. Table 7 shows the results. Table 7 shows the mean±standard deviation of three measurement results for Reference Example 3. For comparison, the results of Reference Example 1 are shown again in Table 7.

Figure 2022134907000008
Figure 2022134907000008

表7に示す通り、参考例3におけるバイオフィルム化細胞割合は、参考例1におけるバイオフィルム化細胞割合の52%程度に低下していた。 As shown in Table 7, the biofilm-forming cell ratio in Reference Example 3 was reduced to about 52% of the biofilm-forming cell ratio in Reference Example 1.

(参考例4及び5)
Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を、菌体濃度OD730が0.1となるように、誘導物質である1μg/mLのaTcを含んだ150mLのBG-11液体培地で希釈し、培養液を作製した。この培養液を、シリコーンラバー又はポリ塩化ビニルシートが基材として配置された参考例1で用いた培養容器に注入し、培養液に対して、100μmol m-2・s-1の光量子束密度を有する連続光を照射しながら、30℃で2日間通気培養した。この通気培養において、3.6L/分の流量でインレットから培養容器の内部に空気を供給した。基材としてシリコーンラバーを使用した例が参考例4に相当し、基材としてポリ塩化ビニルシートを使用した例が参考例5に相当する。
(Reference Examples 4 and 5)
The Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain was diluted with 150 mL of BG-11 liquid medium containing 1 μg/mL of aTc as an inducer to prepare a culture solution so that the cell concentration OD 730 was 0.1. This culture solution was injected into the culture vessel used in Reference Example 1, in which a silicone rubber or polyvinyl chloride sheet was arranged as a base material, and a photon flux density of 100 μmol m −2 s −1 was applied to the culture solution. Aeration culture was carried out at 30° C. for 2 days while irradiating with continuous light. In this aeration culture, air was supplied from the inlet into the culture vessel at a flow rate of 3.6 L/min. An example using a silicone rubber as a base material corresponds to Reference Example 4, and an example using a polyvinyl chloride sheet as a base material corresponds to Reference Example 5.

2日間の通気培養によって基材上に菌体が付着して面状に凝集し、バイオフィルムが形成されていた。培養液の上清を35mLの分量で残して培養容器の内部から除去し、150mLの新しいBG-11培地を培養容器の内部に加えた。このBG-11培地には、誘導物質である1μg/mLのaTcが含まれていた。その後、培養容器のインレット及びアウトレットをゴム栓で封じ、培養容器の内部を密閉した。この状態で通気を行わずに静置培養を開始した。 After 2 days of aerobic culture, the cells adhered to the substrate and agglomerated in a plane to form a biofilm. The culture supernatant was removed from the interior of the culture vessel, leaving a 35 mL portion, and 150 mL of fresh BG-11 medium was added to the interior of the culture vessel. The BG-11 medium contained 1 μg/mL of aTc, an inducer. After that, the inlet and outlet of the culture vessel were sealed with rubber plugs to seal the inside of the culture vessel. In this state, static culture was started without aeration.

14日間の静置培養後に、培養液及び基材に付着した菌体を用いて、参考例1と同様にして、浮遊細胞数の指標A、バイオフィルム化細胞数の指標B、及びバイオフィルム化細胞割合の値を決定した。結果を表8に示す。また、静置培養直前の培養液の上清及び14日間の静置培養後の培養液の上清における分泌タンパク質濃度を測定した。分泌タンパク質濃度の測定は、以下の通り行った。サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のBCAタンパク質アッセイ試薬のA液とB液を50:1の体積比で混合して500μLのworking reagentを調製した。測定対象のサンプル液及び濃度既知のウシ血清アルブミン溶液のそれぞれを50μLの分量でworking reagentに添加した。ウシ血清アルブミン溶液は一般的なタンパク質の標準溶液として用いられている。working reagentに対して測定対象のサンプル液が添加された試料及びworking reagentに対してウシ血清アルブミン溶液が添加された試料を37℃で30分間インキュベートし、冷ましたのちに、それらの試料の波長562nmにおける吸光度を測定した。得られた濃度既知のウシ血清アルブミン溶液の吸光度のデータをもとに検量線を作成し、この検量線をもとに測定対象のサンプル溶液に含まれるタンパク質濃度を算出した。14日間の静置培養後の培養液の上清における分泌タンパク質濃度から静置培養直前の培養液の上清における分泌タンパク質濃度の濃度を差し引いて、分泌タンパク質濃度の変化量を決定した。結果を表8に示す。表8において、各値は3回の測定結果の平均値±標準偏差で示されている。 After static culture for 14 days, using the culture solution and the cells attached to the substrate, in the same manner as in Reference Example 1, the indicator A for the number of floating cells, the indicator B for the number of biofilm-forming cells, and biofilm formation Cell percentage values were determined. Table 8 shows the results. In addition, the secreted protein concentration was measured in the supernatant of the culture solution immediately before static culture and in the supernatant of the culture solution after static culture for 14 days. Measurement of secretory protein concentration was performed as follows. A solution A and a solution B of BCA protein assay reagents manufactured by Thermo Fisher Scientific were mixed at a volume ratio of 50:1 to prepare 500 μL of working reagent. A sample liquid to be measured and a bovine serum albumin solution of known concentration were each added to the working reagent in an amount of 50 μL. A bovine serum albumin solution is used as a general protein standard solution. A sample in which the sample solution to be measured was added to the working reagent and a sample in which the bovine serum albumin solution was added to the working reagent were incubated at 37°C for 30 minutes and cooled. was measured. A calibration curve was prepared based on the obtained absorbance data of bovine serum albumin solutions with known concentrations, and the protein concentration contained in the sample solution to be measured was calculated based on this calibration curve. The amount of change in secreted protein concentration was determined by subtracting the concentration of secreted protein in the supernatant of the culture immediately before static culture from the concentration of secreted protein in the supernatant of the culture after static culture for 14 days. Table 8 shows the results. In Table 8, each value is shown as the mean±standard deviation of three measurements.

Figure 2022134907000009
Figure 2022134907000009

表8に示す通り、参考例4及び5において、バイオフィルム化細胞数の指標B及び分泌タンパク質濃度の変化量に有意な差はみられなかった。バイオフィルム化細胞数の指標B及び分泌タンパク質濃度の変化量に関する統計的仮説検定におけるp値は、それぞれ、0.14及び0.98であった。一方で、参考例5における浮遊細胞数の指標Aの値は、参考例4における浮遊細胞数の指標Aの値より低かった。この統計的仮説検定におけるp値は、0.02であった。これらの結果から、シリコーンラバー及びポリ塩化ビニルシートのいずれの基材を用いても、バイオフィルムにおける菌体のタンパク質生産能力は維持されることが理解される。一方、基材としてシリコーンラバーを使用することにより、基材としてポリ塩化ビニルシートを使用した場合に比べて、細胞増殖が阻害されにくいことが示唆された。これは、シリコーンラバーの基材がポリ塩化ビニルシートの基材よりも通気性に優れることに起因しているのではないかと考えられる。 As shown in Table 8, in Reference Examples 4 and 5, no significant difference was observed in the index B of the number of biofilm-forming cells and the amount of change in secretory protein concentration. The p-values in the statistical hypothesis test for the biofilm number index B and the amount of change in secreted protein concentration were 0.14 and 0.98, respectively. On the other hand, the value of index A for the number of suspended cells in Reference Example 5 was lower than the value of index A for the number of suspended cells in Reference Example 4. The p-value for this statistical hypothesis test was 0.02. From these results, it is understood that the protein-producing ability of the bacterial cells in the biofilm is maintained regardless of whether the substrate is a silicone rubber or a polyvinyl chloride sheet. On the other hand, it was suggested that cell proliferation is less likely to be inhibited by using silicone rubber as the base material than when using a polyvinyl chloride sheet as the base material. This is presumably because the base material of silicone rubber is superior in air permeability to the base material of polyvinyl chloride sheet.

14日間の静置培養後に、基材に付着した菌体を剥離及び懸濁させて得られた懸濁液の吸収スペクトルを測定した。結果を図17に示す。図17において、実線のグラフが参考例4に関する結果を示し、破線のグラフが参考例5に関する結果を示す。図17に示すデータから、波長750nmにおける吸光度A750に対する、主な光合成光捕集タンパク質であるフィコビリタンパク質に由来する630nmにおける吸光度A630の比A630/A750の値を求めた。その結果、実施例4において、A630/A750は1.24±0.03であり、参考例5において、A630/A750は1.18±0.04であった。参考例5におけるA630/A750の値は、参考例4におけるA630/A750の値よりも低い傾向にあった。この統計的仮説検定におけるp値は、0.08であった。 After static culture for 14 days, the absorption spectrum of the suspension obtained by peeling and suspending the cells adhering to the substrate was measured. The results are shown in FIG. In FIG. 17 , the solid-line graph indicates the results for Reference Example 4, and the broken-line graph indicates the results for Reference Example 5. From the data shown in FIG. 17, the ratio A 630 /A 750 of the absorbance A 630 at 630 nm derived from phycobiliprotein, which is a major photosynthetic light-harvesting protein, relative to the absorbance A 750 at a wavelength of 750 nm was determined. As a result, in Example 4, A 630 /A 750 was 1.24±0.03, and in Reference Example 5, A 630 /A 750 was 1.18±0.04. The A 630 /A 750 value in Reference Example 5 tended to be lower than the A 630 / A 750 value in Reference Example 4. The p-value for this statistical hypothesis test was 0.08.

14日間の静置培養後に基材に付着した菌体を剥離及び懸濁させて得られた懸濁液の写真を図18に示す。図18において左側2つのサンプル瓶に入っている懸濁液が参考例4に対応しており、右側2つのサンプル瓶に入っている懸濁液が参考例5に対応している。この写真から、参考例5に係る懸濁液はその色が黄色くなっており、chlorosisが起こっていることが確認された。一方、参考例4に係る懸濁液は、参考例5に係る懸濁液よりも濃い緑を呈していた。これらの結果より、基材としてシリコーンラバーを使用することにより、基材としてポリ塩化ビニルシートを使用した場合に比べて、細胞の生育状態が良好になりやすいことが示唆された。これは、シリコーンラバーの基材がポリ塩化ビニルシートの基材よりも通気性に優れることに起因しているのではないかと考えられる。 FIG. 18 shows a photograph of a suspension obtained by peeling off and suspending the cells adhering to the substrate after static culture for 14 days. In FIG. 18, the suspension contained in the two sample bottles on the left side corresponds to Reference Example 4, and the suspension contained in the two sample bottles on the right side corresponds to Reference Example 5. From this photograph, it was confirmed that the color of the suspension according to Reference Example 5 had turned yellow, indicating that chlorosis had occurred. On the other hand, the suspension according to Reference Example 4 exhibited a darker green color than the suspension according to Reference Example 5. These results suggest that the use of silicone rubber as a base material tends to improve cell growth conditions as compared to the use of a polyvinyl chloride sheet as a base material. This is presumably because the base material of silicone rubber is superior in air permeability to the base material of polyvinyl chloride sheet.

(参考例6)
図19は、スケールアップの可能性を検討するため試作した培養容器40sを示す断面図である。培養容器18は、基材30、底部材40a、中枠40b、蓋部材40c、シール部材43、及びシール部材44を備えている。底部材40a、中枠40b、及び蓋部材40cのそれぞれはアクリル樹脂によって作製されている。中枠40bは、底部材40aと蓋部材40cとの間に配置されている。底部材40a、中枠40b、及び蓋部材40cは、スナップ錠によって、底部材40a及び蓋部材40cが中枠40bに対して押圧された状態で固定されている。基材30は、底部材40aと中枠40bとの間に配置され、底部材40a及び中枠40bによって押圧された状態で固定されている。基材30は、実施例1で使用されたシリコーンラバーと同一種類のシリコーンラバーのシートである。底部材40aの基材30に接する面には環状の溝が形成されており、この溝にシール部材43が配置されている。これにより、底部材40aと基材30との隙間がシールされている。また、中枠40bの蓋部材40cに接する面には環状の溝が形成されており、この溝にシール部材44が配置されている。これにより、中枠40bと蓋部材40cとの隙間がシールされている。
(Reference example 6)
FIG. 19 is a cross-sectional view showing a culture vessel 40s that was produced as a trial to examine the possibility of scale-up. The culture container 18 includes a base material 30, a bottom member 40a, a middle frame 40b, a lid member 40c, a sealing member 43, and a sealing member 44. Each of the bottom member 40a, the middle frame 40b, and the lid member 40c is made of acrylic resin. The middle frame 40b is arranged between the bottom member 40a and the lid member 40c. The bottom member 40a, the middle frame 40b, and the lid member 40c are fixed with a snap lock in a state in which the bottom member 40a and the lid member 40c are pressed against the middle frame 40b. The base material 30 is arranged between the bottom member 40a and the middle frame 40b, and is fixed while being pressed by the bottom member 40a and the middle frame 40b. The substrate 30 is a sheet of silicone rubber of the same type as the silicone rubber used in Example 1. An annular groove is formed in the surface of the bottom member 40a in contact with the base material 30, and the seal member 43 is arranged in this groove. Thereby, the gap between the bottom member 40a and the base member 30 is sealed. An annular groove is formed in the surface of the middle frame 40b that contacts the lid member 40c, and a seal member 44 is arranged in this groove. Thereby, the gap between the middle frame 40b and the lid member 40c is sealed.

培養容器40sの内部において、基材30によって676cm2の底面が形成されている。中枠40bには、基材30から3cmの高さにインレット41及びアウトレット42が形成されている。 Inside the culture container 40s, the base material 30 forms a bottom surface of 676 cm 2 . An inlet 41 and an outlet 42 are formed at a height of 3 cm from the base material 30 in the middle frame 40b.

Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を、菌体濃度OD730が0.1となるように、誘導物質である1μg/mLのaTcを含んだ1LのBG-11液体培地で希釈し、参考例6に係る培養液を作製した。この培養液を、上記の培養容器40sの内部に注入し、培養液に対して、100μmol m-2・s-1の光量子束密度を有する連続光を照射しながら、30℃で7日間通気培養した。この通気培養において、30L/分の流量でインレット41から培養容器40sの内部に空気を供給した。 The Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain was diluted with 1 L of BG-11 liquid medium containing 1 μg/mL of aTc as an inducer so that the cell concentration OD 730 was 0.1, and the culture solution according to Reference Example 6 was made. This culture solution is injected into the above culture vessel 40s, and aeration culture is performed at 30° C. for 7 days while irradiating the culture solution with continuous light having a photon flux density of 100 μmol m −2 s −1 . did. In this aeration culture, air was supplied from the inlet 41 into the culture vessel 40s at a flow rate of 30 L/min.

7日間の通気培養の後、培養容器40sのインレット41及びアウトレット42に綿栓を詰めて、通気を行わない静置培養を開始した。静置培養の開始から0日目、7日目、14日目、23日目、及び34日目に培養液の上清の浮遊細胞濃度OD730及びタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度は、参考例4及び5に示す方法と同様の方法で測定した。また、培養液の上清のタンパク質濃度と培養液の上清の体積から分泌タンパク質量を算出した。結果を図20に示す。静置培養の開始から0日目、7日目、14日目、23日目には、誘導物質である1μg/mLのaTcを添加した。また、静置培養の開始から14日目に培養液の上清の半量を新しいBG-11培地に入れ替え、静置培養の開始から23日目には130mLの新しいBG-11培地を添加した。培養液の上清の浮遊細胞濃度、タンパク質濃度、及び体積の測定は、これらの操作を行う前に行った。 After seven days of aeration culture, the inlet 41 and the outlet 42 of the culture container 40s were filled with cotton plugs, and static culture without aeration was started. On the 0th day, 7th day, 14th day, 23rd day and 34th day from the start of static culture, the suspension cell concentration OD 730 and protein concentration of the culture supernatant were measured. The protein concentration was measured by the same method as shown in Reference Examples 4 and 5. In addition, the amount of secreted protein was calculated from the protein concentration of the supernatant of the culture medium and the volume of the supernatant of the culture medium. The results are shown in FIG. On the 0th day, 7th day, 14th day, and 23rd day from the start of static culture, 1 μg/mL of aTc as an inducer was added. On the 14th day after the start of static culture, half of the supernatant of the culture was replaced with fresh BG-11 medium, and on the 23rd day after the start of static culture, 130 mL of fresh BG-11 medium was added. Suspended cell concentration, protein concentration, and volume of the culture supernatant were measured prior to these operations.

図20に示す通り、浮遊細胞濃度OD730は静置培養の期間中に常に0.5を下回り、菌体がバイオフィルムとして安定的に生育されていたことが示された。一方、分泌タンパク質量は、静置培養の期間中に継続的にタンパク質が分泌されたことを示した。 As shown in FIG. 20, the suspension cell concentration OD 730 was always below 0.5 during the static culture period, indicating that the cells were stably growing as a biofilm. On the other hand, the amount of secreted protein showed that the protein was continuously secreted during the static culture period.

静置培養の開始から36日目に基材に付着した菌体を剥離及び懸濁させて懸濁液を調製した。この懸濁液を用いて、参考例1と同様にして、浮遊細胞数の指標A及びバイオフィルム化細胞数の指標Bの値を決定した。その結果、浮遊細胞数の指標Aは、322[OD730・mL]であり、バイオフィルム化細胞数の指標Bは、779[OD730・mL]であった。これらの値から算出されるバイオフィルム化細胞割合は71%であった。培養容器40sのようなスケールアップされた試作機を用いた場合でも、小スケールの参考例1と同程度の割合の細胞がバイオフィルムの形成に寄与することが確認された。 On the 36th day from the start of static culture, the cells adhering to the substrate were peeled off and suspended to prepare a suspension. Using this suspension, in the same manner as in Reference Example 1, the values of the index A for the number of floating cells and the index B for the number of biofilm-forming cells were determined. As a result, the index A for the number of floating cells was 322 [OD 730 -mL], and the index B for the number of biofilm-forming cells was 779 [OD 730 -mL]. The biofilm cell percentage calculated from these values was 71%. Even when a scaled-up prototype such as the culture vessel 40s was used, it was confirmed that the same proportion of cells as in the small-scale Reference Example 1 contributed to biofilm formation.

以上、本開示に係るバイオフィルムの製造方法、バイオフィルム、及び有機物の製造方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲に含まれる。 The biofilm production method, biofilm, and organic matter production method according to the present disclosure have been described above based on the embodiments, but the present disclosure is not limited to these embodiments. As long as it does not deviate from the gist of the present disclosure, various modifications that a person skilled in the art can think of are applied to the embodiments, and other forms constructed by combining some of the constituent elements of the embodiments are also within the scope of the present disclosure. included.

上記の実施の形態では、シアノバクテリアにおける外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能を抑制させることにより、菌体内で産生されたタンパク質を菌体外に漏出させる例について説明したが、これに限られない。例えば、シアノバクテリアに外力を加えることにより、外膜と細胞壁との結合を弱めてもよく、外膜を脆弱化させてもよい。また、シアノバクテリアの培養液に酵素又は薬剤に添加することにより、外膜を脆弱化させてもよい。 In the above embodiment, an example was described in which a protein produced within a bacterium is leaked out of the bacterium by inhibiting the function of a protein involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria. is not limited to For example, by applying an external force to the cyanobacteria, the bond between the outer membrane and the cell wall may be weakened, and the outer membrane may be weakened. Enzymes or agents may also be added to the cyanobacterial culture to weaken the outer membrane.

本開示のバイオフィルムの製造方法、バイオフィルム、及び有機物の製造方法によれば、水、光、空気、及び、微量の無機物を改変シアノバクテリアに与えて培養することにより、効率良く有機物を得ることができる。例えば、食品成分の原料若しくは化合物の製造のための酵素、医療用分野における診断用酵素若しくは治療用酵素、又は、農水畜産分野における飼料用酵素などを得ることができる。 According to the biofilm production method, biofilm, and organic matter production method of the present disclosure, water, light, air, and a trace amount of inorganic matter are given to modified cyanobacteria for cultivation, thereby efficiently obtaining organic matter. can be done. For example, it is possible to obtain raw materials for food ingredients or enzymes for producing compounds, diagnostic enzymes or therapeutic enzymes in the medical field, or feed enzymes in the field of agriculture, fisheries and livestock.

1 内膜
2 ペプチドグリカン
3 糖鎖
4 細胞壁
5 外膜
6 SLHドメイン保持型外膜タンパク質
7 SLHドメイン
8 有機物チャネルタンパク質
9 細胞壁-ピルビン酸修飾酵素
10 改変シアノバクテリア
15 培養液
20 バイオフィルム
30 基材
1 inner membrane 2 peptidoglycan 3 sugar chain 4 cell wall 5 outer membrane 6 SLH domain-retaining outer membrane protein 7 SLH domain 8 organism channel protein 9 cell wall-pyruvate modifying enzyme 10 modified cyanobacteria 15 culture medium 20 biofilm 30 substrate

Claims (9)

シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に抑制されている改変シアノバクテリアを含む培養液を前記培養液と空気との間の気液界面が存在するように貯留することと、
前記改変シアノバクテリアを前記気液界面に沿って面状に凝集させることと、を含む、
バイオフィルムの製造方法。
A culture medium containing a modified cyanobacterium in which the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed to 30% to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain is placed between the culture medium and air. storing such that there is a gas-liquid interface of
Aggregating the modified cyanobacteria into a planar shape along the gas-liquid interface;
Methods of producing biofilms.
前記改変シアノバクテリアを前記気液界面に沿って面状に凝集させるときに、前記培養液に対して光が照射される、請求項1に記載のバイオフィルムの製造方法。 The method for producing a biofilm according to claim 1, wherein the culture solution is irradiated with light when the modified cyanobacteria are planarly aggregated along the air-liquid interface. 前記改変シアノバクテリアを前記気液界面に沿って面状に凝集させるときに、前記培養液において前記改変シアノバクテリアは静置培養されている、請求項1又は2に記載のバイオフィルムの製造方法。 3. The method for producing a biofilm according to claim 1, wherein the modified cyanobacteria are statically cultured in the culture medium when the modified cyanobacteria are planarly aggregated along the air-liquid interface. 前記培養液のpHは、例えば6.5以上8.4以下である、請求項1から3のいずれか1項に記載のバイオフィルムの製造方法。 The method for producing a biofilm according to any one of claims 1 to 3, wherein the culture solution has a pH of, for example, 6.5 or more and 8.4 or less. 前記タンパク質は、Surface Layer Homologyドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁-ピルビン酸修飾酵素の少なくとも1つである、請求項1から4のいずれか1項に記載のバイオフィルムの製造方法。 The method for producing a biofilm according to any one of claims 1 to 4, wherein the protein is at least one of a surface layer homology domain-retaining outer membrane protein and a cell wall-pyruvate modifying enzyme. シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に抑制されている改変シアノバクテリアを含む、バイオフィルム。 A biofilm comprising modified cyanobacteria wherein the total amount of proteins involved in the binding of the outer membrane to the cell wall in cyanobacteria is suppressed to 30% to 70% of the total amount of said proteins in the parental strain. 培養液と空気との間の気液界面に沿って配置されている、請求項6に記載のバイオフィルム。 7. The biofilm of claim 6, disposed along an air-liquid interface between the medium and air. シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が親株における当該タンパク質の総量の30%から70%に抑制されている改変シアノバクテリアを含むバイオフィルムの前記改変シアノバクテリアにおいて有機物を産生し、前記有機物を前記改変シアノバクテリアの外部に分泌させることを含む、
有機物の製造方法。
A biofilm containing a modified cyanobacterium in which the total amount of proteins involved in the binding of the outer membrane and the cell wall in the cyanobacteria is suppressed to 30% to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain, producing organic matter in the modified cyanobacteria. and secreting the organic substance to the outside of the modified cyanobacterium,
Organic production method.
前記バイオフィルムは、培養液と空気との間の気液界面に沿って配置されている、請求項8に記載の有機物の製造方法。 9. The method for producing organic matter according to claim 8, wherein the biofilm is arranged along an air-liquid interface between the culture solution and the air.
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