CN105636600A - 细胞接种组合物和用于治疗骨区的方法 - Google Patents

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Abstract

用于治疗患病或受损骨(优选缺血性和/或坏死的骨)的组合物和方法包括使用内皮祖细胞和间质干细胞的组合，理想地还结合胶原性胞外基质组织。还描述了所述组合物的制备方法。

Description

细胞接种组合物和用于治疗骨区的方法
相关申请参考
本申请要求2013年9月2日提交的美国临时专利申请No.61/872,828的权益，由此将其按引用全部并入。
背景
本发明公开内容涉及治疗患者患病或受损的组织，并且特别涉及用于治疗患者骨区的方法和组合物，例如在缺血性坏死中可能发生的缺血和/或坏死的骨区的治疗中。
缺血性坏死(AVN)的特征在于存在死小梁骨区域，常常涉及软骨下骨板。关节下的骨和身体中的承载面的退化可能引起失去软骨的支撑，导致严重的关节退化。在50％的患者中看到了由骨坏死引起的严重关节破坏，并且在美国每年进行的500,000例全髋关节置换的10％主要外科手术计划治疗AVN。AVN最常见的是影响髋关节并且常常在软骨磨损至需要全部或部分关节置换前的较年轻的患者中发生。关节表面下的支撑骨退化后，常常跟随着软骨的损伤，导致关节疼痛、不稳定。常见的治疗主要局限于清创术和自体骨移植，其在技术上是有挑战性的，其中外科医生从患者收集松质骨，需要第二个切口，并且会出现合并症。如果骨移植程序不成功或处置不当，需要股骨头或全关节成形术来替代。
尽管已经进行了相当大的努力来改善涉及患病或受损骨的这个领域和其他领域的治疗，但进展缓慢。对用于修复缺陷骨区(包括由AVN引起的那些)的改进和/或备选的组合物和方法存在需求。
概述
在某些方面中，本发明公开内容涉及用于治疗骨组织的组合物和方法。优选的组合物和方法涉及呈现出缺血性坏死的小梁骨组织的治疗，例如，用于诱导这样的组织区域中新的骨生长。
因此，在本发明的一些实施方案中，本发明公开内容提供了用于治疗患者呈现出缺血性坏死的区域骨的方法。该方法包括在该区域植入内皮祖细胞和间质干细胞，优选在组合物中混合，并且所述组合物还理想地包括固体载体材料，如胶原性胞外基质(ECM)组织材料。该组合物有利地包括相对于间质干细胞至少等量，并且优选地，较大量的内皮祖细胞，理想地，以至少1.5:1，至少2:1，或至少3:1的相应比例。在某些形式中，这样的比例在约2:1至约10:1的范围中。胶原ECM组织当使用时可以保留来自源组织的天然生物活性物质，包括糖蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖和生长因子(例如，FGF-2)和/或保留来自源组织的天然肝素。
在另外的实施方案中，本发明公开内容涉及包括如上概述的成分和/或本公开内容别处鉴定的成分的组合物，以及用于制备所述组合物的方法。
在阅读本文的公开内容时，所属领域技术人员将清楚另外的实施方案及其特征和优点。
详述
现在将参考某些实施方案，并且将使用特定的语言来描述这些实施方案。然而，将明白没有因此打算限制本发明的范围。如同通常被本发明所涉及领域的技术人员想到的，考虑了所述实施方案的任何改变和更多变化以及如本文中所述的本发明原理的任何进一步的应用。
如以上公开的，本发明的某些方面涉及包括内皮祖细胞(EPC)和间质干细胞(MSC)的组合并且优选还包括胞外基质组织的组合物，其制备方法，及其用于治疗患病或受损骨区(例如，坏死的骨)的用途。
如以上公开的，本文的组合物和方法将涉及内皮祖细胞(EPC)的使用。EPC是未成熟的内皮细胞，其具有增殖、转移和分化成内皮细胞的能力，但尚未获得成熟内皮细胞的特征。EPC包括但不限于集落形成单位-内皮细胞(CFU-EC)、循环血管生成细胞(CAC)、循环内皮前体(CEP)和内皮集落形成细胞(ECFC)，包括低增殖力ECFC(LPP-ECFC)和/或高增殖力ECFC(HPP-ECFC)。在优选的方面中，EPC是或包括ECFC，如HPP-ECFC。
EPC可以从血液、骨髓或脐带血分离并且可以在成人外周单核细胞中的CD34+细胞级分中鉴别出来。EPC可以响应某些生理刺激，如，例如，组织损伤，从骨髓转移至外周血(循环EPC)。循环EPC可以获自成人血液。在某些方面中，可以使用CD34+细胞或单独的CD133+细胞或与KDR+结合作为外周血中富含EPC的细胞级分，通过直接FACS分选或其他可用的体外选择方法，如磁珠、微流体、芯片实验室(lab-on-a-chip)、亲和性柱或相关设备，从这些或其他来源分离EPC。
如以上公开的，ECFC是用于本文中的优选细胞。理想地，ECFC获自脐带血。ECFC的特征在于：表达细胞表面蛋白KDR、CD34、vWF、eNOS和VE-钙粘蛋白，缺乏造血细胞标记CD45、AC133、CD11b和CD14的表达；以克隆涂布水平增殖并替换成二代和三代ECFC的能力；结合乙酰化低密度脂蛋白(AcLDL)的能力；在体外形成毛细管样结构的能力；和/或在免疫缺陷小鼠体内形成人血管并结合鼠脉管系统变成鼠系统循环一部分的能力。用于本文中的ECFC细胞群可以是基本上纯化的ECFC(在结合MSC之前)，例如，克隆ECFC群或其中至少90％，或至少95％，或100％的细胞呈现如上所述的ECFC特征的细胞群。对于关于ECFC及其制备方法的其他信息，例如可以参考美国专利公开No.20050266556(2005年12月1日)，20080025956(2008年1月31日)和20090280180(2009年11月12日)。
用于本发明的MSC可以获自任何合适的来源并且以任何合适的方式获得。合适的MSC来源包括例如胎盘组织，骨髓，牙齿组织，睾丸组织，子宫组织，脐带血，脐带组织和皮肤组织。可以在与其他细胞的混合群中，例如，在未分级的骨髓吸出物或纯化的骨髓单核细胞中提供MSC。还可以在相对纯的MSC群中提供MSC，例如，其中群中至少90％的细胞表达CD105，CD106，CD156，CD44，CD29，CD166，Stro-1、FGF10、Prx1、Oct4、Sox2和Nanog并且没有表达CD34、CD45、CD14和CD31。优选获自脐带血的MSC。对于关于MSC及其获得方法的其他信息，例如可以参考美国专利申请20120052049(2012年3月1日)。
EPC和MSC可以各自独立地是患者自体同源或同种异体的。说明性地，在某些实施方案中，EPC和MSC都是患者同种异体的，例如，使用源自脐带血的同种异体EPC和同种异体MSC。在其他实施方案中，EPC是患者自体同源的(例如，获自患者的脐带血或外周血)，并且MSC可以是患者同种异体的(例如，获自同种异体的脐带血)。在再进一步的实施方案中，EPC是患者同种异体的(例如，获自同种异体的脐带血)，并且MSC可以是患者自体同源的(例如，获自患者的脐带血、外周血或骨髓，如含有MSC的骨髓吸出物、含有MSC的纯化骨髓单核细胞或更纯化的获自骨髓的MSC制备物的形式)。
用于本文中的胶原性胞外基质(ECM)材料可以是脱细胞的包括ECM组织的动物组织层。在这点上，本文中使用的“脱细胞的”是指其中ECM组织天然的全部或基本上全部的细胞已经被除去的ECM组织的状态；因此，其他(非天然)细胞可以存在于ECM组织上或其中，仍然将其称为脱细胞的。ECM组织层可以获自温血脊椎动物，如绵羊、牛或猪动物的源组织。源组织层优选是未矿化的(即，软组织)源组织。例如，合适的ECM组织包括包含粘膜下层、肾小囊膜、真皮胶原、硬脑脊膜、心包膜、羊膜、阔筋膜、浆膜、腹膜或基底膜层的那些，包括肝基底膜。用于这些目的的合适粘膜下层材料包括，例如，肠粘膜下层，包括小肠粘膜下层，胃粘膜下层，膀胱粘膜下层和子宫粘膜下层。可以通过采集这样的组织来源并且从平滑肌层、粘膜层和/或组织源中出现的其他层中分出含有粘膜下层的基质来获得本发明中有用的包含粘膜下层(可能连同其他相关组织一起)的ECM组织。猪组织源是优选的来源，从其采集ECM组织，包括含有粘膜下层的ECM组织。
本发明中使用的ECM组织优选的是脱细胞的并且是高度纯化的，例如，如Cook等的美国专利No.6,206,931或2008年11月20日公开的美国专利申请公开No.US2008286268，2008年7月23日提交的公开美国专利申请系列No.12/178,321中所述的，由此将其全部以其整体按引用并入本文中。优选的ECM组织材料将呈现出低于约12内毒素单位(EU)/克，更优选低于约5EU/克，并且最优选低于约1EU/克的内毒素水平。作为另外的优选，粘膜下层或其他ECM材料可以具有低于约1集落形成单位(CFU)/克的微生物量(bioburden)，更优选低于约0.5CFU/克。真菌水平理想地是相似地低，例如，低于约1CFU/克，更优选低于约0.5CFU/克。核酸水平优选地低于约5μg/mg，更优选地低于约2μg/mg，并且病毒水平优选地低于约50空斑形成单位(PFU)/克，更优选地低于约5PFU/克。美国专利No.6,206,931或美国专利申请公开No.US2008286268中教导的粘膜下层或其他ECM组织的这些和另外的特征可以是本发明中使用的任何ECM组织的特征。
在某些实施方案中，本文中使用的ECM组织材料将是膜状组织，具有从组织源分离的层结构。ECM组织当完全水合时可以如分离的具有从约50至约250微米范围的层厚度，更常见地为当完全水合时从约50至约200微米，尽管也可以获得和使用具有其他厚度的分离层。这些层厚度可以随着用作组织源的动物的类型和年龄而不同。同样，这些层厚度可以随着从动物源获得的组织源而不同。
利用的ECM组织材料理想地保留来自源组织的结构微结构，包括结构纤维蛋白，如胶原，以及还有可能的可以形成天然纤维的弹性蛋白。在某些实施方案中，这样的纤维可以是非随机定向的，与用于脱细胞的ECM组织材料的源组织中出现的一样。这样的非随机胶原和/或其他结构蛋白纤维可以在某些实施方案中提供就抗张强度而言非同向性的ECM组织，因此其一个方向的抗张强度不同于至少一个其他方向的抗张强度。
脱细胞的ECM组织材料可以包括一种或多种ECM组织材料来源天然的生物活性剂，并且通过加工保留在ECM组织材料中。例如，粘膜下层或其他ECM组织材料可以保留一种或多种天然生长因子，如但不限于碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、软骨衍生的生长因子(CDGF)和/或血小板衍生的生长因子(PDGF)。同样，粘膜下层或其他ECM材料当用于本发明中时可以保留其他天然生物活性剂，如但不限于蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖。例如，脱细胞的ECM组织材料可以包括天然肝素、硫酸肝素、透明质酸、纤连蛋白、细胞因子等。将保留天然物质的脱细胞ECM组织材料有利地用于本文中，例如因为它们可以呈现出结合有益生长因子的能力，所述生长因子如通过本文中的组合物的细胞或通过植入部位的患者细胞分泌的那些，例如，成骨生长因子，如成骨骨形态生成蛋白。因此，一般而言，粘膜下层或其他ECM组织材料可以保留来自源组织的一种或多种生物活性成分，其直接或间接地诱导细胞响应，如细胞形态、增殖、生长、蛋白或基因表达中的变化。
本发明中使用的含粘膜下层的ECM材料或其他ECM材料可以源自任何合适的器官或其他组织源，通常是含有结缔组织的软组织源(非骨、非软骨)。为了用于本发明中而加工的ECM材料通常将包括丰富的胶原，最常见地由至少约80％重量胶原(基于干重)构成。对于极大部分而言，这样的天然衍生的ECM材料包括非随机定向的胶原纤维，例如作为通常单轴或多轴但规则定向的纤维出现。当加工以保留天然生物活性因子(例如，如上讨论的)时，ECM材料可以保留这些因子，作为固体散布在胶原纤维之间、之上和/或之内。用于本发明中的特别理想的天然衍生的ECM材料将包括相当大量的这样的散布的非胶原固体，其使用合适的染色在光学显微镜检查下可以容易地确定。在本发明特定实施方案中，这样的非胶原固体可以构成相当大百分比干重的ECM材料，例如，在本发明不同的实施方案中，至少约1％，至少约3％和至少约5％重量。
本发明中使用的含粘膜下层或其他ECM组织材料还可以呈现出血管生成特征并且因此能有效诱导移植了所述材料的宿主中的血管生成。在这点上，血管生成是身体通过其制造新血管来产生提高的组织血液供应的过程。因此，血管生成材料，当接触宿主组织时，促进或激励所述材料中新血管的形成。最近已经研发了用于测量响应生物材料植入的体内血管生成的方法。例如，一种这样的方法使用皮下植入物模型以确定材料的血管生成特征。参见，C.Heeschen等，NatureMedicine7(2001)，No.7，833-839。当与荧光微血管造影技术结合时，这种模型可以提供生物材料中血管生成的定量和定性测量。C.Johnson等，CirculationResearch94(2004)，No.2，262-268。
脱细胞的ECM组织层可以作为单层植入物用于本发明中，但在某些实施方案中，将用于多层构建体中。在这点上，用于将层碾压在一起的多种技术是已知的并且可以用于制备用于本发明中的移植物中的多层构建体。例如，多层(即，两层或更多层)胶原材料，例如，含粘膜下层或其他ECM材料，可以结合在一起形成多层结构。说明性地，两层至约两百层脱细胞胶原ECM组织层可以结合在一起，来提供用于本发明中的多层构建体。在某些实施方案中，两层至八层脱细胞的胶原ECM组织层结合在一起形成用于本文中的多层构建体。优选，含粘膜下层ECM组织层从肠组织分离，更优选，从小肠组织分离。为了这些目的，猪衍生的组织是优选的。ECM组织层可以以任何合适的方式结合在一起，所述方式包括加热、非加热或冻干条件下的脱水热粘合，使用粘合剂、胶水或其他结合剂，与化学试剂交联或辐射(包括UV辐射)，或这些方法彼此组合或与其他合适的方法组合。关于可以用于本发明中的多层ECM构建体及其制备方法的其他信息，可以参考例如美国专利No.5,711,969，5,755,791，5,855,619，5,955,110，5,968,096和2005年3月3日公开的美国专利公开No.20050049638A1。这些构建体可以是有孔的或无孔的，并且当有孔时可以包括基本上跨过构建体表面延伸的穿孔阵列，或可以包括只在选定区域有穿孔。
本文中实施方案的成骨组合物可以掺入异种移植ECM组织材料(即，跨种材料，如来自非人供体至人受体的组织材料)、同种异体移植ECM材料(即，种间材料，使用来自与受体相同物种的供体组织的材料)和/或自体移植ECM材料(即，其中供体和受体是同一个体)。此外，掺入ECM材料中的BMP和/或其他外源性生物活性物质可以来自由此产生ECM材料的动物的相同物种(例如，相对于ECM材料是同种异体或自体的)或可以来自与ECM材料源不同的物种(相对于ECM材料是异种的)。在某些实施方案中，ECM组织材料相对于接受移植物的患者是异种的，并且任何添加的细胞或其他外源性材料都将来自与接受移植物的患者相同的物种(例如，同种异体或自体的)。说明性地，可以用已经用异源人BMP(如本文中描述的rhBMP)修饰的异种ECM材料(例如，猪-、牛-或绵羊-衍生的)来治疗人患者。
本文中实施方案中使用的ECM组织材料可以不含或基本上不含另外的、非天然交联，或可以含有另外的交联。这样的另外的交联可以通过光-交联技术、通过化学交联剂或通过由脱水或其他方式诱导的蛋白质交联来获得。然而，因为某些交联技术，某些交联剂和/或某些交联程度可以破坏可重建材料的可重建特性，在需要保留可重建特性的情况下，可以进行可重建ECM材料的任何交联至允许该材料保留至少一部分可重建特性的程度，或以允许该材料保留至少一部分可重建特性的方式来进行可重建ECM材料的任何交联。可以使用的化学交联剂包括例如醛类，如戊二醛，二酰亚胺类，如碳化二亚胺类，例如，盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺，核糖或其他糖类，酰基叠氮，硫-N-琥珀酰胺，或聚环氧化物化合物，包括例如聚缩水甘油醚，如乙烯甘油二聚缩水甘油醚，依据商品名DENACOLEX810可从NageseChemicalCo.，Osaka，日本获得，以及甘油聚甘油醚，依据商品名DENACOLEX313也可从NageseChemicalCo.获得。通常，使用时，聚甘油醚或其他聚环氧化物化合物将具有每个分子2至约10个环氧化物基团。
在其他实施方案中，本文中的成骨组合物可以掺入已经接受了扩大组织材料处理的ECM组织材料。在某些形式中，这种扩大的材料可以通过ECM材料与变性剂的受控接触直至该材料扩大并分离扩大的材料来形成，所述变性剂如一种或多种碱性物质。说明性地，所述接触可以足以将ECM组织材料扩大至其初始毛体积的至少120％(即，1.2倍)，或在一些形式中，扩大至其初始体积的至少约两倍。此后，可以任选地从碱性介质中分离出扩大的材料，例如，通过中和和/或冲洗。收集的、扩大的材料可以以任何合适的方式用于给予患者的材料的制备中。扩大的材料可以富含生物活性成分，在所需形状或构造的可植入体的形成中研碎、干燥和/或模制等。在某些实施方案中，用扩大的ECM组织材料形成的干燥植入体是可压缩的。
用变性剂(如碱性材料)处理ECM组织材料会引起该材料物理结构的变化，这随后使其扩大。这样的变化可能包括该材料中胶原的变性。在某些实施方案中，优选将该材料扩大至其初始毛体积的至少约三倍，至少约四倍，至少约5倍，或至少约6倍，或甚至更多倍。本领域技术人员将清楚扩大的规模涉及几个因素，包括例如碱性介质的浓度或pH，碱性介质暴露于该材料的时间和待扩大材料处理中使用的温度等等。鉴于本文中的公开内容，这些因素可以通过常规实验来改变，以获得具有所需扩大水平的材料。
胶原小纤维是由原胶原分子的四分之一交错(quarter-staggered)阵列组成。原胶原分子自身由三个多肽链形成，所述多肽链通过共价分子内键和氢键连接在一起形成三股螺旋。另外，在胶原小纤维内的不同原胶原分子之间形成共价分子间键。常常，多个胶原小纤维彼此装配在一起形成胶原纤维。据认为可以进行如本文中所述的将碱性物质添加至该材料，使得没有显著破坏分子内和分子间键，但使该材料变性至给该材料提供提高的经过加工的厚度的程度，例如，天然产生厚度的至少两倍。可以加工来制备用作基底的扩大材料的ECM材料可以包括本文中公开的那些中的任何一种或其他合适的ECM。典型的这样的ECM材料将包括具有天然产生的分子内交联和天然产生的分子间交联的胶原小纤维的网络。在如本文中所述的扩大处理时，天然产生的分子内交联和天然产生的分子间交联可以保留在加工过的胶原基质材料中，足以使该胶原基质材料保持为完整的胶原性板材；然而，胶原性板材中的胶原小纤维可以变性，并且胶原性板材可以具有大于起始材料厚度的碱性加工过的厚度，例如初始厚度的至少120％，或初始厚度的至少两倍。然后加工扩大的ECM材料，以提供用作移植体或移植体中的泡沫或海绵结构，例如，通过研碎、浇注和干燥加工过的材料。关于扩大的ECM材料及其制备的其他信息在2009年12月31日公开的美国专利申请公开No.US20090326577，2009年6月22日提交的公开美国专利申请系列No.12/489,199中可以找到，将其全部按引用并入本文中。
在本文中的某些实施方案中，待给药的组合物可以由或基本上由脱细胞的ECM组织以及EPC和MSC细胞的组合组成。另外或可替换地，组合物，除了细胞，可以主要由脱细胞的ECM材料组成，例如，至少80％重量，至少90％重量，或至少95％重量由脱细胞的ECM组织组成，基于干重。
本文中使用的ECM组织材料可以任选地呈微粒形式，例如，掺入用于给药的可流动组合物中。这样的ECM微粒材料可以具有颗粒或随机和/或规则形状。说明性地，可以通过粉碎、研磨或切碎较大的脱细胞ECM组织薄层材料来制备随机的ECM组织微粒。另一方面，可以通过从较大脱细胞ECM组织薄层材料的受控形状(如，圆形、椭圆形或多边形)切割来制备规则的ECM组织微粒。这种规则的ECM颗粒可以保留薄层形式，并且在某些实施方案中，可以具有约0.1至约1mm，或约0.1至约5mm，或约0.1至约2mm范围的最大薄层尺寸(跨过薄层颗粒面)。另外地或可替换地，规则的ECM颗粒可以是含有多个结合的脱细胞ECM层的多层构建体，例如，可以通过如上所述的受控切割相应的较大多层脱细胞的ECM组织构建体来制备。本文中描述了碾压多层脱细胞ECM层的方法并且可以用于产生较大的多层脱细胞ECM组织构建体，以用于切割产生规则的ECM微粒。ECM微粒可以与可流动的液体载体，通常是含水载体，连同本文中的其他成分一起掺和，以形成用于给药的可注射或另外可流动的组合物。
在其他形式中，除了ECM组织材料，本文中的组合物可以包括其他有机载体材料。说明性的材料包括，例如，合成产生的包含天然或合成聚合物的基底。说明性的合成聚合物优选的是生物可降解合成聚合物，如聚乳酸、聚乙醇酸或其共聚物，聚酐、聚己内酯、聚羟基-戊酸丁酸酯、聚羟基链烷酸酯或另一种生物可降解聚合物或其混合物。优选的由这些或其他材料(例如，如本文中讨论的ECM材料)组成的植入体可以是多孔基质材料，配制成允许细胞入侵和向内生长至基质中。
在本文中的组合物中还可以掺入无机支架材料。在某些实施方案中，组合物可以连同ECM组织材料和骨形态生成蛋白掺入一种或多种含矿物质材料。这样的矿物质材料可以用作支架来支持硬组织(如骨)的产生。许多用于该目的的含矿物质材料是已知的并且可以以例如微粒形式来使用。合适的材料包括例如羟磷灰石、磷酸三钙、生物玻璃、磷酸钙、硫酸钙、骨或其组合。
含矿物质材料和ECM组织材料可以以任何合适的方式来组合。在一些变化中，含矿物质材料是微粒材料，如粉末或颗粒材料，并且ECM组织材料也是微粒材料。在这些形式中，含矿物质微粒和ECM组织微粒可以是在与彼此的混合物中，优选在基本上均质的混合物中。可以以干的形式来提供这样的混合物，用于之后与本文中公开的细胞群或其混合物混合。
在优选的实施方案中，待给药的组合物将含有相对于MSC至少等量并且理想地较大量的EPC。在更优选的形式中，待给药的组合物将具有至少1.5:1，或至少2:1，或至少3:1的EPC比MSC的比例。在某些实施方案中，EPC比MSC的比例将在约2:1至约10:1的范围中，理想地在约2:1至约5:1的范围中。MSC和EPC细胞以这样的比例使用时，优选ECFC。将理解EPC比MSC的这些比例可以是最初应用于接种胶原ECM组织和/或其他载体材料的比例，并且任选地还可以是给予患者时的比例。由于给药前孵育阶段(如果有的话)过程中EPC和MSC的增殖速率(如果有的话)的差异，本领域技术人员将理解给药时的比例可以不同于接种的比例。
除了或替换上述EPC与MSC的比例，给予的EPC和MSC的总数(即，两者的总和)可以在约105至约1010个细胞，更常见为约105至约108个细胞。
EPC和MSC，其理想地是核型正常的，优选与固体载体材料结合使用。EPC、MSC和固体载体材料可以在给予患者前混合，或可以分开给予患者并在原位组合，或其组合。在给药前，当EPC和MSC与固体载体材料混合时，它们可以与固体载体材料一起孵育，使得增殖和扩大EPC和/或MSC的数量；或者，EPC和/或MSC可以与固体材料混合，然后基本上没有EPC和/或MSC数量的扩大(例如，5％或更少，或1％或更少)就给予患者。在某些实施方案中，EPC和MSC与固体载体基质混合并与其接触孵育足够的时间段，使得EPC和MSC(例如，存在的EPC和MSC总数的至少50％)附着于固体载体基质，但如上所述基本上没有EPC和MSC数量的扩大，并且所得到的组合物可以给予患者。脱细胞的ECM组织材料是优选的用于这些目的的固体载体基质材料，特别是上文公开的微粒形式并且保留天然生物活性物质的那些。在这点上，如果其他固体载体基质材料结合脱细胞的组织ECM材料(例如，如上所述的含矿物质材料)来使用，在某些实施方式中，用ECM材料孵育EPC和/或MSC时，这些其他固体载体基质材料可以存在，或可以在孵育阶段后与ECM材料(和细胞)混合。
除了EPC，MSC以及优选还有一种或多种如上讨论的固体载体材料，待给药的组合物还可以含有其他惰性或生物活性材料。这些包括，例如，其他细胞、有机聚合物、骨形态生成蛋白(如BMP-2或BMP-7)、骨连接素、骨唾液蛋白(Bsp)、α.2HS-糖蛋白、骨Gla-蛋白(Bgp)、基质Gla-蛋白、骨磷糖蛋白、骨磷蛋白、骨蛋白聚糖、蛋白脂质、生长因子，如血小板衍生的生长因子、骨骼生长因子、成纤维细胞生长因子等；微粒增量剂；无机水溶性盐，例如，NaCl，硫酸钙；糖类，例如蔗糖、果糖和葡萄糖；药物学上可接受的载体，药物(例如，抗生素)；等等。
本文中公开的组合物可以用于治疗患者患病或受损的骨。例如，患病或受损的骨可以发生在动物，尤其是哺乳动物，如人的任何骨中，包括扁平骨(例如，肋骨以及头颅的额骨和顶骨)，长骨(例如，手足的骨)，短骨(例如，腕骨和距骨)，不规则骨(例如，椎骨和骨盆)和籽骨(例如，髌骨)。待治疗的受损骨可以包括骨折的骨。在一些实施方案中，待治疗的患病的骨包括骨质疏松的骨、坏死的骨或缺血的骨。
在本文中某些优选的形式中，本文中所述的组合物将用于治疗呈现出缺血性坏死(AVN)的骨区。AVN可以具有多种已知诱因中的一种，如外伤、全身性疾病、不良药物或辐射响应、类风湿性关节炎或职业危害(例如，长期暴露于高压)。呈现出AVN的骨区可以发生在与铰接接头相连的骨中，例如臀部的股骨头、股骨骨节、距骨颈或手舟骨的中间细部。这些和其他呈现AVN的骨区常常是小梁骨(也称为松质骨)区的区域。
本文中所述的组合物可以以任何合适的方式递送至待治疗的骨区。优选通过针腔注射递送，或另外通过递送设备的腔(如管或导管)递送。
在本文中特别优选的实施方案中，将组合物递送至髋骨的股骨头的呈现AVN的小梁骨。理想地，AVN是股骨头结构崩塌前的阶段。可以通过针(如套针或其他针)注射来进行组合物的递送。在某些实施方案中，通过多针阵列来递送组合物，所述多针阵列在辐射延伸的阵列中产生两个、三个或多个单独的针套，以提供组合物的区域化递送。在还有的其他实施方案中，组合物可以结合核心减压的操作来递送，其中在股骨颈中通过钻孔或其他外科手术形成槽。本文中所述的组合物可以用于材料中或用作材料，填满所述槽，来治疗呈现AVN的骨区。可替换地，槽可以填满合成的或天然的骨移植材料，如磷酸三钙、骨接合剂或自体同源或同种异体骨，并且此后可以将本文中所述的组合物通过填满移植物的槽递送并递送至呈现AVN的骨区，或例如通过填满移植物的槽的针注射。这些和其他治疗呈现AVN的骨区的方式将是本领域技术人员从本文的描述中显而易见的。
为了促进进一步理解本文中的实施方案及其特征和优势的目的，提供了以下具体的实施例。将理解这些实施例是本文中另外所述实施方案范围的说明，而并不是限制。
实施例
植入物制备和外科手术用4-mm活检穿孔器，从ECM薄层材料(肾小囊的4-层薄片，“RC”)切出4mm直径的圆片。将RC圆片植入物在37℃下接触20μl悬浮液孵育24小时，所述悬浮液通过混合脐带血衍生的ECFC(10μl中约300,000个细胞)和脐带血衍生的MSC(10μl中约100,000个细胞)制得。然后将接种细胞的RC圆片递送至外科手术区域中，以允许外科医生将其植入准备好的已知免疫缺陷(SCID)小鼠颅盖缺陷模型的缺陷中。对于该模型，在每只小鼠中钻出双侧4mm直径的缺陷。将双侧缺陷中的一个用作对照(没有接受治疗材料)，而另一个接受了治疗材料。将两个长度的钛丝系在相对侧上的植入圆片的外缘，作为可成像的参照物。通过治疗缺陷中钻取的头盖和尾部缝合孔并通过植入圆片中匹配的孔来引导缝合。使用缝合结将植入圆片缝合在顶骨上。对照(没有)治疗部位相似地用缝合线打结，但没有接受植入物。将切口闭合，并且给小鼠装配上伊丽莎白项圈领(外科手术后穿戴1周)。在植入后2、4、8、12和16周时，用微CT(小型计算机断层扫描)将研究中的小鼠体内成像。使用微CT扫描治疗和未治疗缺陷的骨覆盖中的变化。
结果：对于用接种细胞的ECM植入圆片治疗的缺陷，植入后16周时的骨覆盖百分比平均为52.6％(n＝6)。对于这些组中相应的未治疗缺陷，植入后16周时的骨覆盖百分比平均为23.7％。此外，在相似进行的实验中，在一侧仅接受ECM植入物(没有添加的细胞)而另一侧没有治疗的一组小鼠(n＝7)，在植入后16周时，治疗侧上的平均骨覆盖为约35％，而未治疗侧上的骨覆盖为约22％。
如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非文中另外明确指出。除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
在提供数值范围的情况下，将理解每个中间值，至下限单位的十分之一，除非文中另外明确指出，在该范围的上限和下限之间以及所述范围中的任何其他所述的或中间值都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围中，并且这样的实施方案也包括在本发明内，受到所述范围中任何特意排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
本文中提及的所有出版物按引用并入本文中，用于描述和公开出版物中所述的可以与目前描述的发明一道使用的成分的目的。
尽管在附图和之前的描述中详细说明和描述了本发明，但应当认为其对特征是说明性的，而不是限制性的，应当明白只是显示和描述了优选的实施方案，并且期望保护在本发明精神内的所有变化和改变。此外，本文中引用的所有出版物都表明了本领域普通技术人员的能力，并且将其全部按引用并入，如同单独按引用并入并全部列出一样。

Claims (75)

1.用于治疗患者受损或患病的骨的方法，包括：
将包括内皮祖细胞(EPC)和间质干细胞(MSC)的组合物给予受损或患病的骨。
2.可用于治疗患者受损或患病的骨的组合物，其包含内皮祖细胞(EPC)和间质干细胞(MSC)。
3.权利要求1或2的方法或组合物，其中组合物包括(i)至少约1.5:1，更优选至少约2:1，甚至更优选至少约3:1，或(ii)在约2:1至约10:1的范围中的相应细胞数量比的EPC和MSC。
4.之前任一项权利要求的方法或组合物，其中EPC是内皮集落形成细胞(ECFC)。
5.之前任一项权利要求的方法或组合物，其中EPC和MSC中的至少一种是患者同种异体的。
6.之前任一项权利要求的方法或组合物，其中EPC和MSC中的至少一种是患者自体同源的。
7.之前任一项权利要求的方法或组合物，其中MSC是患者同种异体的，而EPC是患者自体同源的。
8.之前任一项权利要求的方法或组合物，其中MSC是脐带血衍生的MSC。
9.之前任一项权利要求的方法或组合物，其中EPC是脐带血衍生的EPC。
10.权利要求9的方法或组合物，其中MSC是骨髓衍生的MSC。
11.之前任一项权利要求的方法或组合物，其中组合物还包含固体载体材料，并且优选其中PEC和MSC总数的至少约50％附着于所述固体载体材料上。
12.权利要求11的方法或组合物，其中固体载体材料包含胶原性胞外基质(ECM)组织材料。
13.根据权利要求12的方法或组合物，其中胶原性ECM组织材料包括来自用于胶原性ECM组织材料的源组织的天然肝素。
14.权利要求12或13的方法或组合物，其中ECM组织材料保留来自用于ECM组织材料的源组织的天然生长因子、糖胺聚糖、蛋白聚糖和糖蛋白。
15.权利要求12-14任一项的方法或组合物，其中胶原性ECM组织材料保留来自用于ECM组织材料的源组织的天然FGF-2。
16.权利要求15的方法或组合物，其中天然FGF-2以至少约50纳克/克胶原性ECM组织材料的水平存在于胶原性ECM组织材料中。
17.权利要求12-16任一项的方法或组合物，其中胶原性ECM组织材料包含粘膜下组织或肾小囊组织。
18.权利要求12-17任一项的方法或组合物，其中胶原性ECM组织材料是猪ECM组织材料。
19.权利要求1-18任一项的方法或组合物，其中组合物还包含磷酸钙化合物。
20.根据权利要求1-19任一项的方法或组合物，其中MSC和EPC是核型正常的。
21.之前任一项权利要求的方法或组合物，用于缺血性或坏死的骨的治疗。
22.权利要求21的方法或组合物，其中骨呈现缺血性坏死。
23.权利要求21或22的方法或组合物，其中骨在髋关节的股骨头中。
24.权利要求21-23任一项的方法或组合物，其中骨是小梁骨。
25.用于治疗患者股骨头的小梁骨区的方法，其中小梁骨呈现出缺血性坏死，所述方法包括：
使具有内腔的递送装置通入小梁骨区中；和
将根据权利要求1至20任一项的组合物通过内腔递送并递送至小梁骨区中。
26.权利要求25的方法，还包括钻取通过股骨头的通道。
27.权利要求26的方法，还包括将通道的至少一部分填满权利要求1-20任一项的组合物。
28.权利要求26的方法，还包括：
将通道的至少一部分填满骨移植材料；
使具有内腔的递送装置通过骨移植材料；和
将根据权利要求1至20任一项的组合物通过内腔递送并递送至小梁骨区。
29.脱细胞胞外基质(ECM)组织材料，用于根据权利要求1-28任一项的组合物或方法中。
30.间质干细胞，用于根据权利要求1-28任一项的组合物或方法中。
31.内皮祖细胞，优选内皮集落形成细胞，用于根据权利要求1-28任一项的组合物或方法中。
32.权利要求1的方法，其中组合物包括(i)至少约1.5:1，更优选至少约2:1，甚至更优选至少约3:1，或(ii)在约2:1至约10:1的范围中的相应细胞数量比的EPC和MSC。
33.权利要求1的方法，其中EPC是内皮集落形成细胞(ECFC)。
34.权利要求1的方法，其中EPC和MSC中的至少一种是患者同种异体的。
35.权利要求1的方法，其中EPC和MSC中的至少一种是患者自体同源的。
36.权利要求1的方法，其中MSC是患者同种异体的并且EPC是患者同种异体的。
37.权利要求1的方法，其中MSC是脐带血衍生的MSC。
38.权利要求1的方法，其中EPC是脐带血衍生的EPC。
39.权利要求1的方法，其中MSC是骨髓衍生的MSC。
40.权利要求1的方法，其中组合物还包含固体载体材料，并且优选EPC和MSC总数的至少约50％附着于固体载体材料上。
41.权利要求40的方法，其中固体载体材料包含胶原性胞外基质(ECM)组织材料。
42.权利要求41的方法，其中胶原性ECM组织材料包括来自用于胶原性ECM组织材料的源组织的天然肝素。
43.权利要求41的方法，其中ECM组织材料保留来自用于ECM组织材料的源组织的天然生长因子、糖胺聚糖、蛋白聚糖和糖蛋白。
44.权利要求41的方法，其中胶原性ECM组织材料保留来自用于ECM组织材料的源组织的天然FGF-2。
45.权利要求44的方法，其中天然FGF-2以至少约50纳克/克胶原性ECM组织材料的水平存在于胶原性ECM组织材料中。
46.权利要求41的方法，其中胶原性ECM组织材料包括粘膜下组织或肾小囊组织。
47.权利要求41的方法，其中胶原性ECM组织材料是猪ECM组织材料。
48.权利要求1的方法，其中组合物还包含磷酸钙化合物。
49.权利要求1的方法，其中MSC和EPC是核型正常的。
50.权利要求1和32-49任一项的方法，用于治疗缺血性或坏死的骨。
51.权利要求50的方法，其中所述骨呈现出缺血性坏死。
52.权利要求50的方法，其中所述骨在髋关节的股骨头中。
53.权利要求50的方法，其中所述骨是小梁骨。
54.权利要求2的组合物，其中组合物包括(i)至少约1.5:1，更优选至少约2:1，甚至更优选至少约3:1，或(ii)在约2:1至约10:1的范围中的相应细胞数量比的EPC和MSC。
55.权利要求2的组合物，其中EPC是内皮集落形成细胞(ECFC)。
56.权利要求2的组合物，其中EPC和MSC中的至少一种是患者同种异体的。
57.权利要求2的组合物，其中EPC和MSC中的至少一种是患者自体同源的。
58.权利要求2的组合物，其中MSC是患者同种异体的并且EPC是患者同种异体的。
59.权利要求2的组合物，其中MSC是脐带血衍生的MSC。
60.权利要求2的组合物，其中EPC是脐带血衍生的EPC。
61.权利要求2的组合物，其中MSC是骨髓衍生的MSC。
62.权利要求2的组合物，其中组合物还包含固体载体材料，并且优选其中EPC和MSC总数的至少约50％附着于固体载体材料上。
63.权利要求62的组合物，其中固体载体材料包含胶原性胞外基质(ECM)组织材料。
64.权利要求63的组合物，其中胶原性ECM组织材料包括来自用于胶原性ECM组织材料的源组织的天然肝素。
65.权利要求63的组合物，其中ECM组织材料保留来自用于ECM组织材料的源组织的天然生长因子、糖胺聚糖、蛋白聚糖和糖蛋白。
66.权利要求63的组合物，其中胶原性ECM组织材料保留来自用于ECM组织材料的源组织的天然FGF-2。
67.权利要求66的组合物，其中天然FGF-2以至少约50纳克/克胶原性ECM组织材料的水平存在于胶原性ECM组织材料中。
68.权利要求66的组合物，其中胶原性ECM组织材料包括粘膜下组织或肾小囊组织。
69.权利要求66的组合物，其中胶原性ECM组织材料是猪ECM组织材料。
70.权利要求2的组合物，其中组合物还包含磷酸钙化合物。
71.权利要求2的组合物，其中MSC和EPC是核型正常的。
72.权利要求2和54-71任一项的组合物，用于缺血性或坏死的骨的治疗。
73.权利要求72的组合物，其中所述骨呈现出缺血性坏死。
74.权利要求72的组合物，其中所述骨在髋关节的股骨头中。
75.权利要求72的组合物，其中所述骨是小梁骨。
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