JP2022121623A - リゾホスファチジルコリンの足場を利用する組成物及び方法 - Google Patents

リゾホスファチジルコリンの足場を利用する組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

【課題】リゾホスファチジルコリンの足場を利用する組成物及び方法を提供する。【解決手段】本明細書で開示されるのは、Ｍｆｓｄ２ａタンパク質を介した輸送のためにリゾホスファチジルコリンの足場のような足場を利用する組成物及び方法である。該組成物及び方法を脂肪酸及び他の分子のＬＰＣが媒介する送達に使用して、数ある用途の中で特に非経口栄養のための及び生きている動物の臓器の画像化のための脂肪酸製剤をスクリーニングし、特定することができる。【選択図】図１７

Description

分野
本発明は、リゾホスファチジルコリンの足場のような足場を利用する組成物及び方法に関する。該組成物及び方法を、脂肪酸及び他の分子のＬＰＣが媒介する送達に用いて、非経口栄養のための及び生きている動物の臓器の画像化のための脂肪酸製剤をスクリーニングし、特定することができる。本発明はまた、神経学的欠損のマーカーとしてヒトＭｆｓｄ２ａの変異及び多型を利用する組成物及び方法にも関する。
背景
血流は、リポタンパク質、アルブミン及び他の脂質結合タンパク質の状態で循環する多数の種の脂質を含有する。血中脂質の多様性は複雑であり、種の大半はリン脂質、脂肪酸及びスフィンゴ脂質のクラスに属する。これらのクラスの多数のメンバーは、たとえば、ホスファチジルコリンのような構造的な役割、及び、たとえば、スフィンゴシン－１－リン酸のようなシグナル伝達の役割を有する。血中でのその機能について相対的にほとんど知られていないその脂質種の１つがリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）である。ＬＰＣは構造的に、３つの主要な脂質成分：グリセロールと、ホスホコリンと、グリセロールのｓｎ－１またはｓｎ－２ヒドロキシルにエステル化される脂肪酸とで構成される。細胞膜内で、ＬＰＣの大半は、ホスホリパーゼＡ２酵素を介したホスファチジルコリン脂質のｓｎ－２位における脂肪酸部分の加水分解によって合成される。新しく生成されたＬＰＣは、リン脂質リモデリングのランズ回路を構成するリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）酵素を介したアシル化反応によってホスファチジルコリンを再合成するための前駆体である。ランズ回路は、核エンベロープにてリン脂質における飽和脂肪酸の高レベルを維持することのような膜の特性を調節することに重要であると提案されている。加えて、ランズ回路は、細胞にとって毒性であるＬＰＣを細胞膜内にて極めて低いレベルで保持するのにも役立ち得る。興味深いことに、ＬＰＣの血中レベルはかなり高く、ヒトや齧歯類では約１００μＭに達する（Ｃｒｏｓｅｔ，Ｍ．，Ｂｒｏｓｓａｒｄ，Ｎ．，Ｐｏｌｅｔｔｅ，Ａ．及びＬａｇａｒｄｅ，Ｍ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｒａｔ．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３４５，Ｐｔ.１，６１－６７（２０００）（非特許文献１）；Ｑｕｅｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｏ．ら．Ｌｉｐｉｄｏｍｉｃｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１，３２９９－３３０５，ｄｏｉ：１０．１１９４／ｊｌｒ．Ｍ００９４４９（２０１０）（非特許文献２））。血中総ＬＰＣのうちの少量は、高密度リポタンパク質に対するレシチン／コレステロールアシルトランスフェラーゼの作用によって、及び低密度リポタンパク質に対するリポタンパク質関連のホスホリパーゼＡ２を介して、循環中のリポタンパク質の状態で生成される。ヒト及び齧歯類の血液におけるＬＰＣの大半は肝臓におけるホスホリパーゼＡ２の作用を介して合成され、その際、それらはアルブミンの状態で分泌される。ヒト及び齧歯類にて最も豊富な血中ＬＰＣは、ＬＰＣ－パルミチン酸、ＬＰＣ－ステアリン酸及びＬＰＣ－オレイン酸である。たとえば、リゾ－ＰＥ、リゾ－ＰＩ及びリゾ－ＰＳのような、他のクラスの非膜局在型のリゾ脂質は、血中にて極めて低いレベルで見いだされ、主としてリポタンパク質の状態で循環する。血中ＬＰＣの生理的な機能は謎めいたままであるが、幾つかの報告は炎症、血管新生、細胞の増殖及び移動における主にシグナルを伝達する役割を示唆している。本明細書で提供されるのは、栄養を含む多様な領域におけるＬＰＣの新しい用途である。
栄養に関しては、低出生体重及び超低出生体重の未熟児の大半は、妊娠第３期と同等の期間、新生児集中治療室（ＮＩＣＵ）に残る。この期間中、消化器を介して適当な栄養素を得ることができない未熟児は非経口栄養（ＰＮ）の支援を必要とする。未熟児における栄養不足は、身体的及び知的な発達に関して後年、主要な負の転帰を有し、循環器疾患及び代謝性疾患の大きなリスクを有することが示されている（Ｉｓａａｃｓ，ＥＢ，ら．（２００８）Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｈｕｍａｎ ｄｉｅｔ ｏｎ ｃａｕｄａｔｅ ｖｏｌｕｍｅｓ ａｎｄ ＩＱ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３（３）：３０８－３１４（非特許文献３）；Ｌａｐｉｌｌｏｎｎｅ，Ａ及びＧｒｉｆｆｉｎ，ＩＪ．（２０１３），Ｆｅｅｄｉｎｇ ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔｓ ｔｏｄａｙ ｆｏｒ ｌａｔｅｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１６２（３，Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ７－１６．（非特許文献４））。
小児ＰＮに関する国際的な指針が最近改良され、世界中のケアの基準になっているが（Ｎｕｉｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｎｅｅｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔ：scientific ｂａｓｉｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ：Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，ＯＨ．（非特許文献５）；Ｋｏｌｅｔｚｋｏ，Ｂ．Ｇｏｕｌｅｔ，Ｏ．Ｈｕｎｔ，Ｊ．Ｋｒｏｈｎ，Ｋ.及びＳｈａｍｉｒ，Ｒ.（２００５）１．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（ＥＳＰＧＨＡＮ）並びにｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（ＥＳＰＥＮ），Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＥＳＰＲ）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，４１．Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ１－８７（非特許文献６））、ＮＩＣＵにてＰＮを用いた未熟児における栄養摂取が不適当であることは広く受け入れられるようになっている（Ｍａｒｔｉｎ，ＣＲ．ら．（２００９），Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｍｏｎｔｈ ｏｆ ｌｉｆｅ ｉｎ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１２４（２）：６４９－６５７（非特許文献７）；Ｏｌｓｅｎ，ＩＥ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ＤＫ．Ｓｃｈｍｉｄ，ＣＨ．Ａｕｓｍａｎ，ＬＭ.及びＤｗｙｅｒ，ＪＴ．（２００２），Ｉｎｔｅｒｓｉｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｗｅｉｇｈｔ ｇｒｏｗｔｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｏｆ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１１０（６）：１１２５－１１３２（非特許文献８））。重要なことに、ＰＮにおける栄養素の最適な組成は未知のままである（Ｂｅａｒｄｓａｌｌ，Ｋ.ら．（２００８），Ｅａｒｌｙ ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｖｅｒｙ－ｌｏｗ－ｂｉｒｔｈ－ｗｅｉｇｈｔ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５９（１８）：１８７３－１８８４（非特許文献９）；Ｃｌａｒｋ，ＲＨ．Ｃｈａｃｅ，ＤＨ，及びＳｐｉｔｚｅｒ，ＡＲ（２００７）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｎｅｏｎａｔｅｓ ａｄｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｃａｒｅ ｕｎｉｔ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１２０（６）：１２８６－１２９６（非特許文献１０））。ケアの基準はアミノ酸とグルコースと脂質の製剤である。脂質は通常、大豆油（２０％まで）に由来し、一部のさらに新しい製剤では、ω－３油（たとえば、ＦからのＳＵＭＦ脂質）を含有する。大豆油はエネルギーのための脂肪酸を提供し、ω－３及びω－６の脂肪酸前駆体はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びアラキドン酸（ＡＲＡ）に合成され、それらは脳の発達に必須である。前駆体脂肪酸のＤＨＡ及びＡＲＡへの変換は新生児の肝臓に頼るが、それは乏しい機能を有し、適当な量のこれら必須脂肪酸を提供できないことが多い。本明細書で提供されるのは、これらの及び他の栄養問題の解決である。
さらに、神経学的な疾患及び欠損の根拠としてのＭｆｓｄ２ａタンパク質における変異の役割も解明されている。本明細書で開示されるのは、同様にこれらの医学的難題に対する解決である。
Ｃｒｏｓｅｔ，Ｍ．，Ｂｒｏｓｓａｒｄ，Ｎ．，Ｐｏｌｅｔｔｅ，Ａ．及びＬａｇａｒｄｅ，Ｍ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｒａｔ．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３４５，Ｐｔ.１，６１－６７（２０００） Ｑｕｅｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｏ．ら．Ｌｉｐｉｄｏｍｉｃｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１，３２９９－３３０５，ｄｏｉ：１０．１１９４／ｊｌｒ．Ｍ００９４４９（２０１０） Ｉｓａａｃｓ，ＥＢ，ら．（２００８）Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｈｕｍａｎ ｄｉｅｔ ｏｎ ｃａｕｄａｔｅ ｖｏｌｕｍｅｓ ａｎｄ ＩＱ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３（３）：３０８－３１４ Ｌａｐｉｌｌｏｎｎｅ，Ａ及びＧｒｉｆｆｉｎ，ＩＪ．（２０１３），Ｆｅｅｄｉｎｇ ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔｓ ｔｏｄａｙ ｆｏｒ ｌａｔｅｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１６２（３，Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ７－１６． Ｎｕｉｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｎｅｅｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔ：scientific ｂａｓｉｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ：Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，ＯＨ． Ｋｏｌｅｔｚｋｏ，Ｂ．Ｇｏｕｌｅｔ，Ｏ．Ｈｕｎｔ，Ｊ．Ｋｒｏｈｎ，Ｋ.及びＳｈａｍｉｒ，Ｒ.（２００５）１．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（ＥＳＰＧＨＡＮ）並びにｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（ＥＳＰＥＮ），Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＥＳＰＲ）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，４１．Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ１－８７ Ｍａｒｔｉｎ，ＣＲ．ら．（２００９），Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｍｏｎｔｈ ｏｆ ｌｉｆｅ ｉｎ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１２４（２）：６４９－６５７ Ｏｌｓｅｎ，ＩＥ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ＤＫ．Ｓｃｈｍｉｄ，ＣＨ．Ａｕｓｍａｎ，ＬＭ.及びＤｗｙｅｒ，ＪＴ．（２００２），Ｉｎｔｅｒｓｉｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｗｅｉｇｈｔ ｇｒｏｗｔｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｏｆ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１１０（６）：１１２５－１１３２ Ｂｅａｒｄｓａｌｌ，Ｋ.ら．（２００８），Ｅａｒｌｙ ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｖｅｒｙ－ｌｏｗ－ｂｉｒｔｈ－ｗｅｉｇｈｔ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５９（１８）：１８７３－１８８４ Ｃｌａｒｋ，ＲＨ．Ｃｈａｃｅ，ＤＨ，及びＳｐｉｔｚｅｒ，ＡＲ（２００７）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｎｅｏｎａｔｅｓ ａｄｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｃａｒｅ ｕｎｉｔ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１２０（６）：１２８６－１２９６
概要
本明細書で開示されるのは、Ｍｆｓｄ２ａタンパク質を介した輸送のためにリゾホスファチジルコリンの足場のような足場を利用する組成物及び方法である。該組成物及び方法を脂肪酸及び他の分子のＬＰＣが媒介する送達に使用して、数ある用途の中で特に非経口栄養のための及び生きている動物の臓器の画像化のための脂肪酸製剤をスクリーニングし、特定することができる。本明細書で開示されるのはまた、神経学的欠損のマーカーとしてのヒトＭｆｓｄ２ａにおける変異及び多型を利用する組成物及び方法である。
第１の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｍｆｓｄ２ａタンパク質を介した輸送を判定する１以上の化合物をスクリーニングする方法であり、該方法は、（ａ）そのゲノムにＭｆｓｄ２ａ遺伝子のホモ接合性の破壊を含む遺伝子操作されたマウス（ＫＯマウス）及び野生型マウスに調べられる生物学的混合物を接触させることと；（ｂ）ＫＯマウス及び野生型マウスの組織または体液における１以上の化合物の量を測定することと；（ｃ）ＫＯマウス及び野生型マウスの組織または体液における前記１以上の化合物の量を比較することとを含み、その際、ＫＯマウスと比べて野生型マウスにおける前記１以上の化合物の量が多いことがＭｆｓｄ２ａタンパク質を介した化合物の輸送を示す。
一部の実施形態では、ＫＯマウスは機能的なＭｆｓｄ２ａタンパク質を発現しない。一部の実施形態では、生物学的混合物は乳、魚油抽出物またはＬＰＣ製剤に由来する。一部の実施形態では、組織または体液は脳、肝臓、心臓または母乳である。一部の実施形態では、接触させる方法は、経口投与または静脈内投与による。
第２の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｍｆｓｄ２ａタンパク質を介した輸送を判定する１以上の化合物をスクリーニングする方法であり、該方法は、（ａ）ヒト野生型Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡもしくはヒト変異Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを含む細胞株またはモックで形質移入した細胞に、試験される生物学的混合物を接触させることと；（ｂ）ヒト野生型Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを含む細胞及びヒト変異Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを含む細胞またはモックで形質移入した細胞における前記１以上の化合物の量を測定することと；（ｃ）野生型Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを含む細胞及びヒト変異Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを含む細胞またはモックで形質移入した細胞における前記１以上の化合物の量を比較することとを含み、その際、ヒト変異Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを含む細胞またはモックで形質移入した細胞と比べて野生型Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを含む細胞における前記１以上の化合物の量が多いことはＭｆｓｄ２ａタンパク質を介した化合物の輸送を示す。
一部の実施形態では、細胞はＨＥＫ２９３である。一部の実施形態では、ヒト変異Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡはヒトＭｆｓｄ２ａタンパク質配列におけるＤ９３またはＤ９７に相当する位置で変異を含む。
第３の態様では、本明細書で提供されるのは、ＬＰＣ－１６：０、ＬＰＣ－１８：０、ＬＰＣ－１８：１、ＬＰＣ－１８：２ｎ－６、ＬＰＣ－２０：４ｎ－６、ＬＰＣ－２２：６ｎ－３、ＬＰＣ－２０：５ｎ－３から成る群から選択される１以上のＬＰＣ成分を含む栄養補給剤である。
第４の態様では、本明細書で提供されるのは、それぞれ３７、１４、１０、２０、４、２５、及び０．５ｍＭの濃度でＬＰＣ－１６：０、ＬＰＣ－１８：０、ＬＰＣ－１８：１、ＬＰＣ－１８：２ｎ－６、ＬＰＣ－２０：４ｎ－６、ＬＰＣ－２２：６ｎ－３、ＬＰＣ－２０：５ｎ－３を含む栄養補給剤である。
第５の態様では、本明細書で提供されるのは、ＰＣ－１６：０、ＰＣ－１８：０、ＰＣ－１８：１、ＰＣ－１８：２ｎ－６、ＰＣ－２０：４ｎ－６、ＰＣ－２２：６ｎ－３、ＰＣ－２０：５ｎ－３から成る群から選択される１以上のＰＣ成分を含む栄養補給剤である。
第６の態様では、本明細書で提供されるのは、それぞれ３７、１４、１０、２０、４、２５、及び０．５ｍＭの濃度でＰＣ－１６：０、ＰＣ－１８：０、ＰＣ－１８：１、ＰＣ－１８：２ｎ－６、ＰＣ－２０：４ｎ－６、ＰＣ－２２：６ｎ－３、ＰＣ－２０：５ｎ－３を含む栄養補給剤である。
一部の実施形態では、栄養補給剤はさらにヒトのアルブミンを含む。一部の実施形態では、栄養補給剤はさらに、イントラリピッド（商標）、ＳＭＯＦＫａｂｉｖｅｎ（商標）、オメガベン（商標）、リポフンジン（商標）、ＣｌｉｎＯｌｅｉｃ（商標）、及びリポシン（商標）から成る群から選択される追加の脂質剤を含む。
第７の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）ヒト野生型Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡもしくはヒト変異Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを含む細胞株またはモックで形質移入した細胞をＬＰＣ－パルミチン酸、ＬＰＣ－オレイン酸、ＬＰＣ－ステアリン酸、ＬＰＣ－リノール酸、ＬＰＣ－リノレン酸、ＬＰＣ－アラキドン酸、ＬＰＣ－ドコサヘキサエン酸または誘導体に接触させることと；（ｂ）ヒト野生型Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを含む細胞及び変異Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを含む細胞またはモックで形質移入した細胞にて試験化合物の存在下及び非存在下でＬＰＣ－パルミチン酸、ＬＰＣ－オレイン酸、ＬＰＣ－ステアリン酸、ＬＰＣ－リノール酸、ＬＰＣ－リノレン酸、ＬＰＣ－アラキドン酸、ＬＰＣ－ドコサヘキサエン酸または誘導体の取り込みを測定することとを含む、Ｍｆｓｄ２ａタンパク質を介した輸送を調節する化合物をスクリーニングする方法であり、その際、試験化合物の非存在下に比べて試験化合物の存在下でのヒト野生型Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを含む細胞へのＬＰＣ－パルミチン酸、ＬＰＣ－オレイン酸、ＬＰＣ－ステアリン酸、ＬＰＣ－リノール酸、ＬＰＣ－リノレン酸、ＬＰＣ－アラキドン酸、ＬＰＣ－ドコサヘキサエン酸または誘導体の取り込みの上昇したレベルまたは低下したレベルはＭｆｓｄ２ａタンパク質を介した輸送の調節因子としての化合物を特定する。
一部の実施形態では、細胞はＨＥＫ２９３である。一部の実施形態では、ヒト変異Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡはヒトＭｆｓｄ２ａタンパク質配列におけるＤ９３またはＤ９７に相当する位置で変異を含む。一部の実施形態では、試験化合物はＭｆｓｄ２ａタンパク質を介して直接輸送される。
第８の態様では、本明細書で提供されるのは、標識された足場またはコンジュゲートを対象に投与することと、当該臓器にて前記標識された足場またはコンジュゲートのＭｆｓｄ２ａタンパク質による取り込みまたはそれとの相互作用を測定することとを含む、臓器を画像化する方法である。
一部の実施形態では、足場はＬＰＣである。一部の実施形態では、標識は蛍光である。一部の実施形態では、標識はフッ素化される。一部の実施形態では、臓器は脳または眼である。一部の実施形態では、標識された足場はＴｏｐ－Ｆｌｕｏｒ－ＬＰＣまたはＮＢＤ－ＬＰＣである。
第９の態様では、本明細書で提供されるのは、足場またはコンジュゲートを取り込ませるのに十分な条件下で足場またはコンジュゲートを対象に提供することを含む、Ｍｆｓｄ２ａタンパク質を介して化合物を輸送する方法である。
一部の実施形態では、足場はＬＰＣである。一部の実施形態では、化合物はＬＰＣのω炭素を介してＬＰＣにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、足場またはコンジュゲートはＢＢＢを越えるまたはＢＢＢにて蓄積される。一部の実施形態では、足場またはコンジュゲートは脳または眼に蓄積する。
第１０の態様では、本明細書で提供されるのは、化合物にコンジュゲートされた足場を含む組成物である。
一部の実施形態では、足場はＬＰＣである。一部の実施形態では、化合物はＬＰＣのω炭素を介してＬＰＣにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、化合物は医薬剤である。一部の実施形態では、化合物は造影剤である。
第１１の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）Ｍｆｓｄ２ａ遺伝子の全部または一部を含む、対象からの生物試料を提供することと、（ｂ）試料中にてＭｆｓｄ２ａ遺伝子またはその一部における変異または多型の存在を検出することと、（ｃ）Ｍｆｓｄ２ａ遺伝子またはその一部における変異または多型の存在に基づいて対象が神経学的欠損に対して増加した易罹患性を有することを評価することとを含む、対象における神経学的欠損に対する増加した易罹患性を評価する方法である。
一部の実施形態では、変異はＴｈｒ１５９ＭｅｔまたはＳｅｒ１６６Ｌｅｕである。一部の実施形態では、多型は表４、６または７にて列記される１以上の単一ヌクレオチド多型である。一部の実施形態では、変異は機能の喪失を生じる。一部の実施形態では、変異はＭｆｓｄ２ａの低次形態対立遺伝子である。
一部の実施形態では、神経学的欠損は記憶及び学習における欠損または不安である。
一部の実施形態では、対象は、受胎前または妊娠中の女性である。
一部の実施形態では、方法はさらに、Ｍｆｓｄ２ａ遺伝子またはその一部に変異または多型が存在するのであれば、高ＤＨＡ食を投与すること、またはＬＰＣによる静脈内処置若しくは腸内処置を施与することを含む。一部の実施形態では、ＬＰＣはＬＰＣ－ＤＨＡを含む。
一部の実施形態では、対象は認知機能に問題があると診断された小児または成人である。一部の実施形態では、認知機能は学習障害または不安である。
一部の実施形態では、検出することは、Ｍｆｓｄ２ａ遺伝子またはその一部と優先的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブに試料を接触させることを含む。一部の実施形態では、検出することは、Ｍｆｓｄ２ａ遺伝子またはその一部をＰＣＲによって増幅することを含む。一部の実施形態では、検出することは、Ｍｆｓｄ２ａ遺伝子もしくはその一部、または相当するＭｆｓｄ２ａのｃＤＮＡもしくはその一部を配列決定することを含む。
第１２の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）第１の細胞にて試験Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡ及び第２の細胞にて野生型Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを発現させることと、（ｂ）試験Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを発現している第１の細胞及び野生型Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを発現している第２の細胞をＬＰＣ－ＤＨＡまたはＬＰＣ－ω３脂肪酸に接触させることと、（ｃ）試験Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを発現している第１の細胞及び野生型Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを発現している第２の細胞へのＬＰＣ－ＤＨＡまたはＬＰＣ－ω３脂肪酸の取り込みを測定することとを含む、対象に由来するＭｆｓｄ２ａタンパク質の輸送機能を評価する方法であり、その際、野生型Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを発現している第２の細胞と比べた試験Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡを発現している第１の細胞へのＬＰＣ－ＤＨＡまたはＬＰＣ－ω３脂肪酸の取り込みの低下したレベルは試験Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡが輸送について欠陥にあるタンパク質をコードすることを示す。
一部の実施形態では、試験Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡはＴｈｒ１５９ＭｅｔまたはＳｅｒ１６６Ｌｅｕの変異をコードする。一部の実施形態では、試験Ｍｆｓｄ２ａのｃＤＮＡは表４、６または７で列記される多型の１以上をコードする。
[本発明1001]
Ｍｆｓｄ2ａタンパク質を介した輸送を判定する1以上の化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）そのゲノムにてＭｆｓｄ2ａ遺伝子のホモ接合性の破壊を含む遺伝子操作されたマウス（ＫＯマウス）及び野生型マウスに前記1以上の化合物を含む生物学的混合物を接触させることと、
（ｂ）ＫＯマウス及び野生型マウスの組織または体液にて前記1以上の化合物の量を測定することと、
（ｃ）ＫＯマウス及び野生型マウスの組織または体液にて前記1以上の化合物の量を比較することとを含み、
ＫＯマウスに比べて野生型マウスにおいて前記1以上の化合物の量がより多いことがＭｆｓｄ2ａタンパク質を介した前記化合物の輸送の指標である、前記スクリーニング方法。
[本発明1002]
ＫＯマウスが機能的なＭｆｓｄ2ａタンパク質を発現しない、本発明1001の方法。
[本発明1003]
生物学的混合物が乳、魚油抽出物、またはＬＰＣ製剤に由来する、本発明1001の方法。
[本発明1004]
組織または体液が脳、眼、肝臓、心臓または母乳である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
接触させる方法が経口投与または静脈内投与を介する、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記1以上の化合物が栄養補給剤である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
栄養補給剤がＬＰＣ製剤である、本発明1006の方法。
[本発明1008]
Ｍｆｓｄ2ａタンパク質を介した輸送を判定する1以上の化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ヒトの野生型のＭｆｓｄ2ａのｃＤＮＡもしくはヒトの変異Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを含む細胞株またはモックで形質移入した細胞に前記1以上の化合物を含む生物学的混合物を接触させることと、
（ｂ）ヒトの野生型のＭｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを含む細胞及びヒトの変異Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを含む細胞またはモックで形質移入した細胞にて前記1以上の化合物の量を測定することと、
（ｃ）野生型のＭｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを含む細胞及びヒトの変異Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを含む細胞またはモックで形質移入した細胞にて前記1以上の化合物の量を比較することとを含み、
ヒトの変異Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを含む細胞またはモックで形質移入した細胞に比べて野生型のＭｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを含む細胞において前記1以上の化合物の量がより多いことがＭｆｓｄ2ａタンパク質を介した前記化合物の輸送の指標である、前記スクリーニング方法。
[本発明1009]
細胞がＨＥＫ293である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
ヒトの変異Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡがヒトのＭｆｓｄ2ａタンパク質配列におけるＤ93またはＤ97に相当する位置で変異を含む、本発明1008の方法。
[本発明1011]
ＬＰＣ－16：0、ＬＰＣ－18：0、ＬＰＣ－18：1、ＬＰＣ－18：2 ｎ－6、ＬＰＣ－20：4 ｎ－6、ＬＰＣ－22：6 ｎ－3、ＬＰＣ－20：5 ｎ－3から成る群から選択される1以上のＬＰＣ成分を含む栄養補給剤。
[本発明1012]
それぞれ37、14、10、20、4、25、及び0．5ｍＭの濃度でＬＰＣ－16：0、ＬＰＣ－18：0、ＬＰＣ－18：1、ＬＰＣ－18：2 ｎ－6、ＬＰＣ－20：4 ｎ－6、ＬＰＣ－22：6 ｎ－3、ＬＰＣ－20：5 ｎ－3を含む栄養補給剤。
[本発明1013]
ヒトのアルブミンをさらに含む、本発明1011または1012の栄養組成物。
[本発明1014]
イントラリピッド（商標）、ＳＭＯＦＫａｂｉｖｅｎ（商標）、オメガベン（商標）、リポフンジン（商標）、ＣｌｉｎＯｌｅｉｃ（商標）、及びリポシン（商標）から成る群から選択される追加の脂質剤をさらに含む、本発明1011または1012または1013の栄養組成物。
[本発明1015]
ＰＣ－16：0、ＰＣ－18：0、ＰＣ－18：1、ＰＣ－18：2 ｎ－6、ＰＣ－20：4 ｎ－6、ＰＣ－22：6 ｎ－3、ＰＣ－20：5 ｎ－3から成る群から選択される1以上のＰＣ成分を含む栄養補給剤。
[本発明1016]
それぞれ37、14、10、20、4、25、及び0．5ｍＭの濃度でＰＣ－16：0、ＰＣ－18：0、ＰＣ－18：1、ＰＣ－18：2 ｎ－6、ＰＣ－20：4 ｎ－6、ＰＣ－22：6 ｎ－3、ＰＣ－20：5 ｎ－3を含む栄養補給剤。
[本発明1017]
ヒトのアルブミンをさらに含む、本発明1015または1016の栄養組成物。
[本発明1018]
イントラリピッド（商標）、ＳＭＯＦＫａｂｉｖｅｎ（商標）、オメガベン（商標）、リポフンジン（商標）、ＣｌｉｎＯｌｅｉｃ（商標）、及びリポシン（商標）から成る群から選択される追加の脂質剤をさらに含む、本発明1015または1016または1017の栄養組成物。
[本発明1019]
Ｍｆｓｄ2ａタンパク質による輸送を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ヒトの野生型のＭｆｓｄ2ａのｃＤＮＡもしくはヒトの変異Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを含む細胞株またはモックで形質移入した細胞をＬＰＣ－パルミチン酸、ＬＰＣ－オレイン酸、ＬＰＣ－ステアリン酸、ＬＰＣ－リノール酸、ＬＰＣ－リノレン酸、ＬＰＣ－アラキドン酸、ＬＰＣ－ドコサヘキサエン酸、または誘導体に接触させることと、
（ｂ）ヒトの野生型のＭｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを含む細胞及びヒトの変異Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを含む細胞またはモックで形質移入した細胞にて、試験化合物の存在下及び非存在下で、ＬＰＣ－パルミチン酸、ＬＰＣ－オレイン酸、ＬＰＣ－ステアリン酸、ＬＰＣ－リノール酸、ＬＰＣ－リノレン酸、ＬＰＣ－アラキドン酸、ＬＰＣ－ドコサヘキサエン酸、または誘導体の取り込みを測定することとを含み、
試験化合物の非存在下に比べて試験化合物の存在下で、ヒトの野生型のＭｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを含む細胞へのＬＰＣ－パルミチン酸、ＬＰＣ－オレイン酸、ＬＰＣ－ステアリン酸、ＬＰＣ－リノール酸、ＬＰＣ－リノレン酸、ＬＰＣ－アラキドン酸、ＬＰＣ－ドコサヘキサエン酸、または誘導体の取り込みの増加したレベルまたは低下したレベルが、Ｍｆｓｄ2ａタンパク質による輸送の調節因子としての化合物を示す、前記スクリーニング方法。
[本発明1020]
細胞がＨＥＫ293である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
ヒトの変異Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡがヒトのＭｆｓｄ2ａタンパク質配列におけるＤ93またはＤ97に相当する位置で変異を含む、本発明1019の方法。
[本発明1022]
試験化合物がＭｆｓｄ2ａタンパク質により直接輸送される、本発明1019の方法。
[本発明1023]
臓器の画像化法であって、標識した足場またはコンジュゲートを対象に投与することと、対象臓器にて前記標識した足場またはコンジュゲートのＭｆｓｄ2ａタンパク質による取り込みまたはＭｆｓｄ2ａタンパク質との相互作用を測定することとを含む、前記画像化法。
[本発明1024]
足場がＬＰＣである、本発明1023の方法。
[本発明1025]
標識が蛍光である、本発明1023の方法。
[本発明1026]
標識がフッ素化される、本発明1023の方法。
[本発明1027]
臓器が脳または眼である、本発明1023の方法。
[本発明1028]
標識された足場がＴｏｐ－Ｆｌｕｏｒ－ＬＰＣまたはＮＢＤ－ＬＰＣである、本発明1023の方法。
[本発明1029]
Ｍｆｓｄ2ａタンパク質による化合物の輸送方法であって、足場またはコンジュゲートを取り込ませるのに十分な条件下で対象に前記足場またはコンジュゲートを提供することを含む、前記輸送方法。
[本発明1030]
足場がＬＰＣである、本発明1029の方法。
[本発明1031]
化合物が、ＬＰＣのω炭素を介してＬＰＣにコンジュゲートされる、本発明1030の方法。
[本発明1032]
足場またはコンジュゲートがＢＢＢを越えるまたはＢＢＢで蓄積する、本発明1029の方法。
[本発明1033]
足場またはコンジュゲートが脳または眼にて蓄積する、本発明1029の方法。
[本発明1034]
化合物にコンジュゲートされた足場を含む組成物。
[本発明1035]
足場がＬＰＣである、本発明1034の組成物。
[本発明1036]
化合物がＬＰＣのω炭素を介してＬＰＣにコンジュゲートされる、本発明1035の組成物。
[本発明1037]
化合物が医薬剤である、本発明1034の組成物。
[本発明1038]
化合物が造影剤である、本発明1034の組成物。
[本発明1039]
対象における神経学的欠損に対する増加した易罹患性の評価方法であって、
（ａ）Ｍｆｓｄ2ａ遺伝子の全部または一部を含む、対象に由来する生物試料を提供することと；
（ｂ）試料におけるＭｆｓｄ2ａ遺伝子またはその一部にて変異または多型の存在を検出することと、
（ｃ）Ｍｆｓｄ2ａ遺伝子またはその一部における変異または多型の存在に基づいて、対象が神経学的欠損に対する増加した易罹患性を有することを評価することとを含む、前記評価方法。
[本発明1040]
変異がＴｈｒ159ＭｅｔまたはＳｅｒ166Ｌｅｕである、本発明1039の方法。
[本発明1041]
多型が表4、6または7にて列記される単一ヌクレオチド多型の1以上である、本発明1039の方法。
[本発明1042]
変異が機能の喪失を生じる、本発明1039の方法。
[本発明1043]
変異がＭｆｓｄ2ａの低次形態対立遺伝子である、本発明1039の方法。
[本発明1044]
神経学的欠損が記憶及び学習における欠損または不安である、本発明1039の方法。
[本発明1045]
対象が受胎前のまたは妊娠中の女性である、本発明1039の方法。
[本発明1046]
Ｍｆｓｄ2ａ遺伝子またはその一部において変異または多型が存在するならば、高ＤＨＡ食を投与すること、またはＬＰＣを用いた静脈内処置若しくは腸内処置を施与することをさらに含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
ＬＰＣがＬＰＣ－ＤＨＡを含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
対象は、認知機能に関する問題があると診断された小児または成人である、本発明1039の方法。
[本発明1049]
認知機能が学習障害または不安である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
Ｍｆｓｄ2ａ遺伝子またはその一部において変異または多型が存在するならば、高ＤＨＡ食を投与すること、またはＬＰＣを用いた静脈内処置若しくは腸内処置を施与することをさらに含む、本発明1048の方法。
[本発明1051]
ＬＰＣがＬＰＣ－ＤＨＡを含む、本発明1050の方法。
[本発明1052]
検出することが、Ｍｆｓｄ2ａ遺伝子またはその一部と優先的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブに試料を接触させることを含む、本発明1039の方法。
[本発明1053]
検出することが、Ｍｆｓｄ2ａ遺伝子またはその一部をＰＣＲによって増幅することを含む、本発明1039の方法。
[本発明1054]
検出することが、Ｍｆｓｄ2ａ遺伝子、その一部、または相当するＭｆｓｄ2ａのｃＤＮＡもしくはその一部の配列を決定することを含む、本発明1039の方法。
[本発明1055]
対象に由来するＭｆｓｄ2ａタンパク質の輸送機能の評価方法であって、
（ａ）第1の細胞にて試験Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを、第2の細胞にて野生型Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを発現させることと、
（ｂ）試験Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを発現する第1の細胞及び野生型Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを発現する第2の細胞をＬＰＣ－ＤＨＡまたはＬＰＣ－ω3脂肪酸に接触させることと、
（ｃ）試験Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを発現する第1の細胞及び野生型Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを発現する第2の細胞へのＬＰＣ－ＤＨＡまたはＬＰＣ－ω3脂肪酸の取り込みを測定することとを含み、
野生型Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを発現する第2の細胞に比べて試験Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡを発現する第1の細胞へのＬＰＣ－ＤＨＡまたはＬＰＣ－ω3脂肪酸の取り込みの低下したレベルは、試験Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡが輸送に不十分なタンパク質をコードすることを示す、前記評価方法。
[本発明1056]
試験Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡが、Ｔｈｒ159ＭｅｔまたはＳｅｒ166Ｌｅｕの変異をコードする、本発明1055の方法。
[本発明1057]
試験Ｍｆｓｄ2ａのｃＤＮＡが、表4、6または7に列記される多型の1以上をコードする、本発明1055の方法。
ＫＯマウスにおける血液脳関門及びニューロン欠損でのＭｆｓｄ２ａの局在を示す図である。（ａ）Ｍｆｓｄ２ａ（赤色）は脳の微細血管で高度に濃縮され、ここでは成熟ニューロンのＮｅｕＮ染色（緑色）と共にＣＡ１領域で示される。（ｂ、ｃ）Ｍｆｓｄ２ａはＧＦＡＰ染色で示されるような星状細胞のエンドフィートと密着した血液脳関門の内皮細胞にて発現される。（ｄ）ＫＯマウスの小脳におけるパルブアルブミン（Ｐｖａｌｂ）染色によって検出されたプルキンエ細胞の喪失。（ｅ）ＷＴマウス及びＫＯマウスの小脳におけるプルキンエ細胞の定量。***Ｐ＜０．００１。（ｆ）８週齢のＷＴマウス及びＫＯマウスの脳の矢状断面の海馬におけるＮｅｕＮ染色はＫＯマウスの特定の海馬領域における成熟ニューロンの低下を示した。（ｇ）上記（ｆ）で調べたマウスに由来するＣＡ１、ＣＡ３及び歯状回（ＤＧ）の領域におけるニューロン数の定量。***Ｐ＜０．００１。データは平均値±ＳＥＭとして表す。 Ｍｆｓｄ２ａのＫＯマウスの脳はＤＨＡ欠乏であることを示す図である。成熟Ｍｆｓｄ２ａノックアウト（ＫＯ）マウス及び野生型（ＷＴ）マウスの脳、肝臓、及び心臓のリン脂質の包括的リピドミクス解析。（ａ）脳、肝臓、及び心臓で測定した個々のリン脂質種の比率のヒートマップ表示。ＤＨＡ及びＡＡを含有する種をそれぞれ赤及び青で強調する。ｌｙｓｏＰＣ：リゾホスファチジルコリン、ＰＣ：ホスファチジルコリン、ｌｙｓｏＰＥ：リゾホスファチジルエタノールアミン、ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン、ｌｙｓｏＰＩ：リゾホスファチジルイノシトール、ＰＩ：ホスファチジルイノシトール、ＰＳ：ホスファチジルセリン、ｐ：プラズマローゲン、ｅ：エステル。（ｂ、ｄ、ｆ）脳、肝臓、及び心臓のリン脂質における総ＤＨＡレベル（ＷＴ、ｎ＝５；ＫＯ、ｎ＝４）。（ｃ、ｅ、ｆ）脳、肝臓、及び心臓のリン脂質における総ＡＡレベル。***Ｐ＜０．０００１，**Ｐ＜０．０１，*Ｐ＜０．０５。ＤＨＡ及びＡＡのレベルはリン脂質の総レベルの比率の平均値±ＳＥＭとして表す。表２を参照のこと。 放射性標識したＬＰＣの細胞に基づく輸送アッセイを示す図である。（ａ、ｂ、ｃ）３０分後のＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ、ＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸、ＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸の濃度依存性の輸送。マウスのＭｆｓｄ２ａ（ＷＴ）及び変異体構築物Ｄ９２Ａ、Ｄ９６Ａを示した濃度での放射性標識したＬＰＣの取り込みについて調べた。（ｄ）ＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ、ＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸、ＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸の比較輸送優先性。（ｅ）放射性標識したＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡの生物学的取り込み。（ｆ）ｅで示したＴＬＣプレートのＰＣバンドの定量。（ｇ）ホスファチジルコリンへのＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸の生体取り込み。（ｈ、ｆ）ｇで示したＴＬＣプレートのＰＣバンドの定量。（ｉ）マウスＭｆｓｄ２ａの輸送活性はナトリウムに依存する（Ｃｈ＋はコリンを指す）。（ｋ）５０μＭのＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸のＭｆｓｄ２ａによる輸送のナトリウム濃度依存性についての用量反応曲線。ａ～ｄ、ｆ、ｈ、ｉ、ｋについては、３つ組のデータを平均値±ＳＥＭとして表す。***Ｐ＜０．０００１。 脳による放射性標識したＬＰＣの取り込みはＫＯマウスで低下したことを示す図である。６～７週齢のオスのマウスに同じ用量の（ａ）ＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ及び（ｂ）ＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸を静脈内注射した。脂質の抽出及びシンチレーションカウントを用いて定量されるＤＰＭのために注射後２時間で脳、肝臓及び心臓を採取した。取り込みは平均値±ＳＥＭとして表す（ＷＴ、ｎ＝５；ＫＯ、ｎ＝５）。***Ｐ＜０．０００１、*Ｐ＜０．０５。（ｃ）蛍光ＮＢＤ－ＬＰＣの構造。（ｄ）野生型Ｍｆｓｄ２ａを発現しているＨＥＫ２９３細胞はモック（空のプラスミド）、Ｄ９２Ａ及びＤ９６Ａの変異体に比べてＮＢＤ－ＬＰＣに対して有意に高い取り込み活性を示した。（ｅ）ＴＬＣ解析はＮＢＤ－ＬＰＣがＰＣに生体取り込みされることを示した。ＮＢＤ－ＬＰＣの輸送は１０倍モル過剰のＬＰＣ－１８：０（標識なし）によって抑制された。変異体Ｄ９２Ａ、Ｄ９６Ａはモックで形質移入した細胞と類似のＮＢＤ－ＬＰＣに対する輸送活性を有した。（ｆ）ｅで示したＴＬＣプレートのＰＣバンドの定量。（ｇ）ＮＢＤ－ＬＰＣの脳による取り込みはＫＯマウスで低下した。６週齢のオスマウス（ＷＴ、ｎ＝３；ＫＯ、ｎ＝３）にＮＢＤ－ＬＰＣ／ＢＳＡ複合体３００μｇを静脈内注射した。（ｈ）ＷＴ及びＫＯの１５の脳切片に由来する蛍光を定量し、画素当たりの蛍光強度として表した。データは平均値±ＳＥＭとして表す。**Ｐ＜０．００１。 Ｍｆｓｄ２ａは脳における微細血管の内皮にて高度に発現されることを示す図である。（ａ）内皮におけるＭｆｓｄ２ａの発現はグルコース輸送体Ｓｌｃ２ａ１（Ｇｌｕｔ１）と共局在する。矢頭は脳血管における内皮細胞を示す。縮尺棒：５μｍ。（ｂ）Ｍｆｓｄ２ａは脳の微細血管で高度に発現され、ここで示すのは歯状回領域における切片である。縮尺棒：５０μｍ。（ｃ）Ｍｆｓｄ２ａと周皮細胞マーカーＰｄｇｆｒ－ｂは脳の微細脈管構造にて共局在するが、パネルｄで示すようにＭｆｓｄ２ａは周皮細胞では発現されない。パネルｄにおける黄色と赤色の矢頭はそれぞれ、内皮細胞と周皮細胞を示す（ｃ及びｄにおける縮尺棒は２０μｍ及び５μｍ）。 サルの脳における微細血管の内皮でＭｆｓｄ２ａの類似の発現パターンが見いだされることを示す図である。（ａ）Ｍｆｓｄ２ａは脳における微細血管にて高度に発現され、グルコース輸送体Ｓｌｃ２ａ１（Ｇｌｕｔ１）と共局在し、ここで示すのはＰ４サルの小脳である。縮尺棒：２００μｍ。（ｂ、ｃ）脳の微細血管の内皮におけるＭｆｓｄ２ａの発現。示すのは海馬領域である。ＧＦＡＰは星状細胞のマーカーである。 胎齢ｅ１５．５の胎仔のＢＢＢにおけるＭｆｓｄ２ａの局在及び脂質の分析を示す図である。（ａ）胎仔の脳でＭｆｓｄ２ａ（赤色）は微細血管にて高度に発現され、グルコース輸送体Ｓｌｃ２ａ１（Ｇｌｕｔ１、緑色）と共局在する。縮尺棒：１００μｍ。（ｂ）ＷＴ（ｎ＝６）及びＫＯ（ｎ＝5）の胎齢ｅ１８．５の胎仔の脳におけるリン脂質の質量分光分析測定は、ＫＯ胎仔の脳は有意に低下したＤＨＡレベルを有する一方でＡＡレベルは上昇することを示した。***Ｐ＜０．００１。完全なデータセットについてはソースファイルを参照のこと。 （ａ）胎盤及び胎仔の重量を示す。ＫＯオスと交配した２匹のＨＥＴ妊娠マウス（胎齢Ｅ１８．５）の胎盤及び胎仔を採取し、秤量した。ＨＥＴ（ｎ＝7）とＫＯ（ｎ＝１１）の間で胎盤及び胎仔の重量に有意差はなかった。（ｂ）尾懸垂を用いて１０週齢のＷＴマウスとＫＯマウスの足把持表現型の存在について調べた。 （ａ）２匹の８週齢のＷＴとＫＯの同腹仔の脳の代表的な画像。（ｂ）ＫＯマウス（ｎ＝４）の脳の重量はＷＴ（ｎ＝４）同腹仔よりも有意に低い。***Ｐ＜０．００１。データは平均値±ＳＥＭとして表す。（ｃ）脳及び脳の矢状断面の肉眼的形態。８週齢のＷＴマウス及びＫＯマウスの矢状断面をＮｅｕＮで染色してニューロン細胞を視覚化し、Ｍｆｓｄ２ａポリクローナル抗体で染色してＭｆｓｄ２ａの発現を視覚化した。Ｍｆｓｄ２ａは脳で広く発現されることを示す。縮尺棒：１ｍｍ。（ｄ）ＫＯマウスにてさらに小さな海馬を示す、８週齢のＷＴマウス及びＫＯマウスの海馬領域のＨ＆Ｅ染色。縮尺棒：５００μｍ。 Ｍｆｓｄ２ａのＫＯマウスは学習、記憶における欠損及び重度の不安を呈することを示す図である。（ａ、ｂ）Ｙ迷路試験及び（ｃ、ｄ）新奇の物体認識試験を用いてそれぞれＷＴマウス及びＫＯマウスの空間学習、短期の記憶（ＳＴＭ）及び長期の記憶（ＬＴＭ）を評価した。ＫＯマウスは、空間作業記憶についてのＹ迷路試験で有意に低下した総アーム進入回数を示した。ＫＯマウスは、新奇の物体認識試験にて新奇の物体に対して有意に低下した嗜好性を示したということは、それぞれ短期の記憶及び長期の記憶における欠陥を示す。「Ｔｒａｉｎ」は訓練期間を示す。（ｅ～ｈ）ゼロ迷路試験、（ｉ～ｍ）明／暗ボックス試験を用いてそれぞれＷＴマウス及びＫＯマウスの不安を評価した。ＫＯマウスは、不安挙動についてのゼロ迷路試験の間、低下した移動及び覗き込み行動を示した。ＫＯマウスは、不安についての明／暗ボックス試験の間、明ボックスへの進入が減り、明ボックスへの進入にかかった時間が増えた。（ｍ～ｏ）運動についてのオープンフィールド試験。ＫＯマウスは自発運動についてのオープンフィールド試験にて低下した移動距離を示した。オープンフィールド試験の間、ＫＯマウスは、運動機能不全を示す垂直方向行動を有さず、中心で費やす時間の低下があり、それはＷＴマウスに比べて低下した探索を示す。オープンフィールドのコーナーで費やす時間の増加は、ＫＯマウスがＷＴマウスよりも大きな不安を抱えていることを示唆し、ゼロ迷路試験及び明／暗ボックス試験の我々の結果に一致する。ＷＴマウス（ｎ＝１１～１３）及びＫＯマウス（ｎ＝８～１０）。***Ｐ＜０．００１、**Ｐ＜０．０１、*Ｐ＜０．０５。データは平均値±ＳＥＭとして表す。 質量分光分析によって分析された個々のリン脂質の種を示す図である。（ａ～ｅ）Ｍｆｓｄ２ａノックアウト（ＫＯ、ｎ＝４、斜線棒）及び野生型（ＷＴ、ｎ＝５、黒棒）の同腹仔の脳、肝臓及び心臓のリン脂質の包括的リピドミクス解析。ｌｙｓｏＰＣ：リゾホスファチジルコリン、ＰＣ：ホスファチジルコリン、ｌｙｓｏＰＥ：リゾホスファチジルエタノールアミン、ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン、ｌｙｓｏＰＩ：リゾホスファチジルイノシトール、ＰＩ：ホスファチジルイノシトール、ＰＳ：ホスファチジルセリン、ｐ：プラズマローゲン、ｅ：エステル。脂肪酸レベルは相当する臓器における総リン脂質のパーセントとして算出し、平均値±ＳＥＭとして表した。重ね合わせたグラフを用いてＷＴマウスとＫＯマウスの同じ脂肪酸の種の差異を提示した。 図１１ａの説明を参照のこと。 図１１ａの説明を参照のこと。 図１１ａの説明を参照のこと。 図１１ａの説明を参照のこと。 Ｍｆｓｄ２ａはエステル化されていない脂肪酸を輸送しないことを示す図である。（ａ）１００μＭの［１４Ｃ］－ＤＨＡと共に一晩インキュベートした後の、マウスＭｆｓｄ２ａ及びヒトＭｆｓｄ２ａで形質移入したＨＥＫ２９３細胞のリン脂質と中性脂質の薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）解析。標準：遊離の［１４Ｃ］－ＤＨＡ。（ｂ）１００μＭの［１４Ｃ］－オレイン酸と共に一晩インキュベートした後の、マウスＭｆｓｄ２ａ及び変異体で形質移入したＨＥＫ２９３細胞のリン脂質と中性脂質のＴＬＣ解析。用いたＴＬＣのプロトコールは方法に記載した。ＰＣ：ホスファチジルコリン、ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン、ＴＡＧ：トリグリセリド、ＣＥ：コレステリルエステル。 形質移入の２４時間後のＨＥＫ２９３細胞におけるマウスＭｆｓｄ２ａ及び変異体の発現及び局在を示す図である。（ａ）原形質膜におけるＭｆｓｄ２ａ、Ｄ９２Ａ及びＤ９６Ａの局在（赤色）。（ｂ）形質移入の２４時間後のＨＥＫ２９３細胞におけるＭｆｓｄ２ａ、Ｄ９２Ａ及びＤ９６Ａの発現のウエスタンブロット解析。 ヒトＭｆｓｄ２ａのＬＰＣ輸送活性を示す図である。（ａ）放射性標識したＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ及び（ｃ）ＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸のホスファチジルコリン（ＰＣ）への生体取り込み。ヒトＭｆｓｄ２ａを発現している細胞をＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡまたは５０μＭのＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸とインキュベートした。ＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡとの３０分のインキュベート及びＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸との１２０分のインキュベートの後、細胞から脂質を抽出し、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を分割するＴＬＣ法を用いて解析した。ヒトＭｆｓｄ２ａ（ｈＭｆｓｄ２ａ）及び空のプラスミド（モック）を発現するＨＥＫ２９３による（ｂ）ＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ及び（ｄ）ＬＰＣ－［3Ｈ］オレイン酸の用量依存性の輸送。 ＬＰＣの時間依存性の輸送及び物質輸送を示す図である。（ａ）５０μＭのＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸の輸送の時間依存性。（ｂ）Ｍｆｓｄ２ａを発現している細胞におけるＬＰＣリガンドの正味取り込みの増加。１００μＭの非標識のＬＰＣ－オレイン酸とのインキュベートの１時間後、マウスのＭｆｓｄ２ａ及び変異体で形質移入したＨＥＫ２９３細胞のリン脂質の薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）解析。示された数はモックに比べたＰＣレベルの倍変化である。標準のＰＣ：ホスファチジルコリン；ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン。 Ｍｆｓｄ２ａの輸送活性はプロトン依存性ではなく且つリチウム依存性ではないことを示す図である。（ａ）Ｍｆｓｄ２ａ（ＷＴ）、Ｄ９２Ａ、Ｄ９６Ａ及びモックを発現している細胞の輸送活性は、示されたｐＨでは有意差はなかった。（ｂ）Ｍｆｓｄ２ａの活性はナトリウム依存性であって、リチウム依存性ではない。データは同じ条件で処理された相当するモック細胞に対するＭｆｓｄ２ａを発現している細胞の倍変化で表した。（ｃ）Ｍｆｓｄ２ａの輸送活性は、エタノールまたはミセル形態で可溶化されたＬＰＣ－パルミチン酸がＢＳＡよりも低レベルにもかかわらず、Ｍｆｓｄ２ａによって輸送されたので、ＢＳＡ依存性ではない。 Ｍｆｓｄ２ａのリガンド構造を決定するための競合アッセイを示す図である。競合アッセイはすべて、１０倍モル過剰（２５０μＭ）の示した競合相手と共にまたはそれを伴わずに２５μＭのＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸をリガンドとして用いて行った。（ａ）ｂ及びｃで使用された脂質競合相手の構造。（ｂ）示したアシル鎖ＬＰＣとの競合アッセイ。（ｃ）示した頭基との競合アッセイ。インキュベートの３０分後、アッセイを止めた。競合活性は対照（競合相手を伴わないＭｆｓｄ２ａの活性）に対する比率として表した。ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン、ＬＰＥ：リゾホスファチジルエタノールアミン、ＬＰＳ：リゾホスファチジルセリン、ＬＰＡ：リゾホスファチジン酸、６：０：ヘキサノエート、８：０：ドカノエート、１０：０：オクタノエート、１２：０：ラウレート、１４：０：ミリステート、１６：０：パルミテート、１８：０：ステアレート、１８：１：オレエート。ＧＰＣ：α－グリセリルホスホコリン。（ｄ）ｅ及びｆで使用された生体活性のある脂質競合相手の代表的な構造。（ｅ）プラズマローゲンのリゾリン脂質形態及び血小板活性化因子（ＰＡＦ）との競合アッセイ。この実験はｂと一緒に行ったので、ｂで示した対照及びモックを参照として使用することができる。（ｆ）ＰＡＦ及びリゾスフィンゴミエリン（リゾＳＭ）が強力な競合を示したのに対してスフィンゴシン１－リン酸（Ｓ１Ｐ）はＬＰＣ－［３Ｈ］１６：０の取り込みで競合しなかった。競合活性は対照（競合相手を伴わないＭｆｓｄ２ａの活性）に対する比率として表した。（ｇ）１６炭素のアルキル鎖を有する非生物学的なリゾリン脂質類似体、フォスコリン－１６（ミルテフォシン）の代表的な構造。（ｈ）示したフォスコリンのＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸との競合アッセイ。インキュベートの１５分後にアッセイを止めた。競合活性は対照（競合相手を伴わないＭｆｓｄ２ａの活性）に対する比率として表した。８（Ｆｏｓ－８）、１０（Ｆｏｓ－１０）及び１２（Ｆｏｓ－１２）のアルキル鎖長を持つフォスコリンは競合しなかったのに対して、１６炭素のアルキル鎖長を持つフォスコリン（ミルテフォシン）はＬＰＣ－［３Ｈ］１６：０との強力な競合を示した。データは平均値±ＳＥＭとして表す。***Ｐ＜０．００１。 ２５μＭのＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＥとのインキュベートの３０分後のマウスのＭｆｓｄ２ａ及び変異体で形質移入したＨＥＫ２９３細胞のリン脂質の薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）解析を示す図である。（ａ）リン脂質のＴＬＣ解析。（ｂ）ＴＬＣプレートのＰＥバンドの強度の定量。ＰＥ：ホスファチジンエタノールアミン；ＬＰＥ：リゾホスファチジンエタノールアミン。 Ｍｆｓｄ２ａ欠損マウスではエステル化されていない［１４Ｃ］ＤＨＡの脳への取り込みは低下しなかったことを示す図である。７週齢のオスマウスに１ミリモルの［１４Ｃ］ＤＨＡ／ＢＳＡ複合体を静脈内注射した。脂質抽出とシンチレーションカウントを用いて定量されるＤＰＭのために注射の２時間後に脳、肝臓及び心臓を採取した。（ａ～ｃ）ＷＴ及びＫＯの脳、肝臓及び心臓におけるエステル化されていない［１４Ｃ］ＤＨＡの取り込みをＤＰＭ／ｇで表した。（ｄ～ｆ）「ａ～ｃ」のＤＨＡの取り込みのレベルをナノモル／ｇに変換した。（ｇ～ｉ）ＬＰＣ－ＤＨＡの形態（２時間で図４からナノモル／ｇに変換された）でのＤＨＡ取り込みの絶対量とＷＴマウスの脳、肝臓及び心臓におけるエステル化されていないＤＨＡ（上記ｄ～ｆに由来する）の間での比較。同じ量のＬＰＣ－ＤＨＡ及びＤＨＡをマウスに注射した。ＬＰＣ－ＤＨＡ取り込みの量は、野生型の脳によるエステル化されていないＤＨＡの取り込みよりもはるかに多かった。データは平均値±ＳＥＭとして表す。（ＷＴ、ｎ＝５；ＫＯ、ｎ＝５）。***Ｐ＜０．０００１、*Ｐ＜０．０５。 Ｍｆｓｄ２ａ欠損マウスではエステル化されていないＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＣの脳による取り込みは低下したことを示す図である。この実験は図４でＮＢＤ－ＬＰＣについて記載したように行った。（ａ）ＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＣの構造。（ｂ）野生型Ｍｆｓｄ２ａを発現しているＨＥＫ２９３細胞は、モック（空のプラスミド）、Ｄ９２Ａ及びＤ９６Ａ変異体に比べてＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＣに対して有意に高い取り込み活性を示した。（ｃ）ＴＬＣ解析はＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＣがＰＣに生体取り込みされることを示した。（ｄ）ｃで示したＴＬＣプレートのＰＣバンドの定量。（ｅ）ＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＣの脳による取り込みはＫＯマウスで低下した。７週齢のオスマウス（ＷＴ、ｎ＝３；ＫＯ、ｎ＝３）に３００μｇのＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＣ／ＢＳＡ複合体を静脈内注射した。（ｆ）ＷＴマウス及びＫＯマウスの１０の脳切片の蛍光を定量し、画素当たりの蛍光強度として表した。データは平均値±ＳＥＭとして表す。**Ｐ＜０．００１。 食事へのＤＨＡの補給はＭｆｓｄ２ａノックアウト表現型をレスキューできなかったことを示す図である。ＫＯオスとの交配での受胎に先立って、ヘテロ接合体のメスマウスに２日ごとに２週間、１００μＬのＤＨＡ油（２６％ＤＨＡトリグリセリド及び６％ＥＰＡを含有し、総ω－３は３５％である）を強制投与した。ヘテロ接合体のマウスは検出可能な表現型を示さず、ＷＴマウスと類似の脳ＤＨＡを有する（示さず）ので、ＷＴに似ている。ＨＥＴとＫＯの異系交配を用いる根拠はこのレスキュー試験でＫＯマウスの産出量を上げるためであった。妊娠中、妊娠マウスには２日ごとにＤＨＡの強制投与を続けた。母親の強制投与は授乳の間も継続し、仔は３週齢にて普通食で離乳し、８週間、２日ごとにＤＨＡを強制投与した。（ａ）食餌ＤＨＡ油で処理した後８週齢の成熟ＷＴマウス（ｎ＝４）及びＫＯマウス（ｎ＝４）の脳重量。ＫＯマウスの脳は依然として有意に小さかった。（ｂ～ｅ）ＤＨＡ処理したＫＯマウスは明／暗ボックス試験を用いて測定したような強い不安表現型を低下させなかった。何故食餌ＤＨＡがＫＯ表現型をレスキューすることができないのかを検討するために、我々は、母親由来のＤＨＡ（この場合、ＤＨＡは強制投与によって母親に送達された）の取り込みは脳の発達の間にＫＯマウスの脳に到達しないという仮説を調べた。この可能性を調べるために、ＫＯ父親と異系交配した妊娠ＨＥＴ母親に胎齢ｅ１７．５～ｅ１９．５日にて［１４Ｃ］ＤＨＡを強制投与し、胎仔の脳への取り込みを定量した。ｆにて示すデータは、同じ母親内でのＨＥＴマウスに比べてＫＯマウスの脳は［１４Ｃ］ＤＨＡの取り込みで８０％の低下を示した（ｎ＝４、ＷＴ；ｎ＝６、ＫＯ）。従って、胎仔発生の間で発現されるＭｆｓｄ２ａは脳へのＤＨＡの輸送に重要である。データは平均値±ＳＥＭとして表す。*Ｐ＜０．０５、***Ｐ＜０．００１。 Ｍｆｓｄ２ａのホモ接合体変異を持つヒトは重度の小頭症を示すことを示す図である。（ａ）Ｔｈｒ１５９Ｍｅｔの変異について血縁のエジプト人家族の家系図を示す。家系図の黒い物が冒された小児である。家系図の右の写真は家系図で＃２として示された冒された少女の写真である。（ｂ）冒された小児における重度の小頭症と水頭症を示すＭＲＩを用いた脳の構造画像。小さな皮質及び脳のしわの欠如に留意のこと。これらのデータは、他の臨床データを見いだすことができるＺａｋｉ，Ｍ.Ｓ.ら．Ｂｒａｉｎ，２０１２；１３５：２４１６－２４２７に由来する。（ｃ）ホモ接合体Ｓｅｒ１６６Ｌｅｕ変異を有するリビア人家族に由来する血縁ではない小児の脳のＭＲＩ画像。これら２人の血縁ではない患者間での表現型の類似性に留意のこと。 ＭＦＳＤ２Ａの変異は重度の小頭症及び脳室拡大の原因となることを示す図である。（Ａ）各世代にて数で示される血縁家族１４２２及び１８２５。丸：女性、四角：男性、スラッシュ：罹患した、星印：試料採取した。（Ｂ）上：軸方向ＭＲＩ、下：傍矢状のＭＲＩ。画像は、冒された小児すべてにて大きく拡張した側脳室（星印）と同様に脳梁及び脳幹（矢頭）及び小脳（矢印）の形成不全を示す。（Ｃ）患者の変異の位置でのＭＦＳＤ２Ａ遺伝子のエクソン構造。（Ｄ）残基Ｔ１５９及びＳ１６６の保存を示すＭＦＳＤ２Ａのヒト、マウス、サカナ及び細菌のオルソログのアミノ酸配列の配列比較。（順番にそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１６）（Ｅ）予測されるタンパク質に対する変異の位置。ＴＭ：膜貫通ドメイン、橙色：主要ファシリテータスーパーファミリードメイン、一般基質輸送体ドメイン。 Ｍｆｓｄ２ａのｐ.Ｔ１５９Ｍ及びｐ.Ｓ１６６Ｌの変異は損傷されたＬＰＣ輸送を示すことを示す図である。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞で発現されたＭｆｓｄ２ａ（ＷＴ）、変異体ｐ.Ｔ１５９Ｍ及びｐ.Ｓ１６６Ｌのタンパク質のウエスタンブロット。変異体タンパク質は野生型と区別できない翻訳後修飾及び安定性を示す。（Ｂ）変異体タンパク質は野生型と区別できない形質移入したＨＥＫ２９３細胞における膜局在を示す。（Ｃ）鋳型としてＭｅｌＢの原子分解構造を用いたスレッドモデルから生成したヒトＭＦＳＤ２Ａの内部空洞の図。膜貫通ドメインＩＩは保存されたナトリウム結合残基Ｄ９３及びＤ９７を含有する。膜貫通ドメインＩＶはＴ１５９及びＳ１６６を含有する。３０分後のＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ（Ｄ）ＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸（Ｅ）及びＬＰＣ－［１４Ｃ］パルミチン酸（Ｆ）の濃度依存性の輸送。変異体構築物ｐ.Ｔ１５９Ｍ及びｐ.Ｓ１６６Ｌは濃度の範囲にわたって欠陥のある輸送を示す。（Ｇ）変異体及びモックはＷＴに比べてホスファチジルコリン（ＰＣ）への放射性標識したＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸の低下した生物学的取り込みを示した。モック、ｐ.Ｔ１５９Ｍ及びｐ.Ｓ１６６Ｌを発現している細胞における多量のＬＰＣは欠陥のあるＬＰＣの取り込みを反映する。（Ｇ）で示されたＴＬＣプレートからの放射性標識したＰＣ（Ｈ）及びＬＰＣ（Ｉ）のバンドの定量。実験は３つ組で２回行った。データは平均値±ＳＥＭとして表す。***Ｐ＜０．００１、**Ｐ＜０．０１、*Ｐ＜０．０５。 リピドミクス質量分光分析による血漿総ＬＰＣ及び個々のＬＰＣ種を示す図である。ＷＴ（ｎ＝５）マウス及びＭｆｓｄ２ａのＫＯ（ｎ＝５）マウスに由来する血漿総ＬＰＣ（Ａ）及び共通するＣ１６～２２鎖長のＬＰＣ種（Ｂ）の濃度を３つ組で調べた。（Ｃ）ＷＴ（ｎ＝３）同腹仔に比べたＭｆｓｄ２ａのＫＯマウス（ｎ＝４）の血漿における注入したＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸の経時的な定量。対照、家族１４２２及び１８２５からの冒されていない両親、及び冒された個体に由来する血漿総ＬＰＣ（Ｄ）及び共通するＬＰＣ種（Ｅ）の濃度。異なる日に採取した２種類の独立した血漿試料から３つ組で解析を１回行った。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０，００１。 冒された個体のホモ接合性マップを示す図である。ホモ接合体Ｍｆｓｄ２ａ変異を持つ家族１４２２及び１８２５からの冒された個体におけるホモ接合性ブロック（赤色）を示すホモ接合性プロット。灰色：Ｍｆｓｄ２ａを含むホモ接合性ブロックは冒されたものすべてで重なり合う。矢印：Ｍｆｓｄ２ａの位置。 父親（ヘテロ接合体）、冒されたもの（ホモ接合体）及び冒されていない兄弟姉妹または変異（矢印）を示す無関係な対照（参照正常ホモ接合体）のＳａｎｇｅｒ配列決定からのクロマト図を示す。１４２２の配列は順番にそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７～１９として開示され、１８２５の配列は順番にそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０～２２として開示されている。 Ｍｆｓｄ２ａはヒト胎児脳における微細血管の内皮細胞で発現されることを示す図である。Ｍｆｓｄ２ａ（赤色）はヒト胎児脳にて内皮で高度に発現され、グルコース輸送体ＧＬＵＴ１（緑色）と共局在する。矢印は脳血管の内皮細胞を示す。尺度棒：２０μｍ。 ヒトの組織におけるＭｆｓｄ２ａの発現を示す図である。ヒト成人組織にわたるＲＴ－ＰＣＲは骨格筋と心臓以外の調べたすべての組織で発現を示す。ＧＡＰＤＨを負荷対照として使用した。
序論
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は正常な脳の成長と認知機能に必須のω－３脂肪酸である（Ｋｉｄｄ，Ｐ．Ｍ．Ｏｍｅｇａ－３ ＤＨＡ ａｎｄ ＥＰＡ ｆｏｒ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ｂｅｈａｖｉｏｒ，ａｎｄ ｍｏｏｄ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｅｒｇｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｒｅｖｉｅｗ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，１２，２０７－２２７（２００７）；Ｈｏｒｒｏｃｋｓ，Ｌ．Ａ．及びＹｅｏ，Ｙ．Ｋ．Ｈｅａｌｔｈ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｏｆ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＤＨＡ）．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｔａｌｉａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，４０，２１１－２２５，ｄｏｉ：１０．１００６／ｐｈｒｓ．１９９９．０４９５（１９９９）；Ｍｏｚａｆｆａｒｉａｎ，Ｄ．及びＷｕ，Ｊ．Ｈ．Ｏｍｅｇａ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ， ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，５８，２０４７－２０６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｃ．２０１１．０６．０６３（２０１１）；Ｃｏｎｎｏｒ，Ｗ．Ｅ．Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｎ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，７１，１７１Ｓ－１７５Ｓ（２０００））。脳におけるその重要性と一致して、ＤＨＡは脳のリン脂質で高度に濃縮される（Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｃ．，Ｇｏｍｂｏｓ，Ｇ．及びＭｏｒｇａｎ，Ｉ．Ｇ．Ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２６６，６９５－７０７（１９７２）；Ｉｎｎｉｓ，Ｓ．Ｍ．Ｄｉｅｔａｒｙ（ｎ－３）ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１３７，８５５－８５９（２００７）；Ｓａｌｅｍ，Ｎ．，Ｊｒ．，Ｌｉｔｍａｎ，Ｂ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｙ．及びＧａｗｒｉｓｃｈ，Ｋ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｌｉｐｉｄｓ，３６，９４５－９５９（２００１））。脳のリン脂質における豊富な脂肪酸であるにもかかわらず、ＤＨＡは脳でデノボ合成することができず、血液脳関門を越えて移入されねばならないが、脳におけるＤＨＡの取り込みのメカニズムは謎のままである。ここで我々は、脳へのＤＨＡ取り込みの主要な輸送体としての、微細血管の血液脳関門の内皮に専ら発現されることを我々が示す、以前オーファンであった輸送体Ｍｆｓｄ２ａである主要ファシリテータスーパーファミリーのメンバーを特定する。リピドミクス解析は、Ｍｆｓｄ２ａ欠損マウス（ＫＯ）が脳におけるＤＨＡレベルを劇的に低下させることを示し、それには海馬及び小脳におけるニューロン細胞の喪失及び神経学的な且つ重度の行動障害、及び重要なことに脳の大きさの低下が伴う。驚くべきことに、細胞に基づく試験は、Ｍｆｓｄ２ａがリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の形態でのＤＨＡをナトリウム依存性に輸送するが、エステル化されていない脂肪酸を輸送しないことを示した。とりわけ、Ｍｆｓｄ２ａは、たとえば、ＬＰＣ－オレイン酸及びＬＰＣ－パルミチン酸のような長鎖脂肪酸を運ぶ一般的な血漿ＬＰＣを輸送したが、１４炭素未満のアシル鎖を有するＬＰＣを輸送しなかった。さらに、我々はＬＰＣのホスホル両性イオン頭基が輸送に決定的であることを見つけ出した。重要なことに、ＫＯマウスは、Ｍｆｓｄ２ａがＤＨＡの脳での取り込みに必要とされることを明らかにしている標識したＬＰＣ－ＤＨＡ及び他のＬＰＣの血漿から脳への取り込みを劇的に低下させた。我々の知見は、脳での成長及び機能における、血漿に由来するＬＰＣの予想外の本質的な生理的役割を明らかにしている。
本明細書で開示される知見に基づいて、組成物及び方法は、血液／脳、血液／眼及び胎盤内皮のバリアを越えたＤＨＡ及びω－３脂肪酸のＬＰＣが介在する送達；非経口栄養のためのＬＰＣ－ＤＨＡ、ＬＰＣ及びω－３脂肪酸の製剤；ＬＰＣ／栄養コンジュゲート及び他のコンジュゲートの最適化された製剤をスクリーニングする系；及び脳や眼の生きている動物の画像化のためのＬＰＣコンジュゲート及び他のコンジュゲートの使用方法、及び神経学的欠損を示す傾向を特定する方法のために提供される。
使用される用語
本発明は、当然変化することができる特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物系に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は特定の態様を記載する目的のみのためのものであって、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。本明細書及び添付のクレームで使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈が明瞭に述べない限り、複数の参照が含まれる。
用語「約」は、たとえば、量、一時的な持続時間等のような測定可能な値を参照して本明細書で使用されるとき、特定の値からの±２０％または±１０％、さらに好ましくは±５％、一層さらに好ましくは±１％、及びその上さらに好ましくは±０．１％の変動を包含することとし、そのようなものとして変動は開示される方法を実施するのに適当である。
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて本発明が関する当該技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものに類似するまたは同等である方法及び材料を本発明の試験のための実践で使用することができるけれども、好まれる材料及び方法は本明細書で記載される。
「脊椎動物」、「哺乳類」、「対象」、「哺乳類対象」または「患者」は相互交換可能に使用され、たとえば、ヒト患者及び非ヒト患者、と同様に、たとえば、ウサギ、ラット及びマウスのような実験動物、及び他の動物のような哺乳類を指す。動物には、脊椎動物すべて、たとえば、マウス、ヒツジ、イヌ、ウシ、鳥類種、アヒル、ガチョウ、ブタ、ニワトリ、両生類及び爬虫類のような哺乳類及び非哺乳類が挙げられる。
主要ファシリテータスーパーファミリー（ＭＦＳ）
主要ファシリテータスーパーファミリー（ＭＦＳ）は原核生物及び真核生物の双方にて最大の二次輸送体ファミリーである。性状分析されたＭＦＳタンパク質の大半は親水性化合物を輸送し、生体脂質、特にリン脂質を輸送するものは未だ特定されておらず（Ｌａｗ，Ｃ．Ｊ．，Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｐ．Ｃ．及びＷａｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｉｎｓ ａｎｄ ｏｕｔｓ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２，２８９－３０５ ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｍｉｃｒｏ．６１．０８０７０６．０９３３２９（２００８））、それはタンパク質のＡＴＰ結合カセット輸送ファミリーによって選択される機能である。Ｍｆｓｄ２ａはＭＦＳ３のメンバーとして分類されたオーファン輸送体である（Ｌａｗ，Ｃ．Ｊ．，Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｐ．Ｃ．及びＷａｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｉｎｓ ａｎｄ ｏｕｔｓ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２，２８９－３０５，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｍｉｃｒｏ．６１．０８０７０６．０９３３２９（２００８））。細菌では、Ｍｆｓｄ２ａはナトリウム／二糖類の共輸送体、ｍｅｌＢ、細菌の二糖類、メリビオースのための輸送体に対して遠隔相同性を有する。包括的な配列解析は魚からヒトに至るまでのＭｆｓｄ２ａの系統発生上の強い保存を示している（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｈａｒｒｏｎ，Ｍ．Ｊ．及びＳｉｌｖｅｒ，Ｄ．Ｌ．Ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ（ＭＦＳＤ２Ａ）ｈａｓ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｂｏｄｙ ｇｒｏｗｔｈ，ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７，ｅ５０６２９，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５０６２９（２０１２））。魚のＭｆｓｄ２ａは脳で発現される（ｗｗｗ．ｆｉｓｈｂａｓｅ．ｏｒｇ）。細胞培養モデルにおける公平なスクリーニングを用いて、ヒトＭｆｓｄ２ａは霊長類ゲノムで見いだされたレトロウイルス由来のタンパク質である、合胞体栄養細胞融合因子シンシチン－２の受容体として特定されたが、マウスＭｆｓｄ２ａはシンシチンに結合しない、または細胞融合を媒介しない。従って、ヒトＭｆｓｄ２ａの融合機能は「二次的な」機能であるらしく、その一次的な機能は輸送にあると示唆された（Ｅｓｎａｕｌｔ，Ｃ．ら．Ａ ｐｌａｃｅｎｔａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ，ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ，ｈｕｍａｎ ｓｙｎｃｙｔｉｎ－２．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０５，１７５３２－１７５３７，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０７４１３１０５（２００８））。別の研究では、Ｍｆｓｄ２ａはマウスの肝臓にて絶食が誘導する遺伝子として記載されたが、脳では高度に且つ構成的に発現されている（Ａｎｇｅｒｓ，Ｍ．，Ｕｌｄｒｙ，Ｍ．，Ｋｏｎｇ，Ｄ．，Ｇｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．及びＪｅｔｔｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｍｆｓｄ２ａ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｕｒｉｎｇ ｆａｓｔｉｎｇ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，４１６，３４７－３５５，ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＪ２００８０１６５（２００８））。我々は、マウスの肝臓におけるＭｆｓｄ２ａの基本的なレベルは非常に低く、肝臓における絶食が誘導するＭｆｓｄ２ａの発現は脂肪酸代謝の優れた調節因子ＰＰＡＲαによって調節されることを見いだした（Ａｎｇｅｒｓ，Ｍ．，Ｕｌｄｒｙ，Ｍ．，Ｋｏｎｇ，Ｄ．，Ｇｉｍｂｌｅ，Ｊ Ｍ．及びＪｅｔｔｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｍｆｓｄ２ａ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｕｒｉｎｇ ｆａｓｔｉｎｇ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，４１６，３４７－３５５，ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＪ２００８０１６５（２００８））ということは、Ｍｆｓｄ２ａが脂肪酸の輸送に関与し得ることを示唆している。
ＭＦＳファミリーのタンパク質は、大腸菌からヒトまでで見いだされるメンバーで膨大である。今日までに知られ、性状分析されたＭＦＳメンバーの大半は親水性分子を輸送する。ＭＦＳファミリーの全体的な構造上の高い類似性にもかかわらず、ＭＦＳタンパク質は相対的に少ないアミノ酸残基の変化によってリガンド特異性を達成する（Ｌａｗ，Ｃ．Ｊ．，Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｐ．Ｃ．及びＷａｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｉｎｓ ａｎｄ ｏｕｔｓ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６２，２８９－３０５，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｍｉｃｒｏ．６１．０８０７０６．０９３３２９（２００８））。ＭＦＳファミリーの輸送の全体的なメカニズムは、大腸菌に由来するグリセロール－３－リン酸輸送体ＧｌｐＴのＸ線構造から最初に推論され、他のＭＦＳファミリーメンバーの構造によって確認された（Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｏｎｇ，Ｊ．，Ａｕｅｒ，Ｍ．及びＷａｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１，６１６－６２０，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０８７６１９（２００３）；Ｓｈｉ，Ｙ．Ｃｏｍｍｏｎ ｆｏｌｄｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，４２，５１－７２，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｂｉｏｐｈｙｓ－０８３０１２－１３０４２９（２０１３））。モデルは、外開き構造がリガンドに結合して内開き構造への構造変換を生じる「ロッカー／スイッチ」モデルとして記載されている（Ｓｈｉ，Ｙ．Ｃｏｍｍｏｎ ｆｏｌｄｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，４２，５１－７２，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｂｉｏｐｈｙｓ－０８３０１２－１３０４２９（２０１３））。この構造変化を行わせるエネルギーは、その濃度勾配を流下させるナトリウムのようなカチオンの結合によって提供される。Ｍｆｓｄ２ａの場合、それはナトリウムを利用してＬＰＣの輸送を行わせる。実際、Ｍｆｓｄ２ａは我々が示し、ＬＰＣのナトリウム依存性の輸送に必須である保存されたナトリウム結合部位を含有する。Ｍｆｓｄ２ａによる輸送に必要とされるリゾ脂質の最小リガンド構造は、リン酸に基づく両性イオンの頭基と１４の炭素を有する最小のアルキル側鎖である。重要なリガンドの構造的特徴としてのＬＰＣの両性イオン頭基の使用は、ほとんどのＭＦＳファミリーのメンバーについての親水性リガンドの使用と一致する。アルキル側鎖に対するＭｆｓｄ２ａの認容はＭＦＳタンパク質についての新しい特質である。生体内では、Ｍｆｓｄ２ａはアルブミンに結合したＬＰＣリガンドを輸送するが、我々の試験はＭｆｓｄ２ａがエタノールに溶解した、またはミセルの形態でのＬＰＣリガンドも輸送できることを示している。従って、アルブミンへのＬＰＣの結合は輸送には必要とされない。我々は、ＬＰＣのＭｆｓｄ２ａによる輸送について以下の単純なモデルを提案する：（１）ＬＰＣは先ず、原形質膜の外葉に吸着し、その後、側方拡散及び（２）Ｍｆｓｄ２ａへの結合が続く。（３）ホスホコリン頭基が輸送体を介してナトリウムと共に共輸送される一方で、アルキル側鎖が輸送体を膜の周辺の疎水性環境にぶら下げる。この構成が最終的にアルキル側鎖及びＬＰＣ分子全体の膜を越えての内葉への移動を可能にする。
ヒトのＭｆｓｄ２ａタンパク質をコードする代表的なｃＤＮＡ配列を以下に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）：
Figure 2022121623000002
代表的なヒトＭｆｓｄ２ａタンパク質の配列を以下に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）：
Figure 2022121623000003
一部の実施形態では、上述した核酸及びアミノ酸の配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、上記配列の変異体を本発明の実践で使用してもよい。
機能的に活性のある変異体は、たとえば、対立遺伝子変異体や種変異体のような天然に存在する機能的に活性のある変異体、及び、たとえば、変異誘発法によってまたは直接合成によって作出することができる天然に存在しない機能的に活性のある変異体を含む。
機能的に活性のある変異体は、たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基によって上記で示された配列と異なり、なお且つ、生物活性を保持する。この比較が配列比較を必要とする場合、配列は最大の相同性について並べられる。表現型でサイレントなアミノ酸置換の作り方に関する指針はＢｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６－１３１０（１９９０）にて提供され、それは変化に対するアミノ酸配列の認容を研究するには２つの主な戦略があることを教示している。第１の戦略は進化の過程の間での自然淘汰によるアミノ酸置換の認容を活用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することによって種間で保存されているアミノ酸の位置を特定することができる。これらの保存されたアミノ酸はタンパク質の機能にとって重要である可能性がある。対照的に、自然淘汰によって置換が認容されているアミノ酸の位置はタンパク質の機能にとって決定的ではない位置を示す。従って、アミノ酸置換を認容する位置を修飾することができるが、それは修飾されたペプチドの特定の免疫原性活性を依然として維持する。
第２の戦略は遺伝子操作を用い、クローニングした遺伝子の特定の位置にアミノ酸の変化を導入してタンパク質機能にとって決定的な領域を特定する。たとえば、部位特異的変異誘発またはアラニン走査変異誘発を使用することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５（１９８９））。次いで特定の生物活性について得られた変異体ペプチドを調べることができる。
Ｂｏｗｉｅらによれば、これら２つの戦略はタンパク質がアミノ酸の置換に驚くほど寛容であることを明らかにしている。著者らはさらに、どのアミノ酸変化がタンパク質における特定のアミノ酸位置で許容性である可能性があるのかを示している。たとえば、最も埋め込まれたまたは内部の（タンパク質の三次構造の中で）アミノ酸残基は非極性の側鎖を必要とするのに対して表面または外部の側鎖の特徴は一般にほとんど保存されない。
タンパク質のアミノ酸に変異を導入する方法は当業者に周知である。たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ． Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照のこと。
変異はまた、たとえば、「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような市販のキットを用いて、またはペプチド合成によって直接、導入することもできる。ペプチドの機能に有意に影響を与えないアミノ酸を置き換えることによる機能的に活性のある変異体の前記ペプチドへの生成は当業者によって達成され得る。
本発明に係るペプチドの１つで行われ得るアミノ酸置換の種類は保存的なアミノ酸置換である。「保存的なアミノ酸置換」は、類似の化学的特性（たとえば、電荷または疎水性）を持つ側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によってアミノ酸残基が置き換えられるものである。一般に、保存的なアミノ酸置換はタンパク質の機能的な特性を実質的に変化させないであろう。２以上のアミノ酸配列が保存的な置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似の程度を上向きに調整して置換の保存的性質を是正する。この調整を行う手段は当業者に周知である。たとえば、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７－３１（１９９４）を参照のこと。
類似の化学的特性を持つ側鎖を有するアミノ酸の群の例には、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族／ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸；並びに（７）イオウ含有側鎖：システイン及びメチオニンが挙げられる。好まれる保存的なアミノ酸置換の群は、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、及びアスパラギン／グルタミンである。
或いは、保存的な置換は、Ｇｏｎｎｅｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１４４３－４５（１９９２）にて開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおける正の値を有する変化である。「中程度に保存された」置換はＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおける負ではない値を有する変化である。
さらに、当業者によってＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ検索が実行されて上記配列に対して８０％以上の配列同一性を有するタンパク質を特定することができる。
所望のタンパク質についてのコーディング配列がいったん調製されると、好適なベクターまたはレプリコンにそれらをクローニングすることができる。多数のクローニングベクターが当業者に既知であり、適当なクローニングベクターの選択は選択できる問題である。クローニングのための組換えＤＮＡベクター及び形質転換することができる宿主細胞の例には、バクテリオファージλ（大腸菌）、ｐＢＲ３２２（大腸菌）、ｐＡＣＹＣ１７７（大腸菌）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性細菌）、ｐＬＡＦＲｌ（グラム陰性細菌）、ｐＭＥ２９０（非大腸菌グラム陰性細菌）、ｐＨＶ１４（大腸菌及び枯草菌）、ｐＢＤ９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ｐＩＪ６１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ＹＩｐ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ＹＣｐ１９（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びウシのパピローマウイルス（哺乳類細胞）が挙げられる。Sａｍｂｒｏｏｋら，上記；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，上記；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，上記を参照のこと。遺伝子は、プロモータ、リボソーム結合部位（細菌での発現用）及び任意でオペレータ（本明細書ではまとめて「制御」要素と呼ばれる）の制御のもとに置くことができるので、この発現構築物を含有するベクターで形質転換された宿主細胞にて所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列はＲＮＡに転写される。コーディング配列はシグナルペプチドまたはリーダー配列を含有することができ、または含有することができない。リーダー配列は翻訳後プロセッシングにて宿主によって取り除くことができる。たとえば、ＵＳ４，４３１，７３９；４，４２５，４３７；４，３３８，３９７を参照のこと。
宿主細胞の増殖に関連してタンパク質配列の発現の調節を可能にする他の調節配列も望ましくてもよい。調節配列は当業者に既知であり、例には、調節性化合物の存在を含む化学的なまたは物理的な刺激に応答して遺伝子の発現をオンにするまたはオフにするものが挙げられる。他の種類の調節要素、たとえば、エンハンサ配列もベクターにて存在することができる。
上述のクローニングベクターのようなベクターへの挿入に先立って、制御配列及び他の調節配列をコーディング配列に連結することができる。或いは、制御配列及び適当な制限部位をすでに含有している発現ベクターにコーディング配列を直接クローニングすることができる。
場合によっては、適当な配向を持つ、すなわち、適正なリーディングフレームを維持するためにコーディング配列が制御配列に連結され得るようにそれを修飾することが必要であり得る。タンパク質の変異体または類似体を作出することも望ましくてもよい。変異体または類似体は、タンパク質をコードする配列の一部の欠失によって、配列の挿入によって及び／または配列内での１以上のヌクレオチドの置換によって調製することができる。たとえば、部位特異的変異誘発のようなヌクレオチド配列を修飾する技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，上記に記載されている。
次いで発現ベクターを用いて適当な宿主細胞を形質転換する。多数の哺乳類細胞株が当該技術で既知であり、それらには、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手できる不死化した細胞株、たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、幼若ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（たとえば、ＨｅｐＧ２）、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、などが挙げられるが、これらに限定されない。
当該技術で既知の方法、たとえば、リン酸カルシウム形質移入、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイルスベクター系、レンチウイルスベクター系、アデノウイルスベクター系、または他のウイルスベクター系等による形質導入によって、発現ベクターを好適な宿主細胞に導入することができる。
脂質分析
一部の実施形態では、個体の脂質組成の分析を行う。本明細書で使用されるとき、用語「脂質」は広く意図され、ワックス、トリグリセリド、遊離の脂肪酸、ジアシルグリセロール、脂肪酸に由来するリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質及び、たとえば、レチノイド、コレステロール、コレステロールエステル及びステロイドのようなテルペノイドを含む、生物起源の相対的に水不溶性または非極性の化合物である多様な範囲の分子を包含する。一部の脂質は直鎖脂肪族分子である一方で、他は環構造を有する。一部は芳香族である一方で、他はそうではない。
本明細書で使用されるとき、用語、脂質の「クラス」は、構造的特性及び／または生化学的特性を共有する脂質分子の収集である。好適な脂質のクラスには脂質の極性クラス及び非極性クラスが挙げられる。例となる非極性脂質のクラスには限定しないで、遊離の脂肪酸、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、ステロール及び／またはコレステロールエステルが挙げられる。例となる極性のクラスには限定しないで、ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、カルジオリピン及び／またはリゾカルジオリピンのようなリン脂質のクラスが挙げられる。
用語「リピドミクス」は本明細書で使用されるとき、生物試料における脂質代謝体の評価を指す。脂質のプロファイリングには一般に、１以上の脂質のクラス（たとえば、脂肪酸、トリグリセリド、ジグリセリド、コレステロールエステル；及びホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン及びカルジオリピンを含むリン脂質のクラス）の脂質代謝体の評価が関与する。
用語「脂質のプロファイル」は本明細書で使用されるとき、生物試料内での１以上の脂質代謝体の評価を指す。特定の実施形態では、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１５以上、２０以上、５０以上、１００以上、またはさらに多く数の脂質代謝体が評価される。実施形態では、２以上の脂質代謝体が評価される場合、２以上の脂質は同一クラスに属することができ、または２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、またはさらに多くの数の異なる脂質クラスに属することができる。
脂質のプロファイルは定量的、半定量的、及び／または定性的であることができる。たとえば、脂質のプロファイルは、脂質の存在または非存在を評価することができ、特定の閾値を上回るまたは下回る脂質の存在を評価することができ、及び／または脂質の相対量若しくは絶対量を評価することができる。特定の実施形態では、２、３、４つ以上の脂質の間での比率を決定する。脂質の比率における変化または揺らぎは、疾患、治療に対する応答、副作用の発生等に関連する代謝経路にて代謝阻害（またはそのような阻害の解除）または他の代替がある場合を指し示すことにおいて有利であり得る。代謝経路を介した酵素活性及び流れを評価するために脂質前駆体及び脂質生成物の比率を評価する方法は当該技術で既知である（たとえば、Ａｔｔｉｅら，（２００２），Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４３：１８９９－１９０７及びＰａｎら，（１９９５），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：２８０２－２８０８を参照のこと）。
好適な生物試料を用いて脂質のプロファイルを決定することができる。生物試料は対象（たとえば、患者）から採取することができ、限定しないで体液、組織、細胞の、細胞内の及び／または細胞外の生物試料を含む、中枢及び／または末梢に由来する生物試料であることができる。説明に役立つ組織及び細胞には、骨格筋の組織及び細胞、皮膚の組織及び細胞、脳の組織及び細胞、脊髄の組織及び細胞を含む神経の組織及び細胞、眼の組織及び細胞（たとえば、網膜細胞）、心筋の組織及び細胞、肺の組織及び細胞、膵臓の組織及び細胞、肝臓の組織及び細胞、消化器系の組織及び細胞、脂肪の組織及び細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞内試料には、細胞質、核、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、リボソーム、リソソーム、原形質膜、エンドソームトラクション等を含むが、これらに限定されない前述の細胞種の１以上の分画及び／または小器官が挙げられる。体液の例には、血液、血漿、血清、唾液、尿、リンパ液、精液、涙液、母乳及び脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。
好適な方法を用いて生物試料の脂質のプロファイルを決定することができる。脂質の様々なクラス及びそれを検出し、任意で定量する方法は当該技術で周知である（たとえば、薄層クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、質量及びＮＭＲ分光分析、及びそれらの組み合わせ（たとえば、ＧＣ／ＭＳ）等）。生物試料における脂質を検出し、任意で定量する好適な方法の１つは安定な同位元素追跡子を用いて脂質を標識する。生物試料から脂質のプロファイルを得る方法は記載されており、たとえば、ＵＳ２００４／０１４３４６１ Ａ１（Ｓ．Ｍ．Ｗａｔｋｉｎｓ）及びＷａｔｋｉｎｓら．（２００２），Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４３（１１）：１８０９－１７を参照のこと。
本発明のリピドミクス解析はインフォマティクス法を用いて評価することができる高密度のデータセットを生成することができる。高データ密度のインフォマティクス解析法は既知であり、ソフトウエアは、当該技術におけるもの、たとえば、クラスター解析（Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅ、Ｉｎｆｏｒｍｅｔｒｉｘ）、クラス予測（ＳＩＭＣＡ－Ｐ、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ）、コンピュータでモデル化したデータセットの主成分分析（ＳＩＭＣＡ－Ｐ、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ）、２Ｄクラスター解析（ＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒ Ｐｌａｔｉｎｕｍ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、及び代謝経路解析（ｂｉｏｔｅｃｈ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ）で入手可能である。ソフトウエアパッケージの選択は当該疑問に対する特定のツールを提供する（Ｋｅｎｎｅｄｙら，Ｓｏｌｖｉｎｇ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ：Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ ＰＴＲ，１９９７；Ｇｏｌｕｂら，（２９９９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：５３１－７；Ｅｒｉｋｓｓｏｎら， Ｍｕｌｔｉ ａｎｄ Ｍｅｇａｖａｒｉａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｕｍｅｔｒｉｃｓ，Ｕｍｅａ，２００１）。一般に、好適な数学的解析を用いて脂質のプロファイルにおける１、２以上の脂質代謝体を評価することができる。多変量分散分析、多変量回帰及び／または重回帰のような方法を用いて従属変数（たとえば、臨床対策）と独立変数（たとえば、脂質代謝体のレベル）との間での関係を究明することができる。階層的な方法及び非階層的な方法の双方を含むクラスタリングと同様に非計量的次元尺度法を用いてこれらの変数における変数間及び変化間での関連性を究明することができる。
加えて、主成分分析は試験の規模を減らす一般的な方法であり、それを用いてデータセットの分散／共分散構造を解釈することができる。重回帰及びクラスター分析としてそのような適用に主成分分析が使用されてもよい。因子分析を用いて、観察された変数から「隠された」変数を構築することによって共分散を記載する。因子分析は主成分分析の延長と見なされてもよく、その際、主成分分析は最大尤度法と共にパラメータ推定として使用される。さらに、ＨｏｔｅｌｌｉｎｇのＴ２統計を用いて、手段の２つのベクトルの同等性のような単純な仮説を調べることができる。
変異の配列決定
一部の実施形態では、患者試料に由来する核酸を配列決定してＭｆｓｄ２ａ遺伝子における変異を究明する。当業者に周知である核酸の配列を決定するための任意の技法を使用することができる。ＤＮＡの配列決定の技法には、標識されたターミネータまたはプライマーを用いた従来のジデオキシ配列決定反応（Ｓａｎｇｅｒ法）及びスラブ電気泳動またはキャピラリー電気泳動におけるゲル分離が含まれる。一実施形態では、次世代（ＮｅｘｔＧｅｎ）の配列決定プラットフォームが本発明の実践にて有利に使用される。ＮｅｘｔＧｅｎ配列決定は、高処理能力の配列決定が可能である従来のＳａｎｇｅｒ型以降の多数の配列決定法のいずれかを指す。ＮｅｘｔＧｅｎの配列決定プラットフォームには、可逆的に終端となる標識されたヌクレオチドを用いた合成による配列決定、ピロ配列決定、４５４配列決定、標識されたオリゴヌクレオチドのプローブのライブラリに対する対立遺伝子特異的なハイブリッド形成、その後にライゲーションが続く標識されたクローンのライブラリに対する対立遺伝子特異的なハイブリッド形成を用いた合成による配列決定、重合工程の間での標識されたヌクレオチドの取り込みのリアルタイムのモニタリング、ポロニー配列決定、単一分子リアルタイム配列決定、及びＳＯＬｉＤ配列決定を挙げることができる。特定の配列決定プラットフォームの例には、４５４配列決定（Ｒｏｃｈｅ）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍら．２００５，Ｎａｔｕｒｅ，４３７，３７６－３８０）；ヌクレオチド付加の際に解放されるピロリン酸（ＰＰｉ）を使用するピロ配列決定が挙げられる。ＰＰｉはアデノシン５'－ホスホ硫酸の存在下でＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換される。ルシフェラーゼはＡＴＰを用いてルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し、この反応は検出され、分析される光を生成する。使用することができるＤＮＡ配列決定法の別の例はＳＯＬｉＤ法（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である。ＳＯＬＥＸＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）配列決定は、フォールドバックＰＣＲと係留したプライマーを用いた固相表面におけるＤＮＡの増幅に基づく。使用することができる配列決定法の別の例には、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））法が挙げられる。使用することができる配列決定法のさらなる例は、ナノポア配列決定（Ｓｏｎｉ，Ｇ．Ｖ．及びＭｅｌｌｅｒ，Ａ．（２００７），Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３：１９９６－２００１）である。使用することができる配列決定法の別の例には、ＤＮＡの配列決定を行うために化学感受性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイ（たとえば、ＵＳ２００９００２６０８２に記載されたような）を使用することが関与する。
足場及びコンジュゲート
一部の実施形態では、本開示はＭｆｓｄ２ａタンパク質を介した化合物または部分の送達のための足場を提供する。本明細書で使用されるとき、「足場」はＭｆｓｄ２ａタンパク質と相互作用するまたはそれを介した輸送を可能にする任意の分子を指す。相互作用には、Ｍｆｓｄ２ａタンパク質の輸送、結合、遮断、活性化または阻害が挙げられる。一部の実施形態では、足場はリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の足場である。そのような足場は脂肪酸及び他の分子のＬＰＣが介在する送達に使用され得る。一部の実施形態では、足場には最小限、両性イオンの頭基及びアシル鎖またはアルキル鎖が含まれる。一部の実施形態では、足場には最小限、ホスホコリン頭基、リン酸基、及び少なくとも１４炭素の長さのアシル鎖またはアルキル鎖が含まれる。
一部の実施形態では、足場は天然に存在する分子またはその修飾体であることができる。一部の実施形態では、足場は、Ｍｆｓｄ２ａタンパク質と相互作用するまたはそれを介して輸送される限り、普通、自然界では見いだされない合成実体であってよい。
一部の実施形態では、化合物または部分は足場に結合されて、Ｍｆｓｄ２ａタンパク質を介して輸送される「コンジュゲート」を形成し得る。一実施形態では、輸送のための化合物または部分の結合のためにＬＰＣのアシル鎖のω炭素が修飾され得る。しかしながら、結合がＭｆｓｄ２ａタンパク質を介した輸送を妨害しないという条件で結合のためには任意の位置が使用されてもよい。さらに、コンジュゲーションのための当該技術で既知の任意の方法、共有結合または非共有結合を用いて当該の化合物または部分を足場に結合させてもよい。
輸送のために結合されてもよい化合物または部分の例には、とりわけ、脂肪酸、非脂肪酸、薬剤、及び標識が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、輸送される化合物または部分は以下で議論されるような画像化のための作用物質を含んでもよい。そのような実施形態では、標識は足場上にあることができ、または輸送のための足場に結合される化合物または部分の上にあることができる。
造影剤
一部の実施形態では、本開示は生きている動物を画像化するためのＬＰＣ－コンジュゲートを提供する。そのような適用に好適な標識の例には、以下で開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
標識は、たとえば、ローダミン、ロドール及びフルオレセインのようなキサンテン及びその誘導体；ビマン；クマリン及びその誘導体、たとえば、ウンベリフェロン及びアミノメチルクマリン；ダンシルのような芳香族アミン；スクアレート染料；ベンゾフラン；蛍光シアニン；カルバゾール；ジシアノメチレンピラン、ポリメチン、オキサベンザントラン、キサンテン、ピリリウム、カルボスチル、ペリレン、アクリドン、キナクリドン、ルブレン、アントラセン、コロネン、フェナントラセン、ピレン、ブタジエン、スチルベン、ランタニド金属キレート錯体、希土類金属キレート錯体、及びそのような染料の誘導体のような蛍光分子であってもよい。蛍光染料は、たとえば、ＵＳ４，４５２，７２０、ＵＳ５，２２７，４８７及びＵＳ５，５４３，２９５にて議論されている。
フルオレセイン染料の場合、典型的なフルオレセイン染料には、５－カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン－５－イソチオシアネート及び６－カルボキシフルオレセインが挙げられるが、これらに限定されない；他のフルオレセイン染料の例は、たとえば、ＵＳ６，００８，３７９、ＵＳ５，７５０，４０９、ＵＳ５，０６６，５８０及びＵＳ４，４３９，３５６にて見いだすことができる。ローダミン染料のさらなる例には、テトラメチルローダミン－６－イソチオシアネート、５－カルボキシテトラメチルローダミン、５－カルボキシロドール誘導体、テトラメチルローダミン、テトラエチルローダミン、ジフェニルジメチルローダミン、ジフェニルジエチルローダミン、ジナフチルローダミン、ローダミン１０１塩化スルホニル（ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（商標）の商品名で販売されている）及び他のローダミン染料が挙げられる。他のローダミン染料は、たとえば、ＵＳ６，０８０，８５２、ＵＳ６，０２５，５０５、ＵＳ５，９３６，０８７、ＵＳ５，７５０，４０９にて見いだすことができる。さらに、たとえば、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７のようなシアニン染料も使用されてもよい。
一部の実施形態では、標識は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）用のポジトロン放出同位元素（たとえば、１８Ｆ）、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）用のγ線同位元素（たとえば、９９ｍＴｃ）、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）用の常磁性の分子またはナノ粒子（たとえば、Ｇｄ３＋キレートの又はコーティングの磁気ナノ粒子）、近赤外線（近ＩＲ）画像診断用の近赤外線蛍光色素分子、生物発光画像診断用のルシフェラーゼ（ホタル、細菌または腔腸動物）または他の発光分子である。
一部の実施形態では、標識は、放射性部分、たとえば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、１８Ｆのような放射性同位元素、Ｌｕ及びその他の放射性同位元素である。
上記化合物またはそれらの誘導体の一部は蛍光に加えてリン光を生じ、またはリン光のみを生じるであろう。一部のリン光化合物には、ポルフィリン、フタロシアニン、たとえば、ピレン、アントラセン及びアセナフテンのようなポリ芳香族化合物、等が挙げられる。標識にはまた、蛍光クエンチャ、たとえば、（４－ジメチルアミノ－フェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）基が挙げられてもよい。
他の標識の例には、インドカルボシアニン染料、ＩＲＤＹＥ８００ＣＷ、ＡＬＥＸＡ６４７、ＭＲＩ造影剤、［４，７，１０－トリス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデック－１－イル］アセチルのＧｄ錯体が挙げられる。
栄養組成物
本発明の栄養組成物は従来の製剤化法及び食物生産法によって製造することができる。
栄養組成物はエネルギー消費を高めるための医薬物品、食品または飲料等として有用であることができる。
栄養組成物は投与チューブを用いて不十分な経口摂取を示す患者の腸または胃に直接投与することができ、または経口摂取が可能である場合、それは食品または飲料として与えることができる。
栄養組成物は、たとえば、エリキシル、懸濁液、シロップ、エマルジョン、アンプルのような液状調製物として、または、たとえば、ジェル、ガム、ドロップ、粉末、顆粒、丸薬、錠剤（糖衣錠、フィルムコート錠を含む）、カプセル、包装剤、粉末等のような固体調製物として製剤化することができる。
栄養組成物を食品または飲料として提供することができる場合、そのような製品には、飲料、たとえば、乳、乳飲料、ヨーグルトのような乳製品のような液状製品、ゼリー飲料、ゼリーのようなゼリー製品、ガム製品、粉製品、顆粒製品、シート状製品、カプセル製品、錠剤製品、たとえば、スナックバー、クッキー等のような固形製品を挙げることができる。
食品または飲料として栄養組成物を形成するのに使用することができる材料の例には、甘味剤、着色剤、保存剤、増粘剤、安定剤、抗酸化剤、色形成剤、殺真菌剤、ガム基剤、苦み剤、酵素、光沢剤、酸味料、香味料、乳化剤、強化剤、製造のための作用物質、風味剤、スパイス等が挙げられる。
栄養組成物が食品及び飲料として提供される場合、それは１回限りとして包装することができる。１回限りの包装は、食事当たりで摂取される食品及び飲料の量が前もって決定される場合、使用することができる。その例には、飲料、ガム、ゼリー、ヨーグルト、クッキー等の場合、パック、バッグ、ボトル、箱のような１回限りの包装が挙げられる。顆粒、粉末、スラリー等の形態での食品の場合、１回限りの包装はパック、バッグ等であることができる。特に食品または飲料が健康上、栄養上、特定の使用または病人用の使用について特定される場合、たとえば、単回消費等のために組成物がボトルで懸濁または溶解されて飲料等を提供すべきである場合、組成物は１回限りの単位量として包装することができる。
１日当たり摂取される栄養組成物の量は、年齢、性別、体重、食事の状態等に応じて個々に決定することができ、１日当たり成人について約５０ｋｃａｌ～２０００ｋｃａｌであることができる。この量を１日１～３回で摂取することができる。栄養組成物が１つの摂取量単位の包装形態で１回限りの食品または飲料で製剤化される場合、上記で決定されたような１回で摂取される量を個々に包装することができる。
本発明を実施するための特定の態様の以下の実施例は説明目的のみのために提供されるのであって、本発明の範囲を限定するようには決して意図するものではない。
方法及び材料
［化学物質］
放射性標識していないリゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン及び他のリゾリン脂質はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入した。放射性標識した１－パルミトイル２－リゾホスホコリン（ＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸）、１－オレオイル２－リゾホスホコリン（ＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸）、１－ドコサヘキサエノイル２－リゾホスホコリン（ＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ）及び［１－１４Ｃ］ドコサヘキサエン酸（［１４Ｃ］ＤＨＡ）はＡｍｅｒｉｃａｎｓ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。クロロホルム（非標識）またはエタノール／トルエン（放射性標識）におけるリゾリン脂質を窒素ガスのもとで完全に乾燥させ、１２％脂肪酸－遊離のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）にて可溶化し、それを１５０ｍＭのＮａＣｌに溶解した。ＬＰＣ－［１４Ｃ］－オレイン酸／ＬＰＣ－オレイン酸混合物を調製するために、２５μＣｉのＬＰＣ－［１４Ｃ］－オレイン酸（比活性：５５ｍＣｉ／ミリモル）を乾燥させ、３ｍｌの２０ｍＭの非標識のＬＰＣ－１８：０／ＢＳＡに溶解した。ＬＰＣ－［３Ｈ］－パルミチン酸）／ＬＰＣ－パルミチン酸は、２５μＣｉのＬＰＣ－［３Ｈ］－パルミチン酸（比活性：６０Ｃｉ／ミリモル）を４ｍｌの１０ｍＭのＬＰＣ－パルミチン酸に溶解することによって調製した。１－ドコサヘキサエノイルＬＰＣは、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するホウ砂緩衝液（ｐＨ８．５）におけるミツバチ毒ＰＬＡ２（Ｓｉｇｍａ）による１，２－ジドコサヘキサエノイルＰＣの加水分解によって調製し、ＴＬＣ法によって精製した。ＬＰＣ－［１４Ｃ］－ＤＨＡ／ＬＰＣ－ＤＨＡ混合物を調製するために、１０μＣｉのＬＰＣ－［１４Ｃ］－ＤＨＡを非標識のＬＰＣ－ＤＨＡ／ＢＳＡと１０ｍＭの最終濃度に混合した。［１４Ｃ］－ＤＨＡ／ＤＨＡ混合物を調製するために、５０μＣｉの［１４Ｃ］－ＤＨＡを非標識のＤＨＡ／ＢＳＡと１２．２ｍＭの最終濃度に混合した。
［動物］
Ｍｆｓｄ２ａノックアウトマウスは以前記載された（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｈａｒｒｏｎ，Ｍ．Ｊ．及びＳｉｌｖｅｒ，Ｄ．Ｌ．Ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ （ＭＦＳＤ２Ａ） ｈａｓ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｂｏｄｙ ｇｒｏｗｔｈ，ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７，ｅ５０６２９，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５０６２９（２０１２））ように生成した。合計１１％の脂肪を含有する高エネルギー餌５ＬＪ５（ＰｉｃｏＬａｂ）でマウスを維持した。仔は３週齢で離乳し、高エネルギー餌で維持した。実験プロトコールはＳｉｎｇＨｅａｌｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。
［リピドミクス解析］
組織の脂質の分析のために、ＨＥＴ系の母に生まれた７～８週齢のメスＷＴ及びＫＯマウスの脳、肝臓及び心臓、並びに胎齢ｅ１８．５日の胎仔から脳を採取し、直ちに抽出まで液体窒素で凍結した。脂質抽出はクロロホルム／メタノール法に従った。細胞に基づいた遊離の脂肪酸の輸送については、ＢＳＡ複合体における１００μＭのドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、α－リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸で一晩処理した後のマウスＭｆｓｄ２ａ及びモック対照を発現しているＨＥＫ２９３細胞からＨＩＰ緩衝液（容量当たり、ヘキサン：イソプロパノール３：２）を用いて脂質を抽出し、Ｎ２ガスのもとで乾燥させた。三連四重極／イオン捕捉質量分光分析（４０００Ｑｔｒａｐ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）と一体化した高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）１１００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ）によってリン脂質の種を測定した。以前記載されたように、個々のリン脂質種のレベルを分析し、ＰＣ－１４：０／１４：０、ＰＥ－１４：０／１４：０、ＰＳ－１４：０／１４：０（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）及びジオクタノイルＰＩ（Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ，ＵＳＡ）を含むスパイクのある内部標準を用いて定量した。
［放射性標識したＬＰＣ及び蛍光ＬＰＣのインビトロ輸送］
放射性標識したＬＰＣパルミチン酸（ＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸）、オレイン酸（ＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸）及びドコサヘキサエン酸（ＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ）またはＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＣ、ＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＥ及びＮＢＤ－ＬＰＣを１２％ＢＳＡに溶解し、それを１５０ｍＭのＮａＣｌにて希釈した。Ｍｆｓｄ２ａ及び変異体の構築物を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞を用いて放射性標識したＬＰＣまたは蛍光ＬＰＣの取り込みアッセイを調べた。手短には、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用いて、９０～９５％の集密度のＨＥＫ２９３細胞にｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａ（ＷＴ）、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａＤ９２Ａ（Ｄ９２Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａＤ９６Ａ（Ｄ９６Ａ）またはｐｃＤＮＡ３．１（モック）のプラスミドで形質移入した。取り込みアッセイは形質移入の２４時間後に実施した。リガンドとのインキュベートに先立って、形質移入されたＨＥＫ２９３細胞をアッセイ前に無血清ＤＭＥＭで洗浄した。濃度及び時間に依存性のアッセイについては、放射性標識したＬＰＣを事前に温めたＤＭＥＭ培地で希釈した。ナトリウム依存性のアッセイについては、１５０ｍＭのＮａＣｌまたは１５０ｍＭの塩化コリンを伴った輸送緩衝液（５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨepes、ｐＨ７．４）にて放射性標識したＬＰＣを希釈した。ナトリウム濃度依存性アッセイについては、１５０ｍＭの一定のカチオンのモル濃度を維持するために、ＮａＣｌの濃度の低下を塩化コリンで置き換えた。アッセイはすべて３つ組で３７℃にて１２穴プレートにおいて行った。
［アルブミンを含まないリガンドについての輸送アッセイ］
エタノールに溶解されたＬＰＣ－パルミチン酸を調製するために、０．７５μＣｉのＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸をクロロホルム中のＬＰＣ－パルミチン酸で希釈した。混合物を乾燥させ、５０μｌのエタノールに溶解した後、上述のような１５０ｍＭのナトリウムを伴った輸送緩衝液６ｍｌを加えて５０μＭのＬＰＣ－パルミチン酸を有した。ＬＰＣ－パルミチン酸ミセルを調製するために、０．７５μＣｉのＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸をクロロホルム中のＬＰＣ－パルミチン酸で希釈した。混合物を乾燥させ、１５０ｍＭのナトリウムを伴った輸送緩衝液６ｍｌに溶解して１００μＭのＬＰＣ－パルミチン酸を有し、５分間氷上で超音波処理した。活性炭を加え、遠心分離してＬＰＣ－パルミチン酸の単量体を取り除いた。ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａプラスミドまたは対照としてのｐｃＤＮＡ３．１プラスミドによって過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞にて輸送アッセイを３７℃にて３０分間同様に行った。
［競合輸送アッセイ］
ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａ（ＷＴ）、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａＤ９２Ａ（Ｄ９２Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａＤ９６ＡまたはｐｃＤＮＡ３．１（モック）のプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の形質移入の２４時間後、無血清ＤＭＥＭ培地で細胞を１回洗浄し、その後、２５μＭの放射性標識したＬＰＣ－パルミチン酸と２５０μＭの非放射性の競合相手の混合物を添加し、それを１２％のＢＳＡに溶解した。非放射性の競合相手を伴ったまたは伴わない試料にてＢＳＡの総濃度を一定に保持した。アッセイは３７℃で３０分間行った。フォスコリン界面活性剤及びＰＡＦのような他のＬＰＣ類似体との競合アッセイを、１５分間を除いて同じ条件下で行った。細胞の生存に対する界面活性剤と生物活性のある脂質の否定的な効果を限定するために短い反応時間が必要だった。アッセイはすべて３つ組で３７℃にて１２穴プレートにおいて行った。
［放射性標識したＬＰＣ、蛍光ＬＰＣ及びエステル化されていないＤＨＡの生体内の輸送］
６～８週齢のオス及びメスのマウスに、総容量１５０μｌのリン酸緩衝化生理食塩水における７５μｌの２０ｍＭの放射性標識したＬＰＣ－［１４Ｈ］オレイン酸、１００μｌの１０ｍＭのＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ／ＢＳＡ複合体または８２μｌの１２．２ｍＭの［１４Ｃ］ＤＨＡ／ＢＳＡ複合体を静脈内注射した。注射の２時間後、マウスを麻酔し、脳血管系に結合した血液及び脂質のトレーサーを取り除くために０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで５分間潅流した。脂質抽出のために組織を採取した。脂質抽出のために、組織を秤量し、類似の量の組織をクロロホルム／メタノール中にてホモジネートした。有機相の脂質をシンチラントと混合し、シンチレーションでカウントした。マウス当たり３００μｇのＮＢＤ－ＬＰＣ／ＢＳＡまたは３００μｇのＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＣ／ＢＳＡ複合体の注射によって同様の実験も行った。この実験では、ＰＢＳでマウスを５分間潅流し、その後、組織固定のために４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）による１５分間の潅流が続いた。厚さ４０μｍのＷＴ及びＫＯの脳切片を調製し、ＴｙｐｈｏｏｎＦＬＡ９０００スキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ）における緑色蛍光方式を用いて走査した。ＮＢＤ－ＬＰＣの蓄積はその領域当たりの各切片の蛍光として表された。母親から胎仔への餌ＤＨＡの輸送も［１４Ｃ］ＤＨＡ／ＢＳＡ複合体を用いて測定した。胎齢e１８.５日の妊娠メスに［１４Ｃ］ＤＨＡ／ＢＳＡ複合体（２００μｌの１０ｍＭ［１４Ｃ］ＤＨＡ／ＢＳＡ／マウス）のボーラスを強制投与した。強制投与の２０時間後、胎仔の脳を採取し、秤量した。脂質抽出及び放射線活性の測定は上述のように行った。
［リン脂質のＴＬＣ解析］
ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａ（ＷＴ）、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａＤ９２Ａ（Ｄ９２Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａＤ９６ＡまたはｐｃＤＮＡ３．１（モック）のプラスミドまたはヒトＭｆｓｄ２ａ（Ｓｐｏｒｔ６プラスミドにおける）によって過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で１回洗浄し、その後、放射性標識した５０μＭのＬＰＣ［１４Ｃ］オレイン酸、ＬＰＣ［１４Ｃ］ＤＨＡ又は５０μＭのＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＣ及びＮＢＤ－ＬＰＣと共にインキュベートした。ＨＩＰ緩衝液で３０分間脂質を２回抽出した。窒素流で脂質を乾燥させ、クロロホルムで再構成させ、ＴＬＣプレート（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）上でスポットを作らせた。リン脂質分離のための溶媒はクロロホルム／メタノール／アンモニア溶液（２５％）（容積当たり５０：２５：６）だった。放射性標識したリン脂質のＴＬＣプレートを３０分間乾燥させ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｓｃｒｅｅｎｓに一晩暴露し、ＴｙｐｈｏｏｎＦＬＡ９０００スキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ）で走査した。蛍光リン脂質のＴＬＣプレートはＴｙｐｈｏｏｎＦＬＡ９０００スキャナーで走査し、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウエアを用いて定量した。
［組織学的検討］
ＨＥＴ系の両親で生まれた７．５～８週齢の成熟オスＷＴ及びＫＯマウスを深く麻酔し、経心腔で５０ｍｌの生理食塩水によって潅流し、その後、０．１ＭのＰＢ（ｐＨ７．４）中４％のＰＦＡ、１００ｍｌにより３０分間潅流した。胎仔については、４％ＰＦＡで一晩、次いで３０％スクロースで一晩、脳を固定した。低温保持装置にて厚さ４０μｍの矢状断面の切片を作り、免疫染色用に連続切片を２４穴組織培養ディッシュの異なるウェルに移した。ＮｅｕＮ（１：１０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｍｆｓｄ２ａ（１：５００）、ＧＦＡＰ（１：１０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）、パルブアルブミン（１：５００、Ｓｗａｎｔ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｇｌｕｔ１（１：５００、Ａｂｃａｍ）、ＰＤＧＦＲ－β（１：１５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する抗体を用いた免疫細胞化学の手順のために脳切片を処理し、４'，６－ジアミノジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ，１：５０００）にて５分間インキュベートした後、洗浄し、標本にした。ＺｅｉｓｓＬＳＭ７１０倒立蛍光共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｐｔｅ．Ｌｔｄ．，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）にて画像を取得した。カニクイザルの海馬切片で同じ局在決定手順を行った。ＮｅｕＮ免疫染色された海馬におけるニューロン断面及びパルブアルブミン染色された小脳におけるプルキンエ細胞を数え、平均値±ＳＥＭで密度（平方ミリメートル当たりの免疫陽性ニューロンの数（数／ｍｍ２）及びミリメートル当たりの免疫陽性細胞の数（数／ｍｍ））として示した。スチューデントのｔ検定を用いて統計的な有意性を評価した。
［行動の検討］
Ｙ字型迷路による自発的交替試験：互いに１２０°の角度で３つのアームがあるＹ字型の迷路の中央にマウスを置いた。動物が３つのアームすべてを自由に探索できるようにする。マウスがインタクトな空間作業記憶を有していれば、直近に訪れたアームに入る傾向が減ることになる。Ｔｏｐｓｃａｎプログラム（Ｃｌｅｖｅｒｓｙｓ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｔｏｎ，ＶＡ）を用いてアームへの侵入の数をスコア化し、交替の数を決定した。四肢すべてがアーム内にある場合、マウスはアームに入ったと見なされる。
新奇物体認識試験：前に記載したように新奇物体認識試験を行った。手短には、同一の「非新奇の」物体で５分間マウスを訓練し、次いで、訓練のそれぞれ２０分及び２４時間後に行われる短期（ＳＴＭ）及び長期（ＬＴＭ）で評価した。Ａｎｎｏｓｔａｒプログラム（Ｃｌｅｖｅｒｓｙｓ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｔｏｎ，ＶＡ）を用いて各物体に対する探索の一仕事をスコア化した。参照スコアは（新奇物体で費やした時間－非新奇物体で費やした時間）／（双方の物体で費やした時間）として算出した。非新奇物体及び新奇物体についての嗜好性をネガティブスコアと定義し、ゼロに近いスコアはいずれかの物体に対する嗜好性がないことを示した。
不安試験：各動物間で表面殺菌剤及び７０％エタノールによって行動装置すべてを清浄した。ゼロ迷路にて、マウスを閉鎖アームに入れ、１０分間探索させた。Ａｎｎｏｓｔａｒ行動スコア化プログラム（Ｃｌｅｖｅｒｓｙｓ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｔｏｎ，ＶＡ）を用いて、たとえば、開放アームで費やした時間、それに入る回数、その間で移動する回数及びそれに入るのにかかった時間のような行動をスコア化した。加えて、覗き込む行動及び伸展に伴う姿勢のような探索行動を記録した。明／暗ボックス試験の開始の際、２０×４０×１６ｃｍを測定する暗ボックスにマウスを入れ、１０分間、暗ボックスと明ボックスの間を自由に移動させた。たとえば、明ボックスにおける費やした時間及び水平活動、明ボックスに入るのにかかった時間及び２つのボックス間の移動の回数のような行動尺度を、Ｖｅｒｓａｍａｘプログラム（ＡｃｃｕＳｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を用いて記録した。
オープンフィールド活動：マウスを６０分間チャンバーに入れ、Ｖｅｒｓａｍａｘプログラム（ＡｃｃｕＳｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を用いて、移動した総距離、後ろ足立ちの回数及びコーナーと中央で費やした時間を記録した。
［統計的な解析］
対応のないスチューデントのｔ検定を用いて、遺伝子型間のＤＨＡ及びＡＡのレベル、及び組織学的な解析の有意差を算出した。二元配置ＡＮＯＶＡを用いてモック対ＷＴ及び変異体の間でのＤＰＭとして表されたＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ、ＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸、ＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸のシグナルの統計的な解析を計算した。ｐ＜０．０５を有意であると見なした。
行動試験については、遺伝子型は対象因子の間だった。一元配置ＡＮＯＶＡを用いてゼロ迷路、明／暗ボックス、オープンフィールド及びＹ迷路を解析した。二元配置ＡＮＯＶＡを用いて新規対象試験を解析したが、試験日は対象の因子間だった。事後試験としてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正のペアワイズ比較を用いた。データは平均値±ＳＥＭとして表した。ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なした。
実施例１：Ｍｆｓｄ２ａの免疫学的局在決定
Ｍｆｓｄ２ａの免疫学的局在決定は、それがＢＢＢを構成する内皮で専ら見いだされる脳の微細血管にてそれが高度に濃縮される（図１ａ、ｂ、ｃ及び図５ａ、ｂ）が、内皮を包む周皮細胞では発現されない（Ａｒｍｕｌｉｋ，Ａ．ら．Ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ，４６８，５５７－５６１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９５２２（２０１０）；Ｂｅｌｌ，Ｒ．Ｄ．ら．Ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｋｅｙ ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｄｕｒｉｎｇ ｂｒａｉｎ ａｇｉｎｇ．Ｎｅｕｒｏｎ，６８，４０９－４２７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１０．０９．０４３（２０１０））（図５ｃ、ｄ）ことを示しているということは、Ｍｆｓｄ２ａのｍＲＮＡはＢＢＢで見いだされた最高に濃縮された転写物の１つであることを示す以前の報告（Ｄａｎｅｍａｎ，Ｒ．ら．Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ：ａ ｎｅｗ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，５，ｅ１３７４１，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１３７４１（２０１０））を裏付けている。ＢＢＢにおけるこの局在化パターンはサルの小脳及び海馬でも言及された（図６）。Ｍｆｓｄ２ａは胎齢e１５．５日でのＢＢＢにて発現されることが見いだされた（図７ａ）。ＢＢＢの内皮へのＭｆｓｄ２ａの局在化はＢＢＢにおける輸送機能を示唆している。
実施例２：Ｍｆｓｄ２ａノックアウトマウスにおける表現型の差異
オス及びメスのＭｆｓｄ２ａ遺伝子欠損（ＫＯ）マウスはメンデル比率で生まれたが、生後間もなく有意に高い出生後死亡率を有した（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｈａｒｒｏｎ，Ｍ．Ｊ．及びＳｉｌｖｅｒ，Ｄ．Ｌ． Ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ （ＭＦＳＤ２Ａ）ｈａｓ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｂｏｄｙ ｇｒｏｗｔｈ，ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７，ｅ５０６２９，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５０６２９（２０１２））。組織の生理的な及び生化学的な測定値及び全身の健康状態は、独立して生成されたＭｆｓｄ２ａのＫＯマウスモデルにて平凡であることが報告された（Ｔａｎｇ，Ｔ．ら．Ａ ｍｏｕｓｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｏｒ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８，７４９－７５５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１６４４（２０１０））。一貫して、胎齢E１８．５日でのＫＯマウスの胎仔及び胎盤の重量はＷＴ同腹仔に類似した（図８ａ）。加えて、ＫＯマウスは離乳後、運動機能不全を示し（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｈａｒｒｏｎ，Ｍ．Ｊ．及びＳｉｌｖｅｒ，Ｄ．Ｌ．Ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ（ＭＦＳＤ２Ａ）ｈａｓ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｂｏｄｙ ｇｒｏｗｔｈ，ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７，ｅ５０６２９，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５０６２９（２０１２））、尾懸垂の間、前足把持を伴った（図８ｂ）。ＫＯマウスの脳のサイズ及び重量はＷＴ同腹仔よりも有意に小さかった（図９ａ、ｂ）。しかしながら、ＷＴとＫＯの脳の肉眼的解剖では目に見える差異はなかった（図９ｃ、ｄ）。興味深いことに、ＫＯマウスの小脳はプルキンエ細胞の有意な喪失を示した（図１ｄ、ｅ）。さらに、海馬、特にＣＡ１及びＣＡ３の領域でニューロン細胞の密度に有意な低下があったが、ＫＯマウスの歯状回（ＤＧ）では正常な細胞密度だった（図１ｆ、ｇ）。これらのデータはＫＯマウスが学習及び記憶に欠陥を有し得ることを示唆した。実際、行動試験は、ＫＯマウスが学習、短期と長期の記憶に重度の欠陥を有し、同様に重度の不安を有することを示した（図１０）。
実施例３：野生型マウス及びＭｆｓｄ２ａノックアウトマウスにおけるリピドミクス解析
ω－３脂肪酸の欠乏は齧歯類のモデルにて認知機能不全及び不安に関連付けされてきた（Ｌａｆｏｕｒｃａｄｅ，Ｍ．ら．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｏｍｅｇａ－３ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｂｏｌｉｓｈｅｓ ｅｎｄｏｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１４，３４５－３５０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．２７３６（２０１１）；Ｃａｒｒｉｅ，Ｉ．，Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｍ．，ｄｅ Ｊａｖｅｌ，Ｄ．，Ｆｒａｎｃｅｓ，Ｈ．及びＢｏｕｒｒｅ，Ｊ．Ｍ． Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｅｓ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎ－３ ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１，４７３－４８０（２０００)）。これらのＫＯ表現型は、Ｍｆｓｄ２ａのＫＯマウスはω－３脂肪酸の脳でのレベルが低下し、他の脂質種で代替し得ることを我々に示唆した。我々は、ＷＴマウス及びＫＯマウスにて質量分光分析によって脳、肝臓及び心臓の包括的なリピドミクス解析を行った。際立って、ＫＯマウスの脳のＰＥ、ＰＣ、ＰＩ及びＰＳの主要なリン脂質種のうちで他のω－３脂肪酸ではなくＤＨＡがＷＴマウスに比べて有意に低下することを我々は見いだした（図２ａ及び図１１には詳述）。ＤＨＡはＰＥ、ＰＣ、ＰＩ及びＰＳにおけるリン脂質種３８：６及び４０：６として主に見いだされる（Ｋｉｍ，Ｈ．Ｙ．Ｎｏｖｅｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８２，１８６６１－１８６６５，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｒ７０００１５２００（２００７））（図２ａ及び図１１）。ＤＨＡを含有する種の総レベルはＷＴマウスに比べてＫＯマウスの肝臓及び心臓では有意差はない（図２ｄ、ｆ及び図１１）。しかしながら、ＫＯマウスの脳におけるＤＨＡの総レベルは、他の脂肪酸種における軽微な変化を伴っておよそ５８．８％低下した（図２ｂ及び図１１）。ＫＯマウスの脳はリン脂質のうちでアラキドン酸が３３．８％増加した（図２ｃ及び図１１）が、それはＤＨＡ欠乏の齧歯類モデルで共通して増加する（Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｐ．Ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｏｍｅｇａ－６／ｏｍｅｇａ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒａｔｉｏ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（Ｍａｙｗｏｏｄ）２３３，６７４－６８８，ｄｏｉ：１０．３１８１／０７１１－ＭＲ－３１１（２００８））。脳のＤＨＡレベルを維持することにおいてＭｆｓｄ２ａの生理的な役割を強調するＤＨＡが十分な餌でＫＯマウスが成長したことは注目に値する。ＫＯ胚の脳の発生において解剖上の変化が欠如しているにもかかわらず、脳のリン脂質における生化学的な変化はリン脂質のうちでＤＨＡのレベルの有意な低下を伴って、胎齢e１８．５日で明らかだった（図７ｃ）ということは、胚発生の間でＤＨＡレベルを維持することにおいてＭｆｓｄ２ａが本質的な役割を担うことを示している。
実施例４：Ｍｆｓｄ２ａによるＬＰＣの輸送
脳は多量の血漿由来のＤＨＡを蓄積する。血漿では、血漿ＤＨＡの交換可能なブールがエステル化されていない脂肪酸としてまたはＬＰＣ１７としてアルブミンで見いだされる。細胞系アッセイを用いて、我々は、Ｍｆｓｄ２ａがエステル化されていないＤＨＡまたは他のエステル化されていない脂肪酸を輸送しない（図１２、表１）ことを見いだしたので、脂肪酸輸送体としてのＭｆｓｄ２ａを除外した。次に我々はＭｆｓｄ２ａがＬＰＣ形態でのＤＨＣを輸送することができるかどうかを調べた。顕著なことに、Ｍｆｓｄ２ａを発現している細胞は、対照細胞に比べてＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡの増強された濃度依存性の取り込みを示した（図３ａ）ということは、Ｍｆｓｄ２ａが実際にＬＰＣ－ＤＨＡの輸送体であることを示している。ＭＦＳタンパク質におけるナトリウム結合に決定的である系統発生上保存された残基アスパラギン酸９２と９６（Ｇｒａｎｅｌｌ，Ｍ．，Ｌｅｏｎ，Ｘ．，Ｌｅｂｌａｎｃ，Ｇ．，Ｐａｄｒｏｓ，Ｅ．及びＬｏｒｅｎｚ－Ｆｏｎｆｒｉａ，Ｖ．Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ ｂｙ ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０７，２２０７８－２２０８３，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１００８６４９１０７（２０１０））のアラニン変異誘発（Ｄ９２Ａ）及び（Ｄ９６Ａ）はそれぞれ、輸送の低下及び輸送の非存在を生じた（図３ａ）。Ｄ９２Ａ及びＤ９６Ａは野生型と類似の発現を有した（図１３）。我々は次に血漿で見られる最も一般的なＬＰＣであるＬＰＣ－オレイン酸及びＬＰＣ－パルミチン酸についてのＭｆｓｄ２ａの輸送特異性を調べた。野生型Ｍｆｓｄ２ａを発現している細胞はＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸及びＬＰＣ－［3H］パルミチン酸の濃度依存性の取り込みを示した（図３ｂ、ｃ）。ヒトＭｆｓｄ２ａも同様にＬＰＣを輸送した（図１４）。ＬＰＣ－オレイン酸、ＬＰＣ－パルミチン酸及びＬＰＣ－ＤＨＡのＭｆｓｄ２ａが介在する取り込みの比較は、Ｍｆｓｄ２ａはＬＰＣ－ＤＨＡを輸送する最高の能力を有し、ＬＰＣ－オレイン酸及びＬＰＣ－パルミチン酸がそれに続くことを示した（図３ｄ）。さらに、野生型及び部分的に活性のあるＤ９２Ａ変異体を発現している細胞は経時的に飽和動態を示した（図１５ａ）。重要なことに、ＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ及びＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸のＭｆｓｄ２ａ依存性の輸送は、輸送されたＬＰＣのＰＣへの迅速な変換を生じた（図３ｅ、ｆ、ｇ、ｈ）。さらに、Ｍｆｓｄ２ａの発現がＰＣ質量の増加を生じるということは、Ｍｆｓｄ２ａの輸送活性が細胞へのＬＰＣの正味の取り込みを生じることを示している（図１５ｂ）。
ＭＦＳファミリーメンバーはその濃度勾配を下げて溶質の輸送を行わせるＮａ＋、Ｈ＋及びＬｉ＋のようなカチオンの共輸送を利用する促進性輸送体である。上述のＬＰＣの輸送のための系統発生上保存されたカチオン結合部位残基Ｄ９６の必要性を考えると、我々はＭｆｓｄ２ａによる輸送がナトリウム依存性であるかどうかを調べた。ナトリウムの非存在下で、野生型Ｍｆｓｄ２ａを発現している細胞によるＬＰＣの輸送がモックで形質移入した細胞に類似したということはＬＰＣの輸送がナトリウム依存性であることを示している（図３ｉ）。他のナトリウム依存性のＭＦＳ共輸送体の特徴に一致して、輸送体が低ナトリウム濃度に感受性が高いということはナトリウムに対する高い親和性を示している（図３ｋ）（Ｐａｒｏｄｅｒ－Ｂｅｌｅｎｉｔｓｋｙ，Ｍ．ら．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａ＋／Ｉ－ ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ（ＮＩＳ）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０８，１７９３３－１７９３８，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１０８２７８１０８（２０１１））。ＬＰＣの輸送はｐＨまたはリチウムに依存しなかった（図１６ａ、ｂ）。加えて、エタノールで可溶化したまたはミセルにおけるＬＰＣ－［３Ｈ］１６：０は双方とも、ＢＳＡに結合した形態に比べて低い能力にもかかわらず、Ｍｆｓｄ２ａによって輸送されたということは、アルブミンが輸送に必須ではないことを示している（図１６ｃ）。我々の知見はリン脂質の輸送について特定された最初の促進性輸送体としてのＭｆｓｄ２ａを明らかにしている。
実施例５：Ｍｆｓｄ２ａによる輸送のためのリガンド特異性及び要件
我々は次に、Ｍｆｓｄ２ａによる輸送に必要とされるＬＰＣリガンドのリガンド特異性及び化学的特徴を確定しようとした。この目標を実行するために、我々は、Ｍｆｓｄ２ａを発現している細胞またはモック対照細胞を用いた競合アッセイを設定し、１０倍過剰の非標識の競合相手の存在下または非存在下でそれらを２５μＭのＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸で処理した。我々は、１４炭素の最小アシル鎖長を持つＬＰＣが取り込みに対して効果的に競合することを見いだした（図１７ａ、ｂ、ｃ）。リゾリン脂質ＬＰＥ及びＬＰＳが弱い競合を示した一方で、ＬＰＡはＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸の輸送に対して非競合性だった（図１７ｃ）。我々は、蛍光ＬＰＥを用いてＭｆｓｄ２ａが直接ＬＰＥを輸送できることを確認した（図１８）。これらの結果は、ホスファチジルコリン頭基の両性イオンの電荷がリガンドの輸送に決定的であることを示している。さらに、短鎖脂肪酸及びグリセロホスファチジルコリンが単独では競合相手ではなかった（図１７ｂ、ｃ）ということは、ＬＰＣの長いアシル鎖がリガンドの輸送に不可欠であるという結論を支持している。リゾプラスマローゲン、リゾ血小板活性化因子、及び血小板活性化因子が強力な競合相手であるということは、ＬＰＣのアシル鎖のカルボニル基は輸送に必要とされないことを示している（図１７ｄ、ｅ、ｆ）。リゾスフィンゴミエリンもＬＰＣ－［３Ｈ］パルミチン酸の輸送について競合したということは、グリセロール主鎖はリガンド機能に必要とされないことを示している（図１７ｆ）。ＬＰＡに類似して、スフィンゴシン－１－リン酸が競合相手ではない（図１７ｆ）ということは、ホスホコリン頭基のコリン部分がリガンドの輸送に必須であるという結論をさらに支持する。リゾ脂質様の界面活性剤を用いて、我々は、グリセロール主鎖及びカルボニル基ではなく、１４炭素の最小のアシル側鎖及びホスホコリン頭基がＬＰＣリガンドの必須の化学的特徴であること（図１７ｇ、ｈ）を確認した。
実施例６：脳へのＬＰＣ－ＤＨＡの輸送についてのＭｆｓｄ２ａの必要要件
我々は次に、脳へのＬＰＣ－ＤＨＡの輸送にＭｆｓｄ２ａが必要とされるかどうかを判定しようとした。Ｍｆｓｄ２ａのＫＯ及び野生型の同腹仔マウスにＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡを静脈注射した。意外なことに、Ｍｆｓｄ２ａのＫＯマウスは野生型対照と比べて９０％を超えてＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡの脳への取り込みを低下させた（図４ａ）。対照的に、ＫＯマウスの末梢組織におけるＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡの取り込みは野生型対照に比べて低下しなかった（図４ａ、ｂ）。エステル化されていないＤＨＡは拡散を介して脳によって取り込まれ得る（Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｓ．Ｉ．，Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｃ．及びＳｐｅｃｔｏｒ，Ａ．Ａ． Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ｐｌａｓｍａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＰＵＦＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２，６７８－６８５（２００１））ので、ＤＨＡ取り込みの拡散経路がＭｆｓｄ２ａのＫＯマウスでは変化するのかどうかを調べた。エステル化されていない［１４Ｃ］ＤＨＡの脳による取り込みはＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡの取り込みに比べて有意に低かったが、野生型マウスに比べてＫＯマウスで低下したわけではなかった（図１９）。総合して、これらの知見はＭｆｓｄ２ａのＫＯマウスにおける脳の低いＤＨＡレベルへの因果関係を表しており、Ｍｆｓｄ２ａは脳におけるＬＰＣ－ＤＨＡの生理的輸送体であるという結論を支持している。
Ｍｆｓｄ２ａが一般的な血漿ＬＰＣも輸送することができることを示す細胞培養試験に一致して、ＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸の脳による取り込みはＫＯマウスで顕著に低下した（図４ｂ）。Ｍｆｓｄ２ａによるＬＰＣの生体内輸送を調べる別のアプローチにて、我々は、蛍光ＬＰＣ類似体であるＮＢＤ－ＬＰＣの輸送を調べた（図４ｃ）。我々は先ず細胞にてＮＢＤ－ＬＰＣがＭｆｓｄ２ａによって輸送されることを検証した。ネイティブなＬＰＣに類似して、ＮＢＤ－ＬＰＣはＭｆｓｄ２ａによって輸送されたが、輸送はそれぞれ、Ｄ９２変異体によって低下し、Ｄ９６変異体では存在しなかった（図４ｄ）。重要なことに、ＮＢＤ－ＬＰＣは膜のリン脂質に生体取り込みされた（図４ｅ、ｆ）。さらに、過剰なネイティブのＬＰＣはＮＢＤ－ＬＰＣの取り込みと競合した（図４ｅ、ｆ）。我々は次に生体内の輸送を調べた。Ｍｆｓｄ２ａのＫＯマウス及び野生型のマウスに同じ用量のＮＢＤ－ＬＰＣを静脈内注射し、蛍光の蓄積について脳の切片を調べた。ネイティブなリガンドの輸送と一致して、野生型対照に比べてＫＯの脳の切片の蛍光が有意に低下したということ（図４ｇ、ｈ）は、ＮＢＤ－ＬＰＣの脳による取り込みがＭｆｓｄ２ａに依存することを示している。ＮＢＤ－ＬＰＣとは構造的に異なる蛍光色素分子であるＴｏｐＦｌｕｏｒ－ＬＰＣを用いた細胞培養及び生体内試験の双方にて類似の知見が得られた（図２０）。
実施例７：餌ＤＨＡ処理によるＭｆｓｄ２ａノックアウトマウスのレスキューに関する試験
我々は、餌ＤＨＡ処理によってＫＯマウスをレスキューすることができるかどうかを調べた。妊娠前から授乳までのＭｆｓｄ２ａヘテロ接合体マウスの餌ＤＨＡ処理、及び８週齢まで継続した離乳仔のＤＨＡ処理は、たとえば、脳のサイズ及び不安のようなＫＯの表現型をレスキューしなかった（図２１ａ～ｅ）。重要なことに、胎齢ｅ１８．５日でのＫＯ胎仔による餌ＤＨＡの脳による取り込みが野生型胎仔に比べて劇的に低下した（図２１）ことは、ＫＯ胎仔における脳の低下したＤＨＡレベル（図７ｂ）に一致し、レスキューの欠如は、胚形成の間でのＤＨＡの脳への輸送に関するＭｆｓｄ２ａの本質的な役割が原因で生じる可能性があることを示している。
総合すれば、現在の研究は、ナトリウム／ＬＰＣの共輸送体としてオーファンの輸送体Ｍｆｓｄ２ａを特定し、且つＤＨＡが脳に入る主要なメカニズムを説明し、且つ正常な脳の成長と機能のための血漿由来のＬＰＣの重要な生理的役割を初めて示す。これらの知見を考えて、我々はＭｆｓｄ２ａをナトリウム／ＬＰＣの共輸送体１（ＮＬＳ１）と名付け直すことを提案する。
実施例８：非経口栄養のためのＬＰＣ製剤
本明細書で開示される知見は、ω－３脂肪酸が脳によって取り込まれる主要な経路はＬＰＣへのその自然なコンジュゲーション及びＭｆｓｄ２ａによる脳への輸送を介することを示している。ω－３脂肪酸を含有するトリグリセリド及びコンジュゲートされていない脂肪酸はこの主要な経路によって輸送されないので、主として肝臓及び他の臓器によって取り込まれる。さらに、Ｍｆｓｄ２ａ欠損マウスは小さな脳及び神経学的欠損を有し、脳のＤＨＡが欠乏する。我々は、ＬＰＣ－ＤＨＡ及び他の一般的なＬＰＣ－脂肪酸のようなＬＰＣ－脂肪酸の脳への取り込みは正常な脳の成長と機能に必須であると結論付けることができる。重要なことに、小児ＰＮのケアの標準はＬＰＣ－脂肪酸及びＬＰＣ－ＤＨＡを提供しないが、それらは正常な脳の成長と機能に必要とされる。
従って、ＬＰＣを製造し、ＰＮへの補給剤としてのＬＰＣの添加がＮＩＣＵの新生児において改善された転帰を生じるかどうかを見るために調べることができる。正常なヒト血清におけるＬＰＣのレベルはおよそ１００～２００μＭ（７～９マイクロモル／ｋｇ）であり、アルブミンの状態で循環する（Ｂａｒｂｅｒ，ＭＮ.ら．（２０１２），Ｐｌａｓｍａ ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ａｒｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７（７）：ｅ４１４５６；Ｃｒｏｓｅｔ，Ｍ，Ｂｒｏｓｓａｒｄ，Ｎ，Ｐｏｌｅｔｔｅ，Ａ，及びＬａｇａｒｄｅ，Ｍ．（２０００），Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｒａｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４５，Ｐｔ．１：６１－６７）。ヒト血漿にて最も豊富なＬＰＣは、ＬＰＣ－パルミチン酸、ＬＰＣ－ステアリン酸及びＬＰＣ－オレイン酸である。我々のアプローチは、上記で列記したＬＰＣに加えてω－３及びω－６の脂肪酸（ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＡＲＡ）を有するＬＰＣを含有する物質からＬＰＣの混合物を精製することである。これら後者のポリ不飽和脂肪酸はヒトにおける脳の発達と機能に関連付けられてきた（Ｋｉｄｄ ＰＭ（２００７），Ｏｍｅｇａ－３ ＤＨＡ ａｎｄ ＥＰＡ ｆｏｒ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ｂｅｈａｖｉｏｒ，ａｎｄ ｍｏｏｄ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｅｒｇｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｒｅｖｉｅｗ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，１２（３）：２０７－２２７；Ｈｏｒｒｏｃｋｓ，ＬＡ．及びＹｅｏ，ＹＫ．（１９９９），Ｈｅａｌｔｈ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｏｆ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ，（ＤＨＡ）．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｔａｌｉａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，４０（３）：２１１－２２５；Ｍｏｚａｆｆａｒｉａｎ，Ｄ．及びＷｕ，ＪＨ．（２０１１），Ｏｍｅｇａ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，５８（２０）：２０４７－２０６７；Ｃｏｎｎｏｒ，ＷＥ．（２０００），Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｎ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，７１（１，Ｓｕｐｐｌ）：１７１Ｓ－１７５Ｓ））。これらＬＰＣの考えられる供給源は、現在市場で入手できるω－３及びω－６の脂肪酸が濃縮されたニワトリの卵である。従って、ＬＰＣの混合物を精製し、次いでこの混合物を非経口栄養（ＰＮ）に使用して臨床試験における成果を調べることができる。新生児からの成果の大半は生後９ヵ月以内に測定することができる。これらには、ＮＩＣＵにいる間及びＮＩＣＵから出た後の体及び頭囲の改善された成長、及び正常な発達の節目のモニタリングが挙げられるであろう。
本明細書の開示に基づいて、以下で示すもののようなＰＮ用の補給剤を製剤化することができる。
Figure 2022121623000004
上記で示されたのは、ＰＮで補給剤として使用される７つの成分ＬＰＣそれぞれの０．５μＭ～２００μＭの考えられる濃度範囲（上記図４で示したヒト細胞で発現されたＭｆｓｄ２ａによる輸送の動態解析に基づいた）である。そのような製剤はキャリアとしてのアルブミン（組換え発現または商業的供給源に由来する）で可溶化して栄養組成物を生成することができる。さらに、ＬＰＣの混合物または補給剤は単独で、及び、たとえば、イントラリピッド（商標）、ＳＭＯＦＫａｂｉｖｅｎ（商標）、オメガベン（商標）（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）、リポフンジン（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）、 ＣｌｉｎＯｌｅｉｃ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ）、リポシン（商標）（Ｈｏｓｐｉｒａ Ｉｎｃ）のような現在のＰＮ脂質剤との併用で提供することができる。
ＬＰＣは逆相クロマトグラフィによって精製された卵黄由来のＬＰＣとしてまたはＰＣとして混合物として単離され、アルブミンで可溶化され得る。ＬＰＣは特定のホスホリパーゼ（本明細書で記載されたような）を用いＰＣ出発物質から製造することができ、必要性に従って調整することができる。各ＬＰＣ成分の比は、精製された個々のＬＰＣの添加及び上記で示唆されたように調整された範囲によって改変することができる。
さらなる実施形態では、提供されるのはまた上記のＬＰＣ及び他のＬＰＣのＰＣ形態を含む腸管栄養用の補給剤である。この実施形態では、ＰＣは経口投与のために提供される。摂取の際、ＰＣは肝臓でＬＰＣに変換され、次いで記載されるようなＭｆｓｄ２ａタンパク質を介してＢＢＢを越える。
実施例９：ヒトにおける機能的なＭｆｓｄ２ａの変異
本明細書で議論されるように、ＤＨＡは正常な脳の成長と認知機能に必須のω－３脂肪酸である（Ｋｉｄｄ，Ｐ．Ｍ．（２００７），Ｏｍｅｇａ－３ ＤＨＡ ａｎｄ ＥＰＡ ｆｏｒ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ｂｅｈａｖｉｏｒ，ａｎｄ ｍｏｏｄ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｅｒｇｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｒｅｖｉｅｗ：a jｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，１２，２０７－２２７；Ｈｏｒｒｏｃｋｓ，Ｌ．Ａ．，及びＹｅｏ，Ｙ．Ｋ．（１９９９）．Ｈｅａｌｔｈ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｏｆ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ＤＨＡ）．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｔａｌｉａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ４０，２１１－２２５．；Ｍｏｚａｆｆａｒｉａｎ，Ｄ．，及びＷｕ，Ｊ．Ｈ．（２０１１）．Ｏｍｅｇａ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，５８，２０４７－２０６７；Ｃｏｎｎｏｒ，Ｗ．Ｅ．（２０００）．Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｎ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．７１，１７１Ｓ－１７５Ｓ）。脳におけるその重要性に一致して、ＤＨＡは脳のリン脂質で高度に濃縮される（Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｃ．，Ｇｏｍｂｏｓ，Ｇ．，及びＭｏｒｇａｎ，Ｉ．Ｇ．（１９７２）．Ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２６６，６９５－７０７；Ｉｎｎｉｓ，Ｓ．Ｍ．（２００７）．Ｄｉｅｔａｒｙ（ｎ－３） ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１３７，８５５－８５９））。脳のリン脂質における豊富な脂肪酸にもかかわらず、ＤＨＡは脳ではデノボ合成され得ず、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて移入されねばならないが、脳におけるＤＨＡ取り込みのメカニズムは謎のままだった。本明細書で示されるように、我々は、我々が胎仔及び成人の脳へのＤＨＡの取り込みのための主要な輸送体として微細血管の血液脳関門の内皮で発現されることを示した、主要ファシリテータスーパーファミリーのメンバーである以前オーファンだった輸送体Ｍｆｓｄ２ａを特定した（Ｎｇｕｙｅｎら．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４；５０９：５０３－６）。リピドミクス解析は、Ｍｆｓｄ２ａ欠損マウスが海馬や小脳におけるニューロン細胞の喪失及び神経学的な障害や重度の行動障害及び重要な脳サイズの低下を伴って脳におけるＤＨＡの劇的に低下したレベルを有することを示した。驚くべきことに、細胞系の試験は、Ｍｆｓｄ２ａがナトリウム依存性の方法でＤＨＡをリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の形態で輸送するが、エステル化されていない脂肪酸を輸送しないことを示した。特に、Ｍｆｓｄ２ａは、たとえば、ＬＰＣ－オレイン酸及びＬＰＣ－パルミチン酸のような長鎖脂肪酸を運ぶ一般的な血漿ＬＰＣを輸送した。重要なことに、ＫＯマウスはＬＰＣ－ＤＨＡ及び血漿に由来する他のＬＰＣの脳への取り込みを劇的に低下させたということは、Ｍｆｓｄ２ａがＤＨＡの脳への取り込みに必要とされることを実証している。さらに、我々の知見は脳の成長と機能における血漿由来のＬＰＣの予想外の本質的な生理的役割を明らかにしている。
マウスにおけるこれらの知見に一致して、Ｍｆｓｄ２ａの稀な不活化変異を持つ小児（Ｚａｋｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｓａｌｅｅｍ，Ｓ．Ｎ．，Ｄｏｂｙｎｓ，Ｗ．Ｂ．，Ｂａｒｋｏｖｉｃｈ，Ａ．Ｊ．，Ｂａｒｔｓｃｈ，Ｈ．，Ｄａｌｅ，Ａ．Ｍ．，Ａｓｈｔａｒｉ，Ｍ．，Ａｋｉｚｕ，Ｎ．，Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．，及びＧｒｉｊａｌｖｏ－Ｐｅｒｅｚ，Ａ．Ｍ．（２０１２）．Ｄｉｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ－ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｄｙｓｐｌａｓｉａ：ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｂｒａｉｎ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｒａｉｎ：a jｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１３５，２４１６－２４２７）（図２２）が、重度の小頭症、水頭症を呈し、対まひがあり、言語能力がないということは、Ｍｆｓｄ２ａがヒトの正常な脳の成長及び機能に必須であることを明らかにしている。重要なことに、Ｔｈｒ１５９Ｍｅｔ及びＳｅｒ１６６Ｌｅｕの変異は双方とも、不活性な輸送を生じることが示される可能性があり、冒された小児の表現型を不活性のＭｆｓｄ２ａに関連付けている。
これらの知見は、Ｍｆｓｄ２ａの低次形態対立遺伝子が、たとえば、記憶や学習における欠損のような神経学的欠損、及び不安のような行動上の障害を生じる可能性をもたらす。ヒトＭｆｓｄ２ａコドンにおける単一ヌクレオチド多型はＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクトにて特定されている（表４）。合わせて１２，０００人を超えるヨーロッパ系アメリカ人及びアフリカ系アメリカ人の遺伝子型が決定されている。表４に示す変異は、Ｍｆｓｄ２ａ輸送活性の不活化を生じる機能的な変異であり得、これらの集団での遺伝子スクリーニングで使用することができる。
（表４）ヒトＭｆｓｄ２ａのコドンにおける単一ヌクレオチド多型
Figure 2022121623000005
Figure 2022121623000006
実施例１０：Ｍｆｓｄ２ａにおける不活化変異は致死性の小頭症症候群を生じる
この実施例では、我々は実施例９の結果をさらに詳しく述べた。我々は主として劣性の神経発達疾患の３３９６人の患者のコホートでエクソームの配列決定を行った。リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）－脂質について患者及びノックアウトマウスの血清を評価した。野生型または変異Ｍｆｓｄ２ａをコードするｃＤＮＡ構築物で細胞に形質移入し、脂質の取り込みをモニターした。
我々は、高度に保存された残基における非同義的なホモ接合体変異を示す確認された血縁関係を持つ２つの家族を特定した。患者は、重度の水頭症、難治性痙攣及び脳性麻痺と共に小頭症の致死的形態を示した。患者の血清が高いＬＰＣ脂質を示したということは、細胞の取り込みにおける欠損を示唆している。変異Ｍｆｓｄ２ａは形質移入細胞ではインビトロのＬＰＣ脂質の取り込みを欠いた。
従って、Ｍｆｓｄ２ａの変異は必須のＬＰＣ脂質の不適当な取り込みに関連した特徴的な致死性小頭症症候群を生じる。
方法
［試験の管理］
試験はヘルシンキ宣言の規定を順守して実施された。サンディエゴ大学の施設内倫理委員会及びエジプト及びトリポリの子供病院の倫理委員会が試験プロトコールを認可した。人員確保は、疾患の遺伝的基盤を特定するためにエクソームの配列決定が行われた３３９６人の家族から成る神経発達疾患の大きな試験の一部だった。試験の参加者または指名者すべてから書面でのインフォームドコンセントを得た。
［試験の参加者］
我々は、小頭症、乏しい頭部制御と躯幹筋緊張低下を伴った痙性四肢麻痺、発達遅延、知的障害、及び脳室拡大、と同様に脳梁と脳幹の低形成を類似して提示する２つの家族を特定した（表５）。
（表５）家族１４２２及び１８２５の冒されたメンバーの臨床的な特徴
Figure 2022121623000007
略記：ＨＣ、頭囲；ＭＲＩ、磁気共鳴画像診断；ＳＤ、標準偏差；ｎ/ａ、利用不可
一般的な評価及び神経学的な評価、擬人化測定、及び脳の画像診断の概観を含め、生きている冒されたメンバーそれぞれを評価した。確認時に、各家族には生きている者１人と患者１人がいた。血液試料が得られ、アリコートをＤＮＡ抽出に使用し、その後のリピドミクス評価のために凍結した。既知のリソソーム性、ペルオキシソーム性及びミトコンドリア性の疾患についての血液由来の完全な代謝スクリーニングは陰性だった。２、３歳のうちに神経疾患の合併症で死亡した冒されたメンバーはすべて、致死的状態と一致する成長障害及び心肺機能不全に起因した。
［遺伝子型決定及び遺伝子地図］
各家族における両親と冒されたメンバー１人を含む６人のＤＮＡ試料が遺伝的検討で利用可能だった。これらの試料は、配列解析の比較のために民族的に一致した個体として使用された１３４９人のエジプト人と９３人のリビア人を含む遺伝子研究を受けた３３９６人の患者が関与するさらに大きな取り組みの一部だった。各家族からの１人が比較ゲノムハイブリッド形成（ＣＧＨ）解析及び核型分析を受けたが、構造的な染色体異常は検出されなかった。
［標的化配列捕捉及び配列決定］
我々は各家族からの冒されたメンバーにて全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）を行った。家族１８２５では、我々はさらに両親のＷＥＳを行い、結果の特異性を高めた。ゲノムＤＮＡをＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ ５０Ｍｂキットのライブラリ調製、次いでＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ２０００機器における両末端配列決定（２×１５０ｂｐ）に供した。各患者の試料について＞９０％のエクソームが＞３０×でカバーされた。変異体の特定にはＧＡＴＫを用いた（ＤｅＰｒｉｓｔｏ，ＭＡ.Ｂａｎｋｓ，Ｅ．Ｐｏｐｌｉｎ，Ｒら．Ａ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０１１；４３：４９１－８）。我々はＸＨＭＭを用いて分離している稀な構造的変異体について調べた（Ｆｒｏｍｅｒ，Ｍ．Ｍｏｒａｎ，ＪＬ．Ｃｈａｍｂｅｒｔ，Ｋら．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｐｙ－ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ－ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄｅｐｔｈ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１２；９１：５９７－６０７）。次いで我々は、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いてホモ接合性変異体についてフィルターをかけ、集団にて０．１％を超える頻度でホモ接合体区間に存在しない、またはタンパク質機能への損傷の可能性について高いスコアではない対立遺伝子を取り除いた。家族１４２２及び１８２５にて新規の変異はＭｆｓｄ２ａ遺伝子において特定された。コホートの他のメンバーは推定上の有害な変異体を提示しなかった。
［Ｍｆｓｄ２ａの機能的な解析］
我々は輸送アッセイ（Ｎｇｕｙｅｎ，ＬＮ．Ｍａ，Ｄ．Ｓｈｕｉ，Ｇら．Ｍｆｓｄ２ａ ｉｓ ａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｏｍｅｇａ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４；５０９：５０３－６）におけるＭｆｓｄ２ａの変異の効果及びＭＯ表現型をレスキューすることにおけるヒト野生型（ＷＴ）Ｍｆｓｄ２ａに導入された変異の効果を調べた。患者の血清をリピドミクス解析（Ｓｈｕｉ，Ｇ．Ｓｔｅｂｂｉｎｓ，ＪＷ．Ｌａｍ，ＢＤら．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｉｄｏｍｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ：ａｒｅ ｐｌａｓｍａ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ ｇｏｏｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｏｎｋｅｙｓ？ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１１；６：ｅ１９７３１）に供した。機能的な解析の詳細な方法は以下で提供される。
［ヒト対象］患者は、カリフォルニア大学の認可されたヒト対象プロトコールにおける標準の現地業務に従って登録された。
［全エクソームの配列決定］各試料について、塩抽出によって末梢血白血球からＤＮＡを抽出した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒト全エクソーム５０Ｍｂキットによってエクソンの捕捉を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００装置によって両末端配列決定を行い、＞１０×のカバー度で約９４％の回収を生じた。Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）によってヒトのゲノム（ｈｇ１９）に対して配列を並べ、ＳＮＰ及び挿入／欠失の多型の双方についてゲノム解析ツールキット（ＧＡＴＫ）ソフトウエア及びＳＡＭＴｏｏｌｓアルゴリズムを用いて変異体を詳しく説明した。その後、以下の基準：コーディング領域及び／又はスプライス部位に存在すること、対照集団（５０００人の我々の研究室内エクソームのデータセット、ｄｂＳＮＰ及びエクソーム変異体のサーバー）にて０．１％未満の頻度で見いだされる非同義性のもの、ホモ接合性の連鎖の区間またはブロックの範囲内での血縁家族におけるホモ接合性のものに従って変異体をフィルターにかけた。残りの変異体は、変異の種類（ナンセンス／スプライス／インデル／ミスセンス）、種を越えたアミノ酸の保存、及び損傷予測プログラム（ＰｏｌｙＰｈｅｎとＧｒａｎｔｈａｍのスコア）によってランク分けした。家族性遺伝パターン及び変異（ナンセンス／スプライス／インデル＞ミスセンス）の重大性を考慮に入れる自動化された優先順位付けのワークフローを用いて変異体を解析した。推定ヌル対立遺伝子、ＧＥＲＰスコア＞４またはＰｈａｓｔｃｏｎスコア＞０．８のこの閾値をパスする考えられる有害変異体すべてのリストを家族全体におけるＳａｎｇｅｒ配列決定による分離について調べ、エクソームの配列決定エラーまたは分離解析をパスしない（すなわち、劣性の遺伝モデルに従う）変異体を除外した。単一の有害変異が分離したもののみを潜在的に原因となるものとしてマークした。ホモ接合性マッパーを用いてエクソーム配列から同質接合性マップを構築した（Ｓｅｅｌｏｗ，Ｄ．Ｓｃｈｕｅｌｋｅ，Ｍ．Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，Ｆ．Ｎｕｒｎｂｅｒｇ，Ｐ．ＨｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙＭａｐｐｅｒ－－ａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ｍａｐｐｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９；３７：Ｗ５９３－９）。
［Ｓａｎｇｅｒ配列決定］Ｐｒｉｍｅｒ３プログラムを用いてプライマーを設計し、ＮＩＨのＢＬＡＳＴソフトウエアを用いて特異性について調べた。ＰＣＲ産物をエンドヌクレアーゼＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）及びエビのアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で処理し、ＡＢＩ３１００ ＤＮＡアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてＢｉｇ Ｄｙｅターミネータサイクル配列決定キットｖ．３．１を用いて配列決定した。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ４．９（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ）によって配列データを解析した。
［ヒトＭｆｓｄ２ａの変異誘発］プライマーｈＭｆｓｄ２ａＢａｍＨＩ及びｈＭｆｓｄ２ａＸｂａＩ（表８）を用いてＳｐｏｒｔ６（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に由来するヒトＭｆｓｄ２ａでＰＣＲを行い、ｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ部位にクローニングした。Ｍｆｓｄ２ａの変異誘発のために、ＰＣＲによる特異的なプライマー、ｐ．Ｔ１５９Ｍ及びｐ．Ｓ１６６Ｌを用いた（表６）。ｐ．Ｔ１５９Ｍ及びｐ．Ｓ１６６Ｌの変異させたＰＣＲ産物をその後、ｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、配列決定した。
（表６）この試験で使用したプライマー
Figure 2022121623000008
［ＰＮＧａｓｅＦ処理］インキュベート時間が３時間であることを除いて以前記載されたように（Ｄａｎｅｍａｎ，Ｒ．Ｚｈｏｕ，Ｌ．Ａｇａｌｌｉｕ，Ｄ．Ｃａｈｏｙ，ＪＤ．Ｋａｕｓｈａｌ，Ａ．Ｂａｒｒｅｓ，ＢＡ．Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ： ａ ｎｅｗ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１０；５：ｅ１３７４１）、ＨＥＫ２９３細胞にて発現されたＭｆｓｄ２ａ、ｐ．Ｔ１５９Ｍ、ｐ．Ｓ１６６ＬのＰＮＧａｓｅＦ処理を行った。
［Ｍｆｓｄ２ａのモデル化］ｉ－Ｔａｓｓｅｒプログラムを用いてＭｆｓｄ２ａの３Ｄ構造をモデル化した。Ｍｆｓｄ２ａに最も適合したモデルは、その原子構造が最近解かれた細菌のメリビオース透過酵素（ＭｅｌＢ）である（Ｅｔｈａｙａｔｈｕｌｌａ，ＡＳ．Ｙｏｕｓｅｆ，ＭＳ．Ａｍｉｎ，Ａ．Ｌｅｂｌａｎｃ，Ｇ．Ｋａｂａｃｋ，ＨＲ．Ｇｕａｎ，Ｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｎａ（＋）／ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ ｓｙｍｐｏｒｔ ｂｙ ＭｅｌＢ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４；５：３００９）。その後、ＰｙＭｏｌを用いて、モデル化されたＭｆｓｄ２ａの膜貫通ドメイン及び膜貫通残基を見た。
［輸送アッセイ］ＨＥＫ２９３細胞を用いた輸送アッセイを以前記載された（Ｎｇｕｙｅｎ，ＬＮ．Ｍａ，Ｄ．Ｓｈｕｉ，Ｇ．ら，Ｍｆｓｄ２ａ ｉｓ ａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｏｍｅｇａ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４；５０９：５０３－６）ように実施した。手短には、ＷＴのＭｆｓｄ２ａ、ｐ．Ｔ１５９Ｍ及びｐ．Ｓ１６６ＬのプラスミドでＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。形質移入の２４時間後、様々な量のＬＰＣ［１４Ｃ］－オレイン酸で取り込みアッセイを行った。１２穴プレートにて３つ組で実験を２回繰り返した。取り込み活性はＤＰＭ／ウェルとして表した。放射性標識した１－オレオイル２－リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）［１４Ｃ］－オレイン酸はＡＲＣから購入し、放射性標識していないＬＰＣ－オレイン酸はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から入手した。
［リン脂質のＴＬＣ解析］ｐｃＤＮＡ３．１ｈＭｆｓｄ２ａ（ＷＴ）、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａＴ１５９Ｍ（ｐ．Ｔ１５９Ｍ）、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｆｓｄ２ａＳ１６６Ｌ（ｐ．Ｓ１６６Ｌ）、またはｐｃＤＮＡ３．１（モック）のプラスミドを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で１回洗浄した後、１００μＭの放射性標識したＬＰＣ［１４Ｃ］オレイン酸と共に３０分間インキュベートした。０．５％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭでウェルを３回洗浄した。ＨＩＰ（ヘキサン／イソプロパノール、比３：２）緩衝液で３０分間、脂質を２回抽出し、窒素流で乾燥させ、クロロホルムで再構成し、ＴＬＣプレート（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）上でスポットにした。リン脂質の分離用の溶媒はクロロホルム／メタノール／アンモニア溶液（２５％）（容量当たり５０：２５：６）だった。放射性標識したリン脂質のＴＬＣプレートを３０分間乾燥させ、一晩Ｐｈｏｓｐｈｏｒｓｃｒｅｅｎｓに暴露し、ＴｙｐｈｏｏｎＦＬＡ９０００スキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ）で走査した。Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウエアを用いてリン脂質のバンドを定量し、モックに対する倍変化として表した。
［血漿試料のリピドミクス解析］ヒト血漿試料については、家族１８２５の父親、母親
及び患者の単一の血漿試料、及び家族１４２２の父親、母親及び患者の２つ組の血漿試料をＬＰＣ分析に使用した。以前記載された（Ｚｈａｏ，Ｚ．Ｘｕ，Ｙ．Ａｎ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２０１０；５１：６５２－９）メタノール系のプロトコールを用いてリゾリン脂質を抽出した。手短には、内部標準として１００ピコモル／ｍＬのＬＰＣ２０：０を含有する２００μＬのメタノール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，ＵＳＡ）に血漿試料（２μＬ）を再懸濁し、その後、氷上で３０秒間のボルテックス撹拌と３０分間の超音波処理を行った。試料を４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、残渣を取り除いた。上清をメタノールで５倍に希釈した（総容量２５μＬ）後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに注入した。マウスの血漿試料については、活性炭を用いてリゾ脂質を抽出した。手短には、３．５カ月齢の５匹のＷＴ同腹仔及び５匹のＫＯ同腹仔の血漿（１５０μＬ）を先ず６５０μＬのＰＢＳ、次いで８００μＬの活性炭溶液（１ｇ／５０ｍＬのＰＢＳ）で希釈した。試料を２５℃で１時間回転し、その後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して活性炭ペレットを回収した。ペレットをＰＢＳで３回洗浄し、次いで５００μＬのＰＢＳに再懸濁した。等量のクロロホルム／メタノール（２：１）を試料に加え、２５℃にて３０分間激しくボルテックスした。遠心分離によって有機相を分離し、クロロホルム／メタノール（２：１）によって脂質の抽出を２回行い、Ｎ２ガスで乾燥させた。リピドミクス解析に先立って、乾燥させた脂質抽出物を１５０μＬのクロロホルム／メタノール１／１に再懸濁し、さらに、内部標準として０．９１ナノモル／ｍＬのＬＰＣ２０：０を含有する２００μＬのメタノールで希釈した。ＬＣ／ＭＳＭＳへの注入にはこれらの溶液を用いた。
［質量分光分析］ＬＣ／ＭＳＭＳへの注入のために試料を無作為化した。各試料は技術的な３つ組で解析した。各試料の解析にはブランクの注入が続いてキャリーオーバーを回避した。解析全体を通したシグナルの安定性はＱＣ試料の定期的な注入によってモニターした。クロマトグラフィ解析は、Ｋｉｎｅｔｅｘ ＨＩＬＩＣ固定相（１５０×２．１ｍｍ，２．６μｍ，１００Å，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ＵＳＡ）を用いて１２９０液体クロマトグラフィシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）にて行われた。勾配溶出については、使用した溶媒は、Ａ：９５％アセトニトリル／５％１０ｍＭのギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸、及びＢ：５０％アセトニトリル／５０％１０ｍＭのギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸だった。勾配は、６分間で０．１％Ｂから７５％Ｂに、１分間で９０％Ｂになり、０．１分間で０．１％Ｂになり、０．１％Ｂで３分間保持した（合計実行時間１０．１分）。これらの条件下で、ＬＰＣ種は約４．９分で溶出する。流速は０．５ｍＬ／分だった。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて６４６０三連四重極質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）にてＬＰＣ種を定量した。線源条件は以下のとおりであった：気体温度３００℃、気体流速５Ｌ／分、シース気体流速１１Ｌ／分、及びキャピラリー電圧３５００Ｖ。ＭＲＭトランジションは、２９Ｖの衝突エネルギーを伴って前駆体イオンからコリンの先頭断片（ｍ／ｚ１８４）までだった。２０ミリ秒の滞留時間で３６回のトランジションを同時にモニターした。ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定量解析（ＱＱＱ）ソフトウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を用いて定量データを抽出した。データを手動で監督して正しいピークの積分を確保した。各ＭＲＭトランジションについての抽出されたイオンクロマト図のピークの曲線下面積（ＡＵＣ）をエクセルに抽出した。脂質種のＡＵＣを内部標準のＡＵＣに対して正規化した。ヒト及びマウスの試料に由来する合計の及び個々のＬＰＣ種を算出し、μＭとして表した。
［血中ＬＰＣ［１４Ｃ］－オレイン酸の分析］１００μＭの放射性標識したＬＰＣ［１４Ｃ］－オレイン酸をＭｆｓｄ２ａのＫＯマウス及びＷＴマウスに静脈内注射した。２分後（当初の投与）及び２時間後、尾静脈から１０μＬの血液試料を採取し、シンチレーションカウントによって放射活性を定量した。ＫＯマウスにおける血漿ＬＰＣ［１４Ｃ］－オレイン酸の量を各時点でのＷＴに対する比として表した。
［統計的解析］
我々はインビトロの実験はすべて４つ組で行った。データは平均値及び標準誤差として表す。我々はスチューデントのｔ検定（両側）を用いて群間の比較を行った。複数の比較については、我々はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウエアを用いた分散分析と併せてターキーの検定を行った。注射されたｍＲＮＡに関わりなく、受精後１、２及び３日のＭＯ注射の後の生存についてＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を算出した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウエアを用いたロングランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて生存曲線を比較した。ｐ値＜０．０５が有意差を示すと見なした。ｐ値はすべて両側性で調べた。
結果
［試験集団］
試験に動員された３３９６人の患者は、進行性の神経学的経過に対する固定した神経学的経過、癲癇の存在、自閉症または知的障害、肉眼的な醜形特徴、または、たとえば、脳ＭＲＩ、ＥＥＧ若しくは血液の化学的分析のような診断試験における顕著な知見に基づいて大部分は識別できる神経発達障害の多数の個々に稀な形態を表した。２つの家族が、思い返せば、小頭症、混合型筋緊張低下／痙性四肢麻痺、頭部制御の不在、癲癇性発作及び大きく拡張した脳室を含む多数の類似の特徴を示したものの、日常検査の際の普通でないまたは特徴的な臨床知見の非存在を考えると、彼らの臨床所見をコホートの残りから識別するのは困難だった。
一方はリビアからの及び他方はエジプトからの２つの家族は生後３ヵ月以内で重要な出来事がなかったために医学的な注目がもたらされた。遺伝の劣性様式に一致して、双方の家族はいとこ同士の両親という血縁関係を示し、それぞれ２人の冒されたメンバーがあり（図２３Ａ）、発達遅延について環境のリスク因子はなかった（Ｅｎｇｌｅ，ＰＬ．Ｂｌａｃｋ，ＭＭ．Ｂｅｈｒｍａｎ，ＪＲら．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ａｖｏｉｄ ｔｈｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ２００ ｍｉｌｌｉｏｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｗｏｒｌｄ．Ｌａｎｃｅｔ，２００７；３６９：２２９－４２）。冒されたメンバーの臨床的な特徴は、小頭症を除いて出生時正常な外見及び成長のパラメータを示したが、生後１ヵ月以内に構成的な成長遅延、発作及び頭部成長の不在が明らかになった。混合型筋緊張低下／痙性四肢麻痺、頭部制御の維持の困難さ、胃食道逆流、及び誤嚥性肺炎があった。発作の発症は生後７日と２歳の間であり、３～１０分間続く間代性または強直性の痙攣から成り、気分がすぐれないことによって引き起こされた。日常の血液検査は、化学検査値、完全な血球数、血沈速度、標準の脂質特性、乳酸／ピルビン酸、詳細な核型、及び代謝中間体のための臨床タンデム質量分析を含めて完全に正常だった。脳の画像診断試験は、肉眼的な水頭症を示し、大きく拡張した側脳室、皮質表面の消失、大脳及び脳幹の形成不全／萎縮を伴った（図２３Ｂ）。閉塞性水頭症は開いているシルビウス水道、及び状態が深部白質の疾患のこれまで未知の形態を表すという予測診断に基づいて除外した。
［エクソーム全体の配列決定］
我々は、変異型（５０００人の我々の研究室内エクソームデータまたは４０００人のＮＨＬＢＩのデータベースにおける＞０．１％の対立遺伝子頻度）及び両親にてヘテロ接合性ではない変異型を取り除くことによって冒されたメンバーにおけるＷＥＳからデータをフィルターにかけた（Ｔｅｎｎｅｓｓｅｎ，ＪＡ．Ｂｉｇｈａｍ，ＡＷ．Ｏ'Ｃｏｎｎｏｒ，ＴＤら．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｒａｒｅ ｃｏｄｉｎｇ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｘｏｍｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２；３３７：６４－９）。我々は各家族のメンバーにて稀なタンパク質を変化させる変異型を特定した。これらの変異型の中で、家族１８２５にてたった４つが遺伝の様式に一致し（表７）、そのうちのたった１つが分離解析をパスし、それは、Ｍｆｓｄ２ａ遺伝子におけるｃｈｒ１：４０４３１００５Ｃ＞Ｔ変異型であり、ｃ．４７６Ｃ＞Ｔヌクレオチド及びｐ．Ｔ１５９Ｍタンパク質の変化につながった。この特定の後、我々はデータベースを検索し、家族１４２２が、ｃ．４９７Ｃ＞Ｔヌクレオチド及びｐ．Ｓ１６６Ｌタンパク質の変化につながる、同一遺伝子におけるｃｈｒ１：４０４３１１６２Ｃ＞Ｔ変異型を抱くことを見いだした（図２３Ｃ）。２つの家族の表現型の比較はそれらが正確に一致することを示した。双方の変異型は、標準のプログラムを用いて高い損傷予測を示し（表７、表８）、ホモ接合性のブロックに存在し（図２６）、脊椎動物の進化の全体を通して完全に保存され、タンパク質の第４膜貫通ドメインに位置するアミノ酸残基（図２３Ｄ、Ｅ）の中にあった。双方の変異は、構成的にスプライスされるエクソンの中にあり、遺伝の厳格な劣性様式に従って各家族で分離した（図２７）。これらの変異型は、ほぼ１０，０００の染色体の我々の内部データセット、または公的に利用できるデータベースには存在しなかった。
（表７）エクソームの配列決定に由来する家族１８２５の遺伝子変異型
Figure 2022121623000009
（表８）エクソームの配列決定に由来する家族１４２２の遺伝子変異型
Figure 2022121623000010
［Ｍｆｓｄ２ａの機能に対する変異の影響］
本明細書で議論されるように、Ｍｆｓｄ２ａは、マウスにてＢＢＢの形成及び機能に最近関わるとされ、ＤＨＡの輸送に必要とされる１２回膜貫通型タンパク質をコードする（Ｎｇｕｙｅｎ，ＬＮ．Ｍａ，Ｄ．Ｓｈｕｉ，Ｇら．Ｍｆｓｄ２ａ ｉｓ ａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｏｍｅｇａ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４；５０９：５０３－６；Ｂｅｎ－Ｚｖｉ，Ａ．Ｌａｃｏｓｔｅ，Ｂ．Ｋｕｒ，Ｅら．Ｍｆｓｄ２ａ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４；５０９：５０７－１１）。ＨＥＫ２９３細胞におけるＭｆｓｄ２ａの発現は、残基Ｎ２１７及びＮ２２７におけるグリコシル化のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で約５５ｋＤａと約７０ｋＤａの２つのアイソフォームに分割される（Ｂｅｒｇｅｒ，ＪＨ．Ｃｈａｒｒｏｎ，ＭＪ．Ｓｉｌｖｅｒ，ＤＬ．Ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ（ＭＦＳＤ２Ａ）ｈａｓ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｂｏｄｙ ｇｒｏｗｔｈ，ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１２；７：ｅ５０６２９）。ＨＥＫ２９３細胞にて発現されたヒトのＭｆｓｄ２ａタンパク質にｐ.Ｔ１５９Ｍ及びｐ.Ｓ１６６Ｌの変異を導入し、ウエスタンブロット及び免疫蛍光法で調べた。双方とも類似のレベルで発現され、ＷＴと同一の翻訳後修飾を示し、グリコヒドロラーゼＰＮＧａｓｅＦ処理に続いて低分子量の実体に分割した（図２４Ａ）。さらに、双方の変異体タンパク質は安定して発現され、ＷＴと類似の方法（図２４Ｂ）で原形質膜に部分的に局在化した。不活化している変異のために分子基盤を提供するために、我々は、ＭＦＳファミリーの大腸菌のナトリウム－メリビオース輸送体部分であり、Ｍｆｓｄ２ａと高い配列類似性を共有するＭｅｌＢの構造情報を利用した。ｐ.Ｔ１５９及びｐ. Ｓ１６６は双方とも膜貫通ドメイン４に存在し、それぞれナトリウム結合及びリガンド結合を伝達する（Ｅｔｈａｙａｔｈｕｌｌａ，ＡＳ．Ｙｏｕｓｅｆ，ＭＳ．Ａｍｉｎ，Ａ．Ｌｅｂｌａｎｃ，Ｇ．Ｋａｂａｃｋ，ＨＲ．Ｇｕａｎ，Ｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｎａ（＋）／ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ ｓｙｍｐｏｒｔ ｂｙ ＭｅｌＢ．Ｎａｔ.Ｃｏｍｍｕｎ.２０１４；５：３００９；Ｃｏｒｄａｔ，Ｅ．Ｌｅｂｌａｎｃ，Ｇ．Ｍｕｓ－Ｖｅｔｅａｕ，Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｅｌｉｘ ＩＶ ｉｎ ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｃａｔｉｏｎ－ ａｎｄ ｓｕｇａｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００；３９：４４９３－９）。ヒトの残基ｐ.Ｔ１５９はＭｅｌＢの残基ｐ.Ｔ２２１に保存され、ｐ.Ｔ１５９Ｍ変異はナトリウム結合の相互作用を破壊させると予測される一方で、ｐ.Ｓ１６６変異はＭｅｌＢ（ｐ.Ｗ２２８）にて保存され、ｐ.Ｓ１６６Ｌ変異はＬＰＣの結合を妨害すると予測される（図２４Ｃ）。
機能的損傷について調べるために、我々は、ＨＥＫ２９３細胞へ形質移入に続いて、様々な濃度のＬＰＣ－［１４Ｃ］ＤＨＡ、ＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸及びＬＰＣ－［１４Ｃ］パルミチン酸（図２４Ｄ－Ｆ）と共に細胞系アッセイを使用した。ｐ.Ｔ１５９Ｍ及びｐ.Ｓ１６６Ｌの変異体が大部分不活性であるということは、調べたＬＰＣ－脂質に対してモックで形質移入した細胞におけるバックグランドに類似する輸送活性を呈し、変異がＬＰＣ輸送体としてのＭｆｓｄ２ａの機能を損傷することを示している。ＨＥＫ２９３細胞によって取り込まれるＬＰＣは細胞性のリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）酵素によってホスファチジルコリン（ＰＣ）にエステル化され、細胞取り込みのさらなる生化学的な証拠を提供する。従って、ＬＰＣからＰＣへの変換についてＭｆｓｄ２ａ及び変異体の構築物を評価した（図２４Ｇ～Ｉ）。野生型のＭｆｓｄ２ａを発現している細胞は、ｐ.Ｔ１５９Ｍ及びｐ.Ｓ１６６Ｌの変異体を発現している細胞に比べて外来性ＬＰＣの膜ＰＣへの有意に大きな変換を示したが、それは変異体における輸送機能の喪失に一致した（図２４Ｆ、Ｇ）。
［血漿ＬＰＣのレベルに対するＭｆｓｄ２ａ変異の影響］
我々は、ＢＢＢでのＭｆｓｄ２ａによる血漿脂質の取り込みが血漿ＬＰＣのレベルに影響を与えるので、Ｍｓｆｄ２ａ欠乏は高い血漿ＬＰＣレベルを生じるはずであるという仮説を立てた。実際、我々は、Ｍｓｆｄ２ａのＫＯマウスが対照に比べて４０％高い血漿総ＬＰＣレベルを示すことを見いだした（図２５Ａ）。Ｍｓｆｄ２ａのＫＯマウスはまた対照に比べて個々のＬＰＣの高いレベルも有した（図２５Ｂ）。ＬＰＣ－ＤＨＡのような他の豊富ではない血漿ＬＰＣ種はＭｓｆｄ２ａのＫＯマウスでは高いレベルに向かう傾向を示した（図２５Ｂ）。Ｍｓｆｄ２ａのＫＯマウスにおける高い血漿ＬＰＣの定常状態レベル、及びＭｓｆｄ２ａのＫＯマウスにおけるＬＰＣの脳による取り込みがＬＰＣ種に応じて８５～９０％の間で低下したという知見に一致して、静脈内注射したＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸の追跡試験は、注射後２時間でのＭｓｆｄ２ａのＫＯマウスにおける血漿ＬＰＣ－［１４Ｃ］オレイン酸の高いレベルを示した（図２５Ｃ）。これらの結果を考えると、我々は患者がヘテロ接合性の両親及び健常な年齢の一致した対照と比べてＬＰＣの高い血漿レベルを有するかどうかを調べた。リピドミクス解析は、ヘテロ接合性の両親及び対照と比べて総血漿ＬＰＣは発端者で増加することを示した（図２５Ｄ）。Ｍｓｆｄ２ａのＫＯマウスにおける知見に類似して、１６：０、１８：０、１８：１及び１８：２の長さの脂肪酸を含有する一般的な血漿ＬＰＣ種はＭｓｆｄ２ａ変異体の患者の血清で増加したということは、ＬＰＣ取り込みの欠損を示唆している（図２５Ｅ）。
実施例１１：ヒトＭｆｓｄ２ａ変異のモデル化
我々は、不活化変異ｐ.Ｔ１５９Ｍ及びｐ.Ｓ１６６Ｌのための分子基盤を提供するためにＭｅｌＢの詳細な構造情報を利用した。ＭＦＳファミリーの輸送の全体的なメカニズムは大腸菌由来のグリセロール－３－リン酸輸送体ＧｌｐＴのＸ線構造から最初に推論され、他のＭＦＳファミリーメンバーの及びさらに最近、Ｍｆｓｄ２ａの密接なオルソログであるＭｅｌＢを含む構造によって確認された（Ｅｔｈａｙａｔｈｕｌｌａ，ＡＳ．Ｙｏｕｓｅｆ，ＭＳ．Ａｍｉｎ，Ａ．Ｌｅｂｌａｎｃ，Ｇ．Ｋａｂａｃｋ，ＨＲ．Ｇｕａｎ，Ｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｎａ（＋）／ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ ｓｙｍｐｏｒｔ ｂｙ ＭｅｌＢ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４；５：３００９；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｌｅｍｉｅｕｘ，ＭＪ．Ｓｏｎｇ，Ｊ．Ａｕｅｒ，Ｍ．Ｗａｎｇ，ＤＮ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３；３０１：６１６－２０；Ｓｈｉ，Ｙ．Ｃｏｍｍｏｎ ｆｏｌｄｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０１３；４２：５１－７２）。モデルは、外開きの構造がリガンドに結合して内開きの構造への構造交替を生じる「ロッカースイッチ、交互アクセス」として記載されている（Ｓｈｉ，Ｙ．Ｃｏｍｍｏｎ ｆｏｌｄｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０１３；４２：５１－７２）。この構造変化を行わせるエネルギーはその濃度勾配を下げるカチオンの結合によって提供される。Ｍｆｓｄ２ａの場合、それはナトリウムを利用してＬＰＣの輸送を行わせる。実際、Ｍｆｓｄ２ａは、ＬＰＣのナトリウム依存性の輸送には必須であることが示されている保存されたナトリウム結合部位を含有する（Ｎｇｕｙｅｎ，ＬＮ．Ｍａ，Ｄ．Ｓｈｕｉ，Ｇら．Ｍｆｓｄ２ａ ｉｓ ａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｏｍｅｇａ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４；５０９：５０３－６）。
冒された小児におけるｐ.Ｔ１５９Ｍの機能の喪失についての分子的な説明は、ＭｅｌＢの原子分解構造から推論することができる。ヒトのＭｆｓｄ２ａとＭｅｌＢの配列比較はＭｅｌＢにおけるＴ１２１によるＴ１５９の保存を示した。ＭｅｌＢにおけるＴ１２１はナトリウム結合部位に面し、ヒトＭｆｓｄ２ａのＤ９７と同等であるナトリウム結合残基Ｄ５９と水素結合を形成する（図２４Ｃ）。Ｔ１２１及びＤ５９は双方ともＭｅｌＢの輸送に必要とされる（Ｅｔｈａｙａｔｈｕｌｌａ，ＡＳ．Ｙｏｕｓｅｆ，ＭＳ．Ａｍｉｎ，Ａ．Ｌｅｂｌａｎｃ，Ｇ．Ｋａｂａｃｋ，ＨＲ．Ｇｕａｎ，Ｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｎａ（＋）／ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ ｓｙｍｐｏｒｔ ｂｙ ＭｅｌＢ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４；５：３００９）。ヒトのＭｆｓｄ２ａ配列をＭｅｌＢモデルに重ねると、ヒトにおけるＴ１５９もマウスＭｆｓｄ２ａにおけるＤ９６と同等であり、且つ機能に必須であるナトリウム結合残基Ｄ９７に非常に近接していることが明らかになった（Ｎｇｕｙｅｎ，ＬＮ．Ｍａ，Ｄ．Ｓｈｕｉ，Ｇら，Ｍｆｓｄ２ａ ｉｓ ａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｏｍｅｇａ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４；５０９：５０３－６）。ｐ.Ｔ１５９Ｍと同様に、ＭｅｌＢにおけるｐ.Ｔ１２１Ａは機能的ではない。従って、ｐ.Ｔ１５９Ｍ変異はナトリウム結合を破壊し、リガンドの輸送を妨げると予測される。ｐ.Ｓ１６６Ｌ変異も機能的ではなく、冒された小児は、ｐ.Ｔ１５９Ｍを有する小児の臨床的な表現型模写である。興味深いことに、ｐ.Ｔ１５９Ｍ及びｐ.Ｓ１６６Ｌは双方とも膜貫通ドメイン４（ＴＭＤ４）に存在し、それはリガンド及びナトリウム結合と情報交換すると提案されている（Ｅｔｈａｙａｔｈｕｌｌａ，ＡＳ．Ｙｏｕｓｅｆ，ＭＳ．Ａｍｉｎ，Ａ．Ｌｅｂｌａｎｃ，Ｇ．Ｋａｂａｃｋ，ＨＲ．Ｇｕａｎ，Ｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｎａ（＋）／ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ ｓｙｍｐｏｒｔ ｂｙ ＭｅｌＢ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４；５：３００９；Ｃｏｒｄａｔ，Ｅ．Ｌｅｂｌａｎｃ，Ｇ．Ｍｕｓ－Ｖｅｔｅａｕ，Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｅｌｉｘ ＩＶ ｉｎ ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｃａｔｉｏｎ－ ａｎｄ ｓｕｇａｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００；３９：４４９３－９）。Ｓ１６６残基は、配列決定した脊椎動物すべてにおいて保存されているが、ＭｅｌＢでは保存されていない。さらに、Ｓ１６６残基が輸送空洞に面している（図２４Ｃ）ということはリガンド結合における役割を示唆している。実際、ＭｅｌＢにおけるＳ１６６に相当する残基であるＷ１２８はメルビオースの輸送に決定的である（Ｅｔｈａｙａｔｈｕｌｌａ，ＡＳ．Ｙｏｕｓｅｆ，ＭＳ．Ａｍｉｎ，Ａ．Ｌｅｂｌａｎｃ，Ｇ．Ｋａｂａｃｋ，ＨＲ．Ｇｕａｎ，Ｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｎａ（＋）／ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ ｓｙｍｐｏｒｔ ｂｙ ＭｅｌＢ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４；５：３００９；Ｃｏｒｄａｔ，Ｅ．Ｌｅｂｌａｎｃ，Ｇ．Ｍｕｓ－Ｖｅｔｅａｕ，Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｅｌｉｘ ＩＶ ｉｎ ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｃａｔｉｏｎ－ ａｎｄ ｓｕｇａｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００；３９：４４９３－９）。従って、Ｓ１６６残基は、ＬＰＣのホスホリルコリン頭基と潜在的に水素結合を形成することによって基質結合にて役割を担うと予測される。
実施例９、１０及び１１で開示された試験は、ヒトにおけるω－３脂肪酸の輸送と脳の成長の間の関連性を立証している。我々がＭｆｓｄ２ａに不活化変異を抱くことを特定した２つの血縁関係のある家族は、重度の水頭症、痙攣性の四肢麻痺及び癲癇を伴った生後３ヵ月で症状が見つかる致死的な小頭症を示した。脂質の分析はＭｆｓｄ２ａ活性の欠如による細胞性の取り込みができないことの結果であると思われる高い血清ＬＰＣレベルを指摘した。患者の全体的な表現型の重症度は、生き残り、小頭症、運動失調、記憶と学習の欠陥、及び不安を呈するノックアウトマウスから予測されたものより大きかった（Ｎｇｕｙｅｎ，ＬＮ．Ｍａ，Ｄ．Ｓｈｕｉ，Ｇら，Ｍｆｓｄ２ａ ｉｓ ａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｏｍｅｇａ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４；５０９：５０３－６）。
本発明の特定の態様が記載され、説明されてきた一方で、そのような態様は本発明の例にすぎず、添付のクレームに従って解釈されるような本発明を限定するものではないと見なされるべきである。
本明細書で引用されている出版物及び特許出願はすべて、個々の出版物または特許出願がそれぞれ具体的に且つ個々にあらゆる目的で参照によって組み入れられるように指示されたかのように、あらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
理解の明瞭性の目的で説明と例示のために前述の発明は少し詳しく記載されているけれども、本発明の教示に照らして、添付のクレームの精神または範囲から逸脱することなく特定の変更及び改変をそれに対して行うことができることは当業者に容易に明らかであろう。
（表１）ＨＥＫ２３９細胞における遊離の脂肪酸の取り込みの質量分光分析。Ｍｆｓｄ２ａを発現しているＨＥＫ２３９細胞を１００μＭの示した脂肪酸/ＢＳＡ複合体と共に一晩インキュベートした。脂質抽出及びＭＳによるリン脂質の分析は方法の区分で記載されたように行った。各脂質種に量を内部標準に対して正規化し、分析した総リン脂質におけるモルパーセントとして表した。
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（表２）リピドミクス解析。図２のための完全なデータセット。脂質抽出及びＭＳによるリン脂質の分析は方法の区分で記載されたように行った。各脂質種に量を内部標準に対して正規化し、分析した総リン脂質におけるモルパーセントとして表した。赤色及び青色の強調はそれぞれ、ＤＨＡ及びＡＡを含有する種を指す。
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（表３）リピドミクス解析。図２ｄのための完全なデータセット。脂質抽出及びＭＳによるリン脂質の分析は方法の区分で記載されたように行った。各脂質種に量を内部標準に対して正規化し、分析した総リン脂質におけるモルパーセントとして表した。赤色及び青色の強調はそれぞれ、DHA及びAAを含有する種を指す。
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Claims (16)

  1. 足場に共有結合した化合物を含むコンジュゲートであって、該足場が、両性イオンの頭基とアシル鎖またはアルキル鎖とを含む分子であり、該化合物が薬物であり、かつ、該コンジュゲートは、主要ファシリテータスーパーファミリードメイン含有２Ａ（Ｍｆｓｄ２ａ）タンパク質と相互作用するか、該Ｍｆｓｄ２ａタンパク質を介して輸送される、コンジュゲート。
  2. 前記両性イオンの頭基がリン酸に基づく両性イオンの頭基である、請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. 前記両性イオンの頭基がホスホコリンである、請求項２に記載のコンジュゲート。
  4. 前記両性イオンの頭基が、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）またはリゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）のものである、請求項２に記載のコンジュゲート。
  5. 前記足場がリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）である、請求項１に記載のコンジュゲート。
  6. 前記化合物が、前記足場のω炭素を介して該足場に結合される、請求項１～５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  7. 前記アシル鎖またはアルキル鎖が少なくとも１４の炭素原子を含む、請求項１～６のいずれかに記載のコンジュゲート。
  8. 対象におけるＭｆｓｄ２ａタンパク質を介して化合物を輸送するための組成物であって、該組成物が、請求項１に記載のコンジュゲートを含み、該組成物が、該コンジュゲートを取り込ませるのに十分な条件下で該対象に投与されることを特徴とする、前記組成物。
  9. 前記両性イオンの頭基がリン酸に基づく両性イオンの頭基である、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記両性イオンの頭基がホスホコリンである、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記両性イオンの頭基が、ＬＰＥまたはＬＰＳのものである、請求項９に記載の組成物。
  12. 前記足場がＬＰＣである、請求項８に記載の組成物。
  13. 前記化合物が、前記足場のω炭素を介して該足場に結合される、請求項８～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記アシル鎖またはアルキル鎖が少なくとも１４の炭素原子を含む、請求項８～１３のいずれかに記載の組成物。
  15. 前記コンジュゲートが、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する、請求項８～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記コンジュゲートが脳または眼に蓄積する、請求項８～１４のいずれか一項に記載の組成物。
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