JP2022122293A - 骨部位を処理するために有用な細胞がシードされた組成物および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】損傷したか病気の骨、好ましくは虚血および／または壊死の骨の治療のための組成物および治療方法の提供。【解決手段】内皮先祖細胞（ＥＰＣ）および間充織幹細胞（ＭＳＣ）並びに固体のキャリア材料を含む組成物である。この組成物は、ＥＰＣとＭＳＣを少なくとも２：１の細胞数比で含む。固体のキャリア材料は、コラーゲンの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組織材料を含み、ＥＣＭ組織材料がＥＣＭ組織材料のための源組織からの生来の生物活性物質を保持し、生来の生物活性物質が、成長因子、グリコサミノグリカン類、プロテオグリカン類、および糖タンパク質を含み、ＥＣＭ組織材料のコラーゲン繊維の間、上および／または内に点在した固体としてＥＣＭ組織材料に保持されて、ＥＣＭ組織材料の乾燥重量での少なくとも１％を構成している。組成物中のＥＰＣとＭＳＣを合わせた合計数の少なくとも５０％が固体のキャリア材料に付着されている。【選択図】なし

Description

関連出願への言及
本出願は、２０１３年９月２日に申請された、米国仮特許出願番号６１／８７２，８２８の優先権の利益を要求する。それは参照されその全体が本明細書に組み入れられる。

本明細書の開示は、対象の病気または損傷を受けた組織の処理に関し、たとえば壊死が生じる場合のある骨の虚血および／または壊死領域の治療のような、骨領域の治療のための組成物および方法に関する。

虚血壊死（avascular necrosis:ＡＶＮ）は、軟骨下のプレートをしばしば含む、死んでいる骨梁のエリアにより特徴づけられる。体内の基礎的な関節と荷重支持表面の劣化は、軟骨の支援の損失をもたらし、関節の厳しい劣化に導く。骨壊死に起因する厳しい関節破壊は患者の５０％で見られる。アメリカで毎年行なわれた５００，０００の人工股関節の主な外科の問題のｌ０％は、ＡＶＮを扱うように意図される。ＡＶＮは最も一般に股関節に影響し、軟骨が全体または部分的な関節の置換を要求するのに十分に摩滅させられる前に、より若い患者にしばしば生じることがある。関節面の下の支持骨が損傷した後、軟骨の分解および損傷は、痛く不安定な関節を結果としてしばしば生じる。現在の治療は、主として創面切除および自己由来の骨移植に制限されている。ここでは外科医は患者からの海綿質骨を収穫し、２回目の切開および併発症についての技術的な挑戦がある。骨移植手続きが失敗するか、禁忌が示される場合、大腿骨頭または関節全置換術が必要である。

米国特許公開番号２００５０２６６５５６ 米国特許公開番号２００８００２５９５６ 米国特許公開番号２００９０２８０１８０ 米国特許公開番号２０１２００５２０４９ 米国特許６，２０６，９３１ 米国特許出願公開番号２００８２８６２６８ 米国特許出願番号１２／１７８，３２１ 米国特許番号５，７１１，９６９ 米国特許番号５，７５５，７９１ 米国特許番号５，８５５，６１９ 米国特許番号５，９５５，１１０ 米国特許番号５，９６８，０９６ 米国特許公開２００５００４９６３８ 米国特許出願公開２００９０３２６５７７ 米国特許出願番号１２／４８９，１９９

Ｃ．Ｈｅｅｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（２００１），Ｎｏ．７，８３３－８３９ Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９４（２００４），Ｎｏ．２，２６２－２６８

病気か破損された骨に関する、この領域および他の領域の治療を改善する重要な努力がなされているが、進行は遅かった。ＡＶＮに起因するものを含む、骨の不十分な部位の修復に役立つ、改良されたおよび／または他の組成物および方法のためのニーズが存在する。

ある態様では、本明細書の開示は骨組織の治療用組成物および方法に関する。好ましい組成物および方法は、例えば、そのような組織の部位中の新しい骨成長を引き起こすために、虚血壊死を示す骨梁組織(trabecular bone tissue)の治療を含んでいる。

従って、その実施態様のうちのいくつかでは、本明細書の開示は、虚血壊死を示す患者の部位骨を治療する方法を提供する。本発明の方法は、部位に内皮の先祖細胞および間充織の幹細胞を部位に移植することを含み、好ましくは組成物とともに移植され、該組成物は望ましくは固体のキャリア材料、たとえばコラーゲンの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組織材料を含んでいる。組成物は、有利には間充織の幹細胞に対する内皮の先祖細胞の比率として、少なくとも同じ、好ましくはより多く、望ましくは少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、あるいは少なくとも３：１である。ある形態では、そのような比は約２：１から約１０：１の範囲である。使用する場合にはコラーゲンのＥＣＭ組織は、源組織からの生来の生物活性物質を保持してもよい。生物活性物質としては、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン類、成長因子（例えばＦＧＦ－２）、および／または源組織からの生来のヘパリンがあげられる。

追加の実施態様では、本明細書の開示は、上記で要約された物質、および／または本明細書の他の箇所で識別されるような成分を含む組成物、およびそのような組成物を調製する方法に関する。特徴およびその利点と同様に追加の実施態様も、以下の記述を検討する事により当業者には明白になるだろう。

ある実施態様が以下で説明される。特定の言語は同じことについて記述するために使用されるだろう。しかし発明の範囲の制限を意図しないことは理解されるだろう。 本発明の技術分野の当業者が通常行うように、記述された実施態様の任意の変更および修正、および記述された本発明の原理のさらなる適用も意図される。

上に開示されるように、本発明のある態様は、内皮の先祖細胞（endothelial progenitor cells：ＥＰＣ）および間充織の幹細胞（mesenchymal stem cells：MSC)を含む組成物に関し、好ましくはさらに細胞外マトリックス組織を含む組成物、その製造方法、および病気か破損された骨、例えば壊死の骨の部位の治療のための使用に関する。

上に開示されるように、本発明の組成物と方法は、内皮の先祖細胞（ＥＰＣ）の使用を含む。ＥＰＣは未熟な内皮細胞で、増殖し、移動し、内皮細胞に分化する能力を有するが、まだ成熟した内皮細胞の遺伝形質を獲得していない細胞をいう。ＥＰＣは、コロニー形成単位内皮細胞(colony forming unit-endothelial cells:CFU-EC)、循環脈管原性細胞(circulating angiogenic cells:CAC)、循環内皮前駆物質(circulating endothelial precursors:CEP)、および低増殖潜在性ＥＣＦＣ(low proliferative potential ECFC :LPP-ECFC)および／または高増殖性ＥＣＦＣ(high proliferative ECFC:HPP-ECFC）を始めとする内皮コロニー形成細胞（endothelial colony-forming cells ：ECFC）を含むが、これらに限定されない。好ましい態様では、ＥＰＣはＥＣＦＣ、たとえばＨＰＰ－ＥＣＦＣを含む。

ＥＰＣは血液、骨髄あるいは臍帯血から分離することができ、成人の人間の末梢血単核細胞中のＣＤ３４＋細胞分画中で識別することができる。ＥＰＣは例えば組織傷害のようなある生理学的刺激に応じて、末梢血（循環ＥＰＣ）の中へ骨髄から移動されてもよい。循環ＥＰＣは成人の人間の血液から得ることができる。ある態様では、ＥＰＣは直接のＦＡＣＳソートあるいは他の利用可能なｅｘ－ｖｉｖｏ選択方法、たとえば磁気ビーズ、マイクロフルイディクス(microfluidics）、ラブオンナチップ(lab-on-a-chip)、アフィニティー・カラムあるいは関連する装置によって、末梢血中のＥＰＣが富化した細胞分画として、ＣＤ３４＋細胞あるいはＣＤ１３３＋細胞を単独であるいはＫＤＲ＋と組み合わせて使用して、上記あるいは他の源から分離することができる。

上に開示されるように、ＥＣＦＣは本発明における使用のための好ましい細胞である。望ましくは、ＥＣＦＣは臍帯血から得られる。ＥＣＦＣは以下によりキャラクタライズされることができる：細胞表面蛋白ＫＤＲ、ＣＤ３４、ｖＷＦ、ｅＮＯＳおよびＶＥカドヘリンの発現、および造血性細胞マーカーＣＤ４５、ＡＣ１３３、ＣＤｌｌｂおよびＣＤ１４の発現の欠如；クローンプレーティングレベルおよび第２および第３のＥＣＦＣへのリプレートへのキャパシティー；アセチル化された低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）を組込む能力；毛状の構造（capillary-like structures）を生体外で形成するキャパシティー；および／または、免疫不全のハツカネズミの生体中で人間の血管を形成し、ネズミの血管に組み込み、ネズミの体循環の一部とするキャパシティー。使用のためのＥＣＦＣ細胞集団は、本質的に（ＭＳＣと組み合わせる前に）清浄化されたＥＣＦＣ、例えばクローンＥＣＦＣ集団、または細胞の少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは１００％が上に記載されたＥＣＦＣ特性を示す細胞集団でありうる。ＥＣＦＣおよびそれらの調製方法に関する追加情報については、たとえば米国特許公開番号２００５０２６６５５６（２００５年１２月１日）、２００８００２５９５６（２００８年１月３１日）および２００９０２８０１８０（２００９年１１月１２日）を参照することができる。

本発明で使用されるＭＳＣは、任意の適切な源から、任意の適切な方法で得ることができる。ＭＳＣの適切な源としては、たとえば胎盤組織、骨髄、歯の組織、こう丸組織、子宮組織、臍帯血、臍の緒組織および皮膚組織があげられる。ＭＳＣは他の細胞との混合された集団として提供されることができ、たとえば分画されていない骨髄穿刺液あるいは清浄化された骨髄単核球細胞であることができる。ＭＳＣも、ＭＳＣの比較的純粋な集団として提供することができる。そこにおいてはたとえば集団中の細胞の少なくとも９０％はＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１５６、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１６６、Ｓｔｒｏ－１、ＦＧＦ１０、Ｐｒｘｌ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇを発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびＣＤ３１を発現しない。臍帯血から得られたＭＳＣが好ましい。ＭＳＣ、およびそれらを得る方法に関する追加情報については、たとえば米国特許公開番号２０１２００５２０４９（２０１２年３月１日）を参照することができる。

ＥＰＣおよびＭＳＣは各々、独立して患者の自己由来あるいは同種異型であることができる。例示として、ある実施態様では、たとえば臍帯血に由来した同種異型のＥＰＣおよび同種異型のＭＳＣの使用のように、ＥＰＣとＭＳＣは両方とも患者の同種異型である。

他の実施態様では、ＥＰＣは、患者の自己由来（例えば、患者の臍帯血あるいは末梢血から得られたもの）であることができる。また、ＭＳＣは患者の同種異型（例えば、同種異型の臍帯血から得られたもの）であることができる。まださらなる実施態様では、ＥＰＣは患者の同種異型（例えば、同種異型の臍帯血から得られたもの）であることができる。また、ＭＳＣは患者の自己由来（例えば、患者の臍帯血、末梢血あるいは骨髄、たとえばＭＳＣを含む骨髄穿刺液、ＭＳＣを含む清浄化された骨髄の単核細胞から得られたもの、または骨髄から得られたより清浄化されたＭＳＣ）であることができる。

本発明で使用されるコラーゲンの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料はＥＣＭ組織を含む、脱細胞された動物組織層(decellularized animal tissue layer)であることができる。この点に関して、本明細書で使用される「脱細胞された」とは、ＥＣＭ組織の生来の細胞のすべてあるいは本質的にすべてが除去されたＥＣＭ組織の状態をいう。したがって、他の（非－生来の）細胞はＥＣＭ組織上あるいは組織内に存在することができる。それはそれにもかかわらず「脱細胞された」と呼ばれる。ＥＣＭ組織層は、温血の脊椎動物（たとえば羊、牛、豚）の源組織から得ることができる。源組織層(source tissue layer)は好ましくは非ミネラル化(nonmineralized)（すなわち軟線維）源組織である。例えば、適切なＥＣＭ組織としては、粘膜下組織、腎臓部のカプセル膜、皮膚のコラーゲン、硬膜、心膜、羊膜、腹部の筋膜、大腿筋膜、漿膜、腹膜あるいは肝臓基底膜を含む基底膜層を含むものがあげられる。これらの目的にふさわしい粘膜下組織材料としては、例えば、小腸粘膜下組織を含む腸の粘膜下組織、胃粘膜下組織、膀胱粘膜下組織および子宮の粘膜下組織があげられる。本発明に役立つ粘膜下組織（潜在的に他の付随する組織とともに）を含むＥＣＭ組織は、そのような組織源を収穫し、平滑筋層、粘膜層および／または組織源内にある他の層から粘膜下組織を含むマトリックスをはがすことにより得ることができる。豚の組織源は、粘膜下組織含有ＥＣＭ組織を含む、ＥＣＭ組織を収穫するための好ましい源である。

本発明で使用されるＥＣＭ組織は好ましくは、脱細胞されて高度に浄化される。例えば、クックらの米国特許６，２０６，９３１あるいは米国特許出願公開番号ＵＳ２００８２８６２６８（２００８年１１月２０日）、２００８年７月２３日に出願された米国特許出願番号１２／１７８，３２１に記載され、これらはその全体が参照として本明細書に組込まれる。好ましいＥＣＭ組織材料は、１グラム当たり約１２未満の菌体内毒素ユニット（ＥＵ）、さらに好ましくは１グラム当たり約５ＥＵ未満、および最も好ましくは１グラム当たり約１ＥＵ未満の菌体内毒素レベルを示すだろう。さらなる好ましい態様では、粘膜下組織あるいは他のＥＣＭ材料が１ｇあたり約１未満のコロニー形成単位（ＣＦＵ）、より好ましくは１グラム当たり約０．５ＣＦＵ未満の生物負荷量を有する。菌類レベルは、たとえば１グラム当たり約１ＣＦＵ未満、好ましくは１グラム当たり約０．５ＣＦＵ未満で低いものが好ましい。核酸レベルは好ましくは約５μｇ／ｍｇ未満、より好ましくは２μｇ／ｍｇ未満、およびウィルス・レベルは好ましくは、１グラム当たり約５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）未満で、より好ましくは１グラム当たり約５ＰＦＵ未満である。粘膜下組織あるいは他のＥＣＭ組織のさらなる特性は米国特許６，２０６，９３１あるいは米国特許出願公開番号ＵＳ２００８２８６２６８に開示され、本発明の中で使用される任意のＥＣＭ組織はこれらの特性を有することができる。

ある実施態様では、本発明に使用されるＥＣＭ組織材料は、組織源から分離された層状構造を持った膜質の組織である。ＥＣＭ組織は、分離された時、完全に水和された状態で約５０～約２５０ミクロン、より典型的には完全に水和された状態で約５０～約２００ミクロンの層厚さを持っているが、分離された層は異なる厚さを有することができ、それを使用することができる。これらの層厚さは、組織源として使用される動物のタイプおよび年齢に応じて変わってもよい。同様に、これらの層厚さは、動物源から得られた組織の源に応じて変わってもよい。

利用されたＥＣＭ組織材料は、たとえばコラーゲン、および潜在的には生来のファイバーを形成することができるエラスチンのような、構造的ファイバー・タンパク質を始めとする源組織からの構造マイクロアーキテクチャーを望ましくは保持する。ある実施態様では、脱細胞されたＥＣＭ組織材料の源組織で生じることがあるように、そのようなファイバーは、非ランダムに配向されることができる。そのような非ランダムコラーゲン、および／または他の構造タンパク質ファイバーは、ある実施態様では、抗張力に関して非等方性のＥＣＭ組織を提供し、したがって少なくとも１つの他の方向における抗張力と異なる１つの方向での抗張力を有する。

細胞されたＥＣＭ組織材料は、ＥＣＭ組織材料の源に生来であり、処理を通してＥＣＭ組織材料の中に保持された１つ以上の生物活性物質を含んでもよい。例えば、粘膜下組織あるいは他のＥＣＭ組織材料は１つ以上の生来の成長因子を保持してもよい。成長因子としては、非制限的例として、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦベータ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、軟骨由来成長因子（ＣＤＧＦ）、および／または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）があげられる。本発明で使用される時、粘膜下組織あるいは他のＥＣＭ物質は、他の生来の生物活性物質を保持してもよい。生物活性物質としては、非制限的例としてタンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン類およびグリコサミノグリカン類があげられる。例えば、脱細胞されたＥＣＭ組織材料は生来のヘパリン、ヘパリン硫酸塩、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、サイトカイニンなどを含んでいてもよい。生来の物質を保持する脱細胞されたＥＣＭ組織材料は、たとえば有益な成長因子に結合する能力を示すことができるので本発明において有利に使用される。成長因子としてはたとえば骨原性骨形成タンパク質(osteogenic bone morphogenic proteins)をはじめとする骨原性成長因子のような、本発明の組成物の細胞によって、あるいは患者の移植部位の細胞によって分泌されたものがあげられる。したがって、概して言えば、粘膜下組織あるいは他のＥＣＭ組織材料は、細胞のレスポンス、たとえば細胞形態変化、増殖、成長、タンパク質あるいは遺伝子発現を直接あるいは間接的に引き起こす１つ以上の生物活性成分を源組織から保持してもよい。

本発明で使用される粘膜下組織を含むＥＣＭ物質あるいは他のＥＣＭ物質は、任意の適切な器官あるいは他の組織源、通常は軟組織源（非骨、非軟骨）を含む結合組織であるものに由来することができる。本発明で使用するために処理されたＥＣＭ物質は典型的には豊富なコラーゲンを含んでおり、最も一般的には、乾燥重量基準で少なくとも約８０％のコラーゲンから構成される。そのような自然由来のＥＣＭ物質は、大部分の成分として非ランダム配向のコラーゲン、たとえば一軸または多重軸配向であるが規則的に配向されたものを含んでいるだろう。生来の生物活性要因（例えば上に議論されたもの）を保持するように処理された時、ＥＣＭ材料はコラーゲン線維間、上および／または内に、固体として点在したこれらの要因を保持することができる。本発明で使用される特に望ましい天然由来のＥＣＭ物質は、適切な染色をした光学顕微鏡検査の下で容易に確認可能であるような有意の量で点在する、非コラーゲンの固体を含んでいるだろう。そのような非コラーゲンの固体は、本発明のある実施態様ではＥＣＭ材料の乾燥重量の大きな割合を構成することができ、たとえば様々な本発明の実施態様においては少なくとも約１重量％、少なくとも約３重量％、少なくとも約５重量％である。

本発明で使用される粘膜下組織含有あるいは他のＥＣＭ組織材料は、さらに脈管原性の特徴を示し、したがって、材料が移植されたホストの中の血管形成を引き起こすのに有効かもしれない。この点では、血管形成は、組織への増加した血液供給を生成するために、体が新しい血管を作るプロセスである。したがって、脈管原性物質は、ホスト組織と接触された時、物質の中への新しい血管の形成を促進するか助長する。バイオマテリアル移植に応じた生体内の血管形成を測定する方法が最近開発されている。例えば、そのような方法の１つは、物質の脈管原性の特徴を決定するために皮下移植組織モデルを使用する。C.Heeschen et al,Nature Medicine 7(2001),No.7,833-839参照。螢光微小血管造影法と組み合わせた時、このモデルはバイオマテリアル中への血管形成の量的および質的測定手段を提供することができる。C.Johnson et al,Circulation Research 94(2004),No.2,262-26８参照。

脱細胞されたＥＣＭ組織層は単独層移植組織として本発明で使用することができるが、ある実施態様では多層の構成物の中で使用されるだろう。この点では、薄層を互いに積層するための様々なテクニックが知られており、本発明でグラフトのために使用される多層の構成物を製造するために使用することができる。例えばコラーゲンの材料の複数（すなわち２以上）の層、たとえば粘膜下組織含有あるいは他のＥＣＭ材料は多層の構造を形成するためにともに接合することができる。例示的には、２から約２００の脱細胞されたコラーゲンのＥＣＭ組織層が互いに接合されて、本発明での使用のための多層の構成物を提供することができる。ある実施態様では、２から８の脱細胞されたコラーゲンのＥＣＭ組織層が互いに接合されて、本発明での使用のための多層の構成物を形成することができる。好ましくは粘膜下組織を含むＥＣＭ組織層は腸の組織、より好ましくは小腸の組織から分離される。豚由来の組織は、これらの目的のために好ましい。ＥＣＭ組織の層は、加熱下または非加熱下での脱水熱処理結合(dehydrothermal bonding)、または凍結乾燥、接着剤、のりあるいは他の結合剤の使用、化学物質または放射（ＵＶ放射を含む）による架橋、あるいはこれらの任意の組み合わせ、あるいは他の適切な方法でともに接合することができる。

本発明の中で使用することができる多層のＥＣＭ構成物に関する追加の情報およびそれらの調製のための方法については、米国特許番号５，７１１，９６９、５，７５５，７９１、５，８５５，６１９、５，９５５，１１０および５，９６８，０９６、および２００５年３月３日に公開された米国特許公開２００５００４９６３８を参照。これらの構造物は穿孔されるかまたは穿孔されないことができる。穿孔される時には、構成物の表面全体に本質的に広がる多くの孔を有することができ、また選択されたエリアにのみ孔を有することができる。

実施態様の骨原性組成物は異種移植片ＥＣＭ組織材料（つまり異なる種間の材料、たとえば人間のレシピエントへの人類以外のドナーからの組織材料）、同種異型移植ＥＣＭ材料（つまりレシピエントと同じ種のドナーからの組織材料）、および／または自家移植ＥＣＭ材料（つまりドナーとレシピエントが同じ個人である場合の組織材料）を含むことができる。さらに、ＥＣＭ物質に組み入れられたＢＭＰおよび／または他の外生の生物活性物質は、ＥＣＭ材料が由来した動物と同じ種（例えば、ＥＣＭ材料が自己由来か同種異型か）、またはＥＣＭ材料が由来した動物と異なる種（ＥＣＭ材料と異種の個体）からのものであることができる。ある実施態様では、ＥＣＭ組織材料は移植を受け取る患者と異種の個体であり、任意の加えられる細胞あるいは他の外生の材料も、移植を受け取る患者と同じ種（例えば、自己由来か同種異型）からだろう。例示的に、人間の患者は、外生のヒトＢＭＰで変成された異種個体のＥＣＭ物質（例えば、豚、牛のまたは羊－由来）、たとえば前記のｒｈＢＭＰで治療されてもよい。

実施態様の中で使用されるＥＣＭ組織材料は、追加の生来ではない架橋が無いか、本質的に無いことができ、あるいは追加の架橋を含んでもよい。そのような付加的な架橋は、光架橋テクニック、化学的架橋、あるいは脱水あるいは他の手段によって引き起こされて架橋するタンパク質によって達成されてもよい。しかしながら、ある種の架橋テクニック、架橋剤および／または架橋の程度が再形成することができる物質の再形成することができる特性を破壊する場合があるので、再形成することができる特性の保持が望まれる場合には、再形成することができるＥＣＭ材料の架橋は、材料が少なくともその再形成することができる特性の一部を保持することを可能にする程度または態様で行なうことができる。使用することのできる化学的架橋剤としては、例えばアルデヒド、たとえばグルタルアルデヒド、ジイミド、たとえばカルボジイミド、例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、リボースあるいは他の糖、アシルアジ化物、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンアミド、あるいはポリエポキシド化合物、例えばポリグリシジルエーテル、たとえばエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケミカル社（大阪（日本））から商標ＤＥＮＡＣＯＬ ＥＸ８１０の下で利用可能）、およびグリセリンポリグリセロールエーテル（ナガセケミカル社から商標ＤＥＮＡＣＯＬ ＥＸ ３１３の下で利用可能）があげられる。典型的に、使用された時、ポリグリセロールエーテルあるいは他のポリエポキシド化合物は１つの分子当たり２～約１０のエポキシド基を持つだろう。

追加の実施態様では、本明細書記載の骨原性組成物は、組織材料を増大するプロセスで処理されたＥＣＭ組織材料を組込むことができる。ある形態では、そのような増大された材料は、変性剤、たとえば１つ以上のアルカリ性物質でＥＣＭ物質が増大されるまで制御された接触によって形成し、増大した材料を単離することによって形成することができる。例示として、接触はそのオリジナルのバルク体積の少なくとも１２０％、つまり１．２倍まで、あるいはいくつかの態様ではそのオリジナルの体積の少なくとも約２倍までＥＣＭ組織材料を増大するのに十分なように行われることができる。その後、増大された材料は、任意にアルカリの媒体から（例えば中和および／または水洗により）分離することができる。集めた増大された材料は、患者へ投与するための物質の調製において任意の適切な方法で使用することができる。増大された材料は生物活性成分で豊化され、粉砕され、乾燥され、および／または所望形状または構成の移植可能な形に形成することができる。ある実施態様では、増大されたＥＣＭ組織材料で作られた乾いた移植ボディーは圧縮可能であることができる。

アルカリの物質のような変性剤でのＥＣＭ組織材料の処理は、材料の物理的構造の変化を引き起こし、次いで増大を引き起こす場合がある。そのような変化は、材料内のコラーゲンの変性を含むことがある。ある実施態様では、そのオリジナルのバルク体積の少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約６倍、あるいはより多く増大することが好ましい。当該技術分野の当業者らは、増大の程度はいくつかの要因と関係があり、例えばアルカリ媒体の濃度あるいはｐＨ、材料へのアルカリ媒体の暴露時間、増大される材料の処理中の温度に関係することが理解されるだろう。これらの要因は、材料の増大の希望のレベルを達成するために、本明細書に記載されたルーチンの実験を通して変えることができる。

コラーゲン線維はトロポコラーゲン分子の４分の１を互い違いにされた配列で構成される。トロポコラーゲン分子はそれ自体、三重螺旋を形成するために共有結合の分子内の結合および水素結合によって結合された３つのポリペプチド鎖から形成される。さらに、共有結合の分子間結合は、コラーゲン線維内の異なるトロポコラーゲン分子間で形成される。頻繁に、多数のコラーゲン線維はコラーゲン線維を形成するために互いに集まる。本明細書記載のように、著しく分子内および分子間の結合を分裂させないように材料へのアルカリ性物質の追加を行うことができるが、材料に増加した処理された厚さ（例えば少なくとも自然におけるものの２倍の厚さ）を与える程度まで材料の本来特性を損なわないようにされる。基体としての使用のための増大された物質を作るために処理することができるＥＣＭ物質は、本明細書に開示したものあるいは他の適切なＥＣＭを含むことができる。典型的には、そのようなＥＣＭ物質は、自然に発生した分子内架橋および自然に発生した分子間架橋を含むコラーゲン線維のネットワークを含んでいる。本明細書記載の増大処理に際して、自然に発生した分子内架橋および自然に発生した分子間架橋は、完全なコラーゲンのシート材料としてコラーゲンのマトリクス材を維持するために十分に、処理されたコラーゲンのマトリクス材の中に保持されることができる；しかしながら、コラーゲンのシート材料中のコラーゲン線維の本来特性を奪うことができる。またコラーゲンのシート材料は、出発原料の厚さよりも大きなアルカリの処理された厚さを有することができ、例えばオリジナルの厚さの少なくとも１２０％の厚さ、あるいはオリジナルの厚さの少なくとも２倍の厚さを持つことができる。その後、増大されたＥＣＭ材料は移植体の中または移植体としての使用のために、発泡体またはスポンジの基体を提供するために、例えば、粉砕、キャストおよび処理された材料を乾かすことによって処理することができる。増大されたＥＣＭ物質およびそれらの調製に関する追加の情報は、米国特許出願公開ＵＳ２００９０３２６５７７（２００９年１２月３１日公開）、米国特許出願番号１２／４８９，１９９（２００９年６月２２日出願）に見いだされ、これはその全体が参照され本明細書に組み入れられる。

ある実施態様では、投与される組成物は脱細胞されたＥＣＭ組織並びにＥＣＭおよびＭＳＣ細胞から成るか、本質的にから成る。さらにまたはあるいは、細胞を除いた組成物は主として脱細胞されたＥＣＭ組織から成り、たとえば乾燥重量基準で少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％から成る。

たとえば投与用の流動可能な組成物に組み入れられる時、本発明で使用されるＥＣＭ組織材料は、任意に微粒子の形態であることができる。そのようなＥＣＭの微粒子の物質は粒子はランダムおよび／または規則的な形でありえる。例示として、ランダムのＥＣＭ組織微粒子はより大きな脱細胞されたＥＣＭ組織シート材料を砕くか、微粉砕するか、切ることにより調製することができる。他方で、規則的なＥＣＭ組織微粒子は、より大きな脱細胞されたＥＣＭ組織層材料（例えばディスク形状粒子を提供する）から、球、卵形または多角形形状のような制御された切断によって調製することができる。そのような規則的なＥＣＭ粒子は、シート形態を保持することができ、ある実施態様では約０．１～約１ｍｍ、約０．１～約５ｍｍ、あるいは約０．１～約２ｍｍの範囲の（シート粒子の表面を横切る）最大のシート・ディメンションを持つことができる。さらに、あるいは別法として、規則的なＥＣＭ粒子は多数の接合した脱細胞されたＥＣＭ層を含む多層構造であることができ、たとえば上記のようなより大きな多層の脱細胞されたＥＣＭ組織の制御された切断によって調製することができる。ＥＣＭ微粒子は、流動可能な液体キャリアに組み入れることができ、液体キャリアは典型的には水性キャリアであり、他の成分も存在することができ、投与用の注射可能、または他の流動可能な組成物を形成する。

他の形態では、ＥＣＭ組織材料に加えて、本発明の組成物は他の有機的なキャリア材料を含むことができる。例示物質としては、例えば、天然または合成のポリマーから構成される合成の基体があげられる。例示される合成高分子は、好ましくは生物分解性の合成高分子であり、たとえばポリ乳酸、ポリグリコール酸あるいはそれらの共重合体、ポリ無水物、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ－酪酸塩 吉草酸塩、ポリヒドロキシアルカノエート、あるいは別の生分解性ポリマーまたは、混合物である。これらあるいは他の物質（例えば本明細書に議論されるようなＥＣＭ物質）で構成された好ましい移植体は、細胞の侵入およびマトリックスへ内部成長を許可するように構成された多孔性のマトリクス材であろう。

無機の足場物質も、本発明の組成物に組み入れることができる。ある実施態様では、組成物はＥＣＭ組織材料および骨形成タンパク質と共に１つ以上のミネラル含有物質を組込むことができる。たとえば骨のような硬組織の生成を支援するために、そのようなミネラルの材料は足場として役立つことができる。そのような目的の多くのミネラルを含む物質が知られており、たとえば微粒子の形態で使用することができる。適切な物質としては、たとえばハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、生体ガラス、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、骨あるいはそれらの組み合わせを含んでいる。

ミネラルを含む物質およびＥＣＭ組織材料は、任意の適切な方法で組み合わせることができる。いくつかの変法では、ミネラルを含む材料は微粒子物質、たとえば粉末または顆粒状物である。また、ＥＣＭ組織材料も微粒子物質である。これらの形態では、ミネラルを含む微粒子およびＥＣＭ組織微粒子は互いの混合物であり、好ましくは本質的に均質の混合物である。そのような混合物は細胞集団またはそれらの混合物との後の組み合わせのために乾燥した形態で提供することができる。

好ましい実施態様では、適用される組成物はＭＳＣに対して少なくとも同量、望ましくは多量のＥＰＣを含むだろう。より多くの好ましい形態では、適用される組成物は、ＥＰＣ対ＭＳＣの比率は少なくとも１．５：１、あるいは少なくとも２：１、あるいは少なくとも３：１である。ある実施態様では、ＥＰＣ対ＭＳＣの比は約２：１から約１０：１、望ましくは約２：１～約５：１の範囲である。ＭＳＣとＥＰＣの細胞がそのような比で使用される場合、ＥＣＦＣが好ましい。ＭＳＣに対するＥＰＣのこれらの比は、コラーゲンのＥＣＭ組織および／または他のキャリア材料にシードするために最初に適用される比であり得ることは理解されるだろう。またさらに任意に患者への投与の際の比でありえる。
当業者は、適用に先立つインキュベーションの間（もしあれば）のＥＰＣおよびＭＳＣの増大の割合の差により、シードの時の比と適用の時の比が異なってもよいことを理解するだろう。

さらにまたはあるいは、ＥＰＣ対ＭＳＣの上記の比について、適用されるＥＰＣおよびＭＳＣ（つまり２つの合計）の総量は、約１０^５～約１０^１０個、より典型的には約１０^５～約１０^８個の細胞の範囲であることができる。

ＥＰＣおよびＭＳＣ（それらは望ましくは核型に正常である）は、好ましくは固体のキャリア材料と結合して使用される。ＥＰＣ、ＭＳＣおよび固体のキャリア材料は、患者への適用に先立って組み合わせることができるか、あるいはそれらを、別々に、その場で組み合わされて適用することができる。ＥＰＣとＭＳＣが適用に先立って固体のキャリア材料と結合される場合、それらは固体のキャリア材料とインキュベートされ増殖され、ＥＰＣおよび／またはＭＳＣの数を増大することができる。あるいは、ＥＰＣおよび／またはＭＳＣは固体のキャリア材料と組み合わされ、次にＥＰＣおよび／またはＭＳＣの数の本質的な増大無く（例えば５％以下、あるいは１％以下）、患者に適用することができる。ある実施態様では、ＥＰＣとＭＳＣは固体のキャリア・マトリックスと組み合わされ、一緒にＥＰＣおよびＭＳＣを十分な時間インキュベートし（例えばＥＰＣおよびＭＳＣが総数の少なくとも５０％存在するように）、固体のキャリア・マトリックスに付着させつつ、ＥＰＣまたはＭＳＣの数を上記のような本質的な増大をさせない。結果として生じる組成物は、患者に適用することができる。脱細胞されたＥＣＭ組織材料（特に本明細書に記載されるような、微粒子の形態で生来の生物活性物質を保持するもの）は、これらの目的のための好ましい固体キャリア・マトリクス材である。この点に関して、他の固体のキャリア・マトリクス材が脱細胞された組織ＥＣＭ物質（例えば上記のミネラルを含む物質）と共に使用される場合、ＥＰＣおよび／またはＭＳＣがＥＣＭ材料とともにインキュベートされる時にはこれらの他の固体のキャリア・マトリクス材が存在してもよく、またはインキュベートの後にＥＣＭ材料（また細胞）と組み合わされることができる。

ＥＰＣ、ＭＳＣおよびさらに上記のような１つ以上の固体のキャリア材料に加えて、適用される組成物は他の不活性または生物活性の物質を含むことができる。これらとしては例えば、他の細胞、有機ポリマー、骨形成タンパク質、たとえばＢＭＰ－２あるいはＢＭＰ－７、オステオネクチン、骨シアロたんぱく質（Ｂｓｐ）、アルファ２ＨＳ－糖タンパク質、骨Ｇｌａタンパク質（Ｂｇｐ）、マトリックスＧｌａタンパク質、骨ホスホ糖蛋白質、骨燐蛋白質、骨プロテオグリカン、プロテオリピド、成長因子、たとえば血小板由来の成長因子、骨格成長因子、線維芽細胞増殖因子、その他同種のもの；微粒子のエクステンダー；無機の水溶性塩、例えばＮａＣｌ、硫酸カルシウム；砂糖、例えばスクロース、フルクトース、グルコース；薬学的に受理可能なキャリア、薬、例えば抗生物質；また同種のものがあげられる。

ここに開示した組成物は患者の中の病気か破損された骨を治療するために使用することができる。例えば、病気か破損された骨は、動物、特に人間のような哺乳動物の全ての骨に発生することがあり、たとえば扁平骨（例えば肋骨および頭蓋の前面および頭頂骨）、長骨（例えば骨の末端）、短い骨（例えば、手首および足首の骨）、不規則形骨（例えば脊椎骨と骨盤）および種子骨（例えば膝蓋骨）中の骨のうちのどれにも生じる場合がある。扱われる損傷した骨は砕かれた骨を含んでいるかもしれない。扱われる病気の骨はいくつかの実施態様では、骨減少症の骨、骨多孔症の骨あるいは壊死の骨を含んでいるかもしれない。

ある好ましい形態では、ここに記述された組成物は虚血壊死（ＡＶＮ）を示す骨部位を治療するために使用されるだろう。ＡＶＮは様々な既知の原因、たとえば、外傷、全身性疾患、薬の副作用あるいは放射線の影響、リューマチまたは職業上の危険（例えば高圧への長期暴露）などにより起こる。ＡＶＮを示す骨部位は、関節接合（例えば腰大腿骨頭、大腿部の関節丘、距骨頸あるいは舟状骨のウエスト）に関連した骨に生じる場合がある。これらおよび他のＡＶＮを示す骨部位は、しばしば骨梁（海綿質骨としても知られている）部位の領域である。

ここに記述された組成物は、任意の適切な方法で治療される骨部位に届けることができる。ニードル・ルーメンによる注入、あるいは供給装置（たとえばチューブまたはカテーテル）のルーメンによる通路による供給が好ましい。

特に好ましい実施態様では、組成物は腰骨の大腿骨頭のＡＶＮを示す骨梁へ供給される。望ましくは、ＡＶＮは大腿骨頭の構造の崩壊前のステージにある。組成物のデリバリーは、ニードル（たとえばトロカールあるいは他のニードル）による注入によって行なうことができる。ある実施態様では、組成物は、領域ごとに組成物を供給するために放射状に伸びる配列の中で、２つ、３つのあるいはそれ以上個々のニードル・カニューレを展開させる、多重ニードル配列によって供給される。さらに別の実施態様では、組成物は、トラフに穴が空けられるか、または他の方法で大腿骨頸部に外科的に作成されるコア減圧の行為と共に供給することができる。ここに記述された組成物は、トラフを満たしてＡＶＮを示す骨部位を治療するための物質として、あるいはその物質内において使用することができる。あるいは、トラフは合成または自然な骨移植物質、たとえばリン酸三カルシウム、骨セメントあるいは自己由来か同種異型の骨で充填することができる。本明細書に記述される組成物を、その後移植物で充填されたトラフを通してＡＶＮを示す骨部位に供給することができ、あるいは移植物で充填されたトラフを通してニードルを介して注入することができる。ＡＶＮを示す骨部位の治療のこれらおよび他のモードは、本発明の技術分野の当業者には明らかであろう。実施態様とその特徴および利点についての一層の理解を促進する目的で、次の具体的な例が提供される。これらの例は例示であり、本明細書に記述された実施態様の範囲を制限するものではないことが理解されるだろう。

移植組織の調製および手術
４ｍｍの直径のディスクが、４ｍｍの生検パンチで、ＥＣＭシート材料（腎被膜、「ＲＣ」の４層ラミネート）から切り出された。ＲＣディスク移植組織は、臍帯血由来のＥＣＦＣ（１０μｌの中の約３００，０００個の細胞）および臍帯血由来のＭＳＣ（１０μｌの中の約１００，０００個の細胞）を組み合わすことにより準備された２０μｌの懸濁液に２４時間、３７℃でインキュベートされた。その後、外科医が既知の免疫不全の(SCID)マウスの頭蓋冠欠損モデルの欠損へそれを注入することを可能にするために、細胞がシードされたRCディスクは、外科のフィールドへ渡された。モデルについては、各マウスに左右同形の４ｍｍの直径の欠損が空けられた。左右同形の欠損のうちの１つはコントロール（処理されない）として使用された。また、他方は処理物質を受け取った。２本のチタン線が、イメージ可能な参照として対向する移植組織ディスクの外側端に結び付けられた。縫合は、欠損治療で空けられた頭部および尾部の穴、および移植組織ディスクの対になった穴部を通って行われた。移植組織ディスクは縫合結び目で頭頂骨に固定された。対照（空間）治療部位は、縫合で同様に結ばれたが、移植組織を受け取らなかった。その切り口は閉じられ、マウスにエリザベスカラー（手術の後に１週間着用された）が取り付けられた。研究されたハツカネズミは、移植後２、４、８、１２および１６週にｍｉｃｒｏＣＴ（小規模コンピューター断層撮影）で生体内イメージを得た。ｍｉｃｒｏＣＴ走査は、治療された部位と治療されない欠損のための骨被覆の相違の測定のために使用された。

結果：
細胞がシードされたＥＣＭ移植組織ディスクで治療された欠損については、移植後１６週での骨被覆％は平均５２．６％（ｎ＝６）となった。これらのグループの対応する治療していない欠損については、移植後１６週での骨被覆％は平均２３．７％となった。同様な実験が行われた実験が行なわれた。一群のハツカネズミ（ｎ＝７）はＥＣＭ移植組織ディスク（追加の細胞はない）のみを受け取り、他の側には治療はしなかった。移植後１６週で、治療していない側の骨被覆は約２２％であり、治療した側の骨被覆は約３５％であった。

明細書および特許請求の範囲に使用される時、文脈が明白に他のものを指示しなければ、単数表現は複数のものを含んでいる。もし他の方法で定義されなかったならば、ここに使用される技術的および科学用語はすべて本発明が属する技術の通常の技術者に一般に理解されるのと同じ意味を持っている。

値の範囲が提供される場合、文脈が明白に他を指示しなければ、その範囲の上限および下限の間の中間値は、下限の単位の１０分の１であり、記載された範囲の値および中間値は発明の範囲に包含される。これらのより小さな範囲の上限および下限の範囲は、より小さな範囲に独立して含まれることができる。またそのような実施態様も、記載された範囲で具体的に除かれたものを除き発明の範囲に包含される。記載された範囲が１または両方の限界を含む場合、どちらかあるいは両方を除く範囲及ぶものも、さらに発明の範囲に含まれる。

ここに言及された出版物はすべて、本明細書に記述された発明に関連して使用されるかもしれない出版物に開示され述べられている成分について記述する目的で、参照され、本明細書に組込まれる。

発明が図面および先の記述に詳細に述べられているが、それらは例示であり何らの限定を意図するものではない。好ましい実施態様だけが示され記述された。また、発明の精神内における変更および変化はすべて、保護されることが望まれる。さらに、ここに引用された出版物はすべて、当業者に示されその全体が参照され本明細書の一部とされ、個々参照として全部の記載が本明細書に加えられる。

Claims (1)

1. 内皮先祖細胞（ＥＰＣ）および間充織幹細胞（ＭＳＣ）並びに固体のキャリア材料を含む、患者の損傷したかまたは病気の骨を治療するための組成物であって、
   ＥＰＣとＭＳＣをそれぞれ少なくとも２：１の細胞数比で含み、
   該固体のキャリア材料は、コラーゲンの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組織材料を含み、該ＥＣＭ組織材料が該ＥＣＭ組織材料のための源組織からの生来の生物活性物質を保持し、該生来の生物活性物質が、成長因子、グリコサミノグリカン類、プロテオグリカン類、および糖タンパク質を含み、該生来の生物活性物質が、該ＥＣＭ組織材料のコラーゲン繊維の間、上および／または内に点在した固体として該ＥＣＭ組織材料に保持されて、該ＥＣＭ組織材料の乾燥重量での少なくとも１％を構成しており、
   当該組成物中のＥＰＣとＭＳＣを合わせた合計数の少なくとも５０％が該固体のキャリア材料に付着されている、組成物。