JP2022118008A - 新規リン脂質およびその利用ならびにリン脂質分離測定法の開発 - Google Patents
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Abstract
Description
(項目1A)
リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸である化合物。
(項目2A)
1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール三リン酸、または2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である項目1Aに記載の化合物。
(項目3A)
1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3-一リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-4-一リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-5-一リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3-一リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-4-一リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-5-一リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3.4-二リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3.5-二リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-4.5-二リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3,4-二リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3,5-二リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸、または2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸である項目1Aまたは2Aに記載の化合物。
(項目4A)
2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール三リン酸または2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である項目1A~3Aのいずれか1項に記載の化合物。
(項目5A)
1-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-7Z,10Z,13Z,16Z-ドコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサペンタエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-7Z,10Z,13Z,16Z-ドコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサペンタエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-6Z,9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-6Z,9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;および
2-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸
からなる群より選択される、
項目1A~4Aのいずれか1項に記載の化合物。
(項目6A)
疾患マーカーとして使用するための、項目1A~5Aのいずれか1項に記載の化合物を含む組成物。
(項目7A)
前記疾患マーカーが、炎症マーカーまたはがんマーカーである、項目6Aに記載の組成物。
(項目8A)
前記がんは前立腺がんを含む、項目7Aに記載の組成物。
(項目9A)
ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸をアルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程を包含する、項目1A~5Aのいずれか1項に記載の化合物の製造方法。
(項目10A)
前記アルキルアミンは、メチルアミンである、項目9Aに記載の製造方法。
(項目11A)
前記脱アシル化は、脱ジアシル化する条件より緩和な条件である、項目9Aまたは10Aに記載の製造方法。
(項目12A)
前記緩和な条件は、脱ジアシル化する条件のうち反応時間の短縮、前記アルキルアミンの濃度の低減、反応温度、またはその組み合わせで達成される、項目11Aに記載の方法。
(項目13A)
前記緩和な条件は、アルキルアミンとしてメチルアミンを用い、10分間以下の反応時間または該メチルアミンの濃度が約11%以下、反応温度が53℃以下あるいは該反応時間および該濃度および該反応温度の組み合わせである、項目11Aまたは12Aに記載の方法。
(項目14A)
(A) 1位と2位とに異なる質量のアシル基を有するホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を提供する工程であって、所望の質量を有するアシル基が1位または2位から選択される所望の位置に存在する、工程;
(B) 該ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を、アルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程、および
(C) 必要に応じて、所望の質量のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を取り出す工程
を包含する、所望の位置に所望のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を製造する方法。
(項目15A)
試料を、陰イオン交換樹脂に接触させることによりリン脂質を濃縮する工程;
該酸性リン脂質中のリン酸基を保護基で保護する工程;および
質量分析法により、該リン脂質中のリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する工程、
を包含する、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する方法。
(項目16A)
さらに前記リン脂質中のホスファチジルイノシトールリン酸塩も検出、同定または定量する、項目15Aに記載の方法。
(項目17A)
前記保護基はアルキル基を含む、項目15Aまたは16Aに記載の方法。
(項目18A)
前記保護基はメチル基を含む、項目15A~17Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目19A)
前記質量分析法は三連四重極質量分析計による選択反応モニタリング法(SRM)を含む、項目15A~18Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目20A)
さらに、液体カラムクロマトグラフィーまたはイオンモビリティ分離を用いて前記リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩の脂肪酸側鎖および/またはリン酸基の検出、同定または定量を行う工程を包含する、項目15A~19Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目21A)
さらにリン酸基の位置を特定する、項目15A~20Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目22A)
前記質量分析法において、アシルグリセロールをプロダクトイオン(フラグメントイオン)として選択して前記脂肪酸側鎖および/またはリン酸基の検出、同定または定量を行う、項目15A~21Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目23A)
項目15A~22Aのいずれか一項に記載の検出、同定または定量により、がんの診断を行う方法。
(項目24A)
試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを測定、検出または同定する方法であって、該方法は
A)該試料を質量分析(MS)に適用する工程;および
B)該MSにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程
を包含する、方法。
(項目25A)
前記A)工程において、前記試料をさらにクロマトグラフィーに適用することを包含する、項目24Aに記載の方法。
(項目26A)
前記質量分析が液体カラムクロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)であり、
前記特定する工程B)が、該LC-MSにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程である、項目24Aまたは25Aに記載の方法。
(項目27A)
前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の分子量の合計も特定される、項目24A~26Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目28A)
前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の種類も特定される、項目24A~27Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目29A)
同一のランにおいて前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよびリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する、項目24A~28Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目30A)
前記測定、検出または同定は、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを他のイノシトール含有リン脂質から区別して行うことを特徴とする、項目24A~29Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目31A)
前記試料は、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で調製されたものである、項目24A~30Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目32A)
前記条件は脱アシル化処理を行わないことを含む、項目31Aに記載の方法。
(項目33A)
前記液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラム、親水基および疎水基を分離するカラムクロマトグラフィーからなる群より選択される、項目26A~32Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目34A)
前記液体カラムクロマトグラフィーは、イオンモビリティ分離と組み合わせられる、項目24A~33Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目35A)
前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを定量する工程をさらに包含する、項目24A~34Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目36A)
前記試料はインタクトな試料である、項目24A~35Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目37A)
前記特定は試料を標識せずに行われる、項目24A~36Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目38A)
前記質量分析がイオンモビリティ分離-質量分析(IMS-MS)であり、
前記特定する工程B)が、該IMS-MSにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程である、
項目24A~37Aのいずれか1項に記載の方法。
(項目39A)
項目25A~33A、35A~37Aのいずれかまたは複数の特徴を備える項目38Aに記載の方法。
(項目40A)
試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのアシル基およびリン酸基の位置を測定、検出または同定する装置であって、質量分析(MS)と、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該MSに該試料を適用する適用部とを含む装置。
(項目41A)
さらにクロマトグラフィー用の装置を含む項目40Aに記載の装置。
(項目42A)
前記質量分析が液体カラムクロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)であり、前記適用部がホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該LC-MSに該試料を適用する適用部である、項目40Aまたは41Aに記載の装置。
(項目43A)
前記液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラムなど親水基、疎水基を分離するすべてのカラムクロマトグラフィーからなる群より選択される、項目42Aに記載の装置。
(項目44A)
前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを検知または定量する手段をさらに含む、項目40A~43Aのいずれか1項に記載の装置。
(項目45A)
前記質量分析がイオンモビリティ分離-質量分析(IMS-MS)であり、前記適用部がホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該IMS-MSに該試料を適用する適用部である、項目40A~44Aのいずれか1項に記載の装置。
(項目46A)
試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを、アシル基を保持しつつ、リン酸基の位置に応じて分離または精製する方法であって、該方法は
A)該試料を液体カラムクロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)またはイオンモビリティ分離-質量分析(IMS-MS)に適用する工程;および
B)該LC-MSまたはIMS-MSにおけるLCまたはIMSの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを収集する工程を包含する、方法。
(項目47A)
ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置について2以上存在する混合物から、該混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを含む試料を生産する方法であって、
A)該試料を液体カラムクロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)またはイオンモビリティ分離-質量分析(IMS-MS)に適用する工程;および
B)該LC-MSまたはIMS-MSにおけるLCまたはIMSの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを含む画分を収集する工程
を包含する、方法。
(項目48A)
前記混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類は一種類である、項目47Aに記載の方法。
(1B)試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートを測定、検出または同定する方法であって、該方法は
A)該試料を液体カラムクロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)に適用する工程;および
B)該LC-MSにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程
を包含する、方法。
(2B)前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の有無も特定される、項目1Bに記載の方法。
(3B)前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の分子量の合計も特定される、項目1Bまたは2Bに記載の方法。
(4B)前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の種類も特定される、項目1B~3Bのいずれか1項に記載の方法。
(5B)前記測定、検出または同定は、ホスファチジルイノシトールホスフェートを他のイノシトール含有リン脂質から区別して行うことを特徴とする、項目1B~4Bのいずれか1項に記載の方法。
(6B)前記試料は、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で調製されたものである、項目1B~5Bのいずれか1項に記載の方法。
(7B)前記条件は脱アシル化処理を行わないことを含む、項目6Bに記載の方法。
(8B)前記液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラム、親水基および疎水基を分離するカラムクロマトグラフィーからなる群より選択される、項目1B~7Bのいずれか1項に記載の方法。
(9B)前記液体カラムクロマトグラフィーは、イオンモビリティ分離と組み合わせられる、項目1B~8Bのいずれか1項に記載の方法。
(10B)前記ホスファチジルイノシトールホスフェートを定量する工程をさらに包含する、項目1B~9Bのいずれか1項に記載の方法。
(11B)前記試料はインタクトな試料である、項目1B~10Bのいずれか1項に記載の方法。
(12B)前記特定は試料を標識せずに行われる、項目1B~11Bのいずれか1項に記載の方
法。
(13B)試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートを測定、検出または同定する方法であって、該方法は
A)該試料をイオンモビリティ分離-質量分析(IMS-MS)に適用する工程;およびB)該IMS-MSにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程
を包含する、方法。
(14B)項目2B~8B、10B~12Bのいずれかまたは複数の特徴を備える項目13Bに記載の方法。
(15B)試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートのアシル基およびリン酸基の位置を測定、検出または同定する装置であって、液体カラムクロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)と、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該LC-MSに該試料を適用する適用部とを含む装置。
(16B)前記液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラムなど親水基、疎水基を分離するすべてのカラムクロマトグラフィーからなる群より選択される、項目15Bに記載の装置。
(17B)前記ホスファチジルイノシトールホスフェートを検知または定量する手段をさらに含む、項目15Bまたは16Bに記載の装置。
(17B2)項目2B~12Bのいずれかまたは複数の特徴を備える項目15B~17Bのいずれか1項に記載の装置。
(18B)試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートのアシル基およびリン酸基の位置を測定、検出または同定する装置であって、イオンモビリティ分離-質量分析(IMS-MS)と、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該IMS-MSに該試料を適用する適用部とを含む装置。
(18B2)項目2B~12Bのいずれかまたは複数の特徴を備える項目18Bに記載の装置。
(19B)試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートを、アシル基を保持しつつ、リン酸基の位置に応じて分離または精製する方法であって、該方法は
A)該試料を液体カラムクロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)またはイオンモビリティ分離-質量分析(IMS-MS)に適用する工程;および
B)該LC-MSまたはIMS-MSの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートを収集する工程を包含する、方法。
(19B2)項目2B~12Bのいずれかまたは複数の特徴を備える項目19Bに記載の方法。
(20B)ホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置について2以上存在する混合物から、該混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートを含む試料を生産する方法であって、
A)該試料を液体カラムクロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)またはイオンモビリティ分離-質量分析(IMS-MS)に適用する工程;および
B)該LC-MSまたはIMS-MSの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートを含む画分を収集する工程
を包含する、方法。
(21B)前記混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類は一種類である、項目20Bに記載の方法。
(21B2)項目2B~12Bのいずれかまたは複数の特徴を備える項目20Bまたは21Bに記載の方法。
(1C)リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸である化合物。
(2C)1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール三リン酸、または2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である項目1Cに記載の化合物。
(3C)1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3-一リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-4-一リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-5-一リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3-一リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-4-一リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-5-一リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3.4-二リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3.5-二リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-4.5-二リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3,4-二リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3,5-二リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸、または2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸である項目1Cまたは2Cに記載の化合物。
(4C)2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、1-アシル-リゾホスファチジルイノシトール三リン酸または2-アシル-リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である項目1C~3Cのいずれか一項に記載の化合物。
(5C)1-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-7Z,10Z,13Z,16Z-ドコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサペンタエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-7Z,10Z,13Z,16Z-ドコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサペンタエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-6Z,9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-6Z,9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;および
2-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸
からなる群より選択される、
項目1C~4Cのいずれか一項に記載の化合物。
(6C)がんマーカーとして使用するための、項目1C~5Cのいずれか1項に記載の化合物を含む組成物。
(7C)前記がんは前立腺がんを含む、項目6Cに記載の組成物。
(8C)ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸をアルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程を包含する、項目1C~5Cのいずれか一項に記載の化合物または項目6Cまたは7Cに記載の組成物の製造方法。
(9C)前記アルキルアミンは、メチルアミンである、項目8Cに記載の製造方法。
(10C) 前記脱アシル化は、脱ジアシル化する条件より緩和な条件である、項目8Cまたは9Cに記載の製造方法。
(11C)前記緩和な条件は、脱ジアシル化する条件のうち反応時間の短縮、前記アルキルアミンの濃度の低減、反応温度、またはその組み合わせで達成される、項目10Cに記載の方法。
(12C)前記緩和な条件は、アルキルアミンとしてメチルアミンを用い、10分間以下の反応時間または該メチルアミンの濃度が約11%以下、反応温度が53℃以下あるいは該反応時間および該濃度および該反応温度の組み合わせである、項目10Cまたは11Cに記載の方法。
(13C)(A)1位と2位とに異なる質量のアシル基を有するホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を提供する工程であって、所望の質量を有するアシル基が1位または2位から選択される所望の位置に存在する、工程;(B)該ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を、アルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程、および(C)必要に応じて、所望の質量のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を取り出す工程を包含する、所望の位置に所望のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を製造する方法。
(14C)(A)試料を、陰イオン交樹脂に接触させることによりリン脂質を濃縮する工程;(B)該酸性リン脂質中のリン酸基を保護基で保護する工程;および(C)質量分析法により、該リン脂質中にリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する工程、を包含する、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する方法。
(15C)前記保護基はアルキル基を含む、項目14Cに記載の方法。
(16C)前記保護基はメチル基を含む、項目14Cまたは15Cに記載の方法。
(17C)前記質量分析法は三連四重極質量分析計による選択反応モニタリング法(SRM)を含む、項目14C~16Cのいずれか一項に記載の方法。
(18C)さらに、逆相カラムクロマトグラフィーを用いて前記リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩の脂肪酸側鎖および/またはリン酸基の検出、同定または定量を行う工程を包含する、項目14C~17Cのいずれか一項に記載の方法。
(19C)前記逆相カラムクロマトグラフィーにおいて、ジアシルグリセロールをプロダクトイオン(フラグメントイオン)として選択して前記脂肪酸側鎖および/またはリン酸基の検出、同定または定量を行う、項目18Cに記載の方法。
(20C)項目14C~19Cのいずれか一項に記載の検出、同定または定量により、がんの診断を行う方法。
本発明は、新規リン脂質、ならびにリン脂質であるホスホイノシタイドおよびリゾホスホイノシタイドをサブクラスで分離して測定、検出または同定する技術を提供する。
・一リン酸、sn-1位のもの
1-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<パルミチル>;
1-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<パルミトレニイニル>;
1-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<ステアリル>;
1-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<オレイニル>;
1-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<リノール酸>;
1-6Z,9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<γリノレン酸>;
1-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<アラキドン酸>;
1-7Z,10Z,13Z,16Z-ドコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサペンタエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
1-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
・一リン酸、sn-2位のもの
2-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<パルミチル>;
2-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<パルミトレニイニル>;
2-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<ステアリル>;
2-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<オレイニル>;
2-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<リノール酸>;
2-6Z,9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<γリノレン酸>;
2-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸<アラキドン酸>;
2-7Z,10Z,13Z,16Z-ドコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサペンタエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
2-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール4-一リン酸;
・二リン酸、sn-1位のもの
1-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<パルミチル>;
1-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<パルミトレニイニル>;
1-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<ステアリル>;
1-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<オレイニル>;
1-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<リノール酸>;
1-6Z,9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<γリノレン酸>;
1-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<アラキドン酸>;
1-7Z,10Z,13Z,16Z-ドコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサペンタエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
1-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
・二リン酸、sn-2位のもの
2-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<パルミチル>;
2-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<パルミトレニイニル>;
2-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<ステアリル>;
2-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<オレイニル>;
2-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<リノール酸>;
2-6Z,9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<γリノレン酸>;
2-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸<アラキドン酸>;
2-7Z,10Z,13Z,16Z-ドコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサペンタエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
2-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸;
・三リン酸、sn-1位のもの
1-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<パルミチル>;
1-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<パルミトレニイニル>;
1-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<ステアリル>;
1-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<オレイニル>;
1-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<リノール酸>;
1-6Z,9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<γリノレン酸>;
1-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<アラキドン酸>;
1-7Z,10Z,13Z,16Z-ドコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサペンタエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
1-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
・三リン酸、sn-2位のもの
2-ブタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-ヘキサニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-オクタニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-ヘキサデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<パルミチル>;
2-9Z-ヘキサデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<パルミトレニイニル>;
2-ヘプタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-オクタデカニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<ステアリル>;
2-9Z-オクタデセニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<オレイニル>;
2-9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<リノール酸>;
2-6Z,9Z,12Z-オクタデカンジエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<γリノレン酸>;
2-8Z,11Z,14Z-イコサトリエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-5Z,8Z,11Z,14Z-イコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸<アラキドン酸>;
2-7Z,10Z,13Z,16Z-ドコサテトラエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサペンタエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸;
2-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-ドコサヘキサエニル-リゾホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸
これらの脂肪酸または脂肪酸に基づくアシル基は、本発明の開示に基づいて、本発明のリゾホスファチジルイノシトールリン酸類においてsn-1位またはsn-2位のいずれにおいても結合した形式で入手可能であることが理解される。
本明細書において「クロマトグラフィー」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、媒体が物質のカラムまたはキャピラリー通路を均一に通過(浸透)するときに、媒体中の1種または複数の成分が選択的に遅延するプロセスを意味する。遅延は、バルク媒体(すなわち、移動相)が固定相(複数可)に対して移動するとき、1つまたは複数の固定相とこの媒体の間の混合物成分の分布によって生じる。「クロマトグラフィー」の例には、液体クロマトグラフィー(LC)、およびガスクロマトグラフィー(GC)が含まれる。1つの実施形態では、クロマトグラフィーを用いて、リン酸基の結合位置が識別され得る。
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
1つの局面において、本発明は、リゾホスファチジルイノシトール一リン酸(lyso-phosphatidylinositol monophosphate(LPIP1))、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸(lyso-phosphatidylinositol bisphosphate(LPIP2))またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸(lyso-phosphatidylinositol trisphosphate(LPIP3))である化合物を提供する。ホスファチジルイノシトールリン酸類の研究は比較的早期からなされており、近年では相当程度の内容が判明するに至っている(佐々木ら、医学のあゆみ Vol. 248, No. 13, (2014)pp.1039-1049)。ホスホイノシタイド/イノシ卜ールリン脂質(PIPs)は形質膜,オルガネラ膜を構成するといわれており、そのヘッドグループは炭素6員環と多価のリン酸基により他のグリセロリン脂質と比較してきわだって大きく、また、電荷に富むPIPs代謝系は増殖、分化、運動、老化、死といった幅広い生命現象に関与するとされている。したがって、本発明において初めて同定された本発明の脂質(LPIPs)そのものや、その代謝酵素や受容体などは、多様な疾患治療薬の標的として、また、疾患マーカーとして有用であり得る。また、脂質代謝は重要な研究対象の一つであるため試薬として、これらの脂質が実験用試薬として利用される。
別の局面において、本発明は、本発明の化合物(リゾホスファチジルイノシトールリン酸類等)を含む疾患マーカーとして使用するための組成物を提供する。このような化合物としては、本明細書中の<リゾホスファチジルイノシトールリン酸類(LPIPs)>に記載される任意の実施形態を1つまたは複数組み合わせて採用され得ることが理解される。そのような例としては、例えば、リゾホスファチジルイノシトール一リン酸(LPIP1)、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸(LPIP2)またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸(LPIP3)、それらの組合せを挙げることができ、特に、LPIP3について、がん組織において、その発現レベルが有意に上昇したことが示されており、本発明の化合物は、特に生体内に存在する物質の場合は、炎症マーカーまたはがんマーカーとして使用することができ、合成品についても、炎症マーカーまたはがんマーカーの検出の際の対照または標準品として有用であることが理解される。
別の局面において、本発明は、ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸をアルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程を包含する本発明の化合物(リゾホスファチジルイノシトールリン酸類)の製造方法。
化合物P-1(たとえば(+)-1-O-(4-メトキシベンジル)-2-O-メトキシメチル-グリセロール)とカルボン酸ハロゲン化物を適切な条件下に付すことで(たとえばP-1のジクロロメタン溶液にジメチルアミノピリジン(DMAP)および塩化アセチルを0℃で添加し、室温で撹拌することで)化合物P-2を得る。化合物P-2を適切な条件下に付すことで(たとえばトリフルオロ酢酸を用いることで)ヒドロキシ基の保護基PGP1(たとえばメトキシメチル基)を脱保護して化合物P-3を得る。化合物P-3とカルボン酸ハロゲン化物とを適切な条件下に付すことで(たとえば化合物P-3のジクロロメタン溶液にジメチルアミノピリジン(DMAP)および塩化オクタデカノイルを0℃で添加し、室温で撹拌することで)化合物P-4を得る。化合物P-4を適切な条件下に付すことで(たとえば2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノン(DDQ)やヘキサニトラセリウム(IV)酸アンモニウム(CAN)を用いることで)ヒドロキシ基の保護基PGP2(たとえば4-メトキシベンジル基)を脱保護して化合物P-5を得る。化合物P-5とアミノホスフィン(たとえば(4-メトキシベンジルオキシ)ビス(N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスフィン)とを適切な条件下に付すことで(たとえばジクロロメタン溶液中室温で1H-テトラゾールを添加し、撹拌させることで)ホスホロアミダイトP-6を得る。
化合物I-1を適切な条件に付すことで(たとえば化合物I-1のDMF溶液に4-メトキシベンジルクロリドと水素化ナトリウムとを0℃で添加し、室温で撹拌することで)保護基PGA(たとえば4-メトキシベンジル基)を導入した化合物I-2を得る。化合物I-2を適切な条件に付すことで(たとえば化合物I-2のDMF溶液にクロロメチルメチルエーテルと水素化ナトリウムとを0℃で添加し、室温で撹拌することで)保護基PG1(たとえばメトキシメチル基)を導入した化合物I-3を得る。化合物I-3を適切な条件に付すことで(たとえば化合物I-3のジクロロメタン/ヘキサン溶液に水素化ジイソブチルアルミニウム(DIBAL)を0℃で添加し、室温で撹拌することで)化合物I-4を得る。化合物I-4を適切な条件に付すことで(たとえば化合物I-4のDMF溶液に4-メトキシベンジルクロリドと水素化ナトリウムとを0℃で添加し、室温で撹拌することで)保護基PG2(たとえば4-メトキシベンジル基)を導入した化合物I-5を得る。化合物I-5を適切な条件に付すことで(たとえば化合物I-5のメタノール溶液に塩酸を添加し、還流させることで)化合物I-6を得る。化合物I-6を適切な条件に付すことで(たとえば化合物I-6のジクロロメタン溶液にトルエンスルホン酸一水和物と
イノシトール前駆体PI-1(たとえば1D-2,3,4,5,6-ペンタ-O-(4’-メトキシベンジル)-1-O-(メトキシメチル)-myo-イノシトール)のヒドロキシ基に適切なリン試薬(たとえばビス(4-メトキシベンジルオキシ)(N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスフィン)を用い、適切な条件下に付すことで(たとえばPI-1のジクロロメタン溶液に1H-テトラゾールを添加し、室温で10~14時間撹拌を行うことで)リン酸基で修飾されたPI-2(たとえば1D-2,3,4,5,6-ペンタ-O-(4’-メトキシベンジル)-1-O-(メトキシメチル)-myo-イノシトール-4-(ビス(4-メトキシベンジルオキシ)ホスフェート))を得る。PI-2を適切な条件に付すことで(たとえばトリフルオロ酢酸を用いることで)保護基PG1(たとえばメトキシメチル基)を脱保護したPI-3(たとえば1D-2,3,4,5,6-ペンタ-O-(4’-メトキシベンジル)-myo-イノシトール-4-(ビス(4-メトキシベンジルオキシ)ホスフェート))を得る。PI-3とホスホロアミダイト前駆体(たとえば(1-アセチルオキシ-2’-オクタデカノイルオキシプロピル)(4-メトキシベンジル)ジイソプロピルホスホロアミダイト)とを適切な条件に付すことで(たとえばPI-3のジクロロメタン溶液に1H-テトラゾールおよび(1-アセチルオキシ-2-オクタデカノイルオキシプロピル)(4-メトキシベンジル)ジイソプロピルホスホロアミダイト)を添加して室温で10~14時間撹拌後、メタクロロ過安息香酸(mCPBA)を-78℃で添加し、室温で20分撹拌することで)PI-4を得る。PI-4を適切な条件(たとえばPI-4のアセトニトリル溶液にヘキサニトラセリウム(IV)酸アンモニウム(CAN)を添加し、室温で45分間撹拌を行うことで)保護基PG2(たとえば4-ベンジル基)を脱保護したPI-5(たとえば1D-myo-イノシトール-1-(1’-O-アセチル-2’-O-オクタデカノイル-sn-グリセラ-3-イルホスフェート))を得る。
別の局面では、本発明は、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する方法であって、(A)試料を、陰イオン交樹脂に接触させることによりリン脂質を濃縮する工程;(B)該リン脂質中のリン酸基を保護基で保護する工程;および(C)質量分析により、該リン脂質中にリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する工程を包含する、酸性リン脂質を検出、同定または定量する方法を提供する。リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を含むホスホイノシタイドは、多くのリン酸基をもつことや、(生体脂質抽出物中の存在量が)微量であるために試料中の他の脂質によるイオンサプレッションを受けることなどから、従来は不可能とされている解析が最も困難な膜リン脂質となっているが、本発明の方法を用いれば、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定および定量することができるようになった。本発明の方法は、数百amol~数fmolを定量下限とすることができ、生体内で存在するか不明であった、多種類のLPIPsを測定することができた。このように様々な生体微量サンプルでの絶対定量が可能な、質量分析をベースとした方法が本発明により提供される。
イノシトール環に多くのリン酸基をもつホスホイノシタイドは、不安定かつ金属をはじめとする多くの材質に吸着しやすい性質をもつため、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類もまたも同様の性質を有すると考えられる。そのためホスホイノシタイドは回収後から測定までの待機時間の間に分析用バイアル中で急速に損なわれ、検出した溶出ピークにはテーリングがみられる。本発明者らはホスホイノシタイドを高回収後、リン酸基にメチル化を施すことで分解・吸着を抑えた安定誘導体を作製し堅牢な分析を行う。このような手法は、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類にも応用可能である。
ホスホイノシタイドおよびリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類の測定には、高感度かつ定量性に優れた分析法である三連四重極質量分析計による選択反応モニタリング法(SRM)を用いる。ホスホイノシタイドはその構造から負イオンとして検出しやすいが、本発明の分析法ではリン酸基にメチル化等の保護化を施しているため正イオンとして検出しやすくなる。リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類もまた同様の性状を示す。各分子種はジアシルグリセロール(DG)を特徴的なフラグメントイオンとして選択する。分析は逆相カラム(C8)により脂肪酸側鎖の疎水性の違いを利用して各分子種ごとに分離・溶出する。同じ分子種の各ホスホイノシタイドはリン酸基の数の違いによりPIP3、PIP2、PIP1の順に溶出するため、この溶出時間の相違を利用して分析する。定量解析はGaussian法によりスムージングを行った各分子種のクロマトグラムのピーク面積を数値化し、それを生体内にほとんど存在しない各種17:0/20:4合成品を用いて作製した検量線に当てはめて算出する。本発明のこの分析法は、高感度かつ定量性に優れ、培養細胞以外にもヒト臨床検体や動物組織由来試料での解析が可能である。リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類についても、同様の分析が可能であり、分子量の相違はもとより、LPIP3、LPIP2、LPIP1の順に溶出するため、この溶出時間の相違を利用して分析し、適宜Gaussian法によりスムージングを行った各分子種のクロマトグラムのピーク面積を数値化し、標準品と対比し、作製した検量線に当てはめて算出することができる。
1つの局面において、本発明は、試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを測定、検出または同定する方法を提供する。この方法はA)該試料を質量分析(MS)に適用する工程;およびB)該MSにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程を包含する。一つの実施形態では、試料はさらにクロマトグラフィーに適用される。一つの実施形態では、試料はさらにイオンモビリティ分離(IMS)に適用される。
1つの局面において、本発明は、試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのアシル基およびリン酸基の位置を測定、検出または同定する装置を提供する。ここで、この装置は、質量分析装置を含み、好ましくはさらにクロマトグラフィー用の装置またはイオンモビリティ分離用の装置を含み、例えば、クロマトグラフィー用の装置はガスクロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィー用の少なくとも1つの装置を含みうる。理論に束縛されることを望まないが、本明細書において液体カラムクロマトグラフィーと質量分析装置を用いてホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを測定することができていることから、ガスクロマトグラフィーにおいても同様に分離可能であり測定することができると理解される。リン酸位置異性体間の分離をより正確に行う場合は、クロマトグラフィー用の装置またはイオンモビリティ分離用の装置と組み合わせることが好ましい。具体的な実施形態としては、本発明は、質量分析(MS)装置と、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該MSに該試料を適用する適用部とを含む。より具体的な実施形態としては、本発明は、液体カラムクロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)装置と、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該LC-MSに該試料を適用する適用部とを含む。
1つの局面において、本発明は、試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを、アシル基を保持しつつ、リン酸基の位置に応じて分離または精製する方法を提供する。この方法はA)該試料を質量分析(MS)に適用する工程;およびB)該MSの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを収集する工程を包含する。1つの実施形態では、試料はさらにクロマトグラフィーまたはイオンモビリティ分離(IMS)に適用される。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M.(1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M. (1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al.(1995).PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J. et al.(1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
本明細書において説明した略称の他、以下の略称も用いる。
PI3PまたはPI(3)P:ホスファチジルイノシトール-3-一リン酸
PI4PまたはPI(4)P:ホスファチジルイノシトール-4-一リン酸
PI5PまたはPI(5)P:ホスファチジルイノシトール-5-一リン酸
(PI3PまたはPI4PまたはPI5PをPIP1と表記する)
PI(3,4)P2:ホスファチジルイノシトール-3,4-二リン酸
PI(3,5)P2:ホスファチジルイノシトール-3,5-二リン酸
PI(4,5)P2:ホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸
(PI(3,4)P2またはPI(3,5)P2またはPI(4,5)P2をPIP2と表記する)
PI(3,4,5)P3:ホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸
(PI(3,4,5)P3をPIP3と表記する)
PIP1,PIP2,PIP3をPIPsと総称する。
本実施例では、リゾホスファチジルイノシトールリン酸類の製造を行い、その新規物質の新規同定法も開発した。
以下の試料を標準試料および出発原料として用いた。
(使用材料)
出発原料として用いるホスファチジルイノシトールリン酸である17:0/20:4-PI3P、17:0/20:4-PI4P、17:0/20:4-PI5P、17:0/20:4-PI(3,4)P2、17:0/20:4-PI(3,5)P2、17:0/20:4-PI(4,5)P2、17:0/20:4-PI(3,4,5)P3およびその他のグリセロリン脂質標準合成品は、Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL,USA)から購入した。トリメチルシリルジアゾメタン(TMS-ジアゾメタン)は、東京化成から購入した。超純水はKantoChemicals(Tokyo,Japan)から入手した。他のすべての溶媒は、HPLCまたはLC-MSグレードであり、他の化学試薬は分析グレードであった。これらは、Wako Pure Chemicalsより入手した。
出発原料としてホスファチジルイノシトールリン酸(一リン酸、二リン酸および三リン酸)を用いて、メチルアミンとのO→Nトランスアシレーション反応による脱アシル化を行った。脱アシル化は、1つのアシルのみが脱アシル化できるように、以下の条件を設定した:
クロロホルム/メタノール(1/1)に溶解した100pmolの1-ヘプタデカノイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-1’-myo-イノシトール-4’一リン酸(1-heptadecanoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phospho-1'-myo-inositol-4'-monophosphate)(17:0/20:4-PI4P)をN2ガスで乾固し、0.3mLの2.13%メチルアミン溶液(メチルアミン/水/メタノール/1-ブタノール(1.92/38.08/40/10))あるいは10.7%メチルアミン溶液(メチルアミン/水/メタノール/1-ブタノール(9.6/30.4/40/10))を53℃あるいは37℃で添加して、撹拌後53℃あるいは37℃で0,5,10,30,60,120分間静置し、氷冷メタノール溶液を加えることにより反応をクエンチした。反応物をN2ガスで乾固し、目的とするリゾホスファチジルイノシトール一リン酸(LPIP1:収率約0~40%)を、リン酸基のメチル化保護を行い、三連四重極質量分析計による以下の方法で測定した。
「三連四重極質量分析計でのSRMによる測定および検出方法」を以下に記す。
イオンスプレー電圧を3.0kVに設定した。加熱されたキャピラリー温度を270°Cに設定した。他のパラメータを製造者の推奨にしたがって設定した。MS系をXcaliburソフトウェアを用いて調整した。ポジティブイオンモードにおける選択反応モニタリング(SRM)法によってLPIPsを測定した。SRMモードにおける個々のLPIPsの測定条件を表2にまとめた。LPIP1、LPIP2、およびLPIP3を親イオンのm/z値(Q1)と娘イオンとして測定するモノアシルグリセロールのm/z値(Q2)の組合せによって同定した。その模式図を図1-1に示す。
横軸に反応時間を、縦軸に17:0 LPIP1あるいは20:4 LPIP1の生成量(クロマトグラム上の原料と反応生成物のピーク面積比から得た収率)を図1-1示す。従来法(メチルアミン濃度10.7%による120分間インキュベーション)では、LPIP1は検出されず、これは反応時間を60分に短縮しても同様であった。反応時間をさらに短縮して5,10,30分とすることによってはじめて、LPIP1が検出された。17:0 LPIP1と20:4 LPIP1の両者が生成された。従来法より低いメチルアミン濃度2.14%による反応でも同様の反応時間依存性の傾向が認められた。この場合、反応時間60分、120分でも少量のLPIP1が検出され、5,10,30分ではより多くのLPIP1が検出された。
メチルアミンを用いたこの方法は従来、イノシトールリン脂質を含むリン脂質の親水基には影響を与えず、二つのアシル基を完全に脱アシル化する目的で汎用されているように、イノシトールに結合するリン酸の位置が変更しないことが知られており(Serunian LA, et al. Methods Enzymol. 1991;198:78-87, Fujii et al. Folia Pharmacol Jpn. 2013; 142: 236-240)、それより緩和な条件であれば、リン酸基の位置や数は変更しない。反応時間の短縮、メチルアミン濃度の低減、反応温度の低下、その組合せによって、脱アシル化の程度を調節することにより、1つのアシルのみを脱アシル化でき、出発物質として用いるジアシル型PIPsに対応したLPIPsを合成できる。次に、表3に、本実施例で市販のPIPs合成品を原材料として合成することができるLPIPsの例を示し、表4には、リン酸基の位置まで確定することができる例を示す。表中の数字は、炭素数と二重結合の数を示す。二重結合があるものについては、16:1=9-ヘキサデセン酸(パルミトレイン酸);18:1=cis-9-オクタデセン酸(オレイン酸);20:4=5,8,11,14-イコサテトラエン酸(アラキドン酸);22:6=4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸である。
本発明の化合物を同定するために、LPIPsの構造を裏付ける特異的フラグメントの精密質量測定を行った。「ハイブリッド四重極-オービトラップ質量分析計を用いた測定および検出方法」を以下に記す。使用した機器は、上述の三連四重極質量分析計よりも高い質量精度をもつOrbitrap Q-Exactive Plusであり、その使用条件は以下のとおりである。
典型的には、試料10μLを注入した。質量分析の条件としては、イオンスプレー電圧を3.0kVに設定した。加熱されたキャピラリー温度を250℃に設定した。他のパラメータを製造者の推奨にしたがって設定した。MS系をXcaliburソフトウェアを用いて調整した。ポジティブイオンモードにおける選択イオンモニタリング法(Selected Ion Monitoring;SIM)および並列反応モニタリング法(Parallel reaction monitoring;PRM)によってLPIPsを測定した。
を四段目に示す。
を四段目に示す。
生成物と生成物由来フラグメントの構造(フラグメント)の精密質量の決定によって、上記結果に記すように生成物の構造が一義的に決定された。「ハイブリッド四重極-オービトラップ質量分析計用いた測定および検出方法」によって得られた結果は、「三連四重極質量分析計でのSRMによる測定および検出方法」と同様に、PIPsの適切なメチルアミン処理によってLPIPsが生じることを示しており、二つの測定法は共に、LPIPsの検出と測定に適していると考えられた。
合成したLPIPsについてNMRによって構造を決定した。NMRによる脂質の構造決定について、当業者は適切に構造決定を行うことができ、例えば、1H化学シフトは、Ong et al.,Mol. Biosys.(2009)5,288-298などに記載されているものを参照することができる。
・試料1) 16:0 LPI4P 5~7nmol
・試料2) 17:0 LPI(4,5)P2 4~6nmol
・試料3) 18:0 LPI(4,5)P2 4~6nmol
・試料4) 32:0(16:0/16:0) PI4P 10nmol
・試料5) 37:4 (17:0/20:4) PI(4,5)P2 10nmol
・試料6) Brain PI(4,5)P2(大部分が38:4(18:0/20:4)) 10nmol
試料1~3は、上記の実施例に従って調製した。試料4~6は、Avanti Polar Lipids(アラバマ、米国)から購入した。
(結論)
NMRにおいて、約5~10nmolの試料量で、リゾリン脂質の脂肪酸およびグリセロール骨格の少なくとも一部のシグナルを観測することが可能であり、リゾリン脂質の構造を決定することができた。また、約50nmolの試料量があれば、全ての水素原子およびリン原子のシグナルを観測することが可能である。
本実施例では、生物試料におけるLPIPsの分離および分析についての実験を行った。生物試料としてはヒト培養細胞株を利用した。
(培養細胞株)HEK293T(ヒト胎児由来腎臓上皮細胞株、Open biosysytemsカタログ番号HCL4517)、Jurkat(ヒト急性T細胞性白血病細胞由来細胞株、ATCCカタログ番号TIB-152)は提供元の推奨する条件で培養、維持した。
上述の手法で抽出したリン脂質をDEAE-セルロースカラムに加える前に、メタノール1.5mLを各サンプルに添加した。カラムに吸着した脂質は、クロロホルム/メタノール(1:1,v/v)(3mL)およびクロロホルム/メタノール/28%アンモニア水/酢酸(200:100:3:0.9,v/v)(3mL)を用いて順次洗浄した。次いでLPIPsを含む高度酸性脂質を、クロロホルム/メタノール/HCl/水(12:12:1:1,v/v)(1.5mL)により溶出した。水(0.75mL)および1M NaCl(0.1mL)の添加後、溶液を、撹拌、遠心分離し下層を収集した。
0.6MのTMS-ジアゾメタンのヘキサン溶液(150μL)の添加後、試料を室温で10分間インキュベートした(Nature Methods 8, 267-272(2011))。次いで、氷酢酸(15μL)および洗浄液(クロロホルム/メタノール/水(3:48:47,v/v)0.7mL)を各溶液に添加した。溶液を、撹拌、遠心分離し下層を収集した。各サンプルを窒素ガス下、乾燥させ、メタノール/70%エチルアミン(100:0.065、v/v)24μLに再溶解させ、水8μLを添加した。得られたLPIPsを含む酸性リン脂質が豊富な画分を、調製してから1日以内で分析した。
定量性に優れた「三連四重極質量分析計でのSRMによる測定および検出方法」により行った。ジアシル型であるPIPsの分子種解析に基づいて、生体試料に含まれると予想されるLPIPs分子種について、選択反応モニタリング(SRM)を行った。TSQ Vantageを用い、Q1:親イオンのm/zおよびQ3:プロダクトイオンであるモノアシルグリセロールのm/zとした。質量分析データはピーク面積を定量し、各々の分子種の存在量を内部標準物質として添加したLPIを基に算出した。付加物イオンは、[M+CH3CH2NH3]+である。本実施例で各LPIPsの検出に用いたQ1、Q3で指定するm/z値のリストを表5に示す。
図5AにHEK293T細胞、図5BにJurkat細胞での、LPIP1、LPIP2、LPIP3の存在を示す。横軸は脂肪酸構成が異なる分子種、縦軸はPS 1nmolを含む細胞由来リン脂質中での存在量を示す。炭素数16~22、二重結合が0~6の多様なアシル基をもつLPIPsが細胞内に見出された。LPIP1、LPIP2はPSの数百分の1から数十分の1程度、LPIP3は数百分の1から数千分の1程度のレベルで存在する微量リン脂質であった。
次に、本実施例では、生物試料におけるLPIPsの分離および分析についての実験を別の試料を用いて行った。生物試料としてはマウスあるいはヒトの組織あるいは血清あるいは血漿でのLPIPsを利用した。
図6Aに示すように、マウス組織にLPIPsが存在することが明らかとなった。さらに、図6Bに示す血清、図6Cに示す血漿など、生体内の液性成分としてLPIPsが存在することから、細胞で産生されたLPIPsが分泌されたり、あるいは、LPIPsの生成や分解(例えばLPIP1のリン酸化によるLPIP2の生成など)が細胞外でも起こることが示唆された。図6Dに示すようにヒト血清にもLPIPsが存在した。
マウス、ヒト由来の試料に加え、別の実験から、酵母、ショウジョウバエにもLPIPsは存在することなどを見出しており、多くの生物種において、細胞内、細胞外にLPIPsが存在することが判明した。
本実施例では、新規LPIPsの有用性について検討した。
PTENflox/floxマウス(対象マウス)ならびにPB-Cre4:PTENflox/floxマウス(前立腺特異的Pten欠損マウス)♂、16wk
臓器:前立腺
試料の調製は以下の通り行った。マウスを頸椎脱臼し、仰向けに固定した後に開腹し、実体顕微鏡下で単離した前立腺を、速やかに液体窒素で凍結した。脂質抽出直前に解凍し、ホモジナイザーで均一化した。リン脂質の抽出およびDEAEセルロースによる分離およびメチル化反応は、実施例2に準じて行った。分析も実施例2と同様に「三連四重極質量分析計でのSRMによる測定および検出方法」で行った。
図7Aに、正常マウス(Ctrl)あるいはがん抑制遺伝子Ptenを前立腺特異的に欠損するマウス(PTEN KO)の前立腺について、上段に組織重量を、下段にHE染色による組織像を表す。Pten欠損は前立腺がんを発症することがわかる。図7Bに示すように、対照となる正常前立腺と比して、前立腺がん組織で16:0LPIPsが上昇していることが明らかとなった。特にLPIP3においては、正常組織では検出限界以下であるところ、腫瘍形成に伴って顕著な上昇が見出された。LPIPsの変動は発がんと相関することから、がんの治療標的やがんを反映するバイオマーカーとしてのLPIPsの有用性が期待される。
(材料および方法)
C57BL/6J<日本クレア株式会社から購入>、12-16週齢
マウスを頸椎脱臼した後に解剖し、足部大腿骨を得た。得られた大腿骨より骨髄球、好中球を回収し、起炎症性物質である補体成分C5aにより刺激した。リン脂質の抽出およびDEAEセルロースによる分離およびメチル化反応は、実施例2と同様に行った。分析も実施例2と同様に「三連四重極質量分析計でのSRMによる測定および検出方法」で行った。
図8に示すように、好中球、マクロファージ等炎症に関連する血液細胞の活性化に関与する補体成分C5a刺激に伴い、18:0 LPIP3が上昇する。LPIP3が炎症細胞の走化性、活性酸素産生、貪食、酵素分泌反応などに関与する可能性が提示され、炎症の治療標的としての有用性を期待することができる。
本実施例では、LC-MSでのホスホイノシタイド(PIPs)のリン酸基の位置による分離が可能であることを実証した。
(使用材料)
以下の分析対象の試料として用いたホスファチジルイノシトールリン酸(ホスホイノシタイド)をAvanti Polar Lipids(アラバマ州、米国)から購入した。
17:0-20:4 PI(3)P(LM-1900)
17:0-20:4 PI(4)P(LM-1901)
17:0-20:4 PI(5)P(LM-1902)
17:0-20:4 PI(3,4)P2(LM-1903)
17:0-20:4 PI(4,5)P2(LM-1904)
17:0-20:4 PI(3,5)P2(LM-1905)
17:0-20:4 PI(3,4,5)P3(LM-1906)
17:0-20:4 PI(LM-1502)
その他のグリセロリン脂質標準合成品
利用したすべての溶媒は、HPLCまたはLC-MSグレードであり、他の化学試薬は分析グレードであった。トリメチルシリルジアゾメタン(TMS-ジアゾメタン)は、東京化成から購入した。超純水はKantoChemicals(Tokyo,Japan)から入手した。
PI(3)P+PI(4)P+PI(5)P(それぞれ、100μM 1μLずつ)
PI(3,4)P2+PI(4,5)P2+PI(3,5)P2(それぞれ、100μM 1μLずつ)
各試料をTMSジアゾメタンで処理して、リン酸基を保護した。具体的には、各試料を0.6M TMSジアゾメタン150μLで処理(22~25℃)し、5分後に氷酢酸15μLを添加してメチル化反応を止めた。その後、それぞれの試料に対してクロロホルム:メタノール:水(3:48:47)混合液を700μL加え、遠心分離後、有機層(下層)をスピッツ試験管に分注し、窒素ガス濃縮器により蒸発乾固させて、それぞれ、アセトニトリル100μLに再溶解してLC-MS測定用の試料とした。
LC-MSによる測定は以下の条件で行った。
質量分析装置:QTRAP6500 with SelexION System(ABSciex、東京、日本)
ポンプ:Nexera X2 system(島津製作所、京都、日本)
オートサンプラー:PAL HTC-xt(AMR、東京、日本)
カラム:CHIRALPAK IC-3、2.1mm x 250mm、粒径3μm(DAICEL corporation、大阪、日本)
流速:0.1mL/分
注入試料量:10μL
(クロマトグラフィー条件)
移動相A:アセトニトリル+5mM酢酸アンモニウム
移動相B:メタノール+5mM酢酸アンモニウム
*これらの試薬は、全て和光純薬(東京、日本)から購入したLC-MS用グレードのものを使用した。
0分、移動相B=40%
1分、移動相B=40%
3分、移動相B=85%
14分、移動相B=85%
15分、移動相B=40%
20分、移動相B=40%
・質量分析計条件
イオン化法:エレクトロスプレー(正イオンモード)
測定メソッド:多重反応モニタリング(MRM)
制御ソフトウェア:Analyst 1.6.2(Sciex、東京、日本)
測定メソッドは以下のものを用いた。
Parameter Table(Period1 Experiment1)
CUR:20.00
CAD:9.00
IS:5500.00
TEM:100.00
GS1:50.00
GS2:50.00
DP 100.00
EP 10.00
CXP 12.00
Resolution tables
Quad1 Positive Unit Scan Speed=10Da/s
(キャリブレーション条件)
ポリプロピレングリコール(PPG)をキャリブレーション用の試薬として用いたところ以下の結果となった。
IE1 1.800
Mass(Da) Offset Value
59.050 0.010
175.133 -0.035
500.380 -0.194
616.464 -0.268
906.673 -0.421
1254.925 -0.617
1545.134 -0.782
1952.427 -1.013
Quad3 Positive Unit Scan Speed=10Da/s
IE3 1.000
Mass(Da) Offset Value
59.050 0.005
175.133 -0.012
500.380 -0.085
616.464 -0.105
906.673 -0.183
1254.925 -0.270
1545.134 -0.329
1952.427 -0.429
Calibration tables
Quad1 Positive Unit Resolution Scan Speed=10Da/s
Mass(Da) Dac Value
175.133 18682
500.380 53678
616.464 66162
906.673 97393
1254.925 134868
1545.134 166099
1952.427 209933
Quad3 Positive Unit Resolution Scan Speed=10Da/s
Mass(Da) Dac Value
59.050 6189
175.133 18637
500.380 53564
616.464 66028
906.673 97195
1254.925 134603
1545.134 165759
1952.427 209490
(装置パラメータ)
Detector Parameters(Positive):
CEM 1800.0
(ソフトウェアバージョン)
software version:Analyst 1.6.2
以上のように、取得したデータは、Analyst(Sciex、東京、日本)またはMulti Quant(Sciex、東京、日本)を使用して解析した。
LC-MS/MSによるホスホイノシタイドの定量の精度を調べるために種々の試料量、および反復測定による影響を試験した。
実施例6と同様に、合成17:0/20:4ホスホイノシタイド試料を調製した。
実施例8は、イオンモビリティ分離によるホスホイノシタイドのリン酸基の位置による分離が可能であることを実証する。
17:0-20:4 PI(3,4)P2(LM-1903)
17:0-20:4 PI(4,5)P2(LM-1904)
17:0-20:4 PI(3,5)P2(LM-1905)
から、実施例6と同様に、MS分析用の試料を調製した。
MS:
装置:Q TRAP 6500、SelexIONシステム(ABSciex、東京、日本)
制御ソフト:Analyst1.6.2、PeakView(Sciex、東京、日本)
イオン化/イオン源:ESI/IonDrive(Sciex、東京、日本)
シリンジポンプ:7μL/分
イオン源パラメータ:
カーテンガス:20
コリジョンガス:Medium
イオンスプレー電圧:5500V(正イオンモード)
温度:500℃
イオン源ガス1:70psi
イオン源ガス2:50psi
結果を図12に示す。図12に示すように、補償電圧(COV)の違いによりPI(4,5)P2を、PI(3,5)P2およびPI(3,4)P2から分離することができた。このようにカラムを用いなくてもホスホイノシタイドの位置異性体を分離できることが示された。なお、測定に用いたC17:0/C20:4-PIP2はメチル化していないものであった。
本実施例では、本発明の方法を使用することで、薬剤処理した細胞におけるホスホイノシタイド組成の変化を評価することができることを示す。実施例6と同様に、それぞれのジアシルグリセロール種について、リン酸基の位置異性体の溶出順序を事前に確認した。
リン脂質の抽出
PIPs分析のために、細胞試料に、50μLの0.2pmol/μL 17:0/20:4-PI3P、17:0/20:4-PI4P、17:0/20:4-PI5P、17:0/20:4-PI(3,5)P2、17:0/20:4-PI(3,4)P2、17:0/20:4-PI(4,5)P2、17:0/20:4-PI(3,4,5)P3、2pmol/μL 17:0/20:4-PI、および17:0/20:4-PSを添加し、これらを内部サロゲート標準とした。次に、2μLの1nmol/μL 8:0/8:0-PI(4,5)P2(吸着防止剤として)、0.75mLの2N HCl、0.75mLの水、0.2mLの1M NaClおよび3mLのクロロホルムを添加し、振り混ぜた。遠心分離した後、下層を収集し、1.5mLのメタノールを各試料に添加した後、DEAEセルロースカラム(Santa Cruz Biotechnology、テキサス、米国)にアプライした。カラムに吸着された脂質を、クロロホルム:メタノール(1:1、v/v)(3mL)およびクロロホルム:メタノール:28%アンモニア水溶液:酢酸(200:100:3:0.9、v/v)(3mL)で順次洗浄した。次に、PIPs、PIおよびPSを含む高度酸性脂質をクロロホルム:メタノール:HCl:水(12:12:1:1、v/v)(1.5mL)で溶離させた。0.75mLの水および0.1mLの1M NaClを添加した後、溶液を振り混ぜ、遠心分離し、下層を収集した。150μLの0.6M TMS-ジアゾメタン(ヘキサン中)を添加した後、試料を10分間室温でインキュベートした(Nature Methods)。次に、20μLの氷酢酸および0.7mLの洗浄溶液(クロロホルム:メタノール:水(3:48:47、v/v))をそれぞれの溶液に添加した。溶液を振り混ぜ、遠心分離し、下層を収集した。各試料を窒素ガス下で乾燥させ、アセトニトリルに再溶解させた。得られたPIPs濃縮分画を調製から1日以内に分析した。
LC-ESI MS/MSシステム
試料の分析は、実施例6と同様に以下の条件で行った。
質量分析装置:QTRAP 6500(ABSciex、東京、日本)
ポンプ:Nexera X2 system(島津製作所、京都、日本)
オートサンプラー:PAL HTC(CTC Analytics,Zwingen,スイス)
カラム:CHIRALPAK IC-3、2.1mm x 250mm、粒径3μm(DAICEL corporation、大阪、日本)
インジェクタ:非金属インジェクタユニット
サンプルループ:25μL PEEKチューブ
流速:0.1mL/分
注入試料量:10μL
温度:室温
(クロマトグラフィー条件)
移動相A:アセトニトリル+5mM酢酸アンモニウム
移動相B:メタノール+5mM酢酸アンモニウム
*これらの試薬は、全て和光純薬(東京、日本)から購入したLC-MS用グレードのものを使用した。
0分、移動相B=40%
1分、移動相B=40%
3分、移動相B=85%
14分、移動相B=85%
15分、移動相B=40%
20分、移動相B=40%
・質量分析計条件
イオン化法:エレクトロスプレー(正イオンモード)
測定メソッド:多重反応モニタリング(MRM)
測定結果を図13および図14に示す。
本実施例では、本発明の方法を使用することで、遺伝子操作したマウスにおけるホスホイノシタイド組成の変化を評価することができることを示す。実施例6と同様に、それぞれのジアシルグリセロール種について、リン酸基の位置異性体の溶出順序を事前に確認した。
PI(3,4,5)P3→PI(3,4)P2→PI(3)P
を促進し、PTENは以下の脱リン化反応
PI(3,4,5)P3→PI(4,5)P2
を促進することが報告されている(Kofuji S et.al., Cancer Discov. 2015 Jul;5(7):730-9、Li Chew C et.al., Cancer Discov. 2015 Jul;5(7):740-51およびVo TT et.al., Cancer Discov. 2015 Jul;5(7):697-700)。
・C57/B6Jマウス(雄性または雌性、5~6月齢)(N=3)
・INPP4B(-/-)マウス(雄性または雌性、5~8月齢)(N=4)
・PTEN(+/-)マウス(雄性または雌性、5~7月齢)(N=4)
・INPP4B(-/-)PTEN(+/-)マウス(雄性または雌性、5~7月齢)(N=4)
それぞれの試料に対して、以下の脂質抽出およびメチル化処理を行い、キラルLC-MS/MSによって測定した。
リン脂質の抽出
PIPs分析のために、それぞれのマウス組織を1.5mLの氷冷メタノールとともにホモジネートし、50μLの0.2pmol/μL 17:0/20:4-PI3P、17:0/20:4-PI4P、17:0/20:4-PI5P、17:0/20:4-PI(3,5)P2、17:0/20:4-PI(3,4)P2、17:0/20:4-PI(4,5)P2、17:0/20:4-PI(3,4,5)P3、2pmol/μL 17:0/20:4-PI、および17:0/20:4-PSを添加し、これらを内部サロゲート標準とした。次に、2μLの1nmol/μL 8:0/8:0-PI(4,5)P2(吸着防止剤として)、0.75mLの2N HCl、0.75mLの水、0.2mLの1M NaClおよび3mLのクロロホルムを添加し、振り混ぜた。遠心分離した後、下層を収集し、1.5mLのメタノールを各試料に添加した後、DEAEセルロースカラム(Santa Cruz Biotechnology、テキサス、米国)にアプライした。カラムに吸着された脂質を、クロロホルム:メタノール(1:1、v/v)(3mL)およびクロロホルム:メタノール:28%アンモニア水溶液:酢酸(200:100:3:0.9、v/v)(3mL)で順次洗浄した。次に、PIPs、PIおよびPSを含む高度酸性脂質をクロロホルム:メタノール:HCl:水(12:12:1:1、v/v)(1.5mL)で溶離させた。0.75mLの水および0.1mLの1M NaClを添加した後、溶液を振り混ぜ、遠心分離し、下層を収集した。150μLの0.6M TMS-ジアゾメタン(ヘキサン中)を添加した後、試料を10分間室温でインキュベートした(Nature Methods)。次に、20μLの氷酢酸および0.7mLの洗浄溶液(クロロホルム:メタノール:水(3:48:47、v/v))をそれぞれの溶液に添加した。溶液を振り混ぜ、遠心分離し、下層を収集した。各試料を窒素ガス下で乾燥させ、アセトニトリルに再溶解させた。得られたPIPs濃縮分画を調製から1日以内に分析した。
LC-ESI MS/MSシステム
試料の分析は、実施例6と同様に以下の条件で行った。
質量分析装置:QTRAP 6500(ABSciex、東京、日本)
ポンプ:Nexera X2 system(島津製作所、京都、日本)
オートサンプラー:PAL HTC(CTC Analytics、Zwingen、スイス)
カラム:CHIRALPAK IC-3、2.1mm x 250mm、粒径3μm(DAICEL corporation、大阪、日本)
インジェクタ:非金属インジェクタユニット
サンプルループ:25mL PEEKチューブ
流速:0.1mL/分
注入試料量:10μL
温度:室温
(クロマトグラフィー条件)
移動相A:アセトニトリル+5mM酢酸アンモニウム
移動相B:メタノール+5mM酢酸アンモニウム
*これらの試薬は、全て和光純薬(東京、日本)から購入したLC-MS用グレードのものを使用した。
0分、移動相B=40%
1分、移動相B=40%
3分、移動相B=85%
14分、移動相B=85%
15分、移動相B=40%
20分、移動相B=40%
・質量分析計条件
イオン化法:エレクトロスプレー(正イオンモード)
測定メソッド:多重反応モニタリング(MRM)
測定結果を図15および図16に示す。
定を用いた。PIP3の分解を促進する遺伝子をノックアウトしたマウスでは予想通りPIP3の量が大きく増えたがPIP2およびPIPの減少は観察されなかった。PI(3,4)P2は、野生型およびINPP4B(-/-)マウスでは観察されなかったが、PTEN(+/-)マウスにおいて産生が観察され、INPP4B(-/-)PTEN(+/-)マウスではさらに産生の増強が観察された。
本実施例は、LPIPsのリン酸位置異性体を分離および定量可能であることを示す。
17:0 リゾPIP1
Q1:726.5(Da) Q3:327.3(Da)
17:0 リゾPIP2
Q1:834.5(Da) Q3:327.3(Da)
実施例6と同様に分析した結果を図17に示す。リン酸基の位置のみが異なる3種類の異性体は異なる保持時間で観察された。このことから、リゾホスホイノシタイドのリン酸基位置異性体による分離によって、定量的な位置異性体特異的な分析が可能となる。そのため、本発明の方法を用いて、リゾホスホイノシタイドについても、リン酸基の位置およびアシル基の種類の解析が可能となる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。なお、本出願は、日本国特許庁に2016年7月22日に出願された特願2016-144177および2017年3月16日に出願された特願2017-51354に対して優先権主張をするものであり、これらの出願のその全体が、本明細書において参考として援用される。
Claims (1)
- 本明細書に記載の発明。
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